CN113999869A - 一种表达强度受细菌胞内聚羟基脂肪酸酯（pha）合成调控的启动子及其应用 - Google Patents

一种表达强度受细菌胞内聚羟基脂肪酸酯（pha）合成调控的启动子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于PHA合成技术领域，具体提供了一种表达强度受细菌胞内聚羟基脂肪酸酯（PHA）合成调控的启动子及其应用，所述的启动子包含PhaR的结合位点，所述PhaR的结合位点包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种表达载体，该表达载体包含启动子和编码PhaR的核苷酸序列。本发明还提供了包含该表达载体的重组菌，利用该重组菌可以联产PHA与其他产物。

Description

一种表达强度受细菌胞内聚羟基脂肪酸酯（PHA）合成调控的 启动子及其应用
技术领域
本发明涉及PHA合成技术领域，具体涉及一种表达强度受细菌胞内聚羟基脂肪酸酯（PHA）合成调控的启动子及其应用。
背景技术
PHA是一种能够在许多细菌胞内合成并累积的高分子聚酯，在提取加工后，其性质可以类比于聚乙烯和聚苯乙烯，有潜力作为石油基塑料替代品。同时，由于其生物来源的特点，PHA也能够被自然界的微生物降解，开发其作为塑料制品可以解决白色污染和微塑料等环境保护问题。根据其组成单体不同，PHA有着不同的材料性能，从而可以应用在包装材料，医疗器械，有机农业，先进材料等方面。PHA根据其组成单体不同，可以分为单体碳链长度6个碳以下的短链PHA，如聚3-羟基丁酸酯（P3HB），聚4-羟基丁酸酯（P4HB），聚3-羟基戊酸酯（P3HV）；或由碳链长度6个碳及以上的单体组成的中长链PHA，如聚3-羟基己酸酯（P3HHx）等。
PHA作为一种来源于生物发酵的胞内产物，发展其和其他胞外产物的联产发酵是降低发酵成本，提升发酵产品价值的重要策略。常见的联产产物包括氨基酸、肌醇，四氢嘧啶、1,3-丙二醇，3-羟基丙酸、1,5-戊二胺、5-氨基乙酰丙酸（ALA）等。
在细菌中生产各类分泌酶，可以扩展其对不同底物的适应性，发展其利用廉价碳源的能力，降低工业生产成本。设计能够同步于发酵过程生产分泌酶对优化发酵条件，提升发酵效果有一定的意义。
PHA作为一种胞内产物，其发酵的产品量会受到细胞体积的影响。能够同步于发酵增加细胞体积的量会生产PHA有一定的促进作用。调整细胞体积的相关基因往往和细胞分裂密切相关，过早的调控这些基因表达会影响到细胞的分裂和增殖，进而影响到终产物的产量。所以调控这些基因在后期进行表达，具有一定的意义。
在细菌发酵后期，很多启动子的表达将逐渐趋于弱化。然而在实际的生产过程中，需要在后期有大量菌体量的时候大量表达，这样能够显著的提升最终产品的产量。PhaP蛋白是PHA颗粒结合蛋白，其表达量和PHA的合成直接相关，这促使其能够在PHA合成的过程中逐步表达，并不因为发酵的进行而逐渐减弱。因此，利用phaP启动子可以开发为一个后期表达量高的表达工具。
同时，在发酵后期，也可以通过联用该启动子和各类调控因子表达元件，实现发酵后期对于特定基因的抑制效果，提高主产物的产量。
发明内容
为提升现有的PHA发酵过程，降低发酵成本，本发明提供了一种启动子，其表达强度受PHA的合成调控，即随着PHA的累积该启动子的强度逐渐增强。将该启动子制备成表达载体，可以同步合成PHA与其他相关产物例如与PHA合成相关的产物、酶以及与细胞形变相关的产物。采用本申请所述的启动子或表达载体构建重组菌可以使得重组菌提高自身生存能力以及合成产物的能力。具体的，
本发明的第一方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体包含启动子和编码PhaR（PHA颗粒调控蛋白）的核苷酸序列，所述的启动子包含PhaR的结合位点。
在本发明的一个具体实施方式中，所述PhaR的结合位点包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，或者其为SEQ ID NO：5的突变体。
所述的启动子可以选自现有技术中常规的启动子，只要该启动子包含PhaR的结合位点，且具有启动子的活性。优选的，所述的启动子选自phaP1、phaP2、phaP3或porin-R，所述的porin-R为在porin启动子或其突变体上加入PhaR的结合位点。
优选的，porin启动子突变体包括但不限于porin-203、porin-211、porin-42或porin-140中的任一种。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的启动子为phaP1，其核苷酸序列包含SEQID NO：1或者包含与SEQ ID NO：1具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的启动子为phaP2，其核苷酸序列包含SEQID NO：2或者包含与SEQ ID NO：2具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的启动子为phaP3，其核苷酸序列包含SEQID NO：3或者包含与SEQ ID NO：3具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的启动子为porin-R，其核苷酸序列包含SEQ ID NO：6或者包含与SEQ ID NO：6具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
所述的表达载体能够在宿主细胞中复制、转录及翻译。因此，其还包含常规的其他表达元件，例如终止子、酶切位点等等。
优选的，所述的表达载体可以为原核表达载体或真核表达载体，优选为原核表达载体。
优选的，所述的表达载体为质粒。
优选的，所述的表达载体还包含编码产物合成途径相关的基因。
所述的产物包含PHA或组成PHA的单体。其中，所述的PHA选自3-羟基丁酸均聚物PHB，3-羟基丁酸和4-羟基丁酸二元共聚物P3HB4HB，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基戊酸三元共聚物PHBV4HB，3-羟基丁酸和3-羟基己酸二元共聚物PHBHHx，3-羟基丙酸的均聚物或共聚物，所述的3-羟基丙酸的均聚物为P3HP，所述的3-羟基丙酸的共聚物为P(3HB-co-3HP)或PHBHP；所述的组成PHA的单体选自3-羟基丁酰辅酶A、4-羟基丁酰辅酶A、3-羟基戊酰辅酶A、5-羟基戊酰辅酶A、3-羟基己酰辅酶A或6-羟基己酰辅酶A。
所述的产物包含：
a）与PHA联产的产物及生产与PHA联产的产物相关的酶，所述的与PHA联产的产物选自氨基酸、肌醇、四氢嘧啶、1,3-丙二醇、3-羟基丙酸、1，5-戊二胺或5-氨基乙酰丙酸；
b）分泌到胞外的酶，选自脂肪酶、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、酯酶、葡聚糖酶、果胶酶、磷酯酶、明胶酶或核酸酶（例如DNA酶或RNA酶）；
c）与细胞形态相关的蛋白，选自微管蛋白FtsZ、细胞骨架蛋白MreB或细胞分裂调控因子MinCD；或，
d）与细胞内基因调控相关的蛋白或RNA，选自乳糖操纵子遏制蛋白LacI、四环素操纵子阻遏蛋白TetR或CRISPRi/CRISPRa中使用的sgRNA等。
所述的产物还包含胞外各种小分子产物和/或胞外各种水解酶。
优选的，所述的启动子表达产物，可以在表达载体上表达也可以在基因组上表达。
本发明的第二方面，提供了一种表达载体组合物，所述的表达载体组合物包含一个或多个第一表达载体和一个或多个第二表达载体，所述的第一表达载体包含第一启动子，所述的第二表达载体包含第二启动子，所述的第一启动子和/或第二启动子包含PhaR的结合位点，所述的第一表达载体和/或第二表达载体包含编码PhaR的核苷酸序列。优选的，所述PhaR的结合位点包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
优选的，所述包含PhaR的结合位点的启动子选自phaP1、phaP2、phaP3或porin-R，所述的porin-R为在porin启动子或其突变体上加入phaR的结合位点。
优选的，porin启动子突变体包括但不限于porin-203、porin-211、porin-42或porin-140中的任一种。
表达载体组合物中：
i）所述的第一表达载体包含编码产物合成途径相关的基因，所述的产物为PHA或组成PHA的单体；所述的第二表达载体包含编码产物合成途径相关的基因，所述的产物选自：
a）与PHA联产的产物及生产与PHA联产的产物相关的酶，所述的与PHA联产的产物选自氨基酸、肌醇、四氢嘧啶、1,3-丙二醇、3-羟基丙酸、1，5-戊二胺或5-氨基乙酰丙酸；
b）分泌到胞外的酶，选自脂肪酶、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、酯酶、葡聚糖酶、果胶酶、磷酯酶、明胶酶或核酸酶；
c）与细胞形态相关的蛋白，选自微管蛋白FtsZ、细胞骨架蛋白MreB或细胞分裂调控因子MinCD；或，
d）与细胞内基因调控相关的蛋白或RNA，选自乳糖操纵子遏制蛋白LacI、四环素操纵子阻遏蛋白TetR或CRISPRi/CRISPRa中使用的sgRNA等。
ii）所述的第二表达载体包含编码产物合成途径相关的基因，所述的产物为PHA或组成PHA的单体；所述的第一表达载体包含编码产物合成途径相关的基因，所述的产物选自：
a）与PHA联产的产物及生产与PHA联产的产物相关的酶，所述的与PHA联产的产物选自氨基酸、肌醇、四氢嘧啶、1,3-丙二醇、3-羟基丙酸、1，5-戊二胺或5-氨基乙酰丙酸；
b）分泌到胞外的酶，选自脂肪酶、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、酯酶、葡聚糖酶、果胶酶、磷酯酶、明胶酶或核酸酶；
c）与细胞形态相关的蛋白，选自微管蛋白FtsZ、细胞骨架蛋白MreB或细胞分裂调控因子MinCD。以实现细胞生长过程中的逐渐形变的需求；或，
d）与细胞内基因调控相关的蛋白或RNA，选自乳糖操纵子遏制蛋白LacI、四环素操纵子阻遏蛋白TetR或CRISPRi/CRISPRa中使用的sgRNA等。
本发明的第三方面，提供了一种启动子，所述的启动子为在porin启动子或其突变体上加入PhaR的结合位点。
优选的，porin启动子突变体包括但不限于porin-203、porin-211、porin-42或porin-140中的任一种。
在本发明的一个具体实施方式中，启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：6。
本发明的第四方面，提供了一种调控元件，所述的调控元件包含启动子和编码PhaR的核苷酸序列，所述的启动子包含PhaR的结合位点。所述PhaR的结合位点包含SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列。
本发明的第五方面，提供了一种骨架载体，所述的骨架载体包含启动子和编码PhaR的核苷酸序列，所述的启动子包含PhaR的结合位点。所述PhaR的结合位点包含SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列。
本发明的第六方面，提供了一种细胞，所述的细胞包含上述表达载体、表达载体组合物、启动子、调控元件或骨架载体。
本发明的第七方面，提供了一种细胞，所述的细胞包含上述表达载体、表达载体组合物、启动子、调控元件、骨架载体或细胞在生产PHA或生产组成PHA的单体或者生产与PHA相关的产物或者生产与细胞形态相关的蛋白或生产细胞内基因调控相关的蛋白或RNA中的应用。
本发明的第八方面，提供了一种重组菌，所述的重组菌中包含：
A）上述的表达载体；
B）上述的表达载体组合物；
C）上述的启动子；
D）上述的骨架载体；或者，
E）上述的调控元件。
优选的，所述的重组菌为真核微生物和/或原核微生物。所述的原核微生物包括但不限于大肠杆菌、罗氏真养杆菌、芽孢杆菌、谷棒菌、巨大产碱杆菌、假单胞菌属、气生单胞菌属或嗜盐菌中的任一种。所述的真核微生物包括但不限于酵母、真菌或者藻类中的任一种。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的重组菌选自大肠杆菌、罗氏真养杆菌（Ralstonia eutropha，也叫Alcaligenes eutrophus，Cupriavidus necator）、巨大产碱杆菌（Alcaligenes latus）、假单胞菌属（Aeromonas spp.）、气生单胞菌属（Aeromonas spp.）、嗜盐单胞菌属（Halomonas spp.）。
所述的嗜盐菌为嗜盐单胞菌属。在本发明的一个具体实施方式中，所述嗜盐菌包括但不限于嗜盐单胞菌，包括但不限于Halomonas bluephagenesis TD01 CGMCC. No.4353，Halomonas campaniensis LS21 CGMCC No.6593或Halomonas aydingkolgenesis M1CGMCC NO.19880。
本发明的第九方面，提供了一种上述的重组菌的制备方法，所述的制备方法包括将上述的表达载体、上述的表达载体组合物、上述的启动子、上述的骨架载体或上述的调控元件导入重组菌中。
优选的，所述表达载体将启动子整合至重组菌基因组中或者所述表达载体游离在重组菌中。
本发明的第十方面，提供了一种发酵方法，所述的方法包括发酵培养上述的重组菌。
优选的，所述的发酵产物为PHA或组成PHA的单体。
优选的，所述的发酵产物还包括但不限于：
a）与PHA联产的产物及生产与PHA联产的产物相关的酶，所述的与PHA联产的产物选自氨基酸、肌醇、四氢嘧啶、1,3-丙二醇、3-羟基丙酸、1，5-戊二胺或5-氨基乙酰丙酸；
b）分泌到胞外的酶，选自脂肪酶、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、酯酶、葡聚糖酶、果胶酶、磷酯酶、明胶酶或核酸酶；
c）与细胞形态相关的蛋白，选自微管蛋白FtsZ、细胞骨架蛋白MreB或细胞分裂调控因子MinCD；或，
d）与细胞内基因调控相关的蛋白或RNA，选自乳糖操纵子遏制蛋白LacI、四环素操纵子阻遏蛋白TetR或CRISPRi/CRISPRa中使用的sgRNA等。
优选的，所述发酵的培养基为常规培养基或者为了适应微生物的生存和产生产物适当的调整培养基的成分。
优选的，所述发酵的条件可以根据具体重组菌适当调整。
优选的，所述发酵的设备可以为摇瓶、小试发酵罐、中试发酵罐或者工业大量生产的大型发酵罐。
本发明的第十一方面，提供了一种生产PHA的方法，所述的方法包括发酵培养上述的重组菌。
本发明的第十二方面，提供了一种生产赖氨酸的方法，所述的方法包括发酵培养上述的重组菌。优选的，所述的重组菌为向罗氏真养杆菌中导入包含cadA的上述表达载体。
本发明的第十三方面，提供了一种联产PHA和赖氨酸的方法，所述的方法包括发酵培养上述的重组菌。优选的，所述的重组菌为向罗氏真养杆菌中导入包含cadA的上述表达载体。
本发明的第十四方面，提供了一种生产苏氨酸的方法，所述的方法包括发酵培养上述的重组菌。优选的，所述的重组菌为向Halomonas aydingkolgenesis M1或Halomonas campaniensis LS21中导入包含rhtC的上述表达载体。
本发明的第十五方面，提供了一种联产PHA和苏氨酸的方法，所述的方法包括发酵培养上述的重组菌。优选的，所述的重组菌为向Halomonas aydingkolgenesis M1或Halomonas campaniensis LS21中导入包含rhtC的上述表达载体。
本发明的第十六方面，提供了一种生产四氢嘧啶的方法，所述的方法包括发酵培养上述的重组菌。优选的，所述的重组菌为向Halomonas bluephagenesis TD01中导入包含ectABC的上述表达载体。
本发明的第十七方面，提供了一种联产PHA和四氢嘧啶的方法，所述的方法包括发酵培养上述的重组菌。优选的，所述的重组菌为向Halomonas bluephagenesis TD01中导入包含ectABC的上述表达载体。
本发明的第十八方面，提供了一种生产淀粉酶的方法，所述的方法包括发酵培养上述的重组菌。优选的，所述的重组菌为向Halomonas bluephagenesis TD01中导入包含amyL的上述表达载体。
本发明的第十九方面，提供了一种联产PHA和淀粉酶的方法，所述的方法包括发酵培养上述的重组菌。优选的，所述的重组菌为向Halomonas bluephagenesis TD01中导入包含amyL的上述表达载体，或者向大肠杆菌中导入包含amyL的上述表达载体和包含phaA，phaB和phaC的表达载体。
本发明的第二十方面，提供了一种生产1，5-戊二胺的方法，所述的方法包括发酵培养上述的重组菌。优选的，所述的重组菌为向罗氏真养杆菌中导入包含cadA的上述表达载体。
本发明的第二十一方面，提供了一种联产PHA和1，5-戊二胺的方法，所述的方法包括发酵培养上述的重组菌。优选的，所述的重组菌为向罗氏真养杆菌中导入包含cadA的上述表达载体。
本发明的第二十二方面，提供了一种生产3-羟基丙酸的方法，所述的方法包括发酵培养上述的重组菌。优选的，所述的重组菌为向巨大产碱杆菌或假单胞菌属或气生单胞菌属中导入包含dhaB和/或aldD的上述表达载体。
本发明的第二十三方面，提供了一种联产PHA和3-羟基丙酸的方法，所述的方法包括发酵培养上述的重组菌。优选的，所述的重组菌为向巨大产碱杆菌或假单胞菌属或气生单胞菌属中导入包含dhaB和/或aldD的上述表达载体。
本发明的第二十四方面，提供了一种促进细胞增长的方法，所述的方法包括发酵培养上述的重组菌。优选的，所述的重组菌为向Halomonas bluephagenesis TD01中导入包含minCD的上述表达载体。
本发明的第二十五方面，提供了一种增大细胞体积的方法，所述的方法包括发酵培养上述的重组菌。优选的，所述的重组菌为向Halomonas bluephagenesis TD01中导入包含lacI的上述表达载体。
使用本申请所述的启动子进行发酵生产产物，可以通过四个途径来改善发酵结果：
1）形成自激励的表达回路，对PHA合成的基因进行自激励的过表达，进一步提高胞内的产量。例如采用本申请所述的启动子过表达与PHA合成相关的基因，随着PHA的累积启动子的表达量逐渐增多，又由于启动子的表达量的增加实现了PHA更多的累积，形成自激励的表达回路。
2）克服有毒的代谢中间产物会在发酵初期累积，实现有毒中间代谢产物的快速转化。例如在PHA合成过程的中间产物SSD是有毒的，采用本申请所述的启动子过表达SucD，同时过表达4HbD和OrfZ，使得SSD尽快转化为PHA的单体进而合成PHA，减轻毒害作用。
3）避免细菌在发酵初期由于大量表达某些蛋白对代谢造成压力而影响生长。例如为了减少发酵初期过表达淀粉酶对细菌的压力，利用本申请所述的启动子过表达amyL基因。
4）避免过早的表达细胞形变的基因进而影响细胞分裂。在生产PHA领域，发酵后期的变形可以提高终产量，降低提取难度。例如，利用本申请所述的启动子过表达minCD基因来解决。
本发明所述的“PHA”为均聚PHA和/或共聚PHA。优选的，所述的PHA选自3-羟基丁酸（3HB）均聚物PHB，3-羟基丁酸（3HB）和4-羟基丁酸(4HB)二元共聚物P3HB4HB，3-羟基丁酸（3HB）、4-羟基丁酸(4HB)和3-羟基戊酸三元共聚物P(3HB-co-4HB-co-3HV)，3-羟基丁酸（3HB）和3-羟基己酸二元共聚物PHBHHx，3-羟基丙酸（3HP）的均聚物或共聚物，优选的，所述的3-羟基丙酸（3HP）的均聚物为P3HP，优选的，所述的3-羟基丙酸（3HP）的共聚物为P(3HB-co-3HP)或PHBHP。在本发明的一个具体实施方式中，所述的PHA选自3-羟基丁酸均聚物PHB，3-羟基丁酸和4-羟基丁酸二元共聚物P3HB4HB，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基戊酸三元共聚物PHBV4HB，3-羟基丁酸和3-羟基己酸二元共聚物PHBHHx，3-羟基丙酸的均聚物或共聚物，所述的3-羟基丙酸的均聚物为P3HP，所述的3-羟基丙酸的共聚物为P(3HB-co-3HP)或PHBHP。
本发明所述的“组成PHA的单体”包括但不限于3-羟基丁酰辅酶A（3HB-CoA），4-羟基丁酰辅酶A（4HB-CoA），3-羟基戊酰辅酶A（3HV-CoA），5-羟基戊酰辅酶A（5HV-CoA），3-羟基己酰辅酶A（3HHx-CoA），6-羟基己酰辅酶A（6HHx-CoA）。
本发明所述的“包含”或“包括”为开放式写法，当用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有与原序列相同或相似的活性。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：Halomonas bluephagenesis中使用phaP1启动子表达MinCD后菌体伸长的表型。
图2：Halomonas bluephagenesis中使用phaP1启动子表达LacI后细胞体积增大的表型。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：phaP系列启动子的性质和鉴定
一、在Halomonas bluephagenesis中phaP和phaR的启动子的预测
PhaP为PHA颗粒结合蛋白（Phasin），在盐单胞菌Halomonas bluephagenesis的基因组中，有三个phaP基因，分别为phaP1，phaP2，phaP3。还有一个PHA合成调控蛋白基因，phaR。这三个phaP和phaR的表达强度有所差别，可以根据后续基因表达的需要进行选取。其中，phaP系列启动子的强度，phaP1最强，phaP3次之，phaP2最弱。对这四个基因的开放阅读框的上游进行启动子预测，可以确定这四个启动子的具体位置。具体情况如下：
phaP1的启动子在phaP1开放阅读框上游109位碱基处，其序列及其后的调控序列如下，SEQ ID NO：1：
ggttgttgttgtcggtggctagtcgcaatgttatgaaaaaatcatgttgcgctgcacaaaaagcactgctagctttgttgttagtaaaggcaaccgcctgatcatcgaccgctcatcgatgcgtgtcgaatcgctagctcacttaaggagattatgtg
phaP2的启动子在phaP2开放阅读框上游79位碱基处，其序列及其后的调控序列如下，SEQ ID NO：2：
atgttgcactgcacaaaaccccctgttatgctgcaacgCaagataactagatatcagctgcggtgggtgcttaacaaaaccgttgctgatcaaccaacactaacggcaccgtcaatca
phaP3的启动子在phaP3开放阅读框上游446位碱基处，其序列及其后的调控序列如下，SEQ ID NO：3：
cagcacggtgcgcttggcgtaacgctgctacactctaggaagatggttaaggagtcgcctatgaaaatcaacgttgaatttgacttgacaccggatgagtttcgccaatcgctagggctgccggatgttgaggcgtttcagcaaaacctgctggaaaacattcagcggcaaatggaatctggggtggatggctatgaccccatgaatctaatgcgaccttttctgcagcagccaatgatgcagcagggagtctcgcaagggctggctaatttcggcacgtatcaacagatgatgttggatatgttgcgcaaagcgggaacctcaggcggcagtgctgaacaggatagcgacacgagccaagacgagtcccaagaagcagctaaaccaaagccagcagcatcaggtaaaagcgcatcaagtgcgagaagctccaaagcgaaagcgacagcttcttcgcgttctcgcgctaaagggtagaaatgtaatgtgaa
phaR的启动子在phaR开放阅读框上游37位碱基处，其序列及其后的调控序列如下，SEQ ID NO：4：
gcttgcataggcgcatgttgcaggcacaatagcagcaacggcgacaaagcctctaccgcgtttaaggagatgcgcta
二、在Halomonas bluephagenesis中phaP启动子及phaR启动子中PhaR结合区域的预测和验证
1、在Halomonas bluephagenesis中PhaR对phaP的调控验证
phaP-GFP标记的菌株可以在生产PHA时有明显绿色荧光，而在不生产PHA时几乎没有荧光，在LB60平板上培养，由于不符合生产PHA的高碳低氮的培养策略，在胞内不会累积大量PHA，此时观察平板没有荧光出现。
敲除phaR之后，菌体可以在LB60平板上观察到明显的荧光，证明phaP启动子被RhaR抑制调控，敲除phaR可以使其不受PHA合成的调控，荧光在没有合成PHA的时候出现。也就是说，PhaR的控制对于phaP启动子受PHA合成调控至关重要。
2、在Halomonas bluephagenesis中phaR和phaP及自身启动子区结合位点的验证
经足迹实验证实，phaR和phaP及自身启动子区的结合位点为：
SEQ ID NO：5：atgttgc
综上试验结果，表明phaP系列启动子的位置，和其依赖于SEQ ID NO：5的核酸位点受PhaR蛋白在转录水平的调控。后续实验都基于该实验而设计。
实施例2：在Halomonas bluephagenesis中利用phaP系列启动子生产PHA
Halomonas bluephagenesis作为PHA的天然生产菌株，可以在胞内大量累积PHA，利用phaP系列启动子，对生产PHA的基因进行过表达，主要从两个方面提升PHA的产量。
1）形成自激励的表达回路，对PHA合成的基因进行自激励的过表达，进一步提高胞内的产量。
2）克服有毒的代谢中间产物在发酵初期累积的情况，实现有毒中间代谢产物的快速转化。
1、在Halomonas bluephagenesis中利用phaP1启动子生产聚-3-羟基脂肪酸酯（P3HB）
P3HB的生产过程中需要的酶，包括乙酰辅酶A乙酰基转移酶（PhaA），3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶(PhaB)和PHA合酶（PhaC），在PHA的合成过程中，通过过表达这几个合成酶，实现P3HB生产的自激励诱导。
实验方案如下，在Halomonas bluephagenesis TD01中，利用pSEVA341质粒上构建phaP1启动子连接的phaA，phaB和phaC基因或他们任意的组合，一共有9种不同的组合方式，具体实验数据如表1所示。可以看出，用该启动子通过自激励的方式表达PhaA，PhaB，PhaC蛋白或它们的组合能够提高PHA含量和细胞干重水平。
表1：在Halomonas bluephagenesis中利用phaP1启动子过表达phaCAB
Figure 782681DEST_PATH_IMAGE001
2、在Halomonas bluephagenesis中利用phaP2启动子生产聚(3-羟基丁酸-4-羟基丁酸)共聚酯
聚(3-羟基丁酸-4-羟基丁酸)共聚酯[P(3HB-co-4HB)]是一种二元聚酯，相对于单纯由3-羟基脂肪酸构成的P3HB而言，[P(3HB-co-4HB)]有着更好的延展性，而且随着4-羟基脂肪酸（4HB）的比例上升而杨氏模量逐渐增加。所以生产P（3HB-co-4HB）中，提高4HB比例在生产中有重要意义。
4HB单体的产生从三羧酸循环中的琥珀酰辅酶A而来，需要通过琥珀酸半醛脱氢酶（SucD）和4-羟基丁酸脱氢酶（4HbD）和4-羟基丁酰辅酶A还原酶（OrfZ）生成4-羟基丁酰辅酶A（4HB-CoA），而4HB-CoA可以被phaC识别，合成P(3HB-co-4HB)。在这个过程中，SucD的生成产物琥珀酸半醛（SSD）是有毒的，提高该底物的传递效率，对于终产物的产量提高有重要意义。该实验的主要思路是减少有毒中间产物的累计。
通过phaP2启动子过表达sucD，长表达启动子porin表达4hbD和orfZ，使得在生产出SSD的时候，胞内已经有足够的4HbD和OrfZ来将其反应为下游代谢物。
具体实验设计是，实验组为在Halomonas bluephagenesis TD01的菌株中，有phaP2启动子表达的sucD基因，和porin启动子表达的4hbD基因和orfZ基因（TD01+P2-sucD+porin-4hbD-orfZ）。对照组1在实验组的基础上敲除phaR，解除对于phaP2启动子的抑制(TD01∆phaR+P2-sucD+porin-4hbD-orfZ)。对照组2为完全由porin启动子表达这三个基因（TD01+porin-sucD+porin-4hbD-orfZ）。实验结果如表2所示，从中可以看出，通过phaP2启动子，可以在一定程度上提高4HB比例，从而对材料性能的提升有所帮助。
表2：在Halomonas bluephagenesis中利用phaP2的启动子生产P(3HB-co-4HB)
Figure DEST_PATH_IMAGE002
3、在Halomonas bluephagenesis中利用phaP1的启动子生产聚(3-羟基丁酸-3-羟基戊酸)共聚酯（PHBV）。
PHBV相较于PHB而言，由于单体3-羟基戊酸（3HV）的掺入，其熔点和玻璃化温度降低，给材料加工提供了很多便利，生产PHBV所需要的酶和生产PHB相同，也需要PhaA，PhaB和PhaC的参与。只是需要丙酰辅酶A作为前体。利用异源表达scpAB基因簇合成的丙酰辅酶A作为前体，就能在Halomonas bluephagenesis内合成PHBV。在该体系下，也可适用于自激励系统。
在基因组上整合了scpAB的基底菌Halomonas bluephagenesis TD08，和在生产PHB中过表达phaA基因，phaB基因或phaC基因的质粒，挑选其中较好的过表达phaA基因或phaB基因或这两者的组合，可以看出，用该启动子通过自激励的方式表达phaA基因，phaB基因，phaC基因或它们的组合能够提高PHBV含量和细胞干重水平。实验结果如表3所示。可以看出，在生产PHBV的菌株中，同样可以利用基于phaP系列启动子来提高PHA的产量。
表3：在Halomonas bluephagenesis中利用phaP1启动子生产PHBV
Figure 90034DEST_PATH_IMAGE003
实施例3：在Halomonas bluephagenesis中利用phaP系列启动子合成和PHA联产的小分子产物。
PHA作为一种胞内累积产物，同时生成胞外分泌类的小分子产物能够在一定程度上降低发酵成本，提高其产品附加值。然而在小分子生产过程中，存在细菌发酵初期大量表达各种酶类对细胞生长的压力过大及一些大量有毒的中间代谢产物无法及时释放的等问题。为了解决这两个问题，可以采用如下策略，
1)克服有毒的代谢中间产物会在发酵初期累积，实现有毒中间代谢产物的快速转化。
2)避免细菌在发酵初期由于大量表达某些蛋白对代谢造成压力而影响生长。
1、在Halomonas bluephagenesis中利用phaP1的启动子生产3-羟基丙酸
利用甘油生产3-羟基丙酸（3HP），可以dhaB和aldD这两个基因编码的甘油脱水酶和3-羟基丙醛脱氢酶来实现。其中，3-羟基丙酸是一种三碳平台的重要组成部分。在发酵过程中，会产生有毒的中间代谢物3-羟基丙醛。同样，参考生产P(3HB-co-4HB)中4HB组分的策略，可以利用长表达强启动子过表达aldD基因，同时利用phaP1启动子表达dhaB基因，来实现在胞内不过多累积有毒的中间代谢产物3-羟基丙醛的效果。
具体实验设置，实验组为在Halomonas bluephagenesis TD01的基础上，用phaP1启动子表达的dhaB和利用长表达启动porin表达的aldD。对照组1为表达体系不变，但菌株本身敲除了phaR。对照组2为利用长表达的启动子porin表达这两个基因。具体的实验结果如表4所示。可以看出，在使用phaP启动子中，相对于对照组1和2可以显著的提升3HP的产量。
表4：在Halomonas bluephagenesis中phaP1启动子生产3-羟基丙酸
Figure DEST_PATH_IMAGE004
2、在Halomonas bluephagenesis中利用phaP3启动子生产四氢嘧啶。
四氢嘧啶（ectoine）是嗜盐菌用于对抗胞外高浓度的盐离子而产生的渗透压调节物质，其在工业上能够应用在化妆品，防冻剂等化工应用。生产四氢嘧啶需要从天冬氨酸出发，通过基因簇ectABC实现四氢嘧啶的生产。
该实验可利用减少初期细菌分裂压力的策略，实验设计上，实验组为以Halomonas bluephagenesis TD01为底盘菌，在质粒上使用phaP3启动子表达的ectABC基因簇。对照组1使用相同的质粒，但底盘菌为敲除了phaR的Halomonas bluephagenesis TD01。对照组2的底盘菌为Halomonas bluephagenesis TD01，质粒上为porin启动子表达的基因簇。结果展示在表5中，从其中可以看出，利用phaP3启动子表达ectABC基因可以提高四氢嘧啶（ectoine）的产量。
表5：在Halomonas bluephagenesis中利用phaP3启动子生产四氢嘧啶ectoine
Figure 73034DEST_PATH_IMAGE005
实施例4：在Halomonas bluephagenesis中利用phaP系列启动子表达分泌酶
在细菌中表达分泌酶可以扩展细菌本身的可用的底物。如，过表达淀粉酶可以使细菌能够更好的利用胞外的淀粉，增加其利用复杂碳源的能力。表达这些酶类往往需要大量表达，这对于细胞分裂初期的代谢压力是很大的，同样，可以使用上文中提到的避免细菌在发酵初期由于大量表达某些蛋白对代谢造成压力而影响生长策略来减少细菌初期的分裂压力。
在Halomonas bluephagenesis中利用phaP1启动子表达淀粉酶。淀粉酶的生产主要由编码淀粉酶的蛋白和N端的的信号肽（AmyL），通过淀粉酶的表达，可以使细菌可以利用淀粉作为碳源生长，提高其可以利用餐厨垃圾作为原料的可能性。
该实验设计参考上文中的策略，减少发酵初期过表达淀粉酶对细菌的压力。实验组为在Halomonas bluephagenesis TD01的基础上，用phaP1的启动子表达amyL基因，对照组1为在TD01∆phaR的基础上，使用相同质粒表达amyL基因，对照组2为在TD01的基础上，用porin启动子表达amyL基因。测量指标为淀粉酶活性，具体结果如表6所示，可以看出利用phaP1启动子表达淀粉酶对累积淀粉酶活性有提高的作用。表中酶活指数是指淀粉分解圈的直径和菌落直径之比。
表6：在Halomonas bluephagenesis中利用phaP1启动子表达淀粉酶
Figure DEST_PATH_IMAGE006
实施例5：在Halomonas bluephagenesis中利用phaP系列启动子通过细胞形变提高PHA含量
在PHA发酵后期，PHA的累计会受到细胞体积的限制，无法进一步增加，在后期对细胞分裂的基因进行干扰，可以在一定程度上提高PHA的含量。用于表达的基因有细胞分裂抑制因子MinCD，编码细胞骨架蛋白的MreB等。
由于细胞分裂对于细胞而言非常重要，所以对于这种基因的调控要控制在发酵的后期进行，也就是使用phaP启动子的策略。
在细菌的二分裂过程中，细胞分裂抑制因子MinC是FtsZ蛋白的抑制因子，会阻止FtsZ的多聚化。而FtsZ蛋白是胞内分裂环，会在细胞分裂的位置招募其他蛋白最终导致分裂的产生。在天然条件下，MinC受到胞内精确的调控，会不断的在胞内穿梭，最终形成细胞中心浓度最低的状态，FtsZ在此处受到的抑制较小，最终导致在细胞中间位置产生分裂。而过表达MinC会打破这种平衡，最终导致细胞无法分裂，进而不断伸长。具体为在Halomonas bluephagenesis中利用phaP2基因过表达细胞分裂抑制因子MinCD，促进细胞增长，提高PHA含量。
本试验旨在避免过早的干扰细胞分裂影响细胞的生长问题。实验组为在Halomonas bluephagenesis TD01菌株的基础上用质粒过表达minCD基因，对照组1为在Halomonas bluephagenesis TD01菌株的基础上用质粒过表达minCD基因，对照组2为TD01的基础上和空白质粒（表7）。可以看出，相较于对照组1和2，使用phaP1启动子过表达minCD基因可以提高PHA含量和细胞干重。伸长的细胞形态如图1所示。
表7：在Halomonas bluephagenesis中利用phaP2的启动子过表达minCD基因
Figure 655194DEST_PATH_IMAGE007
实施例6：在大肠杆菌Escherichia coli中利用人工设计的包含PhaR结合位点的porin-R启动子表达淀粉酶
在已经鉴定了phaP启动子和其受到调控的原因之后，也可以在大肠杆菌中实现这一过程的调控。大肠杆菌没有天然的合成PHA的能力，也没有产生淀粉酶的能力，所以，使用双质粒系统来同时表达产PHA的酶（PhaCAB）以及受到PhaR控制的porin-R启动子表达的淀粉酶。其中porin-R启动子由人工设计，在原本的porin启动子后连接PhaR结合位点SEQ IDNO：5，使其也能够受到PhaR的调控，进而跟随PHA累积而强度增加。
porin-R的序列如下，SEQ ID NO：6：
ATGCCTCCACACCGCTCGTCACAtcctgttgcgtTCACTGGAATCCCAgtatagagtTTGACCTGCGAGatgttgcCAaGCTGTCACCGGATGTGCTTTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAGCCTCTACAAATAATTTTGTTTAAgagttactagagaaagaggagaaatactag
实验在大肠杆菌JM109上进行，实验组为导入了带有来源于Ralstonia eutropha的phaCAB基因簇的质粒（质粒名称PBHR68，其启动子为内源启动子）和带有porin-R启动子表达的amyL基因以及phaR基因，对照组1的质粒上不表达phaR基因，对照组2用长表达启动子porin表达amyL基因。可以看出，使用受PhaR调控的phaP启动子的累积淀粉酶活性更高（表8）。表中酶活指数是指淀粉分解圈的直径和菌落直径之比。
表8：大肠菌株JM109中利用phaP1的启动子表达淀粉酶
Figure DEST_PATH_IMAGE008
实施例7：罗氏真养杆菌利用phaP1启动子表达赖氨酸脱氢酶转化赖氨酸生产1，5-戊二胺
1,5-戊二胺是一种重要的聚合物的组成单体，可以用来合成聚酰胺等聚合物。而其本身有一定的毒性，在发酵前期累计1,5-戊二胺会对细胞生长造成一定的影响。在生物发酵生产中，其主要来源于L-赖氨酸的脱羧。催化此反应的酶是由来源于大肠杆菌的cadA基因编码的赖氨酸脱羧酶。
利用phaP1启动子表达赖氨酸脱羧酶，是解决发酵前期1,5-戊二胺累积，对细胞造成毒性的对应策略。在罗氏真氧菌中表达赖氨酸脱羧酶的具体实验结果如表9所示。其中实验组为用phaP1的启动子表达cadA基因，同时，质粒上还有编码PhaR蛋白的基因作为调控。对照组1的质粒和实验组相比不包括phaR。对照组2使用porin启动子表达cadA基因。以上组别均过表达cadA从而把1,5-戊二胺转运到胞外（表9）。
表9：Ralstonia eutropha中利用phaP1启动子生产1,5-戊二胺
Figure 407249DEST_PATH_IMAGE009
实施例8：巨大产碱杆菌（Alcaligenes latus）、假单胞菌属（Pseudomonas spp.）、气生单胞菌属（Aeromonas spp.）利用phaP1启动子表达3-羟基丙酸代谢通路生产3-羟基丙酸
1、巨大产碱杆菌（Alcaligenes latus）利用phaP1启动子生产3-羟基丙酸
巨大产碱杆菌是一种能够利用蔗糖作为碳源生长，并天然累积PHA的细菌。由于其优秀的PHA生产能力，也被开发利用为一株生产菌株。巨大产碱杆菌生产3-羟基丙酸可以利用长表达强启动子过表达aldD基因，同时利用phaP1启动子表达dhaB基因，来实现在胞内不过多累积有毒的中间代谢产物3-羟基丙醛的效果。
具体的，实验组为质粒上使用phaP1启动子表达dhaB基因，同时用长表达的porin启动子表达aldD基因，及PhaR用自身启动子表达。对照组1相对于实验组不表达PhaR。对照组2相对于实验组用长表达启动子表达dhaB基因（表10）。
表10：Alcaligenes latus中利用phaP1启动子生产3-羟基丙酸
Figure DEST_PATH_IMAGE010
2、假单胞菌属（Pseudomonas spp.）利用phaP1启动子生产3-羟基丙酸
假单胞菌属也是PHA的天然生产菌株，主要生产单体为6至14个碳的长链PHA。所以也可以在其生产PHA的同时，利用phaP1启动子生产3-羟基丙酸。实验设计和巨大产碱杆菌类似，以Pseudomonas putida为例。具体结果如表11所示。
表11：Pseudomonas putida中利用phaP1启动子生产3-羟基丙酸
Figure 422521DEST_PATH_IMAGE011
3、气生单胞菌属（Aeromonas spp.）利用phaP1启动子生产3-羟基丙酸
气生单胞菌是PHA的天然生产菌株，和其他生产菌株对比，主要生产单体为5至12个碳的中长链PHA。所以也可以在其生产这类PHA产品的同时，利用phaP1启动子生产3-羟基丙酸。实验设计和巨大产碱杆菌类似，以Aeromonas hydrophila 4AK4为例。具体结果如表12所示。
表12：Aeromonas hydrophila 4AK4中利用phaP1启动子生产3-羟基丙酸
Figure DEST_PATH_IMAGE012
实施例9：Halomonas campaniensis LS21 CGMCC No.6593 和Halomonas aydingkolgenesis M1 CGMCC NO.19880利用phaP1启动子表达苏氨酸合成通路生产苏氨酸
苏氨酸是人体的必须氨基酸之一，广泛应用于饲料添加剂，食品添加剂等领域。由于盐单胞菌培养条件特殊（需要一定浓度的钠盐），可进行大规模开放式发酵而不易染菌，利用其进行开放发酵产苏氨酸有一定的生产意义。在盐单胞菌中（Halomonas campaniensis LS21 CGMCC No.6593和Halomonas aydingkolgenesis M1 CGMCCNO.19880）中，缺乏苏氨酸外转运蛋白，所以无法将生产的苏氨酸分泌到细胞外来。分泌型的苏氨酸不但在下游处理中有优势，也有利于和胞内产物PHA同步生产。而在发酵初期大量过表达苏氨酸转移蛋白（由来源于大肠杆菌的rhtC编码），会影响胞内正常对苏氨酸的利用，造成细胞生长较差，影响最终的PHA产量。
具体实验设计上，实验组为使用phaP1启动子表达rhtC基因，同时在一起表达phaR基因，对照组1为使用phaP1启动子，但没有表达phaR基因。对照组2为用较弱的长表达启动子porin-203表达rhtC基因，对照组3为用较强的启动子野生型porin启动子表达rhtC基因。可以看出利用phaP1启动子可以克服较强的启动子带来的对细胞生长的影响和较弱启动子带来的分泌不足。具体结果如表13，14所示。
表13：Halomonas campaniensis LS21中利用phaP1启动子生产3-羟基丙酸
Figure 627238DEST_PATH_IMAGE013
表14：Halomonas aydingkolgenesis M1中利用phaP1启动子生产3-羟基丙酸
Figure DEST_PATH_IMAGE014
实施例10：利用phaP1启动子表达lacI在Halomonas bluephagenesis中对mreB基因进行抑制实现细胞体积增大。
mreB基因是细胞内对于细胞大小调控的基因，对其抑制会引起细胞体积增大，在其启动子区插入lacO位点，lacI的产物称为Lac阻遏物（lac repressor），其功能是和lacZ、Y、A基因簇5’端的操纵基因lacO结合，当操纵基因lacO被LacI占据时，RNA聚合酶不与启动子结合，阻碍启动子上的转录起始，从而抑制mreB基因，实现在细胞生长后期变大，提高PHA含量。
具体实验设置，实验组为将lacO位点插入到在Halomonas bluephagenesis TD01自身基因组中的mreB启动子后，再导入用phaP1启动子表达lacI基因的质粒；对照组1为只将lacO位点插入到在Halomonas bluephagenesis TD01自身基因组中的mreB启动子后，不导入表达lacI基因的质粒；对照组2为Halomonas bluephagenesis TD01，既不插入lacO位点也不导入表达lacI基因的质粒，具体结果如表15及图2所示。
表15：Halomonas bluephagenesis中利用phaP1启动子表达lacI基因抑制mreB基因
Figure 216351DEST_PATH_IMAGE015
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
序列表
<110> 清华大学
北京微构工场生物技术有限公司
<120> 一种表达强度受细菌胞内聚羟基脂肪酸酯（PHA）合成调控的启动子及其应用
<130> P0102021100746W
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 158
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggttgttgtt gtcggtggct agtcgcaatg ttatgaaaaa atcatgttgc gctgcacaaa 60
aagcactgct agctttgttg ttagtaaagg caaccgcctg atcatcgacc gctcatcgat 120
gcgtgtcgaa tcgctagctc acttaaggag attatgtg 158
<210> 2
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgttgcact gcacaaaacc ccctgttatg ctgcaacgca agataactag atatcagctg 60
cggtgggtgc ttaacaaaac cgttgctgat caaccaacac taacggcacc gtcaatca 118
<210> 3
<211> 491
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagcacggtg cgcttggcgt aacgctgcta cactctagga agatggttaa ggagtcgcct 60
atgaaaatca acgttgaatt tgacttgaca ccggatgagt ttcgccaatc gctagggctg 120
ccggatgttg aggcgtttca gcaaaacctg ctggaaaaca ttcagcggca aatggaatct 180
ggggtggatg gctatgaccc catgaatcta atgcgacctt ttctgcagca gccaatgatg 240
cagcagggag tctcgcaagg gctggctaat ttcggcacgt atcaacagat gatgttggat 300
atgttgcgca aagcgggaac ctcaggcggc agtgctgaac aggatagcga cacgagccaa 360
gacgagtccc aagaagcagc taaaccaaag ccagcagcat caggtaaaag cgcatcaagt 420
gcgagaagct ccaaagcgaa agcgacagct tcttcgcgtt ctcgcgctaa agggtagaaa 480
tgtaatgtga a 491
<210> 4
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcttgcatag gcgcatgttg caggcacaat agcagcaacg gcgacaaagc ctctaccgcg 60
tttaaggaga tgcgcta 77
<210> 5
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgttgc 7
<210> 6
<211> 183
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atagagtttg 60
acctgcgaga tgttgccaag ctgtcaccgg atgtgctttc cggtctgatg agtccgtgag 120
gacgaaacag cctctacaaa taattttgtt taagagttac tagagaaaga ggagaaatac 180
tag 183

Claims (14)

1.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体包含启动子和编码PhaR的核苷酸序列，所述的启动子包含PhaR的结合位点，所述PhaR的结合位点包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的启动子选自phaP1、phaP2、phaP3或porin-R，所述的porin-R为在porin启动子或其突变体上加入PhaR的结合位点，其中，porin启动子突变体选自porin-203、porin-211、porin-42或porin-140中的任一种。
3.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体还包含编码产物合成途径相关的基因，所述的产物包含PHA或组成PHA的单体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述的PHA选自3-羟基丁酸均聚物PHB，3-羟基丁酸和4-羟基丁酸二元共聚物P3HB4HB，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基戊酸三元共聚物PHBV4HB，3-羟基丁酸和3-羟基己酸二元共聚物PHBHHx，3-羟基丙酸的均聚物或共聚物，所述的3-羟基丙酸的均聚物为P3HP，所述的3-羟基丙酸的共聚物为P(3HB-co-3HP)或PHBHP；所述的组成PHA的单体选自3-羟基丁酰辅酶A、4-羟基丁酰辅酶A、3-羟基戊酰辅酶A、5-羟基戊酰辅酶A、3-羟基己酰辅酶A或6-羟基己酰辅酶A。
5.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述的产物还包含：
a）与PHA联产的产物及生产与PHA联产的产物相关的酶，所述的与PHA联产的产物选自氨基酸、肌醇、四氢嘧啶、1,3-丙二醇、3-羟基丙酸、1，5-戊二胺或5-氨基乙酰丙酸；
b）分泌到胞外的酶，选自脂肪酶、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、酯酶、葡聚糖酶、果胶酶、磷酯酶、明胶酶或核酸酶；
c）与细胞形态相关的蛋白，选自微管蛋白FtsZ、细胞骨架蛋白MreB或细胞分裂调控因子MinCD；或，
d）与细胞内基因调控相关的蛋白，选自乳糖操纵子遏制蛋白LacI或四环素操纵子阻遏蛋白TetR。
6.一种表达载体组合物，其特征在于，所述的表达载体组合物包含一个或多个第一表达载体和一个或多个第二表达载体，所述的第一表达载体包含第一启动子，所述的第二表达载体包含第二启动子，所述的第一启动子和/或第二启动子包含PhaR的结合位点，所述的第一表达载体和/或第二表达载体包含编码PhaR的核苷酸序列，其中，所述PhaR的结合位点包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的表达载体组合物，其特征在于，所述包含PhaR的结合位点的启动子选自phaP1、phaP2、phaP3或porin-R，所述的porin-R为在porin启动子或其突变体上加入phaR的结合位点，其中，porin启动子突变体选自porin-203、porin-211、porin-42或porin-140中的任一种。
8.根据权利要求6或7所述的表达载体组合物，其特征在于，
i）所述的第一表达载体包含编码产物合成途径相关的基因，所述的产物为PHA或组成PHA的单体；所述的第二表达载体包含编码产物合成途径相关的基因，所述的产物选自：
a）与PHA联产的产物及生产与PHA联产的产物相关的酶，所述的与PHA联产的产物选自氨基酸、肌醇、四氢嘧啶、1,3-丙二醇、3-羟基丙酸、1，5-戊二胺或5-氨基乙酰丙酸；
b）分泌到胞外的酶，选自脂肪酶、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、酯酶、葡聚糖酶、果胶酶、磷酯酶、明胶酶或核酸酶；
c）与细胞形态相关的蛋白，选自微管蛋白FtsZ、细胞骨架蛋白MreB或细胞分裂调控因子MinCD；或，
d）与细胞内基因调控相关的蛋白，选自乳糖操纵子遏制蛋白LacI或四环素操纵子阻遏蛋白TetR；
ii）所述的第二表达载体包含编码产物合成途径相关的基因，所述的产物为PHA或组成PHA的单体；所述的第一表达载体包含编码产物合成途径相关的基因，所述的产物选自：
a）与PHA联产的产物及生产与PHA联产的产物相关的酶，所述的与PHA联产的产物选自氨基酸、肌醇、四氢嘧啶、1,3-丙二醇、3-羟基丙酸、1，5-戊二胺或5-氨基乙酰丙酸；
b）分泌到胞外的酶，选自脂肪酶、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、酯酶、葡聚糖酶、果胶酶、磷酯酶、明胶酶或核酸酶；
c）与细胞形态相关的蛋白，选自微管蛋白FtsZ、细胞骨架蛋白MreB或细胞分裂调控因子MinCD；或，
d）与细胞内基因调控相关的蛋白，选自乳糖操纵子遏制蛋白LacI或四环素操纵子阻遏蛋白TetR。
9.一种启动子，其特征在于，所述的启动子为在porin启动子或其突变体上加入PhaR的结合位点，其中，porin启动子突变体选自porin-203、porin-211、porin-42或porin-140中的任一种。
10.一种重组菌，其特征在于，所述的重组菌中包含：
A）权利要求1-5任一所述的表达载体；
B）权利要求6-8任一所述的表达载体组合物；或者，
C）权利要求9所述的启动子。
11.根据权利要求10所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌选自大肠杆菌、罗氏真养杆菌、巨大产碱杆菌、假单胞菌属、气生单胞菌属或嗜盐单胞菌属。
12.一种权利要求10或11所述的重组菌的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括将权利要求1-5任一所述的表达载体、权利要求6-8任一所述的表达载体组合物或权利要求9所述的启动子导入重组菌中。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体将启动子整合至重组菌基因组中或者所述表达载体游离在重组菌中。
14.一种发酵方法，其特征在于，所述的方法包括发酵培养权利要求10或11所述的重组菌。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114134096A (zh) * 2022-02-07 2022-03-04 清华大学 3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基戊酸三元共聚物p(3hb-4hb-3hv)及其微生物生产
CN114561415A (zh) * 2022-04-08 2022-05-31 清华大学 一种在微生物中用油酸调控基因表达的方法及其应用
CN116814615A (zh) * 2023-08-30 2023-09-29 清华大学 一种细胞形态纤长化的重组菌株及其构建方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2008200780A1 (en) * 2001-04-19 2008-03-13 The Regents Of The University Of California In vivo incorporation of unnatural amino acids
AU2013201354A1 (en) * 2005-09-27 2013-03-28 Polybatics Limited Polymer particles and uses thereof
CN110004182A (zh) * 2019-04-02 2019-07-12 清华大学 一种微生物胞内大颗粒内含物的制备方法及其应用
CN111235173A (zh) * 2020-01-22 2020-06-05 清华大学 一种生产短中链聚羟基脂肪酸酯pha及其功能衍生物的方法
CN113684169A (zh) * 2021-10-26 2021-11-23 清华大学 聚(3-羟基丁酸-4-羟基丁酸-5-羟基戊酸)三聚物及其微生物生产菌株构建

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2008200780A1 (en) * 2001-04-19 2008-03-13 The Regents Of The University Of California In vivo incorporation of unnatural amino acids
AU2013201354A1 (en) * 2005-09-27 2013-03-28 Polybatics Limited Polymer particles and uses thereof
CN110004182A (zh) * 2019-04-02 2019-07-12 清华大学 一种微生物胞内大颗粒内含物的制备方法及其应用
CN111235173A (zh) * 2020-01-22 2020-06-05 清华大学 一种生产短中链聚羟基脂肪酸酯pha及其功能衍生物的方法
CN113684169A (zh) * 2021-10-26 2021-11-23 清华大学 聚(3-羟基丁酸-4-羟基丁酸-5-羟基戊酸)三聚物及其微生物生产菌株构建

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKIRA MAEHARA等: "《A Repressor Protein, PhaR, Regulates Polyhydroxyalkanoate (PHA) Synthesis via Its Direct Interaction with PHA》", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 *
CHEN, XB等: "《Reprogramming Halomonas for industrial production of chemicals》", 《 JOURNAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY & BIOTECHNOLOGY》 *
CHOU, ME等: "《Analyses of binding sequences of the PhaR protein of Rhodobacter sphaeroides FJ1》", 《FEMS MICROBIOLOGY LETTERS》 *
DUANGTHIP TRISRIVIRAT等: "《Promoter engineering for microbial bio-alkane gas production》", 《SYNTHETIC BIOLOGY》 *
EKATERINA S. KOMAROVA等: "《Influence of the spacer region between the Shine–Dalgarno box and the start codon forfine-tuning of thetranslation efficiency inEscherichia coli》", 《MICROBIAL BIOTECHNOLOGY》 *
POETTER, MARKUS等: "《Regulation of phasin expression and polyhydroxyalkanoate (PHA) granule formation in Ralstonia eutropha H16》", 《MICROBIOLOGY (READING) 》 *
POTTER, M等: "《Influence of homologous phasins (PhaP) on PHA accumulation and regulation of their expression by the transcriptional repressor PhaR in Ralstonia eutropha H16》", 《MICROBIOLOGY-SGM》 *
RUCHIRA MITRA等: "《An updated overview on the regulatory circuits of polyhydroxyalkanoates synthesis》", 《MICROBIAL BIOTECHNOLOGY》 *
TRISRIVIRAT,D等: "《Cloning vector pHal2-FAPG462 VRFP, complete sequence》", 《GENBANK: MW076828.1》 *
YAMADA, M等: "《Monitoring and kinetic analysis of the molecular interactions by which a repressor protein, PhaR, binds to target DNAs and poly[(R)-3-hydroxybutyrate]》", 《AMB EXPRESS》 *
ZHI-HUI WANG等: "《A transferable heterogeneous two-hybrid system in Escherichia coli based on polyhydroxyalkanoates synthesis regulatory protein PhaR》", 《MICROBIAL CELL FACTORIES》 *
陈江楠等: "《基于工程化盐单胞菌的下一代工业生物技术》", 《合成生物学》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114134096A (zh) * 2022-02-07 2022-03-04 清华大学 3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基戊酸三元共聚物p(3hb-4hb-3hv)及其微生物生产
CN114561415A (zh) * 2022-04-08 2022-05-31 清华大学 一种在微生物中用油酸调控基因表达的方法及其应用
CN114561415B (zh) * 2022-04-08 2023-08-22 清华大学 一种在微生物中用油酸调控基因表达的方法及其应用
CN116814615A (zh) * 2023-08-30 2023-09-29 清华大学 一种细胞形态纤长化的重组菌株及其构建方法和应用
CN116814615B (zh) * 2023-08-30 2024-01-19 清华大学 一种细胞形态纤长化的重组菌株及其构建方法和应用

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