CN114766546B - 地衣芽孢杆菌hg03在防治葡枝根霉所致水蜜桃采后软腐病中的应用及应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种地衣芽孢杆菌HG03在防治葡枝根霉所致水蜜桃采后软腐病中的应用及应用方法，用HG03菌悬液接种处理水蜜桃，降低了水蜜桃的发病率和病斑直径，在接种2天后，HG03处理组的水蜜桃发病率降低了36.26%，病斑直径减少了50.00%。3天后，VC含量为11.20 mg/kg，可滴定酸含量为0.07%，硬度为7.17 N，可溶性固形物为10.93%。HG03处理也提高了防御相关基因的表达。因此，地衣芽孢杆菌HG03降低了葡枝根霉所致水蜜桃采后软腐病的发生，延缓了衰老，提高了抗病性，延长了货架期。

Description

地衣芽孢杆菌HG03在防治葡枝根霉所致水蜜桃采后软腐病中 的应用及应用方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种地衣芽孢杆菌HG03在防治葡枝根霉所致水蜜桃采后软腐病中的应用及应用方法。
背景技术
软腐病是水蜜桃采后腐烂最主要病害之一，而引起水蜜桃软腐病的主要病原菌为广泛存在自然界中的葡枝根霉（Rhizopus stolonifer），其生长繁殖速度较快，葡枝根霉孢子借气流即可传播，一旦侵入寄主就会迅速蔓延，导致果实腐烂变质。水蜜桃的采后损失率最高可达总产量的50%，严重影响其经济效益。因此延长水蜜桃货架期、减少在贮藏期间发生的腐烂，不仅可以维持果实的供应量，又可以减少经济损失。目前果实采后防治研究大部分集中在化学防治，但持续使用化学杀菌剂易导致病原菌产生抗药性及农药残留等问题，危害人体健康并污染环境。因此，安全、经济的生物防治在果实采后病害防治中具有广阔的前景。
地衣芽孢杆菌为芽孢杆菌属菌株，其可产生多种抗菌活性物质以及诱导有机体产生抗病性，用来防治果蔬采后病害。为降低采后果蔬在运输贮藏过程中被病原菌侵害而腐烂造成的经济损失，研究者们筛选多种生防菌能够有效地防治采后病害，地衣芽孢杆菌就是其中的一种。2015年，纪兆林等人研究发现地衣芽孢杆菌W10及其抗菌蛋白对桃褐腐病都具有较好的抑制作用 (农业科技，2015, 42(10) :1879-1888)；2020年，郑丽等人研究筛选得到菌株地衣芽孢杆菌HS10对黄瓜霜霉病具有较好的防效功能 (农业科技，2020, 47(09) :81-87)。
发明内容
发明目的：针对现有技术中没有对水蜜桃采后软腐病有较高防效的拮抗菌这一现状，本发明提供一种地衣芽孢杆菌HG03在防治葡枝根霉所致水蜜桃采后软腐病中的应用及应用方法，该菌株易培养，生长繁殖快，对葡枝根霉所致水蜜桃采后软腐病菌具有拮抗作用。
技术方案：本发明提供了一种芽孢杆菌（Bacillus sp.）HG03在防治葡枝根霉所致水蜜桃采后软腐病中的应用。
所述地衣芽孢杆菌HG03于2016年05月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC No. 12481，存活。
本发明还提供了一种地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）HG03在防治葡枝根霉所致水蜜桃采后软腐病中的应用方法，使用活菌总浓度为1×108CFU/mL的地衣芽孢杆菌HG03的菌悬液对水蜜桃进行接种处理。
进一步地，所述地衣芽孢杆菌HG03的菌悬液的制备方法如下：将地衣芽孢杆菌HG03划线培养于LB平板培养基上；在27~29 ºC下培养20~24 h后转接于LB培养液中，27~29ºC、180~200 rpm培养20~24 h；将所得菌液在4000~6000 rpm室温离心10 min，所得菌体用无菌水悬浮。
进一步地，所述接种处理的具体方法如下：在水蜜桃赤道部刺孔，向孔中定量注入所述地衣芽孢杆菌HG03的菌悬液，24 h之后再定量注入葡枝根霉病原菌孢子悬浮液，自然风干后，将接种的果实装入聚乙烯袋中，置于20±1 ℃贮藏3天。
进一步地，所述葡枝根霉病原菌孢子悬浮液的制备方法如下：在培养2 d的葡枝根霉板子中加入10 mL的无菌水洗下孢子，用血球计数板计数，用无菌水将葡枝根霉孢子悬浮液浓度稀释至1×105CFU/mL，现配现用。
优选地，在所述水蜜桃赤道部等距离刺孔2个。
优选地，使用微量移液器向孔中定量注入所述地衣芽孢杆菌HG03的菌悬液。
优选地，所述水蜜桃为大小一致、八成熟、无机械损伤、无病虫害的水蜜桃。
有益效果：地衣芽孢杆菌HG03能有效防治水蜜桃采后软腐病、延缓水蜜桃的衰老。通过对水蜜桃的病斑直径、发病率、硬度、VC含量、可溶性固形物和可滴定酸含量的检测，结果显示HG03菌悬液处理对水蜜桃采后病害防治效果显著优于对照组，并在一定程度上维持了果实的品质。接种地衣芽孢杆菌HG03可以诱导抗病相关基因的表达，增强水蜜桃的抗病性。可见，HG03通过维持相关品质指标，延缓果实的衰老；提高相关抗病基因的表达，防治水蜜桃采后软腐病。地衣芽孢杆菌HG03防治水蜜桃采后软腐病包括抑制采后软腐病的发生，降低病斑的扩展，一定程度上维持桃果实的相关品质指标，例如硬度、VC、可滴定酸和可溶性固形物的含量，以及提高了水蜜桃果实防御相关基因的表达。
用HG03菌悬液接种处理水蜜桃，降低了水蜜桃的发病率和病斑直径，在接种2天后，HG03处理组的水蜜桃发病率降低了36.26%，病斑直径减少了50.00%。HG03处理水蜜桃3天后，VC含量为11.20 mg/kg，可滴定酸含量为0.07%，硬度为7.17 N，可溶性固形物为10.93%。此外，HG03处理也提高了防御相关基因的表达。因此，地衣芽孢杆菌HG03对水蜜桃采后软腐病的防治效果优于对照组，其降低水蜜桃采后软腐病的发生，延缓果实的衰老，提高水蜜桃的抗病性，延长其货架期。
本发明防治效果好，安全，操作简单。所使用的地衣芽孢杆菌HG03目前尚未有在水蜜桃软腐病上应用报道，具有一定新颖性。
附图说明
图1为HG03处理对水蜜桃病斑直径的影响；
图2为HG03处理对水蜜桃发病率的影响；
图3为实时荧光定量 (qRT-PCR) 检测HG03处理后水蜜桃中脂类转运蛋白质相关差异基因PRUPE_1G312900表达水平；
图4为实时荧光定量 (qRT-PCR) 检测HG03处理后水蜜桃中防御相关差异基因PRUPE_3G202000表达水平；
图5为实时荧光定量 (qRT-PCR) 检测HG03处理后水蜜桃中防御相关差异基因PRUPE_4G017600表达水平。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细的介绍。
实施方式1：地衣芽孢杆菌HG03对葡枝根霉所致水蜜桃采后软腐病的防治效果：
用地衣芽孢杆菌HG03对水蜜桃进行接种处理。水蜜桃用75％乙醇进行表面消毒，自然晾干后，在水蜜桃赤道部等距处穿刺2个孔，孔深4 mm，直径2 mm。定量注射HG03菌悬液15 μL（对照组为无菌水）。24 h后，每孔再注入1×105CFU/mL葡枝根霉孢子病原菌悬浮液10μL。自然风干后，将接种的水蜜桃装入聚乙烯袋中，置于20±1℃贮藏3天。每天统计水蜜桃的发病率和病斑直径。每组处理30个水蜜桃，重复三次。发病率（%）=（水蜜桃发病总数/水蜜桃总数）×100。
结果如图1所示：在整个贮藏期间，地衣芽孢杆菌HG03处理水蜜桃的病斑直径显著小于对照组，在贮藏第3天，对照组的病斑直径已经达到5.87 cm，是处理组病斑直径的15倍。如图2所示，在水蜜桃贮藏第1天和第2天，经过HG03处理水蜜桃的发病率为30.08%和60.35%，显著低于对照组的47.64%和94.68%。因此可知，HG03接种处理水蜜桃在防治葡枝根霉所致水蜜桃采后软腐病的防治中起着重要作用。
实施方式2：地衣芽孢杆菌HG03对水蜜桃相关品质指标的影响：
硬度、可溶性固形物含量、可滴定酸含量和VC含量是直接衡量果实成熟度和贮藏品质的重要指标。因此，分别在贮藏第0、1、2、3天对地衣芽孢杆菌HG03处理的水蜜桃进行指标测定。实验设置2个处理组：接种无菌水1dpi接种葡枝根霉病原菌孢子悬浮液（配制方法：在培养2 d的葡枝根霉板子中加入10 mL的无菌水洗下孢子，用血球计数板计数，用无菌水将葡枝根霉病原菌孢子悬浮液浓度稀释至1×105CFU/mL，现配现用）和接种HG03菌悬液1dpi接种葡枝根霉病原菌孢子悬浮液。每天每组取3个水蜜桃进行指标测定。采用GY-3指针式水果硬度仪进行测定水蜜桃的硬度；采用便携式糖度计测定水蜜桃的可溶性固形物含量；可滴定酸含量的测定根据酸碱中和原理，以酸碱滴定法测定可滴定酸含量；VC含量的测定采用2，6-二氯靛酚滴定法进行测定。实验重复三次。
结果如表1所示：在水蜜桃贮藏第2天HG03处理组的桃果实硬度是对照组硬度的3倍，其硬度远远大于对照组，在贮藏第3天，处理组的硬度为5.03 N，对照组大面积腐烂，硬度仅为2.17 N。在贮藏第1、2、3天，处理组的水蜜桃可溶性固形物分别是对照组的1.09倍、1.13倍、1.16倍。处理组的水蜜桃VC含量分别是对照组的1.29倍、1.28倍和1.53倍。处理组的水蜜桃可滴定酸含量分别是对照组的1.63倍、2.33倍和2.00倍。因此HG03菌悬液接种的水蜜桃硬度、可溶性固形物、可滴定酸和VC含量均高于对照组，一定程度上能够维持果实的品质。
表1 HG03处理对水蜜桃相关品质指标的影响
注：组间比较使用单因素方差分析，不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
实施方式3：地衣芽孢杆菌HG03对水蜜桃抗病基因表达水平的影响：
共测定三组样品的转录组，分别取自对照组的第0 d和第2 d以及HG03处理的第2d，三组样品分别命名为H_CK0 d、H_CK2 d和HG_2 d。剥去果皮后，将果核和腐烂的果肉去除，将剩余的果肉切片剁碎，立即用液氮速冻研磨，提取总RNA。采用逆转录PCR试剂盒进行定量逆转录PCR (qRT-PCR)。按照Novozan逆转录PCR试剂盒(R223)说明书，用含2µg TotalRNA的20µL反应混合物合成cDNA。以桃Actin基因为内参，以cDNA为模板进行定量PCR。3个生物学重复。引物序列见表2。
表2 引物序列
结果如图2所示：HG03处理组的基因包括属于植物-病原相互作用途径的防御相关差异基因PRUPE_3G202000和PRUPE_4G017600以及脂类转运蛋白质相关差异基因PRUPE_1G312900都上调了。相比于对照组第0和2天，HG03处理诱导了防御相关基因的表达，从而使水蜜桃产生抗病性。
上述实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 淮阴工学院
<120> 地衣芽孢杆菌HG03在防治葡枝根霉所致水蜜桃采后软腐病中的应用及应用方法
<130> 2021
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1475
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc gaatggatta agagcttgct 60
cttatgaagt tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgccca taagactggg 120
ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg ataacatttt gaactgcatg gttcgaaatt 180
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agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg 540
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tgggctacac acgtgctaca atggacggta cgaagagctg caagaccgcg aggtggagct 1260
aatctcataa aaccgttctc agttcggatt gtaggctgca actcgcctac atgaagctgg 1320
aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca 1380
ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtggggtaac cttttggagc 1440
cagccgccta aggtgggaca gatgattggg gtgaa 1475

Claims (6)

1.一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)HG03在防治葡枝根霉所致水蜜桃采后软腐病中的应用方法，其特征在于：使用活菌总浓度为1×108CFU/mL的地衣芽孢杆菌HG03的菌悬液对水蜜桃进行接种处理；
在水蜜桃赤道部刺孔，向孔中定量注入所述地衣芽孢杆菌HG03的菌悬液，24h之后再定量注入葡枝根霉病原菌孢子悬浮液，所述葡枝根霉孢子悬浮液浓度1×105CFU/mL，自然风干后，将接种的果实装入聚乙烯袋中，置于20±1℃贮藏3天；
所述地衣芽孢杆菌HG03于2016年05月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC No.12481。
2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌HG03的菌悬液的制备方法如下：将地衣芽孢杆菌HG03划线培养于LB平板培养基上；在27～29℃下培养20～24h后转接于LB培养液中，27～29℃、180～200rpm培养20～24h；将所得菌液在4000～6000rpm室温离心10min，所得菌体用无菌水悬浮。
3.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述葡枝根霉病原菌孢子悬浮液的制备方法如下：在培养2d的葡枝根霉板子中加入10mL的无菌水洗下孢子，用血球计数板计数，用无菌水将葡枝根霉孢子悬浮液浓度稀释至1×105
CFU/mL，现配现用。
4.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，在所述水蜜桃赤道部等距离刺孔2个。
5.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，使用微量移液器向孔中定量注入所述地衣芽孢杆菌HG03的菌悬液。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的应用方法，其特征在于，所述水蜜桃为大小一致、八成熟、无机械损伤、无病虫害的水蜜桃。
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