CN117693588A

CN117693588A - 用于改进乙二醇的生物产生的微生物和方法

Info

Publication number: CN117693588A
Application number: CN202280051773.5A
Authority: CN
Inventors: Z·R·考登; 冷静; M·科普克; R·O·延森; A·P·米勒
Original assignee: Lanzatech Inc
Current assignee: Lanzatech Inc
Priority date: 2021-08-06
Filing date: 2022-08-05
Publication date: 2024-03-12

Abstract

本公开提供了用于改进乙二醇和乙二醇前体的生物产生的经基因工程化的微生物和方法。本公开的所述微生物通过5,10‑亚甲基四氢叶酸盐、草酰乙酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐和甘氨酸中的一种或多种产生乙二醇或乙二醇前体。本公开进一步提供了包括乙二醇或如聚对苯二甲酸乙二酯等乙二醇聚合物的组合物。

Description

用于改进乙二醇的生物产生的微生物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年8月6日提交的美国临时专利申请第63/260,054号和于2021年9月14日提交的第63/261,185号的权益，所述美国临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。

对序列表的参考

本申请含有已经以ASCII格式电子提交并且特此通过引用以其整体并入的序列表。创建于2021年8月9日的所述ASCII副本命名为LT199US1-Sequences.txt并且大小为215,003字节。

技术领域

本公开涉及经基因工程化的微生物和用于通过微生物发酵，特别是通过气态底物的微生物发酵产生乙二醇和乙二醇前体的方法。

背景技术

乙二醇，也称为单乙二醇(MEG)，其目前的市场价值超过330亿美元，并且是各种工业、医疗和消费产品的重要组成部分。乙二醇目前是使用需要大量的能量和水、产生许多不希望的副产物并且依赖于石化原料的化学催化工艺产生的。对可持续材料的需求带来了一些技术进步，如从源自甘蔗的乙醇催化产生乙二醇。

乙二醇前体也具有商业价值。例如，乙醇酸盐用于皮肤护理、个人护理、染色、鞣制和作为清洁剂。乙醛酸盐是香草醛、农药、抗生素、尿囊素和络合剂的中间体。

然而，没有已知的微生物能够生物地产生乙二醇，并且还没有建立完全生物的乙二醇产生途径。文献中已经描述了从糖到乙二醇的一些生物途径。例如，Alkim等人,《微生物细胞工厂(Microb Cell Fact)》14:127,2015证明了在大肠杆菌中从(D)-木糖产生乙二醇，但指出需要有氧条件才能获得高产量。类似地，Pereira等人,《代谢工程(Metab Eng)》,34:80-87,2016实现了在大肠杆菌中从戊糖产生乙二醇。在酿酒酵母中也进行了一些关于戊糖产生乙二醇的研究，但结果不一致。参见，例如Uranukul等人,《代谢工程》,51:20-31,2018。

气体发酵提供了一条将各种容易获得的低成本C1原料(例如工业废气、合成气或重整甲烷)转化为化学品和燃料的途径。由于气体发酵代谢与糖发酵代谢显著不同，使用上述途径是不实际的，因为这些途径需要通过糖异生从气体中产生糖前体(一种能量负过程)。迄今为止，还没有从气态底物产生乙二醇的途径。

在探索性实践中，Islam等人,《代谢工程》,41:173-181,2017预测了数百种用于使用化学信息学工具由热醋穆尔氏菌(M.thermoacetica)中的合成气产生乙二醇的假设通路。然而，即使本领域的技术人员也不可能将这些通路结合到气体发酵生物中，因为许多通路由于热力学或其它限制因素而不可行。例如，Islam等人包含了近2,000个氧或氧自由基依赖反应，这在严格的厌氧系统中是不可行。Islam等人唯一确定的具有已知反应的假设通路需要糖异生或乙醇作为中间体。因此，仍然需要能够从气态底物产生高产量的乙二醇和乙二醇前体的经过验证的、能量上有利的重组产生系统。

发明内容

正是在以上背景下，本公开提供了相对于现有技术的某些优点和进步。

尽管本文公开的本公开不限于特定优点或功能，但是本公开提供了能够由气态底物产生乙二醇或乙二醇前体的经基因工程化的微生物。

在本文公开的微生物的一些方面，所述微生物通过包括在编码二醇脱水酶的基因中的破坏性突变的一种或多种中间体产生乙二醇或所述乙二醇前体。

在本文公开的微生物的一些方面，所述微生物通过一种或多种中间体产生乙二醇或所述乙二醇前体，所述一种或多种中间体选自由以下组成的组：5,10-亚甲基四氢叶酸盐、草酰乙酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐和甘氨酸。

在本文公开的微生物的一些方面，所述微生物包括以下一种或多种：能够将草酰乙酸盐转化为柠檬酸盐的异源酶、能够将甘氨酸转化为乙醛酸盐的异源酶、能够将异柠檬酸盐转化为乙醛酸盐的异源酶和能够将乙醇酸盐转化为乙醇醛的异源酶。

在本文公开的微生物的一些方面，所述能够将草酰乙酸盐转化为柠檬酸盐的异源酶为柠檬酸[Si]-合酶[2.3.3.1]、ATP柠檬酸合酶[2.3.3.8]；或柠檬酸(Re)-合酶[2.3.3.3]；所述能够将甘氨酸转化为乙醛酸盐的异源酶为丙氨酸-乙醛酸转氨酶[2.6.1.44]、丝氨酸-乙醛酸转氨酶[2.6.1.45]、丝氨酸-丙酮酸转氨酶[2.6.1.51]、甘氨酸-草酰乙酸转氨酶[2.6.1.35]、甘氨酸转氨酶[2.6.1.4]、甘氨酸脱氢酶[1.4.1.10]、丙氨酸脱氢酶[1.4.1.1]或甘氨酸脱氢酶[1.4.2.1]；所述能够将异柠檬酸盐转化为乙醛酸盐的异源酶为异柠檬酸裂解酶[4.1.3.1]；和/或所述能够将乙醇酸盐转化为乙醇醛的异源酶为乙醇醛脱氢酶[1.2.1.21]、乳醛脱氢酶[1.2.1.22]、琥珀酸-半醛脱氢酶[1.2.1.24]、2,5-二氧戊酸脱氢酶[1.2.1.26]、醛脱氢酶[1.2.1.3/4/5]、甜菜碱-醛脱氢酶[1.2.1.8]或醛铁氧还蛋白氧化还原酶[1.2.7.5]。

在本文公开的微生物的一些方面，所述异源酶衍生自选自由以下组成的组的属：芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、埃希氏菌属(Escherichia)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、赖氨酸芽胞杆菌属(Lysinibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、栖沉积物菌属(Sedimenticola)、芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)、链霉菌属(Streptomyces)、热硫杆状菌属(Thermithiobacillus)、热袍菌属(Thermotoga)和玉蜀黍属(Zea)。

在本文公开的微生物的一些方面，所述异源酶中的一种或多种异源酶被密码子优化以在所述微生物中表达。

在本文公开的微生物的一些方面，所述微生物进一步包括以下中的一种或多种：能够将乙酰辅酶A转化为丙酮酸盐的酶；能够将丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐的酶；能够将丙酮酸盐转化为苹果酸盐的酶；能够将丙酮酸盐转化为磷酸烯醇丙酮酸盐的酶；能够将草酰乙酸盐转化为柠檬酰辅酶A的酶；能够将柠檬酰辅酶A转化为柠檬酸盐的酶；能够将柠檬酸盐转化为乌头酸盐并将乌头酸盐转化为异柠檬酸盐的酶；能够将磷酸烯醇丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐的酶；能够将磷酸烯醇丙酮酸盐转化为2-磷酸-D-甘油酸盐的酶；能够将2-磷酸-D-甘油酸盐转化为3-磷酸-D-甘油酸盐的酶；能够将3-磷酸-D-甘油酸盐转化为3-膦酰氧基丙酮酸盐的酶；能够将3-膦酰氧基丙酮酸盐转化为3-磷酸-L-丝氨酸的酶；能够将3-磷酸-L-丝氨酸转化为丝氨酸的酶；能够将丝氨酸转化为甘氨酸的酶；能够将5,10-亚甲基四氢叶酸盐转化为甘氨酸的酶；能够将丝氨酸转化为羟基丙酮酸盐的酶；能够将D-甘油酸盐转化为羟基丙酮酸盐的酶；能够将苹果酸盐转化为乙醛酸盐的酶；能够将乙醛酸盐转化为乙醇酸盐的酶；能够将羟基丙酮酸盐转化为乙醇醛的酶；和/或能够将乙醇醛转化为乙二醇的酶。

在本文公开的微生物的一些方面，所述微生物过表达所述能够将草酰乙酸盐转化为柠檬酸盐的异源酶、所述能够将甘氨酸转化为乙醛酸盐的异源酶和/或所述能够将乙醇酸盐转化为乙醇醛的异源酶。

在本文公开的微生物的一些方面，所述微生物过表达所述能够将丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐的酶、所述能够将柠檬酸盐转化为乌头酸盐并将乌头酸盐转化为异柠檬酸盐的酶、所述能够将磷酸烯醇丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐的酶、所述能够将丝氨酸转化为甘氨酸的酶、所述能够将5,10-亚甲基四氢叶酸盐转化为甘氨酸的酶、所述能够将乙醛酸盐转化为乙醇酸盐的酶；和/或所述能够将乙醇醛转化为乙二醇的酶。

在本文公开的微生物的一些方面，所述微生物包括一种或多种选自由以下组成的组的酶中的破坏性突变：异柠檬酸脱氢酶、甘油酸脱氢酶、乙醇酸脱氢酶、甘油酸脱氢酶、乙醇酸脱氢酶、醛铁氧还蛋白氧化还原酶和醛脱氢酶。

在本文公开的微生物的一些方面，所述微生物是选自由以下组成的组的属的成员：醋杆菌属(Acetobacterium)、嗜碱菌属(Alkalibaculum)、布劳特氏菌属(Blautia)、丁酸杆菌属(Butyribacterium)、梭菌属(Clostridium)、贪铜菌属(Cupriavidus)、真杆菌属(Eubacterium)、穆尔氏菌属(Moorella)、产醋杆菌属(Oxobacter)、鼠孢菌属(Sporomusa)和热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)。

在本文公开的微生物的一些方面，所述微生物衍生自亲本微生物，所述亲本微生物选自由以下组成的组：伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculum bacchii)、生产布劳特氏菌(Blautia producta)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、克氏梭菌(Clostridium coskatii)、德氏梭菌(Clostridium drakei)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii)、马氏梭菌(Clostridium magnum)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、粪味梭菌(Clostridiumscatologenes)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermautotrophica)、热醋穆尔氏菌(Moorellathermoacetica)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)、森林土壤醋酸鼠孢菌(Sporomusa silvacetica)、球形鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)和凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。

在本文公开的微生物的一些方面，所述微生物衍生自选自由以下组成的组的亲本细菌：产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌。

在本文公开的微生物的一些方面，所述微生物包括天然或异源伍德-永达尔通路(Wood-Ljungdahl pathway)。

在本文公开的微生物的某些方面，所述微生物产生乙醛酸盐或乙醇酸盐作为乙二醇前体。

本公开进一步提供了一种产生乙二醇或乙二醇前体的方法，所述方法包括在营养培养基中和在存在底物的情况下培养本文公开的微生物，由此所述微生物产生乙二醇或乙二醇前体。

在本文公开的方法的一些方面，所述底物包括CO、CO₂和H₂中的一种或多种。

在本文公开的方法的一些方面，所述底物的至少一部分为工业废气、工业尾气或合成气。

在本文公开的方法的一些方面，所述微生物产生乙醛酸盐或乙醇酸盐作为乙二醇前体。

在本文公开的方法的一些方面，所述方法进一步包括从所述营养培养基中分离所述乙二醇或所述乙二醇前体。

在本文公开的方法的一些方面，所述微生物进一步产生乙醇、2,3-丁二醇和琥珀酸盐中的一种或多种。

本公开进一步提供了一种包括通过本文所述方法产生的乙二醇的组合物。在一些方面，所述组合物是防冻剂、防腐剂、脱水剂或钻井液。

本公开进一步提供了一种包括通过本文所述方法产生的乙二醇的聚合物。在一些方面，所述聚合物是均聚物或共聚物。在一些方面，所述聚合物是聚乙二醇(PEG)或聚对苯二甲酸乙二酯(PET)。

本公开进一步提供了一种由气态底物产生聚对苯二甲酸乙二酯(PET)产物的方法，所述方法包括1)形成至少一种PET组分，其中所述至少一种PET组分选自单乙二醇、对苯二甲酸(PTA)或其任何组合；2)将所述至少一种PET组分处理为PET；3)聚合所述PET以形成PET树脂；4)将所述PET树脂处理为PET产物。本公开规定所述PTA可以衍生自化石来源，或者直接或间接来源于气体发酵。PET产物的实例可以是在US2020/0048665A1中公开的那些，所述文献在此通过引用以其整体并入。

本公开提供了一种用于由气态底物产生PET聚合物的方法，所述方法包括：1)提供至少一种二酸化合物，所述至少一种二酸化合物包括对苯二甲酸酯化合物；2)提供至少一种二醇化合物，所述至少一种二醇化合物包括单乙二醇；3)共聚所述二酸化合物和所述二醇化合物的混合物以获得包括二酸组分和二醇组分的PET聚合物。

本公开进一步提供了一种包括本文所述的聚合物的组合物。在一些方面，所述组合物是纤维、树脂、薄膜或塑料。

从下面结合所附权利要求书的详细描述中，将更全面地理解本公开的这些和其它特征和优点。注意，权利要求的范围由其中的叙述来限定，而不是由本说明书中阐述的特征和优点的具体讨论来限定。

附图说明

当结合以下附图阅读时，可以最好地理解以下对本公开的实施例的详细描述，其中相似的结构用相似的附图标记指示，并且其中：

图1是示出用于由包括CO、CO₂和/或H₂的气态底物产生乙二醇、乙醇酸盐和乙醛酸盐的通路的示意图。

图2A-2E是实例1-4中使用的质粒的图谱。图2A是实例1中所述的表达穿梭载体pIPL12的图谱。图2B是质粒pMEG042的图谱，如实例1所述，所述质粒pMEG042包括枯草芽孢杆菌柠檬酸合酶、大肠杆菌异柠檬酸裂解酶和氧化葡萄糖酸杆菌乙醇醛脱氢酶。图2C是质粒pMEG058的图谱，如实例2中所述，所述质粒pMEG058包括硫牛磺酸栖沉积物菌丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶(S.thiotaurini alanine-glyoxylate aminotransferase)和荧光假单胞菌醛脱氢酶(P.fluorescens aldehyde dehydrogenase)。图2D是质粒pMEG059的图谱，如实例3所述，所述质粒pMEG059包括硫牛磺酸栖沉积物菌丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶和氧化葡萄糖酸杆菌醛脱氢酶。图2E是质粒pMEG061的图谱，如实例4中所述，所述质粒pMEG061包括尿酸梭菌V类氨基转移酶和荧光假单胞菌醛脱氢酶。

图3A示出了表达pMEG042的产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)(克隆1-3)或产乙醇梭菌野生型(阴性对照1或阴性对照2)的生物质水平(g干细胞重量/L)。图3B示出了相比于野生型(阴性对照1或阴性对照2)在自养生长并携带表达载体pMEG042的产乙醇梭菌中随时间推移产生的乙二醇。图3C示出了在自养生长并携带表达载体pMEG042的产乙醇梭菌中随时间推移产生的乙醇酸盐。参见实例1。

图4A示出了表达pMEG058的产乙醇梭菌(克隆1-2)或产乙醇梭菌野生型(阴性对照1)的生物质水平(g干细胞重量/L)。图4B示出了相比于野生型(阴性对照1)在自养生长并携带表达载体pMEG058的产乙醇梭菌中随时间推移产生的乙二醇。参见实例2。

图5A示出了表达pMEG059的产乙醇梭菌(克隆1-3)或产乙醇梭菌野生型(阴性对照)的生物质水平(g干细胞重量/L)。图5B示出了相比于野生型(阴性对照)在自养生长并携带表达载体pMEG059的产乙醇梭菌中随时间推移产生的乙二醇。参见实例3。

图6A示出了表达pMEG061的产乙醇梭菌(克隆1)或产乙醇梭菌野生型(阴性对照1)的生物质水平(g干细胞重量/L)。图6B示出了相比于野生型(阴性对照1)在自养生长并携带表达载体pMEG061的产乙醇梭菌中随时间推移产生的乙二醇。参见实例4。

图7示出了产乙醇梭菌的两种不同基因型的生物质水平(g干细胞重量/L)：一种基因型含有所标识的天然二醇脱水酶(基础)，并且一种基因型的二醇脱水酶基因缺失(KO)。每种菌株具有两种变体，一种变体携带pMEG042表达载体，并且一种变体不携带载体(阴性对照)。示出的值是根据3次技术重复的平均值计算的。误差条示出了标准偏差。

图8A示出了在产乙醇梭菌的两种不同基因型中随时间推移产生的MEG(mg/L)：一种基因型含有所标识的天然二醇脱水酶(基础)，并且一种基因型的二醇脱水酶基因缺失(KO)。每种菌株具有两种变体，一种变体携带pMEG042表达载体，并且一种变体不携带载体(阴性对照)。示出的值是根据3次技术重复的平均值计算的。误差条示出了标准偏差。图8B示出了在产乙醇梭菌的两种不同基因型中随时间推移产生的MEG(mg/g干细胞重量)：一种基因型含有所标识的天然二醇脱水酶(基础)，并且一种基因型的二醇脱水酶基因缺失(KO)。每种菌株具有两种变体，一种变体携带pMEG042表达载体，并且一种变体不携带载体(阴性对照)。示出的值是根据3次技术重复的平均值计算的。误差条示出了标准偏差。

具体实施方式

笼统地给出以下实施例描述。本公开由在以下本文中标题“实例”下给出的公开内容进一步阐明，其提供支持本公开的实验性数据、本公开的各个方面的具体实例以及执行本公开的方式。

诸位发明人出人意料地能够对一氧化碳营养型产乙酸微生物进行工程化以通过包括CO和/或CO₂的底物的发酵来产生乙二醇或乙二醇前体，所述微生物包括编码二醇脱水酶的基因中的破坏性突变。

除非另有定义，否则贯穿本规范所使用的以下术语定义如下：

本公开提供了用于生物产生乙二醇的微生物。“微生物”是微观有机体，具体地是细菌、古菌、病毒或真菌。在一优选的实施例中，本公开的微生物是细菌。

当用于指微生物时，术语“非天然存在的”旨在意指微生物具有在所参考物种的天然存在的菌株(包含所参考物种的野生型菌株)中未发现的至少一种基因修饰。非天然存在的微生物通常在实验室或研究机构中开发。本公开的微生物是非天然存在的。

术语“基因修饰”、“基因改变”或“基因工程化”光泛地指通过人工对微生物的基因组或核酸的操作。同样，术语“经基因修饰的”、“经基因改变的”或“经基因工程化的”是指含有这种基因修饰、基因改变或基因工程的微生物。这些术语可用于区分实验室产生的微生物与自然存在的微生物。基因修饰的方法包含例如异源基因表达、基因或启动子插入或缺失、核酸突变、经改变的基因表达或失活、酶工程、定向进化、基于知识的设计、无规诱变方法、基因改组和密码子优化。本公开的微生物是经基因工程化的。

“重组”指示核酸、蛋白质或微生物是基因修饰、基因工程或基因重组的产物。通常，术语“重组”是指含有衍生自多个来源，如两种或更多种不同的微生物菌株或物种的基因材料或由其编码的核酸、蛋白质或微生物。本公开的微生物通常是重组的。

“野生型”是指区别于突变形式或变体形式的有机体、菌株、基因或其存在于自然中时的特征的典型形式。

“内源”是指在衍生出本公开的微生物的野生型或亲本微生物中存在或表达的核酸或蛋白质。举例来说，内源基因是天然存在于衍生出本公开的微生物的野生型或亲本微生物中的基因。在一个实施例中，内源基因的表达可以由外源调控元件，如外源启动子控制。

“外源”是指起源于本公开的微生物之外的核酸或蛋白质。举例来说，可以人工或重组产生外源基因或酶并将其引入本公开的微生物中或在本公开的微生物中表达。也可以从异源微生物中分离外源基因或酶并将其引入本公开的微生物中或在本公开的微生物中表达。外源核酸可以调整以整合到本公开的微生物的基因组中或在本公开的微生物中例如在质粒中保持染色体外状态。

“异源”是指在衍生出本公开的微生物的野生型或亲本微生物中不存在的核酸或蛋白质。举例来说，异源基因或酶可以衍生自不同的菌株或物种并被引入到本公开的微生物中或在本公开的微生物中表达。异源基因或酶可以以其存在于不同菌株或物种中的形式被引入本公开的微生物或在本公开的微生物中表达。可替代地，可以某种方式修饰异源基因或酶，例如通过对其进行密码子优化以用于在本公开的微生物中表达或通过对其进行工程化以改变功能，如以逆转酶活性方向或改变底物特异性。

具体地，在本文所述的微生物中表达的异源核酸或蛋白质可以衍生自芽孢杆菌(Bacillus)、梭菌(Clostridium)、贪铜菌(Cupriavidus)、埃希氏菌(Escherichia)、葡糖杆菌(Gluconobacter)、生丝微菌(Hyphomicrobium)、赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、栖沉积物菌(Sedimenticola)、芽孢八叠球菌(Sporosarcina)、链霉菌(Streptomyces)、热硫杆状菌(Thermithiobacillus)、热袍菌(Thermotoga)、玉蜀黍、克雷伯氏菌(Klebsiella)、分枝杆菌(Mycobacterium)、沙门氏菌(Salmonella)、类分枝杆菌(Mycobacteroides)、葡萄球菌(Staphylococcus)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)、李斯特氏菌(Listeria)、不动杆菌(Acinetobacter)、志贺氏菌(Shigella)、奈瑟氏菌(Neisseria)、博德特氏菌(Bordetella)、链球菌(Streptococcus)、肠杆菌(Enterobacter)、弧菌(Vibrio)、军团菌(Legionella)、黄单胞菌(Xanthomonas)、沙雷氏菌(Serratia)、克罗诺杆菌(Cronobacter)、铜杆菌(Cupriavidus)、螺杆菌(Helicobacter)、耶尔森菌(Yersinia)、角质细菌(Cutibacterium)、弗朗西斯菌(Francisella)、果胶杆菌(Pectobacterium)、弧杆菌(Arcobacter)、乳杆菌(Lactobacillus)、希瓦氏菌(Shewanella)、欧文氏菌(Erwinia)、硫脲螺旋菌(Sulfurospirillum)、肽球菌科(Peptococcaceae)、嗜热球菌(Thermococcus)、酵母菌(Saccharomyces)、热球菌(Pyrococcus)、甘氨酸(Glycine)、人属(Homo)、罗氏菌(Ralstonia)、短杆菌(Brevibacterium)、甲基杆菌(Methylobacterium)、地芽孢杆菌(Geobacillus)、牛属(bos)、原鸡属(gallus)、厌氧球菌(Anaerococcus)、非洲爪蟾属(Xenopus)、肺炎支气管杆菌(Amblyrhynchus)、鼠属(rattus)、家鼠属(mus)、猪属(sus)、红球菌(Rhodococcus)、球菌(Rhizobium)、巨球菌(Megasphaera)、根瘤菌(Mesorhizobium)、消化球菌(Peptococcus)、农杆菌(Agrobacterium)、弯曲杆菌(Campylobacter)、醋酸杆菌(Acetobacterium)、嗜碱菌(Alkalibaculum)、布劳特氏菌、丁酸杆菌、真杆菌(Eubacterium)、穆尔氏菌(Moorella)、产醋杆菌(Oxobacter)、鼠孢菌(Sporomusa)、热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、拟芽孢杆菌(Fictibacillus)、赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus)、鸟氨酸芽孢杆菌(Ornithinibacillus)、盐杆菌(Halobacillus)、库特氏菌(Kurthia)、慢杆菌(Lentibacillus)、厌氧杆菌(Anoxybacillus)、土壤芽孢杆菌(Solibacillus)、枝芽孢菌(Virgibacillus)、脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)、芽孢八叠球菌(Sporosarcina)、盐生微生物(Planococcus)、芽孢八叠球菌(Sporosarcina)、平球菌(Planococcus)、棒状杆菌(Corynebacterium)、嗜热菌(Thermaerobacter)、硫杆菌(Sulfobacillus)或共生菌(Symbiobacterium)。

术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。所述术语係指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的基因座(loci)(基因座(locus))、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括一个或多个经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸或核苷酸类似物。如果存在，则对核苷酸结构的修饰可以在组装聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以间杂有非核苷酸组分。多核苷酸可以在聚合后如通过与标记组分结合来进一步修饰。

如本文所使用，“表达”是指多核苷酸从DNA模板转录的工艺(如转录为mRNA或其它RNA转录物)和/或经转录mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的工艺。转录物和编码的多肽可以统称为“基因产物”。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线性或支化的，其可以包括经修饰氨基酸，并且可以被非氨基酸间断。该术语还包括已修饰的氨基酸聚合物；所述修饰例如通过二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，如与标记成分的缀合。如本文所用的，术语“氨基酸”包含天然和/或非天然或合成的氨基酸，包含甘氨酸和D或L光学异构体两者，以及氨基酸类似物和肽模拟物。

“酶活性”或简称“活性”广义上是指酶促活性，包含但不限于酶的活性、酶的量或酶催化反应的可用性。因此，“增加”酶活性包含增加酶的活性、增加酶的量或增加酶催化反应的可用性。类似地，“降低”酶活性包含降低酶的活性、降低酶的量或降低酶催化反应的可用性。

“突变的”是指与本公开的微生物所衍生的野生型或亲本微生物相比，在本公开的微生物中已进行修饰的核酸或蛋白质。在一个实施例中，突变可以是编码酶的基因中的缺失、插入或取代。在另一个实施例中，突变可以是酶中一个或多个氨基酸的缺失、插入或取代。

“被破坏的基因”是指以某种方式被修饰以减少或消除基因表达、基因调节活性或经编码蛋白或酶活性的基因。破坏可以部分灭活、完全灭活或删除基因或酶。破坏可以是完全消除基因、蛋白质或酶的表达或活性的敲除(KO)突变。这种破坏也可能是降低但不完全消除基因、蛋白质或酶的表达或活性的敲除。破坏可以是减少、阻止或阻断由酶产生的产物的生物合成的任何东西。所述破坏可以包含例如编码蛋白质或酶的基因中的突变、参与编码酶的基因表达的基因调节元件中的突变、引入产生降低或抑制酶活性的蛋白质的核酸、或引入抑制蛋白质或酶表达的核酸(例如，反义核RNA、RNAi、TALEN、siRNA、CRISPR或CRISPRi)或蛋白质。可以使用本领结构域已知的任何方法引入破坏。为了实现本公开的目的，破坏是实验室产生的，而不是自然发生的。

“亲本微生物”是用于生成本公开的微生物的微生物。亲本微生物可以是天然存在的微生物(即，野生型微生物)或先前已经修饰的微生物(即，突变或重组微生物)。本公开的微生物可以被修饰成表达或过表达在亲本微生物中未表达或过表达的一种或多种酶。类似地，本公开的微生物可以被修饰成含有亲本微生物所不含的一个或多个基因。本公开的微生物还可以被修饰成不表达或表达在亲本微生物中表达的较低量的一种或多种酶。

本公开的微生物可以衍生自基本上任何亲本微生物。在一个实施例中，本公开的微生物可以衍生自选自由以下组成的组的亲本微生物：丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、贝氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在其它实施例中，所述微生物衍生自亲本微生物，所述亲本微生物选自由以下组成的组：伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、生产布劳特氏菌、食甲基丁酸杆菌、醋酸梭菌、产乙醇梭菌、食一氧化碳梭菌、克氏梭菌、德可氏梭菌、蚁酸醋酸梭菌、永达尔梭菌、马氏梭菌、拉氏梭菌、粪味梭菌、粘液真杆菌、热自养穆尔氏菌、热醋穆尔氏菌、普氏产醋杆菌、卵形鼠孢菌、森林土壤醋酸鼠孢菌、球形鼠孢菌和凯伍热厌氧杆菌。在一优选实施例中，所述亲本微生物是产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌。在一特别优选的实施例中，亲本微生物是产乙醇梭菌LZ1561，所述产乙醇梭菌于2010年6月7日根据《布达佩斯条约(Budapest Treaty)》的条款于2010年6月7日保藏在德国布伦瑞克省D-38124Inhoffenstraβe 7B的Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ)，并且登录号为DSM23693。这种菌株在国际专利申请第PCT/NZ2011/000144号中进行了描述，所述国际专利申请以WO 2012/015317公开。

术语“衍生自”表示核酸、蛋白质或微生物从不同的(如亲本或野生型)核酸、蛋白质或微生物修饰或改造，从而产生新的核酸、蛋白质或微生物。此类修饰或改编通常包含核酸或基因的插入、缺失、突变或取代。通常，本公开的微生物衍生自亲本微生物。在一个实施方案中，本公开的微生物衍生自产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌。在优选实施例中，本公开的微生物衍生自产乙醇梭菌LZ1561，其保藏在DSMZ登录号DSM23693下。

本公开的微生物可以基于功能特性进一步分类。例如，本公开的微生物可以是或可以衍生自C1固定型微生物、厌氧菌、产乙酸菌、产乙醇菌(ethanologen)、一氧化碳营养菌(carboxydotroph)和/或甲烷氧化菌。

表1提供了微生物的代表性列表并标识了其功能特性。

¹伍氏醋酸杆菌可以由果糖产生乙醇，但不能由气体产生乙醇。

²尚未研究马氏梭菌是否可以依靠CO生长。

³已报告，热醋穆尔氏菌中的一种菌株穆尔氏菌HUC22-1从气体中产生乙醇。

⁴尚未研究卵形鼠孢菌是否可以依靠CO生长。

⁵尚未研究森林土壤醋酸鼠孢菌是否可以依靠CO生长。

⁶尚未研究卵形鼠孢菌是否可以依靠CO生长。

“伍德-永达尔”是指碳固定的伍德-永达尔通路，如例如由Ragsdale,《生物化学与生物物理学报(Biochim Biophys Acta)》,1784:1873-1898,2008所描述的。“伍德-永达尔微生物”可预见地指代含有伍德-永达尔通路的微生物。一般来说，本公开的微生物含有天然伍德-永达尔通路。在本文中，伍德-永达尔通路可以是天然的未经修饰的伍德-永达尔通路，或者所述伍德-永达尔通路可以是有一定程度的基因修饰(例如，过表达、异源表达、敲除等)的伍德-永达尔通路，只要所述伍德-永达尔通路仍然起作用以将CO、CO₂和/或H₂转化为乙酰辅酶A即可。

“C1”指一个碳分子，例如CO、CO₂、CH₄或CH₃OH。“C1含氧化合物”是指也包括至少一个氧原子的单碳分子，例如CO、CO₂或CH₃OH。“C1碳源”是指充当本公开微生物的部分或唯一碳源的单碳分子。例如，C1碳源可以包括以下中的一种或多种：CO、CO₂、CH₄、CH₃OH或CH₂O₂。优选地，C1碳源包括CO和CO₂中的一种或两种。“C1固定型微生物”是指具有由C1碳源产生一种或多种产物的能力的微生物。本公开的微生物通常是C1固定型细菌。在一优选实施例中，本公开的微生物衍生自表1中标识的C1固定型微生物。

“厌氧菌”是不需要氧气即可生长的微生物。如果氧气超过某一阈值存在，则厌氧菌可能会产生不良反应或甚至死亡。然而，一些厌氧菌能够耐受低水平的氧(例如，0.000001-5％的氧)，有时被称为“微氧条件”。通常，本公开的微生物是厌氧菌。在一个优选的实施例中，本公开的微生物衍生自表1中标识的厌氧菌。

“产乙酸菌”为使用伍德-永达尔通路作为其能量守恒和合成乙酰辅酶A以及乙酰辅酶A衍生产物(如乙酸酯)的主要机制的绝对厌氧细菌(Ragsdale,《生物化学与生物物理学学报》,1784:1873-1898,2008)。具体来说，产乙酸菌使伍德-永达尔通路作为(1)用于从CO₂还原合成乙酰辅酶A的机制，(2)最终电子接收、能量保存过程，(3)在细胞碳的合成中固定(同化)CO₂的机制(Drake,“产乙酸原核生物(Acetogenic Prokaryotes)”，见：《原核生物(The Prokaryotes)》,第3版,第354页,纽约州纽约(New York,NY),2006)。所有天然存在的产乙酸菌都是C1固定型、厌氧型、自养型和非甲烷氧化型。通常，本公开的微生物是产乙酸菌。在一优选实施例中，本公开的微生物衍生自表1中标识的产乙酸菌。

“产乙醇菌”是产生或能够产生乙醇的微生物。通常，本公开的微生物是产乙醇菌。在一优选实施例中，本公开的微生物衍生自表1中标识的产乙醇菌。

“自养菌”是能够在不存在有机碳的情况下生长的微生物。相反，自养菌使用无机碳源，如CO和/或CO₂。通常，本公开的微生物是自养菌。在一优选实施例中，本公开的微生物衍生自表1中标识的自养菌。

“一氧化碳营养菌”是能够利用CO作为碳和能量的唯一来源的微生物。通常，本公开的微生物是一氧化碳营养菌。在一优选实施例中，本公开的微生物衍生自表1中标识的一氧化碳营养菌。

“甲烷氧化菌”是能够利用甲烷作为碳和能量的唯一来源的微生物。在某些实施例中，本公开的微生物是甲烷氧化菌或衍生自甲烷氧化菌。在其它实施例中，本公开的微生物不是甲烷氧化菌或不衍生自甲烷氧化菌。

在一优选实施例中，本公开的微生物衍生自包括物种产乙醇梭菌、永达尔梭菌和拉氏梭菌的梭菌簇。这些物种最初由Abrini,《微生物学文献集(Arch Microbiol)》,161:345-351,1994(产乙醇梭菌)；Tanner,《国际系统细菌学杂志(Int J System Bacteriol)》,43:232-236,1993(永达尔梭菌)；以及Huhnke,WO 2008/028055(拉氏梭菌)报导和表征。

这三个物种有许多相似之处。具体地说，这些物种都是梭状芽胞杆菌属的C1固定型、厌氧型、产乙酸型、产乙醇型和羧基营养型成员。这些物种具有相似的基因型和表型以及相似的能量保存和发酵代谢模式。此外，这些物种簇集于16S rRNADNA超过99％相同的梭菌rRNA同源组I中，具有约22-30mol％的DNAG+C含量，是革兰氏阳性的，具有相似形态和大小(对数生长期细胞介于0.5-0.7×3-5μm之间)，是嗜温性的(在30-37℃下生长最佳)，具有约4-7.5的相似pH范围(最佳pH为约5.5-6)，缺乏细胞色素，并且通过Rnf复合体保存能量。另外，在这些物种中已证明羧酸还原为其对应的醇(Perez,《生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng)》,110:1066-1077,2012)。重要的是，这些物种还均示出依靠含CO气体的强自养性生长，产生乙醇和乙酸盐(或醋酸)作为主要发酵产物，并且在一定条件下产生少量的2,3-丁二醇和乳酸。

然而，这三种物种也有许多不同之处。这些物种分离自不同的来源：来自兔肠道中的产乙醇梭菌、来自鸡场废物中的扬氏梭菌和来自淡水沉积物中的拉氏梭菌。这些物种的不同在于各种糖(例如，鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如，葡萄糖酸、柠檬酸盐)、氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸)和其它底物(例如，甜菜碱、丁醇)的利用。此外，这些物种的不同在于某些维生素(例如硫胺、生物素)营养缺陷。这些物种在伍德-永达尔通路基因和蛋白质的核酸和氨基酸序列上存在差异，不过已经发现所有物种中的这些基因和蛋白质的一般结构和数量相同(《生物技术最新观点(Curr Opin Biotechnol)》,22:320-325,2011)。

因此，总的来说，产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌的多种特性并不对这些物种具有特异性，但是梭状芽胞杆菌属的C1固定型、厌氧型、产乙酸型、产乙醇型和羧基营养型成员的这一簇的一般特性却对这些物种具有特异性。然而，由于这些物种实际上是不同的，所以这些物种中的一种的基因修饰或操纵在这些物种的另一种中可能不具有相同的作用。举例来说，可观察到生长、性能或产物产生的不同。

本公开的微生物也可以衍生自产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌的分离株或突变体。产乙醇梭菌的分离株和突变体包含JA1-1(DSM10061)(Abrini,《微生物学文献集》,161:345-351,1994)、LBS1560(DSM19630)(WO 2009/064200)和LZ1561(DSM23693)(WO2012/015317)。永达尔梭菌的分离物和突变体包含ATCC 49587(Tanner,《国际系统细菌学杂志(Int J Syst Bacteriol)》,43:232-236页,1993)、PETCT(DSM13528，ATCC 55383)、ERI-2(ATCC 55380)(US 5,593,886)、C-01(ATCC 55988)(US 6,368,819)、O-52(ATCC55989)(US 6,368,819)和OTA-1(Tirado-Acevedo,《使用永达尔梭菌由合成气体产生生物乙醇(Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridiumljungdahlii)》,北卡罗莱纳州立大学博士论文(PhD thesis,North Carolina StateUniversity),2010)。拉氏梭菌的分离株和突变体包含PI 1(ATCC BAA-622、ATCC PTA-7826)(WO 2008/028055)。

然而，如上所述，本公开的微生物也可以衍生自基本上任何亲本微生物，如选自由以下组成的组的亲本微生物：丙酮丁醇梭菌、贝氏梭菌、大肠杆菌和酿酒酵母。

本公开提供了能够产生乙二醇、乙醛酸盐和乙醇酸盐的微生物以及产生乙二醇、乙醛酸盐和乙醇酸盐的方法，所述方法包括在存在底物的情况下培养本公开的微生物，由此所述微生物产生乙二醇。

本公开的微生物可以包括将乙酰辅酶A(如通过伍德-永达尔通路径产生的乙酰辅酶A)转化为丙酮酸盐(图1的反应1)的酶。这种酶可以是丙酮酸合酶(PFOR)[1.2.7.1]或ATP:丙酮酸正磷酸磷酸转移酶\1.2.7.1>。在一些实施例中，将乙酰辅酶A转化为丙酮酸盐的酶是内源酶。

本公开的微生物可以包括将丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐(图1的反应2)的酶。这种酶可能是丙酮酸盐:二氧化碳连接酶[ADP-形成][6.4.1.1]。在一些实施例中，将丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐的酶是内源酶。在一些实施例中，将丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐的酶被过表达。

本公开的微生物可以包括将草酰乙酸盐转化为柠檬酰辅酶A(图1的反应3)的酶。这种酶可以是柠檬酰辅酶A裂解酶[4.1.3.34]。在一些实施例中，将草酰乙酸盐转化为柠檬酰辅酶A的酶是内源酶。

本公开的微生物可以包括将柠檬酰辅酶A转化为柠檬酸盐(图1的反应4)的酶。这种酶可以是柠檬酸辅酶A转移酶[2.8.3.10]。在一些实施例中，将柠檬酰辅酶A转化为柠檬酸盐的酶是内源酶。

本公开的微生物可以包括将草酰乙酸盐转化为柠檬酸盐(图1的反应5)的酶。这种酶可以是柠檬酸[Si]-合酶[2.3.3.1]、ATP柠檬酸合酶[2.3.3.8]或柠檬酸(Re)-合酶[2.3.3.3]。在一些实施例中，将草酰乙酸盐转化为柠檬酸盐的酶是内源酶。在其它实施例中，将草酰乙酸盐转化为柠檬酸盐的酶是异源酶。例如，在一些实施例中，本公开的微生物包括来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的柠檬酸合酶1[EC 2.3.3.16]，使得所述微生物包括SEQ ID NO:1中所示的编码SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自科氏梭菌(C.kluyveri)的柠檬酸(Re)-合酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:3中所示的编码SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自梭菌(Clostridium sp.)的柠檬酸(Si)-合酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:5中所示的编码SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自枯草芽孢杆菌的柠檬酸合酶2，使得所述微生物包括SEQ ID NO:7中所示的编码SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，将草酰乙酸盐转化为柠檬酸盐的酶被过表达。

本公开的微生物可以包括将柠檬酸盐转化为乌头酸盐并将乌头酸盐转化为异柠檬酸盐(图1的反应6)的酶。这种酶可能是乌头酸水合酶[4.2.1.3]。在一些实施例中，将柠檬酸盐转化为乌头酸盐并将乌头酸盐转化为异柠檬酸盐的酶是内源酶。在一些实施例中，将柠檬酸盐转化为乌头酸盐并将乌头酸盐转化为异柠檬酸盐的酶被过表达。

本公开的微生物可以包括将异柠檬酸盐转化为乙醛酸盐(图1的反应7)的酶。这种酶可以是异柠檬酸裂解酶[4.1.3.1]。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自玉米黍的异柠檬酸裂解酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:9中所示的编码SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自大肠杆菌的异柠檬酸裂解酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:11中所示的编码SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中：

本公开的微生物可以包括将乙醛酸盐转化为乙醇酸盐(图1的反应8)的酶。这种酶可以是甘油酸脱氢酶[1.1.1.29]、乙醛酸还原酶[1.1.1.26/79]或乙醇酸脱氢酶[1.1.99.14]。在一些实施例中，将乙醛酸盐转化为乙醇酸盐的酶是内源酶。在一些实施例中，将乙醛酸盐转化为乙醇酸盐的酶被过表达。

本公开的微生物可以包括将乙醇酸盐转化为乙醇醛(图1的反应9)的酶。这种酶可以是乙醇醛脱氢酶[1.2.1.21]、乳醛脱氢酶[1.2.1.22]、琥珀酸-半醛脱氢酶[1.2.1.24]、2,5-二氧戊酸脱氢酶[1.2.1.26]、醛脱氢酶[1.2.1.3/4/5]、甜菜碱-醛脱氢酶[1.2.1.8]或醛铁氧还蛋白氧化还原酶[1.2.7.5]。在一些实施例中，将乙醇酸盐转化为乙醇醛的酶是内源酶。在其它实施例中，将乙醇酸盐转化为乙醇醛的酶是异源酶。例如，在一些实施例中，本公开的微生物包括来自大肠杆菌的γ-氨基丁醛脱氢酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:49中所示的编码SEQ ID NO:50中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自大肠杆菌的醛脱氢酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:51中所示的编码SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自大肠杆菌的NADP依赖性琥珀酸-半醛脱氢酶I，使得所述微生物包括SEQ ID NO:53中所示的编码SEQ ID NO:54中所述的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)的乳醛脱氢酶/乙醇醛脱氢酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:55中所示的编码SEQ ID NO:56中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自荧光假单胞菌的醛脱氢酶A，使得所述微生物包括SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:59中所示的分别编码SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:60中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。将乙醇酸盐转化为乙醇醛的酶的额外非限制性实例可在GenBank登录号WP_003202098、WP_003182567、ACT39044、ACT39074、WP_041112005和ACT40170中找到。在一些实施例中，将乙醇酸盐转化为乙醇醛的酶被过表达。

本公开的微生物可以包括将乙醇醛转化为乙二醇(图1的反应10)的酶。这种酶可以是乳醛还原酶[1.1.1.77]、醇脱氢酶[1.1.1.1]、醇脱氢酶(NADP+)[1.1.1.2]、甘油脱氢酶[1.1.1.72]、甘油-3-磷酸脱氢酶[1.1.1.8]或醛还原酶[1.1.1.21]。在一些实施例中，将乙醇醛转化为乙二醇的酶是内源酶。在一些实施例中，将乙醇醛转化为乙二醇的内源酶被过表达。在其它实施例中，将乙醇醛转化为乙二醇的酶是异源酶。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自糖产丁醇丙酮梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)的乳醛还原酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:61中所示的编码SEQ ID NO:62中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自永达尔梭菌的乳醛还原酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:63中所示的编码SEQ ID NO:64中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自大肠杆菌的乳醛还原酶，使得所述微生物包括SEQID NO:65中所示的编码SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自贝氏梭菌的乳醛还原酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:67中所示的编码SEQ ID NO:68中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，将乙醇醛转化为乙二醇的异源酶被过表达。

本公开的微生物可以包括将丙酮酸盐转化为苹果酸盐(图1的反应11)的酶。这种酶可以是苹果酸脱氢酶[1.1.1.37]、苹果酸脱氢酶(草酰乙酸盐脱羧)[1.1.1.38]、苹果酸脱氢酶(脱羧)[1.1.1.39]、苹果酸脱氢酶(草酰乙酸脱羧)(NADP+)[1.1.1.40]、苹果酸脱氢酶(NADP+)[1.1.1.82]、D-苹果酸脱氢酶(脱羧)[1.1.1.83]、二甲基苹果酸脱氢酶[1.1.1.84]、3-异丙基苹果酸脱氢酶[1.1.1.85]、苹果酸脱氢酶[NAD(P)+][1.1.1.299]或苹果酸脱氢酶(醌)[1.1.5.4]。在一些实施例中，将丙酮酸盐转化为苹果酸盐的酶是内源酶。在其它实施例中，将丙酮酸盐转化为苹果酸盐的酶是异源酶。例如，在一些实施例中，本公开的微生物包括来自产乙醇梭菌的苹果酸脱氢酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:23中所示的编码SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自产乙醇梭菌的NAD依赖性苹果酸酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:25中所示的编码SEQ ID NO:26中所述的氨基酸序列的核苷酸序列。

本公开的微生物可以包括将苹果酸盐转化为乙醛酸盐(图1的反应12)的酶。这种酶可以是苹果酸合酶[2.3.3.9]或异柠檬酸裂解酶[4.1.3.1]。在一些实施例中，将苹果酸盐转化为乙醛酸盐的酶是异源酶。例如，在一些实施例中，本公开的微生物包括来自芽孢八叠球菌(Sporosarcina sp.)的苹果酸合酶G，使得所述微生物包括SEQ ID NO:27或SEQ IDNO:33中所示的分别编码SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自芽孢杆菌(Bacillus sp.)的苹果酸合酶G，使得所述微生物包括SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:35中所示的分别编码SEQ ID NO:30或SEQID NO:36中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自天蓝色链霉菌(S.coelicolor)的苹果酸合酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:31中所示的编码SEQ ID NO:32中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自婴儿芽孢杆菌(B.infantis)的苹果酸合酶G，使得所述微生物包括SEQ ID NO:37中所示的编码SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自匙形梭菌(C.cochlearium)的苹果酸合酶，使得所述微生物包括SEQ IDNO:39中所示的编码SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自巨大芽孢杆菌(B.megaterium)的苹果酸合酶G，使得所述微生物包括SEQ ID NO:41中所示的编码SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)的苹果酸合酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:43中所示的编码SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)的苹果酸合酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:45中所示的编码SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自蜡样芽孢杆菌(B.cereus)的苹果酸合酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:47中所示的编码SEQ ID NO:48中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

本公开的微生物可以包括将丙酮酸盐转化为磷酸烯醇丙酮酸盐(图1的反应13)的酶。这种酶可以是丙酮酸激酶[2.7.1.40]、丙酮酸磷酸二激酶[2.7.9.1]或丙酮酸水二激酶[2.7.9.2]。在一些实施例中，将丙酮酸盐转化为磷酸烯醇丙酮酸盐的酶是内源酶。

本公开的微生物可以包括将磷酸烯醇丙酮酸盐转化为2-磷酸-D-甘油酸盐(图1的反应14)的酶。这种酶可以是磷酸丙酮酸水合酶[4.2.1.11]。在一些实施例中，将磷酸烯醇丙酮酸盐转化为2-磷酸-D-甘油酸盐的酶是内源酶。

本公开的微生物可以包括将2-磷酸-D-甘油酸盐转化为3-磷酸-D-甘油酸盐(图1的反应15)的酶。这种酶可以是磷酸甘油酸变位酶[5.4.2.11/12]。在一些实施例中，将2-磷酸-D-甘油酸盐转化为3-磷酸-D-甘油酸盐的酶是内源酶。

本公开的微生物可以包括将3-磷酸-D-甘油酸盐转化为3-膦酰氧基丙酮酸盐(图1的反应16)的酶。这种酶可以是磷酸甘油酸脱氢酶[1.1.1.95]。在一些实施例中，将3-磷酸-D-甘油酸盐转化为3-膦酰氧基丙酮酸盐的酶是内源酶。

本公开的微生物可以包括将3-膦酰氧基丙酮酸盐转化为3-磷酸-L-丝氨酸(图1的反应17)的酶。这种酶可以是磷酸丝氨酸转氨酶[2.6.1.52]。在一些实施例中，将3-膦酰氧基丙酮酸盐转化为3-磷酸-L-丝氨酸的酶是内源酶。

本公开的微生物可以包括将3-磷酸-L-丝氨酸转化为丝氨酸(图1的反应18)的酶。这种酶可以是磷酸丝氨酸磷酸酶[3.1.3.3]。在一些实施例中，将3-磷酸-L-丝氨酸转化为丝氨酸的酶是内源酶。

本公开的微生物可以包括将丝氨酸转化为甘氨酸(图1的反应19)的酶。这种酶可以是甘氨酸羟甲基转移酶[2.1.2.1]。在一些实施例中，将丝氨酸转化为甘氨酸的酶是内源酶。在一些实施例中，将丝氨酸转化为甘氨酸的酶被过表达。

本公开的微生物可以包括将甘氨酸转化为乙醛酸盐(图1的反应20)的酶。这种酶可以是丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶/转氨酶[2.6.1.44]、丝氨酸-乙醛酸氨基转移酶/转氨酶[2.6.1.45]、丝氨酸-丙酮酸氨基转移酶/转氨酶[2.6.1.51]、甘氨酸-草酰乙酸氨基转移酶/转氨酶[2.6.1.35]、甘氨酸转氨酶[2.6.1.4]、甘氨酸脱氢酶[1.4.1.10]、丙氨酸脱氢酶[1.4.1.1]或甘氨酸脱氢酶[1.4.2.1]。在一些实施例中，将甘氨酸转化为乙醛酸盐的酶是内源酶。在其它实施例中，将甘氨酸转化为乙醛酸盐的酶是异源酶。例如，在一些实施例中，本公开的微生物包括来自嗜甲基生丝微菌(H.methylovorum)的丝氨酸-乙醛酸氨基转移酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:13中所示的编码SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自硫牛磺酸栖沉积物菌(S.thiotaurini)的丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:15中所示的编码SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自温浴嗜热硫杆菌(T.tepidarius)的丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:17中所示的编码SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自尿酸梭菌(C.acidurici)的V类氨基转移酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:19中所示的编码SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的微生物包括来自海栖热袍菌(T.maritima)的丝氨酸-丙酮酸氨基转移酶，使得所述微生物包括SEQ ID NO:21中所示的编码SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，将甘氨酸转化为乙醛酸盐的酶被过表达。

本公开的微生物可以包括将丝氨酸转化为羟基丙酮酸盐(图1的反应21)的酶。这种酶可以是丝氨酸-丙酮酸转氨酶[2.6.1.51]、丝氨酸-乙醛酸转氨酶[2.6.1.45]、丙氨酸脱氢酶[1.4.1.1]、L-氨基酸脱氢酶[1.4.1.5]、丝氨酸2-脱氢酶[1.4.1.7]、丙氨酸转氨酶[2.6.1.2]、谷氨酰胺-丙酮酸转氨酶[2.6.1.15]、D-氨基酸转氨酶[2.6.1.21]、丙氨酸-乙醛酸转氨酶[2.6.1.44]或丝氨酸-丙酮酸转氨酶[2.6.1.51]。在一些实施例中，将丝氨酸转化为羟基丙酮酸盐的酶是内源酶。在其它实施例中，将丝氨酸转化为羟基丙酮酸盐的酶是异源酶。能够将丝氨酸转化为羟基丙酮酸盐的酶的非限制性实例可以在GenBank登录号WP_009989311和NP_511062.1中找到。在一些实施例中，将丝氨酸转化为羟基丙酮酸盐的酶被过表达。

本公开的微生物可以包括将羟基丙酮酸盐转化为乙醇醛(图1的反应22)的酶。这种酶可以是羟基丙酮酸脱羧酶[4.1.1.40]或丙酮酸脱羧酶[4.1.1.1]。这种酶也可以是任何其它脱羧酶[4.1.1.-]。在一些实施例中，将羟基丙酮酸盐转化为乙醇醛的酶是异源酶。能够将羟基丙酮酸盐转化为乙醇醛的酶的非限制性实例可以在GenBank登录号CCG28866、SVF98953、PA0096、CAA54522、KRU13460和KLA26356中找到。

本公开的微生物可以包括将D-甘油酸盐转化为羟基丙酮酸盐(图1的反应23)的酶。这种酶可以是乙醛酸还原酶[EC 1.1.1.26]、甘油酸脱氢酶[EC 1.1.1.29]或羟丙酮酸还原酶[EC1.1.1.81]。在一些实施例中，将D-甘油酸盐转化为羟基丙酮酸盐的酶是异源酶。能够将D-甘油酸盐转化为羟基丙酮酸盐的酶的非限制性实例可以在GenBank登录号SUK16841、RPK22618、KPA02240、AGW90762、CAC11987、Q9CA90和Q9UBQ7中找到。

本公开的微生物可以包括将5,10-亚甲基四氢叶酸盐转化为甘氨酸(图1的反应24)的酶的复合物。5,10-亚甲基四氢叶酸盐是伍德-永达尔通路的还原分支中的辅因子，并在乙酰辅酶A的产生中充当支架。这种复合物可以是包括甘氨酸脱氢酶[1.4.4.2]、二氢脂酰脱氢酶[1.8.1.4]和氨基甲基转移酶(甘氨酸合酶)[2.1.2.10]的甘氨酸切割系统。在一些实施例中，复合物的将5,10-亚甲基四氢叶酸盐转化为甘氨酸的酶是内源酶。在一些实施例中，甘氨酸切割系统的酶被过表达。

本公开的微生物可以包括将磷酸烯醇丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐(图1的反应25)的酶。这种酶可以是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(ATP)[4.1.1.49]或(GTP)[4.1.1.32]。在一些实施例中，将磷酸烯醇丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐的酶是内源酶。在其它实施例中，将磷酸烯醇丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐的酶是异源酶。在一些实施例中，将磷酸烯醇丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐的酶被过表达。

在一些实施例中，包括将乙酰辅酶A转化为丙酮酸盐(图1的反应1)的酶、将丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐(图1的反应2)的酶、将草酰乙酸盐转化为柠檬酸盐的酶(图1的反应5)、将柠檬酸盐转化为乌头酸盐并将乌头酸盐转化为异柠檬酸盐(图1的反应6)的酶、将异柠檬酸盐转化为乙醛酸盐(图1的反应7)的酶、将乙醛酸盐转化为乙醇酸盐(图1的反应8)的酶、将乙醇酸盐转化为乙醇醛(图1的反应9)的酶以及将乙醇醛转化为乙二醇(图1的反应10)的酶的微生物产生乙二醇。在一非限制性实例中，将草酰乙酸盐转化为柠檬酸盐的酶可以是来自枯草芽孢杆菌(SEQ ID NO:1-2)的柠檬酸合酶。在一非限制性实例中，将异柠檬酸盐转化为乙醛酸盐的酶可以是来自大肠杆菌(SEQ ID NO:11-12)的异柠檬酸裂解酶。在一非限制性实例中，将乙醇酸盐转化为乙醇醛的酶可以是来自氧化葡萄糖酸杆菌(SEQ IDNO:55-56)的乙醇醛脱氢酶或来自荧光假单胞菌(SEQ ID NO:57-58)的醛脱氢酶。催化如图1所示的反应2、5、6、8、9和10的酶中的一种或多种酶可以被过表达。参见例如实例1和图3B。

在一些实施例中，包括将乙酰辅酶A转化为丙酮酸盐(图1的反应1)的酶、将丙酮酸盐转化为磷酸烯醇丙酮酸盐(图1的反应13)的酶、将磷酸烯醇丙酮酸盐转化为2-磷酸-D-甘油酸盐(图1的反应14)的酶、将2-磷酸-D-甘油酸盐转化为3-磷酸-D-甘油酸盐(图1的反应15)的酶、将3-磷酸-D-甘油酸盐转化为3-膦酰氧基丙酮酸盐(图1的反应16)的酶、将3-膦酰氧基丙酮酸盐转化为3-磷酸-L-丝氨酸(图1的反应17)的酶、将3-磷酸-L-丝氨酸转化为丝氨酸(图1的反应18)的酶、将丝氨酸转化为甘氨酸(图1的反应19)的酶、将甘氨酸转化为乙醛酸盐(图1的反应20)的酶、将乙醛酸盐转化为乙醇酸盐(图1的反应8)的酶、将乙醇酸盐转化为乙醇醛(图1的反应9)的酶以及将乙醇醛转化为乙二醇(图1的反应10)的酶的微生物产生乙二醇。在一非限制性实例中，将甘氨酸转化为乙醛酸盐的酶可以是来自硫牛磺酸栖沉积物菌(SEQ ID NO:15-16)的丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶或来自尿酸梭菌(SEQ ID NO:19-20)的V类氨基转移酶。在一非限制性实例中，将乙醇酸盐转化为乙醇醛的酶可以是来自氧化葡萄糖酸杆菌(SEQ ID NO:55-56)的乙醇醛脱氢酶或来自荧光假单胞菌(SEQ ID NO:57-58)的醛脱氢酶。催化如图1所示的步骤19、20、8、9和10的反应的酶中的一种或多种酶可以被过表达。参见例如实例2-4和图4B、5B和6B。

在一些实施例中，包括将乙酰辅酶A转化为丙酮酸盐(图1的反应1)的酶、将丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐(图1的反应2)的酶、将草酰乙酸盐转化为柠檬酰辅酶A(图1的反应3)的酶、将柠檬酰辅酶A转化为柠檬酸盐的酶(图1的反应4)、将柠檬酸盐转化为乌头酸盐并将乌头酸盐转化为异柠檬酸盐(图1的反应6)的酶、将异柠檬酸盐转化为乙醛酸盐(图1的反应7)的酶、将乙醛酸盐转化为乙醇酸盐(图1的反应8)的酶、将乙醇酸盐转化为乙醇醛(图1的反应9)的酶以及将乙醇醛转化为乙二醇(图1的反应10)的酶的微生物产生乙二醇。在一非限制性实例中，将异柠檬酸盐转化为乙醛酸盐的酶可以是来自大肠杆菌(SEQ ID NO:11-12)的异柠檬酸裂解酶。在一非限制性实例中，将异柠檬酸盐转化为乙醛酸盐的酶可以是来自大肠杆菌(SEQ ID NO:11-12)的异柠檬酸裂解酶。在一非限制性实例中，将乙醇酸盐转化为乙醇醛的酶可以是来自氧化葡萄糖酸杆菌(SEQ ID NO:55-56)的乙醇醛脱氢酶或来自荧光假单胞菌(SEQ ID NO:57-58)的醛脱氢酶。催化如图1所示的反应2、6、8、9和10的酶中的一种或多种酶可以被过表达。

在一些实施例中，包括将乙酰辅酶A转化为丙酮酸盐(图1的反应1)的酶、将丙酮酸盐转化为苹果酸盐(图1的反应11)的酶、将苹果酸盐转化为乙醛酸盐(图1的反应12)的酶、将乙醛酸盐转化为乙醇酸盐(图1的反应8)的酶、将乙醇酸盐转化为乙醇醛(图1的反应9)的酶和将乙醇醛转化为乙二醇的酶(图1的反应10)的微生物产生乙二醇。在一非限制性实例中，将乙醇酸盐转化为乙醇醛的酶可以是来自氧化葡萄糖酸杆菌(SEQ ID NO:55-56)的乙醇醛脱氢酶或来自荧光假单胞菌(SEQ ID NO:57-58)的醛脱氢酶。催化如图1所示的步骤8、9和10的反应的酶中的一种或多种酶可以被过表达。

在一些实施例中，包括将5,10-亚甲基四氢叶酸盐转化为甘氨酸(图1的反应24)的酶、将甘氨酸转化为乙醛酸盐(图1的反应20)的酶、将乙醛酸盐转化为乙醇酸盐(图1的反应8)的酶、将乙醇酸盐转化为乙醇醛(图1的反应9)的酶和将乙醇醛转化为乙二醇的酶(图1的反应10)的酶的复合物的微生物产生乙二醇。在一非限制性实例中，将甘氨酸转化为乙醛酸盐的酶可以是来自硫牛磺酸栖沉积物菌(SEQ ID NO:15-16)的丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶或来自尿酸梭菌(SEQ ID NO:19-20)的V类氨基转移酶。在一非限制性实例中，将乙醇酸盐转化为乙醇醛的酶可以是来自氧化葡萄糖酸杆菌(SEQ ID NO:55-56)的乙醇醛脱氢酶或来自荧光假单胞菌(SEQ ID NO:57-58)的醛脱氢酶。催化步骤8、9、10、20和24的反应的酶中的一种或多种酶可以被过表达。

在一些实施例中，包括将乙酰辅酶A转化为丙酮酸盐(图1的反应1)的酶、将丙酮酸盐转化为磷酸烯醇丙酮酸盐的酶(图1的反应13)、将磷酸烯醇丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐的酶(图1的反应25)、将草酰乙酸盐转化为柠檬酰辅酶A(图1的反应3)的酶、将柠檬酰辅酶A转化为柠檬酸盐的酶(图1的反应4)、将柠檬酸盐转化为乌头酸盐并将乌头酸盐转化为异柠檬酸盐(图1的反应6)的酶、将异柠檬酸盐转化为乙醛酸盐(图1的反应7)的酶、将乙醛酸盐转化为乙醇酸盐(图1的反应8)的酶、将乙醇酸盐转化为乙醇醛(图1的反应9)的酶以及将乙醇醛转化为乙二醇(图1的反应10)的酶的微生物产生乙二醇。在一非限制性实例中，将异柠檬酸盐转化为乙醛酸盐的酶可以是来自大肠杆菌(SEQ ID NO:11-12)的异柠檬酸裂解酶。在一非限制性实例中，将乙醇酸盐转化为乙醇醛的酶可以是来自氧化葡萄糖酸杆菌(SEQID NO:55-56)的乙醇醛脱氢酶或来自荧光假单胞菌(SEQ ID NO:57-58)的醛脱氢酶。催化如图1所示的反应2、6、8、9、10和25的酶中的一种或多种酶可以被过表达。

在一些实施例中，包括将乙酰辅酶A转化为丙酮酸盐(图1的反应1)的酶、将丙酮酸盐转化为磷酸烯醇丙酮酸盐(图1的反应13)的酶、将磷酸烯醇丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐(图1的反应25)的酶、将草酰乙酸盐转化为柠檬酸盐的酶(图1的反应5)、将柠檬酸盐转化为乌头酸盐并将乌头酸盐转化为异柠檬酸盐(图1的反应6)的酶、将异柠檬酸盐转化为乙醛酸盐(图1的反应7)的酶、将乙醛酸盐转化为乙醇酸盐(图1的反应8)的酶、将乙醇酸盐转化为乙醇醛(图1的反应9)的酶以及将乙醇醛转化为乙二醇(图1的反应10)的酶的微生物产生乙二醇。在一非限制性实例中，将草酰乙酸盐转化为柠檬酸盐的酶可以是来自枯草芽孢杆菌(SEQ ID NO:1-2)的柠檬酸合酶。在一非限制性实例中，将异柠檬酸盐转化为乙醛酸盐的酶可以是来自大肠杆菌(SEQ ID NO:11-12)的异柠檬酸裂解酶。在一非限制性实例中，将乙醇酸盐转化为乙醇醛的酶可以是来自氧化葡萄糖酸杆菌(SEQ ID NO:55-56)的乙醇醛脱氢酶或来自荧光假单胞菌(SEQ ID NO:57-58)的醛脱氢酶。催化如图1所示的反应5、6、8、9、10和25的酶中的一种或多种酶可以被过表达。

在一些实施例中，包括将乙酰辅酶A转化为丙酮酸盐(图1的反应1)的酶、将丙酮酸盐转化为磷酸烯醇丙酮酸盐(图1的反应13)的酶、将磷酸烯醇丙酮酸盐转化为2-磷酸-D-甘油酸盐(图1的反应14)的酶、将2-磷酸-D-甘油酸盐转化为3-磷酸-D-甘油酸盐(图1的反应15)的酶、将3-磷酸-D-甘油酸盐转化为3-膦酰氧基丙酮酸盐(图1的反应16)的酶、将3-膦酰氧基丙酮酸盐转化为3-磷酸-L-丝氨酸(图1的反应17)的酶、将3-磷酸-L-丝氨酸转化为丝氨酸(图1的反应18)的酶的微生物包括将丝氨酸转化为羟基丙酮酸盐(图1的反应21)的酶、将羟基丙酮酸盐转化为乙醇醛(图1的反应22)的酶以及将乙醇醛转化为乙二醇(图1的反应10)的酶，产生乙二醇。催化乙醇醛转化为乙二醇的酶可以被过表达。

在一些实施例中，包括将D-甘油酸盐转化为羟基丙酮酸盐(图1的反应23)的酶、将羟基丙酮酸盐转化为乙醇醛(图1的反应22)的酶和将乙醇醛转化为乙二醇(图1的反应10)的酶的微生物产生乙二醇。催化乙醇醛转化为乙二醇的酶可以被过表达。

本公开的酶可以被密码子优化以在本公开的微生物中表达。“密码子优化”是指核酸例如基因的突变，用于优化或改进特定菌株或物种中的核酸转译。密码子优化可以带来更快的转译速度或更高的转译准确性。在一优选实施例中，本公开的基因被密码子优化以在本公开的微生物中表达。尽管密码子优化指的是潜在的遗传序列，但密码子优化通常会使得转译得到改进，从而提高酶的表达。因此，本公开的酶也可以被描述为经密码子优化的。

本公开的酶中的一种或多种酶可以被过表达。“过表达”是指与衍生出本公开的微生物的野生型或亲本微生物相比本公开的微生物中的核酸或蛋白质的表达增加。过表达可以通过本领域已知的任何手段实现，包含修饰基因拷贝数、基因转录速率、基因转译速率或酶降解速率。如上所述，催化图1的反应2、5、6、8、9、10、19、20、24或25的酶中的一种或多种可以过表达。

本公开的酶可以包括破坏性突变。“破坏性突变”是指减少或消除(即“破坏”)基因或酶的表达或活性的突变。破坏性突变可以部分灭活、完全灭活或删除基因或酶。破坏性突变可以是敲除(KO)突变。破坏性突变可以是减少、防止或阻断酶产生的产物的生物合成的任何突变。所述破坏性突变可以包含例如编码酶的基因中的突变、参与编码酶的基因表达的基因调节元件中的突变、引入产生降低或抑制酶活性的蛋白质的核酸、或引入抑制蛋白质或酶表达的核酸(例如，反义RNA、siRNA、CRISPR)。破坏性突变可以使用本领域已知的任何方法引入。

在一个实施例中，本公开的微生物包括编码二醇脱水酶的基因中的破坏性突变。

在一些实施例中，本公开的微生物包括异柠檬酸脱氢酶[1.1.1.41]中的破坏性突变。异柠檬酸脱氢酶将异柠檬酸盐转化为2-氧代戊二酸盐。异柠檬酸脱氢酶如通过缺失异柠檬酸脱氢酶的破坏使异柠檬酸盐的水平增加。

在一些实施例中，本公开的微生物包括甘油酸脱氢酶[1.1.1.29]中的破坏性突变。甘油酸脱氢酶将乙醛酸盐转化为乙醇酸盐。甘油酸脱氢酶如通过缺失异柠檬酸脱氢酶的破坏使乙醛酸盐的水平增加。

在一些实施例中，本公开的微生物包括乙醇酸脱氢酶[1.1.99.14]中的破坏性突变。乙醇酸脱氢酶将乙醛酸盐转化为乙醇酸盐。乙醇酸脱氢酶如通过缺失乙醇酸脱氢酶的破坏使乙醛酸盐的水平增加。

在一些实施例中，本公开的微生物包括在醛铁氧还蛋白氧化还原酶[1.2.7.5]中的破坏性突变。醛铁氧还蛋白氧化还原酶将乙醇酸盐转化为乙醇醛。醛铁氧还蛋白氧化还原酶如通过缺失醛铁氧还蛋白氧化还原酶的破坏使乙醇酸盐的水平增加。

在一些实施例中，本公开的微生物包括醛脱氢酶[1.2.1.3/1.2.3.4/1.2.3.5]中的破坏性突变。乙醛脱氢酶将乙醇酸盐转化为乙醇醛。醛脱氢酶如通过缺失醛脱氢酶的破坏使乙醇酸盐的水平增加。

破坏性突变的引入导致本公开的微生物不产生目标产物或基本上不产生目标产物，或者与衍生出本公开的微生物的亲本微生物相比目标产物的量减少。举例来说，本公开的微生物可能不产生目标产物，或者可能产生比亲本微生物少至少约1％、3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的目标产物。举例来说，本公开的微生物可能产生小于约0.001、0.01、0.10、0.30、0.50或1.0g/L的目标产物。

尽管本文提供了酶的示例性序列和来源，但本公开决不局限于这些序列和来源，本公开还涵盖变体。术语“变体”包含序列不同于参考核酸和蛋白质序列的核酸和蛋白质，如现有技术中公开的或本文举例说明的参考核酸和蛋白质序列。本公开可以使用执行与参考核酸或蛋白质基本相同的功能的变体核酸或蛋白质实践。例如，变体蛋白质可以进行与参考蛋白质基本上相同的功能或催化与参考蛋白质基本上相同的反应。变体基因可以编码与参考基因相同或基本上相同的蛋白质。变体启动子可以具有与参考启动子基本上相同的能力来促进一种或多种基因的表达。

此类核酸或蛋白质在本文中可称为“功能等效变体”。举例来说，核酸的功能等效变体可以包含等位基因变体、基因片段、突变基因、多态性等。来自其它微生物的同源基因也是功能等效变体的实例。这些基因包含如丙酮丁醇梭菌、贝氏梭菌或永达尔梭菌等物种的同源基因，其详细信息可在如Genbank或NCBI等网站上公开获得。功能等效变体还包含其序列由于特定微生物的密码子优化而变化的核酸。核酸的功能等效变体与参考的核酸优选地将具有至少大约70％、大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约98％或更高的核酸序列同一性(同源性百分比)。蛋白质的功能等效变体与参考的蛋白质优选地将具有至少大约70％、大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约98％或更高的氨基酸同一性(同源性百分比)。可以使用本领域已知的任何方法评估变体核酸或蛋白质的功能等效性。

“互补性”是指一个核酸通过传统的沃森-克里克(Watson-Crick)或其它非传统类型与另一核酸序列形成一个或多个氢键的能力。互补性百分比表示核酸分子中能够与第二个核酸序列形成氢键(例如沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10个中有5个、6个、7个、8个、9个、10个是50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完全互补”是指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数量的连续残基氢键结合。如本文所用，“基本上互补”是指8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸的区结构域内互补程度为至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％，或指在严格条件下杂交的两种核酸。

“杂交”是指一种一个或多个多核苷酸反应形成通过在核苷酸残基碱基之间进行氢键结合稳定的复合物的反应。氢键合可以通过沃森克里克碱基配对(Watson Crick basepairing)、胡格斯坦结合(Hoogstein binding)或任何其它序列特异性方式发生。复合物可以包括形成双链结构的两条链、形成多链复合物的三条或多条链、单个自杂交链或这些的任意组合。杂交反应可以构成更广泛工艺(如启动PCR，或用酶切割多核苷酸)中的一个步骤。能够与给定序列杂交的序列称为给定序列的“互补序列”。

可以使用本领域已知的任何方法将核酸递送到公开的微生物。例如，核酸可以以裸露的核酸形式递送，或者可以与一种或多种试剂(如脂质体)一起调配。适当时，核酸可以是DNA、RNA、cDNA或其组合。在某些实施例中可以使用限制性抑制剂。另外的载体可以包含质粒、病毒、噬菌体、粘粒和人工染色体。在一优选实施例中，使用质粒将核酸递送到本公开的微生物。举例来说，转化(包含转导或转染)可以通过电穿孔、超声波处理、聚乙二醇介导的转化、化学或天然感受态、原生质体转化、前噬菌体诱导或缀合来实现。在具有活性限制酶系统的某些实施例中，可能有必要在将核酸引入微生物中之前使核酸甲基化。

此外，可以将核酸设计成包括调控元件(如启动子)以增加或以其它方式控制特定核酸的表达。启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。理想地，启动子是伍德-永达尔通路启动子、铁氧还蛋白启动子、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合操纵子启动子、ATP合酶操纵子启动子或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。

应当理解，本公开可以使用其序列与本文具体例示的序列不同的核酸来实施，条件是所述核酸执行基本上相同的功能。对于编码蛋白质或肽的核酸序列，这意味着经编码的蛋白质或肽具有基本上相同的功能。对于表示启动子序列的核酸序列，变体序列将能够促进一种或多种基因的表达。此类核酸在本文中可以被称为“功能等效变体”。举例来说，核酸的功能等效变体包含等位基因变体、基因的片段、包含突变(缺失、插入、核苷酸取代等)的基因和/或多态性等。来自其它微生物的同源基因也可以被视为是本文具体例示的序列的功能等效变体的实例。

这些同源基因包含如永达尔梭菌、嗜热光全绿丝菌(Chloroflexusaurantiacus)、嗜酸热古菌(Metallosphaera)或硫化叶菌(Sulfolobus)的物种中的同源基因，其详细信息可在如Genbank或NCBI的网站上公开获得。短语“功能等效变体”还应包含其序列由于特定生物体的密码子优化而变化的核酸。本文的核酸的“功能等效变体”与所标识的核酸将优选地具有至少大约70％、优选地大约80％、更优选地大约85％、优选地大约90％、优选地大约95％或更高的核酸序列同一性。

还应当理解，本公开可以使用其序列不同于本文具体例示的氨基酸序列的多肽来实施。这些变体在本文中可以被称为“功能等效变体”。蛋白质或肽的功能等效变体包含与所标识的蛋白质或肽共享至少40％、优选地50％、优选地60％、优选地70％、优选地75％、优选地80％、优选地85％、优选地90％、优选地95％或更高的氨基酸同一性的那些蛋白质或肽并且与所关注的肽或蛋白质具有基本上相同的功能。此类变体在其范围内包含蛋白质或肽的片段，其中所述片段包括截短形式的多肽，其中缺失可以为1个到5个、到10个、到15个、到20个、到25个氨基酸，并且可以在多肽的任一末端从残基1到25延伸，并且其中缺失可以是区域内的任何长度；或者可以在内部位置。本文的特定多肽的功能等效变体还应被视为包含由其它细菌物种中的同源基因表达的多肽，例如上一段中所例示的。

可以使用本领域已知的用于产生重组微生物的任何数量的技术，由亲本微生物和一种或多种外源核酸制备本公开的微生物。举例来说，转化(包含转导或转染)可以通过电穿孔、超声处理、聚乙二醇介导的转化、化学或天然感受态或缀合来实现。合适的转化技术例如在Sambrook J、Fritsch EF、Maniatis T：《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:Alaboratory Manual)》冷泉港冷泉港出版社(Cold Spring Harbour LaboratoryPress,Cold Spring Harbour),1989中描述。

在某些实施例中，由于在要转化的微生物中有活性的限制系统，需要将要引入到微生物中的核酸甲基化。这可以使用多种技术来完成，包含以下描述的那些技术，并且进一步在下文的实例部分中例示。

举例来说，在一个实施例中，本公开的重组微生物通过包括以下步骤的方法产生：将如本文所述的表达构建体/载体的(i)和(ii)包括甲基转移酶基因的甲基化构建体/载体引入到穿梭微生物(shuttle microorganism)中；表达甲基转移酶基因；从穿梭微生物中分离一种或多种构建体/载体；以及将一种或多种构建体/载体引入到目的微生物中。

在一个实施例中，步骤B的甲基转移酶基因被组成型地表达。在另一实施例中，步骤B的甲基转移酶基因的表达被诱导。

穿梭微生物是促进构成表达构建体/载体的核酸序列甲基化的微生物，优选地限制阴性微生物。在一具体实施例中，穿梭微生物是限制阴性大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。

甲基化构建体/载体包括编码甲基转移酶的核酸序列。

一旦表达构建体/载体和甲基化构建体/载体被引入到穿梭微生物中，存在于甲基化构建体/载体上的甲基转移酶基因就会被诱导。诱导可以通过任何合适的启动子系统进行，但是在本公开的一个特定实施例中，甲基化构建体/载体包括诱导型lac启动子并且通过添加乳糖或其类似物，更优选地异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导。其它合适的启动子包含ara、tet或T7系统。在本公开的另外的实施例中，甲基化构建体/载体启动子是组成型启动子。

在一具体实施例中，甲基化构建体/载体具有对穿梭微生物的身份有特异性的复制起点，使得甲基化构建体/载体上存在的任何基因在穿梭微生物中进行表达。优选地，表达构建体/载体具有对目的微生物的身份具有特异性的复制起点，使得表达构建体/载体上存在的任何基因在目的微生物中进行表达。

甲基转移酶的表达引起表达构建体/载体上存在的基因甲基化。表达构建体/载体然后可以根据多种已知方法中的任何一种方法从穿梭微生物中分离。仅通过实例，可以使用下文描述的实例部分中描述的方法来分离表达构建体/载体。

在一个具体实施例中，构建体/载体两者并行分离。

表达构建体/载体可以使用任何多种已知方法引入到目的微生物中。然而，举例来说，可以使用下文的实例部分中描述的方法。由于表达构建体/载体被甲基化，因此表达构建体/载体上存在的核酸序列能够掺入到目的微生物中并且成功表达。

设想了可以将甲基转移酶基因引入到穿梭微生物中并过表达。因此，在一个实施例中，所得甲基转移酶可以使用已知方法收集并且在体外使用以使表达质粒甲基化。表达构建体/载体然后可以被引入到目的微生物中以进行表达。在另一实施例中，将甲基转移酶基因引入到穿梭微生物的基因组中，然后将表达构建体/载体引入到穿梭微生物，从穿梭微生物中分离一种或多种构建体/载体，并且然后将表达构建体/载体进入到目的微生物中。

设想了如以上定义的表达构建体/载体和甲基化构建体/载体可以组合以提供物质的组合物。这种组合物在规避限制性屏障机制以产生本公开的重组微生物方面具有特别的效用。

在一个具体实施例中，表达构建体/载体和/或甲基化构建体/载体为质粒。

本领域的普通技术人员将理解用于产生本公开的微生物的许多合适的甲基转移酶。然而，举例来说，可以使用枯草芽孢杆菌噬菌体ΦT1甲基转移酶和下文的实例中描述的甲基转移酶。考虑到所需甲基转移酶的序列和遗传密码，将容易理解编码合适甲基转移酶的核酸。

可以使用任何数量的适于允许甲基转移酶基因表达的构建体/载体以产生甲基化构建体/载体。

在一个实施例中，底物包括CO。在一个实施例中，底物包括CO2和CO。在另一实施例中，底物包括CO2和H2。在另一实施例中，底物包含CO2和CO和H2。

“底物”是指本公开的微生物的碳源和/或能量源。通常，底物是气态的并且包括C1碳源，例如CO、CO₂和/或CH₄。优选地，底物包括CO或CO+CO₂的C1碳源。底物可以进一步包括其它非碳组分，如H₂、N₂或电子。然而，在其它实施例中，底物可以是碳水化合物(如糖、淀粉、纤维、木质素、纤维素或半纤维素或其组合)。例如，碳水化合物可以是果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、木糖或其的一些组合。在一些实施例中，底物不包括(D)-木糖(Alkim,《微生物细胞工厂》,14:127,2015)。在一些实施例中，底物不包括戊糖，如木糖(Pereira,《代谢工程》,34:80-87,2016)。在一些实施例中，底物可以包括气态底物和碳水化合物底物(混合营养发酵)。底物可以进一步包括其它非碳组分，如H₂、N₂或电子。

所述气态底物通常包括至少某种量的CO，如约1mol％、2mol％、5mol％、10mol％、20mol％、30mol％、40mol％、50mol％、60mol％、70mol％、80mol％、90mol％或100mol％的CO。气态底物可以包括一定范围的CO，如约20-80mol％、30-70mol％或40-60mol％的CO。优选地，气态底物包括约40-70mol％的CO(例如，钢厂或高炉气)、约20-30mol％的CO(例如，碱性氧气炉气)或约15-45mol％的CO(例如，合成气)。在一些实施例中，气态底物可以包含相对较低量的CO，如约1-10mol％或1-20mol％的CO。本公开的微生物通常将底物中的CO的至少一部分转化为气态底物。在一些实施例中，气态底物不包括或基本上不包括(<1mol％)CO。

气态底物可以包括一定量的H₂。举例来说，气态底物可以包括约1mol％、2mol％、5mol％、10mol％、15mol％、20mol％或30mol％的H₂。在一些实施例中，气态底物可以包括相对较高量的H₂，如约60mol％、70mol％、80mol％或90mol％的H₂。在其它实施例中，气态底物不包括或基本上不包括(<1mol％)H₂。

气态底物可以包括一定量的CO₂。举例来说，气态底物可以包括约1-80mol％或1-30mol％的CO₂。在一些实施例中，气态底物可以包括小于约20mol％、15mol％、10mol％或5mol％的CO₂。在一些实施例中，气态底物不包括或基本上不包括(<1mol％)CO₂。

气态底物也可以以替代形式提供。例如，气态底物可以溶解在液体中或吸附在固体载体上。

气态底物和/或C1碳源可以是作为工业过程的副产物或从一些其它来源获得的废气，例如来自汽车废气或生物质气化。在某些实施例中，所述工业过程选自由以下组成的组：黑色金属产品制造(如钢厂制造)、有色金属产品制造、石油精炼、煤气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭生产。在这些实施例中，气态底物和/或C1碳源可在其被排放到大气中之前使用任何适宜方法从工业工艺中采集。

气态底物和/或C1碳源可以是合成气，如通过煤炭或精炼残余物的气化、生物质或木质纤维素材料的气化或天然气的重整获得的合成气。在另一实施例中，合成气可以从市政固体废物或工业固体废物的气化中获得。

底物和/或C1碳源可以是作为工业过程的副产物获得的废气或来自另一种来源的废气，如汽车排烟、生物气或填埋气、直接空气捕获或来自电解的废气。底物和/或C1碳源可以是通过热解、焙干或气化生成的合成气。换言之，废物材料中峰碳可以通过热解、焙干或气化而再循环，以产生用作底物和/或C1碳源的合成气。底物和/或C1碳源可以是包括甲烷的气体。

在某些实施例中，工业过程选自黑色金属产物制造，如钢铁制造、有色金属产物制造、石油精炼、电力生产、炭黑生产、纸和纸浆制造、氨生产、甲醇生产、焦炭制造、石化生产、碳水化合物发酵、水泥制造、好氧消化、厌氧消化、催化工艺、天然气提取、纤维素发酵、油提取、地质油藏、来自如天然气煤和石油等化石资源的气体或其任何组合。工业过程内的特定处理步骤的实例包含催化剂再生、流体催化剂裂化和催化剂再生。空气分离和直接空气捕获是其它合适的工业过程。钢铁和铁合金制造中的具体实例包含高炉煤气、碱性氧气炉煤气、焦炉煤气、铁炉炉顶煤气的直接还原和来自冶铁的残余气体。在这些实施例中，可以使用任何已知方法从工业过程中捕获底物和/或C1碳源，然后将其排放到大气中。

底物和/或C1碳源可以是被称为合成气的合成气体，其可以从重整、部分氧化或气化过程中获得。气化过程的实例包含煤的气化、炼油厂残渣的气化、石油焦的气化、生物质的气化、木质纤维素材料的气化、废木材的气化、黑液的气化、城市固体废物的气化、城市液体废物的气化、工业固体废物气化、工业液体废物气化、垃圾来源的燃料的气化、下水的气化、下水道污泥的气化、来自废水处理的污泥的气化、生物气的气化。重整过程的实例包含蒸汽甲烷重整、蒸汽石脑油重整、天然气重整、生物气重整、填埋气重整、石脑油重整和干甲烷重整。部分氧化过程的实例包含热和催化部分氧化过程、天然气的催化部分氧化、烃的部分氧化。城市固体废物的实例包含如鞋、服装和纺织品中的轮胎、塑料、纤维。城市固体废物可能只是填埋型废物。城市固体废物可以是经分类的或未经分类的。生物质的实例可以包含木质纤维素材料，并且还可以包含微生物生物质。木质纤维素材料可以包含农业废物和森林废物。

底物和/或C1碳源可以是包括甲烷的气体流。这种含甲烷的气体可以从化石甲烷排放，如在压裂、废水处理、牲畜、农业和城市固体废物填埋期间中获得。还设想了可以燃烧甲烷以产生电或热，并且C1副产物可以用作底物或碳源。

气态底物的组成可能对反应的效率和/或成本有显著影响。例如，氧气(O₂)的存在可能会降低厌氧发酵过程的效率。取决于底物的组成，可能需要处理、擦洗或过滤所述底物以除去任何不期望的杂质(如毒素、不期望的组分或灰尘颗粒)和/或增加期望组分的浓度。

在某些实施例中，在不存在碳水化合物底物(如糖、淀粉、木质素、纤维素或半纤维素)的情况下执行发酵。

在一些实施例中，CO和H₂到乙二醇(MEG)的总能量学优于从葡萄糖到乙二醇的总能量学，如下所示，其中CO和H₂的吉布斯自由能(Gibbs free energy)ΔrG'm值越负，表明对乙二醇的驱动力越大。对作为底物的葡萄糖与CO的比较的总反应δG的计算是使用平衡仪(http://equilibrator.weizmann.ac.il/)进行的，平衡仪是用于评估生物系统中通路或通路中的单个步骤的总体可行性的标准方法(Flamholz、E.Noor、A.Bar-Even、R.Milo(2012),“平衡仪—生化热力学计算器(eQuilibrator-the biochemical thermodynamicscalculator)”,《核酸研究(Nucleic Acids Res)》，40:D770-5Noor、A.Bar-Even、A.Flamholz、Y.Lubling、D.Davidi、R.Milo(2012),“结合准确性和覆盖范围的反应的热力学集成开放框架(An integrated open framework for thermodynamics of reactionsthat combines accuracy and coverage)”,《生物信息学(Bioinformatics)》28:2037-2044；Noor、H.S.Haraldsdóttir、R.Milo、R.M.T.Fleming(2013),“使用分量贡献对吉布斯能量进行一致估计”,《PLoS计算生物学(PLoS Comput Biol)》,9(7):e1003098；Noor、A.Bar-Even、A.Flamholz、E.Reznik、W.Liebermeister、R.Milo(2014),“通路热力学凸显中枢代谢的动力学障碍(Pathway Thermodynamics Highlights Kinetic Obstacles inCentral Metabolism)”，《PLoS计算生物学》,10(2):e1003483)。计算如下：

ΔrG'm-104kJ/mol

ΔrG'm-192kJ/mol

生理条件：

ΔrG'm-70kJ/mol

ΔrG'm-295kJ/mol

除了乙二醇、乙醛酸盐和/或乙醇酸盐之外，本公开的微生物可以被培养以产生一种或多种副-产物。例如，除了2-苯乙醇之外，本公开的微生物还可以产生或还可以被工程化以产生乙醇(WO 2007/117157)、乙酸盐(WO 2007/117157)、1-丁醇(WO 2008/115080、WO2012/053905和WO 2017/066498)、丁酸盐(WO 2008/115080)、2,3-丁二醇(WO 2009/151342和WO 2016/094334)、乳酸盐(WO 2011/112103)、丁烯(WO 2012/024522)、丁二烯(WO 2012/024522)、甲基乙基酮(2-丁酮)(WO 2012/024522和WO 2013/185123)、乙烯(WO 2012/026833)、丙酮(WO 2012/115527)、异丙醇(WO 2012/115527)、脂质(WO 2013/036147)、3-羟基丙酸盐(3-HP)(WO 2013/180581)、包含异戊二烯在内的萜烯(WO 2013/180584)、脂肪酸(WO 2013/191567)、2-丁醇(WO 2013/185123)、1,2-丙二醇(WO 2014/036152)、1-丙醇(WO2017/066498)、1-己醇(WO 2017/066498)、1-辛醇(WO 2017/066498)、分支酸盐衍生的产物(WO 2016/191625)、3-羟基丁酸盐(WO 2017/066498)、1,3-丁二醇(WO 2017/066498)、2-羟基异丁酸盐或2-羟基异丁酸(WO 2017/066498)、异丁烯(WO 2017/066498)、己二酸(WO2017/066498)、1,3-己二醇(WO 2017/066498)、3-甲基-2-丁醇(WO 2017/066498)、2-丁烯-1-醇(WO 2017/066498)、异戊酸盐(WO 2017/066498)、异戊醇(WO 2017/066498)和/或单乙二醇(WO 2019/126400)。在一些实施例中，除了乙二醇，本公开的微生物还产生乙醇、2,3-丁二醇和/或琥珀酸盐。在某些实施例中，微生物生物质本身可以被视为产物。这些产物可以被进一步转化，以产生柴油、喷气燃料和/或汽油的至少一种组分。在某些实施例中，可以将2-苯乙醇用作香精、精油、调味剂和肥皂中的成分。此外，微生物生物质可以通过本领域已知的任何方法或方法的组合进一步处理以产生单细胞蛋白质(SCP)。除一种或多种目标产物外，本公开的微生物还可以产生乙醇、乙酸盐和/或2,3-丁二醇。

“天然产物”是由未经基因修饰的微生物产生的产物。例如，乙醇、乙酸盐和2,3-丁二醇是产乙醇梭菌、永达尔梭菌和拉氏梭菌的天然产物。“非天然产物”是由经基因修饰的微生物产生的产物，而不是由衍生出经基因修饰的微生物的未经基因修饰的微生物产生的产物。众所周知，乙二醇不是由任何天然存在的微生物产生的，因此其是所有微生物的非天然产物。

“选择率”是指目标产物的产量与微生物所产生的全部发酵产物的产量的比率。本公开的微生物可以被工程化以便以特定选择率或最小选择率产生产物。在一个实施例中，如乙二醇等目标产物占由本公开的微生物产生的所有发酵产物的至少约5％、10％、15％、20％、30％、50％或75％。在一个实施例中，乙二醇占由本公开的微生物产生的全部发酵产物的至少10％，使得本公开的微生物的乙二醇的选择率为至少10％。在另一实施例中，乙二醇占由本公开的微生物产生的全部发酵产物的至少30％，使得本公开的微生物的乙二醇的选择率为至少30％。

一种或多种发酵产物中的至少一种可以是通过培养物产生的生物质。微生物生物质的至少一部分可以被转化成单细胞蛋白质(SCP)。可以利用单细胞蛋白质的至少一部分作为动物饲料的组分。

在一个实施例中，本公开提供了一种动物饲料，其包括微生物生物质和至少一种赋形剂，其中微生物生物质包括在包括CO、CO2和H2中的一种或多种的气态底物上生长的微生物。

“单细胞蛋白质”(SCP)是指可以用于富含蛋白质的人和/或动物饲料，通常置换蛋白质补充剂的常规来源的微生物生物质，如豆粕或鱼粉。为了产生单细胞蛋白质或其它产物，工艺可以包括额外的分离、加工或处理步骤。举例来说，方法可以包括对微生物生物质进行灭菌，对微生物生物质进行离心和/或对微生物生物质进行干燥。在某些实施例中，使用喷雾干燥或桨叶干燥对微生物生物质进行干燥。所述方法还可以包括使用本领域已知的任何方法来降低微生物生物质的核酸含量，因为摄取核酸含量高的饮食可能导致核酸降解产物的累积和/或胃肠不适。单细胞蛋白质可以适合于喂养如牲畜或宠物等动物。特别地，动物饲料可以适合于喂养一种或多种肉牛、奶牛、猪、绵羊、山羊、马、骡、驴、鹿、水牛/野牛、骆马、羊驼、驯鹿、骆驼、白臀野牛、大额牛、牦牛、鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、珍珠鸡、雏鸟/鸽子、鱼、虾、甲壳类动物、猫、狗和啮齿动物。动物饲料的组成可以根据不同动物的营养要求定制。此外，工艺可以包括将微生物生物质与一种或多种赋形剂共混或组合。

“微生物生物质”是指包括微生物细胞的生物材料。举例来说，微生物生物质可以包括细菌、古菌、病毒或真菌的纯培养物或基本上纯的培养物或由其组成。当最初从发酵培养液中分离时，微生物生物质通常含有大量的水。可通过对微生物生物质进行干燥或加工来去除或减少这种水。

“赋形剂”可以指代可以添加到微生物生物质中以增强或改变动物饲料的形式、性质或营养含量的任何物质。举例来说，赋形剂可包括以下中的一个或多个：碳水化合物、纤维、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质、水、调味剂、甜味剂、抗氧化剂、酶、防腐剂、益生菌或抗生素。在一些实施例中，赋形剂可以是干草、稻草、青贮饲料、谷物、油或脂肪或其它植物材料。赋形剂可以是在Chiba,第18节：“饮食配料和普通饲料原料(Diet Formulation andCommon Feed Ingredients)”,动物营养手册(Animal Nutrition Handbook),第3次修订版,第575-633页,2014中鉴定的任何饲料原料。

“生物聚合物”是指由活生物体的细胞产生的天然聚合物。在某些实施例中，生物聚合物是PHA。在某些实施例中，生物聚合物是PHB。

“生物塑料”是指由可再生生物质来源产生的塑料材料。生物塑料可以由可再生资源产生，如植物脂肪和油、玉米淀粉、稻草、木片、锯末或回收的食物垃圾。

在本文中，提及酸(例如，乙酸或2-羟基异丁酸)应被理解为也包含对应的盐(例如，乙酸盐或2-羟基异丁酸盐)。

通常，在生物反应器中进行培养。术语“生物反应器”包含由一个或多个容器、塔或管路布置组成的培养/发酵装置，如连续搅拌槽反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、气泡柱、气升式发酵器、静态混合器或适合气液接触的其它容器或其它装置。在一些实施例中，生物反应器可以包括第一生长反应器和第二培养/发酵反应器。可以向这些反应器中的一个或两个反应器提供底物。如本文所用，术语“培养”和“发酵”可互换使用。这些术语涵盖培养/发酵工艺的生长阶段和产物生物合成阶段两个。

培养通常在含有足以允许微生物生长的营养素、维生素和/或矿物质的水性培养基中维持。优选地，水性培养基是厌氧微生物生长培养基，如基本厌氧微生物生长培养基。合适的培养基是所属领域中众所周知的。

培养/发酵应该理想地在产生乙二醇的适当条件下进行。通常，培养/发酵在厌氧条件下进行。要考虑的反应条件包括压力(或分压)、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电势、搅拌速率(如果使用连续搅拌槽反应器)、接种物水平、确保液相中的气体不会变成限制因素的最大气体底物浓度和避免产物抑制的最大产物浓度。具体来说，可以控制底物的引入速率来确保液相中的气体的浓度不会变成限制因素，因为在气体限制条件下培养会消耗产物。

在高压下操作生物反应器允许增加气体从气相到液相的传质速率。因此，在高于大气压的压力下执行培养/发酵通常是优选的。同样，由于给定气体转化率部分地为底物保留时间的函数并且保留时间指示生物反应器的所需体积，所以使用加压系统可以大大减小所需生物反应器的体积，并且因此降低培养/发酵设备的资金成本。这又意味着当在高压而不是大气压下维持生物反应器时，能够缩短保留时间，保留时间被定义为是生物反应器中的液体体积除以输入气体流速。最优反应条件将部分取决于所使用的特定微生物。然而，一般来说，在高于大气压的压力下操作发酵为优选的。同样，由于给定气体转化率部分地为底物保留时间的函数并且实现期望的保留时间进而指示生物反应器的所需体积，所以使用加压系统可以大大减小所需生物反应器的体积，并且因此降低发酵设备的资金成本。

在某些实施例中，发酵在没有光的情况下或在存在不足以满足光合微生物的能量需求的光量的情况下进行。在某些实施例中，本公开的微生物是非光合微生物。

可使用任何方法或技术领域中已知的方法的组合从发酵培养液中分离或纯化目标产物，所述方法包含例如分馏、蒸发、渗透蒸发、气体剥离、相分离和萃取发酵，包含例如液-液萃取。在某些实施例中，目标产物通过以下从发酵液中回收：从生物反应器中不断去除发酵液的一部分、从发酵液分离微生物细胞(宜通过过滤)以及从发酵液中回收一种或多种目标产物。醇和/或丙酮可以例如通过蒸馏回收。可以例如通过吸附于活性炭来回收酸。分离的微生物细胞优选地返回到生物反应器中。去除目标产物之后残留的游离渗透物也优选地返回到生物反应器中。可以在游离渗透物返回到生物反应器中之前向其中添加另外的营养素(如维生素B)来补充培养基。纯化技术可以包含亲和标签纯化(例如，His、Twin-Strep和FLAG)、基于珠粒的系统、基于尖端的方法和用于更大规模自动化纯化的FPLC系统。还公开了不依赖亲和标签的纯化方法(例如盐析、离子交换和尺寸排阻)。

本公开的方法可以进一步包括从发酵液中分离乙二醇。可以使用本领域已知的任何方法或方法组合从发酵液中分离或纯化乙二醇，包含例如蒸馏、模拟移动床过程、膜处理、蒸发、渗透蒸发、气提、相分离、离子交换或萃取发酵(包含例如液-液萃取)。在一个实施例中，乙二醇可以使用反渗透和/或渗透蒸发从发酵液中浓缩(US 5,552,023)。可以通过蒸馏除去水，然后可以使用蒸馏或真空蒸馏回收底部产物(含有高比例的乙二醇)，以产生高纯度的乙二醇流。可替代地，在通过反渗透和/或渗透蒸发浓缩或不浓缩的情况下，乙二醇可以通过与醛的反应蒸馏(Atul,《化学工程学(Chem Eng Sci)》,59:2881-2890,2004)或使用烃的共沸蒸馏(US2,218,234)进一步纯化。在另一种方法中，乙二醇可以从水性溶液中捕集在活性炭或聚合物吸收剂(使用或不使用反渗透和/或渗透蒸发)上，并使用低沸点有机溶剂回收(Chinn,“通过可再生吸附到活性炭上从稀水溶液中回收乙二醇、糖和相关的多OH化合物(Recovery of Glycols,Sugars,and Related Multiple-OH Compounds fromDilute-Aqueous Solution by Regenerable Adsorption onto Activated Carbons)”,加利福尼亚大学伯克利分校(University of California Berkeley),1999)。然后可以通过蒸馏从有机溶剂中回收乙二醇。在某些实施例中，通过从生物反应器中连续去除发酵液的一部分、从发酵液中分离微生物细胞(宜通过过滤)、并从发酵液中回收乙二醇从发酵液中回收乙二醇。还可以从发酵液中分离或纯化出副产物(如醇或酸)。可以例如通过蒸馏回收醇。可以例如通过吸附于活性炭来回收酸。在某些实施例中，可将分离的微生物细胞返回生物反应器。去除目标产物后剩余的无细胞渗透物也优选全部或部分返回生物反应器。可以在游离渗透物返回到生物反应器中之前向其中添加另外的营养素(如维生素B)来补充培养基。

已证明有多种从含水介质中回收二醇的方法。已使用模拟移动床(SMB)技术从乙醇和相关含氧化合物的含水混合物中回收2,3-丁二醇(美国专利8,658.845)。反应性分离也被证明能有效回收二醇。在一些实施例中，通过含二醇物流与醛的反应、二醇的分馏和再生、最终分馏以回收浓缩的二醇物流来进行乙二醇的回收。参见例如美国专利7,951,980。

本公开提供了包括由微生物并且根据本文所述方法产生的乙二醇的组合物。例如，包括乙二醇的组合物可以是防冻剂、防腐剂、脱水剂或钻井液。

本公开还提供了包括由微生物并且根据本文所述方法产生的乙二醇的聚合物。这种聚合物可以是例如均聚物，如聚乙二醇或共聚物(如聚对苯二甲酸乙二酯)。这些聚合物的合成方法在本领域中是众所周知的。参见例如Herzberger等人,《化学评论(ChemRev.)》,116(4):2170-2243(2016)和Xiao等人,《工业与工程化学研究(Ind Eng ChemRes.)》,54(22):5862-5869(2015)。

本公开进一步提供了包括聚合物的组合物，所述聚合物包括由微生物并且根据本文所述方法产生的乙二醇。例如，所述组合物可以是纤维、树脂、薄膜或塑料。

一个实施例涉及一种能够由气态底物产生乙二醇或乙二醇前体的经基因工程化的微生物，所述经基因工程化的微生物包括：编码二醇脱水酶的基因中的破坏性突变。

根据实施例所述的微生物，其中所述微生物通过一种或多种中间体产生乙二醇或所述乙二醇前体，所述一种或多种中间体选自由以下组成的组：5,10-亚甲基四氢叶酸盐、草酰乙酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐和甘氨酸。

根据实施例所述的微生物，其中所述微生物包括以下中的一种或多种：

a.编码能够将草酰乙酸盐转化为柠檬酸盐的异源酶的核酸；

b.编码能够将甘氨酸转化为乙醛酸盐的异源酶的核酸；

c.编码能够将异柠檬酸盐转化为乙醛酸盐的异源酶的核酸；以及

d.编码能够将乙醇酸盐转化为乙醇醛的异源酶的核酸。

根据实施例所述的微生物，其中：

a.所述能够将草酰乙酸盐转化为柠檬酸盐的异源酶为EC编号为2.3.3.1的柠檬酸[Si]-合酶、EC编号为2.3.3.8的ATP柠檬酸合酶；或者EC编号为2.3.3.3的柠檬酸(Re)-合酶；

b.所述能够将甘氨酸转化为乙醛酸盐的异源酶是EC编号为2.6.1.44的丙氨酸-乙醛酸转氨酶、EC编号为2.6.1.45的丝氨酸-乙醛酸转氨酶、EC编号为2.6.1.51的丝氨酸-丙酮酸转氨酶、EC编号为2.6.1.35的甘氨酸-草酰乙酸转氨酶、EC编号为2.6.1.4的甘氨酸转氨酶、EC编号为1.4.1.10的甘氨酸脱氢酶、EC编号为1.4.1.1的丙氨酸脱氢酶或EC编号为1.4.2.1的甘氨酸脱氢酶；

c.所述能够将异柠檬酸盐转化为乙醛酸盐的异源酶是EC编号为4.1.3.1的异柠檬酸裂解酶；和/或

d.所述能够将乙醇酸盐转化为乙醇醛的异源酶是EC编号为1.2.1.21的乙醇醛脱氢酶、EC编号为1.2.1.22的乳醛脱氢酶、EC编号为1.2.1.24的琥珀酸-半醛脱氢酶、EC编号为1.2.1.26的2,5-二氧戊酸脱氢酶、EC编号为1.2.1.3/4/5的醛脱氢酶、EC编号为1.2.1.8的甜菜碱-醛脱氢酶或EC编号为1.2.7.5的醛铁氧还蛋白氧化还原酶。

根据实施例所述的微生物，其中所述异源酶中的一种或多种异源酶衍生自选自由以下组成的组的属：芽孢杆菌属、梭状芽胞杆菌属、埃希氏菌属、葡糖杆菌属、生丝微菌属、赖氨酸芽胞杆菌属)、类芽孢杆菌属、假单胞菌属、栖沉积物菌属、芽孢八叠球菌属、链霉菌属、热硫杆状菌属、热袍菌属、铜杆菌属和玉蜀黍属。

根据实施例所述的微生物，其中所述异源酶中的一种或多种异源酶被密码子优化以在所述微生物中表达。

根据实施例所述的微生物，其中所述微生物进一步包括以下中的一种或多种：能够将乙酰辅酶A转化为丙酮酸盐的酶；能够将丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐的酶；能够将丙酮酸盐转化为苹果酸盐的酶；能够将丙酮酸盐转化为磷酸烯醇丙酮酸盐的酶；能够将草酰乙酸盐转化为柠檬酰辅酶A的酶；能够将柠檬酰辅酶A转化为柠檬酸盐的酶；能够将柠檬酸盐转化为乌头酸盐并将乌头酸盐转化为异柠檬酸盐的酶；能够将磷酸烯醇丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐的酶；能够将磷酸烯醇丙酮酸盐转化为2-磷酸-D-甘油酸盐的酶；能够将2-磷酸-D-甘油酸盐转化为3-磷酸-D-甘油酸盐的酶；能够将3-磷酸-D-甘油酸盐转化为3-膦酰氧基丙酮酸盐的酶；能够将3-膦酰氧基丙酮酸盐转化为3-磷酸-L-丝氨酸的酶；能够将3-磷酸-L-丝氨酸转化为丝氨酸的酶；能够将丝氨酸转化为甘氨酸的酶；能够将5,10-亚甲基四氢叶酸盐转化为甘氨酸的酶；能够将丝氨酸转化为羟基丙酮酸盐的酶；能够将D-甘油酸盐转化为羟基丙酮酸盐的酶；能够将苹果酸盐转化为乙醛酸盐的酶；能够将乙醛酸盐转化为乙醇酸盐的酶；能够将羟基丙酮酸盐转化为乙醇醛的酶；以及能够将乙醇醛转化为乙二醇的酶。

根据实施例所述的微生物，其中所述微生物过表达以下：

a.所述能够将草酰乙酸盐转化为柠檬酸盐的异源酶；

b.所述能够将甘氨酸转化为乙醛酸盐的异源酶；和/或

c.所述能够将乙醇酸盐转化为乙醇醛的异源酶。

根据实施例所述的微生物，其中所述微生物过表达以下：

a.所述能够将丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐的酶；

b.所述能够将柠檬酸盐转化为乌头酸盐并将乌头酸盐转化为异柠檬酸盐的酶；

c.所述能够将磷酸烯醇丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐的酶；

d.所述能够将丝氨酸转化为甘氨酸的酶；

e.所述能够将5,10-亚甲基四氢叶酸盐转化为甘氨酸的酶；

f.所述能够将乙醛酸盐转化为乙醇酸盐的酶；和/或

g.所述能够将乙醇醛转化为乙二醇的酶。

根据实施例所述的微生物，其中所述微生物进一步包括以下中的一种或多种中的破坏性突变：异柠檬酸脱氢酶、甘油酸脱氢酶、乙醇酸脱氢酶、甘油酸脱氢酶、乙醇酸脱氢酶、醛铁氧还蛋白氧化还原酶和醛脱氢酶。

根据实施例所述的微生物，其中所述微生物是选自由以下组成的组的属的成员：醋酸杆菌属、嗜碱菌属、布劳特氏菌属、丁酸杆菌属、梭菌属、铜杆菌属、真杆菌属、穆尔氏菌属、产醋杆菌属、鼠孢菌属和嗜热厌氧杆菌属。

根据实施例所述的微生物，其中所述微生物衍生自亲本微生物，所述亲本微生物选自由以下组成的组：伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、产生布劳特氏菌、甲基营养丁酸杆菌、醋酸梭菌、产乙醇梭菌、嗜一氧化碳梭菌、科斯卡塔梭菌、德氏梭菌、甲酸乙酸梭菌、永达尔梭菌、马氏梭菌、拉氏梭菌、粪味梭菌、钩虫贪铜菌、粘液真杆菌、热自养穆尔氏菌、热醋穆尔氏菌、普氏产醋杆菌、卵形鼠孢菌、森林土壤醋酸鼠孢菌、球形鼠孢菌和凯伍热厌氧杆菌。

根据实施例所述的微生物，其中所述微生物衍生自选自由以下组成的组的亲本细菌：产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌。

根据实施例所述的微生物，其中所述微生物包括天然或异源伍德-永达尔通路。

根据实施例所述的微生物，其中所述乙二醇前体为乙醛酸盐或乙醇酸盐。

另一实施例涉及一种产生乙二醇或乙二醇前体的方法，所述方法包括在存在气态底物的情况下在营养培养基中培养根据权利要求1所述的微生物，由此所述微生物产生乙二醇或所述乙二醇前体。

根据一个实施例所述的方法，其中所述气态底物包括CO、CO₂和H₂中的一种或多种。

根据一个实施例所述的方法，其中所述乙二醇前体为乙醛酸盐或乙醇酸盐。

根据一个实施例所述的方法，其进一步包括从所述营养培养基中分离乙二醇或所述乙二醇前体。

根据一个实施例所述的方法，其中所述微生物进一步产生乙醇、2,3-丁二醇和琥珀酸盐中的一种或多种。

另一实施例涉及一种由气态底物产生聚对苯二甲酸乙二酯(PET)产物的方法，所述方法包括1)形成至少一种PET组分，其中所述至少一种PET组分选自单乙二醇(MEG)、对苯二甲酸(PTA)或其任何组合；2)将所述至少一种PET组分处理为PET；3)聚合所述PET以形成PET树脂；4)将所述PET树脂处理为PET产物。

实例

以下实施例进一步说明本公开，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。

实例1：构建包括枯草芽孢杆菌柠檬酸合酶、大肠杆菌异柠檬酸裂解酶和氧化葡萄糖酸杆菌乙醇醛脱氢酶的异源表达载体以在产乙醇梭菌中从CO和/或CO₂和H₂产生乙二醇。

编码来自枯草芽孢杆菌(citZ；SEQ ID NO:1-2)的柠檬酸合酶、来自大肠杆菌(icl；SEQ ID NO:11-12)的异柠檬酸裂解酶和来自氧化葡萄糖酸杆菌(aldA1；SEQ ID NO:55-56)的乙醇醛脱氢酶的基因是密码子衔接的，并且是合成的以在产乙醇梭菌中表达。使用标准的BsaI金门(golden gate)克隆试剂盒(马萨诸塞州伊普斯威奇新英格兰生物实验室(New England Biolabs,Ipswich,MA))将衔接的基因克隆到表达穿梭载体pIPL12中。pIPL12包括大肠杆菌和产乙醇梭菌的复制起点，使其能够复制并且被维持在两个物种中；pIPL12在大多数梭状芽孢杆菌中也起作用。pIPL12还包括向红霉素/克拉霉素赋予用于阳性选择的抗性的23S rRNA(腺嘌呤(2058)-N(6))-甲基转移酶Erm(B)、用于自大肠杆菌的结合转移的TraJ和用于异源基因的表达的启动子。见图2A。将citZ、icl和aldA1克隆到pIPL12中产生的表达载体在本文中称为pMEG042(图2B)。

表2：用于构建pMEG042表达载体的寡核苷酸。

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通过缀合将pMEG042构建体转化到产乙醇梭菌中。表达载体首先通过标准的热激转化被引入缀合供体菌株大肠杆菌HB101+R702(CA434)(Williams等人，1990)(供体)。将供体细胞在37℃的SOC培养基中恢复1小时，然后铺板到包括100μg/mL壮观霉素和500μg/mL红霉素的LB培养基平板上，并在37℃孵育过夜。第二天，将包含100μg/mL大观霉素和500μg/mL红霉素的5mL LB等分试样与几个供体菌落接种，并在37℃孵育，振荡约4小时或直到培养物明显致密但尚未进入固定相。通过在4000rpm和20-25℃下离心2分钟收获1.5mL供体培养物，弃去上清液。将供体细胞轻轻重悬于500μL无菌PBS缓冲液中，在4000rpm下离心2分钟，弃去PBS上清液。

将沉淀物引入厌氧室，并在产乙醇梭菌培养物(受体)的后期指数阶段轻轻重悬于200μL中。产乙醇梭菌DSM10061和DSM23693(DSM10061的衍生物)从DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心(The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures),德国布伦瑞克(Braunschweig,Germany)38124Inhoffenstraβe 7B)获得。使用标准厌氧技术(Hungate1969；Wolfe 1971)使菌株在37℃下在pH 5.6的PETC培养基(参见美国专利第9,738,875号)中生长。

将缀合混合物(供体和受体细胞的混合物)点样到PETC-MES+果糖琼脂平板上，使其干燥。当斑点不再明显湿润时，将平板引入压力罐中，用合成气(50％ CO、10％ N₂、30％CO₂、10％ H₂)加压至25-30psi，并在37℃下孵育约24小时。然后通过使用10μL接种环温和刮除将接合混合物从平板上移除。将除去的混合物悬浮在200-300μL PETC培养基中。将缀合混合物的100μL等份试样铺板到补充了5μg/mL克拉霉素的PETC培养基琼脂平板上，以选择携带质粒的转化体。

将携带pMEG042质粒的三个不同的产乙醇梭菌菌落接种到2mL含有5μg/mL克拉霉素的PETC-MES培养基中，并在37℃下用50％ CO、10％ N2、30％ CO₂、10％ H2和100rpm的轨道振荡自养生长三天。将培养物用血清瓶中的5μg/mL克拉霉素稀释至OD₆₀₀为0.05(在10mLPETC-MES培养基中)，在37℃下用50％ CO、10％ N₂、30％ CO₂、10％ H2和100rpm轨道振荡自养生长长达20天，每天取样以测量生物量和代谢物(图3A和3B)。使用气相色谱质谱(GC-MS)测量乙二醇的产量，使用高效液相色谱(HPLC)测量其它代谢物，如下所述。

乙二醇浓度用配备有安捷伦(Agilent)VF-WAXms柱(15m×0.25μm×0.25μm)和RSH自动进样器的赛默飞世尔(Thermo Scientific)ISQ LT GCMS测量。通过用200μL甲醇稀释200μL发酵液制备样品。将样品涡旋，然后在14,000rpm下离心3分钟；将200μL上清液转移到带有称垫的玻璃瓶中。将样品转移至自动进样器中，使用1.0μL进样、5比1的分流比和240℃的入口温度进行分析。色谱使用80℃的烤箱程序进行，保持0.5分钟，以10℃/分钟的斜升升至150℃，以25℃/分钟的斜升升至220℃，最后保持3分钟。柱流速为4.0毫升/分钟，保持0.5分钟，然后使用氦气作为载气以100毫升/分钟/分钟的速度降到1.5毫升/分钟。MS离子源保持在260℃，传输线设置为240℃。使用线性外部标准校准进行定量，使用33.0m/z作为定量峰，使用31.0+62.0m/z作为确认峰。

乙醇、乙酸盐、2,3-丁二醇、乙醛酸盐和乙醇酸盐的浓度通过HPLC使用折光率(RI)检测在35℃下在安捷伦1260Infinity LC上测定。样品是通过在80℃下加热5分钟，然后在14,000rpm下离心3分钟制备的；将上清液转移到玻璃瓶中进行分析。在等度条件下使用5mM硫酸流动相在0.7毫升/分钟和35°下将10μL注射液注入到Phenomenex RezexTM ROA-有机酸H+(8％)柱(300mm×7.8mm×8μm)中进行分离。

在大约3天的自养生长后，观察到了乙二醇前体乙醇酸盐，10天后，观察到了乙二醇的产生(图3B)。在自养生长并携带表达载体pMEG042的产乙醇梭菌中随时间推移产生了乙醇酸盐(图3C)。

实例2：构建包括硫牛磺酸栖沉积物菌丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶和荧光假单胞菌醛脱氢酶的异源表达载体以在产乙醇梭菌中由CO和/或CO₂和H₂产生乙二醇。

编码来自硫牛磺酸栖沉积物菌(pucG；SEQ ID NO:15-16)的丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶和来自荧光假单胞菌Q8r1-96(aldA1；SEQ ID NO:57-58)的醛脱氢酶的基因是密码子衔接的，并且是合成的以在产乙醇梭菌中表达。将密码子衔接的基因克隆到pIPL12中(图2A)，并将得到的表达载体pMEG058引入到产乙醇梭菌中，如实例1中所述。参见图2C。

表3：用于构建pMEG058表达载体的寡核苷酸。

将携带pMEG058质粒的两个不同的产乙醇梭菌菌落接种到2mL含有5μg/mL克拉霉素的PETC-MES培养基中，并使其自养生长，如实例1所述。参见图4A。在大约3天的自养生长后，观察到了乙醇酸盐，8天后观察到了乙二醇的产生(图4B)。

实例3：构建包括硫牛磺酸栖沉积物菌丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶和氧化葡萄糖酸杆菌乙醇醛脱氢酶的异源表达载体以在产乙醇梭菌中由CO和/或CO₂和H₂产生乙二醇。

编码来自硫牛磺酸栖沉积物菌(pucG；SEQ ID NO:15-16)的丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶和来自氧化葡萄糖酸杆菌(aldA1；SEQ ID NO:55-56)的乙醇醛脱氢酶的基因是密码子衔接的，并且是合成的以在产乙醇梭菌中表达。将密码子衔接的基因克隆到pIPL12中(图2A)，并将得到的表达载体pMEG059引入到产乙醇梭菌中，如实例1中所述。参见图2D。

表4：用于构建pMEG059表达载体的寡核苷酸。

将携带pMEG059质粒的两个不同的产乙醇梭菌菌落接种到2mL含有5μg/mL克拉霉素的PETC-MES培养基中并使其自养生长，如实例1所述。参见图5A。在大约3天的自养生长后，观察到乙醇酸盐，10天后，观察到了乙二醇的产生(图5B)。

实例4：构建包括硫牛磺酸栖沉积物菌丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶和荧光假单胞菌醛脱氢酶的异源表达载体以在产乙醇梭菌中从CO和/或CO₂和H₂产生乙二醇。

编码来自尿酸梭菌(SgA；SEQ ID NO:19、20)的V类氨基转移酶和来自荧光假单胞菌Q8r1-96(aldA1；SEQ ID NO:57-58)的醛脱氢酶的基因是密码子衔接的，并且是合成的以在产乙醇梭菌中表达。将密码子衔接的基因克隆到pIPL12中(图2A)，并且将所得载体pMEG061引入到产乙醇梭菌中，如实例1中所述。参见图2E。

表5：用于构建pMEG061表达载体的寡核苷酸。

将携带pMEG061质粒的三个不同的产乙醇梭菌菌落接种到2mL含5μg/mL克拉霉素的PETC-MES培养基中，并使其自养生长，如实例1所述。参见图6A。自养生长约3天后，观察到了乙醇酸盐，并且在16天后，观察到了乙二醇的产生(图6B)。

实例5：对获得乙二醇的不同途径的最大产率的建模

利用了产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)的基因组级代谢模型(如Marcellin,《绿色化学(Green Chem)》,18:3020-3028,2016中描述的模型)来预测获得乙二醇的不同途径的最大产量。将异源代谢反应添加到野生型产乙醇梭菌模型结构中，以表示非天然化合物产生通路的结合。尽管本文所述的用于实验工作的模型是基于产乙醇梭菌，但由于代谢相似，因此可以合理地预期结果也适用于其它伍德-永达尔微生物。

如下模拟乙二醇产生：使用基于限制的计算建模技术通量平衡分析(FBA)和代谢调节的线性最小化(LMOMA)(Maia,《GECCO'17遗传和进化计算会议论文集(Proceedings ofthe Genetic and Evolutionary Computation Conference Companion on–GECCO'17)》,纽约州纽约ACM出版社(ACM Press),1661-1668,2017)利用cobrapy版本0.8.2(Ebrahim.,COBRApy：“基于限制的Python重构和分析(COnstraints-Based Reconstruction andAnalysis for Python)”，《BMC系统生物学(BMC Syst Biol)》,7:74,2013)模拟乙二醇产生，并且使用optlang版本1.2.3(Jensen，Optlang：“用于数学优化的代数建模语言(Algebraic Modeling Language for Mathematical Optimization)”，《开源软件杂志(The Journal of Open Source Software)》,2,doi:10.21105/joss.00139,2017)作为求解器接口，使用Gurobi Optimizer版本7.0.2作为优化求解器。

模拟显示，通过本文实例1-4中所述的通路获得的预测产率为0.37mol乙二醇/molCO。这是Islam等人(《代谢工程(Metab Eng)》,41:173-181 2017)描述的需要糖异生的假设通路的预测产量的两倍以上，发现最高的预测产量为约0.44g乙二醇/g CO，等于约0.18mol乙二醇/mol CO。

实例6：乙二醇产生和二醇脱水酶敲除

产乙醇梭菌的两种不同基因型的生物质水平(g干细胞重量/L)：一种基因型含有所标识的天然二醇脱水酶(基础)，并且一种基因型的二醇脱水酶基因缺失(KO)。每种菌株具有两种变体，一种变体携带pMEG042表达载体，并且一种变体不携带载体(阴性对照)。示出的值是根据3次技术重复的平均值计算的。参见图7。在产乙醇梭菌的两种不同基因型中随时间推移产生的乙二醇(mg/L)：一种基因型含有所标识的天然二醇脱水酶(基础)，并且一种基因型的二醇脱水酶基因缺失(KO)。每种菌株具有两种变体，一种变体携带pMEG042表达载体，并且一种变体不携带载体(阴性对照)。示出的值是根据3次技术重复的平均值计算的。参见图8A。在产乙醇梭菌的两种不同基因型中随时间推移产生的乙二醇(mg/L/g干细胞重量)：一种基因型含有所标识的天然二醇脱水酶(基础)，并且一种基因型的二醇脱水酶基因缺失(KO)。每种菌株具有两种变体，一种变体携带pMEG042表达载体，并且一种变体不携带载体(阴性对照)。示出的值是根据3次技术重复的平均值计算的。参见图8B。

本文引用的所有参考文献(包含出版物、专利申请和专利)均通过引用特此并入，其程度如同每篇参考文献被单独并且具体地指出通过引用并入并且在本文中被整体阐述。本说明书中对任何现有技术的引用不是，也不应被视为承认现有技术形成任何国家所致力的领域中的公知常识的一部分。

除非本文中另外指明或明显与上下文相矛盾，否则在描述本公开的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用的术语“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”以及类似的指代词应被解释为涵盖单数和复数两个。除非另外指出，否则术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”应解释为开放式术语(即，意味着“包含但不限于”)。术语“基本上由……组成”将组合物、过程或方法的范围限制在特定的材料或步骤，或者限制在那些对组合物、过程或方法的基本和新颖特性没有实质性影响的材料或步骤。替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。如本文所使用的，术语“约”是指所指定范围、值或结构的±20％，除非另有指示。

除非本文中另有指示，否则本文中对值的范围的叙述仅旨在用作单独地指出落入所述范围内的每个单独的值的速记方法并且每个单独的值并入本说明书中，如同所述值在本文中被单独地叙述一样。例如，除非另有指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围、整数范围、大小范围或厚度范围应被理解为包含所叙述范围内的任何整数的值并且在适当的情况下包含其分数(如整数的十分之一和百分之一)。

除非本文中另有指示或明显与上下文相矛盾，否则本文所描述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有实例或示范性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地说明本公开，而不对本公开的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应被解释为将任何未要求保护的元件指示为实践本公开所必须的。

本文描述了本公开的优选实施方式。在阅读前文描述后，对本领域的普通技术人员而言，那些优选实施方式的变型可以变得显而易见。诸位发明人预期技术人员可以在适当时采用此类变型，并且诸位发明人旨在使本公开以与本文具体描述的方式不同的其它方式来进行实践。因此，在适用法律允许的情况下，本公开包含所附权利要求中叙述的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有指示或明显与上下文相矛盾，否则本公开涵盖上述要素在其所有可能变型中的任何组合。

Claims

1.一种能够由气态底物产生乙二醇或乙二醇前体的经基因工程化的微生物，所述经基因工程化的微生物包括：编码二醇脱水酶的基因中的破坏性突变。

2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物通过一种或多种中间体产生乙二醇或所述乙二醇前体，所述一种或多种中间体选自由以下组成的组：5,10-亚甲基四氢叶酸盐、草酰乙酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐和甘氨酸。

3.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物包括以下中的一种或多种：

a.编码能够将草酰乙酸盐转化为柠檬酸盐的异源酶的核酸；

b.编码能够将甘氨酸转化为乙醛酸盐的异源酶的核酸；

d.编码能够将乙醇酸盐转化为乙醇醛的异源酶的核酸。

4.根据权利要求3所述的微生物，其中：

5.根据权利要求3所述的微生物，其中所述异源酶中的一种或多种异源酶衍生自选自由以下组成的组的属：芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、埃希氏菌属(Escherichia)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、赖氨酸芽胞杆菌属(Lysinibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、栖沉积物菌属(Sedimenticola)、芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)、链霉菌属(Streptomyces)、热硫杆状菌属(Thermithiobacillus)、热袍菌属(Thermotoga)、铜杆菌属(Cupriavidus)和玉蜀黍属(Zea)。

6.根据权利要求3所述的微生物，其中所述异源酶中的一种或多种异源酶被密码子优化以在所述微生物中表达。

7.根据权利要求3所述的微生物，其中所述微生物进一步包括以下中的一种或多种：能够将乙酰辅酶A转化为丙酮酸盐的酶；能够将丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐的酶；能够将丙酮酸盐转化为苹果酸盐的酶；能够将丙酮酸盐转化为磷酸烯醇丙酮酸盐的酶；能够将草酰乙酸盐转化为柠檬酰辅酶A的酶；能够将柠檬酰辅酶A转化为柠檬酸盐的酶；能够将柠檬酸盐转化为乌头酸盐并将乌头酸盐转化为异柠檬酸盐的酶；能够将磷酸烯醇丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐的酶；能够将磷酸烯醇丙酮酸盐转化为2-磷酸-D-甘油酸盐的酶；能够将2-磷酸-D-甘油酸盐转化为3-磷酸-D-甘油酸盐的酶；能够将3-磷酸-D-甘油酸盐转化为3-膦酰氧基丙酮酸盐的酶；能够将3-膦酰氧基丙酮酸盐转化为3-磷酸-L-丝氨酸的酶；能够将3-磷酸-L-丝氨酸转化为丝氨酸的酶；能够将丝氨酸转化为甘氨酸的酶；能够将5,10-亚甲基四氢叶酸盐转化为甘氨酸的酶；能够将丝氨酸转化为羟基丙酮酸盐的酶；能够将D-甘油酸盐转化为羟基丙酮酸盐的酶；能够将苹果酸盐转化为乙醛酸盐的酶；能够将乙醛酸盐转化为乙醇酸盐的酶；能够将羟基丙酮酸盐转化为乙醇醛的酶；以及能够将乙醇醛转化为乙二醇的酶。

8.根据权利要求3所述的微生物，其中所述微生物过表达以下：

a.所述能够将草酰乙酸盐转化为柠檬酸盐的异源酶；

b.所述能够将甘氨酸转化为乙醛酸盐的异源酶；和/或

c.所述能够将乙醇酸盐转化为乙醇醛的异源酶。

9.根据权利要求7所述的微生物，其中所述微生物过表达以下：

a.所述能够将丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐的酶；

c.所述能够将磷酸烯醇丙酮酸盐转化为草酰乙酸盐的酶；

d.所述能够将丝氨酸转化为甘氨酸的酶；

e.所述能够将5,10-亚甲基四氢叶酸盐转化为甘氨酸的酶；

f.所述能够将乙醛酸盐转化为乙醇酸盐的酶；和/或

g.所述能够将乙醇醛转化为乙二醇的酶。

10.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物进一步包括以下中的一种或多种中的破坏性突变：异柠檬酸脱氢酶、甘油酸脱氢酶、乙醇酸脱氢酶、甘油酸脱氢酶、乙醇酸脱氢酶、醛铁氧还蛋白氧化还原酶和醛脱氢酶。

11.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物是选自由以下组成的组的属的成员：醋酸杆菌属(Acetobacterium)、嗜碱菌属(Alkalibaculum)、布劳特氏菌属(Blautia)、丁酸杆菌属(Butyribacterium)、梭菌属、铜杆菌属、真杆菌属(Eubacterium)、穆尔氏菌属(Moorella)、产醋杆菌属(Oxobacter)、鼠孢菌属(Sporomusa)和嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)。

12.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物衍生自亲本微生物，所述亲本微生物选自由以下组成的组：伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculum bacchii)、产生布劳特氏菌(Blautia producta)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、克氏梭菌(Clostridiumcoskatii)、德氏梭菌(Clostridium drakei)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridiumformicoaceticum)、永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii)、马氏梭菌(Clostridium magnum)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、粪味梭菌(Clostridiumscatologenes)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermautotrophica)、热醋穆尔氏菌(Moorellathermoacetica)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)、森林土壤醋酸鼠孢菌(Sporomusa silvacetica)、球形鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)和凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。

13.根据权利要求12所述的微生物，其中所述微生物衍生自亲本细菌，所述亲本细菌选自由以下组成的组：产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌。

14.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物包括天然或异源伍德-永达尔通路(Wood-Ljungdahl pathway)。

15.根据权利要求1所述的微生物，其中所述乙二醇前体为乙醛酸盐或乙醇酸盐。

16.一种产生乙二醇或乙二醇前体的方法，所述方法包括在存在气态底物的情况下在营养培养基中培养根据权利要求1所述的微生物，由此所述微生物产生乙二醇或所述乙二醇前体。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述气态底物包括CO、CO₂和H₂中的一种或多种。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述乙二醇前体为乙醛酸盐或乙醇酸盐。

19.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括从所述营养培养基中分离乙二醇或所述乙二醇前体。

20.根据权利要求16所述的方法，其中所述微生物进一步产生乙醇、2,3-丁二醇和琥珀酸盐中的一种或多种。