CN108660145A - 耐热型普鲁兰酶的编码基因及其重组表达和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌的耐热型普鲁兰酶的编码基因，及其重组表达和应用。本发明成功构建了含Plu_GS的重组质粒，从而获得多种高表达菌株，包括大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母菌及霉菌。本发明得到的重组宿主细胞，适于上述普鲁兰酶基因的表达。根据本发明的普鲁兰酶最适pH为6.0，在pH 5.0‑7.0保持较高酶活。最适温度65℃，且在60～70℃的热稳定性良好，在60℃保温3h，该普鲁兰酶仍保留90％以上的酶活，适于工业上应用的要求。通过薄层层析法和高效液相色谱分析鉴定该重组表达的普鲁兰酶为I型普鲁兰酶，能够水解普鲁兰多糖、支链淀粉和可溶性淀粉的α‑1，6‑糖苷键，不能水解支链淀粉和环糊精。

Description

耐热型普鲁兰酶的编码基因及其重组表达和应用

技术领域

本发明涉及生物技术及食品领域，具体涉及一种来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌具有较强热稳定性的普鲁兰酶的克隆，本发明还提供该普鲁兰酶编码基因重组质粒的构建、表达和酶学性质。

背景技术

普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)是一种淀粉脱支酶，已用于催化水解支链淀粉、普鲁兰多糖、α-和β-极限糊精的α-1,4-和α-1,6-糖苷键。普鲁兰酶是一种主要的脱支酶，可以特异性地水解分支点，当与葡糖淀粉酶一起使用时，可显着提高淀粉葡糖苷酶的利用率，并大大减少葡糖淀粉酶的需求(Bertoldo,C.,Antranikian,G.,Starch-hydrolyzing enzymes fromthermophilic archaea and bacteria.Curr.Opin.Chem.Biol.,2002,151-160)。在小麦发酵工业中，普鲁兰酶与真菌α-淀粉酶或葡糖淀粉酶结合使用生产低碳水化合物“轻啤”(M.,Bardowski,J.,Pullulan degrading enzymes of bacterialorigin.Crit.Rev.Microbiol.,2004,30,107-121)。Ⅰ型普鲁兰酶特异性水解普鲁兰多糖、支链淀粉和其他多糖中的α-1,6-糖苷键以产生麦芽三糖和线性寡糖。普鲁兰酶来源于各种生物体，如细菌(芽孢杆菌属，气杆菌属，克雷伯氏菌属)、真菌、酵母菌和高等植物(Han,T.,Zeng,F.,Li,Z.,Liu,L.,(Eds.),Biochemical characterization of a recombinantpullulanase from Thermococcus kodakarensis KOD1.Lett.Appl.Microbiol.,2013,57,336-343；Chen,W.-B.,Nie,Y.,Xu,Y.,Xiao,R.,Enhancement of extracellularpullulanase production from recombinant Escherichia coli by combined strategyinvolving auto-induction and temperature control.Bioprocess Biosyst Eng,2014,37,601-608；Orhan,N.,Kiymaz,N.A.,Peksel,A.,A novel pullulanase from a fungusHypocrea jecorina QM9414:production and biochemical characterization.Indian JBiochem Biophys,2014,51,149-155；Rajaei,S.,Heidari,R.,Shahbani Zahiri,H.,Sharifzadeh,S.,(Eds.),A novel cold-adapted pullulanase from Exiguobacteriumsp.SH3:Production optimization,purification,and characterization.2014,66,225-234)。其中微生物所产的普鲁兰酶生产成本相对较低且工业生产方便，许多研究者对其进行了相关研究，已经从多种来源中分离或表征了普鲁兰酶包括Bacillusthermoleovorans(Messaoud,E.B.,Ammar,Y.B.,Mellouli,L.,Bejar,S.,Thermostablepullulanase type I from new isolated Bacillus thermoleovorans US105_cloning,sequencing and expression of the gene in E.coli.Enzyme.Microb.Tech.,2002,31,827-832.)，Bacillus stearothermophilus(Kuriki,T.,Park,J.-H.,Imanaka,T.,Characteristics of thermostable pullulanase from Bacillus stearothermophilusand the nucleotide sequence of the gene.Journal of Fermentation andBioengineering,1990,69,204-210.)，Bacillus flavocaldarius(Suzuki,Y.,Hatagaki,K.,Oda,H.,A hyperthermostable pullulanase produced by an extreme thermophile,Bacillus flavocaldarius KP 1228,and evidence for the proline theory ofincreasing protein thermostability.Appl Microbiol Biotechnol,1991,34,707-714.)和Fernobacterium Pennavorans(KOCH,R.,CANGANELLA,F.,HIPPE,H.,JAHNKE,K.D.,(Eds.),Purification and Properties of a Thermostable Pullulanase from a NewlyIsolated Thermophilic Anaerobic Bacterium,Fervidobacterium pennavoransVen5.Appl.Environ.Microb.,1997,63,1088-1094)等，但由于产量低和高生产成本等原因造成了商业应用的局限性，采用克隆来自原始菌株的普鲁兰酶基因和在异源宿主中的表达的方法能有效解决这一困难。目前，许多普鲁兰酶基因已经被克隆和异源表达，并表征了其酶学性质，例如Bacillus thermoleovorans US105(Messaoud,E.B.,Ammar,Y.B.,Mellouli,L.,Bejar,S.,Thermostable pullulanase type I from new isolatedBacillus thermoleovorans US105_cloning,sequencing and expression of the genein E.coli.Enzyme.Microb.Tech.,2002,31,827-832)，嗜热栖热菌HB27(Wu,H.,Yu,X.,Chen,L.,Wu,G.,Cloning,overexpression and characterization of a thermostablepullulanase from Thermus thermophilus HB27.Protein Expres.Purif,2014,95,22-27)，多粘类芽孢杆菌Nws-pp2(Wei,W.,Ma,J.,Chen,S.Q.,Cai,X.H.,(Eds.),A novelcold-adapted type I pullulanase of Paenibacillus polymyxa Nws-pp2:in vivofunctional expression and biochemical characterization of glucanshydrolyzates analysis.BMC Biotechnol,2015,15,96)和Anoxybacillus sp.LM18-11(Xu,J.,Ren,F.,Huang,C.-H.,Zheng,Y.,(Eds.),Functional and structural studiesof pullulanase from Anoxybacillus sp.LM18-11.Proteins:Structure,Function andBioinformatics,2014,82,1685-1693)。此外，淀粉加工是通常采用60-65℃的反应温度，因此对普鲁兰酶的稳定性和耐热性要求较高，筛选新型高酶活且具有较好热稳定性的普鲁兰酶，具有重要的应用意义。工业化普鲁兰酶(2wan)产自嗜酸芽孢杆菌，该酶的最适pH为4.5～5.5(JENSEN B F,NORMAN B E.Bacillus acidopullulyticus pullulanase:application and regulatory aspects for use in the food industry[J].PROCESSBIOCHEMISTRY,1984,19(4):129-34)，在玉米淀粉发酵生产糖浆或抗性淀粉时，天然的pH为6.0左右，而2wan在该pH条件下酶活损失较大，需pH调至4.5～5.5后进行糖化，因此增加了能耗和发酵时长，故而筛选不同性质的普鲁兰酶以适应更广泛的工业需求具有重要的意义和商业化价值。

目前没有关于来自嗜热脂肪土芽孢杆菌普鲁兰酶的详细报道。本发明提供了对该普鲁兰酶的基因克隆、表达和酶学性质的表征。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种热稳定性优良、符合工业应用的需求、具有较大的应用潜力的耐热型普鲁兰酶的编码基因及其重组表达和应用。

为了实现上述目的，本发明的耐热Ⅰ型普鲁兰酶的编码基因及其重组表达和应用具体如下：

本发明提供了一种来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌的耐热型普鲁兰酶的编码基因，用于编码I型普鲁兰酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，记为plu_GS。

所述的耐热型普鲁兰酶基因与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有80％以上的一致性、更优的是具有85％以上的一致性或与所述SEQ ID NO:1所示序列具有90％以上的一致性。

本发明提供了一种根据所述的耐热型普鲁兰酶的编码基因，所述的编码I型普鲁兰酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示或其无义突变序列。

所述耐热型普鲁兰酶基因编码的蛋白序列与所述氨基酸序列具有80％以上的一致性，更优的是具有90％以上的一致性。

本发明提供了一种具有I型普鲁兰酶活性的氨基酸片段，所述的氨基酸片段为SEQID NO:2所示的氨基酸，记为Plu_GS，蛋白预测大小104KDa，pI为5.53。

本发明提供了一种含有编码所述的氨基酸片段的核苷酸序列的重组质粒，通过将所述的核苷酸序列克隆至载体pET-28a的多克隆位点而获得，记为pET-28a-plu_GS。

本发明提供了一种重组表达所述的具有I型普鲁兰酶活性的氨基酸片段的载体，所述的载体是细菌表达载体、酵母表达载体、霉菌表达载体或哺乳动物表达载体。

其中所述细菌表达载体是大肠杆菌表达载体或芽孢杆菌表达载体。

本发明提供了一种根据所述的重组表达的具有I型普鲁兰酶活性的氨基酸片段在环保、食品、或保健中的应用。例如，耐热型普鲁兰酶基因工程菌株在玉米淀粉加工、糖工业、氨基酸生产等工业上的应用。

本发明成功地获得了嗜热脂肪土芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilus普鲁兰酶基因和氨基酸序列。成功构建了含Plu_GS的大肠杆菌重组质粒，本发明得到的重组宿主细胞，适于上述普鲁兰酶基因的表达，在最佳诱导条件(20℃)诱导得到的重组表达蛋白的酶活为25.16U/ml。根据本发明的普鲁兰酶最适pH为6.0，最适温度65℃，且在60～70℃的热稳定性良好，在60℃保温3h，该普鲁兰酶仍保留90％以上的酶活，适于工业上应用的要求。通过薄层层析法和高效液相色谱分析鉴定该重组表达的普鲁兰酶为I型普鲁兰酶，能够水解普鲁兰多糖、支链淀粉和可溶性淀粉的α-1，6-糖苷键，不能水解支链淀粉和环糊精。

附图说明

图1a和图1b为：嗜热脂肪土芽孢杆菌普鲁兰酶大肠杆菌BL21重组菌在不同温度(20℃、30℃和37℃)下诱导表达的蛋白电泳图，其中M为蛋白Marker，1-3分别为20℃诱导条件下的全菌、上清、包涵体，4-6分别为30℃诱导条件下的全菌、上清、包涵体，7-9分别为37℃诱导条件下的全菌、上清、包涵体。

图2为：重组普鲁兰酶最适温度测定图示(pH7.0的条件下测定)。

图3为：重组普鲁兰酶热稳定性图示，分别在60℃、65℃和70℃保温6h，每隔1h取样冷却后测定残余酶活。

图4为：重组普鲁兰酶最适pH测定图示(65℃的条件下测定)。

图5为：重组普鲁兰酶pH耐受性测定图示，在4℃孵育1h后测定残余酶活。

图6为：重组普鲁兰酶水解普鲁兰多糖的产物薄层层析图，其中，G2表示麦芽糖；G3表示麦芽三糖；1表示未经水解的普鲁兰多糖；2表示PluGS水解1％普鲁兰多糖1h后的产物；3表示PluGS水解1％普鲁兰多糖3h后的产物，4表示PluGS水解0.1％普鲁兰多糖1h后的产物；5表示PluGS水解0.1％普鲁兰多糖3h后的产物。

图7a为：重组普鲁兰酶水解普鲁兰多糖高效液相色谱分析图。

图7b为：底物普鲁兰多糖和产物麦芽三糖标品高效液相色谱分析图。

图8为：重组普鲁兰酶底物谱分析图。

具体实施方式

为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进行进一步的描述。

下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂或者耗材，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1

普鲁兰酶基因的扩增

1.1菌株及其培养

本发明所述的普鲁兰酶基因克隆自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)。

本发明所述的嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)(DSMZ456)可以从德国微生物菌种保藏中心直接购买，菌种编号为DSMZ 456，其原始来源是在奥地利从甜菜汁中提取得到的。因此，本发明所述的嗜热脂肪土芽孢杆菌可通过商购途径获得，也可以通过野外采集和其他途径获得。

接种甘油菌至1号培养基，55℃培养2天收集菌体，用于基因组提取。

1.2基因组提取

参照Generay细菌基因组DNA快速提取试剂盒说明书。

1.3嗜热脂肪土芽孢杆菌普鲁兰酶基因的扩增

在NCBI上找到嗜热脂肪土芽孢杆菌相近种属普鲁兰酶的基因序列，设计引物并加入相应的酶切位点(EcoRⅠ/XhoⅠ)，其中：

456-PU 5'CCGGAATTCATGCTTCACATCAGCCGAACG 3'

456-PD 5'CCGCTCGAGCCCCGCAGGCTGGACGA 3'

进行pcr扩增，PCR体系为：

反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；保存在4℃。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收，连pMD19-T SimpleVector，菌落PCR验证阳性克隆送测序，测序由上海睿迪生物科技有限公司完成。由此获得嗜热脂肪土芽孢杆菌完整DNA序列。

将测序结果在NCBI上进行比对并分析表明，所获得的普鲁兰酶基因DNA由2154个核苷酸组成，序列如SEQ ID NO:1所示。

该DNA编码718个氨基酸，其序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例2

含有普鲁兰酶的大肠杆菌重组表达载体的构建及表达

2.1重组表达载体pET-28a-Plu_GS的构建

在大肠杆菌DH5α宿主菌大量克隆含嗜热脂肪土芽孢杆菌普鲁兰酶基因的pMD19-TSimple Vector，用AxyPrep质粒DNA提取试剂盒提取质粒(操作步骤参照说明书)，用EcoRⅠ和XhoⅠ(购自Themo)进行双酶切，切胶回收普鲁兰酶基因片段，然后与同样经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切的大肠杆菌表达载体pET-28a 16℃连接过夜，转化至大肠杆菌DH5α(购自天根生化科技(北京)有限公司)，PCR验证阳性克隆并测序；测序结果显示未发生移码等碱基突变，表明构建的重组表达载体pET-28a-Plu_GS可用。

2.2大肠杆菌系统表达及纯化蛋白

将含有普鲁兰酶基因的pET-28a-Plu_GS质粒转化至大肠杆菌表达菌BL21中，涂布于LB(含50μg/ml卡那霉素)平板，37℃倒置培养至转化子出现。用接种针挑取一个单克隆转化子接种至5ml LB(含50μg/ml卡那霉素)培养基中，37℃，250rpm培养过夜。次日取0.5mL过夜菌至50mL LB(含50μg/ml卡那霉素)中，37℃，250rpm培养，当菌密度(OD600)达到0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，分别在20℃、30℃、37℃，250rpm继续培养16小时。离心收集菌体，用pH 7.0，20mM磷酸盐缓冲溶液重悬菌体，超声破碎大肠杆菌细胞，高速离心收集上清，N1-NTA柱结合目的酶蛋白，用梯度浓度的咪唑洗脱蛋白。

图1a和图1b显示嗜热脂肪土芽孢杆菌普鲁兰酶大肠杆菌BL21重组菌在不同温度下(20℃、30℃、37℃)诱导表达及纯化的蛋白电泳图。

实施例3

普鲁兰酶酶活测定

3.1标准曲线绘制

取干净试管将试管标号，配制葡萄糖浓度梯度溶液，分别向试管中加入0.2-1.4mL(以0.2mL为间隔)的1％的葡萄糖溶液，以不加葡萄糖的试管做空白对照。每管做三个平行样品。分别向试管中补ddH₂O至总体积为2.0mL，再向试管中加入3mL DNS试剂，煮沸15min，立即加入10mL ddH₂O并预冷，在波长550nm处用分光光度计比色测量，并记下各试管对应的样品的光密度值再求其平均值，再绘制葡萄糖标准曲线，结果附图1所示。

3.2酶活测定

用DNS终止法来测量重组普鲁兰酶的酶活。

(1)适当稀释粗酶液(可做稀释梯度)，取75μL于试管中，并用煮沸10min灭活的粗酶液样品做空白对照。

(2)向每个试管中加入175μL磷酸盐缓冲液(pH 6.0)，混匀。

(3)加入250μL浓度为1％的普鲁兰多糖(Sigma)溶液，混匀。

(4)65℃下反应20min。

(5)从65℃水浴中取出，立即加入750μL DNS试剂终止反应，沸水浴中煮沸10min后迅速置于冰上。

(6)将上述各反应样品在550nm吸光度出测量其观密度值(用空白对照试管的样品调零分光光度计)。

普鲁兰酶酶活定义为：在所选取的条件下，每分钟分解普鲁兰多糖产生的还原糖，其还原力相当于1μmol葡萄糖所需要的酶量，以1U表示。

实施例4

重组普鲁兰酶的酶学性质测定

4.1最适反应温度测定：按标准反应体系分别在40℃、50℃、60℃、65℃、70℃和80℃温度下反应20min，然后用DNS法测定普鲁兰酶活力，其中酶活力最高的设为100％(如图2)。

如图2所示，表明重组普鲁兰酶的最适反应温度为65℃，在60℃和70℃条件下仍具有80％以上的酶活。

4.2最适pH值测定：分别配制pH 4.0～9.0的缓冲液，其中pH 4.0～5.5为20mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，pH 6.0～7.0为20mM的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液，pH 8.0～9.0为20mM的Tris-HCl缓冲液。按3.2的方法测定普鲁兰酶活力，其中酶活力最高的设为100％。

如图3所示，该酶的最适pH为6.0，在pH＝6.5时具有80％的酶活。

4.3热稳定性分析：将适量的酶液放置在60℃、65℃和70℃的恒温水浴中，每隔1h取样测定残余酶活力，以保温0min时的酶活力为100％。

如图4所示，该酶在60℃条件下稳定，在60℃保温3h，该普鲁兰酶仍保留90％以上的酶活，在65℃的半衰期为5h，在70℃保温4h，残余酶活仍达50％以上。表明该酶的热稳定性优良，符合工业应用的需求，具有较大的应用潜力。

4.4pH稳定性分析：将适量酶液分别置于pH 4.0-9.0的缓冲液中于4℃放置1h后，在普鲁兰酶最适条件下测定残余酶活力，其中酶活力最高的设为100％。

如图5所示，在pH6.0～8.0的区间内4℃孵育1h后均具有较好的pH稳定性。

实施例5

重组表达普鲁兰酶的酶学催化类型分析

由于不同类型的普鲁兰酶的应用不相同，其中，Ⅰ型普鲁兰酶在工业上的应用最广。为了鉴定重组表达普鲁兰酶的酶学催化类型，本发明使用两种方法对重组普鲁兰酶水解普鲁兰多糖和可溶性淀粉产物进行分析

1.薄层色谱分析TLC

取75μL纯酶液与250μL 1％的普鲁兰多糖/可溶性淀粉，在pH 6.0、温度65℃的条件下进行反应，以不含酶液(NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液补足体积)的样品为对照。反应三小时后，取出样品在沸水中煮沸10min，12,000rpm离心5-10min，取上清进行薄层色谱分析。色谱粘层时间约为两小时，展层结束后，将薄层层析板从展层杯中拿出，浸润在显色剂中，再立即用吹风机吹干。放入95℃的烘箱显色15min，即可看到产物的斑点。

根据IUBMB(International Union of Biochemistry and Molecular Biology)建立的两类分类标准，把普鲁兰酶分为多类，其中I型普鲁兰酶(Type I pullulanase，EC3.2.1.41)专一水解普鲁兰多糖的α-1，6-糖苷键产生麦芽三糖。本发明采用薄层层析法(TLC)对Plu_GS水解普鲁兰多糖的产物进行了分析，如图6所示，泳道G2-G3为麦芽二糖和麦芽三糖层析后位置；泳道1为未水解过的普鲁兰多糖(0min)；泳道2-3为PluGS水解1％普鲁兰多糖不同时间得到的产物(泳道2：1h；泳道3：3h)；泳道4-5为PluGS水解0.1％普鲁兰多糖不同时间得到的产物(泳道4：1h；泳道5：3h)。该图表明PluGS以内切方式水解普鲁兰多糖，1％普鲁兰多糖在3h内尚未水解完全，生成中间产物和终产物麦芽三糖；0.1％的普鲁兰多糖在1h内完全被水解成麦芽三糖。

2.高效液相色谱HPLC

将0.5U纯酶与500μL 1％的普鲁兰多糖，350μL最适pH缓冲液混匀，在最适温度下反应3h，取出反应液煮沸10min后12,000rpm离心15min，取上清进行超滤去除其他杂质并浓缩反应液。处理好的反应液即可进行液相色谱分析，所使用的柱子为Waters Sugar-pak1，检测器为示差检测器，流动相为双蒸水，流速为0.5mL/min，进样量10μL，柱温和检测器温度分别为75℃和35℃。

为了进一步鉴定PluGS的催化分类，本发明采用高效液相色谱对其水解普鲁兰多糖的产物进行了鉴定。如图7(a)所示，该普鲁兰酶水解普鲁兰多糖产物的出峰时间为7.244min，与标品麦芽三糖(如图7(b)所示)的出峰时间7.249min基本一致，还有一个单一峰峰出峰时间为5.235min，与普鲁兰多糖标品(如图7(b)所示)出峰时间4.902min近似，说明还有部分普鲁兰多糖底物未被完全降解，但产物峰为单一峰，这一结果说明该普鲁兰酶完全水解普鲁兰多糖产生麦芽三糖，因此普鲁兰酶Plu_GS属于I型普鲁兰酶。

实施例6

重组表达普鲁兰酶的底物特异性分析

用1％的普鲁兰多糖、支链淀粉、可溶性淀粉、直链淀粉、糖原、α-环糊精、γ-环糊精溶液，取75μL纯化后的酶液与250μL底物混合，于65℃反应20min，用DNS还原糖法测定重组普鲁兰酶对不同底物的水解酶活。将重组普鲁兰酶水解普鲁兰多糖的酶活设为100％，计算其水解淀粉、糖原等多糖的能力。

本发明还对Plu_GS酶解不同底物的情况进行分析，如图8所示，以水解最适底物普鲁兰酶的酶活为100％，Plu_GS还能够特异水解普鲁兰多糖、可溶性淀粉和支链淀粉，其水解可溶性淀粉能力约为水解普鲁兰多糖的44.5％，不能够水解直链淀粉，糖原和α-/γ-环糊精。说明Plu_GS属于I型普鲁兰酶，不能对α-1，4糖苷键作用，而能特异性水解α-1，6糖苷键。

实施例7

重组表达普鲁兰酶在玉米淀粉糖化中的应用

将玉米淀粉(购自北京索莱宝科技有限公司)配制成10％(质量比)的淀粉乳，用磁力搅拌器在100℃下糊化10min，调节温度至90℃后，加入0.8Uα-淀粉酶(40000U/mL，诺维信(中国)生物技术有限公司)液化30min，利用α-淀粉酶水解淀粉和淀粉水解物中的α-1,4糖苷键,使分子断裂为糊精和低聚糖，使底物分子数增加，糖化酶作用的机会增多，有利于下一步糖化反应。然后，调节温度至65℃，加入0.24UPlu_GS糖化30min，将反应产物取出煮沸10min终止反应，用HPLC检测反应产物。

综上，本发明成功地获得了嗜热脂肪土芽孢杆菌Geobacillusstearothermophilus普鲁兰酶基因和氨基酸序列。成功构建了含Plu_GS的大肠杆菌重组质粒，本发明得到的重组宿主细胞，适于上述普鲁兰酶基因的表达，在最佳诱导条件(20℃)诱导得到的重组表达蛋白的酶活为25.16U/ml。根据本发明的普鲁兰酶最适pH为6.0，最适温度65℃，且在60～70℃的热稳定性良好，在60℃保温3h，该普鲁兰酶仍保留90％以上的酶活，适于工业上应用的要求。通过薄层层析法和高效液相色谱分析鉴定该重组表达的普鲁兰酶为I型普鲁兰酶，能够水解普鲁兰多糖、支链淀粉和可溶性淀粉的α-1，6-糖苷键，不能水解支链淀粉和环糊精。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 耐热型普鲁兰酶的编码基因及其重组表达和应用

<130> 2018

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2154

<212> DNA

<213> 嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)

<400> 1

atgcttcaca tcagccgaac gtttgccgcc tatttggacg agatggatca aatcgttgtg 60

cttgcgccga aatcgctcgg ctttgatgga atggcgccgt ttacgctcgt ggcgccgagc 120

ggcgaggaga ttccgctgtc cgtgcagcac gtcgaggatg ttggggagac ggtgaaatat 180

gtgtgccggt ttgcatccgc gttcgagttt ggagcgacat actgggtgcg ttcttgccgc 240

ggggaggaga ccgatgttca aatcggcgcc gttgtgcgca ctcctgcatt tgatgatcgg 300

tttttctatg atggaccgtt aggagcggag tatctcaaag aacagacggt atttcgcgta 360

tgggcgccga ccgccaccgc ggttagcgtc aagctggttc atccgcatct cgacgagatc 420

cgctgcgtgc cgcttgtgcg cggcgaacgc ggcgtatggt cagccgtcgt ccccggcgat 480

tgggagcgag cgcgttacac atatatcgcc tgcatcaacc gcgtatggcg cgaggcagtg 540

gacccgtatg cgaccgcggt ttcggtcaat ggcgagttcg gcgtcgtgat cgactgggag 600

aaaacgaagc tggcgccgcc ctctttgccg cttccaccgc tctgttcgcc gacggatgcc 660

atcatttatg agctgagcat ccgcgacttt accagccacc cggacagcgg cgccgtccat 720

aaagggaagt atctcgggct ggccgaaacg aacacgagcg ggccgaacgg gacggccacc 780

gggctttcgt atgtcaaaga gctgggcgtc acccatgtgc agctcatgcc gtttatggac 840

tttgcgggcg tcgatgagcg cgacccacaa gcggcttaca actggggata caatcccctt 900

catctatatg cgccggaagg gagttatgcg accgatccag cggatccata cgcgcgcatt 960

gtagaattga agcaggcgat ccacacgctg cacgaaaatg gcttgcgcgt cgtgatggat 1020

gcggtctaca accatgtcta tgaccgggag caatcgccgc ttgagaagct cgttcccggt 1080

tattacttcc gctacgacgc ctatggccaa ccggccaacg gcaccggcgt cggcaacgac 1140

atcgcttcgg agcggcggat ggcgcgccgc tggatcgtcg attcggtggt gttttgggcg 1200

aaagaatatg gcattgacgg gttccgcttt gatttgatgg gcgtgcacga tatcgagacg 1260

atgaaagcgg tgcgcgatgc cctcgacgcc atcgatccgt cgatccttgt gtatggggaa 1320

gggtgggatt tgccgacgcc tcttccaccg gaacaaaagg cgacgatggc caacgccaag 1380

cagctgccgc gcttcgctta tttcaatgac cggtttcgcg atgcggtgaa agggagcacc 1440

tttcatttgc cggaccgtgg gttcgccctc ggcaacccag gcgggcgaga acaggtgaag 1500

ctcgccattg ccgggagctt gcgagcgctc ggcgggctgt tttgccaccc gcgtcagtca 1560

atcaattacg tcgaatgtca tgacaaccat acgttttggg ataagatgga ggcggccaac 1620

catgatgagc cggaatggct ccggcgaaag cggcaaaagc tggcgacggc gatcgttctg 1680

ttggcgcaag gcattccgtt tttgcacagc ggccaagagt tttatcggac gaaaggcggc 1740

gatgggaaca gctaccgatc gccggatgcg gtcaatcagc tggattggga gcggaaaagc 1800

cgctatgaag acgacgtccg ctacgttcaa ggattgatcg cccttcgccg tgcgcatggc 1860

gcatttcgcc tcgccacgga ggcggaagtg ctgcgtcatt tcacgtttct tgagccgctg 1920

ccgccgtcgg tcatcgccta ccgattgcat gatgccgccg cctatgggcc ttgggaggac 1980

atcatcgtcg tgcatcataa cgaggagaaa gagacagcca ttgcgctccc cgacgagcgc 2040

gagtgggcgg ttgtatgcga cggacagcga tgcgggacaa cgccctttgg ccaagcgcgc 2100

ggcatgcttc ggcttgacgg catcggcaca tgggtgctcg tccagcctgc gggg 2154

<210> 2

<211> 718

<212> PRT

<213> 嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)

<400> 2

Met Leu His Ile Ser Arg Thr Phe Ala Ala Tyr Leu Asp Glu Met Asp

1 5 10 15

Gln Ile Val Val Leu Ala Pro Lys Ser Leu Gly Phe Asp Gly Met Ala

20 25 30

Pro Phe Thr Leu Val Ala Pro Ser Gly Glu Glu Ile Pro Leu Ser Val

35 40 45

Gln His Val Glu Asp Val Gly Glu Thr Val Lys Tyr Val Cys Arg Phe

50 55 60

Ala Ser Ala Phe Glu Phe Gly Ala Thr Tyr Trp Val Arg Ser Cys Arg

65 70 75 80

Gly Glu Glu Thr Asp Val Gln Ile Gly Ala Val Val Arg Thr Pro Ala

85 90 95

Phe Asp Asp Arg Phe Phe Tyr Asp Gly Pro Leu Gly Ala Glu Tyr Leu

100 105 110

Lys Glu Gln Thr Val Phe Arg Val Trp Ala Pro Thr Ala Thr Ala Val

115 120 125

Ser Val Lys Leu Val His Pro His Leu Asp Glu Ile Arg Cys Val Pro

130 135 140

Leu Val Arg Gly Glu Arg Gly Val Trp Ser Ala Val Val Pro Gly Asp

145 150 155 160

Trp Glu Arg Ala Arg Tyr Thr Tyr Ile Ala Cys Ile Asn Arg Val Trp

165 170 175

Arg Glu Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Val Ser Val Asn Gly Glu

180 185 190

Phe Gly Val Val Ile Asp Trp Glu Lys Thr Lys Leu Ala Pro Pro Ser

195 200 205

Leu Pro Leu Pro Pro Leu Cys Ser Pro Thr Asp Ala Ile Ile Tyr Glu

210 215 220

Leu Ser Ile Arg Asp Phe Thr Ser His Pro Asp Ser Gly Ala Val His

225 230 235 240

Lys Gly Lys Tyr Leu Gly Leu Ala Glu Thr Asn Thr Ser Gly Pro Asn

245 250 255

Gly Thr Ala Thr Gly Leu Ser Tyr Val Lys Glu Leu Gly Val Thr His

260 265 270

Val Gln Leu Met Pro Phe Met Asp Phe Ala Gly Val Asp Glu Arg Asp

275 280 285

Pro Gln Ala Ala Tyr Asn Trp Gly Tyr Asn Pro Leu His Leu Tyr Ala

290 295 300

Pro Glu Gly Ser Tyr Ala Thr Asp Pro Ala Asp Pro Tyr Ala Arg Ile

305 310 315 320

Val Glu Leu Lys Gln Ala Ile His Thr Leu His Glu Asn Gly Leu Arg

325 330 335

Val Val Met Asp Ala Val Tyr Asn His Val Tyr Asp Arg Glu Gln Ser

340 345 350

Pro Leu Glu Lys Leu Val Pro Gly Tyr Tyr Phe Arg Tyr Asp Ala Tyr

355 360 365

Gly Gln Pro Ala Asn Gly Thr Gly Val Gly Asn Asp Ile Ala Ser Glu

370 375 380

Arg Arg Met Ala Arg Arg Trp Ile Val Asp Ser Val Val Phe Trp Ala

385 390 395 400

Lys Glu Tyr Gly Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Gly Val His

405 410 415

Asp Ile Glu Thr Met Lys Ala Val Arg Asp Ala Leu Asp Ala Ile Asp

420 425 430

Pro Ser Ile Leu Val Tyr Gly Glu Gly Trp Asp Leu Pro Thr Pro Leu

435 440 445

Pro Pro Glu Gln Lys Ala Thr Met Ala Asn Ala Lys Gln Leu Pro Arg

450 455 460

Phe Ala Tyr Phe Asn Asp Arg Phe Arg Asp Ala Val Lys Gly Ser Thr

465 470 475 480

Phe His Leu Pro Asp Arg Gly Phe Ala Leu Gly Asn Pro Gly Gly Arg

485 490 495

Glu Gln Val Lys Leu Ala Ile Ala Gly Ser Leu Arg Ala Leu Gly Gly

500 505 510

Leu Phe Cys His Pro Arg Gln Ser Ile Asn Tyr Val Glu Cys His Asp

515 520 525

Asn His Thr Phe Trp Asp Lys Met Glu Ala Ala Asn His Asp Glu Pro

530 535 540

Glu Trp Leu Arg Arg Lys Arg Gln Lys Leu Ala Thr Ala Ile Val Leu

545 550 555 560

Leu Ala Gln Gly Ile Pro Phe Leu His Ser Gly Gln Glu Phe Tyr Arg

565 570 575

Thr Lys Gly Gly Asp Gly Asn Ser Tyr Arg Ser Pro Asp Ala Val Asn

580 585 590

Gln Leu Asp Trp Glu Arg Lys Ser Arg Tyr Glu Asp Asp Val Arg Tyr

595 600 605

Val Gln Gly Leu Ile Ala Leu Arg Arg Ala His Gly Ala Phe Arg Leu

610 615 620

Ala Thr Glu Ala Glu Val Leu Arg His Phe Thr Phe Leu Glu Pro Leu

625 630 635 640

Pro Pro Ser Val Ile Ala Tyr Arg Leu His Asp Ala Ala Ala Tyr Gly

645 650 655

Pro Trp Glu Asp Ile Ile Val Val His His Asn Glu Glu Lys Glu Thr

660 665 670

Ala Ile Ala Leu Pro Asp Glu Arg Glu Trp Ala Val Val Cys Asp Gly

675 680 685

Gln Arg Cys Gly Thr Thr Pro Phe Gly Gln Ala Arg Gly Met Leu Arg

690 695 700

Leu Asp Gly Ile Gly Thr Trp Val Leu Val Gln Pro Ala Gly

705 710 715

Claims (10)

1.一种来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌的耐热型普鲁兰酶的编码基因，用于编码I型普鲁兰酶，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，记为plu_GS。

2.根据权利要求1所述的耐热型普鲁兰酶的编码基因，其特征在于，所述的编码I型普鲁兰酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其无义突变序列。

3.根据权利要求1所述的耐热型普鲁兰酶的编码基因，其特征在于，所述的耐热型普鲁兰酶的编码基因与SEQ ID NO:1所示序列具有80％以上的一致性。

4.根据权利要求1所述的耐热型普鲁兰酶的编码基因，其特征在于，所述的耐热型普鲁兰酶的编码基因编码的蛋白序列与所述氨基酸序列具有80％以上的一致性。

5.一种耐热型普鲁兰酶，其特征在于，所述耐热型普鲁兰酶是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其无义突变序列。

6.具有I型普鲁兰酶活性的氨基酸片段，其特征在于，所述的氨基酸片段为SEQ ID NO:2所示的氨基酸，记为Plu_GS，蛋白预测大小104KDa，pI为5.53。

7.含有编码权利要求6所述的氨基酸片段的核苷酸序列的重组质粒，其特征在于，通过将所述的核苷酸序列克隆至载体pET-28a的多克隆位点而获得，记为pET-28a-plu_GS。

8.一种重组表达权利要求6所述的具有I型普鲁兰酶活性的氨基酸片段的载体，其特征在于，所述的载体包括细菌表达载体、酵母表达载体、霉菌表达载体或哺乳动物表达载体；所述的细菌表达载体包括大肠杆菌表达载体或芽孢杆菌表达载体。

9.根据权利要求8所述的重组表达的具有I型普鲁兰酶活性的氨基酸片段在环保、食品、或保健中的应用。

10.根据权利要求8所述的重组表达的具有I型普鲁兰酶活性的氨基酸片段在玉米淀粉加工、糖工业、氨基酸生产上的应用。