CN101008011A - 生产聚羟基脂肪酸酯的重组菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了可以生产3－羟基丁酸与4－羟基丁酸的共聚物P(3HB－co－4HB)的重组菌株及其构建方法与应用。更具体地，本发明公开了导入了PHB生物合成途径基因以及编码4－羟基丁酰辅酶A转移酶基因的重组菌株GBCZ017和导入了生物合成途径基因、编码4－羟基丁酰辅酶A转移酶基因以及克隆透明颤菌血红蛋白的重组菌株GBCZ003，利用它们可以方便地得到P(3HB－co－4HB)，而GBCZ003更适合于工业化的高密度培养。

Description

生产聚羟基脂肪酸酯的重组菌株及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种生产聚羟基脂肪酸酯的重组菌株的构建方法与应用，更具体地本发明涉及可以生产3-羟基丁酸与4-羟基丁酸的共聚物P(3HB-co-4HB)的含有VHb基因重组菌株的构建方法与应用。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯尤其是聚羟基于酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA)是一类由微生物合成的高分子聚酯，其分子量一般由几万到几百万，广泛存在于自然界的多种微生物体内。它的某些物理性质与传统的由石油合成的塑料如聚乙烯、聚丙烯类似，可由可再生的资源合成，并且可以完全降解，进入自然界的生态循环，被认为是一种未来可以替代不可降解的传统塑料的“生物可降解新型塑料”，引起了世界各国科学界和产业界的广泛关注。

生物可分解塑料的共同特点不仅是在自然界可被微生物完全分解而减轻陆地和海洋的污染，而且在废弃后焚烧处理时所释放的CO₂量都明显低于合成塑料，从而能对保护地球大气环境、减少温室效应起到积极作用。

而以3-羟基丁酸为单体组成的聚3-羟基丁酸酯P(3HB)，因其物理性质较脆等而不适合于工业应用。由3-羟基丁酸分别与4-羟基丁酸、3-羟基戊酸或3-羟基己酸共聚合形成的P(3HB-co-4HB)、P(3HB-co-3HV)或P(3HB-co-3HHx)，由于它们具有优良的物理和机械性能(可按不同要求通过共聚比例进行调节，获得具有不同刚性、结晶性、熔点和玻璃化温度适合于不同用途的聚合物材料)，特别是具有生物相容性和可吸收性，能用作生物医学材料，而成为当今世界研究最热门的PHA之一。

近年来，基因重组微生物生产PHA最引人瞩目的成就是将罗氏真养菌(Ralstonia eutropha)的PHA生物合成途径基因(J.Bacteriol.Vol.179 p.4431-4436 1988)和克氏梭菌(Clostridium kluyveri)的琥珀酰半醛代谢途径基因都重组到大肠杆菌宿主细胞中(US6117658)，在适当的培养条件下进行表达。由于琥珀酰半醛代谢途径以6碳糖或5碳糖为起始物质产生4-羟基丁酰辅酶A中间体，它与PHA生物合成途径的结合意味着可以不依赖前体4-羟基丁酸或1，4-丁二醇或γ-丁内酯产生4HB单体的PHA共聚物。另外，土肥仪治等就发现，真养产碱杆菌(Doi，et al.，1990，Int.J.Biol.Macromol.12：106)可以由4-羟基丁酸，γ-丁内酯、1，4-丁二醇和1，6-己二醇合成P(3HB-co-4HB)共聚物。通过调节碳、氮源的组成，这一共聚物中4HB的比例可以在0～100％的范围内改变。P(3HB-co-4HB)的生物降解性和材料性能与P(3HB)和P(3HB-co-3HV)都有所不同，因而具有重要的应用价值。

以γ-丁内酯为碳源，在无氮培养基中用真养产碱杆菌30小时发酵，得到分子量240,000～425,000、占细胞干重29％的共聚物P(3HB-co-4HB)。当发酵培养基中γ-丁内酯用量由10％增加到25％，所得共聚物中4HB的含量可从9％增加到21％。上述培养基里加入果糖，可提高P(3HB-co-4HB)的产率和分子量，细胞中共聚物含量达细胞干重的48％，而共聚物中4HB的含量减少为17％。土肥仪治等还用食酸丛毛单胞菌为生产菌(Int.J.Biol.Macromo.Vol.16p.99-104 1994)，以丁酸或1，4-丁二醇为碳源，获得的产物分别是P(3HB)和P(3HB-co-4HB)(其中4HB含量为94mol％)。如以丁酸或1，4-丁二醇为混合碳源，则4HB在P(3HB-co-4HB)中的含量随1，4-丁二醇在混合碳源中的比例增加而增加。所得共聚物不是均一的，而是含有4HB不同含量共聚物的混合物(Appl.Envir.Microbiol.1998 64：3437-3443)。

尽管目前已经有上述各种利用各种不同的微生物或重组菌株、调节底物中炭源、氨源的组成及在发酵过程中补料和控制不同的发酵条件从而提高P(3HBco-4HB)产量的方法，但上述方法均需要在富氧条件下进行，为工业化的高密度发酵培养带来了困难，因此，不断利用现代生物技术得到新的重组菌株从而在供氧不足的高密度发酵条件下较高的产生P(3HB-co-4HB)一直是本领域技术人员着力解决的问题。

发明内容

本发明公开了：

1.一种表达3-羟基丁酸(3HB)和4-羟基丁酸(4HB)共聚物P(3HB-co-4HB)的重组质粒pGB PHA，其特征在于含有来自于罗氏真养菌的PHB的生物合成途径基因以及来自克氏梭酸菌的编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶基因和来自透明颤菌的VHb基因。

2.重组菌株GBCZ003。

3.一种获得权利要求1所述的重组质粒的方法，包括：

(1)克隆透明颤菌血红蛋白得到重组质粒pET_VHb

(2)克隆4-羟基丁酰辅酶A转移酶基因得到质粒pET_VHb_orfZ；

(3)克隆PHB生物合成途径基因获得质粒pCR_PHB；

(4)将(1)、(2)和(3)所述的基因在大肠杆菌宿主细胞中表达获得重组质粒pGB_PHA。

4.一种利用权利要求2所述的重组菌株产生P(3HB-co-4HB)的方法，包括：

(1)对重组菌株进行培养；

(2)对重组菌株进行发酵；

(3)分离发酵液，提取目的物P(3HB-co-4HB)。

5.一种利用权利要求2所述的重组菌株大规模生产P(3HB-co-4HB)的方法。

本发明的发明人进行了大量的实验，将PHB的生物合成途径基因以及编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶基因转入宿主细胞，得到重组质粒。本发明中，PHB的生物合成途径基因可来自罗氏真养菌，编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶基因来自克氏梭酸菌，利用大肠杆菌(E.coli BL21(DE3))作为宿主细胞。本发明的发明人通过克隆罗氏真养菌的PHB生物合成途径基因得到了重组质粒pCR_PHB，通过克隆来自克氏梭酸的编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶基因原核表达质粒pET_orfZ，将其酶切，通过连接酶连接，通过CaCl₂的方法将连接产物转化感受态的大肠杆菌(E.coli BL21(DE3))，筛选转化子得到重组质粒pET_orfZ_PHB，进而得到重组菌株GBCZ017。同样地，将PHB的生物合成途径基因、编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶基因以及透明颤菌的VHb基因转入宿主细胞，得到重组质粒pCR_PHB，进而得到重组菌株GBCZ003。

利用相同的培养条件在通常条件下对得到的重组菌株进行摇瓶实验，实验结果表明，利用重组菌株GBCZ003得到的P(3HB-co-4HB)发酵细胞干重为1.85～1.91g/L，P(3HB-co-4HB)含量占细胞干重的百分比(PHA/DCW(％))为38.99％～45.26％，4HB的含量为3.37mol％～4.16mol％；利用重组菌株GBCZ017得到的P(3HB-co-4HB)发酵细胞干重为1.51～1.90g/L，P(3HB-co-4HB)重量占细胞干重的百分比为36.64％～40.29％，4HB的含量为2.71mol％～4.04mol％。可以看出，本发明公开的菌株达到了在通常的条件下以葡萄糖和1.4-丁二醇为底物可以较高地得到P(3HB-co-4HB)。而本发明中公开的重组菌株GBCZ003与重组菌株GBCZ017相比，由于引入了透明颤菌的VHb基因，在供氧不充足的摇瓶发酵条件下，用重组菌株GBCZ003得到的P(3HB-co-4HB)发酵细胞干重为1.64～1.82g/L，P(3HB-co-4HB)含量占细胞干重的百分比为37.45％～51.28％，4HB的含量为3.76mol％～4.21mol％；利用重组菌株GBCZ017得到的P(3HB-co-4HB)发酵细胞干重为1.19～1.45g/L，P(3HB-co-4HB)重量占细胞干重的百分比(PHA/DCW(％))为33.1％～38.1％。，4HB的含量为3.02mol％～3.54mol％。从以普通条件和在供氧不充足的条件下摇瓶发酵的数据的比较，可以证实含有VHb基因的重组菌株GBCZ003无论是在供氧不足或充足的发酵条件下，其产生PHA的能力都比不含有VHb基因的重组菌株GBCZ017强，尤其是在本发明的实施例5中，当两个菌株同样在供氧不充足的摇瓶发酵条件下，含有VHb基因的重组菌株GBCZ003的细胞干重，P(34HB)的含量，以及4HB的百分含量相比不含VHb基因的重组菌株GBCZ017提高了35.7％，26.8％和21.8％。所以含有VHb基因的重组菌株GBCZ003将更适合进行高密度培养，达到了本发明的目的。

附图说明：

附图1：重组质粒pET_VHb的物理图谱；

附图2：重组质粒pET_orfZ的物理图谱；

附图3：重组质粒pET_VHb_orfZ的物理图谱；

附图4：重组质粒pET_orfZ_PHA的物理图谱；

附图5：重组质粒pGB_PHA的物理图谱；

具体实施方式：

以下实施例仅用于进一步说明本发明，不应理解为对本发明的限制。

本发明中所用的分子克隆技术，包括DNA的分离纯化、DNA合成、聚合酶链式反应(PCR)、DNA的限制性内切酶酶切、DNA的连接、大肠杆菌转化筛选都是本领域中非常熟悉的，在Sambrook等著的MolecularCloning，alaboratorymanual一书中有充分地描述。

本发明中如果没有特别说明，所有试剂均为市售。

本发明中如果没有特别说明，细胞干重百分比均为P(3HB-co-4HB)含量占细胞总干重的重量百分比；4HB含量百分比为P(3HB-co-4HB)中4HB摩尔数占3HB与4HB摩尔数之和的摩尔百分比。

pET3b购自stratagene公司，pCR2.1TOPO载体、T4连接酶、NdeI、BamHI、EcoRI、ClaI限制性内切酶均购自Promega公司，Expand LongTemplate PCR system购自罗氏公司，E.coliDH5α、E.coli BL21(DE3)购自北京鼎国生物技术公司，克氏梭酸(己酸菌)(Clostridium kluyveri)购自中国工业微生物菌种保藏中心CICC8022。

气相色谱仪的型号及生产厂家：安捷伦公司6890型

全温振荡器型号及生产厂家：哈东联公司HZQ-Q

实施例1：透明颤菌血红蛋白基因克隆

为了将编码透明颤菌血红蛋白基因克隆到质粒中，根据透明颤菌的血红蛋白基因的核酸序列(参见Khosla，C.和Bailey等，GenBank SequenceDatabase，M30794，1993)合成下列引物；

引物1；5′-CATCGATGGACGCTGGGGTTAAAAGTAT-3′

引物2；5′-GATCGATGTCCCAAGTTTTGGCAACAGC-3′

以从透明颤菌中分离得到的基因组DNA为模板，通过PCR扩增的方法得到血红蛋白基因。按照下列条件进行PCR：首先在94℃变性5分钟，然后35次循环的94℃变性50秒，50℃退火1分钟以及72℃延伸1分钟后，最后加上72℃延伸10分钟。将得到的PCR产物按照Invitrogen公司提供操作手册连接到pCR2.1 TOPO载体，通过CaCl₂的方法将连接产物转化感受态E.coli DH5α。然后在含有氨苄青霉素(50ug/L)，IPTG和X-Gal的LB琼脂平板上(酵母粉5g/L；胰蛋白胨10g/L；NaCl 10g/L；琼脂粉15g/L)筛选转化子从而获得重组的E.coli DH5α/pCR_VHb。

将获得的质粒pCR_VHb用ClaI酶切，琼脂糖凝胶电泳分离约650bp含有VHb基因的DNA片段，并将回收得到的片段用T4连接酶连接到同样用ClaI处理过的质粒pET3b中，通过CaCl₂的方法将连接产物转化感受态E.coli DH5α。然后在含有氨苄青霉素(50ug/L)，IPTG和X-Gal的LB琼脂平板上(酵母粉5g/L；胰蛋白胨10g/L；NaCl10g/L；琼脂粉15g/L)筛选转化子从而获得重组质粒pET_VHb。

实施例2：4-羟基丁酰辅酶A转移酶基因的克隆

为了将编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶(orfZ)基因从克氏梭酸(己酸菌)(Clostridium kluyveri)中用PCR的方法克隆。根据orfZ基因的核酸序列(参见GenBank Sequence Database，L21902 1996)设计引物，

引物1；5’-GCATATGGAGTGGGAAGAGATATATAAAG-3’(NdeI)

引物2；5’-CGGATCCTAAAATCTCTTTTTAAATTC-3’(BamHI)

以从克氏梭酸(己酸菌)中分离得到的基因为模板，按照以下条件进行PCR：首先在94℃变性5分钟，然后35次循环的94℃变性50秒，50℃退火1分钟以及72℃延伸2分钟后，最后加上72℃延伸10分钟。将得到的PCR产物按照Invitrogen公司提供操作手册连接到pCR2.1 TOPO载体，通过CaCl₂的方法将连接产物转化感受态E.coli DH5α。然后在含有氨苄青霉素(50ug/L)，IPTG和X-Gal的LB琼脂平板上(酵母粉5g/L；胰蛋白胨10g/L；NaCl10g/L；琼脂粉15g/L)筛选转化子从而获得重组的E.coliDH5α/pCR_orfZ。

将获得的质粒pCR_orfZ用NdeI和BamHI进行双酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离约1.3Kb的DNA片段，并将回收片段用T4连接酶分别连接到同样用NdeI和BamHI双酶处理过的实施例1中得到的pET_VHb载体和pET3b中，得到原核表达质粒pET_VHb_orfZ和pET_VHb_orfZ和pET_orfZ。

实施例3：PHB生物合成途径基因的克隆

将罗氏真养菌ATCC17699接种于5ml LB培养基(酵母粉5g/L；胰蛋白胨10g/L；NaCl 10g/L)中，30℃，220rpm培养72小时。离心收集菌体，按照分子克隆手册的方法抽提基因组DNA备用。

根据PHB生物合成途径基因的核酸序列(参见GenBank SequenceDatabase，U47026 1999)设计引物；

引物1；5’-TACCTTGCCGACATCTATGCGCTG-3’

引物2；5’-GCTGGCTGCGCCGCTGCCCTGATTCTATG-3’

以从罗氏真养菌获得的基因组DNA为模板，用罗氏公司的Expand LongTemplate PCR system，根据产品提供的操作手册按照以下条件进行PCR：首先在94℃变性5分钟，然后10次循环的94℃变性10秒，55℃退火30秒钟以及68℃延伸6分钟，然后再加25个循环的94℃变性15秒，55℃退火30秒钟以及68℃延伸6分(每个循环加20秒钟)，最后加上68℃延伸10分钟。将得到的PCR产物按照Invitrogen公司提供操作手册连接到pCR2.1 TOPO载体，通过CaCl₂的方法将连接产物转化感受态E.coli DH5α。然后在含有氨苄青霉素(50ug/L)，IPTG和X-Gal的LB琼脂平板上(酵母粉5g/L；胰蛋白胨10g/L；NaCl 10g/L；琼脂粉15g/L)筛选转化子从而获得重组质粒pCR_PHB。

将获得的质粒pCR_PHB用EcoRI酶切，琼脂糖凝胶电泳分离约5kb含有PHB生物合成途径基因的DNA片段，并将回收得到的片段用T4连接酶连接到同样用EcoRI处理过的实施例2得到质粒pET_VHb_orfZ和pET_orfZ中，通过CaCl₂的方法将连接产物转化感受态E.coli BL21(DE3)。然后在含有氨苄青霉素(50ug/L)，IPTG和X-Gal的LB琼脂平板上(酵母粉5g/L；胰蛋白胨10g/L；NaCl 10g/L；琼脂粉15g/L)筛选转化子从而分别获得含有透明颤菌VHb基因和4-羟基丁酰辅酶A转移酶基因(orfZ)以及PHB生物合成途径基因的重组质粒pGB_PHA和不含有透明颤菌VHb基因而只有4-羟基丁酰辅酶A转移酶基因(orfZ)以及PHB生物合成途径基因的重组质粒pET_orfZ_PHB，并根据克隆号将含有重组质粒pGB_PHA的E.coliBL21(DE3)菌根据克隆筛选号重新命名为GBCZ003，而将含有重组质粒pET_orfZ_PHB的E.coli BL21(DE3)菌根据克隆筛选号重新命名为GBCZ017。

实施例4：利用重组大肠杆菌GBCZ003和GBCZ017在供氧充足的条件下用摇瓶工艺比较其产生PHA能力。

种子生长培养基(LB)：酵母粉5g/L；胰蛋白胨10g/L；NaCl 10g/L，pH7.0。

发酵培养基(g/L)：2g/L NH₄Cl，0.2g/L MgSO₄.7H₂O，9g/LNa₂HPO₄.12H₂O，1.5g/L KH₂PO₄，50ul/L氨苄青霉素和1ml/L微量元素(1mol/L HCl中(g/L)：9.7g FeCl₃，7.8g CaCl₂，0.218g CoCl₂.6H₂O，0.156g CuSO₄.5H₂O，0.118g NiCl₂.6H₂O，0.105g CrCl₃.6H₂O，0.05gMnCl₂.4H₂O，0.06g ZnSO₄.7H₂O)，pH6.8，葡萄糖40g/L，1，4-丁二醇浓度为0.5％(V/V)。

以各100ul接种量将含有15％甘油的-80℃保藏的重组大肠杆菌GBCZ003和GBCZ017分别接种于100ml(500ml三角瓶)菌体生长培养基(LB)中。以八层纱布覆盖。37℃，220rpm在全温振荡器中培养5小时。

将在LB中培养好的菌体各自按照1∶10的比例将30ml菌液接入装在500ml三角瓶中的上述发酵培养基100ml中，以八层无菌纱布覆盖。30℃，220rpm在全温振荡器中培养40小时。在培养8小时后加入IPTG至终浓度为0.05mM诱导orfZ基因表达。离心收集30ml菌体干燥称重获得发酵细胞干重。离心收集50ml菌体用氯仿/乙醇沉淀法(体积比1∶4)提取P(3HB-co-4HB)进行气相色谱检测，得到P(3HB-co-4HB)胞内含量百分比(胞内蓄积量百分比)本发明中用P(34HB)/DCW(％)表示：

共进行平行三组实验，结果见表1。

表1重组菌株GBCZ003和GBCZ017摇瓶发酵对比实验结果

	批次	细胞干重(DCW)(g/L)	P(34HB)/DCW(％)	4HB含量(％)
					GBCZ003	1	1.85	41.50	3.37
2	1.87	38.99	4.16
				3		1.91	45.26	3.90
平均值	1.88	41.92	3.81
				GBCZ017		1	1.76	36.64	3.29
2	1.90	40.29	4.04
					3	1.51	39.89	2.71
平均值	1.75	38.94	3.35

检测方法：称取8-10mg干细胞，加入2ml氯仿，然后加入1.7ml甲醇，再加入0.3ml浓硫酸，100℃酯化4小时，酯化后的液体加入1ml水，振荡后取下层有机相进行气相色谱检测(Braunegg，G.et al.Eur.J.Microbiol.Biotechnol.1978，6：29-37)，计算得到重组大肠杆菌GBCZ003组细胞干重平均为1.88g/L，P(3HB-co-4HB)含量平均占细胞干重的41.92％，4HB的摩尔百分含量平均为3.81mol％；重组大肠杆菌GBCZ017组细胞干重平均为1.75g/L，P(3HB-co-4HB)含量平均占细胞干重的38.94％，4HB的摩尔百分含量平均为3.35mol％。

实施例5：利用重组大肠杆菌GBCZ003和GBCZ017在供氧不充足的条件下用摇瓶工艺比较其产生PHA的能力。

所有试验原料、步骤同实施例4；将发酵液的摇瓶装量100ml改为250ml，并将覆盖的纱布由八层改为二十四层。

共进行平行三组实验，结果见表2。

表2重组菌株GBCZ003和GBCZ017摇瓶发酵对比实验结果

	批次	细胞干重(DCW)(g/L)	P(34HB)/DCW(％)	4HB含量(％)
					GBCZ003组	1	1.78	37.45	3.76
2	1.64	45.53	4.21
				3		1.82	51.28	3.94
平均值	1.75	44.75	3.97
				GBCZ017组		1	1.23	34.69	3.54
2	1.45	33.10	3.22
					3	1.19	38.10	3.02
平均值	1.29	35.30	3.26

计算得到重组大肠杆菌GBCZ003组细胞干重平均为1.75g/L，P(3HB-co-4HB)含量平均占细胞干重的44.75％，4HB的摩尔百分含量平均为3.97mol％；重组大肠杆菌GBCZ017组细胞干重平均为1.29g/L，P(3HB-co-4HB)含量平均占细胞干重的35.30％，4HB的摩尔百分含量平均为3.26mol％。

SEQUENCE LISTING

SEQ No.1

<110>天津国韵生物科技有限公司

<120>生产聚羟基脂肪酸酯的重组菌株及其构建方法与应用

<130>Doi，et al.，1990，Int.J.Biol.Macromol.12：106

<160>6

<170>Patentln version 3.1

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

catcgatgga cgctggggtt aaaagtat                           28

SEQ No.2

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gatcgatgtc ccaagttttg gcaacagc                           28

SEQ No.3

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gcatatggag tgggaagaga tatataaag                          29

SEQ No.4

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cggatcctaa aatctctttt taaattc                            27

SEQ No.5

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

taccttgccg acatctatgc gctg                               24

SEQ No.6

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gctggctgcg ccgctgccct gattctatg                               29

Claims (5)

1.一种表达3-羟基丁酸(3HB)和4-羟基丁酸(4HB)共聚物P(3HB-co-4HB)的重组质粒pGB_PHA，其特征在于含有来自于罗氏真养菌的PHB的生物合成途径基因以及来自克氏梭酸菌的编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶基因和来自透明颤菌的VHb基因。

2.重组菌株GBCZ003。

3.一种获得权利要求1所述的重组质粒的方法，包括：

(1)克隆透明颤菌血红蛋白得到重组质粒pET_VHb

(2)克隆4-羟基丁酰辅酶A转移酶基因得到质粒pET_VHb_orfZ；

(3)克隆PHB生物合成途径基因获得质粒pCR_PHB；

(4)将(1)、(2)和(3)所述的基因在大肠杆菌宿主细胞中表达获得重组质粒pGB_PHA。

4.一种利用权利要求2所述的重组菌株产生P(3HB-co-4HB)的方法，包括：

(1)对重组菌株进行培养；

(2)对重组菌株进行发酵；

(3)分离发酵液，提取目的物P(3HB-co-4HB)。

5.一种利用权利要求2所述的重组菌株大规模生产P(3HB-co-4HB)的方法。

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