CN113563435B - 一种促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的蛋白及其应用 - Google Patents
一种促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的蛋白及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种促进罗氏真养产碱杆菌生产聚‑3‑羟基丁酸酯的蛋白及其应用。所述促进罗氏真养产碱杆菌生产聚‑3‑羟基丁酸酯的蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。所述蛋白能够显著提高罗氏真养产碱杆菌株生长速率和PHB的产量，为高效生产PHB提供了新思路，此外，利用所述蛋白构建的基因工程菌能够以果糖或葡萄糖为碳源高效生产PHB，产量较野生菌株提高50%以上，为开发利用糖为碳源高效生产PHB的工艺奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物材料和微生物代谢工程技术领域，涉及一种促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的蛋白及其应用。
背景技术
聚-3-羟基丁酸酯（polyhydroxybutyrate，PHB）是一种在微生物细胞内形成的用于储存能量的聚合物，当微生物处于环境胁迫条件（如氮源缺乏）下，其自身会在胞内积累PHB以贮存碳源或能源。PHB具有良好的防潮性能，对气体也有良好的阻隔性，不溶于水，具有良好的抗水解侵蚀能力，还具有很强的抗紫外线能力，除了具有上述优异的材料性能，PHB也具有生物相容性和生物可降解性。PHB在医疗、农业、环保、化工等领域都得到了广泛的应用，尤其是在医疗材料方面，由于其具备优异的材料性能，被认为是一种具有广阔前景的生物可降解塑料。
虽然PHB等可降解塑料拥有绿色环保的特点，并且应用范围广泛，但到目前为止，所有可降解塑料的产量仅占塑料总产量的1%，目前主要采用生物法合成PHB，生产成本相对较高，限制了其推广应用，如何降低PHB生产成本，成为PHB研究领域的热点问题。
通过代谢工程等手段提高菌株的PHB产量，是降低PHB升产成本的一种重要手段，罗氏真养产碱杆菌是一种天然可合成PHB的菌种，在PHB研究领域被广泛研究和应用，如CN106119181A公开了一种产聚羟基丁酸羟基戊酸酯的基因工程菌及其应用方法，将来自罗氏真养产碱杆菌基因组的phaCAB基因簇，在谷氨酸棒杆菌WM001进行重组表达，构建的基因工程菌可利用单一碳源生产聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯（PHBV），且3HV的摩尔分数为66%，解决了PHBV生产中辅助碳源丙酸盐的添加带来的成本过高的问题，但并未提高菌株自身的生产能力。
综上所述，如何提高菌株合成PHB的能力，以提高PHB产量，从而降低成产成本，是目前PHB研究领域亟需解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的蛋白及其应用，本发明首次发现在罗氏真养产碱杆菌中过表达所述蛋白，能够有效提高罗氏真养产碱杆菌合成聚-3-羟基丁酸酯（PHB）的能力，构建过表达所述蛋白的罗氏真养产碱杆菌，利用该菌株能够高效生产PHB。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
SEQ ID NO.1：
MILTPEQVAAAQKANLETLFGLTTKAFEGVEKLVELNLQVVKTSFAEGVDNAKKALSAKDAQELLAIQAAAVQPVAEKTLAYTRHLYEIASETQSEFTKVAEAQLAEGSKNVQALVENLAKNAPAGSESTVAIVKSAISAANNAYESVQKATKQAVEIAETNFQAAATAATKAAQQASATARTATAKKTTAA。
本发明中，首次发现一种未知功能的蛋白能够提高罗氏真养产碱杆菌生产PHB的能力，在罗氏真养产碱杆菌中过表达该蛋白后，显著提高了菌株生长速率和PHB的产量，为高效生产PHB提供了新思路。
第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子包括第一方面所述促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的蛋白的编码基因。
优选地，所述核酸分子的碱基序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。
SEQ ID NO.2：
TCAGGCAGCCGTCGTCTTCTTTGCCGTGGCCGTACGGGCCGTGGCGCTGGCTTGCTGGGCAGCCTTGGTGGCAGCCGTAGCCGCAGCCTGGAAGTTGGTTTCAGCGATTTCGACCGCTTGCTTGGTCGCCTTCTGCACCGACTCGTAGGCGTTGTTGGCAGCGGAGATCGCCGACTTCACGATGGCCACGGTCGATTCCGAACCGGCCGGGGCGTTCTTGGCGAGGTTCTCGACCAGCGCTTGCACGTTCTTCGAGCCTTCGGCCAGTTGAGCCTCGGCTACCTTGGTGAACTCGCTCTGGGTTTCCGAAGCGATTTCATACAGGTGGCGGGTGTAGGCCAGGGTCTTTTCGGCAACCGGCTGCACGGCTGCGGCCTGGATGGCCAGCAGTTCCTGTGCGTCCTTGGCCGACAGCGCCTTCTTGGCGTTGTCAACGCCTTCTGCGAACGAAGTCTTGACGACCTGCAGGTTCAGCTCGACGAGCTTTTCGACGCCTTCAAACGCCTTGGTGGTCAGGCCGAACAGCGTTTCGAGGTTGGCCTTTTGCGCTGCTGCAACTTGTTCCGGGGTGAGGATCAT。
第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包括第二方面所述的核酸分子。
优选地，所述表达载体为含有第二方面所述的核酸分子的质粒载体或病毒载体，优选为质粒载体。
优选地，所述质粒载体为线性质粒pBBR1MCS。
本发明的表达载体含有所述促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的蛋白的编码基因，在宿主菌中能够稳定高效表达该蛋白。
第四方面，本发明提供一种基因工程菌，所述基因工程菌包括第三方面所述的表达载体。
优选地，所述基因工程菌为含有第三方面所述表达载体的罗氏真养产碱杆菌。
本发明的基因工程菌含有第三方面所述的表达载体，能够在胞内高效表达所述促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的蛋白，从而能够高效合成PHB。
第五方面，本发明提供一种构建第四方面所述的基因工程菌的方法，所述方法包括：
将第二方面所述的核酸分子插入载体中，得到表达载体，将所述表达载体导入宿主菌，得到所述基因工程菌。
优选地，所述宿主菌包括罗氏真养产碱杆菌。
优选地，所述方法包括以下步骤：
（1）通过Gibson组装技术将线性质粒pBBR1MCS与第二方面所述的核酸分子连接，然后转化大肠杆菌Dh5α感受态细胞，在LB平板上培养转化后细胞；
（2）挑取LB平板上菌落，进行PCR验证，然后将阳性克隆接种在液体LB培养基中培养，提取并纯化质粒；
（3）将纯化后的质粒转化大肠杆菌S17-1，然后涂布平板，培养，挑取单菌落进行PCR验证；
（4）将验证正确的大肠杆菌S17-1菌落接种于LB液体培养基上培养，同时在LB液体培养基中培养罗氏真养产碱杆菌，然后通过双亲结合将大肠杆菌S17-1菌中质粒转入罗氏真养产碱杆菌；
（5）通过PCR筛选重组罗氏真养产碱杆菌，获得所述基因工程菌。
第六方面，本发明提供一种生产聚-3-羟基丁酸酯的方法，所述生产聚-3-羟基丁酸酯的方法包括：
将第四方面所述的基因工程菌的种子液接入发酵培养基，进行培养，收集菌体并提取聚-3-羟基丁酸酯。
优选地，所述发酵培养基的配方按浓度计包括胰蛋白胨8~12 g/L（例如可以是8.2g/L、8.5 g/L、8.8 g/L、9 g/L、10 g/L、11 g/L、11.2 g/L、11.5 g/L或11.8 g/L）、酵母提取物4~6 g/L（例如可以是4.2 g/L、4.3 g/L、4.5 g/L、4.6 g/L或4.8 g/L）、氯化钠8~12 g/L（例如可以是8.2 g/L、8.5 g/L、8.8 g/L、9 g/L、10 g/L、11 g/L、11.2 g/L、11.5 g/L或11.8 g/L）和碳源10~60 g/L（例如可以是11 g/L、12 g/L、13 g/L、14 g/L、15 g/L、16 g/L、18 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L、40 g/L、45 g/L、50 g/L、52 g/L、54 g/L、56 g/L或58 g/L）。
优选地，所述碳源包括果糖和/或葡萄糖。
本发明中，通过在罗氏真养产碱杆菌中过表达蛋白（包括SEQ ID NO.2所示序列），促进了聚-3-羟基丁酸酯的合成，提高了菌株的生长速率和PHB合成效率，同时为开发利用糖为碳源高效生产PHB的工艺奠定了基础。
优选地，所述培养的时间为48~72 h（例如可以是49 h、50 h、51 h、52 h、53 h、54h、55 h、60 h、62 h、65 h、66 h、68 h、69 h、70 h或71 h），所述培养的温度为25~30℃（例如可以是26℃、27℃、28℃或29℃）。
第七方面，本发明提供如第一方面所述的促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的蛋白在促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯中的应用。
第八方面，本发明提供如第一方面所述的促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的蛋白、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体或第四方面所述的基因工程菌在制备聚-3-羟基丁酸酯中的应用。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
（1）本发明首次发现一种未知功能的蛋白能够提高罗氏真养产碱杆菌生产PHB的能力，在罗氏真养产碱杆菌中过表达该蛋白后，显著提高了菌株生长速率和PHB的产量，为高效生产PHB提供了新思路；
（2）本发明构建的基因工程菌能够以糖为碳源高效生产PHB，产量较野生菌提高50%以上，为开发利用糖为碳源高效生产PHB的工艺奠定了基础。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例扩增所述促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的蛋白的编码基因。
配制LB液体培养基，向水中加入5 g/L酵母浸粉、10 g/L胰蛋白胨和10 g/L NaCl，搅拌均匀，调节pH为7.0，随后于121℃高压灭菌20 min。向LB液体培养基中按质量百分比加入1.5%的琼脂即为LB固体培养基。在LB液体培养基中培养（30℃，200 转/分钟）罗氏真养产碱杆菌H16（Cupriavidus necator H16，购自德国微生物和细胞保藏中心GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures），然后提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，以上游引物5’-TCAGGCAGCCGTCGTCTTCT-3’（Primer F）和下游引物5’-ATGATCCTCACCCCGGAAC-3’（Primer R）PCR扩增所述促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的蛋白的编码基因（序列如SEQ ID NO.2所示），PCR反应体系如表1所示，PCR反应程序为：94℃，5 min；98℃，30 s；60℃，30 s；72℃，2 min，30个循环；72℃，10 min；10℃，1 h。
表1
| 成分 | 体积（μL） |
| 罗氏真养产碱杆菌DNA | 1 |
| Primer F (10 μM) | 1 |
| Primer R (10 μM) | 1 |
| 2.5 mM×dNTPs | 4 |
| TransStart <i>FastPfu</i> buffer | 10 |
| Stimulant | 10 |
| TransStart<i> FastPfu</i> DNA Polymerase | 1 |
| ddH<sub>2</sub>O | 22 |
| 总体积 | 50 |
实施例2
本实施例通过琼脂糖凝胶电泳对实施例1得到的PCR产物进行纯化。
称取0.2 g琼脂糖加入20 mL 1×TEA溶液中并加热溶解，然后加入1 μL核酸染料后混匀倒入槽中制胶，得到琼脂糖凝胶，向50 μL所述PCR产物中加入10 μL上样缓冲液后混匀，再将其加入琼脂糖凝胶的上样孔中，并加入相应的DNA marker，电压121 V，电流200 mA电泳35 min，用凝胶成像仪观察电泳情况并记录，回收和纯化DNA片段，并检测浓度，得到所述促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的蛋白的编码基因。
实施例3
本实施例构建含有所述促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的蛋白的编码基因的表达载体。
利用限制性内切酶SalI酶切载体pBBR1MCS2，并进行纯化，然后将纯化后的酶切反应产物与实施例2纯化得到的基因片段进行Gibson组装，Gibson组装反应条件：50℃反应3h，冰浴10 min，反应结束后，将反应产物转化进入大肠杆菌Dh5α中：将大肠杆菌Dh5α感受态放置冰上融化，将10 μLGibson组装产物加入已融化的感受态细胞中混合均匀，冰浴30min，将混合液放置于42℃水浴中90 s，然后置于冰中2 min，加入500 μL LB液体培养基，37℃、200 rpm培养45 min，取100 μL复苏后的菌液涂布于带有相应抗性的LB固体平板上，37℃培养16 h，挑取单菌落验证重组菌，然后挑取阳性克隆，在LB液体培养基中37℃培养，提取质粒，得到所述含有促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的蛋白的编码基因的表达载体，并储存于-20℃冰箱中。
实施例4
本实施例构建过表达所述促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的蛋白的基因工程菌。
将实施例3制备的表达载体转化进入大肠杆菌S17-1中，含有表达载体的大肠杆菌S17-1为接合转化的供体菌，以罗氏真养产碱杆菌 H16（Cupriavidus necator H16）为受体菌，将供体菌S17-1和受体菌分别在LB液体培养基中30℃培养，随后将供体菌和受体菌混合均匀，将得到的混合菌液接种于无抗LB固体平板培养基中培养24 h，然后涂至含有卡纳霉素和庆大霉素的双抗LB固体平板上培养48 h，挑取上述平板中生长的单克隆，进行液体培养和菌液PCR验证，将验证正确的基因工程菌株进一步于LB液体培养基中30℃培养提取质粒并进行PCR验证，取验证正确的菌株，即为所述过表达所述促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的蛋白的基因工程菌，储存于-20℃冰箱中。
实施例5
按实施例1所述分别配制不含碳源的LB液体培养基，分别在LB液体培养基中加入20 g/L果糖或葡萄糖作为发酵培养基，然后以上述培养基分别培养实施例4获得的基因工程菌，以培养野生罗氏真养产碱杆菌 H16作为对照，首先在LB液体培养基中30℃培养48 h作为种子液，然后以10%（v/v）的接种量，将种子液接种于发酵培养基培养48 h。发酵结束后，收集菌体，在菌体中加入氯仿充分混匀，然后在100℃下消化4 h，使聚合物解聚成单体，样品冷却至室温后，加入蒸馏水并震荡，待上述样品静置分层后，取下层清液进行气相色谱检测聚-3-羟基丁酸酯含量。检测方法如下：气相色谱柱：Analytical Tenchnology SE-54毛细管柱，柱温箱温度240℃，气相载体为氮气、氢气和空气，升温程序：首先80℃保留1.5min，再以30 ℃/min的速率升温至140℃，然后以40 ℃/min的速率升温至240℃并保留2min。
以葡萄糖为碳源时，野生罗氏真养产碱杆菌H16的PHB产量为20.1 g/L，基因工程菌的PHB产量为30.6 g/L，以果糖为碳源时，野生罗氏真养产碱杆菌H16的PHB产量为18.9g/L，基因工程菌的PHB产量为29.6 g/L，由此可知，过表达本发明促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的蛋白的基因工程菌能够以果糖或葡萄糖为碳源高效生产PHB，与低表达所述蛋白的野生菌相比，PHB产量提高50%以上，表明本发明发现的促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的蛋白能够显著提高罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的能力，所构建的基因工程菌能够利用果糖或葡萄糖为碳源高效生产PHB。
综上所述，本发明首次发现一种未知功能的蛋白能够提高罗氏真养产碱杆菌生产PHB的能力，能够显著提高罗氏真养产碱杆菌株生长速率和PHB的产量，为高效生产PHB提供了新思路，此外，所构建的基因工程菌能够以果糖或葡萄糖为碳源高效生产PHB，产量较野生菌株提高50%以上，为开发利用果糖或葡萄糖为碳源高效生产PHB的工艺奠定了基础。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院过程工程研究所
<120> 一种促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯的蛋白及其应用
<130> 20210915
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ile Leu Thr Pro Glu Gln Val Ala Ala Ala Gln Lys Ala Asn Leu
1 5 10 15
Glu Thr Leu Phe Gly Leu Thr Thr Lys Ala Phe Glu Gly Val Glu Lys
20 25 30
Leu Val Glu Leu Asn Leu Gln Val Val Lys Thr Ser Phe Ala Glu Gly
35 40 45
Val Asp Asn Ala Lys Lys Ala Leu Ser Ala Lys Asp Ala Gln Glu Leu
50 55 60
Leu Ala Ile Gln Ala Ala Ala Val Gln Pro Val Ala Glu Lys Thr Leu
65 70 75 80
Ala Tyr Thr Arg His Leu Tyr Glu Ile Ala Ser Glu Thr Gln Ser Glu
85 90 95
Phe Thr Lys Val Ala Glu Ala Gln Leu Ala Glu Gly Ser Lys Asn Val
100 105 110
Gln Ala Leu Val Glu Asn Leu Ala Lys Asn Ala Pro Ala Gly Ser Glu
115 120 125
Ser Thr Val Ala Ile Val Lys Ser Ala Ile Ser Ala Ala Asn Asn Ala
130 135 140
Tyr Glu Ser Val Gln Lys Ala Thr Lys Gln Ala Val Glu Ile Ala Glu
145 150 155 160
Thr Asn Phe Gln Ala Ala Ala Thr Ala Ala Thr Lys Ala Ala Gln Gln
165 170 175
Ala Ser Ala Thr Ala Arg Thr Ala Thr Ala Lys Lys Thr Thr Ala Ala
180 185 190
<210> 2
<211> 579
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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cttggtcgcc ttctgcaccg actcgtaggc gttgttggca gcggagatcg ccgacttcac 180
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cttttgcgct gctgcaactt gttccggggt gaggatcat 579
Claims (1)
1.一种蛋白在促进罗氏真养产碱杆菌生产聚-3-羟基丁酸酯中的应用；
所述蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；
所述蛋白的使用方式包括：
将所述蛋白的编码基因插入线性质粒pBBR1MCS中，得到表达载体，将所述表达载体导入罗氏真养产碱杆菌Cupriavidus necator H16，得到基因工程菌；
将所述基因工程菌的种子液接入发酵培养基，进行培养，收集菌体并提取聚-3-羟基丁酸酯；
所述发酵培养基的配方按浓度计包括胰蛋白胨8~12 g/L、酵母提取物4~6 g/L、氯化钠8~12 g/L和碳源10~60 g/L；
所述碳源为果糖和/或葡萄糖。
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2021
- 2021-09-23 CN CN202111110114.8A patent/CN113563435B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109295085A (zh) * | 2018-10-19 | 2019-02-01 | 北京化工大学 | 一种生产乳酸和3-羟基丁酸共聚酯的基因工程菌及其构建方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| New Insight into the Role of the PhaP Phasin of Ralstonia eutropha in Promoting Synthesis of Polyhydroxybutyrate;GREGORY M. YORK;《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》;20011231;第183卷(第7期);2394-2397 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113563435A (zh) | 2021-10-29 |
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