CN113980992B - 一种l-半胱氨酸生物传感器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种L‑半胱氨酸生物传感器的构建及应用。该生物传感器含有CcdR编码基因及其控制序列PccdR启动子,以及报告基因及其控制序列PccdA启动子,其中CcdR转录调节因子能够特异性结合PccdA启动子区域,诱导激活报告蛋白的表达。该生物传感器对L‑半胱氨酸表现出优良的线性响应关系,通过与高通量筛选体系等相结合,可以用于高效选育L‑半胱氨酸高产菌株或者定向进化L‑半胱氨酸合成途径关键限速酶,具有操作简单、检测周期短、检测效率高、灵敏度高等优势。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域,具体涉及一种L-半胱氨酸的特异性生物传感器及其应用。
背景技术
L-半胱氨酸是一种具有重要生理功能的含硫氨基酸,在食品、医药、化妆品和饲料等领域具有广泛的用途。随着L-半胱氨酸终端用途的不断开拓,全球半胱氨酸市场需求迅速增大,市场前景十分光明。据媒体报道,2016 年全球L-半胱氨酸总产量约在1.4万~1.5万吨之间,半胱氨酸及下游衍生产品的市场规模已接近或超过4000亿美元。我国L-半胱氨酸产量约占全球总产量的2/3,每年出口量保持在80%以上,在竞争激烈的国际市场上占据着重要地位。国内外当前主要采用盐酸水解毛发提取L-半胱氨酸的传统工艺,技术水平较低且存在环境污染等问题。目前利用微生物发酵法生产L-半胱氨酸的产量偏低,在构建细胞工厂提升L-半胱氨酸制造水平方面仍有许多瓶颈需要突破。
代谢物生物传感器是基于转录调控因子、RNA 开关等生物识别元件和荧光报告信号、酶活力等信号输出元件构建的一类生物传感器装置,能够感应细胞内特定代谢物浓度的变化,转化为可识别信号输出,在构建高效微生物细胞工厂中具有巨大应用潜力。现已经有一些代谢物生物传感器开发出来并用于生产实践中,例如专利CN111635454A公开了一种基于转录因子argR的精氨酸生物传感器,可用于从大量菌株突变体候选文库中快速筛选得到精氨酸高产菌株。专利CN110129354A公开了一种N-乙酰神经氨酸的特异性生物传感器,为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产N-乙酰神经氨酸以及菌株进化奠定了基础。专利CN112375771A公开了一种基于转录因子NCgl0581的高丝氨酸生物传感器,能够灵敏响应胞内L-高丝氨酸浓度的变化,可用于L-高丝氨酸高产菌株的高通量筛选。上述实践表明,通过构建高效的目标代谢物生物传感器,将为实现菌株快速进化、代谢途径的动态调节及突变体高通量筛选提供新策略。但是遗憾的是,目前关于L-半胱氨酸生物传感器及其用于高通量筛选的报道相对较少。例如CN 110283764 A涉及一种半胱氨酸单细胞生物传感器,具有一定开创性,但其敏感度等性能还有待提高。因此,总体来说,L-半胱氨酸高产菌株的快速筛选和分离仍然受到较大限制,所以急需构建一种类似高效的生物传感器以解决L-半胱氨酸菌株选育的瓶颈问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效的L-半胱氨酸生物传感器及其构建方法,并使用该生物传感器建立L-半胱氨酸高产菌株及其生物合成途径关键酶的高通量筛选方法。
本发明依据L-半胱氨酸及类似物的结构特性,选择能够响应该目标代谢物的来源于菠萝泛菌(Pantoea ananatis AJ13355)中转录调控因子CcdR进行突变改造作为基础生物元件,构建一种高效的L-半胱氨酸生物传感器,进而将L-半胱氨酸浓度与荧光强度信号相偶联,实现菌株胞内L-半胱氨酸浓度的实时监测。
因此,本发明提供一种L-半胱氨酸生物传感器,其含有CcdR编码基因突变体及其控制序列PccdR启动子,以及报告标记蛋白的编码基因及其控制序列PccdA启动子,其中CcdR转录调节因子能够特异性结合PccdA启动子区域,进而诱导激活报告标记蛋白的表达。其中进一步地,CcdR编码基因突变体编码的CcdR相对于野生型CcdR而言,存在V94I,M104V或K154I突变,其中野生型CcdR的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示,其编码基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示。
其中,由于PccdR启动子控制CcdR编码基因表达,PccdA启动子控制GFP编码基因表达,优选地PccdR启动子和PccdA启动子方向相反。
本发明是通过易错PCR等方法对转录调控因子CcdR进行分子改造,以期优化L-半胱氨酸生物传感器的响应灵敏度,最终筛选获得三个高效CcdR突变体(V94I,M104V和K154I),即相对于野生型CcdR蛋白存在第94位氨基酸由缬氨酸突变为异亮氨酸,第104位氨基酸由甲硫氨酸突变为缬氨酸,第154位氨基酸由赖氨酸突变为异亮氨酸。基于上述CcdR突变体构建的L-半胱氨酸生物传感器,与野生型相比具有明显增强的L-半胱氨酸响应灵敏度,在0~12mM L-半胱氨酸浓度下表现出更加优良的线性响应关系。
在本发明的一个具体实施方案中,其中携带的报告标记蛋白为荧光蛋白,更优选为绿色荧光蛋白GFP。在一个具体实施方式,质粒骨架优选为大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pTRCmob。本发明还提供了含有所述生物传感器的重组菌株。
进而,本发明还提供所述生物传感器或含有所述生物传感器的重组菌株在筛选L-半胱氨酸高产菌株中的应用。在本发明的一个具体实施方案中,通过常压室温等离子体(ARTP)诱变、化学诱变、实验室适应性进化等方法对上述重组菌株进行随机诱变,获得随机突变体菌株库。将诱变菌株进行发酵培养后,使用流式细胞仪分选,选取荧光信号获得明显提升的细胞,即为L-半胱氨酸生产能力提高的候选诱变菌株。任选地,还包括复筛步骤,即收集单克隆后接种于新鲜的发酵培养基中,进行摇瓶发酵复筛L-半胱氨酸生产能力提高的诱变菌株。上述实践表明,基于改进型生物传感器与高通量筛选系统偶联,可以高效快速省力的筛选出L-半胱氨酸高产菌株。
本发明还提供了利用所述生物传感器或含有所述改进型生物传感器的重组菌株在筛选L-半胱氨酸生物合成途径关键酶中的应用。优选地,所述L-半胱氨酸生物合成途径关键酶是指丝氨酸乙酰基转移酶CysE,半胱氨酸合酶CysK,D-3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA,3-磷酸丝氨酸氨基转移酶SerC。在本发明的一个具体实施方案中,对L-半胱氨酸合成路径中大肠杆菌来源的丝氨酸乙酰基转移酶CysE进行定向改造和筛选。通过易错PCR等方法对CysE编码基因进行随机突变,亚克隆至大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pXMJ19后获得随机突变质粒文库,并导入具有一定L-半胱氨酸生产能力的大肠杆菌基础工程菌E.coli-CYS中,获得能够表达CysE编码基因突变文库的菌株。所述大肠杆菌基础工程菌E.coli-CYS是指在E. coli W3110中敲除两个L-半胱氨酸降解途径基因tanA和yhaM,同时表达一个L-半胱氨酸合成途径基因cysE,该菌株在发酵条件下具有一定的L-半胱氨酸生产能力。利用流式细胞仪分选出荧光强度位于前0.04%的单细胞菌体,分别挑至含有96孔板中培养后,进行酶活测定,筛选出比野生型酶活有提高的CysE突变体。上述实践表明,基于改进型生物传感器与高通量筛选系统偶联,可以实现代谢途径关键酶的快速筛选改造,为微生物发酵生产L-半胱氨酸及其衍生物提供具有优良催化性能的酶资源。
此外,本发明还提供一种CcdR突变体,其特征在于,相对于野生型CcdR而言,存在V94I,M104V或K154I突变,其中野生型CcdR氨基酸序列如SEQ ID No.19所示。进一步提供编码所述的CcdR突变体的编码基因。
本发明的有益之处在于提供了一种高效改进型的L-半胱氨酸生物传感器,利用转录调控因子CcdR及其控制的PccdA启动子和报告基因作为基本生物元件,将L-半胱氨酸浓度与荧光信号强度联系起来,使L-半胱氨酸浓度可视化,实现菌株胞内L-半胱氨酸浓度的实时灵敏监测。该生物传感器可以与高通量诱变和筛选体系相结合,有助于快速进化和高效筛选L-半胱氨酸生物合成途径关键酶及L-半胱氨酸高产工程菌株,为微生物高效发酵生产L-半胱氨酸及衍生物提供了技术保障。而且,目前由于缺乏合适的L-半胱氨酸检测方法以偶联流式细胞分选等高通量筛选体系,L-半胱氨酸生产菌株的分离主要依靠人工挑选单克隆进行验证。构建基于转录因子的L-半胱氨酸单细胞生物传感器,将为实现高通量筛选(快速鉴定目标突变体)、合成途径的动态调节及菌株适应性进化提供了新的策略。
附图说明
图1为L-半胱氨酸生物传感器的示例图谱;
图2为L-半胱氨酸生物传感器的荧光信号响应曲线;
图3为基于L-半胱氨酸生物传感器的高通量筛选流程示意图;
图4为各菌株半胱氨酸产量图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步的阐述,以期更好的理解本发明,但并不构成对本发明的限制。
实施例1:L-半胱氨酸生物传感器质粒的构建
本实施例通过PCR方法扩增获得L-半胱氨酸生物传感器中的各组分生物元件,并通过一步法高效无缝克隆(ClonExpress®II One Step Cloning Kit,Vazyme Biotech,China)等分子组装技术将各片段按一定顺序连接,完成L-半胱氨酸生物传感器质粒的构建。
在菠萝泛菌中,CcdR蛋白是最先发现的L-半胱氨酸转录调控因子,能够调控下游的ccdA基因表达,在外源添加0.1 mmol/L 的L-半胱氨酸后,ccdA的转录水平可增加上百倍(Takumi K, et al. Bacterial cysteine-inducible cysteine resistance systems. JBacteriol. 2016;198:1384-1392.)。CcdR作为一种与L-半胱氨酸作用的转录调节因子,其调控的反应速度和灵敏性很高,胞内存在一定L-半胱氨酸浓度时,转录调节因子CcdR可以响应L-半胱氨酸从而激活ccdA基因启动子,增强GFP基因的表达强度。因此,本实施例中拟利用CcdR转录调节因子作为构建L-半胱氨酸生物传感器的基础生物元件。
以菠萝泛菌P. ananatis AJ13355基因组为模板,使用引物F1和R1,采用普通PCR方法扩增获得生物传感器响应模块,包括CcdR编码基因(SEQ ID No.1),PccdR启动子控制序列(SEQ ID No.2)和PccdA启动子控制序列(SEQ ID No.3);以文献报道的pXMJ19-GFP质粒为模板(见Wei et al. Promoter library-based module combination (PLMC) technologyfor optimization of threonine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum.Appl Microbiol Biotechnol. 2018,102:4117-4130),使用引物F2和R2,采用普通PCR方法扩增获得荧光报告GFP编码基因(SEQ ID No.4);以大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pTRCmob为模板,使用引物F3和R3,采用普通PCR方法扩增获得pTRCmob质粒骨架。利用一步法高效无缝克隆ClonExpress®技术,将上述获得的核苷酸片段和质粒骨架按照顺序进行组装(图1),其中PccdR启动子控制CcdR编码基因表达,PccdA启动子控制GFP编码基因表达,PccdR启动子和PccdA启动子方向相反。经过筛选验证后,最终获得L-半胱氨酸生物传感器质粒Pcys-Bio,并进行公司测序确认。质粒构建过程所使用的引物序列如下:
F1: 5’-GCTACGTGACTGGGTCATGGCGAACTCAGGGGCCAACAGGCAGGGCTGTC-3’
R1:5’- GTTCTTCTCCTTTACTCATCGCCATCCGGTCGGATGAAAGTCAT-3’
F2:5’- ATGACTTTCATCCGACCGGATGGCGATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3’
R2:5’- CTCTCATCCGCCAAAACAGCCCTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-3’
F3:5’- GGCATGGATGAACTATACAAATAGGGCTGTTTTGGCGGATGAGAG-3’
R3:5’- GACAGCCCTGCCTGTTGGCCCCTGAGTTCGCCATGACCCAGTCACGTAGC-3’。
为了保证扩增中的序列正确性,采用目前商用的高效超保真DNA聚合酶进行PCR反应。PCR扩增体系为:10 μL 5×HF Phusion buffer,4 μL 2.5mM dNTP Mix,2.5 μL 10 μM上游引物,2.5 μL 10 μM下游引物,1.5 μL DMSO,1 μL模板,0.5 μL Phusion聚合酶,28 μLddH2O。PCR扩增条件为:98℃预变性30 s;98℃变性10 s,60℃退火10 s,72℃延伸2 min,35个循环;72℃延伸5min。
采用商用的基于重组酶的高效无缝克隆ClonExpress®技术进行质粒组装,重组反应体系为:4 μL5×CE II Buffer,2 μLExnase II,0.03 pmol载体骨架,0.06pmol插入片段,补足ddH2O至20 μL体系。重组反应条件为:冰上配置重组反应体系,37℃反应30 min,降至4℃或立即置于冰上冷却。然后将上述获得的重组质粒按照常规的大肠杆菌热激转化法,导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。
实施例2:L-半胱氨酸生物传感器的改造和优化
CcdR作为一种与L-半胱氨酸作用的转录调控因子,其调控活性与生物传感器的响应速度和灵敏度密切相关。通过对CcdR蛋白进行定向进化,筛选更加优良的CcdR蛋白突变体,增强结合特异性和亲和性,将有助于进一步改进和提升L-半胱氨酸生物传感器的灵敏度。
以菠萝泛菌P. ananatis AJ13355基因组为模板,使用引物F4和R4,采用易错PCR随机突变方法扩增获得CcdR编码基因突变文库。通过在PCR反应体系中加入一定浓度的镁离子和锰离子,进一步降低PCR扩增过程中的保真性,控制获得的编码基因中含有1~3个点突变。以实施例1中获得的L-半胱氨酸生物传感器质粒Pcys-Bio为模板,使用引物F5和R5,采用高保真性的Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶扩增获得质粒骨架。利用一步法高效无缝克隆ClonExpress®技术,将上述获得的核苷酸片段和质粒骨架按照顺序进行组装,获得含有多样化CcdR编码基因点突变的重组质粒文库。
本发明采用的易错PCR体系为:5 μL 10 × EasyTaq缓冲液、0.2 μM上游引物F4、0.2 μM上游引物R4,200 μM dNTPs、0.8 mM MnCl2、6 mM MgSO4、50 ng模板DNA、1 μLEasyTaqDNA聚合酶(TransGen Biotech, China),加入无菌的水补齐至50 μL体系。PCR反应程序为:95℃预变性3 min;95℃变性30 s;58℃退火30s;72℃延伸2 min,循环35次;72℃延伸5min,4℃保存。
本实施例中所用引物为:
F4:5’- CGTGACTGGGTCATGGCGAACTCA-3’
R4:5’- CTGGTTTTGCGTTAAAATGGCGGTAATG-3’
F5:5’- CATTTTAACGCAAAACCAGCAAGCTCTTTTTCCTAC-3’
R5:5’- TGAGTTCGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATA-3’。
在筛选平板上获得重组质粒文库后,利用pH7.4PBS缓冲液(137mM NaCl, 2.7mMKCl, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4)将菌落冲洗下来,并按照初始OD=0.1接入含有10mM L-半胱氨酸的LB液体培养基(1%酵母提取物,2%胰蛋白胨,1% NaCl)中,37℃200 rpm振荡孵育6小时后,离心收集菌体,利用pH7.4PBS缓冲液洗涤菌体后重悬至OD=0.1。利用流式细胞仪根据荧光强度对菌体细胞进行分选,选取前0.4%的细胞,直接收集并点板至LB固体培养基中。待37℃静置培养48 h,LB平板上出现明显的单菌落后,分别将菌落挑至含有LB液体培养基的96深孔板中,并添加终浓度10mM L-半胱氨酸,37℃200 rpm振荡孵育6小时。离心收集菌体,使用等体积0.9%NaCl重悬后,使用SpectraMax®多功能酶标仪测定其相对荧光强度,其中设定激发波长为488 nm,发射波长为520 nm,同时测量菌体OD600值,将荧光强度和OD600的比值作定义为相对荧光强度的数值。选取相对荧光强度较高的多株菌进行复筛,测定其在0~12mML-半胱氨酸浓度下诱导6小时后,相对荧光强度的高低,将灵敏度有明显提升的菌株通过菌落PCR鉴定后,确定ccdR基因突变靶点,最终确定了三株灵敏度比野生型有显著提高的CcdR突变体,分别是V94I,M104V和K154I。其中,M104V氨基酸序列如SEQ ID NO. 20所示,M104V核苷酸序列如SEQ ID NO. 21所示,V94I氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示,V94I核苷酸序列如SEQ ID NO. 23所示,K154I氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示,K154I核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
基于上述三种CcdR突变体构建获得的改进型L-半胱氨酸生物传感器分别命名为Pcys-Bio-V94I,Pcys-Bio-M104V和Pcys-Bio-K154I。
以外源L-半胱氨酸浓度为横坐标,以相对荧光强度为纵坐标,绘制含有不同生物传感器重组菌株具有的荧光强度与L-半胱氨酸浓度间相关性。结果如图2所示,通过对CcdR转录调节因子进行分子改造,可以获得性能更加优良的L-半胱氨酸生物传感器,其中Pcys-Bio-V94I响应灵敏度可达野生型Pcys-Bio的3.6倍,是最优的。
实施例3:基于改进型生物传感器的L-半胱氨酸高产菌株筛选
L-半胱氨酸作为一种不明显的小分子化合物,胞内很难进行检测,难以开发高通量筛选方法。基于改进后的生物传感器可以灵敏感应胞内的L-半胱氨酸浓度变化并输出为荧光信号,通过偶联流式细胞仪等高通量筛选设备,可以在荧光水平进行快速分选,将很大程度提升高产菌株选育的速度及从多样化突变体库中高效筛选目标菌株的潜力。
如图3所示为L-半胱氨酸高通量筛选的流程示意图,具体步骤为:选取含有Pcys-Bio-V94I报告系统的具有基础L-半胱氨酸发酵能力的CYS-2菌株(敲除半胱氨酸降解途径基因tnaA和yhaM,整合表达具有解除L-半胱氨酸反馈抑制能力的生物合成途径关键酶基因cysE和serA),接种于5 mL LB液体培养基中,待37℃,200 rpm振荡培养10 h后,离心收集菌体细胞,使用pH7.4 PBS缓冲液洗涤菌体后重悬至细胞浓度OD600=1.0。取10 μL菌体细胞,使用常压室温等离子体ARTP诱变育种仪进行随机诱变,其中仪器参数设置为功率120W,气量10 SLM,处理时间15 s。将经诱变处理的菌体细胞,悬于1 mL LB新鲜液体培养基中,37℃,200 rpm振荡1h进行复苏,待复苏完成后按初始浓度OD600=0.1接入新鲜的L-半胱氨酸发酵培养基中,30℃,200 rpm发酵培养24 h。待发酵培养完成后,使用pH 7.4 PBS缓冲液洗涤菌体并重悬至OD600=0.1,利用流式细胞仪对菌体细胞进行筛选,选取荧光强度位于前0.5%的细胞,直接收集并点板至LB固体培养基中。待37℃静置培养48 h,LB平板上出现明显的单菌落后,分别将菌落挑至含有发酵培养基的96深孔板中进行复筛,30℃,200 rpm发酵培养24h,离心收集菌体,使用等体积0.9%NaCl重悬后,用SpectraMax®多功能酶标仪测定其相对荧光强度,其中设定激发波长为488 nm,发射波长为520 nm,同时测量菌体OD600值,将荧光强度和OD600的比值作定义为相对荧光强度的数值,挑选其中相对荧光强度比出发菌株CYS-2更高的突变菌株,进行后续摇瓶发酵测试。菌株发酵培养24 h后,取样测定L-半胱氨酸的含量。
本实施例中所述的L-半胱氨酸发酵培养基中组分包括:葡萄糖50 g/L,玉米浆 20g/L,(NH4)2SO4 20 g/L,KH2PO4 1 g/L,K2HPO4 1 g/L,MgSO4·7H2O 0.01 g/L,MnSO4·H2O0.01 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L,柠檬酸钠 0.5 g/L,维生素B1 2 mg/L,生物素0.1 mg/L;本实施例中所述L-半胱氨酸含量的测定方法采用传统茚三酮化学法(Gaitonde M, etal. A spectrophotometric method for the direct determination of cysteine inthe presence of other naturally occurring amino acids. Biochem J, 1967, 104:627-633),配置反应体系:500 μL稀释后的发酵液,500 μL检测母液(250 mg茚三酮,4 mL浓盐酸,6 mL冰乙酸)和500 μL冰乙酸,设置反应条件:混合后沸水浴10 min,冰浴冷却2min,在OD560检测吸收光。根据绘制的L-半胱氨酸和吸光度对应标准曲线,计算发酵样品中的L-半胱氨酸的含量。
通过摇瓶发酵测试,最终获得六株L-半胱氨酸发酵产量比出发菌株CYS-2更高的突变体菌,如图4所示,分别命名为A1,A2,A3,A4,A5,A7,其中A1突变体的L-半胱氨酸产量约为出发菌株CYS-2的1.53倍。上述实施例表明,基于改良后的生物传感器可以更灵敏响应L-半胱氨酸的特性,偶联流式细胞仪等筛选方法可以高效开发和建立L-半胱氨酸高产菌株的筛选平台。基于此筛选平台,能够快速高效筛选L-半胱氨酸高产菌株。
实施例4:基于改进型生物传感器的L-半胱氨酸生物合成途径关键酶筛选
在植物和细菌中存在着L-丝氨酸到L-半胱氨酸的合成途径,其中L-丝氨酸到O-乙酰丝氨酸途径是L-半胱氨酸合成途径的限速步骤,这是由于O-乙酰丝氨酸转移酶CysE会受到L-半胱氨酸强烈的反馈抑制,这在很大程度上影响了L-半胱氨酸在体内的生物合成,基于改良的生物传感器可以对CysE进行快速的筛选,提升CysE的酶学性能,对L-半胱氨酸生产有更进一步的帮助。
以大肠杆菌W3110基因组为模板,使用引物F6和R6,采用易错PCR随机突变方法扩增获得cysE编码基因突变文库。易错PCR体系和实施例2中相同,以PACYC质粒为模板,采用高保真性的Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶利用引物F7和R7扩增获得质粒骨架。利用一步法高效无缝克隆ClonExpress®技术,将上述获得的核苷酸片段和质粒骨架按照顺序进行组装,获得含有多样化cysE编码基因点突变的重组质粒文库。
本实施例中所用引物为:
F6:5’- GTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATG-3’
R6:5’- CTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAT-3’
F7:5’-CTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTG-3’
R7:5’- GTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCC-3’
将构建好的重组质粒文库转入含有Pcys-Bio-V947I的CYS-1菌株(敲除半胱氨酸降解途径基因tnaA和yhaM),待平板中菌落形成后,使用pH7.4 PBS缓冲液洗涤菌体并重悬于实施例3中所述L-半胱氨酸发酵培养基中,30℃,200rpm发酵培养24h。待发酵培养完成后,使用pH 7.4 PBS缓冲液洗涤菌体并重悬至OD600=0.1,利用流式细胞仪对菌体细胞进行筛选,选取荧光强度位于前0.5%的细胞,直接收集并点板至LB固体培养基中。待37℃静置培养48 h,LB平板上出现明显的单菌落后,分别将菌落挑至含有LB液体培养基的96深孔板中,待在37℃,200rpm条件下培养10 h后,加入终浓度0.4mM IPTG诱导剂,在25℃,800rpm条件下过夜培养。诱导结束后,低温离心收集菌体,加入200μL3mg/mL溶菌酶至96孔板中,37℃孵育3h后,低温离心获得上清即为粗酶液。利用SpectraMax®多功能酶标仪进行酶动力学测试,筛选出底物消耗速率高于野生型的突变体酶,并通过PCR扩增后测序确定酶的突变位点。针对初步筛选出的突变体酶,通过对相关突变体酶进行蛋白纯化,并进行酶学性质表征,最终筛选获得四个催化性能明显提升的突变体酶。
本实施例中所采用的酶活反应测定体系为:50mM Tris-HCl(pH7.5),2mM L-丝氨酸,5mM MgCl2,0.1mM 乙酰辅酶A,水补齐至150μL。本实施例中蛋白纯化所用裂解缓冲液为:20 mM Tris-HCl,200 mM NaCl,pH 7.5;本实施例中蛋白纯化所用洗杂缓冲液:20 mMTris-HCl,200 mM NaCl,50mM 咪唑,pH 7.5;本实施例中蛋白纯化所用洗脱缓冲液:20 mMTris-HCl,200 mM NaCl,500 mM 咪唑,pH 7.5。
经过酶动力学性质评估后,如表1所示。
表1野生型和CysE突变体的酶活性比较
突变位点 | 比酶活(U/min/mg) | 100umol半胱氨酸下剩余酶活 |
野生型 | 1.75±0.04 | 0.05±0.01 |
Val-67-Met(V67M) | 3.76±0.10 | 0.12±0.02 |
Asn-12-Val/Glu-39-Gly(N12V-E39G) | 5.97±0.03 | 0.23±0.03 |
Ala-237-Val(A237V) | 1.63±0.14 | 0.73±0.03 |
Leu-45-Gln/Asp-250-Val(L45N-D250V) | 9.10±0.31 | 0.69±0.03 |
由此表明,最终筛选获得四个在催化酶活或解反馈抑制效应上有明显提升的CysE突变体,即V67M,N12V-E39G, A237V和L45N-D250V。其中L45N-D250V突变体的酶活是初始野生型酶活的5.2倍,A237V突变体在100 μM L-半胱氨酸抑制剂存在情况下,其仍保持44.8%的剩余酶活,相对初始野生型提升了13.6倍。上述实施例表明,经改良后的生物传感器在L-半胱氨酸合成途径关键酶的筛选上具有优良的应用性。
<110>中国科学院天津工业生物技术研究所
<120>一种L-半胱氨酸生物传感器及其应用
<130>
<160> 25
<170>PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 492
<212> DNA
<213>Pantoea ananatis
<400> 1
ATGGAGAAAATATTTCTACCGGAGGGCCGTATGCCAGATAAAATTGACCTTAAACTGTTGGCTATGCTGCAGCAGGACTGCACCACTTCACTTCAGGTACTGGCAGATGCGGTTAATCTCACCACGACGCCCTGTTGGAAGCGCCTTAAAAAGCTGGAAGAAGACGGCATTATTCGCGGACGGGTCGCTCTGCTGGATAATGAAAAGCTTGGCCTCTGTCTCACGGCCTTTATGTTTGTCAAAACCACCCAGCACATCAAAGCCTGGTATCAGGAGTTCGTCTCGGTGGTGCAGAGCATGCCGGAAGTGATGGGCTTTTACCGTATGGCCGGTGAGTACGATTATTTACTGCGTATTCAGGTTGCCGACATGAAAAGTTATGATGCCTTTTATAAGCGTTTAGTTAATGGTGTAACAGGCCTGATCGATGTGACCTCCAGCTTCGCGATGGAAGAGATTAAATACACGACAGCCCTGCCTGTTGGCCCCTGA 492
<210>2
<211>37
<212> DNA
<213>人工序列
<400>2
TACCGCCATTTTAACGCAAAACCAGCAAGCTCTTTTT 37
<210>3
<211>36
<212> DNA
<213>人工序列
<400>3
GTCATTATTTTAAGGCACGTGTAGGAAAAAGAGCTT 36
<210>4
<211>723
<212> DNA
<213>人工序列
<400>4
ATGGCGATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGACGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTCTGACTTATGGTGTTCAATGCTTTTCAAGATACCCAGATCATATGAAACAGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTCACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGATCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAATAG 723
<210>5
<211>50
<212> DNA
<213>人工序列
<400>5
GCTACGTGACTGGGTCATGGCGAACTCAGGGGCCAACAGGCAGGGCTGTC 50
<210>6
<211>44
<212> DNA
<213>人工序列
<400>6
GTTCTTCTCCTTTACTCATCGCCATCCGGTCGGATGAAAGTCAT 44
<210>7
<211>44
<212> DNA
<213>人工序列
<400>7
ATGACTTTCATCCGACCGGATGGCGATGAGTAAAGGAGAAGAAC 44
<210>8
<211>723
<212> DNA
<213>人工序列
<400>8
CTCTCATCCGCCAAAACAGCCCTATTTGTATAGTTCATCCATGCC 45
<210>9
<211>45
<212> DNA
<213>人工序列
<400>9
GGCATGGATGAACTATACAAATAGGGCTGTTTTGGCGGATGAGAG 45
<210>10
<211>50
<212> DNA
<213>人工序列
<400>10
GACAGCCCTGCCTGTTGGCCCCTGAGTTCGCCATGACCCAGTCACGTAGC 50
<210>11
<211>24
<212> DNA
<213>人工序列
<400>11
CGTGACTGGGTCATGGCGAACTCA 24
<210>12
<211>28
<212> DNA
<213>人工序列
<400>12
CTGGTTTTGCGTTAAAATGGCGGTAATG 28
<210>13
<211>36
<212> DNA
<213>人工序列
<400>13
CATTTTAACGCAAAACCAGCAAGCTCTTTTTCCTAC 36
<210>14
<211>44
<212> DNA
<213>人工序列
<400>14
TGAGTTCGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATA 44
<210>15
<211>38
<212> DNA
<213>人工序列
<400>15
GTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATG 38
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<211>43
<212> DNA
<213>人工序列
<400>16
CTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAT 43
<210>17
<211>43
<212> DNA
<213>人工序列
<400>17
CTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTG 43
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GTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCC 46
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<211>163
<212>PRT
<213>Pantoea ananatis
<400>19
MEKIFLPEGRMPDKIDLKLLAMLQQDCTTSLQVLADAVNLTTTPCWKRLKKLEEDGIIRGRVALLDNEKLGLCLTAFMFVKTTQHIKAWYQEFVSVVQSMPEVMGFYRMAGEYDYLLRIQVADMKSYDAFYKRLVNGVTGLIDVTSSFAMEEIKYTTALPVGP 163
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<400>20
MEKIFLPEGRMPDKIDLKLLAMLQQDCTTSLQVLADAVNLTTTPCWKRLKKLEEDGIIRGRVALLDNEKLGLCLTAFMFVKTTQHIKAWYQEFVSVVQSMPEVVGFYRMAGEYDYLLRIQVADMKSYDAFYKRLVNGVTGLIDVTSSFAMEEIKYTTALPVGP 163
<210> 21
<211>492
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 21
ATGGAGAAAATATTTCTACCGGAGGGCCGTATGCCAGATAAAATTGACCTTAAACTGTTGGCTATGCTGCAGCAGGACTGCACCACTTCACTTCAGGTACTGGCAGATGCGGTTAATCTCACCACGACGCCCTGTTGGAAGCGCCTTAAAAAGCTGGAAGAAGACGGCATTATTCGCGGACGGGTCGCTCTGCTGGATAATGAAAAGCTTGGCCTCTGTCTCACGGCCTTTATGTTTGTCAAAACCACCCAGCACATCAAAGCCTGGTATCAGGAGTTCGTCTCGGTGGTGCAGAGCATGCCGGAAGTGGTGGGCTTTTACCGTATGGCCGGTGAGTACGATTATTTACTGCGTATTCAGGTTGCCGACATGAAAAGTTATGATGCCTTTTATAAGCGTTTAGTTAATGGTGTAACAGGCCTGATCGATGTGACCTCCAGCTTCGCGATGGAAGAGATTAAATACACGACAGCCCTGCCTGTTGGCCCCTGA 492
<210>22
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<212>PRT
<213>人工序列
<400>22
MEKIFLPEGRMPDKIDLKLLAMLQQDCTTSLQVLADAVNLTTTPCWKRLKKLEEDGIIRGRVALLDNEKLGLCLTAFMFVKTTQHIKAWYQEFISVVQSMPEVMGFYRMAGEYDYLLRIQVADMKSYDAFYKRLVNGVTGLIDVTSSFAMEEIKYTTALPVGP 163
<210> 23
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<212> DNA
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<400> 23
ATGGAGAAAATATTTCTACCGGAGGGCCGTATGCCAGATAAAATTGACCTTAAACTGTTGGCTATGCTGCAGCAGGACTGCACCACTTCACTTCAGGTACTGGCAGATGCGGTTAATCTCACCACGACGCCCTGTTGGAAGCGCCTTAAAAAGCTGGAAGAAGACGGCATTATTCGCGGACGGGTCGCTCTGCTGGATAATGAAAAGCTTGGCCTCTGTCTCACGGCCTTTATGTTTGTCAAAACCACCCAGCACATCAAAGCCTGGTATCAGGAGTTCATATCGGTGGTGCAGAGCATGCCGGAAGTGATGGGCTTTTACCGTATGGCCGGTGAGTACGATTATTTACTGCGTATTCAGGTTGCCGACATGAAAAGTTATGATGCCTTTTATAAGCGTTTAGTTAATGGTGTAACAGGCCTGATCGATGTGACCTCCAGCTTCGCGATGGAAGAGATTAAATACACGACAGCCCTGCCTGTTGGCCCCTGA 492
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<212>PRT
<213>人工序列
<400>24
MEKIFLPEGRMPDKIDLKLLAMLQQDCTTSLQVLADAVNLTTTPCWKRLKKLEEDGIIRGRVALLDNEKLGLCLTAFMFVKTTQHIKAWYQEFVSVVQSMPEVMGFYRMAGEYDYLLRIQVADMKSYDAFYKRLVNGVTGLIDVTSSFAMEEIIYTTALPVGP 163
<210> 25
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<212> DNA
<213>人工序列
<400> 25
ATGGAGAAAATATTTCTACCGGAGGGCCGTATGCCAGATAAAATTGACCTTAAACTGTTGGCTATGCTGCAGCAGGACTGCACCACTTCACTTCAGGTACTGGCAGATGCGGTTAATCTCACCACGACGCCCTGTTGGAAGCGCCTTAAAAAGCTGGAAGAAGACGGCATTATTCGCGGACGGGTCGCTCTGCTGGATAATGAAAAGCTTGGCCTCTGTCTCACGGCCTTTATGTTTGTCAAAACCACCCAGCACATCAAAGCCTGGTATCAGGAGTTCGTCTCGGTGGTGCAGAGCATGCCGGAAGTGATGGGCTTTTACCGTATGGCCGGTGAGTACGATTATTTACTGCGTATTCAGGTTGCCGACATGAAAAGTTATGATGCCTTTTATAAGCGTTTAGTTAATGGTGTAACAGGCCTGATCGATGTGACCTCCAGCTTCGCGATGGAAGAGATTATTTACACGACAGCCCTGCCTGTTGGCCCCTGA 492
Claims (15)
1.一种L-半胱氨酸生物传感器,其特征在于,包括具有增强的L-半胱氨酸响应灵敏度的CcdR编码基因突变体及控制其表达的PccdR启动子,以及报告标记蛋白的编码基因及控制其表达的PccdA启动子,且 PccdR启动子和PccdA启动子方向相反;其中CcdR编码基因突变体编码的CcdR相对于野生型CcdR而言存在V94I,M104V或K154I突变,其中野生型CcdR的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示;
其中,CcdR编码基因突变体所编码的CcdR转录调节因子能够特异性结合PccdA启动子区域,进而诱导激活报告标记蛋白的表达;
所述L-半胱氨酸生物传感器是质粒载体。
2.如权利要求1所述的L-半胱氨酸生物传感器,其特征在于,报告标记蛋白为荧光蛋白。
3.如权利要求2所述的L-半胱氨酸生物传感器,其特征在于,所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白GFP;所述L-半胱氨酸生物传感器是以大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pTRCmob为骨架。
4.如权利要求1所述的L-半胱氨酸生物传感器,其特征在于,PccdR启动子控制序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
5.如权利要求1所述的L-半胱氨酸生物传感器,其特征在于,PccdA启动子控制序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
6.含有如权利要求1至5任一项所述的L-半胱氨酸生物传感器的重组菌株。
7.含有如权利要求1至5任一项所述的L-半胱氨酸生物传感器的重组菌株在筛选L-半胱氨酸高产菌株中的应用。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,具体步骤包括:诱变获得随机突变体菌株库;将随机突变体菌株库中的诱变菌株进行发酵培养后,使用流式细胞仪分选,选取报告蛋白信号获得提升的细胞,即为L-半胱氨酸生产能力提高的候选诱变菌株。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,还包括复筛步骤,即收集单克隆后接种于新鲜的发酵培养基中,测定其L-半胱氨酸生产能力。
10.含有如权利要求1至5任一项所述的L-半胱氨酸生物传感器的重组菌株在筛选L-半胱氨酸生物合成途径关键酶中的应用;所述L-半胱氨酸生物合成途径关键酶是指丝氨酸乙酰基转移酶CysE,半胱氨酸合酶CysK,D-3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA,3-磷酸丝氨酸氨基转移酶SerC。
11.如权利要求10所述的应用,其特征在于,具体步骤包括:对所述关键酶定向改造和筛选,亚克隆获得随机突变质粒文库;所述质粒文库导入到含有所述的L-半胱氨酸生物传感器的重组菌株,发酵培养后,利用流式细胞仪分选出达到规定要求的荧光强度的单细胞菌体,进行培养并测定酶活,筛选出比野生型酶活有提高的突变体。
12.如权利要求11所述的应用,其特征在于,所述重组菌株是大肠杆菌,且在发酵条件下具有L-半胱氨酸生产能力。
13.如权利要求12所述的应用,其特征在于,所述大肠杆菌是E. coli W3110,且敲除了L-半胱氨酸降解途径基因tanA和yhaM,同时表达L-半胱氨酸合成途径基因cysE,以使得菌株在发酵条件下具有L-半胱氨酸生产能力。
14.一种CcdR突变体,其特征在于,相对于野生型CcdR而言,存在V94I,M104V或K154I突变,其中野生型CcdR氨基酸序列如SEQ ID No.19所示。
15.编码如权利要求14所述的CcdR突变体的编码基因。
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半胱氨酸单细胞生物传感器的构建及应用;刘川等;《中国食品添加剂》;20181231(第5期);第147-154页 * |
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