CN116925981B - 一株高温嗜盐菌及其应用 - Google Patents
一株高温嗜盐菌及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116925981B CN116925981B CN202311172228.4A CN202311172228A CN116925981B CN 116925981 B CN116925981 B CN 116925981B CN 202311172228 A CN202311172228 A CN 202311172228A CN 116925981 B CN116925981 B CN 116925981B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- pha
- temperature
- halophilic bacteria
- high temperature
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 59
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 59
- 239000005014 poly(hydroxyalkanoate) Substances 0.000 claims description 42
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 claims description 41
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 16
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 15
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 10
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 claims description 9
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 7
- 239000012533 medium component Substances 0.000 claims description 7
- 229920001397 Poly-beta-hydroxybutyrate Polymers 0.000 claims description 6
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims description 5
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 4
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 claims 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000011109 contamination Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 4
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 4
- CKUAXEQHGKSLHN-UHFFFAOYSA-N [C].[N] Chemical compound [C].[N] CKUAXEQHGKSLHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 241000206596 Halomonas Species 0.000 description 1
- 241000544058 Halophila Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229920000704 biodegradable plastic Polymers 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 238000011090 industrial biotechnology method and process Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000006140 methanolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
- C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一株高温嗜盐菌及其应用。所述高温嗜盐菌为LY02，其保藏编号为GDMCC No:63381。本发明的LY02不仅能适应高温环境（40℃），在高温环境下维持良好的细胞状态，保证细胞稳定性，而且能够在高温条件下高产PHA。本发明能够利用LY02在高温下进行开放式连续发酵过程中制备大量PHA，进一步降低开放式连续发酵过程中的染菌风险，具备巨大的工业应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及工业微生物技术领域，特别涉及一株高温嗜盐菌及其应用。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，PHA）是一类生物可降解塑料，许多微生物在碳、氮源失衡条件下以其作为细胞内的碳源和能源储存物。PHA具有生物可降解性。
现有技术中，微生物发酵是生物合成PHA的主要途径，由于传统工业生物技术存在灭菌成本高、高淡水消耗、不连续发酵易污染等缺点，导致其与化学工艺相比竞争力较低。
嗜盐菌具有天然合成PHA的优点。然而，在高产量的PHA生产过程中，传统的嗜盐菌在无法在高温环境中生产PHA。因此，目前亟需一株能够在高温条件下高产PHA的嗜盐菌株。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一株能够高温条件下高产PHA的嗜盐菌及其应用。
本发明提供一株高温嗜盐菌（）LY02，所述嗜盐菌的保藏编号为GDMCCNo:63381。
本发明中使用的LY02菌株已于2023年4月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC地址：广州市先列中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070）。保藏号为GDMCC NO:63381。菌株名称为/>LY02，分类命名为。
进一步的，所述高温嗜盐菌的16S rDNA的序列如SEQ ID No.3所示。
本发明还提供所述的高温嗜盐菌在制备聚羟基脂肪酸酯中的应用。
进一步的，所述聚羟基脂肪酸酯为聚β-羟基丁酸酯。
本发明还提供一种制备聚β-羟基丁酸酯的方法，包括如下步骤：发酵所述的高温嗜盐菌，得到聚β-羟基丁酸酯。
进一步的，发酵的过程为，将高温嗜盐菌（）LY02在培养基上进行菌株的纯化，然后进行一级、二级种子培养，之后接种于发酵培养基中培养。
进一步的，发酵温度为30~42℃；发酵pH为6.5~11；发酵时间为36~50 h。
进一步的，发酵使用的发酵培养基组分包括：葡萄糖35 g/L；氯化钠50 g/L，酵母粉1.2 g/L，尿素0.2~3 g/L，无水硫酸镁0.2 g/L，磷酸二氢钾1.5~5.5 g/L，Fe(III)-NH4-Citrate 5 g/L、CaCl2·2H2O 2 g/L、HCl 12 mol/L，ZnSO4·7H2O 0.1 g/L，MnCl2·4H2O0.03 g/L，，CoCl2·6H2O 0.2 g/L，CuSO4·5H2O 0.01 g/L，NiCl2·6H2O 0.02g/L，NaMoO4·2H2O 0.03 g/L。
进一步的，发酵使用的发酵培养基组分中葡萄糖：尿素为（25~35 g/L）：（0.5~1 g/L），优选为30 g/L：0.75 g/L。
进一步的，发酵使用的发酵培养基组分中磷元素浓度为0.6~2 g/L，优选为1.5 g/L。
进一步的，发酵使用的发酵培养基组分中MgSO4浓度为0.05~0.3 g/L，优选为0.2g/L。
进一步的，发酵使用的发酵培养基组分中酵母粉浓度为0~2 g/L，优选为1 g/L。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
（1）嗜盐菌（）LY02在高温（40℃）下，细胞干重高，长势最好，能够在高温下保持良好的细胞状态。
（2）嗜盐菌（）LY02在高温（40℃）下，PHA产量高，能够在高温下高产PHA。
（3）本发明对（）LY02发酵合成PHA的条件进行优化，进一步提高PHA的产量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中LY02菌株的电镜图。
图2为本发明实施例1中LY02菌株与其他菌株16S rDNA序列对比的进化树。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明第一部分比较不同菌株在40℃环境中的生长情况；
第二部分对LY02的生长条件（碳源、氮源、P元素、Mg元素、酵母粉）进行筛选；
第三部分探究菌株天然合成PHA的含量。
LY02的培养条件：
60LB固体培养基：酵母粉3~10 g/L，胰蛋白胨6~20 g/L，氯化钠36~120 g/L，琼脂粉1~2%（w/v），pH 7~9；
液体培养基：氯化钠40~60 g/L，酵母粉3~10 g/L，胰蛋白胨6~20 g/L，氢氧化钠调节培养基pH至8.0~10.5，培养基体积为150 mL（500 mL锥形瓶）；
发酵培养基（50MM培养基）：葡萄糖35 g/L，氯化钠50 g/L，酵母粉1.2 g/L，尿素0.2~3 g/L，无水硫酸镁0.2 g/L，磷酸二氢钾1.5~5.5 g/L，Fe(III)-NH4-Citrate 5 g/L，CaCl2·2H2O 2 g/L，HCl 12 mol/L，ZnSO4·7H2O 0.1 g/L，MnCl2·4H2O 0.03 g/L，，CoCl2·6H2O 0.2 g/L，CuSO4·5H2O 0.01 g/L，NiCl2·6H2O 0.02 g/L，NaMoO4·2H2O 0.03 g/L，NaOH调节培养基pH至6.5~11；
碳源：葡萄糖；
碳源浓度：20~35 g/L；
发酵温度：30~42℃；
pH：6.5~11（采用5M NaOH调节）。
利用本发明的高温嗜盐菌生产PHA的方法如下：
（1）将嗜盐菌（LY02）在固体培养基上单克隆培养，然后进行一级，二级种子培养，最后接入发酵培养基，持续发酵36~50 h。
（2）PHA细胞干重处理：将25~35 mL发酵后菌液置于50 mL离心管中，8000~9000rpm室温下离心5~7 min，去上清液，去离子水清洗两次，冻干机冷冻干燥12~20小时。
（3）测定PHA含量：然后在40 mg冻干细胞中加入2 mL酯化液（包含甲醇、3%（v/v）浓硫酸（98%，w/w）和1 g/L苯甲酸）及2 mL氯仿，100℃下酯化约3~5 h。对应的标准品同样处理为参照。甲醇分解后，样品在GC-2014气相色谱仪（日本岛津）上测定PHB含量。
实施例1 菌株的分离与纯化
（1）菌株的分离
称取1 g来自新疆淤泥样，用无菌水稀释，涂布于含NaCl（60 g/L）的LB平板上（60LB），37℃培养48 h。
（2）菌株的纯化
随机挑平板上的多个单克隆菌落，用新的LB液体培养基稀释，涂布于新NaCl（60g/L）的LB平板上，37℃，静止培养48 h；反复重复上述过程，直至平板上长出形状相近的单克隆，完成菌株的纯化，并将其命名为LY02。
（3）菌株特征及类别鉴定
菌株形态：将分离纯化好的菌株采用60LB液体培养基在37℃条件下培养48小时（摇床转速为220 rpm），取少量培养好的菌液，使用扫描电镜确定菌的形态为短杆状或椭球形，如图1所示。
类别鉴定：利用革兰氏染色法对该菌株进行鉴别，确定该菌株为革兰氏阴性菌。
（4）菌株16S rDNA基因测定
检测该菌株的16S rDNA序列，扩增16S rDNA序列。
引物设计如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
随后送至广州华大生物公司测序分析，经测序，16S rDNA的序列如SEQ ID No.3所示。
（5）菌株序列对比
将测序得到的LY02菌株的16S rDNA与/>TTW4、X34、/>MG34、/>EG27S8QL、/>SSP41、SUR27、/>LUH20、/>JS92-SW72、/>TD01、LY01等常见盐单胞菌来源的16S DNA，采用MEGA-11软件进行序列比对，并绘制进化树，如图2所示。可见与本发明的/>LY02菌株亲缘关系最近的为/>LUH20，说明本发明的/>LY02确为嗜盐菌。
实施例2LY02在高温环境下的生长情况
（1）种子液制备
①菌种活化
于实验室-80℃冰箱取菌种，用枪头挑取菌液划线接种于平板固体培养基（酵母粉5 g/L；胰蛋白胨10 g/L；氯化钠60 g/L，pH为8.5）上，37℃培养24 h。
②一级种子培养：
挑取单菌落接种于12 mL摇菌管（5 mL 60LB培养基：酵母粉5 g/L；胰蛋白胨10 g/L；氯化钠60 g/L；pH为8.5）中，将培养液置于摇床37℃、220 rpm培养12 h。
③二级种子培养：
吸取一级菌液200 μL（1%接种量），接种于150 mL锥形瓶（20 mL 60LB培养基）中，将置于摇床37℃、220 rpm培养12 h。
（2）发酵培养基准备
发酵培养基（50MM培养基）：葡萄糖35 g/L，氯化钠50 g/L，酵母粉1.2 g/L，尿素0.2~3 g/L，无水硫酸镁0.2 g/L，磷酸二氢钾1.5~5.5 g/L，Fe(III)-NH4-Citrate 5 g/L，CaCl2·2H2O 2 g/L，HCl 12 mol/L，ZnSO4·7H2O 0.1 g/L，MnCl2·4H2O 0.03 g/L，，CoCl2·6H2O 0.2 g/L，CuSO4·5H2O 0.01 g/L，NiCl2·6H2O 0.02 g/L，NaMoO4·2H2O 0.03 g/L，NaOH调节培养基pH至6.5~11。
（3）发酵培养
将种子液按5%接种（2.5 mL）于500 mL锥形瓶内，置于摇床40℃、220 rpm培养48h。
（4）细胞干重及PHA含量测定
细胞干重（CDW）：将30-35 mL发酵后菌液置于50 mL离心管中，室温离心6分钟，转速为8000 rpm，倒掉上清；加入适量去离子水恢复原体积，重悬，保证沉淀完全消失，同等条件下离心，倒掉上清液；封口膜封口离心管置于-80℃冰箱冻存2 h；将离心管于真空冷冻干燥机内干燥12-16小时；称重，计算细胞干重（g/L）。
测定PHA含量：然后在40 mg冻干细胞中加入2 mL酯化液（包含甲醇、3%（v/v）浓硫酸（98%，w/w）和1 g/L苯甲酸）及2 mL氯仿，100℃下酯化约4 h。PHB标品20-30 mg采用同样处理为参照；随后使用GC-2014气相色谱仪（日本岛津）测定PHB含量。
测试方法是：初始温度维持在80℃，1.5 min；第一阶段，温度以30℃/min的速度增加到140℃；第二阶段，以40℃/min的速度增加到240℃，此过程耗时2 min；总的分析时间是8 min；注射温度为240℃和检测器温度为250℃。
（4）发酵结果
不同菌株高温环境下的发酵结果如表1所示：
表1 不同菌株在40℃高温环境下的发酵结果
结果表明，不同菌株在40℃环境下进行培养时，LY02菌株的长势最好，其细胞干重最高可达到9.73 g/L，PHA wt含量最高达到80.10%。
实施例3高氮源条件下LY02生长及PHA合成情况
（1）种子液制备
同实施例1中的种子液制备步骤。
（2）发酵液准备
发酵培养基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠60 g/L；
其中尿素设置6个水平：0.2、0.5、1、1.5、2、3 g/L；
碳氮比：葡萄糖（25~35 g/L）：尿素（0.5~1 g/L）。
（3）发酵培养
将种子液按5%接种（2.5 mL）于500 mL锥形瓶内，置于摇床40℃、220 rpm培养48h。
（4）发酵结果
不同氮源浓度及碳氮比LY02 细胞干重（CDW）和PHA发酵结果如表2所示：
表2不同尿素浓度LY02 CDW和PHA发酵结果
结果表明：当尿素浓度达到0.5 g/L时，PHA含量达到最高80.12%，但生长状态相对于尿素浓度为1 g/L时略差（细胞干重低），且PHA含量开始随着尿素浓度的增加而降低，为了探索最合适的尿素浓度，对葡萄糖和尿素不同碳氮比进行筛选，结果如表3和表4所示：
表3 不同碳氮比下的LY02 CDW（g/L）结果
表4 不同碳氮比下的LY02产PHA wt（%）结果
结果显示，碳氮比为30 g/L葡萄糖，0.75 g/L尿素时，菌株的生长状态最好，CDW含量高达12.22 g/L，PHA含量达到77.94%。
实施例4LY02发酵合成PHA的条件优化
（1）种子液制备
同实施例1中的种子液制备步骤。
（2）发酵液准备
发酵培养基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠60 g/L；
其中磷元素设置五个水平：0.6、0.85、1.12、1.5、2 g/L；
MgSO4同样设置五个水平：0.02、0.05、0.1、0.2、0.3 g/L；
酵母粉也设置五个水平：0、0.5、1、1.5、2 g/L。
（3）发酵培养
将种子液按5%接种（2.5 mL）于500 mL锥形瓶内，置于摇床37℃、220 rpm培养48h。
（4）培养基优化发酵结果如表5所示：
表5 培养基优化发酵结果
结果表明，在磷元素实验中，磷元素浓度为0.85 g/L时，细胞呈现较好的状态，并且聚羟基脂肪酸酯（PHA）的含量达到最高值，为84.21%；在MgSO4实验中，MgSO4浓度为0.2 g/L时，细胞的生长状态最佳，细胞干重（CDW）和PHA的含量达到最高水平，分别为12.97 g/L和73.71%；在酵母粉实验中，当酵母粉浓度达到1 g/L时，细胞干重和PHA重量百分比均达到最高值，分别为13.29 g/L和84.88%。
实施例5LY02生产PHA的高温摇瓶发酵
按实施例4筛选出的最优条件，在40℃高温中采用50MM培养基进行发酵，高产PHA产品。
（1）种子液制备：同实施例2中的种子液制备。
（2）培养基的准备：采用50MM培养体系。
（3）发酵培养：接种量及发酵条件同实施例2。
（4）细胞干重及PHA含量测定：细胞干重及PHA含量测定操作同实施例2。
（5）发酵结果如表6所示：
表6LY02高效产PHA的摇瓶发酵结果
结果表明，LY02在高温环境（40℃）下表现出良好的细胞稳定性和高产PHA。相较于/>TD01，该菌株不仅能适应高盐高PH环境生长，还能在高温环境（40℃）下保持良好的细胞状态。在工业生产PHA中进一步降低开放式连续发酵的染菌风险。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
SEQ ID No.1
agagtttgatcatggctca
SEQ ID No.2
aggtgatccagccgcaggtt
SEQ ID No.3
AGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAACGATGGAAGCTTGCTTCCAGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCATAGGAATCTGCCCGATAGTGGGGGATAACCTGGGGAAACTCAGGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTATCGGATGAGCCTATGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAAGAAGGCCTGAGGGCTAATACCCTTCAGGAAGGACATCACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGCTTGATAAGCCGGTTGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACGGCATCCGGAACTGTCAGGCTAGAGTGCAGGAGAGGAAGGTAGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGGAGGAATACCAGTGGCGAAGGCGGCCTTCTGGACTGACACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGGTCCTTGAGACCTTTGTGGCGCAGTTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACCCTTGACATCGTGCGAACTTTCCAGAGATGGATGGGTGCCTTCGGGAGCGCACAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCCTATTTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCTAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCAATGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAGCCGGTCTCAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGACTGCACCAGAAGTGGTTAGCTTAACCTTCGGGGGAGCGATCACCACGGTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCT。
Claims (9)
1.一株高温嗜盐菌（Halomonas sp.）LY02，其特征在于，所述嗜盐菌的保藏编号为GDMCC No:63381；
所述嗜盐菌的16S rDNA的序列如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的嗜盐菌在制备聚羟基脂肪酸酯中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述聚羟基脂肪酸酯为聚β-羟基丁酸酯。
4.一种制备聚β-羟基丁酸酯的方法，其特征在于，包括如下步骤：
发酵权利要求1所述的嗜盐菌（Halomonas sp.）LY02，得到聚β-羟基丁酸酯。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵温度为30~42℃；发酵pH为6.5~11；发酵时间为36~50 h。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵使用的发酵培养基组分包括：葡萄糖35 g/L；氯化钠50 g/L，酵母粉1.2 g/L，尿素0.2~3 g/L，无水硫酸镁0.2 g/L，磷酸二氢钾1.5~5.5 g/L，Fe(III)-NH4-Citrate 5 g/L、CaCl2·2H2O 2g/L、HCl 12 mol/L，ZnSO4·7H2O0.1 g/L，MnCl2·4H2O 0.03 g/L，，CoCl2·6H2O 0.2 g/L，CuSO4·5H2O0.01 g/L，NiCl2·6H2O 0.02 g/L，NaMoO4·2H2O 0.03 g/L。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵使用的发酵培养基组分中葡萄糖：尿素为（25~35 g/L）：（0.5~1 g/L）。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵使用的发酵培养基组分中磷元素浓度为0.6~2 g/L。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵使用的发酵培养基组分中MgSO4浓度为0.05~0.3 g/L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311172228.4A CN116925981B (zh) | 2023-09-12 | 2023-09-12 | 一株高温嗜盐菌及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311172228.4A CN116925981B (zh) | 2023-09-12 | 2023-09-12 | 一株高温嗜盐菌及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116925981A CN116925981A (zh) | 2023-10-24 |
| CN116925981B true CN116925981B (zh) | 2024-01-23 |
Family
ID=88375659
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311172228.4A Active CN116925981B (zh) | 2023-09-12 | 2023-09-12 | 一株高温嗜盐菌及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116925981B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117551585A (zh) * | 2023-11-29 | 2024-02-13 | 华南理工大学 | 一株盐单胞菌、重组盐单胞菌及其构建方法和应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102120973A (zh) * | 2010-12-08 | 2011-07-13 | 清华大学 | 一株盐单胞菌及其应用 |
| CN111593006A (zh) * | 2020-06-03 | 2020-08-28 | 清华大学 | 一株自凝絮嗜盐菌及其应用 |
| CN112961049A (zh) * | 2021-02-02 | 2021-06-15 | 珠海麦得发生物科技股份有限公司 | 一种光学右旋3-羟基丁酸的制备方法 |
| CN113583922A (zh) * | 2021-09-28 | 2021-11-02 | 清华大学 | 一种以低盐培养基培养嗜盐菌生产pha的方法 |
-
2023
- 2023-09-12 CN CN202311172228.4A patent/CN116925981B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102120973A (zh) * | 2010-12-08 | 2011-07-13 | 清华大学 | 一株盐单胞菌及其应用 |
| CN111593006A (zh) * | 2020-06-03 | 2020-08-28 | 清华大学 | 一株自凝絮嗜盐菌及其应用 |
| CN112961049A (zh) * | 2021-02-02 | 2021-06-15 | 珠海麦得发生物科技股份有限公司 | 一种光学右旋3-羟基丁酸的制备方法 |
| CN113583922A (zh) * | 2021-09-28 | 2021-11-02 | 清华大学 | 一种以低盐培养基培养嗜盐菌生产pha的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Finding of Novel Galactose Utilizing Halomonas sp. YK44 for Polyhydroxybutyrate (PHB) Production.;Jung HJ, Kim SH等;《Polymers (Basel)》;第14卷(第24期);摘要 * |
| PHA Production and PHA Synthases of the Halophilic Bacterium Halomonas sp. SF2003;Tatiana Thomas等;《Bioengineering》;第7卷(第1期);摘要、表7 * |
| PHB production from food waste hydrolysates by Halomonas bluephagenesis Harboring PHB operon linked with an essential gene;Ji M等;《Metab Eng》;摘要 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116925981A (zh) | 2023-10-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN116925981B (zh) | 一株高温嗜盐菌及其应用 | |
| CN106190907B (zh) | 一种利用木质素降解菌合成生物塑料前体聚羟基脂肪酸酯的方法 | |
| CN112458031B (zh) | 一株源自白酒酿造窖泥的产乳酸型己酸菌及其应用 | |
| CN111593006A (zh) | 一株自凝絮嗜盐菌及其应用 | |
| CN104830712B (zh) | 一种产高纯度2‑酮基‑d‑葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌株 | |
| CN101302488B (zh) | 一种生产乳酸的方法及其专用植物乳杆菌 | |
| CN110484471A (zh) | 一株高产细菌纤维素的耐酸菌株及其生产细菌纤维素的方法 | |
| CN110373346B (zh) | 枯草芽孢杆菌Bacillus sp.A-5及其用途 | |
| CN116574645A (zh) | 一株蜡样芽孢杆菌mg1及应用 | |
| CN116970538A (zh) | 一株广碳源利用的盐单胞菌及应用 | |
| CN108220192B (zh) | 一株泡囊短波单胞菌及其培养方法与应用 | |
| CN112430557B (zh) | 高产pha的卡巴耶罗氏菌株、筛选方法及其产生pha的方法 | |
| CN116396886B (zh) | 嗜盐单胞菌及其应用 | |
| JP7335469B1 (ja) | Ｐｂａｔ農業用フィルム分解菌およびその用途 | |
| CN114874941B (zh) | 一株具有水解生淀粉能力的叶际类芽孢杆菌及其应用 | |
| CN114958655B (zh) | 一株源自白酒酿造窖泥中的产丁酸型梭菌及其应用 | |
| CN113717892B (zh) | 一种发酵产他克莫司的筑波链霉菌株及其应用 | |
| CN109554321B (zh) | 一种高产脂肽的基因工程菌及其应用 | |
| CN109022329B (zh) | 一种产生物表面活性剂的双头菌菌株 | |
| CN114634894B (zh) | 一株实现耐盐发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN114958654B (zh) | 一种源自白酒酿造窖泥的产丙酸型嗜蛋白菌及其应用 | |
| CN117887641B (zh) | 一株兼具苯胺降解及聚羟基丁酸酯合成能力的菌株及其应用 | |
| CN115786300B (zh) | 一株低产芽孢解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
| CN113512512B (zh) | 一株海水硝酸盐还原菌及其产pha的应用 | |
| CN115820470B (zh) | 一株解淀粉芽孢杆菌zh804及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |