CN101139575B - 极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶及其编码基因与应用。该聚羟基脂肪酸酯合酶，由PhaEHh亚基和PhaCHh亚基组成；所述phaEHh亚基的氨基酸残基序列如序列表中序列1所示；所述PhaCHh亚基的氨基酸残基序列如序列表中序列2所示。本发明的聚羟基脂肪酸酯合酶具有很高的PHA合酶活性，将本发明的聚羟基脂肪酸酯合酶基因phaECHh导入宿主菌中可高效表达PHA合酶，可以提高极端嗜盐古菌PHA合酶活性及PHA产量。
Description
技术领域
本发明涉及一种极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶及其编码基因与应用。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(PHA)是羟基脂肪酸单体组成的线性聚酯，作为一种碳源和能源的储备物广泛存在于自然界的多种原核微生物体内，包括极端嗜盐古菌中。公众对于石油塑料引起的“白色污染”问题的日益关注促进了化学家、微生物学家、分子生物学家对微生物制造的生物可降解塑料的合成与应用研究的强烈兴趣(Biochem.J.376：15-33，2003)。由于PHA是由可再生资源合成的并且可生物降解，还具有组织相容性特点，因此其商业应用日益受到重视。目前已知的应用领域包括可生物降解的薄膜、容器等包装材料，以及缝合线、药物释放载体、聚合物支架等医用材料等(Microbiol.Mol.Biol.Rev.63：21-53，1999)。
细菌中PHA的工业化生产及应用还主要是PHB(聚羟基丁酸酯)和PHBV(聚羟基丁酸羟基戊酸酯)，但因为其加工性能尚有缺陷，各国学者还在致力于开发性能更加优良的PHA，并对PHA合酶进行系统研究(Nat.Prod.Rep.20：445-57，2003)。PHA合酶是PHA合成过程中的关键酶，按照合酶聚合单体的长度，它可分为聚合短链单体(长度3-5个碳原子)和聚合中长链单体(长度大于6个碳原子)的两类。细菌中已经克隆了50多个合酶的基因，主要是因为细菌中PHA的相关研究已进行了80余年，并获得了短链PHA合酶的缺失突变株Cupriavidus necator PHB-4和中长链PHA合酶的缺失突变株Pseudomonas putida GPp104，突变株的获得促进了细菌域PHA合成菌株中PHA合酶基因的克隆。
极端嗜盐古菌作为PHA的生产菌株有其独特的优点(Macromol.Biosci.7：218-26，2007)：可以利用低廉的淀粉、废糖蜜等作为碳源；高盐环境可以简化高压灭菌甚至省略灭菌；菌体在水溶液中非常容易裂解，从而简化了PHA的提取过程。因此可以降低PHA生产成本。另外，一些极端嗜盐古菌合成的PHBV性能上要优于细菌来源的PHBV，因此在极端嗜盐古菌中寻求性能更佳的PHA已经成为众多科研工作者的研究方向。目前国际上对极端嗜盐古菌中PHA的研究工作还主要集中在发酵工艺的研究上，至今编码PHA合酶基因的功能验证还未见报道，更无类似于细菌中PHA合酶的高效表达菌株和缺失突变株。因此极端嗜盐古菌PHA合酶基因的发现，及遗传工程技术的发展，对于嗜盐古菌PHA的生物工程开发具有极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶及其编码基因与应用。
本发明所提供的极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶，名称为PhaECHh，来源于极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS 1.2049，是由PhaEHh亚基和PhaCHh亚基组成；所述PhaEHh亚基具有序列表中序列1的氨基酸残基序列或将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有聚羟基脂肪酸酯合酶亚基功能的由序列1衍生的氨基酸残基序列；所述PhaCHh亚基具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有聚羟基脂肪酸酯合酶亚基功能的由序列2衍生的氨基酸残基序列。
在基因工程生产该合酶用于体外合成PHA及其衍生物方面，为了使所述PhaECHh、PhaEHh亚基或PhaCHh亚基分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定，可在所述PhaECHh、PhaEHh亚基或PhaCHh亚基的N端连接上信号肽序列；为了PhaECHh便于纯化，可在PhaECHh、PhaEHh亚基或PhaCHh亚基的N端或C端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 11 | EQKLISEEDL |
序列表中序列1由181位氨基酸残基组成；序列表中序列2由474位氨基酸残基组成。
上述极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的编码基因(phaECHh)也属于本发明的保护范围。
所述极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的编码基因，包括极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的PhaEHh亚基和PhaCHh亚基的编码序列(phaEHh和phaCHh)；
所述PhaEHh亚基的编码序列，可为如下1)、2)或3)的核苷酸序列，所述PhaCHh亚基的编码序列，可为如下4)、5)或6)的核苷酸序列：
1)自序列表中序列3的5′端第409-1051位脱氧核苷酸序列；
2)编码序列表中序列1所示蛋白质序列的多核苷酸；
3)在严格条件下与序列表中序列3的5′端第409-1051位限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4)自序列表中序列3的5′端第1058-2479位脱氧核苷酸序列；
5)编码序列表中序列1所示蛋白质序列的多核苷酸；
6)在严格条件下与序列表中序列3的5′端第1058-2479位限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。
所述极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的编码基因的核苷酸序列优选为序列表中序列3所述的核苷酸序列。
序列表中序列3是由2948个脱氧核苷酸组成；自5′端第509-511位核苷酸序列为phaEHh的起始密码子，自5′端第1052-1054位核苷酸序列为phaEHh的终止密码子，自5′端第409-1051位核苷酸序列为phaEHh编码序列，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列；自5′端第1058-1060位核苷酸序列为phaEHh的起始密码子，自5′端第2480-2482位核苷酸序列为phaEHh的终止密码子，自5′端第1058-2479位核苷酸序列为phaEHh编码序列，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列；自5′端第450-508位核苷酸序列为所述极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的编码基因phaECHh的启动子区域，其中序列第475-483位核苷酸序列为该启动子的核心序列。
含有上述基因的工程菌、转基因细胞系或重组表达载体也属于本发明保护范围。
本发明还提供一种缺失聚羟基脂肪酸酯合酶功能的极端嗜盐古菌工程菌。
所述缺失聚羟基脂肪酸酯合酶功能的极端嗜盐古菌工程菌是将极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组中序列表中序列3自5′端第509-2479位所示的聚羟基脂肪酸酯合酶编码基因突变，得到的失去其聚羟基脂肪酸酯合酶功能的重组工程菌。
所述突变是将序列表中序列3的自5′端第435-2479位核苷酸中部分序列利用同源重组的方法缺失；优选为将极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组中序列表中序列3的自5′端第435-1891位核苷酸利用同源重组的方法缺失。
通过基因敲除、和过表达实验证明本发明的聚羟基脂肪酸酯合酶具有很高的PHA合酶活性，将本发明的聚羟基脂肪酸酯合酶及其亚基的编码基因phaECHh、phaEHh、phaCHh导入宿主菌中可高效表达PHA合酶，可以提高极端嗜盐古菌PHA合酶活性及PHA产量。
附图说明
图1为Haloarcula hispanica AS1.2049中PHA合酶基因的克隆策略示意图
图2为整合载体pUBPHL的构建示意图
图3为极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049 phaECHh双交换原理示意图
图4为极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049 phaECHh单交换与双交换PCR验证图谱
图5为极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica PHB-1及其重组菌积累PHB的气相色谱检测结果
具体实施方式
实施例1、聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶及其编码基因的获得(克隆策略示意图如图1所示)
1、聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶两个亚基(PhaEHh和PhaCHh)及其编码基因的获得
极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049与全基因组序列已经公布的极端嗜盐古菌Haloarcula marismortui ATCC 43049(GenBank号：AY596297)具有非常近的亲缘关系，根据极端嗜盐古菌Haloarcula marismortui ATCC 43049的全基因组序列中有一个PHA合酶亚基基因注释为phaCHm，本实验室研究证明了其上游毗邻的一个未注释基因功能的ORF编码了PHA合酶的另外一个亚基，并将其命名为phaEHm。根据极端嗜盐古菌Haloarcula marismortui ATCC 43049中phaCHm和phaEHm的序列设计了P1/P2和P3/P4两对引物。
P1：5′CTAGGATCCATGTCCAGCAACCCCTTC 3′(BamHI)
P2：5′CGTGGTACCTTACAGTTGATCGAGCCA 3′(KpnI)
P3：5′GGCGGATCCATGAGTAATACAAACAAC 3′(BamHI)
P4：5′GCGGAATTCTTATTCTTCTAAGTGTTC 3′(EcoRI)
以极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组为模板，用引物对P1和P2为上下游引物进行PCR扩增，得到550bp长度的PCR产物。
以极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组为模板，用引物对P3和P4为上下游引物进行PCR扩增；得到1450bp长度的PCR产物。
上述PCR扩增程序均为：94℃3min预变性；然后94℃45s、56℃45s、72℃120s进行30个循环；72℃再延伸7min。扩增体系均为25μL。
将这两个PCR扩增产物片段分别连接到pUCm-T载体上进行测序，测序结果表明引物对P1和P2扩增得到了546bp的序列，具有序列表中序列3的自5′端第509-1054位核苷酸序列，编码序列表中序列1的氨基酸残基序列；引物对P3和P4扩增得到了1425bp的序列，具有序列表中序列3的自5′端第1058-2482位核苷酸序列，编码序列表中序列2的氨基酸残基序列。将该两端序列在NCBI上进行同源比对分析，发现546bp的序列编码的氨基酸序列(序列表中序列1)与极端嗜盐古菌Haloarcula marismortui ATCC 43049的PhaEHm(GenBank号：YP_137338)具有96％的同源性，1425bp的序列编码的氨基酸序列(序列表中序列2)与极端嗜盐古菌Haloarcula marismortui ATCC 43049的PhaCHm(GenBank号：YP_137339)具有94％的同源性，因此这两个序列就是极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶的两个亚基的编码序列。将扩增的具有序列表中序列3的自5′端第509-1054位核苷酸序列的聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶亚基的编码基因命名为phaEHh，其编码的具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶亚基蛋白质命名为PhaEHh；将扩增的具有序列表中序列3的自5′端第1058-2482位核苷酸序列的聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶亚基的编码基因命名为phaCHh，其编码的具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶亚基蛋白质命名为PhaCHh。
2、聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶两个亚基(PhaEHh和PhaCHh)的编码基因(phaEHh和phaCHh)的间隔序列及phaCHh的3′端序列和phaEHh的5′端核酸序列的获得
phaEHh和phaCHh的间隔序列还没有克隆得到，并且这两个聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶亚基的编码基因的5′端和3′端序列可能存在一定的错误序列。根据上述扩增并测序得到的phaEHh和phaCHh的序列设计了一对引物P5和P6：
P5：5′CGAGTCGATGATGGAGAT 3′
P6：5′GGACGACCGACCGCTCTT 3′
以极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组为模板，利用引物P5和P6进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃3min预变性；然后94℃30s、56℃30s、72℃60s进行30个循环；72℃再延伸7min；扩增体系为25μL。扩增得到500bp的片段，经过测序表明，扩增得到的片段为phaCHh和phaEHh的间隔序列以及phaEHh的3’序列和phaCHh的5’核酸序列，具有序列表中序列3的5′端第874—1373位核苷酸序列。
3、聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶编码基因的上下游序列克隆
根据极端嗜盐古菌Haloarcula marismortui ATCC 43049的phaEHm上游序列和phaCHm的下游序列设计引物P7和P8：
P7：5′AGAAGGCGCTCGAACAGA 3′
P8：5′CGGCAGGGGTGTCGACGT 3′
以极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组为模板，以P2和P7为引物，进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃3min预变性；然后94℃30s、56℃30s、72℃120s进行30个循环；72℃再延伸7min；扩增体系为25μL。扩增得到约1kb的片段；测序表明扩增得到phaEHh上游508bp的序列(序列表中序列3的5′端第1—508位核苷酸序列)和phaEHh序列(序列表中序列3的自5′端第509-1054位核苷酸序列)；
以极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组为模板，以P3和P8为引物，进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃3min预变性；然后94℃30s、56℃30s、72℃120s进行30个循环；72℃再延伸7min；扩增体系为25μL。扩增得到约1.8kp的片段；测序表明扩增得到phaCHh序列(序列表中序列3的自5′端第1058-2482位核苷酸序列)和phaCHh下游的序列(序列表中序列3的5’端第2483—2948位核苷酸序列)
以极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组为模板，以P7和P4为引物，进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃3min预变性；然后94℃30s、56℃30s、72℃150s进行30个循环；72℃再延伸7min；扩增体系为25μL。扩增得到了2482bp的核苷酸序列，测序表明具有序列3自5′端第1-2482位所述的核苷酸序列，包括完整的phaEHh(序列表中序列3的自5′端第509-1054位核苷酸序列)和phaCHh(序列表中序列3的自5′端第1058-2482位核苷酸序列)的基因序列，phaEHh前的启动子及其上游序列(序列表中序列3的自5’端第1-508位核苷酸序列)，该序列编码序列表中序列1和序列2所述的两段氨基酸残基序列，这两段氨基酸残基序列分别为聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶的两个亚基PhaEHh和PhaCHh的序列，PhaEHh和PhaCHh组成聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶，将该聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶命名为PhaECHh；将上述扩增得到的具有序列表中序列3自5′端第1-2482位的核苷酸序列的PhaECHh的编码基因命名为phaECHh。
实施例2、PHA合酶基因phaECHh及phaECHh的两个亚基的编码基因phaEHh和phaCHh的功能验证
1、在极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049中过表达PHA合酶基因phaECHh、phaEHh和phaCHh的重组质粒的构建及其过表达重组工程菌的构建
根据极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049已经克隆的序列信息设计如下引物：
PE1：5′ATTGGATCCCAACTCGAAGAAGTGCAG 3′(BamHI)
PE2：5′GGCGGTACCTTACTCTTCCAGGTGTTC 3′(KpnI)
PE3：5′CGCCCATGGCAACTCGAAGAAGTGCAG 3′(NcoI)
PE4：5′ATAGGATCCAATAGTACCTCGGCGGCG 3′(BamHI)
PC1：5′CTAGGATCCATGTCCAGCAACCCGTTT 3′(BamHI)
PC2：5′CGTGGTACCTTACAGTTGGTCGAGCCA 3′(KpnI)
1)以Haloarcula hispanica AS1.2049基因组DNA为模板，用引物PE1/PE2，PCR反应，扩增含phaEHh启动子的phaEHh片段；用引物PE3/PE4扩增phaEHh启动子片段PphaEHh；用引物PC1/PC2扩增phaCHh片段；用PE1/PC2扩增phaECHh片段。以上PCR反应条件均为：94℃3min预变性；然后94℃30s、56℃30s、72℃150s进行30个循环；72℃再延伸7min；扩增体系为25μL。回收所有PCR产物，然后用BamHI/KpnI分别双酶切经测序验证表明正确的含phaEHh启动子的phaEHh片段、phaCHh以及含phaEHh启动子的phaECHh片段；并用BamHI/KpnI双酶切穿梭载体pWL102(pWL102的信息和构建方法见文献Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5478-82)。回收pWL102载体片段和含phaEHh启动子的phaEHh片段、phaCHh以及含phaEHh启动子的phaECHh片段。分别将pWL102载体片段与酶切后的含phaEHh启动子的phaEHh片段、phaCHh或含phaEHh启动子的phaECHh片段连接后，用常规的CaCl2化学法分别转化大肠杆菌JM109，分别在含有氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，提取质粒，测序，将经测序表明含有phaEHh的重组载体命名为pWL102-E；含有phaECHh的重组载体命名为pWL102-EC；含有phaCHh的重组载体命名为pWL102-C′。用BamHI和NcoI分别切割pWL102-C′及上述扩增得到的phaEHh启动子片段PphaEHh，然后回收载体和酶切后的片段、连接后用常规的CaCl2化学法转化大肠杆菌JM109，在含有氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，测序，将测序表明含有含有phaEHh启动子和phaCHh片段的重组载体命名为pWL102-C。
2)将pWL102-E、pWL102-C、pWL102-EC和pWL102通过PEG介导的方法(Can.J.Microbiol.35：148-52.)分别转入极端嗜盐古菌Haloarcula hispanicaAS1.2049，在含有5g/L莫维诺林的AS-168固体平板(每升含有：5.0g酸水解酪素(casamino acids)，5.0g酵母提取物(yeast extract)，1.0g谷氨酸钠(sodium glutamate)，3.0g柠檬酸钠，200g NaCl，20g MgSO4·7H2O，2.0g KCl，0.36g FeSO4·4H2O and 0.36mgMnCl2·4H2O，pH 7.2)上筛选阳性转化子，并对阳性转化进行提取质粒测序验证，将经测序表明含有pWL102-E的极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049工程菌命名为Hh/pWL102-E，将经测序表明含有pWL102-C的极端嗜盐古菌Haloarculahispanica AS1.2049工程菌命名为Hh/pWL102-C，将经测序表明含有pWL102-EC的极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049工程菌命名为Hh/pWL102-EC，将经测序表明含有pWL102的极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049工程菌命名为Hh/pWL102。
2、重组工程菌Hh/pWL102-E、Hh/pWL102-C、Hh/pWL102-EC以及Hh/pWL102的PHA合酶酶活及PHA合成水平检测
将步骤1得到的重组工程菌Hh/pWL102-E、Hh/pWL102-C、Hh/pWL102-EC以及Hh/pWL102首先在AS-168培养基中37℃培养3-4天，使其进入对数生长期。然后按5％体积的接种量，接种在5升的发酵罐进行发酵，发酵培养基为MG培养基(每升含有：200g NaCl，20g MgSO4·7H2O，2g KCl，1g谷氨酸钠，37.5mg KH2PO4，50mg FeSO4·7H2O，0.36mg MnCl2·4H2O，1g酵母提取物，20g葡萄糖，pH7.2)，发酵温度为37℃。培养96小时和144小时各收集一次菌体。
将收集的菌体分别置于敞口的离心管中，放在真空冷冻干燥器中冰干，然后称取约75mg冰干的菌体，将其置于酯化管中，然后加入2mL酯化液(3％体积的浓硫酸溶于甲醇中，含1g/L苯甲酸作为内标)和2mL氯仿，混匀后将其置于100℃的烤箱中酯化4小时，然后用气相色谱分别检测PHA合成情况。结果表明，在144小时时，工程菌Hh/pWL102-E、Hh/pWL102-C、Hh/pWL102-EC的PHA产量均大幅度提高，其中同时导入phaEHh和phaCHh两个基因的重组菌Hh/pWL102-EC比导入空载pWL102的工程菌Hh/pWL102提高了1倍的PHA含量，而由于重组菌Hh/pWL102-EC比野生菌菌体生长更好，因而PHB产量约提高至导入pWL102的工程菌Hh/pWL102的2.3倍，达5克/升发酵液。而工程菌Hh/pWL102-E、Hh/pWL102-C中PHB产量也均提高至导入pWL102的工程菌Hh/pWL102的1.8倍。
离心收集15mL重组菌的菌体，用0.5mL缓冲液SAT(20mM Tris-HCl(pH7.5)，3.4M KCl，100μM Mg(OAC)2)悬浮菌体，然后超声破碎菌体，即得到了全息细胞粗提物。然后测定全细胞粗提物的PHA酶活(按照文献Arch.Biochem.Biophys.403：284-91所述的方法进行)。结果表明单独导入phaEHh基因的重组工程菌Hh/pWL102-E的PHA合酶酶活是Hh/pWL102工程菌的2倍，单独导入phaCHh基因的重组工程菌Hh/pWL102-C的PHA合酶酶活是Hh/pWL102工程菌的1.6倍，而同时导入phaEHh和phaCHh两个基因的重组菌Hh/pWL102-EC的PHA合酶酶活是Hh/pWL102工程菌酶活的2.7倍。
上述结果表明，通过采用嗜盐菌的高拷贝质粒作为载体和强启动子来过表达本发明的PHA合酶基因phaECHh或本发明的PHA合酶亚基编码基因phaEHh、phaCHh，可以大大提高野生菌的PHA合酶的酶活。若为含有本发明的PHA合酶基因phaECHh的重组菌提供充足的PHA合成前体，也就可以用来高效的生产PHA。这为以后构建高产PHA的重组菌，实际生产PHA提供了基因基础。
实施例3、PHA合酶基因缺失突变株Haloarcula hispanica PHB-1的构建及其功能验证
1、破坏phaECHh的同源重组整合质粒pUBPHL的构建
pUBPHL的构建过程如图2所示，具体的实施方式如下：
1)出发质粒pUBP的构建
pUBP2是极端嗜盐古菌和大肠杆菌的穿梭质粒(pUBP2序列信息和构建方法见见文献Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：6772-6)。首先用EcoRI酶切pUBP2去除pUBP2中嗜盐古菌的复制子pHH9，得到6.6kb的线形片段，然后将该6.6kb的线形片段自连后形成质粒pUBP，用于构建整合载体pUBPHL所用。
2)用于破坏phaECHh的同源重组双交换臂的扩增
根据phaCHh和phaEHh的核苷酸序列，设计了两对双交换臂的扩增引物N1/N2和C1/C2：
N1：5′GCGAAGCTTCCAGCAAAACGTCAACAG 3′(HindIII)
N2：5′TATGGATCCCTTCGGCCTGCACTTCCT 3′(BamHI)
C1：5′TATGGATCCCTCGAAGACGTGTATCAGGAC 3′(BamHI)
C2：5′TATGGTACCCGGGATTCGGTGGTTTCG 3′(KpnI)
以极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的全基因组为模板，用引物对N1和N2扩增破坏phaECHh的双交换左臂(pha-L)，PCR扩增程序为：94℃3min预变性；然后94℃30s、56℃30s、72℃30s进行30个循环；72℃再延伸7min；扩增体系为：25μL；扩增得到434bp的片段，经测序表明该片段具有序列表中序列3的自5′端第1-434位核苷酸序列，即为破坏phaECHh的左臂(pha-L)；
以极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的全基因组为模板，用引物对C1和C2扩增破坏phaECHh的双交换右臂(pha-R)，PCR扩增程序为：94℃3min预变性；然后94℃30s、56℃30s、72℃30s进行30个循环；72℃再延伸7min；扩增体系为25μL。扩增得到563bp的片段，经测序表明该片段具有序列表中序列3的自5′端第1892-2454位核苷酸序列，即为破坏phaECHh的右臂(pha-R)。凝胶回收PCR产物pha-L和pha-R。
3)破坏phaECHh的整合载体pUBPHL的构建
用BamHI和KpnI分别双酶切载体pUBP和PCR产物pha-R，回收载体和片段、连接、CaCl2化学法转化大肠杆菌JM109，在含有氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，并测序验证，将经验证含有pha-R的重组载体命名为pUBP-R。
右臂成功连入后，再用HindIII和BamHI分别双酶切连有右臂的pUBP重组载体pUBP-R和PCR产物pha-L，回收载体和片段、连接、CaCl2化学法转化大肠杆菌JM109，在含有氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，并测序验证，将经验证表明含有pha-L和pha-R完整的双交换整合载体命名为pUBPHL。
2、PHA合酶基因phaECHh缺失突变株Haloarcula hispanica PHB-1的构建
通过pUBPHL的双交换臂与极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049基因组中的phaECHh进行同源重组，破坏Haloarcula hispanica AS1.2049基因组中的phaECHh，该同源重组双交换原理示意图如图3所示，具体步骤如下所述：
1)整合载体pUBPHL转化Haloarcula hispanica AS1.2049
采用PEG介导的方法(按照文献Can.J.Microbiol.35：148-52.所述的方法)将pUBPHL转化极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049，由于pUBPHL缺少极端嗜盐古菌的复制子，在有抗性选择的压力下菌株只能通过载体上与基因组的同源序列重组到极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组上，转化后在含有5g/L莫维诺林的AS-168固体平板上筛选转化子。
2)筛选PHA合酶基因的单交换菌株
在步骤1)得到的转化子中，有的菌株虽然对莫维诺林有抗性却没有发生重组，因此筛选单交换菌株需对转化子进行PCR验证：抽取总DNA，以PL
(5′CAACTCGAAGAAGTGCAG 3′)和C2作为引物反应，反应体系为：1×PCR缓冲液，dNTPs0.2μM，Mg2+1.5μL(终浓度1.5μM)，PL和C2各1μL(终浓度0.4nM)，Taq DNA聚合酶1μl(3U)；反应条件为先94℃3min预变性；然后94℃45s、56℃45s、72℃120s进行30个循环；72℃再延伸7min。PCR产物大小如果为2087bp，说明克隆是野生型菌株；如果PCR产物有两种，大小分别为2087bp和630bp，说明克隆是发生了单交换(图3，图4中泳道3)筛选到的phaECHh单交换菌株可以进行下一步双交换菌株的筛选。图4中泳道1为极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049野生菌阴性对照(PCR产物大小2087bp)；泳道2为pUBPHL质粒阳性对照(PCR产物大小630bp)；泳道3为发生phaECHh单交换的极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049菌株；泳道4为发生phaECHh双交换phaECHh缺失的极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049菌株；泳道M为1kbmarker。
3)同源重组双交换后缺失PHA合酶基因的突变工程菌株(Haloarcula hispanicaPHB-1)的筛选
将步骤2)筛选到的PHA合酶基因的单交换菌株，在含有莫维诺林的培养基中其整合的质粒稳定存在，故将步骤2)筛选到的PHA合酶基因的单交换菌株在不含莫维诺林的液体AS-168培养基中传代培养80代，重复转接培养4次，使其发生二次交换。然后将传代培养的培养液倍比稀释109，在固体AS-168培养基平板上涂布均匀，培养一周左右得到单克隆，挑取单克隆分别先后在不含或含有5g/L莫维诺林的固体培养基上划线，做两次重复。待菌生长一周后，挑取在抗性平板上不生长但在非抗性平板上生长的单菌落，抽提其基因组DNA作为模板，同样以PL和C2作为引物进行PCR验证，反应体系和条件如上所述。如果PCR产物有两种，大小分别为2087bp和630bp，说明菌落中有发生双交换的菌，也有回复野生型的菌。如果PCR产物大小为2087bp，说明菌体中通过单交换整合到基因组上的质粒已经从发生整合的位点脱落下来，并在没有复制子和抗性选择压力的情况下丢失，转化子已经回复到野生型。如果PCR产物大小为630bp，说明整合在基因组上的质粒在另外一个同源序列处发生了二次交换，环化后的质粒由于缺少复制子而丢失，即：整合载体pUBPHL根据连入的左臂pha-L和右臂pha-R与基因组的高度同源性，将基因组上完整的phaECHh基因替换下来。图4所示，泳道4的PCR结果证明：已经筛选到发生双交换的菌株，将其命名为Haloarcula hispanica PHB-1。
3、PHA合酶基因phaECHh缺失突变株Haloarcula hispanica PHB-1积累能力的验证
对Haloarcula hispanica PHB-1在积累PHA的培养基中验证此菌株在缺失了PHA合酶的情况下是否还有积累PHA的能力，用野生菌作为阳性对照。具体操作如下所示：
1)将Haloarcula hispanica PHB-1在AS-168培养基中37℃培养3-4天，使其进入对数生长期。
2)按5％的接种量，将Haloarcula hispanica PHB-1接种在MG培养基中37℃继续培养3天，然后离心收集菌体。
3)将收集的菌体冰干，酯化后用气相色谱进行检测。检测结果如图5A和B所示，结果表明野生菌在MG培养基中可积累PHA(图5A)，而Haloarcula hispanicaPHB-1在相同的培养条件下由于缺失了PHA合酶的两个编码基因，而不能够合成PHA(图5B)。
实施例4、Haloarcula hispanica PHB-1在验证其它PHA合酶功能中的应用
将Haloarcula marismortui ATCC 43049的两个合酶基因phaEHm和phaCHm导入Haloarcula hispanica PHB-1，以验证PHA合酶的功能，具体操作如下：
1)首先根据根据极端嗜盐古菌Haloarcula marismortui ATCC 43049的基因组序列信息设计如下引物：
LE1：5′ATTGGATCCCAGCTCGAAGAAGTGCAG 3′(BamHI)
LE2：5′GGCGGTACCTTATTCTTCTAAGTGTTC 3′(KpnI)
LE3：5′CGCCCATGGCAGCTCGAAGAAGTGCAG 3′(NcoI)
LE4：5′ATAGGATCCAATAGTACCTCGGCGGCG 3′(BamHI)
LC1：5′CTAGGATCCATGTCCAGCAACCCCTTC 3′(BamHI)
LC2：5′CGTGGTACCTTACAGTTGATCGAGCCA 3′(KpnI)
1)以Haloarcula marismortui ATCC 43049基因组DNA为模板，用引物LE1/LE2，PCR反应，扩增含phaEHm启动子的phaEHm片段；用引物LE3/LE4扩增phaEHm启动子片段PphaEHm；用引物LC1/LC2扩增phaCHm片段；用LE1/LC2扩增phaECHm片段。以上PCR反应条件均为：94℃3min预变性；然后94℃30s、56℃30s、72℃150s进行30个循环；72℃再延伸7min；扩增体系为25μL。回收所有PCR产物，然后用BamHI/KpnI分别双酶切经测序验证表明正确的含phaEHm启动子的phaEHm片段、phaCHm以及含phaEHm启动子的phaECHm片段；并用BamHI/KpnI双酶切穿梭载体pWL102(参见文献Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5478-82)。回收pWL102载体片段和含phaEHm启动子的phaEHm片段、phaCHm以及含phaEHm启动子的phaECHm片段。分别将pWL102载体片段与酶切后的含phaEHm启动子的phaEHm片段、phaCHm或含phaEHm启动子的phaECHm片段连接后，用常规的CaCl2化学法分别转化大肠杆菌JM109，分别在含有氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，提取质粒，测序，将经测序表明含有phaEHm的重组载体命名为pWL102-Em；含有phaECHm的重组载体命名为pWL102-ECm；含有phaCHm的重组载体命名为pWL102-Cm′。用BamHI和NcoI分别切割pWL102-Cm′及上述扩增得到的phaEHm启动子片段PphaEHm，然后回收载体和酶切后的片段、连接后用常规的CaCl2化学法转化大肠杆菌JM109，在含有氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，测序，将测序表明含有含有phaEHm启动子和phaCHhm片段的重组载体命名为pWL102-Cm。
然后将质粒pWL102-Cm、pWL102-Em及pWL102-ECm分别通过上述PEG介导的方法转入Haloarcula hispanica PHB-1，在含有5g/L的莫维诺林的AS-168固体平板上筛选阳性转化子，并进行测序验证阳性转化子，将验证正确的含有pWL102-Cm的Haloarcula hispanica PHB-1工程菌命名为PHB-1/pWL102-Cm，将验证正确的含有pWL102-Em的Haloarcula hispanica PHB-1工程菌命名为PHB-1/pWL102-Em，将验证正确的含有pWL102-ECm的Haloarcula hispanica PHB-1工程菌命名为PHB-1/pWL102-ECm。
2)将步骤1)得到的PHB-1/pWL102-Cm、PHB-1/pWL102-Em或PHB-1/pWL102-ECm、野生菌极端嗜盐古菌Haloarcula Hispanica AS1.2049(阳性对照)、Haloarcula Hispanica PHB-1(阴性对照)按照实施例2中步骤2的所述的方法发酵，收集菌体，经过甲酯化处理后，气相色谱检测PHA的积累情况。检测结果如图5所示，phaEHm或phaCHm导入Haloarcula hispanica PHB-1(PHB-1/pWL102-Cm或PHB-1/pWL102-Em)，没有PHA的积累(图5C和D)；只有当phaEHm和phaCHm共同导入Haloarcula hispanica PHB-1(PHB-1/pWL102-ECm)才能够积累PHA(图5E)，其含量和产量均与极端嗜盐古菌Haloarcula Hispanica AS1.2049野生菌相当。图5中A为极端嗜盐古菌Haloarcula Hispanica AS1.2049野生菌；B为HaloarculaHispanica PHB-1；C为PHB-1/pWL102-Em；D为PHB-1/pWL102-Cm；E为PHB-1/pWL102-ECm；F为PHB标准样品(购自Sigma)。气相色谱检测的各样品经过甲醇高温处理生成羟基脂肪酸甲酯，4.85min的出峰位置对应1ng苯甲酸的甲酯化产物(内标)。
另外，按照实施例2步骤2所述的方法测定了PHB-1/pWL102-Cm、PHB-1/pWL102-Em或PHB-1/pWL102-ECm全细胞粗提物的PHA合酶的酶活。结果证明，PHB-1/pWL102-Cm、PHB-1/pWL102-Em发酵后均没有检测到酶活。而PHB-1/pWL102-ECm获得了与Haloarcula marismortui AS1.2049野生菌相当的酶活，PHB-1/pWL102-ECm的PHA合酶酶活为1U/mg全细胞蛋白。这个实验首次证明Haloarcula marismortui的PHA合酶也由两个亚基PhaEhm和PhaChm组成.
上述实验和结果表明，Haloarcula hispanica PHB-1可以作为一株宿主菌来验证自于极端嗜盐古菌的PHA合酶基因功能，这不仅为将来在嗜盐菌领域中筛选到新型的PHA合酶基因奠定了良好的基础，而且也可以为将来构建新型PHA高产菌株提供了宿主。
序列表
<160>3
<210>1
<211>181
<212>PRT
<213>极端嗜盐古菌(Haloarcula hispanica)
<400>1
<210>2
<211>474
<212>PRT
<213>极端嗜盐古菌(Haloarcula hispanica)
<400>2
<210>3
<211>2948
<212>DNA
<213>极端嗜盐古菌(Haloarcula hispanica)
<400>3
Claims (12)
1.一种极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶，由PhaEHh亚基和PhaCHh亚基组成；所述phaEHh亚基的氨基酸残基序列如序列表中序列1所示；所述PhaCHh亚基的氨基酸残基序列如序列表中序列2所示。
2.权利要求1所述的极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述PhaEHh亚基的编码序列为自序列表中序列3的5′端第409-1051位脱氧核苷酸序列；所述PhaCHh亚基的编码序列为自序列表中序列3的5′端第1058-2479位脱氧核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列3所述的核苷酸序列。
5.含有权利要求2-4中任意一项所述基因的工程菌。
6.含有权利要求2-4中任意一项所述基因的转基因细胞系。
7.含有权利要求2-4中任意一项所述基因的重组表达载体。
8.一种提高工程菌聚羟基脂肪酸酯产量的方法，是将权利要求2-4中任意一项所述的极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的编码基因或权利要求3所述的极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的phaCHh亚基的编码基因导入宿主细胞中，得到聚羟基脂肪酸酯产量提高的工程菌或转基因细胞系。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞为极端嗜盐古菌。
10.一种缺失聚羟基脂肪酸酯合酶功能的极端嗜盐古菌工程菌，是将极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组中序列表中序列3的自5′端第435-1891位核苷酸突变，得到的失去其聚羟基脂肪酸酯合酶功能的重组工程菌。
11.根据权利要求10所述的工程菌，其特征在于：所述突变是将极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组中序列表中序列3的自5′端第435-1891位核苷酸利用同源重组的方法缺失。
12.权利要求10或11所述的缺失聚羟基脂肪酸酯合酶功能的极端嗜盐古菌工程菌在验证其它PHA合酶及其编码基因功能中的应用。
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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| 王玉华,等,.PHAS合酶phaC2基因转化烟草叶绿体的研究.农业生物技术学报14 2.2006,14(2),213-218. * |
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