CN114250215A

CN114250215A - 一种超嗜热ii型普鲁兰酶及应用

Info

Publication number: CN114250215A
Application number: CN202111483679.0A
Authority: CN
Inventors: 周哲敏; 周丽; 谢婷; 韩来闯; 崔文璟; 刘中美; 程中一; 郭军玲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-12-07
Filing date: 2021-12-07
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2041-12-07
Also published as: CN114250215B

Abstract

本发明公开了一种超嗜热II型普鲁兰酶及应用，属于基因工程技术领域。本发明通过对超嗜热II型普鲁兰酶进行氨基酸突变，获得了超嗜热II型普鲁兰酶突变体Q13H、I25E和Q13H/I25E。本发明获得的突变体催化性能有了很大的提高，且突变体在反应过程中不需要其他金属离子辅助(例如Ca²⁺)，有助于降低产物提取成本。本发明构建的突变体具有极强的热稳定性，在100℃保温10h还剩余50％的酶活，并具有较为广泛的pH活性范围和pH耐受性，在pH 5.8‑7.0范围保有70％活性，于不同的pH下，4℃放置剩余酶活均在75％以上，能很好的应用于淀粉工业中的糖化过程中。

Description

一种超嗜热II型普鲁兰酶及应用

技术领域

本发明涉及一种超嗜热II型普鲁兰酶及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)是糖苷水解酶家族中最重要的成员之一，通常由多个结构域组成，并且根据水解方式及产物的不同而被分为I型和II型。I型普鲁兰酶只作用于ɑ-1，6糖苷键，可以将淀粉，普鲁兰糖，ɑ-极限糊精等水解为麦芽三糖，线性寡糖。而II型普鲁兰酶是一种双功能酶，可以作用于ɑ-1，6和ɑ-1,4糖苷键，其水解产物是麦芽三糖和葡萄糖。普鲁兰酶在制糖工业(葡萄糖浆和果糖糖浆)、发酵工业(啤酒和有机酸)、饲料、抗性淀粉的制备等具有很好的应用。

在制糖工业中，通常分为两个步骤，首先是淀粉的液化，此步骤是在ɑ-淀粉酶的作用下，条件为95℃，pH 6.0，将淀粉水解为ɑ-环糊精；第二个是糖化，此步骤是普鲁兰酶和糖化酶，在55-60℃pH 4.5-5.0条件下去除支链将ɑ-环糊精彻底水解为葡萄糖。普鲁兰酶和糖化酶的协同作用下能够使淀粉水解的更彻底，提高淀粉的转化率。

在糖化过程中，普鲁兰酶和糖化酶拥有相同的反应条件可以减少工业生产上的消耗，其关键就是最适pH和温度。现有的糖化酶最适pH通常在4.5-5.0范围内，反应温度为60℃左右。目前，报道的超嗜热II型普鲁兰酶的最适pH多数为6.0-6.5，最适温度为80-100℃，并不适应于糖化过程，虽然有一种来源Thermofilum pendens的嗜酸II型普鲁兰酶，最适pH为3.5，但其活性较低的活性，淀粉转化率不高。因此提供一种在pH 4.5-5.0具有高酶活的II型普鲁兰酶在淀粉工业加工上中有重要的应用意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供了一种重组II型普鲁兰酶的突变体，是在SEQ IDNO.1所编码的氨基酸序列的基础上，进行了如下至少一种突变：

(1)将第13位谷氨酰胺突变为组氨酸的得到SEQ ID NO.2氨基酸序列，命名为Q13H；

(2)将第25位异亮氨酸突变为谷氨酸得到SEQ ID NO.3，命名为I25E。

在一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上将13位异亮氨酸突变为组氨酸，并将第25位异亮氨酸突变为谷氨酸，得到SEQ ID NO.4编码氨基酸，命名为Q13H/I25E。

本发明还提供了编码所述突变体的基因。

在一种实施方式中，所述基因是在SEQ ID NO.5的基础上，将第13位的密码子由CAG替换为CAT，获得编码突变体Q13H的基因。

在一种实施方式中，所述基因是在SEQ ID NO.5的基础上，将第25位的密码子由ATT替换为GAA，获得编码突变体I25E的基因。

在一种实施方式中，所述基因是在SEQ ID NO.5的基础上，将第25位的密码子由CAG替换为CAT，并将25位的密码子由ATT替换为GAA，获得编码突变体Q13H/I25E的基因。

本发明还提供了携带所述基因的重组质粒。

本发明还提供一种构建II型普鲁兰酶突变体的方法，包括如下步骤：

(1)在II型普鲁兰酶的SEQ ID NO.1所编码氨基酸序列基础上确定需要突变的位点，并设计对应突变位点的引物，以含有II型普鲁兰酶编码的核酸序列的质粒为模板，全质粒PCR获得突变体质粒；

(2)将步骤(1)的突变体质粒在宿主菌株中克隆，诱导表达；

(3)分别纯化II型普鲁兰酶的突变体Q13H、I25E、Q13H/I25E。

本发明还提供了表达所述突变体的重组微生物。

在一种实施方式中，所述重组微生物是重组大肠杆菌。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以pET系列质粒为表达载体。

本发明还提供了一种生产II型普鲁兰酶突变体的方法，是将所述重组大肠杆菌接种至培养基中，于30～37℃培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8，在以终浓度1～3mM IPTG和终浓度为1～3％的无水乙醇于16～20℃诱导16-20h。

在一种实施方式中，所述培养基包括LB培养基或2YT培养基。

本发明还要求保护所述II型普鲁兰酶突变体在制糖工业中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是将所述II型普鲁兰酶用于淀粉水解液的糖化。

在一种实施方式中，所述应用是将所述II型普鲁兰酶和糖化酶共同用于淀粉水解液的糖化。

本发明的有益效果：

(1)本发明筛选获得了II型普鲁兰酶的突变体，在反应过程中不需要其他金属离子辅助(例如Ca²⁺)，有助于降低产物提取成本；本发明获得的II型普鲁兰酶突变体具有较为广泛的pH活性范围，并具有低pH耐受性，能很好的应用于淀粉工业中的糖化过程中。

(2)本发明提供的突变体Q13H的最适pH为5.0，比酶活是54.2U/mg，相较于野生型的最大比活(pH 6.4)提高了70％；其催化效率k_cat/K_m是野生型的3.4倍；并且在pH 4.4、5.0的比酶活是野生型的3.8倍和3倍，同时扩宽了普鲁兰酶的pH活性范围，从原来的5.8-6.8扩大到4.8-7.0。

(3)本发明构建的单点突变体I25E的最适pH为5.5，比酶活是45U/mg，相较于野生型的最大比活(pH 6.4)提高了40％。

(4)本发明构建的迭代组合突变体Q13H/I25E的最适pH为5.0，测定的比活为63.9U/mg，是野生型最大比酶活的2倍，催化效率k_cat/K_m是野生型的2.9倍；在pH 4.4、5.0的比酶活是野生型的4倍和3.6倍，同时扩宽了普鲁兰酶的pH活性范围，从原来的5.8-6.8扩大到4.8-7.0；并且在100℃保温4h仍剩余70％酶活高于野生型的剩余酶活(50％)。

附图说明

图1为II型普鲁兰酶的突变体在不同pH的比酶活结果。

图2为II型普鲁兰酶及突变体Q13H/I25E在100℃放置不同时间的剩余酶活。

图3为II型普鲁兰酶及突变体Q13H/I25E在不同pH下放置4h剩余酶活。

图4为将II型普鲁兰酶第13位氨基酸突变为不同氨基酸后的突变体的比酶活。

具体实施方式

本发明实施例中的所用一下材料、试剂及培养基：

(一)质粒及菌株

使用pET24a载体克隆表达SEQ ID NO.1编码的基因序列；用于基因克隆的菌株为大肠杆菌JM109；用于表达酶的菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

(二)酶及反应底物

PrimeSTAR MAX DNA及Dpn I消化酶均购自于TAKARA公司，底物普鲁兰糖属于食品级购自于山东福瑞达生物科技有限公司，DNS配制试剂均属国产普通试剂。

(三)试剂和培养基

纯化试剂：1L结合缓溶液：含有125mL磷酸盐缓冲液(50mmol/L Na₂HPO₄、50mmol/LNaH₂PO₄、500mmol/L NaCl)，10mL 2M咪唑溶液；1L洗脱缓冲液：125mL磷酸盐缓冲液(50mmol/L Na₂HPO₄、50mmol/L NaH₂PO₄、500mmol/L NaCl)，250mL 2M咪唑溶液；

反应缓冲液：pH为5.8，6.0，6.4，6.8，7.2，7.6，8.0的100mM磷酸钾缓冲液；pH为4.0，4.4，4.8，5.0，5.4，5.8的100mM醋酸钠缓冲液。

LB液体培养基(每L)：10g氯化钠，10g蛋白胨，5g酵母粉，1L超纯水。

LB固体培养基(每L)：10g氯化钠，10g蛋白胨，5g酵母粉，20g琼脂粉，1L超纯水。

2YT液体培养基(每L)：16g蛋白胨，10g酵母粉，5g氯化钠，1L超纯水。

(四)酶活的测定：利用Breadford试剂测定酶活反应体系：40μL普鲁兰酶，6％普鲁兰糖50μL，100mM不同pH缓冲液10uL。首先将缓冲液和底物普鲁兰糖混合在100℃预热5min，然后加入普鲁兰酶于100℃反应15min，反应结束后向反应体系中加入100μL DNS，100℃煮沸6min。最后将反应产物用水稀释72倍，用分光光度计测定OD₄₇₆下的吸光值，根据葡萄糖做的标曲，计算产物形成量。

酶活定义：在合适的测定条件下，每分钟生成1μmol还原糖所需的酶量为一个U。

实施例1II型普鲁兰酶单突变体的构建

单突变体的制备：根据SEQ ID NO.1所示编码的核苷酸序列基础上，设计单个位点突变的引物，分别设计Q13H和I25E上下游引物，并在金唯智生物公司合成。以带有SEQ IDNO.1编码的基因的质粒为模板，利用快速PCR扩增单点突变序列，测序验证突变基因，从而获得Q13H和I25E单突变体质粒。

组合突变体的制备：在单突变体质粒Q13H基础上设计I25E上下游引物，并以Q13H单突变体质粒为模板，利用快速PCR扩增，测序验证突变基因，从而获得Q13H-I25E突变质粒。

引入突变体引物序列如下：

Q13H定点突变引物为：

Q13H-F：GTTATTATTGTTTGGCATCACCATCAGCCGTA(下划线为定向突变核苷酸序列)；

Q13H-R：CATAATAATACGGCTGATGGTGATGCCAAACA(下划线为定向突变核苷酸序列)；

I25E定点突变引物为：

I25E-F：GATCCGGTTCAGGGTGAATATACCCGTCCG(下划线为定向突变核苷酸序列)；

I25E-R：ACCCACGGACGGGTATATTCACCCTGAACC(下划线为定向突变核苷酸序列)；

PCR反应条件：使用Primer Star Max为PCR扩增试剂，98℃预变性3min，接下来进行30个循环(98℃5min解链，55℃30s复性，72℃90s延伸)，随后72℃延伸10min，最后4℃保存。扩增好的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测。

实施例2II型普鲁兰酶突变体的发酵及表达纯化

(1)突变体诱导表达

将实施例1经PCR获得的产物用Dpn I酶于37℃消化2-3h，将消化产物转化至大肠杆菌JM109大量克隆，经测序正确的阳性克隆子提取质粒，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态，获得突变体表达菌株，分别命名为BL21-PulPy2-Q13H，BL21-PulPy2-I25E，BL21-PulPy2-Q13H/I25E。

用30％甘油于-80℃保存这三个菌株。然后取出甘油菌在含有50mg/mL卡阿霉素的LB平板上划线，37℃培养10h，接下来挑取一单菌株于5mL含有50mg/mL卡那霉素LB培养基，37℃过夜培养，将培养好的菌液按照1％的比例加入100mL 2YT液体培养基中，37℃培养2-3h，OD₆₀₀达到0.6-0.8，向菌液中加入2mM IPTG和2％无水乙醇，18℃培养16-20h，获得0D600为2-3的细胞培养液。

(2)蛋白纯化

培养好的菌液在4℃离心机12000rpm离心4min，弃去上清，保留菌体。收完菌体之后，向装有菌体的缓冲液中加入一定量的10mM磷酸钾缓冲液，利用超声破碎仪破碎细胞(破碎条件：工作3s，停7s，工作30min)，破碎结束后将破碎液在4℃离心机中12000rpm离心30min，保留上清，弃去沉淀。破碎液的上清利用TAKA蛋白纯化仪及HIS trap HP柱纯化出纯净的普鲁兰酶，首先用结合缓冲液平衡HIS柱，然后加入上清，使目的蛋白挂到HIS柱上，再用结合缓冲液冲掉没有挂在柱子的杂蛋白，最后用高浓度咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，最终获得纯净的普鲁兰酶。

实施例3II型普鲁兰酶及突变体的pH活性范围的测定

将实施例2纯化后的蛋白测定浓度，并把浓度统一调至为100ug/mL，分别在不同pH的缓冲液中测定酶活，结果见图1。

突变体Q13H的最适pH为5.0，比酶活是54.2U/mg，相较于野生型酶在pH 6.4下的最大比酶活提高了1.7倍；其催化效率k_cat/K_m提高了3.4倍；并且在pH 4.4、5.0下的比酶活相比于野生型分别提高了3.8倍和3倍，扩宽了普鲁兰酶的pH活性范围，从原来的5.8-6.8扩大到4.8-7.0，更适合参与酸性pH下的糖化反应。

另一个单点突变体I25E的最适pH为5.5，比酶活是45U/mg，相较于野生型酶在pH6.4下的最大比酶活提高了1.4倍。迭代组合突变体Q13H/I25E的最适pH为5.0，测定的比酶活为63.9U/mg，并且在pH 4.4、4.8、5.0下的比酶活相比于野生型分别提高了4倍、4倍和3.8倍，表现出在酶活方面有更为明显的提高。

实施例4迭代突变体Q13H/I25E在100℃下的热稳定性测定

(1)100℃热稳定性测定

纯化后的普鲁兰酶及突变体Q13H/I25E浓度均调至100μg/mL，取400μL蛋白与100μL pH 6.5磷酸钾缓冲液混合在2mL离心管中，然后放置100℃，每次实验放置30个2mL，每隔两个小时取出3个离心管放入4℃冰箱中，在100℃分别放置2、4、6、8、10h，然后在每个离心管中加入500μL普鲁兰糖，100℃中反应15min，反应结束后向反应液中加入1000μLDNS，100℃煮沸6min终止反应，最后将反应液用水稀释72倍，测OD₄₇₆吸光值，计算出剩余酶活，结果如图2。

结果表明在100℃处理240min后，迭代突变体仍保留70％的活性，相较于II型普鲁兰酶的50％有明显的提高，并且在100℃处理600min后，迭代突变体的酶活仍有50％酶活剩余。因此迭代突变体Q13H/I25E在100℃具有较好的热稳定性。

实施例5迭代突变体Q13H/I25E在不同pH下的酶活测定

用10mM不同pH的醋酸钠缓冲液(pH分别为4.0，4.4，4.8，5.0，5.4，5.8)和10mM不同pH的磷酸钾缓冲液(pH分别为5.8，6.0，6.4，6.8，7.2，7.6，8.0)，图中pH 5.8是在磷酸钾缓冲液中测定的。将纯化后的蛋白稀释到100μg/mL，然后于4℃放置4h，然后采用上述的酶活测定方法测其剩余酶活。结果如图3。结果表明II型普鲁兰酶及突变体在不同pH中放置4h均能剩余75％以上的酶活，而迭代突变体Q13H/I25E在pH 4-5之间几乎没有活性损失，尤其在pH4.0孵育4h后的剩余酶活相较野生型提高约50％，因此相较于野生型具有较好的pH耐受性。

对比例1：

具体实施方式同实施例1，区别在于，将第13位氨基酸分别突变为亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丙氨酸，按照实施例2相同方法制备纯化的酶蛋白，测定在pH 5.0，6.4，8.0的比酶活。

结果如图4，突变为这几个氨基酸酶活均没有突变体Q13H、I25E、Q13H/I25E的高，并且这几个突变体在pH6.4的活性均高于pH5.0。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种超嗜热II型普鲁兰酶及应用

<130> BAA211640A

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 764

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Pro Lys Pro Leu Asn Val Ile Ile Val Trp His Gln His Gln Pro

1 5 10 15

Tyr Tyr Tyr Asp Pro Val Gln Gly Ile Tyr Thr Arg Pro Trp Val Arg

20 25 30

Leu His Ala Ala Asn Asn Tyr Trp Lys Met Ala Tyr Tyr Leu Ser Lys

35 40 45

Tyr Pro Asp Val His Ala Thr Ile Asp Leu Ser Gly Ser Leu Ile Ala

50 55 60

Gln Leu Ala Asp Tyr Met Asn Gly Ala Lys Asp Ile Tyr Gln Ile Ile

65 70 75 80

Thr Glu Lys Ile Ala Lys Gly Glu Pro Leu Thr Val Glu Glu Lys Trp

85 90 95

Leu Met Leu Gln Ala Pro Gly Gly Phe Phe Asp His Thr Ile Pro Trp

100 105 110

Asn Gly Glu Pro Val Thr Asp Lys Asn Gly Asn Pro Ile Arg Asp Phe

115 120 125

Trp Asn Arg Tyr Thr Glu Leu Lys Asn Lys Met Leu Gln Ala Lys Ala

130 135 140

Lys Tyr Ala Asn Leu Pro Leu Glu Glu Gln Lys Val Ala Val Thr Asn

145 150 155 160

Glu Phe Thr Glu Gln Asp Tyr Ile Asp Leu Ala Val Leu Phe Asn Leu

165 170 175

Ala Trp Ile Asp Tyr Asn Tyr Ile Met Asn Thr Pro Glu Leu Lys Ala

180 185 190

Leu Tyr Glu Lys Val Asp Glu Gly Gly Tyr Thr Arg Glu Asp Val Arg

195 200 205

Thr Val Leu Lys His Gln Met Trp Leu Leu Asn His Thr Phe Glu Glu

210 215 220

His Glu Lys Ile Asn Leu Leu Leu Gly Asn Gly Asn Val Glu Val Thr

225 230 235 240

Val Val Pro Tyr Ala His Pro Ile Gly Pro Ile Leu Asn Asp Phe Gly

245 250 255

Trp Glu Glu Asp Phe Asp Ala His Val Lys Lys Ala His Glu Leu Tyr

260 265 270

Lys Lys Tyr Leu Gly Ala Gly Lys Val Thr Pro Lys Gly Gly Trp Ala

275 280 285

Ala Glu Ser Ala Leu Asn Asp Lys Thr Leu Glu Ile Leu Ala Glu Asn

290 295 300

Gly Trp Gln Trp Val Met Thr Asp Gln Leu Val Leu Gln Lys Leu Gly

305 310 315 320

Ile Pro Tyr Thr Val Glu Asn Tyr Tyr Lys Pro Trp Val Ala Glu Phe

325 330 335

Asn Gly Arg Lys Ile Tyr Leu Phe Pro Arg Asp His Ala Leu Ser Asp

340 345 350

Arg Val Gly Phe Thr Tyr Ser Gly Met Asn Gln Tyr Gln Ala Val Glu

355 360 365

Asp Phe Ile Asn Glu Leu Leu Arg Ile Gln Lys Gln Asn Tyr Asp Gly

370 375 380

Ser Leu Val Tyr Val Ile Thr Leu Asp Gly Glu Asn Pro Trp Glu His

385 390 395 400

Tyr Pro Tyr Asp Gly Lys Leu Phe Leu Glu Thr Leu Tyr Lys Arg Leu

405 410 415

Thr Glu Leu Gln Arg Gln Gly Leu Ile Arg Thr Leu Thr Pro Ser Glu

420 425 430

Tyr Ile Lys Leu Tyr Gly Asp Lys Ala Asn Lys Leu Thr Pro Gln Met

435 440 445

Met Glu Arg Leu Asp Leu Thr Gly Asp Asn Val Glu Ala Leu Leu Lys

450 455 460

Ala Gln Ser Leu Gly Glu Leu Tyr Asp Met Ile Gly Val Lys Glu Glu

465 470 475 480

Met Gln Trp Pro Glu Ser Ser Trp Ile Asp Gly Thr Leu Ser Thr Trp

485 490 495

Ile Gly Glu Pro Gln Glu Asn Tyr Gly Trp Tyr Trp Leu Tyr Leu Ala

500 505 510

Arg Lys Ala Leu Met Ala Gln Lys Asp Lys Met Ser Gln Glu Asn Trp

515 520 525

Glu Lys Ala Tyr Glu Tyr Leu Leu Arg Ala Glu Ala Ser Asp Trp Phe

530 535 540

Trp Trp Tyr Gly Ser Asp Gln Ser Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Phe Asp

545 550 555 560

Arg Tyr Phe Lys Thr Tyr Leu Tyr Glu Ile Tyr Arg Leu Ala Gly Leu

565 570 575

Glu Pro Pro Ser Tyr Leu Tyr Gly Asn Tyr Phe Pro Asp Gly Glu Pro

580 585 590

Tyr Thr Ile Arg Ala Leu Glu Gly Leu Gly Glu Gly Gln Val Lys Glu

595 600 605

Tyr Ser Ser Met Ser Pro Leu Ala Glu Gly Val Ser Val Tyr Phe Asp

610 615 620

Gly Glu Gly Val His Phe Val Val Lys Gly Asn Leu Glu Lys Phe Glu

625 630 635 640

Ile Ser Ile Tyr Glu Lys Gly Glu Arg Val Gly Asn Thr Phe Thr Leu

645 650 655

Leu Gln Glu Arg Pro Gly Glu Leu Lys Tyr Ser Leu Phe Pro Phe Ser

660 665 670

Arg Asp Ser Val Gly Leu Leu Ile Pro Ile Thr Lys His Val Val Tyr

675 680 685

Arg Asp Gly Lys Ala Glu Ile Tyr Ala Ala Thr Asp Tyr Glu Asn Thr

690 695 700

Glu Lys Val Gly Glu Ala Ser Val Lys Gln Val Asp Gly Gly Val Glu

705 710 715 720

Ile Val Val Pro Phe Asp Tyr Ile Lys Thr Pro Glu Asp Phe Tyr Phe

725 730 735

Ala Val Ser Thr Val Lys Asp Gly Glu Leu Glu Ile Ile Thr Thr Pro

740 745 750

Ile Glu Leu Lys Leu Pro Met Glu Val Lys Gly Val

755 760

<210> 2

<211> 764

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Pro Lys Pro Leu Asn Val Ile Ile Val Trp His His His Gln Pro

1 5 10 15

Tyr Tyr Tyr Asp Pro Val Gln Gly Ile Tyr Thr Arg Pro Trp Val Arg

20 25 30

Leu His Ala Ala Asn Asn Tyr Trp Lys Met Ala Tyr Tyr Leu Ser Lys

35 40 45

Tyr Pro Asp Val His Ala Thr Ile Asp Leu Ser Gly Ser Leu Ile Ala

50 55 60

Gln Leu Ala Asp Tyr Met Asn Gly Ala Lys Asp Ile Tyr Gln Ile Ile

65 70 75 80

Thr Glu Lys Ile Ala Lys Gly Glu Pro Leu Thr Val Glu Glu Lys Trp

85 90 95

Leu Met Leu Gln Ala Pro Gly Gly Phe Phe Asp His Thr Ile Pro Trp

100 105 110

Asn Gly Glu Pro Val Thr Asp Lys Asn Gly Asn Pro Ile Arg Asp Phe

115 120 125

Trp Asn Arg Tyr Thr Glu Leu Lys Asn Lys Met Leu Gln Ala Lys Ala

130 135 140

Lys Tyr Ala Asn Leu Pro Leu Glu Glu Gln Lys Val Ala Val Thr Asn

145 150 155 160

Glu Phe Thr Glu Gln Asp Tyr Ile Asp Leu Ala Val Leu Phe Asn Leu

165 170 175

Ala Trp Ile Asp Tyr Asn Tyr Ile Met Asn Thr Pro Glu Leu Lys Ala

180 185 190

Leu Tyr Glu Lys Val Asp Glu Gly Gly Tyr Thr Arg Glu Asp Val Arg

195 200 205

Thr Val Leu Lys His Gln Met Trp Leu Leu Asn His Thr Phe Glu Glu

210 215 220

His Glu Lys Ile Asn Leu Leu Leu Gly Asn Gly Asn Val Glu Val Thr

225 230 235 240

Val Val Pro Tyr Ala His Pro Ile Gly Pro Ile Leu Asn Asp Phe Gly

245 250 255

Trp Glu Glu Asp Phe Asp Ala His Val Lys Lys Ala His Glu Leu Tyr

260 265 270

Lys Lys Tyr Leu Gly Ala Gly Lys Val Thr Pro Lys Gly Gly Trp Ala

275 280 285

Ala Glu Ser Ala Leu Asn Asp Lys Thr Leu Glu Ile Leu Ala Glu Asn

290 295 300

Gly Trp Gln Trp Val Met Thr Asp Gln Leu Val Leu Gln Lys Leu Gly

305 310 315 320

Ile Pro Tyr Thr Val Glu Asn Tyr Tyr Lys Pro Trp Val Ala Glu Phe

325 330 335

Asn Gly Arg Lys Ile Tyr Leu Phe Pro Arg Asp His Ala Leu Ser Asp

340 345 350

Arg Val Gly Phe Thr Tyr Ser Gly Met Asn Gln Tyr Gln Ala Val Glu

355 360 365

Asp Phe Ile Asn Glu Leu Leu Arg Ile Gln Lys Gln Asn Tyr Asp Gly

370 375 380

Ser Leu Val Tyr Val Ile Thr Leu Asp Gly Glu Asn Pro Trp Glu His

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405 410 415

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420 425 430

Tyr Ile Lys Leu Tyr Gly Asp Lys Ala Asn Lys Leu Thr Pro Gln Met

435 440 445

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450 455 460

Ala Gln Ser Leu Gly Glu Leu Tyr Asp Met Ile Gly Val Lys Glu Glu

465 470 475 480

Met Gln Trp Pro Glu Ser Ser Trp Ile Asp Gly Thr Leu Ser Thr Trp

485 490 495

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530 535 540

Trp Trp Tyr Gly Ser Asp Gln Ser Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Phe Asp

545 550 555 560

Arg Tyr Phe Lys Thr Tyr Leu Tyr Glu Ile Tyr Arg Leu Ala Gly Leu

565 570 575

Glu Pro Pro Ser Tyr Leu Tyr Gly Asn Tyr Phe Pro Asp Gly Glu Pro

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<210> 3

<211> 764

<212> PRT

<213> 人工序列

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<211> 764

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<213> 人工序列

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<210> 5

<211> 2289

<212> DNA

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ccggttcagg gtatttatac ccgtccgtgg gttcgtctgc atgcagcaaa taattattgg 120

aaaatggcat attatctgag caaatatccg gatgttcatg caaccattga tctgagcggt 180

agcctgattg cacagctggc agattatatg aatggtgcaa aagatattta tcagatcatc 240

accgaaaaaa tcgcaaaagg tgaaccgctg accgttgaag aaaaatggct gatgctgcag 300

gcaccgggtg gtttttttga tcataccatt ccgtggaatg gtgaaccggt taccgataaa 360

aatggtaatc cgattcgtga tttttggaat cgttataccg aactgaaaaa taaaatgctg 420

caggcaaaag caaaatatgc aaatctgccg ctggaagaac agaaagttgc agttaccaat 480

gaatttaccg aacaggatta tattgacctg gcagttctgt ttaatctggc atggattgat 540

tataattaca tcatgaacac cccggaactg aaagcactgt atgaaaaagt tgatgaaggt 600

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gttgttccgt atgcacatcc gattggtccg attctgaatg attttggttg ggaagaagat 780

tttgatgcac atgttaaaaa agcacatgaa ctgtataaaa aatacctggg tgcaggtaaa 840

gttaccccga aaggtggttg ggcagcagaa agcgcactga atgataaaac cctggaaatt 900

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tatctgtatg gtaattattt tccggatggt gaaccgtata ccattcgtgc actggaaggt 1800

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gatggtgaac tggaaattat taccaccccg attgaactga aactgccgat ggaagttaaa 2280

ggtgttccg 2289

Claims

1.一种超嗜热II型普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述突变体是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，进行了如下至少一种突变：

(1)将第13位谷氨酰胺突变为组氨酸；

(2)将第25位异亮氨酸突变为谷氨酸。

2.编码权利要求1所述超嗜热II型普鲁兰酶突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的质粒。

4.表达权利要求1所述超嗜热II型普鲁兰酶突变体的重组微生物细胞。

5.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以pET系列质粒为表达载体，表达权利要求1所述的超嗜热II型普鲁兰酶突变体。

6.根据权利要求5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。

7.一种生产权利要求1所述超嗜热II型普鲁兰酶突变体的方法，其特征在于，将权利要求5或6所述的重组大肠杆菌在培养基中培养，收集培养获得的超嗜热II型普鲁兰酶突变体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌接种至LB培养基中，于30～37℃培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8，在以终浓度1～3mM IPTG和终浓度为1～3％的无水乙醇于16～20℃诱导16-20h。

9.含有权利要求1所述超嗜热II型普鲁兰酶突变体的酶制剂。

10.权利要求1所述II型普鲁兰酶突变体在制糖工业中的应用。