CN112746020B

CN112746020B - 产生物表面活性剂的青霉菌及其应用

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Publication number: CN112746020B
Application number: CN201911047917.6A
Authority: CN
Inventors: 杨美; 沈卫海; 杨健; 谭枝文; 陈东
Original assignee: China Petroleum and Chemical Corp
Current assignee: China Petroleum and Chemical Corp
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2039-10-30
Also published as: CN112746020A

Abstract

本发明提供了一种产表面活性剂的青霉菌及其应用。本发明的青霉菌的保藏编号为CGMCC NO.10455，其具有优异的产生物表面活性剂的性能，可用于降解石油烷烃。

Description

产生物表面活性剂的青霉菌及其应用

技术领域

本发明属于环境污染生物处理技术领域，具体涉及一株高产生物表面活性剂的青霉菌及其应用。

背景技术

表面活性剂是一类品种多样，用途广泛的精细化工产品，它在各个工业领域中具有特殊的重要地位，素有“工业味精”的美称。但随着人们对环境问题认识加深，从源头上减少污染及治理污染的同时不产生二次污染已经成为人们的共识，表面活性剂的生物降解性越来越成为衡量其性能的一个重要指标。可降解的生物表面活性剂是未来表面活性剂的发展趋势。

生物表面活性剂的种类繁杂，因合成它的微生物的种类的不同而不同。细菌产生的生物表面活性剂中最常见的是糖脂，如鼠李糖脂、海藻糖脂、葡萄糖脂、蔗糖脂和果糖脂等；其次是含氨基酸类脂，包括鸟氨酸脂、脂肽等；酵母菌产生的生物表面活性剂主要含蛋白质脂和槐糖脂等，霉菌产生的生物表面活性剂以黑粉菌酸和甘露糖赤藓糖醇脂为主。

和传统的化学合成表面活性剂相比，生物表面活性剂具有以下显著特征和优点：

1.较低的表面张力和界面张力。生物表面活性剂通常比合成表面活性剂化学结构更为庞大和复杂，具有更多的活性基团，可以更好地吸附于油水界面，改善油水界面性状，因而在降低水-气及油-水界面张力方面更加有效。

2.耐温性：有些生物表面活性剂在90℃的高温下仍可保持其表面活性。

3.耐盐性：生物表面活性剂在10％的盐溶液中仍不沉降或析出，而化学合成表面活性剂在2-3％的盐溶液中就会失活。

4.可生化降解性：生物表面活性剂在水体或土壤中都易于降解。

5.低毒或无毒，对环境友好。

6.通过生物方法引入化学方法难以合成的新基团，使得生物表面活性剂化学结构具有多样性，从而可能使其具有某种特殊功能。

由此可见，生物表面活性剂是一种公认的多功能化学处理剂，它一方面具有化学合成表面活性剂的共性，另一方面又有稳定性好、抗盐性强、受温度影响小、能被生物降解、无毒等优点。

生物表面活性剂应用范围广，且具有对有机体无害和有利于生物降解等特性，在农业、食品和环保等领域中有很强的竞争优势。随着石油工业的发展，石油污染已经成为重要的污染物之一，水、空气都受到严重的污染，如能成功地处理我国石油污染，必定会产生巨大的社会效益和经济效益。生物表面活性剂具有无毒、可生物降解，不会对环境造成污染，且能够增强憎水基性化合物的亲水性和生物可利用性、提高水、土壤微生物的数量，继而提高了石油烷烃的降解速度。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一株生物表面活性剂高产菌株(Penicillium sp.Y)并通过条件优化提高产率。

为实现上述目的，本发明提供一种生物表面活性剂高产微生物，其分类命名为青霉菌(Penicillium sp.)Y，于2015年1月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10455。保藏单位的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明所获得菌株筛选自郊区农田土壤，经过富集培养基富集培养，再以蓝色凝胶培养基培养基分离纯化，得到23株形态各异的产生物表面活性剂菌株，通过96孔板快速初筛，得到6株产表面活性剂菌株，再经过摇瓶复筛，得到1 株高产生物表面活性剂微生物菌株Y。

本发明还提供上述产生物表面活性剂菌Penicillium sp.Y在含有培养基中的发酵产表面活性剂的优化方法。通过额外补充碳源及诱导物，可提高上述菌株的表面活性剂产量，并通过单因素试验和正交试验优化方法获得表面活性剂最优发酵条件。

在第一方面，本发明提供了一种青霉菌，其保藏编号为CGMCC NO.10455。

根据本发明的一些实施方式，所述青霉菌具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

根据本发明的一些实施方式，所述青霉菌的生物学特征为：营养体为无色或淡色的菌丝体，在气生菌丝上有长而直立的分生孢子梗，分生孢子梗上有瓶梗，在瓶梗上着生分生孢子链，分生孢子为球形至卵形，菌落不透明、绒毛状，呈绿色，边缘不整齐。

在第二方面，本发明提供了一种青霉菌制剂，其包括保藏编号为CGMCC NO.10455的青霉菌。

在第三方面，本发明提供了一种制备生物表面活性剂的方法，其包括：

步骤A：在发酵培养液中培养第一方面所述的青霉菌或第二方面所述的青霉菌制剂；

步骤B：将步骤A之后的发酵培养液离心，去除菌体，得到上清液；

步骤C：将所述上清液中与氯仿/甲醇溶液混合，得到混合液；

步骤D：萃取所述混合液，取下层萃取液减压蒸干，得生物表面活性剂粗品；

根据本发明的优选实施方式，所述方法还包括

步骤E：将所述生物表面活性剂粗品洗涤，干燥，得到所述生物表面活性剂。

根据本发明的一些实施方式，所述离心的条件为：5000-1000rpm，4℃，离心 15-25min。

根据本发明的一些实施方式，所述氯仿/甲醇溶液的体积与所述上清液的体积比为0.25-1:1。

根据本发明的一些实施方式，所述氯仿/甲醇溶液中氯仿与甲醇溶液的体积比为2:1。

根据本发明的一些实施方式，所述萃取的次数为1-3次。

根据本发明的一些实施方式，所述减压蒸干的温度为40-80℃。

根据本发明的一些实施方式，所述洗涤为氯仿洗涤。

根据本发明的一些实施方式，所述氯仿的体积为5-20ml。

根据本发明的一些实施方式，所述干燥的温度为40-80℃。

根据本发明的一些实施方式，所述营养发酵液包括：Na₂HPO₄ 1.2-1.8g/L、 KH₂PO₄3.2-3.6g/L、(NH₄)₂SO₄ 2.8-3.2g/L、MgSO₄ 0.6-0.9g/L、酵母膏0.005-0.015 g/L，EDTA0.8-1.2g/L，葡萄糖4-6g/L，液体石蜡8-12g/L，pH＝6.8-7.2。

根据本发明的优选实施方式，所述营养发酵液包括：Na₂HPO₄ 1.2-1.8g/L、 KH₂PO₄3.2-3.6g/L、(NH₄)₂SO₄ 0.06-0.1g/L、MgSO₄ 0.6-0.9g/L、酵母膏 0.005-0.015g/L，EDTA0.8-1.2g/L，液体石蜡18-22g/L，尿素3.5-4.5，pH＝6.8-7.2。

根据本发明的一些实施方式，所述培养的条件为：150-250rpm，25-35℃恒温培养5-10d。

根据本发明的优选实施方式，所述培养的条件为：180-200rpm，27-32℃恒温培养6-8d。

根据本发明的一些实施方式，所述方法还包括在步骤A之前，挑取所述青霉菌单菌落在牛肉膏蛋白胨液体培养基中活化至对数生长期，将所述青霉菌的菌悬液接种至发酵培养基中。

根据本发明的一些实施方式，将所述青霉菌的菌悬液按照5％的体积比接种至发酵培养基中。

根据本发明的一些实施方式，所述牛肉膏蛋白胨培养基包括：牛肉膏2-4g/L，蛋白胨8-12g/L，NaCl 4-6g/L，固体培养基加1.2-1.7％琼脂粉，pH＝7.0-7.2。

根据本发明的一些实施方式，所述青霉菌Y发酵生产的表面活性剂均为脂肽类物质。

在第四方面，本发明提供了一种根据第三方面所述的方法制备得到的生物表面活性剂。

在第五方面，本发明提供了一种根据第一方面所述的青霉菌或第二方面所述的青霉菌制剂或根据第四方面所述的生物表面活性剂在降解石油烷烃中的应用。

附图说明

图1为根据本发明的青霉菌(Penicillium sp.)Y的菌落形态图。

图2为根据本发明的青霉菌(Penicillium sp.)Y的分生孢子光学显微镜图和扫描电镜图。

图3为根据本发明的青霉菌(Penicillium sp.)Y的系统发育树图。

图4为碳源对根据本发明的青霉菌(Penicillium sp.)Y的发酵产表面活性剂的影响。

图5为氮源对根据本发明的青霉菌(Penicillium sp.)Y的发酵产表面活性剂的影响。

图6为根据本发明的青霉菌(Penicillium sp.)Y的纯化后生物表面活性剂与茚三酮溶液显色TLC图。

图7为根据本发明的青霉菌(Penicillium sp.)Y的生物表面活性剂的精制品 IR图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明，这些实施例仅用出于解释说明的目的，并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1

青霉菌(Penicillium sp.)Y的分离、筛选与鉴定

(1)菌株的分离

从江苏省常州市南郊不同农田取样点收集泥土表层下5～10cm处的土壤样品 10g保藏于无菌20mL密封袋中，保存于4℃冰箱中用于后续菌株的筛选。称取 3g不同采样点的土壤样品分别加入装有50ml无菌生理盐水的250ml锥形瓶中混匀，充分振荡后静置30min，取上清液2ml加入装有50ml初始富集培养基的250ml 锥形瓶中，在30℃条件下以120rpm·min^-1的恒温摇床培养，实现菌体的富集培养。3天后，将5ml液体培养基转移至装有45ml新鲜的无机盐筛选培养基的250ml 锥形瓶中用于随后的传代培养。用于传代培养的无机盐筛选培养基中硫化黑的浓度从50mg/L逐步提高至100mg/L。传代培养3次后，取100μL菌悬液涂布与无机盐固体培养基上，待长出菌落后挑选表型各不相同的菌落在无机盐固体平板培养基上进行划线分离，分离出表型各不相同的单菌落，将所有获得的菌落进行多次划线分离以获得纯种菌株，共计35株。将分离得到的35株菌株进行斜面及冻存管保存。

初始富集培养基的组成如下：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，硫化黑50mg/L。无机盐筛选培养基(MSM)的组成如下：K₂HPO₄ 4g/L，KH₂PO₄ 4g/L，NH₄Cl 0.4g/L，盐溶液10mL/L。盐溶液的组成如下：MgCl₂ 15.4g/L，MnCl₂ 4.2g/L，FeCl₃ 5.4g/L，CaCl₂0.3g/L。

(2)菌株的筛选

使用96孔板快速初筛选方法和摇瓶复筛相结合的方法。挑取分离所得到的 30株单菌落，分别接种于蓝色凝胶培养基平板上，在30℃培养箱中培养3天，根据蓝圈直径和菌落直径的比值，分别挑比值较高的菌株4株(Y0、Y、Y-30、 Y-21、Y-15、Y-11)进行摇瓶复筛，检测发酵液中的生物表面剂活性，从而高产的菌株，并进行后续鉴定及优化。

(3)菌株的鉴定

对细菌进行形态学、生理生化试验。测定菌株的18S rRNA基因序列与NCBI 数据库中的序列进行同源性比较，最终确定该菌的种属。

形态特征：菌落不透明、表面凸起、呈乳白色、边缘整齐光滑，如图1所示。

根据Y的形态学(图2)、生理生化试验及分子生物学分析，菌株Y的18SrRNA 核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

测序完成后在Genbank登录，用BLAST软件进行分析，Clustalx对比，与其它菌株的18SrRNA基因的同源性进行比较，结果显示菌株Y与P.expansum(登录号：GU561988.1)等的相似性在99％以上，结合菌株的形态学特征则对产脂肪酶菌Y的鉴定结果为青霉属(Penicillium sp.)。系统进化树(图3)是用MEGA4.1 软件使用邻接法构建的，Bootstrap进化分析，设置自展检验置信值为1000次。

实施例2

通过优化碳源，提高菌株Penicillium sp.Y发酵生物表面活性剂产量。选择葡萄糖、蔗糖、淀粉和液体石蜡四种常见的碳源，以培养基不接菌作为空白对照组，每组实验做3次重复实验。具体实施操作如下：

在超净工作台中，用接种环从Penicillium sp.Y的保藏斜面试管中取一环菌接入已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基中，培养至对数生长期后按5％的接种量接入添加有不同种类的碳源的无机盐培养基，碳源的量均为500mg/L，在30℃恒温摇床中以200rpm·min^-1培养7天，取样测发酵液中生物表面活性剂的量、表面张力和排油圈直径，结果如图4所示。

本实施例说明，以液体石蜡为碳源，菌株Y的产生物表面活性剂的能力较高，比以葡萄糖和蔗糖为碳源，提高了30％，从而确定以液体石蜡为碳源可提高菌株 Y的发酵产量。

实施例3

通过优化氮源提高Penicillium sp.Y发酵产量。选择NH₄HCO₃、蛋白胨、酵母粉和尿素四种常见氮源，以初始无机盐培养基不接菌作为空白对照组，每组实验做3次重复实验。具体实施操作如下：

在超净工作台中，用接种环从Penicillium sp.Y的保藏斜面试管中取一环菌接入已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基中，培养至对数生长期后按5％的接种量接入添加有不同种类的氮源的无机盐培养基，氮源的量均为500mg/L，在28℃恒温摇床中以200rpm·min^-1培养7天，取样测发酵液中生物表面活性剂的量、表面张力和排油权直径，结果如图5所示。

本实施例说明，以尿素为氮源，菌株Y的产生物表面活性剂的能力较高，比以NH₄HCO₃、蛋白胨和酵母粉为氮源，提高近25％，从而确定以尿素为氮源可提高菌株Y的发酵产量。

实施例4

一种从发酵液中提取及分离纯化生物表面活性剂的方法，其包括如下步骤：

将40ml的发酵液，5000～1000rpm，4℃离心20min去除菌体，上清液中加入 1/4～等体积的氯仿/甲醇(2/1，V/V)，混合均匀，分液漏斗萃取1～3次，取下层萃取液，40～80℃减压蒸干，得生物表面活性剂粗品，5～20ml氯仿洗涤，40～80℃ 烘干，得到生物表面活性剂精制品0.8～1.5g。经高效液相检测纯度达到84.25％(纯化后的生物表面活性剂TLC图如图6所示、IR图谱如图7所示)。

在IR谱图上，3396.5cm^-1是由分子间氢键引起的N-H伸缩振荡，1650.8cm^-1与1537.4cm^-1为酰胺键吸收谱带，说明表面活性剂分子结构中有肽键；2961～2860 cm^-1和1470～1380cm^-1的两处吸收是脂肪酸族的C-H伸缩振荡，因此青霉菌青霉菌Y发酵生产的表面活性剂均为脂肽类物质。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims

1.一种青霉菌，其保藏编号为CGMCC NO.10455。

2.一种青霉菌制剂，其包括保藏编号为CGMCC NO.10455的青霉菌。

3.根据权利要求1所述的青霉菌或权利要求2所述的青霉菌制剂，其特征在于，所述青霉菌具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的青霉菌或权利要求2所述的青霉菌制剂，其特征在于，所述青霉菌的生物学特征为：营养体为无色或淡色的菌丝体，在气生菌丝上有长而直立的分生孢子梗，分生孢子梗上有瓶梗，在瓶梗上着生分生孢子链，分生孢子为球形至卵形，菌落不透明、绒毛状，呈绿色，边缘不整齐。

5.一种制备生物表面活性剂的方法，其包括：

步骤A：在发酵培养液中培养权利要求1所述的青霉菌；

可选地，所述方法还包括

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述离心的条件为：5000-1000rpm，4℃，离心15-25min；和/或

所述氯仿/甲醇溶液的体积与所述上清液的体积比为0.25-1:1；和/或

所述氯仿/甲醇溶液中氯仿与甲醇溶液的体积比为2:1；和/或

所述萃取的次数为1-3次；和/或

所述洗涤为氯仿洗涤；和/或

所述干燥的温度为40-80℃。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养液包括：Na₂HPO₄ 1.2-1.8g/L、KH₂PO₄ 3.2-3.6 g/L、(NH₄)₂SO₄ 2.8-3.2 g/L、MgSO₄ 0.6-0.9 g/L、酵母膏 0.005-0.015 g/L，EDTA 0.8-1.2 g/L，葡萄糖 4-6 g/L，液体石蜡 8-12 g/L，pH=6.8-7.2；或所述发酵培养液包括：Na₂HPO₄ 1.2-1.8 g/L、KH₂PO₄ 3.2-3.6 g/L、(NH₄)₂SO₄ 0.06-0.1 g/L、MgSO₄ 0.6-0.9 g/L、酵母膏 0.005-0.015 g/L，EDTA 0.8-1.2 g/L，液体石蜡 18-22 g/L，尿素 3.5-4.5 g/L，pH=6.8-7.2；

和/或，所述培养的条件为：150-250 rpm，25-35℃恒温培养5-10d。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养的条件为：180-200 rpm，27-32℃恒温培养6-8d。

9.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤A之前，挑取所述青霉菌单菌落在牛肉膏蛋白胨液体培养基中活化至对数生长期，将所述青霉菌的菌悬液接种至发酵培养基中。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述青霉菌的菌悬液按照5%的体积比接种至发酵培养基中。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述牛肉膏蛋白胨培养基包括：牛肉膏2-4 g/L，蛋白胨8-12 g/L，NaCl 4-6 g/L，固体培养基加1.2-1.7%琼脂粉，pH=7.0-7.2。

12.一种根据权利要求1所述的青霉菌或权利要求2所述的青霉菌制剂在降解石油烷烃中的应用。