CN117965593A - 一种生产3-羟基丁酸的菌株及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产3‑羟基丁酸的菌株及其构建方法和应用。所述构建方法包括如下步骤：S1：体外扩增phaA、phaB、tesB基因的序列，将基因的序列连接成单一片段，将单一片段导入质粒；S2：将S1所述质粒导入菌株中。本发明利用工程菌发酵生产3‑HB，通过对联合代谢途径进一步优化、发酵中添加乙酸钠底物，减少了中间代谢产物乙酸对细菌3‑HB产量的影响，进一步提高了3‑HB的产量。生产工艺简单、生产效率高，适用于工业化连续性生产。
Description
技术领域
本发明涉及工业微生物技术领域，特别涉及一种生产3-羟基丁酸的菌株及其构建方法和应用。
背景技术
3-羟基丁酸(3-hydroxybutyric acid，3-HB)是一种具有广泛应用潜力的重要化学品，能够参与可生物降解塑料的合成，作为生物降解塑料聚3-羟基丁酸(PHB)的单体，通过微生物发酵或化学合成方法制备PHB。PHB具有良好的生物降解性和生物相容性，可用于包装材料、医疗器械、农业覆盖物等，还可以和其他生物聚合物共聚，以改善其物理性质，如聚(3-羟基丁酸酯-4-羟基丁酸酯、聚(3-羟基丁酸酯-6-羟基己酸酯)等。
3-HB单体通过聚合形成PHB后，可用于多方面应用，尤其是环保方面。随着环保要求提高，在包装领域生物可降解材料越来越受到关注，正在逐步取代传统不可降解塑料。聚羟基丁酸酯的物理性能，机械性能与聚丙烯类似，并且具有可生物降解性，在自然界中降解产物为二氧化碳和水，对环境无污染，故在包装领域有广泛应用前景。因此，研究开发利用高效生产3-HB的方法对于推动生物基化学品的发展，减少对有限资源的依赖以及减少环境影响具有重要意义。近年来，利用生物法合成3-HB的方法受到了广泛关注。但目前3-HB的生产面临一个主要问题：中间产物乙酸的产量较大，导致流向3-HB的量大大减少，从而降低了生产效率，成为制约3-HB生产的最大挑战。因此，亟需一种能够提高3-HB产量的方法，以提高工业生产的效率，降低生产成本。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种生产3-羟基丁酸的菌株及其构建方法和应用。
本发明提供了一种生产3-羟基丁酸的菌株的构建方法，包括如下步骤：
S1：体外扩增phaA、phaB、tesB基因的序列，将基因的序列连接成单一片段，将单一片段导入质粒；所述tesB的核苷酸序列如SEQ ID No.63所示。
S2：将S1所述质粒导入菌株中。
进一步的，步骤S2所述菌株为Escherichia coli Nissle 1917、Escherichiacoli JM109、Halomonas sp.LY03、Lactobacillus gasseri ATCC 33323和Bacilluscoagulans DSM1中的任意一种。
本申请中使用的Halomonas sp.LY03菌株已于2023年4月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC地址：广州市先列中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070)。保藏号为GDMCC NO：63382。菌株名称为Halomonas sp.LY03，分类命名为Halomonas sp.。
进一步的，步骤S1中所述phaA为物种来源为Halomonas sp.TD01的phaATD、物种来源为Ralstonia eutropha的phaARE中的任意一种；所述phaATD的核苷酸序列如SEQ IDNo.61所示，所述phaARE核苷酸序列如SEQ ID No.64所示；
进一步的，步骤S1中所述phaB为物种来源为Halomonas sp.TD01的phaBTD、物种来源为Ralstonia eutropha的phaBRE中的任意一种。所述phaBTD的核苷酸序列如SEQ IDNo.62所示，所述phaBRE的核苷酸序列如SEQ ID No.65所示；
进一步的，步骤S1所述单一片段为tesB-phaATD-phaBTD、tesB-phaARE-phaBTD、tesB-phaARE-phaBRE、tesB-phaBTD-phaATD、phaATD-tesB-phaBTD、phaBTD-tesB-phaATD、phaATD-phaBTD-tesB、phaBTD-phaATD-tesB中的任意一种，优选为phaATD-tesB-phaBTD。
所述tesB-phaATD-phaBTD的核苷酸序列如SEQ ID No.53所示；所述tesB-phaARE-phaBTD的核苷酸序列如SEQ ID No.54所示；所述tesB-phaARE-phaBRE的核苷酸序列如SEQ IDNo.55所示；所述tesB-phaBTD-phaATD的核苷酸序列如SEQ ID No.56所示；所述phaATD-tesB-phaBTD的核苷酸序列如SEQ ID No.57所示；所述phaBTD-tesB-phaATD的核苷酸序列如SEQ IDNo.58所示；所述phaATD-phaBTD-tesB的核苷酸序列如SEQ ID No.59所示；所述phaBTD-phaATD-tesB的核苷酸序列如SEQ ID No.60所示；
本发明还提供一种生产3-羟基丁酸的菌株，由所述的构建方法得到。
本发明还提供一种使用所述的菌株生产3-羟基丁酸的方法，包括如下步骤：将菌株活化，进行摇瓶种子培养后在发酵培养基中进行发酵培养。
进一步的，所述发酵培养基中包括短链脂肪酸，优选为乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、戊酸钠中的任意一种。
进一步的，所述短链脂肪酸的添加量为3～12g/L。
进一步的，所述发酵的温度为36～42℃，pH为6～11，发酵的时间为12～48h。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
(1)本发明构建的联合代谢途径菌株，提高了3-HB的产量。
(2)本发明对联合代谢途径进一步优化、发酵中添加乙酸钠底物，减少了中间代谢产物乙酸对细菌3-HB产量的影响，进一步提高了3-HB的产量。
(3)本发明利用工程菌发酵生产3-HB，生产工艺简单、生产效率高，适用于工业化连续性生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明利用葡萄糖合成3-HB的途径通路图；
图2为本发明实施例1使用的pSEVA321tesB-phaA-phaB质粒图；
图3为本发明实施例1中tesB-phaA-phaB目的片段电泳图；
图4为本发明实施例2使用的pSEVA321tesB-phaARE-phaBTD质粒图；
图5为本发明实施例2使用的pSEVA321tesB-phaARE-phaBRE质粒图；
图6为本发明实施例2中tesB-phaARE-phaBTD目的片段电泳图；
图7为本发明实施例2中tesB-phaARE-phaBRE目的片段电泳图；
图8为本发明实施例3使用的pSEVA321tesB-phaARE-phaBTD质粒图；其中a图为2-pSEVA321tesB-phaB-phaA质粒图、b图为3-pSEVA321phaA-tesB-phaB质粒图、c图为4-pSEVA321phaB-tesB-phaA质粒图、d图为5-pSEVA321phaA-phaB-tesB质粒图、e图为6-pSEVA321phaB-phaA-tesB质粒图；
图9为本发明实施例3中tesB-phaB-phaA目的片段电泳图；
图10为本发明实施例3中phaA-tesB-phaB目的片段电泳图；
图11为本发明实施例3中phaB-tesB-phaA目的片段电泳图；
图12为本发明实施例3中phaA-phaB-tesB目的片段电泳图；
图13为本发明实施例3中phaB-phaA-tesB目的片段电泳图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
大肠杆菌Escherichia coli Nissle 1917本身不具有利用3-HB的能力，且没有生产3-HB的能力，因此本发明第一部分引入了从葡萄糖生成3-HB的合成途径，通过过表达不同来源的phaA、phaB、tesB三个基因，促进代谢通路流向3-HB。
为了提高3-HB的产量，本发明第二部分还探究了phaA、phaB、tesB三个基因的位置效应，确定代谢途径基因更好的表达量。
本发明第三部分通过在发酵培养基中引入乙酸钠，一方面作为碳源加强乙酰辅酶A的合成，另一方面可用于平衡胞内的氧化还原水平，进一步提高3-HB的产量。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。Halomonas sp.TD01从清华大学获得。
实施例1从头合成3-HB代谢途径的构建
1、tesB、phaA、phaB基因表达
(1)质粒构建
PCR扩增E.coli MG1655来源的tesB、Halomonas sp.TD01来源的phaA、phaB和质粒pSEVA321骨架，在Gibson连接酶的作用下，phaA、phaB、tesB片段和pSEVA321骨架重组形成新的质粒，命名为pSEVA321tesB-phaA-phaB。通过PCR以pSEVA321tesB-phaA-phaB为模板得到tesB-phaA-phaB，取部分产物送生物公司测序，质粒信息如图2所示。
利用PCR扩增tesB、phaA、phaB和质粒pSEVA321骨架的引物序列(5’-3’)如下：
tesB-F：见SEQ ID No.1；
tesB-R：见SEQ ID No.2；
phaA-F：见SEQ ID No.3；
phaA-R：见SEQ ID No.4；
phaB-F：见SEQ ID No.5；
phaB-R：见SEQ ID No.6；
pSEVA321-F：见SEQ ID No.7；
pSEVA321-R：见SEQ ID No.8。
其扩增体系和扩增程序见表1和表2：
表1扩增体系表
表2扩增程序表
PCR反应完成后，配制相应浓度的琼脂糖凝胶，进行电泳以便观察DNA条带的大小，将凝胶置于紫外灯下，迅速的切下目的DNA片段的凝胶，尽可能的将多余的凝胶切掉。
(2)Gibson Assembly法连接
将回收的DNA检测其浓度，再根据目的片段和pSEVA321骨架的长度、浓度计算DNA的添加比例，并利用Gibson混合酶进行连接，其Gibson Assembly连接体系和程序如表3和表4所示：
表3Gibson Assembly连接体系表
表4Gibson Assembly连接程序
(3)Nissle 1917大肠杆菌转化
步骤1：将提前制备好的Nissle 1917大肠杆菌感受态细胞从-80℃拿出，在冰上解冻，5min后待菌块融化；
步骤2：往感受态细胞中加入5μL连接产物，轻轻的弹管壁将反应液混匀(请勿振荡混匀)。注：连接产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的1/10；
步骤3：冰上冰浴30min，42℃水浴热激2min后，立即置于冰上冷却2min，注：晃动会降低转化效率；
步骤4：向离心管中加入400μL LB培养基(不含抗生素)，混匀后放入37℃摇床中200rpm复苏60min；
步骤5：5000rpm离心5min收菌，弃掉350μL上清留取100μL轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的LB培养基上；
步骤6：将培养基倒置到37℃培养箱中培养12～16h。
(4)单克隆菌落阳性验证
在相对应的抗性LB板上挑出菌落，并进行菌落PCR验证，将条带大小正确的PCR产物送至生物公司进行测序。
(5)选择序列正确的单菌落进行扩培，12～16h后将其在抗性LB板子上划线，等长出来单克隆后再一次单克隆菌落验证。
(6)产物鉴定
菌落验证结果表明Escherichia coli Nissle 1917菌株中成功转入了tesB-phaA-phaB基因序列，如图3所示，目的片段为3667bp，符合预期结果，将菌株命名为Nissle-1。
实施例2不同来源的phaA、phaB基因表达
质粒构建：利用PCR扩增E.coli MG1655来源的tesB、Halomonas sp.TD01来源的phaB和Ralstonia eutropha来源的phaA、phaB及pSEVA321-porin58骨架构建质粒pSEVA321tesB-phaA-phaBTD，具体步骤参照实施例1；含Ralstonia eutropha来源的phaA、phaB基因质粒pSEVA321tesB-phaARE-phaBRE，质粒信息如图4所示；构建含Ralstonia eutropha来源的phaA、Halomonas bluephagenesis来源的phaB基因质粒pSEVA321tesB-phaARE-phaBTD，，模版为pSEVA321tesB-phaARE-phaBRE，质粒信息如图5所示。以pSEVA321tesB-phaARE-phaBTD为模板得到tesB-phaARE-phaBTD序列；以pSEVA321tesB-phaARE-phaBRE为模板得到tesB-phaARE-phaBRE序列，取部分产物送生物公司进行测序。
利用PCR扩增的引物序列(5’-3’)如下：
pSEVA321-porin58-F：见SEQ ID No.9；
pSEVA321-porin58-R：见SEQ ID No.10；
tesB-F：见SEQ ID No.11；
tesB-R：见SEQ ID No.12；
phaABRE-F：见SEQ ID No.13；
phaABRE-R：见SEQ ID No.14；
phaARE-F：见SEQ ID No.15；
phaARE-R：见SEQ ID No.16；
phaBTD-F：见SEQ ID No.17；
phaBTD-R：见SEQ ID No.18。
将pSEVA321tesB-phaARE-phaBTD和pSEVA321tesB-phaARE-phaBRE分别转入Escherichia coliNissle 1917。通过目的产物的大小进行验证，结果表明在Escherichia coli Nissle 1917中成功转入了tesB-phaARE-phaBTD基因序列，如图6所示；在Escherichia coli Nissle1917中成功转入了tesB-phaARE-phaBRE基因序列，如图7所示，将两个重组菌分别命名为Nissle-ARE-BTD，Nissle-RE。
实施例3phaA、phaB、tesB基因位置效应
质粒构建：参照实施例1的操作，利用PCR扩增E.coli MG1655来源的tesB、Halomonas bluephagenesis来源的phaA、phaB和质粒pSEVA321骨架，在Gibson连接酶的作用下，phaA、phaB、tesB片段以不同的顺序连接，和pSEVA321骨架重组形成新的质粒，命名为2-pSEVA321tesB-phaB-phaA，质粒图如图8a所示、3-pSEVA321phaA-tesB-phaB，质粒图如图8b所示、4-pSEVA321phaB-tesB-phaA，质粒图如图8c所示、5-pSEVA321phaA-phaB-tesB，质粒图如图8d所示、6-pSEVA321phaB-phaA-tesB，质粒图如图8e所示，取部分产物送生物公司进行测序。
利用PCR扩增引物序列(5’-3’)如下：
2-pSEVA321-F：见SEQ ID No.19；2-pSEVA321-R：见SEQ ID No.20；
2-phaA-F：见SEQ ID No.21；2-phaA-R：见SEQ ID No.22；
2-phaB-F：见SEQ ID No.23；2-phaB-R：见SEQ ID No.24；
3-pSEVA321-F：见SEQ ID No.25；3-pSEVA321-R：见SEQ ID No.26；
3-phaA-F：见SEQ ID No.27；3-phaA-R：见SEQ ID No.28；
3-tesB-F：见SEQ ID No.29；3-tesB-R：见SEQ ID No.30；
4-pSEVA321-F：见SEQ ID No.31；4-pSEVA321-R：见SEQ ID No.32；
4-phaB-F：见SEQ ID No.33；
4-phaB-R：见SEQ ID No.34；
4-tesB-F：见SEQ ID No.35；
4-tesB-R：见SEQ ID No.36；
4-phaA-F：见SEQ ID No.37；
4-phaA-R：见SEQ ID No.38；
5-pSEVA321-F：见SEQ ID No.39；
5-pSEVA321-R：见SEQ ID No.40；
5-phaAB-F：见SEQ ID No.41；
5-phaAB-R：见SEQ ID No.42；
5-tesB-F：见SEQ ID No.43；
5-tesB-R：见SEQ ID No.44；
6-pSEVA321-F：见SEQ ID No.45；
6-pSEVA321-R：见SEQ ID No.46；
6-phaB-F：见SEQ ID No.47；
6-phaB-R：见SEQ ID No.48；
6-phaA-F：见SEQ ID No.49；
6-phaA-R：见SEQ ID No.50；
6-tesB-F：见SEQ ID No.51；
6-tesB-R：见SEQ ID No.52。
将上述构建的质粒2-pSEVA321tesB-phaB-phaA、3-pSEVA321phaA-tesB-phaB、4-pSEVA321phaB-tesB-phaA、5-pSEVA321phaA-phaB-tesB和6-pSEVA321phaB-phaA-tesB，分别转入Escherichia coli Nissle 1917。
通过目的产物的大小进行验证，结果表明在Escherichia coli Nissle 1917中成功转入了tesB-phaB-phaA基因序列，如图9所示；在Escherichia coli Nissle 1917中成功转入了phaA-tesB-phaB基因序列，如图10所示；在Escherichia coli Nissle 1917中成功转入了phaB-tesB-phaA基因序列，如图11所示；在Escherichia coli Nissle 1917中成功转入了phaA-phaB-tesB基因序列，如图12所示；在Escherichia coli Nissle 1917中成功转入了phaB-phaA-tesB基因序列，如图13所示；将5个重组菌分别命名为Nissle-2、Nissle-3、Nissle-4、Nissle-5、Nissle-6。
实施例4利用不同改造菌生产3-HB
参照实施例1的操作，将实施例1构建的质粒pSEVA321tesB-phaA-phaB导入Escherichiacoli S17-1，Escherichia coli JM109中，采用实施例1的Nissle-1以及S17-1、JM109菌作为发酵底盘菌。
(1)培养基
LB平板培养基：酵母浸粉0.5g/L、胰蛋白胨1g/L、氯化钠1g/L、琼脂粉1.8g/100mL，pH＝7。
发酵培养基(LBG)：氯化钠10g/L、酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、葡萄糖10g/L。
(2)种子液制备
①菌种活化：
将重组的菌株在LB平板培养基进行划线，37℃培养24h，待其长出单克隆。
②一级种子培养：
挑取单菌落接种于12mL摇菌管(5ml LB培养基)中，加入相应抗生素，将培养液置于摇床37℃、220rpm培养12h。
(3)发酵培养：
将种子液按5％接种(1mL)于150mL锥形瓶内，置于摇床37℃、220rpm培养48h。
(4)发酵结束后收集菌体进行检测：
(a)OD600测定：将200μL发酵后菌按适当的倍数稀释，在分光光度计中测量OD值。
(b)3-HB含量的测定：将200μL发酵后菌按适当的倍数稀释，4度条件下12000rpm离心后，再用0.22μm水系滤头过滤稀释后的发酵液，将其注入上样瓶后，放进液相中测试3-HB含量。液相检测采用HPX-87h柱子，流动相为0.5mM硫酸，温度为60℃。进样体积为10μL，采用外标法对3-HB进行定量分析，根据峰面积计算3-HB的产量。
(c)乙酸的测定：将200μL发酵后菌按适当的倍数稀释，4度条件下12000rpm离心后，再用0.22μm水系滤头过滤稀释后的发酵液，将其注入上样瓶后，放进液相中测试乙酸含量。液相检测采用HPX-87h柱子，流动相为0.5mM硫酸，温度为60℃。进样体积为10μL，采用外标法对乙酸进行定量分析，根据峰面积计算乙酸的产量。
(5)发酵结果如表5所示。
表5三株改造菌的发酵效果
由上述结果表明，利用地盘菌S17-1、JM109、Nissle-1菌株构建3-HB途径，其中，S17-1不能生产3-HB，JM109能够生产3-HB，但产量不及Nissle-1，Nissle-1生产的3-HB产量最高可达5.12g/L，乙酸含量仅1.92g/L。说明Escherichia coli Nissle 1917菌株适合作为合成3-HB的底盘菌株。
实施例5比较不同来源的phaA、phaB发酵效果
使用实施例1的Nissle-1、实施例2的Nissle-ARE-BTD、Nissle-RE菌株进行发酵，具体发酵使用的培养基、步骤以及参数测定方法参照实施例4。
发酵结果如表6所示。
表6不同来源phaA、phaB发酵效果
结果表明，过表达来自Halomonas sp.TD01的phaA、phaB的Nissle-1菌株发酵效果最好，3-HB的产量可达5.05g/L。
实施例6利用不同基因连接顺序的改造菌生产3-HB
使用实施例1的Nissle-1、实施例3的5种改造菌进行发酵，具体发酵使用的培养基、步骤以及参数测定方法参照实施例4。
发酵结果如表7所示。
表7基因位置效应发酵效果
由上述结果显示，Nissle-3菌株的发酵效果最好，3-HB的产量高达5.83g/L，说明将基因phaA、tesB、phaB三个基因以phaA-tesB-phaB的连接顺序插入质粒，导入菌株中能够进一步提高3-HB的产量。
实施例7在葡萄糖基础上额外添加乙酸钠发酵效果
使用Nissle-3菌株进行发酵，根据实施例4的步骤，发酵培养基中除碳源外，其余组分保持不变。碳源为20g/L葡萄糖和不同浓度的乙酸钠(0、3、6、9、12g/L)，配置方式及操作方法和实施例4相同。
发酵结果如表8所示。
表8额外添加不同浓度乙酸钠发酵效果
结果显示，在发酵培养基中额外添加12g/L乙酸钠时，发酵效果最好，可促进菌株利用更多的葡萄糖从而提升产量，产量高达18.73g/L。
实施例8在葡萄糖基础上额外添加其他短链脂肪酸发酵效果
使用Nissle-3菌株进行发酵，根据实施例4的步骤，发酵培养基中除碳源外，其余组分保持不变。碳源为20g/L葡萄糖和12g/L其他短链脂肪酸，配置方式及操作方法和实施例4相同。发酵结果如表8。
表9额外添加其他短链脂肪酸发酵效果
结果显示，在发酵培养基中额外添12g/L其他短链脂肪酸时，可促进菌株利用更多的葡萄糖从而提升产量，产量高达10.2g/L。
实施例9利用重组菌LY03-3、Lg-3和Bc-3生产3-羟基丁酸
重组盐单胞菌LY03、重组益生乳杆菌Lactobacillus gasseri ATCC 33323和重组益生凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans DSM1生产3-羟基丁酸。
(1)重组菌的构建
将实施例3构建的质粒3-pSEVA321phaA-tesB-phaB通过接合转化的方式分别盐单胞菌和转入益生乳杆菌中，方法同实施例1，将得到的重组菌分别命名为LY03-3、Lg-3和Bc-3。
(2)应用重组LY03-3、Lg-3和Bc-3生产3-羟基丁酸
菌种活化：将重组的菌株在LB平板培养基进行划线，37℃培养24h，待其长出单克隆。
一级种子培养：挑取单菌落接种于12mL摇菌管(5ml LB培养基)中，加入相应抗生素，将培养液置于摇床37℃、220rpm培养12h。
(3)发酵培养：
将种子液按5％接种(1mL)于150mL锥形瓶内，加入相应抗生素，葡萄糖20g/L，乙酸钠12g/L，置于摇床37℃、220rpm培养48h。培养结束后，进行3-HB含量的测定。进行两次重复实验，每次重复试验设置三个生物学平行样品，结果取平均值。
结果如表10所示。
表10重组菌3HB生产结果
由表10结果显示，LY03-3、Lg-3和Bc-3均能成功生产3-HB，产量分别为10.2g/L、5.67g/L和6.42g/L。本实施例结果说明，本申请的方法还适用于重组盐单胞菌LY03、重组益生乳杆菌Lactobacillus gasseri ATCC 33323和重组益生凝结芽孢杆菌Bacilluscoagulans DSM1生产3-羟基丁酸。
综上所述，本发明提出一种利用葡萄糖合成3-HB的菌株及利用乙酸钠生产3-HB的两条代谢途径构建方法和应用。采用合成生物学技术引入了葡萄糖为底物合成3-HB的新代谢途径，构建了联合代谢途径菌株，减少中间代谢产物乙酸对细菌3-HB产量的影响，并对其代谢途径进一步优化，实现高产3-HB的目标，从而在化学材料和医疗领域展现出较强的应用潜力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种生产3-羟基丁酸的菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：体外扩增phaA、phaB、tesB基因的序列，将基因的序列连接成单一片段，将单一片段导入质粒；
S2：将S1所述质粒导入菌株中。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S2所述菌株为Escherichia coliNissle 1917、Escherichia coli JM109、Halomonas sp.LY03、Lactobacillus gasseriATCC 33323和Bacillus coagulans DSM1中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中所述phaA为物种来源为Halomonas sp.TD01的phaATD、物种来源为Ralstonia eutropha的phaARE中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中所述phaB为物种来源为Halomonas sp.TD01的phaBTD、物种来源为Ralstonia eutropha的phaBRE中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1所述单一片段为tesB-phaATD-phaBTD、tesB-phaARE-phaBTD、tesB-phaARE-phaBRE、tesB-phaBTD-phaATD、phaATD-tesB-phaBTD、phaBTD-tesB-phaATD、phaATD-phaBTD-tesB、phaBTD-phaATD-tesB中的任意一种。
6.一种生产3-羟基丁酸的菌株，其特征在于，由权利要求1～5任一项所述的构建方法得到。
7.一种使用权利要求6所述的菌株生产3-羟基丁酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：将菌株活化，进行摇瓶种子培养后在发酵培养基中进行发酵培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中包括短链脂肪酸，优选为乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、戊酸钠中的任意一种。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述短链脂肪酸的添加量为3～12g/L。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为36～42℃，发酵的pH为6～11，发酵的时间为12～48h。
Priority Applications (1)
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| CN202410149933.0A CN117965593A (zh) | 2024-02-02 | 2024-02-02 | 一种生产3-羟基丁酸的菌株及其构建方法和应用 |
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2024
- 2024-02-02 CN CN202410149933.0A patent/CN117965593A/zh active Pending
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Non-Patent Citations (1)
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