CN112410273A - 一种地衣芽孢杆菌w10菌悬液在诱导油桃果实抗褐腐病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种地衣芽孢杆菌W10菌悬液在诱导油桃果实抗褐腐病中的应用，产品为地衣芽孢杆菌W10的菌悬液；所述菌悬液中的菌浓度具体为1×108 CFU ml‑1；所述菌悬液的制备方法为：将地衣芽孢杆菌W10接种至NA液体培养基，28℃、200rpm振荡培养24h，然后离心（具体条件为5000 rpm离心5 min）收集沉淀，用无菌水悬浮沉淀，得到菌浓度为1×108 CFU ml‑1的菌悬液。所述诱导油桃果实抗褐腐病包括抑制褐腐病的发生，降低油桃果实的丙二醛MDA含量、电导率和H2O2含量，以及提高油桃果实的抗氧化酶和防御相关酶活性并增加相应基因的表达。通过本发明，表明地衣芽孢杆菌W10通过调节活性氧水平、激活抗氧化酶和防御相关酶防治桃褐腐病，对于桃褐腐病，特别是桃褐腐病的防治具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种地衣芽孢杆菌W10菌悬液在诱导油桃果实抗褐腐病中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
桃褐腐病，又叫果腐病或菌核病，是桃果实上最严重的病害之一，广泛分布于世界各地。主要集中在潮湿温暖的地方，引起果实、花腐烂以及枝条溃疡，严重影响油桃的产量和品质。目前，桃褐腐病的防治主要采用化学防治，如多菌灵、嘧菌酯、戊唑醇、百克列等。然而，这些化学农药长期、大量、普遍的使用，容易造成“3R”问题。目前，欧洲已禁止在采后核果中使用化学农药。因此，寻找新的有效防治桃褐腐病的方法具有重要意义。
生物防治，安全、经济、可持续，在有机农业生产中防治植物病害的前景广阔。例如许多细菌，如假单胞菌属，芽孢杆菌属和链霉菌属被用于防治棉花黄萎病。此外，许多生防真菌，如高里假丝酵母菌、顶头孢霉菌和黏红酵母菌能够显著抑制灰霉病菌。2017年，在新西兰、澳大利亚、加拿大、欧洲、巴西、日本和美国共有101种用于植物病害防治的生物药剂被注册。
芽孢杆菌属是细菌中最大的属之一，广泛分布于植物、土壤和植物微生物中，具有抗逆性和抗病性，同时还能促进植物生长，是目前较具有应用潜力的细菌之一，已被广泛应用于农业的生物防治之中。2017年，新西兰、澳大利亚、加拿大、欧洲、巴西、日本和美国共有61个基于芽孢杆菌属的用于植物病害防治的生物药剂被注册。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题，提供一种地衣芽孢杆菌W10菌悬液在诱导油桃果实抗褐腐病中的应用。
本发明的技术方案是：一种用于防治桃褐腐病的产品，其特征是，产品为地衣芽孢杆菌W10的菌悬液；
所述地衣芽孢杆菌W10已于2017年11月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.14859，分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。
所述菌悬液中的菌浓度具体为1×108CFU ml-1；
所述菌悬液的制备方法为：将地衣芽孢杆菌W10接种至NA液体培养基，28℃、200rpm振荡培养24h，然后离心(具体条件为5000rpm离心5min)收集沉淀，用无菌水悬浮沉淀，得到菌浓度为1×108CFU ml-1的菌悬液。
利用地衣芽孢杆菌W10菌悬液在诱导油桃果实抗褐腐病中的应用。
所述诱导油桃果实抗褐腐病包括抑制褐腐病的发生，降低油桃果实的丙二醛MDA含量、电导率和H2O2含量，以及提高油桃果实的抗氧化酶和防御相关酶活性并增加相应基因的表达。
所述菌悬液的制备方法为：将地衣芽孢杆菌W10接种至牛肉膏液体培养基，30℃、200rpm振荡培养24h，然后离心收集沉淀，用无菌水悬浮沉淀，得到菌浓度为1×108CFU ml-1的菌悬液；其中，离心收集沉淀时，离心条件为5000rpm离心5min。
本发明方法先进科学，通过本发明，提供的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)W10，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.14859。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)W10 CGMCC No.14859简称地衣芽孢杆菌W10。
本发明还保护一种用于防治桃褐腐病的产品，它的活性成分为地衣芽孢杆菌W10的菌悬液。所述桃褐腐病具体可由果生链核盘菌引起。所述桃果具体可为品种名称为大关1号芽变的油桃果实。所述菌悬液中的菌浓度具体可为1×108CFU ml-1。所述菌悬液的制备方法具体如下：将地衣芽孢杆菌W10接种至NA液体培养基，28℃、200rpm振荡培养24h，然后离心(具体条件可5000rpm离心5min)收集沉淀，用无菌水悬浮沉淀，得到菌浓度为1×108CFUml-1的菌悬液。
本发明还保护一种诱导油桃果实抗褐腐病的方法，包括将油桃果实用地衣芽孢杆菌W10的菌悬液进行喷洒处理的步骤。所述喷洒处理具体可为将桃果整体喷湿。所述桃果为挑选的生理性状一致的桃果，具体可为选取大小均一、成熟度一致、无病虫害、无机械损伤的桃果。所述桃褐腐病具体可由果生链核盘菌引起。所述桃果具体可为品种名称为大关1号芽变的油桃果实。所述菌悬液中的菌浓度具体可为1×108CFU ml-1。所述菌悬液的制备方法具体如下：将地衣芽孢杆菌W10接种至牛肉膏液体培养基，30℃、200rpm振荡培养24h，然后离心(具体条件可5000rpm离心5min)收集沉淀，用无菌水悬浮沉淀，得到菌浓度为1×108CFU ml-1的菌悬液。
地衣芽孢杆菌W10的菌悬液在桃褐腐病防治中的应用也属于本发明的保护范围。所述桃褐腐病具体可由果生链核盘菌引起。所述桃果具体可为品种名称为大关1号芽变的油桃果实。所述菌悬液中的菌浓度具体可为1×108CFU ml-1。所述菌悬液的制备方法具体如下：将地衣芽孢杆菌W10接种至NA液体培养基，28℃、200rpm振荡培养24h，然后离心(具体条件可5000rpm离心5min)收集沉淀，用无菌水悬浮沉淀，得到菌浓度为1×108CFU ml-1的菌悬液。所述诱导油桃果实抗褐腐病的应用包括抑制褐腐病的发生，降低油桃果实的丙二醛(MDA)含量、电导率和H2O2含量，以及提高油桃果实的抗氧化酶和防御相关酶活性并增加相应基因的表达等。
本发明提供的地衣芽孢杆菌W10能有效防治桃褐腐病，且实际应用方法简单、易于操作。本发明确定了地衣芽孢杆菌W10通过激活油桃中的防御相关酶(包括抗氧化酶)来诱导抗性。用地衣芽孢杆菌W10处理油桃果实，可降低桃褐腐病引起的氧化损伤和活性氧(ROS)的产生。此外，在油桃果实上施用地衣芽孢杆菌W10可显著提高油桃果实的抗氧化酶和防御相关酶活性，并增加相应基因的表达。本发明表明地衣芽孢杆菌W10通过调节活性氧水平、激活抗氧化酶和防御相关酶防治桃褐腐病，对于桃褐腐病，特别是桃褐腐病的防治具有重大价值。
附图说明
图1为实施例1中地衣芽孢杆菌W10对油桃果实桃褐腐病的防治效果。
图2为实施例2中从0～4dpi分析地衣芽孢杆菌W10处理的油桃果实中MDA含量(A)和电导率(B)。
图3为实施例3中从0～4dpi分析地衣芽孢杆菌W10处理的油桃果实中H2O2含量。
图4为实施例4中从0～4dpi分析地衣芽孢杆菌W10处理的油桃果实中多酚氧化酶(PPO)(A)、过氧化氢酶(CAT)(B)、超氧化物歧化酶(SOD)(C)和过氧化物酶(POD)(D)活性。
图5为实施例4中从0～4dpi分析地衣芽孢杆菌W10处理的油桃果实中苯丙氨酸解氨酶(PAL)(A)、脂氧合酶(LOX)(B)、几丁质酶(CHI)(C)和β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-GA)(D)活性。
图6为实施例5中实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测地衣芽孢杆菌W10处理后油桃果实抗氧化酶基因表达水平。
图7为实施例5中实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测地衣芽孢杆菌W10处理后油桃果实中防御相关酶基因表达水平。
具体实施方法
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、地衣芽孢杆菌W10对油桃果实褐腐病的防治效果；
为研究地衣芽孢杆菌W10对油桃果实桃褐腐病的防治效果，用地衣芽孢杆菌W10对油桃果实进行处理。设置3个处理组：清水处理(CK)、接种桃褐腐病菌处理(M.fructicola)、喷洒W10菌液1dpi接种桃褐腐病菌处理(W10+M.fructicola)，每个油桃果实用灭菌针头在赤道部位均匀刺4个5mm深的孔，使直径为6mm的菌饼刚好覆盖。每个处理使用3个桃果实，用纱布保湿，置于25℃、12h光照/12h黑暗的光照培养箱中。该实验重复3次。培养2dpi测量桃果实表面的病斑直径并记录。结果如图1所示，清水处理的油桃果实在接种桃褐腐病菌2dpi严重腐烂，地衣芽孢杆菌W10处理的油桃果实在接种桃褐腐病菌2dpi病害症状少且轻(图1A)。与CK相比，在接种桃褐腐病菌2dpi，地衣芽孢杆菌W10处理油桃果实的平均病损直径显著降低(图1B)。因此，本发明表明，地衣芽孢杆菌W10在防治油桃果实褐腐病中起着重要作用。
实施例2、地衣芽孢杆菌W10对油桃果实氧化损伤的影响；
植物病原菌引起的氧化损伤会对植物细胞膜产生不利影响。MDA含量和电导率是膜脂过氧化、细胞死亡和细胞膜渗透性的重要指标。因此，在不同时间间隔(0、1、2、3、4dpi)对地衣芽孢杆菌W10处理的油桃果实进行MDA含量和电导率测定。设置4个处理组：清水处理(Water)、W10菌悬液处理(W10)、喷洒清水1dpi接种桃褐腐病菌处理(Water+M.fructicola)、喷洒W10菌悬液1dpi接种桃褐腐病菌处理(W10+M.fructicola)，每个油桃果实用灭菌针头在赤道部位均匀刺4个5mm深的孔，使直径为6mm的菌饼刚好覆盖。每个处理使用3个桃果实，用纱布保湿，置于25℃、12h光照/12h黑暗的光照培养箱中。在喷洒W10菌悬液后(1、2、3、4dpi)测定各处理组油桃果实中丙二醛(MDA)含量和电导率。该实验重复3次。
丙二醛(MDA)含量测定。通过硫代巴比妥酸(TBA)反应测定MDA含量。将各处理组约0.5g油桃果实于5mL10％(w/v)三氯乙酸(TCA)中研磨。匀浆，10000rpm，4℃，离心10min。上清液与等体积的6％TBA充分混合。混合物，100℃，煮沸20min，冰浴冷却。3000rpm，4℃，离心10min，532nm处测量上清液的吸光度，600nm处校正非特定吸光度。
电导率测定。分别于喷洒W10菌悬液第1、2、3和4dpi将各处理组约0.5g油桃果实切成约1cm的小块，在室温下，置于10ml去离子水中。60min后，用电导率仪测定室温下油桃果实的电导率(C1)。然后将油桃果实在沸水浴中孵育15分钟，以达到100％的电导率(C2)。结果按(C1/C2)×100％计算。
结果如图2所示，W10菌悬液处理的油桃果实与清水处理的油桃果实MDA含量和电导率没有明显差异。但是，在接种桃褐腐病菌后，随着时间的增加(1、2、3、4dpi)，清水处理和W10菌悬液处理的油桃果实中丙二醛(MDA)含量增加，但W10处理的油桃果实中丙二醛含量明显低于清水处理的油桃果实(图2A)。与丙二醛含量测定结果一致，在不同的时间间隔(1、2、3、4dpi)，W10菌悬液处理的油桃果实的电导率显著低于清水处理的油桃果实(图2B)。
实施例3、地衣芽孢杆菌W10对油桃果实活性氧的影响；
活性氧(ROS)的产生通常与植物细胞死亡和植物对病原菌的敏感性增强有关，H2O2是一种重要的活性氧。为了准确测定地衣芽孢杆菌W10对油桃果实活性氧的影响，设置4个处理组：清水处理(Water)、W10菌悬液处理(W10)、喷洒清水1dpi接种桃褐腐病菌处理(Water+M.fructicola)、喷洒W10菌悬液1dpi接种桃褐腐病菌处理(W10+M.fructicola)，每个油桃果实用灭菌针头在赤道部位均匀刺4个5mm深的孔，使直径为6mm的菌饼刚好覆盖。每个处理使用3个桃果实，用纱布保湿，置于25℃、12h光照/12h黑暗的光照培养箱中。在喷洒W10菌悬液后(1、2、3、4dpi)，用过氧化氢/过氧化物酶定量检测试剂盒检测各处理组油桃果实的H2O2含量，将各处理组约0.1g油桃果实与1mL试剂1混合，冰浴匀浆，8000rpm，4℃，离心10min。将上清液置于冰上进行测定。用H2O2标准液建立标准曲线。按顺序将250μL样品、25μL试剂2和50μL试剂3放入EP管中，室温，4000rpm，离心10min。弃上清液，加250μL试剂4溶解沉淀，室温放置5min。加样200μL到96孔板上，酶标仪，415nm处测量吸光度。该实验重复3次。如图3所示，W10菌悬液处理的油桃果实与清水处理的油桃果实的H2O2含量无明显差异。然而，不同的时间间隔(1、2、3、4dpi)，喷洒清水1dpi接种桃褐腐病菌处理的油桃果实H2O2含量增加(图3)，W10菌悬液处理的油桃果实中H2O2含量均低于清水处理的油桃果实(图3)。
实施例4、地衣芽孢杆菌W10对油桃果实防御相关酶活性的影响；
为探讨地衣芽孢杆菌W10对油桃果实抗氧化酶活性的影响，测定了油桃果实抗氧化酶活性。设置4个处理组：清水处理(Water)、W10菌悬液处理(W10)、喷洒清水1dpi接种桃褐腐病菌处理(Water+M.fructicola)、喷洒W10菌悬液1dpi接种桃褐腐病菌处理(W10+M.fructicola)，每个油桃果实用灭菌针头在赤道部位均匀刺4个5mm深的孔，使直径为6mm的菌饼刚好覆盖。每个处理使用3个桃果实，用纱布保湿，置于25℃、12h光照/12h黑暗的光照培养箱中。在喷洒W10菌悬液后(1、2、3、4dpi)，采集伤旁油桃果实组织，并立即用液氮冷冻。将各处理组冷冻样品用1mL磷酸钠缓冲液(50mM，pH 7.8)、1.33mM乙二胺四乙酸和1％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)在4℃下研磨，匀浆，12000rpm，离心10min，根据制造商的说明，使用试剂盒测定提取物的多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、脂氧合酶(LOX)、几丁质酶(CHI)、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-GA)活性。该实验重复3次。
本发明表明，地衣芽孢杆菌W10能调节油桃果实的抗氧化酶活性(图4)。如图4A所示，W10菌悬液处理的PPO活性持续增加，2dpi下降(图4A)。W10菌悬液处理的油桃果实，PPO活性显著增加(图4A)。无论是否接种桃褐腐病，W10菌悬液处理的油桃果实，CAT活性降低(图4B)。在处理2、3和4dpi，桃褐腐病菌诱导了油桃果实的CAT活性(图4B)。W10菌悬液处理的油桃果实中POD和SOD活性显著提高(图4C和4D)。
在不同时间间隔(0、1、2、3、4dpi)对W10菌悬液处理的油桃果实进行PAL、LOX、CHI和β-1,3-GA活性测定。如图5所示，在处理2、3和4dpi，桃褐腐病菌轻微诱导油桃果实的PAL和LOX活性。无论是否接种桃褐腐病菌，W10菌悬液处理的油桃果实中，PAL和LOX活性显著增加(图5A和5B)。本发明表明，在处理2、3、4dpi，桃褐腐病菌能轻微诱导油桃果实的CHI活性(图5C)。然而，在接种和未接种桃褐腐病菌的油桃果实中，β-1,3-GA的活性没有明显差异(图5D)。无论是否接种桃褐腐病菌，W10菌悬液处理的油桃果实中CHI和β-1,3-GA活性显著提高(图5C和5D)。
实施例5、地衣芽孢杆菌W10对油桃果实防御相关酶基因表达水平的影响；
为了进一步证实W10菌悬液处理是否增强了油桃果实包括抗氧化酶在内的防御相关酶的活性，测定了包括抗氧化酶在内的防御相关酶基因的表达水平。设置4个处理组：清水处理(Water)、W10菌悬液处理(W10)、喷洒清水1dpi接种桃褐腐病菌处理(Water+M.fructicola)、喷洒W10菌悬液1dpi接种桃褐腐病菌处理(W10+M.fructicola)，每个油桃果实用灭菌针头在赤道部位均匀刺4个5mm深的孔，使直径为6mm的菌饼刚好覆盖。每个处理使用3个桃果实，用纱布保湿，置于25℃、12h光照/12h黑暗的光照培养箱中。在喷洒W10菌悬液后(1、2、3、4dpi)，采集伤旁油桃果实组织，使用TaKaRa柱式法植物RNA小量提取试剂盒(Code No.9769)提取相关处理油桃果实的总RNA。使用TaKaRaPrimeScriptTM 1st StrandcDNASynthesis Kit试剂盒(Code No.6110A)进行RNA的反转录。20μL体系进行qRT-PCR，其中模板cDNA为100ng，每个引物为0.4μM，2×AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix为10μL。该实验重复3次。将翻译延伸因子PpTEF2基因用作内参基因。qRT-PCR引物序列见表1。
表1用于实时定量PCR分析基因表达的引物序列
如图6所示，无论是否接种桃褐腐病菌，W10菌悬液处理的油桃果实中PpPPO、PpSOD和PpPOD的表达水平显著提高(图6A、6C和6D)，CAT的表达水平降低(图6B)。此外，如图7所示，桃褐腐病菌能诱导油桃果实PpPAL、PpLOX、PpCHI和PpGns3的表达。无论是否接种桃褐腐病菌，W10菌悬液处理的油桃果实中PpPAL、PpLOX、PpCHI和PpGns3的表达水平都显著增加。喷洒W10菌悬液1dpi接种桃褐腐病菌处理的油桃果实中，PpPAL和PpLOX的表达水平增加最显著(图7A和7B)。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种地衣芽孢杆菌诱导油桃抗性防御褐腐病的方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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tgaaggagag ggaaggtgaa ag 22
Claims (5)
1.一种用于防治桃褐腐病的产品，其特征是，产品为地衣芽孢杆菌W10的菌悬液；
所述地衣芽孢杆菌W10已于2017年11月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.14859，分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
2. 根据权利要求1所述的一种用于防治桃褐腐病的产品，其特征是，所述菌悬液中的菌浓度具体为1×108CFU ml-1；
所述菌悬液的制备方法为：将地衣芽孢杆菌W10接种至NA液体培养基，28℃、200rpm振荡培养24h，然后离心收集沉淀，用无菌水悬浮沉淀，得到菌浓度为1×108CFU ml-1的菌悬液；其中，离心收集沉淀时，离心条件为5000rpm离心5 min。
3.利用地衣芽孢杆菌W10菌悬液在诱导油桃果实抗褐腐病中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述诱导油桃果实抗褐腐病包括抑制褐腐病的发生，降低油桃果实的丙二醛MDA含量、电导率和H2O2含量，以及提高油桃果实的抗氧化酶和防御相关酶活性并增加相应基因的表达。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述菌悬液的制备方法为：将地衣芽孢杆菌W10接种至牛肉膏液体培养基，30℃、200rpm振荡培养24 h，然后离心收集沉淀，用无菌水悬浮沉淀，得到菌浓度为1×108CFU ml-1的菌悬液；其中，离心收集沉淀时，离心条件为5000rpm离心5min。
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| CN114766546A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-07-22 | 淮阴工学院 | 地衣芽孢杆菌hg03在防治葡枝根霉所致水蜜桃采后软腐病中的应用及应用方法 |
| CN114766546B (zh) * | 2021-12-29 | 2024-03-26 | 淮阴工学院 | 地衣芽孢杆菌hg03在防治葡枝根霉所致水蜜桃采后软腐病中的应用及应用方法 |
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