CN115746111A

CN115746111A - 一种转录调控因子LysG的突变体及其应用

Info

Publication number: CN115746111A
Application number: CN202111028178.3A
Authority: CN
Inventors: 郑平; 蒲伟; 陈久洲; 孙际宾; 蔡柠匀; 王钰; 周文娟; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2021-09-02
Filing date: 2021-09-02
Publication date: 2023-03-07

Abstract

本公开属于基因工程与分子生物学领域，涉及一种转录调控因子LysG的突变体、多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞、生物传感器及用途，调控目标基因表达的方法、生产碱性氨基酸的方法、碱性氨基酸高产菌株和碱性氨基酸合成相关蛋白或蛋白编码基因的筛选方法。本公开中转录调控因子LysG的突变体，为转录调控因子LysG对Linker Helix区突变后的突变体，突变体具有提高的对碱性氨基酸诱导响应的强度，能够实现对碱性氨基酸高产菌株及与碱性氨基酸合成相关的蛋白或其编码基因的高灵敏度检测，对于碱性氨基酸高产菌株和合成途径相关蛋白的高通量筛选以及碱性氨基酸高产菌株构建中关键酶的表达调控具有重要意义。

Description

一种转录调控因子LysG的突变体及其应用

技术领域

本公开属于基因工程与分子生物学领域，具体涉及一种转录调控因子LysG的突变体、编码突变体的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞、生物传感器及用途，调控目标基因表达的方法、生产碱性氨基酸的方法、碱性氨基酸高产菌株和碱性氨基酸合成相关蛋白的筛选方法。

背景技术

LysR家族转录调控因子(LysR-type transcriptional regulators，LLTRs)广泛分布于微生物的各种属中，其调控的基因功能多样，涉及合成代谢、群体感应、毒力等方面^[1]。随着生物信息学和蛋白质结构学的发展，越来越多LysR型转录调控因子被发现。目前为止，LysR家族转录调控因子已经成为原核生物中最大的一类转录因子家族。

谷氨酸棒杆菌中鉴定的LysG属于典型的LysR家族转录调控因子，N端存在与DNA结合的Helix-turn-helix motif(HTH)，C端存在与效应物结合的区域(Effector bindingdomain，EBD)，中间通过柔性Linker Helix连接^[2]。转录调控因子LysG可以响应胞内三种碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，通过调控lysE启动子进而激活下游转运蛋白LysE的表达，以此来维持胞内碱性氨基酸的平衡^[3]。

由于转录调控因子的传感特性，目前基于转录调控因子的生物传感器已经广泛用于胞内小分子代谢物浓度的检测以及小分子代谢物高产菌株的高通量筛选，例如氨基酸高产菌株及其合成途径关键酶的高通量筛选^[3-5]。然而，基于天然转录调控因子的生物传感器往往对小分子的响应强度较低，难以应用到高产菌株的高通量筛选中。因此，如何改造天然转录调控因子，优化生物传感器的响应强度，是目前亟需解决的重要问题。

转录调控因子LysG能够通过lysE启动子调控下游靶基因——氨基酸转运蛋白的表达^[6]，其响应碱性氨基酸产生转录调控作用对于提高响应元件的调控性能具有重要意义。然而，野生型LysG对三种碱性氨基酸响应的强度较低，对下游氨基酸转运蛋白及其他蛋白的转录激活作用有限，无法用于更大范围的基因表达调控。

引用文献：

[1]Maddocks,S.E.and Oyston,P.C.F.(2008)Structure and function of theLysR-type transcriptional regulator(LTTR)family proteins.Microbiology,154,3609-3623.

[2]Della Corte,D.,van Beek,H.L.,Syberg,F.,Schallmey,M.,Tobola,F.,Cormann,K.U.,Schlicker,C.,Baumann,P.T.,Krumbach,K.,Sokolowsky,S.et al.(2020)Engineering and application of a biosensor with focused ligandspecificity.Nat.Commun.,11,4851.

[3]Binder,S.,Schendzielorz,G.,

N.,Krumbach,K.,Hoffmann,K.,Bott,M.and Eggeling,L.(2012)A high-throughput approach to identify genomicvariants of bacterial metabolite producers at the single-cell level.Genomebiology,13,R40.

[4]Kortmann,M.,Mack,C.,Baumgart,M.and Bott,M.(2019)Pyruvatecarboxylase variants enabling improved lysine production from glucoseidentified by biosensor-based high-throughput fluorescence-activated cellsorting screening.ACS Synth.Biol.,8,274-281.

[5]Schendzielorz,G.,et al.(2014)Taking control over control:use ofproduct sensing in single cells to remove flux control at key enzymes inbiosynthesis pathways.ACS Synth.Biol.,3,21-29.

[6]Zhou LB,Zeng AP.(2015)Engineering a lysine-ON riboswitch formetabolic control of lysine production in Corynebacterium glutamicum.ACSSynth.Biol.,4,1335-1340.

发明内容

发明要解决的问题

鉴于现有技术中存在的问题，例如，野生型LysG对碱性氨基酸的响应强度较低，无法高效调控靶基因的表达，无法构建具有高灵敏度的生物传感器的缺陷。为此，本公开提供了具有转录调控因子活性的多肽，是对转录调控因子LysG的Linker Helix区域进行突变得到的突变体。与野生型的转录调控因子LysG相比，突变体具有提高的对碱性氨基酸的诱导响应强度，能够实现生物传感器对碱性氨基酸高产菌株及与碱性氨基酸合成相关的蛋白编码基因的高灵敏度检测，对于构建碱性氨基酸高产菌株以及菌株或碱性氨基酸合成相关蛋白的高通量筛选具有重要意义。

用于解决问题的方案

(1)一种转录调控因子LysG的突变体，所述突变体具有位于Linker Helix区的一个或多个突变的氨基酸；并且，与野生型的转录调控因子LysG相比，所述突变体具有提高的碱性氨基酸响应强度；

(2)根据(1)所述的转录调控因子LysG的突变体，其中，所述突变体选自如下(i)-(iii)组成的组中的任一项：

(i)包含如SEQ ID NO：1所示序列的多肽的突变体，所述突变体在对应SEQ ID NO：1所示序列的第57-89位的一个或多个位置处具有突变的氨基酸；

(ii)与(i)所示的氨基酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的多肽；

(iii)如(i)或(ii)所示氨基酸序列的多肽在N端和C端的至少一端添加或缺失一个或多个氨基酸的多肽。

(3)根据(1)或(2)所述的转录调控因子LysG的突变体，其中，所述突变体对应SEQID NO：1所示序列，具有如下一个或多个位置处的突变的氨基酸：

第58位、第59位、第61位、第64位、第65位、第66位、第67位、第70位、第73位、第75位、第76位、第77位、第78位、第79位、第80位、第83位、第84位、第85位、第86位、第87位、第88位、第89位；

优选地，所述突变体在对应SEQ ID NO：1所示序列的至少1个、至少2个或至少3个位置处具有突变的氨基酸。

(4)根据(1)-(3)任一项所述的转录调控因子LysG的突变体，其中，所述突变体对应SEQ ID NO：1所示序列，具有如下(a₁)-(a₂₂)组成的组中任意一个位置处的突变的氨基酸，或任意两个以上的位置处的突变的氨基酸：

(a₁)E58V；

(a₂)A59S；

(a₃)E61K或E61V；

(a₄)V64A；

(a₅)Q65R；

(a₆)A66T；

(a₇)A67T或A67S；

(a₈)A70I；

(a₉)L73I；

(a₁₀)A75G；

(a₁₁)E76D、E76C、E76K或E76W；

(a₁₂)T77A；

(a₁₃)K78E或K78R；

(a₁₄)A79V、A79T或A79R；

(a₁₅)Q80R或Q80K；

(a₁₆)G83R；

(a₁₇)R84H；

(a₁₈)L85P、L85A、L85D、L85G、L85A、L85S、L85T或L85Y；

(a₁₉)A86R或A86D；

(a₂₀)E87G、E87D、E87R、E87N、E87H、E87K或E87S；

(a₂₁)I88V、I88T、I88A、I88N、I88G、I88H、I88K、I88P或I88S；

(a₂₂)P89Q。

(5)根据(1)-(4)任一项所述的转录调控因子LysG的突变体，其中，所述突变体对应SEQ ID NO：1所示序列，具有如下所示(m₁)-(m₅₁)中任意一种所示的突变的氨基酸：

(m₁)E58V；(m₂)A59S和Q80R；(m₃)E61V；(m₄)E61K和K78E；

(m₅)V64A和E87D；(m₆)Q65R；(m₇)A66T；(m₈)A67T和A79V

(m₉)A67T；(m₁₀)A67S和T77A；(m₁₁)M70I；(m₁₂)L73I；(m₁₃)L73V；

(m₁₄)A75G；(m₁₅)E76D；(m₁₆)E76C；(m₁₇)E76K；(m₁₈)E76W

(m₁₉)T77A，K78R和G83R；(m₂₀)T77A；(m₂₁)A79V；(m₂₂)A79R；

(m₂₃)A79T和G83R；(m₂₄)Q80R；(m₂₅)Q80K和R84H；(m₂₆)L85P；

(m₂₇)L85A；(m₂₈)L85D；(m₂₉)L85G；(m₃₀)L85M；(m₃₁)L85S；

(m₃₂)L85T；(m₃₃)L85Y；(m₃₄)A86R；(m₃₅)A86D；(m₃₆)E87G；

(m₃₇)E87R；(m₃₈)E87N；(m₃₉)E87H；(m₄₀)E87K；(m₄₁)E87S；

(m₄₂)I88V；(m₄₃)I88T；(m₄₄)I88A；(m₄₅)I88N；(m₄₆)I88G；

(m₄₇)I88H；(m₄₈)I88K；(m₄₉)I88P；(m₅₀)I88S；(m₅₁)P89Q。

(6)根据(1)-(5)任一项所述的转录调控因子LysG的突变体，其中，所述突变体与SEQ ID NO：1所示序列的多肽相比，具有1.4-5倍以上的提高的碱性氨基酸响应强度。

(7)一种分离的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码如(1)-(6)任一项所述的转录调控因子LysG的突变体。

(8)一种核酸构建体，其中，所述核酸构建体包含如(7)所述的多核苷酸，所述多核苷酸与LysG调控型启动子可操作地连接，所述LysG调控型启动子指导多肽的表达。

(9)一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含如(7)所述的多核苷酸，或如(8)所述的核酸构建体。

(10)一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含如(1)-(6)任一项所述的转录调控因子LysG的突变体、如(7)所述的多核苷酸、如(8)所述的核酸构建体，或者如(9)所述的重组表达载体。

(11)根据(10)所述的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞来源于埃希氏杆菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗维登斯菌属(Providencia)、肠道菌属(Enterobacteria)、沙门氏菌属(Salmonella)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、短杆菌属(Brevibacterium)或棒状杆菌属(Corynebacterium)的微生物；

优选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067菌株或上述任一种的衍生菌株。

(12)一种生物传感器，其中，所述生物传感器包含如(1)-(6)任一项所述的转录调控因子LysG的突变体，或者如(7)所述的多核苷酸、如(8)所述的核酸构建体、如(9)所述的重组表达载体或如(10)-(11)任一项所述的重组宿主细胞表达的多肽。

(13)根据(1)-(6)任一项所述的转录调控因子LysG的突变体，根据(7)所述的多核苷酸，根据(8)所述的核酸构建体，根据(9)所述的重组表达载体，或根据(10)-(11)任一项所述的重组宿主细胞在如下(a)-(d)至少一种中的用途：

(a)调控目标基因的转录水平，或制备用于调控目标基因的转录水平的试剂或试剂盒；

(b)生产碱性氨基酸，或制备用于生产碱性氨基酸的试剂或试剂盒；

(c)筛选碱性氨基酸高产菌株，或制备用于筛选碱性氨基酸高产菌株的试剂、试剂盒或生物传感器；

(d)筛选与碱性氨基酸合成相关的蛋白或蛋白编码基因，或制备用于筛选与碱性氨基酸合成相关的蛋白或蛋白编码基因的试剂、试剂盒或生物传感器；

可选地，所述碱性氨基酸为组氨酸、赖氨酸或精氨酸。

(14)一种调控目标基因表达的方法，其中，所述方法包括将根据(7)所述的多核苷酸与转录起始序列、目标基因可操作地连接的步骤；优选地，所述转录起始序列为具有LysG调控型启动子活性的多核苷酸。可选地，所述目标基因包括与碱性氨基酸合成相关的蛋白的编码基因、基因表达调控蛋白的编码基因、与膜转运相关的蛋白的编码基因中的至少一种。

(15)一种生产碱性氨基酸的方法，其中，所述方法包括在根据(1)-(6)任一项所述的转录调控因子LysG的突变体，根据(7)所述的多核苷酸，根据(8)所述的核酸构建体，根据(9)所述的重组表达载体存在的环境下生产碱性氨基酸的步骤；或者，所述方法包括利用根据(10)-(11)任一项所述的重组宿主细胞生产碱性氨基酸的步骤；

任选地，所述方法还包括分离或纯化所述碱性氨基酸的步骤。

(16)一种碱性氨基酸高产菌株的筛选方法，其中，所述方法包括使用根据(1)-(6)任一项所述的转录调控因子LysG的突变体，根据(7)所述的多核苷酸，根据(8)所述的核酸构建体，根据(9)所述的重组表达载体，根据(10)-(11)任一项所述的重组宿主细胞，或根据(12)所述的生物传感器筛选碱性氨基酸高产菌株的步骤。

(17)一种与碱性氨基酸合成相关的蛋白或蛋白编码基因的筛选方法，其中，所述方法包括使用根据(1)-(6)任一项所述的转录调控因子LysG的突变体，根据(7)所述的多核苷酸，根据(8)所述的核酸构建体，根据(9)所述的重组表达载体，根据(10)-(11)任一项所述的重组宿主细胞，或根据(12)所述的生物传感器筛选与碱性氨基酸合成相关的蛋白或蛋白编码基因的步骤。

发明的效果

在一些实施方式中，本公开提供的转录调控因子LysG的突变体，为转录调控因子LysG对Linker Helix区域突变后得到的突变体。与野生型的转录调控因子LysG相比，突变体对碱性氨基酸诱导响应的强度显著提高；突变体用于筛选碱性氨基酸高产菌株以及与碱性氨基酸合成相关的蛋白、蛋白编码基因突变，可有效提高碱性氨基酸高产菌株或与碱性氨基酸合成相关的蛋白或蛋白编码基因突变体的筛选灵敏度，对于构建碱性氨基酸高产菌株以及菌株的高通量筛选具有重要意义。

在一些实施方式中，本公开提供的转录调控因子LysG的突变体，由于其响应碱性氨基酸的强度和灵敏度提高，突变体对LysG调控型启动子的转录激活作用增强，利用LysG的突变体与受其调控的启动子可激活合成途径关键基因的表达，构建氨基酸高产菌株，有效提高目标氨基酸的产量。

在一些实施方式中，本公开提供的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体，可表达碱性氨基酸响应强度提高的转录调控因子LysG的突变体，用于碱性氨基酸高产菌株的高通量筛选，或用于提高氨基酸的产量。

在一些实施方式中，本公开提供的重组宿主细胞，包含转录调控因子LysG的突变体，或编码突变体的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体，可有效提高目标氨基酸的产量和转化率，实现对目标氨基酸的大规模工业化生产。

在一些实施方式中，本公开提供的生物传感器，其具有碱性氨基酸响应强度提高的转录调控因子LysG的突变体，生物传感器一方面筛选碱性氨基酸高产菌株或碱性氨基酸合成相关的蛋白编码基因的强度提高，能够实现高通量的工业化筛选，另一方面也可以用于碱性氨基酸合成代谢通路关键基因的表达调控，构建高效的碱性氨基酸高产菌株。

附图说明

图1示出了LysG的二聚体晶体结构及其Linker Helix区域示意图。

图2示出了LysG Linker Helix文库流式细胞仪分析结果，其中，A：对照菌株13032(pTRCmob)；B：对照菌株13032(pLysWT)；C：文库菌株13032(pLysWT^mut)。

图3示出了LysG及其突变体对三种碱性氨基酸二肽的诱导响应荧光值比较结果，其中，A：LysG及其突变体对赖氨酸-丙氨酸二肽的诱导响应荧光值比较；B：LysG及其突变体对精氨酸-丙氨酸二肽的诱导响应荧光值比较；C：LysG及其突变体对组氨酸-丙氨酸二肽的诱导响应荧光值比较。

图4示出了pLysWT和pLysJL48赖氨酸生物传感器对不同赖氨酸产量菌株的诱导响应荧光值比较。A:Control:ZPCgL1(pTRCmob+pXMJ19)；pXMJ19:ZPCgL1(pLysWT+pXMJ19)；PEPC-WT:ZPCgL1(pLysWT+pZPW54)；PEPC-D299N:ZPCgL1(pLysWT+pZPW55)；PEPC-N917G:ZPCgL1(pLysWT+pZPW56)；B:Control:ZPCgL1(pTrcmob+pXMJ19)；pXMJ19:ZPCgL1(pLysJL48+pXMJ19)；PEPC-WT:ZPCgL1(pLysJL48+pZPW54)；PEPC-D299N:ZPCgL1(pLysJL48+pZPW55)；PEPC-N917G:ZPCgL1(pLysWT+pZPW56)；C:发酵36h后不同菌株的胞外赖氨酸产量；D:不同菌株响应的平均荧光信号。

具体实施方式

定义

当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。

如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。

在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。

虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。

当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。

如本公开所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。

如本公开所使用的，术语“野生型的”指在自然界中可以找到的对象。例如，一种存在于生物体中，可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本公开所用的，“天然存在的”和“野生型的”是同义词。

如本公开所使用的，术语“转录调控因子”是一类可以控制DNA转录成RNA，即基因表达第一阶段的蛋白质。其通过特异性结合调控区域的DNA序列来调控靶基因的转录过程。在一些实施方式中，转录调控因子为转录调控因子LysG，转录调控因子LysG属于典型的LysR家族的转录调控因子，其N端存在与DNA结合的Helix-turn-helix motif(HTH)，C端存在与效应物结合的区域(Effector binding domain，EBD)，中间通过柔性Linker Helix连接。示例性的，与LysG结合的调控区域的DNA序列为碱性氨基酸转运蛋白LysE编码基因lysE的启动子序列，或其他任意类型的转录过程受LysG调控的启动子序列。

如本公开所使用的，术语“响应强度”是指在氨基酸的诱导作用下，转录调控因子起始目标基因转录的转录水平的高低。在一些实施方式中，通过在转录调控因子的下游连接荧光报告基因，检测在特定氨基酸的诱导作用下荧光信号的强度大小，实现对转录调控因子受特定氨基酸诱导的响应强度表征。

如本公开所使用的，术语“LysG调控型启动子”是指能与LysG结合，且其转录活性受LysG调控的启动子。在一些实施方式中，LysG调控型启动子不被具体限定，只要其活性受到LysG调控即可。示例性的，LysG调控型启动子可以是野性型lysE启动子，也包括对lysE启动子进行改造后仍然受LysG调控的启动子，也包括未知或未鉴定的受LysG调控的启动子。

在本公开中的转录调控因子LysG不被具体限定，只要其具有相应的转录调控活性即可。在一些实施方式中，LysG来源于棒状杆菌属的微生物，进一步的，LysG来源于谷氨酸棒状杆菌。示例性的，来源于谷氨酸棒杆菌的LysG具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列相比，具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性(包括这些数值之间所有范围和百分数)的序列。

如本公开所使用的，术语“突变体”是指相对于“野生型”，或者“相比较的”多核苷酸或多肽，在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的多核苷酸或多肽，其中，取代是指用不同的核苷酸或氨基酸置换占用一个位置的核苷酸或氨基酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸或氨基酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸或氨基酸之后添加核苷酸或氨基酸。

如本公开所使用的，术语“突变的氨基酸”，包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个的氨基酸”。在本公开中，术语“突变”是指氨基酸序列的改变。在一个具体的实施方式中，术语“突变”是指“取代”。

本公开中的转录调控因子LysG的突变体是对转录调控因子LysG的Linker Helix区突变后得到的突变体，且突变体具有与野生型的转录调控因子LysG相比，提高的碱性氨基酸的响应强度。进一步的，转录调控因子LysG的突变体在对应SEQ ID NO：1所示序列的57-89位的一个或多个位置处具有突变的氨基酸，上述位置属于转录调控因子LysG的Linker Helix区，对其中的一个或多个氨基酸进行突变后，突变体具有转录调控因子LysG的转录调控活性，且对碱性氨基酸(赖氨酸、组氨酸或精氨酸)的诱导响应的强度显著提高。在一些实施方式中，突变体在对应SEQ ID NO：1所示序列的57-89位的任意一个或多个位置处具有取代的氨基酸。

在本公开中，“突变”还可以包含在对应SEQ ID NO：1所示序列的一个或几个位置处不影响转录调控因子活性的添加、缺失或取代的氨基酸。众所周知，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换、添加或缺失某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性。示例性的，本公开的“突变”包含在对应SEQID NO：1所示序列的多肽的C端和N端至少一端的至少一个氨基酸残基的缺失或添加，且多肽具有转录调控因子活性。在一些实施方式中，本公开的“突变”对应如SEQ ID NO：1所示序列的多肽的N端起或C端起，缺失或添加1-15个氨基酸，优选1-10个，更优选1-6个，并且具有转录调控因子活性。

在一些实施方式中，本公开的“突变”可以选自“保守突变”。在本公开中，术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变。保守突变的代表性例子为保守置换。

如本公开所使用的，术语“保守置换”涉及用具有类似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，并且包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、和半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)、β-支链(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。

如本公开所使用的，“保守置换”通常在蛋白质的一个或多个位点上交换一种氨基酸。这种取代可以是保守的。作为被视作保守置换的置换，示例性的，可以举出Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。

如本公开所使用的，术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法(例如，使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。

如本公开所使用的，术语“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。

在一些实施方式中，当使用序列比较算法或通过目视检查测量以最大的对应性进行比较和比对时，两个或多个序列或子序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸的“序列同一性”或“同一性百分比”。在某些实施方式中，所述序列在任一或两个相比较的生物聚合物(例如，多核苷酸)的整个长度上基本相同。

本文所用的术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，例如，就“对应于序列1所示氨基酸序列的第150位的氨基酸残基”而言，如果在序列1所示氨基酸序列的一端加上6×His标签，那么所得突变体中对应于序列1所示氨基酸序列的第150位就可能是第156位。

如本公开所使用的，术语“表达”包括涉及RNA产生及蛋白产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

如本公开所使用的，术语“核酸构建体”是包含具有编码转录因子突变体多肽的多核苷酸的重组表达元件。在一些实施方式中，核酸构建体中还包括lysE基因的启动子。编码转录因子突变体多肽的多核苷酸与lysE基因的启动子“可操作地连接”，是指将编码转录因子突变体多肽的多核苷酸与lysE基因的启动子功能性连接，以启动和介导目标基因的转录，所述可操作地连接的方式可以采用本领域技术人员所述的任何方式。

如本公开所使用的，术语“载体”指的是DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列，从而在合适的宿主中表达目标基因。“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括，例如包含i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；ii)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要，并可以使用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本公开的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列，例如细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体，来自如牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。在本公开中，“重组表达载体”与“重组载体”可以互换地使用。

本公开中的术语“蛋白编码基因”是指能够通过一定的规则指导蛋白的合成DNA分子，蛋白编码基因指导蛋白合成的过程一般包括以双链DNA为模板的转录过程和以mRNA为模板的翻译过程。蛋白编码基因含有CDS序列(Coding Sequence)，能够指导编码蛋白质的mRNA的产生。

示例性的，蛋白编码基因为与碱性氨基酸合成相关蛋白的编码基因。

示例性的，蛋白编码基因可以为丙酮酸羧化酶基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因、γ-谷氨酰激酶基因、谷氨酸半醛脱氢酶基因、吡咯啉-5-羧酸还原酶基因、氨基酸运输蛋白基因、ptsG系统相关基因、丙酮酸脱氢酶基因、高丝氨酸脱氢酶基因、草酰乙酸脱羧酶基因、葡萄糖酸阻遏蛋白基因、葡萄糖脱氢酶基因、天冬氨酸激酶基因、天冬氨酸半醛脱氢酶基因、天冬氨酸氨裂合酶基因、二氢吡啶二羧酸合成酶基因、二氢吡啶甲酸还原酶基因、琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶基因、四氢吡啶二羧酸酯琥珀酰酶基因、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶基因、二氨基庚二酸差向异构酶基因、二氨基庚二酸脱酰基酶基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因、转酮酶基因、二氨基庚二酸脱氢酶基因、N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶基因、鸟氨酸乙酰转移酶基因、N-乙酰谷氨酸激酶基因、乙酰鸟氨酸转氨酶基因、鸟氨酸氨甲酰基转移酶基因、精氨基琥珀酸合成酶基因、精氨基琥珀酸裂解酶基因和氨甲酰基磷酸合成酶基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因、异柠檬酸脱氢酶基因、苹果酸脱氢酶基因、6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因、葡萄糖-6-磷酸异构酶基因和吡啶核苷酸转氢酶基因。

本公开中的术语“宿主细胞”意指易于用包含本公开的转录调控因子LysG的突变体，或包含编码突变体的多核苷酸、核酸构建体或重组表达载体的任何细胞类型。术语“重组宿主细胞”涵盖导入多核苷酸、核酸构建体或重组表达载体后不同于亲本细胞的宿主细胞，重组宿主细胞具体通过转化来实现。

本公开中的术语“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙沉淀法、氯化钙(CaCl₂)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。

本公开的宿主细胞可以是原核细胞，只要是能够包含本公开的转录调控因子LysG的突变体，或包含编码突变体的多核苷酸、核酸构建体或重组表达载体的细胞即可。在一些实施方式中，宿主细胞指来源于适合发酵生产氨基酸的微生物，包括但不限于可以包括埃希氏杆菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗维登斯菌属(Providencia)、肠道菌属(Enterobacteria)、沙门氏菌属(Salmonella)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)等的菌株。在一些实施方式中，宿主细胞为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067菌株或上述任一种的衍生菌株。在一些实施方式中，本公开中的宿主细胞还可以是具有氨基酸生产能力的其他类型的菌株，其包括野生型菌株和重组菌株。

示例地，宿主细胞为生产赖氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，对于生产赖氨酸的宿主细胞，可以是在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基础上表达解除反馈抑制的天冬氨酸激酶的菌株。此外，生产赖氨酸的宿主细胞也可以是具有赖氨酸生产能力的其他种类的菌株。

在一些实施方式中，所述生产赖氨酸的宿主细胞中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：

a.编码乙醇脱氢酶的adhE基因；

b.编码乙酸激酶的ackA基因；

c.编码磷酸乙酰转移酶的pta基因；

d.编码乳酸脱氢酶的ldhA基因；

e.编码甲酸转运蛋白的focA基因；

f.编码丙酮酸甲酸裂解酶的pflB基因；

g.编码丙酮酸氧化酶的poxB基因；

h.编码天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I双功能酶的thrA基因；

i.编码高丝氨酸激酶的thrB基因；

j.编码赖氨酸脱羧酶的ldcC基因；和

h.编码赖氨酸脱羧酶的cadA基因。

在一些实施方式中，所述生产赖氨酸宿主细胞中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：

a.编码解除赖氨酸反馈抑制的二氢二吡啶合成酶的dapA基因；

b.编码二氢二吡啶二羧酸还原酶的dapB基因；

c.编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因；

d.编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶的dapD和编码琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的dapE；

e.编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的asd基因；

f.编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因；

g.编码烟酸胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的pntAB基因；

i.编码赖氨酸的运输蛋白lysE基因。

在一些实施方式中，所述生产精氨酸的宿主细胞可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：

a)编码N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶argC基因；

b)编码鸟氨酸乙酰转移酶argJ基因；

c)编码N-乙酰谷氨酸激酶argB基因；

d)编码乙酰鸟氨酸转氨酶argD基因；

e)编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶argF基因；

f)编码精氨琥珀酸合成酶argG基因；

g)编码精氨琥珀酸裂解酶argH基因；

h)编码氨基甲酰磷酸合成酶基因。

在一些实施方式中，所述生产精氨酸的宿主细胞还可以包括编码精氨酸阻抑物调节argR基因的失活。

在一些实施方式中，所述生产组氨酸的宿主细胞可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：

a)编码L-组氨酸合成操纵子hisEG基因和hisDCB基因；

b)编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶zwf-opcA基因；

c)编码PRPP合成酶prsA基因；

在一些实施方式中，所述生产组氨酸的宿主细胞还可以包括降低出发菌中6-磷酸葡萄糖异构酶pgi基因的表达。

本公开的宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。

本公开的术语“氨基酸”或“L-氨基酸”是指其中氨基和羧基结合至相同碳原子的蛋白质的基本构成单元。示例性的，氨基酸选自如下的一种或多种：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸或上述的任一种的氨基酸的衍生物。此外，氨基酸也可以是本领域中其他种类的氨基酸。在本公开的具体实施方式中，所述碱性氨基酸为赖氨酸、组氨酸和精氨酸。

本公开的术语“培养”可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。

除非在本公开中另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

转录调控因子LysG的突变体

本公开对LysG的Linker Helix区(57位氨基酸到89位氨基酸)进行随机突变，获得了LysG的Linker Helix区域的突变体文库，发现突变体可以大幅提高生物传感器对赖氨酸、组氨酸和精氨酸的诱导响应强度，突变体可作为生物传感器应用于碱性氨基酸高产菌株的筛选；此外，进一步利用上述突变体及其调控的lysE基因启动子，可以用于强化氨基酸合成通路中关键基因的表达，提高氨基酸的合成和产量。

在一些实施方式中，突变体在对应SEQ ID NO：1所示序列的的一个或多个位置处具有突变的氨基酸，且突变体具有转录调控因子LysG的转录调控活性。本公开发现，在上述位置处的氨基酸突变后，与SEQ ID NO：1所示序列的野生型多肽相比，突变体响应赖氨酸、组氨酸和精氨酸的强度显著提高，可提高生物传感器筛选碱性氨基酸高产菌株或碱性氨基酸合成途径中关键基因的灵敏度、动态范围和操作等。

在一些更为具体的实施方式中，突变体在对应SEQ ID NO：1所示序列的57-89的任意一个或多个位置处具有取代的氨基酸，氨基酸取代后在维持LysG的转录调控活性的同时，可提高对碱性氨基酸的诱导响应的强度。

在一些实施方式中，突变体对应SEQ ID NO：1所示序列，具有如下任意一个或多个位置处的突变的氨基酸：第58位、第59位、第61位、第64位、第65位、第66位、第67位、第70位、第73位、第75位、第76位、第77位、第78位、第79位、第80位、第83位、第84位、第85位、第86位、第87位、第88位、第89位。

本公开发现，上述各位点的氨基酸残基的突变，都可以不同程度的提高LysG对碱性氨基酸的诱导响应强度。

在一些更为具体的实施方式中，突变体在上述的一个或多个位置处具有取代的氨基酸。本公开通过筛选突变体文库，发现上述位置处的氨基酸的取代对于提高对碱性氨基酸的诱导响应度具有积极影响。

在一些优选的实施方式中，突变体对应SEQ ID NO：1所示序列的至少1个、至少2个或至少3个位置处具有突变的氨基酸。示例性的，突变体在对应SEQ ID NO：1所示序列的第58位、第59位、第61位、第64位、第65位、第66位、第67位、第70位、第73位、第75位、第76位、第77位、第78位、第79位、第80位、第83位、第84位、第85位、第86位、第87位、第88位和第89位中的1个、2个、3个、4个、5个等等位置处包含突变。

在一些具体的实施方式中，突变体在对应SEQ ID NO：1所示序列的第58位、第59位、第61位、第64位、第65位、第66位、第67位、第70位、第73位、第75位、第76位、第77位、第78位、第79位、第80位、第83位、第84位、第85位、第86位、第87位、第88位和第89位中任意一个位置处具有氨基酸的取代。

在一些具体的实施方式中，突变体在对应SEQ ID NO：1所示序列的第59位和第80位同时具有氨基酸的取代。

在一些具体的实施方式中，突变体在对应SEQ ID NO：1所示序列的第61位和第78位具有氨基酸的取代。

在一些具体的实施方式中，突变体在对应SEQ ID NO：1所示序列的第64位和第87位具有氨基酸的取代。

在一些具体的实施方式中，突变体在对应SEQ ID NO：1所示序列的第67位和第79位具有氨基酸的取代。

在一些具体的实施方式中，突变体在对应SEQ ID NO：1所示序列的第67位和第77位具有氨基酸的取代。

在一些具体的实施方式中，突变体在对应SEQ ID NO：1所示序列的第77位、第78位和第83位具有氨基酸的取代。

在一些具体的实施方式中，突变体在对应SEQ ID NO：1所示序列的第77位、第79位和第83位具有氨基酸的取代。

在一些具体的实施方式中，突变体在对应SEQ ID NO：1所示序列的第77位、第80位和第84位具有氨基酸的取代。

在一些优选的实施方式中，突变体对应SEQ ID NO：1所示序列，具有如下(a₁)-(a₂₂)组成的组中任意一个位置处的突变的氨基酸，或任意两个以上的位置处的突变的氨基酸：

(a₁)E58V；

(a₂)A59S；

(a₃)E61K或E61V；

(a₄)V64A；

(a₅)Q65R；

(a₆)A66T；

(a₇)A67T或A67S；

(a₈)A70I；

(a₉)L73I；

(a₁₀)A75G；

(a₁₁)E76D、E76C、E76K或E76W；

(a₁₂)T77A；

(a₁₃)K78E或K78R；

(a₁₄)A79V、A79T或A79R；

(a₁₅)Q80R或Q80K；

(a₁₆)G83R；

(a₁₇)R84H；

(a₁₈)L85P、L85A、L85D、L85G、L85A、L85S、L85T或L85Y；

(a₁₉)A86R或A86D；

(a₂₀)E87G、E87D、E87R、E87N、E87H、E87K或E87S；

(a₂₁)I88V、I88T、I88A、I88N、I88G、I88H、I88K、I88P或I88S；

(a₂₂)P89Q。

在一些优选的实施方式中，突变体对应SEQ ID NO：1所示序列，具有(a₁)-(a₂₂)组成的组中的任意1个位置处的突变的氨基酸、任意2个位置处的突变的氨基酸或任意3个位置处的突变的氨基酸。在发生上述的氨基酸突变后，转录调控因子LysG的突变体可用于构建检测灵敏度提高的生物传感器，实现对碱性氨基酸高产菌株的高通量筛选；或是用于提高碱性氨基酸合成途径中关键基因的表达，提高碱性氨基酸的合成效率和产量。

在一些具体的实施方式中，突变体对应SEQ ID NO：1所示序列，具有如下所示(m₁)-(m₅₁)中任意一种所示的突变的氨基酸：

(m₁)E58V；(m₂)A59S和Q80R；(m₃)E61V；(m₄)E61K和K78E；

(m₅)V64A和E87D；(m₆)Q65R；(m₇)A66T；(m₈)A67T和A79V

(m₁₄)A75G；(m₁₅)E76D；(m₁₆)E76C；(m₁₇)E76K；(m₁₈)E76W

(m₁₉)T77A，K78R和G83R；(m₂₀)T77A；(m₂₁)A79V；(m₂₂)A79R；

(m₂₃)A79T和G83R；(m₂₄)Q80R；(m₂₅)Q80K和R84H；(m₂₆)L85P；

在发生上述的氨基酸突变后，转录调控因子LysG的突变体可用于构建检测灵敏度提高的生物传感器，实现对碱性氨基酸高产菌株的高通量筛选；或是用于提高碱性氨基酸合成途径中关键基因的表达，提高碱性氨基酸的合成效率和产量。

在一些实施方式中，转录调控因子LysG的突变体的N端和C端的至少一端缺失或添加至少一个氨基酸，优选1-15个氨基酸，优选1-10个，更优选1-6个氨基酸后，具有转录调控因子LysG的转录调控因子活性，以及提高的碱性氨基酸的响应强度。

在一些实施方式中，与上述任一种的转录调控因子LysG的突变体具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，且氨基酸序列不为SEQ ID NO：1所示序列的多肽，具有转录调控因子LysG的转录调控因子活性，以及提高的碱性氨基酸的响应强度。

在一些实施方式中，本公开中转录调控因子LysG的突变体，与SEQ ID NO：1所示序列的多肽相比，具有4.58倍、2.68倍、2.74倍、3.15倍、2.65倍、3.17倍、1.94倍、1.85倍、1.89倍、2.22倍、2.43倍、2.8倍、2.85倍、3.62倍、3.28倍、2.07倍、2.47倍、3.02倍、2.51倍、2.55倍、2.91倍、3.04倍、2.13倍、2.57倍、2.41倍、2.8倍、2.08倍、1.78倍、1.4倍、1.97倍、1.51倍、3.14倍、2.01倍、3.1倍、2.52倍、3.04倍、3.07倍、3.18倍、2.89倍、3.06倍、2.91倍、1.87倍、2.81倍、3.19倍、2.95倍、3.18倍、2.87倍、2.8倍、2.79倍、2.63倍、2.15倍、2.1倍、2.41倍、2.03倍、2.28倍、1.89倍的提高的碱性氨基酸的诱导响应强度。

在一些实施方式中，转录调控因子LysG的突变体由多核苷酸编码，本公开对多核苷酸的序列不进行具体限定，只要其能够编码得到上述任一种的具有转录调控因子活性的多肽即可。

突变体文库的构建和突变体筛选

在一些实施方式中，本公开以人工合成的eyfp基因(GeneBank No.AM774338.1)为模板，以eyfp-F和eyfp-R为引物，扩增eyfp基因片段；以谷氨酸棒状杆菌13032基因组为模板，利用lysGE-F/lysGE-R为引物，PCR扩增得到lysG及lysE基因的启动子区的片段；以pTRCmob为模板，以pTRCmob-rev-F/R为引物PCR扩增得到质粒骨架；将上述片段同源重组连接，得到重组表达载体pLysWT。

在一些实施方式中，本公开以含有赖氨酸生物传感器的表达载体pLysWT为模板，利用随机突变引物LysG-mut-F和LysG-mut-R通过易错PCR扩增得到不同突变率的LinkerHelix区域的编码基因片段；以pLysWT为模板，通过PCR反向扩增去除LysG的Linker Helix区域，得到线性化载体片段；将上述片段同源重组连接，得到包含不同突变率的基因片段的重组表达载体。

在一些实施方式中，将重组表达载体转化宿主细胞，得到突变的菌株文库。在一些更为具体的实施方式中，宿主细胞为C.glutamicum ATCC 13032的感受态细胞。在另外一些实施方式中，宿主细胞也可以是其他的细胞种类。

在一些实施方式中，本公开将载体pTRCmob和pLysWT分别转化ATCC 13032菌株，获得对照的重组宿主细胞13032(pTRCmob)和13032(pLysWT)。在碱性氨基酸(例如，赖氨酸)存在的环境下，对重组宿主细胞进行培养，然后对菌株文库进行荧光分选，获得与对照的重组宿主细胞相比荧光强度更高的目标重组宿主细胞，其中包含目标的转录调控因子LysG的突变体。

在一些实施方式中，本公开选取Linker Helix区域的部分位点进行饱和突变，设计了饱和突变文库引物，在引物上特定氨基酸位点引物NNS(N代表A/T/C/G四种碱基，S代表C/G两种碱基)。以含有赖氨酸生物传感器的载体pLysWT为模板，利用饱和突变文库引物进行反向扩增，得到饱和突变体文库质粒。

在一些实施方式中，将饱和突变体文库质粒转化宿主细胞，得到饱和突变的菌株文库。在一些更为具体的实施方式中，宿主细胞为C.glutamicum ATCC 13032的感受态细胞。在另外一些实施方式中，宿主细胞也可以是其他的细胞种类。

在一些实施方式中，本公开将载体pTRCmob和pLysWT分别转化ATCC 13032菌株，获得对照的重组宿主细胞13032(pTRCmob)和13032(pLysWT)。在碱性氨基酸(例如，赖氨酸)存在的环境下，对饱和突变的重组宿主细胞进行培养，然后对菌株文库进行荧光分选，获得与对照的重组宿主细胞相比荧光强度更高的目标重组宿主细胞，其中包含目标的转录调控因子LysG的突变体。

生物传感器

生物传感器的原理如下：作为诱导物的碱性氨基酸(例如，赖氨酸)浓度较低时，转录调控因子LysG不能与氨基酸结合。当碱性氨基酸达到一定浓度后，转录调控因子LysG与作为诱导物的碱性氨基酸(例如，赖氨酸)结合后，能够调控lysE基因启动子。因此，若lysE基因启动子的下游连接有荧光蛋白等报告基因后，可启动下游报告基因的表达，通过报告基因的荧光信号的强度可以评估碱性氨基酸的浓度高低，从而筛选氨基酸高产菌株。

在一些实施方式中，本公开利用转录调控因子LysG的突变体构建生物传感器，突变体具有大幅度提高的诱导响应强度，因此，其启动报告基因表达的荧光强度显著提高，使生物传感器的检测灵敏度大幅度提升。

在一些实施方式中，生物传感器用于筛选碱性氨基酸高产菌株，或用于筛选与碱性氨基酸合成相关的蛋白编码基因。其中，碱性氨基酸高产菌株为赖氨酸、精氨酸或组氨酸的高产菌株。本公开中的生物传感器，能够实现对碱性氨基酸高产菌株的高通量筛选。

在一些优选地实施方式中，碱性氨基酸高产菌株为赖氨酸高产菌株。

在一些实施方式中，生物传感器在如下的培养基条件下培养：CGXⅡ培养基，成分为：50g/L glucose，2g/L yeast extract,16.5g/L NH₄Cl，5g/L urea，1g/L KH₂PO₄，1g/LK₂HPO₄，42g/L MOPS，0.25g/L MgSO₄，0.01g/L FeSO₄·2H₂O，0.01g/L MnSO₄·H₂O，0.001g/L ZnSO₄·7H₂O，0.2mg/L CuSO₄，0.02mg/L NiCl₂·6H₂O，0.01g/L CaCl₂，0.03g/Lprotocatechuic acid，0.2mg/L biotin，0.1mg/L vitamin B1。培养基中含有25μg/mL卡那霉素以及不同浓度的赖氨酸-丙氨酸、精氨酸-丙氨酸或组氨酸-丙氨酸二肽(0mM、0.5mM、1.0mM、1.5mM、2mM、4mM、6mM和8mM)。30℃、800rpm培养10h，稀释一定倍数后，利用酶联标仪(SpectraMax M5，Molecular Devices，λexcitation＝488nm，λemission＝520nm)检测菌液的荧光值和OD₆₀₀。

目标氨基酸的生产过程

(1)将编码转录调控因子LysG的突变体的基因与LysG调控型启动子、与目标氨基酸合成相关的蛋白编码基因可操作地连接，得到能够表达与目标氨基酸合成相关蛋白的重组表达载体，利用重组表达载体转化宿主细胞，获得重组宿主细胞。

(2)对重组宿主细胞进行发酵培养，从重组宿主细胞或重组宿主细胞的培养液中收集目标化合物，完成目标化合物的生产过程。

上述生产过程中，由于转录调控因子LysG的突变体具有提高的诱导影响强度，其对LysG调控型启动子的转录调控作用增强，进而可提高与目标氨基酸合成相关的蛋白编码基因的表达水平，使目标化合物的产量显著提升。

在一些实施方式中，LysG调控型启动子为lysE基因启动子；在另外一些实施方式中，编码转录调控因子LysG的突变体的基因还可以与在LysG转录调控作用下起始转录过程的其他种类的启动子相连。

在一些实施方式中，目标氨基酸为L-氨基酸，与合成氨基酸相关的蛋白编码基因是指与合成L-氨基酸相关的蛋白编码基因。

示例性的，目标氨基酸包括如下的一种或两种以上的组合：赖氨酸、精氨酸、组氨酸或上述任一种的氨基酸的衍生物。

示例性的，与合成氨基酸相关的蛋白编码基因包括下述一种或两种以上的组合的酶的编码基因：丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、γ-谷氨酰激酶、谷氨酸半醛脱氢酶、吡咯啉-5-羧酸还原酶、氨基酸运输蛋白、ptsG系统、丙酮酸脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、草酰乙酸脱羧酶、葡萄糖酸阻遏蛋白、葡萄糖脱氢酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸氨裂合酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶甲酸还原酶、琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶、四氢吡啶二羧酸酯琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶、二氨基庚二酸差向异构酶、二氨基庚二酸脱酰基酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、转酮酶、二氨基庚二酸脱氢酶、N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶、鸟氨酸乙酰转移酶、N-乙酰谷氨酸激酶、乙酰鸟氨酸转氨酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、精氨基琥珀酸合成酶、精氨基琥珀酸裂解酶和氨甲酰基磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因、异柠檬酸脱氢酶基因、苹果酸脱氢酶基因、6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因、葡萄糖-6-磷酸异构酶基因和吡啶核苷酸转氢酶基因。

在一些优选的实施方式中，目标氨基酸为赖氨酸。

在一些具体的实施方式中，宿主细胞为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，谷氨酸棒杆菌是用于生产氨基酸、有机酸等目标化合物的重要菌株。

在一些具体的实施方式中，宿主细胞是经过如下改良的谷氨酸棒杆菌：谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组上天冬氨酸激酶(lysC基因编码)第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸。

在一些具体的实施方式中，目标氨基酸为赖氨酸，赖氨酸发酵培养基成分为：80g/Lglucose，8g/L酵母粉，9g/L尿素，1.5g/L K₂HPO₄，0.01g/L MnSO₄，0.6g/L MgSO₄，0.01g/LFeSO₄，42g/L MOPS，pH 7.2。

在一些具体的实施方式中，对于重组宿主细胞或重组细胞的培养液回收目标化合物，可通过本领域常用方法，包括但不限于：过滤、阴离子交换色谱、结晶或HPLC。

在本领域，用于操纵微生物的方法是已知的，如《分子生物学现代方法》(OnlineISBN：9780471142720,John Wiley and Sons,Inc.)、《微生物代谢工程：方法和规程》(Qiong Cheng Ed.,Springer)和《系统代谢工程：方法和规程》(Hal S.Alper Ed.,Springer)等出版物中被解释。

实施例

本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

实施例1.LysG的Linker Helix随机突变库的构建及流式细胞仪分选

根据文献(Della Corte,D.,et al.(2020)Engineering and application of abiosensor with focused ligand specificity.Nature Communications,11.)报道的晶体结构，我们首先找到了Linker Helix区，位于LysG蛋白氨基酸序列的第57位-89位(如图1所示)。

(1)赖氨酸生物传感器表达载体pLysWT构建

根据已报道的eyfp基因序列信息(GeneBank No.AM774338.1)做全基因合成，利用eyfp-F和eyfp-R引物PCR扩增得到eyfp基因片段，以谷氨酸棒状杆菌13032基因组为模板，利用lysGE-F/lysGE-R为引物PCR扩增得到lysG及lysE基因的启动子区的片段，以pTRCmob为模板，利用pTRCmob-rev-F/R为引物PCR扩增得到质粒骨架，上述片段纯化回收后重组连接，获得重组载体pLysWT。

(2)LysG的Linker Helix随机突变库的构建

根据LysG的蛋白晶体结构(PDB:6XTU)，锁定其Linker Helix区域(从57氨基酸到89位氨基酸)，对该区域设计随机突变引物LysG-mut-F/R，以含有赖氨酸生物传感器的载体pLysWT为模板，添加0.05mM到0.5mM的MnCl₂，易错PCR扩增得到不同突变率的Linker Helix片段；同时以引物LysG-rev-F/R，以含有赖氨酸生物传感器载体pLysWT为模板，PCR反向扩增去除LysG的linker helix。Dpn I处理去除模板质粒回收后，利用重组酶连接以上两片段，化学转化入E.coli DH5α中，37℃培养。次日，从平板上刮下菌落，提取不同突变率的质粒，不同突变率的质粒按照等摩尔比例混合后，电脉冲转化入菌株C.glutamicum ATCC13032的感受态细胞中，30℃复筛2h后，将复苏液转接含有25μg/mL卡那霉素的TSB液体培养基，30℃培养16h后得到文库菌株13032(pLysWT^mut)。

实施例2.LysG突变库流式细胞仪分选

根据赖氨酸生物传感器的响应原理，当胞内的赖氨酸浓度较低时，调控蛋白LysG不能与赖氨酸结合，从而不能通过调控lysE启动子启动荧光蛋白基因的转录；当胞内的赖氨酸达到一定浓度后，调控蛋白LysG与赖氨酸结合，从而使LysG的构象发生变化，进而与LysE的启动子结合，启动下游报告基因黄色荧光蛋白的表达。不同LysG的突变体对赖氨酸的诱导响应强度不一样，荧光蛋白的表达强度就不一样。基于此原理，我们对LysG的LinkerHelix区域随机突变文库进行了筛选。首先将阴性对照菌株13032(pTRCmob)、13032(pLysWT)和文库菌株13032(pLysWT^mut)接入含有25μg/mL卡那霉素的TSB液体培养基，30℃培养8h后，转接添加0.8M赖氨酸的CGXⅡY培养基(50g/L glucose,2g/L yeast extract,16.5g/L NH₄Cl,5g/L urea,1g/L KH₂PO₄,1g/L K₂HPO₄,42g/L MOPS,0.25g/L MgSO₄,0.01g/L FeSO₄·2H₂O,0.01g/L MnSO₄·H₂O,0.001g/L ZnSO₄·7H₂O,0.2mg/L CuSO₄,0.02mg/LNiCl₂·6H₂O,0.01g/L CaCl₂,0.03g/L protocatechuic acid,0.2mg/L biotin,and0.1mg/L vitamin B1)，30℃培养6h后，利用PBS缓冲液将菌体浓度稀释到0.1OD₆₀₀。利用流式细胞仪对上述菌株的荧光强度进行分析，分析结果如图-2所示，以13032(pLysWT)为参比，选定文库菌株的流式细胞仪分选区域，文库菌株13032(pLysWT^mut)的Gate R15区域含有0.12％的荧光增强的细胞，该区域可能含有对赖氨酸诱导响应强度增强的突变体，因此我们对该区域的细胞进行了分选。

实施例3.LysG突变库复筛

将实施例2中经过流式细胞仪初筛得到的单细胞菌落，随机挑取88个单克隆，利用牙签挑取接入装有200μL TSB液体培养基(含有25μg/mL卡那霉素)的96孔板中，同时接入对照菌株13032(pTRCmob)和13032(pLysWT)，在孔板摇床中30℃、800rpm中培养8h。将种子液按照5％(V/V)转接至含有200μL CGXⅡY培养基(添加25μg/mL卡那霉素)的96孔板中，同时分别添加0M或者0.8M的赖氨酸，在孔板摇床中30℃、800rpm培养12h后，利用PBS缓冲液将菌液稀释20倍后，利用酶联标仪(SpectraMax M5,Molecular Devices,λexcitation＝488nm,λemission＝520nm)检测eYFP的荧光强度和OD₆₀₀，将得到的荧光值比对照菌株13032(pLysWT)强的突变体送测序，分析其突变位点。得到的结果如表-1所示，氨基酸残基从E58到P89皆有突变，且突变后可以不同程度的提高LysG对赖氨酸的诱导响应强度，其中E58突变成V，使其诱导相应强度提高的最多，且突变位点基本上覆盖了整个Linker Helix区域(图-1)。该结果表明LysG的Linker Helix区域的突变可以大幅提高赖氨酸生物传感器对赖氨酸的诱导响应强度。

表1 LysG的Linker Helix区域突变体信息汇总

a＝LysG突变体传感器诱导时的荧光值/LysG野生型生物传感器诱导时的荧光值；

b＝LysG突变体传感器诱导时的荧光值/LysG突变体传感器不诱导时的荧光值。

实施例4LysG的Linker Helix区域氨基酸饱和突变体文库构建及筛选

(1)LysG的Linker Helix区域氨基酸饱和突变体文库构建

选取部分位点进行饱和突变，以验证Linker Helix区域突变为不同氨基酸也具有增强的效果。根据pLysWT的序列信息，分别设计了L73、A75、E76、A79、L85、A86、E87和I88位氨基酸残基的饱和突变文库引物L73-F/L73-R、A75-F/A75-R、E76-F/E76-R、A79-F/A79-R、L85-F/L85-R、A86-F/A86-R、E87-F/E87-R和I88-F/I88-R，在引物上特定氨基酸位点引物NNS(N代表A/T/C/G四种碱基，S代表C/G两种碱基)，以含有赖氨酸生物传感器的载体pLysWT为模板，分别PCR反向扩增全长质粒，Dpn I处理载体片段PCR产物去除模板质粒，回收后将不同位点的饱和突变体文库PCR产物，按照等摩尔比例混合后，转化入E.coli DH5α感受态细胞。次日提取文库质粒，电脉冲转化入C.glutamicum 13032，得到饱和突变文库菌株C.glutamicum 13032(pLysWT^Sat-mut)。

(2)LysG的linker helix区域氨基酸饱和突变体文突变库流式细胞仪分选

利用和实施例2中相同的筛选原理，首先将阴性对照菌株13032(pTRCmob)、13032(pLysWT)和文库菌株13032(pLysWT^Sat-mut)接入含有25μg/mL卡那霉素的TSB液体培养基，30℃培养8h后，转接添加0.8M赖氨酸的CGXⅡY培养基(50g/L glucose,2g/L yeast extract,16.5g/L NH₄Cl,5g/L urea,1g/L KH₂PO₄,1g/L K₂HPO₄,42g/L MOPS,0.25g/LMgSO₄,0.01g/LFeSO₄·2H₂O,0.01g/L MnSO₄·H₂O,0.001g/L ZnSO₄·7H₂O,0.2mg/LCuSO₄,0.02mg/LNiCl₂·6H₂O,0.01g/L CaCl₂,0.03g/L protocatechuic acid,0.2mg/L biotin,and0.1mg/L vitamin B1)，30℃培养6h后，利用PBS缓冲液将菌体浓度稀释到0.1OD₆₀₀。利用流式细胞仪对上述菌株的荧光强度进行分析，并对文库中荧光值比对照菌株13032(pLysWT)强的部分进行了分选。

(3)LysG突变库复筛

将前面中经过流式细胞仪初筛得到的单细胞菌落，随机挑取94个单克隆，利用牙签挑取接入装有200μL TSB液体培养基(含有25μg/mL卡那霉素)的96孔板中，同时接入对照菌株13032(pTRCmob)和13032(pLysWT)，在孔板摇床中30℃、800rpm中培养8h。将种子液按照5％(V/V)转接至含有200μL CGXⅡY培养基(添加25μg/mL卡那霉素)的96孔板中，同时分别添加0M或者0.8M的赖氨酸，在孔板摇床中30℃、800rpm培养12h后，利用PBS缓冲液将菌液稀释20倍后，利用酶联标仪(SpectraMax M5,Molecular Devices,λexcitation＝488nm,λemission＝520nm)检测eYFP的荧光强度和OD₆₀₀，将得到的荧光值比对照菌株13032(pLysWT)强的突变体送测序，分析其突变位点。得到的结果如表2所示，除了L75位氨基酸之筛选到一个突变体外，其余L73、E76、A79、L85、A86、E87和I88位氨基酸残基皆筛选到突变成不同的氨基酸的突变体，且皆有助于提高其响应的荧光强度，尤其是L85和I88位氨基酸分别突变体成8种和9种不同的氨基酸。

表2 LysG突变体信息汇总

实施例5.LysG突变体对组氨酸和精氨酸的响应

为了测试LysG LH的突变体对三种碱性氨基酸的诱导响应情况，首先将菌株13032(pTRCmob)、13032(pLysWT)、13032(pLysWT^Glu58Val)和13032(pLysWT^Gln80Arg)接入含有1mLTSB(含有25μg/mL卡那霉素)的24孔板中，30℃、800rpm培养8h后，将种子液按照初始OD 0.5转接含有200μL CGXⅡ(含25μg/mL卡那霉素)的96孔板中，并分别添加0mM、0.5mM、1.0mM、1.5mM、2mM、4mM、6mM和8mM的赖氨酸-丙氨酸、精氨酸-丙氨酸或组氨酸-丙氨酸二肽，30℃、800rpm培养10h后，稀释一定倍数后，利用酶联标仪(SpectraMax M5,Molecular Devices,λexcitation＝488nm,λemission＝520nm)检测菌液的荧光值和OD₆₀₀。检测结果如图-3所示，可以看到对于赖氨酸诱导响应强度提高的突变体，对精氨酸和组氨酸的诱导响应也明显提高。

实施例6.LysG Linker Helix突变的生物传感器在氨基酸高产菌筛选中的应用

(1)pepc基因表达载体构建

为了检测LysG Linker Helix突变的生物传感器pLysJL48(pLysWT^E58V)相对于野生型生物传感器pLysWT是否具有筛选优势。首先我们构建了几个不同赖氨酸产量的菌株，有文献报道在谷氨酸棒状杆菌中过表达解除了L-天冬氨酸和苹果酸反馈抑制的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC)可以提高赖氨酸产量，通过文献挖掘找到两个PEPC的突变体，它们分别为D299N(Yokota,A.,et al.(2017)BoostingAnaplerotic Reactions by Pyruvate Kinase Gene Deletion andPhosphoenolpyruvate Carboxylase Desensitization for Glutamic Acid and LysineProduction in Corynebacterium glutamicum.Advances in biochemical engineering/biotechnology,159,181-198.)和N917G(Chen,Z.,et al.(2014)Deregulation offeedback inhibition of phosphoenolpyruvate carboxylase for improved lysineproduction in Corynebacterium glutamicum.Applied and environmentalmicrobiology,80,1388-1393.)，过表达这两个突变体后赖氨酸产量分别提高了15％和37％。

根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，设计引物pepc-tac-F/R，以ATCC13032基因组为模板，通过PCR扩增获得pepc gene。另外设计引物pXMJ19-rev-2F/2R，以质粒pXMJ19为模板，通过PCR反向扩增获得线性化载体片段，Dpn I处理载体片段PCR产物去除模板质粒，回收后，利用重组酶连接以上两片段，化学转化入E.coli DH5α感受态细胞中，获得pepc基因的表达载体pXMJ19-pepc，命名为pZPW54。

(2)pepc基因突变载体构建

pepc^D299N或者pepc^N917G表达载体构建，设计引物D299N-F/R(或N917G-F/R)，以质粒pZPW54为模板，反向扩增全长质粒，Dpn I处理载体片段PCR产物去除模板质粒，回收后转入E.coli DH5α感受态细胞，获得的pepc^D299N或者pepc^N917G表达载体分别命名为pZPW55和pZPW56。

(3)基因组pepc基因敲除菌株构建

据文献中公开的赖氨酸菌株构建方法(Becker,J.,Zelder,O.,

S.,

H.and Wittmann,C.(2011)From zero to hero--design-based systemsmetabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for L-lysineproduction.Metab.Eng.,13,159-168.)，利用基于pK18mobsacB的同源重组技术将谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组上天冬氨酸激酶(lysC基因编码)第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸，构建获得一株具有一定赖氨酸合成能力的菌株SCgL30。同时为了排除基因组表达的PEPC与载体上过表达的PEPC突变体之间的相互干扰，我们利用文献中报道的CRISPR-Cas9敲除方法(Liu,J.,et al.(2017)Development of a CRISPR/Cas9 genome editingtoolbox for Corynebacterium glutamicum.Microbial cell factories,16,205.)，将SCgL30的pepc基因敲除，敲除的过程如下：首先构建敲除质粒pgRNA-Δpepc，根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，分别设计引物pepc-up-F/R和pepc-down-F/R，以ATCC13032基因组为模板，通过PCR扩增获得用于pepc基因的上游和下游同源臂片段；同时以pgRNA2为模板，引物pepc-pgRNA-2/pepc-pgRNA-3，PCR扩增骨架片段1；以pgRNA2为模板，gRNA-pepc/pepc-pgRNA-1为引物扩增带有pepc-sgRNA(N20,5′-CGTGCGGGATCAGCGGACGA-3′)的骨架片段2。将上述片段纯化回收后，利用重组酶连接以上四片段，得到pepc基因敲除质粒pgRNA-Δpepc。

将质粒pCas9和pgRNA-Δpepc，通过电脉冲方法共同转化入菌株SCgL30的感受态细胞，加入1mL 46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6min，30℃孵育3h，涂布含有50μM IPTG+25μg/mL卡那霉素+5μg/mL氯霉素的TSB固体培养基，30℃培养2天，获得重组的转化子，利用验证引物pepc-TF/TR验证转化子，确认菌株染色体上的目标基因被成功敲除，然后通过37℃高温丢质粒，获得基因敲除菌株SCgL30(△pepc)，命名为ZPCgL1。

(4)LysG突变体在赖氨酸高产菌株筛选中的应用

首先，分别将pLysWT或者pLysJL48(pLysWT^E58V)转化ZPCgL1菌株，获得重组菌株ZPCgL1(pLysWT)和ZPCgL1(pLysJL48)。然后分别将表达载体pXMJ19、pZPW54、pZPW55和pZPW56转化上述重组菌株，分别得到测试菌株ZPCgL1(pTRCmob+pXMJ19)、ZPCgL1(pLysWT+pXMJ19)、ZPCgL1(pLysWT+pZPW54)、ZPCgL1(pLysWT+pZPW55)和ZPCgL1(pLysWT+pZPW56)以及ZPCgL1(pLysJL48+pXMJ19)、ZPCgL1(pLysJL48+pZPW54)、ZPCgL1(pLysJL48+pZPW55)和ZPCgL1(pLysJL48+pZPW56)。

为了测试LysG Linker Helix突变的生物传感器pLysJL48相对于野生型生物传感器pLysWT对不同产量的赖氨酸菌株的诱导响应情况。首先将上述测试菌株接入含有1mLTSB(添加25μg/mL卡那霉素和5μg/mL氯霉素)的24孔板中，孔板摇床中30℃、800rpm培养8h后，按初始OD₆₀₀ 0.5，转接含有1mL CGXⅡ培养基的24孔板中，30℃、800rpm孔板摇床中培养。CGXⅡY培养基成分为：80g/L glucose,16.5g/L NH₄Cl,5g/L urea,1g/L KH₂PO₄,1g/LK₂HPO₄,42g/L MOPS,0.25g/L MgSO₄,0.01g/L FeSO₄·2H₂O,0.01g/LMnSO₄·H₂O,0.001g/LZnSO₄·7H₂O,0.2mg/L CuSO₄,0.02mg/L NiCl₂·6H₂O,0.01g/LCaCl₂,0.03g/Lprotocatechuic acid,0.2mg/L biotin,and 0.1mg/L vitamin B1，并添加25μMIPTG、25μg/mL的卡那霉素和5μg/mL的氯霉素。培养6h后，检测菌液的OD₆₀₀，利用PBS缓冲液将菌体浓度稀释到0.1OD₆₀₀。利用流式细胞仪对这些菌株的响应荧光强度进行分析，分析结果如图4所示。其中A图是ZPCgL1(pLysWT)菌株分别转入空质粒pXMJ19、pepc-WT及pepc突变体表达载体的流式细胞分析结果；B图是ZPCgL1(pLysJL48)菌株分别转入空质粒pXMJ19、pepc-WT及pepc突变体表达载体的流式细胞分析结果；C图是不同菌株的胞外赖氨酸产量，D图是不同菌株的荧光数据。从数据中可以看出，不同菌株赖氨酸产量有一定的差异，随着赖氨酸产量的提升，胞内荧光信号也逐渐提高。相对于野生型LysG，突变后的响应系统不但增强了同一菌株中的荧光信号强度，而且放大了不同赖氨酸生产菌株的信号差异强度，更有利于快速筛选出高产菌株。

实施例7.谷氨酸棒杆菌染色体lysG基因突变载体构建

根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，分别设计引物lysG-up-F、lysG-A66T/L73I/E76D-F和lysG-A66T/L73I/E76D-R、lysG-down-R，以ATCC13032基因组为模板，通过PCR扩增获得用于lysG突变的上游和下游同源臂片段(其中分别为lysG基因A66T/L73I/E76D突变体)。另外设计引物lysG-up-F/R和lysG-down-F/R，分别以质粒JL-32(即pLysWT^Glu61Val)为模板扩增E61V突变体的上游和下游同源臂片段，以质粒JL-33(即pLysWT^GLn80Arg)为模板扩增Q80R突变体的上游和下游同源臂片段，以质粒C2-80(即pLysWT^Leu85Ser)为模板扩增L85S突变体的上游和下游同源臂片段，以质粒JL-47(即pLysWT^GLu87Gly)为模板扩增E87G突变体的上游和下游同源臂片段，以质粒C1-57(pLysWT^Ile88Ala)为模板扩增I88A突变体的上游和下游同源臂片段。上述PCR片段回收后，与EcoR I和BamH I酶切处理的pK18mobsacB载体进行重组连接，获得lysG基因的突变载体pK18-lysG-A66T/L73I/E76D/E61V/Q80R/L85S/E87G/I88A。

实施例8.谷氨酸棒杆菌lysG基因突变菌株构建

由于野生型谷氨酸棒杆菌不能生产赖氨酸，而在谷氨酸棒杆菌引入lysC、pyc和hom的点突变之后都可以生产赖氨酸。本实施例以ATCC 13032为出发菌株，首先构建一个产赖氨酸的菌株，即在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032菌株天冬氨酸激酶基因lysC引入了T311I点突变(解除酶的反馈抑制)，在丙酮酸羧化激酶基因pyc引入P458S点突变(解除酶的反馈抑制)，在高丝氨酸脱氢酶基因hom引入V59A点突变(弱化酶的活性)，获得赖氨酸高产菌株AHP-3(Becker,J.,Zelder,O.,

S.,

H.and Wittmann,C.(2011)From zeroto hero--design-based systems metabolic engineering of Corynebacteriumglutamicum for L-lysine production.Metab.Eng.,13,159-168..)。采用文献报道的方法制备感受态细胞(Ruan Y,Zhu L,Li Q.Improving the electro-transformationefficiency of Corynebacterium glutamicum by weakening its cell wall andincreasing the cytoplasmic membrane fluidity.Biotechnol Lett.2015；37:2445-2452.)，得到谷氨酸棒杆菌AHP-3的感受态细胞，向上述制备获得的AHP-3感受态细胞电转化1μg上述突变载体，加入1mL 46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6min，30℃孵育3h，涂布含有25μg/mL卡那霉素的TSB固体培养基，30℃培养2天，获得第一次重组的转化子。(TSB培养基成份为(g/L)：葡萄糖，5g/L；酵母粉，5g/L；大豆蛋白胨，9g/L；尿素，3g/L；丁二酸，0.5g/L；K₂HPO₄·3H₂O，1g/L；MgSO₄·7H₂O，0.1g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1mg/L；MOPS，20g/L)正确转化子转接TSB培养基过夜培养，然后转接含有100g/L蔗糖的TSB培养基，30℃培养6h后涂布于添加100g/L蔗糖的TSB培养基进行筛选，获得lysG突变的菌株SCgL55-SCgL62，对应的LysG突变体分别为E61V、A66T、L73I、E76D、Q80R、L85S、E87G和I88A。

实施例9.谷氨酸棒杆菌lysG基因突变体对L-赖氨酸合成的影响

为了测试谷氨酸棒杆菌lysG基因突变体对菌株产赖氨酸的影响，分别对SCgL55-SCgL62菌株进行发酵测试。以野生型AHP-3菌株作对照，发酵培养基成份为：葡萄糖80g/L、酵母粉8g/L、尿素9g/L、K₂HPO₄ 1.5g/L、MOPS 42g/L、FeSO₄ 0.01g/L、MnSO₄ 0.01g/L、MgSO₄0.6g/L，pH 7.2。首先将菌株接种到TSB液体培养基中培养8h，培养物作为种子接种到每孔含有800μL发酵培养基的24孔板中，初始OD₆₀₀控制约为0.1，30℃培养21h，孔板摇床转速为800rpm，每个菌株3个平行，发酵结束后检测L-赖氨酸产量和葡萄糖消耗量，并计算从葡萄糖到赖氨酸的糖酸转化率。

结果如表2所示，L-赖氨酸产量都高于野生型对照菌株，并且糖酸转化率都有所提高。可见，这些氨基酸位点突变在L-赖氨酸及其衍生物生产中具有较好的应用前景。

表2

菌株	突变体	OD<sub>600</sub>	L-赖氨酸(g/L)	糖酸转化率(g/g，％)
					AHP-3	WT	12.38±0.65	1.78±0.02	2.70±0.04
SCgL55	E61V	12.10±0.37	2.38±0.08	3.64±0.09
					SCgL56	A66T	12.12±0.36	1.93±0.04	2.97±0.05
SCgL57	L73I	12.02±0.39	2.03±0.03	3.09±0.04
					SCgL58	E76D	12.66±0.22	2.01±0.05	3.12±0.02
SCgL59	Q80R	12.16±0.31	2.05±0.05	3.19±0.08
					SCgL60	L85S	12.35±0.17	2.00±0.00	3.15±0.00
SCgL61	E87G	12.63±0.22	2.03±0.03	3.16±0.00
					SCgL62	I88A	12.45±0.35	2.08±0.03	3.34±0.07

本公开实施例中所用的引物见下表3：

本说明书公开的所有技术特征都可以任何组合方式进行组合。本说明所公开的每个特征也可以被其它具有相同、相等或相似作用的特征所替换。因此，除非特殊说明，所公开的每一特征仅仅是一系列相等或相似特征的实例。

此外，从上述描述中，本领域技术人员可从本公开中很容易清楚本公开的关键特征，在不脱离本公开的精神及范围的情况下，可对发明进行很多修改以适应各种不同的使用目的及条件，因此这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种转录调控因子LysG的突变体及其应用

<130> 6A17-2173364I

<160> 55

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 290

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 1

Met Asn Pro Ile Gln Leu Asp Thr Leu Leu Ser Ile Ile Asp Glu Gly

1 5 10 15

Ser Phe Glu Gly Ala Ser Leu Ala Leu Ser Ile Ser Pro Ser Ala Val

20 25 30

Ser Gln Arg Val Lys Ala Leu Glu His His Val Gly Arg Val Leu Val

35 40 45

Ser Arg Thr Gln Pro Ala Lys Ala Thr Glu Ala Gly Glu Val Leu Val

50 55 60

Gln Ala Ala Arg Lys Met Val Leu Leu Gln Ala Glu Thr Lys Ala Gln

65 70 75 80

Leu Ser Gly Arg Leu Ala Glu Ile Pro Leu Thr Ile Ala Ile Asn Ala

85 90 95

Asp Ser Leu Ser Thr Trp Phe Pro Pro Val Phe Asn Glu Val Ala Ser

100 105 110

Trp Gly Gly Ala Thr Leu Thr Leu Arg Leu Glu Asp Glu Ala His Thr

115 120 125

Leu Ser Leu Leu Arg Arg Gly Asp Val Leu Gly Ala Val Thr Arg Glu

130 135 140

Ala Asn Pro Val Ala Gly Cys Glu Val Val Glu Leu Gly Thr Met Arg

145 150 155 160

His Leu Ala Ile Ala Thr Pro Ser Leu Arg Asp Ala Tyr Met Val Asp

165 170 175

Gly Lys Leu Asp Trp Ala Ala Met Pro Val Leu Arg Phe Gly Pro Lys

180 185 190

Asp Val Leu Gln Asp Arg Asp Leu Asp Gly Arg Val Asp Gly Pro Val

195 200 205

Gly Arg Arg Arg Val Ser Ile Val Pro Ser Ala Glu Gly Phe Gly Glu

210 215 220

Ala Ile Arg Arg Gly Leu Gly Trp Gly Leu Leu Pro Glu Thr Gln Ala

225 230 235 240

Ala Pro Met Leu Lys Ala Gly Glu Val Ile Leu Leu Asp Glu Ile Pro

245 250 255

Ile Asp Thr Pro Met Tyr Trp Gln Arg Trp Arg Leu Glu Ser Arg Ser

260 265 270

Leu Ala Arg Leu Thr Asp Ala Val Val Asp Ala Ala Ile Glu Gly Leu

275 280 285

Arg Pro

290

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 2

gcccttagtg actcgaattc ctaaggccgc aatccctc 38

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 3

tcttaaagtt catctattac ggtccgatgg acagtaaaag a 41

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 4

gtaatagatg aactttaaga aggagatata catatggtga gcaagggcga g 51

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 5

cagcggccgc tactagttta ttacttgtac agctcgtcca tg 42

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 6

taaactagta gcggccgctg 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 7

gaattcgagt cactaagggc ta 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 8

cccttagtga ctcgaattcc ta 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 9

taaagctctc gagcatcacg tg 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 10

cgtgatgctc gagagcttta 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 11

ggaattcgag tcactaaggg 20

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 12

tttctgcttg snncaacacc attttccgcg ctgctt 36

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 13

aatggtgttg nnscaagcag aaactaaagc gcaactatct gga 43

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 14

ctttagtttc snnttgcagc aacaccattt tccgc 35

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 15

gttgctgcaa nnsgaaacta aagcgcaact atctggacgc c 41

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 16

gcgctttagt snntgcttgc agcaacacca ttttcc 36

<210> 17

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 17

gctgcaagca nnsactaaag cgcaactatc tggacgcc 38

<210> 18

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 18

cagatagttg snntttagtt tctgcttgca gcaacacc 38

<210> 19

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 19

agaaactaaa nnscaactat ctggacgcct tgctgaaat 39

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 20

ggatttcagc snngcgtcca gatagttgcg ctttag 36

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 21

atctggacgc nnsgctgaaa tcccgttaac catcg 35

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 22

acgggatttc snnaaggcgt ccagatagtt gcgct 35

<210> 23

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 23

tggacgcctt nnsgaaatcc cgttaaccat cgccatc 37

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 24

ttaacgggat snnagcaagg cgtccagata gttgcg 36

<210> 25

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 25

acgccttgct nnsatcccgt taaccatcgc catcaac 37

<210> 26

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 26

tggttaacgg snnttcagca aggcgtccag atagttgc 38

<210> 27

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 27

ccttgctgaa nnsccgttaa ccatcgccat caacg 35

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 28

aggtaacgac cacgtagctt gc 22

<210> 29

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 29

aaagagtgtt taaagtagtt tccagccggc tgggtagt 38

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 30

aactacttta aacactcttt cacattgagg 30

<210> 31

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 31

cagttattgg tgcccttcga gaccagagtc cgtcaagaac ttc 43

<210> 32

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 32

cgtgcgggat cagcggacga gttttagagc tagaaatagc aag 43

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 33

cgcttccttt agcagccctt g 21

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 34

gtagaaagcc agtccgcaga aacg 24

<210> 35

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 35

gattccaaac cgagcaccac tgaattacac tgtacctgtt gcgtc 45

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 36

cgagcatgaa gcccatcatt 20

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 37

gacgcagaga agcagatcgt t 21

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 38

actctagagg atccccgggt ac 22

<210> 39

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 39

agtcatatgt atatctcctt cctgcaggca tgcaagctt 39

<210> 40

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 40

aaggagatat acatatgact gattttttac gcgatgac 38

<210> 41

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 41

acccggggat cctctagagt cctttgccgt ttgagaaccc 40

<210> 42

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 42

tgcgctgcgc ggctccggct agtccagccg g 31

<210> 43

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 43

actagccgga gccgcgcagc gcagtggaaa ga 32

<210> 44

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 44

cagcctgtcg aaccgcatga ataaggtcac ccc 33

<210> 45

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 45

tattcatgcg gttcgacagg ctgagctcat gct 33

<210> 46

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 46

gagctcggta cccggggatc ccaacagcct tgattcactc aacaac 46

<210> 47

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 47

atgctcgaga gctttaacgc gctgactcac cgccga 36

<210> 48

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 48

ttccgcgctg tttgcacaag gacttcacc 29

<210> 49

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 49

tctgcttgga tcaacaccat tttccgcgc 29

<210> 50

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 50

gctttagtgt ctgcttgcag caacaccat 29

<210> 51

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 51

ttgtgcaaac agcgcggaaa atggtgttg 29

<210> 52

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 52

tggtgttgat ccaagcagaa actaaagcg 29

<210> 53

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 53

tgcaagcaga cactaaagcg caactatct 29

<210> 54

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 54

tcggcggtga gtcagcgcgt taaagctctc gagcatcacg t 41

<210> 55

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 55

cgacggccag tgccaagctt ctaaggccgc aatccctcg 39

Claims

1.一种转录调控因子LysG的突变体，所述突变体具有位于Linker Helix区的一个或多个突变的氨基酸；并且，与野生型的转录调控因子LysG相比，所述突变体具有提高的碱性氨基酸响应强度。

2.根据权利要求1所述的转录调控因子LysG的突变体，其中，所述突变体选自如下(i)-(iii)组成的组中的任一项：

3.根据权利要求1或2所述的转录调控因子LysG的突变体，其中，所述突变体对应SEQID NO：1所示序列，具有如下一个或多个位置处的突变的氨基酸：

4.根据权利要求1-3任一项所述的转录调控因子LysG的突变体，其中，所述突变体对应SEQ ID NO：1所示序列，具有如下(a₁)-(a₂₂)组成的组中任意一个位置处的突变的氨基酸，或任意两个以上的位置处的突变的氨基酸：

(a₁)E58V；

(a₂)A59S；

(a₃)E61K或E61V；

(a₄)V64A；

(a₅)Q65R；

(a₆)A66T；

(a₇)A67T或A67S；

(a₈)A70I；

(a₉)L73I；

(a₁₀)A75G；

(a₁₁)E76D、E76C、E76K或E76W；

(a₁₂)T77A；

(a₁₃)K78E或K78R；

(a₁₄)A79V、A79T或A79R；

(a₁₅)Q80R或Q80K；

(a₁₆)G83R；

(a₁₇)R84H；

(a₁₈)L85P、L85A、L85D、L85G、L85A、L85S、L85T或L85Y；

(a₁₉)A86R或A86D；

(a₂₀)E87G、E87D、E87R、E87N、E87H、E87K或E87S；

(a₂₁)I88V、I88T、I88A、I88N、I88G、I88H、I88K、I88P或I88S；

(a₂₂)P89Q。

5.根据权利要求1-4任一项所述的转录调控因子LysG的突变体，其中，所述突变体对应SEQ ID NO：1所示序列，具有如下所示(m₁)-(m₅₁)中任意一种所示的突变的氨基酸：

(m₁)E58V；(m₂)A59S和Q80R；(m₃)E61V；(m₄)E61K和K78E；

(m₅)V64A和E87D；(m₆)Q65R；(m₇)A66T；(m₈)A67T和A79V

(m₁₄)A75G；(m₁₅)E76D；(m₁₆)E76C；(m₁₇)E76K；(m₁₈)E76W

(m₁₉)T77A，K78R和G83R；(m₂₀)T77A；(m₂₁)A79V；(m₂₂)A79R；

(m₂₃)A79T和G83R；(m₂₄)Q80R；(m₂₅)Q80K和R84H；(m₂₆)L85P；

6.根据权利要求1-5任一项所述的转录调控因子LysG的突变体，其中，所述突变体与SEQ ID NO：1所示序列的多肽相比，具有1.4-5倍以上的提高的碱性氨基酸响应强度。

7.一种分离的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码如权利要求1-6任一项所述的转录调控因子LysG的突变体。

8.一种核酸构建体，其中，所述核酸构建体包含如权利要求7所述的多核苷酸，所述多核苷酸与LysG调控型启动子可操作地连接，所述LysG调控型启动子指导多肽的表达。

9.一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含如权利要求7所述的多核苷酸，或如权利要求8所述的核酸构建体。

10.一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含如权利要求1-6任一项所述的转录调控因子LysG的突变体、如权利要求7所述的多核苷酸、如权利要求8所述的核酸构建体，或者如权利要求9所述的重组表达载体。

11.根据权利要求10所述的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞来源于埃希氏杆菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗维登斯菌属(Providencia)、肠道菌属(Enterobacteria)、沙门氏菌属(Salmonella)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、短杆菌属(Brevibacterium)或棒状杆菌属(Corynebacterium)的微生物；

12.一种生物传感器，其中，所述生物传感器包含如权利要求1-6任一项所述的转录调控因子LysG的突变体，或者如权利要求7所述的多核苷酸、如权利要求8所述的核酸构建体、如权利要求9所述的重组表达载体或如权利要求10-11任一项所述的重组宿主细胞表达的多肽。

13.根据权利要求1-6任一项所述的转录调控因子LysG的突变体，根据权利要求7所述的多核苷酸，根据权利要求8所述的核酸构建体，根据权利要求9所述的重组表达载体，或根据权利要求10-11任一项所述的重组宿主细胞在如下(a)-(d)至少一种中的用途：

可选地，所述碱性氨基酸为组氨酸、赖氨酸或精氨酸。

14.一种调控目标基因表达的方法，其中，所述方法包括将根据权利要求7所述的多核苷酸与转录起始序列、目标基因可操作地连接的步骤；优选地，所述转录起始序列为具有LysG调控型启动子活性的多核苷酸；可选地，所述目标基因包括与碱性氨基酸合成相关的蛋白的编码基因、基因表达调控蛋白的编码基因、与膜转运相关的蛋白的编码基因中的至少一种。

15.一种生产碱性氨基酸的方法，其中，所述方法包括在根据权利要求1-6任一项所述的转录调控因子LysG的突变体，根据权利要求7所述的多核苷酸，根据权利要求8所述的核酸构建体，根据权利要求9所述的重组表达载体存在的环境下生产碱性氨基酸的步骤；或者，所述方法包括利用根据权利要求10-11任一项所述的重组宿主细胞生产碱性氨基酸的步骤；

16.一种碱性氨基酸高产菌株的筛选方法，其中，所述方法包括使用根据权利要求1-6任一项所述的转录调控因子LysG的突变体，根据权利要求7所述的多核苷酸，根据权利要求8所述的核酸构建体，根据权利要求9所述的重组表达载体，根据权利要求10-11任一项所述的重组宿主细胞，或根据权利要求12所述的生物传感器筛选碱性氨基酸高产菌株的步骤。

17.一种与碱性氨基酸合成相关的蛋白或蛋白编码基因的筛选方法，其中，所述方法包括使用根据权利要求1-6任一项所述的转录调控因子LysG的突变体，根据权利要求7所述的多核苷酸，根据权利要求8所述的核酸构建体，根据权利要求9所述的重组表达载体，根据权利要求10-11任一项所述的重组宿主细胞，或根据权利要求12所述的生物传感器筛选与碱性氨基酸合成相关的蛋白或蛋白编码基因的步骤。