CN112126613B - 一株重组茂原链霉菌及其在生产谷氨酰胺转氨酶中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株重组茂原链霉菌及其在生产谷氨酰胺转氨酶中的应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种可高产谷氨酰胺转氨酶的重组茂原链霉菌smY2019‑nC，此重组茂原链霉菌smY2019‑nC是通过在茂原链霉菌smY2019的基因组上整合若干核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的谷氨酰胺转氨酶基因表达框获得的；将此重组茂原链霉菌smY2019‑nC接种至发酵培养基中发酵72h，即可使发酵液中谷氨酰胺转氨酶的酶活高达40U/mL，较野生型茂原链霉菌smY2019提高了100％，因此，此重组茂原链霉菌smY2019‑nC在生产谷氨酰胺转氨酶上具有极高的应用前景。

Description

一株重组茂原链霉菌及其在生产谷氨酰胺转氨酶中的应用

技术领域

本发明涉及一株重组茂原链霉菌及其在生产谷氨酰胺转氨酶中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TGase)是一类可以通过酰基转移反应在谷氨酰胺残基和多种伯胺之间引入共价交联的酶。由于这种独特的催化能力，谷氨酰胺转氨酶已经被广泛应用于食品、饲料、生物医学工程、材料科学、纺织品和皮革加工等领域。

谷氨酰胺转氨酶广泛分布于脊椎动物、无脊椎动物、软体动物、植物和微生物中，不同来源的谷氨酰胺转氨酶具有不同的特性，其中，微生物来源的谷氨酰胺转氨酶不依赖Ca²⁺的存在，易于提取和分离，因此，微生物来源的谷氨酰胺转氨酶的生产得到广泛了研究。

目前，谷氨酰胺转氨酶已成功在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、解酯耶式酵母和毕赤酵母中实现表达，但是，这些宿主表达的是没有活性的酶原形式pro-TGase，需要后期添加额外的蛋白酶进行活化处理，或者，需要在宿主中共表达酶原激活蛋白酶才会获得活性，这无疑又增加了谷氨酰胺转氨酶的生产成本和宿主的代谢负担(具体可见参考文献：Heterologous signal peptides-directing secretion of Streptomycesmobaraensis transglutaminase by Bacillus subtilis和Expression of recombinanttransglutaminase gene in Pichia pastoris and its uses in restructured meatproducts)。

茂原链霉菌自身可以产生酶原激活蛋白，直接分泌成熟的TGase，不需要进行额外的后期活化处理或者共表达其它激活蛋白酶，因此，利用茂原链霉菌来实现谷氨酰胺转氨酶的生产也得到了广泛的研究。但是，现有的茂原链霉菌产谷氨酰胺转氨酶的产量并不高，例如，张莉莉等人将S.mobaraensis DSM40587接种至发酵培养基中发酵96h，仅可使发酵液中谷氨酰胺转氨酶的酶活达4.3U/mL(具体可见参考文献：Enhancement oftransglutaminase production in Streptomyces mobaraensis as achieved bytreatment with excessive MgCl₂)；田淑翠等人将诱变菌M-8接种至发酵培养基中发酵40h，仅可使发酵液中谷氨酰胺转氨酶的酶活达5.1U/mL(具体可见参考文献：常压室温等离子体(ARTP)诱变茂源链霉菌菌株)，这大大阻碍了微生物来源谷氨酰胺转氨酶的大规模工业化生产。

急需找到一种可高产谷氨酰胺转氨酶的茂原链霉菌。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种可高产谷氨酰胺转氨酶的茂原链霉菌。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种重组茂原链霉菌，所述重组茂原链霉菌的基因组整合有一个或一个以上谷氨酰胺转氨酶基因表达框；所述谷氨酰胺转氨酶基因表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组茂原链霉菌以茂原链霉菌(streptomycesmobaraensis)smY2019为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组茂原链霉菌的基因组整合有两个谷氨酰胺转氨酶基因表达框。

在本发明的一种实施方式中，当重组茂原链霉菌的基因组整合有一个谷氨酰胺转氨酶基因表达框时，所述方法包含如下步骤：

(1)通过PCR扩增获得带有酶切位点的的谷氨酰胺转氨酶基因表达框；

(2)将步骤(1)获得的带有酶切位点的的谷氨酰胺转氨酶基因表达框和整合型载体经酶切后连接，得到携带有一个谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体；

(3)将步骤(2)获得的携带有一个谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体导入茂原链霉菌中，得到重组茂原链霉菌；

当重组茂原链霉菌的基因组整合有一个以上谷氨酰胺转氨酶基因表达框时，所述方法包含如下步骤：

(1)通过PCR扩增获得带有酶切位点的的谷氨酰胺转氨酶基因表达框；

(2)将步骤(1)获得的带有酶切位点的的谷氨酰胺转氨酶基因表达框和整合型载体经酶切后连接，得到携带有一个谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体；

(3)将步骤(2)获得的携带有一个谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体经酶切，得到线性化的重组载体；

(4)将线性化的重组载体和步骤(1)获得的带有酶切位点的的谷氨酰胺转氨酶基因表达框连接，得到携带有两个谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体；

(5)在步骤(4)获得的携带有两个谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体的基础上，重复步骤(3)～(4)，得到携带有两个以上谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体；

(6)将步骤(4)获得的携带有两个谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体或步骤(5)获得的携带有两个以上谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体导入茂原链霉菌中，得到重组茂原链霉菌。

在本发明的一种实施方式中，所述整合型载体为pSET152质粒、pIB139质粒或pIJ8600质粒。

本发明还提供了一种生产谷氨酰胺转氨酶的方法，所述方法为先将上述重组茂原链霉菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有谷氨酰胺转氨酶的发酵液，然后将含有谷氨酰胺转氨酶的发酵液进行分离，获得谷氨酰胺转氨酶。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为28～32℃、转速为200～220rpm、pH为7.0～7.4。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含甘油15～30g·L^-1、酵母粉5～10g·L^-1、胰蛋白胨15～30g·L^-1、大豆粉15～30g·L^-1、KH₂PO₄1～3g·L^-1、K₂HPO₄1～3g·L^-1以及MgSO₄1～3g·L^-1。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含甘油20g·L^-1、酵母粉5g·L^-1、胰蛋白胨20g·L^-1、大豆粉20g·L^-1、KH₂PO₄2g·L^-1、K₂HPO₄2g·L^-1以及MgSO₄2g·L^-1。

本发明还提供了上述重组茂原链霉菌或上述重组茂原链霉菌的制备方法或上述生产谷氨酰胺转氨酶的方法在生产谷氨酰胺转氨酶中的应用。

[有益效果]

(1)本发明提供了一种可高产谷氨酰胺转氨酶的重组茂原链霉菌smY2019-nC，此重组茂原链霉菌smY2019-nC是通过在茂原链霉菌smY2019的基因组上整合若干核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的谷氨酰胺转氨酶基因表达框获得的；将此重组茂原链霉菌smY2019-nC接种至发酵培养基中发酵72h，即可使发酵液中谷氨酰胺转氨酶的酶活高达40U/mL，较野生型茂原链霉菌smY2019提高了100％，因此，此重组茂原链霉菌smY2019-nC在生产谷氨酰胺转氨酶上具有极高的应用前景。

(2)本发明提供了一种生产谷氨酰胺转氨酶的方法，此方法为将重组茂原链霉菌smY2019-nC接种至发酵培养基中进行发酵；使用此方法，仅需将重组茂原链霉菌smY2019-nC接种至发酵培养基中发酵72h，即可使发酵液中谷氨酰胺转氨酶的酶活高达40U/mL，因此，此方法在生产谷氨酰胺转氨酶上具有极高的应用前景。

生物材料保藏

一株茂原链霉菌(streptomyces mobaraensis)smY2019，所述茂原链霉菌(streptomyces mobaraensis)smY2019已于2020年09月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020507，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

附图说明

图1：重组质粒pSET152-nTG(n＝1、2、3、4)和重组茂原链霉菌smY2019-nC(n＝2、3、4、5)的构建示意图。

图2：不同茂原链霉菌发酵所得的发酵液中谷氨酰胺转氨酶的酶活。

图3：不同茂原链霉菌发酵所得的发酵液的SDS-PAGE分析结果；其中，1为茂原链霉菌(streptomyces mobaraensis)smY2019，2为重组茂原链霉菌smY2019-2C，3为重组茂原链霉菌smY2019-3C，4为重组茂原链霉菌smY2019-4C，5为重组茂原链霉菌smY2019-5C。

具体实施方式

下述实施例中涉及的pSET152质粒购自淼灵生物科技有限公司；下述实施例中涉及的α-N-CBZ-Gln-Gly购自sigma公司；下述实施例中涉及的无甲基化大肠杆菌ET12567/pUZ8002购自Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g·L^-1、氯化钠10g·L^-1、酵母粉5g·L^-1。

LB固体培养基：蛋白胨10g·L^-1、氯化钠10g·L^-1、酵母粉5g·L^-1、琼脂粉20g·L^-1。

2×YT培养基：蛋白胨16g·L^-1、氯化钠4g·L^-1、酵母粉10g·L^-1。

GYM液体培养基：酵母提取物10g·L^-1、麦芽提取物4g·L^-1、葡萄糖10g·L^-1。

GYM固体培养基：酵母提取物10g·L^-1、麦芽提取物4g·L^-1、葡萄糖10g·L^-1、琼脂粉20g·L^-1。

MS液体培养基：甘露醇20g·L^-1、黄豆粉10g·L^-1、MgCl₂ 10mmol·L^-1，自然pH。

MS固体培养基：甘露醇20g·L^-1、黄豆粉10g·L^-1、琼脂20g·L^-1、MgCl₂ 10mmol·L^-1，自然pH。

种子培养基：甘油20g·L^-1、酵母粉5g·L^-1、胰蛋白胨20g·L^-1、K₂HPO₄ 2g·L^-1、MgSO₄ 2g·L^-1，pH 7.2。

发酵培养基：甘油20g·L^-1、酵母粉5g·L^-1、胰蛋白胨20g·L^-1、大豆粉20g·L^-1、KH₂PO₄ 2g·L^-1、K₂HPO₄ 2g·L^-1、MgSO₄ 2g·L^-1，pH 7.2-7.4。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

谷氨酰胺转氨酶酶活测定方法：比色法；

以α-N-CBZ-Gln-Gly作为底物，以L-谷氨酸-γ-单羟氨酸做标准曲线，取3mL发酵液离心取上清作为粗酶液。酶活测定反应体系：60μL粗酶液、150μL底物溶液、60μL终止剂。酶活测定过程：将60μL粗酶液加入到150μL反应体系中，37℃保温反应10min，添加60μL终止剂终止反应，得到反应液；取200μL反应液在525nm下测定吸光度，按照标准曲线换算酶活；

其中，终止剂为：

A.1.2.2.1 3mol/L(将36％的HCl用水稀释4倍)；

A.1.2.2.2 12％三氯乙酸(TCA)(称取12.00g的TCA于100mL的容量瓶中，加水定容至100mL)；

A.1.2.2.3 5％FeCl₃溶于0.1mol/LHCl中(称取5.00g FeCl₃.6H₂O于100mL容量瓶中，加0.1mol/L的HCl溶解并定容至100mL)

A.1.2.2.4使用时再将三种溶液等量混合，并用磁力搅拌器混合均匀。

谷氨酰胺转氨酶酶活的定义：在37℃、pH6.0的条件下下，将每分钟催化底物产生1μmol的单羟肟酸所需的酶量定义为一个酶活力单位(1U)。

实施例1：重组质粒pSET152-nTG(n＝1、2、3、4)和重组茂原链霉菌smY2019-nC(n＝2、3、4、5)的构建

具体步骤如下：

1、重组质粒pSET152-nTG(n＝1、2、3、4)的构建

以茂原链霉菌(streptomyces mobaraensis)smY2019的基因组为模板，以primer-F和primer-R为引物进行PCR扩增，得到核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的谷氨酰胺转氨酶基因表达框；将谷氨酰胺转氨酶基因表达框和pSET152质粒经限制性内切酶Xba I和BamH I酶切后进行连接，得到携带有一个谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体pSET152-1TG；将重组载体pSET152-1TG经限制性内切酶Xba I和Bgl II酶切，得到线性化的重组载体；将线性化的重组载体和谷氨酰胺转氨酶基因表达框连接，得到携带有两个谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体pSET152-2TG；重复上述步骤，获得携带有三个谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体pSET152-3TG和携带有四个谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体pSET152-4TG(重组质粒的构建过程见图1)；

其中，PCR扩增引物为：

primer-F:5’-TGCTCTAGAGGAGAGATCTGACGGAGTGGCCGGTTTTGGAGCC-3’(SEQ IDNo.2)；

primer-R:5’-CGGGATCCCACGACGGGCCACGAGCTGTAGAGCC-3’(SEQ ID No.3)。

2、重组茂原链霉菌smY2019-nC(n＝2、3、4、5)的构建

将步骤1获得的重组质粒pSET152-nTG(n＝1、2、3、4)分别转化无甲基化大肠杆菌ET12567/pUZ8002，得到转化产物；将转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃培养8h，得到培养液；将培养液按3％(v/v)的接种量接种至LB液体培养基中(含安普霉素50μg·mL^-1、氯霉素25μg·mL^-1和卡那霉素25μg·mL^-1)，于37℃培养6h至OD₆₀₀为0.5，得到菌液；收集10mL菌液，将菌液离心取沉淀；将沉淀用预冷至4℃的LB液体培养基漂洗两次后，重悬于0.5mL 2×YT培养基中，得到重悬液，重悬液置于冰上备用；

将茂原链霉菌(streptomyces mobaraensis)smY2019涂布于GYM固体培养基上，于30℃培养7d至GYM固体培养基上长满孢子；将GYM固体培养基上的孢子全部刮到10mL无菌水中，用玻璃珠打散后用无菌滤纸过滤，得到孢子悬浮液；将孢子悬浮液用50℃水浴热激10min后冷却至室温(25℃)，得到预处理后的孢子悬浮液；在预处理后的孢子悬浮液中加入等体积的2×YT培养基混合均匀，于37℃、220rpm摇床培养3h进行萌发，得到萌发液；

取100μL重悬液和100μL萌发液于离心管中混匀后，先静置2min，然后于30℃培养1h，得到混合液；将混合液涂布于MS固体培养基上，于30℃恒温培养箱中倒置培养14d后，在MS固体培养基上涂布安普霉素和萘啶酮酸至终浓度分别为50μg·mL^-1和25μg·mL^-1，于30℃恒温培养箱中继续倒置培养至接合转移子在MS固体培养基上长出；挑取接合转移子接种至MS液体培养基中，于30℃培养24h后提取质粒进行PCR验证以及测序验证，验证正确即获得基因组上分别整合有重组质粒pSET152-nTG(n＝1、2、3、4)的重组茂原链霉菌smY2019-nC(n＝2、3、4、5)；

其中，PCR验证引物为：

attp-ver-F:5’-GAAGGTGCCGTCGATGATGTACGTGACCGTC-3’(SEQ ID No.4)；

attp-ver-R:5’-GGAGGGCGACATGCCTGCTGTAACTGC-3’(SEQ ID No.5)。

实施例2：谷氨酰胺转氨酶的生产

具体步骤如下：

将茂原链霉菌(streptomyces mobaraensis)smY2019和实施例1获得的重组茂原链霉菌smY2019-nC(n＝2、3、4、5)分别涂布于GYM固体培养基上，于30℃培养5d至GYM固体培养基上长出孢子；将GYM固体培养基上的孢子分别刮到无菌水中，用玻璃珠打散后用无菌滤纸过滤，得到孢子悬浮液；用无菌水分别将孢子悬浮液的浓度调整为1×10⁷个/mL后，分别取50μL孢子悬浮液接种至种子培养基中，于30℃培养24h，得到种子液；将种子液分别按照8％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，于30℃发酵72h，得到发酵液。

通过细胞干重法检测茂原链霉菌(streptomyces mobaraensis)smY2019和实施例1获得的重组茂原链霉菌smY2019-nC(n＝2、3、4、5)发酵获得的发酵液的菌体干重(检测结果见图2)，检测茂原链霉菌(streptomyces mobaraensis)smY2019和实施例1获得的重组茂原链霉菌smY2019-nC(n＝2、3、4、5)发酵获得的发酵液中谷氨酰胺转氨酶的酶活(检测结果见图2)，并且，对茂原链霉菌(streptomyces mobaraensis)smY2019和实施例1获得的重组茂原链霉菌smY2019-nC(n＝2、3、4、5)发酵获得的发酵液进行SDS-PAGE分析(分析结果见图3)。

由图2可知，与茂原链霉菌(streptomyces mobaraensis)smY2019相比，重组茂原链霉菌smY2019-nC(n＝2、3、4、5)发酵获得的发酵液的生物量有小幅度的下降，但是，谷氨酰胺转氨酶的酶活有明显上升，其中，重组茂原链霉菌smY2019-2C、smY2019-3C、smY2019-4C、smY2019-5C发酵获得的发酵液中谷氨酰胺转氨酶的酶活分别为30U/mL、40U/mL、38U/mL和37U/mL，分别较茂原链霉菌(streptomyces mobaraensis)smY2019(20U/mL)提高了50％、100％、90％和85％。

由图3可知，与茂原链霉菌(streptomyces mobaraensis)smY2019相比，重组茂原链霉菌smY2019-nC(n＝2、3、4、5)发酵获得的发酵液中的蛋白表达量也明显增加。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一株重组茂原链霉菌及其在生产谷氨酰胺转氨酶中的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1766

<212> DNA

<213> 茂原链霉菌

<400> 1

gacggagtgg ccggttttgg agccgtggtg ttgccgggga gttaactggg agatataatc 60

acttctcgta gcgacccgat cactcgtccg ggagtcgaga agtgttacgc cgaaccccat 120

tccgcaccat cacccctgcc gccgtgaccg cggccggcag tctgcctctc gccgagagag 180

ccacccggag aaccgcccgg acggggtccg cttcaccgct ccggtgacgg cttcgacgta 240

acacgaccgc gccgtcaccg gccgtatccg gtacgcaccg catccccatt ccgccgtgcg 300

gccgcggcct cttcctcacc gccgttaccg gcgcggcacc gcaggacggg caccgcccga 360

cgttatgcgc ggccactcgc cgcaacctcc accccccgcg tcgcactctg gcatgccctc 420

gttccgcgag gttcgccaga ttcagccctt tcgtcacgtt cgccaaagga gttgttgttc 480

ttcatgtccc aacgcgggag aactctcgtc ttcgccgctc tcggtgcggt catgtgcacc 540

accgcgttaa tgccgtccgc aggcgcggcc accggcagtg gcagtggcag cggcaccggg 600

gaagagaaga ggtcctacgc cgaaacgcac cgcctgacgg cggatgacgt cgacgacatc 660

aacgcgctga acgaaagcgc tccggccgct tcgagcgccg gtccgtcctt ccgggccccc 720

gactccgacg agcgggtgac tcctcccgcc gagccgctcg accggatgcc cgacccgtac 780

cggccctcgt acggcagggc cgagacgatc gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag 840

gtctacagcc accgcgacgg caggaaacag cagatgaccg aggaacagcg ggagtggctg 900

tcctacggtt gcgtcggtgt cacctgggtc aactcgggcc agtatccgac gaacaggctg 960

gctttcgcgt tcttcgacga ggacaagtac aagaacgagc tgaagaacgg caggccccgg 1020

tccggcgaaa cgcgggcgga gttcgagggg cgcgtcgcca aggacagctt cgacgaggcg 1080

aaggggttcc agcgggcgcg tgacgtggcg tccgtcatga acaaggccct ggagaacgcc 1140

cacgacgagg gggcgtacct cgacaacctc aagaaggagc tggcgaacgg caacgacgcc 1200

ctgcggaacg aggatgcccg ctcgcccttc tactcggcgc tgcggaacac gccgtccttc 1260

aaggaccgca acggcggcaa tcacgacccg tccaagatga aggccgtcat ctactcgaag 1320

cacttctgga gcggccagga ccggtcgggc tcctccgaca agaggaagta cggcgacccg 1380

gaggccttcc gccccgaccg cggcaccggc ctggtcgaca tgtcgaggga caggaacatt 1440

ccgcgcagcc ccaccagccc cggcgagagt ttcgtcaatt tcgactacgg ctggttcgga 1500

gcgcagacgg aagcggacgc cgacaagacc gtatggaccc acggcaacca ctaccacgcg 1560

cccaatggca gcctgggtgc catgcacgtg tacgagagca agttccgcaa ctggtccgac 1620

ggttactcgg acttcgaccg cggagcctac gtggtcacgt tcgtccccaa gagctggaac 1680

accgcccccg acaaggtgac acagggctgg ccgtgatgta agcggggagg ggaggggagg 1740

cggagcatcc ggctcccctc cccacc 1766

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgctctagag gagagatctg acggagtggc cggttttgga gcc 43

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgggatccca cgacgggcca cgagctgtag agcc 34

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaaggtgccg tcgatgatgt acgtgaccgt c 31

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggagggcgac atgcctgctg taactgc 27

Claims (8)

1.一种重组茂原链霉菌，其特征在于，所述重组茂原链霉菌的基因组整合有1~5个谷氨酰胺转氨酶基因表达框；所述谷氨酰胺转氨酶基因表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述重组茂原链霉菌以茂原链霉菌（streptomyces mobaraensis）smY2019为宿主，所述茂原链霉菌（streptomyces mobaraensis）smY2019已于2020年09月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2020507，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

2.如权利要求1所述的一种重组茂原链霉菌的制备方法，其特征在于，当重组茂原链霉菌的基因组整合有一个谷氨酰胺转氨酶基因表达框时，所述方法包含如下步骤：

（1）通过PCR扩增获得带有酶切位点的谷氨酰胺转氨酶基因表达框；

（2）将步骤（1）获得的带有酶切位点的谷氨酰胺转氨酶基因表达框和整合型载体经酶切后连接，得到携带有一个谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体；

（3）将步骤（2）获得的携带有一个谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体导入茂原链霉菌中，得到重组茂原链霉菌；

当重组茂原链霉菌的基因组整合有一个以上谷氨酰胺转氨酶基因表达框时，所述方法包含如下步骤：

（1）通过PCR扩增获得带有酶切位点的谷氨酰胺转氨酶基因表达框；

（2）将步骤（1）获得的带有酶切位点的谷氨酰胺转氨酶基因表达框和整合型载体经酶切后连接，得到携带有一个谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体；

（3）将步骤（2）获得的携带有一个谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体经酶切，得到线性化的重组载体；

（4）将线性化的重组载体和步骤（1）获得的带有酶切位点的谷氨酰胺转氨酶基因表达框连接，得到携带有两个谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体；

（5）在步骤（4）获得的携带有两个谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体的基础上，重复步骤（3）~（4），得到携带有两个以上谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体；

（6）将步骤（4）获得的携带有两个谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体或步骤（5）获得的携带有两个以上谷氨酰胺转氨酶基因表达框的重组载体导入茂原链霉菌中，得到重组茂原链霉菌。

3.如权利要求2所述的一种重组茂原链霉菌的制备方法，其特征在于，所述整合型载体为pSET152质粒、pIB139质粒或pIJ8600质粒。

4.一种生产谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于，所述方法为先将权利要求1所述的重组茂原链霉菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有谷氨酰胺转氨酶的发酵液，然后将含有谷氨酰胺转氨酶的发酵液进行分离，获得谷氨酰胺转氨酶。

5.如权利要求4所述的一种生产谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于，所述发酵的温度为28~32℃、转速为200~220rpm、pH为7.0~7.4。

6.如权利要求4所述的一种生产谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含甘油15~30 g×L^-1、酵母粉5~10 g×L^-1、胰蛋白胨15~30 g×L^-1、大豆粉15~30 g×L^-1、KH₂PO₄1~3 g×L^-1、K₂HPO₄1~3 g×L^-1以及MgSO₄1~3 g×L^-1。

7.如权利要求6所述的一种生产谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含甘油20 g×L^-1、酵母粉5 g×L^-1、胰蛋白胨20 g×L^-1、大豆粉20 g×L^-1、KH₂PO₄2 g×L^-1、K₂HPO₄ 2 g×L^-1以及MgSO₄ 2 g×L^-1。

8.权利要求1所述的重组茂原链霉菌在生产谷氨酰胺转氨酶中的应用。

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