CN106011185B - 一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于：包括，构建重组质粒，获得重组大肠杆菌，配制培养基，制备种子液，发酵。与前期已报道的生物法合成乙醇酸相比，本发明中所提到的乙醇酸发酵技术方案在没有敲除大肠杆菌BL21(DE3)中任何基因的情况下提高了乙醇酸的产量及产率。以葡萄糖为唯一碳源，GL1、GL3、GL2摇瓶发酵产率分别为0.109g/g，0.155g/g，0.248g/g，通过发酵条件优化，GL2上罐发酵时产量达到4.275g/L，产率为0.427g/g。

Description

一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法。
背景技术
乙醇酸(glycolicacid，glycolate)又称羟基乙酸(Hydroxyaceticacid)、甘醇酸，是最简单的α—羟基酸。它在化妆品，制药，纺织和制革等行业得到了广泛的应用。
已知多种使用相应的α-羟基腈作为原料以及微生物作为催化剂用于制备α-羟基酸的方法。所产生的α-羟基酸的例子包括：乙醇酸、乳酸、2-羟基异丁酸、2-羟基-2-苯丙酸、苦杏仁酸、2-羟基-3，3-二甲基-4-丁内酯和4-甲硫丁酸。这些产物是使用微生物合成的，例如属于诺卡氏菌属(Nocardia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、金杆菌属(Aureobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳酪杆菌属(Caseobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、不动杆菌属(Acinetobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、微球菌属(Micrococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、黄杆菌属(Flavobacterium)、气单胞菌属(Aeromonas)、枝动杆菌属(Mycoplana)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、假丝酵母属(Candida)、无芽孢杆菌属(Bacteridium)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、镰孢菌属(Fusarium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、细杆菌属(Microbacterium)、Obsumbacterium和戈登氏菌属(Gordona)的那些微生物(相应于US5,223,416的JP-A-4-99495、JP-A-4-99496和JP-A-4-218385；相应于US5,234,826的JP-A-4-99497；相应于US5,296,373的JP-A-5-95795JP-A-5-21987；相应于US5,326,702的JP-A-5-192189；相应于EP-A-0610048的JP-A-6-237789；相应于EP-A-0610049的JP-A-6-284899；相应于US5,508,181的JP-A-7-213296)。
目前乙醇酸的主要生产方式是化学合成，但是该方法的产品收率并不高。此外，在乙醇酸的化学合成过程中需要加入大量的有毒有害的甲醛，并且整个生产过程对环境污染非常大。为了解决上述问题，人们将目光聚焦到生物合成乙醇酸的道路上，且做了大量的基础工作。目前报道的主要生物合成乙醇酸的方法有微生物酶催化法和全生物合成方法。主要的微生物酶催化法包括利用微生物产腈水解酶水解乙醇腈产乙醇酸以及微生物产甘油氧化酶氧化乙二醇产乙醇酸。全生物合成乙醇酸的方法包括：利用乙二醇作为底物生产乙醇酸及利用大肠杆菌以葡萄糖为底物全生物合成乙醇酸。以葡萄糖为底物全生物合成乙醇酸具有底物廉价，操作简单，产品纯度高等突出优点。尽管研究人员已经在大肠杆菌中实现了利用葡萄糖全生物合成乙醇酸，但是该方法得到的乙醇酸产率较低，在没有敲除基因的情况下，目前已报道的乙醇酸的最高产率为0.157g/g。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有乙醇酸合成中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明目的是解决现有技术中的不足，提供一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于，包括，利用基因组提取试剂盒提取大肠杆菌DH5α基因组，并以此为模板进行PCR扩增目的基因，在35～37℃条件下，NdeI和XhoI双酶切PCR扩增的目的基因1.5～2.5h，PCR产物纯化试剂盒纯化，在35～37℃条件下，NdeI和XhoI双酶切质粒pCOLDuet-11.5～2.5h，利用胶回收试剂盒回收载体片段，用T4连接酶处理目的基因片段与载体片段，在35～37℃培养箱内培养过夜，验证后完成重组质粒的构建，并进行重组大肠杆菌的制备，将甘油保藏的菌种接种于LB液体培养基中，在35～37℃、220～280r/min条件下摇瓶过夜，将过夜培养的种子液离心，并用M9培养基重悬菌体，进行摇瓶发酵或上罐发酵，得到含有乙醇酸的发酵液。
作为本发明所述无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法的一种优选方案，其中：所述目的基因包括ycdW或aceAK。
作为本发明所述无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法的一种优选方案，其中：所述用T4连接酶处理目的基因片段与载体片段，包括，用T4连接酶在15～20℃处理目的基因片段与载体片段7～10小时，将上述连接反应液加入JM109化转感受态中冰上放置25～35min，40～42℃热激80～100s，加入SOC液体培养基，35～37℃摇床孵育0.8～1.2h，以45～55ug/mL涂布卡那抗性平板。
作为本发明所述无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法的一种优选方案，其中：所述验证后完成重组质粒的构建，包括，挑取菌落进行PCR验证，并将疑似正确菌落转接入LB液体培养基，培养12～16h，利用质粒小提试剂盒提取质粒，NcoI和XhoI酶切验证，得到重组质粒pJNU-1、pJNU-2、pJNU-3。
作为本发明所述无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法的一种优选方案，其中：所述重组大肠杆菌的制备，包括，将重组质粒加入到BL21(DE3)化转感受态中，混合均匀，冰上放置25～35min，40～42℃热激80～100s，加入SOC液体培养基，35～37℃摇床孵育0.8～1.2h，以45～55ug/mL涂布卡那抗性平板，37℃培养箱培养过夜，挑取单菌落进行PCR验证，并将验证正确的重组大肠杆菌以45～55ug/mL接种于含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，摇瓶培养过夜，用12～15％的甘油冷冻保藏。
作为本发明所述无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法的一种优选方案，其中：所述摇瓶发酵包括，将种子液以1～3％的接种量接种于摇瓶发酵培养基中，使其初始OD600为0.1，在35～37℃、220～280r/min条件下培养至OD600为0.8时加入1mMIPTG诱导表达，并将培养条件改为28～32℃、220～280r/min培养。
作为本发明所述无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法的一种优选方案，其中：所述摇瓶发酵培养基成分包括4～10g/L葡萄糖、1.5～2.5mMMgSO4、0.08～0.12mMCaCl2或40～60ug/ml硫酸卡那霉素中的一种或几种，其余成分为M9盐溶液。
作为本发明所述无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法的一种优选方案，其中：所述上罐发酵包括，以1～3％的接种量接种于发酵罐中，在35～40℃下培养至OD600为0.7～0.9时加220～280ng/mlaTc，搅拌转速为350～450r/min，通气量0.8～1.2vvm，1.8～2.2MNa0H维持pH为6.8～7.2。
本发明的有益效果：与化学法相比，生物法合成乙醇酸首先产品的回收更加方便简单，而且极大程度地降低了对环境的污染程度。与前期已报道的生物法合成乙醇酸相比，本发明中所提到的乙醇酸发酵技术方案在没有敲除大肠杆菌BL21(DE3)中任何基因的情况下，优选优化了重组质粒的构建体系、重组大肠杆菌的制备条件以及发酵过程中的工艺参数，极大地提高了乙醇酸的产量及产率。以葡萄糖为唯一碳源，GL1、GL3、GL2摇瓶发酵产率分别为0.109g/g，0.155g/g，0.248g/g，通过发酵条件优化，GL2上罐发酵时产量达到4.275g/L，产率为0.427g/g。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为乙醇酸合成途径。
图2为pJNU-1质粒图谱。
图3为pJNU-2质粒图谱。
图4为pJNU-3质粒图谱。
图5为pJNU-1质粒酶切验证图谱。
图6为pJNU-3质粒酶切验证图谱。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1：重组质粒pJNU-1构建及重组大肠杆菌GL1的制备
1、目的基因ycdW和aceAK的获得
利用基因组提取试剂盒提取大肠杆菌DH5α基因组，并以此为模板进行PCR扩增目的基因。
2、目的基因与载体连接
NdeI和XhoI37℃双酶切PCR扩增的基因片段ycdW2小时，PCR产物纯化试剂盒纯化，NdeI和XhoI37℃双酶切质粒pCOLDuet-12小时，利用胶回收试剂盒回收载体片段。
T4连接酶处理目的基因片段与载体片段，16℃处理8小时，将上述连接反应液加入100ulJM109化转感受态中冰上放置30min，42℃热激90s，加入1mLSOC液体培养基，37℃摇床孵育1h，涂布卡那抗性平板(50ug/mL)。37℃培养箱培养过夜，挑取单菌落进行PCR验证，并将疑似正确菌落转接LB液体培养基，培养12-16h，利用质粒小提试剂盒提取质粒，用NdeI和XhoI酶切验证。验证正确的质粒用NcoI和EcoRI37℃双酶切2小时，同时NcoI和EcoRI37℃双酶切PCR扩增的基因片段aceAK2小时。后续连接转化实验步骤同上，用XhoI和EcoRI酶切验证。
3、重组大肠杆菌GL1的获得
取重组质粒pJNU-110ul，加入到100ul的BL21(DE3)化转感受态中，混合均匀，冰上放置30min，42℃热激90s，加入1mLSOC液体培养基，37℃摇床孵育1h，涂布卡那抗性平板(50ug/mL)。37℃培养箱培养过夜，挑取单菌落进行PCR验证。并将验证正确的重组大肠杆菌接种于含有硫酸卡那霉素(50ug/mL)的LB液体培养基中，摇瓶培养过夜，用15％的甘油冷冻保藏，备用。
引物设计如下：
扩增目的基因的PCR体系：模板5ul，引物F15ul，引物R15ul，PrimeSTARMaxDNAPolymerase250ul，ddH2O定容至500ul。
PCR反应条件：98℃5min，98℃5s，55℃5s，72℃1min(34个循环)，72℃10min。
实施例2：重组质粒pJNU-2的构建及重组大肠杆菌GL2的制备
1、目的基因ycdW的获得
利用基因组提取试剂盒提取大肠杆菌DH5α基因组，并以此为模板进行PCR扩增目的基因。
2、目的基因ycdW与载体连接
NdeI和XhoI37℃双酶切PCR扩增的基因片段ycdW2小时，PCR产物纯化试剂盒纯化，NdeI和XhoI37℃双酶切质粒pCOLDuet-12小时，利用胶回收试剂盒回收载体片段。
3、T4连接酶处理目的基因片段与载体片段，16℃处理8小时，将上述连接反应液加入100ulJM109化转感受态中冰上放置30min，42℃热激90s，加入1mLSOC液体培养基，37℃摇床孵育1h，涂布卡那抗性平板(50ug/mL)。37℃培养箱培养过夜，挑取单菌落进行PCR验证，并将疑似正确菌落转接LB液体培养基，培养12-16h，利用质粒小提试剂盒提取质粒，用NdeI和XhoI酶切验证，获得pCOLDuet-1-ycdW。目的基因aceAK、启动子ptet、终止子片段的获得及与载体的连接。以大肠杆菌DH5α基因组为模板进行PCR扩增目的基因aceAK，以pGLY-2为模板进行PCR扩增启动子ptet及终止子片段，PCR产物纯化试剂盒纯化，用NcoI和PfoI37℃双酶切pCOLDuet-1-ycdW2小时，利用胶回收试剂盒回收载体片段。
将上述得到的4个片段利用Gibson组装体系构建重组质粒pJNU-2，具体实施方法如下：
1、配制6mL5ⅹisobuffer
3ml1MTris-HCl，150ul2MMgCl2，240ul100mMdNTP，300ul1MDTT(二硫苏糖醇)，1.5gPEG-8000，3000ul100mMNAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，加ddH2O至6ml。
2、配制1.2mlGibson组装混合液
320ul5ⅹisobuffer，0.64ul10u/ulT5exonuclease，30ul2u/Lphusionpolymerase，160ul40u/ulTaqligase，加ddH2O至1.2ml。
取15ulGibson组装混合液及上述四个片段个100ng至20ul，50℃反应1小时，进行化转，转入JM109中。转化方法同上。挑取单菌落PCR验证。EcoRI酶切验证。
3、重组大肠杆菌GL2的获得
取重组质粒pJNU-210ul，加入到100ul的BL21(DE3)化转感受态中，混合均匀，冰上放置30min，42℃热激90s，加入1mLSOC液体培养基，37℃摇床孵育1h，涂布卡那抗性平板(50ug/mL)。37℃培养箱培养过夜，挑取单菌落进行PCR验证。并将验证正确的重组大肠杆菌接种于含有硫酸卡那霉素(50ug/mL)的LB液体培养基中，摇瓶培养过夜，用15％的甘油冷冻保藏，备用。
引物设计如下
实施例3：重组质粒pJNU-3构建及重组大肠杆菌GL3的制备
1、目的基因ycdW和aceAK的获得
NcoI和XhoI双酶切质粒pJNU-1，切胶回收片段(70-4425bp)，获得目的基因ycdW和aceAK。
2、目的基因与载体连接
NcoI和XhoI酶切质粒pRSFDuet-1，利用胶回收试剂盒回收载体片段。T4连接酶处理目的基因片段与载体片段，16℃处理8小时，将上述连接反应液加入100ulJM109化转感受态中冰上放置30min，42℃热激90s，加入1mLSOC液体培养基，37℃摇床孵育1h，涂布卡那抗性平板(50ug/mL)。37℃培养箱培养过夜，挑取菌落进行PCR验证，并将疑似正确菌落转接LB液体培养基，培养12-16h，利用质粒小提试剂盒提取质粒，NcoI和XhoI酶切验证。
3、重组大肠杆菌GL3的制备
取重组质粒pJNU-310ul，加入到100ul的BL21(DE3)化转感受态中，混合均匀，冰上放置30min，42℃热激90s，加入1mLSOC液体培养基，37℃摇床孵育1h，涂布卡那抗性平板(50ug/mL)。37℃培养箱培养过夜，挑取单菌落进行PCR验证。并将验证正确的重组大肠杆菌接种于含有硫酸卡那霉素(50ug/mL)的LB液体培养基中，摇瓶培养过夜，用15％的甘油冷冻保藏，备用。
引物设计如下：
实施例4：重组大肠杆菌GL1，GL2摇瓶发酵及结果分析
培养基：M9盐溶液+8g/L葡萄糖+2mMMgSO4+0.1mMCaCl2+50ug/ml硫酸卡那霉素。
种子液制备：甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50ml的LB液体培养基的250ml锥形瓶中，37℃、250r/min摇瓶过夜。
发酵条件：过夜培养的种子液离心，并用M9培养基重悬菌体，接种于摇瓶发酵培养基中，使其初始OD600为0.1。37℃、250r/min培养至OD600为0.8左右时加入相应的诱导剂诱导表达——1mMIPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导GL1，1mMIPTG、250ng/mlaTc(脱水四环素盐酸盐)诱导GL2，改为30℃、250r/min培养。
结果分析：发酵过程中每4h取一次样，8000r/min离心2min将发酵液与菌体分离，0.22um滤膜处理发酵液，用于进行HPLC(高效液相色谱法)检测，HPLC检测中流动相为5mMH2SO4，柱温为50℃。GL1乙醇酸产量为0.877g/L，产率为0.109g/g，GL2乙醇酸产量为1.988g/L，产率为0.248g/g。
实施例5：GL3摇瓶发酵及结果分析
培养基：M9盐溶液+4g/L葡萄糖+2mMMgSO4+0.1mMCaCl2+50ug/ml硫酸卡那霉素。
种子液制备：甘油保藏的菌种接种于盛有50ml的LB液体培养基的250ml锥形瓶中，37℃、250r/min摇瓶过夜。
发酵条件：过夜培养的种子液离心，并用M9培养基重悬菌体，接种于摇瓶发酵培养基中，使其初始OD600为0.1。37℃、250r/min培养至OD600为0.8左右时加入1mMIPTG诱导表达，改为30℃、250r/min培养。
结果分析：发酵过程中每4h取一次样，8000r/min离心2min将发酵液与菌体分离，0.22um滤膜处理发酵液，用于进行HPLC(高效液相色谱法)检测，HPLC检测中流动相为1.25mMH2SO4，柱温为32℃。GL3乙醇酸产量为0.628g/L，产率为0.157g/g。
实施例6：GL2上罐发酵及结果分析
培养基：M9盐溶液+8g/L葡萄糖+2mMMgSO4+0.1mMCaCl2+50ug/ml硫酸卡那霉素
种子液制备：甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50ml的LB液体培养基的250ml锥形瓶中，37℃、250r/min摇瓶过夜。次日取500ul菌液转接于60mlLB液体培养基中，37℃、250r/min培养至OD600达到0.5-0.6时，接种于5L发酵罐中。
发酵条件：2％接种量，37℃培养至OD600为0.8左右时加250ng/mlaTc、1mMIPTG30℃诱导，搅拌转速400r/min，通气量1vvm，2MNa0H维持pH为6.8～7.2。
结果分析：发酵过程中每4h取一次样，8000r/min离心2min将发酵液与菌体分离，0.22um滤膜处理发酵液，用于进行HPLC(高效液相色谱法)检测，HPLC检测中流动相为5mMH2SO4，柱温为50℃。GL2上罐发酵乙醇酸产量为4.275g/L，产率为0.427g/g。
由此可见，本发明中所提到的乙醇酸发酵技术方案在没有敲除大肠杆菌BL21(DE3)中任何基因的情况下提高了乙醇酸的产量及产率。以葡萄糖为唯一碳源，GL1、GL3、GL2摇瓶发酵产率分别为0.109g/g，0.155g/g，0.248g/g，通过发酵条件优化，GL2上罐发酵时产量达到4.275g/L，产率为0.427g/g。
上述说明已经充分揭示了本发明的具体实施方式。需要指出的是，熟悉该领域的技术人员对本发明的具体实施方式所做的任何改动均不脱离本发明的权利要求书的范围。相应地，本发明的权利要求的范围也并不仅仅局限于前述具体实施方式。

Claims (1)

1.一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于：包括，
利用基因组提取试剂盒提取大肠杆菌DH5α基因组，并以此为模板进行PCR扩增目的基因；
NdeI和XhoI37℃双酶切PCR扩增的基因片段ycdW 两小时，PCR产物纯化试剂盒纯化，NdeI和XhoI37℃双酶切质粒pCOLADuet-1两小时，利用胶回收试剂盒回收载体片段；
T4连接酶处理目的基因片段与载体片段，16℃处理8小时，将上述连接反应液加入100ul JM109转化 感受态中冰上放置30min，42℃热激90s，加入1mL SOC液体培养基，37℃摇床孵育1h，涂布50ug/mL卡那抗性平板，37℃培养箱培养过夜，挑取单菌落进行PCR验证，并将疑似正确菌落转接LB液体培养基，培养12~16h，利用质粒小提试剂盒提取质粒，用NdeI和XhoI酶切验证，获得pCOLADuet-1-ycdW，目的基因aceAK、启动子ptet、终止子片段的获得及与载体的连接，以大肠杆菌DH5α基因组为模板进行PCR扩增目的基因aceAK，以pGLY-2为模板进行PCR扩增启动子ptet及终止子片段，PCR产物纯化试剂盒纯化，用NcoI和PfoI 37℃双酶切pCOLADuet-1-ycdW两小时，利用胶回收试剂盒回收载体片段；
利用Gibson组装体系构建重组质粒pJNU-2；
取重组质粒pJNU-2 10ul，加入到100ul的BL21(DE3)化转感受态中，混合均匀，冰上放置30min，42℃热激90s，加入1mL SOC液体培养基，37℃摇床孵育1h，涂布50ug/mL卡那抗性平板，37℃培养箱培养过夜，挑取单菌落进行PCR验证，并将验证正确的重组大肠杆菌接种于含有50ug/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，摇瓶培养过夜，用15％的甘油冷冻保藏；
甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50ml的LB液体培养基的250ml锥形瓶中，37℃、250r/min摇瓶过夜，次日取500ul菌液转接于60ml LB液体培养基中，37℃、250r/min培养至OD600达到0.5-0.6时，接种于5L发酵罐中；发酵条件为：2％接种量，37℃培养至OD600为0.8左右时加250ng/ml aTc、1mM IPTG30℃诱导，搅拌转速400r/min，通气量1vvm，2M NaOH 维持pH为6.8～7.2；培养基配方为：M9盐溶液、8g/L葡萄糖、2mM MgSO4、0.1mM CaCl2、50ug/ml硫酸卡那霉素。
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