JP5431149B2 - 再生可能資源からの発酵によるグリコール酸生産 - Google Patents
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Description
− 遺伝子への変異の導入、該遺伝子の発現レベルまたはコードされたタンパク質の活性レベルを減少させること、
− その遺伝子の本来のプロモーターの低い強度のプロモータへの置換、その結果の低い発現、
− 対応するメッセンジャーRNAまたはタンパク質を不安定化する要素の使用
− 発現しないことが必要であれば、遺伝子の欠失、
である。
i) イソクエン酸脱水素酵素(Icd)の活性を減少させること、
ii)遺伝子の減衰によって、次の酵素の少なくともひとつの活性を減少させること
−pta遺伝子にコードされるホスホトランスアセチラーゼ
−ack遺伝子にコードされる酢酸キナーゼ
−poxB遺伝子にコードされるピルビン酸酸化酵素
iii) aceA遺伝子にコードされるイソクエン酸リアーゼの活性を増加させること、
によって増加され得る。
グリコレートに還元することを除いて、グリオキシレートを代謝することができない株の構築:MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcB
aceB遺伝子を欠失させるために、Datsenko & Wanner(2000)に記載の相同的組み換え方法を用いる。この方法によって、関連する遺伝子のほとんどを欠失させる一方、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットの挿入が可能となる。この目的の為、次のオリゴヌクレオチドを用いる:
DaceBF (配列番号1)
ggcaacaacaaccgatgaactggctttcacaaggccgtatggcgagcaggagaagcaaattcttactgccgaagcggtagCATATGAATATCCTCCTTAG
−遺伝子aceB(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列)の配列(4213068〜4213147)に相同な領域(小文字)
−クロラムフェニコール耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域(大文字)
DaceBR (配列番号2)
ggcggtagcctggcagggtcaggaaatcaattaactcatcggaagtggtgatctgttccatcaagcgtgcggcatcgtcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
−遺伝子aceB(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列)の配列(4214647〜4214569)に相同な領域(小文字)
−クロラムフェニコール耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域(大文字)
オリゴヌクレオチドDaceBFおよびDaceBRを、プラスミドpKD3からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅する為に用いる。次いで、得られたPCR産物を電気穿孔法により、MG1655株 (pKD46)に導入する。該菌株では発現したRedリコンビナーゼ酵素が相同性組み換えを可能にする。その後、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下に定義されたオリゴヌクレオチドaceBFおよびaceBRを用いたPCR分析によって検証する。保持した株を、MG1655 ΔaceB::Cmと呼ぶ。
aceBF (配列番号3) : cgttaagcgattcagcaccttacc(4212807〜4212830の配列に相同)
aceBR (配列番号4) : ccagtttctgaatagcttcc(4215327〜4215308の配列に相同)
DgclF (配列番号5)
ggcaaaaatgagagccgttgacgcggcaatgtatgtgctggagaaagaaggtatcactaccgccttcggtgttccgggagcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
−遺伝子gcl(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列)の領域の配列(533142〜533224)に相同な領域(小文字)
−カナマイシン耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域(大文字)
DgipR (配列番号6)
gcgttacgttttaacggtacggatccatccagcgtaaaccggcttccgtggtggtttggggtttatattcacacccaacccCATATGAATATCCTCCTTAG
−遺伝子gcl(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列)の領域の配列(535720〜535640)に相同な領域(小文字)
−カナマイシン耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域(大文字)
オリゴヌクレオチドDgclFおよびDgipRをプラスミドpKD4からカナマイシン耐性カセットを増幅する為に用いる。次いで、得られたPCR産物を電気穿孔法により、MG1655株 (pKD46)に導入する。その後、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下に定義されたオリゴヌクレオチドgclFおよびgipRを用いたPCR分析によって検証する。保持された株を、MG1655 Δgcl::Kmと呼ぶ。
gclF (配列番号7) : ggatatgcccaccttgctgaagg(532795〜532817の配列に相同)
gipR (配列番号8) : cgcttagtttcaatcggggaaatgg(536114〜536090の配列に相同)
ファージ溶解物P1の調製:
− Km50μg/ml、0.2%グルコース、5mM塩化カルシウム入りの10mlのLB培地中で一晩培養のMG1655Δgcl::Km株の100μlを接種
− 37°Cで30分間振盪しながら培養
− 100μlのMG1655株で調製されたファージ溶解物P1の添加(約1.109ファージ/ml)
− すべての細胞が溶解するまで37°Cで3時間振盪
− 200μlのクロロホルムの添加およびボルテックス
− 細胞残屑を除くために10分間4500gで遠心
− 上清を滅菌した試験管に移し、200μlのクロロホルムを添加
− 溶解物を4°Cで保存
トランスダクション
− LB培地中で一晩培養のMG1655ΔaceB::Cm株の5mlを10分間1500gで遠心
− 細胞沈殿物を2.5mlの10mMの硫化マグネシウム、5mMの塩化カルシウムに懸濁
− 対照試験管:100μlの細胞、100μlのMG1655Δgcl::Km株のファージP1
− テスト試験管:100μlの細胞および100μlのMG1655Δgcl::Km株のファージP1
− 30°Cで30分間振盪せずに培養
− 各試験管に100μlの1Mのクエン酸ナトリウムの添加およびボルテックス
− 1mlのLBの添加
− 37°Cで1時間振盪しながら培養
− 試験管を3分間7000rpmで遠心した後、50μg/mlのKm入りLBをディシュに薄く広げる
− 37°Cで一晩培養
株の検証
次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、遺伝子の欠失Δgcl::Kmを、前述のgclFおよびgipRを用いたPCR分析によって検証する。保持された株を、MG1655 ΔaceB::Cm Δgcl::Kmと呼ぶ。
はじめに、MG1655 ΔglcB::Kmを、次のオリゴヌクレオチドを用いて前述と同様の方法を使用して構築する:
DglcBR (配列番号9)
cccagagccgtttacgcattgacgccaattttaaacgttttgtggatgaagaagttttaccgggaacagggctggacgcCATATGAATATCCTCCTTAG
−遺伝子glcB(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列)の領域の配列(3121805〜3121727)に相同な領域(小文字)
−カナマイシン耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域(大文字)
DglcBF (配列番号10)
cgcgtaaacgccaggcgtgtaataacggttcggtatagccgtttggctgtttcacgccgaggaagattaaatcgctggcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
−遺伝子glcB(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列)の領域の配列(3119667〜3119745)に相同な領域(小文字)
−カナマイシン耐性カセット(参照配列はDatsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)の増幅の為の領域(大文字)
オリゴヌクレオチドDglcBFおよびDglcBRを、プラスミドpKD4からカナマイシン耐性カセットを増幅する為に用いる。次いで、得られたPCR産物を、電気穿孔法により、MG1655株(pKD46)に導入する。その後、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下に定義されたオリゴヌクレオチドglcBFおよびglcBRを用いたPCR分析によって検証する。保持された株を、MG1655 ΔglcB::Kmと呼ぶ。
glcBR (配列番号11) : gccagcaaatggcgagtgc(3122225〜3122207の配列に相同)
glcBF (配列番号12) : cgcagagtatcgttaagatgtcc(3119475〜3119497の配列に相同)
その後、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、遺伝子の欠失ΔglcB::Kmを前述のオリゴヌクレオチドglcBFおよびglcBRを用いたPCR分析によって検証する。保持された株を、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcB::Kmと呼ぶ。
NADPH依存性グリオキシル酸還元酵素の増加したレベルを有する株の構築:MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcB (pME101-ycdW)
NADPH依存性グリオキシル酸還元酵素のレベルを引き上げる為にycdW遺伝子をプラスミドpCL1920(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631)からプロモーターPtrcを用いて発現する。低コピーベクターからの発現の為、プラスミドpME101は次のように構築される。オリゴヌクレオチドPME101FおよびPME101Rを用いてプラスミドpCL1920をPCR増幅し、lacI遺伝子およびPtrcプロモーターをもつベクターPTRC99AからのBst17I-XmnI断片を増幅したベクターに挿入する。
PME101F (配列番号13) : Ccgacagtaagacgggtaagcctg
PME101R (配列番号14) : Agcttagtaaagccctcgctag
ycdW遺伝子を次のオリゴヌクレオチドを用いてゲノムDNAからPCR増幅する。
BspHI ycdW (配列番号15):
agctagctctcatgagaataaatttcgcacaacgcttttcggg
SmaI ycdW (配列番号16):
gcatgcatcccgggtctctcctgtattcaattcccgcc
PCR断片をBspHIおよびSmaIで切断し、NcoIおよびSmaI制限酵素で切断したベクターpME101にクローンし、その結果、pME101-ycdWプラスミドを生じる。
次いで、pME101-ycdWプラスミドを、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcBに導入する。
減少したグリコレート消費を有する株の構築:MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA (pME101-ycdW)
トランスダクションによってMG1655 ΔaceB Δgcl株においてglcDEFGB遺伝子が欠失される。
はじめに、MG1655 ΔglcDEFGB::Km株を、次のオリゴヌクレオチドを用いて前述と同様の方法を使用して構築する:
DglcDR(配列番号17)
gcgtcttgatggcgctttacccgatgtcgaccgcacatcggtactgatggcactgcgtgagcatgtccctggacttgagatccCATATGAATATCCTCCTTAG
−遺伝子glcD(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列)の配列(3126016〜3125934)に相同な領域(小文字)
−クロラムフェニコール耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域(大文字)
DglcBF(配列番号18)
cgcgtaaacgccaggcgtgtaataacggttcggtatagccgtttggctgtttcacgccgaggaagattaaatcgctggcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
−遺伝子glcB(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列)の領域の配列(3119667〜3119745)に相同な領域(小文字)
−クロラムフェニコール耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域(大文字)
オリゴヌクレオチドDglcDRおよびDglcBFをプラスミドpKD4からカナマイシン耐性カセットを増幅する為に用いる。次いで、得られたPCR産物を、電気穿孔法により、MG1655株(pKD46)に導入する。該菌株では発現したRedリコンビナーゼ酵素によって相同性組み換えが可能となる。その後、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下に定義されたオリゴヌクレオチドglcDRおよびglcBFを用いたPCR分析によって検証する。保持された株を、MG1655 ΔglcDEFGB::Kmと呼ぶ。
glcDR (配列番号19) : ccaagacaaggtcacagagc(3126183〜3126164の配列に相同)
glcBF (配列番号20) : cgcagagtatcgttaagatgtcc(3119475〜3119497の配列に相同)
その後、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、遺伝子の欠失ΔglcDEFGB::Kmは前述のオリゴヌクレオチドglcBFおよびglcDRを用いてPCR分析によって検証する。保持された株を、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB::Kmと呼ぶ。
AldA D r (配列番号21)
ttaagactgtaaataaaccacctgggtctgcagatattcatgcaagccatgtttaccatctgcgccgccaataccggatttCATATGAATATCCTCCTTAG
−遺伝子aldA(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列)の配列(1487615〜1487695)に相同な領域(小文字)
−カナマイシン耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域(大文字)
AldA D f (配列番号22)
atgtcagtacccgttcaacatcctatgtatatcgatggacagtttgttacctggcgtggagacgcatggattgatgtggtaGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
−遺伝子aldA(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur. fr/Co libri/に参照配列)の配列(1486256〜1486336)に相同な領域(小文字)
−カナマイシン耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域(大文字)
オリゴヌクレオチドaldAFおよびaldARを、プラスミドpKD3からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅するのに用いる。次いで、得られたPCR産物を電気穿孔法により、MG1655株(pKD46)に導入する。該菌株では発現したRedリコンビナーゼ酵素によって相同性組み換えが可能となる。次いで、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下に定義されたオリゴヌクレオチドYdcFCfおよびgapCCRを用いたPCR分析によって検証する。保持された株は、MG1655 ΔaldA::Cmと呼ぶ。
YdcFCf (配列番号23) : tgcagcggcgcacgatggcgacgttccgccg(1485722〜1485752の配列に相同)
gapCCR (配列番号24) : cacgatgacgaccattcatgcctatactggc (1488195〜1488225の配列に相同)
その後、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、遺伝子の欠失ΔaldA::Cmを前述のオリゴヌクレオチドYdcFcfおよびgapCCRを用いたPCR分析によって検証する。保持された株を、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB::Km ΔaldA::Cmと呼ぶ。
その後、pME101-ycdWプラスミドを、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA株に導入する。
グリオキシル酸経路の流れが増加した株の構築:MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR (pME101-ycdW)
次のオリゴヌクレチドを用いて、前述と同じ方法を用いて、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldAにおいてiclR遺伝子の欠失を導入する:
DiclF(配列番号25)
CgcacccattcccgcgaaacgcggcagaaaacccgccgttgccaccgcaccagcgactggacaggttcagtctttaacgcgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
−遺伝子iclR(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur. fr/Co libri/に参照配列)の配列(4221202〜4221120)に相同な領域(小文字)
−カナマイシン耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域(大文字)
DiclR(配列番号26)
gcgcattccaccgtacgccagcgtcacttccttcgccgctttaatcaccatcgcgccaaactcggtcacgcggtcatcggCATATGAATATCCTCCTTAG
−遺伝子iclR(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur. fr/Co libri/上参照配列)の配列(4220386〜4220465)に相同な領域(小文字)
−カナマイシン耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域(大文字)
オリゴヌクレチドDiclFおよびDiclRをプラスミドpKD4からカナマイシン耐性カセットを増幅する為に用いる。次いで、得られたPCR産物を、電気穿孔法によってMG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA (pKD46)株に導入する。その後、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットを下に定義されたオリゴヌクレオチドiclFおよびiclRを用いたPCR分析によって検証する。保持された株を、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR::Kmと呼ぶ。
iclF (配列番号27) : cctttgaggtcgcatggccagtcggc (4221558〜4221533の配列に相同)
iclR (配列番号28):gctttttaatagaggcgtcgccagctccttgcc (4219917〜4219949の配列に相同)。
その後、pME101-ycdWプラスミドをMG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclRに導入する。
NADPHの供給が増加した株の構築:MG1655 ΔaceB Δgcl ΔiclR ΔglcDEFGB ΔaldA Δedd-eda (pME101-ycdW)
edd-eda遺伝子はMG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcB ΔglcDEF ΔaldA ΔiclR株においてトランスダクションによって欠失される。
最初に、MG1655 Δedd-eda::Cm株を、次のオリゴヌクレチドを用いて、前記と同様の方法を用いて構築する:
DeddF (配列番号29)
CgcgcgagactcgctctgcttatctcgcccggatagaacaagcgaaaacttcgaccgttcatcgttcgcagttggcatgcggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
−遺伝子edd-eda(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur. fr/Co libri/に参照配列)の領域の配列(1932582〜1932500)に相同な領域(小文字)
−クロラムフェニコール耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域(大文字)
DedaR (配列番号30)
gcttagcgccttctacagcttcacgcgccagcttagtaatgcggtcgtaatcgcccgcttccagcgcatctgccggaaccCATATGAATATCCTCCTTAG
−遺伝子edd-eda(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur. fr/Co libri/に参照配列)の領域の配列(1930144〜1930223)に相同な領域(小文字)
−クロラムフェニコール耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域(大文字)
オリゴヌクレチドDeddFおよびDedaRをプラスミドpKD3からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅する為に用いる。次いで、得られたPCR産物を電気穿孔法によってMG1655(pKD46)株に導入する。その後、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を下に定義されたオリゴヌクレオチドeddFおよびedaRを用いたPCR分析によって検証する。保持された株を、MG1655 Δedd-eda::Cmと呼ぶ。
eddF (配列番号31) : Gggtagactccattactgaggcgtgggcg (1932996〜1932968の配列に相同).
edaR (配列番号32) : ccacatgataccgggatggtgacg (1929754〜1929777の配列に相同).
その後、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、Δedd-eda::Cm遺伝子の欠失を、オリゴヌクレオチドeddFおよびedaRを用いたPCR分析によって検証する。保持された株を、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcB ΔglcDEF ΔaldA ΔiclR Δedd-eda::Cmと呼ぶ。
次に、pME101-ycdWプラスミドを、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd-edaに導入する。
NADPHの供給が増加した株の構築:MG1655 ΔaceB Δgcl ΔiclR ΔglcDEFGB ΔaldA Δpgi::Cm Δedd-eda (pME101-ycdW)
次のオリゴヌクレチドを用い、前述と同様の方法を使って、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcB ΔglcDEF ΔaldA ΔiclR Δedd-edaにおいて、pgi遺伝子の欠失を導入する:
DpgiF (配列番号33)
ccaacgcagaccgctgcctggcaggcactacagaaacacttcgatgaaatgaaagacgttacgatcgccgatctttttgcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
−pgi遺伝子(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列)の配列(4231352〜4231432)に相同な領域(小文字)
−クロラムフェニコール耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域(大文字)
DpgiR (配列番号34)
gcgccacgctttatagcggttaatcagaccattggtcgagctatcgtggctgctgatttctttatcatctttcagctctgCATATG AATATCCTCCTTAG
−pgi遺伝子(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur. fr/Co libri/に参照配列)の配列(4232980〜4232901)に相同な領域(小文字)
−クロラムフェニコール耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域(大文字)
オリゴヌクレチドDpgiFおよびDpgiRをプラスミドpKD3からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅する為に用いる。次いで、得られたPCR産物を電気穿孔法によってMG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcB ΔglcDEF ΔaldA ΔiclR Δedd-eda (pKD46)株に導入する。その後、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下に定義されたオリゴヌクレオチドpgiFおよびpgiRを用いたPCR分析によって検証する。保持された株は、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcB ΔglcDEF ΔaldA ΔiclR Δedd-eda Δpgi::Cmと呼ぶ。
pgiF (配列番号35) : gcggggcggttgtcaacgatggggtcatgc (4231138〜4231167の配列に相同)
pgiR (配列番号36) : cggtatgatttccgttaaattacagacaag (4233220〜4233191の配列に相同).
次に、pME101-ycdWプラスミドを、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd-eda Δpgi::Cmに導入する。
NADPH供給が増加した株の構築:MG1655 ΔaceB Δgcl ΔiclR ΔglcDEFGB ΔaldA Δpgi Δedd-eda::Cm ΔudhA::Km (pME101-ycdW)
次のオリゴヌクレチドを用い、前述と同様の方法を使って、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δpgi::Cm Δedd-edaにおいてudhA遺伝子の欠失を導入する:
DudhAF (配列番号37)
CCCAGAATCTCTTTTGTTTCCCGATGGAACAAAATTTTCAGCGTGCCCACGTTCATGCCGACGATTTGTGCGCGTGCCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
−udhA遺伝子(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur. fr/Co libri/に参照配列)の配列(4157588〜4157667)に相同な領域(太字)、
−カナマイシン耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域(下線文字)
DudhAR (配列番号38)
GGTGCGCGCGTCGCAGTTATCGAGCGTTATCAAAATGTTGGCGGCGGTTGCACCCACTGGGGCACCATCCCGTCGAAAGCCATATGAATATCCTCCTTAG
−udhA遺伝子(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur. fr/Co libri/に参照配列)の配列(4158729〜4158650)に相同な領域(太字)、
−カナマイシン耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域(下線文字)。
オリゴヌクレチドDudhAFおよびDudhARをプラスミドpKD4からカナマイシン耐性カセットを増幅するのに用いた。次いで、得られたPCR産物を、電気穿孔法によってMG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δpgi::Cm Δedd-eda (pKD46)株に導入した。その後、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を下に定義されたオリゴヌクレオチドudhAFおよびudhARを用いて、PCR分析によって検証する。保持された株を、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δpgi::Cm Δedd-eda ΔudhA::Kmと呼ぶ。
udhAF (配列番号39) : GATGCTGGAAGATGGTCACT (4157088〜4157108の配列に相同)
udhAR (配列番号40) : gtgaatgaacggtaacgc (4159070〜4159052の配列に相同)。
次に、pME101-ycdWプラスミドをMG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δpgi::Cm Δedd-eda ΔudhA::Kmに導入する。
三角フラスコにおけるグリコール酸生産株の発酵
初めに、株の性能を、40g/lのMOPSおよび10g/lのグルコースを補完し、pHを6.8に調節した改良M9培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)を用いて、250mlのバッフル付三角フラスコ培養で評価した。必要に応じて、スペクチノマイシンを、50mg/lの濃度で加え、発現ベクターが存在する場合、その誘導の為に100μmのIPTGも又加えた。一晩の前培養を、約0.3のOD600 nmで50ml培養の接種の為に用いた。培養液は培養培地中においてグルコースが枯渇するまで、30°C、400rpmで振盪器で振盪する。培養の最後に、グルコースとグリコール酸を、分離のためにBiorad HPX 97Hカラムを、検出のために屈折計を用いて、HPLCで分析した。
流加培養発酵槽におけるグリコール酸生産株の発酵
実施例6および実施例7に記載の株を、流加培養(fed batch)プロトコルを用いて、600ml発酵槽における生産条件下で評価した。
通常、発酵槽において、実施例7記載の株は、実施例6記載の株より良い生産能力を示した(グルコースからの収率0.22g/g対0.15g/g)。
Claims (17)
- グリコール酸、その誘導体または前駆体の発酵生産方法であって、炭素源を含んでなる適切な培養培地中で大腸菌株を培養し、培養培地からグリコール酸を回収することを含んでなり、
大腸菌株が、次の遺伝子:
− リンゴ酸シンターゼをコードするaceB
− 第二のリンゴ酸シンターゼをコードするglcB、および
− グリオキシル酸カルボリガーゼをコードするgcl
の発現を減衰させることにより、グリオキシレートのグリコレート以外の産物への変換を減衰させるように改変され、かつ
大腸菌株が、グリオキシレートのグリコレートへの変換を触媒するNADPH依存性グリオキシル酸還元酵素をコードするycdW遺伝子を発現し、その発現が増加されている、方法。 - 大腸菌株が、2-ケト-3-デオキシグルコン酸6-リン酸アルドラーゼをコードするeda遺伝子の発現を減衰させるようにさらに改変された、請求項1に記載の方法。
- 大腸菌株が、実質的にグリコレートを代謝することができないように改変された、請求項1または2に記載の方法。
- グリコレート代謝に関わる次の遺伝子、
− グリコール酸酸化酵素をコードするglcDEF、
− グリコルアルデヒド脱水素酵素をコードするaldA、
から選択される少なくともひとつの遺伝子の発現が減衰された、請求項3に記載の方法。 - 大腸菌株が、グリオキシル酸経路の流れを増加させるように形質転換された、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- イソクエン酸脱水素酵素の活性が減衰された、請求項5に記載の方法。
- 次のうち少なくとも一つの遺伝子の発現が減衰された、請求項5に記載の方法:
− ホスホトランスアセチラーゼをコードするpta
− 酢酸キナーゼをコードするack、
− ピルビン酸酸化酵素をコードするpoxB。 - aceAの活性を増加させることによりグリオキシル酸経路の流れが増加された、請求項5に記載の方法。
- iclRまたはfadRの発現を減衰させることによりaceAの発現が増加された、請求項8に記載の方法。
- aceA遺伝子の上流に人工プロモーターを導入することによりaceAの発現が増加された、請求項8に記載の方法。
- NADPHの供給が増加された、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 次の遺伝子、
− グルコース-6-リン酸イソメーラーゼをコードするpgi
− 可溶性トランスヒドロゲナーゼをコードするudhA
− ホスホグルコン酸脱水酵素をコードするedd
から選択される少なくともひとつの遺伝子の発現が減衰された、請求項11に記載の方法。 - 炭素源が、グルコース、スクロース、単糖類もしくはオリゴ糖類、またはデンプンの少なくとも1つである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 下記工程を含んでなる、請求項1〜13のいずれか一項に記載されたグリコレートの発酵調製方法:
a)グリコレート生産する大腸菌株の発酵工程
b)細菌または培地中におけるグリコレートの濃縮工程、および
c)最終産物中に、場合によっては一部または全量(0〜100%)残存している発酵培養液および/またはバイオマスからのグリコール酸の単離工程。 - グリコレートが、少なくともグリコレートの二量体に重合する工程を通して単離される、請求項14に記載の方法。
- グリコレートが、グリコレートの二量体、オリゴマーおよび/またはポリマーからの脱重合によって回収される、請求項15に記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれか一項で定義された大腸菌株。
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