CN111961657B - 具有高耐热性的α-淀粉酶突变体K152H/A166C/E168H及其基因和应用 - Google Patents

具有高耐热性的α-淀粉酶突变体K152H/A166C/E168H及其基因和应用 Download PDF

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    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
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    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
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Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及具有高耐热性的α‑淀粉酶突变体K152H/A166C/E168H及其基因和应用。通过将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型α‑淀粉酶进行K152H/A166C/E168H点突变，获得所述α‑淀粉酶突变体。本发明提供的突变酶的最适作用温度由野生型的85‑90℃提高到了95‑100℃，热稳定性大幅提高，能很好的满足能源、食品和饲料等领域中应用的对于高温下α‑淀粉酶水解活性的需求，有着非常广阔的应用前景。

Description

具有高耐热性的α-淀粉酶突变体K152H/A166C/E168H及其基 因和应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及具有高耐热性的α-淀粉酶突变体K152H/A166C/E168H及其基因和应用。
背景技术
淀粉是大量存在于自然界中的植物多糖，除了可以被直接食用外，还是工业生产果葡糖浆、麦芽糖及酿酒等多种工业的主要原料，其在被利用过程中必须被水解为低聚糖或单糖。α-淀粉酶是一类作用于淀粉内部水解其α-1,4糖苷键从而将淀粉水解为糊精、低聚糖和单糖的酶。α-淀粉酶是工业上应用最早、用途最广、产量最大的酶制剂产品之一，约占全球酶制剂市场的25％左右。因此，合理开发利用α-淀粉酶对淀粉类物质的降解有极大意义，同时对于饲料、食品、医药等领域中的应用也至关重要。
α-淀粉酶在双酶法制糖工业中运用的最多。淀粉的糖转化工业包括三个步骤—糊化、液化与糖化，α-淀粉酶参与液化的过程，这要求其具有很好的耐热性以及高温下保持高活性，因为淀粉喷射液化温度能够达到110℃以上，而许多α-淀粉酶在100℃以上立即失活，阻碍了其在工业生产中的运用。所以，利用蛋白质工程的手段对α-淀粉酶进行分子改良以提高其热稳定性，得到能够满足大规模工业化生产及应用所需的突变体，降低其生产成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种以来源于嗜热古菌Thermococcus eurythermalis的α-淀粉酶作为母本经点突变获得的突变体。
本发明的再一目的是提供编码上述突变体的基因。
本发明的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。
本发明的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组菌株。
本发明的再一目的是提供上述突变体的应用。
本发明的再一目的是提供制备具有高耐热性的α-淀粉酶的方法。
根据本发明的具体实施方式，对氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型α-淀粉酶进行定点突变。
根据本发明的具体实施方式，将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型α-淀粉酶进行152、166、168位点的突变，分别由赖氨酸、丙氨酸、谷氨酸突变为组氨酸、半胱氨酸、组氨酸，从而获得α-淀粉酶突变体。
根据本发明的具有高耐热性的α-淀粉酶突变体具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，由435个氨基酸组成。
根据本发明的具体实施方式，还提供了编码上述具有高耐热性的α-淀粉酶突变体的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:.3所示，共为1305 bp。
根据本发明的具体实施方式，还提供了包含上述α-淀粉酶突变体基因的重组载体，所述重组表达载体的出发载体具体为pET-22b(+)。
根据本发明的具体实施方式，还提供了包含上述α-淀粉酶突变体基因的重组菌株，所述重组菌的出发菌株具体为E.coli BL21(DE3)。
根据本发明的制备具有高耐热性的α-淀粉酶的方法，包括以下步骤：
1）制备包含上述突变体基因的重组载体；
2）以所述重组载体转化宿主；
3）发酵培养所述宿主，并分离α-淀粉酶。
本发明的α-淀粉酶突变体与野生型α-淀粉酶相比，α-淀粉酶水解酶酶最适作用温度提升10℃，热稳定性大幅提高，野生型90℃处理20分钟完全失活,突变体90分钟处理60分钟剩余80%以上。
本发明提供了上述具有高耐热性的α-淀粉酶突变体的应用，具体可以应用于能源、食品和饲料领域中。
本发明克服了现有技术的不足，提供了一种高耐热性的适合于在能源、食品和饲料等领域中应用的α-淀粉酶突变体。本发明提供的突变酶的最适作用温度由野生型的85-90℃提高到了95-100℃，热稳定性大幅提高，野生型90℃处理30分钟完全失活,突变体90分钟处理60分钟剩余80%以上。因此，本发明提供的α-淀粉酶突变体能很好的满足能源、食品和饲料等领域中应用的对于高温下α-淀粉酶水解活性的需求，有着非常广阔的应用前景。
附图说明
图1显示α-淀粉酶野生型及突变体在大肠杆菌BL21(DE3)中表达后的SDS-PAGE电泳检测结果；
图2显示纯化后的α-淀粉酶野生型及突变体的最适温度结果；
图3显示纯化后的α-淀粉酶野生型及突变体的最适pH；
图4显示纯化后的α-淀粉酶野生型及突变体的pH稳定性；
图5显示纯化后的α-淀粉酶野生型及突变体的热稳定性；
图6显示纯化后的α-淀粉酶野生型及突变体的催化效率。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：表达宿主E.coli BL21(DE3)，表达质粒载体pET-22b(+)。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrog
公司,底物可溶性淀粉购自Sigma公司。其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。
3、大肠杆菌培养基LB（1 %蛋白胨、0.5 %酵母提取物、1 % NaCL， pH自然）。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1、重组菌株BL21(pET-22b(+)-teamy)的制备
1.构建重组菌株BL21(pET-22b(+)-teamy)
由华大基因公司合成α-淀粉酶野生型TeAMY的基因, 使用内切酶EcoR Ⅰ 和Not Ⅰ将teamy基因和载体pET-22b(+)切开，通过重组试剂盒将两者连接，获得重组质粒pET-22b(+)-teamy，并转化克隆宿主大肠杆菌XL10，获得重组大肠杆菌菌株X10(pET-22b(+)-teamy)。涂布于LB（含100 μg/mL Amp）进行筛选。经核酸凝胶电泳验证正确后，将克隆子接入50 mL LB培养基中，摇床中过夜培养（37°C），使用质粒小提中量试剂盒提取质粒。将质粒转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)后，获得重组大肠杆菌菌株BL21(pET-22b(+)-teamy)。
实施例2、重组菌株BL21(pET-22b(+)-teamy-K152H/A166C/E168H)的制备
1.重组质粒pET-22b(+)-teamy-K152H/A166C/E168H的构建
经优化突变位点设计为将152、166、168的赖氨酸、丙氨酸、谷氨酸突变为组氨酸、半胱氨酸、组氨酸，通过点突变试剂盒的方法引入突变位点，先对166和168位进行突变，并对其进行测序验证，成功后以pET-22b(+)-teamy- A166C/E168H为模板进行152位的突变，最后获得α-淀粉酶突变质粒pET-22b(+)-teamy-K152H/A166C/E168H。所用引物如下所示：引物A166C/E168H-F（SEQ ID NO:4）；引物A166C/E168H-R（SEQ ID NO:5）；引物K152H/A166C/E168H -F（SEQ ID NO:6）；引物K152H/A166C/E168H-R（SEQ ID NO:7）。
2. 构建重组菌株BL21(pET-22b(+)-teamy-K152H/A166C/E168H)
将测序正确的单克隆接种至50 mL LB培养基中，摇床中过夜培养（37°C），使用质粒小提中量试剂盒提取质粒。将质粒转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)后，并涂布于LB（含100 μg/mL Amp）进行筛选。获得重组大肠杆菌菌株BL21(pET-22b(+)-teamy-K152H/A166C/E168H)。
实施例3、α-淀粉酶蛋白野生型TeAMY及突变体K152H/A166C/E168H的获得
1.蛋白TeAMY及K152H/A166C/E168H的诱导表达
将得到的重组表达菌株BL21(pET-22b(+)-teamy)及BL21(pET-22b(+)-teamy-K152H/A166C/E168H)接种至50ml LB培养基中进行种子培养，200 rpm，37 ℃培养16 h后，以1 %接种量转接至400mL LB培养基中，200 rpm，37 ℃培养2-4h后，测定菌体浓度，用酶标仪读取在波长600 nm下的吸光值，达到0.6-0.8时加入IPTG至终浓度为1Mm, 200rpm，16℃进行诱导表达。
2.蛋白TeAMY及K152H/A166C/E168H的纯化
将诱导表达后的菌液12000 rpm, 10 min离心，收集菌体，再用10 mM Tris-HCl溶液（pH 7.6）进行重悬，然后超声破碎，离心收集上清。用镍亲和层析法纯化蛋白，洗脱液为1M 咪唑，20mMTris-HCl，0.5M NaCl，收集洗脱液，进行SDS-PAGE，蛋白TeAMY及K152H/A166C/E168H蛋白纯化结果见图1。
实施例4、α-淀粉酶TeAMY及K152H/A166C/E168H的最适作用温度的检测
诱导表达后对TeAMY及K152H/A166C/E168H进行纯化及酶活的测定
酶活的测定方法（DNS (3,5-二硝基水杨酸)法）：将配制的2%可溶性淀粉用pH 5.5的缓冲溶液（0.1M HAc-NaAc）稀释至 1% 终浓度淀粉溶液作为底物，测量体系包括 900 μL的底物和 100 μL 适当稀释的酶液，分别在 60、70、80、85、90、95、100℃ 水浴锅和105℃（油浴）中反应 30 min，加入 1.5 mL 的 DNS 试剂终止反应后，置于沸水浴中处理 5 min，快速冷却至室温后取250 μL混合液用酶标仪读取在波长540 nm下的吸光值，每组反应设置1个空白对照及3个平行。结果如图2，TeAMY及K152H/A166C/E168H的最适作用温度分别为85-90℃、95℃，K152H/A166C/E168H较TeAMY提高了10-15℃。
酶活单位 (U) 定义：在最适条件下，每分钟水解可溶性淀粉生成 1 μmoL 葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位。
实施例5、α-淀粉酶TeAMY及K152H/A166C/E168H的最适作用pH的检测
酶活的测定方法同实例4，将配制的2%可溶性淀粉,用0.1M pH 3.5到pH 7的缓冲溶液稀释至 1% 终浓度淀粉溶液作为底物，pH 3.5-4为柠檬酸-磷酸氢二钠，pH 4.5-6乙酸-乙酸钠，pH 6.5-7磷酸氢二钾-磷酸二氢钾。结果如图3，TeAMY及K152H/A166C/E168H的最适作用pH分别为5.5、5。
实施例6、α-淀粉酶TeAMY及K152H/A166C/E168H的pH稳定性的检测
先将酶液用0.05M pH 1-12的缓冲溶液稀释5倍（pH 1-2为甘氨酸-盐酸，pH 3-8柠檬酸-磷酸氢二钠，pH 9-10Tris-HCl，pH 11-12甘氨酸-氢氧化钠），在37℃水浴锅中保温1h后测定酶活，酶活的测定方法同实例4。结果如图4，K152H/A166C/E168H较TeAMY更稳定，二者在pH 1-2极不稳定，pH高于3的情况下能维持60%以上的活性。
实施例7、α-淀粉酶TeAMY及K152H/A166C/E168H的热稳定性的检测
取纯化后的酶液100μL在90℃下分别热处理0、10、20、30、60min后，在冰上冷却，而后分别在其最适作用温度下测定其剩余酶活，测量体系和方法同实例4，结果如图5， TeAMY90℃热处理10min后仅剩余30%左右活性，30min后完全失活，而K152H/A166C/E168H 90℃热处理60min后仍较为稳定，酶活剩余80%以上。
实施例8、α-淀粉酶TeAMY及K152H/A166C/E168H的催化效率的检测
用pH 5.5的缓冲溶液（0.1M HAc-NaAc）配置浓度为0.5、0.8、1.0、1.3、1.5、2.0、2.5、5、8、10、12、15mg/mL的可溶性淀粉为底物，分别在二者的最适pH和最适温度下测定其动力学参数，反应时间为15min。结果如图6及表1，K152H/A166C/E168H的催化效率较TeAMY略有降低。
表1 催化效率
Figure 98812DEST_PATH_IMAGE001
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 具有高耐热性的α-淀粉酶突变体K152H/A166C/E168H及其基因和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 436
<212> PRT
<213> 嗜热古菌(Thermococcus eurythermalis)
<400> 1
Ala Lys Tyr Leu Glu Leu Glu Glu Gly Gly Val Ile Met Gln Ala Phe
1 5 10 15
Tyr Trp Asp Val Pro Ser Gly Gly Ile Trp Asp Thr Ile Arg Gln Lys
20 25 30
Ile Pro Glu Trp Tyr Asp Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro
35 40 45
Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Ala Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr
50 55 60
Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asp Gln Lys Gly Thr Val Glu Thr
65 70 75 80
Arg Phe Gly Ser Lys Gln Glu Leu Val Asn Met Ile Asn Thr Ala His
85 90 95
Ala Tyr Gly Ile Lys Val Ile Ala Asp Ile Val Ile Asn His Arg His
100 105 110
Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Val Asn Asp Tyr Thr
115 120 125
Trp Thr Asp Phe Ser Lys Val Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr
130 135 140
Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Val Lys Cys Cys Asp Glu Gly Thr Phe
145 150 155 160
Gly Gly Phe Pro Asp Ile Ala His Glu Lys Ser Trp Asp Gln Tyr Trp
165 170 175
Leu Trp Ala Ser Asn Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly
180 185 190
Val Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Val Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Val
195 200 205
Val Lys Asp Trp Leu Asp Trp Trp Gly Gly Trp Ala Val Gly Glu Tyr
210 215 220
Trp Asp Thr Asn Val Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Asp
225 230 235 240
Ala Lys Val Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Ala Ala Phe
245 250 255
Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Val Glu Ala Leu Lys Asn Gly Gly
260 265 270
Thr Val Val Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Val Thr Phe Val Ala Asn
275 280 285
His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile
290 295 300
Leu Thr Tyr Glu Gly Gln Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu
305 310 315 320
Trp Leu Asn Lys Asp Arg Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp His
325 330 335
Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Val Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu
340 345 350
Ile Phe Val Arg Asn Gly Tyr Gly Asp Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr
355 360 365
Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Ala Gly Arg Trp Val Tyr Val Pro Lys
370 375 380
Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp
385 390 395 400
Val Asp Lys Trp Val Asp Ser Ser Gly Trp Val Tyr Leu Glu Ala Pro
405 410 415
Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ser Val Trp Ser Tyr
420 425 430
Cys Gly Val Gly
435
<210> 2
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Lys Tyr Leu Glu Leu Glu Glu Gly Gly Val Ile Met Gln Ala Phe
1 5 10 15
Tyr Trp Asp Val Pro Ser Gly Gly Ile Trp Asp Thr Ile Arg Gln Lys
20 25 30
Ile Pro Glu Trp Tyr Asp Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Trp Thr Asp Phe Ser Lys Val Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr
130 135 140
Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Val His Cys Cys Asp Glu Gly Thr Phe
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Trp Ala Ser Asn Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly
180 185 190
Val Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Val Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Val
195 200 205
Val Lys Asp Trp Leu Asp Trp Trp Gly Gly Trp Ala Val Gly Glu Tyr
210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
Ile Phe Val Arg Asn Gly Tyr Gly Asp Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Val Asp Lys Trp Val Asp Ser Ser Gly Trp Val Tyr Leu Glu Ala Pro
405 410 415
Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ser Val Trp Ser Tyr
420 425 430
Cys Gly Val Gly
435
<210> 3
<211> 1305
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctaaatacc tggaactgga agaaggtggt gttatcatgc aggctttcta ctgggacgtt 60
ccgtctggtg gtatctggtg ggacaccatc cgtcagaaaa tcccggaatg gtacgacgct 120
ggtatctctg ctatctggat cccgccggct tctaaaggta tgggtggtgc ttactctatg 180
ggttacgacc cgtacgactt cttcgacctg ggtgaatacg accagaaagg taccgttgaa 240
acccgtttcg gttctaaaca ggaactggtt aacatgatca acaccgctca cgcttacggt 300
atcaaagtta tcgctgacat cgttatcaac caccgtgctg gtggtgacct ggaatggaac 360
ccgttcgtta acgactacac ctggaccgac ttctctaaag ttgcttctgg taaatacacc 420
gctaactacc tggacttcca cccgaacgaa gttcattgct gcgacgaagg taccttcggt 480
ggtttcccgg acatctgtca ccataaatct tgggaccagt actggctgtg ggcttctaac 540
gaatcttacg ctgcttacct gcgttctatc ggtgttgacg cttggcgttt cgactacgtt 600
aaaggttacg gtgcttgggt tgttaaagac tggctggact ggtggggtgg ttgggctgtt 660
ggtgaatact gggacaccaa cgttgacgct ctgctgaact gggcttactc ttctgacgct 720
aaagttttcg acttcccgct gtactacaaa atggacgctg ctttcgacaa caaaaacatc 780
ccggctctgg ttgaagctct gaaaaacggt ggtaccgttg tttctcgtga cccgttcaaa 840
gctgttacct tcgttgctaa ccacgacacc gacatcatct ggaacaaata cccggcttac 900
gctttcatcc tgacctacga aggtcagccg accatcttct accgtgacta cgaagaatgg 960
ctgaacaaag accgtctgaa aaacctgatc tggatccacg accacctggc tggtggttct 1020
accgacatcg tttactacga caacgacgaa ctgatcttcg ttcgtaacgg ttacggtgac 1080
aaaccgggtc tgatcaccta catcaacctg ggttcttcta aagctggtcg ttgggtttac 1140
gttccgaaat tcgctggtgc ttgcatccac gaatacaccg gtaacctggg tggttgggtt 1200
gacaaatggg ttgactcttc tggttgggtt tacctggaag ctccggctca cgacccggct 1260
aacggttact acggttactc tgtttggtct tactgcggtg ttggt 1305
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtttcccgg acatctgtca ccataaatct tggg 34
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggtgacag atgtccggga aaccaccgaa ggt 33
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cacccgaacg aagttcattg ctgcgac 27
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgaacttcg ttcgggtgga agtccaggt 29

Claims (8)

1.具有高耐热性的α-淀粉酶突变体，其特征在于，通过将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型α-淀粉酶进行K152H/A166C/E168H点突变，获得所述α-淀粉酶突变体。
2.一种α-淀粉酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的具有高耐热性的α-淀粉酶突变体。
3.包含权利要求2所述的α-淀粉酶基因的重组载体。
4.包含权利要求2所述的α-淀粉酶基因的重组菌株。
5.一种制备具有高耐热性的α-淀粉酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1）制备包含权利要求2所述的α-淀粉酶基因的重组载体；
2）以步骤1）所得重组载体转化宿主细胞；
3）发酵培养所述宿主细胞，并分离α-淀粉酶。
6.权利要求1所述的具有高耐热性的α-淀粉酶突变体用于水解淀粉的应用。
7.权利要求1所述的具有高耐热性的α-淀粉酶突变体在能源、食品和饲料方面的应用。
8.权利要求2所述α-淀粉酶基因在能源、食品和饲料方面的应用。
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