CN110283764A - 一种半胱氨酸单细胞生物传感器的构建及应用 - Google Patents

一种半胱氨酸单细胞生物传感器的构建及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测L‑半胱氨酸生物传感器的制备方法，以及在该生物传感器在检测大肠杆菌L‑半胱氨酸产量中的应用。该生物传感器主要元件包括，来源于菠萝泛菌中转录调控基因CcdR编码基因及其启动子区和终止子区、来源于菠萝泛菌中基因ccdA的启动子区、绿色荧光蛋白编码基因eGFP和质粒骨架pTrc‑Mob。该生物传感器可在0～32mmol L‑1 L‑半胱氨酸浓度下表现良好的线性关系，在0.01～8mmol L‑1 L‑半胱氨酸浓度下，荧光强度值与半胱氨酸浓度线性关系最高。与高通量筛选体系相结合，利用该生物传感器对大肠杆菌L‑半胱氨酸产量进行实时检测，并能够筛选出L‑半胱氨酸高产突变体，以及L‑半胱氨酸生物合成途径关键酶的突变体。本发明可实现对L‑半胱氨酸的特异性定量实时检测，且灵敏度高。

Description

一种半胱氨酸单细胞生物传感器的构建及应用
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种L-半胱氨酸生物传感器的构建及其应用。
背景技术
L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸，广泛应用于食品，医药以及化妆品行业。因含有还原性极强的巯基，L-半胱氨酸可以将其作为一种天然的还原剂，用于断裂蛋白质当中的二硫键。比如，以其衍生物乙酰L-半胱氨酸为主要成分的祛痰液可以断裂痰当中的二硫键以降低痰的粘性；又如，L-半胱氨酸为主要成分的烫发液可以断裂头发当中的二硫键，所以大量应用于美发行业当中；再如，L-半胱氨酸及其衍生物谷胱甘肽可以断裂酪氨酸酶中的二硫键以使其失活，减少酪氨酸酶产生的黑色素，因而被应用于美容美白产品。以发酵方法生产L-半胱氨酸由于其环境与成本方面的优势被研究者们期望代替传统的水解生产方法。在实验室中，大肠杆菌、菠萝泛菌、谷氨酸棒状杆菌等都被进行代谢改造，作为发酵菌株以生产L-半胱氨酸，其发酵产量可以达到1500mg/L。
已报到的L-半胱氨酸检测方法包括化学检测法、生长互补检测法、高效液相色谱法等，但这些方法灵敏度低、专一性不强并无法用于高通量筛选。在发酵生产中，由于培养基成分复杂，容易对L-半胱氨酸的检测产生干扰。目前还未有L-半胱氨酸高产菌株的高通量筛选方法的相关报道，其主要原因是因为已知的检测方法不能与以流式细胞分选为代表的高通量筛选方法相偶联。因此，急需一种实时、准确、灵敏的L-半胱氨酸检测方法。
本发明基于转录调控因子CcdR，将L-半胱氨酸浓度与荧光强度相偶联，构建了可检测L-半胱氨酸浓度的生物传感器，可实现对L-半胱氨酸的特异性定量检测。
发明内容
针对目前缺乏快速、灵敏且高特异性检测L-半胱氨酸的方法的问题，本发明提供了一种基于转录调控因子CcdR的单细胞L-半胱氨酸生物传感器及其构建方法，该生物传感器可以将L-半胱氨酸浓度转化为荧光强度信号，具有很高的灵敏度。
所述L-半胱氨酸单细胞生物传感器由来源菠萝泛菌中转录调控因子CcdR编码基因及其启动子区和终止子区、来源菠萝泛菌中基因ccdA的启动子区、绿色荧光蛋白编码基因eGFP和质粒骨架pTRCmob质粒组成。通过基因融合的方法将各组成区进行组装，获得质粒pCcdRAe。
所述的单细胞生物传感器检测L-半胱氨酸浓度包括以下步骤：
(1)在37℃的温度下对含有质粒pCcdRAe的大肠杆菌进行预培养12小时以上直至进入稳定期；
(2)将预培养的大肠杆菌以1:50的接种量接种到新鲜的培养基中；
(3)菌液OD600至0.5时加入L-半胱氨酸溶液，2小时后测定荧光强度。
本发明的另一个目的是提供一种能与高通量筛选体系相结合的L-半胱氨酸检测手段，并且证明该方法可以应用于L-半胱氨酸高产菌株和L-半胱氨酸生物合成相关酶的筛选当中，以获得L-半胱氨酸产量菌株。
所述L-半胱氨酸单细胞生物传感器高通量筛选L-半胱氨酸高产菌株包括以下步骤：
(1)使用离子体诱变仪对含有质粒pCcdRAe的L-半胱氨酸生产菌株进行诱变处理，获得突变体库；
(2)使用流式细胞仪筛选荧光信号提高的突变体；
(3)收集突变体接种于LB培养基中振荡培养，使用酶标仪测定其荧光强度，并检测L-半胱氨酸的浓度，获得L-半胱氨酸产量提高的菌株。
所述L-半胱氨酸单细胞生物传感器高通量筛选L-半胱氨酸合成途径相关基因突变体，包括以下步骤：
(1)使用易错PCR对待筛选基因进行随机突变；
(2)构建突变体质粒文库并转化至含有质粒pCcdRAe的大肠杆菌中获得突变体库；
(3)挑取突变体接种于含有SMI培养基的96孔板中，培养10～20h，使用酶标仪测定菌体荧光，荧光值高于野生型2倍以上的突变体，进行L-半胱氨酸浓度和酶催化活性检测。
本发明具有以下优点：
本发明利用转录调控因子CcdR可以感知L-半胱氨酸浓度变化而结合ccdA启动子，并增强下游基因表达的特点。使用绿色荧光蛋白eGFP，将L-半胱氨酸浓度信号转化为荧光强度信号，具有极强的特异性，实现对目标物质L-半胱氨酸的灵敏检测。该传感器可以与高通量筛选体系相结合，实现L-半胱氨酸浓度的单细胞、实时检测，以方便通过荧光强度的改变筛选L-半胱氨酸高产菌株，或筛选L-半胱氨酸合成中关键酶的突变体。
附图说明
图1为L-半胱氨酸单细胞生物传感器的质粒pCcdRAe图谱；
图2为L-半胱氨酸单细胞生物传感器的原理图；
图3为L-半胱氨酸单细胞生物传感器的信号响应曲线；
图4为L-半胱氨酸单细胞生物传感器的专一性；
图5为利用L-半胱氨酸单细胞生物传感器筛选菌株的流程图；
图6为筛选得到的菌株发酵中的L-半胱氨酸产量。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例汇总所用的材料、试剂等，无特殊说明。均可从商业途径得到。
实施例1 L-半胱氨酸生物传感器表达质粒构建
本实施例对L-半胱氨酸生物传感器各组成模块进行PCR扩增，获得组成模块的核苷酸片段，并通过分子克隆技术将各模块按一定顺序进行组装，完成L-半胱氨酸生物传感器表达质粒pCcdRAe构建
应用PCR方法，以菠萝泛菌Pantoea ananatis AJ13355基因为模板扩增ccdR的结构基因及其上下游核苷酸片段，该过程用到引物ccdR for和ccdR re。同样使用引物ccdA-efor和ccdA-e re扩增ccdA的启动子片段，使用引物ccd-efp for和ccd-efp re扩增eGFP基因片段。然后使用引物ccdA-e for和ccd-efp re，通过融合PCR将ccdA的启动子核苷酸片段和eGFP基因片段进行融合。ccdR及其上下游核苷酸片段使用EcoRI和BamHI进行双酶切得到粘性末端，ccdA的启动子与eGFP的融合片段使用BamHI和XbaI进行双酶切得到粘性末端，质粒pTRCmob作为载体使用EcoRI和XbaI进行双酶切得到粘性末端。三段核苷酸片段使用DNA连接酶进行连接并转化入大肠杆菌DH5α中修复切口，获得终质粒pCcdRAe。该过程使用的引物序列如下：
ccdR for：CGGAATTCGGTGTATCTTGTTTGATCCAACCG
ccdR re：CGGGATCCGGGCATCCATGTTTTGGTG
ccdA-e for：CGGAATTCGTGGTGAGATTAACCGCAT
ccdA-e re：AAAAGTTCTTCTCCTTTACTCAT GGCGTTCATTTCCGGT
ccd-efp for：CCGGAAATGAACGCC ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC
ccd-efp re：GCTCTAGATAATCCCAGCAGCTGTTACAA
PCR扩增体系为：Thermo Fisher scientific Phusion 5×buffer10μL，10mMdNTP 4μL，核苷酸模板20ng，10μM引物2.5μL，Phusion High-Fidelity核苷酸Polymerase(2.5 U/μL)0.5μL，ddH2O 2.5μL，总体积为50μL。PCR扩增条件为98℃预变性30s(1个循环)；98℃变性10s，60℃退火10s；72℃延伸1min(35个循环)；72℃延伸5min(一个循环)。
实施例2 L-半胱氨酸单细胞生物传感器对L-半胱氨酸的检测
本实施例对该生物传感器对L-半胱氨酸灵敏性及特异性进行了检测。
(1)将携带单细胞生物传感器质粒pCcdRAe的DH5α单菌落接种到LB+25μg/L卡那霉素的培养基中，37℃，200rpm过夜培养12h。
(2)将过夜培养的菌液以1:50的比例接种到新鲜的LB+25μg/L卡那霉素的培养基中，37℃，200rpm过夜培养12h。
(3)当菌体OD600达到0.5～0.8时加入终浓度为0～32mmoL/L的L-半胱氨酸，2小时后测定荧光强度。
(4)测定荧光强度时先将菌体离心，去掉上清液，然后使用PBS缓冲液洗涤菌体并重悬，使重悬液OD600为0.5左右。测定荧光时使用日立荧光分光光度计F-7000，其激发波长为488nm，发射波长为510nm。记录下荧光强度后再次测量重悬液的OD600值，将荧光强度和OD600的比值作为最终的荧光强度的数值。
(5)所得到的L-半胱氨酸浓度-荧光强度的关系曲线(图3)，其回归方程为其相关系数为0.9961，方程中F代表在510nm所测得的荧光强度，X代表溶液中L-半胱氨酸的浓度。
(6)以实施例2的流程测定其他氨基酸的添加是否会引起该生物传感器荧光强度的改变，了解该生物传感器的特异性。10mmoL/L丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸均不会引起该传感器荧光强度的变化(图4)，而L-半胱氨酸的加入使荧光强度有了10倍左右的增加，这表明了传感器具有极强的特异性。
实施例3 L-半胱氨酸单细胞生物传感器在筛选L-半胱氨酸高产菌株中的应用
本实施例使用该L-半胱氨酸单细胞生物传感器与高通量筛选体系结合筛选L-半胱氨酸高产菌株(图5)。
(1)含有质粒pCcdRAe的大肠杆菌DH5α被作为出发菌株进行诱变。待诱变菌株使用LB+25μg/mL卡那霉素的液体培养基，37℃，200rpm过夜培养。用生理盐水洗涤菌体后重悬并将OD600调整到1.0，取10μL菌液进行诱变。诱变使用ARTP照射12～20s，诱变后的细胞使用LB+25μg/L卡那霉素的液体培养基，37℃，200rpm过夜培养；
(2)过夜培养的细胞使用Beckman MoFlo XDP流式细胞仪进行初筛，筛选出荧光信号为前0.5％的细胞；
(3)筛选得到的细胞被涂布到LB+25μg/L卡那霉素的固体平板上于37℃过夜培养；
(4)将平板上的单菌落接种到含有600μL LB+25μg/L卡那霉素的液体培养基的96孔深孔板中于37℃，800rpm，培养24h，其中4个孔接种野生型菌株，92个孔接种突变体菌株；
(5)24h后取100μL菌液至96孔黑色透明底酶标板中，使用酶标仪测定菌体荧光，取荧光值高于野生型20％的菌株使用甘油保藏于-80℃冰箱；
(6)使用SMI培养基对出发菌株及筛选得到的突变体菌株在33℃，200rpm进行发酵，并每隔24h测定L-半胱氨酸产量。4株突变体的产量分别比出发菌株提高了100％，200％，10％和20％(图6)。
实施例4 L-半胱氨酸单细胞生物传感器在高通量筛选L-半胱氨酸生物合成相关基因突变体中的应用
本实施例使用该L-半胱氨酸单细胞生物传感器筛选L-半胱氨酸代谢途径中关键酶的突变体，以筛选丝氨酸乙酰转移酶(L-serine O-acetyltransferase,SAT)为例，其流程如下：
(1)通过易错PCR使SAT基因随机突变。易错PCR过程中，体系中含有如下成分：Mg2+25mmoL/L，Mn2+1.2mmoL/L，上游引物10μmoL/L，下游引物10μmoL/L，dNTP10μmol/L，PCR模板为谷氨酸棒状杆菌基因组，rTaq酶来自Takara试剂公司。
(2)将SAT的随机突变基因通过酶切位点BamHI和HindIII克隆至表达载体pMW118中，构建突变体库。
(3)将突变体库转化进含有实施例1所示的单细胞生物传感器的大肠杆菌中，并将其涂布在LB+25μg/L卡那霉素+50μg/L的氨苄青霉素的平板上，37℃过夜培养12h。
(4)将单菌落接种在含有发酵培养基+25μg/L卡那霉素+50μg/L的氨苄青霉素的96孔板中33℃，800rpm培养24h，其中4个孔接种野生型菌株，92个孔接种突变体菌株。
(5)使用酶标仪测定荧光强度，激发波长为488nm，发射波长为510nm。取荧光高于野生型菌株50％以上的菌株使用甘油保藏于-80℃冰箱。
(6)使用SMI培养基对筛选出的菌株在33℃，200rpm进行发酵，并测定其产量。经测定其L-半胱氨酸产量在24h达到0.1mmol/L。

Claims (7)

1.一种L-半胱氨酸单细胞生物传感器，其特征在于：包括转录调控因子CcdR编码基因及其启动子区和终止子区、基因ccdA启动子区、绿色荧光蛋白编码基因eGFP和质粒骨架。
2.根据权利要求1所述的L-半胱氨酸单细胞生物传感器，其特征在于：所述转录调控因子CcdR编码基因及其启动子区和终止子区来源于菠萝泛菌；基因ccdA的启动子区来源于菠萝泛菌；绿色荧光蛋白编码基因eGFP序列为NCBI数据库标准序列。
3.根据权利要求1～3所述的L-半胱氨酸单细胞生物传感器质粒骨架，其特征在于：能在宿主菌中表达目的基因，所述宿主菌为大肠杆菌或棒杆菌，优选骨架为pTRCmob表达质粒。
4.一种L-半胱氨酸单细胞生物传感器的构建方法，包括以下步骤：将CcdR编码基因及其启动子区和终止子区核苷酸片段、ccdA的启动子区核苷酸片段和绿色荧光蛋白编码基因eGFP整合至pTRCmob表达质粒中，获得响应L-半胱氨酸的表达质粒pCcdRAe。
5.一种L-半胱氨酸单细胞生物传感器在L-半胱氨酸产物检测中的应用，包括以下步骤：
1)将含有质粒pCcdRAe的大肠杆菌于LB液体培养基中培养至稳定期；
2)以1:50(v/v)的接种量转接种到新鲜的LB培养基中，培养至OD600为0.5～0.8时加入终浓度为0～50mmol/L L-半胱氨酸溶液，2小时后测定荧光强度，其中激发波长为488nm，发射波长为510nm。
6.一种L-半胱氨酸单细胞生物传感器在筛选L-半胱氨酸高产菌株的应用，包括以下步骤：
1)将含有质粒pCcdRAe的大肠杆菌于LB液体培养基中过夜培养；
2)使用生理盐水洗涤菌体并重悬至OD600＝1～2，取10μL涂布在1mm贴片上；使用常压室温等离子体诱变仪(Atmospheric and Room Temperature Plasma，ARTP)照射5～20s进行菌体诱变；
3)将诱变后的菌体转接至LB液体培养基中过夜培养，使用流式细胞仪筛选荧光信号明显提升的候选细胞；
4)筛选的单菌落接种至LB培养基中振荡培养10～20h，使用酶标仪或荧光分光光度计测定其荧光强度，并用液相色谱仪检测L-半胱氨酸的浓度，筛选得到L-半胱氨酸高产菌株。
7.一种L-半胱氨酸单细胞生物传感器在高通量筛选L-半胱氨酸生物合成相关基因突变体中的应用，包括以下步骤：
1)使用易错PCR对待筛选基因进行随机突变；
2)构建突变体质粒文库并转化至含有质粒pCcdRAe的大肠杆菌中获得突变体库；
3)突变体接种于含有培养基的96孔板中，培养10～20h，使用酶标仪测定菌体荧光强度；
4)荧光值高于野生型2倍以上的突变体，进行L-半胱氨酸浓度和酶催化活性检测。
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