CN112481278A

CN112481278A - 一种基于aip诱导的生物传感器及其应用

Info

Publication number: CN112481278A
Application number: CN202011449689.8A
Authority: CN
Inventors: 周哲敏; 韩来闯; 崔文璟; 程中一; 刘中美; 周丽; 郭军玲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2021-03-12
Anticipated expiration: 2040-12-09
Also published as: CN112481278B

Abstract

本发明公开了一种基于AIP诱导的生物传感器及其应用，属于基因工程技术领域。本发明将agr群体感应系统感受AIP的关键组分异源构建至枯草芽孢杆菌168中，使其能够在AIP的诱导下表达绿色荧光蛋白sfGFP。利用该系统，可以通过sfGFP的表达荧光反应AIP的浓度。同时将AIP合成相关基因异源构建至大肠杆菌中，使得大肠杆菌能够合成分泌AIP，获得AIP产生菌。在AIP产生菌中建立AIP的突变体库，在AIP感应菌种筛选突变的AIP，实现AIP高通量突变和筛选。该系统能够方便地研究AIP不同位点突变对其功能的影响，并且获得具有不同特性的突变体AIP。

Description

一种基于AIP诱导的生物传感器及其应用

技术领域

本发明涉及一种基于AIP诱导的生物传感器及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的agr群体感应系统(agrQS)系统是目前研究最为透彻的群体感应系统，与S.aureus的致病性调控有关。agrQS系统主要包括编码信号分子前体的基因agrD，加工AIP合成的基因agrB，传递AIP浓度信号的agrC、agrA双组份系统和效应启动子等主要组分。其利用C端含有环化硫酯键的自诱导肽(Auto-inducing peptide，AIP)作为信号分子，成熟AIP含有8个氨基酸。AIP的合成随着S.aureus的生长同步进行，当S.aureus种群数量达到一定丰度时，高浓度的AIP积累可以激活其受体蛋白AgrC，AgrC磷酸化转录因子AgrA，进一步激活下游一系列基因表达，增强S.aureus的致病性。因此，AIP是S.aureus种群数量及致病性检测的一个关键指标。作为一种小分子肽，AIP的检测比较困难，缺乏简便易行的方法。目前，需要进行复杂的提纯、浓缩，然后使用超高效液相色谱技术才能检测S.aureus产生的AIP。

利用基因表达调控元件(如启动子、转录因子、核糖开关和抗终止子)改造和构建生物传感器是检测生物活性物质的一种有效手段。例如，Lummy Maria Oliveira Monteiro等通过改造AraC转录因子，使其响应阿司匹林，并在大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)中构建阿司匹林生物传感器。该传感器有望在人体内通过服用阿司匹林来诱导抗肿瘤药物的合成，进而应用于肿瘤的生物治疗。(Monteiro L M O,Arruda L M,Sanches-MedeirosA,et al.Reverse Engineering of an Aspirin-Responsive TranscriptionalRegulator in Escherichia coli[J].ACS Synthetic Biology,2019,8(8).)AlicjaDaszczuk等通过DNA微阵列技术高通量筛选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，B.subtilis)启动子，得到一系列枯草芽孢杆菌暴露于腐败肉类时上调表达的启动子，并利用上调表达幅度最高启动子P_sboA构建了可以检测肉类腐败程度的生物传感器。(DaszczukA,Dessalegne Y,Drenth,Ismaêl,et al.Bacillus subtilis Biosensor Engineered ToAssess Meat Spoilage[J].Acs Synthetic Biology,2014,3(12):999-1002.)

如何成功的构建一种灵敏度高、操作简单、成本低且稳定性高的生物传感器，用以检测样本中的AIP的含量成为研究的难点，开发一种简单、快速、高效的检测样本中的自诱导多肽AIP的含量的方法，对于临床上用于S.aureus种群数量及致病性检测均具有重要意义。

发明内容

为了得到一种简单、快速、高效的检测样本中的自诱导多肽AIP含量的方法，本发明首先提供了一种生物传感器，所述生物传感器含有启动子P3、启动子P43、agrC基因、agrA基因和编码标记物的基因；

所述启动子P43调控agrC基因和agrA基因的表达，所述启动子P3调控编码标记物的基因表达，所述启动子P3上包含agrA基因结合位点的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述agrC基因可感受AIP浓度信号；所述agrA基因受AgrC磷酸化激活。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子P3、启动子P43、agrC基因、agrA基因位于载体上，所述启动子P3和启动子P43转录方向相反。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子P3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子P43的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述agrC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述agrA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述载体包括pHT系列质粒、pMA09系列质粒、pUB系列质粒、pKOR系列质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述标记物为荧光蛋白。

本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞以染色体上含有启动子P43、agrC基因和agrA基因的细胞为宿主细胞，以含有启动子P3和标记物基因的质粒为表达载体；所述启动子P43调控agrC基因和agrA基因的表达，所述启动子P3调控标记物基因表达，所述启动子P3上包含调控agrA基因结合位点的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述标记物为荧光蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述荧光蛋白sfGFP基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

本发明还提供了一种构建上述重组细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将编码如SEQ ID NO.1所示的启动子P3和标记物基因依次连接在载体上，构建表达载体；

(2)将编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的agrC基因和编码核苷酸序列如SEQID NO.4所示的agrA基因依次连接在枯草芽孢杆菌的染色体上的启动子P43之后，构建宿主细胞；

(3)将步骤(1)的载体导入步骤(2)的宿主细胞中得到重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌WB600、枯草芽孢杆菌WB800、枯草芽孢杆菌3NA。

本发明还提供了上述生物传感器，或上述重组细胞在检测自诱导多肽AIP含量中的应用。

本发明还提供了一种检测自诱导多肽AIP含量的方法，所述方法为，将上述重组枯草芽孢杆菌接种至培养基中，培养菌体细胞，检测荧光蛋白表达量，通过荧光蛋白表达量的强弱检测自诱导多肽AIP含量。

在本发明的一种实施方式中，将上述重组枯草芽孢杆菌接种至含有相应抗性的LB固体培养基上划线，挑取单菌落接种至含有5mL LB液体培养基的试管中，在200r·min^-1，37℃培养12h，得到种子液；然后按2％(v/v)的接种量将种子液转接入含有5mL LB液体培养基以及AIP的试管中，在37℃，200rpm条件下培养。

在本发明的一种实施方式中，所述自诱导多肽AIP含量的检测限为0.01-1nM。

在本发明的一种实施方式中，所述自诱导多肽AIP含量的计算公式如下：

其中y是荧光强度，x是AIP浓度；

本发明还提供了上述生物传感器，或上述重组细胞在制备检测含有自诱导多肽AIP的产品中的应用。

本发明还提供了一种AIP的高通量检测方法，所述方法包括以下步骤：(1)AIP产生菌的构建；(2)AIP产生菌的培养；(3)AIP感应菌的培养；(4)AIP的高通量检测。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)AIP产生菌的构建：构建含有agrD基因和agrB基因的重组质粒；将重组质粒转化至大肠杆菌JM109(DE3)中，获得含有可生成AIP的基因的重组菌。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)AIP产生菌的培养：挑取AIP产生菌的单菌落接种至含有600μL LB液体培养基的96孔板中，在37℃400rpm培养12h，得到种子液；分别将种子液按照2％(v/v)的接种量接种至新的含有600μL LB液体培养基的96孔板中，同时加入终浓度为1mM的IPTG诱导AIP的表达，在37℃，400rpm下培养12h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)AIP感应菌的培养：按照上述重组细胞(即为AIP感应菌)的构建方法构建AIP感应菌；挑取AIP感应菌的单菌落接种至含有600μL LB培养基的96孔板中，在37℃400rpm培养12h，得到种子液；分别将种子液按照2％(v/v)的接种量接种至新的含有600μL LB液体培养基的96孔板中。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)AIP的高通量检测：向步骤(3)得到的含有种子液的96孔板中加入步骤(2)得到的培养好的AIP产生菌，在37℃，400rpm条件下培养12h后；检测sfGFP表达荧光；取200μL细菌培养液至96孔黑壁透明底酶标板，放入SynergyTM H4荧光酶标仪检测OD₆₀₀和荧光。检测荧光时，激发光波长为485nm，吸收光波长为528nm。通过荧光强度检测AIP含量。

本发明还提供了一种AIP突变体的高通量检测方法，所述方法的具体步骤同AIP的高通量检测方法，区别在于，含有AIP突变体的重组菌的构建方法：通过PCR方法向AIP表达质粒上引入随机突变，并转化至大肠杆菌JM109(DE3)中，获得含有不同AIP突变体质粒的重组菌。

有益效果

(1)本发明将金黄色葡萄球菌agrQS中基因表达调控关键元件异源构建至枯草芽孢杆菌中，构建高性能的基于AIP诱导的生物传感器。经测试，表明该系统可以高灵敏地响应0.01～1nM浓度范围的AIP。

(2)本发明通过构建AIP突变体库，采用本发明提供的基于AIP诱导的生物传感器可以检测哪些AIP突变体依然保留激活功能，哪些突变导致AIP失去功能；这对于研究AIP序列和功能之间的关系具有重要作用。

附图说明

图1：AIP生物传感器功能验证；其中，a：AIP诱导sfGFP表达随时间变化；b：12h荧光强度和AIP浓度非线性拟合。

图2：AIP高通量筛选示意图。

图3：AIP突变体库筛选。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的培养基如下:

LB固体培养基(L^-1)：胰蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母提取物5g，琼脂粉20g，pH7.0。

LB液体培养基(L^-1)：胰蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母提取物5g，pH 7.0。

下述实施例中所涉及的制备方法如下：

人工合成AIP的方法：

本发明中用于测试传感器检测效能的AIP由上海科肽公司化学合成，其合成产品为冻干粉末状态。称取粉末溶于20mM Tris-HCL(pH7)缓冲液中，终浓度为100mM，配制AIP母液。并于-80℃条件下冷冻保存。使用时于冰上融化，并用20mM Tris-HCL(pH7)缓冲液进行适当稀释。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

sfGFP荧光强度的检测方法：

取200μL细菌培养液至96孔黑壁透明底酶标板，放入SynergyTM H4荧光酶标仪检测OD₆₀₀和荧光。检测荧光时，激发光波长为485nm，吸收光波长为528nm。

下述实施例中所涉及的引物序列如下：

表1基于AIP诱导的生物传感器构建引物

实施例1：含有agrC基因、agrA基因的重组枯草芽孢杆菌的构建

具体步骤如下：

(1)以P43-agrCA-P1/P43-agrCA-P2为引物，以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板，扩增P43启动子序列。以P43-agr-CA-i1/P43-agr-CA-i2为引物，以pXylA-agrCA-I质粒(公开于Marchand N,Collins C H.Peptide-based communication systemenablesEscherichia colitoBacillus megateriuminterspecies signaling[J].Biotechnology and Bioengineering,2013.)为模板，扩增得到agrC-agrA基因片段，也即，扩增得到agrCA基因片段。

(2)以P43-agrCA-v1/P43-agrCA-v2为引物，以pBPrpoB-sfGFP质粒(公开于Han L,Chen Q,Lin Q,et al.Realization of Robust and Precise Regulation of GeneExpression by Multiple Sigma Recognizable Artificial Promoters[J].Frontiersin Bioengineering and Biotechnology,2020,8.)为模板，扩增得到载体骨架。

(3)然后通过Gibson Assembly方法将步骤(1)和步骤(2)得到的片段进行无缝克隆，构建质粒pBP43-agrCA。

(4)以Pint-agr-i1/Pint-agr-i2为引物，以质粒pBP43-agrCA为模板，扩增得到P43-agrCA片段；以Pint-agr-v1/Pint-agr-v2为引物，以质粒pAX01位模板，扩增得到载体骨架；将扩增得到P43-agrCA片段和扩增得到载体骨架通过Gibson Assembly方法无缝克隆，构建质粒pAXP43-agrCA。

(5)用引物PlacA-up-1/PlacA-down-2扩增质粒pAXP43-agrCA上的“lacA(核苷酸序列如的SEQ ID NO.6所示)上游同源臂-P43-agrCA-lacA下游同源臂”片段，并将该片段转化至枯草芽孢杆菌168中，经红霉素抗性筛选和菌落PCR鉴定，获得在lacA位点整合有P43-agrCA基因片段的重组枯草芽孢杆菌，并命名为BsCA。

实施例2：重组质粒的构建

具体步骤如下：

(1)以PP3-sfGFP-i1/PP3-sfGFP-i2作为引物，以pP-sfGFP质粒(公开于Yan X,YuH J,Hong Q,et al.Cre/lox System and PCR-Based Genome Engineering in Bacillussubtilis[J].Appl Environ Microbiol,2008,74(17):5556-5562.)作为模板，扩增得到P3启动子。

(2)以PP3-sfGFP-v1/PP3-sfGFP-v2作为引物，以pHT-PAWH-sfGFP质粒(公开于HanL,Chen Q,Lin Q,et al.Realization of Robust and Precise Regulation of GeneExpression by Multiple Sigma Recognizable Artificial Promoters[J].Frontiersin Bioengineering and Biotechnology,2020,8.)作为模板，扩增sfGFP表达载体骨架。

(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的片段通过Gibson Assembly方法连接，构建得到重组质粒pHT-P3-sfGFP。

实施例3：生物传感器的构建及AIP浓度的检测

具体步骤如下：

(1)将实施例2得到的重组质粒pHT-P3-sfGFP转化至实施例1得到的BsCA中，验证正确之后，得到重组枯草芽孢杆菌，即生物传感器，也即AIP感应菌。

(2)将步骤(1)得到的重组枯草芽孢杆菌接种至含有5mL LB培养基的试管中，在200r·min^-1，37℃条件下培养12h，得到种子液；然后按2％(v/v)的接种量将种子液转接入含有5mL LB液体培养基的试管中，在37℃，200rpm条件下培养，同时向试管中加入不同浓度的人工合成的AIP，检测sfGFP表达。

结果如图1和表2所示，不加入AIP时，荧光强度非常低，sfGFP仅有极少量的本底表达。随着AIP添加浓度提升，sfGFP的表达量也明显提升。从结果得知，该系统能够响应非常宽的AIP浓度范围(0.01-1nM)。并且，将sfGFP荧光强度和AIP浓度进行非线性拟合，发现其能完美拟合酶促动力学的米氏方程，表明该传感系统能够非常精准地反映培养基中AIP的浓度；所述自诱导多肽AIP含量的计算公式如下：

其中，y是荧光强度，x是AIP浓度；

表2AIP诱导sfGFP表达的12h荧光强度

AIP浓度(nM)	荧光强度(a.u./OD<sub>600</sub>)
		0.01	1476
0.05	65341
		0.1	177587
0.15	372811
		0.2	515241
0.25	799679
		0.3	908536
0.35	958519
		0.4	1094721
0.45	1177181
		0.5	1252769
0.6	1312667
		0.7	1421259
0.8	1464571
		0.9	1436073
1.0	1509350

实施例4：AIP突变体库构建和高通量筛选

总体思路如下：

将金黄色葡萄球菌的agr群体感应系统中负责AIP合成的主要元件agrD、agrB在大肠杆菌中表达，以得到AIP产生菌。只需要对质粒上的agrD基因进行突变，便可获得各种AIP突变体。成熟AIP为8个氨基酸组成的环肽，氨基酸序列为“YSTCDFIM”，其中第四位的C和第八位的M通过硫酯键成环。该硫酯键为AIP活性所必须，因此对除C和M以外的氨基酸位点进行突变体库的建立和筛选(如图2所示)。

具体步骤如下：

(1)构建pET28a-agrD-agrB质粒：

使用引物Ppet-agrD-i1/Ppet-agrD-i2扩增pT7-agrBD-I质粒(公开于MarchandN,Collins C H.Peptide-based communication system enablesEscherichiacolitoBacillus megateriuminterspecies signaling[J].Biotechnology andBioengineering,2013.)，获得核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的agrD片段；使用引物Ppet-agrD-v1/Ppet-agrD-v2扩增pET28a(+)质粒，获得载体骨架；采用Gibson Assembly方法连接agrD片段和载体骨架，将agrD克隆至pET28a(+)载体中启动子P_T7下游，构建得到质粒pET28a-agrD；

使用引物Ppet-agrB-i1/Ppet-agrB-i2扩增pT7-agrBD-I质粒(公开于MarchandN,Collins C H.Peptide-based communication system enablesEscherichiacolitoBacillus megateriuminterspecies signaling[J].Biotechnology andBioengineering,2013.)，获得核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的agrB片段；使用引物Ppet-agrB-v1/Ppet-agrB-v2扩增pET28a-agrD质粒，获得载体骨架；采用Gibson Assembly方法将agrB片段和载体骨架连接，将agrB克隆至pET28a-agrD质粒中启动子P_lac下游，构建得到质粒pET28a-agrD-agrB；

(2)使用表3中的引物扩增pET28a-agrD-agrB质粒，将随机突变分别引入Y、S、T、D、F、I位点，转化至大肠杆菌JM109(DE3)中，得到重组菌(AIP产生菌)，构建对应的单位点随机突变体库。

(3)分别挑取步骤(2)得到的AIP产生菌的单菌落接种至含有600μL LB液体培养基的96孔板中，在37℃400rpm培养12h，得到种子液；分别将种子液按照2％(v/v)的接种量接种至至新的含有600μL LB液体培养基的96孔板中，同时加入终浓度为1mM的IPTG诱导AIP的表达，在37℃400rpm下培养12h。

(4)采用实施例3步骤(1)相同的方法制备得到的AIP感应菌，挑取AIP感应菌的单菌落接种至含有600μL LB培养基的96孔板中，37℃400rpm培养12h，得到种子液；分别将种子液按照2％(v/v)的接种量接种至新的含有600μL LB液体培养基的96孔板中，得到含有AIP感应菌的培养液。

(5)向步骤(4)得到的含有种子液的96孔板中加入步骤(3)得到的培养好的AIP产生菌，在37℃，400rpm条件下培养12h后，得到培养液；检测sfGFP表达荧光：取200μL培养液至96孔黑壁透明底酶标板，放入SynergyTM H4荧光酶标仪检测OD₆₀₀和荧光；检测荧光时，激发光波长为485nm，吸收光波长为528nm。

将培养好的AIP产生菌培养液转移至含有AIP感应菌的AIP生物传感系统中进行AIP活性筛选，结果见图3。如图3所示，该系统可以检测哪些AIP突变体依然保留激活功能，哪些突变导致AIP失去功能。这对于研究AIP序列和功能之间的关系具有重要作用。

构建突变体所用引物见表3。

表3 AIP突变体库构建引物

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种基于AIP诱导的生物传感器及其应用

<130> BAA201318A

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列

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ttaatatttt aacataaaaa aatttacagt taagaataaa aaacgactag ttaagaaaaa 60

ttggaaaata aatgctttta gcatgtttta atataactag atcacagaga tgtg 114

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<212> DNA

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tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60

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tttgcgtttt tgccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180

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gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300

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ctaatgtgtg tttacgacaa ttctcacttc atacttttcc atcgtcaggt cgcctgacaa 60

tatgtctcct gtcattatgt ccttcacact ctgatcaaac gtgaccagct gtttttcttc 120

cgtgaaattc atgacaaaaa tataatcatt gtcctgatcc tgcctcgctt gtacggagac 180

gccttttccg tgccgaaccg gaaaaactgg agagagagac aggtctgtga tcagaccctc 240

atagaaatca cgctgaaatt gatcctccaa acgcgcgccg ataaaatacg ccttgccctg 300

ctgatactca tggcttgtga ccgctggcgt gcgcgcataa aaatcttctt gatacaccgc 360

ttccactgaa gctgtcttta catcaatcac ggttgcataa tccttcattt catatatttg 420

gctgcggtag ctgacagcgt ttcgatcctt cggatacagg gtgtccgttt caagaggctc 480

aactccaaat atagcttgaa gatccggatg ccatccgcct gtgtatgtta agtcatgctc 540

attcacaacc ccgctgatat acgtcatgac taaggtgccg ccgtcagccg taaacgcttt 600

taaacgggaa acggtgtcct cgctgattaa atacagcatc gggacgatca gcagtttata 660

tggtgaaaag tcttgttctt tcgtgatgac gtcgacaggg atatcgtgtt cccagaatgt 720

gcggtaatgc tgctgaagcg tttgcggata acgttttgtc gccttcgcaa acccctgagc 780

atcctcgagc gcccaatgat tttcccagtc atataaaatc gcggtttgag ccggcctctt 840

cgttccgaca acttcggaca gccgttccaa tgtctcgcct accttggcca cttcttgaaa 900

gacgcggttc ttcgggctat tgtcatgatc cacaaccgct ccgtgtaatt tttctgatga 960

cccccgtgat ttgcggtatt ggaaatagag aacgctgtcc gagccgtggg caatcatttg 1020

catggatgac agcagattca tgcccgggcg ctttgccttg ttgacgttat gccaattgac 1080

cgcgcttggc gtacactcca ttaataagaa gggctgctgc ttcaagcttc ggtacagatc 1140

attgataaag ccgaccttca tcgccaaatc agctgtgctt tcccagtcat tgtgccagac 1200

aggataagcg tcccagctga tggcatcgac atgctttgca aatttgctgt agtcgaggcc 1260

ctgatacggg atcaaatccg gtgtgtcagc cataaaattc gttgtgatag ggatatcagg 1320

cgtcaattct ttcagcggaa tgatttcatt ttcataaaac gaaatcgttt gatcggtgac 1380

gaaccggcgc caatctaaat tcaggccatg caagccattt tcaccgatcg gcgaagggct 1440

ttcaatttgt gaccagtcat tgaacgtatg gctccaaaaa ggggtccacc acgcatggtt 1500

caatgtcttg aggctgttgt catatttcga tttcagccac tcccggaaag catgctggca 1560

taaatcacag tggcaatctc ccccgtattc gtttgaaatg tgccacatta acagcgccgg 1620

gtgatgtccg tatcgttctg ctaataagcg gttgatgtgc cgtgtttttt ctcggtagac 1680

tttagatgtg aggcagtggt tgtgccttcc gccgtgcagc tgtttgacgc gggaggcatt 1740

gacgcgcaaa acttccggat aggtttgcga cagccaggcc ggacgggctc cgctcggcgt 1800

tgctaatatg acccggccgc ctatactgtg aatccgctca aaaatatcat ccagccattc 1860

aaattgatat acgccctcct ccggctcaag tgcgctccat gcaaaaatgc cgacagaaaa 1920

cgtattcgta tgagaaagct tcatcagttt gatatcgtca gctaaaatat cgggccgatc 1980

cagccactga tcggggttgt agtctccccc atggagcata aattttgctt ttgttacgtg 2040

cgttttttca agctttgaca tcac 2064

<210> 7

<211> 570

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgaattatt ttgataataa aattgaccag tttgccacgt atcttcaaaa gagaaataac 60

ttagatcata ttcaattttt gcaagtacga ttagggatgc aggtcttagc taaaaatata 120

ggtaaattaa ttgttatgta tactattgcc tatattttaa acatttttct gtttacgtta 180

attacgaatt taacatttta tttaataaga agacatgcac atggtgcaca tgcaccttct 240

tctttttggt gttatgtaga aagtattata ctatttatac ttttaccttt agtaatagta 300

aattttcata ttaacttttt aattatgatt attttaacag ttatttcttt aggtgtaatc 360

tcagtatatg ctcctgcagc aactaaaaag aagcccattc ctgtgcgact tattaaacga 420

aaaaaatatt atgcgattat tgttagttta acccttttca ttatcacact tatcatcaaa 480

gagccatttg cccaattcat tcaattaggc atcataatag aagctattac attattacct 540

attttcttta ttaaggagga cttaaaatga 570

<210> 8

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgaatacat tatttaactt attttttgat tttattactg ggattttaaa aaacattggt 60

aacatcgcag cttatagtac ttgtgacttc ataatggatg aagttgaagt accaaaagaa 120

ttaacacaat tacacgaata a 141

Claims

1.一种生物传感器，其特征在于，含有启动子P3、启动子P43、agrC基因、agrA基因和编码标记物的基因；

2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述启动子P3、启动子P43、agrC基因、agrA基因位于载体上，所述启动子P3和启动子P43转录方向相反。

3.根据权利要求1或2所述的生物传感器，其特征在于，所述标记物为荧光蛋白。

4.一种重组细胞，其特征在于，以染色体上含有启动子P43、agrC基因和agrA基因的细胞为宿主细胞，以含有启动子P3和标记物基因的质粒为表达载体；所述启动子P43调控agrC基因和agrA基因的表达，所述启动子P3调控标记物基因表达，所述启动子P3上包含调控agrA基因结合位点的序列。

5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述标记物为荧光蛋白；优选的，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌。

6.一种构建权利要求4或5所述的重组细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将编码如SEQ ID NO.1所示的启动子P3和标记物基因依次连接在载体上，构建重组载体；

(2)将编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的agrC基因和编码核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示的agrA基因依次连接在枯草芽孢杆菌的染色体上的启动子P43之后，构建宿主细胞；

(3)将步骤(1)的重组载体导入步骤(2)的宿主细胞中得到重组细胞。

7.权利要求1-3任一所述的生物传感器，或权利要求4或5所述的重组细胞在检测自诱导多肽AIP含量中的应用。

8.一种检测自诱导多肽AIP含量的方法，其特征在于，将权利要求4或5所述的重组细胞接种至培养基中，培养菌体细胞，检测荧光蛋白表达量，通过荧光蛋白表达量的强弱检测自诱导多肽AIP含量。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述自诱导多肽AIP含量的计算公式如下，其中y是荧光强度，x是AIP浓度；

10.权利要求1-3任一所述的生物传感器，或权利要求4或5所述的重组细胞在制备检测含有自诱导多肽AIP的产品中的应用。