CN113512512B - 一株海水硝酸盐还原菌及其产pha的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株海水硝酸盐还原菌及其产PHA的应用,本发明的海水硝酸盐还原菌(Nitratireductor aquimarinus)命名为SY‑2‑4,保藏编号为CGMCC No.22297。本发明提供的海水硝酸盐还原菌SY‑2‑4具有较高的产PHA能力,在NB液体培养基中发酵培养4天后,其累积的PHA占细胞干重的比值高达到35.0%,因而具有良好的工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及菌株分离及应用技术领域,具体涉及一株海水硝酸盐还原菌及其产PHA的应用。
背景技术
传统的石油基塑料产品由于其高分子量和复杂的结构而具有不可生物降解的特性,能够在水体、土壤中保留很长时间,给生态环境造成了巨大威胁。生物基聚合物具有良好的生物可降解性、生物相容性以及塑料的热加工性能,广泛适用于工业应用。因此采用生物基聚合物代替石油基聚合物是一种有效的解决方案,能够显著地减轻塑料使用给生态环境带来的危害。
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA)是一种典型的生物基聚合物,能够被细菌产生,并作为细胞内的能量和碳源储存物。研究表明许多海洋细菌都能产生PHA,并且对PHA的构成和微结构已经开展了许多研究,极大地增强了PHA的性能,并促进了其在医学、农业和日用品等领域的应用。提供一株能高效产生PHA的海洋细菌对于研究开发海洋生物资源、开发海洋碳汇具有很大的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产PHA的海水硝酸盐还原菌(Nitratireductoraquimarinus)。
第一方面,本发明要求保护一株海水硝酸盐还原菌(Nitratireductoraquimarinus)SY-2-4,其保藏编号为CGMCC No.22297。
本发明从广东深圳大鹏湾海域近海海底表层10cm处底泥中分离得到一株海水硝酸盐还原菌,命名为SY-2-4。
具体分离方法为:采集广东深圳大鹏湾海域近海海底表层10cm处底泥;将采集的底泥放入装有已灭菌的含油含盐培养基的锥形瓶中充分震荡培养,制成底泥悬浮液;将所述底泥悬浮液梯度稀释,制成10-3至10-5浓度的底泥悬浮液;将所述稀释的底泥悬浮液加入至2216E培养基平板进行涂布处理,并置于30℃培养箱中培养,得到菌落;挑选形态各异的单菌落进行划线纯化培养,低温保藏菌种;采用菌落PCR方法对所述菌种的phaC基因进行鉴定,有条带的菌种即为产PHA阳性菌,经鉴定为海水硝酸盐还原菌,并命名为SY-2-4。
SY-2-4的菌落较小,呈圆形、呈乳白色、边缘整齐、表面湿润有光泽。
本发明的海水硝酸盐还原菌菌株SY-2-4已于2021年5月10号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮政编码:100101),分类命名为Nitratireductor aquimarinus,保藏编号为CGMCC No.22297。
第二方面,本发明提供一种菌剂,含有上述海水硝酸盐还原菌或其发酵液。在所述菌剂中,PHA占细胞干重的比例大于35%;在所述菌剂中,PHB占所述PHA的97%;PHV占所述PHA的3%。
第三方面,本发明提供所述所述海水硝酸盐还原菌发酵产PHA的方法,将海水硝酸盐还原菌SY-2-4接种至液体培养基中,28-33℃,130-160r/min下培养3-5天,获得发酵液;
具体地,将海水硝酸盐还原菌SY-2-4接种至液体培养基中,30℃,150r/min下培养4天,获得发酵液。
所述液体培养基包括营养肉汤培养基和以葡萄糖为单一碳源的无机盐培养基。
在本发明提供的方法中,所述肉汤培养基的组分包括蛋白胨、牛肉膏和氯化钠;所述无机盐培养基的组分包括葡萄糖、Na2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4、CaCl2、枸椽酸铁铵、ZnSO4、MnCl2、H3BO3、CoCl2、CuCl2、NiCl2和NaMoO4。
具体地,液体培养基包括营养肉汤培养基(NB)和以葡萄糖为单一碳源的无机盐培养基(M1)组分如下:
NB:10g/L的蛋白胨,5g/L的牛肉膏,5g/L的NaCl,pH 7.0,121℃灭菌25min。
M1:10g/L的葡萄糖,9g/L的Na2HPO4,1.5g/L的KH2PO4,1g/L的NH4Cl,0.2g/L的MgSO4,0.02g/L的CaCl2,0.0012g/L的枸椽酸铁铵,加入100μL的微量元素液(1g/L ZnSO4,0.3g/L MnCl2,3g/LH3BO3,2g/L CoCl2,0.1g/L CuCl2,0.2g/L NiCl2,0.3g/L NaMoO4),pH7.0,121℃灭菌25min。
采用上述的海水硝酸盐还原菌或上述的方法,可大幅提高PHA的产量,在使用营养肉汤培养基(NB)培养4天后,菌株SY-2-4产PHA的总累计量占细胞干重的比值达到35.0%。因此,本发明要求保护上述的海水硝酸盐还原菌或上述的方法在提高PHA产量中的应用。
根据本领域技术人员的理解,本发明还要求保护上述的海水硝酸盐还原菌或上述的方法或上述的菌剂在生产PHA中的应用;所述PHA包括聚3-羟基丁酸酯和聚羟基戊酸酯。
聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA),是微生物合成的一种细胞内聚酯,是一种天然的高分子生物材料。PHA具有良好的生物相容性能、生物可降解性的同时,也具备塑料的热加工性能。因此,本发明还要求保护上述的海水硝酸盐还原菌或上述的方法或上述的菌剂在生产包装材料、粘合材料或喷涂材料中的应用。
本发明的有益效果是:本发明提供的海水硝酸盐还原菌(Nitratireductoraquimarinus)SY-2-4是在近海海底表层底泥中分离得到的,在NB液体培养基中发酵培养时,具有较强的PHA生产能力,所产的PHB和PHV总累计量占细胞干重比值高,为生产替代合成塑料的天然高分子生物材料提供了重要的菌株资源和技术手段,具有良好的工业化应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例1分离筛选海水硝酸盐还原菌SY-2-4的流程图。
图2是扩增本发明实施例1中分离筛选得到的海水硝酸盐还原菌SY-2-4的phaC合成酶基因的PCR产物电泳图。
图3是本发明实施例2中在30℃培养1天后海水硝酸盐还原菌SY-2-4的菌落图。
图4是本发明实施例2中海水硝酸盐还原菌SY-2-4的革兰氏染色图。
图5是本发明实施例2中海水硝酸盐还原菌SY-2-4的16S序列构建的系统发育树图。
图6是本发明实施例3中海水硝酸盐还原菌SY-2-4产PHA测定结果图。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的保护范围。
若未特别指明,本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得;若未具体指明,本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例中所用的培养基包括:
(1)含油含盐富集培养基,用于菌株的分离,其组成为:向海水中添加1-10%(v/v)的混合植物油(金龙鱼:花生油:菜籽油=1:1:1)和35-125‰的NaCl。
花生油按照GB/T 1534-2017规定大于5%的组成为:棕榈酸(C16:0,8.0-14.0)、油酸(C18:1,35.0-69.0)和亚油酸(C18:2,13.0-43.0)。菜籽油按照GB/T 1536-2004规定大于5%的组成为:棕榈酸(C16:0,1.5-6.0)、油酸(C18:1,8.0-60.0)、亚油酸(C18:2,11.0-23.0)、亚麻酸(C18:2,5.0-13.0)、花生一烯酸(C20:1,3.0-15.0)和芥酸(C22:1,3.0-60.0)。
普通海水培养基(2216E),用于菌株的纯化培养,其组成包括:5.0g/L的蛋白胨,1.0g/L的酵母膏,0.1g/L的柠檬酸铁,19.45g/L的NaCl,5.98g/L的MgCl2,3.24g/L的Na2SO4,1.8g/L的CaCl2,0.55g/L的KCl,0.16g/L的Na2CO3,0.08g/L的KBr,0.034g/L的SrCl2,0.022g/L的H3BO3,0.004g/L的Na2O·nSiO2,0.0024g/L的NaF,0.0016g/L的NaNO3,0.008g/L的Na2HPO4,pH为7.6±0.2,121℃下高压蒸汽灭菌25min。
产PHA液体培养基包括营养肉汤培养基(NB)和以葡萄糖为单一碳源的无机盐培养基(M1)组分如下:
NB:10g/L的蛋白胨,5g/L的牛肉膏,5g/L的NaCl,pH 7.0,121℃灭菌25min。
M1:10g/L的葡萄糖,9g/L的Na2HPO4,1.5g/L的KH2PO4,1g/L的NH4Cl,0.2g/L的MgSO4,0.02g/L的CaCl2,0.0012g/L的枸椽酸铁铵,加入100μL的微量元素液(1g/L ZnSO4,0.3g/L MnCl2,3g/LH3BO3,2g/L CoCl2,0.1g/L CuCl2,0.2g/L NiCl2,0.3g/L NaMoO4),pH7.0,121℃灭菌25min。
实施例1海水硝酸盐还原菌SY-2-4的分离与筛选
本实施例提供海水硝酸盐还原菌SY-2-4分离与筛选的方法,分离与筛选的流程图见图1,具体步骤如下:
1、可培养菌株的分离
采集广东深圳大鹏湾海域近海海底表层10cm处底泥;将采集的底泥样品加入装有100mL已灭菌的含油含盐富集培养基的锥形瓶中,30℃、160r/min下恒温震荡培养77天,每7天以1%的接种量转接至含新鲜的培养基富集培养基中,同时提高含油量1%、盐度10‰,培养第7、42和77天取1mL土壤悬浮液;将所述底泥悬浮液梯度稀释,制成10-3至10-5浓度的土壤悬浮液;将所述稀释的底泥悬浮液加入至2216E培养基平板进行涂布处理,30℃恒温培养箱培养48h后得到菌落;挑取形态各异的单菌落进行划线纯化培养,低温保藏菌种。
2、产PHA菌株的筛选
采用菌落PCR方法对所述菌种的phaC基因进行鉴定。挑取单菌落加入含50μL无菌水的灭菌PCR管中,95℃、10min得到菌落PCR模板。phaC基因正向引物为(SEQ ID NO.1)PHACGNF(5’-CCYRGATCAACAAGTTCTAC-3’),反向引物为(SEQ ID NO.2)PHACGNR(5’-TTCCAGAACAGMAGGTCGAAGG-3’)。
PCR反应体系为:2×PCR Master Mix 25μL;正向引物和反向引物各1μL;模板1μL;ddH2O补足50μL。
PCR反应条件为:在温度为94℃预变性6min;94℃变性45s,54℃退火30s;72℃延伸90s,31循环;72℃延伸10min,4℃保存。将得到的PCR产物进行120V、30min、1%的琼脂糖凝胶电泳,蓝光透色仪观察胶体,有条带的样品即为phaC基因阳性菌株,将其命名为SY-2-4,其电泳图见图2。
实施例2海水硝酸盐还原菌SY-2-4的鉴定
本发明实施例对实施例1筛选得到的海水硝酸盐还原菌SY-2-4进行鉴定,包括形态学观察、生理生化鉴定和16S rDNA序列分析,具体如下:
1、形态学鉴定
将实施例1筛选得到的菌株SY-2-4划线到2216E固体培养基上,然后将平板倒转,在温度30℃的条件下培养24h,观察并记录平板上菌落的生长情况。本发明实施例提供的菌株SY-2-4的菌落形态请参考图3。从图3能够看出菌株的菌落较小,呈圆形、呈乳白色、边缘整齐、表面湿润有光泽。
用试剂盒对发明实施例1筛选得到的菌株SY-2-4进行革兰氏染色,并在油镜下观察菌株,该菌株的革兰氏染色图见图4。从图4中的阴影部分可以看出菌株呈红色,为革兰氏阴性菌。
2、生理生化鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》中的生理生化鉴定指标,对实施例1分离得到的菌株SY-2-4进行生理生化鉴定。
菌株的生理生化鉴定指标包括过氧化氢酶能力、甲基红MR实验、VP实验、氧化酶能力、淀粉水解能力、产硫化氢能力、硝酸盐还原能力、丙二酸盐利用能力、柠檬酸盐利用能力、明胶液化能力。生理生化鉴定结果如表1。
表1本菌株的生理生化鉴定结果
表性特征 | 反应特征 | 表性特征 | 反应特征 |
过氧化氢酶 | + | 产硫化氢 | + |
MR实验 | - | 硝酸盐还原 | + |
VP实验 | - | 丙二酸盐利用 | + |
氧化酶 | + | 柠檬酸盐利用 | - |
淀粉水解 | - | 明胶液化 | - |
表中,+表示本菌株有反应或可以利用,-表示本菌株没有反应或不可以利用。
3、16S rDNA序列分析
采用Ezup细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株SY-2-4中的DNA。PCR扩增的正向引物(SEQ ID NO.3)为27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’),反向引物(SEQ ID NO.4)为1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。
PCR反应体系为:2×PCR Master Mix 25μL;正向引物和反向引物各1μL;模板1μL;ddH2O补足50μL。
PCR反应体系为:在温度为94℃预变性4min,1个循环;94℃变性45s,55℃退火45s;72℃延伸90s,30个循环;4℃保存。
PCR产物由上海生工生物工程股份有限公司进行测序,测序结果如SEQ ID NO.5所示。将所得序列在GenBank中进行Blast相似性比对,得到相似性较高的序列。运用MEGA7.0软件构建菌株的系统发育树,本菌株的16S rDNA序列与海水硝酸盐还原菌(Nitratireductor aquimarinus)的同源性达到99.9%,本菌株的系统发育树见图5。
综合上述形态学观察、生理生化鉴定及16S rDNA序列分析结果,能够确定本菌株SY-2-4为海水硝酸盐还原菌(Nitratireductor aquimarinus),其被命名为海水硝酸盐还原菌SY-2-4。该菌株已于2021年5月10号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮政编码:100101),分类命名为Nitratireductor aquimarinus,保藏编号为CGMCCNo.22297。
实施例3海水硝酸盐还原菌SY-2-4的产PHA能力测定
本实施例对海水硝酸盐还原菌SY-2-4进行了产PHA能力测定,该测定包括以下内容:
1、PHA的提取
将本发明实施例1提供的菌株SY-2-4分别接种至液体培养基中,于30℃,150r/min条件下恒温震荡培养4天。培养结束后,取发酵液在5000r/min下离心20min,获得细胞沉淀,然后进行冷冻干燥处理;称取10mg的细菌冻干样品,放入脂化管中,然后加入1mL的氯仿(含0.5mg/mL苯甲酸甲酯)和1mL含15%(v/v)浓硫酸的甲醇溶液,在100℃油浴下密封处理2.5h,进行甲酯化反应;反应结束后,将样品冰浴冷却5min,然后加入0.5mL去离子水,充分混匀30s,在3500r/min下离心分层10min,取下层氯仿相用于色谱分析。
所述液体培养基包括营养肉汤培养基(NB)和以葡萄糖为单一碳源的无机盐培养基(M1),组分如下:
NB:10g/L的蛋白胨,5g/L的牛肉膏,5g/L的NaCl,pH 7.0,121℃灭菌25min。
M1:10g/L的葡萄糖,9g/L的Na2HPO4,1.5g/L的KH2PO4,1g/L的NH4Cl,0.2g/L的MgSO4,0.02g/L的CaCl2,0.0012g/L的枸椽酸铁铵,加入100μL的微量元素液(1g/L ZnSO4,0.3g/L MnCl2,3g/LH3BO3,2g/L CoCl2,0.1g/L CuCl2,0.2g/L NiCl2,0.3g/L NaMoO4),pH7.0,121℃灭菌25min。
2、PHA的含量测定
采用气相色谱仪分析甲酯化产物样品,以测定PHA的含量,选用DB-WAX型号色谱柱作为固定相,使用惰性气体氦气作为流动相,进样量为1μL,进样温度250℃,流速0.7mL/min。使用分析纯级别的聚3-羟基丁酸酯(PHB)和聚羟基戊酸酯(PHV)作为标准物,定性分析菌株SY-2-4合成的PHA,以苯甲酸甲酯作为内标物,用内标法作定量分析。称取一定梯度质量的PHA产物进行甲酯化预处理,气相分析后,读取PHA单体峰面积/内标峰面积的比值与单体质量/内标物的质量的数据做标准曲线,该标准曲线用于定量分析干细胞中的PHA含量。本实施例测定的PHA的单体组成包括聚3-羟基丁酸酯(PHB)和聚羟基戊酸酯(PHV)。
上述标准曲线按下式计算:
PHA含量(%)=PHA浓度(g/L)/CDW(g/L)×100%
其中CDW为菌株的细胞干重。
3、测定结果
本发明提供了海水硝酸盐还原菌SY-2-4产PHA能力的测定结果图,见图6。从图6中可以看出利用营养肉汤培养基(NB)和以葡萄糖为单一碳源的无机盐培养基(M1)发酵培养时,菌株均合成两种不同种类的PHA:聚3-羟基丁酸酯(PHB)和聚羟基戊酸酯(PHV)。
以葡萄糖为单一碳源的无机盐培养基(M1)培养4天后,PHA总累计量占细胞干重比值达到2.4%,其中PHB相对占比93.0%,PHV相对占比7.0%。
营养肉汤培养基(NB)培养4天后,菌株SY-2-4产PHA的能力最强,其总累计量占细胞干重比值达到35.0%,其中PHB相对占比97.0%,PHV相对占比3.0%,具有良好的工业化应用前景。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京大学深圳研究院
<120> 一株海水硝酸盐还原菌及其产PHA的应用
<130> KHP211115296.8
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccyrgatcaa caagttctac 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttccagaaca gmaggtcgaa gg 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 5
<211> 1382
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
actggcggag cttaccatgc agtcgagcgc cccctcgggg gagcggcaga cgggtgagta 60
atgcatggga atctacctgg ctctacggaa taactcaggg aaacttgaac taataccgta 120
tacgtccttc gggagaaaga tttatcggag ttagatgagc ccatgtctga ttagctagtt 180
ggtgaggtaa aggctcacca aggcgacgat cagtagctgg tctgagagga tgatcagcca 240
cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca 300
atgggcgcaa gcctgatcca gccatgccgc gtgagtgatg aaggccctag ggttgtaaag 360
ctctttcacc ggtgaagata atgacggtaa ccggagaaga agccccggct aacttcgtgc 420
cagcagccgc ggtaatacga agggggctag cgttgttcgg aattactggg cgtaaagcgc 480
gcgtaggcgg atcggtcagt taggggtgaa atcccggggc tcaaccccgg aactgcctct 540
aatactgccg atctagagtt cgagagaggt gagtggaatt ccgagtgtag aggtgaaatt 600
cgtagatatt cggaggaaca ccagtggcga aggcggctca ctggctcgat actgacgctg 660
aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 720
atggaagcta gccgtcggca ggtttacctg tcggtggcgc agttaacgca ttaagcttcc 780
cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 840
cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgcagaac cttaccagcc cttgacatct 900
gggtcgcgga taccggagac ggtttccttc agttaggctg gacccaagac aggtgctgca 960
tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1020
cgcccttagt tgccagcctt aagttgggca ctctaagggg actgccggtg ataagccgag 1080
aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttacg ggctgggcta cacacgtgct 1140
acaatggtgg tgacagtggg cagcgagacc gcgaggtcga gctaatctcc aaaaaccatc 1200
tcagttcgga ttgcactctg caactcgggt gcatgaagtt ggaatcgcta gtaatcgcgg 1260
atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg 1320
gagttgggtt tacccgaagg cagtgcgcta accgcaagga ggcagctacc acgtgcaggc 1380
gg 1382
Claims (7)
1.一株海水硝酸盐还原菌(Nitratireductor aquimarinus)SY-2-4,其保藏编号为CGMCC No.22297。
2.一种菌剂,其特征在于,含有权利要求1所述的海水硝酸盐还原菌或其发酵液。
3.根据权利要求2所述的菌剂,其特征在于,所述菌剂中,PHA占细胞干重的比例大于35%;所述PHA为聚3-羟基丁酸酯和聚羟基戊酸酯。
4.根据权利要求3所述的菌剂,其特征在于,所述菌剂中,PHB占所述PHA的97%;PHV占所述PHA的3%。
5.一种生产PHA的方法,其特征在于,使用权利要求1所述海水硝酸盐还原菌或权利要求2-4任一项所述菌剂接种至液体培养基中,28-33℃,130-160r/min下培养3-5天,获得含PHA的发酵液;
所述液体培养基为肉汤培养基或以葡萄糖为单一碳源的无机盐培养基;所述PHA为聚3-羟基丁酸酯和聚羟基戊酸酯。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述液体培养基为肉汤培养基;培养条件为30℃,150r/min下培养4天,获得含PHA的发酵液。
7.权利要求1所述的海水硝酸盐还原菌或权利要求2-4任一项所述的菌剂或权利要求5-6任一项所述的方法在生产PHA中的应用;所述PHA为聚3-羟基丁酸酯和聚羟基戊酸酯。
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