CN111235173A - 一种生产短中链聚羟基脂肪酸酯pha及其功能衍生物的方法 - Google Patents

一种生产短中链聚羟基脂肪酸酯pha及其功能衍生物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生产短中链聚羟基脂肪酸酯PHA及其功能衍生物的重组菌的构建方法。所述方法包括如下步骤：将特异性PHA聚合酶的编码基因和PHA合成途径的关键蛋白的编码基因，启动子或经突变的启动子，增强中长链脂肪酸碳源利用能力的相关基因，核糖体结合位点RCJ和核糖体结合位点RD导入敲除内源PHA聚合酶基因的出发菌，在重组菌体内调节短中链聚羟基脂肪酸酯PHA及其功能衍生物中各单体比例，从而实现可控生产短中链聚羟基脂肪酸酯PHA及其功能衍生物。

Description

一种生产短中链聚羟基脂肪酸酯PHA及其功能衍生物的方法
技术领域
本发明属于生物技术和材料领域，具体涉及一种生产短中链聚羟基脂肪酸酯PHA及其功能衍生物的方法。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一种生物线性高分子聚酯，常见于生长条件不平衡的微生物细胞内，其广泛作为能量和碳源的存储物质。由于其具有良好的生物可降解性和生物相容性以及诸多优异性能，PHA被认为是解决全球塑料污染的一类最具潜力的生物材料。目前已有多种PHA被成功合成并投入产业化生产，包括聚3-羟基丁酸酯(PHB)、聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸酯(PHBV)、聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯(PHBHHx)、聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸酯(P3HB4HB)。传统的PHA由于在主侧链上缺乏相应的活性位点而导致了相对的生物惰性，很难用于下游的化学修饰，改性的效率较低且效果有限，而侧链上含有特殊官能团的功能PHA凭借其功能基团可以高效地进行化学修饰和改性。不饱和功能PHA是一种侧链上含有活跃的不饱和基团例如碳碳双键、碳碳三键的功能PHA，具有活泼的化学性质，可作为多种化学反应和进一步引入其他基团的原料。因此不饱和功能PHA认为是极具潜力的高附加值PHA合成原料。
聚羟基脂肪酸酯(PHA)的分子结构通式如式(Ⅰ)所示，在PHA的分子结构通式中，侧链R基可以是多种基团，如烷基或者其他取代基团，根据侧链R基的不同，PHA可分为短链PHA(SCL PHA)、中链PHA(MCL PHA)和长链PHA(LCL PHA)。目前所获得不饱和功能PHA主要是中链PHA和长链PHA，这些PHA的单体碳原子数目为6个及以上，热塑性良好，硬度低，柔韧性优异，但同时其熔融温度较低，在加工过程中容易软化，因此其应用受到较大限制；另一种短链PHA主要由3C到5C单体构成，具有结晶度高、硬度强度高、机械性能优异等特点，而短链中链共聚的PHA(SCL-co-MCL PHA)可以同时结合短链PHA和中链PHA两种PHA材料的优点，具备了更优异的性能，被认为是一种有潜力的PHA材料。其中，最具代表性的是聚3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚酯(P(3HB-co-3HHx)或PHBHHx)，该共聚物同时综合了短链和中链PHA的性能优点，具备出色的物化性能和良好的生物相容性，已经被广泛应用于生物医学领域。
Figure BDA0002378198850000011
目前，短链中链共聚的PHA(SCL-co-MCL PHA)的生产方法存在如下缺点：1、功能衍生物的功能基团比例较低。受限于表达体系的能力和PHA聚合酶的酶活性，目前生产的功能PHA的功能基团比例仍然较低。2、侧链单体比例难以控制。目前除了PHBHHx这种仅含有两种单体的聚合物外，通常的短中链PHA实际上可能由多种单体组成。由于β-氧化循环的存在或削弱的不彻底，中长链碳源进入细胞后通过β-氧化循环每轮会丢失两个碳原子，将得到包括C6、C8、C10、C12等多个PHA单体，因此所生产的短中链PHA的单体比例难以控制，进而难以获得稳定的材料性能。3、缺少合适的底盘菌株。目前生产短中链PHA及其功能衍生物主要基于传统的工业生产菌，如假单胞菌，重组大肠杆菌等，面临着易染菌，不连续生长、需要消耗大量淡水等问题，不适应现代生物技术发展需求。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明申请人经过反复的研究和实验验证，提供了一种可控生产短中链PHA及其功能衍生物的重组菌及其生产方法。
本发明首先保护一种生产短中链聚羟基脂肪酸酯PHA或其功能衍生物的重组菌的构建方法；所述生产短中链聚羟基脂肪酸酯PHA或其功能衍生物的重组菌的构建方法为如下1)或2)：
所述1)包括如下步骤：将核糖体结合位点RCJ、特异性PHA聚合酶的编码基因和PHA合成途径的关键蛋白的编码基因导入敲除内源PHA聚合酶基因的出发菌中；
所述2)包括如下步骤：将核糖体结合位点RCJ、核糖体结合位点RD、特异性PHA聚合酶的编码基因、PHA合成途径的关键蛋白的编码基因和增强中长链脂肪酸碳源利用能力的相关蛋白的编码基因导入敲除内源PHA聚合酶基因的出发菌中。
上述方法中，所述特异性PHA聚合酶能够聚合碳原子数为4或5个的短链PHA单体(如3-羟基丁酸、3-羟基戊酸)和碳原子数为6个的饱和/不饱和中链PHA单体(如3-羟基己酸、3-羟基己烯酸)。
进一步的，所述特异性PHA聚合酶为来源于菌株Aeromonas hydrophila的特异性PHA聚合酶PhaC4AK4，所述特异性PHA聚合酶PhaC4AK4为A1)或A2)：
A1)由GenBank号为AHE49699.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
A2)将GenBank号为AHE49699.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失/或添加且具有PHA聚合酶活性的蛋白质。
更进一步的，所述特异性PHA聚合酶PhaC4AK4的编码基因为a1)或a2)或a3)：
a1)序列表中序列3第294-2078位所示的cDNA分子或DNA分子；
a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述特异性PHA聚合酶PhaC4AK4的cDNA分子或DNA分子；
a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述特异性PHA聚合酶PhaC4AK4的cDNA分子或DNA分子。
上述方法中，所述PHA合成途径的关键蛋白为来源于菌株Aeromonas hydrophila的烯酯酰辅酶A水合酶PhaJ4AK4，所述烯酯酰辅酶A水合酶PhaJ4AK4为B1)或B2)：
B1)由GenBank号为AHE49700.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
B2)将GenBank号为AHE49700.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与PHA合成途径相关的蛋白质。
进一步的，所述烯酯酰辅酶A水合酶PhaJ4AK4的编码基因为b1)或b2)或b3)：
b1)序列表中序列3第2075-2479位所示的cDNA分子或DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述烯酯酰辅酶A水合酶PhaJ4AK4的cDNA分子或DNA分子；
b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述烯酯酰辅酶A水合酶PhaJ4AK4的cDNA分子或DNA分子。
上述方法中，所述增强中长链脂肪酸碳源利用能力的相关蛋白为催化外界碳源经转运蛋白FadL运输进入细胞后进行活化的酶，具体可为酰基辅酶A合成酶FadD。
进一步的，所述酰基辅酶A合成酶FadD可为来源于菌株Halomonasbluephagenesis TD-MmP1的酰基辅酶A合成酶FadDTD或来源于菌株E.coli MG1655的酰基辅酶A合成酶FadD。在本发明的具体实施例中，所述增强中长链脂肪酸碳源利用能力的相关蛋白为酰基辅酶A合成酶FadDTD，所述酰基辅酶A合成酶FadDTD为C1)或C2)：
C1)氨基酸序列是序列6所示的蛋白质；
C2)将序列表中序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与增强中长链脂肪酸碳源利用能力相关的蛋白质。
更进一步的，所述酰基辅酶A合成酶FadDTD的编码基因为c1)或c2)或c3)：
c1)序列表中序列5第4152-5822所示的cDNA分子或DNA分子；
c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述酰基辅酶A合成酶FadDTD的cDNA分子或DNA分子；
c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述酰基辅酶A合成酶FadDTD的cDNA分子或DNA分子。
上述方法中，所述1)中，所述核糖体结合位点RCJ、所述特异性PHA聚合酶的编码基因和所述PHA合成途径的关键蛋白的编码基因通过重组质粒甲导入敲除内源PHA聚合酶基因的出发菌中；所述重组质粒甲包括由启动子、所述核糖体结合位点RCJ序列、所述特异性PHA聚合酶的编码基因、所述PHA合成途径的关键蛋白的编码基因和终止子组成的表达盒。
所述2)中，所述核糖体结合位点RCJ、所述核糖体结合位点RD、所述特异性PHA聚合酶的编码基因、所述PHA合成途径的关键蛋白的编码基因和所述增强中长链脂肪酸碳源利用能力的相关蛋白的编码基因通过重组质粒乙导入敲除内源PHA聚合酶基因的出发菌中；所述重组质粒乙包括依次由启动子、所述核糖体结合位点RCJ、所述特异性PHA聚合酶的编码基因、所述PHA合成途径的关键蛋白的编码基因、所述核糖体结合位点RD、所述增强中长链脂肪酸碳源利用能力的相关蛋白的编码基因和终止子组成的表达盒。
进一步的，所述启动子可为Pporin-57启动子或将所述Pporin-57启动子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的启动子(记作突变后的Pporin-57启动子)。所述Pporin-57启动子的核苷酸序列如序列表的序列3中第41-258位核苷酸所示。所述突变后的Pporin-57启动子可为Pporin-68启动子(将Pporin-57启动子第97-99位由gta突变为gac后得到的启动子)、Pporin-278启动子(将Pporin-57启动子第101-104位由agag突变为taaa后得到的启动子)、Pporin-42启动子(将Pporin-57启动子第97-99位由gta突变为cta后得到的启动子)、Pporin-183启动子(将Pporin-57启动子第101-104位由agag突变为agca后得到的启动子)、Pporin-58启动子(将Pporin-57启动子第97-99位由gta突变为ata后得到的启动子)、Pporin-140启动子(将Pporin-57启动子第101-104位由agag突变为aaga后得到的启动子)和Pporin-3启动子(将Pporin-57启动子第97-99位由gta突变为tga后得到的启动子)。
所述重组质粒的质粒骨架可为中低拷贝质粒骨架。所述中低拷贝质粒骨架具体可为SEVA331。
所述核糖体结合位点RCJ可为核糖体结合位点RCJ0、核糖体结合位点RCJ2、核糖体结合位点RCJ3或核糖体结合位点RCJ4。所述核糖体结合位点RCJ4的核苷酸序列如序列表中序列5第1896-1930位核苷酸所示，所述核糖体结合位点RCJ0的核苷酸序列为将核糖体结合位点RCJ4的核苷酸序列中的ACGAGGA替换为AGAGAGA后得到的序列；所述核糖体结合位点RCJ2的核苷酸序列为将核糖体结合位点RCJ4的核苷酸序列中的ACGAGGA替换为AGGCGCA后得到的序列；所述核糖体结合位点RCJ3的核苷酸序列为将核糖体结合位点RCJ4的核苷酸序列中的ACGAGGA替换为AACACGA后得到的序列。
所述核糖体结合位点RD可为核糖体结合位点RD0、核糖体结合位点RD1、核糖体结合位点RD2、核糖体结合位点RD3、核糖体结合位点RD4或核糖体结合位点RD5。所述核糖体结合位点RD0的核苷酸序列如序列表中序列5第4117-4151位核苷酸所示；所述核糖体结合位点RD1的核苷酸序列为将核糖体结合位点RD0的核苷酸序列中的AGAGAGA替换为AGGTCAA后得到的序列；所述核糖体结合位点RD2的核苷酸序列为将核糖体结合位点RD0的核苷酸序列中的AGAGAGA替换为AAGGACA后得到的序列；所述核糖体结合位点RD3的核苷酸序列为将核糖体结合位点RD0的核苷酸序列中的AGAGAGA替换为AGTAGAA后得到的序列；所述核糖体结合位点RD4的核苷酸序列为将核糖体结合位点RD0的核苷酸序列中的AGAGAGA替换为AAATAAA后得到的序列；所述核糖体结合位点RD5的核苷酸序列为将核糖体结合位点RD0的核苷酸序列中的AGAGAGA替换为ATCATCA后得到的序列。
更进一步的，所述1)中，所述重组质粒甲具体可为pSA3CJ-Pporin-57，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。
所述2)中，所述重组质粒乙具体可为pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ4×RD0、pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ0×RD0、pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ3×RD0、pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ0×RD2、pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ0×RD3、pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ0×RD4、pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ0×RD5、pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ3×RD1、pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ3×RD2、pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ3×RD3、pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ3×RD4、pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ3×RD5、pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ4×RD1、pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ4×RD2、pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ4×RD3、pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ4×RD5。所述pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ4×RD0的核苷酸序列如序列表中序列5所示，其余质粒的核苷酸序列为将pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ4×RD0质粒序列中的核糖体结合位点RCJ和RD替换为相应的核糖体结合位点序列后得到的序列。
上述方法中，所述敲除内源PHA聚合酶基因可通过向出发菌中导入特异DNA分子丙和特异DNA分子丁实现。所述特异DNA分子丙包括对应于PHA聚合酶基因上游的同源臂序列和对应于PHA聚合酶基因下游的同源臂序列。所述特异DNA分子丁包括编码Cas9蛋白的基因。
进一步的，所述敲除内源PHA聚合酶基因通过向出发菌中导入特异质粒丙和特异质粒丁实现。所述特异质粒丙为含有所述特异DNA分子丙的质粒。所述特异质粒丙的核苷酸序列具体可为序列表中序列1。所述特异质粒丁为含有所述特异DNA分子丁的质粒。所述特异质粒丁的核苷酸序列具体可为序列表中序列2。
更进一步的，所述出发菌可为嗜盐单胞菌。所述嗜盐单胞菌包括但不限于H.bluephagenesis、H.campeniesis、H.alkaliphila、H.smymensis和H.levan。在本发明的具体实施例中，所述嗜盐单胞菌为嗜盐单胞菌H.bluephagenesis TD-MmP1。
上述方法中，所述重组质粒或所述特异DNA分子或所述特异质粒可采用任何现有方法导入出发菌。例如，电转、化转、接合等。
本发明还保护按照上述方法构建得到的重组菌。
按照上述方法构建得到的重组菌在制备短中链聚羟基脂肪酸酯PHA或其功能衍生物中的应用也属于本发明的保护范围。
按照上述方法构建得到的重组菌在制备单体比例可控的短中链聚羟基脂肪酸酯PHA或其功能衍生物中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明最后保护一种短中链聚羟基脂肪酸酯PHA或其功能衍生物的制备方法。
本发明提供的短中链聚羟基脂肪酸酯PHA或其功能衍生物的制备方法包括如下步骤：以物质A和/或物质B为碳源，发酵培养任一所述重组菌，得到短中链PHA；所述物质A可用于生产短链PHA；所述物质B可用于生产中链PHA。
进一步的，所述物质A可为如下物质中的至少一种：葡萄糖、乙酸、戊酸。所述葡萄糖包括但不限于葡萄糖，也可以是葡萄糖酸盐(如葡萄糖酸钠)；所述乙酸包括但不限于乙酸，也可以是乙酸盐(如乙酸钠)；所述戊酸包括但不限于戊酸，也可以是戊酸盐(如戊酸钠)。
所述物质B可以是饱和/不饱和中长链脂肪酸但不限于饱和/不饱和中长链脂肪酸，也可以是饱和/不饱和中长链脂肪醇、饱和/不饱和中长链烷烃以及它们的混合物。所述物质B具体可为如下物质中的至少一种：油酸、己酸、5-己烯酸、肉豆蔻酸。
所述发酵培养可以在适当的培养条件(温度、培养基成分、转速、溶氧、pH等)下培养，只要该培养能够使其合成期望的短中链PHA或其功能衍生物即可。例如，培养过程中的温度和培养基成分可以由本领域技术人员根据微生物的特性来适当地设定，或常规的优化实验来进行选择。在本发明的具体实施例中，所述发酵培养的条件具体如下：37℃、200rpm振荡培养48小时。所述发酵培养的培养基具体可为60-MM培养基。
所述方法中，可通过发酵培养不同的任一重组菌，调节物质A和物质B的用量比例，即可实现可控生产短中链PHA或其功能衍生物。
更进一步的，可采用油酸作为物质B，所述油酸浓度可为1-10g/L，优选为3-7g/L，更优选为4-6g/L。在本发明的具体实施例中，所述油酸的浓度为5g/L。
可采用己酸作为物质B，所述己酸浓度可为1-10g/L，优选为3-7g/L，更优选为4-6g/L。在本发明的具体实施例中，所述己酸浓度为1g/L、2g/L、3g/L、5g/L、7g/L或10g/L。
可采用葡萄糖作为物质A，采用己酸作为物质B，所述葡萄糖浓度可为10-30g/L，优选为10-20g/L；所述己酸浓度可为0.25-5g/L，优选为1-3g/L。在本发明的一个具体实施例中，所述葡糖糖浓度为10g/L，所述己酸浓度为0.5g/L；在本发明的另一个具体实施例中，所述葡糖糖浓度为10g/L，所述己酸浓度为1g/L；在本发明的另一个具体实施例中，所述葡糖糖浓度为10g/L，所述己酸浓度为2g/L。
可采用葡萄糖作为物质A，采用5-己烯酸作为物质B，所述葡萄糖浓度可为10-30g/L，优选为10-20g/L；所述5-己烯酸浓度可为0.25-5g/L，优选为1-3g/L。在本发明的一个具体实施例中，所述葡糖糖浓度为10g/L，所述5-己烯酸浓度为0.25g/L；在本发明的另一个具体实施例中，所述葡糖糖浓度为10g/L，所述5-己烯酸浓度为0.5g/L；在本发明的另一个具体实施例中，所述葡糖糖浓度为10g/L，所述5-己烯酸浓度为1g/L；在本发明的另一个具体实施例中，所述葡糖糖浓度为10g/L，所述5-己烯酸浓度为2g/L；在本发明的另一个具体实施例中，所述葡糖糖浓度为10g/L，所述5-己烯酸浓度为3g/L；在本发明的另一个具体实施例中，所述葡糖糖浓度为10g/L，所述5-己烯酸浓度为5g/L。
可采用葡萄糖和乙酸作为物质A，采用5-己烯酸作为物质B，所述葡萄糖浓度可为10-30g/L，优选为10-20g/L；所述乙酸浓度为1-7g/L，优选为3-5g/L；所述5-己烯酸浓度可为0.25-5g/L，优选为1-3g/L。在本发明的具体实施例中，所述葡糖糖浓度为10g/L，所述乙酸浓度为5g/L，所述5-己烯酸浓度为1g/L。
可采用己酸和5-己烯酸作为物质B，所述己酸浓度可为0.25-3g/L，所述5-己烯酸浓度可为0.25-3g/L。在本发明的一个具体实施例中，所述己酸浓度为0.25g/L，所述5-己烯酸浓度为1g/L；在本发明的另一个具体实施例中，所述己酸浓度为1g/L，所述5-己烯酸浓度为1g/L；在本发明的另一个具体实施例中，所述己酸浓度为2g/L，所述5-己烯酸浓度为1g/L；在本发明的另一个具体实施例中，所述己酸浓度为3g/L，所述5-己烯酸浓度为1g/L；在本发明的另一个具体实施例中，所述己酸浓度为0.25g/L，所述5-己烯酸浓度为2g/L；在本发明的另一个具体实施例中，所述己酸浓度为1g/L，所述5-己烯酸浓度为2g/L；在本发明的另一个具体实施例中，所述己酸浓度为2g/L，所述5-己烯酸浓度为2g/L；在本发明的另一个具体实施例中，所述己酸浓度为3g/L，所述5-己烯酸浓度为2g/L；在本发明的另一个具体实施例中，所述己酸浓度为0.25g/L，所述5-己烯酸浓度为3g/L；在本发明的另一个具体实施例中，所述己酸浓度为1g/L，所述5-己烯酸浓度为3g/L；在本发明的另一个具体实施例中，所述己酸浓度为2g/L，所述5-己烯酸浓度为3g/L；在本发明的另一个具体实施例中，所述己酸浓度为3g/L，所述5-己烯酸浓度为3g/L。
以上任一所述短中链PHA或其功能衍生物可为饱和的共聚物或不饱和的共聚物。
以上任一所述短中链PHA或其功能衍生物具体可为Poly(3HB-co-MCL 3HA)，即(3-羟基丁酸(3HB)与链长为六个碳的3-羟基己酸(3HHx)或3-羟基己烯酸(3HHxE)中任一种或两种的共聚物等。
以上任一所述短中链PHA或其功能衍生物具体可为聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯[P(3HB-co-3HHx)]、聚3-羟基丁酸-3-羟基己烯酸酯[P(3HB-co-3HHxE)]或聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸-3-羟基己烯酸酯[P(3HB-co-3HHx-co-3HHxE)]等。
对于短中链PHA或其功能衍生物中短链前体的来源，本发明通过如下实现：以短链碳源底物或中链碳源底物为碳源，得到短链PHA前体，特别是3HB。
对于短中链PHA或其功能衍生物中中链PHA前体的来源，本发明通过如下实现：利用中链碳源底物为碳源，能够得到中链PHA前体，通过导入酰基辅酶A合成酶FadDTD增强微生物的中长链脂肪酸碳源利用能力，提高获得中链PHA前体的比例。
对于将短链PHA前体和中链PHA前体聚合形成短中链PHA或其功能衍生物，特别是Poly(3HB-co-MCL 3HA)或其功能物，本发明通过如下实现：敲除微生物内源的编码PHA聚合酶的基因phaC，替换为具有特异性的PHA聚合酶基因，能够同时聚合3HB和含6个碳原子的MCL 3HA前体。具体地，可以通过调节底物碳源浓度生产单体比例可控的短中链PHA或其功能衍生物，还可以通过控制碳源的添加时间来生产单体比例可控的短中链PHA或其功能衍生物。
本发明利用先进的合成生物学技术，基于嗜盐单胞菌的低能耗、无需灭菌，不需要淡水以及可连续操作的海水基生物技术平台，通过对嗜盐单胞菌进行代谢通路的调控及发酵方式的优化实现比例可控的短中链PHA及其功能衍生物的生产。本发明提供的重组菌和方法，对于生产单体比例可控的短中链PHA及其功能衍生物具有重要意义。
附图说明
图1为质粒pTDCKO3-gRNA(a)和pQ08-Cas9(b)的结构示意图。图(a)中phaC-HR L-3和phaC-HR R-3为盐单胞菌内源phaC基因上下游同源臂，长度为500bp。
图2为质粒pSA3CJ-Pporin-57(a)和pSA3C-Pporin-57(b)的结构示意图。其中phaC4AK4和phaJ4AK4为来源于Aeromonas hydrophila的phaC4AK4和phaJ4AK4基因。
图3为P(3HB-co-3HHx)或PHBHHx的1H NMR图谱。谱图上的数字和分子式中的氢原子编号一一对应。测试条件为氘代氯仿，600MHz。
图4为重组盐单胞菌(pSA3CJ-Pporin-57)以不同浓度己酸为唯一碳源生产P(3HB-co-3HHx)的摇瓶实验结果。培养条件为在60-MM培养基中添加不同浓度己酸，37℃，200rpm，发酵48h。HA表示碳源己酸，例如1HA表示1g/L己酸，依次类推。
图5为重组盐单胞菌(pSA3CJ-Pporin-57)以葡萄糖和不同浓度己酸为双碳源生产P(3HB-co-3HHx)的摇瓶实验结果。培养条件为在60-MM培养基中添加葡萄糖和不同浓度己酸，37℃，200rpm，发酵48h。G和HA分别表示碳源葡萄糖和碳源己酸，例如10G+0.5HA表示10g/L葡萄糖+0.5g/L己酸，依次类推。
图6为P(3HB-co-3HHxE)的1H NMR图谱。谱图上的数字和分子式中的氢原子编号一一对应。测试条件为氘代氯仿，600MHz。
图7为重组盐单胞菌(pSA3CJ-Pporin-57)以葡萄糖和不同浓度己烯酸为双碳源生产P(3HB-co-3HHxE)的摇瓶实验结果。培养条件为在60-MM培养基中添加葡萄糖和不同浓度己烯酸，37℃，200rpm，发酵48h。G和HEA分别表示碳源葡萄糖和碳源己烯酸，例如10G+0.25HEA表示10g/L葡萄糖+0.25g/L己烯酸，依次类推。
图8为流式细胞仪表征突变启动子表达强度的结果。分别将带有相应sfGFP基因的质粒导入盐单胞菌中进行培养，检测相应荧光表达强度。
图9为带有不同突变启动子的重组盐单胞菌(pSA3CJ-Pporin series)生产P(3HB-co-3HHxE)的摇瓶实验结果。培养条件为在60-MM培养基中添加10g/L葡萄糖和1g/L 5-己烯酸，37℃，200rpm，发酵48h。
图10为带有不同突变启动子的重组盐单胞菌(pSA3CJ-Pporin series)生产P(3HB-co-3HHxE)的摇瓶实验结果。培养条件为在60-MM培养基中添加10g/L葡萄糖、1g/L5-己烯酸和5g/L乙酸，37℃，200rpm，发酵48h。
图11为质粒pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ4×RD0的结构示意图。其中phaC4AK4和phaJ4AK4为来源于Aeromonas hydrophila的phaC4AK4和phaJ4AK4基因，fadDTD为来源于H.bluephagenesis的fadDTD基因，RCJ4和RD0分别为核糖体结合位点。
图12为P(3HB-co-3HHx-co-3HHxE)的1H NMR图谱。谱图上的数字和分子式中的氢原子编号一一对应。测试条件为氘代氯仿，600MHz。
图13为重组盐单胞菌(pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ4×RD0)利用不同浓度的己酸和己烯酸作为双碳源生产P(3HB-co-3HHx-co-3HHxE)的实验结果。培养条件为在60-MM培养基中添加不同浓度的己酸和不同浓度的己烯酸，37℃，200rpm，发酵48h。HA和HEA分别表示碳源己酸和碳源己烯酸，例如0.25HA+1HEA表示0.25g/L己酸+1g/L己烯酸，依次类推。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的聚3-羟基丁酸酯PHB标样是Sigma–Aldrich，USA.的产品，货号为Lot#BCBQ3366V。
下述实施例中的PHB代表聚3-羟基丁酸酯，P(3HB-co-3HHx)代表聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯，P(3HB-co-3HHxE)代表聚3-羟基丁酸-3-羟基己烯酸酯，P(3HB-co-3HHx-co-3HHxE)代表聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸-3-羟基己烯酸酯，3HB代表3-羟基丁酸，3HHx代表3-羟基己酸，3HHxE代表3-羟基己烯酸。
下述实施例中的培养基配方具体如下：
10-LB培养基溶剂为水，溶质及其浓度分别为：10g/L NaCl，10g/L蛋白胨(英国OXID公司，产品目录号LP0042)、5g/L酵母提取物(英国OXID公司，产品目录号LP0021)，高压蒸汽灭菌。
20-LB培养基溶剂为水，溶质及其浓度分别为：20g/L NaCl，10g/L蛋白胨(英国OXID公司，产品目录号LP0042)、5g/L酵母提取物(英国OXID公司，产品目录号LP0021)，高压蒸汽灭菌。
60-LB培养基溶剂为水，溶质及其浓度分别为：60g/L NaCl，10g/L蛋白胨(英国OXID公司，产品目录号LP0042)、5g/L酵母提取物(英国OXID公司，产品目录号LP0021)，高压蒸汽灭菌。
60-MM培养基溶剂为水，溶质及其浓度分别为：60g/L NaCl，1g/L酵母提取物，1g/L(NH4)2SO4，0.2g/L MgSO4，9.65g/L Na2HPO4·12H2O，1.5g/L KH2PO4，10ml/L微量元素溶液I和1ml/L微量元素溶液II。其中，微量元素溶液I溶剂为1M HCl，溶质及其浓度分别为：5g/L柠檬酸铁铵，2g/L CaCl2。微量元素溶液II溶剂为1M HCl，溶质及其浓度分别为：100mg/LZnSO4·7H2O，30mg/L MnCl2·4H2O，300mg/L H3BO3，200mg/L CoCl2·6H2O，10mg/L CuSO4·5H2O，20mg/L NiCl2·6H2O，30mg/L NaMoO4·2H2O。培养基最终pH用5M NaOH溶液调至8.5。上述试剂均为国药集团化学试剂公司的产品。在实际培养过程中，可向上述培养基中加入一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，常用抗生素包括：氨苄青霉素母液(100mg/ml)；卡那霉素母液(50mg/ml)；壮观霉素母液(100mg/ml)；氯霉素母液(25mg/ml)。
若需获得固体培养基，则在上述液体培养基的基础上添加1.5％琼脂，灭菌后冷却至60℃，按需求添加适量抗生素，混匀后倒平板。
下述实施例中的嗜盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD-MmP1为在盐单胞菌属(Halomonas spp.)的嗜盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01基因组中插入MmP1表达系统后得到的菌株。嗜盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01记载于文献：Tan,Dan,et al."Unsterile and continuous production of polyhydroxybutyrate byHalomonas TD01."Bioresource technology 102.17(2011):8130-8136中.；嗜盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD-MmP1记载于文献：Zhao,Han,et al."Novel T7-likeexpression systems used for Halomonas."Metabolic engineering 39(2017):128-140.中。
下述实施例中的pSEVA331记载于文献：Silva-Rocha,Rafael,et al."TheStandard European Vector Architecture(SEVA):a coherent platform for theanalysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes."Nucleic acidsresearch 41.D1(2012):D666-D675.中。
下述实施例中的接合转化方法具体如下：1)首先将要接合到盐单胞菌中的目的质粒通过电穿孔转化方式转入电转感受态E.coli S17-1中；2)经摇瓶培养含质粒的供体菌E.coli S17-1在10-LB中培养至OD600＝0.5左右；同时，将受体盐单胞菌在60-LB培养基中培养过夜；3)吸取供体菌和受体菌各1ml分别至灭菌EP管中，2500g离心2min，弃去上清液回收细胞沉淀；4)吸取1ml无抗LB培养基分别重悬供体菌和受体菌，2500g离心2min，弃去上清液回收细胞沉淀，重复该步骤两次；5)取50μl无抗10-LB培养基重悬清洗后的供体菌和受体菌，将二者混匀后小心地滴加在无抗的20-LB平板上，可分批滴加至同一个位置，于通风橱中静置晾干置菌液被平板完全吸收；6)将平板于37℃正置培养8-10h，可根据接合质粒的情况适当调整时间；7)将接合平板取出，用枪头刮取平板上的菌苔，并用200μl 60-LB培养基将其重悬，均匀涂布在相应抗性的平板上，于37℃倒置培养24-48h；8)待涂布的平板上长出单菌落后，确认阳性克隆，进行下一步的菌种保存。
下述实施例中的种子液的制备方法具体如下：1)菌种活化：取保存于-80℃冰箱的菌种甘油管，划线接种至含25mg/L氯霉素的60-LB培养基平板，37℃培养24-36h。2)一级种子：从完成步骤1的平板上挑取接单菌落，接种于20mL含25mg/L氯霉素的液体60-LB培养基，37℃、200rpm振荡培养24h。3)二级种子：取步骤2得到的一级种子液，按照1％的接种量接种于20mL含25mg/L氯霉素的液体60-LB培养基，37℃、200rpm振荡培养8-10h。
下述实施例中的发酵培养方法具体如下：1)制备种子液：参照上述种子液的制备方法。2)制备发酵培养基：溶剂为水，溶质及其浓度分别为：60g/L NaCl，20g/L葡萄糖，16g/L玉米浆粉，2g/L尿素，0.2g/L MgSO4，2.7g/L Na2HPO4·12H2O，3.3g/L KH2PO4，10ml/L微量元素溶液I和1ml/L微量元素溶液II。其中，微量元素溶液I溶剂为1M HCl，溶质及其浓度分别为：5g/L柠檬酸铁铵，2g/L CaCl2。微量元素溶液II溶剂为1M HCl，溶质及其浓度分别为：100mg/L ZnSO4·7H2O，30mg/L MnCl2·4H2O，300mg/L H3BO3，200mg/L CoCl2·6H2O，10mg/LCuSO4·5H2O，20mg/L NiCl2·6H2O，30mg/L NaMoO4·2H2O。上述试剂均为国药集团化学试剂公司的产品。补料培养基根据需求配制。3)发酵培养条件：取二级种子液按照10％的接种量接种到上述发酵培养基中，7.5L发酵罐初始装液3L，发酵体系不灭菌直接发酵。控制温度37℃，初始溶氧控制在30-50％，通过调节转速和通气来控制溶氧，起始转速200rpm，最大转速800rpm，最大通风量3vvm，转速和通气达到最大后，不控制溶氧；发酵过程中通过补料控制糖浓度在10-15g/L之间，发酵过程中添加己酸或5-己烯酸以促使3HHx或3HHxE的积累；用5MNaOH控制发酵pH为8.5。发酵期间需要实时监控发酵状况，控制温度、pH、溶氧、残糖等参数在正常范围内。取样分析频率为每2小时取3-5ml小样一次，每4小时取30ml大样一次；小样用于测定葡萄糖和细胞密度以监控发酵过程和补料速度，大样用于后续的PHA含量分析和细胞干重测定。
下述实施例中的冷冻干燥方法具体如下：以葡萄糖作为单一碳源或部分中链底物(包括己烯酸、己酸)作为单一碳源或葡萄糖和其他底物作为共碳源(包括己烯酸、己酸、乙酸、乙酸钠)进行发酵后，取30ml液相体系，14000g离心10min，收集菌体沉淀，用水进行洗涤，然后进行冷冻干燥(将装有菌体沉淀的离心管先置于-80℃中1h，再放入真空冷冻干燥仪中12h)，得到冷冻干燥产物。以部分长链底物(包括油酸、肉豆蔻酸等)作为碳源进行发酵后，取30ml液相体系，14000g离心10min，收集菌体沉淀，用无水乙醇和超纯水进行洗涤，然后进行冷冻干燥(将装有菌体沉淀的离心管先置于-80℃中1h，再放入真空冷冻干燥仪中12h)，得到冷冻干燥产物。
下述实施例中的细胞干重计算方法、菌体PHA含量以及各个单体含量的检测方法具体如下：以每升发酵后体系中的细胞干重计量。细胞干重的单位为g/L。细胞干重(CDW)＝(进行冷冻干燥后的离心管的重量-原空离心管的重量)÷0.03；进行冷冻干燥后的离心管的重量和原空离心管的重量，单位均为g；0.03代表0.03L；
冷冻干燥产物进行酯化反应，然后通过气相色谱法(GC)测定单体含量；
酯化反应：取30-40mg冷冻干燥产物于酯化管中，加入2mL氯仿和2mL酯化液(含1g/L苯甲酸和3％浓硫酸的甲醇溶液)混匀，加盖密闭，100℃金属浴中酯化4h；冷却至室温后，加入1mL蒸馏水，充分振荡混匀，静置分层；待氯仿相与水完全分离后，取氯仿相进行气相色谱分析；
取20-25mg的聚3-羟基丁酸酯(PHB)、聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯P(3HB-co-3HHx)或聚3-羟基丁酸-3-羟基己烯酸酯P(3HB-co-3HHxE)进行酯化反应后作为标准样品；
气相色谱(GC)分析参数：在岛津GC-2014型气相色谱仪中使用HP-5型色谱柱分离被测物质；设定GC分析升温程序，进样口温度(240℃)、检测器温度(250℃)、起始温度与维持时间(80℃，1.5min)、第一阶段升温(升温速率30℃/min)、第二阶段升温(升温速率40℃/min，升至240℃后维持2min)、总程序时间8min；
通过读取气相色谱测得的内标峰面积、标样的PHA单体甲酯峰面积、样品的内标峰面积和样品的PHA单体甲酯峰面积进行相应PHA单体比例的计算。
PHA的含量(wt％)＝(3HB的质量+3HHx的质量+3HHxE的质量)÷冷冻干燥产物的质量×100％；
3HB的含量(mol％)＝3HB的摩尔数÷(3HB的摩尔数+3HHx的摩尔数+3HHxE的摩尔数)×100％；
3HHx的含量、3HHxE的含量的计算方法参见3HB的含量。
下述实施例中的流式细胞仪检测方法具体如下：采用LSRII型流式细胞仪(BD公司，美国)测定sfGFP绿色荧光蛋白的表达强度，其激发波长在450-490nm。通道设定为FITC，利用BD FACSDiva 8.0软件进行检测，并用FlowJo(v7.6)软件进行分析。检测样品的制备过程如下：1)将菌种在相应抗性的固体平板上进行划线，分离得到单菌落；2)挑取单菌落接种到装有20ml液体培养基的小摇瓶中培养过夜；3)吸取200μl种子液接种到含有1ml液体培养基的96孔深孔板内，在37℃恒温深孔板振荡器中以1000rpm培养12h；4)将培养液用1ml磷酸盐缓冲液(PBS)稀释进行流式细胞仪检测。
实施例1、应用重组盐单胞菌可控生产短中链PHA[P(3HB-co-3HHx)]
一、重组盐单胞菌的构建
1、内源phaC基因缺陷型菌株H.bluephagenesis TDCKO3的构建
1)提取盐单胞菌H.bluephagenesis TD01的基因组DNA，以其为模板克隆出长度均为500bp的同源片段phaC-HR-L-3和phaC-HR-R-3，这两个片段分别位于盐单胞菌H.bluephagenesis TD01 phaC基因的上下游。
2)以pQ31(构建用于CRISPR/Cas9敲除gRNA的骨架质粒[Qin,Q.,Ling,C.,Zhao,Y.Q.,Yang,T.,Yin,J.,Guo,Y.Y.,and Chen,G.Q.(2018)CRISPR/Cas9 editing genome ofextremophile Halomonas spp.,Metab.Eng.47,219-229.])为模板，将两个同源片段和pQ31的骨架片段分别进行PCR扩增，用One-spot办法构建出pTDCKO3-donor质粒，基于测序验证正确的pTDCKO3-donor质粒为模板，在H.bluephagenesis TD01内源phaC基因序列上选取20bp的gRNA序列，用引物梯度退火和质粒环状PCR的形式将其构建到pTDCKO3-donor上，得到pTDCKO3-gRNA质粒(图1a)，经测序验证得到正确克隆。
3)将上述pTDCKO3-gRNA质粒接合转化到带有pQ08-Cas9质粒(Qin,Qin,et al."CRISPR/Cas9 editing genome of extremophile Halomonas spp."Metabolicengineering 47(2018):219-229.)(图1b)的TD-MmP1菌株中，涂布于带相应抗性的60-LB平板，筛选出敲除成功的阳性克隆。利用无抗60-LB液体培养基丢弃Cas9质粒，得到敲除后的菌株。经过PCR和测序验证获得内源phaC基因全长敲除的盐单胞菌H.bluephagenesis TD-MmP1，命名为H.bluephagenesis TDCKO3。
pTDCKO3-gRNA质粒的核苷酸序列如序列表中序列1所示。pTDCKO3-gRNA质粒的结构示意图如图1a所示，为环形质粒。序列1中，第1367-1427位核苷酸为sgRNA，第1462-1961位核苷酸为PHA聚合酶基因上游的同源臂phaC-HR-L-3，第1966-2465位核苷酸为PHA聚合酶基因下游的同源臂phaC-HR-R-3，第2707-3522位核苷酸为卡那霉素抗性基因。
pQ08-Cas9质粒的核苷酸序列如序列表中序列2所示。pQ08-Cas9质粒的结构示意图如图1b所示，为环形质粒。序列2中，第19-429位核苷酸为pCas序列，第430-4536位核苷酸为编码Cas9蛋白的基因，第7324-7983位为卡那霉素抗性基因。
2、两种质粒pSA3CJ-Pporin-57和pSA3C-Pporin-57的构建
制备质粒pSA3CJ-Pporin-57，质粒pSA3CJ-Pporin-57的核苷酸序列如序列表中序列3所示。质粒pSA3CJ-Pporin-57的结构示意图如图2a所示，为环形质粒。序列3中，第41-258位核苷酸为Pporin-57启动子序列，第259-293位核苷酸为来源于Cupriavidus necator H16的RBS序列(RCJ0)，第294-2078位核苷酸为phaC4AK4基因，第2075-2479位核苷酸为phaJ4AK4基因，第2485-2579位为Lambda T0终止子，第2730-3389位核苷酸为氯霉素抗性基因。
制备质粒pSA3C-Pporin-57，质粒pSA3C-Pporin-57的核苷酸序列如序列表中序列4所示。质粒pSA3C-Pporin-57的结构示意图如图2b所示，为环形质粒。序列4中，第33-250位核苷酸为Pporin-57启动子序列，第251-285位核苷酸为来源于Cupriavidus necator H16的RBS序列(RCJ0)，第286-2070位核苷酸为phaC4AK4基因，第2350-3009位核苷酸为氯霉素抗性基因。
3、重组菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-57)和重组菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3C-Pporin-57)的构建
1)将上述步骤2获得的两个质粒pSA3CJ-Pporin-57和pSA3C-Pporin-57通过电穿孔转化方式分别导入大肠杆菌电转感受态E.coli S17-1(北京索莱宝科技公司)中，得到两株供体菌，分别命名为E.coli S17-1(pSA3CJ-Pporin-57)和E.coli S17-1(pSA3C-Pporin-57)。
2)将上述步骤1获得的phaC基因缺陷型菌株H.bluephagenesis TDCKO3在60-LB液体培养基中过夜培养，得到受体菌H.bluephagenesis TDCKO3。
3)将供体菌E.coli S17-1(pSA3CJ-Pporin-57)和受体菌H.bluephagenesis TDCKO3通过接合转化的方法，得到重组盐单胞菌，命名为H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-57)。
将E.coli S17-1(pSA3C-Pporin-57)和受体菌H.bluephagenesis TDCKO3通过接合转化的方法，得到重组盐单胞菌，命名为H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3C-Pporin-57)。
二、应用重组盐单胞菌生产短中链PHA[P(3HB-co-3HHx)]
1、分别制备对照菌H.bluephagenesis TD-MmP1、重组盐单胞菌H.bluephagenesisTDCKO3(pSA3CJ-Pporin-57)和重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3C-Pporin-57)的种子液。
2、以油酸为唯一碳源进行摇瓶培养
取2.5mL步骤1得到的重组盐单胞菌和对照菌种子液，接种于含47.5mL摇瓶培养基的500mL摇瓶，37℃、200rpm振荡培养48小时。
摇瓶培养基5OA：含25mg/L氯霉素和5g/L油酸的60-MM培养基。
摇瓶培养结束后，进行细胞干重测定、PHA含量以及单体含量的测定。进行三次重复试验，每次重复试验设置三个重复处理，结果取平均值。
气相色谱结果显示，标样中3HHx单体在GC色谱中的出峰时间为3.2min，利用重组盐单胞菌所生产的P(3HB-co-3HHx)中3HHx单体的出峰位置与之一致。
表1、以油酸为唯一碳源生产P(3HB-co-3HHx)的摇瓶实验结果
菌株Halomonas bluephagenesis TD CDW(g/L) PHA(wt％) 3HHx(mol％)
TD-MmP1 2.45±0.13 9.39±1.74 ND
TDCKO3(pSA3CJ-P<sub>porin</sub>-57) 2.25±0.13 28.66±3.76 10.55±0.88
TDCKO3(pSA3C-P<sub>porin</sub>-57) 2.03±0.31 24.19±2.65 ND
注：ND表示没有检测到相应单体的特征峰(同下)。
结果见表1。未敲除内源phaC的对照菌盐单胞菌TD-MmP1可以积累少量的PHB，而无法聚合形成P(3HB-co-3HHx)，两株重组菌株中重组菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-57)可以得到28.66％含量的P(3HB-co-3HHx)，细胞干重为2.25g/L，3HHx的比例可以达到10.55％，而重组菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3C-Pporin-57)的摇瓶结果中无法检测到3HHx单体的出峰，证明了外源引入的特异性PHA聚合酶PhaC4AK4(由phaC4AK4基因编码)能够成功聚合3HB和3HHx两种单体，而作为PHA合成途径的关键蛋白，烯酯酰辅酶A水合酶PhaJ4AK4(由phaJ4AK4基因编码)则在P(3HB-co-3HHx)的合成中发挥重要作用。说明重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-57)可被用作P(3HB-co-3HHx)的生产菌。
3、以不同浓度的己酸为单一碳源进行摇瓶培养
取2.5mL步骤1得到的重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-57)种子液，接种于含47.5mL摇瓶培养基的500mL摇瓶，37℃、200rpm振荡培养48小时。
摇瓶培养基为以下任一：
摇瓶培养基1HA：含25mg/L氯霉素和1g/L己酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基2HA：含25mg/L氯霉素和2g/L己酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基3HA：含25mg/L氯霉素和3g/L己酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基5HA：含25mg/L氯霉素和5g/L己酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基7HA：含25mg/L氯霉素和7g/L己酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基10HA：含25mg/L氯霉素和10g/L己酸的60-MM培养基；
摇瓶培养结束后，进行细胞干重测定、PHA含量以及单体含量的测定。进行三次重复试验，每次重复试验设置三个重复处理，结果取平均值。
气相色谱结果显示，标样中3HHx单体在GC色谱中的出峰时间为3.2min，利用重组盐单胞菌所生产的P(3HB-co-3HHx)中3HHx单体的出峰位置与之一致。
结果见图4。重组菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-57)可以利用己酸作为单一碳源生产P(3HB-co-3HHx)。可耐受己酸的浓度范围为1-10g/L，细胞干重范围为0.75-2.85g/L，P(3HB-co-3HHx)含量范围为10.83-29.47％，3HHx单体比例范围为25.87-40.93％。说明可以应用重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-57)可控生产P(3HB-co-3HHx)。
4、以葡萄糖和己酸为双碳源进行摇瓶培养
取2.5mL步骤1得到的重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-57)种子液，接种于含47.5mL摇瓶培养基的500mL摇瓶，37℃、200rpm振荡培养48小时。
摇瓶培养基为以下任一：
摇瓶培养基10G：含25mg/L氯霉素和10g/L葡萄糖的60-MM培养基；
摇瓶培养基10G+0.5HA：含25mg/L氯霉素、10g/L葡萄糖和0.5g/L己酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基10G+1HA：含25mg/L氯霉素、10g/L葡萄糖和1g/L己酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基10G+2HA：含25mg/L氯霉素、10g/L葡萄糖和2g/L己酸的60-MM培养基；
摇瓶培养结束后，进行细胞干重测定、PHA含量以及单体含量的测定。进行三次重复试验，每次重复试验设置三个重复处理，结果取平均值。
气相色谱结果显示，标样中3HHx单体在GC色谱中的出峰时间为3.2min，利用重组盐单胞菌所生产的P(3HB-co-3HHx)中3HHx单体的出峰位置与之一致。
结果见图5。重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-57)可以利用葡萄糖和己酸作为双碳源合成P(3HB-co-3HHx)。细胞干重范围为1.35-2.65g/L，P(3HB-co-3HHx)含量范围为10.60-32.53％，3HHx单体比例范围为11.18-23.03mol％。证实可以应用重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-57)可控生产P(3HB-co-3HHx)。
5、以重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-57)进行发酵罐生产
1)对照组(葡萄糖为单一碳源)发酵条件：采用分批补料方式。控制补料速度维持培养基糖浓度在10-15g/L左右，直至发酵结束。
2)实验组(葡萄糖和己酸双碳源)发酵条件：采用分批补料方式。采用与上述对照组相同的底料。当发酵开始8h时开始以5ml/h的速度流加己酸；发酵开始18h后，调整己酸流速为2ml/h，同时添加补料葡萄糖，控制补料速度维持培养基糖浓度在10-15g/L左右，直至发酵结束。
经过48小时连续发酵后将菌液离心、水洗、冰干后得到待测样品，并通过气相色谱检测(条件和方法同上)。结果见表2。重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-57)可以利用己酸和葡萄糖作为双碳源在放大发酵中生产P(3HB-co-3HHx)，发酵终点的3HHx比例为20.6mol％。
表2、重组菌的发酵实验结果
碳源 CDW(g/L) PHA(wt％) 3HHx(mol％)
葡萄糖 36.7 45.9 ND
葡萄糖和己酸 26.4 13.6 20.6
6、NMR证实短中链PHA[P(3HB-co-3HHx)]的合成
将上述发酵生产后的菌体进行冷冻干燥，进行PHA的提取和纯化，进行NMR检测，分析PHA的化学组成和结构。从核磁谱图(图3)结果可以看出，以δ＝5.25-5.36(1H,-CH,5和6)和δ＝2.40-2.70(1H,-CH,7和8)为代表的质子共振是PHA主链骨架上的特征峰，而在δ＝1.40-1.75、δ＝0.75-1.05ppm(5H,-CH2-CH2-CH3,1和3)处两个共振位置代表典型的P(3HB-co-3HHx)中3HHx单体上的氢质子特征峰，证实重组菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-57)中短中链PHA[P(3HB-co-3HHx)]的合成。
实施例2、应用重组盐单胞菌可控生产短中链功能PHA[P(3HB-co-3HHxE)]
1、制备重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-57)的种子液。
2、以葡萄糖和不同浓度己烯酸为双碳源进行发酵
取2.5mL步骤1得到的重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-57)种子液，接种于含47.5mL摇瓶培养基的500mL摇瓶，37℃、200rpm振荡培养48小时。
摇瓶培养基为以下任一：
摇瓶培养基10G+0.25HEA：含25mg/L氯霉素、10g/L葡萄糖和0.25g/L 5-己烯酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基10G+0.5HEA：含25mg/L氯霉素、10g/L葡萄糖和0.5g/L 5-己烯酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基10G+1HEA：含25mg/L氯霉素、10g/L葡萄糖和1g/L 5-己烯酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基10G+2HEA：含25mg/L氯霉素、10g/L葡萄糖和2g/L 5-己烯酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基10G+3HEA：含25mg/L氯霉素、10g/L葡萄糖和3g/L 5-己烯酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基10G+5HEA：含25mg/L氯霉素、10g/L葡萄糖和5g/L 5-己烯酸的60-MM培养基；
摇瓶培养结束后，进行细胞干重测定、PHA含量以及单体含量的测定。进行三次重复试验，每次重复试验设置三个重复处理，结果取平均值。
气相色谱结果显示，标样中3HHxE单体的出峰位置在3.1min，利用重组盐单胞菌所生产的P(3HB-co-3HHxE)中3HHxE单体的出峰位置与之一致。
结果见图7。重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-57)可以利用葡萄糖和不同浓度的己烯酸作为双碳源合成P(3HB-co-3HHxE)。细胞干重范围为1.61-2.76g/L，P(3HB-co-3HHxE)含量范围为17.47-31.41％，3HHxE单体比例范围为4.41-16.89mol％。证实可以应用重组盐单胞菌可控生产P(3HB-co-3HHxE)。
3、NMR证实功能PHAP(3HB-co-3HHxE)的合成
将上述发酵生产后的菌体进行冷冻干燥，进行PHA的提取和纯化，进行NMR检测，分析PHA的化学组成和结构。从核磁谱图(图6)结果可以看出，在δ＝5.03-5.11、δ＝5.60-5.77ppm(3H，-CH＝CH2，a和b)处出现了两个共振位置，代表了不饱和功能PHA中双键的特征峰。证实重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-57)中短中链PHA[P(3HB-co-3HHxE)]的合成。
实施例3、利用经突变的启动子可控生产短中链功能PHA[P(3HB-co-3HHxE)]
1、制备Porin启动子库
在Pporin-57启动子核心区的-10box上游引入3bp的突变或在-10box内引入4bp的突变，得到Porin启动子库。Pporin-57启动子序列的核苷酸序列如序列表中序列3第41-258位核苷酸所示。Porin启动子库由Pporin-203启动子(将Pporin-57第101-104位由agag突变为ccct后得到的启动子)、Pporin-68启动子(将Pporin-57第97-99位由gta突变为gac后得到的启动子)、Pporin-278启动子(将Pporin-57第101-104位由agag突变为taaa后得到的启动子)、Pporin-42启动子(将Pporin-57第97-99位由gta突变为cta后得到的启动子)、Pporin-183启动子(将Pporin-57第101-104位由agag突变为agca后得到的启动子)、Pporin-58启动子(将Pporin-57第97-99位由gta突变为ata后得到的启动子)、Pporin-140启动子(将Pporin-57第101-104位由agag突变为aaga后得到的启动子)、Pporin-141启动子(将Pporin-57第101-104位由agag突变为atac后得到的启动子)和Pporin-3启动子(将Pporin-57启动子第97-99位由gta突变为tga后得到的启动子)组成。
2、表征Porin启动子库
选择报告基因sfgfp表征Porin启动子库，以pSEVA331为骨架，分别构建含有不同突变的Porin启动子和报告基因sfgfp的质粒(pSA3sfGFP-Pporin series)，经测序验证后通过接合转化导入菌株H.bluephagenesis TDCKO3，获得系列重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3sfGFP-Pporin series)，并分别进行96孔深孔板培养，用以测定荧光强度。
结果见图8。经突变的Porin启动子库涵盖从低到高不同的强度梯度，覆盖约101至105的强度范围，满足可控生产要求。
3、制备含经突变的启动子的系列表达质粒(pSA3CJ-Pporin series)。
将质粒pSA3CJ-Pporin-57中的Pporin-57启动子分别替换为Pporin-203启动子、Pporin-68启动子、Pporin-278启动子、Pporin-42启动子、Pporin-183启动子、Pporin-58启动子、Pporin-140启动子、Pporin-141启动子和Pporin-3启动子，制备得到含经突变的启动子的系列表达质粒(pSA3CJ-Pporin series)。
4、将经测序验证后的含经突变的启动子的系列表达质粒(pSA3CJ-Pporin series)分别通过接合转化导入菌株H.bluephagenesis TDCKO3，获得系列重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin series)。
5、制备系列重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin series)的种子液。
6、取2.5mL步骤5得到的重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporinseries)种子液，分别接种于含47.5mL摇瓶培养基的500mL摇瓶，37℃、200rpm振荡培养48小时。摇瓶培养基10G+1HEA：含25mg/L氯霉素、10g/L葡萄糖和1g/L 5-己烯酸的60-MM培养基；
摇瓶培养结束后，进行细胞干重测定、PHA含量以及单体含量的测定。进行三次重复试验，每次重复试验设置三个重复处理，结果取平均值。
结果见图9。结果表明：除了Pporin-203启动子和Pporin-141启动子之外，系列重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin series)均可利用葡萄糖和己烯酸为双碳源实现可控生产短中链功能PHA[P(3HB-co-3HHxE)]。细胞干重范围为1.68-3.24g/L，P(3HB-co-3HHxE)含量范围为9.34-31.26％，3HHxE单体比例范围为5.32-12.17mol％。证实可以应用重组盐单胞菌可控生产P(3HB-co-3HHxE)。
7、取2.5mL步骤5得到的重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporinseries)种子液，分别接种于含47.5mL培养基的500mL摇瓶，37℃、200rpm振荡培养48小时。摇瓶培养基10G+1HEA+5AA：含25mg/L氯霉素、10g/L葡萄糖、1g/L 5-己烯酸和5g/L乙酸的60-MM培养基。
摇瓶培养结束后，进行细胞干重测定、PHA含量以及单体含量的测定。进行三次重复试验，每次重复试验设置三个重复处理，结果取平均值。
结果见图10。结果表明：除了Pporin-203启动子和Pporin-141启动子之外，系列重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin series)均可利用葡萄糖、己烯酸和乙酸为混合碳源实现可控生产短中链功能PHA[P(3HB-co-3HHxE)]。细胞干重范围为2.01-3.84g/L，P(3HB-co-3HHxE)含量范围为12.50-43.03％，3HHxE单体比例范围为2.03-8.76mol％。证实可以应用重组盐单胞菌可控生产P(3HB-co-3HHxE)。
实施例4、利用增强中长链脂肪酸碳源利用能力的相关基因和核糖体结合位点组合可控生产短中链功能PHA[P(3HB-co-3HHxE)]
1、制备含增强中长链脂肪酸碳源利用能力的相关基因和核糖体结合位点组合的系列表达质粒(pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ×RD series)
1)设计核糖体结合位点(RCJ0，RCJ2，RCJ3，RCJ4)，以上述含经突变的启动子的表达质粒(pSA3CJ-Pporin-68)为模板，用Q5 DNA聚合酶进行PCR，获得系列质粒(pSA3CJ-Pporin-68-RCJ)。
系列质粒(pSA3CJ-Pporin-68-RCJ)由pSA3CJ-Pporin-68-RCJ0、pSA3CJ-Pporin-68-RCJ2、pSA3CJ-Pporin-68-RCJ3和pSA3CJ-Pporin-68-RCJ4组成。pSA3CJ-Pporin-68-RCJ2、pSA3CJ-Pporin-68-RCJ3和pSA3CJ-Pporin-68-RCJ4为将pSA3CJ-Pporin-68质粒中的RCJ0分别替换为RCJ2，RCJ3，RCJ4后得到的质粒。RCJ4的核苷酸序列如序列表中序列5第1896-1930位核苷酸所示，RCJ0的核苷酸序列为将RCJ4的核苷酸序列中的ACGAGGA替换为AGAGAGA后得到的序列；RCJ2的核苷酸序列为将RCJ4的核苷酸序列中的ACGAGGA替换为AGGCGCA后得到的序列；RCJ3的核苷酸序列为将RCJ4的核苷酸序列中的ACGAGGA替换为AACACGA后得到的序列。
2)设计核糖体结合位点RD(RD0，RD1，RD2，RD3，RD4，RD5)，以1)中系列质粒(pSA3CJ-Pporin-68-RCJ)为模板，用Q5 DNA聚合酶分别进行PCR，将fadDTD基因及核糖体结合位点RD插入在phaCJ4AK4后，获得含fadDTD基因和核糖体结合位点RD的系列表达质粒(pSA3CJ-Pporin-68-fadDTD-RCJ×RD series)。RD0的核苷酸序列如序列表中序列5第4117-4151位核苷酸所示；RD1的核苷酸序列为将RD0的核苷酸序列中的AGAGAGA替换为AGGTCAA后得到的序列；RD2的核苷酸序列为将RD0的核苷酸序列中的AGAGAGA替换为AAGGACA后得到的序列；RD3的核苷酸序列为将RD0的核苷酸序列中的AGAGAGA替换为AGTAGAA后得到的序列；RD4的核苷酸序列为将RD0的核苷酸序列中的AGAGAGA替换为AAATAAA后得到的序列；RD5的核苷酸序列为将RD0的核苷酸序列中的AGAGAGA替换为ATCATCA后得到的序列。
系列表达质粒(pSA3CJ-Pporin-68-fadDTD-RCJ×RD series)中RCJ0/RCJ2/RCJ3/RCJ4和RD0/RD1/RD2/RD3/RD4/RD5分别正交组合，一共由24种表达质粒组成，每种表达质粒中的RCJ和RD的组合方式具体见表3。
其中pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ4×RD0的质粒序列如序列表中序列5所示。其结构示意图如图11所示，为环形质粒。序列5中，第1678-1895位核苷酸为Pporin-68启动子，第1896-1930位核苷酸为核糖体结合位点RCJ4，第1931-3715位核苷酸为phaC4AK4基因，第3712-4116位核苷酸为phaJ4AK4基因，第4117-4151位核苷酸核糖体结合位点RD0，第4152-5822位核苷酸为fadDTD基因，第5075-5169位为Lambda T0终止子，第6073-6732位核苷酸为氯霉素抗性基因。
2、将经测序验证后的质粒分别通过接合转化导入H.bluephagenesis TDCKO3，获得系列重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ×RD series，具体分别为如下重组盐单胞菌：TDR0、TDR2、TDR3、TDR4、TDR16、TDR17、TDR18、TDR19、TDR20、TDR21、TDR22、TDR23、TDR24、TDR25、TDR26、TDR27、TDR28、TDR29、TDR30、TDR31、TDR32、TDR33、TDR34、TDR35(见表3)，并制备系列重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ×RD series)的种子液。
3、取2.5mL步骤2得到的系列重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ×RD series)种子液，分别接种于含47.5mL摇瓶培养基的500mL摇瓶，37℃、200rpm振荡培养48小时。摇瓶培养基10G+1HEA：含25mg/L氯霉素、10g/L葡萄糖和1g/L5-己烯酸的60-MM培养基。
摇瓶培养结束后，进行细胞干重测定、PHA含量以及单体含量的测定。进行三次重复试验，每次重复试验设置三个重复处理，结果取平均值。
结果见表3。除了TDR2、TDR4、TDR21、TDR22、TDR23、TDR24、TDR25、TDR34之外，系列重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ×RD series)可以利用葡萄糖和己烯酸为双碳源实现可控生产短中链功能PHA[P(3HB-co-3HHxE)]。细胞干重范围为0.89-4.28g/L，P(3HB-co-3HHxE)含量范围为4.38-40.86％，3HHxE单体比例范围为2.26-45.36％。证实可以应用重组盐单胞菌可控生产P(3HB-co-3HHxE)。
4、以重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ4×RD0)进行发酵罐生产。
发酵条件：采用分批补料方式。当发酵开始8h后流加5-己烯酸，分别控制5-己烯酸终浓度为4g/L和10.5g/L；同时添加补料葡萄糖，控制补料速度维持培养基糖浓度在10-15g/L左右，直至发酵结束。
经过48小时连续发酵后将菌液离心、水洗、冰干后得到待测样品，并通过气相色谱检测(条件和方法同上)，结果见表4。重组菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ4×RD0)可以利用葡萄糖和5-己烯酸作为双碳源在放大发酵中生产P(3HB-co-3HHxE)。5-己烯酸的终浓度为4g/L时，发酵终点的3HHxE单体比例为4.29％。以5-己烯酸的终浓度为10.5g/L时，发酵终点的3HHxE单体比例为22.75％。
表3、系列菌株TDR生产P(3HB-co-3HHxE)的摇瓶实验结果
Figure BDA0002378198850000171
Figure BDA0002378198850000181
表4、重组菌的发酵实验结果
碳源 CDW(g/L) PHA(wt％) 3HHxE(mol％)
葡萄糖和4g/L己烯酸 27.62 19.51 4.29
葡萄糖和10.5g/L己烯酸 29.59 16.20 22.75
实施例5、应用重组盐单胞菌可控生产新型短中链功能PHA[P(3HB-co-3HHx-co-3HHxE)]
1、制备重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ4×RD0)的种子液。
2、取2.5mL步骤1得到的重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ4×RD0)种子液，接种于含47.5mL摇瓶培养基的500mL摇瓶，37℃、200rpm振荡培养48小时。
摇瓶培养基为以下任一：
摇瓶培养基0.25HA+1HEA：含25mg/L氯霉素、0.25g/L己酸和1g/L 5-己烯酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基1HA+1HEA：含25mg/L氯霉素、1g/L己酸和1g/L 5-己烯酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基2HA+1HEA：含25mg/L氯霉素、2g/L己酸和1g/L 5-己烯酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基3HA+1HEA：含25mg/L氯霉素、3g/L己酸和1g/L 5-己烯酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基0.25HA+2HEA：含25mg/L氯霉素、0.25g/L己酸和2g/L 5-己烯酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基1HA+2HEA：含25mg/L氯霉素、1g/L己酸和2g/L 5-己烯酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基2HA+2HEA：含25mg/L氯霉素、2g/L己酸和2g/L 5-己烯酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基3HA+2HEA：含25mg/L氯霉素、3g/L己酸和2g/L 5-己烯酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基0.25HA+3HEA：含25mg/L氯霉素、0.25g/L己酸和3g/L 5-己烯酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基1HA+3HEA：含25mg/L氯霉素、1g/L己酸和3g/L 5-己烯酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基2HA+3HEA：含25mg/L氯霉素、2g/L己酸和3g/L 5-己烯酸的60-MM培养基；
摇瓶培养基3HA+3HEA：含25mg/L氯霉素、3g/L己酸和3g/L 5-己烯酸的60-MM培养基；
摇瓶培养结束后，进行细胞干重测定、PHA含量以及单体含量的测定。进行三次重复试验，每次重复试验设置三个重复处理，结果取平均值。
结果见图13。重组盐单胞菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ4×RD0)可以利用葡萄糖和己烯酸为双碳源实现可控生产新型短中链功能PHA[P(3HB-co-3HHx-co-3HHxE)]，细胞干重范围为1.30-3.94g/L，P(3HB-co-3HHx-co-3HHxE)含量范围为13.75-55.17％，3HHx单体比例范围为18.20-28.48mol％，3HHxE单体比例范围为5.02-24.57mol％。证实可以应用重组盐单胞菌可控生产P(3HB-co-3HHx-co-3HHxE)。
3、NMR证实功能PHA三聚物P(3HB-co-3HHx-co-3HHxE)的合成
将上述发酵生产后的菌体进行冷冻干燥，进行PHA的提取和纯化，进行NMR检测，分析PHA的化学组成和结构。从核磁谱图(图12)结果可以看出，位于δ＝5.25-5.36(H,-CH,d、h和j)位置的质子共振是P(3HB-co-3HHx-co-3HHxE)主链骨架上的特征峰，位于δ＝1.40-1.75(2H,-CH2-CH2-CH3,g)共振位置的代表3HHx单体上的氢质子特征峰，位于δ＝5.03-5.11、δ＝5.60-5.77ppm(3H，-CH＝CH2，a和b)共振位置的代表3HHxE单体上的氢质子特征峰。证实重组菌H.bluephagenesis TDCKO3(pSA3CJ-Pporin-fadDTD-RCJ4×RD0)中新型短中链功能PHA三聚物P(3HB-co-3HHx-co-3HHxE)的合成。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。
序列表
<110>清华大学
<120>一种生产短中链聚羟基脂肪酸酯PHA及其功能衍生物的方法
<160>6
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>6225
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>1
ggggccttac ccaccgcctt ggcgggcttc ttcggtccaa aactgaacaa cagatgtgtg 60
accttgcgcc cggtctttcg ctgcgcccac tccacctgta gcgggctgtg ctcgttgatc 120
tgcgtcacgg ctggatcaag cactcgcaac ttgaagtcct tgatcgaggg ataccggcct 180
tccagttgaa accactttcg cagctggtca atttctattt cgcgctggcc gatgctgtcc 240
cattgcatga gcagctcgta aagcctgatc gcgtgggtgc tgtccatctt ggccacgtca 300
gccaaggcgt atttggtgaa ctgtttggtg agttccgtca ggtacggcag catgtctttg 360
gtgaacctga gttctacacg gccctcaccc tcccggtaga tgattgtttg cacccagccg 420
gtaatcatca cactcggtct tttccccttg ccattgggct cttgggttaa ccggacttcc 480
cgccgtttca ggcgcagggc cgcttctttg agctggttgt aggaagattc gatagggaca 540
cccgccatcg tcgctatgtc ctccgccgtc actgaataca tcacttcatc ggtgacaggc 600
tcgctcctct tcacctggct aatacaggcc agaacgatcc gctgttcctg aacactgagg 660
cgatacgcgg cctcgaccag ggcattgctt ttgtaaacca ttgggggtga ggccacgttc 720
gacattcctt gtgtataagg ggacactgta tctgcgtccc acaatacaac aaatccgtcc 780
ctttacaaca acaaatccgt cccttcttaa caacaaatcc gtcccttaat ggcaacaaat 840
ccgtcccttt ttaaactcta gaggccacgg attacgtggc ctgtagacgt cctaaaaggt 900
ttaaaaggga aaaggaagaa aagggtggaa acgcaaaaaa cgcaccacta cgtggccccg 960
ttggggccgc atttgtgccc ctgaaggggc gggggaggcg tctgggcaat ccccgtttta 1020
ccagtcccct atcgccgcct gagagggcgc aggaagcgag taatcagggt atcgaggcgg 1080
attcaccctt ggcgtccaac cagcggcacc agcggcgcct gagaggggcg cgcccagctg 1140
tctagggcgg cggatttgtc ctactcagga gagcgttcac cgacaaacaa cagataaaac 1200
gaaaggccca gtctttcgac tgagcctttc gttttatttg atgcctttaa ttaaagcgga 1260
taacaatttc acacaggagg ccgcctaagc cgcgcgaatt cgagctcggt attgacagct 1320
agctcagtcc taggtataat actagtgata acattgccgt caccccgttt tagagctaga 1380
aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt 1440
gctttttttg aacccgggat gcaagataaa atgatggacg cctttagtac ccaaactcgc 1500
caaatgtttg agccaatgcg taaaatgaac tcgctaatgc tcaacaacat ggaaaaaatg 1560
actcagtatc agctggaagc gatgaaacgc tacagccaga tgggcactga gcgcatccgc 1620
agcgcgacag aaattaatga tgcagaaagc ctgcgtgatt ttagcaccaa acaagccgaa 1680
atgatgaacg agctttctca gcagatgcag gaagatgctc gcgtcatggg tgagatgagt 1740
ttgcagttca aatccgaaat ggaaaagctg ttcagcgaag ctggtcagaa gatgggcgag 1800
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aaaagctaaa cgcaactatg ttcgcggcgc cttgaaggcg ccgcgttctt ttggatgatg 1920
tgcctgggca gataatgcca agcaggtgag ggagagtgag taaggtaacc atctaatgat 1980
cagcgagtca tgctgggatg gttaaacaag ctgttaatta gtctatttct ccaatagtgg 2040
cgcggctaaa cttggactaa ggccgcgcag tttgacgcta aaactactaa ccgagacgct 2100
actcatgcag ccaactgcac gcttttcatt gtcgccggct cttcctgaga cccacactca 2160
acacagccat ggagcttgct gttgtggttc accattgctg cagcgtttcc atgaacgtgt 2220
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cgcaggattg catgtgcctt ttgctgttgg gcagcagcca aaatcccacg atgggccgct 2340
actattaacc aatttaaagc tttttgatgg aagcggtggc ccgctgcgtg atggcgtatc 2400
aatcagggtg gtggacggcc gtattgatgc gattctagac ggcagtggtg aagtggaagg 2460
tattgagccg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgactagtc ttggactcct gttgatagat 2520
ccagtaatga cctcagaact ccatctggat ttgttcagaa cgctcggttg ccgccgggcg 2580
ttttttattg gtgagaatcc agacgttgtg tctcaaaatc tctgatgtta cattgcacaa 2640
gataaaaata tatcatcatg aacaataaaa ctgtctgctt acataaacag taatacaagg 2700
ggtgttatga gccatattca acgggaaacg tcttgctcga ggccgcgatt aaattccaac 2760
atggatgctg atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg 2820
acaatctatc gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa 2880
ggtagcgttg ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac taaactggct gacggaattt 2940
atgcctcttc cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc 3000
actgcgatcc ccgggaaaac agcattccag gtattagaag aatatcctga ttcaggtgaa 3060
aatattgttg atgcgctggc agtgttcctg cgccggttgc attcgattcc tgtttgtaat 3120
tgtcctttta acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg cgcaatcacg aatgaataac 3180
ggtttggttg atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc 3240
tggaaagaaa tgcataagct tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat 3300
ttctcacttg ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga 3360
cgagtcggaa tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag 3420
ttttctcctt cattacagaa acggcttttt caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg 3480
aataaattgc agtttcattt gatgctcgat gagtttttct aatcagaatt ggttaattgg 3540
ttgtaacact ggcagagcat tacgctgact tgacgggacg gcggctttgt tgaataaatc 3600
gaacttttgc tgagttgaag gatcagatca cgcatcttcc cgacaacgca gaccgttccg 3660
tggcaaagca aaagttcaaa atcaccaact ggtccaccta caacaaagct ctcatcaacc 3720
gtggctccct cactttctgg ctggatgatg gggcgattca ggcctggtat gagtcagcaa 3780
caccttcttc acgaggcaga cctcagcgct attctgacct tgccatcacg actgtgctgg 3840
tcattaaacg cgtattcagg ctgaccctgc gcgctgcgca gggctttatt gattccattt 3900
ttacactgat gaatgttccg ttgcgctgcc cggattacag ccggatcctc tagagtcgac 3960
ctgcaggcat gctgatcggc acgtaagagg ttccaacttt caccataatg aaataagatc 4020
actaccgggc gtattttttg agttatcgag attttcagga gctaaggaag ctaaaatgcg 4080
ctcacgcaac tggtccagaa ccttgaccga acgcagcggt ggtaacggcg cagtggcggt 4140
tttcatggct tgttatgact gtttttttgg ggtacagtct atgcctcggg catccaagca 4200
gcaagcgcgt tacgccgtgg gtcgatgttt gatgttatgg agcagcaacg atgttacgca 4260
gcagggcagt cgccctaaaa caaagttaaa catcatgagg gaagcggtga tcgccgaagt 4320
atcgactcaa ctatcagagg tagttggcgt catcgagcgc catctcgaac cgacgttgct 4380
ggccgtacat ttgtacggct ccgcagtgga tggcggcctg aagccacaca gtgatattga 4440
tttgctggtt acggtgaccg taaggcttga tgaaacaacg cggcgagctt tgatcaacga 4500
ccttttggaa acttcggctt cccctggaga gagcgagatt ctccgcgctg tagaagtcac 4560
cattgttgtg cacgacgaca tcattccgtg gcgttatcca gctaagcgcg aactgcaatt 4620
tggagaatgg cagcgcaatg acattcttgc aggtatcttc gagccagcca cgatcgacat 4680
tgatctggct atcttgctga caaaagcaag agaacatagc gttgccttgg taggtccagc 4740
ggcggaggaa ctctttgatc cggttcctga acaggatcta tttgaggcgc taaatgaaac 4800
cttaacgcta tggaactcgc cgcccgactg ggctggcgat gagcgaaatg tagtgcttac 4860
gttgtcccgc atttggtaca gcgcagtaac cggcaaaatc gcgccgaagg atgtcgctgc 4920
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ggcttatctt ggacaagaag aagatcgctt ggcctcgcgc gcagatcagt tggaagaatt 5040
tgtccactac gtgaaaggcg agatcaccaa ggtagtcggc aaataaacta gtaaataata 5100
aaaaagccgg attaataatc tggcttttta tattctctgc ataaccctgc ttcggggtca 5160
ttatagcgat tttttcggta tatccatcct ttttcgcacg atatacagga ttttgccaaa 5220
gggttcgtgt agactttcct tggtgtatcc aacggcgtca gccgggcagg ataggtgaag 5280
taggcccacc cgcgagcggg tgttccttct tcactgtccc ttattcgcac ctggcggtgc 5340
tcaacgggaa tcctgctctg cgaggctggc cgtaggccgg ccgataatct catgaccaaa 5400
atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 5460
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ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 5580
ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac 5640
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gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 5760
gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 5820
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ttcgcgatct cagcatctga aatcttcccg gccttgcgct tcgct 6225
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<211>8411
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>2
acgtggcttt ccctgcaggg tttgcagtca gagtagaata gaagtatcaa aaaaagcacc 60
gactcggtgc cactttttca agttgataac ggactagcct tattttaact tgctatgctg 120
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gagcatcctg ttgaaaatac tcaattgcaa aatgaaaagc tctatctcta ttatctccaa 2880
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acgcgttctg ataaaaatcg tggtaaatcg gataacgttc caagtgaaga agtagtcaaa 3060
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cgcatgaata ctaaatacga tgaaaatgat aaacttattc gagaggttaa agtgattacc 3300
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aaatccgtta aagagttact agggatcaca attatggaaa gaagttcctt tgaaaaaaat 3960
ccgattgact ttttagaagc taaaggatat aaggaagtta aaaaagactt aatcattaaa 4020
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gcagatcaag gaaatgcagc tttccttgtt cgatattgcg ccgtggccgg acacgatgcg 6300
agcgatgcca aacgacacgg cccgctctgc cctgttcacc acgcgcaaca agaaaatccc 6360
gcgcgaggcg ctgcaaaaca aggtcatttt ccacgtcaac aaggacgtga agatcaccta 6420
caccggcgtc gagctgcggg ccgacgatga cgaactggtg tggcagcagg tgttggagta 6480
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ggctgggtag ccggtgggca atccctgtgg tcaagctcgt gggcaggcgc agcctgtcca 1380
tcagcttgtc cagcagggtt gtccacgggc cgagcgaagc gagccagccg gtggccgctc 1440
gcggccatcg tccacatatc cacgggctgg caagggagcg cagcgaccgc gcagggcgaa 1500
gcccggagag caagcccgta gggggggcgc gcccagctgt ctagggcggc ggatttgtcc 1560
tactcaggag agcgttcacc gacaaacaac agataaaacg aaaggcccag tctttcgact 1620
gagcctttcg ttttatttga tgcctttaat taaagcggat aacaatttca cacaggacgg 1680
ccgctgagac ctgccagttg cccatgggtt ccttaaaaaa atgcaaatcg taaaaaaaca 1740
ctgttttttt ctattgcgtt cactggaatc ccagactaga gtttgacctg cgagcattgg 1800
actataacaa ggcttagttg aggacatgcc gcataccacc gggaaaaacc ggaggatggc 1860
ataaagagca tggcccgcaa gccagctgca gacttggttc gaatagtgac ggcacgagga 1920
caatcaaatc atgagccaac catcttatgg cccgctgttc gaggccctgg cccactacaa 1980
tgacaagctg ctggccatgg ccaaggccca gacagagcgc accgcccagg cgctgctgca 2040
gaccaatctg gacgatctgg gccaggtgct ggagcagggc agccagcagc cctggcagct 2100
gatccaggcc cagatgaact ggtggcagga tcagctcaag ctgatgcagc acaccctgct 2160
gaaaagcgca ggccagcaga gcgagccggt gatcaccccg gagcgcagcg atcgccgctt 2220
caaggccgag gcctggagcg aacaacccat ctatgactac ctcaagcagt cctacctgct 2280
caccgccagg cacctgctgg cctcggtgga tgccctggac ggcgtccccc agaagagccg 2340
ggagcggctg cgtttcttca cccgtcagta cgtcaacgcc atggcaccca gcaacttcct 2400
ggccaccaac ccggagctgc tcaagctcac cctggagtcc gacggccaga acctggtgcg 2460
cgggctggcc ctcttggccg aggatctgga gcgcagcgcc gatcagctca acatccgcct 2520
gaccgacgaa tccgccttcg agctcggccg ggatctggcg accaccccgg gccgggtggt 2580
gcagcgcacc gagctctatg agctgatcca gtacagcccc accacggaaa ccgtgggcaa 2640
gacgcctgtg ctgatcgtgc cccccttcat caacaagtac tacatcatgg acatgcggcc 2700
ccagaactcc ctggtcgcct ggctggtcgc ccagggccag acggtgttca tgatctcctg 2760
gcgcaacccg agcgtagccc aggcccaaat cgatctcgac gactacgtgg tggatggcgt 2820
catcgccgcc ctggacggcg tggaagcggc caccggcgag cgggaggtgc acggcatcgg 2880
ctactgcatc ggcggcaccg ccctgtcgct cgccatgggc tggctggcgg cgcggcgcca 2940
gaagcagcgg gtgcgcactg ccaccctgtt caccaccctg ctggacttct cccagccagg 3000
ggagcttggc atcttcattc acgagcccat catagcggcg ctcgaggcgc aaaatgaggc 3060
caagggcatc atggacgggc gccagctggc tgtctctttc agcctgctgc gggagaacag 3120
cctctactgg aactactaca tcgacagcta cctcaagggt cagagcccgg tggccttcga 3180
tctgctgcac tggaacagcg acagcaccaa tgtggcgggc aagacccaca acagcctgct 3240
gcgccgtctc tatctggaga accagctggt gaagggggag ctcaagatcc gcaacacccg 3300
catcgatctt ggcaaggtga agacccctgt gctgctggtg tcggcggtgg acgatcacat 3360
cgccctctgg cagggcacct ggcagggcat gaagctgttt ggcggggagc agcgcttcct 3420
cctggcagag tccggccaca tcgccggcat catcaacccg ccggtcgcca acaagtacgg 3480
cttctggcac aacggggccg aggccgatag cccggagagc tggctggcag gggcgacgca 3540
tcagagcggc tcctggtggc ccgagatgat gggctttatc cagagccgtg acgaagggtc 3600
agagcccgtc cccgcacggg tgcccgagga ggggctggcc cccgcccccg gccactatgt 3660
caaggtgcgg ctcaaccccg tgtttgccag cgccacagag gaggacgccg catgagcgca 3720
caaccccttg aagtgggcca gaaggcccgt ctcagcaagc ggttcggggc ggcagaggtg 3780
gccgccttcg ccgcgctctc ggaggatttc aaccctctgc accttgatcc ggccttcgcc 3840
gccaccacgg cgttcgagcg acccatcgtc cacggcatgc tgctggccag cctcttctcc 3900
gggctgctgg gccagcagtt gccgggcaag gggagcatct atctgggcca gagcctcagc 3960
ttcaagctgc cggtctttgt cggggatgag gtgacggccg aggtggaggt gaccgccctt 4020
cgcagcgaca agcccatcgc caccctgacc acccgcatct tcacttcaaa cggcgccctc 4080
gccgtgacgg gggaagccgt ggtcaagctg ccttgaggtt cgaatagtga cggcagagag 4140
acaatcaaat catgagcgaa cacgccaatg cccacgtact acgtggccca gcgcttgaag 4200
gcttggatca gtacaactca gtcacggatg tctttcattc agcggttaaa cgttttgcca 4260
gcaaacctgc atttagctgc atgggcaaaa ccctaacatt tgccgacctt gatcgtctgt 4320
ctgccaattt tgcagcctgg ttgcagcatg aaactgactt ggttcccggt gaccgaatcg 4380
ccattcagtt gcctaacgtg ctgcagtttc ctgttgcggt gtttggtgca ctaagggctg 4440
gcttagtcgt cgtcaatacc aacccgctat acaccgagcg ggagatggcg caccagttta 4500
aggactccaa tgccaaagcc attgttattt tggccaatat ggctgacaaa cttgagaaag 4560
tgttggataa aacggatatc caacacgtct tggttaccca gcttgctgac ctacacgatg 4620
tgccaaagcg ttggctaatt aacgccgttg ttaagcacgt taaaaagatg gtgcctgcct 4680
actcgttacc aaacgctgtt ggcttccgcg atgcactgaa aaaaggtgcg tcgttaaatc 4740
ataccgaggt gcaacgcacc atggatgatg tggctggact gcaatacacg ggtggcacca 4800
caggtatgcc taaaggcgcg atgctgactc accagaacct agtggccaat atgctccagg 4860
cgcgtgccgc tatcggtgag catttgactg atggcgaaga gttagtagtc gcgccattgc 4920
cggtctatca catctatacg tttaccgtta actgtttgtt cctaatggaa acaggcaacc 4980
actcgctact gattaccaat cctcgcgact tacctagctt tgtcaaagag cttaaaggct 5040
tgccgtttac cgggtttatt ggtctgaata cgctgtttaa cgcgctgtgt aaccgagatg 5100
actttaagca actcgatttt tcgaagctga agctgactat ttcgggcggt atggcgctaa 5160
ccaaagcggc tgctaaacgt tggggagaaa cgacaggttg cccgattgca gagggctacg 5220
ggctgacgga aacatcaccc attgttagct ttaaccccac taacgctata cagcttggca 5280
ccattggtaa accggtggca ggtaccgctg tgaaagtgat agatgcagac ggtaatgatg 5340
ttgcgatggg ggagcctggt gaactttgcg tgcaagggcc tcaggtgatg aaggggtact 5400
ggcagcggga agatgaaaca cgcaattcca ttgatgaaaa tggctggttc cacacgggtg 5460
acatcgccat attgcaggac gatggctaca tcaaaatcgt tgatcgaaaa aaagatatga 5520
ttttagtatc tggctttaat gtctatccaa atgaaataga agatgtggtg gcagcgcatc 5580
cagatgtgtt ggagtcggcg gctgttggcg tgccggatga agatgctggt gaagcgatca 5640
agctattcgt tgtttccaaa aacagcgagt tagatgctga gacgctgcgc aagtggtgca 5700
aaaaagagct aaccggctat aaggttccga agtacgtaga gttccgtgat gagcttccca 5760
aaaccaacgt tggcaaggtg ctacgccggc agctccgcga tcaggaaaca agcaacgctt 5820
aatcttggac tcctgttgat agatccagta atgacctcag aactccatct ggatttgttc 5880
agaacgctcg gttgccgccg ggcgtttttt attggtgaga atccaggggt ccccaataat 5940
tacgatttaa attggcgaaa atgagacgtt gatcggcacg taagaggttc caactttcac 6000
cataatgaaa taagatcact accgggcgta ttttttgagt tatcgagatt ttcaggagct 6060
aaggaagcta aaatggagaa aaaaatcact ggatatacca ccgttgatat atcccaatgg 6120
catcgtaaag aacattttga ggcatttcag tcagttgctc aatgtaccta taaccagacc 6180
gttcagctgg atattacggc ctttttaaag accgtaaaga aaaataagca caagttttat 6240
ccggccttta ttcacattct tgcccgcctg atgaatgctc atccggaatt tcgtatggca 6300
atgaaagacg gtgagctggt gatatgggat agtgttcacc cttgttacac cgttttccat 6360
gagcaaactg aaacgttttc atcgctctgg agtgaatacc acgacgattt ccggcagttt 6420
ctacacatat attcgcaaga tgtggcgtgt tacggtgaaa acctggccta tttccctaaa 6480
gggtttattg agaatatgtt tttcgtctca gccaatccct gggtgagttt caccagtttt 6540
gatttaaacg tggccaatat ggacaacttc ttcgcccccg ttttcaccat gggcaaatat 6600
tatacgcaag gcgacaaggt gctgatgccg ctggcgattc aggttcatca tgccgtttgt 6660
gatggcttcc atgtcggcag aatgcttaat gaattacaac agtactgcga tgagtggcag 6720
ggcggggcgt aatttgactt ttgtcctttt ccgctgcata accctgcttc ggggtcatta 6780
tagcgatttt ttcggtatat ccatcctttt tcgcacgata tacaggattt tgccaaaggg 6840
ttcgtgtaga ctttccttgg tgtatccaac ggcgtcagcc gggcaggata ggtgaagtag 6900
gcccacccgc gagcgggtgt tccttcttca ctgtccctta ttcgcacctg gcggtgctca 6960
acgggaatcc tgctctgcga ggctggccgt aggccg 6996
<210>6
<211>556
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<400>6
Met Ser Glu His Ala Asn Ala His Val Leu Arg Gly Pro Ala Leu Glu
1 5 10 15
Gly Leu Asp Gln Tyr Asn Ser Val Thr Asp Val Phe His Ser Ala Val
20 25 30
Lys Arg Phe Ala Ser Lys Pro Ala Phe Ser Cys Met Gly Lys Thr Leu
35 40 45
Thr Phe Ala Asp Leu Asp Arg Leu Ser Ala Asn Phe Ala Ala Trp Leu
50 55 60
Gln His Glu Thr Asp Leu Val Pro Gly Asp Arg Ile Ala Ile Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Val Leu Gln Phe Pro Val Ala Val Phe Gly Ala Leu Arg Ala
85 90 95
Gly Leu Val Val Val Asn Thr Asn Pro Leu Tyr Thr Glu Arg Glu Met
100 105 110
Ala His Gln Phe Lys Asp Ser Asn Ala Lys Ala Ile Val Ile Leu Ala
115 120 125
Asn Met Ala Asp Lys Leu Glu Lys Val Leu Asp Lys Thr Asp Ile Gln
130 135 140
His Val Leu Val Thr Gln Leu Ala Asp Leu His Asp Val Pro Lys Arg
145 150 155 160
Trp Leu Ile Asn Ala Val Val Lys His Val Lys Lys Met Val Pro Ala
165 170 175
Tyr Ser Leu Pro Asn Ala Val Gly Phe Arg Asp Ala Leu Lys Lys Gly
180 185 190
Ala Ser Leu Asn His Thr Glu Val Gln Arg Thr Met Asp Asp Val Ala
195 200 205
Gly Leu Gln Tyr Thr Gly Gly Thr Thr Gly Met Pro Lys Gly Ala Met
210 215 220
Leu Thr His Gln Asn Leu Val Ala Asn Met Leu Gln Ala Arg Ala Ala
225 230 235 240
Ile Gly Glu His Leu Thr Asp Gly Glu Glu Leu Val Val Ala Pro Leu
245 250 255
Pro Val Tyr His Ile Tyr Thr Phe Thr Val Asn Cys Leu Phe Leu Met
260 265 270
Glu Thr Gly Asn His Ser Leu Leu Ile Thr Asn Pro Arg Asp Leu Pro
275 280 285
Ser Phe Val Lys Glu Leu Lys Gly Leu Pro Phe Thr Gly Phe Ile Gly
290 295 300
Leu Asn Thr Leu Phe Asn Ala Leu Cys Asn Arg Asp Asp Phe Lys Gln
305 310 315 320
Leu Asp Phe Ser Lys Leu Lys Leu Thr Ile Ser Gly Gly Met Ala Leu
325 330 335
Thr Lys Ala Ala Ala Lys Arg Trp Gly Glu Thr Thr Gly Cys Pro Ile
340 345 350
Ala Glu Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Ser Pro Ile Val Ser Phe Asn
355 360 365
Pro Thr Asn Ala Ile Gln Leu Gly Thr Ile Gly Lys Pro Val Ala Gly
370 375 380
Thr Ala Val Lys Val Ile Asp Ala Asp Gly Asn Asp Val Ala Met Gly
385 390 395 400
Glu Pro Gly Glu Leu Cys Val Gln Gly Pro Gln Val Met Lys Gly Tyr
405 410 415
Trp Gln Arg Glu Asp Glu Thr Arg Asn Ser Ile Asp Glu Asn Gly Trp
420 425 430
Phe His Thr Gly Asp Ile Ala Ile Leu Gln Asp Asp Gly Tyr Ile Lys
435 440 445
Ile Val Asp Arg Lys Lys Asp Met Ile Leu Val Ser Gly Phe Asn Val
450 455 460
Tyr Pro Asn Glu Ile Glu Asp Val Val Ala Ala His Pro Asp Val Leu
465 470 475 480
Glu Ser Ala Ala Val Gly Val Pro Asp Glu Asp Ala Gly Glu Ala Ile
485 490 495
Lys Leu Phe Val Val Ser Lys Asn Ser Glu Leu Asp Ala Glu Thr Leu
500 505 510
Arg Lys Trp Cys Lys Lys Glu Leu Thr Gly Tyr Lys Val Pro Lys Tyr
515 520 525
Val Glu Phe Arg Asp Glu Leu Pro Lys Thr Asn Val Gly Lys Val Leu
530 535 540
Arg Arg Gln Leu Arg Asp Gln Glu Thr Ser Asn Ala
545 550 555

Claims (10)

1.一种生产短中链聚羟基脂肪酸酯PHA或其功能衍生物的重组菌的构建方法，为如下1)或2)：
所述1)包括如下步骤：将核糖体结合位点RCJ、特异性PHA聚合酶的编码基因和PHA合成途径的关键蛋白的编码基因导入敲除内源PHA聚合酶基因的出发菌中；
所述2)包括如下步骤：将核糖体结合位点RCJ、核糖体结合位点RD、特异性PHA聚合酶的编码基因、PHA合成途径的关键蛋白的编码基因和增强中长链脂肪酸碳源利用能力的相关蛋白的编码基因导入敲除内源PHA聚合酶基因的出发菌中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述特异性PHA聚合酶为特异性PHA聚合酶PhaC4AK4；所述特异性PHA聚合酶PhaC4AK4为A1)或A2)：
A1)由GenBank号为AHE49699.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
A2)将GenBank号为AHE49699.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失/或添加且具有PHA聚合酶活性的蛋白质；
或，所述特异性PHA聚合酶PhaC4AK4的编码序列为a1)或a2)或a3)：
a1)序列表中序列3第294-2078位所示的cDNA分子或DNA分子；
a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述特异性PHA聚合酶PhaC4AK4的cDNA分子或DNA分子；
a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述特异性PHA聚合酶PhaC4AK4的cDNA分子或DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述PHA合成途径的关键蛋白为烯酯酰辅酶A水合酶PhaJ4AK4；所述烯酯酰辅酶A水合酶PhaJ4AK4为B1)或B2)：
B1)由GenBank号为AHE49700.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
B2)将GenBank号为AHE49700.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与PHA合成途径相关的蛋白质；
或，所述烯酯酰辅酶A水合酶PhaJ4AK4的编码序列为b1)或b2)或b3)：
b1)序列表中序列3第2075-2479位所示的cDNA分子或DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述烯酯酰辅酶A水合酶PhaJ4AK4的cDNA分子或DNA分子；
b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述烯酯酰辅酶A水合酶PhaJ4AK4的cDNA分子或DNA分子。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述增强中长链脂肪酸碳源利用能力的相关蛋白为酰基辅酶A合成酶FadDTD；所述酰基辅酶A合成酶FadDTD为C1)或C2)：
C1)氨基酸序列是序列6所示的蛋白质；
C2)将序列表中序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与增强中长链脂肪酸碳源利用能力相关的蛋白质；
或，所述酰基辅酶A合成酶FadDTD的编码序列为c1)或c2)或c3)：
c1)序列表中序列5第4152-5822所示的cDNA分子或DNA分子；
c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述酰基辅酶A合成酶FadDTD的cDNA分子或DNA分子；
c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述酰基辅酶A合成酶FadDTD的cDNA分子或DNA分子。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述1)中，所述核糖体结合位点RCJ、所述特异性PHA聚合酶的编码基因和所述PHA合成途径的关键蛋白的编码基因通过重组质粒甲导入敲除内源PHA聚合酶基因的出发菌中；所述重组质粒甲包括依次由启动子、所述核糖体结合位点RCJ序列、所述特异性PHA聚合酶的编码基因、所述PHA合成途径的关键蛋白的编码基因和终止子组成的表达盒；
或，所述2)中，所述核糖体结合位点RCJ、所述核糖体结合位点RD、所述特异性PHA聚合酶的编码基因、所述PHA合成途径的关键蛋白的编码基因和所述增强中长链脂肪酸碳源利用能力的相关蛋白的编码基因通过重组质粒乙导入敲除内源PHA聚合酶基因的出发菌中；所述重组质粒乙包括依次由启动子、所述核糖体结合位点RCJ、所述特异性PHA聚合酶的编码基因、所述PHA合成途径的关键蛋白的编码基因、所述核糖体结合位点RD、所述增强中长链脂肪酸碳源利用能力的相关蛋白的编码基因和终止子组成的表达盒。
6.根据权利要求1-5所述的方法，其特征在于：所述启动子为Pporin-57启动子或将所述Pporin-57启动子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的启动子；
或，所述核糖体结合位点RCJ为核糖体结合位点RCJ0、核糖体结合位点RCJ2、核糖体结合位点RCJ3或核糖体结合位点RCJ4；
或，所述核糖体结合位点RD为核糖体结合位点RD0、核糖体结合位点RD1、核糖体结合位点RD2、核糖体结合位点RD3、核糖体结合位点RD4或核糖体结合位点RD5。
7.根据权利要1-6任一所述的方法，其特征在于：所述出发菌为嗜盐单胞菌。
8.按照权利要求1-7任一所述方法构建得到的重组菌；
或，按照权利要求1-7任一所述方法构建得到的重组菌在制备短中链聚羟基脂肪酸酯PHA或其功能衍生物中的应用；
或，按照权利要求1-7任一所述方法构建得到的重组菌在制备单体比例可控的短中链聚羟基脂肪酸酯PHA或其功能衍生物中的应用。
9.一种短中链聚羟基脂肪酸酯PHA或其功能衍生物的制备方法，包括如下步骤：以物质A和/或物质B为碳源，发酵培养权利要求8所述的重组菌，得到短中链聚羟基脂肪酸酯PHA或其功能衍生物；所述物质A可用于生产短链聚羟基脂肪酸酯PHA；所述物质B可用于生产中链聚羟基脂肪酸酯PHA。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：
所述物质A为如下物质中的至少一种：葡萄糖、乙酸、戊酸；
或，所述物质B为如下物质中的至少一种：油酸、己酸、5-己烯酸、肉豆蔻酸；
或，采用油酸作为物质B，所述油酸浓度为1-10g/L；
或，采用己酸作为物质B，所述己酸浓度为1-10g/L；
或，采用葡萄糖作为物质A，采用己酸作为物质B，所述葡萄糖浓度为10-30g/L；所述己酸浓度为0.25-5g/L；
或，采用葡萄糖作为物质A，采用5-己烯酸作为物质B，所述葡萄糖浓度为10-30g/L；所述5-己烯酸浓度为0.25-5g/L；
或，采用葡萄糖和乙酸作为物质A，采用5-己烯酸作为物质B，所述葡萄糖浓度为10-30g/L；所述乙酸浓度为1-7g/L；所述5-己烯酸浓度为0.25-5g/L；
或，采用己酸和5-己烯酸作为物质B，所述己酸浓度为0.25-3g/L，所述5-己烯酸浓度为0.25-3g/L；
或，所述短中链聚羟基脂肪酸酯PHA或其功能衍生物为聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯[P(3HB-co-3HHx)]、聚3-羟基丁酸-3-羟基己烯酸酯[P(3HB-co-3HHxE)或聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸-3-羟基己烯酸酯[P(3HB-co-3HHx-co-3HHxE)]。
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