CN104718297A - 聚羟基烷酸酯共聚物组合物及其制备方法 - Google Patents
聚羟基烷酸酯共聚物组合物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种聚羟基烷酸酯共聚物组合物。该组合物包含多种聚羟基烷酸酯共聚物分子。所述聚羟基烷酸酯共聚物分子(i)包含3-羟基丁酸酯单体和4-羟基丁酸酯单体、(ii)具有的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为23.5％～75％、且(iii)具有的生物源含量≥80％。本发明还提供了一种制备聚羟基烷酸酯共聚物组合物的方法。所述方法包括在下述条件下在一种或多种含碳原料的存在下培养生物体，从而形成所述组合物；在所述条件下，(a)所述一种或多种含碳原料转化为3-羟基丁酰基CoA和4-羟基丁酰基CoA，并且(b)所述3-羟基丁酰基CoA和4-羟基丁酰基CoA聚合形成聚羟基烷酸酯共聚物分子。所述生物体已被遗传改造成包含一些特定的酶活性，且不包含另一些特定的酶活性。所述一种或多种含碳原料总共的生物源含量≥80％。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年12月7日递交的美国临时申请61/734,489和于2012年10月10日递交的美国临时申请61/711,825的权益，因此将这些申请的所有内容都通过援引并入本文中。
技术领域
本公开内容涉及聚羟基烷酸酯共聚物组合物及其制备方法，更具体而言，涉及包含多种聚羟基烷酸酯共聚物分子的聚羟基烷酸酯共聚物组合物，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子(i)包含3-羟基丁酸酯单体和4-羟基丁酸酯单体、(ii)具有的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为23.5％～75％、且(iii)生物源含量≥80％；并且涉及制备所述组合物的方法，所述方法包括在一种或多种含碳原料的存在下培养生物体。
背景技术
聚羟基烷酸酯(polyhydroxyalkanoate)是生物可降解的生物相容性热塑性材料，能够由可再生资源产生，并且具有广泛的工业和生物医学应用。聚羟基烷酸酯可以制备为均聚物，例如聚3-羟基丁酸酯(亦称为PHB)和聚4-羟基丁酸酯(亦称为P4HB)，或制备为共聚物，例如聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(亦称为PHB-co-4HB)。聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)共聚物因其能够从可再生资源产生并能够用于在聚合物共混物中赋予类似于橡胶的弹性而受到关注。因此，例如，之前在文献中已描述了利用各种微生物将大量的4HB单体引入共聚物中来产生聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)，但是，这仅在与其他碳源一起供应4-羟基丁酰基CoA的直接前体(例如4-羟基丁酸、γ-丁内酯和/或1,4-丁二醇)时得以实现。例如，Kunioka等,PolymerCommunications 29:174-176(1988)；Doi等,Polymer Communications 30:169-171(1989)；Kimura等,Biotechnol.Letters 14(6):445-450(1992)；Nakamura等,Macromolecules25(17):4237-4241(1992)；Saito和Doi,Int.J.Biol.Macromol.16(2):99-104(1994)；Lee等,Biotechnol.Letters 19(8):771-774(1997)；Choi等,Appl.Environm.Microbiol.65(4):1570-1577(1999)；Hsieh等,J.Taiwan Inst.Chem.Engin.40:143-147(2009)。还已实现了在经遗传改造的大肠杆菌细胞中由作为唯一碳源的葡萄糖产生聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)共聚物，但是报道的所得到的共聚物中4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比较低，例如在稳定期为12.5％以下，除非同时给予了其他碳源。Chen等,美国公开2012/0214213；另见Dennis和Valentin,美国专利6,117,658；Valentin和Dennis,J.Biotechnol.58:33-38(1997),Chen等,中国专利申请公开CN 102382789 A；Li等,Metab.Eng.12:352-359(2010)。还描述了从经遗传改造的代谢可再生原料(例如葡萄糖)的微生物生物质中产生聚4-羟基丁酸酯均聚物，但是示例性的聚4-羟基丁酸酯均聚物的滴度小于生物质滴度的50重量％，并且在任何情况下聚4-羟基丁酸酯均聚物的性质都不同于聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)共聚物。Van Walsem等,WO2011/100601。
发明内容
提供了一种聚羟基烷酸酯共聚物组合物。该组合物包含多种聚羟基烷酸酯共聚物分子。所述聚羟基烷酸酯共聚物分子(i)包含3-羟基丁酸酯单体和4-羟基丁酸酯单体、(ii)具有的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为23.5％～75％、且(iii)具有的生物源含量≥80％。
还提供了一种制备聚羟基烷酸酯共聚物组合物的方法。该组合物包含多种聚羟基烷酸酯共聚物分子。所述聚羟基烷酸酯共聚物分子(i)包含3-羟基丁酸酯单体和4-羟基丁酸酯单体、(ii)具有的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为23.5％～75％、且(iii)具有的生物源含量≥80％。所述方法包括在下述条件下在一种或多种含碳原料的存在下培养生物体，从而形成所述组合物；在所述条件下，(a)所述一种或多种含碳原料转化为3-羟基丁酰基CoA和4-羟基丁酰基CoA，并且(b)所述3-羟基丁酰基CoA和4-羟基丁酰基CoA聚合形成聚羟基烷酸酯共聚物分子。所述生物体已被遗传改造成包含聚羟基烷酸酯合酶、乙酰基CoA乙酰基转移酶、乙酰乙酰基CoA还原酶、琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酸半醛还原酶和CoA转移酶的酶活性，并且不包含NAD+依赖型琥珀酸半醛脱氢酶和/或NADP+依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的酶活性。所述一种或多种含碳原料总共的生物源含量≥80％。
附图说明
图1是示例性大肠杆菌中心代谢途径的示意图，其显示出了已在实施例中修改或引入的反应或者可以在今后修改的反应。在某些实施例中通过删除相应的基因而消除的反应用“X”标出。缩写：“PEP”，磷酸烯醇丙酮酸；“PYR”，丙酮酸；“Ac-CoA”，乙酰基CoA；“AcAc-CoA”，乙酰乙酰基CoA；“3HB-CoA”，3羟基丁酰基CoA；“CIT”，柠檬酸；“ICT”，异柠檬酸；“αKG”，α-酮戊二酸；“SUC-CoA”，琥珀酰基CoA；“SUC”，琥珀酸；“Fum”，延胡索酸；“MAL”，L-苹果酸；“OAA”，草酰乙酸；“SSA”，琥珀酸半醛；“4HB”，4-羟基丁酸；“4HB-P”，4-羟基丁酰基-磷酸；“4HB-CoA”，4-羟基丁酰基CoA；“PHB-co-4HB”，聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)。编号的反应：“1”，乙酰基CoA乙酰基转移酶(又名β酮硫解酶)；“2”，乙酰乙酰基CoA还原酶；“3”，琥珀酸半醛脱氢酶；“4”，α-酮戊二酸脱羧酶；“5”，琥珀酸半醛还原酶；“6”，CoA转移酶；“7”，丁酸激酶；“8”，磷酸转丁酰基酶；“9”，聚羟基烷酸酯合酶；“10”，琥珀酸半醛脱氢酶；“11”，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；“12”，4-羟基丁酰基CoA硫酯酶。
具体实施方式
下文将描述本公开内容的实例实施方式。
本发明提供了一种聚羟基烷酸酯共聚物组合物。该组合物包含多种聚羟基烷酸酯共聚物分子。所述组合物可以是例如：生物质组合物，例如已产生并在其中包含多种聚羟基烷酸酯共聚物分子的生物体；不含非聚羟基烷酸酯生物质的组合物，例如，包含已经从产生了聚羟基烷酸酯共聚物分子的生物体中分离和/或纯化出的该聚羟基烷酸酯共聚物分子的组合物；或生物塑料(bioplastic)组合物，例如，包含聚羟基烷酸酯共聚物分子并且适合作为生物塑料使用的均质或共混的组合物。
所述聚羟基烷酸酯共聚物分子包含3-羟基丁酸酯单体和4-羟基丁酸酯单体。因此，每种聚羟基烷酸酯共聚物分子都既包含3-羟基丁酸酯单体又包含4-羟基丁酸酯单体。这些分子可以通过例如由PHA合酶介导的3-羟基丁酰基CoA与4-羟基丁酰基CoA的共聚来合成，所述共聚产生共聚物(例如聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)共聚物)的分子。示例性的适合的PHA合酶将在下文的实施例中描述。每种聚羟基烷酸酯共聚物分子还可以可选地包含其他额外单体，例如，5-羟基戊酸酯单体，例如，当由PHA合酶介导的3-羟基丁酰基CoA与4-羟基丁酰基CoA的共聚过程中还存在所述额外单体的聚合性前体时就会如此。
聚羟基烷酸酯共聚物分子中的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为23.5％～75％。因此，聚羟基烷酸酯共聚物分子的单体单元的总共23.5％～75％是4-羟基丁酸酯单体，而聚羟基烷酸酯共聚物分子的单体单元中其余25％～76.5％则为3-羟基丁酸酯单体和可选的其他额外单体。在一些实施方式中，单体单元中其余25％～76.5％基本上全部(例如，≥95％或≥99％)是3-羟基丁酸酯单体，而剩下的则是其他额外单体。在一些实施方式中，单体单元的其余25％～76.5％全部都是3-羟基丁酸酯单体，因此聚羟基烷酸酯共聚物分子不包含其他额外单体。因此，例如，特别是就聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)共聚物而言，对于4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为23.5％～75％的聚羟基烷酸酯共聚物分子，该聚羟基烷酸酯共聚物分子的单体单元的其余25％～76.5％为3-羟基丁酸酯单体。确定聚羟基烷酸酯共聚物分子的3-羟基丁酸酯单体和4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比的适合的示例方法在下文的实施例中有所描述。
在一些实施方式中，聚羟基烷酸酯共聚物分子中的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为25％～70％。聚羟基烷酸酯共聚物分子中的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比可以为例如30％～40％、40％～50％、50％～60％或60％～70％。
聚羟基烷酸酯共聚物分子中的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比影响其组合物的性质，例如在熔融温度、断裂伸长率、玻璃化转变温度等方面影响其组合物的性质。例如，当聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比增加到超过10％时，熔融温度会下降至低于130℃，且断裂伸长率会增加至超过400％。Saito Y.等,39 Polym.Int.169(1996)。因此，4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比在上述各范围内的聚羟基烷酸酯共聚物分子可以用来调整组合物以获得特定的所需性质。
聚羟基烷酸酯共聚物分子的生物源含量≥80％。本文所用的术语“生物源含量(biobased content)”是指材料或产品中的生物源碳的量占该材料或产品的总有机碳的重量(质量)百分比，如ASTM D6866-12“使用放射性碳分析来确定固体、液体和气体样品中的生物源含量的标准测试方法”(ASTM International,U.S.,2012)(通过援引将其并入本文中)中所定义的。如ASTM D6866-12所述，总有机碳可包括生物源碳和化石碳。生物源碳是指包含放射性碳(即14C)的有机碳，其中所述放射性碳的含量表明最近通过了现存生物圈循环，例如，最近发生的大气CO2(包含已知百分比的14C)并入有机碳中。化石碳是指不含或几乎不含放射性碳的有机碳，这是因为化石碳的年龄(从大气CO2并入时开始计算)远远长于14C的半衰期，即，全部或基本上全部所并入的14C都已衰变。因此，当应用于聚羟基烷酸酯共聚物分子时，生物源含量是指该聚羟基烷酸酯共聚物分子中的生物源碳的量占该聚羟基烷酸酯共聚物分子中的总有机碳的重量(质量)百分比。聚羟基烷酸酯共聚物分子的生物源含量可以例如根据ASTMD6866-12并特别基于以下方法来测量：确定通过燃烧聚羟基烷酸酯而得到的CO2中的14C和12C的含量，并针对1950年后注入大气中的炸弹14C进行校正。因此，例如，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子的根据ASTM D6866-12测量的生物源含量可以≥80％。还可以使用本领域中已知的测量生物源含量的其他适合的方法。不同的聚羟基烷酸酯共聚物分子之间的生物源含量差异表明了结构差异，即，不同的聚羟基烷酸酯共聚物分子之间的14C与12C之比的差异。
在一些实施方式中，聚羟基烷酸酯共聚物分子的生物源含量≥95％。在一些实施方式中，聚羟基烷酸酯共聚物分子的生物源含量≥99％。在一些实施方式中，聚羟基烷酸酯共聚物分子的生物源含量为100％。因此，例如，聚羟基烷酸酯共聚物分子的根据ASTM D6866-12测量的生物源含量可以≥95％或≥99％或为100％。
具有上述生物源含量的聚羟基烷酸酯共聚物分子可用于制造生物源塑料，该生物源塑料中大部分或全部的化石碳都已换成了可再生的生物源碳，并且还有益于环境。此外，基于与生物源含量差异相关的上述结构差异，具有上述生物源含量的聚羟基烷酸酯共聚物分子能够容易地与不具有上述生物源含量的聚羟基烷酸酯共聚物分子及其他聚合物和化合物区分开，并且还具有监管方面的益处。
聚羟基烷酸酯共聚物分子的重量平均分子量可以为250千道尔顿(kDa)至2.0兆道尔顿(MDa)。聚羟基烷酸酯共聚物分子的分子量可以有所分布，而且聚羟基烷酸酯共聚物分子的组合物的物理性质和流变性质可以随该分布有所变化。聚合物的分子量可以用多种方法来计算。重量平均分子量(亦称作Mw)是各种链长度的重量与链的分子量的乘积之和再除以所有链的总重量(ΣNiMi 2/ΣNiMi)。数量平均分子量(亦称作Mn)是给定长度的链的数量与链的分子量的乘积之和再除以链总数(ΣNiMi/ΣNi)。多分散指数提供了聚合物分子量分布宽度的量度，并且计算为重量平均分子量与数量平均分子量之比。除非上下文另有说明，本文所用的术语“分子量”是指重量平均分子量。
聚羟基烷酸酯共聚物分子的重量平均分子量可以例如利用光散射法和凝胶渗透色谱法与聚苯乙烯标准物来确定。可以用氯仿作为凝胶渗透色谱的洗脱剂和聚羟基烷酸酯的稀释剂。用于确定分子量的校准曲线可以使用线性聚乙烯作为分子量标准物并使用基于作为洗脱体积的函数的对数分子量的校准方法来制作。
在一些实施方式中，例如利用光散射法和凝胶渗透色谱法与聚苯乙烯标准物确定的聚羟基烷酸酯共聚物分子的重量平均分子量为1.5MDa～2.0MDa。在一些实施方式中，例如同样利用光散射法和凝胶渗透色谱法与聚苯乙烯标准物确定的聚羟基烷酸酯共聚物分子的重量平均分子量为1.7MDa～2.0MDa。
出乎意料的是，此处观察到，4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为23.5％～75％(例如25％～70％、30％～40％、40％～50％、50％～60％或60％～70％)的聚羟基烷酸酯共聚物分子可以按下文所述的方法以聚羟基烷酸酯滴度≥生物质滴度的50重量％获得，下文所述的方法例如为在如下所述的一种或多种含碳原料的存在下培养生物体，其中，亦如下文所述，所述生物体已被遗传改造过。更具体而言，已观察到所述聚羟基烷酸酯共聚物分子可以按下述方法以聚羟基烷酸酯滴度超过生物质滴度的50重量％获得：在作为唯一碳源的葡萄糖的存在下培养生物体，因此，不存在作为4-羟基丁酰基CoA的直接前体的化合物和/或通常从不可再生资源制得的化合物。还已观察到，在葡萄糖和1,4-丁二醇(该化合物不但是4-羟基丁酰基CoA的直接前体，并且通常从不可再生资源制得)的存在下培养未经如此遗传改造的生物体的过程中，增加1,4-丁二醇的量虽然可用于使聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比相对更高，但会导致聚羟基烷酸酯共聚物分子的收率和重量平均分子量都相对更低。无意受理论束缚，据信可用下述方法获得的聚羟基烷酸酯共聚物分子的≥生物质滴度的50重量％的聚羟基烷酸酯滴度表明了与聚羟基烷酸酯共聚物分子相关的出乎意料地更高的分子量。重量平均分子量在上述范围内的聚羟基烷酸酯共聚物分子可用来制备具有所需的物理性质和流变性质的聚羟基烷酸酯共聚物组合物。
该组合物的玻璃化转变温度可以是-60℃～-5℃。玻璃化转变温度是在超过该温度时聚合物分子开始进行协调分子运动的温度。在物理上，聚合物模量开始下降数个数量级，直至聚合物最终达到橡胶状状态。在一些实施方式中，组合物的玻璃化转变温度是例如-50℃～-15℃、-50℃～-20℃或-45℃～-15℃。玻璃化转变温度在上述范围内的组合物可以用来确保该组合物在所期望的使用温度下处于橡胶状状态。
所述组合物可以是其中聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比不随聚羟基烷酸酯共聚物分子的分子量的增加而下降的组合物。如上所述，聚羟基烷酸酯共聚物分子可以具有依照其分子量的分布。4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比在个体聚羟基烷酸酯共聚物分子之间可以有所不同。其中聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比不随聚羟基烷酸酯共聚物分子的分子量增加而下降的组合物可以是例如以下组合物：其中，处在分子量分布较高区间的聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比不低于处在分子量分布较低区间的聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比。因此，例如，所述组合物可以是聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比随着聚羟基烷酸酯共聚物分子的分子量增加而基本不变(例如完全不变)的组合物，例如，处在分子量分布较高区间的聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比与处在分子量分布较低区间的聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比基本相同(例如相同)。此外，例如，所述组合物可以是聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比随聚羟基烷酸酯共聚物分子的分子量增加而增加的组合物，例如，处在分子量分布较高区间的聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比高于处在分子量分布较低区间的聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比。
出乎意料的是，此处观察到，4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为23.5％～75％(更特别为约50％～60％)的聚羟基烷酸酯共聚物分子可以按下文所述的方法以生物体培养物中的聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比在生物体培养后期(例如稳定期)不下降的形式获得，例如，在如下所述的一种或多种含碳原料(例如作为唯一碳源的葡萄糖)的存在下培养生物体，其中，亦如下文所述，所述生物体已被遗传改造过。还已观察到，在葡萄糖和1,4-丁二醇的存在下培养未如此遗传改造的生物体的过程中，常见于此类培养后期的1,4-丁二醇减量(例如，其反映出大部分之前存在的1,4-丁二醇已被消耗)导致生物体培养物中的聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比下降，并同时使共聚物分子的重量平均分子量上升。无意受理论束缚，据信按下文所述方法，生物体培养物中的聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比在生物体培养后期不下降，表明在聚羟基烷酸酯共聚物分子中聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比不随聚羟基烷酸酯共聚物分子的分子量增加而下降。聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比不随聚羟基烷酸酯共聚物分子的分子量增加而下降的聚羟基烷酸酯共聚物分子可用来确保其组合物具有一致的结构性质和物理性质。
所述组合物可以是其中聚羟基烷酸酯共聚物分子是使用生物源含量总计≥80％的一种或多种含碳原料在发酵过程中制得的组合物；所述一种或多种含碳原料包含选自由葡萄糖、左旋葡聚糖、蔗糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖及其混合物组成的组的碳源；并且收率大于0.25g聚羟基烷酸酯共聚物分子/g碳源。例如，在一些实施方式中，收率大于0.30g或大于0.35g或大于0.40g聚羟基烷酸酯共聚物分子/g碳源。
制备上述聚羟基烷酸酯共聚物组合物的方法如下所述。
本发明还提供了一种聚合物共混物组合物。所述聚合物共混物组合物包含聚羟基烷酸酯组合物和多种第二聚合物分子。所述聚羟基烷酸酯组合物可以是任何上述聚羟基烷酸酯组合物，例如，包含多种聚羟基烷酸酯共聚物分子的聚羟基烷酸酯共聚物组合物，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子(i)包含3-羟基丁酸酯单体和4-羟基丁酸酯单体、(ii)4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为23.5％～75％、且(iii)生物源含量≥80％。此外，所述聚羟基烷酸酯组合物可以是例如以下组合物，其中，(a)聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为25％～70％、30％～40％、40％～50％、50％～60％或60％～70％，(b)聚羟基烷酸酯共聚物分子的生物源含量≥95％、≥99％或为100％，(c)聚羟基烷酸酯共聚物分子的重量平均分子量为250kDa～2.0MDa、1.5MDa～2.0MDa或1.7MDa～2.0MDa，(d)所述组合物的玻璃化转变温度为-60℃～-5℃、-50℃～-15℃、-50℃～-20℃或-45℃～-15℃，(e)聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比不随聚羟基烷酸酯共聚物分子的分子量的增加而下降，且/或(f)聚羟基烷酸酯共聚物分子是使用生物源含量总计≥80％的上述一种或多种含碳原料在发酵过程中制得的。
所述第二聚合物可以是例如生物源聚合物或非生物源聚合物。适合的生物源聚合物包括例如聚乳酸、聚琥珀酸丁二醇酯、聚琥珀酸己二酸丁二醇酯、聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯和/或聚丙撑碳酸酯，其中，生物源塑料的聚合物源自生物源琥珀酸、生物源己二酸、生物源1,4-丁二醇、生物源聚环氧丙烷和/或二氧化碳。适合的生物源聚合物还包括例如除聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)共聚物外的其他聚羟基烷酸酯，例如，诸如聚3-羟基丁酸酯均聚物和聚4-羟基丁酸酯均聚物等均聚物，诸如聚(3-羟基丁酸酯-co-羟基戊酸酯)和聚(3-羟基丁酸酯-co-羟基己酸酯)等其他共聚物，以及这些聚合物与其他聚羟基烷酸酯的共混物。适合的非生物源聚合物包括例如聚氯乙烯。
基于对机械性质(例如抗张强度、耐穿刺性和伸长率)、热性质(例如热变形温度)和/或光学性质(例如透明度)的优化，聚合物共混物组合物可以用于多种应用，例如，包装膜。其中第二聚合物是生物源聚合物的聚合物共混物组合物可特别用于优化性能性质和实现高生物源含量。其中第二聚合物是聚氯乙烯的聚合物共混物组合物与单独的聚氯乙烯相比具有改进的性质，包括改进的加工性。聚合物共混物组合物可以用本领域中已知的适合方法来共混。
聚合物共混物组合物可以是例如其中聚羟基烷酸酯共聚物分子占聚合物共混物组合物的5重量％～95重量％的聚合物共混物组合物。例如，聚合物共混物组合物可以是其中聚羟基烷酸酯共聚物分子占聚合物共混物组合物的20重量％～40重量％、25重量％～35重量％或28重量％～33重量％的聚合物共混物组合物。聚合物共混物组合物还可以是例如连续相的或双连续相的。聚合物共混物组合物还可以是例如其中聚羟基烷酸酯共聚物分子和第二聚合物分子形成单一相的聚合物共混物组合物，例如，其中第二聚合物是聚氯乙烯。聚合物共混物组合物还可以是例如其中聚羟基烷酸酯共聚物分子和第二聚合物分子形成多于单一相的聚合物共混物组合物，例如，其中第二聚合物是聚乳酸。聚合物共混物组合物还可以比缺乏所述聚羟基烷酸酯共聚物分子的相应组合物具有更低的结晶度，即，最大理论结晶度。
还提供了一种生物质组合物。所述生物质组合物包含聚羟基烷酸酯组合物，例如，任何上述聚羟基烷酸酯组合物，其中，聚羟基烷酸酯共聚物分子占所述生物质组合物的50重量％以上。因此，同样地，所述聚羟基烷酸酯共聚物组合物可以是例如包含多种聚羟基烷酸酯共聚物分子的聚羟基烷酸酯共聚物组合物，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子(i)包含3-羟基丁酸酯单体和4-羟基丁酸酯单体、(ii)4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为23.5％～75％、且(iii)生物源含量≥80％。此外，所述聚羟基烷酸酯组合物可以是例如以下组合物，其中，(a)聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为25％～70％、30％～40％、40％～50％、50％～60％或60％～70％，(b)聚羟基烷酸酯共聚物分子的生物源含量≥95％、≥99％或为100％，(c)聚羟基烷酸酯共聚物分子的重量平均分子量为250kDa～2.0MDa、1.5MDa～2.0MDa或1.7MDa～2.0MDa，(d)所述组合物的玻璃化转变温度为-60℃～-5℃、-50℃～-15℃、-50℃～-20℃或-45℃～-15℃，(e)聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比不随聚羟基烷酸酯共聚物分子的分子量的增加而下降，且/或(f)聚羟基烷酸酯共聚物分子是使用生物源含量总计≥80％的上述一种或多种含碳原料在发酵过程中制得的。
如所注明的，聚羟基烷酸酯共聚物分子占所述生物质组合物的50重量％以上。本文所用“生物质组合物的……重量％”是指所述生物质组合物的干重，例如，细胞干重。聚羟基烷酸酯共聚物分子占所述生物质组合物的例如60重量％以上、70重量％以上、80重量％以上、85重量％以上或90重量％以上。
本发明还提供了制备聚羟基烷酸酯共聚物组合物的方法。同样地，所述聚羟基烷酸酯组合物可以是任何上述聚羟基烷酸酯组合物，例如，包含多种聚羟基烷酸酯共聚物分子的聚羟基烷酸酯共聚物组合物，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子(i)包含3-羟基丁酸酯单体和4-羟基丁酸酯单体、(ii)4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为23.5％～75％、且(iii)生物源含量≥80％。此外，所述聚羟基烷酸酯组合物可以是例如以下组合物，其中，(a)聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为25％～70％、30％～40％、40％～50％、50％～60％或60％～70％，(b)聚羟基烷酸酯共聚物分子的生物源含量≥95％、≥99％或为100％，(c)聚羟基烷酸酯共聚物分子的重量平均分子量为250kDa～2.0MDa、1.5MDa～2.0MDa或1.7MDa～2.0MDa，(d)所述组合物的玻璃化转变温度为-60℃～-5℃、-50℃～-15℃、-50℃～-20℃或-45℃～-15℃，(e)聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比不随聚羟基烷酸酯共聚物分子的分子量的增加而下降，且/或(f)聚羟基烷酸酯共聚物分子是使用生物源含量总计≥80％的上述一种或多种含碳原料在发酵过程中制得的。
所述方法可以包括在下述条件下在一种或多种含碳原料的存在下培养生物体，从而形成所述组合物；在所述条件下，(a)所述一种或多种含碳原料转化为3-羟基丁酰基CoA和4-羟基丁酰基CoA，并且(b)所述3-羟基丁酰基CoA和4-羟基丁酰基CoA聚合形成聚羟基烷酸酯共聚物分子。
所述培养可以包括例如通过发酵、摇瓶培养等方式来培养生物体。发酵可以以例如从实验室规模(例如1L)至工业生产规模(例如20,000～100,000L)的规模来进行。其他适合的培养方法将在下文的实施例中描述。
所述生物体可以是例如微生物株或藻类株。适合的微生物株包括例如大肠杆菌菌株或富养产碱菌(Ralstonia eutropha)菌株。适合的藻类株包括例如小球藻属(Chlorella)的株。其他适合的生物体将在下文的实施例中描述。
一种或多种含碳原料可以包括可用于工业过程(从而例如为发酵过程的细胞提供碳或其他能源)的含碳原料和/或可再生的含碳原料(例如，源自活的生物体或其代谢副产物的材料，包括源自生物质的材料，通常由未充分使用的组分构成，例如谷壳或秸秆)。例如，所述一种或多种含碳原料可包含选自由葡萄糖、左旋葡聚糖、蔗糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖及其混合物组成的组的碳源。此外，例如，所述一种或多种含碳原料可包含糖蜜、淀粉、脂肪酸、植物油、木质纤维素材料、乙醇、乙酸、甘油、源自生物质的合成气和源自填埋气(landfill gas)的甲烷中的一种或多种。
进一步考虑一种或多种含碳原料，在一些实施方式中，所述一种或多种含碳原料可以基本上由选自由葡萄糖、左旋葡聚糖、蔗糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖及其混合物组成的组的碳源构成。在一些实施方式中，所述一种或多种含碳原料可以由选自由葡萄糖、左旋葡聚糖、蔗糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖及其混合物组成的组的碳源构成。因此，在一些实施方式中，所述一种或多种含碳原料可以基本上由单一碳源(例如葡萄糖)构成。此外，在一些实施方式中，所述一种或多种含碳原料可以由单一碳源(同样例如葡萄糖)构成。
所述一种或多种含碳原料还可以排除特定化合物，例如作为4-羟基丁酰基CoA的直接前体的化合物，和/或因为与从可再生资源(例如作物)制备相比成本明显更低而通常从不可再生资源制备(例如，从石油制备)的化合物。在聚羟基烷酸酯共聚物分子的制备中采用此类化合物可能非常消耗成本(特别是对于工业生产规模(例如使用20,000～100,000L的容器进行发酵)而言，因为这需要额外的进料并因此需要基础设施和质量控制)，而且还会需要更严格的控制来获得具有结构一致性的聚羟基烷酸酯共聚物组合物。所述一种或多种含碳原料可以是例如不包含γ-丁内酯、1,4-丁二醇、4-羟基丁酸、3-羟基丁酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸、苹果酸、延胡索酸、柠檬酸、琥珀酸或3羟基丁酸并因此排除了这些化合物中的每一个的含碳原料。因此，例如，生物体的培养可以在不存在γ-丁内酯、1,4-丁二醇、4-羟基丁酸、3-羟基丁酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸、苹果酸、延胡索酸、柠檬酸、琥珀酸和3-羟基丁酸的情况下进行，即，在培养之前、过程中或之后都不从外部添加任何这些化合物。
所述条件可以是在例如温度、氧合作用、生物体的初始滴度、培养时间等方面对于培养生物体而言适合的(例如常见的和/或最佳的)条件。示例性的适合条件将在下文的实施例中描述。
如实施例中所详述的，生物体所表达的酶可以将一种或多种含碳原料转化为3-羟基丁酰基CoA和4-羟基丁酰基CoA。同样如实施例中所详述的，生物体所表达的酶还可以使3-羟基丁酰基CoA和4-羟基丁酰基CoA聚合形成聚羟基烷酸酯共聚物分子，从而形成所述组合物。
根据该方法，所述生物体已被遗传改造成包含聚羟基烷酸酯合酶、乙酰基CoA乙酰基转移酶、乙酰乙酰基CoA还原酶、琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酸半醛还原酶和CoA转移酶的酶活性，并且不包含NAD+依赖型琥珀酸半醛脱氢酶和/或NADP+依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的酶活性。
通过例如用编码各种酶活性的一个或多个基因转化生物体，可以将所述生物体遗传改造成包含聚羟基烷酸酯合酶、乙酰基CoA乙酰基转移酶、乙酰乙酰基CoA还原酶、琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酸半醛还原酶和CoA转移酶的酶活性。例如，这些基因可以稳定地并入生物体中，例如通过导入一个或多个稳定质粒和/或通过整合到生物体的基因组中。还可以通过例如以下方法将生物体遗传改造成包含酶活性：通过例如将天然存在的启动子置换成更强的启动子和/或通过消除阻遏因子序列，来改变编码各种酶活性的一个或多个基因的启动子区域。此外，可以使用这些方法的组合，等等。使用例如上述方法可以以高稳定性(例如，超过50代的所述生物体)和对于工业生产(例如，用20,000～100,000L的容器进行发酵)而言足够的高表达水平将基因并入生物体中。适合的示例性方法将在下文的实施例中更详细描述。
使用以下方法还可以将生物体遗传改造成不含NAD+依赖型琥珀酸半醛脱氢酶和/或NADP+依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的酶活性：将一个或多个抑制性突变或序列导入生物体中以抑制上述两种活性或其中一种活性的表达；从生物体的基因组中删除编码上述两种活性或其中一种活性的相应基因；通过同源重组来部分破坏或完全破坏上述两种相应基因或其中一种基因；和/或通过例如表达干扰相应基因表达的siRNA来干扰上述两种相应基因或其中一种基因的表达。适合的示例性方法将在下文的实施例中更详细描述。
根据该方法，可以将所述生物体进一步遗传改造成包含α-酮戊二酸脱羧酶或2-氧代戊二酸脱羧酶以及L-1,2-丙二醇氧化还原酶的酶活性。还可以将所述生物体遗传改造成不包含硫酯酶II、多功能酰基CoA硫酯酶I和蛋白酶I和溶血磷脂酶L、酰基CoA硫酯酶和醛脱氢酶中的一种或多种的酶活性。
此外，根据该方法，所述一种或多种含碳原料总共的生物源含量≥80％。其意思是一种或多种含碳原料中的总共的生物源碳的量大于或等于所有这些一种或多种含碳原料的总有机碳的重量(质量)的80％。因此，例如，一种或多种含碳原料的根据ASTM D6866-12测量的总共的生物源含量可以≥80％。这可以通过以下方式来实现：例如，包含至少一种对应于可再生资源的含碳原料，例如，葡萄糖、左旋葡聚糖、蔗糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖及其混合物，以使得该可再生资源的生物源含量为100％，并使得所述一种或多种含碳原料的总有机碳的重量(质量)的80％以上都对应于所述可再生资源。所述一种或多种含碳原料总共的生物源含量例如可以≥95％、≥99％或为100％。
该方法还可以包括将聚羟基烷酸酯共聚物分子从生物体中分离出以使得聚羟基烷酸酯共聚物组合物基本不含所述生物体。用于进行这种分离的适合的示例性方法在本领域中是已知的。
本发明还提供了根据上述方法制造的聚羟基烷酸酯共聚物组合物。所述聚羟基烷酸酯共聚物组合物可以是例如包含多种聚羟基烷酸酯共聚物分子的聚羟基烷酸酯共聚物组合物，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子(i)包含3-羟基丁酸酯单体和4-羟基丁酸酯单体、(ii)4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为23.5％～75％、且(iii)生物源含量≥80％。此外，所述聚羟基烷酸酯组合物可以是例如以下组合物，其中，(a)聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为25％～70％、30％～40％、40％～50％、50％～60％或60％～70％，(b)聚羟基烷酸酯共聚物分子的生物源含量≥95％、≥99％或为100％，(c)聚羟基烷酸酯共聚物分子的重量平均分子量为250kDa～2.0MDa、1.5MDa～2.0MDa或1.7MDa～2.0MDa，(d)所述组合物的玻璃化转变温度为-60℃～-5℃、-50℃～-15℃、-50℃～-20℃或-45℃～-15℃，(e)聚羟基烷酸酯共聚物分子的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比不随聚羟基烷酸酯共聚物分子的分子量的增加而下降，且/或(f)聚羟基烷酸酯共聚物分子是使用生物源含量总计≥80％的上述一种或多种含碳原料在发酵过程中制得的。
实施例
本技术通过以下实施例来进一步阐述，但绝不能将这些实施例理解为是限制性的。这些实施例描述了用于构建产生所关注的产品的株的多种技术工具和方法。描述了这些实施例中所用的适合的宿主株、潜在来源和一系列重组基因，用于控制重组基因表达的适合的染色体外载体、适合的策略和调控元件，以及用于在宿主生物体中过表达基因或使来自宿主生物体的基因失活的选定的构建技术。这些技术工具和方法是本领域的技术人员熟知的。
适合的宿主株
在一些实施方式中，宿主株是大肠杆菌K-12株LS5218(Spratt等,J.Bacteriol.146(3):1166-1169(1981)；Jenkins和Nunn,J.Bacteriol.169(1):42-52(1987))或MG1655株(Guyer等,Cold Spr.Harb.Symp.Quant.Biol.45:135-140(1981))。其他合适的大肠杆菌K-12宿主株包括但不限于WG1和W3110(Bachmann Bacteriol.Rev.36(4):525-57(1972))。作为另一选择，大肠杆菌株W(Archer等,BMC Genomics 2011,12:9doi:10.1186/1471-2164-12-9)或大肠杆菌株B(Delbruck和Luria,Arch.Biochem.1:111-141(1946))及其衍生株例如REL606(Lenski等,Am.Nat.138:1315-1341(1991))是其他适合的大肠杆菌宿主株。
其他示例性微生物宿主株包括但不限于：富养产碱菌、生枝动胶菌(Zoogloearamigera)、酒色异着色菌(Allochromatium vinosum)、赤红球菌(Rhodococcus ruber)、食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、集胞藻属物种(Synechocystis sp.)PCC 6803、细长聚球蓝细菌(Synechococcus elongates)PCC 7942、普氏荚硫菌(Thiocapsa pfenigii)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)、克氏梭菌(Clostridiumkluyveri)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、珊瑚诺卡菌(Nocardiacorralina)、橙红诺卡菌(Nocardia salmonicolor)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)、假单胞菌属物种(Pseudomonassp.)6-19、假单胞菌属物种61-3和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)、广泛产碱菌(Alcaligenes latus)、催产克雷白杆菌(Klebsiellaoxytoca)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens)、菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡萄糖菌(Gluconobacter oxydans)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、乳乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)和丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。示例性的酵母或真菌包括选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillus niger)和巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)的物种。
示例性的藻类株物种包括但不限于：小球藻属株物种，其选自：微小小球藻(Chlorella minutissima)、浮水小球藻(Chlorella emersonii)、富油小球藻(Chlorellasorokiniana)、椭圆形小球藻(Chlorella ellipsoidea)、小球藻属物种或原始小球藻(Chlorella protothecoides)。
重组基因的来源
编码PHB-co-4HB途径酶的核酸的来源可以包括例如其所编码的基因产物能够催化上述反应的任何物种。此类物种包括原核生物和真核生物，包括但不限于细菌(包括古细菌和真细菌)和真核生物(包括酵母、植物、昆虫、动物和哺乳动物，包括人)。此类来源的示例性物种包括例如：大肠杆菌、酿酒酵母、克鲁费酵母(Saccharomyceskluyveri)、集胞藻属物种PCC 6803、细长聚球蓝细菌PCC 7942、聚球蓝细菌属物种PCC 7002、嗜热蓝藻属物种(Chlorogleopsis sp.)PCC 6912、橙色绿屈挠菌(Chloroflexusaurantiacus)、克氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperjringens)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、假破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、氨基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)、近端梭菌(Clostridium subterminale)、斯氏梭菌(Clostridium sticklandii)、富养产碱菌、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、龈紫单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、假单胞菌属物种(包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、荧光假单胞菌)、微小小球藻、浮水小球藻、富油小球藻、椭圆形小球藻、小球藻属物种或原始小球藻、智人、日本大耳白兔(Oryctolaguscuniculus)、球形红杆菌、布氏热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)、勤奋生金球菌(Metallosphaera sedula)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、卡氏玫瑰弯菌(Roseiflexus castenholzii)、赤杆菌属(Erythrobacter)、加州希蒙得木(Simmondsiachinensis)、不动杆菌属物种(包括乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)和贝氏不动杆菌)、床田氏硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)、枯草杆菌、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、小眼虫(Euglena gracilis)、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、喜温海洋杆菌(Thermotogamaritima)、盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarum)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)、野猪(Sus scrofa)、漂亮新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、乳乳球菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、念珠菌属物种(Candida sp.)、土曲霉、戊糖片球菌(Pedicoccus pentosaceus)、运动发酵单胞菌、巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurians)、乳酸克鲁维酵母、巴克氏真杆菌(Eubacterium barkeri)、多毛拟杆菌(Bacteroidescapillosus)、人肠道厌氧棒状菌(Anaerotruncus colihominis)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)、具核梭杆菌(Fusobacterium nuleatum)、黄青霉(Penicillium chrysogenum)、海洋γ蛋白菌和产丁酸细菌。例如，具有PHB-co-4HB生物合成的微生物宿主(例如，生物体)在本文参照大肠杆菌宿主来例示。然而，基于现在可获得的超过550种物种的全基因组序列(其中超过一半可以在例如NCBI等公共数据库上获得)，其中包括395种微生物基因组和多种酵母、真菌、植物和哺乳动物基因组，在亲缘关系相近或遥远的物种的一个或多个基因中鉴定出编码所需的PHB-co-4HB生物合成活性的基因(包括例如对已知基因的同源基因、直系同源基因、旁系同源基因和非直系同源基因置换，以及生物体之间的遗传变异的易位)是常规的并且在本领域是为人熟知的。因此，使得能够在特定生物体(例如大肠杆菌)中生物合成PHB-co-4HB和本文所公开的其他化合物的代谢改变能够容易地应用于其他生物体，同样包括原核生物体和真核生物体。鉴于本文给出的教导和指导，本领域的技术人员将知晓在一种生物体中例示的代谢改变可以等同地应用于其他生物体。
制备产生4HB的转基因宿主
使用本领域已知的常规技术进行遗传改造以获得产生PHB-co-4HB的转基因(重组)宿主。针对产生PHB-co-4HB的宿主株而克隆和/或评估的基因示于下表1A中，还显示了适当的酶学委员会编号(EC编号)及参考文献。一些基因是为了优化密码子而合成的，而另一些是从天然或野生型宿主的基因组DNA中通过PCR克隆出的。本文所用的“异源”是指来自另一宿主。宿主可以是相同或不同的物种。图1是产生PHB-co-4HB的示例性途径。
表1A.根据图1的在产生PHB-co-4HB的微生物宿主株中过多产生或缺失的基因。基因名称后的星号(*)表示该核苷酸序列已针对在大肠杆菌中的表达优化过。
能够催化表1A中所列的反应的其他蛋白可以通过查询科技文献、专利、BRENDA检索(http://www.brenda-enzymes.info/)和/或在例如NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)的核苷酸或蛋白数据库上进行BLAST检索来发现。随后可以产生合成基因来提供从序列数据库到实质DNA的便捷路径。这些合成基因是从头开始设计和制造的，使用了密码子来增强异源蛋白的表达，并且优化了表达系统和宿主所需的特性。诸如DNA 2.0(Menlo Park,CA 94025,USA)等公司将提供此类常规服务。可以催化表1A中所列的一些生化反应的蛋白提供在表1B～1X中。
表1B.PhaA5蛋白(β-酮硫解酶，来自生枝动胶菌，EC编号2.3.1.9，其作用于乙酰基CoA+乙酰基CoA以产生乙酰乙酰基CoA；蛋白登记号2VU2_A)的适合的同源物。
表1C.PhaB5蛋白(乙酰乙酰基CoA还原酶，来自生枝动胶菌，EC编号1.1.1.36，其作用于乙酰乙酰基CoA以产生3-羟基丁酰基CoA；蛋白登记号P23238)的适合的同源物。
表1D.SucD蛋白(琥珀酸半醛脱氢酶，来自克氏梭菌，EC编号1.2.1.76，其作用于琥珀酰基CoA以产生琥珀酸半醛；蛋白登记号YP_001396394)的适合的同源物。
表1E.KgdM蛋白(α-酮戊二酸脱羧酶，来自结核分枝杆菌，EC编号4.1.1.71，其作用于α-酮戊二酸以产生琥珀酸半醛和二氧化碳；蛋白登记号NP_335730)的适合的同源物。
表1F.KgdP蛋白(α-酮戊二酸脱羧酶，来自食二噁烷假单胞菌(Pseudonocardiadioxanivorans)CB1190，EC编号4.1.1.n，其作用于α-酮戊二酸以产生琥珀酸半醛和二氧化碳；蛋白登记号YP_004335105)的适合的同源物。
表1G.KgdS蛋白(2-氧代戊二酸脱羧酶，来自聚球蓝细菌属物种PCC 7002，EC编号4.1.1.n，其作用于α-酮戊二酸以产生琥珀酸半醛和二氧化碳；蛋白登记号ACB00744.1)的适合的同源物。
表1H.SsaRAt蛋白(琥珀酸半醛还原酶，来自拟南芥，EC编号1.1.1.61，其作用于琥珀酸半醛以产生4-羟基丁酸；蛋白登记号AAK94781)的适合的同源物。
表1I.FucOI6L-L7V蛋白(L-1,2-丙二醇氧化还原酶，来自大肠杆菌K-12株MG1655亚株，EC编号1.1.1.77，其作用于琥珀酸半醛以产生4-羟基丁酸)的适合的同源物。
表1J.OrfZ蛋白(CoA转移酶，来自克氏梭菌DSM 555，EC编号2.8.3.n，其作用于4-羟基丁酸以产生4-羟基丁酰基CoA；蛋白登记号AAA92344)的适合的同源物。
表1K.OrfZ150蛋白(CoA转移酶，来自龈紫单胞菌W83，EC编号2.8.3.n，其作用于4-羟基丁酸以产生4-羟基丁酰基CoA；蛋白登记号NP_904965)的适合的同源物。
表1L.Buk1蛋白(丁酸激酶I，来自丙酮丁醇梭菌ATCC824，EC编号2.7.2.7，其作用于4-羟基丁酸以产生4-羟基丁酰基磷酸)的适合的同源物。
表1M.Buk2蛋白(丁酸激酶II，来自丙酮丁醇梭菌ATCC824，EC编号2.7.2.7，其作用于4-羟基丁酸以产生4-羟基丁酰基磷酸)的适合的同源物。
表1N.Ptb蛋白(磷酸转丁酰基酶，来自丙酮丁醇梭菌ATCC824，EC编号2.3.1.19，其作用于4-羟基丁酰基磷酸以产生4-羟基丁酰基CoA)的适合的同源物。
表1O.PhaC3/C5蛋白(聚羟基烷酸酯合酶融合蛋白，来自恶臭假单胞菌和生枝动胶菌，EC编号2.3.1.n，其作用于(R)-3-羟基丁酰基CoA或4-羟基丁酰基CoA+[(R)-3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯]n以产生[(R)-3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯](n+1)+CoA，还作用于4-羟基丁酰基CoA+[4-羟基丁酸酯]n以产生[4-羟基丁酸酯](n+1)+CoA)的适合的同源物。
表1P.PhaC3/C1蛋白(聚羟基烷酸酯合酶融合蛋白，来自恶臭假单胞菌和富养产碱菌JMP134，EC编号2.3.1.n，其作用于(R)-3-羟基丁酰基CoA或4-羟基丁酰基CoA+[(R)-3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯]n以产生[(R)-3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯](n+1)+CoA，还作用于4-羟基丁酰基CoA+[4-羟基丁酸酯]n以产生[4-羟基丁酸酯](n+1)+CoA)的适合的同源物。
表1Q.PhaC3/C33蛋白(聚羟基烷酸酯合酶融合蛋白，来自恶臭假单胞菌和食酸代尔夫特菌89-11-102，EC编号2.3.1.n，其作用于(R)-3-羟基丁酰基CoA或4-羟基丁酰基CoA+[(R)-3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯]n以产生[(R)-3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯](n+1)+CoA，还作用于4-羟基丁酰基CoA+[4-羟基丁酸酯]n以产生[4-羟基丁酸酯](n+1)+CoA)的适合的同源物。
表1R.YneI(Sad)蛋白(琥珀酸半醛脱氢酶，NAD+依赖型，来自大肠杆菌K-12株MG1655亚株，EC编号1.2.1.24，其作用于戊二酸半醛(琥珀酸半醛)以产生戊二酸(琥珀酸)；蛋白登记号NP_416042(Fuhrer等,J Bacteriol.2007Nov；189(22):8073-8.Dennis和Valentin,美国专利6,117,658))的适合的同源物。
表1S.GabD蛋白(琥珀酸半醛脱氢酶，NADP+依赖型，来自大肠杆菌K-12株MG1655亚株，EC编号1.2.1.20，其作用于戊二酸半醛(或琥珀酸半醛)以产生戊二酸(或琥珀酸)；蛋白登记号NP_417147(Riley等,Nucleic Acids Res.34(1),1-9(2006)))的适合的同源物。
表1T.AstD蛋白(醛脱氢酶，来自大肠杆菌K-12株MG1655亚株，EC编号1.2.1.71，其作用于琥珀酸半醛以产生琥珀酸；蛋白登记号NP_416260)的适合的同源物。
表1U.Ppc蛋白的适合的同源物(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，来自大肠杆菌K-12株MG1655亚株，EC编号4.1.1.31，其作用于磷酸烯醇丙酮酸和二氧化碳以产生草酰乙酸；蛋白登记号NP_418391)。
表1V.TesA蛋白(多功能酰基CoA硫酯酶I和蛋白酶I和溶血磷脂酶L1，来自大肠杆菌K-12株MG1655亚株，EC编号3.1.1.5和3.1.2.14，其作用于4-羟基丁酰基CoA以产生4-羟基丁酸；蛋白登记号NP_415027)的适合的同源物。
表1W.TesB蛋白(硫酯酶II，来自大肠杆菌K-12株MG1655亚株，EC编号3.1.2.20，其作用于4-羟基丁酰基CoA以产生4-羟基丁酸；蛋白登记号ZP_08342109)的适合的同源物。
表1X.TciA蛋白(酰基CoA硫酯酶，来自大肠杆菌K-12株MG1655亚株，EC编号3.1.2.20，其作用于4-羟基丁酰基CoA以产生4-羟基丁酸；蛋白登记号NP_415769)的适合的同源物。
适合的染色体外载体和质粒
本文所用的“载体”是染色体外的复制子，例如质粒、噬菌体和粘粒，其中可以插入其他DNA片段以使所插入的片段得以复制。载体的拷贝数随载体的复制起点和尺寸而有所不同。具有不同的复制起点的载体可以在同一微生物细胞中增殖，除非它们在亲缘关系上非常接近，例如pMB1和ColE1。表达重组蛋白的适合的载体可以是：具有pMB1复制起点的每个细胞有500～700个拷贝的pUC载体，具有ColE1复制起点的每个细胞有300～500个拷贝的pBluescript载体，具有pMB1复制起点的每个细胞有15～20个拷贝的pBR322及衍生物，具有p15A复制起点的每个细胞有10～12个拷贝的pACYC及其衍生物，和具有pSC101复制起点的每个细胞有约5个拷贝的pSC101及衍生物，如质粒纯化手册中所描述(见以下www网址：//kirshner.med.harvard.edu/files/protocols/QIAGEN_QIAGENPlasmidPurification_EN.pdf)。一种广泛使用的载体是pSE380，其使得可以从IPTG可诱导的trc启动子开始表达重组基因(Invitrogen,La Jolla,CA)。
用于重组基因表达的适合的策略和表达控制序列
实现重组基因在大肠杆菌中的表达的策略已在文献中深入描述(Gross,ChimicaOggi 7(3):21-29(1989)；Olins和Lee,Cur.Op.Biotech.4:520-525(1993)；Makrides,Microbiol.Rev.60(3):512-538(1996)；Hannig和Makrides,Trends in Biotech.16:54-60(1998))。表达控制序列可以包括本领域中熟知的组成型启动子和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。适合的启动子包括但不限于Plac、Ptac、Ptrc、PR、PL、PphoA、Para、PuspA、PrpsU、Psyn(Rosenberg和Court,Ann.Rev.Genet.13:319-353(1979)；Hawley和McClure,Nucl.Acids Res.11(8):2237-2255(1983)；Harley和Raynolds,Nucl.AcidsRes.15:2343-2361(1987)；还可见于www网址ecocyc.org和partsregistry.org)。
示例性的启动子有：
PsynA(5’-TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGC-3’)(SEQ ID NO:1)、PsynC(5’-TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTACTGTGCTAGC-3’)(SEQ ID NO:2)、PsynE(5’-TTTACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATTATGCTAGC-3’)(SEQ ID NO:3)、PsynH(5’-CTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGC-3’)(SEQ ID NO:4)、PsynK(5’-TTTACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAATGCTAGC-3’)(SEQ ID NO:5)、PsynM(5’-TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGGACTATGCTAGC-3’)(SEQ ID NO:6)、Px(5’-TCGCCAGTCTGGCCTGAACATGATATAAAAT-3’)(SEQ ID NO:7)、PuspA(5’-AACCACTATCAATATATTCATGTCGAAAATTTGTTTATCTAACGAGTAAGCAAGGCGGATTGACGGATCATCCGGGTCGCTATAAGGTAAGGATGGTCTTAACACTGAATCCTTACGGCTGGGTTAGCCCCGCGCACGTAGTTCGCAGGACGCGGGTGACGTAACGGCACAAGAAACG-3’)(SEQ ID NO:8)、PrpsU(5’-ATGCGGGTTGATGTAAAACTTTGTTCGCCCCTGGAGAAAGCCTCGTGTATACTCCTCACCCTTATAAAAGTCCCTTTCAAAAAAGGCCGCGGTGCTTTACAAAGCAGCAGCAATTGCAGTAAAATTCCGCACCATTTTGAAATAAGCTGGCGTTGATGCCAGCGGCAAAC-3’)(SEQ ID NO:9)、PsynAF7(5’–TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGC–3’)(SEQ ID NO:10)、和PsynAF3(5’–TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAATGCTAGC–3’)(SEQ ID NO:11)。
示例性的终止子有：
TtrpL(5’-CTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGAACAAAA-3’)(SEQ ID NO:12:)、T1006(5-AAAAAAAAAAAACCCCGCTTCGGCGGGGTTTTTTTTTT-3’)(SEQ ID NO:13)、TrrnB1(5-ATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTAT-3’)(SEQ ID NO:14)、和TrrnB2(5-AGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTT-3’)(SEQID NO:15)。
重组宿主的构建
包含编码将碳底物转化为PHB-co-4HB的酶途径的必要基因的重组宿主可以使用本领域中熟知的技术来构建。
从来源生物体(宿主)获得所需基因的方法是分子生物学领域中常见和熟知的。此类方法在例如以下文献中有所描述：Sambrook等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；Ausubel等,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)。例如，如果基因序列已知，那么可以使用聚合酶链式反应(Mullis，美国专利4,683,202)用对所关注的基因有特异性的引物从基因组DNA中扩增出该DNA，从而获得大量的适合于连接到适当的载体中的DNA。作为另一选择，为了考虑宿主生物体的密码子偏好以增强异源蛋白的表达，可以用化学手段从新合成所关注的基因。对于诸如启动子和转录终止子等表达控制序列，可以使用包含这些序列的经改造的引物通过聚合酶链式反应来将其连接至所关注的基因。另一种方法是利用限制性内切酶酶切和连接以正确的顺序将分离的基因导入已包含必要的控制序列的载体中。后一种方法的一个实例是BioBrickTM技术(www.biobricks.org)，其中可以使用相同的两个限制性位点以标准化方式将多个DNA片段按顺序组装到一起。
除了使用载体外，使用靶向方法或随机方法，将碳底物酶促转化为PHB-co-4HB所必需的基因可以通过整合到染色体中的方式来导入宿主生物体中。为了靶向整合到染色上的特定位点，使用最初由Datsenko和Wanner描述的通常称作Red/ET重组工程技术的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97,6640-6645)。随机整合到染色体中包括使用Huisman等描述的mini-Tn5转座子介导的方法(美国专利6,316,262和6,593,116)。
培养宿主以产生PHB-co-4HB生物质
通常，在带有碳源和其他必需营养的培养基中培养重组宿主，从而以分批方式或使用本领域中已知的连续操作法通过发酵技术产生PHB-co-4HB生物质。为了实现所需的生长条件，还可以包含额外的添加剂，例如，抗泡剂等。发酵对于大规模生产而言特别有用。示例性的方法使用生物反应器来进行培养并将发酵液加工成所需的产物。其他技术(例如分离技术)可以与发酵组合，以进行大规模和/或连续的生产。
本文所用的术语“喂料(feedstock)”是指在工业过程中用作含碳原料的物质。当在提及生物体(例如微生物或藻类生物体)的培养(例如细胞的发酵过程)时使用该术语时，该术语是指用来为细胞供应碳或其他能源的原料。可用于产生PHB-co-4HB的碳源包括简单的、廉价的来源，例如单独或组合使用的葡萄糖、左旋葡聚糖、蔗糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖和阿拉伯糖等。在其他实施方式中，喂料是糖蜜、淀粉、脂肪酸、植物油和木质纤维素材料等，同样为单独或组合使用。在其他实施方式中，喂料可以是单独或组合使用的乙醇、乙酸和甘油等。还可以使用生物体来产生PHB-co-4HB生物质，其利用从可再生生物质资源产生的合成气(CO2、CO和氢气)(即，源自生物质的合成气)和/或源自填埋气的甲烷而生长。
导入PHB-co-4HB途径基因使得在利用容易获得且廉价的喂料时具有灵活性。“可再生”喂料是指可再生能源，例如源自活生物体或其代谢副产物的材料，包括源自生物质的材料，通常由未充分使用的组分构成，例如谷壳或秸秆。为了作为可再生喂料使用而特别生长的农产品包括例如玉米、大豆、柳枝稷和树木(例如杨树)、小麦、亚麻子和油菜籽、甘蔗和棕榈油。作为可再生能源和原料，基于作物的农产品喂料是正在减少的油储备的最终替代者。植物使用太阳能和二氧化碳固定来制造成千上万的复杂而有功能的生物化学物质，超过了现代合成化学目前的能力。这些包括精细和散装的化学品、药品、营养品、黄酮类、维生素、香料、聚合物、树脂、油、食品添加剂、生物着色剂、粘合剂、溶剂和润滑剂。
从生物质中提取PHB-co-4HB共聚物
如美国专利7,713,720和7,252,980所述来提取PHB-co-4HB共聚物。
使用凝胶渗透色谱法(GPC)确定分子量
使用配备有折射率检测器的Waters Alliance HPLC系统通过凝胶渗透色谱法来估算PHA的分子量。柱组是一组三个PLGel 10μm Mixed-B(Polymer Labs,Amherst,MA)柱，以氯仿为流动相，以1ml/min泵送。该柱组用窄分布的聚苯乙烯标准物来校准。在60℃下将PHA样品以2.0mg/ml的浓度溶解在氯仿中。用0.2μm的特弗隆注射器过滤器过滤该样品。使用50μl的进样体积来进行分析。用Waters Empower GPC分析软件来分析色谱图。将分子量报告为聚苯乙烯当量分子量。
测量热性质
使用带自动采样器的TA Instruments Q100差示扫描量热计(DSC)测量PHB-co-4HB共聚物的玻璃化转变。小心地称量8～12mg PHA样品并置于铝盘中，并用铝盖密封。随后在氮气吹扫下将该样品置于DSC中，并用热-冷-热循环来分析。加热/冷却范围为-80℃～200℃，其中加热速率为10℃/min，冷却速率为5℃/min。
确定生物源含量
基于ASTM D6866使用放射碳定年来测量PHB-co-4HB共聚物的生物源含量。ASTM D6866是获得美国农业部许可的用于确定天然范围的材料的可再生/生物源含量的方法。该方法给出了产品或混合燃料中的化石碳含量相对于可再生或生物质碳含量的百分比测定值。ASTM D6866被广泛用于确认生物塑料的生物源含量。
实施例1：从作为唯一碳源的葡萄糖产生4HB共聚单体含量为50％以上的PHB-co-4HB
该实施例示出了在经改造的大肠杆菌宿主细胞中从作为唯一碳源的葡萄糖产生4HB共聚单体含量为50％以上的PHB-co-4HB。该实施例中使用的菌株列于表2中。所有这些菌株都使用上文所述的熟知的技术工具和方法来构建。除了31和32号菌株之外，它们都包含yneI和gabD的染色体缺失；31和32号菌株还包含tesB、tesA、yciA和astD的染色体缺失。
表2.实施例1中使用的菌株。
这些菌株在摇动平板测定中评估。生产培养基由1×E2最少量盐、1×E0最少量盐、5mM MgSO4和1×痕量盐溶液组成。对于31、32和33号菌株而言碳源由40g/L葡萄糖构成，而对于实施例1～5中的所有其他菌株而言，葡萄糖浓度为20g/L。50×E2母液由1.28M NaNH4HPO4·4H2O、1.64M K2HPO4和1.36M KH2PO4组成。50×E0母液由1.28M Na2HPO4、1.64M K2HPO4和1.36M KH2PO4组成。1000×痕量盐溶液通过在每升中添加1.5N HCl:50g FeSO4·7H2O、11g ZnSO4·7H2O、2.5g MnSO4·4H2O、5gCuSO4·5H2O、0.5g(NH4)6Mo7O24·4H2O、0.1g Na2B4O7和10g CaCl2·2H2O而制备。
为了检验PHB-co-4HB的产生，以三等分方式在包含3ml LB和适当的抗生素的无菌管中培养各菌株过夜。培养完成后，从管中取出60μl并随后添加到1440μl生产培养基中。随后将所得到的1500μl培养液作为500μl等分样品添加到Duetz深孔平板的三个孔中。除31、32和33号菌株外，对于实施例1～5中的所有菌株，于37℃在摇动下温育摇动平板6小时，随后转换到30℃在摇动下温育40小时；对于31、32和33号菌株，于37℃在摇动下温育6小时，随后转换到28℃在摇动下温育42小时。随后，将来自三个孔的培养液合并(共计1.5ml)，并分析聚合物含量。在实验最后，于4150rpm离心沉降培养物，用蒸馏水洗涤一次，于-80℃冷冻至少30分钟，并过夜冻干。次日，量取冻干的细胞团块并加入玻璃试管中，随后加入3ml由99.9％正丁醇和4.0N的HCl二噁烷溶液的等体积混合物组成的丁醇分解试剂(以2mg/ml二苯甲烷作为内参标准)。试管封盖之后，将其快速涡旋振荡并置于设为93℃的加热块上6小时，期间定期进行涡旋振荡。随后，使试管冷却至室温，而后添加3ml蒸馏水。将试管涡旋振荡约10秒，随后于620rpm下离心沉降2分钟(Sorvall Legend RT台式离心机)。将1ml有机相抽吸至GC小管中，随后用气相色谱-火焰离子化检测(GC-FID)(Hewlett-Packard 5890 Series II)来进行分析。通过与3HB和4HB的标准曲线(针对PHB-co-4HB分析)进行比较来确定细胞团块中的PHA的量。4HB标准曲线通过向单独的丁醇分解反应中添加不同量的10％的γ-丁内酯(GBL)丁醇溶液来产生。3HB标准曲线通过向单独的丁醇分解反应中添加不同量的99％的3-羟基丁酸乙酯来产生。
如上所述以三等分样式进行对PHB-co-4HB产生的所有检验。在不同的日期对一些菌株的聚合物产生以此方式进行检验。所测试的每个菌株的代表性结果示于表3中，这些结果证明每个共聚物组合物的％4HB含量为50％以上。
表3.从微生物株产生PHB-co-4HB聚合物
*没有重复测量
实施例2：从作为唯一碳源的葡萄糖产生4HB共聚单体含量为40％～50％的PHB-co-4HB
该实施例示出了在经改造的大肠杆菌宿主细胞中从作为唯一碳源的葡萄糖产生4HB共聚单体含量为40％～50％的PHB-co-4HB。该实施例中使用的菌株列于表4中。所有这些菌株都使用上文所述的熟知的技术工具和方法来构建。它们都包含yneI和gabD的染色体缺失。
表4.实施例2中使用的菌株。
| 菌株 | 操纵子构成 |
| 23 | Px-phaC3/C33*-TtrpL-PuspA-phaA5-phaB5-ssaRAt*-sucD*,PrpsU-orfZ |
| 22 | Px-phaC3/C1*-PuspA-phaA5-phaB5-ssaRAt*-sucD*,PrpsU-orfZ |
| 21 | Px-phaC3/C1*-TtrpL-PuspA-phaA5-phaB5-T1006-PsynC-ssaRAt*-sucD*,PrpsU-orfZ |
| 2 | Px-phaC3/C5-TtrpL-PuspA-phaA5-phaB5-T1006-PsynC-ssaRAt*-sucD*,PrpsU-orfZ |
| 3 | Px-phaC3/C5-TtrpL-PuspA-phaA5-phaB5-ssaRAt*-T1006-PsynH-sucD*,PrpsU-orfZ |
以与实施例1中相同的方式生长各菌株和分析聚合物含量。所测试的每个菌株的代表性结果示于表5中，这些结果证明每个共聚物组合物的％4HB含量为40％～50％。
表5.从微生物株产生PHB-co-4HB聚合物
实施例3：从作为唯一碳源的葡萄糖产生4HB共聚单体含量为30％～40％的PHB-co-4HB
该实施例示出了在经改造的大肠杆菌宿主细胞中从作为唯一碳源的葡萄糖产生4HB共聚单体含量为30％～40％的PHB-co-4HB。该实施例中使用的菌株列于表6中。所有这些菌株都使用上文所述的熟知的技术工具和方法来构建。它们都包含yneI和gabD的染色体缺失。
表6.实施例3中使用的菌株。
| 菌株 | 操纵子构成 |
| 26 | PuspA-phaC3/C1*-phaA5-phaB5-ssaRAt*-sucD*,PrpsU-orfZ |
| 4 | Px-phaC3/C5-TtrpL-PuspA-phaA5-phaB5-ssaRAt*-T1006-PsynM-sucD*,PrpsU-orfZ |
| 5 | Px-phaC3/C5-TtrpL-PuspA-ssaRAt*-Psyn1-phaA5-phaB5-sucD*,PrpsU-orfZ |
| 6 | Px-phaC3/C5-TtrpL-PuspA-phaA5-phaB5-T1006-ssaRAt*-sucD*,PrpsU-orfZ |
| 7 | Px-phaC3/C5-TtrpL-PuspA-phaA5-phaB5-ssaRAt*-sucD*,PrpsU-orfZ |
| 27 | Px-phaC3/C1*-TtrpL-PuspA-phaA5-phaB5-T1006-ssaRAt*-sucD*,PrpsU-orfZ |
以与实施例1中相同的方式生长各菌株和分析聚合物含量。所测试的每个菌株的代表性结果示于表7中，这些结果证明每个共聚物组合物的％4HB含量为30％～40％。
表7.从微生物株产生PHB-co-4HB聚合物
实施例4：从作为唯一碳源的葡萄糖产生4HB共聚单体含量为20％～30％的PHB-co-4HB
该实施例示出了在经改造的大肠杆菌宿主细胞中从作为唯一碳源的葡萄糖产生4HB共聚单体含量为20％～30％的PHB-co-4HB。该实施例中使用的菌株列于表8中。所有这些菌株都使用上文所述的熟知的技术工具和方法来构建。它们都包含yneI和gabD的染色体缺失。
表8.实施例4中使用的菌株。
| 菌株 | 操纵子构成 |
| 8 | Px-phaC3/C5-TtrpL-PuspA-phaA5-phaB5-T1006-PsynH-ssaRAt*-sucD*,PrpsU-orfZ |
| 28 | Psyn1-phaC1-PuspA-sucD*-ssaRAt*-Psyn1-phaA5-phaB5,PrpsU-orfZ |
| 10 | Px-phaC3/C5-TtrpL-PuspA-sucD*-ssaRAt*-Psyn1-phaA5-phaB5,PrpsU-orfZ |
| 25 | PuspA-phaC3/C1*-sucD*-ssaRAt*,Psyn1-phaA5-phaB5,PrpsU-orfZ |
| 9 | PuspA-phaC3/C5-phaA5-phaB5-ssaRAt*-sucD*,PrpsU-orfZ |
| 11 | Px-phaC3/C5,TtrpL-PuspA-phaA5-phaB5,PrpsU-orfZ,sucD*-ssaRAt* |
| 29 | Px-phaC3/C1*-TtrpL-PuspA-phaA5-phaB5-T1006-sucD*-ssaRAt*,PrpsU-orfZ |
以与实施例1中相同的方式生长各菌株和分析聚合物含量。所测试的每个菌株的代表性结果示于表9中，这些结果证明每个共聚物组合物的％4HB含量为20％～30％。
表9.从微生物株产生PHB-co-4HB聚合物
实施例5：从作为唯一碳源的葡萄糖产生4HB共聚单体含量为1％～20％的PHB-co-4HB
该实施例示出了在经改造的大肠杆菌宿主细胞中从作为唯一碳源的葡萄糖产生4HB共聚单体含量为1％～20％的PHB-co-4HB。该实施例中使用的菌株列于表10中。所有这些菌株都使用上文所述的熟知的技术工具和方法来构建。它们都包含yneI和gabD的染色体缺失。
表10.实施例5中使用的菌株。
| 菌株 | 操纵子构成 |
| 13 | Px-phaC3/C5,TtrpL-PuspA-phaA5-phaB5,PrpsU-orfZ,sucD*-ssaRAt* |
| 12 | Px-phaC3/C5-TtrpL-PuspA-phaA5-phaB5-T1006-sucD*-ssaRAt*,PrpsU-orfZ |
| 14 | Px-phaC3/C5-TtrpL-PuspA-phaA5-phaB5-ssaRAt*-T1006-sucD*,PrpsU-orfZ |
| 30 | Px-phaC3/C1*-TtrpL-PuspA-phaA5-phaB5-ssaRAt*-T1006-sucD*,PrpsU-orfZ |
| 15 | Px-phaC3/C5,TtrpL-PuspA-phaA5-phaB5,PrpsU-orfZ,sucD*-ssaRAt* |
以与实施例1中相同的方式生长各菌株和分析聚合物含量。所测试的每个菌株的代表性结果示于表11中，这些结果证明每个共聚物组合物的％4HB含量为1％～20％。
表11.从微生物株产生PHB-co-4HB聚合物
实施例6：提取PHB-co-4HB共聚物并确定分子量和多分散性
为了纯化更大量的PHB-co-4HB共聚物，首先在37℃下使实施例1所示的具有不同的PHA组成的1、5和12号菌株在250ml摇瓶中的20ml LB培养基中生长过夜。随后将整个体积转移到包含500ml生产培养基(由1×E2最少量盐、1×E0最少量盐、5mMMgSO4、30g/L葡萄糖和1×痕量盐溶液组成)的1L带挡板的摇瓶中。E2和E0最少量盐和痕量盐溶液如实施例1中所述。在37℃在摇动下将这500ml培养液温育6小时，随后转换到28℃下在摇动下温育70小时。随后，于6000×g离心沉降培养物，用蒸馏水洗涤一次，于-80℃冷冻至少30分钟，并过夜冻干。
通过以下方式从干燥的生物质中纯化出1、5和12号菌株的聚合物：首先在65℃～70℃下用环己酮提取30分钟，而后在2000×g下离心沉降5分钟。随后，倾析出上清液并与等体积的5℃～10℃的庚烷混合。过滤所得的析出的聚合物并于室温下干燥过夜。
使用Waters Alliance HPLC系统和凝胶渗透色谱法(GPC)来确定所纯化的共聚物的分子量。表12示出了用从1、5和12号菌株纯化出的共聚物测得的重量平均分子量(Mw)、数量平均分子量(Mn)和多分散指数(PD)。
表12.1、5和12号菌株产生的共聚物的分子量和多分散性。
实施例7：确定PHB-co-4HB共聚物的PHA组成和玻璃化转变温度
使用实施例6所述的从1、5和12号菌株纯化出的共聚物来确定实施例1中概述的PHA组成。使用差示扫描量热法(DSC)分析来测量玻璃化转变温度(Tg)。表13列出了用从1、5和12号菌株纯化出的共聚物测得的4HB含量和Tg。玻璃化转变温度随着共聚物中4HB含量的升高而下降。
表13.用从1、5和12号菌株纯化出的共聚物测得的PHB-co-4HB聚合物产生和Tg。
实施例8：确定PHB-co-4HB共聚物的生物源含量
使用实施例6所述的从1号菌株纯化出的共聚物，由Beta Analytic(Miami,Florida,USA)基于ASTM D6866通过放射碳定年来确定生物源含量。从1号菌株纯化出的共聚物经确定包含97％的生物源含量。
实施例9：从作为唯一碳源的甘油产生PHB-co-4HB
以与实施例1相同的方式生长1和6号菌株并分析聚合物含量，区别在于：喂饲的碳水化合物为30g/L甘油而不是20g/L葡萄糖。这两株的代表性结果示于表14中。
表14.从作为唯一碳源的甘油产生PHB-co-4HB聚合物
Gene ID 001核苷酸序列：克氏梭菌琥珀酸半醛脱氢酶基因sucD*
ATGTCCAACGAGGTTAGCATTAAGGAGCTGATTGAGAAGGCGAAAGTGGCGCAGAAAAAGCTGGAAGCGTATAGCCAAGAGCAAGTTGACGTTCTGGTCAAGGCGCTGGGTAAAGTTGTGTACGACAACGCCGAGATGTTCGCGAAAGAGGCGGTGGAGGAAACCGAGATGGGTGTTTACGAGGATAAAGTGGCTAAATGTCATCTGAAATCTGGTGCAATCTGGAATCACATTAAAGATAAGAAAACCGTTGGTATTATCAAGGAAGAACCGGAGCGTGCGCTGGTGTACGTCGCGAAGCCTAAAGGTGTTGTGGCGGCGACGACCCCTATCACCAATCCTGTGGTTACCCCGATGTGTAACGCGATGGCAGCAATTAAAGGTCGCAACACCATCATTGTCGCCCCGCATCCGAAGGCGAAGAAGGTGAGCGCGCACACCGTGGAGCTGATGAATGCAGAACTGAAAAAGTTGGGTGCGCCGGAAAACATTATCCAGATCGTTGAAGCCCCAAGCCGTGAAGCAGCCAAGGAGTTGATGGAGAGCGCAGACGTGGTTATCGCCACGGGTGGCGCAGGCCGTGTTAAAGCAGCGTACTCCTCCGGCCGTCCGGCATACGGTGTCGGTCCGGGCAATTCTCAGGTCATTGTCGATAAGGGTTACGATTATAACAAAGCTGCCCAGGACATCATTACCGGCCGCAAGTATGACAACGGTATCATTTGCAGCTCTGAGCAGAGCGTGATCGCACCGGCGGAGGACTACGACAAGGTCATCGCGGCTTTCGTCGAGAATGGCGCGTTCTATGTCGAGGATGAGGAAACTGTGGAGAAATTCCGTAGCACGCTGTTCAAGGATGGCAAGATCAATAGCAAAATCATCGGTAAATCCGTGCAGATCATCGCTGACCTGGCTGGTGTCAAGGTGCCGGAAGGCACCAAGGTGATCGTGTTGAAGGGCAAGGGTGCCGGTGAAAAGGACGTTCTGTGCAAGGAGAAAATGTGCCCGGTCCTGGTTGCCCTGAAATATGACACCTTTGAGGAGGCGGTCGAGATCGCGATGGCCAACTATATGTACGAGGGTGCGGGCCATACCGCCGGTATCCACAGCGATAACGACGAGAATATCCGCTACGCGGGTACGGTGCTGCCAATCAGCCGTCTGGTTGTCAACCAGCCAGCAACTACGGCCGGTGGTAGCTTTAACAATGGTTTTAATCCGACCACCACCTTGGGCTGCGGTAGCTGGGGCCGTAACTCCATTAGCGAGAACCTGACGTATGAGCATCTGATTAATGTCAGCCGTATTGGCTATTTCAATAAGGAGGCAAAAGTTCCTAGCTACGAGGAGATCTGGGGTTAA(SEQ ID NO:16)
Gene ID 001氨基酸序列：克氏梭菌琥珀酸半醛脱氢酶基因SucD*
MSNEVSIKELIEKAKVAQKKLEAYSQEQVDVLVKALGKVVYDNAEMFAKEAVEETEMGVYEDKVAKCHLKSGAIWNHIKDKKTVGIIKEEPERALVYVAKPKGVVAATTPITNPVVTPMCNAMAAIKGRNTIIVAPHPKAKKVSAHTVELMNAELKKLGAPENIIQIVEAPSREAAKELMESADVVIATGGAGRVKAAYSSGRPAYGVGPGNSQVIVDKGYDYNKAAQDIITGRKYDNGIICSSEQSVIAPAEDYDKVIAAFVENGAFYVEDEETVEKFRSTLFKDGKINSKIIGKSVQIIADLAGVKVPEGTKVIVLKGKGAGEKDVLCKEKMCPVLVALKYDTFEEAVEIAMANYMYEGAGHTAGIHSDNDENIRYAGTVLPISRLVVNQPATTAGGSFNNGFNPTTTLGCGSWGRNSISENLTYEHLINVSRIGYFNKEAKVPSYEEIWG(SEQ ID NO:17)
Gene ID 002核苷酸序列：拟南芥琥珀酸半醛还原酶基因ssaRAt*
ATGGAAGTAGGTTTTCTGGGTCTGGGCATTATGGGTAAAGCTATGTCCATGAACCTGCTGAAAAACGGTTTCAAAGTTACCGTGTGGAACCGCACTCTGTCTAAATGTGATGAACTGGTTGAACACGGTGCAAGCGTGTGCGAGTCTCCGGCTGAGGTGATCAAGAAATGCAAATACACGATCGCGATGCTGAGCGATCCGTGTGCAGCTCTGTCTGTTGTTTTCGATAAAGGCGGTGTTCTGGAACAGATCTGCGAGGGTAAGGGCTACATCGACATGTCTACCGTCGACGCGGAAACTAGCCTGAAAATTAACGAAGCGATCACGGGCAAAGGTGGCCGTTTTGTAGAAGGTCCTGTTAGCGGTTCCAAAAAGCCGGCAGAAGACGGCCAGCTGATCATCCTGGCAGCAGGCGACAAAGCACTGTTCGAGGAATCCATCCCGGCCTTTGATGTACTGGGCAAACGTTCCTTTTATCTGGGTCAGGTGGGTAACGGTGCGAAAATGAAACTGATTGTTAACATGATCATGGGTTCTATGATGAACGCGTTTAGCGAAGGTCTGGTACTGGCAGATAAAAGCGGTCTGTCTAGCGACACGCTGCTGGATATTCTGGATCTGGGTGCTATGACGAATCCGATGTTCAAAGGCAAAGGTCCGTCCATGACTAAATCCAGCTACCCACCGGCTTTCCCGCTGAAACACCAGCAGAAAGACATGCGTCTGGCTCTGGCTCTGGGCGACGAAAACGCTGTTAGCATGCCGGTCGCTGCGGCTGCGAACGAAGCCTTCAAGAAAGCCCGTAGCCTGGGCCTGGGCGATCTGGACTTTTCTGCTGTTATCGAAGCGGTAAAATTCTCTCGTGAATAA(SEQ ID NO:18)
Gene ID 002氨基酸序列：拟南芥琥珀酸半醛还原酶基因SsaRAt*
MEVGFLGLGIMGKAMSMNLLKNGFKVTVWNRTLSKCDELVEHGASVCESPAEVIKKCKYTIAMLSDPCAALSVVFDKGGVLEQICEGKGYIDMSTVDAETSLKINEAITGKGGRFVEGPVSGSKKPAEDGQLIILAAGDKALFEESIPAFDVLGKRSFYLGQVGNGAKMKLIVNMIMGSMMNAFSEGLVLADKSGLSSDTLLDILDLGAMTNPMFKGKGPSMTKSSYPPAFPLKHQQKDMRLALALGDENAVSMPVAAAANEAFKKARSLGLGDLDFSAVIEAVKFSRE(SEQ ID NO:19)
Gene ID 003核苷酸序列：大肠杆菌K-12株MG1655亚株L-1,2-丙二醇氧化还原酶fucOI6L-L7V
ATGATGGCTAACAGAATGCTGGTGAACGAAACGGCATGGTTTGGTCGGGGTGCTGTTGGGGCTTTAACCGATGAGGTGAAACGCCGTGGTTATCAGAAGGCGCTGATCGTCACCGATAAAACGCTGGTGCAATGCGGCGTGGTGGCGAAAGTGACCGATAAGATGGATGCTGCAGGGCTGGCATGGGCGATTTACGACGGCGTAGTGCCCAACCCAACAATTACTGTCGTCAAAGAAGGGCTCGGTGTATTCCAGAATAGCGGCGCGGATTACCTGATCGCTATTGGTGGTGGTTCTCCACAGGATACTTGTAAAGCGATTGGCATTATCAGCAACAACCCGGAGTTTGCCGATGTGCGTAGCCTGGAAGGGCTTTCCCCGACCAATAAACCCAGTGTACCGATTCTGGCAATTCCTACCACAGCAGGTACTGCGGCAGAAGTGACCATTAACTACGTGATCACTGACGAAGAGAAACGGCGCAAGTTTGTTTGCGTTGATCCGCATGATATCCCGCAGGTGGCGTTTATTGACGCTGACATGATGGATGGTATGCCTCCAGCGCTGAAAGCTGCGACGGGTGTCGATGCGCTCACTCATGCTATTGAGGGGTATATTACCCGTGGCGCGTGGGCGCTAACCGATGCACTGCACATTAAAGCGATTGAAATCATTGCTGGGGCGCTGCGAGGATCGGTTGCTGGTGATAAGGATGCCGGAGAAGAAATGGCGCTCGGGCAGTATGTTGCGGGTATGGGCTTCTCGAATGTTGGGTTAGGGTTGGTGCATGGTATGGCGCATCCACTGGGCGCGTTTTATAACACTCCACACGGTGTTGCGAACGCCATCCTGTTACCGCATGTCATGCGTTATAACGCTGACTTTACCGGTGAGAAGTACCGCGATATCGCGCGCGTTATGGGCGTGAAAGTGGAAGGTATGAGCCTGGAAGAGGCGCGTAATGCCGCTGTTGAAGCGGTGTTTGCTCTCAACCGTGATGTCGGTATTCCGCCACATTTGCGTGATGTTGGTGTACGCAAGGAAGACATTCCGGCACTGGCGCAGGCGGCACTGGATGATGTTTGTACCGGTGGCAACCCGCGTGAAGCAACGCTTGAGGATATTGTAGAGCTTTACCATACCGCCTGGTAA(SEQ ID NO:20)
Gene ID 003氨基酸序列：大肠杆菌K-12株MG1655亚株L-1,2-丙二醇氧化还原酶FucOI6L-L7V
MANRMLVNETAWFGRGAVGALTDEVKRRGYQKALIVTDKTLVQCGVVAKVTDKMDAAGLAWAIYDGVVPNPTITVVKEGLGVFQNSGADYLIAIGGGSPQDTCKAIGIISNNPEFADVRSLEGLSPTNKPSVPILAIPTTAGTAAEVTINYVITDEEKRRKFVCVDPHDIPQVAFIDADMMDGMPPALKAATGVDALTHAIEGYITRGAWALTDALHIKAIEIIAGALRGSVAGDKDAGEEMALGQYVAGMGFSNVGLGLVHGMAHPLGAFYNTPHGVANAILLPHVMRYNADFTGEKYRDIARVMGVKVEGMSLEEARNAAVEAVFALNRDVGIPPHLRDVGVRKEDIPALAQAALDDVCTGGNPREATLEDIVELYHTAW(SEQ ID NO:21)
Gene ID 004核苷酸序列：恶臭假单胞菌/生枝动胶菌聚羟基烷酸酯合酶融合基因phaC3/C5
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Gene ID 005氨基酸序列：恶臭假单胞菌/富养产碱菌聚羟基烷酸酯合酶融合基因PhaC3/C1*
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Gene ID 006核苷酸序列：恶臭假单胞菌/食酸代尔夫特菌89-11-102聚羟基烷酸酯合酶融合基因phaC3/C33
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Gene ID 006氨基酸序列：恶臭假单胞菌/食酸代尔夫特菌89-11-102聚羟基烷酸酯合酶融合基因PhaC3/C33
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本领域的技术人员将知晓或仅使用惯用实验手段就能够确定本文所述的具体实施方式的多种等价实施方式。意图将这些等价实施方式包含在所附的权利要求中。
关于作为ASCII文本文件递交的“序列表”、表格或计算机程序列表附件
通过引用将于2013年9月28日生成的、文件大小为41,042字节的名为“FCI15US1064序列表.txt(MBLX_50416WO_SequenceListing_ST25.txt)”的ASCII文本文件中的内容并入本文中。
Claims (37)
1.一种聚羟基烷酸酯共聚物组合物，所述组合物包含多种聚羟基烷酸酯共聚物分子，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子(i)包含3-羟基丁酸酯单体和4-羟基丁酸酯单体、(ii)具有的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为23.5％～75％、且(iii)具有的生物源含量≥80％。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子的重量平均分子量为250kDa～2.0MDa。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中，所述组合物的玻璃化转变温度为-60℃～-5℃。
4.如权利要求1、2或3所述的组合物，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子中4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比不随所述聚羟基烷酸酯共聚物分子的分子量的增加而下降。
5.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中：
所述聚羟基烷酸酯共聚物分子是使用生物源含量总计≥80％的一种或多种含碳原料在发酵过程中制得的；
所述一种或多种含碳原料包含选自由葡萄糖、左旋葡聚糖、蔗糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖及其混合物组成的组的碳源；并且
收率大于0.25g聚羟基烷酸酯共聚物分子每克碳源。
6.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子中4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为25％～70％。
7.如权利要求1～6中任一项所述的组合物，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子中的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为30％～40％。
8.如权利要求1～6中任一项所述的组合物，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子中4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为40％～50％。
9.如权利要求1～6中任一项所述的组合物，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子中4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为50％～60％。
10.如权利要求1～6中任一项所述的组合物，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子中4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为60％～70％。
11.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子的生物源含量≥95％。
12.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子的生物源含量≥99％。
13.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子的生物源含量为100％。
14.一种聚合物共混物组合物，所述聚合物共混物组合物包含前述权利要求中任一项所述的聚羟基烷酸酯组合物和多种第二聚合物分子。
15.如权利要求14所述的聚合物共混物组合物，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子占所述聚合物共混物组合物的5重量％～95重量％。
16.如权利要求14或15所述的聚合物共混物组合物，其中，所述聚合物共混物组合物是连续相的或双连续相的。
17.如权利要求14、15或16所述的聚合物共混物组合物，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子和所述第二聚合物分子形成单一相。
18.如权利要求14～17中任一项所述的聚合物共混物组合物，其中，所述聚合物共混物组合物的结晶度低于缺乏所述聚羟基烷酸酯共聚物分子的相应组合物。
19.一种生物质组合物，所述生物质组合物包含权利要求1～13中任一项所述的组合物，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子占所述生物质组合物的50重量％以上。
20.一种制备聚羟基烷酸酯共聚物组合物的方法，所述组合物包含多种聚羟基烷酸酯共聚物分子，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子(i)包含3-羟基丁酸酯单体和4-羟基丁酸酯单体、(ii)具有的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为23.5％～75％、且(iii)具有的生物源含量≥80％；所述方法包括：
在一种或多种含碳原料的存在下培养生物体，所述培养在(a)所述一种或多种含碳原料转化为3-羟基丁酰基CoA和4-羟基丁酰基CoA，并且(b)所述3-羟基丁酰基CoA和4-羟基丁酰基CoA聚合形成所述聚羟基烷酸酯共聚物分子的条件下进行，从而形成所述组合物；其中：
所述生物体已被遗传改造成包含聚羟基烷酸酯合酶、乙酰基CoA乙酰基转移酶、乙酰乙酰基CoA还原酶、琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酸半醛还原酶和CoA转移酶的酶活性，并且不包含NAD+依赖型琥珀酸半醛脱氢酶和/或NADP+依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的酶活性，并且
所述一种或多种含碳原料总共的生物源含量≥80％。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述生物体被进一步遗传改造成：
(a)包含(i)α-酮戊二酸脱羧酶或2-氧代戊二酸脱羧酶以及(ii)L-1,2-丙二醇氧化还原酶的酶活性，并且
(b)不包含(i)硫酯酶II、(ii)多功能酰基CoA硫酯酶I和蛋白酶I和溶血磷脂酶L、(iii)酰基CoA硫酯酶和(iv)醛脱氢酶中的一种或多种的酶活性。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中，所述一种或多种含碳原料包含选自由葡萄糖、左旋葡聚糖、蔗糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖及其混合物组成的组的碳源。
23.如权利要求20、21或22所述的方法，其中，所述一种或多种含碳原料包含糖蜜、淀粉、脂肪酸、植物油、木质纤维素材料、乙醇、乙酸、甘油、源自生物质的合成气和源自填埋气的甲烷中的一种或多种。
24.如权利要求20～23中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种含碳原料不包含γ-丁内酯、1,4-丁二醇、4-羟基丁酸、3-羟基丁酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸、苹果酸、延胡索酸、柠檬酸、琥珀酸或3-羟基丁酸。
25.如权利要求20～24中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种含碳原料总共的生物源含量≥95％。
26.如权利要求20～25中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种含碳原料总共的生物源含量≥99％。
27.如权利要求20～26中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种含碳原料总共的生物源含量为100％。
28.如权利要求20～27中任一项所述的方法，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子中的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为25％～70％。
29.如权利要求20～28中任一项所述的方法，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子中的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为30％～40％。
30.如权利要求20～28中任一项所述的方法，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子中的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为40％～50％。
31.如权利要求20～28中任一项所述的方法，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子中的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为50％～60％。
32.如权利要求20～28中任一项所述的方法，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子中的4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比为60％～70％。
33.如权利要求20～32中任一项所述的方法，所述方法还包括从生物体中分离聚羟基烷酸酯共聚物分子，以使得聚羟基烷酸酯共聚物组合物基本不含所述生物体。
34.一种根据权利要求20～33中任一项所述的方法制备的聚羟基烷酸酯共聚物组合物。
35.如权利要求34所述的组合物，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子的重量平均分子量为250kDa～2.0MDa。
36.如权利要求34或35所述的组合物，其中，所述组合物的玻璃化转变温度为-60℃～-5℃。
37.如权利要求34、35或36所述的组合物，其中，所述聚羟基烷酸酯共聚物分子中4-羟基丁酸酯单体的单体摩尔百分比不随着所述聚羟基烷酸酯共聚物分子的分子量的增加而下降。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110951224A (zh) * | 2019-11-20 | 2020-04-03 | 白为为 | 一种聚羟基烷酸酯复合材料及其制备方法 |
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Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3087174B1 (en) * | 2013-12-27 | 2020-05-13 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms with increased carbon flux efficiencies |
| JP2018513256A (ja) * | 2015-04-17 | 2018-05-24 | レプソル，ソシエダッド アノニマ | ポリアルキレンカーボネートおよびポリヒドロキシアルカノエートのブレンド |
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| AU2020293986A1 (en) * | 2019-06-10 | 2022-01-06 | Yield10 Bioscience, Inc. | Transgenic land plants that express a polyhydroxyalkanoate synthase seed specifically with cytosolic localization |
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Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0977865A1 (en) | 1997-02-13 | 2000-02-09 | James Madison University | Methods of making polyhydroxyalkanoates comprising 4-hydroxybutyrate monomer units |
| DE69838768T2 (de) | 1997-09-19 | 2008-10-30 | Metabolix, Inc., Cambridge | Biologische Systeme zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoat-Polymeren die 4-Hy droxysäure enthalten |
| EP1105499B1 (en) | 1998-08-18 | 2006-03-08 | Metabolix, Inc. | Transgenic microbial polyhydroxyalkanoate producers |
| CA2494322C (en) | 2002-08-06 | 2012-05-22 | Metabolix Inc. | Polymer extraction methods |
| KR20110104492A (ko) | 2008-12-12 | 2011-09-22 | 메타볼릭스 인코포레이티드 | 폴리（5ｈｖ）및 5 탄소 화학물질의 생산을 위한 녹색 공정 및 조성물 |
| WO2011031558A2 (en) * | 2009-08-27 | 2011-03-17 | Metabolix, Inc. | Toughened polyhydroxyalkanoate compositions |
| US10786064B2 (en) | 2010-02-11 | 2020-09-29 | Cj Cheiljedang Corporation | Process for producing a monomer component from a genetically modified polyhydroxyalkanoate biomass |
| CN102382789B (zh) | 2010-09-02 | 2014-06-04 | 天津国韵生物材料有限公司 | 含有2-酮戊二酸脱羧酶基因kgd的工程菌及其用途 |
| US8546125B2 (en) | 2011-02-21 | 2013-10-01 | Tianjin Greenbio Material Co., Ltd. | Recombinant hosts and methods for manufacturing polyhydroxyalkanoate |
| US20130034884A1 (en) * | 2011-06-22 | 2013-02-07 | Genomatica, Inc. | Microorganisms for producing 1,4-butanediol and methods related thereto |
| US20110319849A1 (en) | 2011-07-01 | 2011-12-29 | Dimitris Ioannis Collias | Absorbent article comprising a synthetic polymer derived from a renewable resource and methods of producing said article |
| EP2855584A1 (en) * | 2012-06-05 | 2015-04-08 | Metabolix, Inc. | Biobased rubber modified biodegradable polymer blends |
-
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-
2017
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BJORN ANDREEBEN ET AL.: "Bioshnthesis and Biodegration of 3-hydroxypropionate containing Polysters", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
| MASAYA HIRAMITSU ET AL.: "Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) by Alcaligenes latus", 《BIOTECHNOLOGY LETTERS》 * |
| 杜丽丽: "以葡萄糖为唯一碳源合成聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)的研究", 《山东大学硕士学位论文》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110951224A (zh) * | 2019-11-20 | 2020-04-03 | 白为为 | 一种聚羟基烷酸酯复合材料及其制备方法 |
| CN115443298A (zh) * | 2020-04-21 | 2022-12-06 | Cj第一制糖株式会社 | 可低温加工的脂族聚酯 |
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