CN108277186A - 一种作为农药表面活性剂的地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种作为农药表面活性剂的地衣芽孢杆菌及其应用，属于植物保护学科中的生物防治和农药研究与应用领域。本发明的菌株是从植物根际土壤中分离筛选出来的一株高效生防菌——地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）W10菌株，该菌株在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.14859。本发明利用黄豆饼粉、玉米淀粉等为基质作为发酵培养基，制备的菌株发酵液菌剂能改善农药的表面张力，降低接触角，具有良好的表面活性剂功能，同时还具有防治植物病害的作用。因此本发明的发酵液菌剂不仅可作为表面活性剂应用于农药悬浮剂加工制备，而且可以防治病害，显示出广阔的应用前景。

Description

一种作为农药表面活性剂的地衣芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及生防细菌发酵培养物的表面活性作用，属于植物保护学科中的生物防治和农药研究与应用领域。具体涉及一种作为农药表面活性剂的地衣芽孢杆菌及其应用。
背景技术
芽孢杆菌(Bacillus spp.)作为一类重要的生防菌，可以产生多种抑菌抗菌物质，包括细菌素、细胞壁降解酶类、抗菌蛋白、脂肽类抗生素、聚酮类化合物和多肽类化合物等，具有防治植物病害的潜力，也是生物防治的主要来源菌。目前科研人员筛选生防菌的侧重点是各种抗菌活性物质，但是，生防菌发酵代谢产物种类繁多，除了产生抗菌物质外，还有其他种类物质，包括有功能活性的和无生物活性的。具有防治植物病害的地衣芽孢杆菌的菌株较多，具有生物表面活性功能的地衣芽孢杆菌也有报道，但是，未见作为表面活性剂用于农药加工生产的菌株，也未见采用黄豆饼粉、玉米淀粉等基质发酵培养地衣芽孢杆菌用于农药制剂研制的报道。
发明内容
本发明为了提高农药制剂的稳定性，便于药剂贮藏运输和使用，提供一种作为农药表面活性剂的地衣芽孢杆菌及其应用，其能使药剂在植物体表较好展布和黏着，充分发挥药效。
本发明所述的具有表面活性作用的菌株是：一种作为农药表面活性剂的地衣芽孢杆菌，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.14859，分类命名为地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis，菌株编号为W10。
本发明公开了地衣芽孢杆菌的发酵液作为农药表面活性剂的应用。
本发明进一步公开了解地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)W10发酵液作为表面活性剂在农药悬浮剂中的应用，应用方式为：W10发酵液添加到农药原药中，再结合其它添加剂制成农药悬浮剂。
发酵液制备方法如下：采用分批发酵法，将W10菌种按2％接种于50mL NA培养基中，在30℃，180r/min条件下培养12h后，按2％将菌种转接于发酵培养基中，发酵培养基制备方法为：黄豆饼粉10.131g，蛋白胨1.126g，玉米淀粉16.894g，葡萄糖2.413g，硫酸铵7.965g，KH2PO40.45g，MgSO4 0.45g，NaCl 4.5g，加蒸馏水定容至1000mL，调pH至7.0；在250r/min，pH7.0条件下培养60h，0-20h时将温度控制在30℃，20-60h时将温度控制为28℃，并分别于培养10h、18h时按10％加入补料，补料制备方法为：葡萄糖10g，蛋白胨5g，加蒸馏水定容至1000mL；发酵完成即获得地衣芽孢杆菌W10发酵液；
获得地衣芽孢杆菌W10发酵液后，将其置入离心管中，8000g离心15min，取上清，通过细菌滤器，即得W10发酵滤液。
农药剂型为悬浮剂等液体制剂；农药悬浮剂由25.2％嘧菌酯、5％润湿分散剂、10％增稠剂、5％乙二醇、0.2％消泡剂、1％硅酸镁铝、0.5％防腐剂、53.1％地衣芽孢杆菌W10发酵滤液组成，百分比为质量分数。
本发明还进一步公开地衣芽孢杆菌的发酵液作为防治植物病害的药物的应用。
该菌株的表面活性作用与常规表面活性剂作用相当。其能使农药制剂的理化性状非常稳定，有利于药剂贮藏运输和使用，能在植物体表较好展布和黏着，能充分发挥药效。还可弥补常规表面活性剂对人、畜环境产生负面影响、有激素作用且自身降解缓慢，会对环境中的土壤水体造成污染的弊端，该菌可部分替代常规表面活性剂或与常规表面活性剂交替使用，在不影响效果的情况下可以减少常规表面活性剂的使用，减少残留和对环境造成的污染，有助于保证农业生产的安全性，提升作物质量。因此可以用地衣芽孢杆菌W10研发新型绿色的表面活性剂，应用于农药制剂加工。因此，该发明及其应用，不仅能够提高农药的防治效用，而且还能推动农业的绿色可持续发展，减少由常规表面活性剂对环境造成的污染。与化学药剂相比，使用W10菌株发酵液作为农药生产中的表面活性剂对环境的刺激性小，自身易于降解。
本发明的菌株代谢产生的脂肽类化合物，脂肽分子中氨基酸组成的肽链形成亲水基，脂肪烃链形成亲油基，这与化学表面活性剂在分子结构上类似，因此可具有表面活性剂的作用。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)W10是本发明筛选的一株拮抗细菌，具有广谱抗菌性，对多种作物上重要病害，如番茄灰霉病、油菜菌核病、水稻纹枯病、苹果轮纹病、桃褐腐病和枝枯病等都有较好的防治效果，防效与化学农药多菌灵或腐霉利等相当。本发明发现W10发酵液具有改善农药药液表面张力的作用，降低接触角，具有良好的表面活性剂功能，因此在农药液剂(如悬浮剂)加工中可以将该菌株发酵液产物作为表面活性剂类助剂进行添加，替代或部分替代常规的有机化学表面活性剂，减少成本和对环境的污染，具有双重作用。且本发明的W10菌株防病谱广，也未见防病谱广的相关地衣芽孢杆菌菌株报道。
附图说明
图1是地衣芽孢杆菌对番茄灰霉病菌的拮抗效果示意图；
图2是地衣芽孢杆菌对桃褐腐病菌的拮抗效果示意图；
图3是地衣芽孢杆菌对桃枝枯病菌的拮抗效果示意图；
图4是地衣芽孢杆菌对苹果轮纹病菌的拮抗效果示意图；
图5是地衣芽孢杆菌对苹果炭疽病菌的拮抗效果示意图；
图6是添加不同表面活性剂的W10发酵滤液静态接触角示意图，图6中每一行的各小图依序分别对应的表面活性剂；
图7是以W10发酵液为表面活性剂的25％嘧菌酯悬浮剂静态接触角大小图；
图8是25％嘧菌酯悬浮剂的静态接触角物理测定效果图，A：不含发酵液药剂稀释300倍；B：含发酵液药剂稀释300倍；C：不含发酵液药剂稀释1200倍；D：含发酵液药剂稀释1200倍；
本发明所述菌株W10于2017年11月06日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为地衣芽孢杆菌，拉丁名为：Bacillus licheniformis，保藏编号为CGMCC No.14859。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。
(1)地衣芽孢杆菌W10的分离、筛选和鉴定
从扬州郊区蔬菜田块采集番茄植株(根部带土)，带回实验室后将根部的浮土抖掉，将仍粘有细土的番茄根剪下，收集起来即为采集的根际土样。
土壤微生物的分离采用平板稀释涂布法。将收集的番茄根系剪成4mm左右的小段，称取10g放入盛有90mL无菌水的三角瓶中，160r/min振荡30min，得10-1浓度的土壤稀释液，再依次稀释10-3-10-7浓度梯度的土壤悬液。吸取100μL在NA培养基(蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，氯化钠5g，琼脂17-20g，蒸馏水定容至1000mL，调pH7.0-7.2)上涂布，每个梯度3个重复，28℃下培养，24h后开始观察并挑取单菌落纯化。
将挑取的单菌落在NB培养液(上述NA培养基中不添加琼脂)中进行培养。在PDA平板中心接种直径为5mm的待测病原真菌菌饼，25℃培养2d。待菌落直径达2cm时，在菌落四周对称点接4个不同的细菌，25℃培养4-5d。选取对病菌具有拮抗作用的细菌进行复筛，在已培养2d的待测病菌菌落四周点接相同细菌，3个重复，设置不接细菌的对照。25℃下培养4-5d后，测量拮抗细菌的抑菌带宽度。挑取有拮抗作用的细菌进行纯化，在细菌的培养液中加15％甘油，于-20℃冷冻保存备用。
对有拮抗效果的菌株连续转接多代后按上述方法再测量菌株的抗菌活性，确定拮抗稳定性。最终获得一株拮抗性强、抗菌谱广且稳定的细菌菌株，其菌株编号为W10。采用培养特征、生理生化特征和16S rDNA基因序列分析进行菌株种类鉴定，将其鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
(2)地衣芽孢杆菌W10的拮抗和防病效果
地衣芽孢杆菌W10对多种作物上的重要病原真菌具有较好的拮抗作用(图1～5)，在发病初期或事先预防施用对田间番茄灰霉病、油菜菌核病、水稻纹枯病、桃枝枯病具有60％以上的防治效果，防效与化学农药腐霉利或多菌灵相当；对采后水果也有较好的防病效果，如对苹果的轮纹病、炭疽病，对柑橘的青霉病，对桃的桃褐腐病，防效可高达66.7％，与化学农药多菌灵相似，对桃褐腐病能至少推迟发病时间8d以上，对苹果轮纹病、炭疽病可推迟20d以上。另外，处理采后桃果，能显著降低贮藏期桃果的自然腐烂率，与多菌灵效果类似。
(3)W10发酵液培养方法
W10的发酵培养采用分批发酵法，将W10菌种按2％接种于50mL NA培养基中，在30℃，180r/min条件下培养12h后，按2％(指菌种体积占发酵培养基的体积比)将菌种转接于发酵培养基(黄豆饼粉10.131g，蛋白胨1.126g，玉米淀粉16.894g，葡萄糖2.413g，硫酸铵7.965g，KH2PO40.45g，MgSO4 0.45g，NaCl 4.5g，加蒸馏水定容至1000mL，调pH至7.0)中，在250r/min，pH7.0条件下培养60h，0-20h温度控制在30℃，20-60h为28℃，并分别于培养10h、18h时按10％(指补料体积占该时间的发酵液体积比)加入补料(葡萄糖10g，蛋白胨5g，加蒸馏水定容至1000mL)，发酵完成即获得地衣芽孢杆菌W10发酵液。
获得W10发酵液后，将其置入离心管中，8000g离心15min，取上清，通过细菌滤器(滤膜孔径为0.45μm)，即得W10发酵滤液。
(4)表面张力测定
按照吊片法，使用DCAII型表面张力测量仪进行测定。即用一铂箔插入液体，调整位置使其下表面刚好与液体表面接触，测定使它离开液体表面所需拉力，再根据公式计算出表面张力。分别测定W10发酵滤液及加入3％不同表面活性剂的W10发酵滤液的表面张力，比较各组表面张力大小。
表面张力结果见表1。药剂溶液的表面张力越小，越有利于液滴在作物表面的展布。地衣芽孢杆菌W10发酵滤液本身具有良好的表面活性，表面张力仅为27.716mN/m，远小于水的表面张力72mN/m。将表面活性剂分别加入W10发酵滤液中，各处理的溶液表面张力有明显差异。其中表面活性剂CRODA 4913配制的药液表面张力略小于W10发酵滤液，为27.547mN/m，比W10发酵滤液减少0.169mN/m。而其它测试的表面活性剂添加的药液表面张力都高于W10发酵滤液，说明W10发酵滤液本身具有良好的表面活性剂功能。但所配置的各药液表面张力均明显小于水的表面张力(72mN/m)。
表1添加不同表面活性剂的W10发酵滤液的表面张力(实验条件下，25℃)
(5)静态接触角测定
据杨氏方程，液固静态接触角与表面张力间存在如下关系，γLVcosθ＝γSV-γSL，LV、SV、SL分别表示气液界面、气固界面、固液界面，因气液界面、气固界面界面张力在一定条件下是恒定的，故静态接触角大小与固液界面张力大小相关，能从侧面反映固液界面间的界面张力。测定使用OCA40视屏光学接触角测量仪，将待测药剂吸入微量进样器中，在水平的石蜡表面上方缓慢均匀地释放液滴，液滴体积为4μL，待液滴滴落30s后以仪器配套软件测定其静态接触角。实验测定W10发酵滤液及各加入不同表面活性剂的W10发酵滤液的静态接触角，比较各处理的静态接触角。
图6为各静态接触角测量物理图。静态接触角小于90°时，表明液体在供试载体表面有润湿作用，易于铺展。表面活性剂分别加入发酵液中，稀释至使用浓度后，测定其在石蜡标准表面的静态接触角。结果看出，W10发酵滤液的静态接触角最小，为42.2°，表面活性剂CRODA 4913的静态接触角与W10发酵滤液的最为接近，为42.9°，这与表面张力的测定结果基本一致。尽管各表面活性剂处理药液的静态接触角大小有明显差异，但是配置的发酵液在标准表面均处于润湿状态，能够顺利铺展。
(6)W10发酵液作为农药表面活性剂添加使用
①配置农药悬浮剂。将W10作为表面活性剂，配制25％嘧菌酯悬浮剂。25％嘧菌酯悬浮液配方为：嘧菌酯原药25.2％，润湿分散剂TSC-300 3％，润湿分散剂TSC-410 2％，增稠剂10％，乙二醇5％，消泡剂0.2％，硅酸镁铝1％，防腐剂0.5％，地衣芽孢杆菌W10发酵滤液53.1％作为溶剂，对照溶剂为去离子水。采用湿磨法获得药剂，将嘧菌酯原药、润湿分散剂、消泡剂、防冻剂、防腐剂、悬浮稳定剂按配方比例加入烧杯中，加入适量W10菌液，200r/min下搅拌30min，使各组分充分混合，加入增稠剂，加入余量的菌液，将混合物送入含有1.4mm钢珠的立式磨砂机中进行湿磨，2～3h后即得嘧菌酯悬浮剂。两种润湿分散剂均由竹本油脂(苏州)有限公司生产，TSC-300是磷酸酯类润湿分散剂，TSC-410是木质素磺酸盐类分散剂。
②测量表面张力和静态接触角。按照上述(2)和(3)方法测量配置的25％嘧菌酯悬浮剂(分别稀释到最高和最低推荐使用浓度)的表面张力和静态接触角。
结果显示，W10发酵液有明显降低表面张力的作用，表面张力比对照药剂减少2.348～3.724mN/m。随着药剂稀释倍数的增加，活性物质的相对浓度降低，药剂表面张力会逐渐增加。尽管药剂已稀释了1200倍，但是发酵液降低溶液表面张力的作用仍然存在(表2)。
表2 25％嘧菌酯悬浮剂表面张力
用发酵液配制的嘧菌酯悬浮剂的静态接触角与表面张力有相同的趋势，能使药液的静态接触角变小(图7～8)。随稀释倍数增加，药剂中发酵液浓度减小，药剂静态接触角增大。悬浮剂稀释300倍时，静态接触角为88°，其它处理均大于90°，说明W10发酵液作为活性剂在25％嘧菌酯悬浮剂中使用，药剂稀释300倍时，能在固体表面较好展布。
以上显示描述了本发明的基本原理、主要特征以及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落进要求保护本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种作为农药表面活性剂的地衣芽孢杆菌，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.14859，分类命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，菌株编号为W10。
2.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌的发酵液作为农药表面活性剂的应用。
3.根据权利要求2所述的地衣芽孢杆菌的发酵液作为农药表面活性剂的应用，其特征在于，发酵液制备方法如下：采用分批发酵法，将W10菌种按2%接种于50mL NA培养基中，在30℃，180 r/min条件下培养12h后，按2%将菌种转接于发酵培养基中，发酵培养基制备方法为：黄豆饼粉10.131g，蛋白胨1.126 g，玉米淀粉16.894g，葡萄糖2.413 g，硫酸铵7.965g，KH2PO40.45g，MgSO4 0.45g，NaCl 4.5 g，加蒸馏水定容至1000mL，调pH至7.0；在250r/min，pH7.0条件下培养60h，0-20h时将温度控制在30℃，20-60h时将温度控制为28℃，并分别于培养10h、18h时按10%加入补料，补料制备方法为：葡萄糖10g，蛋白胨5g，加蒸馏水定容至1000mL；发酵完成即获得地衣芽孢杆菌W10发酵液；
获得地衣芽孢杆菌W10发酵液后，将其置入离心管中，8000g离心15min，取上清，通过细菌滤器，即得W10发酵滤液。
4.根据权利要求2所述的地衣芽孢杆菌的发酵液作为农药表面活性剂的应用，其特征在于，农药剂型为悬浮剂；悬浮剂由25.2%嘧菌酯、5%润湿分散剂、10%增稠剂、5%乙二醇、0.2%消泡剂、1%硅酸镁铝、0.5%防腐剂、53.1%地衣芽孢杆菌W10发酵滤液组成，百分比为质量分数。
5.含有地衣芽孢杆菌的发酵液的农药悬浮剂，其特征在于，所述的地衣芽孢杆菌为权利要求1所述的作为农药表面活性剂的地衣芽孢杆菌；农药悬浮剂由25.2%嘧菌酯、5%润湿分散剂、10%增稠剂、5%乙二醇、0.2%消泡剂、1%硅酸镁铝、0.5%防腐剂、53.1%地衣芽孢杆菌W10发酵滤液组成，百分比为质量分数。
6.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌的发酵液作为防治植物病害的药物的应用。
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