CN104673729B - 一株解磷根瘤菌及其与沉水植物的联合在减少沉积物内源磷负荷中的应用 - Google Patents

一株解磷根瘤菌及其与沉水植物的联合在减少沉积物内源磷负荷中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株解磷根瘤菌及其与沉水植物的联合在减少沉积物内源磷负荷中的应用。该解磷根瘤菌为根瘤菌（Rhizobium sp） XMT‑5菌株，于2015年2月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为 CGMCC No.10510。该菌株具有良好的解磷能力，可促进沉水植物对沉积物磷的吸收，减少水体总磷含量以及沉积物中的内源磷负荷，利于改善富营养化水体的水质，具有重大的生态和社会效益。

Description

一株解磷根瘤菌及其与沉水植物的联合在减少沉积物内源磷 负荷中的应用
技术领域
本发明涉及一株解磷根瘤菌及其与沉水植物的联合体系在水体除磷中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
水体的富营养化是严重污染环境的世界性问题之一。在我国，处于严重富营养化状态的湖泊（如滇池等）达到了73%以上，给社会经济发展与居民的生产生活都带来了诸多负面影响。所以，亟需采取措施对富营养化水体进行治理。研究发现，磷是导致水体发生富营养化的关键性因素，所以对水体中磷含量的控制是治理富营养化的根本。
目前，对于排入水体的外源磷已经有了相对成熟的控制措施与方法，但是由经年累月积蓄了大量营养物质的沉积物释放的内源磷仍然会导致水体质量的明显下降与富营养化的频繁发生。但是，由于影响因素的复杂性，对内源磷释放的控制以及内源磷负荷的减少是更难以实现的。研究表明，利用沉水植物对富营养化水体进行原位修复，可以实现对水体生态环境的改善。比如微齿眼子菜、穗状狐尾藻、金鱼藻、菹草和伊乐藻等沉水植物对沉积物磷有比较明显的吸收和转化作用，利于控制沉积物磷的释放。但是，在实际应用中单纯依靠沉水植物修复富营养化水体环境时对沉积物内源磷负荷的减少还是远远不能满足实际需要。因此，寻找一种更为有效的开发具有高效吸收和转化沉积物内源磷的方法非常必要，具有重要的理论及现实意义。
发明内容
本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提供一株解磷根瘤菌、含有该根瘤菌的菌剂及其与沉水植物的联合体系在减少沉积物内源磷负荷中的应用，可使富营养化沉积物内源磷更有效地向沉水植物进行转移，并有效减少水体磷的含量，有助于对富营养化水体的原位修复。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一株解磷菌，该解磷菌为根瘤菌（Rhizobium sp） XMT-5菌株，该菌株于2015年2月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为 CGMCCNo.10510。
本发明的另一个目的是提供一种含有该解磷根瘤菌的菌剂，具体制备方法如下：取斜面上保存的XMT-5菌落一环接种于5mLLB液体培养基中，30℃下160rpm摇床培养过夜，得到菌液1，然后将5mL菌液1接入150mL LB液体培养基中，30℃下160 rpm摇床培养24h，得到菌液2，取6mL 菌液2，离心（8000rpm，8min），蒸馏水洗两次，用蒸馏水重悬，得到菌剂。
将所制备的菌剂与沉水植物联合在减少沉积物内源磷负荷中的应用，将该菌剂接种于水下沉积物中，可促进沉水植物对沉积物磷的吸收，减少水体总磷含量以及沉积物中的内源磷负荷，利于改善富营养化水体的水质。
所述沉水植物为穗状狐尾藻或金鱼藻等。
本发明的优点在于：将解磷根瘤菌XMT-5应用于减少沉积物内源磷负荷，利用沉水植物穗状狐尾藻与解磷根瘤菌XMT-5的联合体系使富营养化沉积物内源磷更有效地向沉水植物进行转移，并有效减少水体磷的含量，有助于对富营养化水体的原位修复，具有重大的经济、环境和生态效益。
具体实施方式
本发明以下结合具体实例做进一步描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复，结果取平均值。
在本发明中，所述的XMT-5菌株的最佳培养条件为：以蒙金娜固体培养基为定性筛选培养基，以蒙金娜液体培养基为定量筛选培养基，以LB液体培养基为种子液培养基，培养温度30℃。
蒙金娜固体培养基（定性筛选培养基）：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.35g，Ca3(PO4)2 10g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03g，Ca3(PO4)2 5g，琼脂18g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.2。
蒙金娜液体培养基（定量筛选培养基）：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.35g，Ca3(PO4)2 10g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03g，Ca3(PO4)2 5g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.2。
LB液体培养基（种子液培养基）：蛋白胨 10g，酵母粉 5g，NaCl 10g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.2。
实施例1、根瘤菌（Rhizobium sp.）XMT-5的分离鉴定
一、菌株的分离
采集河南工业大学附件农田土样，称取5g样品放入装有20粒玻璃珠与45mL无菌水的三角瓶中，于30℃，160rpm摇床振荡3h，待样品均匀分散到无菌水中之后，吸取0.5mL悬液于装有4.5mL无菌水的试管中，混匀，梯度稀释为10-1-10-6，从10-3-10-6稀释度的菌悬液中分别吸取200μL涂布于蒙金娜固体培养基平板上，30℃恒温培养箱培养2d。将菌落边缘出现透明圈的不同菌落划线纯化，并依次标记为XMT-1，XMT-2等，记作初步筛选的解磷细菌。
再将初步筛选的解磷细菌接入蒙金娜液体培养基中，30℃，160rpm 摇床振荡培养3d，得到的菌悬液以8000rpm 的转速离心10min，取上清液测定总磷浓度，筛选得到其中磷含量最高的菌株XMT-5。
二、菌株的鉴定
将菌株XMT-5在LB培养基上30℃培养24h后，菌落为圆形、白色、湿润、较粘稠、凸起、边缘不规则、不透明。
菌株XMT-5的主要生物学特性如下：革兰氏阴性（G-），菌体为直杆状，兼性厌氧；能运动，无芽孢。
XMT-5的16S rRNA基因部分序列见序列表。
实施例2、根瘤菌（Rhizobium sp.）XMT-5的解磷能力
一、取斜面上保存的XMT-5菌落一环接种于5mLLB液体培养基中，30℃下160rpm摇床培养过夜，得到菌液1，然后将5mL菌液1接入150mL LB液体培养基中，30℃下160 rpm摇床培养24h，得到菌液2，取6mL 菌液2，离心（8000rpm，8min），蒸馏水洗两次，用蒸馏水重悬，得到菌液3。
二、将菌液3接入150mL蒙金娜液体培养基中，30℃，160 rpm 摇床振荡培养5d，期间于0、1、3和5d时均取样2mL，8000rpm 离心10min，分别取上清液应用过硫酸钾消解钼酸铵分光光度法(GB11893-89)测定总磷浓度。 考察菌株XMT-5的解磷能力。结果表明，XMT-5在第2d时溶磷量达到最大值，为366.3 mg/L。
实施例3、根瘤菌（Rhizobium sp.）XMT-5与沉水植物的联合对沉积物内源磷的转移
一、菌株活化同实施例2的步骤一，直至获得菌液2，将其离心（8000rpm，10min），得到XMT-5的菌体，加入5mL无菌水重悬菌体制备成菌剂。
二、设立如下对照组和实验组：
实验组：先在模拟装置底部装入沉积物，再将培养至对数期的解磷菌接种于沉积物中。之后选取预先培养好的沉水植物（如穗状狐尾藻）植株扦插种植于沉积物中，上层加入上覆水，培养15d后检测沉水植物植株总磷含量与生物量以及水体与沉积物总磷的变化。
对照组：不加菌剂，其它步骤与实验组相同。
将实验组和对照组置于25℃，光照强度为8800lx条件下培养20d，之后小心拔出穗状狐尾藻，自然晾干，测量株高、称干重，并测定植株的总磷含量。同时取各组上覆水样品5mL，沉积物5g，测定其中总磷含量。每组试验设5个平行，最终结果取平均值。
结果表明，与对照组相比，接入XMT-5后，穗状狐尾藻的植株株高高出31%，干重比对照组增加23%，总磷含量提高15%，而水体总磷含量降低30%，沉积物总磷含量降低28%。
序列表
<110>河南工业大学
<120>一株解磷根瘤菌及其与沉水植物的联合在减少沉积物内源磷负荷中的应用
<160>1
<210>1
<211>1352
<212>DNA
<213>根瘤菌（Rhizobium sp.）
<400>1
GCCTCCTTGCGGTTAGCGCACTACCTTCGGGTAAAACCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCATGCTGATCTGCGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGATGGCTTTTGGAGATTAGCTCGACATCGCTGTCTCGCTGCCCACTGTCACCACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGCCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCTCGGCTTATCACCGGCAGTCCCCTTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTTCTGGGGCCAGCCTAACTGAAGGACATCGTCTCCAATGCCCATACCCCGAATGTCAAGAGCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGTTTAATGCGTTAGCTGCGCCACCGAACAGTATACTGCCCGACGGCTAACATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTAATGGACCAGTAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGGAATTCCACTTACCTCTTCCATACTCAAGATACCCAGTATCAAAGGCAGTTCCAGAGTTGAGCTCTGGGATTTCACCCCTGACTTAAATATCCGCCTACGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGAACAACGCTAGCCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGGGCTTCTTCTCCGGATACCGTCATTATCTTCTCCGGTGAAAGAGCTTTACAACCCTAAGGCCTTCATCACTCACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTATGGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCCAACGCGGGCCAATCCTTCCCCGATAAATCTTTCCCCCGTAGGGCGTATGCGGTATTAATTCCAGTTTCCCGGAGCTATTCCGCAGGAAAGGGTATGTTCCCACGCGTTACTCACCCGTCTGCCACTCCCCTTGCGGGGCGTTCGACTGCTCGGTTA

Claims (2)

1.一种解磷根瘤菌菌剂与沉水植物的联合在减少沉积物内源磷负荷中的应用，其特征在于：所述解磷根瘤菌菌剂含有根瘤菌（Rhizobium sp）XMT-5菌株，该菌株于2015年2月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为 CGMCC No.10510；将该菌剂接种于水下沉积物中，可促进沉水植物对沉积物磷的吸收，减少水体总磷含量以及沉积物中的内源磷负荷，利于改善富营养化水体的水质。
2.根据权利要求1所述菌剂与沉水植物的联合在减少沉积物内源磷负荷中的应用，其特征在于：所述沉水植物为穗状狐尾藻或金鱼藻。
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