CN104321427A - 用于生产聚-4-羟基丁酸酯的遗传工程微生物 - Google Patents

Abstract

本文描述了用于生产聚-4-羟基丁酸酯和4-碳产物的方法和遗传工程宿主。

Description

用于生产聚-4-羟基丁酸酯的遗传工程微生物

相关申请

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背景技术

生物基的可生物降解聚合物(如聚羟基链烷酸酯(PHA))在多种多样生物质系统(如植物生物质、微生物生物质(如细菌，包括蓝细菌、酵母菌、真菌)或藻类生物质)中产生。最近已经开发了生产广泛多种的可生物降解PHA聚合物和共聚物的遗传修饰生物质系统(Lee(1996),Biotechnology&Bioengineering 49:1-14；Braunegg等(1998),J.Biotechnology 65:127-161；Madison,L.L.和Huisman,G.W.(1999),Metabolic Engineering ofPoly-3-Hydroxyalkanoates；From DNA to Plastic,in:Microbiol.Mol.Biol.Rev.63:21-53)。

最近，产生“绿色”化学品的生物质系统的开发方面也有进展，所述“绿色”化学品举例来说如γ-丁内酯(Metabolix)、1,3-丙二醇(Dupont’s)、1,4-丁二醇(Genomatica)和琥珀酸(Bioamber)。与生物基PHA聚合物类似，这些生物基化学品已经通过遗传修饰生物质系统生产，这些遗传修饰生物质系统利用可再生原料，与传统的石油化学品生产方法相比具有较低的碳足迹和据说较低的生产成本。

随着石油资源的减少、能源价格增长以及环境问题，开发能效高的生物炼制方法以从可再生的、低成本的碳源生产生物基化学品为解决石油基化学品的越来越大的限制提供了独特的解决方案。

但是，这些方法的不利之处在于生物质中聚合物的量较低，其进一步导致随后的期望产物的量较低。因此，存在产生具有增加量的聚合物(如，聚-4-羟基丁酸酯)的遗传修饰生物体的需要，这些聚合物进而被加工成绿色化学品，从而克服现有方法的低产率、细胞毒性和低纯度的缺点。

发明内容

本发明大体上涉及增加来自可再生原料的4-碳(C4)产物或4-碳单体的聚合物的产量的方法，包括：提供具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性的遗传修饰生物体，使得与活性没有降低的野生型生物体相比，所述遗传修饰生物体的生长是减弱的；以及提供一种或多种稳定表达的基因，所述基因编码具有催化α-酮戊二酸脱羧成琥珀半醛的活性的酶；其中，生长被改善，且自可再生原料的4-碳(C4)产物或4-碳单体的聚合物的碳流量增加。

在本发明的任何方面的一些实施方式中，所述途径是聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)途径或1,4-丁二醇(BDO)途径。

本发明还涉及通过稳定并入一种或多种基因而增加遗传修饰生物体中的聚-4-羟基丁酸酯的量，所述一种或多种基因表达用于增加聚-4-羟基丁酸酯的产量的酶。用于产生P4HB的示例性途径在图1中示出，且应当理解，构成该途径的其它酶学变化也可以被引入或抑制以获得期望的P4HB产生。

在第一个方面，增加来自可再生原料的4-碳(C4)产物或4-碳单体的聚合物的产量的方法，包括：

a)提供具有修饰的C4代谢途径的遗传修饰生物体，以及

b)提供一种或多种稳定表达的基因，所述基因编码具有以下活性的一种或多种酶：i)催化α-酮戊二酸脱羧成琥珀半醛；ii)催化丙二酰辅酶A转化成丙二酸半醛；iii)催化L-乳醛转化成L-1,2-丙二醇并具有提高的氧化应激抗性；iv)催化延胡索酸为琥珀酸；v)催化丙酮酸的羧化；或vi)催化NADH为NADPH；其中，描述了与野生型或步骤a)的遗传修饰生物体相比，所述产物或聚合物的产量提高，和/或自可再生原料的4-碳(C4)产物或4-碳单体的聚合物的碳流量增加。

在第一个方面的第一个实施方式中，本发明涉及在具有聚-4-羟基丁酸酯途径的遗传修饰生物体(重组宿主)中产生增加的聚-4-羟基丁酸酯的方法。所述第一方面的酶催化聚-4-羟基丁酸酯途径中的反应之一，例如，丙二酰辅酶A还原酶还能够将Suc-CoA转化成琥珀半醛(SSA)(图1中的反应5)，但不促进至3-羟基丙酸的转化；氧化应急抗性1,2-丙二醇氧化还原酶还能够将SSA转化成4-羟基丁酸(图1中的反应8)；NADH依赖性延胡索酸还原酶还能够将延胡索酸转化成琥珀酸，图1中的反应14；以及丙酮酸羧化酶能够转化丙酮酸以形成草酰乙酸。此外，在第一个方面，将一种或多种NADH激酶并入所述途径中增加了细胞内NADPH浓度并增加了聚4-羟基丁酸酯的水平(图1中的反应17)。

在第一个方面的第二个实施方式或第一个实施方式中，稳定表达的一种或多种基因编码选自以下的一种或多种酶：α-酮戊二酸脱羧酶、2-酮戊二酸脱羧酶、丙二酰-辅酶A还原酶、NADH依赖性延胡索酸还原酶、氧化应激抗性1,2-丙二醇氧化还原酶、丙酮酸羧化酶和NADH激酶。

在第一个方面的第三个实施方式，或第一个或第二个实施方式中，所述一种或多种酶选自：来自Pseudonocardia dioxanivorans的α-酮戊二酸脱羧酶或其突变体和同源物，来自聚球藻(Synechococcus sp.)PCC 7002的2-酮戊二酸脱羧酶或其突变体和同源物，来自勤奋金属球菌(Metallosphaera sedula)的丙二酰辅酶A还原酶或其突变体和同源物，来自Sulfolous tokodaii的丙二酰辅酶A还原酶或其突变体和同源物，来自大肠杆菌(E.coli)的氧化应激抗性1,2-丙二醇氧化还原酶、其突变体以及同源物，来自布氏锥虫(Trypanosomabrucei)的NADH依赖性延胡索酸还原酶、其突变体以及同源物，来自乳酸乳球菌(L.lactis)的丙酮酸羧化酶、其突变体和同源物，以及来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的NADH激酶、其突变体和同源物。

在第一个方面的第四个实施方式，或者第一个、第二个或第三个实施方式中，所述方法包括将编码α-酮戊二酸脱羧酶或2-酮戊二酸脱羧酶的基因稳定地并入所述生物体的基因组中。所述α-酮戊二酸脱羧酶或2-酮戊二酸脱羧酶催化α-酮戊二酸脱羧成琥珀半醛，因而通过提供另一种生成琥珀半醛的酶反应增加所述生物体中聚-4-羟基丁酸酯的量。

在第二个方面或第一个方面或第一、第二、第三或第四个实施方式中，用于生产包含P4HB的生物质的宿主生物体已经通过在野生型或遗传工程P4HB生产生物体中引入基因或删除基因而进行遗传修饰，从而产生从廉价的可再生原料合成P4HB的菌株。在本发明的第三个方面或者第一、第二个方面或者第一、第二、第三或第四个实施方式的任意一个中，所述α-酮戊二酸脱羧酶来自Pseudonocardia dioxanivorans或其突变体和同源物，或者所述2-酮戊二酸脱羧酶来自聚球藻PCC 7002或其突变体和同源物。

在本发明的第四个方面或者所述第一、第二或第三个方面或者所述第一、第二、第三或第四个实施方式的任何一个中，来自P.dioxanivorans的所述α-酮戊二酸脱羧酶包括第887位氨基酸由丙氨酸到苏氨酸的突变。

在本发明的第五个方面或者所述第一、第二、第三或第四个方面或者所述第一、第二、第三或第四个实施方式的任何一个中，所述遗传工程生物体进一步包含稳定并入的编码将琥珀酰辅酶A转化成琥珀半醛的琥珀酸半醛脱氢酶的基因。

在本发明的第六个方面或者所述第一、第二、第三、第四或第五个方面或者所述第一、第二、第三或第四个实施方式的任何一个中，所述琥珀酸半醛脱氢酶来自克氏梭菌(Clostridium kluyveri)或其同源物。

在本发明的第五个实施方式或者所述第一、第二、第三、第四、第五或第六个方面或者所述第一、第二、第三或第四个实施方式的任何一个中，具有聚-4-羟基丁酸酯途径的所述遗传工程生物体在其非辅酶A依赖性的NAD依赖性琥珀半醛脱氢酶基因或其非辅酶A依赖性的NADP依赖性琥珀半醛脱氢酶基因中具有抑制突变，或者在两个基因中具有抑制突变，并具有稳定并入的编码一种或多种酶的一种或多种基因，所述一种或多种酶选自琥珀酸半醛脱氢酶(其中所述琥珀酸半醛脱氢酶将琥珀酰辅酶A转化成琥珀半醛)、琥珀半醛还原酶(其中所述琥珀半醛还原酶将琥珀半醛转化成4-羟基丁酸)和聚羟基链烷酸酯合酶(其中所述聚羟基链烷酸酯合酶将羟丁酰辅酶A聚合成聚-4-羟基丁酸酯)。

在所述第一、第二、第三、第四、第五、第六个方面的第六个实施方式或者所述第一个实施方式、第二个实施方式、第三个实施方式、第四个实施方式或第五个实施方式的进一步实施方式中，所述生物体中选自yneI、gabD、pykF、pykA、astD和SucCD的一种或多种基因的基因产物被破坏和/或减少。

基因产物的破坏或减少导致酶产物量或活性的降低。例如，已经发现SucCD内源表达的降低使得产物琥珀酰辅酶A合成酶的量降低并有利地使得产生增加量的P4HB产量。所述降低可以是降低的产量或活性。例如，当与具有野生型的产量或表达的基因和产物相比，活性有3％至25％的降低，或者活性有25-95％的降低。

在第七个实施方式中，所述第一、第二、第三、第四、第五或第六个方面的方法或者所述第一、第二、第三、第四、第五或第六个实施方式的方法中，所述方法进一步包括用可再生原料培养遗传工程生物体以生产4-羟基丁酸生物质的起始步骤。

在第八个实施方式中，所述第一、第二、第三、第四、第五或第六个方面的方法或者所述第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七个实施方式的方法中，所述方法包括选自葡萄糖、左旋葡聚糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖、麦芽糖、乳糖、木糖、脂肪酸、植物油、生物质衍生的合成气、源自填埋气体的甲烷、衍生自甲烷的甲醇或它们的组合的可再生原料的来源。在所述六个方面或八个实施方式的任何一个的具体实施方式中，所述原料是葡萄糖或左旋葡聚糖。

在第八个实施方式中，所述第一、第二、第三、第四、第五或第六个方面的方法或者所述第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七个实施方式的方法中，所述生物体是细菌、酵母、真菌、藻类、蓝细菌或其中任何两种或更多种的混合物。

在八个实施方式的方法中使用的细菌包括但不限于大肠杆菌、真养雷尔氏菌(Ralstonia eutropha)、生枝动胶菌(Zoogloea ramigera)、酒色异着色菌(Allochromatium vinosum)、赤红球菌(Rhodococcus ruber)、食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、集胞藻(Synechocystissp.)PCC 6803、细长聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC 7942、普氏荚硫菌(Thiocapsa pfenigii)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、Nocardiacorralina、橙红诺卡菌(Nocardia salmonicolor)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)、单胞菌(Pseudomonas)sp.6-19、单胞菌sp.61-3和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)、广泛产碱菌(Alcaligenes latus)、催产克雷白杆菌(Klebsiella oxytoca)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、Mannheimia succiniciproducens、菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)和丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。

在包括八个实施方式的所述方法中使用的示例性的酵母或真菌包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillusniger)和巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)。

藻类的例子包括但不限于小球藻株和选自以下种：微小小球藻(Chlorellaminutissima)、浮水小球藻(Chlorella emersonii)、富油小球藻(Chlorellasorokiniana)、椭圆形小球藻(Chlorella ellipsoidea)、小球藻属(Chlorella sp.)或原始小球藻(Chlorella protothecoides)。

所述生物质(P4HB或C4化学品)之后可以被处理以生产多用途中间体，所述多用途中间体可以被进一步加工以生产期望的商品和特殊产品。

在第七个方面中，在所述方法的第一、第二、第三、第四、第五或第六个方面的任何一个或者所述第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八个实施方式的任何一个中，来自宿主生物体的重组工程化的生物质利用可再生来源来产生C4化学品或4-羟基丁酸酯均聚物，其随后被转化成有用的中间体和化学产品。在一些实施方式中，所述可再生原料的来源选自葡萄糖、左旋葡聚糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖、麦芽糖、乳糖、木糖、脂肪酸、植物油、生物质衍生的合成气和源自填埋气体的甲烷，或者它们中两种或更多种的组合。

在第八个方面中或所述第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七个方面的任何一个或者所述第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八个实施方式的任何一个中，所述发明进一步包括由本文描述的方法生产的富集的C4化学品或P4HB生物质的控制加工以产生C4化学产品。

该生物过程的有利之处包括利用可再生的碳源作为原料材料，通过可选的方法降低了生产所述产品所需的输入能量，较低的温室排放以及以提高的产率生产C4化学产品或P4HB而对宿主细胞没有毒性副作用(这可能限制处理效率)。

在第九个方面或所述第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八个方面的任何一个或者所述第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八个实施方式的任何一个中，用于本发明方法的遗传工程生物质来自重组宿主，所述重组宿主具有聚-4-羟基丁酸酯或C4化学产品途径并稳定地表达编码两种或更多种酶的两种或更多种基因、编码三种或更多种酶的三种或更多种基因、编码四种或更多种酶的四种或更多种基因、编码五种或更多种酶的五种或更多种基因、或者编码六种或更多种酶的六种或更多种基因，所述酶选自α-酮戊二酸脱羧酶(其中所述α-酮戊二酸脱羧酶将α-酮戊二酸转化成琥珀酸半醛)、2-酮戊二酸脱羧酶(其中所述2-酮戊二酸脱羧酶将α-酮戊二酸转化成琥珀酸半醛)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(其中所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶将磷酸烯醇式丙酮酸转化成草酰乙酸)；以及可选地具有选自yneI、gabD、astD、pykF、pykA和SucCD的一种或多种基因、两种或更多种基因、三种或更多种基因、或四种基因的破坏(或基因产物的表达减少)。

在第十个方面，描述了具有修饰的聚-4-羟基丁酸酯途径的遗传修饰生物体，其中通过并入稳定表达的一种或多种基因增加了聚-4-羟基丁酸酯的产量，所述基因编码选自以下的一种或多种酶：α-酮戊二酸脱羧酶、2-酮戊二酸脱羧酶、丙二酰辅酶A还原酶、NADH-依赖性延胡索酸还原酶、氧化应激抗性1,2-丙二醇氧化还原酶、丙酮酸羧化酶和NADH激酶。

在第十个方面的第一个实施方式中，所述一种或多种酶选自：来自Pseudonocardia dioxanivorans的α-酮戊二酸脱羧酶或其突变体和同源物，来自聚球藻PCC 7002的2-酮戊二酸脱羧酶或其突变体和同源物，来自勤奋金属球菌的丙二酰辅酶A还原酶或其突变体和同源物，来自Sulfolous tokodaii的丙二酰辅酶A还原酶或其突变体和同源物，来自大肠杆菌的氧化应激抗性1,2-丙二醇氧化还原酶、其突变体和同源物，来自布氏锥虫的NADH-依赖性延胡索酸还原酶、其突变体和同源物，来自乳酸乳球菌的丙酮酸羧化酶、其突变体和同源物以及来自构巢曲霉的NADH激酶、其突变体和同源物。

在所述第十个方面的第二个实施方式以及它的第一个实施方式中，所述生物体进一步具有稳定并入的编码将琥珀酰辅酶A转化成琥珀半醛的例如来自克氏梭菌的琥珀酸半醛脱氢酶或其同源物的基因。

在所述第十个方面的第三个实施方式或所述第十个方面的第一或第二个实施方式中，具有聚-4-羟基丁酸酯途径的所述遗传工程生物体在它的非辅酶A依赖性的NAD依赖性琥珀半醛脱氢酶基因或它的非辅酶A依赖性的NADP依赖性琥珀半醛脱氢酶基因中具有抑制突变，或者在这两个基因中具有抑制突变，并具有稳定并入的编码一种或多种酶的一种或多种基因，所述一种或多种酶选自琥珀酸半醛脱氢酶(其中所述琥珀酸半醛脱氢酶将琥珀酰辅酶A转化成琥珀半醛)、琥珀半醛还原酶(其中所述琥珀半醛还原酶将琥珀半醛转化成4-羟基丁酸)、辅酶A转移酶(其中所述辅酶A转移酶将4-羟基丁酸转化成4-羟丁酰辅酶A)和聚羟基链烷酸酯合酶(其中所述聚羟基链烷酸酯合酶将4-羟丁酰辅酶A聚合成聚-4-羟基丁酸酯)。

在所述第十个方面的第四个实施方式或所述第十个方面的第一、第二或第三个实施方式中，所述生物体中选自yneI、gabD、pykF、pykA、astD和SucCD的一种或多种基因被破坏(或基因产物的表达减少)。

在一些方面中，一种或多种核酸可以包括“一个基因家族”并编码单一异质酶(heteromeric enzyme)(例如，sucAB1pdA是编码一种酶的三种基因)，这样的情况被考虑在编码一种或多种酶的一种或多种基因的含义内。

在本发明的一些实施方式中，所述生物质(P4HB或C4化学产物)被处理以生产期望的化学品。在某些实施方式中，所述生物质被加热或热解以从P4HB生物质产生化学品。所述加热在大约100℃至约350℃或大约200℃至约350℃，或从大约225℃至300℃的温度下进行。在一些实施方式中，所述加热将所述生物质的水含量减少至大约5％或更少。

在一些实施方式中，从本文描述的方法生产C4化学品和它们的衍生物。例如，通过加热和酶处理可以生产γ-丁内酯(GBL)，其可以被进一步加工以生产其它期望的商品和特殊产品，例如，1,4-丁二醇(BDO)、四氢呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、2-吡咯烷酮、N-乙烯吡咯烷酮(NVP)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等等。其它包括琥珀酸、1,4-丁二酰胺、琥珀腈、琥珀酰胺和2-吡咯烷酮(2-Py)。

此外，用过的(剩余的)PHA的减少生物质被进一步用于能源开发，例如，作为燃料以生成生产用蒸汽和/或热量。

附图说明

如在所附附图中所举例说明的，从本发明的示例实施方式的下述更具体的描述中，上述内容将显而易见。

图1是显示了在本发明实施例中被修饰或引入的反应或将来可以被修饰的反应的示例性大肠杆菌中心代谢途径的示意图。在一些实施方式中通过删除相关基因而取消的反应用“X”标记。缩写：“PEP”，磷酸烯醇式丙酮酸；“PYR”，丙酮酸；“AcCoA”，乙酰辅酶A；“CIT”，柠檬酸；“ICT”，异柠檬酸；“αKG”，α-酮戊二酸；“SUC-CoA”，琥珀酰辅酶A；“SUC”，琥珀酸；“Fum”，延胡索酸；“MAL”，苹果酸；“OAA”，草酰乙酸；“SSA”，琥珀半醛；“4HB”，4-羟基丁酸；“4HB-CoA”，4-羟丁酰辅酶A；“4HB-P”，4-羟基丁酰磷酸；“P4HB”，聚-4-羟基丁酸酯；“GOx”，乙醛酸；“CoA”，辅酶A；“PAN”，泛酸。编号的反应：“1”，丙酮酸激酶；“2”，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；“3”，丙酮酸羧化酶；“4”，α-酮戊二酸脱氢酶；“5”，琥珀酸半醛脱氢酶；“6”，α-酮戊二酸脱羧酶，也称为2-酮戊二酸脱羧酶；“7”，琥珀酸半醛脱氢酶(NAD⁺-和NADP⁺-依赖性)；“8”，琥珀半醛还原酶；“9”，辅酶A转移酶；“10”，丁酸激酶；“11”，磷酸丁酰转移酶；“12”，聚羟基链烷酸酯合酶；“13”，琥珀酰辅酶A合成酶；“14”，琥珀酸脱氢酶或延胡索酸还原酶(menaquinol-和NADH-依赖性)；“15”，异柠檬酸裂合酶；“16”，苹果酸合酶A；“17”，NADH激酶。

图2是显示了结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的KgdM同源物的系统发生树。其基因被选择进行克隆并且在P4HB生产菌株中重组表达的同源物以下划线标记并通过数字标示：来自结核分枝杆菌的kgdM_MBLX(1)，来自牛分枝杆菌(M.bovis)的sucA(2)，齿垢分枝杆菌(M.smegmatis)(3)，Dietzia cinnamea(4)，Pseudonocardia dioxanivorans(5)和粘金色棒状杆菌(Corynebacterium aurimucosum)(6)。

具体实施方式

以下是本发明的示例实施方式的描述。

本发明提供增加从可再生原料产生4-碳(C4)产物或4-碳单体的聚合物的产量的方法，包括：提供具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性的遗传修饰生物，使得与活性没有降低的野生型生物相比，所述遗传修饰生物的生长是减弱的；以及提供一种或多种稳定表达的基因，所述基因编码具有催化α-酮戊二酸脱羧成琥珀半醛的活性的酶；其中，生长被改善，且自可再生原料的4-碳(C4)产物或4-碳单体的聚合物的碳流量是增加的。

本发明还包括通过稳定表达一种基因而增加具有C4途径的遗传修饰生物体(重组宿主)中的4-碳(C4)产物的产量的方法，所述基因编码催化α-酮戊二酸脱羧成用于产生C4产物的琥珀半醛的酶。所述生物体的α-酮戊二酸脱氢酶(sucAB)基因缺失。该途径提供了期望产物的更高产率，其可以使用作为石油基产物的可行的、经济的替代品的可再生原料大量地培养。

在一些实施方式中，通过所述方法生产的4碳产物包括但不限于1,4-丁二醇、4-羟基丁酸、γ-丁内酯、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮、N-乙基吡咯烷酮、2-吡咯烷酮、N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、琥珀酸、1,4-丁二酰胺、琥珀腈、琥珀酰胺和2-吡咯烷酮(2-Py)。

本发明提供产生遗传工程生物体(如，重组宿主)的方法，所述遗传工程生物体已经过修饰以生产提高量的生物基聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)、4-碳(C4)产物或4-碳单体的聚合物，所述修饰是通过将基因稳定地并入所述宿主生物体中以修饰P4HB、4-碳(C4)产品或4-碳单体的聚合物的代谢途径。在本文中还描述通过使用本文描述的重组宿主生物体改善生产过程而产生的生物基生物质。

这些重组宿主已经被遗传构建以通过操作(如，抑制和/或过表达)P4HB、4-碳(C4)产物或4-碳单体的聚合物的途径中的一些基因以增加生物质中的P4HB、4-碳(C4)产物或4-碳单体的聚合物的产率，从而增加P4HB、4-碳(C4)产物或4-碳单体的聚合物的产率。所述生物质在发酵过程中产生，其中遗传工程微生物供给可再生基质。可再生基质包括发酵原料，如糖、左旋葡聚糖、植物油、脂肪酸或产自植物农作物材料的合成气。从来自可再生基质的生物质中生产的P4HB、4-碳(C4)产物或4-碳单体的聚合物的水平大于所述生物质总干重的5％(如，约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％)。然后所述生物质可用于后续的纯化和修饰方法以生产其它生物基C4化学品和衍生物。

已经开发了以高产率生产广泛多种的可生物降解的PHA聚合物和共聚物的遗传修饰生物质系统(Lee(1996),Biotechnology&Bioengineering 49:1-14；Braunegg等(1998),J.Biotechnology 65:127-161；Madison,L.L.和Huisman,G.W.(1999),Metabolic Engineering of Poly-3-Hydroxyalkanoates；From DNA toPlastic,in:Microbiol.Mol.Biol.Rev.63:21-53)。PHA聚合物是公知的热不稳定化合物，当加热达到和超出其熔点时它们很容易降解(Cornelissen等,Fuel,87,2523,2008)。当加工用于塑料应用的聚合物时，这通常是限制因素，但是，其可以被借用于从100％可再生资源起始建立生物基的化学品生产方法。

具有用于生产P4HB的代谢途径的重组宿主

宿主(如，细菌、真菌、藻类、植物等等)遗传工程化作为用于修饰的和新的材料的生产平台提供了一种用于化学品生产的高价值的环保工业应用的可持续的解决方案。本文描述的方法通过产生培养后或收获后生物基的化学品避免了对宿主生物体的毒性作用，是成本有效且高效率(如，使用较少的生产能量)的，降低温室气体排放，使用可再生资源并可以被进一步加工以从C4产品高产量地生产高纯度产品。

在本文描述的方法中使用的PHA生物质被遗传工程化以生产高于未优化的遗传工程P4HB途径的增加量的聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)。用于生产P4HB的示例性途径在图1中提供，且所述途径、生产P4HB生物质的重组宿主的更详细描述将在下文提供。所述途径可以被工程化以增加来自碳原料来源的P4HB产量。

如本文中所使用的，“P4HB生物质”意味着表示来自重组宿主(如，细菌)的任何遗传工程生物质，其包括非天然存在量的聚羟基链烷酸酯聚合物，如聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)。在一些实施方式中，所述P4HB生物质的来源是细菌、酵母、真菌、藻类、植物农作物、蓝细菌或它们中任意两种或更多种的混合物。在一些实施方式中，当与没有P4HB途径中的一种或多种基因的过表达或抑制的宿主相比时，P4HB的生物质滴度(g/L)提高。在一些实施方式中，所述P4HB滴度被报导为干细胞重量的百分比(％dcw)或P4HB的克数/Kg生物质。

如本文中所使用的，“C4化学产品生物质”意味着表示来自重组宿主(如，细菌)的任何遗传工程生物质，包括非天然存在量的通过C4途径生产的C4化学产品(如，通过BDO途径生产的BDO)。在一些实施方式中，C4化学产品生物质的来源是细菌、酵母、真菌、藻类、植物农作物、蓝细菌或它们中任意两种或更多种的混合物。在一些实施方式中，当与没有C4化学品途径中的一种或多种基因的过表达或抑制的宿主相比，C4化学产品的生物质滴度(g/L)提高。在一些实施方式中，所述C4化学产品滴度被报导为干细胞重量的百分比(％dcw)或C4化学产品的克数/Kg生物质。

“过表达”指的是由引入宿主细胞中的DNA编码的多肽或蛋白质的表达，其中所述多肽或蛋白质并非在所述宿主细胞中正常存在的，或者其中所述多肽或蛋白质以比编码所述多肽或蛋白质的内源基因正常表达的水平更高的水平存在于所述宿主细胞中。“抑制”或“下调”指的是编码多肽或蛋白质的基因的抑制或缺失。在一些实施方式中，抑制表示灭活产生所述途径中的酶的基因。在一些实施方式中，所引入的基因来自异源生物体。

已经开发了具有快速生长宿主(如，大肠杆菌)的遗传工程微生物PHA生产系统。在一些实施方式中，遗传工程也允许对野生型微生物进行修饰，从而改善P4HB聚合物的生产。PHA生产修饰的例子在Steinbuchel&Valentin,FEMS Microbiol.Lett.128:219-28(1995)中描述。PCT公开号WO98/04713描述了使用遗传工程控制PHA合酶的水平从而控制分子量的方法。用于生产PHA的商业可用的菌株，包括真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)(更名为真养雷尔氏菌或钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator))、广泛产碱菌(更名为Azohydromonas lata)、维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinlandii)和假单胞菌(Pseudomonads)在Lee,Biotechnology&Bioengineering,49:1-14(1996)和Braunegg等(1998),J.Biotechnology 65:127-161中公开。美国专利号6,316,262、7,229,804、6,759,219和6,689,589描述了用于生产PHA聚合物(包含4-羟酸)的生物系统，这些文献通过引用的方式并入本文中。

尽管已经有从可再生资源(如糖或氨基酸)生产4-羟基丁酸酯共聚物的报道，从可缩放的可再生基质生产的共聚物中的4HB水平远小于所述共聚物中50％的单体，因此不适于实施本文公开的发明。使用工程化微生物、利用可再生资源生产P4HB生物质或C4化学产品生物质，其中所述生物质中P4HB或C4化学产品的水平足以实施本文公开的发明(即，大于40％、50％、60％或65％的总生物质干重)，这是之前没有实现的。

野生型生物质中PHA的重量百分比随生物质的来源而变化。对于通过发酵过程从基于可再生资源的原料(如，糖、左旋葡聚糖、植物油或甘油)生产的微生物系统，野生型生物质中PHA的量可能是所述生物质总重量的大约65wt％或更多。对于植物农作物系统，特别是在生物质农作物(如甘蔗或柳枝稷)中，PHA的量可以是所述生物质总重量的大约3％或更多。对于藻类或蓝细菌系统，PHA的量可以是所述生物质总重量的大约40％或更多。

在本发明的一些方面中，所述重组宿主已经是遗传工程化，以产生与野生型宿主相比增加量的C4化学产品。所述野生型C4化学产品生物质指生物体在自然条件下通常生产的C4化学产品的量。

例如，在一些实施方式中，所述P4HB或C4化学产品比对照增加约20％至约90％，或约50％至约80％。在其它实施方式中，所述重组宿主比对照菌株产生至少约20％增加量的P4HB、比对照至少约30％的增加量、比对照至少约40％的增加量、比对照至少约50％的增加量、比对照至少约60％的增加量、比对照至少约70％的增加量、比对照至少约75％的增加量、比对照至少约80％的增加量或比对照至少约90％的增加量。在其它实施方式中，所述C4化学产品比野生型宿主产生的量增加约2倍至增加约400％或4倍。根据Doi,Microbial Polyesters,John Wiley&Sons,p24,1990中描述的步骤通过气相色谱法测定宿主或植物中C4化学产品的量。在一些实施方式中，可以达到100-120g P4HB/Kg生物质的生物质滴度。在其它实施方式中，P4HB滴度的量被呈现为百分干细胞重量(％dcw)。

在本发明的一些方面中，所述重组宿主已经遗传工程化以产生与野生型宿主相比增加量的C4化学产品。所述野生型C4化学产品生物质指生物体在自然条件下通常生产的C4化学产品的量。

从P4HB生物质生产C4化学品

通常，在P4HB或C4化学产品生物质的生产(如，培养)过程中或之后，在合适的条件下，所述生物质与催化剂结合以帮助P4HB聚合物或C4化学产品转化为C4产物(如，γ-丁内酯)。所述催化剂(以固体或溶液形式)和生物质例如通过混合、凝絮、离心或喷雾干燥、或本领域已知的其它合适方法结合，用于促进所述生物质和催化剂的相互作用而驱动P4HB有效和特异地转化成γ-丁内酯。在一些实施方式中，所述生物质初始干燥，例如在约100℃至约150℃的温度下干燥一定量的时间以减少所述生物质的水含量。在与所述催化剂结合之前，将干燥的生物质重悬浮在水中。用于干燥的合适温度和持续时间针对产品的纯度和产率确定，并且在一些实施方式中可以包括在延长的时间期间用于除去水的低温(如25℃至150℃)，或者在其它实施方式中，可以包括在短的持续时间内以高温(如，高于450℃)干燥。在“合适的条件”下指的是促进催化反应的条件。例如，在最大化所述产物产生的条件下，如存在助剂或对反应效率有贡献的其它材料的情况下。其它合适的条件包括不存在杂质，例如金属或阻碍反应进行的其它材料。

如本文中所使用的，“催化剂”指的是启动或加速化学反应但其本身在反应中不受影响或消耗的物质。有用的催化剂的例子包括金属催化剂。在一些实施方式中，所述催化剂降低了用于开始热分解的温度，并增加了在特定热解温度(如，约200℃至约325℃)下的热分解速率。

在一些实施方式中，所述催化剂是包含金属离子的氯化物、氧化物、氢氧化物、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐或硬脂酸盐化合物。合适的金属离子的例子包括铝、锑、钡、铋、镉、钙、铈、铬、钴、铜、镓、铁、镧、铅、锂、镁、钼、镍、钯、钾、银、钠、锶、锡、钨、钒或锌等等。在一些实施方式中，所述催化剂是有机催化剂，其是胺、叠氮化合物、烯醇、二醇、季铵盐、酚盐、氰酸盐、硫氰酸盐、二烃基酰胺和烷基硫醇盐。在一些实施方式中，所述催化剂是氢氧化钙。在其它实施方式中，所述催化剂是碳酸钠。还包括两种或更多种催化剂的混合物。

在一些实施方式中，所述金属催化剂的量基于金属离子重量是相对于生物质干固体重量的约0.1％至约15％或者约1％至约25％，或约4％至约50％。在一些实施方式中，所述催化剂的量是约7.5％至约12％。在其它实施方式中，所述催化剂的量是约0.5％的干细胞重量、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、或约10％、或约11％、或约12％、或约13％、或约14％、或约15％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％、或这些之间的量。

如在本文中所使用的，当用于指反应中的化学试剂时，术语“足够量”意味着表示可以满足所述化学反应和期望的产品纯度的要求的所指试剂的量。

P4HB生物质热降解成C4产物

如在本文中使用的“加热”、“热解”、“散热”和“烘焙”指P4HB生物质热降解(如分解)转化成C4产物。通常，在存在催化剂时，P4HB生物质的热降解在升高的温度下发生。例如，在一些实施方式中，用于本文描述的方法的加热温度是约200℃至约400℃。在一些实施方式中，所述加热温度是约200℃至约350℃。在其它实施方式中，所述加热温度是约300℃。“热解”通常指所述生物质在升高的温度下在一段时间内的热化学分解。所述持续时间的范围可以在几秒钟至几小时。在一些条件下，热解在不存在氧或存在有限量的氧的情况下发生以避免氧合作用。用于P4HB生物质热解的方法可以包括直接热传导或间接热传导。“闪热解”指在高温下快速加热所述生物质以快速分解P4HB生物质，例如，所述生物质中P4HB的解聚。闪热解的另一个例子是RTP^TM快速热解。来自Envergent Technologies,Des Plaines,IL的RTP^TM技术和装置将原料转化成生物油。“烘焙”指烘干过程，它是一个本领域公认术语，表示生物质的干燥。该过程通常包括在200-350℃的温度范围内、在相对长的持续时间(如，10-30分钟)内、通常不存在氧的情况下加热生物质。所述过程导致例如具有小于7wt％生物质的水含量的烘干生物质。所述烘干生物质然后可以进一步被加工。在一些实施方式中，加热在真空中、在大气压下或在受控压力下进行。在一些实施方式中，在不使用或使用减少的石油产生能量的情况下完成所述加热。

在一些实施方式中，在加热之前干燥所述P4HB生物质。可选地，在其它实施方式中，在所述P4HB生物质的热降解(如，加热、热解或烘焙)期间进行干燥。干燥减少了生物质的水含量。在一些实施方式中，在约100℃至约350℃(如，约200℃至275℃)的温度下干燥所述生物质。在一些实施方式中，干燥的P4HB生物质的水含量为5％或更少。

在一些实施方式中，P4HB生物质/催化剂混合物的加热进行充足时间以有效地和特异地将P4HB生物质转化为C4产物。在一些实施方式中，加热的时间是约30秒至约1分钟，约30秒至约1.5分钟，约1分钟至约10分钟，约1分钟至约5分钟或者之间的一个时间，例如，约1分钟、约2分钟、约1.5分钟、约2.5分钟、约3.5分钟。

在其它实施方式中，所述时间是约1分钟至约2分钟。依然在其它方式中，所述加热持续时间在约5分钟和约30分钟之间、在约30分钟和2小时之间、或在约2小时和约10小时之间或大于10小时(如，24小时)的时间。

在一些实施方式中，所述加热温度是在约200℃至约350℃的温度，包括其之间的温度，例如，大约205℃、大约210℃、大约215℃、大约220℃、大约225℃、大约230℃、大约235℃、大约240℃、大约245℃、大约250℃、大约255℃、大约260℃、大约270℃、大约275℃、大约280℃、大约290℃、大约300℃、大约310℃、大约320℃、大约330℃、大约340℃或345℃。在一些实施方式中，所述温度是大约250℃。在一些实施方式中，所述温度是大约275℃。在其它实施方式中，所述温度是大约300℃。

在一些实施方式中，所述方法还包括在例如500℃或更高的温度下在足以将至少一部分剩余的生物质分解成热解液的时间段内闪热解剩余的生物质。在一些实施方式中，在500℃至750℃的温度下进行闪热解。在一些实施方式中，所述剩余生物质在闪热解中的停留时间是1秒至15秒，或1秒至5秒，或将所述生物质热解以产生期望的热解预制产物(precut)(例如，热解液)的足够时间。在一些实施方式中，所述闪热解可以代替烘焙而发生。在其它实施方式中，所述闪热解可以在烘焙过程完成后发生。

如本文中所使用的，“热解液”被定义为具有高达15-20％水的低粘度流体，通常包含糖类、醛类、呋喃类、酮类、醇类、羧酸类和木质素类。也被称为生物油，该材料通过在足以将至少一部分生物质分解成可回收的气体和液体(其在静置时固化)的温度下热解(典型地快速热解)生物质而产生。在一些实施方式中，所述足以分解所述生物质的温度是在400℃至800℃之间的温度。

在一些实施方式中，“回收”C4产物蒸汽包括冷凝所述蒸汽。如在本文中所使用的，当应用于蒸汽时，所述术语“回收”表示将其从P4HB生物质材料分离，例如，包括但不限于：通过冷凝、分离方法(如使用膜、气相(如，蒸汽相)分离(如，蒸馏))等回收。因此，可以通过冷凝机构完成回收，所述冷凝机构捕捉单体成分蒸汽，将单体成分蒸汽冷凝成液体形式并将其转移离开所述生物质材料。

作为非限制性的例子，所述蒸汽的冷凝可以描述如下。来自所述热解/烘焙室的流入气体/蒸汽流进入交换器，在其中所述气体/蒸汽流可以被预冷。所述气体/蒸汽流然后穿过制冷器，在其中所述气体/蒸汽流的温度被降低至通过间接接触冷却剂从所述气体冷凝指定蒸汽所需要的温度。所述气体和冷凝的蒸汽从所述制冷器流入分离器中，在其中所述冷凝的蒸汽被收集在底部。无蒸汽的气体从所述分离器流出，穿过所述交换器并离开该装置。所回收的液体从分离器的底部流出或被泵出以保存。对于一些产物，被冷凝的蒸汽固化并收集所述固体。

在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括催化剂的回收。例如，当使用钙催化剂时，煅烧是有用的回收技术。煅烧是在矿物、金属或矿石上实施的热处理过程，以通过脱羧作用、脱水作用、有机物质的脱挥发分、相转化或氧化作用而改变材料。所述过程通常在反应器中实施，所述反应器如膛式炉、竖炉、回转窑或最近以来的流化床反应器。所述煅烧温度被选择为低于基质的熔点，但高于它的分解或相变温度。通常这被作为反应的吉布斯自由能等于零的温度。对于CaCO₃分解为CaO，所述煅烧温度在ΔG＝0时被计算为～850℃。典型地，对于大多数矿物，煅烧温度是在800-1000℃的范围内。

为了在回收C4产物之后从生物质回收钙催化剂，将来自热解或烘焙的用过的生物质剩余物直接转移至煅烧反应器中，并继续在空气中将所述生物质剩余物加热至825-850℃持续一段时间以移除所有痕量的有机生物质。一旦移除有机生物质，所述催化剂可以原样使用或者使用本领域技术人员已知的装置基于密度通过将存在的金属氧化物(与发酵培养基和催化剂)分离而进一步纯化。

在其它实施方式中，如果需要，可以通过本领域已知的其它方法进一步纯化所述产物，例如，通过蒸馏、通过用活性炭处理以移除颜色和/或气味物体而通过反应性精馏、通过离子交换处理、通过液-液萃取(用不相混溶的溶剂移除脂肪酸等，用于回收后的纯化)、通过真空蒸馏、通过提取蒸馏或使用导致进一步纯化产物以提高产物的产率的相似方法。还可以利用这些处理的组合。

如本文中所使用的，术语“剩余生物质”指在PHA转化为小分子中间体之后的生物质。所述剩余生物质然后可以通过烘焙转化为可用燃料，从而减少PHA生产的废物并从典型的烘焙过程获得额外的有价值的商品化学品。所述烘焙在足以使所述剩余生物质密实的温度下进行。在一些实施方式中，本文描述的方法结合有烘焙过程，在其中所述剩余生物质继续被热处理，所述挥发性化学品中间体被释放出来以提供燃料材料。通过该过程生产的燃料材料被用于直接燃烧或者被进一步处理以生产热解液或合成气。总体而言，所述方法具有附加的优势，即所述剩余生物质被转化成更高价值的燃料，所述燃料随后可以用于生产电和蒸汽以提供用于所述方法的能量，从而消除对废物处理的需要。

“碳足迹”是所述方法对环境，以及更具体地，对气候变化的影响的量度。它与产生的温室气体的量相关。

在一些实施方式中，可能期望标记所述生物质的成分。例如，用碳同位素(如，¹³C)特意标记以帮助结构测定或用于其它手段可能是有用的。这通过生长基因工程微生物以表达所述成分(如，聚合物)而实现，但是代替通常的培养基，所述细菌生长在具有含¹³C的碳源，如葡萄糖、丙酮酸等的培养基上。用这种方式，可以生产均匀地、部分地或在特定位点用¹³C标记的聚合物。此外，标记允许可以通过ASTM D6866(一种放射性碳年代测定的工业应用)知道来自可再生原料来源(如，植物衍生物)的生物塑料中的准确百分比。ASTM D6866测量生物基材料的碳14含量；且由于化石基材料不再含有碳14，ASTM D6866可以有效地消除生物基含量的不准确断言。

实施例

通过以下实例进一步举例说明本发明的技术，这不应当被解释成以任何方式的限制。

这些实施例描述了多种用于构建产生目标产物的菌株的生物技术工具和方法。还描述了合适的宿主菌株、在这些实施例中使用的重组基因的潜在来源和列表、合适的染色体外载体、合适的策略和调控元件以控制重组基因表达以及构建技术的选择以在宿主生物体中过表达基因或从宿主生物体灭活基因。

合适的宿主菌株

在一些实施方式中，所述宿主菌株是大肠杆菌K-12菌株LS5218(Spratt等,J.Bacteriol.146(3):1166-1169(1981)；Jenkins和Nunn,J.Bacteriol.169(1):42-52(1987))或菌株MG1655(Guyer等,Cold Spr.Harb.Symp.Quant.Biol.45:135-140(1981))。其它合适的大肠杆菌K-12宿主菌株包括但不限于WG1和W3110(Bachmann Bacteriol.Rev.36(4):525-57(1972))。可选地，大肠杆菌菌株W(Archer等,BMC Genomics 2011,12:9doi:10.1186/1471-2164-12-9)或大肠杆菌菌株B(Delbruck和Luria,Arch.Biochem.1:111-141(1946))以及它们的衍生物如REL606(Lenski等,Am.Nat.138:1315-1341(1991))是其它合适的大肠杆菌宿主菌株。

其它示例的微生物宿主菌株包括但不限于：真养雷尔氏菌、生枝动胶菌、酒色异着色菌、赤红球菌、食酸代尔夫特菌、豚鼠气单胞菌、集胞藻sp.PCC6803、细长聚球藻PCC 7942、普氏荚硫菌、巨大芽孢杆菌、鲍氏不动杆菌、贝氏不动杆菌、克氏梭菌、扭脱甲基杆菌、Nocardia corralina、橙红诺卡菌、荧光假单胞菌、食油假单胞菌、单胞菌sp.6-19、单胞菌sp.61-3和恶臭假单胞菌、球形红杆菌、广泛产碱菌、催产克雷白杆菌、Anaerobiospirillumsuccinciproducens、产琥珀酸放线杆菌、Mannheimia succiniciproducens、菜豆根瘤菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、氧化葡萄糖杆菌、运动发酵单胞菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、天蓝色链霉菌和丙酮丁醇梭菌。示例的酵母或真菌包括选自的酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、土曲霉、黑曲霉和巴氏毕赤酵母的种。

示例的藻类菌株包括但不限于：小球藻菌株，选自微小小球藻、浮水小球藻、富油小球藻、椭圆形小球藻、小球藻属或原始小球藻的种。

重组基因的来源

编码P4HB途径的酶的核酸的来源可以包括，例如，其中编码的基因产物能够催化所指的反应的任何物种。这样的物种包括原核和真核的生物体，包括但不限于，细菌(包括古细菌和真细菌)和真核生物(包括酵母、植物、昆虫、动物和哺乳动物，包括人)。这种来源的示例的物种包括例如，大肠杆菌、酿酒酵母、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、集胞藻PCC 6803、细长聚球藻PCC 7942、聚球藻PCC 7002、嗜热蓝藻(Chlorogleopsis sp.)PCC6912、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)、克氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perjringens)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、破伤风形杆菌(Clostridium tetanomorphum)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、Clostridiumaminobutyricum、近端梭菌(Clostridium subterminale)、斯蒂克兰德梭菌(Clostridium sticklandii)、真养雷尔氏菌、牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、龈紫单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)，假单胞菌的种，包括铜绿假单孢菌(Pseudomonasaeruginosa)、恶臭假单胞菌、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、荧光假单胞菌，微小小球藻、浮水小球藻、富油小球藻、椭圆形小球藻、小球藻属、原始小球藻、智人(Homo sapiens)、家兔(Oryctolagus cuniculus)、Rhodobacterspaeroides、布氏热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)、勤奋金属球菌、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、Roseiflexus castenholzii、赤杆菌属(Erythrobacter)、荷荷巴树(Simmondsia chinensis)，不动杆菌(Acinetobacter)的种，包括醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)和贝氏不动杆菌，Sulfolobus tokodaii、硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)、催产克雷白杆菌、小眼虫(Euglena gracilis)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、喜温海洋杆菌(Thermotoga maritima)、盐生盐杆菌(Halobacterium salinarum)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)、野猪(Sus scrofa)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、谷氨酸棒杆菌、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、念珠菌属(Candida)、土曲霉、戊糖片球菌(Pedicoccus pentosaceus)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilus)、巴氏醋酸杆菌(Acetobacter pasteurians)、乳酸克鲁维酵母、Eubacterium barkeri、多毛拟杆菌(Bacteroides capillosus)、Anaerotruncuscolihominis、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)、具核梭杆菌(Fusobacterium nuleatum)、产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)、海洋γ-变形菌属细菌、产丁酸盐细菌和布氏锥虫。例如，参考大肠杆菌宿主在本文中示例说明具有P4HB生物合成生产的微生物宿主(如，生物体)。但是，由于可利用的完整基因组序列目前已超过550种(这些中的一多半在公开数据库如NCBI中可得)，包括395个微生物基因组和多种酵母、真菌、植物和哺乳动物基因组，鉴定相关物种或远缘物种中编码必要的P4HB生物合成活性的基因中的一种或多种基因，包括例如，已知基因的同源、直系同源、间接同源和非直系同源基因置换以及生物体之间遗传改变的互换，是本领域常规的和公知的。因此，针对具体生物体(如大肠杆菌)在本文中描述的使得能够实现P4HB和本发明其它化合物的生物合成的代谢改变可以容易地应用于其它微生物，包括原核生物和真核生物等。考虑到本文提供的教导和指导，本领域技术人员将知道在一种生物体中示例的代谢改变可以同样地应用在其它生物体中。

用于生产4HB的转基因宿主的产生

使用本领域已知的常规技术对用于生产P4HB的转基因(重组)宿主进行遗传工程。对于生产含4HB的PHA和4-碳化学品的宿主菌株进行克隆和/或评估的基因以及适当的酶委员会编号(EC编号)和参考在下面的表1A中呈现。一些基因以密码子优化合成，而其它通过PCR从原始的或野生型宿主的基因组DNA克隆。如本文中所使用的，“异源”表示来自另一宿主。所述宿主可以是相同或不同的物种。图1是生产P4HB的示例性途径。

表1A：在生产含4HB的PHA和4-碳化学品的微生物宿主菌株中过度产生或缺失的基因。基因名称后面的星号(*)表示所述核苷酸序列对于大肠杆菌表达进行优化。

能够催化表1A中列出的反应的其它蛋白质可以通过翻阅科学文献、专利文件、BRENDA(http://www.brenda-enzymes.info/)检索和/或在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)上通过针对如核苷酸或蛋白质数据库的BLAST检索而发现。然后可以建立合成基因以提供从序列数据库到物理DNA的简单途径。这样的合成基因从头开始设计和制造，从而使用增强异源蛋白质表达的密码子，并优化表达系统和宿主所需要的特性。如DNA 2.0(Menlo Park,CA94025,美国)的公司提供这样的常规服务。可以催化表1A中列出的一些生化反应的蛋白质在表1B-1至1B-29中示出。

表1B-1：PykF和PykA蛋白质(丙酮酸激酶，来自大肠杆菌,EC No.2.7.1.40，其对磷酸烯醇式丙酮酸作用以产生丙酮酸和ATP；蛋白质登录号NP_416191和NP_416368)的合适同源物。

表1B-2：Ppc蛋白质(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，来自大肠杆菌，EC No.4.1.1.31，其对磷酸烯醇式丙酮酸和CO₂/碳酸作用以形成草酰乙酸和正磷酸；蛋白质登录号NP_418391)的合适同源物。

表1B-3：Pyc_Ll蛋白质(来自乳酸乳球菌的丙酮酸羧化酶，EC 6.4.1.1，其对丙酮酸作用以形成草酰乙酸；序列如在基因/蛋白质ID 1中所限定的)的合适同源物。

表1B-4：SucA蛋白质(来自大肠杆菌的α-酮戊二酸脱氢酶复合物的E1亚基，其对α-酮戊二酸作用以形成琥珀酰-辅酶A、二氧化碳和NADPH，ECNo.1.2.4.2；蛋白质登录号NP_415254)的合适同源物。

表1B-5：SucB蛋白质(来自大肠杆菌的α-酮戊二酸脱氢酶复合物的E2亚基，其对α-酮戊二酸作用以形成琥珀酰-辅酶A、二氧化碳和NADPH，ECNo.2.3.1.61；蛋白质登录号NP_415255)的合适同源物。

表1B-6：LpdA蛋白质(来自大肠杆菌的α-酮戊二酸脱氢酶复合物的硫辛酰胺脱氢酶亚基，其对α-酮戊二酸作用以形成琥珀酰-辅酶A、二氧化碳和NADPH，EC No.1.8.1.4；蛋白质登录号NP_414658)的合适同源物。

表1B-7：SucD蛋白质(来自克氏梭菌的琥珀酸-半醛脱氢酶，EC No.1.2.1.76，其将琥珀酰辅酶A转化成琥珀酰半醛；蛋白质序列在WO2011/100601中)的合适同源物。

表1B-8.Mcr蛋白质(来自Sulfolobus tokodaii的丙二酰辅酶A还原酶，EC No.1.2.1.75(1.2.1.-)，其对丙二酰辅酶A(琥珀酰辅酶A)作用以形成丙二酰半醛(琥珀酰半醛)；蛋白质序列在基因/蛋白质ID 2中)的合适同源物。

表1B-9.KgdM蛋白质(来自结核分枝杆菌的α-酮戊二酸脱羧酶，EC No.4.1.1.71，其对α-酮戊二酸作用以产生琥珀酸半醛和二氧化碳；蛋白质登录号NP335730)的合适同源物。

表1B-10.KgdP蛋白质(来自Pseudonocardia dioxanivorans CB1190的α-酮戊二酸脱羧酶，EC No.4.1.1.n，其对α-酮戊二酸作用以产生琥珀酸半醛和二氧化碳；蛋白质登录号YP004335105)的合适同源物。

表1B-11.KgdS蛋白质(来自聚球藻PCC 7002的2-酮戊二酸脱羧酶，ECNo.4.1.1.n，其对α-酮戊二酸作用以产生琥珀酸半醛和二氧化碳；蛋白质登录号ACB00744.1)的合适同源物。

表1B-12.YneI(Sad)蛋白质(琥珀酸半醛脱氢酶，NAD+-依赖性，来自大肠杆菌，EC No.1.2.1.24，其对戊二酸半醛(琥珀半醛)作用以产生戊二酸(琥珀酸)；蛋白质登录号NP_416042(Fuhrer等,J Bacteriol.2007Nov；189(22):8073-8.Dennis和Valentin，美国专利号6,117,658))的合适同源物。

表1B-13.GabD蛋白质(琥珀酸半醛脱氢酶，NADP+-依赖性，来自大肠杆菌，EC No.1.2.1.20，其对戊二酸半醛或琥珀半醛)作用以产生戊二酸(或琥珀酸)；蛋白质登录号NP_417147(Riley等,Nucleic Acids Res.34(1),1-9(2006)))的合适同源物。

表1B-14.蛋白质AstD(来自大肠杆菌的琥珀酰谷氨酸半醛脱氢酶，ECNo.1.2.1.-，其对琥珀酰谷氨酸半醛(琥珀酸半醛)作用以产生琥珀酰谷氨酸(琥珀酸)；蛋白质登录号NP_416260)的合适同源物。

表1B-15.SsaR_At蛋白质(琥珀半醛还原酶，来自拟南芥，EC No.1.1.1.61，其对琥珀酸半醛作用以产生4-羟基丁酸；蛋白质登录号AAK94781)的合适同源物。

表1B-16.YqhD蛋白质(NADP-依赖性醛脱氢酶，来自大肠杆菌，EC.No.1.1.1.61，其对琥珀酸半醛作用以产生4-羟基丁酸；蛋白质登录号NP_417484)的合适同源物。

表1B-17.YihU蛋白质(琥珀酸半醛还原酶，来自大肠杆菌，EC No.1.1.1.61，其对琥珀酸半醛作用以产生4-羟基丁酸；蛋白质登录号NP_418318)的合适同源物。

表1B-18.FucO_I6L-L7V蛋白质(L-1,2-丙二醇氧化还原酶，来自大肠杆菌，EC No.1.1.1.77，其对琥珀酸半醛作用以产生4-羟基丁酸)的合适同源物。

表1B-19.OrfZ蛋白质(辅酶A转移酶，来自克氏梭菌DSM 555，EC No.2.8.3.n，其对4-羟基丁酸作用以产生4-羟基丁酰辅酶A；蛋白质登录号AAA92344)的合适同源物。

表1B-20.Buk1蛋白质(丁酸激酶I，来自丙酮丁醇梭菌ATCC824，EC No.2.7.2.7，其对4-羟基丁酸作用以产生4-羟基丁酰磷酸)的合适同源物。

表1B-21.Buk2蛋白质(丁酸激酶II，来自丙酮丁醇梭菌ATCC824，EC No.2.7.2.7，其对4-羟基丁酸作用以产生4-羟基丁酰磷酸)的合适同源物。

表1B-22.Ptb蛋白质(磷酸丁酰转移酶，来自丙酮丁醇梭菌ATCC824，EC No.2.3.1.19，其对4-羟基丁酰磷酸作用以产生4-羟基丁酰辅酶A)的合适同源物。

表1B-23.聚羟基链烷酸酯合酶蛋白质(来自恶臭假单胞菌和真养雷尔氏菌JMP134的PhaC3/C1*融合蛋白；来自真养雷尔氏菌H16和雷尔氏菌S-6的PhaC183*融合蛋白；EC No.2.3.1.n，其对(R)-3-羟基丁酰辅酶A或4-羟基丁酰辅酶A+[(R)-3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸]_n作用以产生[(R)-3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸]_(n+1)+辅酶A并且也对4-羟基丁酰辅酶A+[4-羟基丁酸]_n以产生[4-羟基丁酸]_(n+1)+辅酶A)的合适同源物。

表1B-24.SucC蛋白质(来自大肠杆菌的琥珀酰辅酶A合成酶的β亚基，EC No.6.2.1.5，其可逆地将琥珀酰辅酶A转化成琥珀酸和ATP；蛋白质登录号NP_415256)的合适同源物。

表1B-25.SucD蛋白质(来自大肠杆菌的琥珀酰辅酶A合成酶的α亚基，EC No.6.2.1.5，其可逆地将琥珀酰辅酶A转化成琥珀酸和ATP；蛋白质登录号NP_415257)的合适同源物。

表1B-26.Frd_g蛋白质(来自布氏锥虫的延胡索酸还原酶，EC No.1.3.1.6，其对延胡索酸作用以产生琥珀酸；蛋白质登录号XP_844767)的合适同源物。

表1B-27.AceA蛋白质(来自大肠杆菌的异柠檬酸裂合酶，EC No.4.1.3.1，其对异柠檬酸作用以产生琥珀酸和乙醛酸；蛋白质登录号NP_418439)的合适同源物。

表1B-28.AceB蛋白质(来自大肠杆菌的苹果酸合酶，EC No.2.3.3.9，其对乙醛酸和乙酰辅酶A作用以产生苹果酸；蛋白质登录号NP_418438)的合适同源物。

表1B-29.Ndk(来自构巢曲霉的NADH激酶，EC No.2.7.1.86，其对NADH和ATP作用以产生NADPH；蛋白质登录号XP_682106)的合适同源物。

合适的染色体外载体和质粒

如本文中所使用的，“载体”是染色体外复制子，如质粒、噬菌体或粘粒，另一DNA片段可以插入其中从而引起所插入片段的复制。载体的拷贝数(取决于它们的复制起点)和大小是变化的。具有不同复制起点的载体可以在相同的微生物细胞中增殖，除非它们密切相关，如pMB1和ColE1。如在质粒纯化手册(可以在互联网网站//kirshner.med.harvard.edu/files/protocols/QIAGEN_QIAGENPlasmidPurification_EN.pdf上找到)中所描述的，表达重组蛋白的合适载体可以构成具有pMB1复制起点、每细胞具有500-700个拷贝的pUC载体，具有ColE1复制起点、每细胞具有300-500个拷贝的pBluescript载体，具有pMB1复制起点、每细胞具有15-20个拷贝的pBR322和衍生物，具有p15A复制起点、每细胞具有10-12个拷贝的pACYC和衍生物，和具有pSC101复制起点、每细胞具有约5个拷贝的pSC101和衍生物。广泛使用的载体是pSE380，其允许重组基因在IPTG-可诱导的trc启动子下表达(Invitrogen,La Jolla,CA)。

用于重组基因表达的合适策略和表达调控序列

文献中已经广泛描述了用于实现重组基因在大肠杆菌中表达的策略(Gross,Chimica Oggi 7(3):21-29(1989)；Olins和Lee,Cur.Op.Biotech.4:520-525(1993)；Makrides,Microbiol.Rev.60(3):512-538(1996)；Hannig和Makrides,Trends in Biotech.16:54-60(1998))。表达调控序列可以包括组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等，其是本领域公知的。合适的启动子包括但不限于P_lac、P_tac、P_trc、P_R、P_L、P_trp、P_phoA、P_ara、P_uspA、P_rpsU、P_syn(Rosenberg和Court,Ann.Rev.Genet.13:319-353(1979)；Hawley和McClure,Nucl.Acids Res.11(8):2237-2255(1983)；Harley和Raynolds,Nucl.Acids Res.15:2343-2361(1987)；还可以在互联网网站ecocyc.org和partsregistry.org上找到)。

示例的启动子是：

P_syn1(也称为P_synA)(5’-TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGC-3’)(SEQID NO:1)，

P_synC(5’-TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTACTGTGCTAGC-3’)(SEQ ID NO:2)，

P_synE(5’-TTTACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATTATGCTAGC-3’)(SEQ ID NO:3)，

P_synH(5’-CTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGC-3’)(SEQ ID NO:4)，

P_synK(5’-TTTACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAATGCTAGC-3’)(SEQ ID NO:5)，

P_synM(5’-TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGGACTATGCTAGC-3’)(SEQ ID NO:6)，

P_trc(5’-TTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATG-3’)(SEQ ID NO:7)，

P_tac(5’-TTGACAATTAATCATCGTCGTATAATGTGTGGA-3’)(SEQ ID NO:8)，

P_tet(5’-TCCCTATCAGTGATAGAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCAC-3’)(SEQ ID NO:9)，

P_x(5’-TCGCCAGTCTGGCCTGAACATGATATAAAAT-3’)(SEQ ID NO:10)，

P_uspA(5’-AACCACTATCAATATATTCATGTCGAAAATTTGTTTATCTAACGAGTAAGCAAGGCGGATTGACGGATCATCCGGGTCGCTATAAGGTAAGGATGGTCTTAACACTGAATCCTTACGGCTGGGTTAGCCCCGCGCACGTAGTTCGCAGGACGCGGGTGACGTAACGGCACAAGAAACG-3’)(SEQ ID NO:11)，

P_rpsU(5’-ATGCGGGTTGATGTAAAACTTTGTTCGCCCCTGGAGAAAGCCTCGTGTATACTCCTCACCCTTATAAAAGTCCCTTTCAAAAAAGGCCGCGGTGCTTTACAAAGCAGCAGCAATTGCAGTAAAATTCCGCACCATTTTGAAATAAGCTGGCGTTGATGCCAGCGGCAAAC-3’)(SEQ ID NO:12)，

P_synAF7(5’-TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGC-3’)(SEQ ID NO:13)，

P_synAF3(5’-TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAATGCTAGC-3’)(SEQ ID NO:14)。

示例的终止子是：

T_trpL(5’-CTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGAACAAAA-3’)(SEQ ID NO:15)，

T₁₀₀₆(5’-AAAAAAAAAAAACCCCGCTTCGGCGGGGTTTTTTTTTT-3’)(SEQ ID NO:16)，

T_rrnB1(5’-ATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTAT-3’)(SEQ ID NO:17)，

T_rrnB2(5’-AGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTT-3’)(SEQ ID NO:18)。

重组宿主的构建

可以使用本领域公知技术构建包含必要基因的重组宿主，所述必要基因编码用于将碳基质转化成P4HB的酶途径。

从来源生物体(宿主)获得期望基因的方法是分子生物学领域常规且公知的。这样的方法在如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001；Ausubel等,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)中有描述。例如，如果基因序列是已知的，可以使用聚合酶链式反应使用特异于目标基因的引物从基因组DNA扩增所述DNA(Mullis,美国专利号4,683,202)，以获得适于连接至合适载体中的量的DNA。可选地，目标基因可以从头化学合成以考虑到宿主生物体的密码子偏好，从而增强异源蛋白质的表达。通过聚合酶链式反应使用包含表达调控序列的工程化引物可以将如启动子和转录终止子的表达调控序列与目标基因连接。另一种方式是通过限制性内切酶消化和连接以合适的顺序将分离的基因并入已经包含必要调控序列的载体中。后一种方式的一个例子是BioBrick^TM技术(www.biobricks.org)，其中通过使用相同的两个限制性位点将多段DNA以标准化方式顺序地组装在一起。

除了使用载体，对于将碳基质酶促转化成P4HB必要的基因可以通过使用靶向或随机方式整合至染色体中而引入宿主生物体中。对于靶向整合至染色体上的特定位点，使用如最初由Datsenko和Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97,6640-6645)描述的、通常被称为Red/ET重组工程的方法。随机整合至染色体中包括使用如Huisman等描述的小Tn5转座子介导的方法。

培养宿主以生产P4HB生物质

通常，重组宿主在含有碳源和其它必需营养物的培养基中培养以通过使用本领域已知方法的发酵技术批式地或连续地生产P4HB生物质。还可以包括其它添加剂，例如，防泡剂等以实现期望的生长条件。发酵对于大规模生产特别有用。示例的方法使用生物反应器以培养和处理发酵培养基而得到期望的产物。其它技术如分离技术可以与发酵结合用于大规模和/或连续生产。

如本文中所使用的，术语“原料”指用作工业过程中的碳原材料的物质。当用于指生物体(如微生物或藻类生物)的培养时，如细胞的发酵过程，所述术语指用于为所述细胞提供碳源或其它能量源的原材料。可用于生产P4HB的碳源包括简单的、便宜的来源，如单独的或组合的葡萄糖、左旋葡聚糖、蔗糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖等等。在其它实施方式中，所述原料是糖浆或淀粉、脂肪酸、植物油或木质纤维素材料等等。还可能使用利用产生自可再生生物质资源的合成气(CO₂、CO和氢气)和/或源自填埋气体的甲烷的生物体来生产P4HB生物质，所述甲烷可以直接用作原料或转化为甲醇。

P4HB途径基因的引入提供了使用容易得到的和便宜的原料的灵活性。“可再生的”原料指可再生能量来源，如衍生自活生物体的材料或它们的代谢副产物，包括衍生自生物质的材料，通常由未充分利用的成分(如谷壳和干草)组成。专门种植用作可再生原料的农产品包括，例如，玉米、大豆、柳枝稷和树(例如，杨树)、小麦、亚麻籽和油菜籽、甘蔗和棕榈油。作为可再生能量来源和原材料，基于农作物的农业原料是对于日减少的油储量的最终替代物。植物使用太阳能和二氧化碳固定以产生出超出现代合成化学的当前能力的数以千计的复杂的和功能性的生物化学品。这些包括精细的和大量的化学品、药物、营养品、类黄酮类、维生素、香料、聚合物、树脂、油、食品添加剂、生物着色剂、粘合剂、溶剂和润滑剂。

实施例1：通过使用来自Pseudonocardia dioxanivorans的α-酮戊二酸脱羧酶改善P4HB产生

已经提出了几条从三羧酸(TCA)循环产生琥珀半醛(SSA)的代谢途径(由Steinbüchel和Lütke-Eversloh综述，Biochem.Engineering J.16:81–96(2003)和Efe等，Biotechnology and Bioengineering 99:1392-1406(2008))。一条这样的途径通过由kgdM编码的α-酮戊二酸脱羧酶将α-酮戊二酸转化成SSA(Tian等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102:10670-10675(2005))。之前尝试利用来自结核分枝杆菌的kgdM基因(Tian等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102:10670-10675(2005)；图1，反应号6)生产P4HB并不成功，仅产生非常少量的P4HB(Van Walsem等，专利申请号WO 2011100601A1)。

这个实施例证明，当在重组宿主菌株中过量产生时，结核分枝杆菌KgdM的同源物出人意料地能够生产显著量的P4HB。使用KgdM的蛋白质序列作为查询在非冗余蛋白质数据库中进行BLASTP检索(Altschul,J.Mol.Biol.219:555-65(1991))鉴定了几个同源物，其使用从Geneious软件包可得的MAFFT比对算法(Drummond,A.J.等，Geneious v5.4(2011)；从互联网geneious.com上可以获得)在多序列比对中进行比对。如图2所示，该比对作为输入文件使用具有Jukes-Cantor遗传距离模型和UPGMA树构建模型的Geneious Tree Builder生成系统发生树。基于该系统发生树，几个近缘的和更远缘的同源物被选为基因靶标。这些包括牛分枝杆菌(登录号CAL71295)、齿垢分枝杆菌(登录号A0R2B1)、Dietzia cinnamea(登录号EFV91102)、粘金色棒状杆菌(登录号ZP_06042096)和Pseudonocardia dioxanivorans(登录号AEA27252；见图2)。使用聚合酶链式反应(PCR)，使用上述公知的分子生物学技术从齿垢分枝杆菌、D.cinnamea、粘金色棒状杆菌和P.dioxanivorans天然微生物的基因组DNA扩增原始基因，并克隆至质粒中P_trc启动子的下游。结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的kgdM*基因通过DNA2.0进行密码子优化以在大肠杆菌宿主菌株中优化表达，并也克隆至相同质粒中P_trc启动子的下游。

因此，使用上述的公知的生物技术工具和方法构建以下六个菌株，它们都包含yneI和gabD以及pykF和pykA的染色体缺失，以及过表达来自克氏梭菌的orfZ_Ck基因、大肠杆菌ppc基因、PHA合酶phaC3/C1*和来自拟南芥的ssaR_At*基因。所有的那些基因都在表1A中描述。菌株1用作表达来自克氏梭菌的sucD_Ck*基因的阳性对照，其之前显示生产显著量的P4HB(VanWalsem等，专利申请号WO 2011100601A1)。菌株2用作从IPTG-诱导的P_trc启动子表达结核分枝杆菌kgdM基因的阴性对照。菌株3-6分别从IPTG-诱导的P_trc启动子表达牛分枝杆菌、粘金色棒状杆菌、P.dioxanivorans和齿垢分枝杆菌kgd同源物(见表2)。

表2：实施例1中使用的微生物菌株

使所述菌株在摇板检测中生长以检查P4HB的产生。六种菌株每一种的三次重复在含有3mL的LB、50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素(针对菌株1)或100μg/mL氨苄青霉素(针对菌株2-6)的无菌管中培养过夜。从其中取50μL，一式三份地加入至含有450μL生产培养基和如上所示抗生素的Duetz深孔平板的孔中。所述生产培养基由含有15g/L葡萄糖、2mMMgSO₄、1×痕量盐溶液和100μM IPTG(以诱导重组基因表达)的1×E2最低盐溶液组成。50×E2原液由1.275M NaNH₄HPO₄·4H₂O、1.643M K₂HPO₄和1.36M KH₂PO₄组成。通过向每1L的1.5N HCL加入50g FeSO₄·7H₂0、11gZnSO₄·7H₂O、2.5g MnSO₄·4H₂O、5g CuSO₄·5H₂O、0.5g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、0.1g Na₂B₄O₇和10g CaCl₂·2H₂O制备1000×痕量盐溶液原液。使摇板在在37℃下、在振动中生长5个小时，然后在30℃下孵育共48小时。之后，将生产孔组合并(一共1.5mL)并分析聚合物含量。在实验结束时，将培养物在4150rpm下旋转，用蒸馏水清洗一次，在-80℃下冷冻至少30分钟并冻干过夜。第二天，将测定量的冻干细胞沉淀加入玻璃管中，然后加入3mL的丁醇分解(butanolysis)试剂，所述丁醇分解试剂由等体积的99.9％正丁醇和于二氧六环中的4.0N HCl组成，以2mg/mL二苯基甲烷作为内标。将管子加盖后，将管子短暂地涡旋振荡并放置在设定为93℃的热模块上持续6小时，并定期涡旋振荡。之后，将管子冷却至室温，然后加入3mL的蒸馏水。将所述管子涡旋振荡约10s，然后以620rpm旋转(Sorvall Legend RT台式离心机)2分钟。将1mL的有机相移液至GC小瓶中，然后通过气相色谱法-火焰离子化检测(GC-FID)(Hewlett-Packard 5890系列II)进行分析。通过与4HB的标准曲线(用于P4HB分析)比较来确定细胞沉淀中的PHA的量。通过加入不同量的丁醇中10％γ-丁内酯(GBL)溶液以分离丁醇分解反应而生成4HB标准曲线。

表3中的结果令人惊异地显示仅表达来自P.dioxanivorans的kgd同源物的菌株5产生显著水平的P4HB。

表3：生物质和P4HB滴度

菌株	生物质滴度(g/L)	P4HB滴度(％dcw)
			1	3.69±0.07	18.0±0.2％
2	3.18±0.12	3.0±0.3％
			3	3.20±0.01	3.0±0.1％
4	3.33±0.16	2.0±0.0％
			5	3.43±0.05	12.0±0.3％
6	3.36±0.08	3.0±0.8％

实施例2：生长选择策略的开发以获得具有改善的α-酮戊二酸脱羧酶活性的基因

表达来自P.dioxanivorans的kgd同源物(以下称为kgdP)的重组宿主的P4HB滴度仅是在表达来自克氏梭菌的sucD_Ck*基因的菌株中获得的滴度的大约三分之二(见表2和3)。因此，开发了一种生长选择方法以获得具有改善的α-酮戊二酸脱羧酶活性的突变的kgdP基因。为此，构建大肠杆菌MG1655ΔsucAB菌株，其缺失α-酮戊二酸脱氢酶活性(图1，反应4)。使用上述公知的生物技术手段和方法构建包含sucAB缺失的MG1655。由于大肠杆菌细胞中缺乏α-酮戊二酸脱氢酶(ΔsucAB)和任何天然α-酮戊二酸脱羧酶活性，这一菌株不能够在补充有2.0g/L的α-酮戊二酸作为唯一碳源的E2最低培养基中生长。但是，假定重组kgd基因在表现出充分的α-酮戊二酸脱羧酶活性水平的ΔsucAB大肠杆菌宿主中表达，细胞应当能够通过使用如图1中所显示的代谢途径反应6(αKG→SSA)和反应7(SSA→SUC)以α-酮戊二酸作为唯一碳源生长，从而完成中断的TCA循环。为测试这一假设，将原始kgdP基因克隆至表达载体中并显示不能在补充有2.0g/Lα-酮戊二酸的E2最低培养基中生长(数据未显示)。因此，如在Sugimoto等(美国专利号5,919,694)中描述的进行羟胺诱导的随机诱变以选择使得能够在补充有α-酮戊二酸作为唯一碳源的E2最低培养基中生长的突变的kgdP基因。

首先将野生型kgdP基因克隆至pSE380中的P_trc启动子控制下，然后在75℃羟胺诱变2小时。然后将诱变溶液转化至大肠杆菌MG1655ΔsucAB菌株中并接种在补充有适当抗生素(100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素)的LB琼脂糖平板上，并在37℃孵育过夜。第二天，使用3mL的1×E2缓冲液收集和合并来自多个转化的约一百万单个集落。将10μl的合并的突变体克隆在含有50mL的生长选择培养基的摇瓶中分培养，所述生长选择培养基由1×E2最低盐溶液、2mM MgSO₄、1×痕量盐溶液、10μM IPTG、100μg/mL氨苄青霉素、25μg/mL氯霉素和2g/Lα-酮戊二酸(作为唯一碳源)组成。如实施例1中所描述的制备50×E2原液和1000×痕量盐原液。将摇瓶培养物在30℃下以250rpm振动孵育。定期监测细胞生长(OD_600nm)。2天后，培养物能够生长至OD_600nm约为2.0的稳定期。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Valencia,CA)从该摇瓶培养物中分离质粒。然后将质粒混合物转化至大肠杆菌菌株中，所述菌株包含yneI、gabD、pykF和pykA的染色体缺失并过表达来自克氏梭菌的orfZ_Ck基因、大肠杆菌的ppc基因、PHA合酶phaC3/C1*基因和来自拟南芥的ssaR_At*基因。然后将转化混合物接种在补充有2mMMgSO₄、1×痕量盐溶液、10g/L葡萄糖作为唯一碳源、100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素和100μM IPTG的1×E2最低培养基琼脂糖板上。最终，选择表示高P4HB产量的非常白的菌落。分离该示例性克隆的质粒并确定其kgdP的DNA序列。突变的kgdP(下文称为kgdP-M38)在编码序列中包含三个突变(表4)。在第696位和第3303位的两个突变没有引起氨基酸变化，但是影响了密码子频率；而第2659位的突变引起了丙氨酸(Ala,A)变化为苏氨酸，其也影响密码子频率。

表4：kgdP-M38编码序列(CDS)中的碱基对变化

碱基对(CDS)	密码子	密码子频率	氨基酸
				696	AAG→AAA	24％→76％	无变化
2659	GCC→ACC	25％→43％	Ala887Thr
				3303	GTG→GTA	34％→17％	无变化

实施例3：通过表达突变的来自Pseudonocardia dioxanivorans的α-酮戊二酸脱羧酶kgdP-M38而改善的P4HB产量

表达kgdP-M38的菌株中改善的P4HB产量

在这个实施例中，比较表达天然kgdP的菌株和表达突变的来自Pseudonocardia dioxanivorans的kgdP-M38的菌种中P4HB的产量。因此，使用上述的公知生物技术工具和方法构建以下两种菌株，这两种菌株的基因组都包含yneI、gabD、pykF和pykA的染色体缺失，并过表达来自克氏梭菌的orfZ_Ck基因、大肠杆菌的ppc基因、PHA合酶phaC3/C1*和来自拟南芥的ssaR_At*基因。此外，菌株7以P_trc启动子表达天然的kgdP基因，而菌株8同样以P_trc启动子表达突变的kgdP-M38(表5)。

表5：在实施例3的该部分中使用的微生物菌株

菌株7和8的LB过夜培养在37℃下在含有50μg/mL Km和100μg/mL Ap的3mL LB中生长。第二天，所述菌株在37℃下在摇板中生长5小时，然后将所述摇板使用与实施例1中描述的相同培养基(除了添加30g/L葡萄糖作为碳源)在30℃下孵育39小时。如在实施例1中所描述的进行所述培养物的制备和分析。

如在表6中所示的，表达突变的kgdP-M38的菌株8的P4HB滴度远超过表达天然kgdP基因的菌株7的P4HB滴度。

表6：生物质和P4HB滴度

菌株	生物质滴度(g/L)	P4HB滴度(％dcw)
			7	3.42±0.01	7.95±2.40
8	4.60±0.09	29.94±0.58

表达kgdP-M38以及sucD_Ck*的菌株中改善的P4HB产量

为确定突变的kgdP-M38的表达是否可以增加也表达来自克氏梭菌的sucD_Ck*基因的菌株中的P4HB滴度，构建了包含yneI、gabD、pykF和pykA的染色体均缺失且过表达来自克氏梭菌的orfZ_Ck基因、大肠杆菌ppc基因、PHA合酶phaC3/C1*基因、来自拟南芥的ssaR_At*基因和来自克氏梭菌的sucD_Ck*基因的两种菌株。菌株9以P_trc启动子表达天然kgdP基因，而菌株10同样以P_trc启动子表达突变的kgdP-M38(表7)。

表7：在实施例3的该部分使用的微生物菌株

菌株9和10的LB过夜培养在37℃下在含有25μg/mL Cm和100μg/mLAp的3mL LB中生长。第二天，将菌株接种至摇板中并在28℃下使用与实施例1中描述的相同的培养基(除了添加56.6g/L葡萄糖作为碳源)孵育42小时。菌株9和10的平行培养物生长，其中添加了0或100μM的IPTG以诱导基因表达。如在实施例1中所描述的进行所述培养物的制备和分析。

如在表8中所示的，由在100μM IPTG下表达天然kgdP基因的菌株9产生的P4HB的滴度与非诱导的、0μM IPTG对照的相同菌株产生的P4HB的滴度没有差别，但是，在100μM IPTG下表达突变的kgdP-M38的菌株10比非诱导的对照菌株10以及非诱导的或诱导的菌株9有显著增加。这证明sucD_Ck*和突变的kgdP-M38的组合表达导致较好的P4HB产量。

表8：生物质和P4HB滴度

实施例4：蓝细菌α-酮戊二酸脱羧酶的野生型酶活性足以用于工程化大肠杆菌筛选菌株的生长恢复

在最近的发现中，Zhang和Bryant(Science 334:1551-1553(2011))从聚球藻PCC 7002中鉴定了2-酮戊二酸脱羧酶，所述酶催化与KgdM或KgdP相同的代谢反应(图1，反应6)。但是，发现新阐明的2-酮戊二酸脱羧酶的氨基酸序列与结核分枝杆菌的Kgd酶及其同源物的氨基酸序列不同。

该实施例证明2-酮戊二酸脱羧酶基因(以下称kgdS)的表达能够使实施例2中描述的大肠杆菌MG1655ΔsucAB菌株在补充有α-酮戊二酸作为唯一碳源的E2最低培养基中生长。构建了以下三种菌株。菌株11是仅载有空载体的MG1655，因此不过表达任何重组基因。菌株12是包含染色体缺失sucAB并仅载有空载体的MG1655宿主。菌株13具有与菌株12相同的染色体缺失，但是以P_trc启动子表达来自聚球藻PCC 7002的kgdS基因(表9)。

表9：实施例4中使用的菌株

菌株	相关宿主基因组缺失	过表达的基因
			11	野生型(sucAB+)	无
12	ΔsucAB	无
			13	ΔsucAB	Ptrc-kgdS(聚球藻PCC 7002)

菌株11、12和13在37℃下、在由1×E2盐、2mM MgSO₄、1×痕量盐溶液、2g/Lα-酮戊二酸、100μg/mL氨苄青霉素和10μM IPTG组成的液体培养基中生长。50×E2盐原液和1000×痕量盐溶液的组成在实施例1中给出。定期地测量OD600以确定生长速率。

如在表10中所示的，阳性对照菌株11展现出0.37h^-1的比生长速率，而如所预期的，包含染色体缺失sucAB的菌株12根本不生长。意外地，来自聚球藻PCC 7002的kgdS的表达导致sucAB缺失背景的菌株中完全恢复的比生长速率0.36h^-1。

表10：α-酮戊二酸作为唯一碳源的生长速率

菌株	比生长速率(h-1)
		11	0.37
12	0.00
		13	0.36

实施例5：通过来自聚球藻PCC 7002的2-酮戊二酸脱羧酶的表达改善的P4HB产量

在该实施例中，比较了表达来自克氏梭菌的sucD_Ck*或突变的来自P.dioxanivorans的kgdP-M38的菌株与表达来自聚球藻PCC 7002的kgdS的菌株中的P4HB产量。为此，构建了三种菌株，其全部包含yneI、gabD、pykF和pykA的染色体均缺失并过表达来自克氏梭菌的orfZ_Ck基因、大肠杆菌ppc基因、PHA合酶phaC3/C1*基因和来自拟南芥的ssaR_At*基因。菌株14以P_tet启动子表达来自克氏梭菌的sucD_Ck*基因，而菌株15和16使用P_trc启动子分别表达突变的来自P.dioxanivorans的kgdP-M38和来自聚球藻PCC 7002的天然kgdS(表11)。

表11：实施例5中使用的微生物菌株

所述菌株在摇板分析中生长以检验P4HB的产生。所述三种菌株每一种的三份在包含具有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素(菌株14)或100μg/mL氨苄青霉素(对于菌株15和16)的3mL LB的无菌管中培养过夜。摇板实验的分析条件与实施例1中描述的条件相同，除了在培养基中使用50g/L葡萄糖、5mM MgSO₄和10μM IPTG。菌株15和16的平行培养物也在其中如表12中所指示的添加100μM IPTG的情况下生长。如实施例1中所描述的制备和分析所述培养物。

如表12中所示的，sucD_Ck*表达的生产菌株14产生的P4HB滴度与在100μM IPTG下表达kgdP-M38的菌株15产生的P4HB滴度相似。但是，在10μMIPTG下菌株16的天然kgdS的中度表达明显超过菌株14和15的P4HB生产能力，证明KgdS对于P4HB产生的优良性能。

表12：生物质和P4HB滴度

实施例6：通过丙二酰辅酶A还原酶基因的表达改善的P4HB产量

在文献中描述了两种类型的丙二酰辅酶A还原酶。来自橙色绿屈挠菌的丙二酰辅酶A还原酶催化丙二酰辅酶A和NADPH经过丙二酸半醛至3-羟基丙酸的两步还原(Hügler等，J.Bacteriol.184(9):2404-2410(2002))。相反，来自勤奋金属球菌的丙二酰辅酶A还原酶以及其来自Sulfolobus tokodaii的同源物是单功能蛋质白，其仅催化丙二酰辅酶A转化成丙二酸半醛，而不再将后者转化成3-羟基丙酸(Alber等，J.Bacteriol.188(24):8551-8559(2006))。

该实施例证明，与不表达丙二酰辅酶A还原酶基因的菌株相比，来自S.tokodaii的丙二酰辅酶A还原酶基因的表达改善了P4HB产量。构建以下两种菌株，其均包含染色体均缺失yneI、gabD、pykF和pykA，并过表达PHA合酶phaC3/C1*、sucD_Ck*和来自克氏梭菌的orfZ_Ck基因、来自拟南芥的ssaR_At*基因以及大肠杆菌ppc gene。包含这些修饰的菌株17作为菌株18的对照，其也以P_syn1启动子表达来自S.tokodaii的mcr_St*基因(表13)。

表13：在实施例6中使用的微生物菌株

将菌株17和18的三份重复在包含具有15μg/mL四环素(菌株17)或25μg/mL氯霉素(菌株18)的3mL LB的无菌管中培养过夜。使摇板在37℃下振动生长5小时，然后在30℃下孵育共48小时。用于所述摇板实验的分析条件与实施例1中所描述的一样，除了在培养基中使用30g/L的葡萄糖且不添加IPTG。如实施例1中所描述的制备和分析培养物。

如在表14中所示的，表达mcr_St*的生产菌株18令人惊异地且出人意料地比不表达该基因的对照菌株17产生高得多的P4HB滴度。

表14：生物质和P4HB滴度

菌株	生物质滴度(g/L)	P4HB滴度(％dcw)
			17	6.14±0.09	19.40±0.49
18	6.96±0.14	31.23±2.00

实施例7：通过氧化应激抗性1,2-丙二醇氧化还原酶的表达改善的P4HB产量

来自大肠杆菌的NADH依赖性氧化还原酶FucO在以L-鼠李糖作为唯一碳源和能量源厌氧生长的细胞中被鉴定为L-1,2-丙二醇氧化还原酶(Boronat和Aguilar,J.Bacteriol.140(2):320-306(1979)；Chin和Lin,J.Bacteriol.157(3):828-832(1984)；Zhu和Lin,J.Bacteriol.171(2):862-867(1989))。该丙二醇氧化还原酶将L-乳醛转化为L-1,2-丙二醇，并且由于在有氧条件下酶失活而仅在厌氧条件下有催化活性。但是，具有增加的氧化应激抗性的FucO突变体被分离出来(Lu等，J.Biol.Chem.273(14):8308-8316(1998))。FucO的扩展的作用由Wang等证明(Appl.Environ.Microbiol.77(15):5132-5140(2011))，他显示工程化大肠杆菌菌株中来自质粒的fucO的表达实质上通过将毒性糠醛转化为低毒性的糖醇提高了糠醛耐受性。

该实施例证明了编码具有增加的氧化应激抗性的氧化还原酶的大肠杆菌fucO基因变体(下文称为fucO_I6L-L7V)的表达与不表达该基因的菌株相比改善了P4HB产量。构建以下两种菌株，其均过表达PHA合酶phaC3/C1*、sucD_Ck*和来自克氏梭菌的orfZ_Ck基因及大肠杆菌ppc基因。两种菌株都不表达在之前实施例中使用的来自拟南芥的ssaR_At*基因。两种菌株包含染色体缺失yneI、gabD、pykF、pykA和fucO并在两种醛脱氢酶yqhD和yihU(其基因产物显示出将琥珀半醛转化为4-羟基丁酸)中具有基因敲除突变(Van Walsem等，美国专利申请号WO 2011100601；Saito等，J.Biol.Chem.284(24):16442–16451(2009)；图1，反应8)。包含所有这些修饰的菌株19作为菌株20的对照，其同样以IPTG-诱导的P_trc启动子表达fucO_I6L-L7V(表15)。

表15：实施例7中使用的微生物菌株

将菌株19和20的三份重复在包含3mL LB的无菌管中培养过夜，LB具有15μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素。使摇板在37℃下振动生长5小时，然后在28℃下孵育共42小时。用于摇板实验的分析条件与实施例1中所描述的一样，除了在培养基中使用40g/L的葡萄糖且添加如表16所指示的0、10或100μM的IPTG。如实施例1中所描述的制备和分析培养物。

如在表16中所示的，对照菌株19仍然生产显著量的P4HB，尽管它包含yqhD、yihU和fucO的染色体基因敲除突变，推测这是由于一种或多种未鉴定的、内源性琥珀半醛还原酶。与对照菌株19相比，表达fucO_I6L-L7V的菌株20产生更高的P4HB滴度，显示了具有增加的氧化应激抗性的FucO突变体酶能够将琥珀半醛转化成4-羟基丁酸。

表16：生物质和P4HB滴度

实施例8：通过内源的大肠杆菌琥珀酰辅酶A合成酶的表达减少而改善的P4HB产量

该实施例证明减少由sucCD编码的内源大肠杆菌琥珀酰辅酶A合成酶的表达提高了P4HB产量。

构建以下两种菌株，其均过表达PHA合酶phaC3/C1*和phaC183*、sucD_Ck*和来自克氏梭菌的orfZ_Ck基因、来自拟南芥的ssaR_At*基因和大肠杆菌ppc基因。两种菌株包含yneI、gabD、pykF和pykA的宿主基因组缺失，并包含fadR601突变，所述突变显示为使乙醛酸支路酶aceB和aceA去阻遏(Rhie和Dennis,Appl.Envion.Microbiol.61(7):2487-2492(1995))。因此，两种菌株均包含aceBA操纵子的染色体均缺失。包含上述所有修饰的菌株21作为菌株22的对照，其另外也包含sucCD基因的染色体缺失(表17)。

表17：实施例8中使用的微生物菌株

将菌株21和22的三份重复在包含具有50μg/mL卡那霉素的3mL LB的无菌管中培养过夜。使摇板在37℃下振动生长5小时，然后在28℃下孵育共47小时。用于摇板实验的分析条件与实施例1中所描述的一样，除了使用45g/L的葡萄糖作为唯一碳源。如实施例1中所描述的制备和分析培养物。

如在表18中所示的，具有降低的琥珀酰辅酶A合成酶活性的菌株22比对照菌株21产生更高的P4HB滴度。

表18：生物质和P4HB滴度

菌株	生物质滴度(g/L)	P4HB滴度(％dcw)
			21	13.6±0.1	60±0.8％
22	17.0±0.3	72±3.4％

实施例9：通过NADH-依赖性延胡索酸还原酶的表达改善的P4HB产量

该实施例证明了异源延胡索酸还原酶基因的表达增加了P4HB产量。当大肠杆菌在厌氧条件下生长时，由内源延胡索酸还原酶催化的反应使得延胡索酸酯用作末端电子受体。延胡索酸还原酶是膜结合的，并使用还原的甲基萘醌类将延胡索酸转化成琥珀酸。相反，来自布氏锥虫的延胡索酸还原酶(称为FRDg)在有氧条件下是有活性的，其为可溶性的(即，非膜结合的)并使用NADH将延胡索酸转化成琥珀酸(Besteiro等，J.Biol.Chem.277(41):38001-38012(2002))。通过驱使更多碳沿反向TCA循环碳流进入P4HB途径，P4HB生产菌株中FRDg的表达可以增加PHA滴度。为了测试这一点，构建以下两种菌株，其均具有yneI、gabD、pykF和pykA的染色体缺失并且过表达PHA合酶phaC3/C1*、sucD_Ck*和来自克氏梭菌的orfZ_Ck基因、来自拟南芥的ssaR_At*基因以及大肠杆菌ppc基因。包含这些修饰的菌株23作为菌株24的对照，其同样以P_trc启动子表达来自布氏锥虫的frd_g*基因(表19)。

表19：实施例9中使用的微生物菌株

将菌株23和24的三份重复在包含具有15μg/mL四环素和100μg/mL氨苄青霉素的3mL LB的无菌管中培养过夜。使摇板在37℃下振动生长5小时，然后在30℃下孵育共24小时。用于摇板实验的分析条件与实施例1中所描述的一样，除了使用20g/L的葡萄糖作为唯一碳源。菌株23和24的平行培养物也在添加0μM或100μM的IPTG下生长。如实施例1中所描述的制备和分析所述培养物。

如在表20中所示的，表达来自布氏锥虫的frd_g*基因的菌株24比对照菌株23产生更高的P4HB滴度。

表20.生物质和P4HB滴度

布氏锥虫FRDg酶的长度是1142个氨基酸，且是推定的多功能蛋白，由三个不同的结构域组成。N-末端结构域(从第37位到第324位)与可能参与硫胺生物合成的ApbE蛋白质同源，C-末端结构域与细胞色素b₅还原酶和硝酸还原酶的细胞色素结构域同源(从第906位到第1128位)，而中间结构域与延胡索酸还原酶同源(Besteiro等，J.Biol.Chem.277(41):38001-38012(2002))。因此，预期仅FRDg的中间结构域的表达足以获得在本实施例中观察到的P4HB滴度的增加。

实施例10：通过丙酮酸羧化酶基因的表达改善的P4HB产量

该实施例证明了与不表达丙酮酸羧化酶基因的菌株相比，异源丙酮酸羧化酶基因的表达改善了P4HB产量。构建以下两种菌株，其均包含yneI、gabD染色体缺失并且过表达PHA合酶phaC3/C1*、sucD_Ck*和来自克氏梭菌的orfZ_Ck基因、来自拟南芥的ssaR_At*基因和大肠杆菌ppc基因。包含这些修饰的菌株25作为菌株26的对照，其同样以P_trc启动子表达来自乳酸乳球菌的pyc_Ll基因(表21)。

表21.在实施例10中使用的微生物菌株

将菌株25和26的三份重复在包含具有25μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄青霉素的3mL LB的无菌管中培养过夜。使摇板在37℃下振动生长5小时，然后在30℃下孵育共48小时。用于摇板实验的分析条件与实施例1中所描述的一样，除了使用20g/L的葡萄糖作为唯一碳源。菌株25和26的平行培养物在添加0、50、150或250μM的IPTG下生长。如实施例1中所描述的制备和分析所述培养物。

如在表22中所示的，表达来自乳酸乳球菌的pyc_Ll基因的菌株26比对照菌株25产生更高的P4HB滴度。

表22.生物质和P4HB滴度

实施例11：通过NADH激酶基因的表达改善的P4HB产量

该实施例证明了，与不表达NADH激酶基因的菌株相比，异源NADH激酶基因的表达改善了P4HB产量。预期这样的NADH激酶基因的表达导致增加的细胞内NADPH浓度，其用于P4HB的高水平生产，因为由sucD_Ck*和ssaR_At*编码的两种4HB途径酶需要这一还原当量。为了测试这一点，过表达编码NADH激酶(也称为ATP:NADH 2’-磷酸转移酶)的来自构巢曲霉的ndk_An*基因(Panagiotou等，Metabol.Engin.11:31-39(2009))。构建以下两种菌株，其均具有yneI和gabD并染色体缺失且过表达PHA合酶phaC1、sucD_Ck*和来自克氏梭菌的orfZ_Ck基因，和来自拟南芥的ssaR_At*基因。包含这些修饰的菌株27作为菌株28的对照，其同样以P_trc启动子表达来自构巢曲霉的ndk_An*基因(表23)。

表23.在实施例11中使用的微生物菌株

将菌株27和28的三份重复在包含具有25μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄青霉素的3mL LB的无菌管中培养过夜。使摇板在37℃下振动生长5小时，然后在30℃下孵育共48小时。用于摇板实验的分析条件与实施例1中所描述的一样，除了使用25g/L的葡萄糖作为唯一碳源。如实施例1中所描述的制备和分析所述培养物。

如在表24中所示的，表达来自构巢曲霉的ndk_An*基因的菌株28比对照菌株27产生明显更高的P4HB滴度。

表24：生物质和P4HB滴度

菌株	生物质滴度(g/L)	P4HB滴度(％dcw)
			27	2.9±0.1	11.5±1.7
28	5.9±0.2	34.8±4.6

实施例12：通过向发酵培养基中加入泛酸盐而改善的P4HB产量

该实施例证明了，与不包含泛酸盐这一代谢物的发酵培养基相比，向发酵培养基中添加泛酸盐改善了P4HB产量。提供的泛酸盐被大肠杆菌使用由panF编码的泛酸盐:Na⁺转运体摄取(Jackowski和Alix,J.Bacteriol.172(7):3842-8(1990)；图1)。泛酸盐是辅酶A的代谢前体，其在下述反应(1)中可以通过乙酰辅酶A合成酶(E.C.6.2.1.1.)转化成乙酰辅酶A：

醋酸+ATP+辅酶A→乙酰辅酶A+AMP+二磷酸  (1)

向发酵培养基中加入泛酸盐可以通过增加补充TCA循环所需要的细胞内乙酰辅酶A池和/或在下述反应(2)中转化由来自克氏梭菌的orfZ_Ck编码的辅酶A转移酶形成的醋酸而改善P4HB产量：

4-羟基丁酸+乙酰辅酶A→4-羟基丁酰辅酶A+醋酸  (2)

为测试这一点，使用菌株29，其包含yneI、gabD、pykF和pykA的染色体缺失，并且过表达PHA合酶phaC3/C1*、sucD_Ck*和来自克氏梭菌的orfZ_Ck基因、来自拟南芥的saR_At*基因以及大肠杆菌ppc基因(表25)。

表25.实施例12中使用的微生物菌株

将菌株29的三份重复在包含具有25μg/mL氯霉素的3mL LB的无菌管中培养过夜。使摇板在37℃下振动生长6个小时，然后在28℃下孵育共46个小时。用于摇板实验的分析条件与实施例1中所描述的一样，除了在培养基中使用43.5g/L的葡萄糖，补充有0或5mM的泛酸盐。在生长期结束时，如实施例1中所概述的测定生物质和P4HB滴度。

如在表26中所示的，与没有向发酵培养基中添加泛酸盐相比，加入5mM泛酸盐产生更高的P4HB滴度。

表26：补充泛酸盐的菌株29的生物质和P4HB滴度

泛酸盐(mM)	生物质滴度(g/L)	P4HB滴度(％dcw)
			0	5.40±0.13	46.6±0.2
5	6.15±0.09	50.4±0.4

基因ID 001核苷酸序列：乳酸乳球菌乳酸亚种Berridge X 13丙酮酸羧化酶pyc_Ll

ATGAAAAAACTACTCGTCGCCAATCGTGGAGAAATCGCCGTTCGTGTCTTTCGTGCCTGTAATGAACTCGGACTTTCTACAGTAGCCGTCTATGCAAGAGAAGATGAATATTCCGTTCATCGCTTTAAAGCAGATGAATCTTACCTTATCGGTCAAGGTAAAAAACCAATTGATGCTTATTTGGATATTGATGATATTATTCGTGTTGCTCTTGAATCAGGAGCAGATGCCATTCATCCCGGTTATGGTCTTTTATCTGAAAATCTTGAATTTGCTACAAAAGTTCGAGCAGCAGGATTAGTTTTTGTCGGTCCTGAACTTCATCATTTGGATATTTTCGGCGATAAAATCAAAGCAAAAGCCGCAGCTGATGAAGCTCAAGTTCCCGGAATTCCCGGAACAAATGGTGCAGTAGATATTGACGGAGCTCTTGAATTTGCTCAAACTTACGGATATCCAGTCATGATTAAGGCAGCATTGGGCGGCGGCGGTCGTGGAATGCGTGTTGCGCGTAATGACGCTGAAATGCACGACGGATATGCTCGTGCGAAATCAGAAGCTATCGGTGCCTTTGGTTCTGGAGAAATCTATGTTGAAAAATACATTGAAAATCCTAAGCATATTGAAGTTCAAATTCTTGGGGATAGTCATGGAAATATTGTCCATTTGCACGAACGTGATTGCTCTGTCCAACGCCGAAATCAAAAAGTCATTGAAATTGCTCCAGCCGTAGGACTCTCACCAGAGTTCCGTAATGAAATTTGTGAAGCAGCAGTTAAACTTTGTAAAAATGTTGGCTATGTTAATGCTGGGACGGTTGAATTTTTAGTCAAAGATGATAAGTTCTACTTTATCGAAGTCAACCCACGTGTTCAAGTTGAACACACAATTACCGAGCTTATTACAGGTGTAGATATTGTTCAAGCACAAATTTTGATTGCTCAAGGCAAAGATTTACATACAGAAATTGGTATCCCGGCACAAGCTGAAATACCACTTTTGGGCTCAGCCATTCAATGTCGTATTACTACAGAAGACCCGCAAAATGGCTTCTTGCCAGATACAGGTAAAATCGATACCTACCGTTCACCAGGTGGTTTCGGCATTCGTTTGGACGTTGGAAATGCCTATGCTGGTTATGAAGTGACTCCCTATTTTGACTCGCTTTTAGTAAAAGTTTGTACCTTTGCTAATGAATTTAGCGATAGTGTACGTAAAATGGATCGTGTGCTTCATGAATTCCGTATTCGTGGGGTGAAAACTAATATTCCATTTTTGATTAATGTTATTGCCAATGAAAACTTTACGAGCGGACAAGCAACAACAACCTTTATTGACAATACTCCAAGTCTTTTCAATTTCCCACGCTTACGTGACCGTGGAACAAAAACCTTACACTACTTATCAATGATTACAGTCAATGGTTTCCCAGGGATTGAAAATACAGAAAAACGCCATTTTGAAGAACCTCGTCAACCTCTACTTAACATTGAAAAGAAAAAGACAGCTAAAAATATCTTAGATGAACAAGGGGCTGATGCGGTAGTTGAATATGTGAAAAATACAAAAGAAGTATTATTGACAGATACAACTTTACGTGATGCTCACCAGTCTCTTCTTGCCACTCGTTTGCGTTTGCAAGATATGAAAGGAATTGCTCAAGCCATTGACCAAGGACTTCCAGAACTTTTCTCAGCTGAAATGTGGGGTGGGGCAACCTTTGATGTCGCTTATCGTTTCTTGAATGAATCGCCTTGGTATCGTCTACGTAAATTACGTAAACTCATGCCAAATACCATGTTCCAAATGCTTTTCCGTGGTTCAAATGCAGTTGGATATCAAAACTATCCTGATAATGTCATTGAAGAATTTATCCACGTAGCTGCACATGAAGGAATCGATGTCTTTCGTATCTTTGATAGCCTCAACTGGTTGCCACAAATGGAAAAATCAATCCAAGCAGTGCGTGATAATGGAAAAATTGCCGAAGCAACCATTTGTTATACAGGAGATATCCTTGACCCAAGTCGACCAAAATATAATATCCAATACTACAAAGATTTGGCAAAAGAGTTAGAAGCTACTGGGGCTCATATACTTGCCGTTAAAGATATGGCGGGCTTGTTGAAACCTCAAGCGGCATATCGCTTGATTTCAGAATTAAAAGATACGGTTGACTTACCAATTCACTTGCATACACATGATACTTCAGGAAATGGTATTATTACCTATTCTGGTGCAACTCAAGCAGGAGTAGATATTATTGATGTGGCAACTGCCAGTCTTGCTGGTGGAACTTCTCAACCTTCAATGCAATCAATTTATTATGCCCTTGAACATGGTCCCCGTCATGCTTCAATTAATGTGAAAAATGCAGAGCAAATTGACCATTATTGGGAAGATGTGCGTAAATATTATGCACCTTTTGAGGCAGGAATTACGAGCCCACAAACTGAAGTTTACATGCATGAAATGCCTGGCGGACAATATACTAACTTGAAATCTCAAGCAGCAGCTGTTGGACTTGGACATCGTTTTGATGAAATCAAACAAATGTATCGTAAAGTAAACATGATGTTTGGCGATATCATTAAAGTAACTCCTTCATCAAAAGTAGTTGGTGATATGGCACTCTTTATGATTCAAAACGAATTGACAGAAGAGGATGTCTATGCGCGAGGAAATGAGCTTAACTTCCCTGAATCAGTAGTCTCATTCTTCCGTGGTGATTTAGGACAGCCTGTTGGAGGTTTCCCAGAAGAACTACAAAAAATTATTGTAAAAGACAAATCGGTCATTATGGATCGTCCAGGATTACATGCCGAAAAAGTTGATTTTGCAACTGTAAAAGCTGACTTGGAACAAAAAATTGGTTATGAACCAGGTGATCATGAAGTTATCTCTTACATTATGTATCCACAAGTTTTCCTTGATTATCAAAAAATGCAAAGAGAATTTGGAGCTGTCACACTACTCGATACTCCAACTTTCTTACACGGAATGCGCCTCAATGAAAAAATTGAAGTCCAAATTGAAAAAGGTAAAACGCTCAGCATTCGTTTAGATGAAATAGGAGAACCTGACCTCGCTGGAAATCGTGTGCTCTTCTTTAACTTGAACGGTCAGCGTCGTGAAGTTGTTATTAATGACCAATCCGTTCAAACTCAAATTGTAGCTAAACGTAAGGCCGAAACAGGTAATCCAAACCAAATTGGAGCAACTATGCCCGGTTCTGTTCTTGAAATCCTAGTTAAAGCTGGAGATAAAGTTAAAAAAGGACAAGCTTTGATGGTTACTGAAGCCATGAAGATGGAAACGACCATTGAGTCACCATTTGATGGAGAGGTTATTGCCCTTCATGTTGTCAAAGGTGAAGCCATTCAAACACAAGACTTATTGATTGAAATTGACTAA(SEQ ID NO:19)

基因ID 001氨基酸序列：乳酸乳球菌乳酸亚种Berridge X 13丙酮酸羧化酶Pyc_Ll

MKKLLVANRGEIAVRVFRACNELGLSTVAVYAREDEYSVHRFKADESYLIGQGKKPIDAYLDIDDIIRVALESGADAIHPGYGLLSENLEFATKVRAAGLVFVGPELHHLDIFGDKIKAKAAADEAQVPGIPGTNGAVDIDGALEFAQTYGYPVMIKAALGGGGRGMRVARNDAEMHDGYARAKSEAIGAFGSGEIYVEKYIENPKHIEVQILGDSHGNIVHLHERDCSVQRRNQKVIEIAPAVGLSPEFRNEICEAAVKLCKNVGYVNAGTVEFLVKDDKFYFIEVNPRVQVEHTITELITGVDIVQAQILIAQGKDLHTEIGIPAQAEIPLLGSAIQCRITTEDPQNGFLPDTGKIDTYRSPGGFGIRLDVGNAYAGYEVTPYFDSLLVKVCTFANEFSDSVRKMDRVLHEFRIRGVKTNIPFLINVIANENFTSGQATTTFIDNTPSLFNFPRLRDRGTKTLHYLSMITVNGFPGIENTEKRHFEEPRQPLLNIEKKKTAKNILDEQGADAVVEYVKNTKEVLLTDTTLRDAHQSLLATRLRLQDMKGIAQAIDQGLPELFSAEMWGGATFDVAYRFLNESPWYRLRKLRKLMPNTMFQMLFRGSNAVGYQNYPDNVIEEFIHVAAHEGIDVFRIFDSLNWLPQMEKSIQAVRDNGKIAEATICYTGDILDPSRPKYNIQYYKDLAKELEATGAHILAVKDMAGLLKPQAAYRLISELKDTVDLPIHLHTHDTSGNGIITYSGATQAGVDIIDVATASLAGGTSQPSMQSIYYALEHGPRHASINVKNAEQIDHYWEDVRKYYAPFEAGITSPQTEVYMHEMPGGQYTNLKSQAAAVGLGHRFDEIKQMYRKVNMMFGDIIKVTPSSKVVGDMALFMIQNELTEEDVYARGNELNFPESVVSFFRGDLGQPVGGFPEELQKIIVKDKSVIMDRPGLHAEKVDFATVKADLEQKIGYEPGDHEVISYIMYPQVFLDYQKMQREFGAVTLLDTPTFLHGMRLNEKIEVQIEKGKTLSIRLDEIGEPDLAGNRVLFFNLNGQRREVVINDQSVQTQIVAKRKAETGNPNQIGATMPGSVLEILVKAGDKVKKGQALMVTEAMKMETTIESPFDGEVIALHVVKGEAIQTQDLLIEID(SEQ ID NO:20)

基因ID 002核苷酸序列：Sulfolobus tokodaii丙二酰辅酶A还原酶mcr_StATGATCCTGATGCGCCGCACCCTCAAAGCAGCAATCCTGGGCGCCACGGGCTTGGTTGGTATTGAGTACGTGCGCATGCTGAGCAATCACCCGTATATCAAACCAGCATATCTGGCGGGTAAGGGCAGCGTTGGCAAGCCTTACGGTGAGGTCGTGCGCTGGCAGACGGTAGGTCAGGTGCCGAAAGAAATTGCGGACATGGAGATCAAGCCGACGGACCCGAAGCTGATGGATGACGTTGACATTATCTTCTCCCCGCTGCCGCAGGGTGCAGCTGGTCCGGTGGAAGAACAATTTGCCAAAGAAGGTTTTCCTGTTATTAGCAACAGCCCGGACCATCGCTTTGATCCGGACGTTCCGCTGCTGGTGCCGGAGCTGAATCCGCATACGATCAGCTTGATTGACGAGCAACGTAAGCGTCGCGAGTGGAAAGGTTTTATCGTCACTACGCCGCTGTGCACCGCCCAAGGTGCGGCCATTCCGCTGGGCGCAATCTTCAAAGATTACAAGATGGACGGTGCGTTTATCACCACCATCCAGAGCCTGAGCGGCGCTGGCTATCCGGGTATTCCGTCCCTGGATGTGGTTGATAACATTCTGCCGCTGGGCGATGGTTACGACGCCAAGACCATTAAAGAAATCTTCCGTATCCTGAGCGAGGTTAAACGTAATGTTGACGAGCCGAAACTGGAGGATGTGTCTCTGGCGGCGACCACGCACCGTATCGCGACCATTCACGGTCATTACGAAGTCCTGTATGTGAGCTTCAAAGAAGAAACTGCAGCGGAGAAGGTCAAAGAAACCCTGGAGAACTTCCGTGGCGAGCCTCAGGATTTGAAGTTGCCGACCGCGCCATCGAAACCGATTATTGTCATGAACGAAGATACCCGTCCGCAGGTTTACTTCGACCGTTGGGCGGGTGATATCCCGGGTATGAGCGTTGTCGTCGGTCGTCTGAAGCAAGTGAACAAGCGTATGATTCGTCTGGTTAGCCTGATTCACAATACCGTGCGTGGCGCTGCGGGTGGTGGCATCCTGGCAGCGGAGCTGTTGGTCGAGAAAGGCTATATTGAAAAGTAA(SEQ ID NO:21)

基因ID 002氨基酸序列：Sulfolobus tokodaii丙二酰辅酶A还原酶Mcr_StMILMRRTLKAAILGATGLVGIEYVRMLSNHPYIKPAYLAGKGSVGKPYGEVVRWQTVGQVPKEIADMEIKPTDPKLMDDVDIIFSPLPQGAAGPVEEQFAKEGFPVISNSPDHRFDPDVPLLVPELNPHTISLIDEQRKRREWKGFIVTTPLCTAQGAAIPLGAIFKDYKMDGAFITTIQSLSGAGYPGIPSLDVVDNILPLGDGYDAKTIKEIFRILSEVKRNVDEPKLEDVSLAATTHRIATIHGHYEVLYVSFKEETAAEKVKETLENFRGEPQDLKLPTAPSKPIIVMNEDTRPQVYFDRWAGDIPGMSVVVGRLKQVNKRMIRLVSLIHNTVRGAAGGGILAAELLVEKGYIEK(SEQ ID NO:22)

基因ID 003核苷酸序列：Pseudonocardia dioxanivorans CB1190α-酮戊二酸还原酶kgdP-M38

ATGTCCACCAGCAGTACCTCCGGCCAGACGAGCCAGTTCGGCCCCAACGAATGGCTCGTCGAGGAGATGTACCAGCGTTTCCTCGACGACCCGGATGCCGTCGACGCCGCCTGGCACGACTTCTTCGCCGACTACCGGCCGCCGTCCGGTGACGACGAGACGGAGTCGAACGGAACCACCTCCACCACGACGACCCCGACCGCCTCCGCGTCCGCCGCCGCTCCCCGTTCCGCCGCCGCCTCCGGGACGGCCGCGGCGAACGGCTCGGCGCCGGCCCCCGAGGACAAGGCGGAGAAGACCACCGAGAAGACCGTGCAGCAGCCCGCCACGCAGAAGCCGGCCCAGCAGGCCGACCGGTCGGCGAACGGCGCCGCCCCCGGCAAGCCCGTCGCGGGCACCACGTCGCGTGCCGCCAAGCCCGCGCCCGCCGCCGCCGAGGGCGAGGTGCTGCCCCTGCGCGGGGCGGCGAACGCCGTCGTCAAGAACATGAACGCCTCGCTCGCCGTGCCGACCGCGACGAGCGTGCGCGCCGTGCCGGCGAAGCTCATCGCCGACAACCGCATCGTCATCAACAACCAGCTCAAGCGCACGCGTGGCGGCAAGCTGTCGTTCACCCACCTCATCGGCTACGCGGTGGTCAAGGCGCTGGCCGACTTCCCGGTGATGAACCGGCACTTCGTCGAGGTCGACGGGAAACCCACCGCCGTCCAGCCGGAGCACGTCAACCTCGGCCTCGCGATCGACCTGCAGGGCAAGAACGGGCAGCGTTCCCTCGTCGTCGTGTCGATCAAGGGCTGCGAGGAGATGACCTTCGCGCAGTTCTGGTCCGCCTACGAGAGCATGGTCCACAAGGCGCGCAACGGCACGCTCGCCGCCGAGGACTTCGCGGGCACCACGATCAGCCTCACCAACCCGGGCACCCTCGGCACCAACCACTCGGTGCCGCGGTTGATGCAGGGCCAGGGCACGATCGTCGGTGTCGGCGCGATGGAGTACCCCGCCGAGTTCCAGGGCGCCAGCGAGGAGCGGCTCGCCGAGCTCGGCATCAGCAAGATCATCACGCTGACGTCGACCTACGACCACCGGATCATCCAGGGCGCGGAGTCGGGCGACTTCCTGCGCCGGGTCCACCACCTGCTGCTGGGCGGCGACGGGTTCTTCGACGACATCTTCCGCTCCCTGCGCGTCCCGTACGAGCCGATCCGCTGGGTGCAGGACTTCGCCGAGGGCGAGGTCGACAAGACCGCGCGCGTCCTCGAGCTGATCGAGTCCTACCGCACGCGCGGCCACCTGATGGCCGACACCGACCCGCTCAACTACCGCCAGCGCCGTCACCCCGACCTCGACGTGCTCAGCCACGGGCTGACGCTGTGGGACCTCGACCGCGAGTTCGCGGTCGGCGGCTTCGCGGGCCAGCTGCGGATGAAGCTGCGCGACGTGCTCGGTGTGCTGCGCGACGCGTACTGCCGCACCATCGGCACCGAGTACATGCACATCGCCGACCCGGAGCAGCGGGCCTGGCTGCAGGAGCGCATCGAGGTCCCGCACCAGAAGCCGCCGGTCGTCGAGCAGAAGTACATCCTGTCGAAGCTCAACGCCGCCGAGGCGTTCGAGACCTTCCTGCAGACGAAGTACGTCGGGCAGAAGCGGTTCTCCCTGGAGGGCGGCGAGACCGTCATCCCGCTGCTCGACGCCGTGCTGGACAAGGCTGCCGAGCACGAGCTCGCCGAGGTCGTCATCGGCATGCCGCACCGCGGCCGGCTCAACGTGCTGGCCAACATCGTCGGCAAGCCGATCAGCCAGATCTTCCGCGAGTTCGAGGGCAACCTCGACCCGGGCCAGGCCCACGGCTCCGGCGACGTCAAGTACCACCTCGGCGCCGAGGGCAAGTACTTCCGCATGTTCGGCGACGGCGAGACGGTCGTGTCGCTGGCGTCCAACCCGAGCCACCTCGAGGCCGTCGACCCCGTGCTCGAGGGGATCGTCCGGGCCAAGCAGGACCTGCTCGACCAGGGCGACGGCGCCTTCCCGGTGCTGCCCCTGATGCTGCACGGCGACGCCGCGTTCGCCGGGCAGGGCGTCGTGGCCGAGACGCTGAACCTCGCCCTGCTGCGCGGCTACCGCACCGGCGGCACCGTGCACGTCGTCGTCAACAACCAGGTCGGGTTCACCACCGCGCCCGAGCAGTCGCGCTCGTCGCAGTACTGCACCGACGTCGCGAAGATGATCGGCGCGCCGGTCTTCCACGTGAACGGCGACGACCCCGAGGCGTGCGTGTGGGTCGCCAAGCTGGCGGTCGAGTACCGCGAGCGCTGGAACAACGACGTCGTGATCGACATGATCTGCTACCGGCGCCGCGGCCACAACGAGGGCGACGACCCCTCGATGACGCAGCCGGCGATGTACGACGTCATCGACGCCAAGCGCAGCGTCCGCAAGATCTACACCGAGTCCCTGATCGGCCGCGGCGACATCACCGTCGACGAGGCCGAGGCCGCGCTGAAGGACTTCTCCAACCAGCTCGAGCACGTGTTCAACGAGGTCCGCGAGCTGGAGCGCACGCCGCCGACGCTCTCGCCCTCGGTCGAGAACGAGCAGTCGGTGCCCACCGACCTCGACACCTCGGTGCCGCTGGAGGTCATCCACCGCATCGGCGACACCCACGTGCAGCTGCCGGAAGGCTTCACCGTGCACCAGCGGGTCAAGCCGGTGCTGGCCAAGCGGGAGAAGATGTCGCGCGAGGGCGACGTCGACTGGGCCTTCGGCGAGCTGCTCGCCATGGGCTCGCTGGCGCTCAACGGCAAGCTGGTCCGGCTCTCCGGGCAGGACTCGCGGCGCGGCACGTTCGTGCAGCGGCACTCGGTCGTCATCGACCGCAAGACCGGCGAGGAGTACTTCCCGCTGCGCAACCTCGCCGAGGACCAGGGCCGCTTCCTGCCCTACGACTCGGCGCTGTCGGAGTACGCGGCGCTCGGCTTCGAGTACGGCTACTCCGTGGCCAACCCGGACGCGCTCGTCATGTGGGAGGCGCAGTTCGGCGACTTCGTCAACGGCGCCCAGTCGATCATCGACGAGTTCATCTCCTCCGGTGAGGCCAAGTGGGGGCAGATGGCCGACGTCGTGCTGCTGCTGCCGCACGGCCTCGAGGGCCAGGGCCCCGACCACAGCTCCGGACGCATCGAGCGGTTCCTGCAGCTGTGTGCCGAGGGGTCGATGACGGTCGCGATGCCGTCGGAGCCCGCGAACCACTTCCACCTGCTGCGCCGGCACGCCCTCGACGGGGTGCGCCGCCCGCTGGTGGTATTCACGCCGAAGTGGATGCTGCGCGCCAAGCAGGTCGTCAGCCCGCTGTCGGACTTCACCGGTGGCCGCTTCCGCACCGTGATCGACGACCCGCGCTTCCGCAACTCCGACAGCCCCGCCCCCGGGGTGCGCCGGGTGCTGCTGTGCTCGGGCAAGATCTACTGGGAGCTGGCGGCGGCGATGGAGAAGCGCGGCGGGCGCGACGACATCGCGATCGTCCGCATCGAGCAGCTCTACCCGGTGCCCGACCGCCAGCTCGCCGCGGTCCTCGAGCGCTACCCCAACGCCGACGACATCCGCTGGGTCCAGGAGGAGCCGGCCAACCAGGGCGCGTGGCCGTTCTTCGGCCTCGACCTGCGGGAGAAGCTCCCGGAGCGGCTCTCGGGCCTGACCCGCGTGTCGCGGCGCCGGATGGCCGCGCCCGCGGCCGGCTCGTCGAAGGTCCACGAGGTCGAGCAGGCCGCGATCCTCGACGAGGCGCTGAGCTGA(SEQ IDNO:23)

基因ID 003氨基酸序列：Pseudonocardia dioxanivorans CB1190α-酮戊二酸还原酶kgdP-M38

MSTSSTSGQTSQFGPNEWLVEEMYQRFLDDPDAVDAAWHDFFADYRPPSGDDETESNGTTSTTTTPTASASAAAPRSAAASGTAAANGSAPAPEDKAEKTTEKTVQQPATQKPAQQADRSANGAAPGKPVAGTTSRAAKPAPAAAEGEVLPLRGAANAVVKNMNASLAVPTATSVRAVPAKLIADNRIVINNQLKRTRGGKLSFTHLIGYAVVKALADFPVMNRHFVEVDGKPTAVQPEHVNLGLAIDLQGKNGQRSLVVVSIKGCEEMTFAQFWSAYESMVHKARNGTLAAEDFAGTTISLTNPGTLGTNHSVPRLMQGQGTIVGVGAMEYPAEFQGASEERLAELGISKIITLTSTYDHRIIQGAESGDFLRRVHHLLLGGDGFFDDIFRSLRVPYEPIRWVQDFAEGEVDKTARVLELIESYRTRGHLMADTDPLNYRQRRHPDLDVLSHGLTLWDLDREFAVGGFAGQLRMKLRDVLGVLRDAYCRTIGTEYMHIADPEQRAWLQERIEVPHQKPPVVEQKYILSKLNAAEAFETFLQTKYVGQKRFSLEGGETVIPLLDAVLDKAAEHELAEVVIGMPHRGRLNVLANIVGKPISQIFREFEGNLDPGQAHGSGDVKYHLGAEGKYFRMFGDGETVVSLASNPSHLEAVDPVLEGIVRAKQDLLDQGDGAFPVLPLMLHGDAAFAGQGVVAETLNLALLRGYRTGGTVHVVVNNQVGFTTAPEQSRSSQYCTDVAKMIGAPVFHVNGDDPEACVWVAKLAVEYRERWNNDVVIDMICYRRRGHNEGDDPSMTQPAMYDVIDAKRSVRKIYTESLIGRGDITVDEAEAALKDFSNQLEHVFNEVRELERTPPTLSPSVENEQSVPTDLDTSVPLEVIHRIGDTHVQLPEGFTVHQRVKPVLAKREKMSREGDVDWAFGELLAMGSLALNGKLVRLSGQDSRRGTFVQRHSVVIDRKTGEEYFPLRNLAEDQGRFLPYDSALSEYAALGFEYGYSVANPDALVMWEAQFGDFVNGAQSIIDEFISSGEAKWGQMADVVLLLPHGLEGQGPDHSSGRIERFLQLCAEGSMTVAMPSEPANHFHLLRRHALDGVRRPLVVFTPKWMLRAKQVVSPLSDFTGGRFRTVIDDPRFRNSDSPAPGVRRVLLCSGKIYWELAAAMEKRGGRDDIAIVRIEQLYPVPDRQLAAVLERYPNADDIRWVQEEPANQGAWPFFGLDLREKLPERLSGLTRVSRRRMAAPAAGSSKVHEVEQAAILDEALS(SEQ ID NO:24)

基因ID 004核苷酸序列：大肠杆菌1,2-丙二醇氧化还原酶(氧化应激抗性)fucO_I6L-L7V

ATGATGGCTAACAGAATGCTGGTGAACGAAACGGCATGGTTTGGTCGGGGTGCTGTTGGGGCTTTAACCGATGAGGTGAAACGCCGTGGTTATCAGAAGGCGCTGATCGTCACCGATAAAACGCTGGTGCAATGCGGCGTGGTGGCGAAAGTGACCGATAAGATGGATGCTGCAGGGCTGGCATGGGCGATTTACGACGGCGTAGTGCCCAACCCAACAATTACTGTCGTCAAAGAAGGGCTCGGTGTATTCCAGAATAGCGGCGCGGATTACCTGATCGCTATTGGTGGTGGTTCTCCACAGGATACTTGTAAAGCGATTGGCATTATCAGCAACAACCCGGAGTTTGCCGATGTGCGTAGCCTGGAAGGGCTTTCCCCGACCAATAAACCCAGTGTACCGATTCTGGCAATTCCTACCACAGCAGGTACTGCGGCAGAAGTGACCATTAACTACGTGATCACTGACGAAGAGAAACGGCGCAAGTTTGTTTGCGTTGATCCGCATGATATCCCGCAGGTGGCGTTTATTGACGCTGACATGATGGATGGTATGCCTCCAGCGCTGAAAGCTGCGACGGGTGTCGATGCGCTCACTCATGCTATTGAGGGGTATATTACCCGTGGCGCGTGGGCGCTAACCGATGCACTGCACATTAAAGCGATTGAAATCATTGCTGGGGCGCTGCGAGGATCGGTTGCTGGTGATAAGGATGCCGGAGAAGAAATGGCGCTCGGGCAGTATGTTGCGGGTATGGGCTTCTCGAATGTTGGGTTAGGGTTGGTGCATGGTATGGCGCATCCACTGGGCGCGTTTTATAACACTCCACACGGTGTTGCGAACGCCATCCTGTTACCGCATGTCATGCGTTATAACGCTGACTTTACCGGTGAGAAGTACCGCGATATCGCGCGCGTTATGGGCGTGAAAGTGGAAGGTATGAGCCTGGAAGAGGCGCGTAATGCCGCTGTTGAAGCGGTGTTTGCTCTCAACCGTGATGTCGGTATTCCGCCACATTTGCGTGATGTTGGTGTACGCAAGGAAGACATTCCGGCACTGGCGCAGGCGGCACTGGATGATGTTTGTACCGGTGGCAACCCGCGTGAAGCAACGCTTGAGGATATTGTAGAGCTTTACCATACCGCCTGGTAA(SEQ ID NO:25)

基因ID 004氨基酸序列：大肠杆菌1,2-丙二醇氧化还原酶(氧化应激抗性)FucO_I6L-L7V

MMANRMLVNETAWFGRGAVGALTDEVKRRGYQKALIVTDKTLVQCGVVAKVTDKMDAAGLAWAIYDGVVPNPTITVVKEGLGVFQNSGADYLIAIGGGSPQDTCKAIGIISNNPEFADVRSLEGLSPTNKPSVPILAIPTTAGTAAEVTINYVITDEEKRRKFVCVDPHDIPQVAFIDADMMDGMPPALKAATGVDALTHAIEGYITRGAWALTDALHIKAIEIIAGALRGSVAGDKDAGEEMALGQYVAGMGFSNVGLGLVHGMAHPLGAFYNTPHGVANAILLPHVMRYNADFTGEKYRDIARVMGVKVEGMSLEEARNAAVEAVFALNRDVGIPPHLRDVGVRKEDIPALAQAALDDVCTGGNPREATLEDIVELYHTAW(SEQ ID NO:26)

基因ID 005核苷酸序列：雷尔氏菌S-6聚羟基链烷酸酯合酶phaC183*ATGGCGACCGGCAAGGGCGCAGCAGCATCGACGCAGGAGGGCAAGAGCCAACCGTTTAAGGTGACTCCGGGTCCGTTTGACCCGGCGACGTGGCTGGAATGGAGCCGCCAATGGCAGGGTACCGAAGGCAATGGCCACGCAGCGGCCAGCGGCATTCCGGGTCTGGATGCCCTGGCTGGCGTGAAGATTGCACCGGCGCAATTGGGCGACATTCAACAGCGCTATATGAAAGACTTCAGCGCCCTGTGGCAAGCGATGGCGGAGGGCAAAGCGGAGGCAACCGGTCCGCTGCACGATCGTCGCTTCGCGGGTGACGCGTGGCGTACGAACCTGCCGTACCGCTTTGCAGCCGCATTTTACCTGTTGAATGCCCGTGCCTTGACCGAACTGGCGGACGCGGTCGAGGCAGATGCGAAAACCCGTCAACGTATTCGTTTCGCGATCAGCCAATGGGTTGACGCAATGAGCCCAGCAAACTTCCTGGCGACGAACCCGGAGGCGCAGCGCCGTCTGATCGAAAGCAACGGCGAGAGCCTGCGTGCTGGTCTGCGCAACATGCTGGAGGACCTGACCCGTGGTAAAATCTCCCAAACCGATGAAAGCGCCTTCGAAGTTGGTCGCAACGTCGCGGTCACCGAGGGTGCTGTGGTTTACGAAAATGAGTATTTTCAGCTGCTGCAGTACAAGCCGTTGACCGCGAAAGTGCACGCGCGTCCGCTGCTGATGGTGCCGCCGTGCATCAATAAGTATTACATCCTGGATCTGCAGCCGGAATCCAGCCTGGTCCGCCATATCGTTGAGCAGGGCCATACGGTTTTCCTGGTGAGCTGGCGTAACCCGGATGCGAGCATGGCAGCGCGTACCTGGGATGACTATATCGAGCATGGCGCCATTCGTGCCATTGAAGTGGCGCGTGCTATCAGCGGTCAGCCGCGCATTAATGTCCTGGGTTTTTGCGTGGGCGGTACCATTGTCTCCACTGCGCTGGCAGTTATGGCCGGTCGTGGCGAACGTCCAGCCCAGAGCCTGACGCTGCTGACCACGCTGTTGGATTTCTCCGATACTGGTGTGTTGGACGTTTTTGTCGACGAAGCACATGTTCAGTTGCGTGAGGCGACCCTGGGCGGTGCTGCAGGTGCGCCGTGTGCGCTGCTGCGTGGTATCGAGTTGGCGAATACCTTTAGCTTCCTGCGCCCGAACGATCTGGTTTGGAATTATGTGGTTGACAATTACCTGAAGGGCAACACCCCGGTGCCATTTGATCTGTTGTTCTGGAACGGTGACGCGACCAACCTGCCGGGTCCGTGGTATTGTTGGTATCTGCGCCATACGTACCTGCAAGACGAGCTGAAGGTTCCGGGTAAGCTGACCGTTTGCGGCGTACCTGTGGACCTGGGTAAAATCGACGTCCCGACGTACCTGTATGGTAGCCGTGAGGATCACATCGTCCCGTGGACCGCGGCTTACGCGTCTACGCGTTTGCTGAGCAACGATCTGCGTTTCGTCCTGGGTGCATCTGGTCACATCGCCGGTGTGATTAATCCACCAGCCAAAAACAAACGCAGCCACTGGACGAATGATGCGCTGCCGGAAAGCCCGCAGCAGTGGCTGGCAGGTGCGATTGAGCACCACGGCTCTTGGTGGCCGGACTGGACCGCATGGCTGGCCGGTCAAGCTGGTGCGAAACGTGCGGCTCCGGCCAATTACGGCAATGCGCGTTACCGCGCTATTGAACCGGCACCTGGTCGTTACGTTAAAGCAAAGGCGTAA(SEQ ID NO:27)

基因ID 005氨基酸序列：雷尔氏菌S-6聚羟基链烷酸酯合酶PhaC183*MATGKGAAASTQEGKSQPFKVTPGPFDPATWLEWSRQWQGTEGNGHAAASGIPGLDALAGVKIAPAQLGDIQQRYMKDFSALWQAMAEGKAEATGPLHDRRFAGDAWRTNLPYRFAAAFYLLNARALTELADAVEADAKTRQRIRFAISQWVDAMSPANFLATNPEAQRRLIESNGESLRAGLRNMLEDLTRGKISQTDESAFEVGRNVAVTEGAVVYENEYFQLLQYKPLTAKVHARPLLMVPPCINKYYILDLQPESSLVRHIVEQGHTVFLVSWRNPDASMAARTWDDYIEHGAIRAIEVARAISGQPRINVLGFCVGGTIVSTALAVMAGRGERPAQSLTLLTTLLDFSDTGVLDVFVDEAHVQLREATLGGAAGAPCALLRGIELANTFSFLRPNDLVWNYVVDNYLKGNTPVPFDLLFWNGDATNLPGPWYCWYLRHTYLQDELKVPGKLTVCGVPVDLGKIDVPTYLYGSREDHIVPWTAAYASTRLLSNDLRFVLGASGHIAGVINPPAKNKRSHWTNDALPESPQQWLAGAIEHHGSWWPDWTAWLAGQAGAKRAAPANYGNARYRAIEPAPGRYVKAKA(SEQ IDNO:28)

基因ID 006核苷酸序列：布氏锥虫延胡索酸还原酶(NADH-依赖性)frd_g*

ATGGTAGACGGCCGCAGCAGCGCATCCATCGTCGCAGTCGACCCGGAGCGTGCCGCACGCGAACGCGATGCGGCTGCGCGTGCCCTGTTGCAGGACAGCCCGCTGCACACGACCATGCAGTATGCGACCTCGGGTCTGGAGCTGACTGTGCCGTATGCACTGAAAGTTGTGGCAAGCGCTGATACCTTTGATCGTGCAAAGGAAGTGGCGGACGAAGTCCTGCGCTGCGCATGGCAATTGGCAGATACCGTTCTGAACAGCTTTAACCCTAACAGCGAGGTGAGCCTGGTCGGTCGCCTGCCGGTTGGTCAAAAACATCAGATGTCCGCACCGCTGAAACGTGTCATGGCGTGTTGCCAGCGCGTGTACAACTCCAGCGCCGGTTGCTTCGACCCGAGCACGGCGCCAGTCGCAAAAGCCTTGCGCGAAATTGCACTGGGTAAGGAGCGCAATAACGCTTGCCTGGAGGCGCTGACCCAGGCTTGTACCCTGCCGAACAGCTTCGTTATCGATTTCGAAGCGGGCACCATCAGCCGCAAACACGAACATGCAAGCCTGGACCTGGGTGGCGTTTCGAAAGGCTATATCGTGGATTATGTGATTGACAACATCAATGCCGCTGGTTTCCAGAATGTTTTCTTCGATTGGGGTGGTGACTGTCGTGCCTCCGGTATGAATGCGCGCAATACGCCGTGGGTCGTCGGTATTACTCGCCCACCGAGCTTGGATATGCTGCCGAACCCGCCAAAGGAAGCGAGCTATATCAGCGTCATCTCCCTGGACAACGAGGCGTTGGCGACCAGCGGTGATTACGAGAACCTGATCTACACCGCAGACGATAAGCCGTTGACCTGCACTTACGATTGGAAAGGTAAAGAGCTGATGAAGCCGAGCCAGAGCAATATCGCTCAAGTTAGCGTGAAATGCTACAGCGCAATGTACGCCGATGCCCTGGCAACGGCGTGCTTTATCAAGCGTGACCCGGCGAAAGTTCGTCAACTGCTGGACGGTTGGCGTTATGTTCGCGACACGGTCCGTGATTACCGTGTGTACGTGCGTGAGAATGAGCGTGTAGCTAAGATGTTCGAGATTGCGACTGAAGATGCGGAGATGCGTAAGCGTCGTATTAGCAATACTCTGCCTGCACGTGTGATCGTGGTTGGTGGCGGTCTGGCGGGTCTGAGCGCTGCGATCGAAGCTGCGGGCTGTGGTGCGCAGGTGGTCCTGATGGAGAAGGAAGCCAAGCTGGGCGGTAACAGCGCGAAAGCTACCAGCGGTATCAACGGCTGGGGCACCCGTGCGCAGGCTAAAGCGAGCATTGTTGATGGCGGCAAGTACTTTGAACGTGACACTTACAAATCGGGTATTGGCGGTAATACTGATCCGGCACTGGTCAAAACCCTGTCCATGAAGAGCGCGGACGCGATTGGTTGGCTGACCAGCCTGGGCGTCCCGCTGACCGTCCTGAGCCAGCTGGGTGGCCATAGCCGCAAGCGCACCCATCGTGCACCGGACAAGAAAGACGGCACGCCTCTGCCAATCGGCTTTACCATCATGAAAACTCTGGAGGATCACGTCCGTGGTAATCTGTCTGGCCGTATCACCATCATGGAGAATTGTAGCGTTACCAGCCTGCTGAGCGAAACCAAGGAACGCCCGGACGGCACGAAGCAGATCCGTGTGACGGGTGTCGAGTTTACCCAAGCGGGCTCTGGCAAGACCACCATCTTGGCGGATGCGGTTATCCTGGCCACGGGTGGTTTCAGCAATGACAAGACGGCTGATAGCCTGCTGCGCGAACACGCACCGCACCTGGTTAACTTTCCGACCACCAACGGCCCGTGGGCGACGGGTGATGGTGTGAAGTTGGCTCAGCGTCTGGGTGCTCAACTGGTCGATATGGATAAAGTTCAGCTGCACCCGACCGGCCTGATTAATCCGAAAGACCCGGCCAATCCGACCAAATTCCTGGGTCCTGAAGCGTTGCGTGGTAGCGGTGGTGTGCTGCTGAATAAACAAGGTAAACGTTTTGTGAATGAGCTGGATCTGCGTAGCGTGGTTAGCAAAGCCATTATGGAGCAAGGTGCCGAGTATCCGGGCAGCGGTGGCAGCATGTTCGCGTATTGTGTTCTGAACGCTGCGGCACAAAAACTGTTCGGCGTTTCTTCGCATGAGTTTTACTGGAAAAAGATGGGCTTGTTCGTGAAGGCCGATACCATGCGCGACCTGGCGGCTCTGATCGGTTGTCCGGTTGAGAGCGTCCAACAAACGCTGGAAGAGTATGAACGTCTGAGCATTAGCCAACGCAGCTGCCCGATCACCCGTAAGTCTGTGTACCCGTGTGTTCTGGGTACGAAAGGCCCGTACTATGTGGCGTTCGTGACCCCGAGCATTCACTATACGATGGGCGGTTGTTTGATCAGCCCGAGCGCGGAGATCCAAATGAAGAACACCAGCTCTCGTGCGCCGCTGTCCCATAGCAACCCGATCCTGGGTCTGTTTGGCGCAGGCGAAGTGACCGGCGGTGTGCACGGTGGTAACCGCCTGGGCGGCAACAGCTTGCTGGAGTGCGTCGTCTTTGGTCGTATTGCAGGTGACCGTGCGAGCACCATTCTGCAACGCAAGTCTAGCGCACTGTCCTTTAAAGTTTGGACCACCGTCGTTCTGCGTGAGGTTCGCGAGGGTGGTGTCTATGGTGCGGGCAGCCGTGTGCTGCGTTTTAACCTGCCAGGCGCGCTGCAACGCTCTGGTCTGTCCCTGGGCCAGTTCATCGCGATTCGTGGTGATTGGGACGGTCAACAGTTGATTGGCTATTACTCCCCGATTACCCTGCCTGACGACCTGGGTATGATTGACATTCTGGCACGCAGCGACAAGGGTACGCTGCGTGAGTGGATTAGCGCGCTGGAACCGGGTGACGCGGTGGAGATGAAAGCGTGTGGTGGCCTGGTGATTGAGCGTCGTCTGAGCGATAAGCACTTCGTGTTTATGGGCCACATCATCAATAAACTGTGCTTGATTGCCGGTGGTACGGGTGTTGCACCGATGCTGCAAATCATCAAAGCGGCATTCATGAAGCCGTTTATCGATACGTTGGAAAGCGTTCATCTGATCTATGCGGCCGAGGATGTTACTGAATTGACCTACCGCGAAGTTTTGGAGGAGCGTCGCCGTGAAAGCCGTGGTAAATTCAAAAAGACGTTCGTGTTGAACCGTCCTCCGCCGCTGTGGACGGATGGTGTCGGCTTTATTGACCGTGGCATTCTGACCAATCATGTTCAGCCGCCGTCCGACAATCTGCTGGTGGCCATTTGTGGTCCGCCTGTGATGCAACGCATTGTTAAAGCGACCCTGAAAACCCTGGGTTACAATATGAATCTGGTTCGTACCGTGGACGAAACGGAACCGAGCGGTAGCTAA(SEQ ID NO:29)

基因ID 006氨基酸序列：布氏锥虫延胡索酸还原酶(NADH-依赖性)Frd_g*

MVDGRSSASIVAVDPERAARERDAAARALLQDSPLHTTMQYATSGLELTVPYALKVVASADTFDRAKEVADEVLRCAWQLADTVLNSFNPNSEVSLVGRLPVGQKHQMSAPLKRVMACCQRVYNSSAGCFDPSTAPVAKALREIALGKERNNACLEALTQACTLPNSFVIDFEAGTISRKHEHASLDLGGVSKGYIVDYVIDNINAAGFQNVFFDWGGDCRASGMNARNTPWVVGITRPPSLDMLPNPPKEASYISVISLDNEALATSGDYENLIYTADDKPLTCTYDWKGKELMKPSQSNIAQVSVKCYSAMYADALATACFIKRDPAKVRQLLDGWRYVRDTVRDYRVYVRENERVAKMFEIATEDAEMRKRRISNTLPARVIVVGGGLAGLSAAIEAAGCGAQVVLMEKEAKLGGNSAKATSGINGWGTRAQAKASIVDGGKYFERDTYKSGIGGNTDPALVKTLSMKSADAIGWLTSLGVPLTVLSQLGGHSRKRTHRAPDKKDGTPLPIGFTIMKTLEDHVRGNLSGRITIMENCSVTSLLSETKERPDGTKQIRVTGVEFTQAGSGKTTILADAVILATGGFSNDKTADSLLREHAPHLVNFPTTNGPWATGDGVKLAQRLGAQLVDMDKVQLHPTGLINPKDPANPTKFLGPEALRGSGGVLLNKQGKRFVNELDLRSVVSKAIMEQGAEYPGSGGSMFAYCVLNAAAQKLFGVSSHEFYWKKMGLFVKADTMRDLAALIGCPVESVQQTLEEYERLSISQRSCPITRKSVYPCVLGTKGPYYVAFVTPSIHYTMGGCLISPSAEIQMKNTSSRAPLSHSNPILGLFGAGEVTGGVHGGNRLGGNSLLECVVFGRIAGDRASTILQRKSSALSFKVWTTVVLREVREGGVYGAGSRVLRFNLPGALQRSGLSLGQFIAIRGDWDGQQLIGYYSPITLPDDLGMIDILARSDKGTLREWISALEPGDAVEMKACGGLVIERRLSDKHFVFMGHIINKLCLIAGGTGVAPMLQIIKAAFMKPFIDTLESVHLIYAAEDVTELTYREVLEERRRESRGKFKKTFVLNRPPPLWTDGVGFIDRGILTNHVQPPSDNLLVAICGPPVMQRIVKATLKTLGYNMNLVRTVDETEPSGS(SEQ ID NO:30)

基因ID 002核苷酸序列：克氏梭菌琥珀酸半醛脱氢酶sucD*

ATGTCCAACGAGGTTAGCATTAAGGAGCTGATTGAGAAGGCGAAAGTGGCGCAGAAAAAGCTGGAAGCGTATAGCCAAGAGCAAGTTGACGTTCTGGTCAAGGCGCTGGGTAAAGTTGTGTACGACAACGCCGAGATGTTCGCGAAAGAGGCGGTGGAGGAAACCGAGATGGGTGTTTACGAGGATAAAGTGGCTAAATGTCATCTGAAATCTGGTGCAATCTGGAATCACATTAAAGATAAGAAAACCGTTGGTATTATCAAGGAAGAACCGGAGCGTGCGCTGGTGTACGTCGCGAAGCCTAAAGGTGTTGTGGCGGCGACGACCCCTATCACCAATCCTGTGGTTACCCCGATGTGTAACGCGATGGCAGCAATTAAAGGTCGCAACACCATCATTGTCGCCCCGCATCCGAAGGCGAAGAAGGTGAGCGCGCACACCGTGGAGCTGATGAATGCAGAACTGAAAAAGTTGGGTGCGCCGGAAAACATTATCCAGATCGTTGAAGCCCCAAGCCGTGAAGCAGCCAAGGAGTTGATGGAGAGCGCAGACGTGGTTATCGCCACGGGTGGCGCAGGCCGTGTTAAAGCAGCGTACTCCTCCGGCCGTCCGGCATACGGTGTCGGTCCGGGCAATTCTCAGGTCATTGTCGATAAGGGTTACGATTATAACAAAGCTGCCCAGGACATCATTACCGGCCGCAAGTATGACAACGGTATCATTTGCAGCTCTGAGCAGAGCGTGATCGCACCGGCGGAGGACTACGACAAGGTCATCGCGGCTTTCGTCGAGAATGGCGCGTTCTATGTCGAGGATGAGGAAACTGTGGAGAAATTCCGTAGCACGCTGTTCAAGGATGGCAAGATCAATAGCAAAATCATCGGTAAATCCGTGCAGATCATCGCTGACCTGGCTGGTGTCAAGGTGCCGGAAGGCACCAAGGTGATCGTGTTGAAGGGCAAGGGTGCCGGTGAAAAGGACGTTCTGTGCAAGGAGAAAATGTGCCCGGTCCTGGTTGCCCTGAAATATGACACCTTTGAGGAGGCGGTCGAGATCGCGATGGCCAACTATATGTACGAGGGTGCGGGCCATACCGCCGGTATCCACAGCGATAACGACGAGAATATCCGCTACGCGGGTACGGTGCTGCCAATCAGCCGTCTGGTTGTCAACCAGCCAGCAACTACGGCCGGTGGTAGCTTTAACAATGGTTTTAATCCGACCACCACCTTGGGCTGCGGTAGCTGGGGCCGTAACTCCATTAGCGAGAACCTGACGTATGAGCATCTGATTAATGTCAGCCGTATTGGCTATTTCAATAAGGAGGCAAAAGTTCCTAGCTACGAGGAGATCTGGGGTTAA(SEQ ID NO.31)

基因ID 002蛋白质序列：克氏梭菌琥珀酸半醛脱氢酶sucD*

MSNEVSIKELIEKAKVAQKKLEAYSQEQVDVLVKALGKVVYDNAEMFAKEAVEETEMGVYEDKVAKCHLKSGAIWNHIKDKKTVGIIKEEPERALVYVAKPKGVVAATTPITNPVVTPMCNAMAAIKGRNTIIVAPHPKAKKVSAHTVELMNAELKKLGAPENIIQIVEAPSREAAKELMESADVVIATGGAGRVKAAYSSGRPAYGVGPGNSQVIVDKGYDYNKAAQDIITGRKYDNGIICSSEQSVIAPAEDYDKVIAAFVENGAFYVEDEETVEKFRSTLFKDGKINSKIIGKSVQIIADLAGVKVPEGTKVIVLKGKGAGEKDVLCKEKMCPVLVALKYDTFEEAVEIAMANYMYEGAGHTAGIHSDNDENIRYAGTVLPISRLVVNQPATTAGGSFNNGFNPTTTLGCGSWGRNSISENLTYEHLINVSRIGYFNKEAKVPSYEEIWG(SEQ ID NO.32)

基因ID 003核苷酸序列：拟南芥琥珀半醛还原酶ssaR_At*

ATGGAAGTAGGTTTTCTGGGTCTGGGCATTATGGGTAAAGCTATGTCCATGAACCTGCTGAAAAACGGTTTCAAAGTTACCGTGTGGAACCGCACTCTGTCTAAATGTGATGAACTGGTTGAACACGGTGCAAGCGTGTGCGAGTCTCCGGCTGAGGTGATCAAGAAATGCAAATACACGATCGCGATGCTGAGCGATCCGTGTGCAGCTCTGTCTGTTGTTTTCGATAAAGGCGGTGTTCTGGAACAGATCTGCGAGGGTAAGGGCTACATCGACATGTCTACCGTCGACGCGGAAACTAGCCTGAAAATTAACGAAGCGATCACGGGCAAAGGTGGCCGTTTTGTAGAAGGTCCTGTTAGCGGTTCCAAAAAGCCGGCAGAAGACGGCCAGCTGATCATCCTGGCAGCAGGCGACAAAGCACTGTTCGAGGAATCCATCCCGGCCTTTGATGTACTGGGCAAACGTTCCTTTTATCTGGGTCAGGTGGGTAACGGTGCGAAAATGAAACTGATTGTTAACATGATCATGGGTTCTATGATGAACGCGTTTAGCGAAGGTCTGGTACTGGCAGATAAAAGCGGTCTGTCTAGCGACACGCTGCTGGATATTCTGGATCTGGGTGCTATGACGAATCCGATGTTCAAAGGCAAAGGTCCGTCCATGACTAAATCCAGCTACCCACCGGCTTTCCCGCTGAAACACCAGCAGAAAGACATGCGTCTGGCTCTGGCTCTGGGCGACGAAAACGCTGTTAGCATGCCGGTCGCTGCGGCTGCGAACGAAGCCTTCAAGAAAGCCCGTAGCCTGGGCCTGGGCGATCTGGACTTTTCTGCTGTTATCGAAGCGGTAAAATTCTCTCGTGAATAA(SEQ ID NO.33)

基因ID 003蛋白质序列：拟南芥琥珀半醛还原酶ssaR_At*

MEVGFLGLGIMGKAMSMNLLKNGFKVTVWNRTLSKCDELVEHGASVCESPAEVIKKCKYTIAMLSDPCAALSVVFDKGGVLEQICEGKGYIDMSTVDAETSLKINEAITGKGGRFVEGPVSGSKKPAEDGQLIILAAGDKALFEESIPAFDVLGKRSFYLGQVGNGAKMKLIVNMIMGSMMNAFSEGLVLADKSGLSSDTLLDILDLGAMTNPMFKGKGPSMTKSSYPPAFPLKHQQKDMRLALALGDENAVSMPVAAAANEAFKKARSLGLGDLDFSAVIEAVKFSRE(SEQ IDNO.34)

基因ID 006核苷酸序列：恶臭假单胞菌/真养雷尔氏菌JMP134聚羟基链烷酸酯合酶融合蛋白phaC3/C1

ATGACTAGAAGGAGGTTTCATATGAGTAACAAGAACAACGATGAGCTGGCGACGGGTAAAGGTGCTGCTGCATCTTCTACTGAAGGTAAATCTCAGCCGTTTAAATTCCCACCGGGTCCGCTGGACCCGGCCACTTGGCTGGAATGGAGCCGTCAGTGGCAAGGTCCGGAGGGCAATGGCGGTACCGTGCCGGGTGGCTTTCCGGGTTTCGAAGCGTTCGCGGCGTCCCCGCTGGCGGGCGTGAAAATCGACCCGGCTCAGCTGGCAGAGATCCAGCAGCGTTATATGCGTGATTTCACCGAGCTGTGGCGTGGTCTGGCAGGCGGTGACACCGAGAGCGCTGGCAAACTGCATGACCGTCGCTTCGCGTCCGAAGCGTGGCACAAAAACGCGCCGTATCGCTATACTGCGGCATTTTACCTGCTGAACGCACGTGCACTGACGGAACTGGCTGATGCAGTAGAAGCGGATCCGAAAACCCGTCAGCGTATCCGTTTTGCGGTTTCCCAGTGGGTAGATGCTATGAGCCCGGCTAACTTCCTGGCCACCAACCCGGACGCTCAGAACCGTCTGATCGAGAGCCGTGGTGAAAGCCTGCGTGCCGGCATGCGCAATATGCTGGAAGATCTGACCCGCGGTAAAATTTCCCAAACCGATGAGACTGCCTTCGAAGTAGGCCGTAACATGGCAGTTACCGAAGGTGCTGTGGTATTCGAAAACGAGTTCTTCCAGCTGCTGCAGTACAAACCTCTGACTGACAAAGTATACACCCGTCCGCTGCTGCTGGTACCGCCGTGCATTAACAAGTTCTATATTCTGGACCTGCAGCCGGAAGGTTCTCTGGTCCGTTACGCAGTCGAACAGGGTCACACTGTATTCCTGGTGAGCTGGCGCAATCCAGACGCTAGCATGGCTGGCTGTACCTGGGATGACTATATTGAAAACGCGGCTATCCGCGCCATCGAGGTTGTGCGTGATATCAGCGGTCAGGACAAGATCAACACCCTGGGCTTTTGTGTTGGTGGCACGATCATCTCCACTGCCCTGGCGGTCCTGGCCGCCCGTGGTGAGCACCCGGTGGCCTCTCTGACCCTGCTGACTACCCTGCTGGACTTCACCGATACTGGTATCCTGGATGTTTTCGTGGACGAGCCACACGTTCAGCTGCGTGAGGCGACTCTGGGCGGCGCCAGCGGCGGTCTGCTGCGTGGTGTCGAGCTGGCCAATACCTTTTCCTTCCTGCGCCCGAACGACCTGGTTTGGAACTACGTTGTTGACAACTATCTGAAAGGCAACACCCCGGTACCTTTCGATCTGCTGTTCTGGAACGGTGATGCAACCAACCTGCCTGGTCCATGGTACTGTTGGTACCTGCGTCATACTTACCTGCAGAACGAACTGAAAGAGCCGGGCAAACTGACCGTGTGTAACGAACCTGTGGACCTGGGCGCGATTAACGTTCCTACTTACATCTACGGTTCCCGTGAAGATCACATCGTACCGTGGACCGCGGCTTACGCCAGCACCGCGCTGCTGAAGAACGATCTGCGTTTCGTACTGGGCGCATCCGGCCATATCGCAGGTGTGATCAACCCTCCTGCAAAGAAAAAGCGTTCTCATTGGACCAACGACGCGCTGCCAGAATCCGCGCAGGATTGGCTGGCAGGTGCTGAGGAACACCATGGTTCCTGGTGGCCGGATTGGATGACCTGGCTGGGTAAACAAGCCGGTGCAAAACGTGCAGCTCCAACTGAATATGGTAGCAAGCGTTATGCTGCAATCGAGCCAGCGCCAGGCCGTTACGTTAAAGCGAAAGCATAA(SEQ IDNO.35)

基因ID 006蛋白质序列：恶臭假单胞菌/真养雷尔氏菌JMP134聚羟基链烷酸酯合酶融合蛋白phaC3/C1

MSNKNNDELATGKGAAASSTEGKSQPFKFPPGPLDPATWLEWSRQWQGPEGNGGTVPGGFPGFEAFAASPLAGVKIDPAQLAEIQQRYMRDFTELWRGLAGGDTESAGKLHDRRFASEAWHKNAPYRYTAAFYLLNARALTELADAVEADPKTRQRIRFAVSQWVDAMSPANFLATNPDAQNRLIESRGESLRAGMRNMLEDLTRGKISQTDETAFEVGRNMAVTEGAVVFENEFFQLLQYKPLTDKVYTRPLLLVPPCINKFYILDLQPEGSLVRYAVEQGHTVFLVSWRNPDASMAGCTWDDYIENAAIRAIEVVRDISGQDKINTLGFCVGGTIISTALAVLAARGEHPVASLTLLTTLLDFTDTGILDVFVDEPHVQLREATLGGASGGLLRGVELANTFSFLRPNDLVWNYVVDNYLKGNTPVPFDLLFWNGDATNLPGPWYCWYLRHTYLQNELKEPGKLTVCNEPVDLGAINVPTYIYGSREDHIVPWTAAYASTALLKNDLRFVLGASGHIAGVINPPAKKKRSHWTNDALPESAQDWLAGAEEHHGSWWPDWMTWLGKQAGAKRAAPTEYGSKRYAAIEPAPGRYVKAKA(SEQ ID NO.36)

本发明公开的内容不限于本申请描述的具体实施方式。如对于本领域技术人员所显而易见的，在不背离其精神和范围情况下，可以对本发明做出多种修饰和变化。除了本文所列举的那些，本文公开范围内的功能等价的方法和组合物对于本领域技术人员来说从上述描述的内容是显而易见的。这样的修饰和变化意味着落入所附的权利要求的范围内。本发明公开的内容仅由所附的权利要求以及这些权利要求所赋予的等价物的全范围所限定。应当理解，该公开内容不限于具体方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，其当然可以变化。同样应当理解，本文使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，不意味着限制。

此外，当以马库什组的方式描述公开内容的特征或方面时，本领域技术人员将理解，该公开内容同样从而以所述马库什的任何单个成员或成员亚组的形式来描述。

在本说明书中引用的所有公开出版物、专利申请、授权专利和其它文件通过引用的方式合并至本文，就像是每一份单独的出版物、专利申请、授权专利和其它文件被特别地和个别地指明通过引用的方式全文结合至本文。通过引用的方式合并的文本中所包含的定义在与本文中的定义相矛盾时被排除。

本文所引用的所有专利、公开的申请和参考文献的教导通过引用的方式全文结合至本文。

尽管本发明已经参照示例实施方式显示和描述，本领域技术人员将理解，在不背离所附的权利要求所包括的本发明范围的情况下，可以做出形式上和细节上的多种改变。

Claims (32)

1.一种增加自可再生原料产生4-碳(C4)产物或4-碳单体的聚合物的产量的方法，包括：

a)提供具有修饰的C4代谢途径的遗传修饰生物体，以及

b)提供一种或多种稳定表达的基因，所述基因编码具有以下活性的一种或多种酶：i)催化α-酮戊二酸脱羧成为琥珀半醛；ii)催化丙二酰辅酶A转化成丙二酸半醛；iii)催化L-乳醛转化成L-1，2-丙二醇并具有增加的氧化应激抗性；iv)催化延胡索酸为琥珀酸；v)催化丙酮酸的羧化；或vi)催化NADH成为NADPH；其中，与野生型或步骤a)的遗传修饰生物体相比，所述产物或聚合物的产量提高，和/或来自可再生原料的4-碳(C4)产物或4-碳单体的聚合物的碳流量得以增加。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述4-碳产物选自：γ-丁内酯、1,4-丁二醇、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮、N-乙基吡咯烷酮、2-吡咯烷酮、N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、琥珀酸、1,4-丁二酰胺、琥珀腈、琥珀酰胺和2-吡咯烷酮(2-Py)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述具有修饰的C4代谢途径的生物体具有修饰的聚-4-羟基丁酸酯途径且聚-4-羟基丁酸酯的产量增加。

4.根据前述权利要求任何一项所述的方法，其中，所述稳定表达的一种或多种基因编码一种或多种酶，所述一种或多种酶选自：α-酮戊二酸脱羧酶、2-酮戊二酸脱羧酶、丙二酰辅酶A还原酶、NADH-依赖性延胡索酸还原酶、氧化应激抗性1,2-丙二醇氧化还原酶、丙酮酸羧化酶和NADH激酶。

5.一种增加4-羟基丁酸或聚-4-羟基丁酸酯的产量的方法，包括：

a)提供具有修饰的4-羟基丁酸代谢途径的遗传修饰生物体，以及

b)提供稳定表达的一种或多种基因，所述一种或多种基因编码选自以下的一种或多种酶：α-酮戊二酸脱羧酶或2-酮戊二酸脱羧酶、具有将琥珀酰辅酶A转化成琥珀半醛的活性的丙二酰辅酶A还原酶、具有将SSA转化成4-羟基丁酸的活性的氧化应激抗性1,2-丙二醇氧化还原酶、具有将延胡索酸转化成琥珀酸的活性的NADH-依赖性延胡索酸还原酶、具有转化丙酮酸以形成草酰乙酸的活性的丙酮酸羧化酶以及其中增加细胞内NADPH浓度的NADH激酶，其中所述表达增加了4-羟基丁酸或聚4-羟基丁酸酯的产量。

6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中，所述一种或多种酶选自：来自Pseudonocardia dioxanivorans的α-酮戊二酸脱羧酶或其突变体和同源物、来自聚球藻sp.PCC 7002的2-酮戊二酸脱羧酶或其突变体和同源物、来自勤奋金属球菌的丙二酰辅酶A还原酶或其突变体和同源物、来自Sulfolous tokodaii的丙二酰辅酶A还原酶或其突变体和同源物、来自大肠杆菌的氧化应激抗性-1,2-丙二醇氧化还原酶、其突变体和同源物、来自布氏锥虫的NADH-依赖性延胡索酸还原酶、其突变体和同源物、来自乳酸乳球菌的丙酮酸羧化酶、其突变体和同源物以及来自构巢曲霉的NADH激酶、其突变体和同源物。

7.一种增加自可再生原料产生4-碳(C4)产物或4-碳单体的聚合物的产量的方法，包括：

提供具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性的遗传修饰生物体，使得与没有该降低活性的野生型生物体相比，所述遗传修饰生物的生长受损；以及

提供一种或多种稳定表达的基因，所述基因编码具有催化α-酮戊二酸脱羧成琥珀半醛的活性的一种或多种酶；其中生长被改善，且来自可再生原料的4-碳(C4)产物或4-碳单体的聚合物的碳流量增加。

8.一种在具有聚-4-羟基丁酸酯途径的遗传修饰生物体(重组宿主)中产生更多的聚-4-羟基丁酸酯的方法，包括由所述宿主生物体稳定表达编码α-酮戊二酸脱羧酶或2-酮戊二酸脱羧酶的基因，其中，所述α-酮戊二酸脱羧酶或2-酮戊二酸脱羧酶催化α-酮戊二酸至琥珀半醛的脱羧反应，并增加所述生物体中聚4-羟基丁酸酯的量。

9.根据前述权利要求任意一项所述的方法，其中，所述酶是来自Pseudonocardia dioxanivorans的α-酮戊二酸脱羧酶或其突变体或同源物，或者所述2-酮戊二酸脱羧酶来自聚球藻sp.PCC 7002或其突变体和同源物。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述来自P.dioxanivoransα-酮戊二酸脱羧酶包括第887位氨基酸由丙氨酸到苏氨酸的突变。

11.根据权利要求1-10任意一项所述的方法，其中，所述生物体进一步具有稳定整合的编码将琥珀酰辅酶A转化为琥珀半醛的琥珀酸半醛脱氢酶的基因。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述琥珀酸半醛脱氢酶来自克氏梭菌或其同源物。

13.根据权利要求3-12任意一项所述的方法，其中，所述具有聚-4-羟基丁酸酯途径的遗传修饰生物体在它的非辅酶A依赖性的NAD依赖性琥珀半醛脱氢酶基因或它的非辅酶A依赖性的NADP依赖性琥珀半醛脱氢酶基因中具有抑制突变，或者在两个基因中具有抑制突变，并具有稳定整合的编码选自以下的一种或多种酶的一种或多种基因：琥珀酸半醛脱氢酶，其中所述琥珀酸半醛脱氢酶将琥珀酰辅酶A转化成琥珀半醛；琥珀半醛还原酶，其中所述琥珀半醛还原酶将琥珀半醛转化成4-羟基丁酸；辅酶A转移酶，其中所述辅酶A转移酶将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰辅酶A；和聚羟基链烷酸酯合酶，其中所述聚羟基链烷酸酯合酶将4-羟丁酰辅酶A聚合成聚-4-羟基丁酸酯。

14.根据权利要求1-13任意一项所述的方法，其中，所述生物体中具有选自yneI、gabD、pykF、pykA、astD和SucCD的一种或多种基因的破坏或所述基因产物的活性降低。

15.根据权利要求1-14任意一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括用可再生原料培养遗传工程生物体以产生生物质。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述可再生原料的来源选自葡萄糖、左旋葡聚糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖、麦芽糖、乳糖、木糖、脂肪酸、植物油和生物质衍生的合成气或它们的组合。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中，所述培养包括向发酵培养基中加入泛酸盐，其中发生生长或产量的增加。

18.根据权利要求1-16任意一项所述的方法，其中，所述生物体是细菌、酵母、真菌、藻类、蓝细菌或其中任何两种或更多种的混合物。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述生物体是细菌。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述细菌选自：大肠杆菌、真养雷尔氏菌、生枝动胶菌、酒色异着色菌、赤红球菌、食酸代尔夫特菌、豚鼠气单胞菌、集胞藻sp.PCC 6803、细长聚球藻PCC 7942、普氏荚硫菌、巨大芽孢杆菌、鲍氏不动杆菌、贝氏不动杆菌、克氏梭菌、扭脱甲基杆菌、Nocardia corralina、橙红诺卡菌、荧光假单胞菌、食油假单胞菌、单胞菌sp.6-19、单胞菌sp.61-3和恶臭假单胞菌、球形红杆菌、广泛产碱菌、催产克雷白杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌、产琥珀酸放线杆菌、Mannheimiasucciniciproducens、菜豆根瘤菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、氧化葡萄糖杆菌、运动发酵单胞菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、天蓝色链霉菌、丙酮丁醇梭菌、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、土曲霉、黑曲霉和巴氏毕赤酵母。

21.根据权利要求18所述的方法，其中，所述重组宿主是藻类。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述藻类选自小球藻株，选自以下的种：微小小球藻、浮水小球藻、富油小球藻、椭圆形小球藻、小球藻属和原始小球藻。

23.一种根据权利要求1-22任意一项所述的方法生产的生物基生物质。

24.根据权利要求1-23任意一项所述的方法，其中，所述遗传工程生物体生产生物质，且所述生物质被转化为4-碳化学产物。

25.一种具有修饰的聚-4-羟基丁酸酯途径的遗传修饰生物体，其中通过并入稳定表达的一种或多种基因增加聚-4-羟基丁酸酯的产量，所述一种或多种基因编码选自以下的一种或多种酶：α-酮戊二酸脱羧酶、2-酮戊二酸脱羧酶、丙二酰辅酶A还原酶、NADH-依赖性延胡索酸还原酶、氧化应激抗性-1,2-丙二醇氧化还原酶、丙酮酸羧化酶和NADH激酶。

26.根据权利要求25所述的生物体，其中，所述一种或多种酶选自：来自Pseudonocardia dioxanivorans的α-酮戊二酸脱羧酶或其突变体和同源物，来自聚球藻sp.PCC 7002的2-酮戊二酸脱羧酶或其突变体和同源物，来自勤奋金属球菌的丙二酰辅酶A还原酶或其突变体和同源物，来自Sulfoloustokodaii的丙二酰辅酶A还原酶或其突变体和同源物，来自大肠杆菌的氧化应激抗性1,2-丙二醇氧化还原酶、其突变体以及同源物，来自布氏锥虫的NADH依赖性延胡索酸还原酶、其突变体以及同源物，来自乳酸乳球菌的丙酮酸羧化酶、其突变体和同源物，以及来自构巢曲霉的NADH激酶、其突变体和同源物。

27.根据权利要求25或26所述的生物体，其中，所述生物体进一步具有稳定并入的编码将琥珀酰辅酶A转化成琥珀半醛的琥珀酸半醛脱氢酶的基因。

28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述琥珀酸半醛脱氢酶来自克氏梭菌或其同源物。

29.根据权利要求25-28任意一项所述的生物体，其中，具有聚-4-羟基丁酸酯途径的遗传工程生物体在其非辅酶A依赖性的NAD依赖性琥珀半醛脱氢酶基因或其非辅酶A依赖性的NADP依赖性琥珀半醛脱氢酶基因中具有抑制突变，或者在两个基因中具有抑制突变，并具有稳定并入的编码一种或多种酶的一种或多种基因，所述一种或多种酶选自：琥珀酸半醛脱氢酶，其中所述琥珀酸半醛脱氢酶将琥珀酰辅酶A转化成琥珀半醛；琥珀半醛还原酶，其中所述琥珀半醛还原酶将琥珀半醛转化成4-羟基丁酸；辅酶A转移酶，其中所述辅酶A转移酶将4-羟基丁酸转化成4-羟丁酰辅酶A；和聚羟基链烷酸酯合酶，其中所述聚羟基链烷酸酯合酶将4-羟丁酰辅酶A聚合成聚-4-羟基丁酸酯。

30.根据权利要求25-29任意一项所述的生物，其中，所述生物体中选自yneI、gabD、pykF、pykA、astD和sucCD的一种或多种基因被破坏或所述基因产物的活性降低。

31.一种具有修饰的聚-4-羟基丁酸酯途径的遗传修饰生物体，其中通过并入稳定表达的编码选自α-酮戊二酸脱羧酶、2-酮戊二酸脱羧酶、丙二酰辅酶A还原酶、NADH-依赖性延胡索酸还原酶、氧化应激抗性-1,2-丙二醇氧化还原酶、丙酮酸羧化酶和NADH激酶的一种或多种酶的一种或多种基因和减少sucCD的表达增加聚-4-羟基丁酸酯的产量，其中，所述sucCD基因产物减少，其中所述聚-4-羟基丁酸酯的产量增加。

32.根据权利要求21所述的生物体，其中，所述生物体中选自yneI、gabD、pykF、pykA和astD的一种或多种基因被破坏。