CN105238717B - 一种高产β-淀粉酶的弯曲芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产β‑淀粉酶的弯曲芽孢杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明的弯曲芽孢杆菌于2015年6月14保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M 2015368。本发明的弯曲芽孢杆菌，β‑淀粉酶活达到121U/mL，其生产的β‑淀粉酶的最适pH7.0、最适温度为50℃、在50℃条件下半衰期可达26h。利用本发明的β‑淀粉酶以10％马铃薯淀粉液化液为底物，在pH6.0，50℃条件下与普鲁蓝酶复配进行糖化，主要产物为麦芽糖和麦芽三糖，糖化24h麦芽糖转化率超过75％，可用于高麦芽糖浆制备、啤酒等食品发酵行业。
Description
技术领域
本发明涉及一种高产β-淀粉酶的弯曲芽孢杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
β-淀粉酶又称为麦芽糖苷酶、糖原淀粉酶，其系统名为α-1,4-葡聚糖-4-麦芽糖水解酶(α-1,4-Dglucan maltohydrolase)，E.C.编号为3.2.1.2.，作用于淀粉时，从其非还原性末端顺次切下麦芽糖，水解产物是β-麦芽糖、β-极限糊精及非常少量的β-葡萄糖。β-淀粉酶具有相当大的工业应用价值，长期以来植物来源的大麦β-淀粉酶一直被广泛用于多个领域。例如,在啤酒发酵业中部分代替大麦芽用于啤酒的生产，在食品业中用于水解淀粉制造麦芽糖浆和饴糖等。自1974年Higashihara等人首次确定巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)胞外淀粉酶含有β-淀粉酶以来,相继发现了几种能够产生该酶的微生物，这些菌株大都属于细菌，如蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、高温放线菌(Thermeoactinomyces sp.)和热硫梭菌(Clostridiumthermosulfurogenes)等。与植物β-淀粉酶相比，微生物来源的β-淀粉酶具有便于大规模工业化生产的优点，因此筛选寻找理想的微生物β-淀粉酶源成为淀粉酶研究应用领域的一个重要目标。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种高产β-淀粉酶的弯曲芽孢杆菌(B.flexus)，于2015年6月14号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2015368，保藏地址为中国武汉武汉大学。
所述弯曲芽孢杆菌，系从菜地土壤中分离得到的。
弯曲芽孢杆菌的筛选方法是从菜地土壤中经平板菌落特征初筛，采用一级发酵逐一摇瓶培养，得到的菌液离心取上清。取适量上清液加入到装有15mL10％可溶性淀粉溶液的三角瓶中，在50℃水浴摇床中摇24h，所得产物经HPLC检测发现以麦芽糖为主，则此酶为β-淀粉酶。经酶活测定，比较β-淀粉酶活性大小而得到产量较高的菌株。对该菌株进行16SrDNA鉴定，鉴定为弯曲芽孢杆菌。
本发明的第二个目的是提供一种利用所述弯曲芽孢杆菌生产β-淀粉酶的方法。
所述方法是以弯曲芽孢杆菌CCTCC NO:M2015368为生产菌株，经种子培养和液体深层发酵制得β-淀粉酶。
在本发明的一种实施方式中，所述液体深层发酵是在37℃、200rpm下发酵时间36h。
在本发明的一种实施方式中，所述液体深层发酵使用的发酵培养基含有：可溶性淀粉15g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、氯化钠5g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养是在温度37℃、摇床转速200rpm下培养时间为10-12h；其中所用的种子培养基含有：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。
本发明还要求保护所述弯曲芽孢杆菌生产的β-淀粉酶及其应用，尤其是食品领域的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种高产β-淀粉酶的弯曲芽孢杆菌，β-淀粉酶活达到121U/mL。本发明菌株生产的β-淀粉酶的最适pH7.0、最适温度为50℃、在50℃条件下半衰期可达26h。利用本发明的β-淀粉酶以10％马铃薯淀粉液化液为底物，在pH6.0，50℃条件下与普鲁蓝酶复配进行糖化，主要产物为麦芽糖和麦芽三糖，糖化24h麦芽糖转化率超过75％，可用于高麦芽糖浆制备、啤酒等食品发酵行业。
生物材料保藏：
弯曲芽孢杆菌，分类学命名为弯曲芽孢杆菌FB-2014-6Bacillus flexus FB-2014-6，于2015年6月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2015368。
附图说明
图1：β-淀粉酶最适pH值；
图2：β-淀粉酶最适温度；
图3：β-淀粉酶热稳定性；
图4：β-淀粉酶糖化产物。
具体实施方式
一个β-淀粉酶酶活单位(1U)定义(U/mL)：1mL酶液在pH7.0，温度50℃，1h水解可溶性淀粉生产1mg麦芽糖所需的酶量称为一个酶活力单位。
测定方法：准确吸取0.5mL2％可溶性淀粉溶液，置于20mL比色管中，加0.4mL50mMpH7.0磷酸盐缓冲溶液，摇匀，于50℃水浴预热5min，准确加入100μL酶液，立即计时，摇匀，于50℃水浴准确保温酶解反应10min，立即加入DNS0.8mL，摇匀，并煮沸5min，冰水中冷却。以同样条件下用缓冲液代替酶液的反应体系作为对照，上述反应体系加10.2mL蒸馏水，混匀，1cm比色皿，540nm波长下测吸光度(A)。根据吸光度求得测试酶液的浓度。
β-淀粉酶酶活计算公式：X＝(1.2736A540-0.0046)n
式中：
X—样品的酶活力，U/mL；
A540—540nm下吸光度之差；
n—样品的稀释倍数。
可溶性淀粉溶液(20g/L)：称取2.000g可溶性淀粉(以绝干计)于烧杯中，用少量水调成浆状物，边搅拌边缓慢加入50mL沸水中，然后用水分次冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌并加热至完全透明，用缓冲液冷却定容至100mL。淀粉溶液现配现用。
50mM磷酸缓冲液(pH＝7.0)：称取17.6g十二水合磷酸氢二钠和7.8g二水合磷酸二氢钠，分别用水溶解并定容至1000mL。取适量体积混合并用pH计校准至7.0后使用。
50mM Britton-Robinson Buffer Solution(伯瑞坦-罗比森缓冲溶液)：在100ml三酸混合液(磷酸、乙酸、硼酸，浓度均为0.04mol/L)中，加入适量体积的0.2mol/LNaOH，调至相应pH值。
实施例1：菌株筛选
按“五点取样法”分别从无锡市滨湖区5处菜地土壤采取土样10份，共30份土壤。从30份土样中中分离目的菌株。将取得的土壤样品取适量放入70～80℃烘箱中进行热处理，20～30min后称取5g干燥的土样加入到装有45mL无菌水的三角瓶中，静置10～20min，取上清液0.1mL梯度稀释(10-5，10-4，10-3)涂布于平板分离培养基上，于37℃培养箱中培养2-3天后测量D/d(水解圈直径/菌落直径)值，挑选值较大的进行初筛。首先挑取单菌落进行3-4次平板划线。然后接种到发酵培养基中进行液体振荡培养。培养温度为37℃，摇床转速为200rpm，培养时间为36h。培养液经过12000rpm离心5min，收集上清液，并进行酶活测定。从中选取酶活高的菌株进行划线传代培养，并对其转化可溶性淀粉的产物进行HPLC检测，最终得到一株产酶稳定且有较高酶活的β-淀粉酶产生菌株。对该菌株进行16SrDNA的PCR扩增、PCR扩增片断回收、T载体连接、重组载体的筛选，经琼脂糖电泳检测后把经过验证的重组载体送至上海生工生物技术有限公司测序，测序结果登录NCBI网站用BLAST进行核苷酸序列比对，鉴定为弯曲芽孢杆菌。将纯化的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，4℃保藏，保藏编号为CCTCC NO:M2015368，保藏机构是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市珞珈山武汉大学。
平板分离培养基(g/L)：蛋白胨10，可溶性淀粉10，酵母粉5，氯化钠10，琼脂粉15。
发酵培养基(g/L)：可溶性淀粉15，蛋白胨10，酵母粉10，氯化钠5。
发酵条件为：37℃，摇瓶转速200rpm，发酵时间36小时。
实施例2：菌株发酵产酶
从4℃保存的牛肉膏蛋白胨斜面上刮取一环菌种，置于装有10mL种子培养基的50mL三角瓶中进行种子培养。培养条件为：时间10-12h，温度37℃，摇床转速200rpm。再以5％接种量接入装有50mL发酵培养基的100mL三角瓶中进行发酵培养。培养条件：时间36h，温度37℃，摇床转速200rpm。即可得到酶活121U/mL的发酵液。
种子培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，pH7.0。
发酵培养基(g/L)：可溶性淀粉15，蛋白胨10，酵母粉10，氯化钠5。
发酵条件为：37℃，摇瓶转速200rpm，发酵时间36小时。
实施例3：β-淀粉酶的纯化
将发酵上清液于4℃，12000rpm离心10min除去细胞。将上清液置于磁力搅拌器中并缓缓加入45％固体硫酸铵盐，于4℃过夜盐析。然后4℃，12000rpm离心20min。取沉淀物用适量pH7.0，50mM磷酸-柠檬酸缓冲液溶解，通过0.4um透析膜过滤透析后得到浓缩酶样品。经过凝胶层析柱纯化后得到电泳纯的β-淀粉酶。
实施例4：β-淀粉酶的酶学性质
将纯化的β-淀粉酶以2％可溶性淀粉为底物进行酶学性质测定。配置pH值为4-11不同梯度的50mM Britton-Robinson Buffer Solution(伯瑞坦-罗比森缓冲溶液)，分别在不同pH条件下测量β-淀粉酶的酶活，结果表明该β-淀粉酶的最适pH7.0(图1)。在最适pH条件下设置不同温度梯度测量β-淀粉酶的酶活，得出最适温度为50℃(图2)，在50℃条件下半衰期可达26h(图3)。
实施例5：β-淀粉酶的应用
以10％的马铃薯淀粉溶液为底物，高温糊化后，首先用α-淀粉酶进行液化，调节pH至6.0，然后加入100U普鲁兰酶和500U本发明的β-淀粉酶。置于50℃水浴摇床中糖化24h，取样处理后利用HPLC进行产物分析。结果表明糖化主要产物为麦芽糖和麦芽三糖。麦芽糖含量为75.4％，葡萄糖含量小于1％(图4)。这表明本发明菌株生产的β-淀粉酶可用于高麦芽糖浆等生产。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (6)
1.一种弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)，其特征在于，所述弯曲芽孢杆菌于2015年6月14号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2015368，保藏地址为中国武汉大学。
2.一种利用权利要求1所述弯曲芽孢杆菌生产β-淀粉酶的方法。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法是以弯曲芽孢杆菌CCTCC NO:M2015368为生产菌株，经种子培养和液体深层发酵制得β-淀粉酶。
4.根据权利要求3所述的，其特征在于，所述液体深层发酵是在37℃、200rpm下发酵时间36h。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述液体深层发酵使用的发酵培养基含有：可溶性淀粉15g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、氯化钠5g/L。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述种子培养是在温度37℃、摇床转速200rpm下培养时间为10-12h；其中所用的种子培养基含有：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。
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