CN101139575A

CN101139575A - 极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101139575A
Application number: CNA2007101199864A
Authority: CN
Inventors: 向华; 韩静; 陆秋鹤
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2007-08-06
Filing date: 2007-08-06
Publication date: 2008-03-12
Anticipated expiration: 2027-08-06
Also published as: CN101139575B

Abstract

本发明公开了一种极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶及其编码基因与应用。该聚羟基脂肪酸酯合酶，是由PhaE_Hh亚基和PhaC_Hh亚基组成；所述PhaE_Hh亚基具有序列表中序列1的氨基酸残基序列或将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的氨基酸残基序列；所述PhaC_Hh亚基具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的氨基酸残基序列。本发明的聚羟基脂肪酸酯合酶具有很高的PHA合酶活性，将本发明的聚羟基脂肪酸酯合酶基因phaEC_Hh导入宿主菌中可高效表达PHA合酶，可以提高极端嗜盐古菌PHA合酶活性及PHA产量。

Description

极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶及其编码基因与应用。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是羟基脂肪酸单体组成的线性聚酯，作为一种碳源和能源的储备物广泛存在于自然界的多种原核微生物体内，包括极端嗜盐古菌中。公众对于石油塑料引起的“白色污染”问题的日益关注促进了化学家、微生物学家、分子生物学家对微生物制造的生物可降解塑料的合成与应用研究的强烈兴趣(Biochem.J.376：15-33，2003)。由于PHA是由可再生资源合成的并且可生物降解，还具有组织相容性特点，因此其商业应用日益受到重视。目前已知的应用领域包括可生物降解的薄膜、容器等包装材料，以及缝合线、药物释放载体、聚合物支架等医用材料等(Microbiol.Mol.Biol.Rev.63：21-53，1999)。

细菌中PHA的工业化生产及应用还主要是PHB(聚羟基丁酸酯)和PHBV(聚羟基丁酸羟基戊酸酯)，但因为其加工性能尚有缺陷，各国学者还在致力于开发性能更加优良的PHA，并对PHA合酶进行系统研究(Nat.Prod.Rep.20：445-57，2003)。PHA合酶是PHA合成过程中的关键酶，按照合酶聚合单体的长度，它可分为聚合短链单体(长度3-5个碳原子)和聚合中长链单体(长度大于6个碳原子)的两类。细菌中已经克隆了50多个合酶的基因，主要是因为细菌中PHA的相关研究已进行了80余年，并获得了短链PHA合酶的缺失突变株Cupriavidus necator PHB^-4和中长链PHA合酶的缺失突变株Pseudomonas putida GPp104，突变株的获得促进了细菌域PHA合成菌株中PHA合酶基因的克隆。

极端嗜盐古菌作为PHA的生产菌株有其独特的优点(Macromol.Biosci.7：218-26，2007)：可以利用低廉的淀粉、废糖蜜等作为碳源；高盐环境可以简化高压灭菌甚至省略灭菌；菌体在水溶液中非常容易裂解，从而简化了PHA的提取过程。因此可以降低PHA生产成本。另外，一些极端嗜盐古菌合成的PHBV性能上要优于细菌来源的PHBV，因此在极端嗜盐古菌中寻求性能更佳的PHA已经成为众多科研工作者的研究方向。目前国际上对极端嗜盐古菌中PHA的研究工作还主要集中在发酵工艺的研究上，至今编码PHA合酶基因的功能验证还未见报道，更无类似于细菌中PHA合酶的高效表达菌株和缺失突变株。因此极端嗜盐古菌PHA合酶基因的发现，及遗传工程技术的发展，对于嗜盐古菌PHA的生物工程开发具有极其重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶及其编码基因与应用。

本发明所提供的极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶，名称为PhaEC_Hh，来源于极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS 1.2049，是由PhaE_Hh亚基和PhaC_Hh亚基组成；所述PhaE_Hh亚基具有序列表中序列1的氨基酸残基序列或将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有聚羟基脂肪酸酯合酶亚基功能的由序列1衍生的氨基酸残基序列；所述PhaC_Hh亚基具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有聚羟基脂肪酸酯合酶亚基功能的由序列2衍生的氨基酸残基序列。

在基因工程生产该合酶用于体外合成PHA及其衍生物方面，为了使所述PhaEC_Hh、PhaE_Hh亚基或PhaC_Hh亚基分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定，可在所述PhaEC_Hh、PhaE_Hh亚基或PhaC_Hh亚基的N端连接上信号肽序列；为了PhaEC_Hh便于纯化，可在PhaEC_Hh、PhaE_Hh亚基或PhaC_Hh亚基的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
标签	残基	序列	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Polv-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Polv-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK	c-myc	11	EQKLISEEDL

序列表中序列1由181位氨基酸残基组成；序列表中序列2由474位氨基酸残基组成。

上述极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的编码基因(phaEC_Hh)也属于本发明的保护范围。

所述极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的编码基因，包括极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的PhaE_Hh亚基和PhaC_Hh亚基的编码序列(phaE_Hh和phaC_Hh)；

所述PhaE_Hh亚基的编码序列，可为如下1)、2)或3)的核苷酸序列，所述PhaC_Hh亚基的编码序列，可为如下4)、5)或6)的核苷酸序列：

1)自序列表中序列3的5′端第409-1051位脱氧核苷酸序列；

2)编码序列表中序列1所示蛋白质序列的多核苷酸；

3)在严格条件下与序列表中序列3的5′端第409-1051位限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

4)自序列表中序列3的5′端第1058-2479位脱氧核苷酸序列；

5)编码序列表中序列1所示蛋白质序列的多核苷酸；

6)在严格条件下与序列表中序列3的5′端第1058-2479位限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

所述极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的编码基因的核苷酸序列优选为序列表中序列3所述的核苷酸序列。

序列表中序列3是由2948个脱氧核苷酸组成；自5′端第509-511位核苷酸序列为phaE_Hh的起始密码子，自5′端第1052-1054位核苷酸序列为phaE_Hh的终止密码子，自5′端第409-1051位核苷酸序列为phaE_Hh编码序列，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列；自5′端第1058-1060位核苷酸序列为phaE_Hh的起始密码子，自5′端第2480-2482位核苷酸序列为phaE_Hh的终止密码子，自5′端第1058-2479位核苷酸序列为phaE_Hh编码序列，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列；自5′端第450-508位核苷酸序列为所述极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的编码基因phaEC_Hh的启动子区域，其中序列第475-483位核苷酸序列为该启动子的核心序列。

含有上述基因的工程菌、转基因细胞系或重组表达载体也属于本发明保护范围。

本发明还提供一种缺失聚羟基脂肪酸酯合酶功能的极端嗜盐古菌工程菌。

所述缺失聚羟基脂肪酸酯合酶功能的极端嗜盐古菌工程菌是将极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组中序列表中序列3自5′端第509-2479位所示的聚羟基脂肪酸酯合酶编码基因突变，得到的失去其聚羟基脂肪酸酯合酶功能的重组工程菌。

所述突变是将序列表中序列3的自5′端第435-2479位核苷酸中部分序列利用同源重组的方法缺失；优选为将极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组中序列表中序列3的自5′端第435-1891位核苷酸利用同源重组的方法缺失。

通过基因敲除、和过表达实验证明本发明的聚羟基脂肪酸酯合酶具有很高的PHA合酶活性，将本发明的聚羟基脂肪酸酯合酶及其亚基的编码基因phaEC_Hh、phaE_Hh、phaC_Hh导入宿主菌中可高效表达PHA合酶，可以提高极端嗜盐古菌PHA合酶活性及PHA产量。

附图说明

图1为Haloarcula hispanica AS1.2049中PHA合酶基因的克隆策略示意图

图2为整合载体pUBPHL的构建示意图

图3为极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049phaEC_Hh双交换原理示意图

图4为极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS 1.2049phaEC_Hh单交换与双交换PCR验证图谱

图5为极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica PHB-1及其重组菌积累PHB的气相色谱检测结果

具体实施方式

实施例1、聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶及其编码基因的获得(克隆策略示意图如图1所示)

1、聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶两个亚基(PhaE_Hh和PhaC_Hh)及其编码基因的获得

极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS 1.2049与全基因组序列已经公布的极端嗜盐古菌Haloarcula marismortui ATCC 43049(GenBank号：AY596297)具有非常近的亲缘关系，根据极端嗜盐古菌Haloarcula marismortui ATCC 43049的全基因组序列中有一个PHA合酶亚基基因注释为phaC_Hm，本实验室研究证明了其上游毗邻的一个未注释基因功能的ORF编码了PHA合酶的另外一个亚基，并将其命名为phaE_Hm。根据极端嗜盐古菌Haloarcula marismortui ATCC 43049中phaC_Hm和phaE_Hm的序列设计了P1/P2和P3/P4两对引物。

P1：5′CTAGGATCCATGTCCAGCAACCCCTTC3′(BamHI)

P2：5′CGTGGTACCTTACAGTTGATCGAGCCA3′(KpnI)

P3：5′GGCGGATCCATGAGTAATACAAACAAC3′(BamHI)

P4：5′GCGGAATTCTTATTCTTCTAAGTGTTC3′(EcoRI)

以极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组为模板，用引物对P1和P2为上下游引物进行PCR扩增，得到550bp长度的PCR产物。

以极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组为模板，用引物对P3和P4为上下游引物进行PCR扩增；得到1450bp长度的PCR产物。

上述PCR扩增程序均为：94℃3min预变性；然后94℃45s、56℃45s、72℃120s进行30个循环；72℃再延伸7min。扩增体系均为25μL。

将这两个PCR扩增产物片段分别连接到pUCm-T载体上进行测序，测序结果表明引物对P1和P2扩增得到了546bp的序列，具有序列表中序列3的自5′端第509-1054位核苷酸序列，编码序列表中序列1的氨基酸残基序列；引物对P3和P4扩增得到了1425bp的序列，具有序列表中序列3的自5′端第1058-2482位核苷酸序列，编码序列表中序列2的氨基酸残基序列。将该两端序列在NCBI上进行同源比对分析，发现546bp的序列编码的氨基酸序列(序列表中序列1)与极端嗜盐古菌Haloarcula marismortuiATCC 43049的PhaE_Hm(GenBank号：YP_137338)具有96％的同源性，1425bp的序列编码的氨基酸序列(序列表中序列2)与极端嗜盐古菌Haloarcula marismortui ATCC 43049的PhaC_Hm(GenBank号：YP_137339)具有94％的同源性，因此这两个序列就是极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶的两个亚基的编码序列。将扩增的具有序列表中序列3的自5′端第509-1054位核苷酸序列的聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶亚基的编码基因命名为phaE_Hh，其编码的具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶亚基蛋白质命名为PhaE_Hh；将扩增的具有序列表中序列3的自5′端第1058-2482位核苷酸序列的聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶亚基的编码基因命名为phaC_Hh，其编码的具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶亚基蛋白质命名为PhaC_Hh。

2、聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶两个亚基(PhaE_Hh和PhaC_Hh)的编码基因(phaE_Hh和phaC_Hh)的间隔序列及phaC_Hh的3′端序列和phaE_Hh的5′端核酸序列的获得

phaE_Hh和phaC_Hh的间隔序列还没有克隆得到，并且这两个聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶亚基的编码基因的5′端和3′端序列可能存在一定的错误序列。根据上述扩增并测序得到的phaE_Hh和phaC_Hh的序列设计了一对引物P5和P6：

P5：5′CGAGTCGATGATGGAGAT3′

P6：5′GGACGACCGACCGCTCTT3′

以极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组为模板，利用引物P5和P6进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃3min预变性；然后94℃30s、56℃30s、72℃60s进行30个循环；72℃再延伸7min；扩增体系为25μL。扩增得到500bp的片段，经过测序表明，扩增得到的片段为phaC_Hh和phaE_Hh的间隔序列以及phaE_Hh的3’序列和phaC_Hh的5’核酸序列，具有序列表中序列3的5′端第874-1373位核苷酸序列。

3、聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶编码基因的上下游序列克隆

根据极端嗜盐古菌Haloarcula marismortui ATCC 43049的paE_Hm上游序列和phaC_Hm的下游序列设计引物P7和P8：

P7：5′AGAAGGCGCTCGAACAGA3′

P8：5′CGGCAGGGGTGTCGACGT3′

以极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组为模板，以P2和P7为引物，进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃3min预变性；然后94℃30s、56℃30s、72℃120s进行30个循环；72℃再延伸7min；扩增体系为25μL。扩增得到约1kb的片段；测序表明扩增得到phaE_Hh上游508bp的序列(序列表中序列3的5′端第1-508位核苷酸序列)和phaE_Hh序列(序列表中序列3的自5′端第509-1054位核苷酸序列)；

以极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组为模板，以P3和P8为引物，进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃3min预变性；然后94℃30s、56℃30s、72℃120s进行30个循环；72℃再延伸7min；扩增体系为25μL。扩增得到约1.8kp的片段；测序表明扩增得到phaC_Hh序列(序列表中序列3的自5′端第1058-2482位核苷酸序列)和phaC_Hh下游的序列(序列表中序列3的5’端第2483-2948位核苷酸序列)

以极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组为模板，以P7和P4为引物，进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃3min预变性；然后94℃30s、56℃30s、72℃150s进行30个循环；72℃再延伸7min；扩增体系为25μL。扩增得到了2482bp的核苷酸序列，测序表明具有序列3自5′端第1-2482位所述的核苷酸序列，包括完整的phaE_Hh(序列表中序列3的自5′端第509-1054位核苷酸序列)和phaC_Hh(序列表中序列3的自5′端第1058-2482位核苷酸序列)的基因序列，phaE_Hh前的启动子及其上游序列(序列表中序列3的自5’端第1-508位核苷酸序列)，该序列编码序列表中序列1和序列2所述的两段氨基酸残基序列，这两段氨基酸残基序列分别为聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶的两个亚基PhaE_Hh和PhaC_Hh的序列，PhaE_Hh和PhaC_Hh组成聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶，将该聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶命名为PhaEC_Hh；将上述扩增得到的具有序列表中序列3自5′端第1-2482位的核苷酸序列的PhaEC_Hh的编码基因命名为phaEC_Hh。

实施例2、PHA合酶基因phaEC_Hh及phaEC_Hh的两个亚基的编码基因phaE_Hh和phaC_Hh的功能验证

1、在极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049中过表达PHA合酶基因phaEC_Hh、phaE_Hh和phaC_Hh的重组质粒的构建及其过表达重组工程菌的构建

根据极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049已经克隆的序列信息设计如下引物：

PE1：5，ATTGGATCCCAACTCGAAGAAGTGCAG3′(BamHI)

PE2：5，GGCGGTACCTTACTCTTCCAGGTGTTC3′(KpnI)

PE3：5，CGCCCATGGCAACTCGAAGAAGTGCAG3′(NcoI)

PE4：5′ATAGGATCCAATAGTACCTCGGCGGCG3′(BamHI)

PC1：5，CTAGGATCCATGTCCAGCAACCCGTTT3′(BamHI)

PC2：5′CGTGGTACCTTACAGTTGGTCGAGCCA3′(KpnI)

1)以Haloarcula hispanica AS1.2049基因组DNA为模板，用引物PE1/PE2，PCR反应，扩增含phaE_Hh启动子的phaE_Hh片段；用引物PE3/PE4扩增phaE_Hh启动子片段PphaE_Hh；用引物PC1/PC2扩增phaC_Hh片段：用PE1/PC2扩增phaEC_Hh片段。以上PCR反应条件均为：94℃3min预变性；然后94℃30s、56℃30s、72℃150s进行30个循环；72℃再延伸7min；扩增体系为25μL。回收所有PCR产物，然后用BamHI/KpnI分别双酶切经测序验证表明正确的含phaE_Hh启动子的phaE_Hh片段、phaC_Hh以及含phaE_Hh启动子的phaEC_Hh片段；并用BamHI/KpnI双酶切穿梭载体pWL102(pWL102的信息和构建方法见文献Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5478-82)。回收pWL102载体片段和含phaE_Hh启动子的phaE_Hh片段、phaC_Hh以及含phaE_Hh启动子的phaEC_Hh片段。分别将pWL102载体片段与酶切后的含phaE_Hh启动子的phaE_Hh片段、phaC_Hh或含phaE_Hh启动子的phaEC_Hh片段连接后，用常规的CaCl₂化学法分别转化大肠杆菌JM109，分别在含有氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，提取质粒，测序，将经测序表明含有phaE_Hh的重组载体命名为pWL102-E；含有phaEC_Hh的重组载体命名为pWL102-EC；含有phaC_Hh的重组载体命名为pWL102-C′。用BamHI和NcoI分别切割pWL102-C′及上述扩增得到的phaE_Hh启动子片段PphaE_Hh，然后回收载体和酶切后的片段、连接后用常规的CaCl₂化学法转化大肠杆菌JM109，在含有氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，测序，将测序表明含有含有phaE_Hh启动子和phaC_Hh片段的重组载体命名为pWL102-C。

2)将pWL102-E、pWL102-C、pWL102-EC和pWL102通过PEG介导的方法(Can.J.Microbiol.35：148-52.)分别转入极端嗜盐古菌Haloarcula hispanicaAS1.2049，在含有5g/L莫维诺林的AS-168固体平板(每升含有：5.0g酸水解酪素(casamino acids)，5.0g酵母提取物(yeast extract)，1.0g谷氨酸钠(sodium glutamate)，3.0g柠檬酸钠，200g NaCl，20g MgSO₄·7H₂O，2.0g KCl，0.36g FeSO₄·4H₂O and 0.36mgMnCl₂·4H₂O，pH7.2)上筛选阳性转化子，并对阳性转化进行提取质粒测序验证，将经测序表明含有pWL102-E的极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049工程菌命名为Hh/pWL102-E，将经测序表明含有pWL102-C的极端嗜盐古菌Haloarculahispanica AS1.2049工程菌命名为Hh/pWL102-C，将经测序表明含有pWL102-EC的极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049工程菌命名为Hh/pWL102-EC，将经测序表明含有pWL102的极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049工程菌命名为Hh/pWL102。

2、重组工程菌Hh/pWL102-E、Hh/pWL102-C、Hh/pWL102-EC以及Hh/pWL102的PHA合酶酶活及PHA合成水平检测

将步骤1得到的重组工程菌Hh/pWL102-E、Hh/pWL102-C、Hh/pWL102-EC以及Hh/pWL102首先在AS-168培养基中37℃培养3-4天，使其进入对数生长期。然后按5％体积的接种量，接种在5升的发酵罐进行发酵，发酵培养基为MG培养基(每升含有：200g NaCl，20g MgSO₄·7H₂O，2g KCl，1g谷氨酸钠，37.5mg KH₂PO₄，50mg FeSO₄·7H₂O，0.36mg MnCl₂·4H₂O，1g酵母提取物，20g葡萄糖，pH7.2)，发酵温度为37℃。培养96小时和144小时各收集一次菌体。

将收集的菌体分别置于敞口的离心管中，放在真空冷冻干燥器中冰干，然后称取约75mg冰干的菌体，将其置于酯化管中，然后加入2mL酯化液(3％体积的浓硫酸溶于甲醇中，含1g/L苯甲酸作为内标)和2mL氯仿，混匀后将其置于100℃的烤箱中酯化4小时，然后用气相色谱分别检测PHA合成情况。结果表明，在144小时时，工程菌Hh/pWL102-E、Hh/pWL102-C、Hh/pWL102-EC的PHA产量均大幅度提高，其中同时导入phaE_Hh和phaC_Hh两个基因的重组菌Hh/pWL102-EC比导入空载pWL102的工程菌Hh/pWL102提高了1倍的PHA含量，而由于重组菌Hh/pWL102-EC比野生菌菌体生长更好，因而PHB产量约提高至导入pWL102的工程菌Hh/pWL102的2.3倍，达5克/升发酵液。而工程菌Hh/pWL102-E、Hh/pWL102-C中PHB产量也均提高至导入pWL102的工程菌Hh/pWL102的1.8倍。

离心收集15mL重组菌的菌体，用0.5mL缓冲液SAT(20mM Tris-HCl(pH 7.5)，3.4M KCl，100μM Mg(OAC)₂)悬浮菌体，然后超声破碎菌体，即得到了全息细胞粗提物。然后测定全细胞粗提物的PHA酶活(按照文献Arch.Biochem.Biophys.403：284-91所述的方法进行)。结果表明单独导入phaE_Hh基因的重组工程菌Hh/pWL102-E的PHA合酶酶活是Hh/pWL102工程菌的2倍，单独导入phaC_Hh基因的重组工程菌Hh/pWL102-C的PHA合酶酶活是Hh/pWL102工程菌的1.6倍，而同时导入phaE_Hh和phaC_Hh两个基因的重组菌Hh/pWL102-EC的PHA合酶酶活是Hh/pWL102工程菌酶活的2.7倍。

上述结果表明，通过采用嗜盐菌的高拷贝质粒作为载体和强启动子来过表达本发明的PHA合酶基因phaEC_Hh或本发明的PHA合酶亚基编码基因phaE_Hh、phaC_Hh，可以大大提高野生菌的PHA合酶的酶活。若为含有本发明的PHA合酶基因phaEC_Hh的重组菌提供充足的PHA合成前体，也就可以用来高效的生产PHA。这为以后构建高产PHA的重组菌，实际生产PHA提供了基因基础。

实施例3、PHA合酶基因缺失突变株Haloarcula hispanica PHB^-1的构建及其功能验证

1、破坏phaEC_Hh的同源重组整合质粒pUBPHL的构建

pUBPHL的构建过程如图2所示，具体的实施方式如下：

1)出发质粒pUBP的构建

pUBP2是极端嗜盐古菌和大肠杆菌的穿梭质粒(pUBP2序列信息和构建方法见见文献Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6772-6)。首先用EcoRI酶切pUBP2去除pUBP2中嗜盐古菌的复制子pHH9，得到6.6kb的线形片段，然后将该6.6kb的线形片段自连后形成质粒pUBP，用于构建整合载体pUBPHL所用。

2)用于破坏phaEC_Hh的同源重组双交换臂的扩增

根据phaC_Hh和phaE_Hh的核苷酸序列，设计了两对双交换臂的扩增引物N1/N2和C1/C2：

N1：5′GCGAAGCTTCCAGCAAAACGTCAACAG3′(HindIII)

N2：5′TATGGATCCCTTCGGCCTGCACTTCCT3′(BamHI)

C1：5′TATGGATCCCTCGAAGACGTGTATCAGGAC3′(BamHI)

C2：5′TATGGTACCCGGGATTCGGTGGTTTCG3′(KpnI)

以极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的全基因组为模板，用引物对N1和N2扩增破坏phaEC_Hh的双交换左臂(pha-L)，PCR扩增程序为：94℃3min预变性；然后94℃30s、56℃30s、72℃30s进行30个循环；72℃再延伸7min；扩增体系为：25μL；扩增得到434bp的片段，经测序表明该片段具有序列表中序列3的自5′端第1-434位核苷酸序列，即为破坏phaEC_Hh的左臂(pha-L)；

以极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的全基因组为模板，用引物对C1和C2扩增破坏phaEC_Hh的双交换右臂(pha-R)，PCR扩增程序为：94℃3min预变性；然后94℃30s、56℃30s、72℃30s进行30个循环；72℃再延伸7min；扩增体系为25μL。扩增得到563bp的片段，经测序表明该片段具有序列表中序列3的自5′端第1892-2454位核苷酸序列，即为破坏phaEC_Hh的右臂(pha-R)。凝胶回收PCR产物pha-L和pha-R。

3)破坏phaEC_Hh的整合载体pUBPHL的构建

用BamHI和KpnI分别双酶切载体pUBP和PCR产物pha-R，回收载体和片段、连接、CaCl₂化学法转化大肠杆菌JM109，在含有氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，并测序验证，将经验证含有pha-R的重组载体命名为pUBP-R。

右臂成功连入后，再用HindIII和BamHI分别双酶切连有右臂的pUBP重组载体pUBP-R和PCR产物pha-L，回收载体和片段、连接、CaCl₂化学法转化大肠杆菌JM109，在含有氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，并测序验证，将经验证表明含有pha-L和pha-R完整的双交换整合载体命名为pUBPHL。

2、PHA合酶基因phaEC_Hh缺失突变株Haloarcula hispanica PHB^-1的构建

通过pUBPHL的双交换臂与极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049基因组中的phaEC_Hh进行同源重组，破坏Haloarcula hispanica AS1.2049基因组中的phaEC_Hh，该同源重组双交换原理示意图如图3所示，具体步骤如下所述：

1)整合载体pUBPHL转化Haloarcula hispanica AS1.2049

采用PEG介导的方法(按照文献Can.J.Microbiol.35：148-52.所述的方法)将pUBPHL转化极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049，由于pUBPHL缺少极端嗜盐古菌的复制子，在有抗性选择的压力下菌株只能通过载体上与基因组的同源序列重组到极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组上，转化后在含有5g/L莫维诺林的AS-168固体平板上筛选转化子。

2)筛选PHA合酶基因的单交换菌株

在步骤1)得到的转化子中，有的菌株虽然对莫维诺林有抗性却没有发生重组，因此筛选单交换菌株需对转化子进行PCR验证：抽取总DNA，以PL(5′CAACTCGAAGAAGTGCAG3′)和C2作为引物反应，反应体系为：1×PCR缓冲液，dNTPs 0.2μM，Mg²⁺1.5μL(终浓度1.5μM)，PL和C2各1μL(终浓度0.4nM)，Taq DNA聚合酶1μl(3U)；反应条件为先94℃3min预变性；然后94℃45s、56℃45s、72℃120s进行30个循环；72℃再延伸7min。PCR产物大小如果为2087bp，说明克隆是野生型菌株；如果PCR产物有两种，大小分别为2087bp和630bp，说明克隆是发生了单交换(图3，图4中泳道3)筛选到的phaEC_Hh单交换菌株可以进行下一步双交换菌株的筛选。图4中泳道1为极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049野生菌阴性对照(PCR产物大小2087bp)；泳道2为pUBPHL质粒阳性对照(PCR产物大小630bp)；泳道3为发生phaEC_Hh单交换的极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049菌株；泳道4为发生phaEC_Hh双交换phaEC_Hh缺失的极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049菌株；泳道M为1kbmarker。

3)同源重组双交换后缺失PHA合酶基因的突变工程菌株(Haloarcula hispanicaPHB^-1)的筛选

将步骤2)筛选到的PHA合酶基因的单交换菌株，在含有莫维诺林的培养基中其整合的质粒稳定存在，故将步骤2)筛选到的PHA合酶基因的单交换菌株在不含莫维诺林的液体AS-168培养基中传代培养80代，重复转接培养4次，使其发生二次交换。然后将传代培养的培养液倍比稀释109，在固体AS-168培养基平板上涂布均匀，培养一周左右得到单克隆，挑取单克隆分别先后在不含或含有5g/L莫维诺林的固体培养基上划线，做两次重复。待菌生长一周后，挑取在抗性平板上不生长但在非抗性平板上生长的单菌落，抽提其基因组DNA作为模板，同样以PL和C2作为引物进行PCR验证，反应体系和条件如上所述。如果PCR产物有两种，大小分别为2087bp和630bp，说明菌落中有发生双交换的菌，也有回复野生型的菌。如果PCR产物大小为2087bp，说明菌体中通过单交换整合到基因组上的质粒已经从发生整合的位点脱落下来，并在没有复制子和抗性选择压力的情况下丢失，转化子已经回复到野生型。如果PCR产物大小为630bp，说明整合在基因组上的质粒在另外一个同源序列处发生了二次交换，环化后的质粒由于缺少复制子而丢失，即：整合载体pUBPHL根据连入的左臂pha-L和右臂pha-R与基因组的高度同源性，将基因组上完整的phaEC_Hh基因替换下来。图4所示，泳道4的PCR结果证明：已经筛选到发生双交换的菌株，将其命名为Haloarcula hispanica PHB^-1。

3、PHA合酶基因phaEC_Hh缺失突变株Haloarcula hispanica PHB^-1积累能力的验证

对Haloarcula hispanica PHB^-1在积累PHA的培养基中验证此菌株在缺失了PHA合酶的情况下是否还有积累PHA的能力，用野生菌作为阳性对照。具体操作如下所示：

1)将Haloarcula hispanica PHB^-1在AS-168培养基中37℃培养3-4天，使其进入对数生长期。

2)按5％的接种量，将Haloarcula hispanica PHB^-1接种在MG培养基中37℃继续培养3天，然后离心收集菌体。

3)将收集的菌体冰干，酯化后用气相色谱进行检测。检测结果如图5A和B所示，结果表明野生菌在MG培养基中可积累PHA(图5A)，而Haloarcula hispanicaPHB^-1在相同的培养条件下由于缺失了PHA合酶的两个编码基因，而不能够合成PHA(图5B)。

实施例4、Haloarcula hispanica PHB^-1在验证其它PHA合酶功能中的应用

将Haloarcula marismortui ATCC 43049的两个合酶基因phaE_Hm和phaC_Hm导入Haloarcula hispanica PHB^-1，以验证PHA合酶的功能，具体操作如下：

1)首先根据根据极端嗜盐古菌Haloarcula marismortui ATCC 43049的基因组序列信息设计如下引物：

LE1：5，ATTGGATCCCAGCTCGAAGAAGTGCAG3′(BamHI)

LE2：5，GGCGGTACCTTATTCTTCTAAGTGTTC3′(KpnI)

LE3：5′CGCCCATGGCAGCTCGAAGAAGTGCAG3′(NcoI)

LE4：5，ATAGGATCCAATAGTACCTCGGCGGCG3′(BamHI)

LC1：5，CTAGGATCCATGTCCAGCAACCCCTTC3′(BamHI)

LC2：5，CGTGGTACCTTACAGTTGATCGAGCCA3′(KpnI)

1)以Haloarcula marismortui ATCC 43049基因组DNA为模板，用引物LE1/LE2，PCR反应，扩增含phaE_Hm启动子的phaE_Hm片段；用引物LE3/LE4扩增phaE_Hm启动子片段PphaE_Hm；用引物LC1/LC2扩增phaC_Hm片段；用LE1/LC2扩增phaEC_Hm片段。以上PCR反应条件均为：94℃3min预变性；然后94℃30s、56℃30s、72℃150s进行30个循环；72℃再延伸7min；扩增体系为25μL。回收所有PCR产物，然后用BamHI/KpnI分别双酶切经测序验证表明正确的含phaE_Hm启动子的phaE_Hm片段、phaC_Hm以及含phaE_Hm启动子的phaEC_Hm片段；并用BamHI/KpnI双酶切穿梭载体pWL102(参见文献Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5478-82)。回收pWL102载体片段和含phaE_Hm启动子的phaE_Hm片段、phaC_Hm以及含phaE_Hm启动子的phaEC_Hm片段。分别将pWL102载体片段与酶切后的含phaE_Hm启动子的phaE_Hm片段、phaC_Hm或含phaE_Hm启动子的phaEC_Hm片段连接后，用常规的CaCl₂化学法分别转化大肠杆菌JM109，分别在含有氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，提取质粒，测序，将经测序表明含有phaE_Hm的重组载体命名为pWL102-Em；含有phaEC_Hm的重组载体命名为pWL102-ECm；含有phaC_Hm的重组载体命名为pWL102-Cm′。用BamHI和NcoI分别切割pWL102-Cm′及上述扩增得到的phaE_Hm启动子片段PphaE_Hm，然后回收载体和酶切后的片段、连接后用常规的CaCl₂化学法转化大肠杆菌JM109，在含有氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，测序，将测序表明含有含有phaE_Hm启动子和phaC_Hmm片段的重组载体命名为pWL102-Cm。

然后将质粒pWL102-Cm、pWL102-Em及pWL102-ECm分别通过上述PEG介导的方法转入Haloarcula hispanica PHB^-1，在含有5g/L的莫维诺林的AS-168固体平板上筛选阳性转化子，并进行测序验证阳性转化子，将验证正确的含有pWL102-Cm的Haloarcula hispanica PHB^-1工程菌命名为PHB^-1/pWL102-Cm，将验证正确的含有pWL102-Em的Haloarcula hispanica PHB^-1工程菌命名为PHB^-1/pWL102-Em，将验证正确的含有pWL102-ECm的Haloarcula hispanica PHB^-1工程菌命名为PHB^-1/pWL102-ECm。

2)将步骤1)得到的PHB^-1/pWL102-Cm、PHB^-1/pWL102-Em或PHB^-1/pWL102-ECm、野生菌极端嗜盐古菌Haloarcula Hispanica AS1.2049(阳性对照)、Haloarcula Hispanica PHB-1(阴性对照)按照实施例2中步骤2的所述的方法发酵，收集菌体，经过甲酯化处理后，气相色谱检测PHA的积累情况。检测结果如图5所示，phaE_Hm或phaC_Hm导入Haloarcula hispanica PHB^-1(PHB^-1/pWL 102-Cm或PHB^-1/pWL102-Em)，没有PHA的积累(图5C和D)；只有当phaE_Hm和phaC_Hm共同导入Haloarcula hispanica PHB^-1(PHB^-1/pWL102-ECm)才能够积累PHA(图5E)，其含量和产量均与极端嗜盐古菌Haloarcula Hispanica AS1.2049野生菌相当。图5中A为极端嗜盐古菌Haloarcula Hispanica AS1.2049野生菌；B为HaloarculaHispanica PHB-1；C为PHB^-1/pWL102-Em；D为PHB^-1/pWL102-Cm；E为PHB^-1/pWL102-ECm；F为PHB标准样品(购自Sigma)。气相色谱检测的各样品经过甲醇高温处理生成羟基脂肪酸甲酯，4.85min的出峰位置对应1ng苯甲酸的甲酯化产物(内标)。

另外，按照实施例2步骤2所述的方法测定了PHB^-1/pWL102-Cm、PHB^-1/pWL102-Em或PHB^-1/pWL102-ECm全细胞粗提物的PHA合酶的酶活。结果证明，PHB^-1/pWL102-Cm、PHB^-1/pWL102-Em发酵后均没有检测到酶活。而PHB^-1/pWL102-ECm获得了与Haloarcula marismortui AS1.2049野生菌相当的酶活，PHB^-1/pWL102-ECm的PHA合酶酶活为1U/mg全细胞蛋白。这个实验首次证明Haloarcula marismortui的PHA合酶也由两个亚基PhaE_hm和PhaC_hm组成.

上述实验和结果表明，Haloarcula hispanica PHB^-1可以作为一株宿主菌来验证自于极端嗜盐古菌的PHA合酶基因功能，这不仅为将来在嗜盐菌领域中筛选到新型的PHA合酶基因奠定了良好的基础，而且也可以为将来构建新型PHA高产菌株提供了宿主。

序列表

<160>3

<210>1

<211>181

<212>PRT

<213>极端嗜盐古菌(Haloarcula hispanica)

<400>1

Met Ser Asn Thr Asn Asn Ile Gln Glu Glu Trp Thr Glu Met Val Glu

1 5 10 15

Glu Met Asn Asn Ala Val Ala Asp Ser Met Glu Gln Asn Met Lys Ala

20 25 30

Gln Ala Ala Phe Val Glu Ser Trp Ala Asp Ala Val Glu Asp Thr Ile

35 40 45

Pro Lys Glu Glu Asp Leu Ala Asp Gly Met Asp Gly Tyr Asn Arg Ala

50 55 60

Tyr Glu Glu Trp Ile Asp Ala Ala Glu Gln Met Val Glu Arg Ser Thr

65 70 75 80

Asp Ala Ala Gln Gly Glu Asp Val Asp Pro Ala Glu Phe Arg Asp Ile

85 90 95

Trp Leu Gln Ser Ala Asn Glu Ala Phe Lys His Val Met Gly Thr Ser

100 105 110

Ala Phe Ala Ala Ala Asn Gly Gln Leu Val Glu Ser Met Met Glu Met

115 120 125

Gln Gln Glu Ala Asp Asp Leu Ser Gln Asp Ala Leu Glu Gln Met Gly

130 135 140

Phe Pro Thr Arg Asn Asp Val Asp Glu Val Ala Glu Arg Leu Ile Glu

145 150 155 160

Leu Glu Arg Arg Gln His Ala Val Glu Gln Lys Leu Asp Arg Val Leu

165 170 175

Glu His Leu Glu Glu

180

<210>2

<211>474

<212>PRT

<213>极端嗜盐古菌(Haloarcula hispanica)

<400>2

Met Ser Ser Asn Pro Phe Asn Pro Phe Glu Ala Ala Leu Asn Trp Gln

1 5 10 15

Arg Lys Thr Leu Glu Asn Met Thr Asp Ala Ala Glu Thr Ser Gln Ile

20 25 30

Ala Asp Glu Arg Leu Glu Leu Met Glu Ser Val Glu Val Gly Gln Thr

35 40 45

Pro Ser Asp Val Val Tyr Glu Glu Asn Lys Leu Glu Leu Leu His Tyr

50 55 60

Asp Ala Glu Ala Thr Gly Ile Glu Val Ala Glu Glu Asp Lys Glu Ala

65 70 75 80

Val Pro Ile Leu Ile Val Tyr Ala Leu Ile Asn Arg Pro Tyr Ile Leu

85 90 95

Asp Leu Gln Glu Glu Arg Ser Val Val Arg Arg Leu Leu Glu Ala Gly

100 105 110

His Asp Val Tyr Leu Ile Asp Trp Asn Glu Pro Ser Arg Leu Asp Gln

115 120 125

His Leu Thr Leu Asp Asp Tyr Val Asn Arg Tyr Met Asp Asn Cys Val

130 135 140

Asp Val Val Arg Glu Arg Ser Gly Gln Asp Ala Ile Asn Ile Leu Gly

145 150 155 160

Tyr Cys Met Gly Gly Thr Met Ser Val Met Tyr Thr Ala Leu His Lys

165 170 175

Glu Lys Val Asn Thr Leu Gly Leu Met Ala Ala Gly Leu Cys Phe Asp

180 185 190

His Thr Gly Gly Val Leu Glu Glu Trp Gly Ser Glu Glu Tyr Tyr Ser

195 200 205

Pro Gln Asp Val Ala Asp Thr Phe Gly Asn Val Pro Ser Asp Met Leu

210 215 220

Asp Ile Gly Phe Ala Leu Met Asp Pro Val Glu Asn Tyr Val Thr Lys

225 230 235 240

Tyr Ile Arg Phe Ala Glu Asn Met Glu Asn Glu Gly Phe Val Glu Asn

245 250 255

Phe Gly Arg Met Glu Gln Trp Leu Gly Asp Gly Ile Asp Val Ala Gly

260 265 270

Glu Ala Tyr Val Gln Phe Leu Glu Asp Val Tyr Gln Asp Asn Lys Leu

275 280 285

Tyr Lys Asn Glu Leu Glu Leu Asn Gly Lys His Val Asp Leu Asp Asn

290 295 300

Ile Asp Met Pro Val Leu Gln Leu Met Ser Glu Tyr Asp His Leu Ile

305 310 315 320

Pro Pro Glu Ala Ser Lys Pro Phe Asn Asp Val Ile Ala Ser Asp Asp

325 330 335

Thr Arg Thr Ile Glu Phe Ser Thr Gly His Ile Gly Leu Ser Val Ser

340 345 350

Ser Ser Thr His Ala Asp Leu Trp Pro Glu Val Ala Glu Trp Tyr Ser

355 360 365

Glu Arg Ser Thr Gly Gly Glu Glu Val Asp Ile Glu Val Glu Ser Pro

370 375 380

Glu Asp Asp Thr Val Asp Gln Ser Glu Ser Thr AspIle Glu Val Asp

385 390 395 400

Ala Thr Asp Asp Val Asp Ala Asp Ala Thr Glu Asp Asp Ala Asp Ala

405 410 415

Ala Asp Glu Pro Ala Asp Val Asp Ser Val Ser Gly Ile Gly Pro Thr

420 425 430

Tyr Ala Glu Arg Leu His Ala Ala Gly Ile His Ser Val Ala Asp Leu

435 440 445

Ala Glu Tyr Asp Ala Ala Glu Leu Ala Asp Ile Ala Glu Thr Thr Glu

450 455 460

Ser Arg Ala Gln Asp Trp Leu Asp Gln Leu

465 470

<210>3

<211>2948

<212>DNA

<213>极端嗜盐古菌(Haloarcula hispanica)

<400>3

ccagcaaaac gtcaacagcg cggtcatcga cagcctcgac acacaggagt cggcacagcg 60

ccgcggtgtc gagctccagc agaccgcgtt ccacagctat ctcgacgcga tggcgtcgac 120

gatgcccggc atgaccgaga ctgtcgagca gatccgcgag accgtcgacg agcagttcga 180

cttcctgctc gagaaccacg ccgaagtctt cgacaacatg gaaacggagc tcgaagaggg 240

cgctgacacc tacgacgaga tgaccgacga gtacgtcacc gccgtcaacg atcaggtcga 300

tatgctcgtc gaggcccacg aggaactcga agcgcagtct gtcgaggccg ccgagcagtt 360

cggcgagcaa ctcgaagaag tgcaggagca ggtcgaagag attcaggaac aggtcgagga 420

agtgcaggcc gaagccgccg acgctgtcga cgtcgaagcg taagtacgac agtcggtttt 480

tttgtgcgcc cgccgccgag gtactattat gagtaataca aacaacattc aggaggaatg 540

gacggagatg gttgaggaga tgaacaatgc ggtcgctgac tcgatggagc agaacatgaa 600

ggcacaggcg gccttcgtgg agtcgtgggc cgacgccgtc gaggacacga ttcccaaaga 660

agaggacctt gccgacggga tggatggcta caaccgcgcc tacgaagagt ggatcgacgc 720

cgccgagcag atggtcgagc gctcgaccga cgccgcgcag ggcgaggatg tcgaccccgc 780

cgagttccgt gatatctggc tgcagtccgc caacgaggcg ttcaaacacg tcatgggaac 840

ctcggccttc gcggccgcca acggccagct cgtcgagtcg atgatggaga tgcaacagga 900

ggccgacgac ctgagtcagg acgctctgga gcagatgggt ttcccaacgc gcaacgatgt 960

cgacgaagtt gctgagcggc tcatcgaact ggagcgccgt cagcacgcgg tcgaacagaa 1020

gcttgaccgc gttctcgaac acctggaaga gtaactcatg tccagcaacc cgtttaatcc 1080

gttcgaagcc gcgctcaact ggcagcgcaa gacgctggaa aacatgaccg acgccgccga 1140

gacgagtcag attgccgacg agcgactgga gctgatggag tccgtcgaag tcggccagac 1200

gcccagcgac gtcgtctacg aggagaacaa gctcgaactc ctccactacg acgccgaggc 1260

caccggcatc gaggtcgccg aggaggacaa ggaagccgtg ccgattctca tcgtgtacgc 1320

gctcatcaac cggccgtaca tcctcgacct gcaggaagag cggtcggtcg tccgacgcct 1380

gcttgaggcg ggccacgacg tgtacctcat cgactggaac gagccgtcgc ggctcgacca 1440

gcacctcacg ctcgatgact acgtcaaccg atacatggat aactgcgtcg acgtggtccg 1500

cgagcgctcc ggccaggacg ccatcaacat cctcggctac tgtatgggcg gcacgatgtc 1560

ggtgatgtac accgcgctcc acaaggagaa agtcaacacc ctgggcctga tggccgctgg 1620

gctgtgcttc gatcacaccg gcggcgtcct cgaagagtgg ggctccgagg agtactactc 1680

cccgcaggac gtcgccgata cgttcggcaa cgtcccctcg gacatgctcg acatcggctt 1740

cgcgctgatg gaccccgtcg agaactacgt cacgaagtac atccggttcg cggagaacat 1800

ggagaacgag ggcttcgtcg agaacttcgg ccggatggag cagtggctcg gtgacggtat 1860

cgacgtcgcc ggcgaggcct acgttcagtt cctcgaagac gtgtatcagg acaacaaact 1920

ctacaagaac gagcttgagc tcaacggcaa gcacgtcgac ctggacaaca tcgacatgcc 1980

cgtcctccag ctcatgagcg agtacgacca cctcatcccg ccggaggcct ccaagccgtt 2040

caacgacgtc atcgccagcg acgacacgcg aaccatcgag ttctcgacgg gccacatcgg 2100

tctctccgtc tcgtcgtcga cccacgctga cctctggccc gaggtcgccg agtggtactc 2160

cgagcgcagc acggggggcg aggaagtcga tatcgaggtc gagtcccctg aagacgacac 2220

agtggaccag tcggaatcca ctgatatcga ggttgacgcg actgacgatg tcgatgccga 2280

cgctaccgag gacgacgccg acgcagccga cgaacccgcc gacgtcgata gcgtctccgg 2340

tatcggcccc acctacgccg aacggctgca cgccgccggc attcacagcg tcgcggacct 2400

ggccgagtac gacgcggccg aactggccga tatcgccgaa accaccgaat cccgcgcgca 2460

agactggctc gaccaactgt aatccggcgg cgtttttctg tttcccgttg cacgaccagc 2520

tatgcgcgtc tcggtcatcg gcggctcgac agttaccgac gaacagtacc aacaggcacg 2580

cggggtcggg aaactactcg gtgagcacgg ccacgacgtc gtctgtggcg gtctcacggg 2640

tgtgatggaa gccgtctgtc gcggtgcggg cgaggcgggc ggtcacactc tcggtatttt 2700

acccggcgag cgccgggccg acgcgaacga ctacgtccag acagctatcg cgacggggat 2760

gggaaacgcc agaaacgtcc tcgtcgtgat gaacggcgcg gccgtcatcg ccgttgacgg 2820

cggcaccgga acgctctcgg aactcggcca cgccctcgac ataaatcgcc cagtcgccgg 2880

gctcggtacc caccgcctcg acggcgtggc cgacggcgac gccatcgaac acgtcgacac 2940

ccctgccg 2948

Claims

1.一种极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶，是由PhaE_Hh亚基和PhaC_Hh亚基组成；所述phaE_Hh亚基具有序列表中序列1的氨基酸残基序列或将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有聚羟基脂肪酸酯合酶亚基功能的由序列1衍生的氨基酸残基序列；所述PhaC_Hh亚基具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有聚羟基脂肪酸酯合酶亚基功能的由序列2衍生的氨基酸残基序列。

2.权利要求1所述的极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的编码基因，包括极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的PhaE_Hh亚基和PhaC_Hh亚基的编码序列；所述PhaE_Hh亚基的编码序列，为如下1)、2)或3)的核苷酸序列，所述PhaC_Hh亚基的编码序列，为如下4)、5)或6)的核苷酸序列：

1)自序列表中序列3的5′端第409-1051位脱氧核苷酸序列；

2)编码序列表中序列1所示蛋白质序列的多核苷酸；

3)在严格条件下与序列表中序列3的5′端第409-1051位限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)自序列表中序列3的5′端第1058-2479位脱氧核苷酸序列；

5)编码序列表中序列1所示蛋白质序列的多核苷酸；

4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列3所述的核苷酸序列。

5.含有权利要求2-4中任意一项所述基因的工程菌、转基因细胞系或重组表达载体。

6.一种提高工程菌聚羟基脂肪酸酯产量的方法，是将权利要求2-4中任意一项所述的极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的编码基因和/或权利要求3所述的极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的phaE_Hh亚基的编码基因和/或权利要求3所述的极端嗜盐古菌聚羟基脂肪酸酯合酶的phaC_Hh亚基的编码基因导入宿主细胞中，得到聚羟基脂肪酸酯产量提高的工程菌或转基因细胞系。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞为极端嗜盐古菌。

8.一种缺失聚羟基脂肪酸酯合酶功能的极端嗜盐古菌工程菌，是将极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组中序列表中序列3自5′端第509-2479位所示的聚羟基脂肪酸酯合酶编码基因突变，得到的失去其聚羟基脂肪酸酯合酶功能的重组工程菌。

9.根据权利要求8所述的工程菌，其特征在于：所述突变是将极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica AS1.2049的基因组中序列表中序列3的自5′端第435-1891位核苷酸利用同源重组的方法缺失。

10.权利要求8或9所述的缺失聚羟基脂肪酸酯合酶功能的极端嗜盐古菌工程菌在验证其它PHA合酶基及其编码基因功能中的应用。