TW202235621A - 重組微生物及其用途 - Google Patents

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史瓦尼 格雷
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Abstract

微生物經基因工程改造以產生各種工業用化學品。該等微生物為一氧化碳營養型產乙酸菌。該等微生物使用伍德-永達爾路徑（Wood-Ljungdahl Pathway）固定CO/CO 2以產生乙醯基-CoA。引入來自含有此組酶之微生物的逆β氧化路徑循環。此外，亦可引入引子及延伸物，及/或編碼產生引子及延伸物之酶的基因。產物合成可藉由經改良之啟動子或催化效率更高之酶設計來實現。類似地，產物合成亦可藉由去除競爭反應來改良。

Description

重組微生物及其用途
相關申請案之交叉參考
本申請案主張於2021年3月8日提交之美國臨時專利申請案第63/158,336號之權益，其全部內容以引用之方式併入本文中。 政府權利
本揭示案係根據能源部（Department of Energy）授予之合作協議DE-EE0008354在政府支持下進行。 有關序列表之參考
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交，且以全文引用之方式併入本文中。該ASCII複本在2022年2月14日創建，命名為LT204TW1-Sequences.txt且大小為91,877位元組。
本揭示案係關於用於製造滴入式燃料(drop-in fuel)、燃料添加劑及化學建構組元之重組微生物及方法，其源自於藉由包含CO、CO 2及/或H 2之受質之微生物醱酵進行的經工程改造之逆β氧化循環。
隨著對氣候變化及石化產品對氣候變化造成之影響的日益關注，出現了新的生物途徑用於製造工業化學品及燃料。逆β氧化路徑（Reversal of beta-oxidation pathway；rBOX）係一種能夠經由迭代製造平台獲取數百種不同化學分子之生物途徑。
迄今為止，rBOX路徑已在諸如大腸桿菌及酵母菌之類宿主中得到成功地證實，用以主要將糖或3碳受質（諸如甘油）轉化為多種類別之產物。其功能性尚未在利用古老伍德-永達爾路徑（Wood-Ljungdahl pathway）醱酵氣體之生物體諸如自產乙醇梭菌（ Clostridium autoethanogenum）中得到證實。
本揭示案提供藉由在利用CO/CO 2之宿主中表現rBOX路徑而產生包括醇、酸、二醇、二酸、酮酸、羥基酸、脂肪酸甲酯在內之不同類別產物的重組微生物及其用途。
本揭示案大體上尤其提供一種藉由包含CO、CO 2及/或H 2之受質之微生物醱酵來產生一級醇、1,4-二醇、1,6-二醇、二酸、反式Δ 2脂肪醇、β-酮醇、1,3-二醇、β-羥基酸、羧酸或烴的經基因工程改造之微生物及方法，以及此類方法中所用的重組微生物。
在第一態樣中，本揭示案提供一種能夠藉由醱酵包含CO、CO 2及/或H 2之受質而自一級醇、1,4-二醇、1,6-二醇、二酸、反式Δ 2脂肪醇、β-酮醇、1,3-二醇、β-羥基酸、羧酸或烴及視情況存在之一或多種其他產物產生的基因重組微生物。
在一個特定實施例中，該微生物適於表現逆β氧化路徑中，例如在逆生物合成方向上的一或多種酶（或其一或多個次單位），該等酶並非天然存在於作為該重組微生物來源之親本微生物中。在另一實施例中，該微生物適於過度表現逆β氧化路徑中的一或多種酶（或其一或多個次單位），該等酶天然存在於作為該重組微生物來源之親本微生物中。在一個實施例中，該微生物適於表現逆β氧化路徑中並非天然存在於親本微生物中之一或多種酶（或其一或多個次單位），且過度表現逆β氧化路徑中天然存在於親本微生物中之一或多種酶（或其一或多個次單位）。逆β氧化路徑亦為循環及迭代的。在另一實施例中，β氧化路徑視需要經逆向驅動，持續多個循環。在一個實施例中，β氧化路徑係在不存在任何天然存在之受質的情況下表現。在一個實施例中，逆β氧化路徑係功能性表現的。在一個實施例中，CoA硫酯中間物可藉由不同類型終止酶之作用轉化為有用產物。
此路徑與輔酶A（CoA）硫酯中間物一起操作且直接使用例如供醯基鏈伸長之乙醯基-CoA及使產物合成能夠與內源性去氫酶及硫酯酶組合使用以合成(C n)-醇、脂肪酸、β-羥基-羧酸、β-酮-羧酸及反-Δ 2-羧酸之特徵。
此路徑可使用對較高鏈長度具有特異性的相同酶或其經工程改造之變異體進一步擴展，以產生包括但不限於一系列C4、C6、C8、C10、C12、C14醇、酮、烯醇或二醇。不同類型之分子亦可藉由在硫解酶步驟中使用不同於乙醯基-CoA之引子或延伸物單元獲得。
在一個實施例中，一種能夠自氣態受質產生產物的經基因工程改造之微生物，其中該微生物包含迭代路徑，該迭代路徑包含： a)    編碼能夠催化(C n)-醯基CoA轉化為β-酮醯基-CoA之一組酶的核酸； b)   編碼能夠催化β-酮醯基-CoA轉化為β-羥基醯基-CoA之一組外源酶的核酸； c)    編碼能夠催化β-羥基醯基-CoA轉化為反-Δ 2-烯醯基-CoA之一組外源酶的核酸； d)   編碼能夠催化反-Δ 2-烯醯基-CoA轉化為(C n+2)醯基-CoA之一組外源酶的核酸； e)    一或多種終止酶；且其中該微生物係在硫酯酶中包含破壞性突變之固定C1之細菌。
在一個實施例中，該編碼能夠催化(C n)-醯基CoA轉化為β-酮醯基-CoA之一組酶的核酸為硫解酶、醯基-CoA乙醯基轉移酶或聚酮合酶；該編碼能夠催化β-酮醯基-CoA轉化為β-羥基醯基-CoA之一組酶的核酸為β-酮醯基-CoA還原酶或β-羥基醯基-CoA去氫酶；該編碼能夠催化β-酮醯基-CoA轉化為反-Δ 2-烯醯基-CoA之一組外源酶的核酸為β-羥基醯基-CoA脫水酶；該編碼能夠催化反-Δ 2-烯醯基-CoA轉化為(C n+2)醯基-CoA之一組外源酶的核酸為反-烯醯基-CoA還原酶或丁醯基-CoA去氫酶/電子轉移黃素蛋白AB（Bcd-EtfAB）。
在一個實施例中，編碼一組終止酶的核酸係選自醇形成輔酶-A硫酯還原酶、醛形成CoA硫酯還原酶、醇去氫酶、硫酯酶、醯基-CoA:乙醯基-CoA轉移酶、磷酸轉醯基酶及羧酸激酶；醛鐵氧化還原蛋白氧化還原酶；醛形成CoA硫酯還原酶、醛脫羰酶、醇去氫酶；醛去氫酶、醯基-CoA還原酶或其任何組合。在一個實施例中，終止酶係磷酸丁醯基轉移酶（Ptb）及外源丁酸激酶（Buk）（Ptb-Buk）。在一個實施例中，終止酶係硫酯酶。在一個實施例中，選擇一或多種終止酶。
在一個實施例中，微生物包含一或多種外源核酸，該一或多種外源核酸適於增加親本微生物天然之一或多種核酸之表現，且該一或多種核酸編碼前文所提及之一或多種酶（或其一或多個次單位）。
在一個實施例中，適於增加表現之一或多種外源核酸為調節元件。在一個實施例中，調節元件為啟動子。
在一個實施例中，啟動子為組成性啟動子。在一個實施例中，啟動子選自包含伍德-永達爾基因叢集或磷酸轉乙醯酶/乙酸激酶操縱子啟動子之群組。
在一個實施例中，微生物包含編碼且適於表現前文所提及之一或多種酶（或其一或多個次單位）的一或多種外源核酸。在一個實施例中，微生物包含編碼且適於表現至少兩種酶（或其一或多個次單位）的一或多種外源核酸。
在一個實施例中，一或多種外源核酸為核酸構築體或載體，在一個特定實施例中為質體，其以任何組合編碼前文所提及之一或多種酶。
在一個實施例中，質體上之兩種或多於兩種酶係以任何次序排列於單一操縱子中，或以任何次序排列於複數個操縱子中。
在一個實施例中，外源核酸為表現質體。
在一個實施例中，親本微生物選自厭氧產乙酸菌之群組。
在一個特定實施例中，親本微生物選自一氧化碳營養型產乙酸細菌之群組，在一個實施例中選自包含以下之群組：自產乙醇梭菌、揚氏梭菌（ Clostridium ljungdahlii）、拉氏梭菌（ Clostridium ragsdalei）、嗜一氧化碳梭菌（ Clostridium carboxidivorans）、德雷克氏梭菌（ Clostridium drakei）、糞味梭菌（ Clostridium scatologenes）、醋酸梭菌（ Clostridium aceticum）、蟻酸醋酸梭菌（ Clostridium formicoaceticum）、大梭菌（ Clostridium magnum）、食甲基丁酸桿菌（ Butyribacterium methylotrophicum）、伍氏醋酸桿菌（ Acetobacterium woodii）、巴氏嗜鹼菌（ Alkalibaculum bacchii）、布勞特氏菌屬（ Blautia producta）、黏液真桿菌（ Eubacterium limosum）、熱醋酸穆爾氏菌（ Moorella thermoacetica）、熱自養穆爾氏菌（ Moorella thermautotrophica）、卵形鼠孢菌（ Sporomusa ovata）、銀醋酸鼠孢菌（ Sporomusa silvacetica）、球形鼠孢菌（ Sporomusa sphaeroides）、普氏產醋桿菌（ Oxobacter pfennigii）及基伍嗜熱厭氧菌（ Thermoanaerobacter kivui）。
在一個實施例中，親本微生物為自產乙醇梭菌或揚氏梭菌。在一個特定實施例中，微生物為自產乙醇梭菌DSM23693。在另一特定實施例中，微生物為揚氏梭菌DSM13528 (或ATCC55383)。
在第二態樣中，本揭示案提供編碼一或多種酶（或其一或多次單位）之核酸，當在微生物中表現時，其允許微生物藉由醱酵包含CO及/或CO 2之受質而產生C n+2乙酸、C n+23-OH-酸、C n+2烯酸、C n+21-酸、C n+2酮、C n+2甲基-2-醇、C n+21,3-二醇、1,4-二醇、1,6-二醇、C n+22-烯-1-醇、C n+21-醇、二酸或其任何組合。例如，C n+2酮可為丙酮。
在一個實施例中，該核酸編碼兩種或多於兩種酶（或其一或多個次單位），當在微生物中表現時，其允許微生物藉由醱酵包含CO之受質而產生一級醇、1,4-二醇、1,6-二醇、二酸、反式Δ 2脂肪醇、β-酮醇、1,3-二醇、β-羥基酸、羧酸或烴。
在一個實施例中，該等酶係選自硫解酶、醯基-CoA乙醯基轉移酶或聚酮合酶，及/或其中任何一或多者之功能等效變異體。
在一個實施例中，該核酸包含呈任何次序之核酸序列，其編碼β-酮醯基-CoA還原酶及/或β-羥基醯基-CoA去氫酶或其中任何一或多者之功能等效變異體。
在一個實施例中，編碼硫解酶之核酸具有SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 6之序列，或為其功能等效變異體。在一個實施例中，編碼β-酮醯基-CoA還原酶之核酸具有SEQ ID NO: 7至SEQ ID NO: 14之序列，或為其功能等效變異體。在一個實施例中，編碼β-羥基醯基-CoA去氫酶之核酸具有SEQ ID NO: 15至SEQ ID NO: 22之序列，或為其功能等效變異體。在一個實施例中，編碼反-烯醯基-CoA還原酶之核酸具有SEQ ID NO: 23至SEQ ID NO: 28之序列，或為其功能等效變異體。
在一個實施例中，本揭示案之核酸進一步包含啟動子。在一個實施例中，啟動子允許基因在其控制下之組成性表現。在一個特定實施例中，使用伍德-永達爾叢集啟動子。在另一個特定實施例中，使用磷酸轉乙醯酶/乙酸激酶操縱子啟動子。在一個特定實施例中，啟動子來自自產乙醇梭菌。
在第三態樣中，本揭示案提供包含第二態樣之一或多種核酸的核酸構築體或載體。
在一個特定實施例中，核酸構築體或載體為表現構築體或載體。在一個特定實施例中，表現構築體或載體為質體。
在第四態樣中，本揭示案提供宿主生物體，其包含第七態樣之核酸或第三態樣之載體或構築體中之任何一或多者。
在第五態樣中，本揭示案提供一種組合物，其包含如本揭示案之第三態樣中所提及之表現構築體或載體及甲基化構築體或載體。
較佳地，該組合物能夠產生根據本揭示案之第一態樣之重組微生物。
在一個特定實施例中，表現構築體/載體及/或甲基化構築體/載體為質體。
在第六態樣中，本揭示案提供一種產生產物之方法，該方法包含在氣態受質之存在下培養如技術方案1之經工程改造之微生物。
在一個實施例中，該方法包含其中該氣態受質包含含CO、CO 2及/或H 2之C1-碳源。
在一個實施例中，該方法包含其中該產物係選自(C n)-醇、一級醇、反式Δ 2脂肪醇、β-酮醇、1,3-二醇、1,4-二醇、1,6-二醇、二酸、β-羥基酸、β-酮酸羧酸、脂肪酸、脂肪酸甲酯、酮酸、烴或其任何組合。
在方法態樣之特定實施例中，微生物維持於水性培養基中。
在方法態樣之特定實施例中，受質之醱酵發生於生物反應器中。
較佳地，含CO及/或CO 2之受質為包含CO及/或CO 2之氣態受質。在一個實施例中，受質包含工業廢氣。在某些實施例中，氣體為鋼廠廢氣或合成氣。
在特定實施例中，受質為包含CO之受質。
在受質包含CO 2但無CO之本揭示案之實施例中，受質較佳地亦包含H 2。
在一個實施例中，受質包含CO及CO 2。在一個實施例中，受質包含CO 2及H 2。在另一實施例中，受質包含CO、CO 2及H 2。
在一個實施例中，受質將通常含有主要比例之CO，諸如至少約20體積%至約100體積% CO、20體積%至70體積% CO、30體積%至60體積% CO以及40體積%至55體積% CO。在特定實施例中，受質包含約25體積%、或約30體積%、或約35體積%、或約40體積%、或約45體積%、或約50體積% CO，或約55體積% CO，或約60體積% CO。
在某些實施例中，該方法進一步包含自醱酵液回收產物之步驟，該產物選自一級醇、1,4-二醇、1,6-二醇、二酸、反式Δ 2脂肪醇、β-酮醇、1,3-二醇、β-羥基酸、羧酸或烴及視情況存在之一或多種其他產物。
在第七態樣中，本揭示案提供在藉由第六態樣之方法產生時之任何一級醇。
在另一態樣，本揭示案提供一種製造本揭示案第一態樣之微生物的方法，該方法包含用一或多種外源核酸對親本微生物進行轉型，以使得該微生物能夠藉由醱酵包含CO及/或CO 2之受質而產生C n+2乙酸、C n+23-OH-酸、C n+2烯酸、C n+21-酸、C n+2酮、C n+2甲基-2-醇、C n+21,3-二醇、1,4-二醇、1,6-二醇、C n+22-烯-1-醇、C n+21-醇、二酸或其任何組合，及視情況存在之一或多種其他產物，其中該親本微生物不能藉由醱酵包含CO及/或CO 2之受質而產生C n+2乙酸、C n+23-OH-酸、C n+2烯酸、C n+21-酸、C n+2酮、C n+2甲基-2-醇、C n+21,3-二醇、1,4-二醇、1,6-二醇、C n+22-烯-1-醇、C n+21-醇、二酸或其任何組合。
在一個特定實施例中，利用適於表現逆β氧化路徑中並非天然存在於親本微生物中之一或多種酶的一或多種外源核酸來轉型親本微生物。在另一實施例中，利用適於過度表現逆β氧化路徑中天然存在於親本微生物中之一或多種酶的一或多種核酸對親本微生物進行轉型。在另一個實施例中，利用一或多種外源核酸對親本微生物進行轉型，該一或多種外源核酸適於表現逆β氧化路徑中並非天然存在於親本微生物中之一或多種酶，且過度表現逆β氧化路徑中天然存在於親本微生物中之一或多種酶。
在某些實施例中，一或多種酶如前文所描述。
在某一實施例中，親本微生物如前文所描述。
根據一個實施例，提供一種用於將CO或CO2轉化成一級醇之方法。將含CO及/或含CO2之氣態受質傳遞至生物反應器中，該生物反應器含有在培養基中之一氧化碳營養型產乙酸細菌培養物，使得細菌將CO及/或CO2轉化成一級醇。一氧化碳營養型產乙酸細菌經過基因工程改造以表現逆β氧化路徑中之酶。其亦表現逆β氧化路徑中之酶，無論是天然的抑或外源的。自生物反應器中回收一級醇。
根據另一實施例，提供一種經分離、基因工程改造的一氧化碳營養型產乙酸細菌，其包含編碼逆β氧化路徑中之一組酶的核酸。核酸對於宿主細菌為外源的。該等細菌表現在逆β氧化路徑中之該組酶且該等細菌獲得產生一級醇、反式Δ 2脂肪醇、β-酮醇、1,3-二醇、1,4-二醇、1,6-二醇、二酸、β-羥基酸、羧酸或烴的能力。逆β氧化路徑中之該組酶通常與由SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 57之核苷酸序列中之任一者編碼的胺基酸序列至少85%一致。在一個實施例中，選擇諸如硫酯酶、醯基-CoA還原酶或磷酸轉醯基酶、羧酸激酶之終止酶，因為此等酶將醯基-CoA中間物自rBOX路徑中拉出並驅動代謝流穿過該路徑。
細菌可進一步包含編碼乙醯輔酶A羧化酶之外源核酸。核酸可以可操作地連接至啟動子。核酸可能已經密碼子優化。核酸或經編碼羧化酶可來自非硫光合細菌。細菌可選自由以下組成之群組：自產乙醇梭菌、揚氏梭菌、拉氏梭菌、嗜一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、糞味梭菌、醋酸梭菌、蟻酸醋酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸桿菌、伍氏醋酸桿菌、巴氏嗜鹼菌、布勞特氏菌屬、黏液真桿菌、熱醋酸穆爾氏菌、熱自養穆爾氏菌、卵形鼠孢菌、銀醋酸鼠孢菌、球形鼠孢菌、普氏產醋桿菌及基伍嗜熱厭氧菌。外源核酸之供體細菌可為非硫光合細菌，諸如橙色綠屈撓菌（ Chloroflexus aurantiacus）、金屬球菌屬（ Metallosphaera）及硫化葉菌屬（ Sulfolobus spp.）。
經基因工程改造細菌可藉由在包含氣態碳源之培養基中生長來培養。碳源可包含CO及/或CO 2，其可用作能量源或碳源中之任一者或兩者。細菌可視情況在嚴格厭氧條件下生長。碳源可包含工業廢料產物或廢氣。
本揭示案亦可廣泛地認為包括在本申請案說明書中單獨地或共同地提及或指示之部分、元件及特徵，呈該等部分、元件或特徵中之兩者或更多者的任何或所有組合形式，且其中本文中提及特定整數，其具有本揭示案涉及之此項技術中已知的等效物，此等已知等效物被視為併入本文中，如同個別地闡述一般。
籠統地給出實施例之以下描述。根據在下文標題「實例」下所給出之揭示內容進一步闡明揭示案，其提供支援本揭示案之實驗資料、本揭示案之各種態樣之特定實例及執行本揭示案之方式。
本發明人出人意料地能夠對一氧化碳營養型產乙酸微生物進行工程改造以使其藉由醱酵包含CO及/或CO 2之受質而產生醇。此為產生一級醇提供一種替代方式，該方式可具有優於當前用於產生一級醇之方法的益處。另外，其提供使用來自工業製程之一氧化碳之方式，否則該一氧化碳將被釋放至大氣中且污染環境。在本揭示案中，經基因工程改造之微生物表現來自逆β氧化路徑之酶，由此自氣態受質產生一級醇。
在工程改造本揭示案之微生物時，本發明人出人意料地能夠對能自氣態受質產生產物之微生物進行基因工程改造，其中該微生物包含迭代路徑，該迭代路徑包含催化(C n)-醯基CoA轉化為β-酮醯基-CoA；催化β-酮醯基-CoA轉化為β-羥基醯基-CoA；催化β-羥基醯基-CoA轉化為反-Δ 2-烯醯基-CoA；及催化反-Δ 2-烯醯基-CoA轉化為(C n+2)醯基-CoA；及一或多種終止酶；且其中該微生物為在硫酯酶中包含破壞性突變的固定C1之細菌，如圖1中所示。此路徑可使用對較高鏈長度具有特異性的相同酶或其經工程改造之變異體進一步擴展，以產生包括但不限於一系列C4、C6、C8、C10、C12、C14醇、酮、烯醇或二醇。不同類型之分子亦可藉由在硫解酶步驟中使用不同於乙醯基-CoA之引子或延伸物單元獲得。此提供可持續醱酵以使用包含CO之受質及/或包含CO 2之受質產生一級醇。
引子及延伸物係選自草醯基-CoA、乙醯基-CoA、丙二醯基CoA、丁二醯基-CoA、羥基乙醯基-CoA、3-羥基丙醯基-CoA、4-羥基丁醯基-CoA、2-胺基乙醯基-CoA、3-胺基丙醯基-CoA、4-胺基丁醯基-CoA、異丁醯基-CoA、3-甲基-丁醯基-CoA、2-羥基丙醯基-CoA、3-羥基丁醯基-CoA、2-胺基丙醯基-CoA、丙醯基-CoA及戊醯基-CoA。此外，細菌表現逆β氧化路徑中之該組酶且細菌獲得產生一級醇、反式Δ 2脂肪醇、β-酮醇、1,3-二醇、1,4-二醇、1,6-二醇、二酸、β-羥基酸、羧酸或烴的能力。在一個實施例中，乙醯基-CoA為引子/起動分子，其使得合成偶數鏈的正醇及/或羧酸。在另一實施例中，丙醯基-CoA為起動/引子分子，其使得能夠合成奇數鏈的正醇及/或羧酸。
在一個實施例中，引子可為除乙醯基-CoA或丙醯基-CoA以外之引子，但乙醯基-CoA可與引子縮合，充當延伸物單元，向其中添加兩個碳單元。在另一實施例中，此等引子與不同終止酶組合使得合成其他產物。
在一個實施例中，本揭示案描述該一或多種終止酶選自醇形成輔酶-A硫酯還原酶、醛形成CoA硫酯還原酶、醇去氫酶、硫酯酶、醯基-CoA:乙醯基-CoA轉移酶、磷酸轉醯基酶及羧酸激酶；醛鐵氧化還原蛋白氧化還原酶；醛形成CoA硫酯還原酶、醛脫羰酶、醇去氫酶；醛去氫酶、醯基-CoA還原酶或其任何組合。
在一個實施例中，本揭示案描述逆β氧化循環之多輪操作，需要由一或多輪循環產生之醯基-CoA與額外的乙醯基-CoA分子縮合，以使醯基-CoA在每輪循環中延長兩個碳。在另一個實施例中，多輪循環之起始及延伸需要使用對較長鏈之醯基-CoA分子具有特異性之硫解酶與能夠作用於增加碳數之路徑中間物之其他路徑酶的組合。
儘管本發明人已證明本揭示案在自產乙醇梭菌中之功效，但本揭示案適用於更廣泛厭氧產乙酸微生物之群組及在包含CO及/或CO 2之受質上的醱酵，如上文及本文中進一步所論述。
除非另外定義，否則如在整個本說明書中所使用之以下術語定義如下：
術語「增加效率」、「增加之效率」及類似者在與醱酵過程相關使用時包括但不限於以下中之一或多者：增加催化醱酵之微生物的生長速率、增加在較高產物濃度下之生長及/或產物產生速率、增加每體積消耗之受質所產生之所需產物之體積、增加所需產物之產生速率或產生水平、增加所產生之所需產物相比於醱酵之其他副產物的相對比例、降低該過程所消耗之水的量，及降低該過程所使用之能量的量。
術語「醱酵」應解釋為在受質中產生化學變化的代謝過程。舉例而言，醱酵過程接收一或多種受質且經由利用一或多種微生物產生一或多種產物。術語「醱酵」、「氣體醱酵」及類似者應解釋為接收一或多種受質，諸如藉由氣化產生之合成氣，且經由利用一或多種固定C1之微生物產生一或多種產物的過程。較佳地，醱酵過程包括使用一或多個生物反應器。醱酵過程可描述為「分批」或「連續」。「分批醱酵」用於描述醱酵過程，其中生物反應器填充有原材料（例如碳源）以及微生物，其中產物保留在生物反應器中直至醱酵完成。在「分批」過程中，醱酵完成後，萃取產物，且在開始下一個「批次」之前清潔生物反應器。「連續醱酵」用於描述其中醱酵過程延長較長時間段，且在醱酵期間萃取產物及/或代謝物的醱酵過程。較佳地，醱酵過程為連續的。
當用於提及微生物時，術語「非天然存在」意指微生物具有至少一種未發現於所提及物種之天然存在之菌株（包括所提及物種之野生型菌株）中的基因修飾。非天然存在之微生物通常在實驗室或研究設施中開發。
術語「基因修飾」、「基因改變」或「基因工程改造」泛指人工操縱微生物之基因體或核酸。同樣，術語「基因修飾」、「基因改變」或「基因工程改造」係指含有此基因修飾、基因改變或基因工程改造之微生物。此等術語可用於區分實驗室產生之微生物與天然存在之微生物。基因修飾方法包括例如異源基因表現、基因或啟動子插入或缺失、核酸突變、經改變之基因表現或不活化、酶工程改造、定向進化、基於知識之設計、隨機突變誘發方法、基因改組及密碼子優化。
微生物（諸如梭菌綱（ Clostridia））之代謝工程改造可極大地擴展其產生除天然代謝物（諸如乙醇）以外之許多重要燃料及化學分子的能力。然而，直到最近，梭菌綱被視為基因難處理的，且因此通常禁止進行廣泛的代謝工程改造工作。近年來，已經開發了若干種不同的梭菌綱基因體工程改造方法，包括基於內含子的方法（ClosTron）（Kuehne, Strain Eng: Methods and Protocols, 389-407, 2011）、等位基因交換方法（ACE）（Heap, 《核酸研究（ Nucl Acids Res）》, 40: e59, 2012; Ng, PLoS One, 8: e56051, 2013）、三系雜交（Liew, 《微生物學前沿（ Frontiers Microbiol）》, 7: 694, 2016）、藉由I-SceI介導之方法（Zhang, 《微生物學方法雜誌（ Journal Microbiol Methods）》, 108: 49-60, 2015）、MazF（Al-Hinai, 《環境應用微生物學（ Appl Environ Microbiol）》, 78: 8112-8121, 2012），或其他（Argyros, 《環境應用微生物學》, 77: 8288-8294, 2011）、Cre-Lox（(Ueki, 《分子生物技術（mBio）》, 5: e01636-01614, 2014）及CRISPR/Cas9（Nagaraju, 《生物技術生物燃料（Biotechnol  Biofuels）》, 9: 219, 2016）。然而，由於緩慢而費力的循環時間以及對跨物種之此等基因技術之可轉移性的限制，以迭代方式引入多個基因變化仍然極具挑戰性。此外，吾等尚未充分瞭解梭菌綱中之C1代謝，無法可靠地預測將最大化C1吸收、轉化及碳/能量/氧化還原流向產物合成之修飾。因此，在梭菌綱中引入目標路徑仍為一個乏味且耗時的過程。
「重組」指示核酸、蛋白質或微生物為基因修飾、工程改造或重組之產物。通常，術語「重組」係指含有衍生自多個來源之遺傳物質或由其編碼之核酸、蛋白質或微生物，該等來源諸如兩種或更多種不同的微生物菌株或物種。
「野生型」係指生物體、菌株、基因或自然界中存在之特性的典型形式，其區別於突變或變異體形式。
「內源的」係指存在於或表現於本揭示案之微生物所衍生自的野生型或親本微生物中的核酸或蛋白質。舉例而言，內源基因為天然存在於本揭示案之微生物所衍生自的野生型或親本微生物中的基因。在一個實施例中，內源基因之表現可藉由諸如外源啟動子之外源調節元件控制。
「外源的」係指源自本揭示案之微生物之外的核酸或蛋白質。舉例而言，外源基因或酶可以人工方式或以重組方式產生且引入或表現於本揭示案之微生物中。外源基因或酶亦可自異源微生物分離且引入或表現於本揭示案之微生物中。外源核酸可適於整合至本揭示案之微生物的基因體中或在本揭示案之微生物中保持在染色體外狀態，例如在質體中。
「異源的」係指不存在於本揭示案之微生物所衍生自的野生型或親本微生物中之核酸或蛋白質。舉例而言，異源基因或酶可衍生自不同的菌株或物種且引入或表現於本揭示案之微生物中。異源基因或酶可以其存在於不同菌株或物種中之形式引入或表現於本揭示案之微生物中。或者，可以某種方式修飾異源基因或酶，例如藉由對其在本揭示案之微生物中表現進行密碼子優化或藉由對其進行工程改造以改變功能，以便逆轉酶活性之方向或改變受質特異性。
術語「聚核苷酸」、「核苷酸」、「核苷酸序列」、「核酸」及「寡核苷酸」可互換使用。其係指任何長度之核苷酸之聚合形式，該核苷酸為去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其類似物。聚核苷酸可具有任何三維結構，且可執行任何已知或未知的功能。以下為聚核苷酸之非限制性實例：基因或基因片段之編碼或非編碼區、由連鎖分析定義之基因座（基因座）、外顯子、內含子、信使RNA（mRNA）、轉移RNA、核醣體RNA、短干擾RNA（siRNA）、短髮夾RNA（shRNA）、微小RNA（miRNA）、核酶、cDNA、重組聚核苷酸、分支聚核苷酸、質體、載體、任何序列之分離DNA、任何序列之分離RNA、核酸探針及引子。聚核苷酸可包含一或多種經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸或核苷酸類似物。若存在，則可在聚合物組裝之前或之後賦予核苷酸結構之修飾。核苷酸序列可能間雜有非核苷酸組分。可在聚合之後，諸如藉由與標記組分結合而進一步修飾聚核苷酸。
如本文中所使用，「表現」係指聚核苷酸自DNA模板轉錄（諸如為mRNA或其他RNA轉錄物）之過程及/或轉錄mRNA隨後轉譯為肽、多肽或蛋白質之過程。轉錄物及經編碼多肽可統稱為「基因產物」。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用以指代任何長度之胺基酸之聚合物。聚合物可為直鏈或分支鏈，其可包含經修飾之胺基酸，且其可間雜有非胺基酸。該術語亦涵蓋經修飾之胺基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操縱，諸如與標記組分之綴合。如本文中所使用，術語「胺基酸」包括天然及/或非天然或合成胺基酸，包括甘胺酸及D或L光學異構體，以及胺基酸類似物及肽模擬物。
「酶活性」或簡言之「活性」泛指酶促活性，包括但不限於酶之活性、酶之量或酶催化反應之可用性。因此，「增加」酶活性包括增加酶之活性、增加酶之量或增加酶催化反應之可用性。類似地，「降低」酶活性包括降低酶之活性、降低酶之量或降低酶催化反應之可用性。
「突變的」係指與本揭示案之微生物所衍生自的野生型或親本微生物相比，在本揭示案之微生物中已經被修飾的核酸或蛋白質。在一個實施例中，突變可為編碼酶之基因中的缺失、插入或取代。在另一實施例中，突變可為酶中一或多個胺基酸之缺失、插入或取代。
特定言之，「破壞性突變」為減少或去除（亦即「干擾」）基因或酶之表現或活性的突變。破壞性突變可使基因或酶部分不活化、完全不活化或缺失。破壞性突變可為減少、防止或阻斷由酶產生之產物之生物合成的任何突變。破壞性突變可為敲除（KO）突變。破壞亦可為減弱（KD）突變，其降低但不完全消除基因、蛋白質或酶之表現或活性。儘管KO通常能有效提高產物產率，但其有時會帶來超過益處之生長缺陷或基因不穩定性的損失，特別是對於非生長偶合產物。破壞性突變可包括例如編碼酶之基因中之突變，參與編碼酶之基因表現的基因調節元件中之突變，引入產生蛋白質之核酸，該蛋白質減少或抑制酶之活性，或引入抑制酶表現之核酸（例如反義RNA、siRNA、CRISPR）或蛋白質。可使用此項技術已知的任何方法引入破壞性突變。
破壞性突變之引入導致本揭示案之微生物與本揭示案之微生物所衍生自的親本微生物相比不產生目標產物或實質上不產生目標產物或目標產物的量減少。舉例而言，本揭示案之微生物可不產生目標產物或比親本微生物少至少約1%、3%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%目標產物。舉例而言，本揭示案之微生物可產生小於約0.001、0.01、0.10、0.30、0.50或1.0 g/L目標產物。
「密碼子優化」係指核酸（諸如基因）突變以用於優化或改良核酸在特定菌株或物種中之轉譯。密碼子優化可導致較快的轉譯速率或較高的轉譯準確性。在一實施例中，本揭示案之基因針對梭菌屬（ Clostridium）、尤其自產乙醇梭菌、揚氏梭菌或拉氏梭菌中之表現進行密碼子優化。在另一實施例中，本揭示案之基因針對自產乙醇梭菌LZ1561中之表現進行密碼子優化，自產乙醇梭菌LZ1561以DSMZ寄存編號DSM23693寄存。
「過度表現」係指與本揭示案之微生物所衍生自的野生型或親本微生物相比，本揭示案之微生物中核酸或蛋白質之表現增加。過度表現可藉由此項技術已知的任何方式實現，包括修改基因複本數、基因轉錄率、基因轉譯率或酶降解率。
術語「變異體」包括序列不同於參考核酸及蛋白質之序列（諸如先前技術中所揭示或本文中所例示之參考核酸及蛋白質之序列）的核酸及蛋白質。可使用執行與參考核酸或蛋白質實質上相同的功能之變異體核酸或蛋白質來實施本揭示案。舉例而言，變異體蛋白質可執行與參考蛋白質實質上相同的功能或催化實質上相同的反應。變異體基因可編碼與參考基因相同或實質上相同的蛋白質。變異體啟動子可具有與參考啟動子實質上相同的促進一或多種基因表現之能力。
此類核酸或蛋白質在本文中可稱為「功能等效變異體」。藉助於實例，核酸之功能等效變異體可包括等位基因變異體、基因片段、突變基因、多態性及類似者。來自其他微生物之同源基因亦為功能等效變異體之實例。此等基因包括諸如丙酮丁醇梭菌（ Clostridium acetobutylicum）、拜氏梭菌（ Clostridium beijerinckii）或揚氏梭菌之物種中之同源基因，其詳情在諸如Genbank或NCBI之網站上公開可用。功能等效變異體亦包括其序列因特定微生物之密碼子優化而變化之核酸。核酸之功能等效變異體將較佳與參考核酸具有至少約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%或更大核酸序列一致性（同源性百分比）。蛋白質之功能等效變異體將較佳與參考蛋白質具有至少約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%或更大胺基酸一致性（同源性百分比）。變異體核酸或蛋白質之功能等效性可使用此項技術中已知之任何方法評估。
「互補性」係指核酸藉由傳統沃森-克里克（Watson-Crick）或其他非傳統類型與另一核酸序列形成氫鍵之能力。互補性百分比指示核酸分子中可與第二核酸序列形成氫鍵（例如，沃森-克里克鹼基配對）之殘基的百分比（例如，10個中之5、6、7、8、9、10個為50%、60%、70%、80%、90%及100%互補)。「完美互補」意謂核酸序列之所有連續殘基將與第二核酸序列中相同數目之連續殘基氫鍵結。如本文中所使用之「實質上互補」係指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多核苷酸之區域上至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%之互補程度，或係指在嚴格條件下雜交之兩種核酸。
如本文中所使用，用於雜交之「嚴格條件」係指與目標序列具有互補性之核酸主要與目標序列雜交且實質上不與非目標序列雜交之條件。嚴格條件通常為序列依賴性的，且取決於多種因素而變化。一般而言，序列愈長，序列與其目標序列特異地雜交之溫度愈高。嚴格條件之非限制性實例為此項技術中所熟知（例如，Tijssen，生物化學中之實驗室技術及與核酸探針之分子生物雜交（Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic acid probes），第二章「雜交原理之概述及核酸探針分析之策略（Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay）」，Elsevier, N.Y, 1993）。
「雜交」係指一或多個聚核苷酸反應以形成複合物之反應，該複合物經由核苷酸殘基之鹼基之間的氫鍵結而穩定化。可藉由沃森克里克鹼基配對、胡斯坦（Hoogsteen）結合或以任何其他序列特異方式進行氫鍵結。複合物可包含形成雙螺旋體結構之兩股、形成多股複合物之三股或更多股、單個自雜交股或此等之任何組合。雜交反應可構成諸如起始PCR或藉由酶裂解聚核苷酸之較廣泛方法中之步驟。能夠與給定序列雜交之序列稱為給定序列之「補體」。
可使用此項技術中已知之任何方法將核酸遞送至本揭示案之微生物。舉例而言，核酸可作為裸核酸遞送，或可與一或多種試劑，諸如脂質體一起調配。若適當，核酸可為DNA、RNA、cDNA或其組合。在某些實施例中可使用限制性抑制劑。額外載體可包括質體、病毒、噬菌體、黏質體及人工染色體。在一實施例中，使用質體將核酸遞送至本揭示案之微生物。藉助於實例，轉型（包括轉導或轉染）可藉由電穿孔、超音波處理、聚乙二醇介導之轉型、化學或天然感受態、原生質體轉型、原噬菌體誘導或綴合來實現。在具有活性限制酶系統之某些實施例中，可能有必要在將核酸引入微生物中之前將核酸甲基化。
此外，核酸可經設計以包含調節元件，諸如啟動子，以提高或以其他方式控制特定核酸之表現。啟動子可為組成性啟動子或誘導性啟動子。理想地，啟動子為伍德-永達爾路徑啟動子、鐵氧化還原蛋白啟動子、丙酮酸:鐵氧化還原蛋白氧化還原酶啟動子、Rnf複合物操縱子啟動子、ATP合成酶操縱子啟動子或磷酸轉乙醯酶/乙酸激酶操縱子啟動子。
「引子」為引發劑或起動分子，其具有或變得具有CoA，且隨後在逆β氧化循環中與另一分子（例如乙醯基-CoA）縮合，從而使引子延長兩個碳。此類分子包括但不限於草醯基-CoA、乙醯基-CoA、丙二醯基CoA、丁二醯基-CoA、羥基醯基-CoA、3-羥基丙醯基-CoA、4-羥基丁醯基-CoA、2-胺基乙醯基-CoA、3-胺基丙醯基-CoA、4-胺基丁醯基-CoA、異丁醯基-CoA、3-甲基-丁醯基-CoA、2-羥基丙醯基-CoA、3-羥基丁醯基-CoA、2-胺基丙醯基-CoA、丙醯基-CoA及戊醯基-CoA。
「終止」酶意謂催化將逆β氧化中間物帶出路徑循環之反應，從而「終止」循環之運行的酶。終止酶包括但不限於醇形成輔酶-A硫酯還原酶、醛形成CoA硫酯還原酶、醇去氫酶、硫酯酶、醯基-CoA:乙醯基-CoA轉移酶、磷酸轉醯基酶及羧酸激酶;醛鐵氧化還原蛋白氧化還原酶；醛形成CoA硫酯還原酶、醛脫羰酶、醇去氫酶；醛去氫酶及醯基-CoA還原酶。
「微生物」為微觀生物體，尤其為細菌、古細菌、病毒或真菌。本揭示案之微生物通常為細菌。如本文中所使用，「微生物」之引述應理解為涵蓋「細菌」。
「親本微生物」為用於產生本揭示案之微生物之微生物。親本微生物可為天然存在之微生物（亦即野生型微生物）或先前已經修飾之微生物（亦即突變或重組微生物）。本揭示案之微生物可經修飾以表現或過度表現一或多種在親本微生物中不表現或不過度表現之酶。類似地，本揭示案之微生物可經修飾以含有一或多個親本微生物所不含之基因。本揭示案之微生物亦可經修飾以不表現或表現較少量之一或多種表現於親本微生物中之酶。在一個實施例中，親本微生物為自產乙醇梭菌、揚氏梭菌或拉氏梭菌。在一實施例中，親本微生物為自產乙醇梭菌LZ1561，其根據布達佩斯條約（Budapest Treaty）之條款及所授予之寄存編號DSM23693，在2010年6月7日寄存在位於Inhoffenstraße 7B, D-38124 Braunschweig, Germany之德國微生物菌種保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ）。此菌株描述於國際專利申請案第PCT/NZ2011/000144號，其作為WO 2012/015317公開。
術語「衍生自」指示核酸、蛋白質或微生物由不同（例如，親本或野生型）核酸、蛋白質或微生物修飾或調適，以便產生新核酸、蛋白質或微生物。此類修飾或調適通常包括核酸或基因之插入、缺失、突變或取代。一般而言，本揭示案之微生物衍生自親本微生物。在一個實施例中，本揭示案之微生物衍生自自產乙醇梭菌、揚氏梭菌或拉氏梭菌。在一實施例中，本揭示案之微生物衍生自以DSMZ寄存編號DSM23693寄存之自產乙醇梭菌LZ1561。
本揭示案之微生物可基於功能特性進一步分類。舉例而言，本揭示案之微生物可為或可衍生自固定C1之微生物、厭氧菌、產乙酸菌、產乙醇菌、一氧化碳氧化菌及/或甲烷氧化菌。表1提供微生物之代表性清單且鑑別其功能特性。
表 1 伍德-永達爾 固定C1之 厭氧菌 產乙酸菌 產乙醇菌 自養生物 一氧化碳氧化菌
伍氏醋酸桿菌 + + + + +/ - 1 + -
巴氏嗜鹼菌 + + + + + + +
布勞特氏菌 + + + + - + +
食甲基丁酸桿菌 + + + + + + +
醋酸梭菌 + + + + - + +
自產乙醇梭菌 + + + + + + +
嗜一氧化碳梭菌 + + + + + + +
科斯卡塔梭菌（ Clostridium coskatii） + + + + + + +
德雷克氏梭菌 + + + + - + +
蟻酸醋酸梭菌 + + + + - + +
揚氏梭菌 + + + + + + +
大梭菌 + + + + - + +/ - 2
拉氏梭菌 + + + + + + +
糞味梭菌 + + + + - + +
黏液真桿菌 + + + + - + +
熱自養穆爾氏菌 + + + + + + +
熱醋酸穆爾氏菌（原名為熱醋酸梭菌） + + + + - 3 + +
普氏產醋桿菌 + + + + - + +
卵形鼠孢菌 + + + + - + +/ - 4
銀醋酸鼠孢菌 + + + + - + +/ - 5
球形鼠孢菌 + + + + - + +/ - 6
基伍嗜熱厭氧菌 + + + + - + -
1 伍氏醋酸桿菌可自果糖，但不自氣體產生乙醇。
2 尚未研究大梭菌是否可生長於CO上。
3 已報導一種熱醋酸穆爾氏菌菌株，即穆爾氏菌屬HUC22-1自氣體產生乙醇。
4 尚未研究卵形鼠孢菌是否可生長於CO上。
5 尚未研究銀醋酸鼠孢菌是否可生長於CO上。
6 尚未研究球形鼠孢菌是否可生長於CO上。
「伍德-永達爾」係指如例如藉由Ragsdale, 《生物化學與生物物理學學報（ Biochim Biophys Acta）》, 1784: 1873-1898, 2008所描述之碳固定之伍德-永達爾路徑。「伍德-永達爾微生物」可預測係指含有伍德-永達爾路徑之微生物。一般而言，本揭示案之微生物含有天然伍德-永達爾路徑。本文中，伍德-永達爾路徑可為天然未經修飾的伍德-永達爾路徑，或者其可為具有一定程度之基因修飾（例如過度表現、異源表現、敲除等）之伍德-永達爾路徑，只要其仍用以將CO、CO 2及/或H 2轉化為乙醯基-CoA。
「C1」係指一碳分子，例如CO、CO 2、CH 4或CH 3OH。「C1-氧合物」係指亦包含至少一個氧原子之一碳分子，例如CO、CO 2或CH 3OH。「C1碳源」係指充當本揭示案微生物之一部分或唯一碳源之一碳分子。舉例而言，C1碳源可包含CO、CO 2、CH 4、CH 3OH或CH 2O 2中之一或多者。較佳地，C1碳源包含CO或CO 2中之一者或兩者。「固定C1之微生物」為能夠自C1碳源產生一或多種產物的微生物。通常，本揭示案之微生物為固定C1之細菌。在一實施例中，本揭示案之微生物衍生自表1中鑑別的固定C1之微生物。
「厭氧菌」為生長不需要氧氣之微生物。若氧氣以高於某一臨限值存在，則厭氧菌可能會消極反應或甚至死亡。然而，一些厭氧菌能夠耐受低含量之氧（例如0.000001至5%氧氣）。通常，本揭示案之微生物為厭氧菌。在一實施例中，本揭示案之微生物衍生自表1中鑑別之厭氧菌。
「產乙酸菌」為使用伍德-永達爾路徑作為其能量守恆及合成乙醯基-CoA及乙醯基-CoA衍生產物（諸如乙酸酯）之主要機制的絕對厭氧細菌（Ragsdale, 《生物化學與生物物理學學報》, 1784:1873-1898, 2008）。特定言之，產乙酸菌使用伍德-永達爾路徑作為（1）自CO 2還原合成乙醯基-CoA之機制，（2）終端接受電子、能量守恆方法，（3）固定（同化）細胞碳之合成中之CO 2之機制（Drake, 《產乙酸原核生物（Acetogenic Prokaryotes）》,《原核生物（The Prokaryotes）》, 第3版, 第354頁, New York, NY, 2006）。所有天然存在之產乙酸菌為固定C1、厭氧、自營及非甲烷氧化的。通常，本揭示案之微生物為產乙酸菌。在一實施例中，本揭示案之微生物衍生自表1中鑑別之產乙酸菌。
「產乙醇菌」為產生或能夠產生乙醇之微生物。通常，本揭示案之微生物為產乙醇菌。在一實施例中，本揭示案之微生物衍生自表1中鑑別之產乙醇菌。
「自養生物」為能夠在不存在有機碳的情況下生長之微生物。實際上，自養生物使用無機碳源，諸如CO及/或CO 2。通常，本揭示案之微生物為自養生物。在一實施例中，本揭示案之微生物衍生自表1中鑑別之自養生物。
「一氧化碳氧化菌」為能夠利用CO作為唯一碳來源及能量來源之微生物。通常，本揭示案之微生物為一氧化碳氧化菌。在一實施例中，本揭示案之微生物衍生自表1中鑑別之一氧化碳氧化菌。
「甲烷氧化菌」為能夠使用甲烷作為唯一碳源及能量來源之微生物。在某些實施例中，本揭示案之微生物為甲烷氧化菌或衍生自甲烷氧化菌。在其他實施例中，本揭示案之微生物並非甲烷氧化菌或並非衍生自甲烷氧化菌。
更廣泛地，本揭示案之微生物可衍生自表1中鑑別之任何屬或物種。舉例而言，微生物可為選自由以下組成之群組之屬的成員：醋桿菌屬（ Acetobacterium）、嗜鹼菌屬（ Alkalibaculum）、布勞特氏菌屬（ Blautia）、丁酸桿菌屬（ Butyribacterium）、梭菌屬（ Clostridium）、真桿菌屬（ Eubacterium）、穆爾氏菌屬（ Moorella）、產醋桿菌屬（ Oxobacter）、鼠孢菌屬（ Sporomusa）及熱厭氧桿菌屬（ Thermoanaerobacter）。特定言之，微生物可衍生自選自由以下組成之群組的親本細菌：伍氏醋酸桿菌、巴氏嗜鹼菌、布勞特氏菌屬、食甲基丁酸桿菌、醋酸梭菌、自產乙醇梭菌、嗜一氧化碳梭菌、科斯卡塔梭菌、德雷克氏梭菌、蟻酸醋酸梭菌、揚氏梭菌、大梭菌、拉氏梭菌、糞味梭菌、黏液真桿菌、熱自養穆爾氏菌、熱醋酸穆爾氏菌、普氏產醋桿菌、卵形鼠孢菌、銀醋酸鼠孢菌、球形鼠孢菌及基伍嗜熱厭氧菌。
然而，在一些實施例中，本發明之微生物為除自產乙醇梭菌、揚氏梭菌或拉氏梭菌以外的微生物。舉例而言，微生物可選自由以下組成之群組：大腸桿菌（ Escherichia coli）、釀酒酵母菌（ Saccharomyces cerevisiae）、丙酮丁醇梭菌（ Clostridium acetobutylicum）、拜氏梭菌（ Clostridium beijerinckii）、糖丁酸梭菌（ Clostridium saccharbutyricum）、糖乙酸多丁醇梭菌（ Clostridium saccharoperbutylacetonicum）、丁酸梭菌（ Clostridium butyricum）、二醇梭菌（ Clostridium diolis）、克氏梭菌（ Clostridium kluyveri）、巴斯德氏梭菌（ Clostridium pasteurianum）、諾維氏梭菌（ Clostridium novyi）、艱難梭菌（ Clostridium difficile）、熱纖梭菌（ Clostridium thermocellum）、解纖維梭菌（ Clostridium cellulolyticum）、嗜纖維梭菌（ Clostridium cellulovorans）、植物醱酵梭菌（ Clostridium phytofermentans）、乳酸乳球菌（ Lactococcus lactis）、枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（ Bacillus licheniformis）、運動醱酵單胞菌（ Zymomonas mobilis）、產酸克雷伯氏菌（ Klebsiella oxytoca）、肺炎克雷伯氏菌（ Klebsiella pneumonia）、麩胺酸棒狀桿菌（ Corynebacterium glutamicum）、瑞氏木黴（ Trichoderma reesei）、鉤蟲貪銅菌（ Cupriavidus necator）、惡臭假單胞菌（ Pseudomonas putida）、植物乳桿菌（ Lactobacillus plantarum）及扭脫甲基桿菌（ Methylobacterium extorquens）。
在一實施例中，本揭示案之微生物衍生自包含物種自產乙醇梭菌、揚氏梭菌及拉氏梭菌之梭菌屬之叢集。此等物種首先藉由Abrini, 《微生物學檔案（ Arch Microbiol）》, 161: 345-351, 1994（自產乙醇梭菌），Tanner, 《國際系統細菌學雜誌（ Int J System Bacteriol）》, 43: 232-236, 1993（揚氏梭菌）及Huhnke, WO 2008/028055（拉氏梭菌）進行報導及表徵。
此等三個物種有許多相似之處。特定言之，此等物種全部為梭菌屬之固定C1、厭氧、產乙酸、產乙醇及一氧化碳營養型成員。此等物種具有類似基因型及表現型及能量守恆及醱酵代謝模式。此外，此等物種叢集於16S rRNA DNA具有大於99%一致性之梭菌rRNA同源組I中，具有約22-30 mol%之DNA G+C含量，為革蘭氏陽性的，具有類似形態及大小（0.5-0.7×3-5 μm之間的對數生長細胞），為嗜溫性的（最佳生長於30-37℃下），具有約4-7.5之類似pH範圍（其中最佳pH為約5.5-6），不具有細胞色素且經由Rnf複合物使能量守恆。另外，已在此等物種中顯示使羧酸還原為其對應醇（Perez, 《生物技術與生物工程（ Biotechnol Bioeng）》, 110:1066-1077, 2012）。重要的是，此等物種亦全部顯示在含有CO氣體上之強自養生長，產生乙醇及乙酸酯（或乙酸）作為主要醱酵產物，且在某些條件下產生少量2,3-丁二醇及乳酸。
然而，此等三個物種亦具有許多不同之處。此等物種分離自不同來源：自產乙醇梭菌分離自家兔腸道，將揚氏梭菌分離自雞舍廢棄物，且拉氏梭菌分離自淡水沈積物。此等物種不同之處在於利用不同的糖（例如鼠李糖、阿拉伯糖）、酸（例如葡糖酸鹽、檸檬酸鹽）、胺基酸（例如精胺酸、組胺酸）以及其他受質（例如甜菜鹼、丁醇）。此外，此等物種對某些維生素（例如硫胺素、生物素）之營養缺陷型不同。此等物種在伍德-永達爾路徑基因及蛋白質之核酸及胺基酸序列方面具有差異，但已發現此等基因及蛋白質之一般組織及數目在所有物種中相同（Köpke, 《生物技術新見（ Curr Opin Biotechnol）》, 22: 320-325, 2011）。
因此，總體而言，自產乙醇梭菌、揚氏梭菌或拉氏梭菌之該等特性並非對該物種具有特異性，而是梭菌屬之固定C1、厭氧、產乙酸、產乙醇及一氧化碳營養型成員之此叢集之一般特性。然而，由於此等物種實際上不同，因此對此等物種中之一者之基因修飾或操縱可能不會對此等物種中之另一者中產生相同影響。舉例而言，可觀測到生長、效能或產物產生之差異。
本揭示案之微生物亦可衍生自自產乙醇梭菌、揚氏梭菌或拉氏梭菌之分離株或突變體。自產乙醇梭菌之分離株及突變體包括JA1-1（DSM10061）（Abrini, 《微生物學檔案》, 161: 345-351, 1994）、LZ1560（DSM19630）（WO 2009/064200）及LZ1561（DSM23693）（WO 2012/015317）。揚氏梭菌之分離株及突變體包括ATCC 49587（Tanner, 《國際系統細菌學雜誌》, 43: 232-236, 1993）、PETCT（DSM13528, ATCC 55383）、ERI‐2（ATCC 55380）（US 5,593,886）、C‐01 （TCC 55988）（US 6,368,819）、O‐52（ATCC 55989）（US 6,368,819）及OTA‐1（Tirado‐Acevedo, 《使用揚氏梭菌自合成氣產生生物乙醇（Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii）》, PhD thesis, 北卡羅來納州立大學（North Carolina State University）, 2010）。拉氏梭菌之分離株及突變體包括PI 1（ATCC BAA-622，ATCC PTA-7826）（WO 2008/028055）。
「受質」係指用於本揭示案之微生物之碳源及/或能量源。通常，受質為氣態的，且包含C1-碳源，例如CO、CO 2及/或CH 4。較佳地，受質包含CO或CO+CO 2之C1-碳源。受質亦可包含其他非碳組分，諸如H 2、N 2或電子。
受質通常包含至少一定量之CO，諸如約1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100 mol% CO。受質可包含一定範圍之CO，諸如約20-80、30-70或40-60 mol% CO。較佳地，受質包含約40-70 mol% CO（例如軋鋼廠或高爐氣體）、約20-30 mol% CO（例如鹼性氧氣轉爐氣體）或約15-45 mol% CO（例如合成氣）。在一些實施例中，受質可包含相對較低量之CO，諸如約1-10或1-20 mol% CO。本揭示案之微生物通常將受質中之至少一部分CO轉化為產物。在一些實施例中，受質不包含或實質上不包含（＜ 1 mol%）CO。
受質可包含一定量之H 2。舉例而言，受質可包含約1、2、5、10、15、20或30 mol% H 2。在一些實施例中，受質可包含相對較高量之H 2，諸如約60、70、80或90 mol% H 2。在其他實施例中，受質不包含或實質上不包含（＜1 mol%）H 2。
受質可包含一些量之CO 2。舉例而言，受質可包含約1-80或1-30 mol% CO 2。在一些實施例中，受質可包含低於約20、15、10或5 mol% CO 2。在另一實施例中，受質不包含或實質上不包含（＜1mol%）CO 2。
儘管受質通常為氣態的，但受質亦可以替代形式提供。舉例而言，受質可使用微泡分散發生器溶解於含CO氣體飽和液體中。藉助於其他實例，受質可吸附至固體載體上。
受質及/或C1-碳源可為作為工業製程之副產物獲得或來自一些其他來源（諸如來自汽車排出之煙或生物質氣化）的廢氣。在某些實施例中，工業製程選自由以下組成之群組：鐵類金屬產品製造（諸如軋鋼廠製造）、非鐵產品製造、石油精煉、煤炭氣化、電力產生、碳黑產生、氨產生、甲醇產生及焦炭製造。在此等實施例中，受質及/或C1-碳源可在其排放至大氣中之前使用任何便利方法自工業製程捕獲。
受質及/或C1-碳源可為合成氣，諸如藉由煤炭或精煉廠殘餘物氣化、生物質或木質纖維素材料氣化或天然氣重整所獲得之合成氣。在另一實施例中，合成氣可獲自城市固體廢物或工業固體廢物之氣化。受質及/或C1-碳源可在熱解油之後續部分氧化存在或不存在下衍生自熱解。
受質之組成可能對反應之效率及/或成本具有顯著影響。舉例而言，氧氣（O 2）之存在可降低厭氧醱酵過程之效率。取決於受質之組成，可能需要處理、洗滌或過濾受質以移除任何非所需雜質，諸如毒素、非所需組分或粉塵顆粒，及/或增加所需組分之濃度。
在特定實施例中，氫之存在導致醱酵過程之改良的總體效率。
可改良合成氣組成以提供所需或最佳H 2:CO:CO 2比率。合成氣組成可藉由調整進料至氣化過程之原料來改良。所需H 2:CO:CO 2比率取決於醱酵過程之所需醱酵產物。對於乙醇，最佳H 2:CO:CO 2比率將為：
Figure 02_image001
，其中
Figure 02_image003
，以便滿足乙醇產生之化學計量
Figure 02_image005
。
在氫存在之情況下操作醱酵過程具有降低由醱酵過程產生之CO 2量之附加益處。舉例而言，包含最少H 2之氣態受質將通常藉由以下化學計量產生乙醇及CO 2：[6 CO+3 H 2O → C 2H 5OH+4 CO 2]。隨著固定C1之細菌所利用之氫的量增加，所產生CO 2的量減少[例如，2 CO+4 H 2→ C 2H 5OH+H 2O]。
當CO為用於乙醇產生之唯一碳源及能量源時，碳之一部分損失為CO 2，如下： 6 CO+3 H 2O → C 2H 5OH+4 CO 2(ΔGº=-224.90 kJ/mol乙醇)
隨著受質中可用H 2的量增加，所產生CO 2的量減少。在2:1（H 2:CO）之化學計量比率下，完全避免CO 2產生。 5 CO+1 H 2+2 H 2O → 1 C 2H 5OH+3 CO 2(ΔGº=-204.80 kJ/mol乙醇) 4 CO+2 H 2+1 H 2O → 1 C 2H 5OH+2 CO 2(ΔGº=-184.70 kJ/mol乙醇) 3 CO+3 H 2→ 1 C 2H 5OH+1 CO 2(ΔGº=-164.60 kJ/mol乙醇)
「流」係指能夠例如自一個過程傳遞至另一過程、自一個模組傳遞至另一模組及/或自一個過程傳遞至碳捕獲構件之任何受質。
如本文中所使用之「反應物」係指參與及經歷化學反應期間變化之物質。在特定實施例中，反應物包括但不限於CO及/或H2。
如本文中所使用之「微生物抑制劑」係指減緩或防止特定化學反應或包括微生物之另一過程的一或多種成分。在特定實施例中，微生物抑制劑包括但不限於氧氣（O 2）、氰化氫（HCN）、乙炔（C 2H 2）及BTEX（苯、甲苯、乙苯、二甲苯）。
如本文中所使用，「催化劑抑制劑」、「吸附劑抑制劑」及類似者係指降低化學反應之速率或防止化學反應之一或多種物質。在特定實施例中，催化劑及/或吸附劑抑制劑可包括但不限於硫化氫（H 2S）及硫化羰（COS）。
「移除過程」、「移除模組」、「清除模組」及類似者包括能夠轉化及/或自氣流移除微生物抑制劑及/或催化劑抑制劑之技術。在特定實施例中，必須藉由上遊移除模組移除催化劑抑制劑以便防止下遊移除模組中一或多種催化劑之抑制。
如本文中所使用，術語「成分」、「污染物」及類似者係指可在氣流中發現之微生物抑制劑及/或催化劑抑制劑。在特定實施例中，該等成分包括但不限於硫化合物、芳族化合物、炔烴、烯烴（alkenes）、烷烴、烯烴（olefins）、氮化合物、含磷化合物、顆粒物質、固體、氧、鹵代化合物、含矽化合物、羰基、金屬、醇、酯、酮、過氧化物、醛、醚及焦油。
術語「經處理氣體」、「經處理流」及類似者係指已通過至少一個移除模組且已移除及/或轉化一或多個成分之氣流。
術語「所需組成」用於指諸如氣流（包括但不限於合成氣）之物質中組分之所需含量及類型。更特定言之，若氣體含有特定組分（例如CO、H 2及/或CO 2）及/或含有特定比例之特定組分及/或不含有特定組分（例如，有害於微生物之污染物）及/或不含有特定比例之特定組分，則氣體視為具有「所需組成」。超過一種組分可在測定氣流是否具有所需組成時加以考慮。
受質之組成可能對反應之效率及/或成本具有顯著影響。舉例而言，氧氣（O 2）之存在可降低厭氧醱酵過程之效率。取決於受質之組成，可能需要處理、洗滌或過濾受質以移除任何非所需雜質，諸如毒素、非所需組分或粉塵顆粒，及/或增加所需組分之濃度。
如本文中所使用之術語「碳捕獲」係指自包括CO 2及/或CO之流分離包含CO 2及/或CO之碳化合物，且： 將CO 2及/或CO轉化成產物；或 將CO 2及/或CO轉化成適用於長期儲存之物質；或 捕獲適用於長期儲存之物質中之CO 2及/或CO； 或此等過程之組合。
在某些實施例中，醱酵在不存在碳水化合物受質，諸如糖、澱粉、木質素、纖維素或半纖維素之情況下進行。
本揭示案之微生物可與氣態受質一起培養以產生一或多種產物。舉例而言，本揭示案之微生物可產生或可經工程改造以產生乙醇（WO 2007/117157）、乙酸酯（WO 2007/117157)、1-丁醇（WO 2008/115080、WO 2012/053905及WO 2017/066498）、丁酸酯（WO 2008/115080）、2,3-丁二醇（WO 2009/151342及WO 2016/094334）、乳酸酯（WO 2011/112103）、丁烯（WO 2012/024522）、丁二烯（WO 2012/024522）、甲基乙基酮（2-丁酮）（WO 2012/024522及WO 2013/185123）、乙烯（WO 2012/026833）、丙酮（WO 2012/115527）、異丙醇（WO 2012/115527）、脂質（WO 2013/036147）、3-羥基丙酸酯（3-HP）（WO 2013/180581）、萜類，除了2-苯乙醇以外，亦包括異戊二烯（WO 2013/180584）、脂肪酸（WO 2013/191567）、2-丁醇（WO 2013/185123）、1,2-丙二醇（WO 2014/036152）、1-丙醇（WO 2017/066498）、1-己醇（WO 2017/066498）、1-辛醇（WO 2017/066498）、分支酸衍產生物（WO 2016/191625）、3-羥基丁酸酯（WO 2017/066498）、1,3-丁二醇（WO 2017/066498）、2-羥基異丁酸酯或2-羥基異丁酸（WO 2017/066498）、異丁烯（WO 2017/066498）、己二酸（WO 2017/066498）、1,3-己二醇（WO 2017/066498）、3-甲基-2-丁醇（WO 2017/066498）、2-丁烯-1-醇（WO 2017/066498）、異戊酸酯（WO 2017/066498）、異戊醇（WO 2017/066498）及/或單乙二醇（WO 2019/126400）。在某些實施例中，微生物生物質本身可視為產物。此等產物可進一步轉化以產生柴油、噴射機燃料及/或汽油之至少一種組分。在某些實施例中，2-苯乙醇可用作芳香劑、精油、調味劑及皂類中之成分。另外，微生物生物質可進一步加工以產生單細胞蛋白質（SCP）。
「單細胞蛋白質」（SCP）係指可用於富含蛋白質之人類餐食及/或動物飼料中，通常替代蛋白質補充物之習知來源之微生物生物質，諸如豆粕或魚粉。為產生單細胞蛋白質或其他產物，該過程可包含額外的分離、加工或處理步驟。舉例而言，該方法可包含對微生物生物質進行滅菌，使微生物生物質離心及/或將微生物生物質乾燥。在某些實施例中，微生物生物質使用噴霧乾燥或槳葉乾燥來乾燥。該方法亦可包含使用此項技術中已知之任何方法降低微生物生物質之核酸含量，因為攝入高核酸含量之膳食可能導致核酸降解產物積聚及/或胃腸窘迫。單細胞蛋白質可適用於餵養動物，諸如家畜或寵物。特定言之，動物飼料可適用於餵養一或多頭肉牛、奶牛、豬、綿羊、山羊、馬、騾子、驢、鹿、水牛/野牛、美洲駝、羊駝、馴鹿、駱駝、野牛、大額牛、犛牛、雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、珍珠雞、雛鳥/鴿子、魚、蝦、甲殼動物、貓、狗及嚙齒動物。動物飼料之組成可根據不同動物之營養要求調整。此外，該過程可包含將微生物生物質與一或多種賦形劑摻合或組合。
「賦形劑」可指可添加至微生物生物質以增強或改變動物飼料之形式、屬性或營養含量之任何物質。舉例而言，賦形劑可包含以下中之一或多者：碳水化合物、纖維、脂肪、蛋白質、維生素、礦物質、水、香料、甜味劑、抗氧化劑、酶、防腐劑、益生菌或抗生素。在一些實施例中，賦形劑可為乾草、稻草、青貯料、穀物、油或脂肪或其他植物材料。賦形劑可為Chiba，第18節：《飲食調配及常見飼料成分（Diet Formulation and Common Feed Ingredients）》，《動物營養手冊（Animal Nutrition Handbook）》，第3修訂版，第575-633頁，2014中所確認之任何飼料成分。
「天然產物」為藉由未經基因修飾之微生物產生之產物。舉例而言，乙醇、乙酸酯及2,3-丁二醇為自產乙醇梭菌、揚氏梭菌及拉氏梭菌之天然產物。「非天然產物」為藉由經基因修飾微生物產生而非藉由衍生經基因修飾微生物之未經基因修飾微生物產生之產物。
「選擇性」係指目標產物之產量與藉由微生物產生之所有醱酵產物之產量的比率。本揭示案之微生物可經工程改造而以一定選擇性或最小選擇性產產生物。在一個實施例中，目標產物占由本揭示案之微生物產生之所有醱酵產物的至少約5%、10%、15%、20%、30%、50%或75%。在一個實施例中，目標產物占藉由本揭示案之微生物產生之所有醱酵產物之至少10%，使得本揭示案之微生物對至少10%之目標產物具有選擇性。在另一實施例中，目標產物占藉由本揭示案之微生物產生之所有醱酵產物之至少30%，使得本揭示案之微生物對至少30%之目標產物具有選擇性。
「提高效率」、「提高之效率」及類似者包括但不限於提高生長速率、產物產生速率或體積、消耗的每體積受質之產物體積或產物選擇性。效率可相對於衍生本揭示案之微生物之親本微生物之效能量測。
通常，在生物反應器中進行培養。術語「生物反應器」包括培養/醱酵裝置，其由一或多個容器、塔或管道配置組成，諸如連續攪拌槽反應器（CSTR）、固定細胞反應器（ICR）、滴流床反應器（TBR）、氣泡柱、氣升式醱酵罐、靜態混合器或適用於氣-液接觸之另一容器或另一裝置。在一些實施例中，生物反應器可包含第一生長反應器及第二培養/醱酵反應器。可將受質提供至此等反應器中之一者或兩者。如本文中所使用，術語「培養」及「醱酵」可互換使用。此等術語涵蓋培養/醱酵過程之生長階段及產物生物合成階段。
通常在含有足以准許微生物生長之營養物、維生素及/或礦物質之水性培養基中維持培養物。較佳地，水性培養基為厭氧微生物生長培養基，諸如最小厭氧微生物生長培養基。合適的培養基為此項技術中所熟知。
培養/醱酵期望應在適用於產生目標產物之條件下進行。通常，培養/醱酵在厭氧條件下進行。應考慮之反應條件包括壓力（或分壓）、溫度、氣體流速、液體流速、培養基pH、培養基氧化還原電位、攪拌速率（若使用連續攪拌槽反應器）、接種物水準、確保液相中之氣體不會變成限制性之最大氣體受質濃度及避免產物抑制之最大產物濃度。特定言之，可控制受質之引入速率以確保液相中之氣體之濃度不會變成限制性的，因為在氣體限制條件下，培養物可能消耗產物。
在高壓下操作生物反應器允許增加自氣相至液相之氣體質量轉移速率。因此，在高於大氣壓之壓力下進行培養/醱酵通常較佳。此外，因為既定氣體轉化率部分為受質滯留時間之函數，且滯留時間指示生物反應器之所需體積，所以使用加壓系統可大大減小所需生物反應器之體積，且因此降低培養/醱酵設備之資金成本。此又意謂當生物反應器維持在高壓而非大氣壓下時，滯留時間（定義為生物反應器中之液體體積除以輸入氣體流動速率）可減少。最佳反應條件將部分地取決於所用特定微生物。然而，一般而言，較佳在高於大氣壓之壓力下操作醱酵。此外，因為既定氣體轉化率部分為受質滯留時間之函數，且實現所需滯留時間又指示生物反應器之所需體積，所以使用加壓系統可大大減小所需生物反應器之體積，且因此降低醱酵設備之資金成本。
在某些實施例中，醱酵在不存在光之情況下或在不存在足以滿足光合微生物之能量需求之光量之情況下進行。在某些實施例中，本揭示案之微生物為非光合微生物。
如本文中所使用，術語「醱酵液」或「培養液」係指生物反應器中組分之混合物，其包括細胞及營養物培養基。如本文中所使用，「分離器」為適於自生物反應器接收醱酵液且使培養液通過過濾器以產生「滲餘物」及「滲透物」之模組。過濾器可為薄膜，例如交叉流薄膜或中空纖維薄膜。術語「滲透物」用於指通過分離器之培養液之實質上可溶的組分。滲透物將通常含有可溶醱酵產物、副產物及營養物。滲餘物將通常含有細胞。如本文中所使用，術語「培養液滲出物」用於指自生物反應器移除且不傳遞至分離器之醱酵液的一部分。
目標產物可使用任何方法或此項技術中已知方法之組合自醱酵培養液分離或純化，該等方法包括例如分餾、蒸發、滲透蒸發、氣體汽提、相分離及萃取醱酵，包括例如液-液萃取。在某些實施例中，目標產物藉由以下步驟自醱酵培養液回收：自生物反應器連續移除培養液之一部分，分離微生物細胞與培養液（宜藉由過濾進行），及自培養液回收一或多種目標產物。醇及/或丙酮可例如藉由蒸餾回收。酸可例如藉由吸附於活性炭上回收。所分離微生物細胞較佳地再循環回至生物反應器。在移除目標產物之後剩餘之不含細胞之滲透物亦較佳地返回至生物反應器。可將額外營養物添加至不含細胞之滲透物中以在滲透物返回至生物反應器之前補充培養基。
如本文中所提及，「穿梭微生物」為其中表現甲基轉移酶之微生物，且不同於目的微生物。
如本文中所提及，「目的微生物」為其中表現包括於表現構築體/載體上之基因之微生物，且不同於穿梭微生物。此亦稱作宿主微生物。
術語「主要醱酵產物」意謂以最高濃度及/或產率產生之一種醱酵產物。可存在一或多種醱酵產物。最普遍的可為或可不為在商業上最有價值的。
片語「包含一氧化碳之受質」及類似術語應理解為包括其中一氧化碳可用於一或多種細菌菌株以用於例如生長及/或醱酵之任何受質。
片語「包含一氧化碳之氣態受質」及類似片語及術語包括含有一定含量之一氧化碳之任何氣體。在某些實施例中，受質含有至少約20體積%至約100體積% CO、20體積%至70體積% CO、30體積%至60體積% CO及40體積%至55體積% CO。在特定實施例中，受質包含約25體積%、或約30體積%、或約35體積%、或約40體積%、或約45體積%、或約50體積% CO，或約55體積% CO，或約60體積% CO。
儘管包含CO之受質不必含有任何氫氣，但H 2之存在不應對根據本揭示案之方法之產物形成有害。在特定實施例中，氫之存在導致乙醇產生之改良的總體效率。舉例而言，在特定實施例中，受質可包含大約2:1、或1:1、或1:2比率之H 2:CO。在一個實施例中，受質包含約30體積%或更少H 2、20體積%或更少H 2、約15體積%或更少H 2或約10體積%或更少H 2。在其他實施例中，受質流包含低濃度H 2，例如小於5%、或小於4%、或小於3%、或小於2%、或小於1%，或實質上不含氫。受質亦可含有一些CO 2，例如約1體積%至約80體積% CO 2，或1體積%至約30體積% CO 2。在一個實施例中，受質包含小於或等於約20體積% CO 2。在特定實施例中，受質包含小於或等於約15體積% CO 2、小於或等於約10體積% CO 2、小於或等於約5體積% CO 2，或實質上不含CO 2。
片語「包含二氧化碳之受質」及類似術語應理解為包括其中二氧化碳可用於一或多種細菌菌株以用於例如生長及/或醱酵之任何受質。包含二氧化碳之受質可進一步包含氫及/或一氧化碳。
片語「包含二氧化碳之氣態受質」及類似片語及術語包括含有一定含量之二氧化碳之任何氣體。在某些實施例中，受質含有至少約10體積%至約60體積% CO 2、20體積%至50體積% CO 2、30體積%至60體積% CO 2及40體積%至55體積% CO 2。在特定實施例中，受質包含約20體積%、或約25體積%、或約30體積%、或約35體積%、或約40體積%、或約45體積%、或約50體積% CO、或約55體積% CO、或約60體積% CO 2。
較佳地，包含CO 2之受質亦將含有一定含量之CO或H 2。在特定實施例中，受質包含至少約1:1、或至少約1:2、或至少約1:3、或至少約1:4、或至少約1:5之CO 2:H 2比率。
在以下描述中，本揭示案之實施例根據遞送及醱酵「含有CO及/或CO 2之氣態受質」加以描述。然而，應瞭解，氣態受質可以替代形式提供。舉例而言，可提供溶解於液體中之含有CO及/或CO 2之氣態受質。基本上，液體經含有一氧化碳之氣體飽和，且接著將該液體添加至生物反應器中。此可使用標準方法來實現。藉助於實例，可使用微泡分散發生器（Hensirisak等人，用於好氣醱酵之微泡分散發生器的規模放大（Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation）；應用生物化學與生物技術（Applied Biochemistry and Biotechnology）第101卷，第3冊/2002年10月）。藉助於另一實例，含有CO之氣態受質可吸附至固體載體上。藉由使用術語「含有CO及/或CO 2之受質」及類似者涵蓋此類替代方法。
在本揭示案之特定實施例中，含CO之氣態受質（或包含CO 2、或CO及CO 2、或CO 2及H 2及CO之氣態受質）為工業廢氣或廢氣。「工業廢料或廢氣」應廣泛地用以包括任何氣體，該等氣體包含藉由工業製程產生之CO及/或CO 2，且包括由於鐵類金屬產品製造、非鐵產品製造、石油精煉過程、煤炭氣化、生物質氣化、電力產生、碳黑產生及焦炭製造而產生之氣體。其他實例可提供於本文別處。
除非上下文另有要求，否則如本文中所使用，片語「醱酵」、「醱酵過程」或「醱酵反應」及類似者意欲涵蓋該過程之生長階段及產物生物合成階段。如本文中進一步描述，在一些實施例中，生物反應器可包含第一生長反應器及第二醱酵反應器。因而，將金屬或組合物添加至醱酵反應應理解為包括添加至此等反應器中之任一者或兩者。
術語「生物反應器」包括醱酵裝置，其由一或多個容器及/或塔或管道配置組成，該裝置包括連續攪拌槽反應器（CSTR）、固定細胞反應器（ICR）、滴流床反應器（TBR）、氣泡柱、氣升式醱酵罐、靜態混合器或適用於氣-液接觸之另一容器或另一裝置。在一些實施例中，生物反應器可包含第一生長反應器及第二醱酵反應器。因而，當提及將受質添加至生物反應器或醱酵反應時，應理解為包括適當時添加至此等反應器中之任一者或兩者。
應瞭解，本揭示案可使用序列與本文中具體例示之序列不同的核酸來實施，只要其執行實質上相同的功能。對於編碼蛋白質或肽之核酸序列，此意謂經編碼之蛋白質或肽具有實質上相同的功能。對於表示啟動子序列之核酸序列，變異體序列將具有促進一或多個基因之表現的能力。此類核酸在本文中可稱為「功能等效變異體」。藉助於實例，核酸之功能等效變異體包括等位基因變異體、基因片段、包括突變（缺失、插入、核苷酸取代及類似者）及/或多態性及類似者之基因。來自其他微生物之同源基因亦可視為本文中具體例示之序列之功能等效變異體之實例。
此等包括諸如揚氏梭菌、橙色綠屈撓菌、金屬球菌屬或硫化葉菌屬之物種中之同源基因，其細節可在諸如Genbank或NCBI之網站上公開獲得。片語「功能等效變異體」亦應視為包括序列由於特定微生物之密碼子優化而變化之核酸。本文中之核酸之「功能等效變異體」將較佳地與所鑑別核酸具有至少約70%、較佳地約80%、更佳地約85%、較佳地約90%、較佳地約95%或更大核酸序列一致性。
亦應瞭解，本揭示案可使用序列與本文中具體例示之胺基酸序列不同的多肽來實踐。此等變異體在本文中可稱為「功能等效變異體」。蛋白質或肽之功能等效變異體包括與所鑑別之蛋白質或肽共用至少40%、較佳地50%、較佳地60%、較佳地70%、較佳地75%、較佳地80%、較佳地85%、較佳地90%、較佳地95%或更大胺基酸一致性且具有與所關注之肽或蛋白質實質上相同的功能的彼等蛋白質或肽。此類變異體在其範疇內包括蛋白質或肽之片段，其中片段包含多肽之截短形式，其中缺失可為1至5、至10、至15、至20、至25個胺基酸，且可在多肽之任一端自殘基1至25延伸，且其中缺失在區內可具有任何長度；或可處於內部位置。本文中之特定多肽之功能等效變異體亦應視為包括由其他細菌物種中之同源基因表現之多肽，例如如先前段落中所例示。
本揭示案之微生物可使用此項技術中已知用於產生重組微生物之任何數目之技術由親本微生物及一或多種外源核酸製備。僅藉助於實例，轉型（包括轉導或轉染）可藉由電穿孔、超音波處理、聚乙二醇介導之轉型、化學或天然感受態或綴合來實現。合適的轉化技術例如描述於Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T:分子選殖（Molecular Cloning）:實驗室手冊（A laboratory Manual）,冷泉港實驗室出版社（Cold Spring Harbour Laboratory Press）,冷泉港（Cold Spring Harbour）, 1989中。
在某些實施例中，由於在待轉型微生物中具有活性之限制系統，有必要將待引入微生物中之核酸甲基化。此可使用多種技術進行，包括下文所描述之彼等技術，且進一步例示於下文實例部分中。
藉助於實例，在一個實施例中，本揭示案之重組微生物藉由包含以下步驟之方法產生：將（i）如本文中所描述之表現構築體/載體及（ii）包含甲基轉移酶基因之甲基化構築體/載體引入至穿梭微生物中；表現甲基轉移酶基因；自穿梭微生物分離一或多個構築體/載體；及將一或多個構築體/載體引入至目的微生物中。
在一個實施例中，組成性表現步驟B之甲基轉移酶基因。在另一實施例中，誘導步驟B之甲基轉移酶基因之表現。
穿梭微生物為促進構成表現構築體/載體之核酸序列之甲基化的微生物，較佳地為限制陰性微生物。在特定實施例中，穿梭微生物為限制陰性大腸桿菌（ E. coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）或乳酸乳球菌（ Lactococcus lactis）。
甲基化構築體/載體包含編碼甲基轉移酶之核酸序列。
一旦表現構築體/載體及甲基化構築體/載體引入穿梭微生物中，則誘導存在於甲基化構築體/載體上之甲基轉移酶基因。誘導可藉由任何合適的啟動子系統實現，但在本揭示案之一個特定實施例中，甲基化構築體/載體包含誘導性lac啟動子且藉由添加乳糖或其類似物，更佳地為異丙基-β-D-硫代-半乳糖苷（IPTG）來誘導。其他合適的啟動子包括ara、tet或T7系統。在本揭示案之另一實施例中，甲基化構築體/載體啟動子為組成性啟動子。
在一個特定實施例中，甲基化構築體/載體具有對穿梭微生物之一致性具有特異性之複製起點，使得存在於甲基化構築體/載體上之任何基因表現於穿梭微生物中。較佳地，表現構築體/載體具有對目的微生物之一致性具有特異性之複製起點，使得存在於表現構築體/載體上之任何基因表現於目的微生物中。
甲基轉移酶之表現導致存在於表現構築體/載體上之基因之甲基化。表現構築體/載體可接著根據多種已知方法中之任一者自穿梭微生物分離。僅藉助於實例，下文所描述之實例部分中所描述之方法可用於分離表現構築體/載體。
在一個特定實施例中，兩個構築體/載體同時分離。
可使用任何數目之已知方法將表現構築體/載體引入至目的微生物中。然而，藉助於實例，可使用下文實例部分中所描述之方法。由於表現構築體/載體經甲基化，因此存在於表現構築體/載體上之核酸序列能夠併入至目的微生物中且成功地表現。
據設想，可將甲基轉移酶基因引入至穿梭微生物中且過度表現。因此，在一個實施例中，所得甲基轉移酶可使用已知方法收集且活體外用於甲基化表現質體。可接著將表現構築體/載體引入至目的微生物中以用於表現。在另一實施例中，將甲基轉移酶基因引入至穿梭微生物之基因體中，隨後將表現構築體/載體引入至穿梭微生物中，自穿梭微生物分離一或多個構築體/載體，且接著將表現構築體/載體引入至目的微生物中。
據設想，如上文所定義之表現構築體/載體及甲基化構築體/載體可組合以提供物質組合物。此組合物在避開限制障壁機制以產生本揭示案之重組微生物方面具有特定效用。
在一個特定實施例中，表現構築體/載體及/或甲基化構築體/載體為質體。
一般熟習此項技術者將瞭解用於產生本揭示案之微生物之多種合適的甲基轉移酶。然而，藉助於實例，可使用枯草芽孢桿菌噬菌體ΦT1甲基轉移酶及本文實例中所描述之甲基轉移酶。考慮到所需甲基轉移酶及基因密碼之序列，將容易瞭解編碼合適的甲基轉移酶之核酸。
適於允許表現甲基轉移酶基因之任何數目之構築體/載體可用於產生甲基化構築體/載體。
在一個實施例中，受質包含CO。在一個實施例中，受質包含CO 2及CO。在另一實施例中，受質包含CO 2及H 2。在另一實施例中，受質包含CO 2及CO及H 2。
在本揭示案之一個特定實施例中，藉由微生物醱酵之氣態受質為含有CO之氣態受質。氣態受質可為作為工業製程之副產物獲得或來自一些其他來源（諸如來自汽車排出之煙）的含CO廢氣。在某些實施例中，工業製程選自由以下組成之群組：鐵類金屬產品製造（諸如軋鋼廠）、非鐵產品製造、石油精煉過程、煤炭氣化、電力產生、碳黑產生、氨產生、甲醇產生及焦炭製造。在此等實施例中，含CO氣體可在其排放至大氣中之前使用任何便利方法自工業製程捕獲。CO可為合成氣（包含一氧化碳及氫氣之氣體）之組分。自工業製程產生之CO通常燃燒以產生CO 2，且因此本揭示案在減少CO 2溫室氣體排放及產生用作生物燃料之丁醇方面具有特定效用。取決於含CO氣態受質之組成，亦可能需要在將其引入醱酵之前對其進行處理以移除任何非所需雜質，諸如粉塵顆粒。舉例而言，可使用已知方法過濾或洗滌氣態受質。
在本揭示案之特定實施例中，藉由微生物醱酵之氣態受質為包含CO2及H2之氣態受質。含CO2/H2之受質可為作為工業製程之副產物獲得之廢氣。在某些實施例中，工業製程選自由氫氣產生組成之群組。在某些實施例中，包含CO2及H2之氣態受質可為摻合氣流，其中氣流之至少一部分衍生自一或多種工業製程，與CO2或H2之至少一部分摻合以使氣態受質之CO2:H2比率最佳化。此可尤其有益於富含CO2或H2之工業氣流。產生可用作CO2及H2受質或CO2及H2摻合受質之來源之副產物氣流的工業製程之實例包括焦炭製造、精煉廠製程、氨生產製程、甲醇生產製程、乙酸生產、天然氣精煉廠及發電廠。
應瞭解，對於細菌之生長及氣體向包含例如醇之產物之轉化，將需要將除了含CO及/或CO 2之受質氣體以外的適合液體培養基饋入生物反應器中。受質及培養基可以連續、分批或分批進料方式饋入生物反應器中。培養基將含有足以准許所用微生物生長之維生素及礦物質。適用於醱酵以使用CO及/或CO 2產生一或多種產物之厭氧培養基為此項技術中已知的。舉例而言，合適的培養基描述為Biebel（2001）。在本揭示案之一個實施例中，培養基如下文實例部分中所描述。
醱酵應理想地在適於支持將氣體轉化為包含醇之產物之醱酵的條件下進行。應考慮之反應條件包括壓力、溫度、氣體流速、液體流速、培養基pH、培養基氧化還原電位、攪拌速率（若使用連續攪拌槽反應器）、接種物水準、確保液相中之CO及/或CO 2不會變成限制性之最大氣體受質濃度及避免產物抑制之最大產物濃度。
另外，常常需要增加受質流之CO及/或CO 2濃度（或氣態受質中之CO及/或CO 2分壓），且因此提高CO及/或CO 2為受質之醱酵反應之效率。在增加之壓力下操作允許CO及/或CO 2自氣相轉移至液相之速率顯著增加，其中其可由微生物吸收作為碳源以製造包含醇之產物。此又意謂當生物反應器維持在高壓而非大氣壓力下時，滯留時間（定義為生物反應器中之液體體積除以輸入氣體流動速率）可減少。最佳反應條件將部分地取決於所使用之本揭示案之特定微生物。然而，一般而言，較佳的為在高於環境壓力之壓力下進行醱酵。此外，因為既定的CO及/或CO 2轉化成至少醇之轉化率部分為受質滯留時間之函數，且實現所需滯留時間又指示生物反應器之所需體積，所以使用加壓系統可大大減小所需生物反應器之體積，且因此降低醱酵設備之資金成本。根據美國專利第5,593,886號中給出之實例，反應器體積可與反應器操作壓力之增加成線性比例地減小，亦即在10個大氣壓下操作之生物反應器僅需要為在1個大氣壓下操作之彼等生物反應器之體積的十分之一。
藉助於實例，已描述在高壓下進行氣體至乙醇醱酵之益處。舉例而言，WO 02/08438描述在30 psig及75 psig之壓力下進行的氣體至乙醇醱酵，分別得到150 g/l/天及369 g/l/天之乙醇產率。然而，發現在大氣壓下使用類似培養基及輸入氣體組合物進行之實例醱酵每天每公升產生少10倍與20倍之間的乙醇。
亦需要含CO及/或CO 2之氣態受質之引入速率為此以便確保液相中之CO及/或CO 2之濃度不變成限制性的。此係因為CO及/或CO 2受限條件之結果可為一或多種產物由培養物消耗。
用於饋入醱酵反應之氣流之組成可對該反應之效率及/或成本具有顯著影響。舉例而言，O 2可降低厭氧醱酵過程之效率。在醱酵之前或之後之醱酵過程階段中對非所需或不必要之氣體的加工可增加該等階段之負擔（對於包含其中氣流在進入生物反應器之前經壓縮之產物，可使用不必要之能量來壓縮在醱酵中非所需之氣體）。因此，可能需要處理受質流，尤其衍生自工業來源之受質流，以移除非所需組分且增加所需組分之濃度。
在某些實施例中，本揭示案之細菌之培養物維持於水性培養基中。較佳地，水性培養基為基本厭氧微生物生長培養基。合適的培養基為此項技術中已知的且描述於例如美國專利第5,173,429號及第5,593,886號以及WO 02/08438中，且如下文實例部分中所描述。
醇或含有醇及/或一或多種其他產物之混合流可藉由此項技術中已知之方法自醱酵培養液回收，該等方法諸如分餾或蒸發、滲透蒸發、氣體汽提及萃取醱酵，包括例如液-液萃取。
在本揭示案之某些實施例中，醇及一或多種產物係藉由以下步驟自醱酵培養液回收：自生物反應器連續移除培養液之一部分，將微生物細胞自該培養液分離（宜藉由過濾進行），及自該培養液回收一或多種產物。醇可適宜地例如藉由蒸餾回收。丙酮可例如藉由蒸餾回收。所產生之任何酸可例如藉由吸附於活性炭上來回收。所分離微生物細胞較佳地返回至醱酵生物反應器。在移除任何醇及酸之後剩餘之不含細胞之滲透物亦較佳地返回至醱酵生物反應器中。可將額外營養物（諸如B維生素）添加至不含細胞之滲透物中以在滲透物返回至生物反應器之前補充營養培養基。
此外，若如上文所描述調節培養液之pH以增強乙酸對活性炭之吸附，則在返回至生物反應器之前，應將pH重新調節至與醱酵生物反應器中之培養液之pH類似的pH。
產物可在醱酵之後使用任何適當方法回收，該方法包括但不限於滲透蒸發、逆滲透及液體萃取技術。
一個實施例係關於一種能夠自氣態受質產生產物的經基因工程改造之微生物，其中該微生物包含迭代路徑，該迭代路徑包含： a)    編碼能夠催化(C n)-醯基CoA轉化為β-酮醯基-CoA之一組酶的核酸； b)   編碼能夠催化β-酮醯基-CoA轉化為β-羥基醯基-CoA之一組外源酶的核酸； c)    編碼能夠催化β-羥基醯基-CoA轉化為反-Δ 2-烯醯基-CoA之一組外源酶的核酸； d)   編碼能夠催化反-Δ 2-烯醯基-CoA轉化為(C n+2)醯基-CoA之一組外源酶的核酸； e)    一或多種終止酶；且其中該微生物係在硫酯酶中包含破壞性突變之固定C1之細菌。
根據一個實施例之微生物，其中該迭代路徑為逆生物合成方向之β氧化路徑。
根據一個實施例之微生物，其中a)該編碼能夠催化(C n)-醯基CoA轉化為β-酮醯基-CoA之一組酶的核酸為硫解酶、醯基-CoA乙醯基轉移酶或聚酮合酶。
根據一個實施例之微生物，其中b)該編碼能夠催化β-酮醯基-CoA轉化為β-羥基醯基-CoA之一組酶的核酸為β-酮醯基-CoA還原酶或β-羥基醯基-CoA去氫酶。
根據一個實施例之微生物，其中c)該編碼能夠催化β-酮醯基-CoA轉化為反-Δ 2-烯醯基-CoA之一組外源酶的核酸為β-羥基醯基-CoA脫水酶。
根據一個實施例之微生物，其中d)該編碼能夠催化反-Δ 2-烯醯基-CoA轉化為(C n+2)醯基-CoA之一組外源酶的核酸為反-烯醯基-CoA還原酶或丁醯基-CoA去氫酶/電子轉移黃素蛋白AB（Bcd-EtfAB）。
根據一個實施例之微生物，其中該一或多種終止酶選自醇形成輔酶-A硫酯還原酶、醛形成CoA硫酯還原酶、醇去氫酶、硫酯酶、醯基-CoA:乙醯基-CoA轉移酶、磷酸轉醯基酶及羧酸激酶；醛鐵氧化還原蛋白氧化還原酶；醛形成CoA硫酯還原酶、醛脫羰酶、醇去氫酶；醛去氫酶及醯基-CoA還原酶。
根據一個實施例之微生物，其中該等外源酶能夠產生C n+2乙酸、C n+23-OH-酸、C n+2烯酸、C n+21-酸、C n+2酮、C n+2甲基-2-醇、C n+21,3-二醇、1,4-二醇、1,6-二醇、C n+22-烯-1-醇、C n+21-醇、二酸或其任何組合。
根據一個實施例之微生物，其中該微生物為選自由以下組成之群組之屬的成員：醋桿菌屬、嗜鹼菌屬、布勞特氏菌屬、丁酸桿菌屬、梭菌屬、真桿菌屬、穆爾氏菌屬、產醋桿菌屬、鼠孢菌屬及熱厭氧桿菌屬。
根據一個實施例之微生物，其中選自a)、b)、c)、d)及e)之該組外源酶係以任何次序排列於單個操縱子中或以任何次序排列於多個操縱子中。
根據一個實施例之微生物，其係選自自產乙醇梭菌、揚氏梭菌、拉氏梭菌、大腸桿菌、釀酒酵母菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、丁酸梭菌、二醇梭菌、克氏梭菌、巴斯德氏梭菌、諾維氏梭菌、艱難梭菌、熱纖梭菌、解纖維梭菌、嗜纖維梭菌、植物醱酵梭菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、運動醱酵單胞菌、產酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌、麩胺酸棒狀桿菌、瑞氏木黴、鉤蟲貪銅菌、惡臭假單胞菌、植物乳桿菌或扭脫甲基桿菌。
根據一個實施例之細菌，其中該微生物進一步包含在一級-二級醇去氫酶基因、3-羥基丁醯基CoA去氫酶基因、磷酸乙醯基轉移酶（pta）、乙酸激酶（ack）、醛-醇去氫酶（adhE1）、β-羥基丁酸去氫酶（bdh）、ctf或其任何組合中的破壞性突變。
根據一個實施例之微生物，其中該產物係選自一級醇、反式Δ 2脂肪醇、β-酮醇、1,3-二醇、1,4-二醇、1,6-二醇、二酸、β-羥基酸、羧酸或烴。
根據一個實施例之微生物，其進一步包含醯基-CoA引子及延伸物，其中該引子及延伸物能夠進行循環、迭代路徑操作。
根據一個實施例之微生物，其中該引子及延伸物係選自草醯基-CoA、乙醯基-CoA、丙二醯基CoA、丁二醯基-CoA、羥基乙醯基-CoA、3-羥基丙醯基-CoA、4-羥基丁醯基-CoA、2-胺基乙醯基-CoA、3-胺基丙醯基-CoA、4-胺基丁醯基-CoA、異丁醯基-CoA、3-甲基-丁醯基-CoA、2-羥基丙醯基-CoA、3-羥基丁醯基-CoA、2-胺基丙醯基-CoA、丙醯基-CoA及戊醯基-CoA。
根據一個實施例之微生物，其中該引子及/或延伸物係乙醯基-CoA。
根據一個實施例之微生物，其中該微生物進一步包含在多於一種硫酯酶中之破壞性突變。
根據一個實施例之微生物，其中a)、b)、c)、d)及e)之該組酶對於該微生物為非天然的。
一個實施例為一種產生產物之方法，該方法包含在氣態受質之存在下培養如技術方案1之經基因工程改造之微生物。
根據一個實施例之方法，其中該氣態受質包含C1-碳源，該C1-碳源包含CO、CO 2及/或H 2。
根據一個實施例之方法，其中該產物係選自一級醇、1,4-二醇、1,6-二醇、二酸、反式Δ 2脂肪醇、β-酮醇、1,3-二醇、β-羥基酸、羧酸或烴。 實例
以下實例進一步說明本揭示案之方法及組成，但當然不應視為以任何方式限制其範疇。
在此工作中，rBOX路徑基因，尤其硫解酶（THL）、β-酮醯基-CoA還原酶（KCR）、β-羥基-CoA脫水酶（HCD）、烯醯基-CoA還原酶/丁醯基-CoA去氫酶、電子轉移蛋白質AB複合物（bcd-etfAB）及終止酶（硫酯酶、醯基-CoA還原酶、磷酸轉乙醯酶、羧酸激酶）的模組化表現係在固定C1之細菌中進行以產生C4-C10醇及酸。在以下實例中異源表現之rBOX路徑及基因展示於 表 2中。 表 2 ：用於路徑原型設計之rBOX路徑基因變異體
酶 基因 來源
硫解酶 fadA 大腸桿菌
   Cace_thlA 丙酮丁醇梭菌
   Cklu_thlA 克氏梭菌
   Eco_thlA 大腸桿菌
   Reut_bktB 富養羅爾斯通氏菌（ Ralstonia eutropha）
   Reut_Bktb_M158A 富養羅爾斯通氏菌
   atoB 大腸桿菌
β-酮醯基-CoA還原酶 Cklu_Hbd1 克氏梭菌 DSM555
   Cklu_Hbd2 克氏梭菌 DSM556
   Cace_Hbd1 丙酮丁醇梭菌
   Cnec_PhaB 鉤蟲貪銅菌
   Cbei_Hbd 拜氏梭菌
   Cace_Hbd2 丙酮丁醇梭菌 ATCC824
   DJ012_hbd 拜氏梭菌
   DJ019_hbd 拜氏梭菌
β-羥基醯基-CoA脫水酶 Cac_Crt 丙酮丁醇梭菌
   DJ012_FabZ 拜氏梭菌 DJ012
   Ctyr_crt 酪丁酸梭菌（ Clostridium tyrobutyricum）
   Cbut_crt 丁酸梭菌
   Pae_phaJ1 銅綠假單胞菌（ Pseudomonas aeruginosa）
   Pae_phaJ4 銅綠假單胞菌
   Acav_phaJ 豚鼠氣單胞菌（ Aeromonas caviae）
   Ec_FadB 大腸桿菌
烯醯基-CoA還原酶/丁醯基-CoA去氫酶、電子轉移蛋白質AB複合物 cac_bcd_etfAB 丙酮丁醇梭菌 ATCC824
   Cbei-bcd_etfAB 拜氏梭菌 NCIMB 8052
   Cty_bcd_etfAB 酪丁酸梭菌
   Tde_ter 齒垢密螺旋體（ Treponema denticola）
   Fib_tre 產琥珀酸絲狀桿菌（ Fibrobacter succinogenes）
   Eug_ter 纖細裸藻（ Euglena gracilis）
   Ilo_ter 羅伊赫海源菌（ Idiomarina loihiensis）
磷酸轉乙醯酶 Ca_Ptb 丙酮丁醇梭菌 ATCC824
   Cu_Ptb 丁酸梭菌
   Bli_Ptb 地衣芽孢桿菌
羧酸激酶 Ca_Buk 丙酮丁醇梭菌 ATCC824
   Cu_Buk 丁酸梭菌
   Bli_Buk 地衣芽孢桿菌
硫酯酶 CAETHG_1524 自產乙醇梭菌
   CAETHG_0718 自產乙醇梭菌
   CAETHG_1780 自產乙醇梭菌
   Eco_TesB 大腸桿菌
   Ppu-TesB 惡臭假單胞菌（ Pseudomonas putida）
   Fsu-TE2108 產琥珀酸絲狀桿菌 S85
   Pru-TE655 棲瘤胃普雷沃氏菌（ Prevotella ruminicola）
   Pru-TE1687 棲瘤胃普雷沃氏菌
   Cpa-TE 沼澤萼距花（ Cuphea palustris）
   Uca-TE 加州月桂TE（ Umbellularia californica TE）
   CpFatB1.2-M4 沼澤萼距花
   Aba-TEG17RA165R 貝氏不動桿菌（ Acinetobacter baylyi）
   Te1 大腸桿菌
   Te2 大腸桿菌
醯基-CoA還原酶 Cace_AdhE2 丙酮丁醇梭菌
   Cbei_Ald 拜氏梭菌
   Maqu2507 水油海桿狀菌（ Marinobacter aquaeolei）
   Aca_acr1 貝氏不動桿菌
   DJ006_acr1 糖乙酸多丁醇梭菌 N1-4 （ HMT ）
   DJ008_acr1 拜氏梭菌
   DJ052_acr1 拜氏梭菌
   DJ079_acr1 拜氏梭菌
   DJ322_acr1 拜氏梭菌
實例1.自產乙醇梭菌中rBOX路徑之概念驗證。
為確定完全功能性rBOX路徑是否可在自產乙醇梭菌中表現，選擇表現硫解酶（THL）、β-酮醯基-CoA還原酶（KCR）、β-羥基-CoA脫水酶（HCD）、烯醯基-CoA還原酶/丁醯基-CoA去氫酶、電子轉移蛋白質AB複合物（BCD-ETFAB）之四個基因之組合（ 表 3 ，圖 2A）。將三個基因（THL、HCD、BCD-ETFAB）組裝於梭菌-大腸桿菌（Clostridium-E.coli）穿梭載體pMTL8315（Heap, 《微生物方法雜誌（J Microbiol Methods）》, 78: 79-85, 2009）中。此等穿梭載體具有預先選殖的梭菌啟動子及終止子。每個基因側接一個啟動子及一個終止子。將KCR選殖至梭菌-大腸桿菌穿梭載體pMTL8225（Heap, 《微生物方法雜誌》, 78: 79-85, 2009）中。將兩種此等質體轉型至敲除硫酯酶之自產乙醇梭菌菌株（CAETHG_1780）中。經由菌落PCR確認所得菌株中該等質體及所有四個rBOX路徑基因之存在。在37℃下，在含10 mL基本培養基之250 mL肖特瓶中於150 kPa合成氣體混合物（50% CO、10% H 2、30% CO 2及10% N 2）之存在下使各菌株經歷自養生長14天，其中定期取樣用於生物質量測及C4-C8醇分析。在所有十二個菌株中偵測到丁醇，其中S08及S10分別產生96 mg/L及115 mg/L之丁醇（ 圖 2B）。在7個菌株中觀測到己醇，其中S19之效價最高（21 mg/L）（ 圖 2B）。在S07、S08及S19中獲得痕量（＞1 mg/L）之辛醇（ 圖 2B）。在不含任何rBOX路徑基因之對照（WT）菌株中未偵測到丁醇、己醇或辛醇（ 圖 2B）。 表 3 ：表現三個或四個基因之第一輪rBOX菌株（R1a）。
設計＃ 啟動子 1 硫解酶 啟動子 2 β- 酮醯基 -CoA 還原酶 啟動子 3 β- 羥基醯基去氫酶 啟動子 4 丁醯基 -CoA 去氫酶
S01 P2 ThlA1 P1 Hbd1 P1 Crt1 P1 Bcd_etfAB1
S02 P2 ThlA2 P1 Hbd1 P1 Crt1 P1 Bcd_etfAB1
S03 P2 ThlA3 P1 Hbd1 P1 Crt1 P1 Bcd_etfAB1
S04 P2 ThlA4 P1 Hbd1 P1 Crt1 P1 Bcd_etfAB1
S05 P2 ThlA1 P1 Hbd2 P1 Crt1 P1 Bcd_etfAB1
S06 P2 ThlA1 P1 Hbd3 P1 Crt2 P1 Bcd_etfAB1
S07 P2 ThlA1 P1 Hbd3 P1 Crt3 P1 Bcd_etfAB1
S08 P2 ThlA1 P1 Hbd4 P1 Bcd_etfAB1
S10 P2 ThlA1 P1 Hbd1 P1 Crt1 P1 Bcd_etfAB3
S17 P2 ThlA3 P1 Hbd4 P1 P1 Bcd_etfAB1
S19 P2 ThlA3 P1 Hbd4 P1 Bcd_etfAB3
S20 P2 ThlA3 P1 Hbd3 P1 Crt2 P1 Bcd_etfAB3
實例2.改善中鏈醇產生的終止酶之異源表現。
為確定終止酶，諸如硫酯酶或磷酸轉醯基酶/羧酸激酶或醯基-CoA還原酶之異源表現對趨向目標產物之路徑流的影響，設計一組新的菌株，其中包括基於菌株S01建構之終止酶（表4）。 表 4 ：除S01菌株中使用之核心rBOX路徑酶外，亦表現終止酶之rBOX菌株。
設計＃ 啟動子 1 硫解酶 啟動子 2 β- 酮醯基 -CoA 還原酶 啟動子 3 β- 羥基醯基去氫酶 啟動子 4 丁醯基 -CoA 去氫酶 啟動子 5 終止酶
S11 P2 ThlA1 P1 Hbd1 P1 Crt1 P1 Bcd_etfAB1 P2 Ptb1, Buk2
S12 P2 ThlA1 P1 Hbd1 P1 Crt1 P1 Bcd_etfAB1 P1 Ptb1 Buk2
S13 P2 ThlA1 P1 Hbd1 P1 Crt1 P1 Bcd_etfAB1 P1 Acr2
S15 P2 ThlA1 P1 Hbd1 P1 Crt1 P1 Bcd_etfAB1 P1 Te1
S16 P2 ThlA1 P1 Hbd1 P1 Crt1 P1 Bcd_etfAB1 P1 Te2
將編碼此等終止酶（TE）之基因選殖至梭菌-大腸桿菌穿梭載體pMTL8225（Heap, 《微生物方法雜誌》, 78: 79-85, 2009），該穿梭載體亦具有KCR。將含有THL、HCD、BCD-ETFAB之質體pMTL8315以及含有TE及KCR之質體8225轉型至敲除硫酯酶之自產乙醇梭菌菌株（CAETHG_1780）中。S01用作對照。所得菌株S11、S12、S13、S15及S16具有與S01相同的四個基因，且具有額外的終止酶（ 圖 3A）。經由菌落PCR確認此等菌株中質體及所有經選殖rBOX路徑基因之存在。在37℃下，在含10 mL基本培養基之250 mL肖特瓶中於150 kPa合成氣體混合物（50% CO、10% H 2、30% CO 2及10% N 2）之存在下使各菌株經歷自養生長14天，其中定期取樣用於生物質量測及C4-C8醇分析。
除S12外，所有表現終止酶之菌株（S11、S13、S15及S16）的丁醇產量均顯示相較於對照菌株S01的至少9倍之改善（ 圖 3B）。在此等菌株中均未偵測到己醇及辛醇，表明所使用之硫解酶不利於己醇或辛醇之產生（ 圖 3B）。此等菌株亦產生範圍介於67-111 mg/L之間的丁酸（資料未示出）。 實例3.改善己醇與丁醇之比率的核心rBOX酶變異體及終止酶變異體之表現。
設計具有不同的rBOX核心酶同源物與終止酶變異體之組合的一組新rBOX菌株，其目標為改善己醇與丁醇之比率（ 圖 4A ，表 5）。 表 5 ：除核心rBOX路徑酶之變異體外，還具有不同終止酶同源物的第二輪rBOX菌株。
菌株編號 啟動子 1 基因 1 啟動子 2 基因2 啟動子 3 基因 3 啟動子 4 基因 4 啟動子 5 基因 5
S21 P2 ThlA1 P1 Hbd1 P1 Crt2 P1 Bcd_etfAB1 P1 Te1
S22 P2 ThlA2 P1 Hbd3 P1 Crt2 P1 Bcd_etfAB1 P1 Te2
S23 P2 ThlA2 P1 Hbd3 P1 Crt4 P1 Bcd_etfAB1 P1 Te2
S24 P2 ThlA2 P1 Hbd1 P1 Crt1 P1 Bcd_etfAB1 P1 Ptb1, Buk2
S25 P2 ThlA2 P1 Hbd1 P1 Crt5 P1 Bcd_etfAB1 P1 Te2
S26 P2 ThlA2 P1 Hbd1 P1 Crt1 P1 Bcd_etfAB1 P1 Acr2
S28 P2 ThlA2 P1 Hbd1 P1 Crt1 P1 Bcd_etfAB1 P1 Te1
S29 P2 ThlA2 P1 Hbd1 P1 Crt1 P1 Bcd_etfAB1 P1 Te2
S32 P2 ThlA3 P1 Hbd1 P1 Crt1 P1 Bcd_etfAB1 P1 Te2
S34 P2 ThlA4 P1 Hbd1 P1 Crt1 P1 Bcd_etfAB1 P1 Te1
S35 P2 ThlA4 P1 Hbd1 P1 Crt1 P1 Bcd_etfAB1 P1 Te2
S38 P1 ThlA2 P1 Hbd1 P1 Crt1 P1 Bcd_etfAB1 P1 Te1/Te2
S39 P1 ThlA2 P1 Hbd1 P1 Crt1 P3 Bcd_etfAB1 P1 Te1/Te2
S41 P2 ThlA4 P1 Hbd1 P1 Crt1 P1 Bcd_etfAB3 P1 Te2
經由菌落PCR確認所得菌株S21-S41中質體及所有經選殖rBOX路徑基因之存在。在37℃下，在含10 mL基本培養基之250 mL肖特瓶中於150 kPa合成氣體混合物（50% CO、10% H 2、30% CO 2及10% N 2）之存在下使各菌株經歷自養生長14天，其中定期取樣用於生物質量測及C4-C8醇分析。
在所有測試之菌株中，S25產生的己醇量最高，達到108 mg/L己醇（ 圖 4B）。與己醇與丁醇之比率為7:1的所有其他菌株相比，此菌株亦對己醇具有最高選擇性。S25產生大約2 mg/L之辛醇（ 圖 4B）。
監測S25之生長及代謝物型態11天，並與不表現rBOX路徑基因之底盤菌株相比較（ 圖 5A）。在第8天達到峰值己醇效價（ 圖 5B）。 實例4：在1.5 L CSTR中自合成氣醱酵產生中鏈醇
菌株S25以分批模式在1.5 L CSTR中進行表徵，以確定在肖特瓶中觀測到的高己醇選擇性是否亦可在CSTR中獲得。使用來自肖特瓶之積極生長（早期指數生長）培養物接種具有合成氣體摻合物（50% CO、10% H2、30% CO2及10% N2）之1.5 L CSTR。
菌株S25實現3.93 gDCW/L之峰值生物質濃度（ 圖 6A）且達到3454 mmol/L/d之峰值CO吸收量（ 圖 6C）。除50 g/L之峰值乙醇濃度（ 圖 6A）外，此菌株亦產生267 mg/L之峰值己醇效價（ 圖 6B）及109 mg/L之峰值丁醇效價（ 圖 6B）。此菌株亦產生約5 mg/L之辛醇及癸醇（ 圖 6B）。 實例5：CSTR操作中酸向醇之轉化
在菌株S32於1.5 L CSTR（分批模式）中表徵期間，量測酸轉化為醇之轉化率，尤其是丁酸及己酸之轉化率。對於C4產物（ 圖 7A）及C6產物（ 圖 7B），觀測到較高的酸轉化為醇之轉化率。 實例6：經由質體上基因之重排改善己醇選擇性
將pMTL8225及pMTL8315質體上之基因次序重排，其中THL及KCR在單個操縱子中表現。（ 圖 8A）。與在單獨操縱子中含有THL及KCR之菌株相比，使用此新質體架構構築之菌株展現較高的己醇與丁醇之比率（ 圖 8B）。
在一個實施例中，Ptb-Buk已在上述實例中針對若干不同產物得到證明，但亦可擴展至其他產物，例如2-丁烯-1-醇、3-甲基-2-丁醇、1,3-己二醇（HDO）之產生。2-丁烯-1-醇可經由Ptb-Buk、AOR及醇去氫酶自巴豆醯基-CoA產生。1,3-己二醇可經由Ptb-Buk、AOR及醇去氫酶自3-羥基-己醯基-CoA產生。藉由組合Ptb-Buk、Adc及醇去氫酶（諸如天然一級:二級醇去氫酶），3-甲基-2-丁醇可由乙醯丁醯基-CoA形成。
所有前驅體，即巴豆醯基-CoA、3-羥基-己醯基-CoA或乙醯丁醯基-CoA均可藉由乙醯基-CoA、乙醯乙醯基-CoA及3-HB-CoA之還原及伸長形成，而乙醯基-CoA、乙醯乙醯基-CoA及3-HB-CoA在前述實例中經由已知的例如克氏梭菌（Barker, 《美國國家科學院院刊（ PNAS USA）》, 31: 373-381, 1945；Seedorf, 《美國國家科學院院刊》, 105: 2128-2133, 2008）及其他梭菌之醱酵路徑描述。涉及的酶包括巴豆醯基-CoA水合酶（巴豆酸酶）或巴豆醯基-CoA還原酶、丁醯基-CoA去氫酶或反-2-烯醯基-CoA還原酶、硫解酶或醯基-CoA乙醯基轉移酶及3 -羥基丁醯基-CoA去氫酶或乙醯乙醯基-CoA水合酶。來自克氏梭菌或其他梭菌之各別基因已被選殖至表現質體（US 2011/0236941）上，且且隨後如先前所描述在來自前述實例之自產乙醇梭菌菌株pta-ack::ptb-buk或CAETHG_1524::ptb-buk中進行轉型，以產生2-丁烯-1-醇、3-甲基-2-丁醇、1,3-己二醇(HDO)。2-丁烯-1-醇、3-甲基-2-丁醇及1,3-己二醇（HDO）可為其他下游產物之前驅體。
雖然此等僅為少數實例，但應清楚，可使用對較高鏈長度具有特異性的相同酶或其經工程改造之變異體進一步擴展此路徑，以產生一系列C4、C6、C8、C10、C12、C14醇、酮、烯醇或二醇。不同類型之分子亦可藉由在硫解酶步驟中使用如別處所描述（Cheong, 《自然-生物技術（ Nature Biotechnol）》 ,34: 556-561, 2016）的不同於乙醯基-CoA之引子或延伸物單元獲得。
本文中所引用之所有參考文獻，包括公開案、專利申請案及專利均特此以引用之方式併入，該引用程度就如同個別且具體地指示各參考文獻以引用之方式併入且全文闡述於本文中一般。在本說明書中對任何先前技術之參考並非且不應視為承認先前技術形成任何國家所致力領域之公共常識的一部分。
除非本文中另外規定或明顯地與上下文相矛盾，否則在描述揭示內容之上下文中（尤其在以下申請專利範圍之上下文中）使用術語「一（a/an）」及「該」及類似參考物解釋為涵蓋單數及複數兩者。除非另外指出，否則術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」應理解為開放性術語（亦即，意謂「包括但不限於」）。術語「基本上由……組成」將組成、製程或方法之範疇限制於指定材料或步驟，或實質上不影響該組成、製程或方法之基本及新穎特性的材料或步驟。使用替代物（例如「或」）應理解為意謂替代物之一者、兩者或其任何組合。如本文中所使用，除非另外規定，否則術語「約」意謂指定範疇、值或結構之±20%。
除非另外規定，否則本文中值範圍之敍述僅意欲充當個別提及屬於該範圍內之各獨立值的簡寫方法，且各獨立值併入至本說明書中，如同在本文中個別列舉一般。舉例而言，除非另外規定，否則任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍、整數範圍、大小範圍或厚度範圍將理解為包括所列舉範圍內之任何整數值，且適當時包括其分數（諸如，整數之十分之一及百分之一）。
除非本文中另外規定或另外明顯與上下文矛盾，否則本文中所描述之所有方法可以任何合適之次序執行。除非另外主張，否則使用本文中所提供之任何及所有實例或例示性語言（例如，「諸如」）僅意欲更好地闡明本揭示案，且不對本揭示案之範疇造成限制。本說明書中之語言均不應解釋為指示任何非主張之要素對於本揭示案之實踐為必不可少的。
本文中描述本揭示案之實施例。在閱讀前述描述之後，彼等實施例之變化對於一般熟習此項技術者而言可變得顯而易見。本發明者期望熟習此項技術者適當時採用此類變化，且本發明者意欲以不同於本文中特定描述之其他方式來實施本揭示案。相應地，本揭示案包括如適用法律准許之隨附於本文之申請專利範圍中所陳述之主題的所有修改及等效物。此外，除非本文中另外規定或另外明顯與上下文矛盾，否則本揭示案涵蓋上述要素在其所有可能變化中之任何組合。
無
圖 1 ：在C1氣體醱酵生物中產生醇及酸的經工程改造之逆β氧化路徑。編碼硫解酶、β-酮醯基-CoA還原酶、β-羥基醯基-CoA脫水酶及烯醯基-CoA還原酶的基因構成核心路徑基因。終止酶，包括硫酯酶、磷酸轉醯基酶、羧酸激酶、醯基-CoA還原酶、醛還原酶、鐵氧化還原蛋白依賴性醛氧化還原酶，能夠將經由rBOX路徑產生之醯基-CoA轉化為相應的醇或酸。
圖 2A 至圖 2B ：利用具有硫解酶、β-酮醯基-CoA還原酶、β-羥基醯基-CoA脫水酶及烯醯基-CoA還原酶/丁醯基-CoA去氫酶-電子轉移蛋白質AB功能性之異源表現酶來證明自產乙醇梭菌中之rBOX路徑(產生丁醇、己醇及辛醇)。實驗在含有10 ml基本培養基且充以合成性合成氣之250 ml肖特瓶（Schott bottle）中進行（n=3）。誤差杠表示標準差。
圖 3A 至圖 3B ：除核心rBOX路徑酶外的用於改善中鏈(C4-C8)醇之產生的終止酶（包括硫酯酶、磷酸轉醯基酶/羧酸激酶或醯基-CoA還原酶）之異源表現。S01：對照菌株。S11-16：表現終止酶的菌株。實驗在含有10 ml基本培養基且充以合成性合成氣之250 ml肖特瓶中進行（n=3）。誤差杠表示標準差。
圖 4A 至圖 4B ：藉由改變核心rBOX酶及終止酶的基因變異體來改善己醇選擇性。實驗在含有10 ml基本培養基且充以合成性合成氣之250 ml肖特瓶中進行（n=3）。誤差杠表示標準差。
圖 5A 至圖 5B ：S25與底盤菌株（無rBOX路徑基因之對照）之生長及代謝物型態的比較。實驗在含有10 ml基本培養基且充以合成性合成氣之250 ml肖特瓶中進行（n=3）。每次取樣後對瓶子重新充氣。誤差杠表示標準差。
圖 6A 至圖 6C ：菌株S25在使用合成氣體摻合物（50% CO、10% H2、30% CO2及10% N2）之1.5 L CSTR（分批模式）中的表徵。
圖 7A 至圖 7B.在使用合成氣體摻合物（50% CO、10% H2、30% CO2及10% N2）操作的1.5 L CSTR（分批模式）中測定的菌株S32中酸轉化為醇之轉化率。
圖 8A 至圖 8B.經由重排質體上之基因次序來改善對己醇之選擇性。建構14菌株，亦即B14.S1、B14.S2及B14.S3，分別與S26、S28及S29具有相同基因，但以不同次序排列於兩個質體上。此等菌株係在含有10 ml基本培養基且充以合成性合成氣之250 ml肖特瓶中測試（n=3）。每次取樣後對瓶子重新充氣。誤差杠表示標準差。 

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          agctttgttg caggagctga catatcggaa atgaaggaaa tgaatactat tgaaggtaga      240
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          agataa                                                                 786
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          ggacttggat ttcctccctt tcatggcggc gcatttagat ggttggatac tttaggttca     2040
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          <![CDATA[<222>  (1)..(2967)]]>
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          atggatttta atttaacaag agaacaagaa ttagtaagac agatggttag agaatttgct       60
          gaaaatgaag ttaaacctat agcagcagaa attgatgaaa cagaaagatt tccaatggaa      120
          aatgtaaaga aaatgggtca gtatggtatg atgggaattc cattttcaaa agagtatggt      180
          ggcgcaggtg gagatgtatt atcttatata atcgccgttg aggaattatc aaaggtttgc      240
          ggtactacag gagttattct ttcagcacat acatcacttt gtgcttcatt aataaatgaa      300
          catggtacag aagaacaaaa acaaaaatat ttagtacctt tagctaaagg tgaaaaaata      360
          ggtgcttatg gattgactga gccaaatgca ggaacagatt ctggagcaca acaaacagta      420
          gctgtacttg aaggagatca ttatgtaatt aatggttcaa aaatattcat aactaatgga      480
          ggagttgcag atacttttgt tatatttgca atgactgaca gaactaaagg aacaaaaggt      540
          atatcagcat ttataataga aaaaggcttc aaaggtttct ctattggtaa agttgaacaa      600
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          ggaggaagaa ttggtatagc agctcaagct ttaggtatag ctgaaggtgc tttcaacgaa      780
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          cttcatgctg caaatgtagc aatggatgta acaactaagg cagtacaatt atttggtgga     1020
          tacggatata caaaagatta tccagttgaa agaatgatga gagatgctaa gataactgaa     1080
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          atgaatgtta aattagaaaa tagatataga ttatttatta atggagaatg gagagatgct       60
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          caaagatctc ttcatatttt aataaatagc gctggaataa tggcacctcc actaataagg      360
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          gcacgacttt ggcctgctct aaaaaatgct aaaggtgctc gagttatttc agtttcatca      480
          agagcgcagc gtcttggcgg agtcaatttt gatgatccaa actttcaaaa aacagaatat      540
          gatagttgga aggcttatgc tcaatcaaaa tccgctaatt cattattcgc cgttgaatta      600
          gacagattag gaaaaaccca tggtgttagg gctttctcag ttcacccagg tttaattcca      660
          actacaaatc ttggaagatt ctctgttaac ggaagagcta ctgtacaaga actaaaaact      720
          aacactagaa aagatgatac taacacaaaa tcaaatgaat ttaaaaccat tgaacagggt      780
          gcagcaacct ctgtttggtg tgctacaaat agtattctag atggaatggg tggagtttac      840
          tgtgaagact gcaatatagc tgaagctgtt ccttatgaca gtttgaaaga taatggtgtt      900
          cgtccttggg ctatagataa agatctagca aaaaaactgt ggatacttag tgaagatctt      960
          acaaatgtta aattcataat ttaa                                             984
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Claims (20)

  1. 一種能夠自氣態受質產生產物的經基因工程改造之微生物，其中該微生物包含迭代路徑，該迭代路徑包含： a)編碼能夠催化(C n)-醯基CoA轉化為β-酮醯基-CoA之一組酶的核酸； b)編碼能夠催化β-酮醯基-CoA轉化為β-羥基醯基-CoA之一組外源酶的核酸； c)編碼能夠催化β-羥基醯基-CoA轉化為反-Δ 2-烯醯基-CoA之一組外源酶的核酸； d)編碼能夠催化反-Δ 2-烯醯基-CoA轉化為(C n+2)醯基-CoA之一組外源酶的核酸； e)一或多種終止酶；且 其中該微生物係在硫酯酶中包含破壞性突變之固定C1之細菌。
  2. 如請求項1之微生物，其中該迭代路徑為逆生物合成方向之β氧化路徑。
  3. 如請求項1之微生物，其中a)該編碼能夠催化(C n)-醯基CoA轉化為β-酮醯基-CoA之一組酶的核酸為硫解酶、醯基-CoA乙醯基轉移酶或聚酮合酶。
  4. 如請求項1之微生物，其中b)該編碼能夠催化β-酮醯基-CoA轉化為β-羥基醯基-CoA之一組酶的核酸為β-酮醯基-CoA還原酶或β-羥基醯基-CoA去氫酶。
  5. 如請求項1之微生物，其中c)該編碼能夠催化β-酮醯基-CoA轉化為反-Δ 2-烯醯基-CoA之一組外源酶的核酸為β-羥基醯基-CoA脫水酶。
  6. 如請求項1之微生物，其中d)該編碼能夠催化反-Δ 2-烯醯基-CoA轉化為(C n+2)醯基-CoA之一組外源酶的核酸為反-烯醯基-CoA還原酶或丁醯基-CoA去氫酶/電子轉移黃素蛋白AB（Bcd-EtfAB）。
  7. 如請求項1之微生物，其中該一或多種終止酶選自醇形成輔酶A硫酯還原酶、醛形成CoA硫酯還原酶、醇去氫酶、硫酯酶、醯基-CoA:乙醯基-CoA轉移酶、磷酸轉醯基酶及羧酸激酶；醛鐵氧化還原蛋白氧化還原酶；醛形成CoA硫酯還原酶、醛脫羰酶、醇去氫酶；醛去氫酶及醯基-CoA還原酶。
  8. 如請求項1之微生物，其中選自a)、b)、c)、d)及e)之該組外源酶係以任何次序排列於單個操縱子中或以任何次序排列於多個操縱子中。
  9. 如請求項1之微生物，其中該等外源酶能夠產生C n+2乙酸、C n+23-OH-酸、C n+2烯酸、C n+21-酸、C n+2酮、C n+2甲基-2-醇、C n+21,3-二醇、1,4-二醇、1,6-二醇、C n+22-烯-1-醇、C n+21-醇、二酸或其任何組合。
  10. 如請求項1之微生物，其係選自：自產乙醇梭菌（ Clostridium autoethanogenum）、揚氏梭菌（ Clostridium ljungdahlii）、拉氏梭菌（ Clostridium ragsdalei）、大腸桿菌（ Escherichia coli）、釀酒酵母菌（ Saccharomyces cerevisiae）、丙酮丁醇梭菌（ Clostridium acetobutylicum）、拜氏梭菌（ Clostridium beijerinckii）、糖丁酸梭菌（ Clostridium saccharbutyricum）、糖乙酸多丁醇梭菌（ Clostridium saccharoperbutylacetonicum）、丁酸梭菌（ Clostridium butyricum）、二醇梭菌（ Clostridium diolis）、克氏梭菌（ Clostridium kluyveri）、巴斯德氏梭菌（ Clostridium pasterianium）、諾維氏梭菌（ Clostridium novyi）、艱難梭菌（ Clostridium difficile）、熱纖梭菌（ Clostridium thermocellum）、解纖維梭菌（ Clostridium cellulolyticum）、嗜纖維梭菌（ Clostridium cellulovorans）、植物醱酵梭菌（ Clostridium phytofermentans）、乳酸乳球菌（ Lactococcus lactis）、枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（ Bacillus licheniformis）、運動醱酵單胞菌（ Zymomonas mobilis）、產酸克雷伯氏菌（ Klebsiella oxytoca）、肺炎克雷伯氏菌（ Klebsiella pneumonia）、麩胺酸棒狀桿菌（ Corynebacterium glutamicum）、瑞氏木黴（ Trichoderma reesei）、鉤蟲貪銅菌（ Cupriavidus necator）、惡臭假單胞菌（ Pseudomonas putida）、植物乳桿菌（ Lactobacillus plantarum）或扭脫甲基桿菌（ Methylobacterium extorquens）。
  11. 如請求項1之微生物，其中該微生物進一步包含在一級-二級醇去氫酶基因、3-羥基丁醯基CoA去氫酶基因、磷酸乙醯基轉移酶（ pta）、乙酸激酶（ ack）、醛-醇去氫酶（ adhE1）、β-羥基丁酸去氫酶（ bdh）、CoA轉移酶（ ctf）或其任何組合中的破壞性突變。
  12. 如請求項1之微生物，其中該產物係選自(C n)-醇、一級醇、反式Δ 2脂肪醇、β-酮醇、1,3-二醇、1,4-二醇、1,6-二醇、二酸、β-羥基酸、β-酮酸羧酸、脂肪酸、脂肪酸甲酯、酮酸、烴或其任何組合。
  13. 如請求項1之微生物，其進一步包含醯基-CoA引子及延伸物，其中該引子及延伸物能夠進行循環、迭代路徑操作。
  14. 如請求項13之微生物，其中引子及延伸物係選自草醯基-CoA、乙醯基-CoA、丙二醯基CoA、丁二醯基-CoA、羥基乙醯基-CoA、3-羥基丙醯基-CoA、4-羥基丁醯基-CoA、2-胺基乙醯基-CoA、3-胺基丙醯基-CoA、4-胺基丁醯基-CoA、異丁醯基-CoA、3-甲基-丁醯基-CoA、2-羥基丙醯基-CoA、3-羥基丁醯基-CoA、2-胺基丙醯基-CoA、丙醯基-CoA、丁醯基-CoA及戊醯基-CoA。
  15. 如請求項13之微生物，其中該引子及/或延伸物係乙醯基-CoA。
  16. 如請求項1之微生物，其中該微生物進一步包含多於一種硫酯酶中之破壞性突變。
  17. 如請求項1之微生物，其中a)、b)、c)、d)及/或e)之該組酶對於該微生物為非天然的。
  18. 一種產生產物之方法，該方法包含在氣態受質之存在下培養如請求項1之經基因工程改造之微生物。
  19. 如請求項18之方法，其中該氣態受質包含含CO、CO 2及/或H 2之C1-碳源。
  20. 如請求項18之方法，其中該產物係選自(C n)-醇、一級醇、反式Δ 2脂肪醇、β-酮醇、1,3-二醇、1,4-二醇、1,6-二醇、二酸、β-羥基酸、β-酮酸羧酸、脂肪酸、脂肪酸甲酯、酮酸、烴或其任何組合。
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