CN104046659A

CN104046659A - 一种聚3-羟基丙酸共聚物及其生产方法

Info

Publication number: CN104046659A
Application number: CN201410272402.7A
Authority: CN
Inventors: 咸漠; 赵广; 冯新军
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2014-06-18
Filing date: 2014-06-18
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2034-06-18
Also published as: CN104046659B

Abstract

本发明公开了一种聚3-羟基丙酸共聚物及其生产方法，属于基因工程技术领域。本发明通过基因整合技术在宿主菌基因组上整合甘油脱水酶基因和甘油脱水酶再激活酶基因，并导入聚羟基脂肪酸合成酶基因、丙醛脱氢酶基因、β-酮脂酰辅酶A硫解酶基因、乙酰乙酰辅酶A还原酶基因和丙酰辅酶A合成酶基因，重组后的基因工程菌具有生物合成聚3-羟基丙酸-co-3-羟基戊酸的能力。本发明首次通过生物合成的方式获得了聚3-羟基丙酸-co-3-羟基戊酸。与聚3-羟基丙酸相比，所得的聚3-羟基丙酸-co-3-羟基戊酸具有更高的熔点和更低的结晶性，具有较佳的可降解性，可作为包装材料、医用植入材料、药物缓释材料和电化学材料。

Description

一种聚3-羟基丙酸共聚物及其生产方法

技术领域

本发明涉及一种聚3-羟基丙酸共聚物及其生产方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

化石能源危机日益严重，生物燃料的制造成为研究焦点。生物柴油是生物液体燃料中最重要的一种。伴随着生物柴油的大量生产，其副产物甘油的大量积累。据初步估算，每生产10吨生物柴油会制造1吨的粗甘油。生物柴油的进一步增长，造成甘油价格的不断降低。充分利用价格低廉的甘油生产高附加值产品，可以带来巨大经济效益和环境效益，受到越来越多的重视。

聚羟基脂肪酸酯是一种通过微生物发酵获得的生物塑料，可以利用葡萄糖、甘油等廉价碳源合成(Drumright RE,Gruber PR,Henton DE.Polylactic acid technology.Adv Mater,2000；12:1841–6.)。其物理性能与传统塑料相似甚至优于传统塑料，具有生物降解性，不会造成污染，可用于制造医疗器械、包装材料、农田地膜等。

聚3-羟基丙酸(P3HP)是一种拥有广阔发展前景的新型可降解塑料，具有优异的生物材料性质和机械性能，比如具有高机械强度和拉伸强度、高断裂伸长量、生物降解性、生物相容性、无毒及热塑性等(Wang Q,Liu C,Xian M,Zhang YG,Zhao G.Biosynthetic pathway for poly(3-hydroxypropionate)in recombinant Escherichia coli.J Microbiol,2012,50(4):693-697.；Wang Q,Yang P,LiuC,Xue Y,Xian M,Zhao G.Biosynthesis of poly(3-hydroxypropionate)from glycerol by recombinant Escherichiacoli.BioresourceTechnol,2013,131:548-51.；Wang Q,Yang P,Xian M,Yang Y,Liu C,Xue Y,Zhao G.Biosynthesis of poly(3-hydroxypropionate-co-3-hydroxybutyrate)with fully controllable structures from glycerol.BioresourTechnol,2013,142:741-4.)。聚3-羟基丙酸在性质上还存在一定缺陷，如熔点较低、结晶导致不透明等在一定程度上限制了其应用(Andreeβen B,Steinbuchel A.Biosynthesis andbiodegradation of3-hydroxypropionate-containing polyesters.Appl Environ Microbiol,2010,76(15):4919-25.)。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种新型聚3-羟基丙酸共聚物，其结构式为：

本发明的一个目的在于提供一种产聚3-羟基丙酸-co-3-羟基戊酸(P(3HP-co-3HV))的基因工程菌，在宿主菌基因组上整合甘油脱水酶基因和甘油脱水酶再激活酶基因，并导入聚羟基脂肪酸合成酶基因、丙醛脱氢酶基因、β-酮脂酰辅酶A硫解酶基因、乙酰乙酰辅酶A还原酶基因和丙酰辅酶A合成酶基因，重组后的基因工程菌具有生物合成聚3-羟基丙酸-co-3-羟基戊酸的能力。

本发明的另一目的是提供一种产聚3-羟基丙酸-co-3-羟基戊酸基因工程菌的构建方法，该方法的步骤如下：

1)宿主菌基因的整合：将甘油脱水酶基因dhaB和甘油脱水酶再激活酶基因gdrAB整合到宿主菌基因组上，获得基因整合宿主菌；

2)重组质粒的构建：分别构建含有丙醛脱氢酶基因pduP、聚羟基脂肪酸合成酶基因phaC1和β-酮脂酰辅酶A硫解酶基因bktB、乙酰乙酰辅酶A还原酶基因phaB1、丙酰辅酶A合成酶基因pcs’的重组质粒；

3)基因工程菌的构建：将步骤2)所得的两个重组质粒导入步骤1)所得的基因整合宿主菌，获得基因工程菌。

所述宿主菌基因的整合，是通过搭桥PCR得到目的片段gdrAB-dhaB片段，以自杀质粒pRE112为媒介与大肠杆菌进行同源重组将gdrAB-dhaB整合到大肠杆菌基因组中得到基因整合宿主菌。

所述重组质粒的构建，是通过克隆丙醛脱氢酶基因pduP和聚羟基脂肪酸合成酶基因phaC1，通过搭桥PCR得到目的基因片段phaC1-pduP，再将目的基因片段和质粒pET21a进行双酶切并酶连后得到重组质粒pET21a-phaC1-pduP；通过克隆β-酮脂酰辅酶A硫解酶基因bktB，同时克隆乙酰乙酰辅酶A还原酶基因phaB1和丙酰辅酶A合成酶基因pcs’，通过搭桥PCR得到目的基因片段bktB-phaB1-pcs’，将目的基因片段和质粒pBAD18进行双酶切并酶连后得到重组质粒pBAD18-bktB-phaB1-pcs’。

所述基因工程菌的构建，是将重组质粒pET21a-phaC1-pduP和重组质粒pBAD18-bktB-phaB1-pcs’导入到基因整合宿主菌中，获得基因工程菌。

本发明所述基因工程菌优选大肠杆菌。

所述甘油脱水酶基因来源于Klebsiella pneumoniae的dhaB基因；甘油脱水酶再激活酶基因为来源于Klebsiella pneumoniae的gdrAB基因；聚羟基脂肪酸合成酶基因来源于RalstoniaeutrophaH16的phaC1基因；丙醛脱氢酶基因来源于Salmonella typhimurium的pduP基因；β-酮脂酰辅酶A硫解酶基因来源于Ralstonia eutrophaH16的bktB基因；乙酰乙酰辅酶A还原酶基因来源于Ralstonia eutrophaH16的phaB1基因；丙酰辅酶A合成酶基因来源于Chloroflexiaurantiacus的pcs’基因。

本发明的另一个目的是提供一种利用所述基因工程菌发酵生产聚3-羟基丙酸-co-3-羟基戊酸的方法，是将活化后的重组基因工程菌接种到含有抗生素的培养基中培养，加入诱导剂，发酵生产聚3-羟基丙酸-co-3-羟基戊酸，发酵结束后收集发酵液，离心，水洗，冻干后用氯仿萃取，得到生产聚3-羟基丙酸-co-3-羟基戊酸。

所述培养基，碳源为甘油，并含有氨苄青霉素和卡那霉素。

所述发酵，是以种子液：培养基＝1～2:100～130的体积比接种基因工程菌，于35℃～37℃，180～220rpm条件下培养至OD₆₀₀在0.6～0.8之间，再加入诱导剂IPTG和阿拉伯糖至终浓度分别为0.05～0.5mM和0.002％～0.02％，然后转入28～30℃，180～220rpm条件下继续培养24～72小时，发酵结束后得到发酵液。

优选地，基因工程菌的构建是通过PCR(聚合酶链式反应)扩增丙醛脱氢酶基因、聚羟基脂肪酸合成酶基因或β-酮脂酰辅酶A硫解酶基因、乙酰乙酰辅酶A还原酶基因、丙酰辅酶A合成酶基因，以扩增片段摩尔比为1:1的添加量为底物进行搭桥PCR，用胶回收试剂盒回收目的片段，然后分别双酶切目的片段和质粒pET21a或pBAD18，酶切产物回收后，将载体：目的片段按摩尔比为1:1的比例混合，加入T4DNA连接酶后在16℃下连接6～12小时，连接产物42℃下热激转化E.coliDH5α感受态细胞，涂布氯霉素或卡那霉素抗性平板过夜培养，PCR筛选阳性克隆；阳性克隆培养后提取质粒，进行酶切和测序鉴定后，转化宿主重组大肠杆菌。

通过PCR扩增甘油脱水酶基因、甘油脱水酶再激活酶基因，以扩增片段摩尔比为1:1的添加量为底物进行搭桥PCR，用胶回收试剂盒回收目的片段，然后分别双酶切目的片段和质粒pRE112，通过自杀质粒pRE112将目的基因整合到E.coliBL21(DE3)基因组中得到宿主重组大肠杆菌。

优选地，所述“发酵培养基”包括各种适于所选用的宿主细胞(大肠杆菌)生长的培养基，碳源优选为低成本的甘油；其他成分不做特别的限定，例如氮源可选择无机氮源(氯化铵、硫酸铵等)或有机氮源(酵母粉、牛肉膏、蛋白胨等)，优选低成本的无机氮源。

丙醛脱氢酶基因为来源于Salmonella typhimurium的pduP基因或同pduP基因具有一定同源性的DNA序列或与pduP基因没有明显同源性但可以编码具有丙醛脱氢酶功能的蛋白的DNA序列。

聚羟基脂肪酸合成酶基因为来源于Ralstonia eutrophaH16的phaC1基因或同phaC1基因具有一定同源性的DNA序列或与phaC1基因没有明显同源性但可以编码具有聚羟基脂肪酸合成酶功能的蛋白的DNA序列。

β-酮脂酰辅酶A硫解酶基因为来源于Ralstonia eutrophaH16的bktB基因或同bktB基因具有一定同源性的DNA序列或与bktB基因没有明显同源性但可以编码具有β-酮脂酰辅酶A硫解酶功能的蛋白的DNA序列。

乙酰乙酰辅酶A还原酶基因为来源于Ralstonia eutrophaH16的phaB1基因或同phaB1基因具有一定同源性的DNA序列或与phaB1基因没有明显同源性但可以编码具有乙酰乙酰辅酶A还原酶功能的蛋白的DNA序列。

丙酰辅酶A合成酶基因为来源于Chloroflexiaurantiacus的pcs’基因或同pcs’基因具有一定同源性的DNA序列或与pcs’基因没有明显同源性但可以编码具有丙酰辅酶A合成酶功能的蛋白的DNA序列。

甘油脱水酶基因为来源于Klebsiella pneumoniae的dhaB基因或同dhaB基因具有一定同源性的DNA序列或与dhaB基因没有明显同源性但可以编码具有甘油脱水酶功能的蛋白的DNA序列。

甘油脱水酶再激活酶基因为来源于Klebsiella pneumoniae的gdrAB基因或同gdrAB基因具有一定同源性的DNA序列或与gdrAB基因没有明显同源性但可以编码具有甘油脱水酶再激活酶功能的蛋白的DNA序列。

本发明具有以下有益效果：

1)首次合成的聚3-羟基丙酸-co-3-羟基戊酸，其结晶性低于聚3-羟基丙酸。

2)合成的聚3-羟基丙酸-co-3-羟基戊酸，其熔点高于聚3-羟基丙酸。

3)发酵生产聚3-羟基丙酸-co-3-羟基戊酸，产量可达2.96g/L。

附图说明

图1聚3-羟基丙酸-co-3-羟基戊酸结构图。

图2为利用甘油合成聚3-羟基丙酸-co-3-羟基戊酸代谢途径示意图。

图3为pBAD18-bktB-phaB1-pcs’载体图谱。

图4为本发明工程大肠杆菌发酵产物聚3-羟基丙酸-co-3-羟基戊酸的核磁共振图谱鉴定结果；(a为¹³C图谱；b为¹H图谱)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。

所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。

实施例1 基因工程菌的构建

通过在整合了甘油脱水酶基因(dhaB123)(dhaB1Gene ID:7947197；dhaB2Gene ID:7947198；dhaB3Gene ID:7947200)、甘油脱水酶再激活酶基因(gdrAB)(gdrA Gene ID：6936977；gdrB Gene ID：6938011)的大肠杆菌体内过量表达丙醛脱氢酶基因(pduP，Gene ID：1253572)、聚羟基脂肪酸合成酶基因(phaC，Gene ID:4250156)、β-酮脂酰辅酶A硫解酶基因(bktB，Gene ID:4248815)、乙酰乙酰辅酶A还原酶基因(phaB₁，Gene ID:4249784)、丙酰辅酶A合成酶基因(pcs’)实现以甘油为碳源合成P(3HP-co-3HV)，利用甘油合成聚3-羟基丙酸-co-3-羟基戊酸代谢途径如图2所示。

1.基因整合

基因dhaB和gdrAB克隆后，通过基因整合技术，使dhaB和gdrAB整合到大肠杆菌基因组中，得到宿主大肠杆菌。此步骤已经实现，具体参照发明人前期工作(Gao Y,Liu C,DingY,Sun C,Zhang R,et al.(2014)Development of Genetically Stable Escherichia coli Strains forPoly(3-Hydroxypropionate)Production.PLoS ONE9(5):e97845.)。

2.表达载体的构建

2.1 聚3-羟基丙酸合成载体的构建

克隆丙醛脱氢酶基因(pduP)、聚羟基脂肪酸合成酶基因(phaC)后，将基因片段与质粒pET21a进行双酶切，酶切产物酶连后，转化E.coli DH5α感受态，PCR验证单克隆，获得重组载体。此步骤已经实现，具体参照发明人前期工作(Gao Y,Liu C,Ding Y,Sun C,Zhang R,et al.(2014)Development of Genetically Stable Escherichia coli Strains forPoly(3-Hydroxypropionate)Production.PLoS ONE9(5):e97845.)。

2.2 3-羟基戊酸单体合成载体的构建

2.2.1 外源基因的克隆

丙酰辅酶A合成酶基因(pcs’)克隆自pKS1质粒，根据pcs’基因序列(基质粒和基因序列(见SEQ ID NO.1)由德国弗赖堡大学Birgit E.Alber教授赠送，基因功能参考Alber B.E.,G.Fuchs.Propionyl-Coenzyme A Synthase from Chloroflexusaurantiacus,aKey Enzyme of the3-HydroxypropionateCycle for AutotrophicCO₂Fixation.J.Biol.Chem.2002,277(14):12137-12143.)设计引物(引物序列为5’-ACTGAGCTCAGGAGGATGGTCGATGAACGCTATCGCTACTTC-3’和5’-CATTCTAGACTACCGCTCGCCGGCCG-3’)，通过PCR扩增获得，再利用回收试剂盒回收目的片段。

β-酮脂酰辅酶A硫解酶基因(bktB)(Gene ID:4248815)的克隆，根据GenBank序列设计引物(引物序列为5’-CACATGCTAGCCGCTATACTGTGCGGTGC-3’和5’-AGTCATGTCCACTCCTTGATTTCAGATACGCTCGAAGAT-3’)，以Ralstonia eutrophaH16为模板，通过PCR扩增获得。

乙酰乙酰辅酶A还原酶基因(phaB₁)(Gene ID:4249784)的克隆，根据GenBank序列设计引物(引物序列为5’-AATCAAGGAGTGGACATGACTCAGCGC-3’和5’-CATGAGCTCGACTGGTTGAACCAGGC-3’)，以Ralstonia eutrophaH16为模板，通过PCR扩增获得。

以扩增所得的bktB基因和phaB₁基因片段为模板，通过搭桥PCR扩增得到bktB-phaB₁，引物为5’-CACATGCTAGCCGCTATACTGTGCGGTGC-3’和5’-CATGAGCTCGACTGGTTGAACCAGGC-3’。

2.2.2 载体的构建

将胶回收的pcs’基因片段和pBAD18载体用SacI、XbaI进行双酶切，酶切产物回收后，片段与载体按摩尔比1:1的比例在连接酶的作用下16℃过夜酶连，酶连产物42℃热激转化E.coliDH5α感受态，PCR筛选获得阳性克隆，得到载体pBAD18-pcs’，并通过酶切最终确认。

将胶回收的bktB-phaB₁基因片段和pBAD18-pcs’载体用NheI、SacI进行双酶切，酶切产物回收后，片段与载体按摩尔比1:1的比例在连接酶的作用下16℃过夜酶连，酶连产物42℃热激转化E.coliDH5α感受态，PCR筛选获得阳性克隆，得到载体pBAD18-bktB-phaB₁-pcs’，并通过酶切最终确认，载体图谱如图3所示。

3.表达载体转化宿主大肠杆菌

按照感受态制备试剂盒(TAKARA)说明制备宿主大肠杆菌感受态，将表达载体pET21a-phaC-pduP通过热激转化宿主大肠杆菌感受态，通过PCR筛选获得阳性克隆，提取阳性克隆质粒后再通过酶切和测序鉴定。然后将pBAD18-bktB-phaB₁-pcs’通过热激转化含有质粒pET21a-phaC-pduP的宿主大肠杆菌感受态，通过PCR筛选获得阳性克隆，提取阳性克隆质粒后再通过酶切和测序鉴定。由此，获得了含有pET21a-phaC-pduP和pBAD18-bktB-phaB₁-pcs’两个表达载体的工程大肠杆菌。

4.工程大肠杆菌的培养

将活化后的工程大肠杆菌以1:100的比例接种到含有20g/L甘油的M9培养集中(含50μg/L的氨苄青霉素和50μg/L的卡那霉素)，37℃，200rpm条件下振荡培养。当OD₆₀₀达到0.6～0.8范围时，加入IPTG和阿拉伯糖分别至终浓度为0.5mM～0.05mM和0.02％～0.002％(wt/v)，然后调节至30℃继续培养24～48小时。培养过程定时用NH₃·H₂O或KOH调节pH。5.P(3HP-co-3HV)的提取

诱导培养后的菌液在12000rpm条件下离心10min，倒掉上清，用无水乙醇悬浮菌体并再次离心，冻干菌体，用适量的氯仿进行萃取，旋转蒸发除去氯仿后得到P(3HP-co-3HV)。氯仿回收利用。

6.P(3HP-co-3HV)的鉴定

得到的P(3HP-co-3HV)通过核磁共振进行定性分析，分析方法参见(Wang HH,Li XT,ChenGQ.Production and characterization of homopolymerpolyhydroxyheptanoate(P3HHp)by a fabBA knockoutmutant Pseudomonas putia KTOY06derived from P.putida KT2442.ProcessBiochemistry2009；44(1):106-111.)。得到的核磁共振C谱(图4)证实得到了P(3HP-co-3HV)。

实施例2 发酵生产P(3HP-co-3HV)

通过调节诱导剂添加量以及有机氮源的的使用考察P(3HP-co-3HV)的产量。

2.1)0.5mM的IPTG和0.02％的阿拉伯糖诱导

改变M9培养基氮源分别为5g/L的酵母粉、蛋白胨或牛肉膏，以1:100的比例接种活化后的大肠杆菌，当OD₆₀₀达到0.6～0.8范围时，添加诱导剂IPTG和阿拉伯糖分别至终浓度为0.5mM和0.02％，继续培养48h后提取P(3HP-co-3HV)。

氮源为牛肉膏时，P(3HP-co-3HV)占细胞干重的12.94％(w/w)，产量为0.45g/L，产量最高。氮源为蛋白胨时产量最低，P(3HP-co-3HV)占细胞干重的6.53％，产量为0.24g/L。氮源为酵母粉时，P(3HP-co-3HV)占细胞干重的6.75％，产量为0.38g/L。

2.2)0.05mM的IPTG和0.002％的阿拉伯糖诱导

改变M9培养基氮源分别为5g/L的酵母粉、蛋白胨或牛肉膏，以1:100的比例接种活化后的大肠杆菌，当OD₆₀₀达到0.6～0.8范围时，添加诱导剂IPTG和阿拉伯糖分别至终浓度为0.05mM和0.002％，继续培养48h后提取P(3HP-co-3HV)。

氮源为酵母粉时，P(3HP-co-3HV)占细胞干重的43.67％(w/w)，产量为4.13g/L，产量最高。氮源为蛋白胨时产量最低，P(3HP-co-3HV)占细胞干重的31.85％，产量为2.22g/L。氮源为牛肉膏时，P(3HP-co-3HV)占细胞干重的37.65％，产量为2.96g/L。

实施例3

将本发明获得的P(3HP-co-3HV)与聚3-羟基丙酸样品经过乙醇清洗并真空干燥，通过示差扫描量热法测定熔点和结晶度，温度设定范围为-80℃～200℃，氮气流速为50ml/min。P(3HP-co-3HV)的熔点由聚3-羟基丙酸的76℃上升到了147℃，结晶度由聚3-羟基丙酸的74％下降为35％。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种聚3-羟基丙酸共聚物，其特征在于，结构式如下所示：

2.一种产权利要求1所述共聚物的基因工程菌，其特征在于，在宿主菌基因组上整合甘油脱水酶基因和甘油脱水酶再激活酶基因，并导入聚羟基脂肪酸合成酶基因、丙醛脱氢酶基因、β-酮脂酰辅酶A硫解酶基因、乙酰乙酰辅酶A还原酶基因和丙酰辅酶A合成酶基因，重组后的基因工程菌具有生物合成聚3-羟基丙酸-co-3-羟基戊酸的能力。

3.权利要求2所述基因工程菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌。

4.权利要求2所述基因工程菌，其特征在于，所述甘油脱水酶基因来源于Klebsiellapneumoniae的dhaB基因；甘油脱水酶再激活酶基因为来源于Klebsiella pneumoniae的gdrAB基因；聚羟基脂肪酸合成酶基因来源于Ralstonia eutrophaH16的phaC1基因；丙醛脱氢酶基因来源于Salmonella typhimurium的pduP基因；β-酮脂酰辅酶A硫解酶基因来源于RalstoniaeutrophaH16的bktB基因；乙酰乙酰辅酶A还原酶基因来源于Ralstonia eutrophaH16的phaB1基因；丙酰辅酶A合成酶基因来源于Chloroflexiaurantiacus的pcs’基因。

5.一种产权利要求1所述共聚物基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

2)重组质粒的构建：分别构建含有丙醛脱氢酶基因pduP、聚羟基脂肪酸合成酶基因phaC1重组质粒和含有β-酮脂酰辅酶A硫解酶基因bktB、乙酰乙酰辅酶A还原酶基因phaB1、丙酰辅酶A合成酶基因pcs’的重组质粒；

6.权利要求5所述方法，其特征在于，步骤1)所述宿主菌基因的整合，是通过搭桥PCR得到目的片段gdrAB-dhaB片段，以自杀质粒pRE112为媒介与大肠杆菌进行同源重组将gdrAB-dhaB整合到大肠杆菌基因组中得到基因整合宿主菌；步骤2)所述重组质粒的构建，是通过克隆丙醛脱氢酶基因pduP和聚羟基脂肪酸合成酶基因phaC1，通过搭桥PCR得到目的基因片段phaC1-pduP，再将目的基因片段和质粒pET21a进行双酶切并酶连后得到重组质粒pET21a-phaC1-pduP；通过克隆β-酮脂酰辅酶A硫解酶基因bktB，同时克隆乙酰乙酰辅酶A还原酶基因phaB1和丙酰辅酶A合成酶基因pcs’，通过搭桥PCR得到目的基因片段bktB-phaB1-pcs’，将目的基因片段和质粒pBAD18进行双酶切并酶连后得到重组质粒pBAD18-bktB-phaB1-pcs’；步骤3)所述基因工程菌的构建，是将重组质粒pET21a-phaC1-pduP和重组质粒pBAD18-bktB-phaB1-pcs’导入到基因整合宿主菌中，获得重组大肠杆菌。

7.权利要求5或6所述方法，其特征在于，所述甘油脱水酶基因来源于Klebsiella pneumoniae的dhaB基因；甘油脱水酶再激活酶基因为来源于Klebsiella pneumoniae的gdrAB基因；聚羟基脂肪酸合成酶基因来源于Ralstonia eutrophaH16的phaC1基因；丙醛脱氢酶基因来源于Salmonella typhimurium的pduP基因；β-酮脂酰辅酶A硫解酶基因来源于RalstoniaeutrophaH16的bktB基因；乙酰乙酰辅酶A还原酶基因来源于Ralstonia eutrophaH16的phaB1基因；丙酰辅酶A合成酶基因来源于Chloroflexiaurantiacus的pcs’基因。

8.一种发酵生产聚3-羟基丙酸-co-3-羟基戊酸的方法，其特征在于，步骤如下：

3)基因工程菌的构建：将步骤2)所得的两个重组质粒导入步骤1)所得的基因整合宿主菌，获得基因工程菌；

4)利用步骤3)得到的基因工程菌发酵生产聚3-羟基丙酸-co-3-羟基戊酸。

9.权利要求8所述方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌；所述甘油脱水酶基因来源于Klebsiella pneumoniae的dhaB基因；甘油脱水酶再激活酶基因为来源于Klebsiellapneumoniae的gdrAB基因；聚羟基脂肪酸合成酶基因来源于Ralstonia eutrophaH16的phaC1基因；丙醛脱氢酶基因来源于Salmonella typhimurium的pduP基因；β-酮脂酰辅酶A硫解酶基因来源于Ralstonia eutrophaH16的bktB基因；乙酰乙酰辅酶A还原酶基因来源于RalstoniaeutrophaH16的phaB1基因；丙酰辅酶A合成酶基因来源于Chloroflexiaurantiacus的pcs’基因。

10.权利要求1所述共聚物，其特征在于，用于包装材料、医用植入材料、药物缓释材料和电化学材料中。