CN116970538A - 一株广碳源利用的盐单胞菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株广碳源利用的盐单胞菌及应用。所述盐单胞菌为，其保藏编号为GDMCC NO. 63382。本发明的能够利用不同的中长链脂肪酸碳源高产PHA，除了能够以常用的葡萄糖为碳源外，还能够利用甘油、糖蜜、果糖、蔗糖等多种廉价碳源，并且在高氮源和高碱性下也能够正常生长。能够提高碳源转化率。本发明利用盐单胞菌（）LY03制备PHA降低了生产成本，可高产PHA，具有巨大的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及工业微生物技术领域，特别涉及一株广碳源利用的盐单胞菌及应用。
背景技术
微生物发酵是生物合成产品的主要途径，由于传统工业生物技术存在灭菌成本高、高淡水消耗、不连续发酵易污染等缺点，导致其与化学工艺相比竞争力较低。
对于下一代工业生物技术，研究比较成熟的便是嗜盐微生物，它是一种在高盐、高pH环境下能够正常生长的极端微生物。随着合成生物学的发展，对于盐单胞菌在基因改造、代谢调控及形态学方面进行深入研究。
盐单胞菌是NGIB最突出的底盘细胞，具有天然合成聚羟基脂肪酸酯（PHA）的优点。然而，高产量的PHA生产过程中，传统的嗜盐单胞菌具有较窄的碳源利用能力。现有的盐单胞菌可利用底物谱窄，多以葡萄糖为底物，可合成单体单一，仅有3-羟基丁酸聚合物以及3-羟基丁酸和4-羟基丁酸聚合物。因此，目前亟需一株既能够高效利用廉价碳源高产PHA，又可以聚合不同链长PHA单体的嗜盐单胞菌株。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一株广碳源利用的盐单胞菌及应用。
本发明提供一株盐单胞菌（）LY03，所述盐单胞菌的保藏编号为GDMCCNo:63382。
本申请中使用的LY03菌株已于2023年4月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC地址：广州市先列中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070）。保藏号为GDMCC NO. 63382。菌株名称为/>，分类命名为。
进一步的，所述盐单胞菌的16S rDNA的序列如SEQ ID No.3所示。
本发明还提供所述的盐单胞菌在制备聚羟基脂肪酸酯中的应用。
进一步的，所述聚羟基脂肪酸酯为聚β-羟基丁酸酯。
本发明还提供所述的盐单胞菌在以中长链脂肪酸为碳源制备聚羟基脂肪酸酯中的应用。所述中长链脂肪酸为6个碳及以上的脂肪酸。
本发明还提供一种制备聚β-羟基丁酸酯的方法，包括如下步骤：发酵所述的盐单胞菌，得到聚β-羟基丁酸酯。
进一步的，所述盐单胞菌可利用的碳源为废豆油、C10饱和脂肪酸、C11饱和脂肪酸、C12饱和脂肪酸、C13饱和脂肪酸、C14饱和脂肪酸、C16饱和脂肪酸、C18饱和脂肪酸、油酸（18:1）、亚油酸（18:2）、亚麻酸（18:3）、甘油、糖蜜、果糖、葡萄糖、蔗糖中的任意一种或多种。
进一步的，包括如下步骤：将盐单胞菌（）LY03在平板固体培养基上单克隆培养，然后进行一级、二级种子培养，最后接入发酵培养基，持续发酵。
进一步的，发酵温度为30~42℃；发酵pH为6.5~11；发酵时间为36~50 h。
进一步的，所述发酵培养基包括以下组分：葡萄糖35 g/L；氯化钠50 g/L，酵母粉1.2 g/L，尿素0.2~3 g/L，无水硫酸镁0.2 g/L，磷酸二氢钾1.5~5.5 g/L，Fe(III)-NH4-Citrate 5 g/L、CaCl2·2H2O 2 g/L、HCl 12 mol/L，ZnSO4·7H2O 0.1 g/L，MnCl2·4H2O0.03 g/L，，CoCl2·6H2O 0.2 g/L，CuSO4·5H2O 0.01 g/L，NiCl2·6H2O 0.02g/L，NaMoO4·2H2O 0.03 g/L。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
（1）能够利用不同的中长链脂肪酸碳源高产PHA。
（2）本发明的除了能够以常用的葡萄糖为碳源外，还能够利用甘油、糖蜜、果糖、蔗糖、废豆油、C10-C18饱和脂肪酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等多种廉价碳源。
（3）本发明的在高氮源下也能够正常生长。
（4）本发明探究了发酵合成PHA的优化条件。
（5）本发明的能够提高碳源转化率，碳源转化率大于36%。
（6）本发明的菌株还具备高耐受高盐和高碱的特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中扫描电镜确定菌株的外部形态图和胞内PHA颗粒的形态图。
图2为本发明实施例1中共聚焦显微镜确定菌株的形状。
图3为本发明实施例1中菌株与其他菌株16s rDNA序列对比的进化树。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明第一部分采用不同长链脂肪酸培养比较生长情况；
第二部分采用不同生长条件下（碳源、氮源、碱性）菌株的生长状态；
第三部分探究菌株天然合成PHA的含量。
培养条件：
60LB固体培养基：酵母粉3~10 g/L；胰蛋白胨6~20 g/L；氯化钠36~120 g/L，琼脂粉1~2%（w/v），pH 7~9；
液体培养基：氯化钠40~60 g/L，酵母粉3~10 g/L，胰蛋白胨6~20 g/L，NaOH调节培养基pH至8.0~10.5，培养基体积为150 mL（500 mL锥形瓶）；
发酵培养基（50MM培养基）：葡萄糖35 g/L；氯化钠50 g/L，酵母粉1.2 g/L，尿素0.2~3 g/L，无水硫酸镁0.2 g/L，磷酸二氢钾1.5~5.5 g/L，Fe(III)-NH4-Citrate 5 g/L、CaCl2·2H2O 2 g/L、HCl 12 mol/L，ZnSO4·7H2O 0.1 g/L，MnCl2·4H2O 0.03 g/L，，CoCl2·6H2O 0.2 g/L，CuSO4·5H2O 0.01 g/L，NiCl2·6H2O 0.02 g/L，NaMoO4·2H2O 0.03 g/L，NaOH调节培养基pH至6.5~11；
碳源：废豆油、油酸、亚油酸、亚麻酸、C10~C18饱和脂肪酸及其一烯酸、甘油、糖蜜、木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖；
浓度：脂肪酸类（废豆油、油酸、亚油酸、亚麻酸、C10~C18饱和脂肪酸及其一烯酸）：2~10 g/L；糖类（甘油、糖蜜、木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖）：10~35 g/L；
发酵温度：30~42℃；
发酵pH：6.5~11（采用5M NaOH调节）；
利用本发明的盐单胞菌生产PHA的方法如下：
（1）将盐单胞菌（）在平板固体培养基上单克隆培养，然后进行一级、二级种子培养，最后接入发酵培养基，持续发酵36~50 h。
（2）PHA细胞干重处理：将25~35 mL发酵后菌液置于50 mL离心管中，8000~9000rpm室温下离心5~7 min，去上清液，去离子水清洗两次，冻干机冷冻干燥12-20小时。
（3）测定PHA含量：在40 mg冻干细胞中加入2 mL酯化液（包含甲醇、3% (v/v)浓硫酸(98%，w/w)和1g/L苯甲酸）及2 mL氯仿，100℃下酯化约3~5 h。对应的标准品同样处理为参照。甲醇分解后，样品在GC-2014气相色谱仪（日本岛津）上测定PHB含量。
实施例1菌株的分离与纯化
（1）菌株的分离
称取1g来自新疆淤泥样，用无菌水稀释，涂布于含NaCl（60 g/L）的LB平板上（60LB培养基），37℃培养48 h。
（2）菌株的纯化
随机挑平板上的多个单克隆菌落，用新的LB液体培养基稀释，涂布于新NaCl（60g/L）的LB平板上，37℃，静止培养48 h；反复重复上述过程，直至平板上长出形状相近的单克隆，完成菌株的纯化，并将其命名为。
（3）菌株特征及类别鉴定
菌株形态及特征：将分离纯化好的菌株采用60LB液体培养基在37℃条件下培养48小时（摇床转速为220 rpm），取少量培养好的菌液，使用扫描电镜确定菌的形态为短杆状或椭球形（见图1和图2），胞内存在白色颗粒状且呈现多颗粒状态（图1），表明细胞天然合成并积累了聚羟基脂肪酸酯（PHA）作为其主要代谢产物。
类别鉴定：利用革兰氏染色法对该菌株进行鉴别，确定该菌株为革兰氏阴性菌。
（4）菌株16s rDNA基因测定
检测该菌株的16S rDNA序列，扩增16S rDNA序列。
引物设计如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2：
16-F（SEQ ID No.1）：agagtttgatcatggctcag；
16-R（SEQ ID No.2）：aggtgatccagccgcaggt。
随后送至广州华大生物公司测序分析，经测序，16S rDNA的序列如SEQ ID No.3所示。
（5）菌株序列对比
将测序得到的菌株的16S rDNA与/>TTW4、/>X34、/>MG34、/>EG27S8QL、/>SSP41、/>SUR27、LUH20、/>JS92-SW72等常见盐单胞菌来源的16S rDNA，采用MEGA-11软件进行序列比对，并绘制进化树，如图3所示，可见与本发明的/>菌株亲缘关系最近的为/>X34和/>TTW4，说明本发明的/>确为盐单胞菌。
实施例2 利用不同长链脂肪酸的生长情况
（1）种子液制备
①菌种活化
于实验室-80℃冰箱取菌种，用枪头挑取菌液划线接种于平板固体培养基（酵母粉5 g/L；胰蛋白胨10 g/L；氯化钠60 g/L，pH为8.5）上，37℃培养24 h。
②一级种子培养：
挑取单菌落接种于12 mL摇菌管（5 mL 60LB培养基：酵母粉5 g/L；胰蛋白胨10 g/L；氯化钠60 g/L；琼脂粉1~2%（w/v），pH为8.5）中，将培养液置于摇床37℃、220 rpm培养12h。
③二级种子培养：
吸取一级菌液200 μL（1%接种量），接种于150 mL锥形瓶（20 mL 60LB培养基）中，将置于摇床37℃、220 rpm培养12 h。
（2）发酵培养基准备
发酵培养基（50MM培养基）：发酵培养基：葡萄糖35 g/L；氯化钠50 g/L，酵母粉1.2g/L，尿素0.2~3 g/L，无水硫酸镁0.2 g/L，磷酸二氢钾1.5~5.5 g/L，Fe(III)-NH4-Citrate5 g/L、CaCl2·2H2O 2 g/L、HCl 12 mol/L，ZnSO4·7H2O 0.1 g/L，MnCl2·4H2O 0.03 g/L，，CoCl2·6H2O 0.2 g/L，CuSO4·5H2O 0.01 g/L，NiCl2·6H2O 0.02 g/L，NaMoO4·2H2O 0.03 g/L；其中碳源设置11个实验组，分别对应的碳源种类为废豆油、C10饱和脂肪酸、C11饱和脂肪酸、C12饱和脂肪酸、C13饱和脂肪酸、C14饱和脂肪酸、C16饱和脂肪酸、C18饱和脂肪酸、油酸（18:1）、亚油酸（18:2）、亚麻酸（18:3）。
（3）发酵培养
将种子液按5%接种（2.5 mL）于500 mL锥形瓶内，置于摇床37℃、220 rpm培养48h。
（4）细胞干重及PHA含量测定
细胞干重（CDW）：将30~35 mL发酵后菌液置于50 mL离心管中，室温离心6分钟，转速为8000 rpm，倒掉上清；加入适量去离子水恢复原体积，重悬，保证沉淀完全消失，同等条件下离心，倒掉上清液；封口膜封口离心管置于-80℃冰箱冻存2 h；将离心管于真空冷冻干燥机内干燥12-16小时；称重，计算细胞干重（g/L）。
测定PHA含量：然后在40 mg冻干细胞中加入2 mL酯化液（包含甲醇、3% (v/v)浓硫酸(98%，w/w)和1 g/L苯甲酸）及2 mL氯仿，100℃下酯化约4 h。PHB标品20-30 mg采用同样处理为参照；随后使用GC-2014气相色谱仪（日本岛津）测定PHB含量。测试方法是：初始温度维持在80℃，1.5 min；第一阶段，温度以30℃/min的速度增加到140℃；第二阶段，以40℃/min的速度增加到240℃，此过程耗时2 min；总的分析时间是8 min；注射温度为240℃和检测器温度为250℃。
（4）发酵结果
不同长链脂肪酸为碳源的发酵结果如表1所示：
表1 不同长链脂肪酸为碳源的发酵结果
| 实验序号 | 碳源（均为10 g/L） | 细胞干重（g/L） | 3HA（mol%) |
| 1 | 废豆油 | 6.43-7.36 | 38.20 |
| 2 | C10饱和脂肪酸 | 5.31-6.01 | 40.11 |
| 3 | C11饱和脂肪酸 | 0.22-0.31 | 45.97 |
| 4 | C12饱和脂肪酸 | 0.11-0.16 | 39.16 |
| 5 | C13饱和脂肪酸 | 7.03-7.29 | 40.08 |
| 6 | C14饱和脂肪酸 | 8.83-9.41 | 39.67 |
| 7 | C16饱和脂肪酸 | 6.98-8.41 | 38.98 |
| 8 | C18饱和脂肪酸 | 1.83-1.95 | 37.50 |
| 9 | 油酸（18:1） | 5.75-6.19 | 40.59 |
| 10 | 亚油酸（18:2） | 3.42-4.03 | 39.31 |
| 11 | 亚麻酸（18:3） | 0.71-0.79 | 39.51 |
结果表明，本发明的可以利用不同的长链脂肪酸，如废豆油、C10饱和脂肪酸、C13饱和脂肪酸、C14饱和脂肪酸、C16饱和脂肪酸和油酸，用不同长链脂肪酸培养该菌株时，发现C14饱和酸为唯一碳源时，菌株的长势状况最好，其细胞干重最高可达到9.41g/L；C16饱和脂肪酸也具有潜力，细胞干重最高达到8.41 g/L。通常以葡萄糖为碳源时嗜盐单胞菌的细胞干重达到10 g/L以上和PHA含量达到70-80%时效果较好，但一般菌株难以利用长链脂肪酸作为碳源，而本发明的LY03可以利用长链脂肪酸为碳源，细胞干重还接近以葡萄糖为碳源的细胞干重。
实施例3 利用不同碳源的生长情况
（1）种子液制备
同实施例2中的种子液制备步骤
（2）发酵液准备
发酵培养基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠60 g/L；
碳源：甘油、糖蜜、葡萄糖、果糖、蔗糖。
（3）发酵培养
将种子液按5%接种（2.5 mL）于500 mL锥形瓶内，置于摇床37℃、220 rpm培养48h。
（4）发酵结果
不同碳源下的发酵结果如表2所示：
表2 不同碳源的发酵结果
| 实验序号 | 碳源（均为10 g/L） | 细胞干重（g/L） | PHA wt(%) |
| 1 | 甘油 | 8.87-9.21 | 70-74 |
| 2 | 糖蜜 | 6.25-6.35 | 61-64 |
| 3 | 葡萄糖 | 9.89-12.27 | 77-83 |
| 4 | 果糖 | 6.22-6.69 | 67-71 |
| 5 | 蔗糖 | 8.63-9.13 | 73-76 |
结果表明，可以利用不同碳源，当以葡萄糖为唯一碳源时，菌株的生长状态最好，其细胞干重最高可达到12.27 g/L；其次，菌株在以甘油和蔗糖为碳源时也具有良好的利用效果，其细胞干重最高分别达到9.21 g/L和9.13 g/L。
实施例4高氮源条件下生长及PHA合成情况
（1）种子液制备
同实施例2中的种子液制备步骤
（2）发酵液准备
发酵培养基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠60 g/L；
其中尿素设置3个水平：0.5、0.75、1.0g/L；
碳氮比：葡萄糖（25、30、35 g/L）：尿素（0.5、0.75、1.5 g/L）。
（3）发酵培养
将种子液按5%接种（2.5 mL）于500 mL锥形瓶内，置于摇床37℃、220 rpm培养48h。
（4）发酵结果
不同浓度尿素下细胞干重（CDW）和PHA发酵结果如表3所示：
表3 不同尿素浓度下的发酵结果
结果表明，当尿素浓度达到0.5 g/L时，PHA含量达到最高79.33%，但细胞干重略低，说明生长状态略差。当浓度为1 g/L时，细胞生长状态较好，但PHA含量开始随着尿素浓度的增加而降低。为了探索最合适的尿素浓度，对葡萄糖和尿素不同碳氮比进行筛选，结果如表4-5所示：
表4 不同碳氮比下的产PHA（%）结果
表5 不同碳氮比下的CDW（g/L）结果
碳氮比为35 g/L葡萄糖，1 g/L尿素时，菌株的生长状态最好，CDW干重高达15.59g/L，PHA产量达到75.85%。
实施例5 发酵合成PHA的条件优化
（1）种子液制备
同实施例2中的种子液制备步骤
（2）发酵液准备
发酵培养基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠60 g/L；其中磷元素设置5个水平：0.6、0.85、1.12、1.5、2 g/L；
MgSO4同样也设置5个水平：0.02、0.05、0.1、0.2、0.3 g/L；
酵母粉设置5个水平：0、0.5、1、1.5、2 g/L。
（3）发酵培养
将种子液按5%接种（2.5 mL）于500 mL锥形瓶内，置于摇床37℃、220 rpm培养48h。
（4）发酵结果见表6：
表6 培养基优化的发酵结果
| 实验序号 | 不同水平梯度 | 细胞干重（g/L） | PHA wt（%） | 转化率（%） |
| 1 | 磷元素浓度0.6 g/L | 15.91-16.78 | 70.54-79.02 | 34.86 |
| 2 | 磷元素浓度0.85 g/L | 15.96-16.87 | 75.44-79.76 | 36.75 |
| 3 | 磷元素浓度1.12 g/L | 16.29-16.59 | 69.88-76.41 | 34.54 |
| 4 | 磷元素浓度1.5 g/L | 15.95-16.95 | 76.47-77.58 | 35.96 |
| 5 | 磷元素浓度2 g/L | 14.84-15.73 | 74.43-82.57 | 34.59 |
| 6 | MgSO4浓度0.02 g/L | 8.97-9.42 | 65.57-69.16 | 17.93 |
| 7 | MgSO4浓度0.05 g/L | 14.46-15.92 | 70.19-77.83 | 31.86 |
| 8 | MgSO4浓度0.1 g/L | 13.90-16.07 | 73.49-80.38 | 33.21 |
| 9 | MgSO4浓度0.2 g/L | 15.45-17.29 | 73.06-75.54 | 34.57 |
| 10 | MgSO4浓度0.3 g/L | 16.71-17.40 | 71.69-78.29 | 36.71 |
| 11 | 酵母粉浓度0 g/L | 14.01-16.13 | 59.10-80.59 | 31.46 |
| 12 | 酵母粉浓度0.5 g/L | 13.98-15.77 | 75.63-85.25 | 34.88 |
| 13 | 酵母粉浓度1.0 g/L | 16.09-16.30 | 78.35-81.88 | 37.15 |
| 14 | 酵母粉浓度1.5 g/L | 15.74-16.27 | 73.38-80.78 | 35.76 |
| 15 | 酵母粉浓度2 g/L | 17.01-17.99 | 69.17-80.19 | 37.22 |
结果表明，在磷元素实验中，磷元素含量为1.5 g/L时CDW含量最高，为16.95 g/L；在MgSO4实验中，MgSO4为0.3 g/L时CDW达到最高，为17.40 g/L；在酵母粉实验中，酵母粉为2g/L时CDW含量达到最高，为17.99 g/L。
实施例6 对碱性条件的耐受性研究
（1）种子液制备
同实施例2中的种子液制备步骤
（2）发酵液准备
发酵培养基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠60 g/L；其中pH水平设置为：9、10、11。
（3）发酵培养
将种子液按5%接种（2.5 mL）于500 mL锥形瓶内，置于摇床37℃、220 rpm培养48h。
（4）发酵结果
不同pH值下的发酵结果见表7：
表7 对碱性条件的耐受性结果
结果表明，在pH为9-11时，LY03的细胞干重随着pH的增长而增长，而TD01的细胞干重则随着pH的升高而降低，在pH为11时，LY03细胞干重最高达到17.29 g/L，是TD01 的1.6倍，说明LY03在高碱性环境下耐受能力较强。
实施例7 高效利用不同碳源产PHA的摇瓶发酵
按上述筛选出的条件，选择不同含量的最优碳源采用50MM培养基进行发酵，高产PHA产品。
（1）种子液制备：同实施例2中的种子液制备。
（2）培养基的准备：采用50MM培养体系；50MM培养体系中添加碳源，长链脂肪酸碳源选用10 g/L的C14饱和脂肪酸、其他碳源选用10 g/L葡萄糖。
（3）发酵培养：接种量及发酵条件同实施例2。
（4）细胞干重及PHA含量测定：细胞干重及PHA含量测定操作同实施例2。
（5）发酵结果见表8。转化率=细胞干重*PHA wt%/（糖初始加入量-残糖量）。
表8 高效利用不同碳源产PHA的摇瓶发酵结果
其中，实验组1的碳源为葡萄糖，实验组2的碳源为C14饱和脂肪酸，实验组3的碳源为葡萄糖，浓度均为10 g/L。结果表明，可高效利用C14饱和脂肪酸高产PHA，与/>TD01相比，该菌株具有较高的转化率，大于36%，这为工业扩大化生产中实现PHA高产奠定了基础。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
SEQ ID No.1
agagtttgatcatggctcag
SEQ ID No.2
aggtgatccagccgcaggt
SEQ ID No.3
AGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGGGGTAGCTTGCTACCCGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCATAGGAATCTGCCCGGTAGTGGGGGATAACCTGGGGAAACCCAGGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGGGGGCTTCGGCTCCCGCTATTGGATGAGCCTATGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATCGGGACTGAGACACGGCCCGAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAAGAACGCCTAGTGGTTAATACCCACTAGGAAAGACATCACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGCTTGATAAGCCGGTTGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACGGCATCCGGAACTGTCAAGCTAGAGTGCAGGAGAGGAAGGTAGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGGAGGAATACCAGTGGCGAAGGCGGCCTTCTGGACTGACACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACCAGCCGTTGGGTGCCTAGCGCACTTTGTGGCGAAGTTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCTGCGAACTTGTGAGAGATCACTTGGTGCCTTCGGGAACGCAGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTATTTGCCAGCGGGTAATGCCGGGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGTTGCGAGCTCGCGAGAGTCAGCTAATCCCGAAAAGCCGGTCTCAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGACTGCACCAGAAGTGGTTAGCCTAACGCAAGAGGGCGATCACCACGGTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCT。
Claims (10)
1. 一株盐单胞菌（）LY03，所述盐单胞菌的保藏编号为GDMCC No:63382。
2. 根据权利要求1所述的盐单胞菌（）LY03，其特征在于，所述盐单胞菌的16S rDNA的序列如SEQ ID No.3所示。
3.权利要求1或2所述的盐单胞菌在制备聚羟基脂肪酸酯中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述聚羟基脂肪酸酯为聚β-羟基丁酸酯。
5.权利要求1或2所述的盐单胞菌在以中长链脂肪酸为碳源制备聚羟基脂肪酸酯中的应用；所述中长链脂肪酸为6个碳及以上的脂肪酸。
6.一种制备聚β-羟基丁酸酯的方法，其特征在于，包括如下步骤：
发酵权利要求1或2所述的盐单胞菌，得到聚β-羟基丁酸酯。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述盐单胞菌可利用的碳源为废豆油、C10饱和脂肪酸、C11饱和脂肪酸、C12饱和脂肪酸、C13饱和脂肪酸、C14饱和脂肪酸、C16饱和脂肪酸、C18饱和脂肪酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、甘油、糖蜜、果糖、葡萄糖、蔗糖中的任意一种或多种。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将盐单胞菌（）LY03在平板固体培养基上单克隆培养，然后进行一级、二级种子培养，最后接入发酵培养基，持续发酵。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，发酵温度为30~42℃；发酵pH为6.5~11；发酵时间为36~50h。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括以下组分：
葡萄糖35 g/L；氯化钠50 g/L，酵母粉1.2 g/L，尿素0.2~3 g/L，无水硫酸镁0.2 g/L，磷酸二氢钾1.5~5.5 g/L，Fe(III)-NH4-Citrate 5 g/L、CaCl2·2H2O 2 g/L、HCl 12 mol/L，ZnSO4·7H2O 0.1 g/L，MnCl2·4H2O 0.03 g/L，，CoCl2·6H2O 0.2 g/L，CuSO4·5 H2O 0.01g/L，NiCl2·6H2O 0.02 g/L，NaMoO4·2H2O 0.03 g/L。
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