CN105483099A - 具有改良特性的嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(AMYS)变体 - Google Patents

具有改良特性的嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(AMYS)变体 Download PDF

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Abstract

本发明描述了亲本α-淀粉酶的变体，该变体与该亲本α-淀粉酶相比呈现出下列性质中至少一种性质的改变：比活、底物特异性、底物结合、底物裂解、热稳定性、pH依赖活性、pH依赖稳定性、氧化稳定性、钙依赖性、pI和洗涤性能。该变体适用于淀粉转化、乙醇生产、衣物洗涤、盘碟洗涤、硬表面清洁、纺织品脱浆和/或增甜剂生产。

Description

具有改良特性的嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(AMYS)变体
本申请是申请人于2009年6月2日提交的题为“具有改良特性的嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(AMYS)变体”的中国专利申请200980121027.3的分案申请。
优先权
本申请要求2008年6月6日提交的美国临时专利申请系列号61/059,423的的优先权，其完整引入作为参考。
技术领域
本发明描述了亲本α-淀粉酶的变体，该变体与该亲本α-淀粉酶相比呈现出下列性质中至少一种性质的改变：比活(specificactivity)、底物特异性、底物结合、底物裂解、热稳定性、pH依赖活性、pH依赖稳定性、氧化稳定性、Ca2+依赖性、pI和洗涤性能。该变体适用于淀粉转化、乙醇生产、衣物洗涤、盘碟洗涤、硬表面清洁、纺织品脱浆和/或增甜剂生产。
背景技术
α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)构成一组酶，其催化淀粉，以及其他线性和有分支的1，4-糖苷低聚糖和多糖的水解。α-淀粉酶可以商业应用于：淀粉加工的初始阶段(液化)；湿玉米碾磨；醇的生产；用作洗涤剂基质中的清洁剂；纺织工业中用于淀粉脱浆；在烘烤应用中；在饮料工业中；在油矿中用于钻孔过程；再循环纸的脱墨和用于动物饲料中。
尽管目前可用的α-淀粉酶已在应用于这些用途中取得了一些成功，还需要具有提高的比活、合适的底物特异性、改良的热稳定性、pH稳定性和氧化稳定性，和降低的Ca2+依赖性的α-淀粉酶。
发明概述
一个方面，提供了Xtra或AmyS-样α-淀粉酶的新α-淀粉分解(酶)变体(突变体)，特别是显示作为在淀粉工业加工(淀粉液化、糖化、清洁等)方面相关的优点的改变特性的变体。
可通过在亲本α-淀粉酶中引入突变实现此类特性的改变，该亲本α-淀粉酶影响如比活、底物特异性、底物结合、底物裂解模型、热稳定性、pH/活性特征、pH/稳定性特征、针对氧化的稳定性、Ca2+依赖性和其他目的特性。例如，此改变可以产生这样的变体，其与亲本SpezymeXtra样α-淀粉酶相比，具有降低的Ca2+依赖性和/或改变的pH/活性特征和/或热稳定性。
在一些实施方案中，变体基于亲本嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)α-淀粉酶，或与此α-淀粉酶具有特定程度的氨基酸序列同一性，如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者甚至99％的氨基酸序列同一性。在其他实施方案中，变体基于相关亲本α-淀粉酶，例如与嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者甚至99％的氨基酸序列同一性的那些亲本α-淀粉酶。
在一些实施方案中，提供了具有α-淀粉酶活性和至少一种改良酶的性能的改变的特征的变体多肽，此变体多肽包含与选自AmyS(SEQIDNO：1)或AmyS的截短变体(SEQIDNO：2)的亲本α-淀粉酶多肽具有至少60％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，且在通过比对变体多肽与亲本多肽而确定的亲本α-淀粉酶多肽的氨基酸残基相应的氨基酸残基处具有至少一种以下突变，其中突变改变来自亲本多肽的氨基酸残基：
a)在一个或多个位点引入带正电的氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自D19、N28、E29、Q86、Q89、Q97、N224、N271、N281、D306、D318、Q319、Q358、D393、Q443和D458；
b)引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自74A、115L、124K、124R、132A、132C、135A、145A、146A、148A、148N、159A、159C、159D、159E、159F、159G、159H、159K、159L、159N、159R、159S、159T、159V、169A、169L、169M、169Y、179A、181A、181C、181D、181E、181L、181P、181Q、181V、181Y、242A、242D、242E、242Q、261L、271A、271V、278A、278H、278K、278N、278R、281A、281L、281M、302D、302M、304D、304E、304M、321A、321H、321Q、321R、333Q、378D、378N、378R、382D、398A、418A、418M、418N、420A、421R、432A、432D、432L、432M、432N、432Q、432R、432Y、437D、437G、437H、437L、437M、437Y、446A、446Y、454A、464Q、464Y、474A、474E、474K、474L、474M、474N、474P、474Q、474R、474S和474V；
c)引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自6I、6N、6Q、6T、6V、14T、16F、25A、25C、25G、25Q、27M、36Q、36S、39G、39V、50I、50L、50M、50N、50Q、52S、53T、67N、67S、80D、80I、90E、133P、133V、137M、137S、141E、141I、141L、141M、141Q、141R、141S、141V、150E、151I、152G、155S、155Y、168W、173T、188P、193F、193K、193L、193Y、213L、213M、213V、217Q、220P、220Q、220R、220S、220V、221I、221S、249E、250F、250I、250M、252L、253Y、254E、254F、254T、254V、255F、255K、255W、257L、257M、257S、257V、258D、258G、258H、258K、258Q、258T、258V、268F、274W、283M、283N、283V、285E、285Q、293G、293K、294W、301F、301I、301P、301R、301T、301W、309D、309V、312H、312S、312V、312Y、313G、313H、313I、313L、313S、313V、318T、338A、338C、338G、338M、338T、339K、339T、339V、340A、340M、340Q、340T、343C、343I、343P、343R、343Y、345I、345Q、369I、369T、370G、375T、385T、386K、394L、394V、400A、400N、400V、402H、402I、402T、402V、402W、403A、403E、403G、403Q、403R、403T、403V、404C、404E、404G、404I、404V、419A、419C、419M、419T、422E、422G、433A、433H、433I、433K、433L、433M、433V、433Y、442A、442G、442N、442R、442S、442T、442V、442W、442Y、445G、445I、445N、445T、445V、445W、447I、447N、447Q、447W、447Y、448C、448F、448G、448H、448I、448N、448Y、450C、450H、450M、450N、450R、450S、450T、450W、455G、455I、455P、455V、463A、463M、463S、463T、463V、463W、465G、465I、465K、465N、465T、465V、469D、469W、469Y、471I、471V、473G、473Y、476A、476G、476L、476M、476N和476T；
d)引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自124N、125A、125K、125N、130A、130S、159A、159D、159E、159G、159H、159K、159L、159N、159R、159S、159T、166F、166G、166H、166S、166Y、169L、179A、179P、180A、180D、180H、180K、180L、180N、180T、180V、180Y、181A、181D、181E、181G、181P、181R、181S、181V、187A、187C、187K、187N、187P、187Q、187R、187S、242H、242N、278H、278K、278N、278R、281M、302D、304M、304Y、321H、321Q、321R、333Q、432Q、437Y、446A、474Q和474S；
e)引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自6A、6D、6E、6H、6I、6K、6L、6M、6N、6P、6Q、6R、6S、6T、6V、6W、6Y、13K、14F、14T、14Y、15A、15D、15E、015G、15H、15K、15N、15P、15Q、15R、15S、15T、15W、16A、16E、16G、16H、16K、16N、16P、16Q、16R、16T、25C、39D、39E、39N、39Q、81Y、121P、139D、139H、139R、139Y、177A、188D、191H、191K、192A、192D、192G、192N、192P、192Q、192S、192T、192V、192Y、196A、196C、196D、196E、196F、196H、196I、196K、196P、196R、196S、196T、196V、201A、201E、201G、201H、201M、202H、216E、216G、216H、216M、216Q、216R、216S、216T、216Y、221A、221D、221F、221I、221L、221M、221N、221R、221S、221V、221Y、237G、240G、240N、240P、240Q、240R、240T、246R、250A、250D、250E、250F、250G、250I、250K、250L、250M、250N、250Q、250R、250S、250W、252K、268A、268D、268E、268G、268H、268K、268N、268P、268Q、268R、268S、274A、274D、274G、274I、274K、274L、274N、274Q、274R、274S、274T、275K、285Q、285Y、293K、293R、318A、318F、318G、318I、318K、318L、318M、318R、318S、318T、318V、318Y、319C、319D、319H、319I、319K、319R、319Y、320K、320R、320T、338A、338G、338I、338M、338P、338S、338V、339G、339P、340A、340D、340E、340H、340K、340N、340Q、345E、363D、363E、363M、363N、363Q、363S、366Q、370A、370D、370E、370H、370K、370N、370Q、370S、375A、375D、375E、375K、375N、375Q、375R、375S、419A、419I、419M、419P、419S、419V、448Y、452N、452Q、452R、452S、471R和471Y；和
f)引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自I181A、I181P、I181C、I181E、I181Y、S242A、S242E、G132A、N193Y和E188P。
在一些实施方案中，变体包括一个或多个位点引入带正电的氨基酸残基的取代，所述位点选自D19、N28、E29、Q86、Q89、Q97、N224、N271、N281、D306、D318、Q319、Q358、D393、Q443和D458；并且变体多肽展示出改良的清洁性能。在具体实施方案中，改良的清洁是在北美洗衣条件下，并采用微量样品测定法(microswatchassay)确定的。在具体实施方案中，带正电的氨基酸残基是精氨酸。在一些实施方案中，变体包括引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自74A、115L、124K、124R、132A、132C、135A、145A、146A、148A、148N、159A、159C、159D、159E、159F、159G、159H、159K、159L、159N、159R、159S、159T、159V、169A、169L、169M、169Y、179A、181A、181C、181D、181E、181L、181P、181Q、181V、181Y、242A、242D、242E、242Q、261L、271A、271V、278A、278H、278K、278N、278R、281A、281L、281M、302D、302M、304D、304E、304M、321A、321H、321Q、321R、333Q、378D、378N、378R、382D、398A、418A、418M、418N、420A、421R、432A、432D、432L、432M、432N、432Q、432R、432Y、437D、437G、437H、437L、437M、437Y、446A、446Y、454A、464Q、464Y、474A、474E、474K、474L、474M、474N、474P、474Q、474R、474S和474V，并且变体与亲本多肽相比具有改良的热稳定性。
在一些实施方案中，变体包括引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自6I、6N、6Q、6T、6V、14T、16F、25A、25C、25G、25Q、27M、36Q、36S、39G、39V、50I、50L、50M、50N、50Q、52S、53T、67N、67S、80D、80I、90E、133P、133V、137M、137S、141E、141I、141L、141M、141Q、141R、141S、141V、150E、151I、152G、155S、155Y、168W、173T、188P、193F、193K、193L、193Y、213L、213M、213V、217Q、220P、220Q、220R、220S、220V、221I、221S、249E、250F、250I、250M、252L、253Y、254E、254F、254T、254V、255F、255K、255W、257L、257M、257S、257V、258D、258G、258H、258K、258Q、258T、258V、268F、274W、283M、283N、283V、285E、285Q、293G、293K、294W、301F、301I、301P、301R、301T、301W、309D、309V、312H、312S、312V、312Y、313G、313H、313I、313L、313S、313V、318T、338A、338C、338G、338M、338T、339K、339T、339V、340A、340M、340Q、340T、343C、343I、343P、343R、343Y、345I、345Q、369I、369T、370G、375T、385T、386K、394L、394V、400A、400N、400V、402H、402I、402T、402V、402W、403A、403E、403G、403Q、403R、403T、403V、404C、404E、404G、404I、404V、419A、419C、419M、419T、422E、422G、433A、433H、433I、433K、433L、433M、433V、433Y、442A、442G、442N、442R、442S、442T、442V、442W、442Y、445G、445I、445N、445T、445V、445W、447I、447N、447Q、447W、447Y、448C、448F、448G、448H、448I、448N、448Y、450C、450H、450M、450N、450R、450S、450T、450W、455G、455I、455P、455V、463A、463M、463S、463T、463V、463W、465G、465I、465K、465N、465T、465V、469D、469W、469Y、471I、471V、473G、473Y、476A、476G、476L、476M、476N和476T，并且变体与亲本多肽相比具有改良的热稳定性。
在一些实施方案中，变体包括引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自124N、125A、125K、125N、130A、130S、159A、159D、159E、159G、159H、159K、159L、159N、159R、159S、159T、166F、166G、166H、166S、166Y、169L、179A、179P、180A、180D、180H、180K、180L、180N、180T、180V、180Y、181A、181D、181E、181G、181P、181R、181S、181V、187A、187C、187K、187N、187P、187Q、187R、187S、242H、242N、278H、278K、278N、278R、281M、302D、304M、304Y、321H、321Q、321R、333Q、432Q、437Y、446A、474Q和474S，并且变体与亲本多肽相比展示出提高的活性或表达。
在一些实施方案中，变体包括引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自6A、6D、6E、6H、6I、6K、6L、6M、6N、6P、6Q、6R、6S、6T、6V、6W、6Y、13K、14F、14T、14Y、15A、15D、15E、015G、15H、15K、15N、15P、15Q、15R、15S、15T、15W、16A、16E、16G、16H、16K、16N、16P、16Q、16R、16T、25C、39D、39E、39N、39Q、81Y、121P、139D、139H、139R、139Y、177A、188D、191H、191K、192A、192D、192G、192N、192P、192Q、192S、192T、192V、192Y、196A、196C、196D、196E、196F、196H、196I、196K、196P、196R、196S、196T、196V、201A、201E、201G、201H、201M、202H、216E、216G、216H、216M、216Q、216R、216S、216T、216Y、221A、221D、221F、221I、221L、221M、221N、221R、221S、221V、221Y、237G、240G、240N、240P、240Q、240R、240T、246R、250A、250D、250E、250F、250G、250I、250K、250L、250M、250N、250Q、250R、250S、250W、252K、268A、268D、268E、268G、268H、268K、268N、268P、268Q、268R、268S、274A、274D、274G、274I、274K、274L、274N、274Q、274R、274S、274T、275K、285Q、285Y、293K、293R、318A、318F、318G、318I、318K、318L、318M、318R、318S、318T、318V、318Y、319C、319D、319H、319I、319K、319R、319Y、320K、320R、320T、338A、338G、338I、338M、338P、338S、338V、339G、339P、340A、340D、340E、340H、340K、340N、340Q、345E、363D、363E、363M、363N、363Q、363S、366Q、370A、370D、370E、370H、370K、370N、370Q、370S、375A、375D、375E、375K、375N、375Q、375R、375S、419A、419I、419M、419P、419S、419V、448Y、452N、452Q、452R、452S、471R和471Y，并且变体与亲本多肽相比展示出提高的活性或表达。
在一些实施方案中，变体包括引入一个或多个氨基酸残基的取代，所述氨基酸残基选自I181A、I181P、I181C、I181E、I181Y、S242A、S242E、G132A、N193Y和E188P，并且变体与亲本多肽相比在淀粉液化试验中展示出提高的粘性降低。
在一些实施方案中，提供了变体α-淀粉酶多肽，其包含衍生自亲本α-淀粉酶多肽的氨基酸序列，并在一些位点上具有三个或更多个突变的组合，所述位点选自5、6、13、14、15、16、18、20、25、27、29、36、39、50、52、53、54、67、71、73、75、77、80、81、83、85、90、92、107、111、113、114、120、121、126、128、131、133、137、138、139、141、143、147、149、150、151、152、155、160、165、168、172、173、177、188、191、192、193、196、200、201、202、213、216、217、220、221、227、232、235、237、238、240、246、249、250、252、253、254、255、257、258、268、272、274、275、279、283、285、293、294、297、300、301、306、309、312、313、317、318、319、320、338、339、340、343、345、363、366、369、370、375、379、381、385、386、391、392、393、394、400、402、403、404、406、407、410、413、414、416、419、422、427、433、436、439、442、445、447、448、450、452、455、463、465、469、471、473和476，其中多肽具有α-淀粉酶活性，并且每个所述至少三个或更多个突变在这些位点引入与亲本多肽中的氨基酸残基不同的氨基酸残基。在具体实施方案中，突变数量是4、5、6、7、8、9、10或更多。
在一些实施方案中，如果突变未出现在位点242，突变与取代S242A、S242E、S242Q、S242F、S242H或S242N一起出现。在具体实施方案中，取代是S242Q。在一些实施方案中，如果突变未出现在位点179或180，突变与在位点179和180缺失一起出现。在一些实施方案中，如果突变未出现在位点349或428，突变与在一个或多个这些氨基酸处的半胱氨酸的取代一起出现。
在一些实施方案中，如果突变未出现在以下任一位点，突变与在位点P17、D19、T21、N28、S51、G72、V74、A82、Q86、Q89、A93、G95、Q97、W115、D117、P123、S124、D125、N127、I130，G132、Q135、P145、G146、G148、S153、Y159、W166、S169、K171、W187、P209、N224、S242、G256、D269、N271、T278、N281、G302、A304、R308、T321、Q358、P378、S382、K383、T398、H405、T417、E418、P420、G421、P432、W437、G446、G454、S457、T459、T461、S464、G474或R483处的取代一起出现。
在一些实施方案中，如果突变未出现在以下任一位点，突变与在位点M8、M9、M15、M96、V128、A111、H133、W138、T149、M197、N188、M200、M206、A209、A210、M284、M307、M311、M316、H405、T412、M438、N193F和V416G处的取代一起出现。
在一些实施方案中，亲本多肽与SEQIDNO：1的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％或甚至至少95％的氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，亲本多肽与SEQIDNO：2的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％或甚至至少95％的氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，亲本多肽与选自SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：15和SEQIDNO：16的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％或甚至至少95％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，亲本多肽包含C-端氨基酸残基的截短。在具体实施方案中，该截短是C-端29个氨基酸残基。
在一些实施方案中，变体多肽不包含在位点106或199或这两个位点处的突变。
在一些实施方案中，从不脱离本说明书的突变清单中可以增加或缺失一个或多个突变。相关地，出现在突变清单背景中的任一个或多个突变可组合为突变子集。
在另一方面，提供了包含一个或多个上述变体α-淀粉酶的组合物。在具体实施方案中，该组合物是清洁组合物，如衣物洗涤剂、盘碟洗涤剂、硬表面清洁组合物等。此组合物可包括洗涤剂。
在另一方面，提供了使用α-淀粉酶变体水解可溶淀粉底物的方法。在一些实施方案中，变体包含引入选自I181A、I181P、I181C、I181E、I181Y、S242A、S242E、S242Q、G132A、N193Y和E188P的一个或多个氨基酸残基的取代。
在一些实施方案中，变体α-淀粉酶与植酸水解酶组合使用，其中α-淀粉酶的活性(按α-淀粉酶单位)与植酸活性(按植酸酶单位)的比率，即AAU∶FTU，是从约1∶15到约15∶1，且优选从1∶10到约10∶1。在具体实施方案中，AAU∶FTU的比率是从1∶4到3∶1，或甚至1∶1。
在另一方面，提供了用于在包含底物的料浆中液化淀粉的方法，其涉及包含植物材料(如来自干磨法或湿磨法的颗粒淀粉)的底物，该方法包括初级和/或次级液化步骤，涉及在初级和/或次级液化步骤中同时或分别地以任意顺序添加至少一种植酸水解酶和至少一种变体α-淀粉酶的组合至料浆。该方法可以还包括糖化液化的淀粉以获得可发酵糖；并且回收可发酵糖。在一些实施方案中，该方法还包括在合适的发酵条件下发酵可发酵糖以获得终产物如醇。在一些实施方案中，酶组合物含有至少一种变体α-淀粉酶和植酸酶。在一些实施方案中，酶组合物为掺合物形式。
在另一方面，提供了涉及用于发酵淀粉底物的方法，该方法包括以任意顺序添加单一或分批量的变体α-淀粉酶和植酸酶的组合。在另一方面，将处理的淀粉底物发酵成乙醇。
在另一方面，提供了不要求添加酸或碱来调节pH的淀粉转化方法和/或乙醇发酵方法。一个实施方案涉及无调节pH的液化步骤，其中液化的pH在pH4.5到pH5.4范围内且液化过程步骤中不添加酸中和化学品。另一实施方案中，液化的pH在pH4.8到pH5.8范围内且液化过程步骤中不添加酸中和化学品。
在另一方面，提供了获得可发酵底物的方法，涉及使含有颗粒淀粉的磨碎谷物料浆与植酸水解酶在比淀粉糊化(gelatinization)温度低约0℃至30℃的温度接触，使该料浆与变体α-淀粉酶接触，升高温度高于颗粒淀粉糊化温度以引起淀粉糊化，并通过使糊化的淀粉与α-淀粉酶接触足以水解该淀粉的时间而水解糊化的淀粉，并且获得可发酵底物。植酸水解酶可以是细菌或真菌植酸酶。真菌植酸酶可以是曲霉属(Aspergillus)植酸酶或布丘氏菌属(Buttiauxella)植酸酶。在一些实施方案中，细菌植酸酶来自大肠杆菌(E.coli)。
在另一方面，提供了用于产生可发酵糖的方法，其包括(a)将含有磨碎淀粉的材料与水和稀釜馏物(thinstillage)混合，其中稀釜馏物占10至70％v/v，并且获得包含淀粉及具有20至50％w/w干固体(ds)含量的料浆，(b)用植酸酶在液化淀粉之前或与之同时处理该料浆，(c)液化该淀粉，(d)在步骤(b)期间和/或与液化步骤同时添加变体α-淀粉酶至所述淀粉和(e)糖化液化的淀粉以获得可发酵糖，其中在步骤(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的任意步骤期间不调节pH。在一些实施方案中，将可发酵糖回收和纯化或异构化。在其他实施方案中，在液化步骤之前添加植酸酶。在一些实施方案中，α-淀粉酶随植酸酶一起添加。在其他实施方案中，在液化步骤期间添加第二份α-淀粉酶剂量。
在另一实施方案中，提供了从含淀粉的材料中生产醇的方法，其包括按照以上公开液化并糖化已液化的淀粉，以获得可发酵糖，并进而在合适的发酵条件下使用发酵微生物发酵可发酵糖来获得醇。在一些实施方案中，液化和发酵同时进行。在一些实施方案中，醇是乙醇。
在另一方面，提供了编码变体α-淀粉酶的DNA构建体，包括表达载体，以及单独或与其他α-淀粉分解酶组合用于例如各种工业过程(如淀粉液化和清洁)的表达和使用变体α-淀粉酶的方法。
附图简述
图1显示几种AmyS相关α-淀粉酶氨基酸序列的比对。
图2显示pHPLT-AmyS质粒。
图3显示S242文库变体在95℃热应激30分钟后的残余活性百分数。变体位点P、S、W和Y缺失，并由野生型AmyS(Xtra-标记为“Z”)取代。线条指示在野生型酶的残余活性百分数的标准差之上2倍和3倍。S242A和S242Q清晰地显示比野生型更高的残余活性。
图4A-4I显示图1中所示的氨基酸序列的逐对比对。
图5显示在没有钙添加的情况下野生型和淀粉酶变体的热熔融曲线和熔点。
图6显示在有2mM的钙情况下野生型和淀粉酶变体的热熔融曲线和熔点。
图7显示SPEZYMEXtra和两种变体相对于LIQUOZYMESC在三个时间点的活性特征。
图8显示4种变体相对于S242Q变体在3个时间点的活性特征。
图9显示因30μg剂量的α-淀粉酶SC或Xtra的作用所致的谷物粉粘度降低。
图10显示因30μg剂量的α-淀粉酶SC或Xtra或两种变体(S242A和S242Q)之一的作用所致的谷物粉粘度降低。
图11显示因20μg剂量的α-淀粉酶SC或Xtra或两种变体(S242A和S242Q)之一的作用所致的谷物粉粘度降低。
图12显示用SC、Xtra或两种变体(S242A和S242Q)之一经过时间(0、30、60和90分钟)处理的全磨谷物的DE进展。
图13显示用SC、Xtra或两种变体(S242A和S242Q)之一经过时间(0、30、60和90分钟)处理的全磨谷物的喷射之后粘度。
图14显示用植酸酶和淀粉酶(Xtra或S242Q变体)经过时间(0、30、60和90分钟)处理的全磨谷物的DE进展。是从Danisco分公司Genencor可获得的植酸酶/淀粉酶掺合物。参考实施例8。
图15显示用植酸酶和淀粉酶(例如，Xtra或S242Q变体)经过时间(0、30、60和90分钟)处理的全磨谷物的喷射之后粘度。
图16显示用S242Q变体和植酸酶处理的全磨谷物的DE进展。参考实施例9。
图17显示用S242Q变体和植酸酶处理的全磨谷物的喷射之后粘度。参考实施例9。
图18显示植酸酶处理全磨谷物对提高S242Q变体的热稳定性和低pH稳定性的影响并参考实施例9。
图19显示在全磨谷物初级液化期间添加植酸酶对喷射蒸煮后粘度降低的影响并参考实施例9。
图20显示DDGS中的硫酸和植酸含量的比较：1)来自常规方法；2)来自无pH调节的方法。参考实施例10。
图21是显示DE进展的速率和植酸降低百分数作为IP6的图。
图22是显示S242Q变体α-淀粉酶对常规加工条件下DE进展的影响的图。参考实施例8。
图23是描述S242Q及其变体在北美洗衣条件下，在稻淀粉微量样品测定法中作为电荷之函数的性能的图。此条件为20℃的Tide2x。参考实施例16。
图24是描述了另一α-淀粉酶(即，芽孢杆菌属物种(Bacillussp.)截短TS-23淀粉酶)在西欧洗衣条件下，在稻淀粉微量样品测定法中随电荷突变的性能的图。此条件为40℃的参考实施例16。
图25是描述S242Q及其变体在BODIPY-淀粉测定法中作为电荷之函数的性能的图。参考实施例16。
图26A是描述作为相对振摇管表达之函数的相对BODIPY-淀粉水解作用(即，相对BODIPY-淀粉水解与相对振摇管表达)的图。图26B是描述作为相对振摇管表达之函数的相对微量样品-淀粉水解作用(即，相对微量样品-淀粉水解作用与相对振摇管表达)的图。参考实施例19。
图27A是描述作为电荷之函数的相对振摇管表达的图。图27B是描述作为电荷之函数的相对BODIPY-淀粉水解作用的图。参考实施例19。
图28A是描述作为电荷之函数的相对振摇管表达的图。图28B是描述作为电荷之函数的相对微量样品清洁活性的图。参考实施例19。
图29是描述在采用第一AmySLadder(阶梯)30％DS、pH5.8、酶剂量30mg的谷物使淀粉液化后的最终粘度的图。对于+6变体，最终粘度太高且无法测量(仪表超量程)。参考实施例16。
图30是描述作为电荷之函数的相对于野生型的第一AmyS电荷阶梯的热稳定性的图。实施的实验采用标准淀粉酶热稳定性测定法。参考实施例17。
图31A是描述作为pH之函数的第一AmyS电荷阶梯的稻淀粉清洁活性的图。pH3.0-4.25是200mM甲酸钠+0.01％Tween-80。pH4.25-5.5是200mM醋酸钠+0.01％Tween-80。数据符合滴定曲线，每条曲线都有单一pKa值。参考实施例21。
图31B是描述电荷突变对用于AmyS催化(第一电荷阶梯)的直观pKa的影响的图。参考实施例21。
图32A显示相对于Xtra，通过AmyS变体的谷物粉的粘度降低。
图32B显示通过AmySN193Y的谷物粉的粘度降低。
图32C显示通过AmySN193Y的植酸添加对粘度降低的影响。
序列简述
本文参考以下氨基酸和核酸序列。
SEQIDNO：1(全长、野生型AmyS)
SEQIDNO：2(截短、野生型AmyS；Xtra)
SEQIDNO：3(全长、S242AAmyS)
SEQIDNO：4(全长、S242QAmyS)
SEQIDNO：5(全长、S242EAmyS)
SEQIDNO：6(Yamane707)
SEQIDNO：7(野生型AmyL；LAT)
SEQIDNO：8(野生型AmyL；Termamyl)
SEQIDNO：9(解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)淀粉酶)
SEQIDNO：10(STAINZYMETM)
SEQIDNO：11(NATALASETM)
SEQIDNO：12(KAOKSM1378)
SEQIDNO：13(KAOKSMK38)
SEQIDNO：14(KAOKSMK36)
SEQIDNO：15(SC)
SEQIDNO：16(Ethyl)
SEQIDNO：17(引物S242F)
5′-[Phos]GTCAAGCATATTAAGTTCNNSTTTTTTCCTGATTGGTTG-3′
SEQIDNO：18(引物S242R)
5′-[Phos]CAACCAATCAGGAAAAAASNNGAACTTAATATGCTTGAC-3′
SEQIDNO：19(BP17植酸酶)
SEQIDNO：20(LAT信号肽的编码序列)
atgaaacaacaaaaacggctttacgcccgattgctgacgctgttatttgcgctcatcttcttgctgcctcattctgcagcttcagca
SEQIDNO：21(LAT信号肽)
MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAASA
SEQIDNO：22(截短S242QAmyS)
SEQIDNO：23(成熟AmyS的编码序列)
SEQIDNO：24(SatoriF)
5′-CTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTC-3′
SEQIDNO：25(SatoriR)
5′-TTATCCTTTACCTTGTCTCCAAGC-3′
发明详述
I.介绍
本组合物和方法涉及亲本α-淀粉酶的变体，该变体与亲本α-淀粉酶相比呈现出下列性质中至少一种性质的改变：比活、底物特异性、底物结合、底物裂解、热稳定性、pH依赖活性、pH依赖稳定性、氧化稳定性、Ca2+依赖性、pI和洗涤性能。该变体适用于淀粉转化、乙醇生产、衣物洗涤、盘碟洗涤、硬表面清洁、纺织品脱浆和/或增甜剂生产。
尽管描述了大量突变，它们普遍具有在氨基酸序列同一性和立体结构方面有相同结构特征的亲本α-淀粉酶的改良的性能。已发现这些突变中的几种突变可与其他突变组合，这使它们在设计具有预选择的特性的变体α-淀粉酶方面具有特定价值。还描述了或者通常不可突变的位点，或者对突变和与其他突变的组合不可行(amendable)的位点。这些位点的确定在设计具有预选择的特性的变体α-淀粉酶方面也是重要的。
尽管主要使用来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的特定亲本α-淀粉酶来实施支持本组合物和方法的研究，结构相关的α-淀粉酶可能从等效突变中受益。因此，本描述基于某些氨基酸残基在特定位点的出现，提供用于改变大量α-淀粉酶的任意α-淀粉酶，以在性能特征方面产生有益改变；并确定有可能具有合意的性能特征的新α-淀粉酶的路线图。
以下更详细地描述了组合物和方法的这些和其他方面及实施方案。
II.定义和命名法
在更详细地描述了本组合物和方法之前，以下列出各种术语、命名法和通用原则。
A.定义
清楚定义了以下术语和习惯用语。未定义的术语和习惯用语应具有其如本领域所用的通常意义。参考标准分子生物学参考文献，如Sambrook等人，MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL(第二版，1989)；Kreigler，GENETRANSFERANDEXPRESSION；ALABORATORYMANUAL(1990)和Ausubel等人，编著.CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(1994)；Singleton等人，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY，第2版，JohnWiley和Sons，NewYork(1994)；和Hale与Markham，THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY，HarperPerennial，NY(1991)。
如此处所用的术语“淀粉”指包含植物复杂多糖糖类、包含具有式(C6H10O5)x(其中X可以是任意数)的直链淀粉和支链淀粉的任何材料。淀粉的示例性来源包括但不限于谷物、草、块茎和根，更具体地，是指小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高粱、糠、木薯、粟、马铃薯、甘薯和木薯。
如本文所使用的术语“α-淀粉酶”指催化1，4-α-糖苷键(即E.C.类3.2.1.1)水解的酶。这些酶还被描述为影响包含1，4-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖中1，4-α-糖苷键的内切或外切水解。用于描述这些酶的另一术语是糖元酶。示例性酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶。
如本文所使用的在涉及细胞、核酸、蛋白质或载体时使用的术语“重组”，是指该细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质，或天然核酸或蛋白质的改变而被修饰，或者指的是该细胞源自这样修饰过的细胞。所以，例如重组细胞表达在天然(非重组的)形式的细胞中未发现的基因，或者表达那些否则会异常表达(下调或者完全不表达)的天然基因。
如本文所使用的术语“蛋白质”和“多肽”在本文互换地使用，指由肽键链接的氨基酸残基的连续的链。本文中使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。
如本文所使用的“信号序列”指在多肽的N-端的氨基酸残基序列，其促进胞外多肽向细胞外分泌。胞外蛋白的成熟形式缺少在分泌过程中被切除的信号序列。
如本文所使用的“基因”指参与产生多肽，并包括在编码区之前及之后的区域以及各个编码区段(外显子)之间间插序列(内含子)的DNA区段。基因的名称通常是斜体的，相应蛋白的名称通常不是斜体且第一个字母大写。
如本文所使用的术语“核酸”和“多核苷酸”可以互换使用，指由磷酸二酯酶或类似键链接的核苷的连续的链，包括DNA、RNA、单链、双链，或部分部双链、以及其化学修饰的DNA或RNA或合成衍生物。除非另外说明，核酸的序列以5’至3’的方向出现。因为遗传密码是简并性的，本领域的技术人员喜欢多于一个密码子可以编码一个特定的氨基酸。
如本文所使用的“载体”是指设计了用来将核酸引入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、表达盒等。
如本文所使用的“表达载体”指包含DNA序列的DNA构建体，该DNA序列有效连接能够影响其在适宜宿主中表达的适宜控制序列。这样的控制序列可包括影响转录的启动子、控制转录的可选操纵子序列、编码mRNA上合适核糖体结合位点的序列、增强子和控制转录和翻译终止的序列。
如本文所使用的“启动子”是在结合RNA聚合酶以起始基因转录中涉及的调节序列。启动子可以是诱导性启动子或组成型启动子。示例性启动子来自里氏木霉(Trichodermareesei)cbh1基因，其是诱导性启动子。
如本文所使用的术语“在转录控制下”是指特定多核苷酸(通常是DNA序列)的转录依赖于其有效连接的调节其转录的特定启动子和/或其他一个或多个元件。
如本文所使用的术语“在翻译控制下”是指特定多核苷酸(通常是mRNA序列)的翻译，其依赖于其有效连接到的调节其翻译的一个或多个特定元件。
如本文所使用的术语“源自”包含术语“起源于”、“获自”或“可得自”和“分离自”，并用于表示特定多肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞或类似物是亲本多肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞或类似物的改变的变体。
如本文所使用的“有效连接的”指所述及的组分之间处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系中。例如，调节序列与编码序列以这样的方式“有效连接”，即，由此可在与控制序列匹配的条件下实现该编码序列的表达。
术语“选择/可选择标记”指这样的基因，该基因能够在宿主细胞中表达，以允许使用培养基成分或生长条件容易地选择那些宿主细胞。可选择标记的实例包括但不限于提供抗生素/对抗微生物抗性(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予代谢或营养优势的基因。
如本文所使用的，当碱基或氨基酸残基所占的特定百分比与随后的比对序列相同时，多核苷酸或多肽与另一序列具有一定“百分比/百分比序列同一性”(例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)。比对和百分比同源性或同一性可以使用本领域已知的适宜软件程序来测定，例如记载于CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel等人编辑(1987)，增刊30，7.7.18部分)中的那些。优选的程序包括VectorNTIAdvanceTM9.0(InvitrogenCorp.Carlsbad，CA)，GCGPileup程序，FASTA(Pearson等人(1988)Proc.NatlAcad.SciUSA85：2444-2448)和BLAST(BLASTManual，Altschul等人，NatlCent.Biotechnol.Inf.，NatlLib.Med.(NCIBNLMNIH)，Bethesda，Md.，和Altschul等人，(1997)NAR25：3389-3402)程序。另一优选的比对程序是ALIGNPlus(ScientificandEducationalSoftware，PA)，其使用缺省参数。另一个可用的序列软件程序是TFASTA数据搜索程序，可来自序列软件包6.0版(SequenceSoftwarePackageVersion6.0)(威斯康辛麦迪逊的威斯康辛大学遗传计算机组(GeneticsComputerGroup，UniversityofWisconsin，Madison，WI)。
如本文所使用的“宿主菌株”或“宿主细胞”是指这样的生物体，其适于引入包含编码目标多肽的多核苷酸的表达载体或DNA构建体。宿主细胞优选为细菌或真菌细胞但也可以是植物细胞(如原生质体)、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
如本文所使用的术语“培养”是指在适宜条件下，在液体或固体培养基中生长微生物细胞群体。培养包括含有颗粒淀粉的淀粉底物发酵生物转化为终产物(通常是在容器或反应器中)。
如本文所使用的术语“发酵”是指用微生物酶促和基本厌氧分解有机底物来产生更简单的有机化合物。虽然一般在厌氧条件下发生发酵，但是这并不意味着该术语仅仅限于严格厌氧条件，因为在氧存在的情况下也发生发酵。
如本文所使用的术语“接触”涉及酶及其底物时指将酶放置到足够靠近底物的位点，以使该酶能够转化底物为终产物(即，对底物起作用)。混合酶与底物的溶液或悬浮体能够导致接触。
如本文所使用的术语“酶转化”一般指通过酶作用的底物修饰，例如，通过淀粉酶、葡糖淀粉酶或其他酶的作用对淀粉底物的修饰。
如本文所使用的术语“糖化”指淀粉酶促转化为葡萄糖。
如本文所使用的术语“糊化”指通过烹饪形成粘稠悬浮体的淀粉(如生或晶体状淀粉)的溶解。
如本文所使用的术语“液化”是指其中糊化的淀粉水解为低分子量可溶糊精的淀粉转化阶段。
如本文所使用的术语“聚合度(DP)”指给定糖的无水吡喃葡萄糖单元数量。DP1糖的实例是单糖，例如葡萄糖和果糖。DP2糖的实例是二糖，例如麦芽糖和蔗糖。DP＞3的糖具有大于3的聚合度。
如本文所使用的术语“终产物”或“目的终产物”指从底物如淀粉酶促衍生的分子。
如本文所使用的术语“干固体含量(ds)”指以干重计(％wt/wt).，料浆中总固体的百分含量(％)。
如本文所使用的术语“料浆(slurry)”指含有不溶固体的含水混合物。
如本文所使用的术语“残余淀粉”指发酵后在淀粉组合物中剩余的淀粉(可溶或不可溶)。
如本文使用的“再循环步骤”指醪液(mash)成分的再循环，醪液中可包括残余淀粉、酶和/或影响或参与额外的淀粉组合物发酵的微生物。
如本文所使用的术语“醪液”指可用于产生发酵产物(例如醇)的可发酵碳分子(例如糖类)在水中的混合物。术语“发酵醪(beer)”和“醪液”可互换使用。
如本文所使用的术语“釜馏物(stillage)”指未发酵的固体和水的混合物，其是从发酵的醪液中除去乙醇之后的残留物。
如本文所使用的术语“干酒糟(DDG)”和“具有可溶物的干酒糟(DDGS)”指谷物发酵的有用副产物。
如本文使用的“产乙醇微生物”指能够将糖或寡糖转化为乙醇的微生物。产乙醇微生物由于其能够表达一种或多种酶而一般能够产乙醇，该酶可单独或一起将糖转化为乙醇。
如本文使用的术语“乙醇生产者”或“产乙醇微生物”指能够从己糖或戊糖产生乙醇的任何生物或细胞。一般来讲，产乙醇细胞含有乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶。产乙醇微生物的实例包括真菌微生物，例如酵母菌。优选的酵母菌包括酵母属(Sacchromyces)，特别是酿酒酵母(S.cerevisiae)。
如本文使用的涉及多核苷酸或多肽的术语“异源的”指不是天然发生于宿主细胞中的多核苷酸或多肽。蛋白质可以是商业上重要的工业多肽，例如酶。这意味着，该术语涵盖了作为天然基因、突变基因和/或合成基因(或由天然基因、突变基因和/或合成基因编码的)的多核苷酸或多肽。
如本文使用的涉及多核苷酸或多肽的术语“内源的“指天然发生于宿主细胞中的多核苷酸或多肽。
如本文使用的术语“回收的”、“分离的”和“分开的”用于指从与其天然相关的至少一种组分中分离出来的化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。
如本文所使用的涉及细胞的术语“转化的”“稳定转化的”和“转基因的”意思是该细胞具有非天然的(例如异源的)核酸序列，该序列整合到细胞基因组中或者作为游离质粒在多次传代中得以保持。
本文中使用的术语“表达”指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。
如本文所使用，在将核酸序列插入到细胞中的背景中，术语“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并包括指将核酸序列合并到真核或原核细胞中，其中该核酸序列可以并入细胞的基因组中(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)、转化为自主复制子或瞬时表达(例如转染的mRNA)。
本文使用的术语“比活”指在特定条件下每单位时间被酶或酶制剂转化为产物的底物的摩尔数。比活一般用单位(U)/mg蛋白质表示。
本文使用的术语“产量”指使用特定方法和特定试剂(包括酶)产生的终产物的量。该终产物的量可以按质量、体积、浓度等表达，且可以包括原始材料(如底物)的量、时间或其他条件。
本文使用的术语“性能指数(PI)”指变体酶于亲本或参照酶之间的性能比。在该背景中，多种其他术语和惯用语被用来表征变体的性能：“启动区突变(upmutation)”具有PI＞1；中性突变具有PI＞0.5；非缺失突变具有PI＞0.05；缺失突变具有PI＝0.05；可组合的突变对至少一种性能具有PI＝0.5，并对所有性能具有PI＞0.05。
本文使用的术语“可组合的突变”是能够组合以产生(deliver)具有针对一种或多种预期性质(见上文)的预选性能指数(PI)的蛋白质的突变。
本文使用的术语“ATCC”指美国典型培养物保藏中心，其位于Manassa，VA，美国。
本文使用的术语“NRRL”指农业研究服务培养物保藏中心，农业应用研究国家中心(AgriculturalResearchServiceCultureCollection，NationalCenterforAgriculturalUtilizationResearch，以前叫USDA北方地区研究实验室)，其位于Peoria，IL，美国。
一般而言，数值范围包括定义该范围的数值。除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一”、“一个”和“该”涵盖对复数形式的提及。本文提供的题目是为方便阅读，且不应解释为将所述主题内容局限在为说明书的一部分。所有专利和出版物明确引入本文作为参考，包括在此类专利和出版物中公开的所有序列。
B.命名法
除非另有说明，使用氨基酸残基的常规单字母和三字母密码。为了。用下列命名法描述变体多肽：原始氨基酸：位点：取代氨基酸。
根据这种命名法，例如，在位点242用丙氨酸取代丝氨酸表示为：
Ser242Ala或S242A
位点30的丙氨酸缺失表示为：
Ala30＊或A30＊或ΔA30
其他氨基酸残基的插入，例如赖氨酸的插入，表示为：
Ala30AlaLys或A30AK
连续氨基酸残基片段的缺失，例如氨基酸残基30-33，表示为(30-33)＊或Δ(A30-N33)。
当多肽与其他多肽(或亲本多肽)相比，包含“缺失”且在这一位点进行了插入，表示为：
＊36Asp或＊36D，该实例指在位点36插入天冬氨酸。
多个突变用加号隔开。例如，在30和34位分别用丙氨酸和谷氨酸取代天冬酰氨和丝氨酸的突变表示为：
Ala30Asp+Glu34Ser或A30N+E34S
当一个或多个备选氨基酸残基可以插入在指定位点时，表示为：
A30N，E或A30N或A30E。
并且，当鉴定了适宜于修饰的位点但没有指定的任何特定修饰时，应理解为任何氨基酸残基可以取代此位点的氨基酸残基。因此，例如，当提及位点30处的丙氨酸的修饰但是并未指明时，应理解为丙氨酸可以被缺失或取代为任何其他氨基酸，即下列氨基酸中的任何一个：
R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V。
另外，“A30X”指下列取代中的任何一个：
A30R、A30N、A30D、A30C、A30Q、A30E、A30G、A30H、A30I、A30L、A30K、A30M、A30F、A30P、A30S、A30T、A30W、A30Y或A30V；也可以表示为：A30R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V。
如果用于编号的亲本酶已经含有所讨论的，在其位点建议进行取代的氨基酸残基，当例如N或V之一存在于野生型中的情况下，则用下列命名法：
“X30N”或“X30N，V”。
所以，这意味着其他相关的亲本酶在位点30处被取代为“Asn”或“Val”。
C.氨基酸残基特征
提供以下氨基酸残基的一般信息特征供参考：
带电荷的氨基酸：
Asp、Glu、Arg、Lys、His
带负电荷的氨基酸(从带负电最多的残基开始排列)：
Asp、Glu
带正电荷的氨基酸(从带正电最多的残基开始排列)：
Arg、Lys、His
中性氨基酸：
Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Met、Cys、Asn、Gln、Ser、Thr、Pro
疏水氨基酸残基(最疏水的残基排在最后)：
Gly、Ala、Val、Pro、Met、Leu、Ile、Tyr、Phe、Trp，
亲水氨基酸(最亲水的残基排在最后)：
Thr、Ser、Cys、Gln、Asn
III.α-淀粉酶用于本发明组合物和方法
以下段落描述了根据本本文说明可修饰和使用的“Xtra-样”或“AmyS-样”α-淀粉酶。
A.α-淀粉酶的同源性
已实施的支持本组合物和方法的实验采用由SEQIDNO：2示例的嗜热脂肪土芽孢杆菌(之前为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)α-淀粉酶(即，AmyS)实施。这种淀粉酶的变体是市售的，如Xtra(DaniscoUSInc，GenencorDivision，PaloAlto，CA，USA)。
芽孢杆菌物种产生的大量α-淀粉酶与AmyS在氨基酸水平上具有高度同源性(同一性)，且本文描述的许多突变在这些淀粉酶内产生时预计将产生类似效果，这些酶总体指如“Xtra-样”α-淀粉酶或“AmyS-样”α-淀粉酶。大量已知芽孢杆菌α-淀粉酶的同一性总结在表A中：
表A.百分比同一性
707 AP1378 BAN BSG SP690 SP722 AA560 LAT
707 100.0 86.4 66.9 66.5 87.6 86.2 95.5 68.1
AP1378 86.4 100.0 67.1 68.1 95.1 86.6 86.0 69.4
BAN 66.9 67.1 100.0 65.6 67.1 68.8 66.9 80.7
BSG 66.5 68.1 65.6 100.0 67.9 67.1 66.3 65.4
SP690 87.6 95.1 67.1 67.9 100.0 87.2 87.0 69.2
SP722 86.2 86.6 68.8 67.1 87.2 100.0 86.8 70.8
AA560 95.5 86.0 66.9 66.3 87.0 86.8 100.0 68.3
LAT 68.1 69.4 80.7 65.4 69.2 70.8 68.3 100.0
发现具有SEQIDNO：7所示的氨基酸序列的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)α-淀粉酶(LAT)与具有SEQIDNO：9所示的氨基酸序列的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)α-淀粉酶具有约81％的同源性，且与包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列的嗜热脂肪土芽孢杆菌(之前为嗜热脂肪芽孢杆菌)α-淀粉酶(BSG；AmyS)具有约65％的同源性。同源α-淀粉酶还包括WO95/26397中公开的SP690和SP722，以及源自杆菌物种的#707α-淀粉酶，此α-淀粉酶由SEQIDNO：6所示并在Tsukamoto等人.(1988)BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications151：25-31中描述。KSMAP1378α-淀粉酶(SEQIDNO：12)在WO97/00324(来自KAOCorporation)中公开。
同源α-淀粉酶还包括EP0252666中描述的由地衣芽孢杆菌菌株(ATCC27811)产生的α-淀粉酶，及WO91/00353和WO94/18314中鉴定的α-淀粉酶。其他市售Xtra-样α-淀粉酶包含在以下列商品名销售的产品中：AA和Ultraphlow(可获自DaniscoUSInc，GenencorDivision)，和KEISTASETM(可获自Daiwa)和SC(SEQIDNO：15)(可获自Novozymes，DK)。其他相关α-淀粉酶包括(SEQIDNO：8；Novozymes)，STAINZYMETM(SEQIDNO：10；Novozymes)，NATALASETM(SEQIDNO：11；Novozymes)，KAOKSMK38(SEQIDNO：13)，KAOKSMK36(SEQIDNO：14)，其他表中提到的α-淀粉酶和其他本文描述的α-淀粉酶。
由于已发现这些α-淀粉酶之间的基本同源性，认为它们属于同一类α-淀粉酶并且涵盖于本发明组合物和方法中。如果嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQIDNO：2)用作起始点，在这些和其他α-淀粉酶如SP722、BLA、BAN、AA560、SP690、KSMAP1378、#707和其他芽孢杆菌α-淀粉酶的相应位点也预计从将描述的修饰中受益。
因此，术语Xtra样α-淀粉酶或AmyS样α-淀粉酶意在包括具有SEQIDNO：1、2、6、7、8、9、10、11、12、15和16的氨基酸序列的α-淀粉酶。在一些实施方案中，Xtra样α-淀粉酶或AmyS样α-淀粉酶还包括与SEQIDNO：2在氨基酸水平上具有基本同一性的α-淀粉酶，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％的同源性(同一性)。在另一些实施方案中，Xtra样α-淀粉酶或AmyS样α-淀粉酶还包括与SEQIDNO：1、2、6、7、8、9、10、11、12、15和16的一个或多个在氨基酸水平上具有基本同一性的α-淀粉酶，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％的同源性(同一性)。
已知或疑似α-淀粉酶与参照α-淀粉酶的同源性可利用本领域已知的计算机程序测定。通常Xtra(SEQIDNO：2)和例如另一种α-淀粉酶之间的结构性比对可以用于鉴定在其他Xtra样α-淀粉酶中的等同/对应位点，该Xtra样α-蛋白酶可按本文描述突变以产生类似效果。一个示例性程序是GAP，其在GCG程序包(上文所述)中提供。具体地，可以以缺省计分矩阵鉴定和下列缺省参数使用GapGCGv8：GAP分别建立罚分5.0和GAP延伸罚分0.3，用于核酸序列比较；GAP分别建立罚分3.0和GAP延伸罚分0.1用于蛋白质序列比较。GAP使用Needleman和Wunsch，(1970)，J.Mol.Biol.48：443-453中描述的方法进行比对和计算同一性。其他程序和方法示本领域已知的。
得到这种结构性比对的另一种方法是利用来自GCG程序包的PileUp程序，使用缺口罚分的缺省值，即，缺口建立罚分3.0和缺口延伸罚分0.1。其他结构性比对的方法包括疏水簇分析(Gaboriaud等人，(1987)，FEBSLETTERS224，第149-155页)和反向线索(reversethreading，Huber，T；Torda，AE，PROTEINSCIENCE，第7卷，第1期，第142-149页(1998))。
Xtra样α-淀粉酶或AmyS样α-淀粉酶又包括DNA序列编码的多肽，该DNA序列与前面提到的一个或多个α-淀粉酶的编码DNA序列杂交，如由WO06/002643的SEQIDNO：9(BAN)、5(BSG；AmyS)、3(SP722)、1(SP690)、7(LAT)和11(AA560)和编码SEQIDNO：1、2、6、7、8、9、10、11、12、15和16的氨基酸序列的多核苷酸所示例的。当核酸的单链形式能够与另一条核酸在适宜的温度和溶液离子强度条件下复性时，该核酸为能够与另一条核酸序列杂交。杂交和洗涤条件为本领域所公知(参见例如上述Sambrook(1989)，特别是第9和11章)。用于表征上面已知或疑似Xtra样α-淀粉酶的寡核苷酸探针可适当地基于所讨论的α-淀粉酶的全长或部分核苷酸或氨基酸序列而制备。
检测杂交的适宜条件包括在5×SSC中预浸润并在40℃的如下溶液中预杂交1小时：20％甲酰胺溶液，5×Denhardt′s溶液，50mM磷酸钠，pH6.8和50mg变性超声处理过的小牛胸腺DNA；然后在补充了100mMATP的相同溶液中在40℃下杂交18小时；然后用如下条件洗涤该滤膜(filter)三次：2×SSC，0.2％SDS，40℃，洗涤30分钟(低严格性)；优选在50℃下洗涤(中严格性)；更优选在65℃下洗涤(高严格性)；进一步优选在75℃下洗涤(非常高严格性)。关于杂交方法的更多细节可参见：Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarbor，1989。在一些实施方式中，严格条件对应于Tm为65℃和0.1×SSC，0.1％SDS。
B.亲本α-淀粉酶
前面提到的任意Xtra/AmyS样α-淀粉酶可用作按本文所述修饰和应用的亲本α-淀粉酶。亲本α-淀粉酶也可参考作为“主链”或“模板”，变体淀粉酶可从其衍生。在一些实施方案中，亲本α-淀粉酶源自嗜热脂肪土芽孢杆菌。在具体实施方案中，亲本α-淀粉酶具有SEQIDNO：2的氨基酸序列。在其他实施方案中，亲本α-淀粉酶具有SEQIDNO：1、6、7、8、9、10、11、12、15和16的氨基酸序列，或在氨基酸水平上与SEQIDNO：1、2、6、7、8、9、10、11、12、15和/或16显示基本同一性，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和甚至至少99％的同源性(同一性)。
亲本α-淀粉酶也可以是杂合(hybrid)α-淀粉酶，即包含源自至少两种例如(如上文所述那些)α-淀粉酶的部分氨基酸序列的组合的α-淀粉酶。此外，杂合α-淀粉酶还可包括Xtra/AmyS样α-淀粉酶的部分和微生物(细菌或真菌)和/或哺乳动物来源的一种或多种其他α-淀粉酶的部分。
因此，亲本杂合α-淀粉酶可包含源自至少两种Xtra样α-淀粉酶，或源自至少一种Xtra样α-淀粉酶和至少一种非Xtra样细菌α-淀粉酶，或源自至少一种Xtra样α-淀粉酶和至少一种真菌α-淀粉酶等的部分氨基酸序列的组合。例如，亲本杂合α-淀粉酶可包含源自地衣芽孢杆菌菌株的α-淀粉酶的C-端部分和源自嗜热脂肪土芽孢杆菌菌株的α-淀粉酶的N-端部分。
IV.α-淀粉酶变体的改变的性质
下面的部分说明了存在于本发明所述变体多肽中的突变体之间的关系，和由其产生的理想的性质改变(与亲本Xtra样α-淀粉酶相比)。
在第一方面，提供了亲本嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，其包含在一个或多个位点(采用SEQIDNO：1或SEQIDNO：2对氨基酸编号)的改变，该位点选自：
其中：
(a)改变是独立的
(i)占有位点的氨基酸的氨基酸下游的插入，
(ii)占有位点的氨基酸的缺失，或
(iii)用不同氨基酸取代占有位点的氨基酸，
(b)变体具有α-淀粉酶活性且(c)每个位点对应具有SEQIDNO：1或2所示的氨基酸序列的亲本嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列的位点。
本文特别预期的是S242A、S242Q、S242N和S242E，其可以与在R179、G180、I181、G182和/或K183的与钙-钠结合关联的突变和/或在α螺旋的中间的P245的突变组合。
按上文所述和图4的比对所示的比对可发现在其他亲本Xtra样α-淀粉酶中的对应位点。
稳定性
在本文所述变体的背景中，对于得到改变的稳定性重要的突变(包括氨基酸取代和缺失)包括列于“改变的性质”部分的任何突变，该改变的稳定性特别是指提高的稳定性(即更高或更低)，在特定的高温下(即70-120℃)和/或极端pH(即低或高pH值，即分别pH4-6或pH8-11)下，特别是低于60ppm的游离(即未结合的，所以在溶液中的)钙浓度。稳定性可以如下面的“方法”部分所述测定。
提高稳定性的Extra和相关α-淀粉酶的示例性突变包括：
(a)引入一个或多个氨基酸残基的取代：74A、115L、124K、124R、132A、132C、135A、145A、146A、148A、148N、159A、159C、159D、159E、159F、159G、159H、159K、159L、159N、159R、159S、159T、159V、169A、169L、169M、169Y、179A、181A、181C、181D、181E、181L、181P、181Q、181V、181Y、242A、242D、242E、242Q、261L、271A、271V、278A、278H、278K、278N、278R、281A、281L、281M、302D、302M、304D、304E、304M、321A、321H、321Q、321R、333Q、378D、378N、378R、382D、398A、418A、418M、418N、420A、421R、432A、432D、432L、432M、432N、432Q、432R、432Y、437D、437G、437H、437L、437M、437Y、446A、446Y、454A、464Q、464Y、474A、474E、474K、474L、474M、474N、474P、474Q、474R、474S和474V，或
(b)引入一个或多个氨基酸残基的取代：6I、6N、6Q、6T、6V、14T、16F、25A、25C、25G、25Q、27M、36Q、36S、39G、39V、50I、50L、50M、50N、50Q、52S、53T、67N、67S、80D、80I、90E、133P、133V、137M、137S、141E、141I、141L、141M、141Q、141R、141S、141V、150E、151I、152G、155S、155Y、168W、173T、188P、193F、193K、193L、193Y、213L、213M、213V、217Q、220P、220Q、220R、220S、220V、221I、221S、249E、250F、250I、250M、252L、253Y、254E、254F、254T、254V、255F、255K、255W、257L、257M、257S、257V、258D、258G、258H、258K、258Q、258T、258V、268F、274W、283M、283N、283V、285E、285Q、293G、293K、294W、301F、301I、301P、301R、301T、301W、309D、309V、312H、312S、312V、312Y、313G、313H、313I、313L、313S、313V、318T、338A、338C、338G、338M、338T、339K、339T、339V、340A、340M、340Q、340T、343C、343I、343P、343R、343Y、345I、345Q、369I、369T、370G、375T、385T、386K、394L、394V、400A、400N、400V、402H、402I、402T、402V、402W、403A、403E、403G、403Q、403R、403T、403V、404C、404E、404G、404I、404V、419A、419C、419M、419T、422E、422G、433A、433H、433I、433K、433L、433M、433V、433Y、442A、442G、442N、442R、442S、442T、442V、442W、442Y、445G、445I、445N、445T、445V、445W、447I、447N、447Q、447W、447Y、448C、448F、448G、448H、448I、448N、448Y、450C、450H、450M、450N、450R、450S、450T、450W、455G、455I、455P、455V、463A、463M、463S、463T、463V、463W、465G、465I、465K、465N、465T、465V、469D、469W、469Y、471I、471V、473G、473Y、476A、476G、476L、476M、476N和476T
Ca2+稳定性
改变的Ca2+稳定性是指酶在Ca2+耗竭(depletion)的条件下的稳定性得到了提高，即，当更高或更低的稳定性。当前描述的变体的背景下，对于得到改变的Ca2+稳定性重要的突变(包括氨基酸取代和缺失)包括列于“改变的性质”部分的任何突变，该改变的Ca2+稳定性特别是指提高的Ca2+稳定性，在特定的高pH(即pH8-10.5)下较高或较低的稳定性。
比活和或增加的表达
在其他方面，对于得到呈现比活改变的变体重要的突变(包括氨基酸取代和缺失)包括列于“改变的性质”部分的任何突变，该比活改变特别是指升高或降低的比活，特别是温度10-60℃，优选20-50℃，特别是30-40℃下的比活。比活可以如下面的“方法”部分所述测定。在一些情况下，除了增加比活外突变增加表达。示例性突变如下：
(a)引入一个或多个氨基酸残基的取代，该氨基酸残基选自124N、125A、125K、125N、130A、130S、159A、159D、159E、159G、159H、159K、159L、159N、159R、159S、159T、166F、166G、166H、166S、166Y、169L、179A、179P、180A、180D、180H、180K、180L、180N、180T、180V、180Y、181A、181D、181E、181G、181P、181R、181S、181V、187A、187C、187K、187N、187P、187Q、187R、187S、242H、242N、278H、278K、278N、278R、281M、302D、304M、304Y、321H、321Q、321R、333Q、432Q、437Y、446A、474Q和474S，或
(b)引入一个或多个氨基酸残基的取代，该氨基酸残基选自6A、6D、6E、6H、6I、6K、6L、6M、6N、6P、6Q、6R、6S、6T、6V、6W、6Y、13K、14F、14T、14Y、15A、15D、15E、015G、15H、15K、15N、15P、15Q、15R、15S、15T、15W、16A、16E、16G、16H、16K、16N、16P、16Q、16R、16T、25C、39D、39E、39N、39Q、81Y、121P、139D、139H、139R、139Y、177A、188D、191H、191K、192A、192D、192G、192N、192P、192Q、192S、192T、192V、192Y、196A、196C、196D、196E、196F、196H、196I、196K、196P、196R、196S、196T、196V、201A、201E、201G、201H、201M、202H、216E、216G、216H、216M、216Q、216R、216S、216T、216Y、221A、221D、221F、221I、221L、221M、221N、221R、221S、221V、221Y、237G、240G、240N、240P、240Q、240R、240T、246R、250A、250D、250E、250F、250G、250I、250K、250L、250M、250N、250Q、250R、250S、250W、252K、268A、268D、268E、268G、268H、268K、268N、268P、268Q、268R、268S、274A、274D、274G、274I、274K、274L、274N、274Q、274R、274S、274T、275K、285Q、285Y、293K、293R、318A、318F、318G、318I、318K、318L、318M、318R、318S、318T、318V、318Y、319C、319D、319H、319I、319K、319R、319Y、320K、320R、320T、338A、338G、338I、338M、338P、338S、338V、339G、339P、340A、340D、340E、340H、340K、340N、340Q、345E、363D、363E、363M、363N、363Q、363S、366Q、370A、370D、370E、370H、370K、370N、370Q、370S、375A、375D、375E、375K、375N、375Q、375R、375S、419A、419I、419M、419P、419S、419V、448Y、452N、452Q、452R、452S、471R和471Y。
氧化稳定性
与亲本α-淀粉酶相比，所述变体也可以具有改变的氧化稳定性，特别是更高的氧化稳定性。例如，在洗涤剂组合物中增加的氧化稳定性是有利的，而在用于淀粉液化的组合物中降低的氧化稳定性是有利的。氧化稳定性可以如下面的“方法”部分所述测定。
改变的pH谱
关于具有pH谱改变的得到的变体的重要位点和突变包括位于活性位点残基附近的氨基酸残基的突变，该改变的pH谱特别是指在特别高的pH(即pH8-10.5)或低pH(即pH4-6)下的改良的活性。在一些情况下，例如在pH＜6、在pH＜5或在pH＞9下观察改良的活性。
优选的具体突变/取代是列于上面“改变的性质”中对于讨论的位点的突变/取代。适宜的检测在下面的“方法”部分说明。
洗涤性能
对于在特别高pH(即pH8.5-11)具有洗涤性能改善的得到的变体的重要位点和突变包括列于上面“改变的性质”中对于讨论的位点的具体突变/取代。洗涤性能可以如下面的“方法”部分所述测定。
淀粉液化
与使用“野生型”α-淀粉酶如Extra观察到的相比，一些突变具有降低淀粉组合物粘度的效果。示例性突变包括引入一个或多个氨基酸残基的取代，该氨基酸残基选自I181A、I181P、I181C、I181E、I181Y、S242A、S242E、S242Q、G132A、N193Y和E188P。
其他变体突变
在一些实施方案中，除了上文概述的那些修饰之外，本发明的变体还可以包含一个或多个修饰。例如，可能有利的是一个或多个脯氨酸残基取代为非脯氨酸残基。示例性的非脯氨酸残基包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和亮氨酸。类似地，可能有利的是将一个或多个半胱氨酸残基取代为非半胱氨酸残基。示例性的非半胱氨酸残基包括如丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸和亮氨酸。
另外，可能有利的是在一个或多个以下位点(使用SEQIDNO：7用于编号)导入突变：M15、V128、A1ii、H133、W138、T149、M197、N188、A209、A210、H405、T412，尤其以下的单一、二重或三重或多重突变：
M15X，尤其M15T，L；
V128X，尤其V128E；
H133X，尤其H133Y；
N188X，尤其N188S，T，P；
M197X，尤其M197T，L；
A209X，尤其A209V；
M197T/W138F；M197T/138Y；M15T/H133Y/N188S；
M15N128E/H133Y/N188S；E1i9C/S130C；D124C/R127C；H133Y/T149I；和/或
G475R，H133Y/S187D；H133Y/A209V。
在亲本α-淀粉酶具有SEQIDNO：7中所示氨基酸序列的情况下，可以被缺失或取代以改善氧化稳定性的相关氨基酸残基包括SEQIDNO：2中的单一半胱氨酸残基(C363)和位于M8、M9、M96、M200、M206、M284、M307、M311、M316和M438位点的甲硫氨酸残基。
就相对于其亲本α-淀粉酶，提高α-淀粉酶变体的热稳定性而言，似乎特别希望在SEQIDNO：2中所示的氨基酸序列中缺失至少一个并且优选地缺失2个或甚至3个以下氨基酸残基：F178、R179、G180、I181、G182和K183。特别有价值地，这种类型的成对缺失是R179＊+G180＊；和I181＊+G182＊(分别是SEQIDNO16或15)(或在满足本公开背景中亲本α-淀粉酶要求的另一个α-淀粉酶中这些成对缺失的等同物)。
其他目的突变包括SEQIDNO：2中所示氨基酸序列中示例的N193F和V416G。
V.制备α-淀粉酶变体的方法
本领域已知几种向基因中引入突变的方法。在简单讨论α-淀粉酶编码DNA序列的克隆之后，将讨论在α-淀粉酶编码序列内部的特异性位点产生突变的方法。
A.编码α-淀粉酶的核酸的克隆和表达
编码亲本α-淀粉酶的DNA序列可从任何产生该α-淀粉酶的细胞或微生物中以本领域已知的多种方法分离。首先，应该用产生要研究的α-淀粉酶的生物的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。然后，如果已知该α-淀粉酶的氨基酸序列，可以合成同源、标记的寡核苷酸探针，用于从上述生物制备的基因组文库中鉴定编码α-淀粉酶的克隆。或者，含有与已知α-淀粉酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针可用作用低严格杂交和洗涤条件下鉴定编码α-淀粉酶克隆的探针。
鉴定编码α-淀粉酶的克隆的另一种方法涉及将基因组DNA的片段插入到表达载体中，例如质粒中，用得到的基因组DNA库转化α-淀粉酶阴性的细菌，然后将转化的细菌平板接种于含α-淀粉酶底物的琼脂上，从而鉴定表达α-淀粉酶的克隆。
或者，编码该酶的DNA序列可以用已建立的标准方法合成制备，例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(1981)描述的亚磷酰胺方法，或Matthes等人(1984)记载的方法。在亚磷酰胺方法中，例如在自动DNA合成仪上合成寡核苷酸，纯化、退火、连接并克隆到适当的载体中。
最后，DNA序列可以是混合了基因组来源和合成来源的，混合了合成来源的和cDNA来源的，或者混合了基因组来源和cDNA来源的，并通过以标准技术连接合成的、基因组的或cDNA来源的(如适用，则为对应于整个DNA序列的多个部分的片段)片段制备。DNA序列也可利用特定的引物通过聚合酶链式反应(PCR)制备，例如美国专利4,683,202中所述。
B.定点诱变
一旦分离了编码α-淀粉酶的DNA序列，确定了所需的突变位点，可以用合成的寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有侧接于所需突变位点的核苷酸序列；突变核苷酸在寡核苷酸合成过程中插入。在特定方法中，在带有α-淀粉酶基因的载体中形成桥接DNAα-淀粉酶-编码序列的单链DNA缺口。然后带有所需突变的合成核苷酸退火到该单链DNA的同源部位。然后用DNA聚合酶I(Klenow片段)将剩余的缺口补齐，用T4连接酶连接该构建体。
向编码α-淀粉酶的DNA序列引入突变的另一方法涉及含有所需突变的PCR片段的三步生成法，该突变用化学合成的DNA链作为PCR反应的一个引物来引入突变。从该PCR产生的片段，带有突变的DNA片段可以用限制性内切酶裂解来分离，然后再插入到表达质粒中。
提供变体的其他方法包括基因改组，例如，如WO95/22625(AffymaxTechnologiesN.V.)或WO96/00343(NoVoNordiskA/S)所述，或者其他相关的得到包含所讨论突变例如一个或多个取代和/或缺失的杂合酶的技术。
C.α-淀粉酶变体的表达
用上述方法或其他方法产生的编码变体的DNA序列，可以用表达载体表达，这些表达载体通常包括编码启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号的控制序列和可选的阻抑基因或各种激活蛋白基因。
带有编码α-淀粉酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是任何载体，其可以方便地进行重组DNA过程，载体的选择经常取决于其要引入的宿主细胞。所以，载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如质粒、噬菌体或染色体外元件、微染色体或人工染色体。或者，该载体可以是当引入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中，并与其整合入的一个或多个染色体一起复制的载体。
DNA序列应有效连接于适当的启动子序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中表现出转录活性的任何DNA序列，可源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于指导编码α-淀粉酶变体的DNA序列转录(特别是在细菌宿主中)的适宜启动子的实例有：大肠杆菌lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂糖酶基因dagA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪土芽孢杆菌产麦芽糖(maltogenic)淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)的启动子和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)xylA和xylB基因的启动子等。对于真菌宿主中的转录，有用的启动子的实例是源自编码米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白水解酶、黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因的启动子。
表达载体也可包括与编码α-淀粉酶变体的DNA序列有效连接的适宜转录终止子以及，在真核生物中的多腺苷酸化序列。终止序列和多腺苷酸化序列可适宜地源自与启动子相同的来源。
载体还可包括允许载体在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。此类序列的实例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
载体也可包括选择标记，例如其产物能在宿主细胞中弥补缺陷的基因，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体可包括曲霉属(Aspergillus)选择标记，例如amdS、argB、niaD和sC(产生潮霉素抗性的标记)，或者可通过共转化实现选择，参见例如，WO91/17243。
虽然细胞内表达在一些方面可能是有益的，例如当使用某些细菌作为宿主细胞时，但是一般优选细胞外表达。一般，这里述及的芽孢杆菌属α-淀粉酶包括允许所表达的蛋白酶分泌到培养基中的前区(preregion)。如果需要，可由不同的前区或信号序列代替该前区，其可以通过编码各自前区的DNA序列的取代而方便地实现。
使用的分别连接编码α-淀粉酶变体的DNA构建体、启动子、终止子和其他元件的操作，和用于将它们插入含有复制必需信息的合适载体的操作是本领域技术人员众所周知的(例如，Sambrook等人，MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，第2版.，ColdSpringHarbor，1989)。
有益地，将包括DNA构建体或表达载体的细胞用作重组产生本发明所述α-淀粉酶变体的宿主细胞。可用编码该变体的DNA构建体，通过将该DNA构建体(以一个或多个拷贝)整合到宿主染色体中而方便地转化细胞。通常认为这一整合是有利的，因为DNA序列更有可能稳定地保持在细胞中。可根据常规方法，例如通过同源或异源重组实现DNA构建体向宿主染色体的整合。或者，可以用与不同类型的宿主细胞相关的上述表达载体转化细胞。
细胞可以是高等生物的细胞，例如哺乳动物或昆虫的细胞，但是优选微生物细胞，例如细菌或真菌(包括酵母菌)细胞。
适宜细菌的实例为：革兰氏阳性菌，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、嗜热脂肪土芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)或鼠灰链霉菌(Streptomycesmurinus)；或革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌。细菌的转化可以以已知的方式用例如原生质体转化进行，或用感受态细胞。
酵母生物可以选自：酵母属物种或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种，例如酿酒酵母。丝状真菌可有利地属于曲霉属物种，例如米曲霉或黑曲霉。真菌细胞可以用包括原生质体形成和原生质体转化的方法进行转化，原生质体转化后以已知的方式进行细胞壁的再生。曲霉属宿主细胞的转化的适宜方法记载于EP238023中。
本发明组合物和方法的一个方面涉及产生α-淀粉酶变体的方法，该方法通过在有利于变体淀粉酶产生的条件下培养上述宿主细胞，并从该细胞和/或培养基中回收变体淀粉酶。用于培养细胞的培养基可以是任何适于生长所讨论宿主细胞和获得α-淀粉酶变体表达的常规培养基。适宜的培养基可获自商品供应商或可根据公开的配方(例如按ATCC的目录所述)制备。
可通过公知的方法从培养基中方便地回收分泌自宿主细胞的α-淀粉酶变体，包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，通过诸如硫酸铵的盐沉淀培养基中的蛋白质组分，随后使用诸如离子交换层析、亲和层析等的层析方法。
VI.工业应用
本发明变体α-淀粉酶具有可用于多种工业应用的有价值的性质。例如，该变体可用于淀粉加工/转化，例如用于淀粉的液化(参见，例如美国专利No.3,912,590、欧洲专利申请no.252730和63909，WO99/19467和WO96/28567，所有的参考文献均引入作为参考)。变体还可以用于增甜剂和乙醇的生产中(参见美国专利No.5,231,017，该参考文献引入作为参考)，例如从淀粉或整个谷物生产燃料乙醇、饮用乙醇和工业乙醇。变体还可以用于发酵醪生产或酿造。变体还可以以组合物的形式，其除了合适的缓冲液、稳定剂、防腐剂等之外，还包括葡糖淀粉酶、支链淀粉酶和其他α-淀粉酶。
淀粉酶变体还可用于衣物和盘碟洗涤和硬表面清洁，作为洗涤剂组合物的组分。淀粉酶变体还可以用于纺织品、织物和衣物的脱浆(参见例如引入作为参考的WO95/21247、美国专利No.4,643,736，EP119,920)，以及纸浆和纸的生产。
以下更详细地描述本发明组合物的这些和其他用途及方法。
A.谷物处理和淀粉转化应用
谷物处理和淀粉转化应用分为两类，即(1)一般淀粉转化，其包括淀粉转化为如麦芽糊精、葡萄糖糖浆(dextrosesyrup)和高果糖糖浆，(2)乙醇生产，和(3)发酵醪。尽管这些工艺设计的许多步骤是类似的，还是分开描述它们。在一些情况下，变体α-淀粉酶与植酸酶(4)使用。实施这些应用的组合物也描述(5)。
1.一般淀粉转化
常规的淀粉转化过程，例如液化和糖化过程记载于引入作为参考的例如美国专利No.3,912,590和欧洲专利公开No.252,730和63,909。通常，淀粉转化过程将淀粉降解为较低分子量的糖类成分。在淀粉向糖的转化的情况下，解聚淀粉，这种解聚过程涉及预处理步骤和两个或三个连续步骤，即液化步骤、糖化步骤，而且取决于目的终点产物的可选的异构化过程。
a.天然/未处理淀粉的预处理
天然/未处理淀粉由微观颗粒组成，其在室温下不溶于水。当加热水性淀粉料浆时，颗粒溶胀并最终破裂，向溶液中释放淀粉分子。在此“糊化”过程中，粘度会急剧升高。由于在通常的工业过程中，固体水平是30-40％，因此淀粉不得不薄化(tbin)或“液化”以使其能够操作。这种粘度的降低通常通过酶促降解来得到。
b.液化
在液化步骤中，长链淀粉分子被α-淀粉酶降解成较短支链和直链分子(麦芽糊精)。液化过程通常在约105-110℃进行约5-10分钟，然后在95℃进行1-2小时。pH值通常在约5.5-6.2之间。为了在这些条件下保证最优的酶稳定性，通常加入1mM钙(40ppm游离钙离子)。该处理以后，液化的淀粉会具有10-15的“葡萄糖当量”(DE)。
c.糖化
液化步骤后，通过添加葡糖淀粉酶(例如L-400)和脱支酶(如异淀粉酶(美国专利No.4,335,208)或支链淀粉酶，将麦芽糊精转换为葡萄糖。在此步骤之前，将pH降至低于约4.5的值，当维持高温(高于95℃)以使液化α-淀粉酶失活，以降低称作“潘糖前体”的短链寡糖的形成，这种短链寡糖不能被分支酶正确水解。使温度降至60℃，可以加入葡糖淀粉酶和脱支酶。糖化步骤进行24-72小时。
通常，当液化步骤后变性α-淀粉酶时，大约0.2-0.5％的糖化产物是分支的三糖，Glcpα1-6Glcpα1-4Glc(潘糖)，其不能被支链淀粉酶降解。如果来自液化步骤的活性淀粉酶在糖化步骤中存在，即没有变性，这种糖的水平可高至1-2％，这是非常不想要的结果，因为这会大大降低糖化作用的产量。
d.异构化
当所需的最终糖产品是例如高果糖糖浆时，葡萄糖糖浆可以转化为果糖。糖化过程之后，pH升高到约6-8范围内，优选pH7.5，通过离子交换除去钙。葡萄糖糖浆然后用例如固定化的葡萄糖异构酶(例如IGI-HF)转化为高果糖糖浆。
2.乙醇生产
通常从全谷物生产乙醇可分为如下四个主要步骤：(a)研磨；(b)液化；(c)糖化和(d)发酵。这些步骤中一些步骤与上述那些步骤类似。
a.研磨和料浆的产生
碾磨含淀粉的底物如谷物、玉米、买罗高梁等打开其结构，从而允许进一步加工。通常可以使用的两种碾磨方法指湿磨法或干磨法。在干磨法中，碾磨整个谷粒(kernel)和在该方法的剩下部分中使用。湿磨法提供胚芽和粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，并且，除少数例外外，在平行进行糖浆生产时使用这种方法。
含有研磨淀粉的材料与水和再循环的稀釜馏物合并，从而产生含水料浆。该料浆包含15至55％dsw/w(例如20至50％，25至50％，25至45％，25至40％，20至35％和30-36％ds)。再循环的稀釜馏物(逆流物)通常在10至70％v/v的范围内(如，10至60％、10至50％、10至40％、10至30％、10至20％、20至60％、20至50％、20至40％并且也在20至30％)。25到40％是相当普遍的。
一旦含有研磨淀粉的材料与水和逆流物(backset)合并，通常不调节料浆中的pH。另外，在添加植酸酶(见下文)和α-淀粉酶至料浆后，不调节pH。料浆的pH通常将在pH4.5至小于6.0的范围(例如，pH4.5至5.8、pH4.5至5.6、pH4.8至5.8、pH5.0至5.8、pH5.0至5.4、pH5.2至5.5和pH5.2至5.9)。料浆的pH可以在pH4.5与5.2之间，这取决于添加至料浆的稀釜馏物的量和包含稀釜馏物的材料的类型。例如，稀釜馏物的pH可以在pH3.8与pH4.5之间。表B展示在155°F搅拌2小时后随增加量的稀釜馏物添加至全磨谷物料浆(32％干固体)而发生的pH变化。
表B：随增加量的稀釜馏物添加而发生的pH变化
应提到在乙醇生产期间，可以添加酸以降低发酵醪井中的pH以降低蒸馏前微生物污染的风险。
在一些情况下，添加植酸酶至料浆。下文更详细地描述植酸酶。在一些情况下，添加α-淀粉酶至该料浆。在一些情况下，将植酸酶和α-淀粉酶依次添加至料浆。在一些情况下，同时添加植酸酶和α-淀粉酶。在一些情况下，将包含植酸酶和α-淀粉酶的料浆温育(预处理)5分钟至8小时的时间(例如，5分钟至6小时、5分钟至4小时、5分钟至2小时和15分钟至4小时)。在其他情况下，料浆在40至115℃(例如45至80℃、50至70℃、50至75℃、60至110℃、60至95℃、70至110℃、70至85℃和77至86℃)的温度范围内温育。
在一些情况下，料浆在含淀粉材料的淀粉糊化温度以下0至30℃(例如0至25℃、0至20℃、0至15℃、0至10℃和0至5℃)的温度温育。在一些情况下，该温度是68℃以下、65℃以下、62℃以下、60℃或甚至55℃以下。在一些实施方案中，该温度是45℃以上、50℃以上、55℃以上和甚至60℃以上。在低于淀粉糊化温度的温度温育包含植酸酶和α-淀粉酶的料浆被称作初级(1°)液化。
目前，认为液化过程中所用的市售微生物α-淀粉酶通常没有稳定到足以在约80℃以上的温度、以小于pH5.6的pH，从使用全磨谷物的干磨法产生液化的淀粉底物。通常，许多市售α-淀粉酶的稳定性在小于约4.0的pH处降低。
b.液化
在液化过程中，淀粉颗粒因水解成大部分具有高于4的DP的麦芽糖糊精而增溶。原料可以是研磨的完整谷物或来自淀粉加工的侧流(sidestream)。研磨和液化的谷物也称作醪液。水解可以通过酸处理或由α-淀粉酶以酶方式实施。有限地使用酸水解。
酶液化一般作为3步骤热料浆过程进行。将料浆加热至60-95℃之间(优选地77-86℃、80-85℃和83-85℃)并添加酶。料浆在95-140℃、优选在105-125℃之间进行喷射蒸煮，冷却至60-95℃并添加更多的酶以获得最终水解。液化过程在pH4.0-6.5、一般在5和6之间的pH处实施。
料浆可以用α-淀粉酶和任选植酸酶(本文所讨论的)温育并在温度为60至75℃的温度范围下温育5分钟至2小时。在另一个液化步骤中，含有温育过或预处理的淀粉的材料在约4.0至5.5的pH可暴露于温度升高，如在含淀粉材料的淀粉糊化温度以上0至45℃(例如70℃至120℃、70℃至110℃和70℃至90℃)持续2分钟至6小时的时间段(例如2分钟至4小时、90分钟、140分钟，和90分钟至140分钟)，更优选地在1小时至2小时之间。温度可以通过常规高温喷射蒸煮系统提高一段短暂时间，例如1至15分钟。随后，淀粉可以在范围从75℃至95℃(例如80℃至90℃，和80℃至85℃)的温度进一步水解15至150分钟(例如30至120分钟)时间。在这些过程步骤期间不调节pH并且液化的醪液的在pH4.0至pH5.8(例如pH4.5至5.8、pH4.8至5.4和pH5.0至5.2)的范围内。在一些实施方案中，将第二剂量的热稳定α-淀粉酶添加至次级液化步骤，但是在其他实施方案中，不添加额外剂量的α-淀粉酶。
根据本发明的温育和液化步骤可以后续本领域熟知的糖化和发酵步骤。
c.发酵
通过微生物发酵，使用在液化过程步骤期间获得的可发酵糖来产生醇，尤其产生乙醇。发酵中所用的生物将取决于所需的终产物。
一般而言，如果乙醇是想要的终产物，将使用酵母作为发酵生物。在一些优选的实施方案中，产乙醇微生物是酵母和特别地是酵母属酵母如酿酒酵母菌株(美国专利号4,316,956)。多种酿酒酵母是市售的并且这些酿酒酵母包括但不限于FALI(Fleischmann’sYeast)、SUPERSTART(Alltech)、FERMIOL(DSMSpecialties)、REDSTAR(Lesaffre)和Angel醇酵母(Angel酵母公司，中国)。在该方法中所用起子酵母的量是在合适的时间段内产生商业显著量的乙醇的有效量(例如有效在少于72小时内从具有25-40％之间DS的底物产生至少10％乙醇的量)。酵母细胞一般以每毫升发酵液104至1012个和优选地从107至1010个活酵母计数的量提供。除了发酵微生物(例如酵母)，发酵可以还包括养分和任选的额外的酶，包括但不限于植酸酶。酵母在发酵中的用途是熟知的并参考THEALCOHOLTEXTBOOK，K.JACQUES等人编著，1999，NOTTINGHAMUNIVERSITYPRESS，UK。酵母发酵通常要进行24-96小时，典型地35-60小时。发酵温度通常在26-34℃，例如约32℃，且pH约3-6，优选约4-5。
使用适宜的发酵微生物，可以获得其他发酵终产物，包括但不限于甘油、1，3-丙二醇、葡萄糖酸、2-酮-D-葡萄糖酸、2，5-二酮-D-葡萄糖酸、2-酮-L-古洛糖酸、丁二酸、乳酸、氨基酸及其衍生物。例如，当乳酸是所需终产物时，可以使用乳杆菌属物种(Lactobacillussp.)(干酪乳杆菌(L.casei))。当甘油或1，3-丙二醇是所需终产物时，可以使用大肠杆菌。当2-酮-D-葡萄糖酸、2，5-二酮-D-葡萄糖酸和2-酮-L-古洛糖酸是所需终产物时，可以使用柠檬泛菌(Pantoeacitrea)作为发酵微生物。
d.糖化和SSF
含有液化淀粉的材料在糖化酶如葡糖淀粉酶存在下糖化。糖化过程可以持续12小时至120小时(例如12至90小时、12至60小时和12至48小时)。然而，常见在30至65℃温度范围、一般在50℃以上并且通常在约60℃实施一个预糖化步骤约30分钟至2小时(例如30至90分钟)，随后是在发酵期间的完全糖化。此随后步骤可称作同步糖化发酵(SSF)。SSF普遍用于乙醇生产，此时正在糖化的酶和正在发酵的生物(如酵母)一起添加并随后在温度30℃至65℃且pH在4.2-4.8之间，优选地是pH4.5下进行。
从酶促糖化产生可发酵糖(例如糊精、单糖，尤其葡萄糖)。可以将这些可发酵糖进一步纯化和/或转化成有用的糖产物。此外，糖可以用作微生物发酵过程中的发酵原料以产生终产物，如醇(例如乙醇和丁醇)、有机酸(例如丁二酸和乳酸)、糖醇(例如甘油)、抗坏血酸中间体(例如葡萄糖酸、2-酮-D-葡萄糖酸、2，5-二酮-D-葡萄糖酸和2-酮-L-古洛糖酸)、氨基酸(例如赖氨酸)、蛋白质(例如抗体及其片段)。
e.蒸馏
任选地，在发酵后，可以通过蒸馏恢复醇(例如乙醇)。乙醇的产量一般是至少8％、至少10％、至少12％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％(v/v)，和一些情况下至少19％、至少20％、至少21％、至少22％和甚至至少23％(v/v)。获得的乙醇可以用作例如，燃料乙醇、饮用乙醇即可饮用的中度酒，或工业用乙醇。
f.副产物
从发酵过程中剩下的是酒糟，其一般用作液体形式或干燥的动物饲料。酒糟可以采用所谓的“发酵联产品(fermentationco-products)”的形式，如干酒精糟(distillersdriedgrains，DDG)和干酒精糟及可溶物(DDGS)，它们还可以用作动物饲料。
3.发酵醪制备
本发明变体α-淀粉酶可以用于发酵醪制备过程。一般在捣浆过程(mashingprocess)期间添加α-淀粉酶，此过程中在淀粉转化条件下实现了在稳定性、比活等方面的优势。
4.变体α-淀粉酶与其他酶联合的用途
在液化、糖化、SSF和糖类加工的所有方面，一般而言，本发明变体α-淀粉酶多肽可与一种和多种额外酶如额外的α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、异淀粉酶、β-淀粉酶、麦芽糖淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、酯酶、氧化酶、果胶酶、果胶裂合酶、角质酶、漆酶和/或植酸酶。针对清洁应用更详细地描述这些酶中的许多酶。
植酸酶市能够分解谷物和油料种子中发现的植酸的酶。认为植酸以及在其降解中的中间物会破坏α-淀粉酶稳定性或对α-淀粉酶有不利影响，从而降低它们的效率。
与变体α-淀粉酶联合使用的植酸酶能够在温育和/或液化步骤的定义条件下水解植酸。在一些实施方案中，植酸酶能够从肌醇六磷酸(植酸)释放至少一种无机磷酸盐。植酸酶可以根据它们对植酸盐分子上磷酸酯基团的特定位点起始水解的偏好性分类(例如作为3-植酸酶(EC3.1.3.8)或作为6-植酸酶(EC3.1.3.26))。植酸酶的常见实例是肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶。
植酸酶可以从微生物如真菌生物和细菌生物获得。这些微生物的中的一些微生物包括例如曲霉属(例如黑曲霉、土曲霉(A.terreus)、无花果曲霉(A.ficum)和烟曲霉(A.fumigatus))、毁丝霉属(Myceliophthora)(嗜热毁丝霉(M.thermophila))、踝节菌属(Talaromyces)(嗜热踝节菌(T.thermophilus))、木霉属物种(里氏木霉)和嗜热丝孢菌属(Thermomyces)(WO99/49740)。植酸酶也可从青霉属(Penicillium)物种获得，例如大麦青霉(P.hordei)(ATCCNo.22053)、桧状青霉(P.piceum)(ATCCNo.10519)或短密青霉(P.brev-icompactum)(ATCCNo.48944)。见，例如USP6,475,762。另外，植酸酶可从芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌)、假单胞菌属(Pseudomonas)、隔孢伏革属(Peniophora)、大肠杆菌、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterbacter)和布丘氏菌属(Buttiauxella)(见WO2006/043178)获得。
商业植酸酶是可获得的，如(BASF)、RONOZYME(NovozymesA/S)、(DaniscoA/S，Diversa)和(ABEnzymes)。用于确定微生物植酸酶活性的方法和植酸酶单位的定义已经由Engelen等人(1994)J.AOACInt.77：760-764公布。植酸酶可以是野生型植酸酶、其变体或片段。
示例性植酸酶从布丘氏菌(Buttiauxiella)细菌的物种衍生。布丘氏菌属物种包括乡间布丘氏菌(B.agrestis)、布里纳氏布丘氏菌(B.brennerase)、费拉格布丘氏菌(B.ferragutiae)、伽瓦尼布丘氏菌(B.gaviniae)、伊查德氏布丘氏菌(B.izardii)、诺基亚布丘氏菌(B.noackiae)和瓦姆波德布丘氏菌(B.warmboldiae)。布丘氏菌物种的菌株从德国国家生物材料资源中心(theGermanNationalResourceCenterforBiologicalMaterial)DSMZ(Inhoffenstrabe7B，38124Braunschweig，德国)可获得。以保藏号NCIMB41248保藏的布丘氏菌属菌株P1-29是可以从中获得有用植酸酶的特别有用的菌株的实例。植酸酶可以是BP-野生型、在WO06/043178中描述的其变体(如BP-11)或如2007年3月6日提交的美国专利公布编号US20080220498中描述的变体(见，例如表1和SEQIDNO：3)。
植酸酶也可以是具有下文显示SEQIDNO：19的氨基酸序列的布丘氏菌植酸酶的BP-17变体，或是与SEQIDNO：19中所述的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和甚至至少99％序列同一性的植酸酶。
温育和/或液化过程中使用的植酸酶的量(剂量)可在约0.001至50FTU/gds的范围内(例如在约0.01至25FTU/gds、约0.01至15FTU/gds、约0.01至10FTU/gds、约0.05至15FTU/gds和约0.05至5.0FTU/gds的范围内)。
5.用于谷物加工和淀粉转化的组合物
本发明组合物和方法的一个方面是包含一种或多种变体α-淀粉酶用于淀粉转化的组合物，该淀粉转化包括一般淀粉转化、醇发酵、发酵醪制备和类似过程。此组合物可以包含所选的缓冲剂、盐、矿物质、稳定剂、防腐剂、抗微生物剂、染色剂、香精等以防止变体α-淀粉酶太早降解(包括蛋白质水解)、延长储藏、改善性能、用颜色编码(color-code)此组合物等。
此组合物还可包括与淀粉转化有关的额外的酶，包括例如葡糖淀粉酶和植酸酶。尤其，葡糖淀粉酶是来自在Boel等人.(1984)EMBOJ.3：1097-1102中描述的黑曲霉的G1或G2AMG，或其变体(如在WO00/04136orWO01/04273中描述的)，或来自如WO06/060062中描述的里氏木霉的葡糖淀粉酶。
B.纸浆和纸张生产
本发明变体α-淀粉酶也可以用在从淀粉强化废纸和纸板产生木素纤维素材料如纸浆、纸张和纸板中，尤其当再浆化在高于7的pH处发生并且淀粉酶通过降解强化淀粉而促进废弃材料分解的情况下。变体α-淀粉酶尤其在从淀粉包层(coat)的印刷纸张产生造纸纸浆的方法中有用。方法可以如WO95/14807中所述进行，包括步骤：(a)使纸张分解以产生纸浆，(b)在步骤(a)之前、期间或之后用淀粉降解酶处理，和(c)在步骤(a)和(b)之后，将油墨颗粒与纸浆分开。
当酶改性的淀粉连同碱性填料如碳酸钙、高岭土和粘土一起用于造纸中时，α-淀粉酶也可以有用。采用本发明变体α-淀粉酶，有可能在填料存在下将淀粉改性，从而允许更简单的集成工艺。
C.纺织品、织物和服装的脱浆
本发明变体α-淀粉酶也可用于纺织品、织物或服装脱浆。在纺织品加工工业中，α-淀粉酶在脱浆工艺中常规地用作辅料以促进除去含淀粉的浆料(size)，所述浆料在织造期间在纬纱上起到保护性涂层的作用。在织造后彻底除去浆料涂层对于确保后续工艺中的最佳结果是重要的，在所述后续工艺中将织物洗刷、漂白和染色。酶法淀粉分解是优选的，因为它不涉及对纤维材料的任何有害影响。
为降低加工成本并提高研磨通量(millthroughput)，脱浆工艺有时候与洗刷和漂白步骤合并。在这类情况下，使用非酶助剂如碱或氧化剂来分解淀粉，因为常规的α-淀粉酶非常不兼容于高pH水平和漂白剂。淀粉浆料的非酶分解由于所用的相当具侵入性的化学品而造成一些纤维损伤。因而，使用具有在碱性溶液中的改良性能的变体α-淀粉酶将是期望的。在含有纤维素的织物或纺织品脱浆时，此变体可以单独使用或与纤维素酶组合使用。
脱浆和漂白工艺是本领域熟知的。例如，此类工艺在例如在此引入作为参考的WO95/21247、美国专利号4,643,736、EP119,920中描述。目前用于脱浆的市售产品包括来自Genencor的FLEX。
D.清洁和洗涤剂组合物
本发明变体α-淀粉酶可以添加至洗涤剂组合物中并因而变成其组分。洗涤剂组合物可以配制为手工或机器用衣物洗涤剂，包括适于预处理着色织物的洗衣添加物和适于漂洗添加的织物软化组合物。洗涤剂组合物还可以配制为配制用于手工或机器用盘碟洗涤操作或用于一般家居硬表面清洁操作的洗涤剂组合物。通常，变体α-淀粉酶的特性在其pH和其他酶成分和非酶成分上应当兼容于所选择的洗涤剂。
洗涤剂组合物或添加物可以包含一种或多种其他酶如蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、另一种淀粉分解酶(例如另一种α-淀粉酶)、葡糖淀粉酶、生麦芽糖淀粉酶、CGTase和/或纤维素酶、甘露聚糖酶(如来自Genencor分公司DaniscoUSInc的MANNASTARTM))、果胶酶、果胶裂合酶、角质酶和/或漆酶，下面更详细描述这些酶。
蛋白酶：合适的蛋白酶可以源自任何生物，且包括化学修饰的或改造的变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选地是碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草蛋白酶，尤其从芽孢杆菌属衍生的那些枯草蛋白酶，例如枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(在WO89/06279描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是(例如猪或牛来源的)胰蛋白酶和在WO89/06270与WO94/25583中描述的镰孢霉属(Fusarium)蛋白酶。
有用蛋白酶的实例是WO98/23732、WO99/20770、WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中所述的变体，尤其是在以下一个或多个位点具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
优选的市售蛋白酶包括 和(来自NovozymesA/S)、MAXACAL、 PURAFECT(GenencorInternationalInc.)。
脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些脂肪酶，且包括化学修饰的或改造的变体。有用脂肪酶的实例包括来自腐质霉属(Humicola)(同义词：嗜热真菌(Thermomyces))的脂肪酶，例如，如EP258068和EP305216中所述的来自柔毛腐质霉(H.lanuginosa)(T.lanuginosus)或如WO96/13580中所述的来自H.insolens的脂肪酶，假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶，例如，来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligene)(EP218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP331376)、斯氏假单胞菌(P.stutzer)(GB1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属物种(Pseudomonasspp.)菌株SD705(WO95/06720和WO96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO96/12012)、芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等人(1993)，BiochemicaetBiophysicaActa，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO91/16422)。其他实例是脂肪酶变体，如WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中描述的那些脂肪酶变体。优选的市售脂肪酶包括LIPOLASETM和LIPOLASEULTRATM(NovozymesA/S)。
淀粉酶：也可以包括一种或多种额外的淀粉酶。合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌或真菌来源的那些淀粉酶，且包括化学修饰的或改造的变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属、例如从GB1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌的特定菌株中获得的α-淀粉酶。有用α-淀粉酶的实例是在WO94/18314、WO96/39528、WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424中描述的变体、尤其在以下一个或多个位点具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。市售的α-淀粉酶是DURAMYLTM、L1QUEZYMETM、TERMAMYTM、NATALASETM、FUNGAMYLTM和BANTM(NovozymesA/S)、RAPIDASETM和PURASTARTM(来自Genencor)。
纤维素酶：合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些纤维素酶。包括化学修饰的或蛋白质改造的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、镰孢霉属(Fusarium)、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢霉属(Acremonium)的纤维素酶，例如在美国专利号4,435,307、美国专利号5,648,263、美国专利号5,691,178、美国专利号5,776,757和WO89/09259中公开的从Humicolainsolens、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)和尖镰孢(Fusariumoxysporum)产生的真菌纤维素酶。里氏木霉纤维素酶在美国专利号4,689,297、美国专利号5,814,501、美国专利号5,324,649、WO92/06221和WO92/06165中公开。芽孢杆菌属纤维素酶在美国专利号6,562,612中公开。市售的纤维素酶包括和(NovozymesA/S)、和PURADAX(GenencorInternationalInc.)和(KaoCorporation)。
过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些过氧化物酶/氧化酶，且包括化学修饰的或改造的变体。有用过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)，例如，来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶和其变体，如在WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中描述的那些变体。市售的过氧化物酶包括(NovozymesA/S)。
洗涤剂酶可以通过添加含有一种或多种酶的独立添加物或通过添加包含全部这些酶的组合添加物而包含于洗涤剂组合物中。洗涤剂添加物可以配制为液体剂、料浆剂、棒剂、片剂、粉末剂、颗粒剂、糊剂等。示例性的洗涤剂添加物制剂是无尘颗粒剂和稳定化液体剂或料浆剂。液体洗涤剂可以是含水的，一般包含多达70％的水和0-30％的有机溶剂，或是非含水的。
无尘颗粒剂可以如美国专利号4,106,991和4,661,452中所公开那样产生并且可以任选地由本领域已知的方法包衣。蜡质包衣材料的实例是平均摩尔重量1000至20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基苯酚；其中醇含有12至20个碳原子并且其中存在15至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸单酰甘油和二酰甘油和三酰甘油。在GB1483591中给出适用于流化床技术的成膜包衣材料的实例。液体酶制剂可以根据建立的方法例如通过添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸稳定化。可以根据EP238,216中所述的方法制备受保护的酶。
洗涤剂组合物通常包含一种或多种表面活性剂，该表面活性剂可以是非离子的(包括半极性)、阴离子、阳离子和/或两性离子的。表面活性剂一般以约0.1％至60％重量的水平存在。示例性洗涤剂组合物包括从约1％至约40％的阴离子表面活性剂如直链烷基苯磺酸盐、α-烯属磺酸酯、烷基硫酸盐(脂肪族醇的硫酸酯)、脂肪醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或皂和/或从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂如脂肪醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基脂肪酸单乙醇胺、脂肪酸单乙醇胺、多羟基烷基脂肪酸胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖胺(glucamide)”)。
洗涤剂组合物可以包括0-65％的洗涤剂增效剂或络合剂，例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、磷酸酯、柠檬酸盐、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂组合物可以包含一种或多种聚合物，例如羧甲基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚乙烯醇、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可以含有漂白系统，所述漂白系统可以包含H2O2来源，如可以与形成过酸的漂白激活物如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐组合的过硼酸盐或过碳酸盐。备选地，该漂白系统可以包含过氧酸，例如酰胺型、亚酰胺型或砜型过氧酸。
可以使用常规稳定剂，例如，多元醇，如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳族硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯硼酸稳定洗涤剂组合物的酶，并且该组合物可以如例如，WO92/19709和WO92/19708中所述配制。
洗涤剂组合物也可以含有其他常规洗涤剂组合物成分，例如织物调理剂、粘土、泡沫促进剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、悬污剂、抗污渍再沉积剂、染料、杀菌剂、荧光增白剂、水溶助长剂、晦暗抑制剂或香料。
变体α-淀粉酶应以有效量出现，这可以采用本文所述的测定法直接确定。作为起始点，构思可以按照与每升洗液0.01-100mg酶蛋白、且优选每升洗液0.1-1mg酶蛋白相对应的量添加一种(或多种)变体α-淀粉酶。示例性的量是每升洗液约0.055mg酶蛋白。
示例性的盘碟洗涤的洗涤剂组合物包括以下：
1)粉状自动盘碟洗涤组合物
2)粉状自动盘碟洗涤组合物
3)粉状自动盘碟洗涤组合物
4)粉状自动盘碟洗涤组合物
5)粉状自动盘碟洗涤组合物
6)具有清洁表面活性剂系统的粉状和液体盘碟洗涤组合物
7)非含水液体自动盘碟洗涤组合物
8)非含水液体盘碟洗涤组合物
9)触变性液体自动盘碟洗涤组合物
10)液体自动盘碟洗涤组合物
11)含有受保护的漂白剂颗粒的液体自动盘碟洗涤组合物
12)如1)、2)、3)、4)、6)中所述的自动盘碟洗涤组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐取代。
13)如1)-6)中所述的自动盘碟洗涤组合物，其额外地含有锰催化剂。所述锰催化剂可以例如是“用于低温漂白作用的高效锰催化剂”(″Efficientmanganesecatalystsforlow-temperaturebleaching″)，Nature369，1994，页：637-639中所述的化合物之一。
VII.测量α-淀粉酶性质的方法
本节描述了用于测量α-淀粉酶性质的基本实验。额外的测定法在实施例章节中描述。
A.过滤筛选实验
下面的实验可用于筛选与亲本酶和Xtra样α-淀粉酶相比，在高或低pH和/或在Ca2+耗竭条件下具有改变的稳定性的Xtra样α-淀粉酶变体。
1.高pH滤膜实验
于37℃，将芽孢杆菌属文库平板接种在含有10微克/毫升卡那霉素的TY琼脂平板上的多层醋酸纤维素(OE67，Schleicher&Schuell，Dassel，DE)和硝酸纤维素滤膜(Protran-Ba85，Schleicher&Schuell，Dassel，DE)上至少21小时。醋酸纤维素层位于TY琼脂平板上。
平板接种后但是在温育之前用针特别标记各个滤膜夹层，以便能够在滤膜上定位阳性变体，将带有结合变体的硝酸纤维素滤膜转移到含有甘氨酸-NaOH缓冲液，pH8.6-10.6的容器中并室温(可在10-60℃间变化)温育15分钟。带有菌落的醋酸纤维素滤膜在室温下储存于TY平板上，直至使用。温育之后，在含有1％琼脂糖、0.2％淀粉的甘氨酸-NaOH缓冲液(pH8.6-10.6)的平板上检测残余的活性。带有硝酸纤维素滤膜的实验平板以与滤膜夹层同样的方式标记，并在室温下温育2小时。去除滤膜后，用10％复方碘溶液(Lugolsolution)对实验平板染色。在暗蓝色背景下，降解淀粉的变体检测为白色斑点并然后在储存平板上鉴定出。在与第一次筛选同样的条件下重新筛选两次阳性变体。
2.低钙滤膜实验
于37℃，在含有相关抗生素(例如卡那霉素或氯霉素)的TY琼脂平板上的多层醋酸纤维素(OE67，Schleicher&Schuell，Dassel，DE)和硝酸纤维素滤膜(Protran-Ba85，Schleicher&Schuell，Dassel，DE)上平板接种芽孢杆菌属文库至少21小时。醋酸纤维素层位于TY琼脂平板上。
平板接种后但是在温育之前用针特别标记各个滤膜夹层，以便能够在滤膜上定位阳性变体，将带有结合变体的硝酸纤维素滤膜转移到含有碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH8.5-10，具有不同EDTA浓度(0.001mM-100mM)的容器中。将滤膜室温下温育1小时。带有菌落的醋酸纤维素滤膜在室温下储存于TY平板上，直至使用。温育之后，在含有1％琼脂糖、0.2％淀粉的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH8.5-10)的平板上检测残余的活性。带有硝酸纤维素滤膜的实验平板以与滤膜夹层同样的方式标记，并在室温下温育2小时。去除滤膜后，用10％复方碘溶液对实验平板染色。在暗蓝色背景下，降解淀粉的变体检测为白色斑点并然后在储存板上鉴定出。在与第一次筛选同样的条件下重新筛选两次阳性变体。
3.低pH滤膜实验
于37℃在含有10微克/毫升氯霉素的TY琼脂平板上多层醋酸纤维素(OE67，Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)和硝酸纤维素滤膜(Protran-Ba85，Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)上平板接种芽孢杆菌属文库至少21小时。醋酸纤维素层位于TY琼脂平板上。
在平板接种后但是温育之前用针特别标记各个滤膜夹层，以便能够在滤膜上定位阳性变体，带有结合变体的硝酸纤维素滤膜被转移到含有柠檬酸盐缓冲液，pH4.5的容器中并80℃温育20分钟(当在野生型主要成分(backbone)中筛选变体时)或85℃温育60分钟(当筛选亲本α-淀粉酶的变体时)。带有菌落的醋酸纤维素滤膜在室温下储存于TY平板上，直至使用。温育之后，在含有1％琼脂糖、0.2％淀粉的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)的实验平板上检测残余的活性。带有硝酸纤维素滤膜的实验平板以与滤膜夹层同样的方式标记，并在50℃下温育2小时。去除滤膜后，用10％复方碘溶液对实验平板染色。在暗蓝色背景下，降解淀粉的变体检测为白色斑点并然后在储存板上鉴定出。在与第一次筛选同样的条件下重新筛选两次阳性变体。
3.第二次筛选
从储存板上挑出重筛选后的阳性转化体并在二次平板筛选中检测。37℃下阳性转化体在5mL的LB+氯霉素中生长22小时。各个阳性转化体和作为对照表达相应主要成分的克隆的芽孢杆菌属培养物在柠檬酸盐缓冲液(pH4.5)中于90℃下温育，在0、10、20、30、40、60和80分钟时取样。在实验平板上点3μL样品。用10％复方碘溶液对实验平板染色。改善的变体视为与主要成分相比具有更高残余活性(在实验平板上检测为晕斑)的变体。用核苷酸测序来确定该改善的变体。
B.未纯化变体的稳定性实验
变体的稳定性可以如下检测：表达要分析的变体的芽孢杆菌属培养物在10mlLB+氯霉素中于37℃下生长21小时。800μL培养物与200μL柠檬酸盐缓冲液(pH4.5)混合。对应于样品时间点数量的多个70μL等分样品在PCR管中制备，并于在PCR仪中于70℃或90℃温育不同时间(通常是5、10、15、20、25和30分钟)。0分钟样品不在高温下温育。通过转移20μL样品至200μL的α-淀粉酶PNP-G7底物MPR3(BoehringerMannheim目录号1660730)中来测定样品活性，如下面“α-淀粉酶活性测定”部分所述。结果以百分比活性(相对于0分钟时间点的活性)对时间作图，或者描述为在温育一定时间之后残余活性百分比。
C.α-淀粉酶变体的发酵和纯化
如下所述发酵和纯化包含相关表达质粒的枯草芽孢杆菌菌株：将从-80℃储存的储液中取出的菌株划线接种于含有10μg/ml卡那霉素的LB琼脂糖板上，37℃下过夜生长。菌落转移至500mL揺瓶中的补充有10微克/毫升氯霉素的100mLPS-1培养基中。培养物在37℃下以270转/分钟振荡培养5天。
PS-1培养基的成分：
颗粒糖(Pearlsugar)100g/l
大豆粉40g/l
Na2HPO4，12H2O10g/l
PluronicTMPE61000.1g/l
CaCO35g/l
4500转/分钟离心20-25分钟，从发酵液中去除细胞和细胞碎片。之后过滤上清得到完全清澈的溶液。浓缩滤液并在UF-过滤器(10000截留膜)上洗涤，缓冲液换为20mM醋酸盐缓冲液，pH5.5。将UF-过滤液上样到S-琼脂糖FF柱上，用同样缓冲液中的0.2MNaCl阶段洗脱。用10mMTris，pH9.0透析洗脱液，并上样到Q-琼脂糖凝胶FF柱，用从0到0.3M的NaCl的线性梯度以6个柱体积洗脱。汇集含有活性(用Phadebas实验测量)的级分，将pH调至pH7.5，通过0.5％w/vol.活性炭处理5分钟来去除残余的颜色。
D.比活测定
用实验(Pharmacia)测定比活，记作“活性/毫克酶”。遵循厂商的说明书(还参加下文“α-淀粉酶活性测定”)。
E.等电点测定
用等电聚焦法测定pI(例如Pharmacia，Ampholine，pH3.5-9.3)。
F.稳定性测定
可以使用如下方法测定酶的稳定性：
酶在相应条件下温育。在不同时点取样，例如在0、5、10、15和30分钟后，并在实验缓冲液(50mMBritton缓冲液pH7.3)中稀释样品25次(同样稀释所有取得的样品)，并使用Phadebas实验(Pharmacia)在标准条件pH7.3、37℃下测定活性。
温育(0分钟)之前测得的活性用作参照(100％)。计算降低百分比作为温育时间的函数。表显示了在例如温育30分钟活的残余活性。
G，α-淀粉酶活性测定
1.实验
可以使用片作为底物的方法测定α-淀粉酶活性。PHADEBAS片(淀粉酶检测，PharmaciaDiagnostic提供)含有交联的不可溶蓝色淀粉聚合物，其已经与牛血清白蛋白和缓冲物质混合并压片。
对于每个单独测量，在含有5ml50mMBritton-Robinson缓冲液(50mM乙酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0.1mMCaCl2，用NaOH调至所需pH值)的管中悬浮一片。该检测在目的温度的水浴中进行。要检测的α-淀粉酶在xml的50mMBritton-Robinson缓冲液中稀释。1ml该α-淀粉酶溶液加入到5ml50mMBritton-Robinson缓冲液中。该α-淀粉酶水解淀粉，得到可溶的蓝色片段。用分光光度计在620nm测量得到的蓝色溶液的吸光度是该α-淀粉酶活性的函数。
重要的是在10或15分钟(检测时间)温育后测得的620nm吸光度处于620nm的0.2-2.0吸光度单位范围内。在这个吸光度范围内，在活性和吸光度之间有线性关系(Lambert-beer定律)。所以酶的稀释必须调整到适合此准则。在特定条件组合(温度、pH、反应时间、缓冲液条件)下1毫克给定α-淀粉酶将水解一定量的底物且将产生蓝色。颜色强度在620nm下测定。测得的吸光度直接与给定条件组合下所实验的α-淀粉酶的比活(纯α-淀粉酶蛋白的活性/mg)成比例。
2.可选方法
可以使用采用PNP-G7底物的方法测定α-淀粉酶活性。PNP-G7是对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-α，D-maltoheptaoside)的缩写，是可由内源酶裂解的封闭寡糖。裂解后，试剂盒中所包括的α-葡糖苷酶分解底物以释放游离的PNP分子，PNP分子为有黄色并因此可以由可视分光光度计在λ＝405nm(400-420nm)下测定。包含PNP-G7底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由Boehringer-Mannheim生产(目录号1054635)。
为了制备该试剂溶液，按照生产者的建议，10ml的底物/缓冲液加入到50ml酶/缓冲液中。将20μL样品转移至96孔微滴定板，在25℃温育来进行该检测。加入在25℃预平衡的200μL试剂溶液。混合溶液，并预温育1分钟，在酶标仪上4分钟内每30秒在OD405nm测量一次吸光度。
时间相关的吸光度曲线的斜率直接与给定条件组合下所实验的α-淀粉酶的活性成比例。
H.LAS敏感度测定
在40℃下将变体与不同浓度的LAS(线性烷基苯磺酸酯；Nansa1169/P)温育10分钟。用测量法或使用PNP-G7底物的其他方法测定残余活性。在0.1M，pH7.5的磷酸盐缓冲液中稀释LAS。在无LAS上使用下列浓度：500ppm、250ppm、100ppm、50ppm、25ppm和10ppm。
在总体积10ml中，在不同的LAS缓冲液中将变体稀释至0.01-5mg/l的浓度，并在温控水浴中温育10分钟。通过转移小等分试样至冷检测缓冲液中来停止温育。重要的是，在活性测量期间，LAS浓度低于1ppm，以免影响该活性测量。
然后用上述测量法或其他方法，测定残余活性，对每样品一式两份测定。减去空白后测定活性。无LAS的活性为100％。
G.植酸酶活性(FTU)的测定
通过无机磷酸盐的释放测量植酸酶活性(FTU)。无机磷酸盐与酸性钼酸盐/钒酸盐试剂形成黄色复合物并且在分光光度计中在415nm波长处测量这种黄色复合物，并且用磷酸盐标准曲线量化释放的无机磷酸盐。1单位植酸酶(FTU)是在欧洲标准(CEN/TC327，2005-TC327WI003270XX)中给定的反应条件下每分钟从植酸盐释放1微摩尔无机磷酸盐的酶量。
H.植酸含量的测定
为测定植酸含量，通过调节5％料浆(如果它是干样品)的pH至pH10从样品提取植酸并随后通过使用离子交换柱的HPLC方法确定植酸。使用NaOH梯度系统从该柱子洗脱植酸。随后通过与植酸标准物的比较计算液体中的植酸含量。
本发明组合物和方法在后续实施例中进一步详述，所述实施例不意图以任何方式限制范围。所引用的全部参考文献通过引用方式在本文中对其中所述的全部内容特别地并入。
实施例
本公开和以下的实施例章节应用以下的缩写：wt％(重量百分数)；℃(摄氏度)；H2O(water)；dH2O(去离子水)；dIH2O(Milli-Q过滤去离子水)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；kg(千克)；μL和μl(微升)；mL和ml(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；U(单位)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；hr(小时)；DO(溶解的氧)；W/V(重量/体积)；W/W(重量/重量)；V/V(体积比体积)；IKA(IKAWorksInc.2635NorthChaseParkwaySE，Wilmington，NC)；Genencor(DaniscoUSInc，Genencor分公司，PaloAlto，CA)；Ncm(牛顿厘米)和ETOH(乙醇).eq(当量)；N(正常)；ds或DS(干固体含量)，SAPU(分光光度酸性蛋白酶单位，其中1SAPU是在测定法的条件下每分钟从酪蛋白底物中释放1微摩尔酪氨酸的蛋白酶酶活性的量)和GAU(葡糖淀粉酶单位，其定义为在pH4.2和60℃每小时将从可溶性淀粉底物产生1g还原性糖(计算为葡萄糖)的酶的量)。
实施例1.变体的构建
使用定点诱变法构建AmyS的成熟序列的变体，例如，按下文构建S242位点的变体：
用于诱变的模板是来自NewEnglandBiolabs(马萨诸塞州)的使用dam甲基化酶的甲基化pHPLT-AmyS(见图2)。在Operon(Huntsville，AL)合成简并引物(S242F(正向)和S242R(反向)，下文给出)并稀释至10μM，互补性正向和反向序列均含有用于反应中连接的5’磷酸酯基。亲本α-淀粉酶的序列是由SEQIDNO：2表示。使用在靶位点处以NN(G/C)随机化的寡核苷酸引物，以StratageneQuik-ChangeTM多位点试剂盒(Stratagene，LaJollaCA)创建文库。所选择的氨基酸(例如S242)随机地用全部19种可能备选物替换。
用于诱变的S242引物：
S242F：5′-[Phos]GTCAAGCATATTAAGTTCNNSTTTTTTCCTGATTGGTTG-3′SEQIDNO：17
S242R：5′-[Phos]CAACCAATCAGGAAAAAASNNGAACTTAATATGCTFGAC-3′SEQIDNO：18
反应如下进行：
QUIK-CHANGE反应：
该反应物由18μL无菌蒸馏水、2.5μL来自该试剂盒的10x缓冲液、1μL来自该试剂盒的dNTP、1.25μL正向引物(10μM母液)、1.25μL反向引物(10μM母液)、1μLpHPLT-AmyS质粒DNA作为模板(约70ng)和1μL来自该试剂盒的酶掺合物组成，总计26.5μL。
循环条件：
循环条件是95℃1分钟，进行一次，随后95℃1分钟、55℃1分钟、65℃10分钟，25个循环。将1μLDpnI(10U/μL)添加至Multi-SiteQuik-ChangeTM反应混合物并在37℃温育18小时，并随后添加另一份0.5μLDpnI温育额外3小时。
使用1μLDpnI消化的反应物作为采用Templiphi扩增试剂盒(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)的滚环复制的模板并且根据Amersham方案进行反应。将1μL滚环DNA转化至100μL枯草芽孢杆菌感受态细胞(2种蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌菌株(ΔaprE，ΔnprE，amyE：：xylRPxylAcomK-phleo))并在37℃振摇1小时。随后将全部转化物涂布在LA+10ppmNeo+1％不溶性淀粉平板(一个平板上涂布25μL，另一个平板上涂布75μL)并在37℃温育过夜。将96个转化体挑入微量滴定平板中150μL的LB+10ppmNeo内并在37℃培育过夜。用96针复制工具将过夜平板印在一个大LA+10ppmNeo+1％不溶性淀粉平板上并提交至QuintaraBiosciences(Berkeley，USA)用于菌落PCR和测序。
在确定变体序列后，将变体挑入含有125μLLB+10ppmNeo的96孔微量滴定平板，将所述变体排列成带对照的四重样式(quadformat)。排列的微量滴定平板在37℃和250转/分钟培育6小时。利用复制器(Enzyscreen，leiden荷兰)，使用微量滴定培养平板来接种含有150μL用于蛋白质表达的MBD培养基(G.Vogtentanz等人，产生大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂的枯草芽孢杆菌融合蛋白系统(ABacillussubtilisfusionproteinsystemtoproducesoybeanBowman-Birkproteaseinhibitor)，Prot.Expr.&Purif.55(2007)40-52)并补充有用于蛋白质表达的5mMCaCl2的一个新微量滴定平板(微量滴定平板和平板盖来自Enzyscreen，leiden荷兰)。将表达平板在37℃、250转/分钟和70％湿度培育64小时。随后，表达培养物经微滤板(0.22μm，Millipore，Billerica，MA)过滤并筛选改善的热稳定性(见实施例3)。
AmyS文库
为以下AmyS变体制作位点评估文库：
P17，D19，T21，N28，S51，G72，V74，A82，Q86，Q89，A93，W115，D117，P123，S124，D125，N127，I130，G132，Q135，P145，G146，G148A，S153A，Y159，W166，S169，K171，R179，G180，I181，G182，K183，W187，G194，P209，N224，S242，P245，G256，D269，N271，T278，N281，G302，A304，R308，T321，Q358，P378，S382，K383，T398，H405，T417，E418，P420，G421，P432，W437，Q443，G446，G454，S457，T459，T461，S464，G474，R483.
实施例2.变体的表达、纯化和表征
将菌落从实施例1的微量滴定平板划线到具有10ppm新霉素的淀粉平板。平板在37℃温育过夜并挑取单菌落并用来接种含有培养基(见下文)和20ppm新霉素的摇瓶(250mL，具有25mL培养基)。培养物在37℃，275转/分钟培育约8小时(至达到OD(600nm)2.0)。将培养物发酵液与50％甘油以2∶1比率混合，置入分别标记的培养小瓶并冷冻于-80℃。随后从这些甘油原种产生所选择的淀粉酶。
淀粉酶发酵在500mL摇瓶内37℃培育含有1％(w/v)大豆胨的极小MOPS培养基(Neidhardt等人，J.Bacteriol.(1974)119(3)：736-747)60小时实施。使用疏水性相互作用层析从发酵液纯化酶。简要地，将发酵液浓缩10倍，随后用含有1M硫酸铵的50mMMES，2mMCaCl2，pH6.8稀释复原至其原始体积，并使用玻璃纤维滤器无菌过滤。样品随后上载到用同一种缓冲液预平衡的苯基琼脂糖凝胶FF高密度柱(20x95mm；Amersham，GEHealthcareBio-Sciences，Sweden)上。用10个柱体积的无硫酸铵的相同缓冲液，随后用5个柱体积的水除去非淀粉酶蛋白质。最后，用含有40％丙二醇的50mMMES，2mMCaCl2，pH6.8洗脱目的酶。
用标准定量SDSPAGE凝胶光密度测定法；或者使用来自Megazyme(Wicklow，Ireland)的标准淀粉酶测定试剂盒，利用活性测定法确定蛋白质浓度。利用纯化淀粉酶(芽孢杆菌属707淀粉酶；SEQIDNO：6)生成的标准曲线用于变换实验。
实施例3.确定改变的特性：热应激
本实施例显示本文中所述的变体可以相对于亲本α-淀粉酶具有改变的特性。实施嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS)变体的高通量热稳定性筛选。
研究并选择这样的热应激条件，该条件在热应激后初始野生型酶大致显示40％未应激活性(即，热应激后活性/热应激前活性大致是0.4)。一式四份筛选突变体文库并且将潜在胜出者鉴定为热应激后显示比初始野生型酶的平均残余活性高至少2个标准差的残余活性的那些突变体。
淀粉酶表达在表达平板的培养上清中是大约100ppm。在37℃于加湿摇床(250转/分钟和70％r相对湿度)中生长60-65小时后，使用滤板澄清培养上清以除去细胞物质。将澄清的上清10倍稀释到含有50mMNaOAc/2.6mMCaCl2/0.002％Tween-20，pH5.8的缓冲液中，至终浓度大约10ppm。将上清的一个等份试样进一步稀释成0.02ppm，并使用荧光标记的谷物淀粉底物如下文所述确定酶变体的活性。在50mMNaOAc/2.6mMCaCl2/0.002％Tween-20，pH5.8中稀释成0.02ppm之前，上清的第二等份试样在热循环仪中经历95℃热应激30分钟，并使用下文所述同样荧光底物和测定法测定残余活性。
使用淀粉酶EnzCheck测定试剂盒基本上如制造商(Invitrogen，SanDiegoCA)所述确定淀粉酶活性。该测定法中淀粉酶的终浓度是大约0.02ppm。测试缓冲液是50mMNaOAc/2.6mMCaCl2/0.002％Tween-20，pH5.8。底物是BODIPY荧光染料缀合的来自谷物的100μg/mLDQTM淀粉(Invitrogen，Eugene，OR)。使用SpectramaxM2(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)测量表示淀粉酶活性的增加的荧光。用记录动态模式的仪器在室温监测反应5分钟。激发波长是485nm；用515nm的截止滤光片在520nm监测发射。
野生型AmyS(Xtra)在经历95℃热应激30分钟后显示33-43％残余活性。AmyS变体S242A和S242Q在相同热应激条件后仍分别保留55-65％和70-80％残余活性。见图3和表3-1。这些残余活性量值表明这两种变体比野生型α-淀粉酶更热稳定。一些变体没在文库中并由带删除线的位点字母表示。在其位点上，取而代之放置野生型(Xtra)；(WT)表示取而代之放置野生型。每决平板包括Xtra作为对照。
表3-1：每种变体样品的残余活性百分数。
实施例4.由DSC确定改变的特性
使用疏水性相互作用层析法从摇瓶发酵液(见实施例2)纯化Xtra、S242A和S242Q。使用含有40％丙二醇和2mMCaCl2的50mMMES，pH6.8从该柱以纯化的形式洗脱蛋白质。
使用超敏感扫描高通量微量量热器VP-CAPDSC(MicroCal，Inc.，Northampton，MA)测量过量热容量曲线。先前公开了DSC测量的标准方法和该技术的理论(Freire，E.(1995)“差示扫描量热法(DifferentialScanningCalorimetry)，”Methods.Mol.Biol.41，191-218)。在30-120℃温度范围扫描大约500μL的0.5mg/ml野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或变体S242S和S242Q(均在2mM氯化钙不存在和存在时)。随后再扫描相同样品以检查该过程的可逆性。对于α-淀粉酶，热解折叠过程是不可逆的。使用的缓冲液是10mM乙酸钠，pH5.5。使用200℃/小时扫描率来使本来可能因聚集引起的任何人造物最小化。使用DSC曲线的热中点(Tm)作为热稳定性的指示。表4-1显示所测试的淀粉酶蛋白质的热熔点。图5中显示野生型和淀粉酶变体的热熔融曲线和熔点。
与野生型的熔点相比时，淀粉酶变体S242A和S242Q在2mM氯化钙不存在和存在下的热解折叠过程显示变体的熔点明显提高。在不存在添加的氯化钙的情况下，野生型淀粉酶具有100.8℃热熔点，而S242A和S242Q的Tm分别是106.5℃和110.1℃。因而，S242替换为A引起Tm提高5.7℃，并且S242替换为Q引起Tm提高9.3℃。
在2mM氯化钙存在下，所表征的野生型淀粉酶具有106.8℃的热熔点，而S242A和S242Q的Tm分别是111.8℃和113.8℃。因而，在2mM氯化钙存在下，全部3种蛋白质显示提高的Tm值。野生型和S242A变体的Tm提高分别是6℃和5.3℃。S242Q变体的Tm提高是3.7℃。这提示S242Q变体更少地被钙稳定化，或就稳定性而言，该变体更少依赖于钙。在氯化钙存在下，相对于野生型，S242A和S242Q的Tm提高分别是5℃和3℃。这提示所述变体的热动力学特性不同于Xtra的那些热动力学特性，并且这个观察结果与应用研究中其增强的性能相一致(见实施例5)。
表4-1
实施例5.活性特征
该实施例显示所测试变体不仅相对于亲本α-淀粉酶，还相对于工业标准具有改变的活性特征。在纯化样品或平板样品上进行蛋白质确定。基于相等蛋白质浓度使用(dose)所有实验变体和标准α-淀粉酶。
使用pH5.6苹果缓冲液，将平板变体或纯化变体稀释为20ppm。底物由50mM相同的苹果酸缓冲液，pH5.6中的15％谷物淀粉组成。将400μL淀粉混悬液平衡至70℃持续2.5分钟。将7μL稀释的酶(约0.36ppm蛋白质终浓度)迅速添加至平衡的淀粉。反应混合物随后置入预热至85℃的振摇加热器并以300转/分钟混合。反应用50μL的125mMNaOH在预定时间间隔猝灭。随后将反应管离心并将上清按10倍稀释到10mMNaOH中，以通过HPAEC-PAD分析DP谱。
在4、10和20分钟建立反应。将从DP2至HPLC运行结束的总面积集成并且该面积除以总蛋白质和反应时间。
4分钟反应提供酶开始分解底物的快慢的指示，10分钟反应提供酶热活性的指示，并且20分钟反应提供酶热稳定性的指示。
结果在图7和8中提供。
实施例6-粘度计中的液化
该实施例显示实施例3的S242A和S242Q变体也相对于亲本α-淀粉酶具有改变的性能，其中所述的变体相对野生型亲本显示改变的残余活性。在应用测试之前，将实施例2的变体α-淀粉酶纯化并表征总蛋白和比活。
使用HAAKE粘度计550仪监测玉米粉因α-淀粉酶作用所致的粘度降低。用30％谷物粉干固体以分批模式每日新鲜制备底物料浆。使用硫酸调节pH至5.8。称量出50g料浆(15g干固体)并预温育10分钟以加温至70℃，伴以搅拌。添加α-淀粉酶后，将温度立即从70℃跃升至85℃，转速75转/分钟。一旦料浆和酶混合物的温度达到85℃，维持温度恒定。监测粘度额外30分钟。在整个运行期间测量粘度并以μNm报告。在相等的蛋白质浓度(20和30μg/50g谷物粉料浆)上使用野生型AmyS、S242A和S242Q。
粘度计应用测试显示AmyS变体S242A和S242Q二者均比基准α-淀粉酶SC和Xtra具有更好的性能。这两变体都展示Xtra特征的低峰粘度以及SC的低最终粘度。当以较低的浓度20μg总蛋白上样时，与SC的峰粘度相比，变体的较低峰粘度之间的差异更明显。见图9、10和11。
实施例7.喷射蒸煮锅中的液化
通过对稀釜馏物使用70∶30比率的水，将全磨谷物制成32％(干固体谷物)的料浆。用10NNaOH调节料浆pH至pH5.8。使用水和蒸汽在夹层锅中加热料浆至70℃(158°F)。添加液化酶(Xtra，SC或S242Q)并将料浆加热至85℃(185°F)持续大约10分钟。在将料浆在85℃温育额外10分钟后，使用大型实验装置喷射(配备来自Hydro-ThermalCorp.，Waukesha，Wisconsin的M103水热器)，将料浆通过维持于107℃(225°F)的喷射蒸煮锅，维持时间为3分钟。从该喷射收集液化物并置于85℃水浴中。喷射后，添加第二剂量的液化酶。连续搅拌液化物并在85℃维持90分钟。在0、30、60和90分钟收集样品。对全部喷射后样品测试DE(使用Schoorls法；备索方法)和粘度(Brookfield型粘度计(Lab-LineInstrumentsInc.，MelrosePark，Illinois)，以20转/分钟转动锭子3)。喷射之前和之后液化酶的投入量在后续图中显示为“X+Y”，其中X代表喷射之前添加的酶的单位数并且Y代表在液化物通过喷射蒸煮锅后添加至液化物的单位数。结果在图12和13中显示。
实施例8.去除植酸抑制作用对α-淀粉酶热稳定性的影响
本实施例中，研究了去除植酸抑制作用对液化热稳定的α-淀粉酶的热稳定性的影响。
A.无喷射蒸煮(单次酶投放(dose))
用含有30％v/v稀釜馏物的水制备全磨谷物料浆(从BadgerStateEthanol，Monroe，WI，USA获得)，终浓度约32％干固体。在夹层锅中制备谷物固体。充分混合料浆并测量pH(pH5.2)并使用而不进一步调整pH。在夹层锅中混合该料浆并使其至预处理温度70℃。正好达到70℃之前添加液化酶，即α-淀粉酶(4AAU每克干固体谷物)，并且添加植酸酶(4FTU每克干固体谷物)并以开始温育或初级液化步骤。允许料浆在淀粉酶存在下，伴有或不伴有添加的植酸酶时温育30分钟。该实验中使用的植酸酶是BP-17(见上文)。虽然在本实施例中在与α-淀粉酶相同的时间添加植酸酶，然而植酸酶可以在淀粉酶之前添加。
处理的料浆随后置于维持在90℃的水浴中，以开始次级液化步骤(2°液化)步骤。在0、30、60和90分钟取得的样品用于粘度(通过Brookfield粘度计)和DE(通过Schoorls法)测试。结果在图14和15中显示。
B.具有喷射蒸煮(分批酶投放)
用含有30％v/v稀釜馏物的水制备全磨谷物料浆(从BadgerStateEthanol，Monroe，WI获得)，终浓度约32％干固体。在夹层锅中制备谷物固体。充分混合料浆并测量料浆的pH(pH5.2)。在夹层锅中混合该料浆并使其至70℃的预处理温度。正好达到70℃之前添加液化酶，即S242Q变体α-淀粉酶(3AAU每克干固体谷物)，并开始计时以开始温育或初级液化步骤。允许料浆在α-淀粉酶存在下，伴有或不伴有添加的植酸酶(4FTU每克干固体谷物)时温育30分钟。虽然在本实施例中在与α-淀粉酶相同的时间添加植酸酶，然而植酸酶可以在淀粉酶之前添加。
随后使温育的料浆通过利用蒸汽和水预热至所需温度的喷射蒸煮锅(225°F；107.2℃)。将料浆以约4升/分钟的最大速度(1.5设定)传送经过喷射(蒸煮锅)。使用保持线圈(holdcoil)的第一次三个循环产生刚超过3分钟的保持时间。在取代全部水并维持稳定所需温度后，收集增溶的谷物醪液的等份试样并且置于85℃的次级浴(悬臂搅拌)以开始次级液化步骤(2°液化)。添加第二剂量的S242Q(1AAU/gm干固体)并且液化继续额外90分钟。在0、30、60和90分钟取得的样品以测试粘度(通过Brookfield粘度计)和DE(通过Schoorls)。该液化物在实施例10B中使用。
C.常规喷射蒸煮
用含有30％v/v稀釜馏物的水制备全磨谷物料浆(从BadgerStateEthanol，Monroe，WI获得)，终浓度约32％干固体。在夹层锅中制备谷物固体。充分混合料浆并测量料浆的pH(pH5.2)并用稀的NaOH调节pH至pH5.8。在夹层锅中混合该料浆并使其直至预处理温度70℃。正好达到70℃之前添加液化酶，即S242Q变体α-淀粉酶(3AAU每克干固体谷物)，并开始计时以开始温育或初级液化步骤。允许料浆在α-淀粉酶存在下而无添加的植酸酶时温育30分钟。
随后使温育的料浆通过利用蒸汽和水预热至所需温度的喷射蒸煮锅(225°F；107.2℃)。将料浆以约4升/分钟的最大速度(1.5设定)传送经过喷射(蒸煮锅)。使用保持线圈的第一次三个循环产生刚超过3分钟的保持时间。在取代全部水并维持稳定的所需温度后，收集增溶的谷物醪液的等份试样并且置于85℃的次级浴(悬臂搅拌)以开始次级液化步骤(2°液化)。添加第二剂量的S242Q变体α-淀粉酶(1AAU/gm干固体)并且液化继续额外90分钟。在0、30、60和90分钟取得样品以测试粘度(通过Brookfield粘度计)和DE(通过Schoorls)。以上实验对pH5.5的料浆。见图22。该得液化物在实施例10A中使用。
D.伴有和不伴有喷射蒸煮的结果
在温育(初级液化)期间添加BP-17植酸酶将全磨谷物的植酸含量从0.60％干固体谷物降低至0.09％干固体谷物(＞85％降低)(图21)。从图14和图15还显而易见α-淀粉酶在225°F(107℃)喷射蒸煮温度基于DE发展或粘度降低而失活。然而，在喷射蒸煮之前投入植酸酶(认为时来去除植酸抑制作用)引起α-淀粉酶的热稳定性明显提高，如次级液化步骤期间在90℃的DE进展和粘度降低所示。随喷射蒸煮观察到相似的结果(数据未显示)，如图14和图15中所示。
实施例9.BP-17植酸酶浓度在低pH对α-淀粉酶稳定性的影响
进一步研究了因解除α-淀粉酶的植酸抑制作用所致的α-淀粉酶热稳定性的提高。在次级液化全磨谷物之前使用植酸酶水解植酸并且在低pH确定pH稳定性的改善。
在典型实验中，通过使用70∶30比率的水和稀釜馏物，将全磨谷物制成32％(干固体谷物)料浆。测量并发现料浆pH是pH5.2。使用水和蒸汽在夹层锅中加热料浆至70℃。添加液化酶即S242Q变体α-淀粉酶(4AAU/gm干固体谷物)和不同浓度的BP-17(0-12FTU/gm干固体谷物)并且通过在70℃保持温度45分钟预处理料浆。45分钟预处理后，料浆置于90℃水浴中。连续搅拌液化物并在90℃维持90分钟。在0、30、60和90分钟收集样品。对全部样品测试DE(使用Schoorls法)和粘度(Brookfield粘度计，以20转/分钟转动锭子2)。DE进展和粘度数据汇总于图16和17中。
图16和17结果显示S242Q变体α-淀粉酶的植酸抑制作用的降低引起对于活性而言的低pH稳定性显著提高，如在90℃的DE进展稳定增加，伴以液化物的粘度同时降低所证实。数据清楚显示植酸抑制作用被消除，S242Q变体α-淀粉酶可以成功地在pH5.2用于全磨谷物的液化过程中。在图21中，可以见到DE进展的速率随植酸的去除升高并在4FTU/gm干固体上达到最大，这表明植酸酶通过从料浆移除植酸提高S242Q变体α-淀粉酶的热稳定性。
实施例10.pH的影响
在本实施例中研究pH对S242Q变体α-淀粉酶的影响。
在常见实验中，通过使用70∶30比率的水和稀釜馏物，将全磨谷物制成32％(干固体谷物)料浆。测量并发现料浆pH是pH5.2。使用H2SO4降低pH至4.2与4.8之间。使用水和蒸汽在夹层锅中加热料浆至70℃。添加液化酶即S242Q变体(4AAU/gm干固体)和BP-17(4FTU/gm干固体)并通过在70℃保持温度45分钟来预处理料浆。45分钟预处理后，料浆置于90℃水浴中。连续搅拌液化物并在90℃维持90分钟。在0、30、60和90分钟收集样品。对全部样品测试DE(使用Schoorls法)和粘度(Brookfield粘度计，以20转/分钟转动锭子2)。DE进展和粘度数据汇总于图18和19中。
结果显示DE进展随pH从5.2下降至4.5而降低。酶在pH4.2彻底失活。
实施例11.对乙醇生产的影响
使用液化物作为乙醇发酵中用于醇生产的发酵原料。全磨谷物料浆(从BadgerStateEthanol，Monroe，WI获得)与含有30％v/v稀釜馏物的水混合至终浓度约32％干固体。
A.常规方法
使用来自实施例8C的液化物(液化物A)。
在同步糖化发酵(SSF)阶段之前使用H2SO4调节次级液化物的pH至4.2。
B.低pH，喷射蒸煮(分批投放)
使用来自实施例8B的液化物(液化物B)。在SSF之前不进行pH调节。
C.同步糖化发酵
在每个实验中，在制备培养基之前获得容器的皮重。将32％DS谷物干固体液化物(2升)置于2L烧瓶中。通过添加10克酵母和1克葡萄糖至40克水，在轻微搅拌下1小时制备红星乙醇红酵母(REDSTAR(Lesaffre))接种物。将5毫升的每种接种物添加至平衡的发酵罐，随后以0.4GAU/g干固体谷物添加GZymeTM480Ethanol(DaniscoUSInc，GenencorDivision)以启动同步糖化发酵。记录初始毛重并将烧瓶置于维持在32℃的水浴中。以不同时间间隔取得样品并使用HPLC分析其糖及乙醇含量。发酵也使用1公斤每种液化物实施，在不同时间间隔测量发酵期间的重量丢失。基于因丧失二氧化碳所致的重量丢失确定醇。在发酵结束时，获得终末毛重。将发酵液定量地转移到5L圆底容器中。蒸馏在真空下进行直至在含有200ml水的接受器收集大约800ml乙醇。将乙醇稀释至2L并通过HPLC分析。在干燥之前获得釜脚的重量和DS。对DDGS进行残余淀粉分析。基于重量丢失、蒸馏和残余淀粉分析进行化学计量计算。
乙醇计算：使用CO2重量丢失：
乙醇产生(mmol)＝CO2丢失(g)/88
乙醇产生(g)＝(CO2丢失(g)/88)＊92＝＞CO2丢失(g)＊1.045
乙醇产生(ml)＝((CO2丢失(g)/88)＊92)/0.789
＝＞CO2丢失(g)x1.325
图20中数据显示根据本发明的常规方法与不调节pH的方法之间游离硫酸盐及植酸含量的主要差异。在温育中随热稳定性α-淀粉酶的植酸抑制作用的去除产生这样的DDGS，其具有降低的植酸含量、更高的游离可用磷酸盐和减少的硫酸盐。因而，不调节pH的方法赋予在淀粉液化中起液化作用的热稳定性α-淀粉酶在低pH处的pH稳定性。
实施例12.其他方法
在下述实施例中使用以下测定法。在实施例中显示对下文所提供方案的任意偏离。在这些实验中，使用分光光度计来测量反应完成后所形成产物的吸光度。
A.蛋白质含量确定
BCA(双喹啉-4-羧酸(bicinchoninicacid))测定法
在这些实验中，使用BCA(Pierce)测定法在微量滴定平板(MTP)规格上确定样品中的蛋白质浓度。在这些测定法系统中，使用的化学品和试剂溶液是：BCA蛋白质测定试剂和Pierce稀释缓冲液(50mMMES，pH6.5，2mMCaCl2，0.005％)。所用的设备是SpectraMAX(340型；MolecularDevices)MTP读数仪。MTP从Costar获得(9017型)。
在测试中，将200μlBCA试剂移入各孔，随后移入20μl稀释的蛋白质。彻底混合后，MTP在37℃温育30分钟。除去气泡，并在562nm处读取孔中溶液的光密度(OD)。为确定蛋白质浓度，从样品读数中扣除背景读数。对蛋白质标准物(纯化的酶)标出OD562以产生标准曲线。从该标准曲线内推样品的蛋白质浓度。
Bradford测定法
在这些实验中，使用Bradford染料试剂(QuickStart)测定法在MTP规格上确定样品中的蛋白质浓度。在这些测定法系统中，使用的化学品和试剂溶液是：快速启动Bradford染料试剂(BIO-RAD目录号500-0205)、稀释缓冲液(10mMNaCl，0.1mMCaCI2，0.005％)。使用的设备是BiomekFXRobot(Beckman)和SpectraMAX(340型)MTP读数仪。MTP来自Costar(9017型)。
在测试中，将200μlBradford染料试剂移入各孔，随后移入15μl稀释缓冲液。最后添加10μl滤过的培养发酵液至诸孔。彻底混合后，MTP在室温温育至少10分钟。吹去气泡并且在595nm处读取这些孔的OD。为测定蛋白质浓度，从样品读数中扣除背景读数(即来自非温育孔的读数)。所获得的OD595值提供了样品中蛋白质含量的相对量值。
B.用于测试酶性能的微量样品测定法
在本测定法中使用的洗涤剂不含酶或已经通过如本文件中其他部分所述的热灭活法摧毁商业洗涤剂中存在的酶。使用的设备包括Eppendorf热混合仪和SpectraMAX(340型)MTP读数仪。MTP从Costar获得(9017型)。
洗涤剂制备(AATCCHDL；美国条件)
将Milli-Q水调节至6gpg水硬度(Ca/Mg＝3/1)，并添加无增白剂的1.5g/lAATCC2003标准参考液体洗涤剂。剧烈地搅拌洗涤剂溶液至少15分钟。然后，添加5mMHEPES(无酸)并调节pH至8.0。
用于测试淀粉酶性能的稻淀粉微量样品测定法
如本文件中其他部分所述制备试验洗涤剂。使用的设备包括NewBrunswickInnova4230摇床/恒温箱和SpectraMAX(340型)MTP读数仪。MTP从Corning获得(3641型)。具有橙色色素样品的老化稻淀粉(CS-28)从(Vlaardingen，荷兰)试验材料中心(CenterforTestMaterials)获得。在切成0.25英寸圆形微量样品前，该织物用水洗涤。将两份微量样品置于96孔微量滴定平板的每个孔中。在20℃(北美)或40℃(西欧)平衡试验洗涤剂。将190μl洗涤剂溶液添加至MTP的含有微量样品的每个孔。向该混合物添加10μl稀释的酶溶液。MTP用粘性箔密封并置于恒温箱中1小时，同时在所需的试验温度(通常20℃或40℃)以750转/分钟混合。温育后，从每个孔转移150μl溶液至一个新鲜MTP中并在488nm处使用SpectraMAXMTP读数仪读出此MTP以量化清洁作用。还包括空白对照以及含有微量样品和洗涤剂但不含酶的对照。
酶性能的计算
所获得的吸光度值对空白值(即在无酶时温育微量样品后获得的吸光度值)校正。所得吸光度是水解活性的量值。
C.通过抗体滴定确定淀粉酶浓度
如本文所述，通过用抑制性多克隆抗体滴定确定α-淀粉酶的浓度和比活。发现针对嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS)产生的多克隆抗体强烈地抑制AmyS和来自芽孢杆菌属物种TS23的α-淀粉酶(例如，结合牢固足以产生活性丧失的线性滴定)。因而，这种抗体可以用来测量酶浓度，后者转而用来计算比活。简而言之，测量了由抗体的几个已知浓度引起的酶抑制作用的量。从这个信息外推出完全抑制作用所需的抗体浓度，该抗体浓度等价于样品中的酶浓度。使用产生荧光的BODIPY-淀粉测定法测量α-淀粉酶活性和抑制作用。缓冲液是含有0.005％Tween-80的pH7.0的50mMMOPS。
针对纯化AmyS的多克隆抗体在兔中产生并由标准方法纯化。通过测量对比活已知的AmyS样品的抑制作用，确定了抗体贮存液的经验性“表观浓度”值。随后抗体样品用来确定AmyS和TS23t变体的浓度和比活。使用这些值来产生归一化96孔酶贮存平板，其中将全部变体稀释至常见浓度。
D.天然蛋白凝胶电泳
使用PhastGel系统(GEHealthcare)在7.5％或12.5％浓度的预制天然聚丙烯酰胺凝胶(PhastGelHomogeneous)上测量变体蛋白质样品的电泳迁移率。使用缓冲带(PhastGelNative)并且它由0.88ML-丙氨酸，0.25MTris缓冲液中的pH8.8组成。一般运行条件由400V持续12.75分钟，阳极至阴极距离3.7cm组成。
备选地，通过选择合适缓冲系统，在多个pH值(即5.8、8.0和10.0)的1mm厚度0.5-1.5％琼脂糖凝胶上测量变体蛋白质样品的电泳迁移率。电泳在非变性条件下进行。阴极-阳极长度是13.9cm。1-2μg蛋白质样品与5％甘油+0.05％溴酚蓝混合并上样到每个泳道上。凝胶一般在100V运行1小时。
在任一情况下，凝胶用溶解在10％乙酸中的Louisville蓝染料染色并用10％甲醇和10％酸性酸水溶液脱色。根据使用的天然凝胶系统，可能同时上样12种至20种蛋白质变体。结果，相对于在相同凝胶上加载的电荷标准物梯，可以立即评估蛋白质变体的电泳迁移率。
E.洗涤剂热失活
商业洗涤剂配方的热失活起到摧毁任意蛋白质组分的酶活性而保留非酶组分特性的作用。因而，这种方法适于制备商业购买的洗涤剂，以用于测试本发明的酶变体。对于北美(NA)和西欧(WE)重垢液体衣物(HDL)洗涤剂，通过将(玻璃瓶子中)预称重的液体洗涤剂置于95℃水浴中2小时进行热失活。用于热失活北美(NA)和日本(JPN)重垢颗粒衣物(HDG)洗涤剂的温育时间是8小时而西欧(WE)HDG洗涤剂的该温育时间是5小时。用于热失活NA和WE自动盘碟(ADW)洗涤剂的温育时间是8小时。所述洗涤剂从本地超市商店购买。在溶解洗涤剂至精确测定失活百分数的5分钟范围内测试未加热过和加热过的洗涤剂。酶活性由suc-AAPF-pNA测定法测试。
为在热失活的洗涤剂中测试酶活性，从热失活的促液制备洗涤剂的工作溶液。添加适宜量的水硬度(6gpg或12gpg)和缓冲液至该洗涤剂溶液以匹配想要的条件(表12-1)。通过旋转或颠倒瓶子而混合溶液。
缩写：Procter&Gamble(P&G)和ReckittBenckiser(RB)。
E用于清洁性能确定的Terg-o-tometer测定法
使用了用于评估蛋白质和糖类污渍(soil)清洁作用的标准方案，其中在标准条件下清洁之前和之后测量织物样品上的污渍水平。织物样品由以玉米淀粉、稻淀粉或血、乳和炭黑混合物弄脏的织造棉质织物组成，并从Testfabrics，Inc.(WestPittiston，PA)购买。玉米淀粉(EMPA161)和血、乳及炭黑(EMPA116)技术性污渍由EMPA试验材料AG(St.Galle，瑞士)产生。稻淀粉(CFTCS-28)污渍由CenterforTestmaterialsBV(Vlaardingen，荷兰)产生。使用设置成D65(6500°K)标准照明的Minolta光反射仪(Reflectometer)CR-410，通过光反射率在处理之前和之后测量每种污渍。将L、a、b值的差异转化成总色差(dE)，如CIE-LAB颜色空间所定义。通过取得洗涤之前和之后的颜色差异之间的比率并比较该比率与未洗涤过的污渍(洗涤之前)对未弄脏织物的差异，将污渍的清洁作用表述为污渍去除指数的百分数(％SRI)。
清洁实验在配备6个2L不锈钢罐的Terg-o-tometer(UnitedStatesTestingCo.，Hoboken，NJ)中实施，其中所述不锈钢罐配有悬臂式搅拌器。每个处理在由6格令/加仑3∶1(钙∶镁)水硬度或12格令/加仑水硬度组成的1L总体积中实施。洗涤实验中使用的洗涤剂是具有pH8的5mMHEPES缓冲液的1.5g/LAATCCHDLWOB2003液体洗涤剂、0.7g/LAATCCHDDWOB1993颗粒洗涤剂、具有过硼酸盐和TAED漂白剂的8g/LIECA＊60456颗粒洗涤剂，或5g/LPersilPower凝胶液体洗涤剂。将酶直接添加至洗涤溶液并随后通过添加40g/L或200g/L的脏污织物和陪洗织物(ballastfabric)启动反应。洗涤反应以100转/分钟在20℃、25℃、30℃、40℃或50℃搅拌10、15或40分钟。清洁后，样品在自来水中漂洗3分钟，在滚筒洗衣机中以1000转/分钟甩干以除去多余水并在干燥器中以低热在恒压循环上干燥大约45分钟。污渍去除程度的比较结果由反射测量术评估并表述为污渍去除指数的百分数(％SRI)。对照条件不含有酶并且阳性对照由多种剂量的基准商业酶组成。
G.用于确定淀粉酶活性的Bodipy-淀粉测定法
使用Ultra淀粉酶测定试剂盒(E33651，Invitrogen)实施Bodipy-淀粉测定法。通过将含有冻干底物的小瓶的内容物溶解于pH4.0的100μL50mM乙酸钠缓冲液中制备DQ淀粉底物的1mg/mL母液。将小瓶涡旋混合约20秒并置于室温黑暗中，偶尔混合直至溶解。添加900μL测试缓冲液(50mM乙酸钠，含2.6mMCaCl2，pH5.8)并且将小瓶通过涡旋混合约20秒。该底物溶液贮存在室温于黑暗中直至待用或贮存在4℃。对于该测定法，从测试缓冲液中的1mg/mL底物溶液制备100μg/mLDQ底物工作溶液。将190μL100μg/mL底物溶液添加至平底96孔微量滴定平板中的各孔。添加10μL的每种酶样品至各孔，使用热混合仪以800转/分钟混合30秒。在测定法中包括仅含有缓冲液和底物的空白样品(无酶空白)。在25℃于荧光微量滴定平板读数仪中测量荧光强度变化率(激发：485nm，发射：520nm)5分钟。
H.用于确定淀粉酶活性的谷物粉水解法
用于酶活性的谷物粉底物测定法的淀粉水解。使用固体撒布装置(V&PScientific)，将有机谷物粉(AzureFarms，批号03227)均匀地铺到聚丙烯黑色平底烟囱状孔Greiner96孔微量平板(目录号655209)中。将85μL的20mM乙酸钠pH5.6添加至各孔并混合。将密封箔施加在平板的顶部并将平板在70℃于热混合仪中预温育20-30分钟。酶样品稀释于Agilent聚丙烯平板(5042-1385)内的20mM乙酸钠缓冲液中。将11μL稀释酶样品添加至该底物平板并将平板牢固地用另一张箔密封。随后将平板转移至具有预热至95℃的有金属板(block)的LabnetVorTemp56恒温箱/摇床(目录号S2056A)并设定振摇速度至500转/分钟。继续温育30分钟。在温育结束时，在冰桶中迅速冷却平板并通过添加100μL的0.1NH2SO4至各孔终止淀粉水解反应。将平板短暂混合并通过PAHBAH测定法或HPLC分析淀粉水解反应产物。
比色检测来自酶水解谷物粉底物的可溶性糖浓度。80μL0.5NNaOH的等份试样添加至空PCR平板的全部孔，随后添加20μLPAHBAH试剂(5％w/v对羟基苯甲酰肼(PAHBAH，Sigma#H9882，溶解于0.5NHCl中的)并混合(PAHBAH反应平板)。将10μL淀粉水解反应上清添加至PAHBAH反应平板。将全部平板密封并置于拟定在95℃持续2分钟并随后冷却至20℃的热循环仪(MJResearchTetrad)中。将已显色的PAHBAH反应混合物中的80μL样品转移至读数板并在分光光度计中于405nm处测定吸光度。
HPLC确定来自酶水解谷物粉底物的可溶性糖浓度。从Sigma(St.Louis，MO)获得的可溶性糖标准物(DP1-DP7)均在Milli-Q水中稀释至100mg/mL并用于将糖的峰面积转化成实际的糖浓度。来自淀粉水解测定法的猝灭的平板在BeckmanCoulterAllegra6R离心机中以3000转/分钟25℃离心5分钟。将上清从离心过的平板吸出并转移至多重筛选-HV滤板(目录号MAHVN4550)。该滤板在HettichRotanta离心机中的AgilentHPLC平板上以6000转/分钟25℃离心10分钟。将50μL的0.01N硫酸流动相(用Milli-Q水稀释10倍的0.1N硫酸)转移至另一块清洁AgilentHPLC平板的各孔。短暂混合过滤的平板并将50μL滤液转移至该平板中的相应孔内，每孔50μL流动相。将稀释的糖标准物添加至平板中的空孔以包括在校准中。在平台摇床上短暂混合内容物并用Nalgene预分隔孔盖(Pre-slitWellCap)覆盖该平板。事先制备HPLC柱(Bio-RadAminexHPX-87H柱，目录号125-0140)，用2L流动相以0.6mL/分钟恒定流速运行。平板中的全部样品以20μL注射体积运行并使用AMINEXH.M和RID(折射率)作为检测器进行分析。在运行结束后，将HPLC中的流速降低至0.05mL/分钟。
I.确定因淀粉酶所致的淀粉粘度降低
在本测定法中，在粘度计中测量谷物淀粉底物溶液的粘度降低。谷物淀粉底物料浆以分批模式用30％谷物粉干固体在蒸馏水中新鲜制备并使用硫酸调节至pH5.8。对于每个运行，称量出50g料浆(15g干固体)并预温育10分钟以升温至70℃。在添加淀粉酶后，将温度立即从70℃跃升至85℃，转速为75转/分钟。一旦料浆和淀粉酶混合物的温度达到85℃，维持温度恒定并监测粘度额外30分钟。
J.测量对大分子底物的酶结合作用
实施结合测定法以确定淀粉酶(AmyS)电荷阶梯变体(电荷改变＝相对于野生型AmyS的-12至+12)与谷物秸秆和甘蔗渣的底物结合作用。使用的底物包括甘蔗渣(来自巴西的甘蔗渣，由国家可再生能源实验室(NationalRenewableEnergyLaboratory)稀酸预处理、洗涤并缓冲于pH5)、AFEX(氨纤维膨胀谷物秸秆)和PCS(稀硫酸预处理的谷物秸秆，洗涤并调节至pH5)。使全部底物在利用前达到想要的固体百分数。
淀粉酶结合作用：将淀粉酶电荷阶梯变体纯化并稀释至200ppm用于测试。在硼酸盐缓冲液(40mM，pH8.5，0.016％Tween-80)中制备1％纤维素甘蔗渣溶液。将150μl甘蔗渣溶液添加至微量滴定过滤平板中的各孔。将150μl硼酸盐缓冲液添加到充当对照的一组独立的孔中。将10μl淀粉酶电荷阶梯变体添加至过滤板，每种条件一式两份。该平板在室温温育2小时。收集滤液并通过BODIPY-淀粉测定法测量上清中的淀粉酶活性。
测量对微量样品的酶结合作用：淀粉酶变体在标准洗涤条件下与或不与CS-28稻淀粉微量样品温育30分钟。游离酶的量由BODIPY-淀粉测定法测量。与微量样品结合的酶的部分计算如下：结合的部分＝(样品不存在时的酶活性-样品存在时的酶活性)/(样品不存在时的酶活性)。
K.嗜热脂肪土芽孢杆菌淀粉酶蛋白质定量
由竞争性免疫测定法定量嗜热脂肪土芽孢杆菌淀粉酶蛋白质。简而言之，用荧光染料(荧光素)标记纯化的嗜热脂肪土芽孢杆菌淀粉酶并且用淬灭剂染料(四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine))标记嗜热脂肪土芽孢杆菌淀粉酶的抗体。荧光素-淀粉酶共轭物的荧光信号当结合淬灭剂-标记的抗体时淬灭。样品中存在的自由淀粉酶竞争淬灭剂-标记的抗体，导致荧光信号的增加。因此，荧光信号的强度与样品中的自由淀粉酶的量成比例。该测定用已知浓度的纯化嗜热脂肪土芽孢杆菌淀粉酶校准。
用荧光染料标记嗜热脂肪土芽孢杆菌淀粉酶：根据厂商的方案，将纯化的嗜热脂肪土芽孢杆菌淀粉酶用pH9.5的50mM碳酸钠缓冲液中的荧光异硫氰酸盐(MolecularProbes，EugeneOR)标记。在反应的最后，通过磷酸缓冲液盐溶液中的SephadexG-25(Sigma，StLouis，MO，USA)的凝胶过滤将蛋白质与未结合的染料分离。
抗体的制备并用淬灭剂染料标记：嗜热脂肪土芽孢杆菌淀粉酶的抗体通过免疫兔子并在抗血清中发现而制备。该抗血清储存于-20℃直至使用。免疫球蛋白级分的制备通过硫酸铵沉淀制备：将15ml.3.75M硫酸铵加入到20ml抗血清中，并在4℃放置60分钟，之后以2,000g离心以回收沉淀。回收的沉淀通过重悬洗涤两次，沉降在10ml冰冷的1.6M硫酸铵中。最终的沉淀溶解成4ml水，并在4℃下用50mM碳酸钠，pH9.5透析。通过使用消光系数ε1％＝15在A280评测蛋白质浓度为29.2mg/ml。用50mM碳酸钠，pH9.5中的四甲基罗丹明异硫氰酸盐标记(Sigma，St.Louis，MO)标记免疫球蛋白级分。然后通过在含有0.1％脱氧胆酸盐的磷酸缓冲液盐溶液平衡的SephadexG-25柱的凝胶过滤将未结合的染料除去。
测定步骤：免疫测定法在96-孔微量滴定板(Corning#3650)中进行。调节荧光素-淀粉酶的浓度，由此测试中的终浓度将在期望的标准曲线的中间。类似地，调节淬灭剂-抗体的浓度，由此终浓度将允许荧光信号的最大调节。使用自动液体控制系统(automatedliquidhandlingsystem)，将5μL每种样品、荧光素-淀粉酶和淬灭剂抗体添加到含有2％(w/v)聚乙二醇8000(Sigma，St.Louis，MO，USA)的180μL磷酸缓冲液盐溶液中。短暂振摇后，使得平板在室温下温育1小时，使用分别将激发和发射滤片设置为495nm和520nm的荧光平板读数器(MolecularDevices)测定荧光信号。
实施例13.在枯草芽孢杆菌中的淀粉酶产生
在本实施例中，描述了在枯草芽孢杆菌中产生突变截短形式的嗜热脂肪芽孢杆菌α淀粉酶(具有S242Q突变和从羧基端的29个氨基酸缺失，本文中也称作S242Q)及其变体。转化如本领域已知那样(见，例如WO02/14490)进行。简而言之，将编码亲本淀粉酶的基因克隆到pHPLT表达载体中，其中该pHPLT表达载体含有LAT启动子(PLAT)、编码LAT信号肽的序列(preLAT)，后接PstI和HpaI限制性位点用于克隆。
下文显示LAT信号肽的编码区：
atgaaacaacaaaaacggctttacgcccgattgctgacgctgttatttgcgctcatcttcttgctgcctcattctgcagcttcagca(SEQIDNO：20).
下文显示LAT信号肽的氨基酸序列：
MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAASA(SEQIDNO：21)
使用带有以斜体显示的替换氨基酸的成熟截短S242Q淀粉酶的氨基酸序列作为制备本文中所述变体文库的基础：
成熟Amys淀粉酶的编码区如下所示：
成熟Amys淀粉酶的氨基酸序列用作制备成熟Amys变体文库的基础，并如SEQIDNO：2提供。
使用来自Qiagen的Qiaquik柱纯化PCR产物并将该产物重悬于50μL去离子水中。用HpaI(Roche)和PstI(Roche)消化50μL纯化的DNA并将所得DNA重悬于30μL去离子水中。利用PstI和HpaI克隆位点，将10-20ng/μL所述DNA克隆到质粒pHPLT中。连接混合物直接转化至感受态枯草芽孢杆菌细胞(基因型：Δvpr，ΔwprA，Δmpr-ybfJ，ΔnprB)。该枯草芽孢杆菌细胞具有置于木糖诱导性启动子下的感受态基因(competencygene)(comK)，从而使用木糖来诱导对DNA结合和摄取的感受态(见Hahn等人，(1996)Mol.Microbiol.，21：763-775)。
质粒pHPLT-AmyS的元件包括：pUB110＝来自质粒pUB110的DNA片段(McKenzie等人，(1986)Plasmid15：93-103)。质粒特征包括：ori-pUB110＝来自pUB110的复制起点；neo＝来自pUB110的新霉素抗性基因；Plat＝来自地衣芽孢杆菌淀粉酶的转录启动子；PreLAT＝来自地衣芽孢杆菌淀粉酶的信号肽；SAMY425ss＝截短AmyS基因序列的编码区(由本研究中所表达的每种截短AmyS变体的编码区取代)。终止子＝来自地衣芽孢杆菌淀粉酶的转录终止子。
实施例14.酶变体的表达
本实施例描述了用来在2mL规模表达前述实施例的经转化枯草芽孢杆菌的多种重组酶的方法。
含有AmyS(或其变体)或S242Q(或其变体)表达载体的枯草芽孢杆菌克隆用钢制96孔复制器从甘油原种复制到含有150μlLB培养基+10μg/ml新霉素的96孔培养平板(BD，353075)中，于加湿箱中在37℃，220转/分钟培育过夜。来自过夜培养物的100μl等份样用来接种5mL塑料培养管中的2000μl确定成分培养基+10μg/ml新霉素。该培养基是基于MOPS缓冲液的半定义丰富培养基，以尿素作为主要氮源，葡萄糖作为主要碳源并且补充有1％大豆胨和5mM钙，用于强壮(robust)细胞生长。培养管在37℃以250转/分钟温育72小时。在这个温育后，培养发酵液以3000xg离心10分钟。将上清倾析至15ml聚丙烯锥形管并且每个样品80μL分配至96孔平板用于蛋白质定量。
实施例15.酶变体的产生
本实施例描述酶电荷阶梯和组合电荷文库的产生
酶电荷阶梯
涵盖目的物理特性范围的多种蛋白质变体选自现存文库或通过如本领域已知的定点诱变技术(见例如美国专利公开号2008-0293610)生成。随后在目的试验中测试这种定义的探针蛋白质集合。
示例性淀粉酶电荷阶梯变体在下表中显示并如本文中所述测试。在这些表格中，电荷改变是相对于亲本酶而言的。
将AmyS基因序列提供给GeneOracle(MountainView，CA)，用于表15-1和15-2中所示的28种电荷阶梯变体的合成。GeneOracle合成并克隆AmyS变体到载体pGov4并将它们转化为大肠杆菌。将分离自小量制备的DNA及琼脂穿刺(stab)提供给各变体。
将变体PCR扩增并克隆到pHPLT枯草芽孢杆菌表达载体。使用r如下引物从质粒pGov4将变体扩增为PstI-HindIII片段。
SatoriF5′-CTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTC-3′(SEQIDNO：24)；和
SatoriR5′-TTATCCTTTACCTTGTCTCCAAGC-3′(SEQIDNO：25)。
使用QiagenQiaquik柱纯化PCR产物并将该产物重悬于50μLmilliQ水中。用HindIII(Roche)和PstI(Roche)消化50μL纯化的DNA并将所得DNA重悬于30μL去离子水中。利用PstI和HpaI克隆位点，将10-20ng/μL所述DNA克隆到质粒pHPLT中。连接混合物直接转化至感受态枯草芽孢杆菌细胞(基因型：amyE：：xylRPxylAcomK-phleo)。这些枯草芽孢杆菌细胞具有置于木糖诱导型启动子下的感受态基因(comK)，从而使用木糖来诱导对DNA结合和摄取的感受态。
酶组合电荷文库(CCL)：嗜热脂肪土芽孢杆菌AmyS-S242QCCL的产生
AmyS-S242Q质粒DNA从转化的枯草芽孢杆菌菌株(基因型：ΔaprE，ΔnprE，amyE：：xylRPxylAcomK-phleo)分离并发送至DNA2.0Inc.作为模板用于CCL构建。要求DNA2.0Inc.(MountainView，CA)在表15-4中所示AmyS-S242Q(S242Q)淀粉酶中4个位点的每个位点处生成位点文库。变体作为96孔平板中的甘油贮藏物提供。
通过鉴定以下4个残基Gln-97、Gln319、Gln358和Gln443设计出AmySS242Q组合电荷文库。通过在每个位点处产生三种可能性：野生型、精氨酸或天冬氨酸的全部组合，产生4位点、81个成员的CCL。
实施例16-酶洗涤性能
本实施例描述在微量样品测定法中于可变离子强度下的AATCCHDL洗涤剂或5mMHEPES缓冲液中测试1.0μg/mlS242Q变体。使用在实施例12中提供的方法(见，例如“用于测试淀粉酶性能的稻淀粉微量样品测定法”)。
对于AATCCHDL洗涤剂中酶的清洁性能，存在最佳净电荷改变。测量性能为稻淀粉微量样品活性测定法中观察到的相对清洁性能。约1的值显示在本测定法中的顶级清洁性能。这是优化蛋白质物理属性(例如净电荷)以改善给定结果或益处(例如在液体衣物洗涤剂中的清洁性能)的实例。用这种有限的探针蛋白集合鉴定的最佳电荷与测量整个电荷组合文库时所观察到的最佳电荷相一致。因而探针蛋白质的使用预测整个文库的特性。
根据Debye-Hückel理论(Israelachivili，IntermolecularandSurfaceForces，第2版：WithApplicationstoColloidalandBiologicalSystems，AcademicPress第2版[1992])，静电相互作用主要由恒定电势或恒定电荷上的相互作用种类(酶、底、织物和洗涤剂)之间的双层力量强度、这些物质的尺寸和周围介质的介电常数决定。为了表征复杂介质如洗涤剂制剂中粒子的静电特性，这些粒子在拥有相同Debye筛选长度的还原性环境中的相互作用是充分的。这通过选择在洗涤条件下使pH和导电性与洗涤剂的pH和导电性匹配的缓冲液实现。对于这种测试适宜的缓冲液是具有可变量的不重要(indefferent)电解质如NaCl的pH8.0的5mMHEPES缓冲液。添加2.5mMNaCl至这种缓冲液匹配了典型北美洗涤条件的pH和导电性。添加100mM的NaCl代表日本和欧洲洗涤条件，所述的日本和欧洲洗涤条件在离子强度上一般因水硬度和洗涤剂浓度提高而更高。
图23显示正电荷S242Q变体对于北美洗衣条件下清洁稻淀粉微量样品是优异的。同样，另一α-淀粉酶(即TS23t)正电荷变体对于北美洗衣条件下清洁稻淀粉微量样品是优异的(图24)，说明电荷突变对不同α-淀粉酶由类似效果。正电荷S242Q变体还展示出颗粒谷物淀粉底物水解的更高比活(图25)。
谷物淀粉液后后通过监测最终粘度来确定通过AmyS电荷阶梯变体的淀粉液化。低粘度值表示淀粉多糖的分解。如图14所示，观察到用于液化的电荷最佳条件(例如-4到-2)。太负的(例如-12到-10)AmyS变体展示出非常高的最终粘度，且太正的变体(例如+6或更高)展示甚至更高的最终粘度(例如，由于扭矩超载超过实验仪表的范围)。
实施例17.热稳定性
本实施例描述了确定蛋白质电荷与热稳定性之间的关系。淀粉酶测定基于加热培养上清液之前和之后的BODIPY淀粉水解作用。使用如实施例12中所述的相同化学品和试剂溶液。
α-淀粉酶的热稳定性测定
滤过的培养上清液在具有002％Tween的50mM乙酸钠+2mMCaCl2pH5.8中连续稀释。测试10μl每种稀释的培养上清液以通过BODIPY淀粉测定法确定初始淀粉酶活性。50μl每种稀释的培养上清液置于VWR低特性的PCR96孔平板中。将30μL矿物油作为密封剂添加至各孔。平板在BioRadDNA引擎Peltier热循环仪器中在95℃根据亲本酶的稳定性温育30分钟或60分钟。温育后，将平板冷却至4℃持续5分钟并随后保持在室温。添加10μl每份样品至一块新平板并测试，以通过如实施例1中所述的BODIPY淀粉测定法确定最终淀粉酶活性。
热稳定性的计算
样品的残余活性表述为最终吸光度与初始吸光度之比，其中两种吸光度均用空白校正。更高的指数指示热稳定更大的变体。这是优化蛋白质物理属性(在这种情况下，净电荷)以改善液体衣物应用中酶热稳定性的实例。
如上所述评测变体的热稳定性。来自S242QCCL的热稳定性胜出者列于表17-1中。胜出者定义为具有大于1的突变体残余活性对亲本(即S242Q)残余活性比的那些变体。图30显示作为相对于野生型电荷变化的函数的第一AmyS电荷阶梯残余活性。在实施例12中描述了该测定法中使用的热稳定性。再一次如从图所证明的，相对于野生酶，极负电荷(-12)或正电荷(+4)的积累对热稳定是有害的。这是一个优化蛋白质物理性质的实施例，在此净电荷情况下，用于改良用于液体洗衣应用的酶的热稳定性。
表17-1：S242QCCL-热稳定性胜出者
实施例18.酶性能
本实施例说明酶性能可以受电荷影响。使用如上文实施例12中描述的热失活洗涤剂评估酶性能。胜出者定义为具有大于1的性能指数(PI)的那些变体。PI是突变体残余活性对亲本(即S242Q)残余活性的比率。结果在图18-1和18-2中显示。
表18-1：S242QCCL-CS-28稻淀粉微量样品胜出者，Tide2X(如实施例12中描述的北美条件)
表18-2：S242QCCL-CS-28稻淀粉微量样品胜出者，Persil(西欧条件)
也使用如本文中提供的BODIPY淀粉水解测定法测量了活性。结果在表18-3中显示。对这种淀粉底物(谷物淀粉)的大于1的相对比活表明该变体比S242Q亲本具有更高的比活。相对ppm是相对于亲本的变体的表现滴度(expressiontiter)，大于1表示比S242Q亲本更高的滴度(在振摇管中)。
表18-3：S242QCCL-滴度和/或BODIPY-淀粉胜出者
实施例19.平衡对淀粉酶活性和表达的突变影响
本实施例说明可以通过导入多个氨基酸替换同时优化两种冲突的酶特性。
如在本发明开发期间确定的，AmyS-242Q的中位数表达随增加的正电荷而减少。然而，特异性BODIPY淀粉水解作用随增加的正电荷而提高。增强的重组淀粉酶表达和淀粉水解作用在例如适用于燃料乙醇工业中淀粉液化或洗涤剂应用中清洁的AmyS-242Q的改造变体中是受欢迎的。然而，这些特性明显是冲突的特征。如在本发明开发期间确定的，使用本发明方法，有可能通过选择性组合单一突变来产生更高度表达的淀粉酶变体，同时并不严重损害淀粉水解作用。本文中所述的策略成功地用来产生和选择多重替换的AmyS-242Q变体，该AmyS-242Q变体具有第一特性(例如作为主要特性的表达)上的改良，同时改良了或并未牺牲第二特性(例如作为次要特性的淀粉水解作用)。
此外，与AmyS-242Q变体的中位值表达相反，谷物淀粉微量样品清洁作用随增加的正电荷而提高。增强的重组淀粉酶表达和清洁性能是在AmyS-242Q的改造变体中受欢迎的。然而，这些特性明显也是冲突的特性。如在本发明开发期间确定的，使用本发明方法，有可能通过选择性组合单一突变来产生更高度表达的淀粉酶变体，同时并不严重损害清洁性能。本文中所述的策略成功地用来产生和选择多重替换的AmyS-242Q变体，该AmyS-242Q变体具有第一特性(例如作为主要特性的表达)上的改良，同时改良了或并未牺牲第二特性(例如作为次要特性的稻淀粉微量样品清洁作用)。
特别地，测试了含80种成员的一个AmyS-S242Q电荷组合文库(CCL)的振摇管表达、BODIPY-淀粉水解作用和稻淀粉清洁活性，其中该AmyS-S242Q电荷组合文库包含具有1至4个带电荷残基替换组合的变体。在表19-1和19-2中显示AmyS-S242Q胜出者。重要地，与亲本酶相比，表19-1的多重替换变体具有等同或改善的表达，和等同或改良的BODIPY-淀粉水解作用。类似地，与亲本酶相比，表19-2的多重替换变体具有相等或改善的表达，和等同或改良的稻淀粉清洁活性。
总之，因为酶活性和酶产生具有不同的电荷依赖性(见图27A、27B、28A和28B)，故它们是负相关的(见图26A和26B)。然而，存在表达和活性方面均改良的众多变体，并且以这种方式对所述文库的分析允许鉴定到这些变体。
尽管以淀粉酶进行了说明，然而本方法可应用于其他酶类，如蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、转移酶和果胶酶。另外，可以同时分析两种或多种特性的任何组合，如表达、活性、结合作用、热稳定性、洗涤剂和螯合剂稳定性。
实施例20.微量样品清洁和淀粉水解
使用如上述的热灭活洗涤剂评估酶性能。按照上文实施例12中所述实施实验(见用于测试淀粉酶性能的稻淀粉微量样品测定法和用于确定淀粉酶活性的Bodipy-淀粉测定法)。胜出者定义为具有大于1的性能指数(PI)的那些变体。PI是突变体残余活性对WT残余活性的比率。表20-1显示对AmyS变体的计算，该变体与电荷变化得分(ΔCHRG)相比优于野生型(ΔΔG＜0)。电荷变化、Kyte-Doolittle、Eisenberg和氢结合在2008年6月6日提交的WO2008/153925中定义。此外，表20-1显示了Kyte-Doolittle亲水性(ΔK-D)和Eisenberg疏水性标度(ΔE)的结果。表20-1还显示了对氢结合(ΔHB)的值，具有-2的得分意味者氢结合活性的丧失。表20-1显示了对AmyS变体的计算，该变体用于在5、10和60分钟(CF5、CF10、CF60)的谷物粉水解、对在pH4.0和5.8(pH4、pH5.8)下的DP7底物的活性、在pH8.6和10(清洁8和清洁10)下的稻淀粉清洁作用和枯草芽孢杆菌中的蛋白质表达时优于野生型。电荷对活性的作用与电荷对表达的作用相反。也证明氢结合和疏水性对这些性质有统计学相关的作用。清楚地，氨基酸取代的性质如电荷和疏水性可以影响在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中的表达水平、以及蛋白质的基本活性和稳定性。
实施例21.酶pH活性特征的调节
本实施例描述表面电荷突变来优化用于给定反应的酶pH活性特征的用途。图31A显示作为pH之函数的用于实施例15的第一AmyS电荷阶梯的稻淀粉微量样品清洁活性。pH范围在200mM含有0.01％Tween-80的甲酸钠中是3.0-4.25，而pH范围在200mM含有0.01％Tween-80的乙酸钠中是4.25-5.5。数据符合滴定曲线，每条曲线都有单一pKa值。图31B显示用于AmyS催化的直观pKa，其是用于实施例15的第一电荷阶梯的电荷变化之函数。这些数据说明用于α-淀粉酶的Ph-活性特征可以通过表面电荷突变显著变化，甚至在200mM缓冲液中。尽管有报道这已经以非常低的离子强度应用于枯草杆菌蛋白酶(Russell等人.(1987)JMolBiol.193：803-13)并用于D-木糖异构酶(Cha等人.(1998)MolCell.8：374-82)，应认为这是第一次用α-淀粉酶实现的，并惊人地，甚至以高离子强度。
实施例22.AmyS超级筛选(Superscreen)
以下测定用于下文描述的实施例中。任何来自以下提供的方案的衍生物在实施例中指出。在这些实验中，使用96孔分光光度计来测定反应完成后形成的产物的吸光度。
针对比活确定和热稳定性的淀粉水解测定法
进行谷物粉的α-淀粉酶活性测定法来测定枯草芽孢杆菌AmyS和AmyS变体的比活和稳定性。条件是使用接近模拟真实的清洁和谷物加工应用。活性定义为由于酶降解谷物粉产生的还原端，通过PAHBAH(对羟基苯甲酸酰肼)法测定。稳定性定义为在85℃保持的活性。
硬件：具有PCR平板适配器(adapter)的InhecoVariomagTeleshake95，ThermoElectronMultidrop，AxygenPCR-96-FS-C全裙边PCR平板，具有最小4块96孔板的热循环仪(MJResearchTetrad)，BiomekFX液体处理器。
淀粉水解：Azure农场有机谷物粉，采用用于液体处理目的的筛分来获得＜600微米的级分，80℃下烘焙4小时，然后在室温下平衡过夜。在500-g和1000-g批次中制备2％w/w的悬液。在pH调节过程中剧烈持续的搅拌该悬液、pH平衡，并从烘焙器转移到PCR平板。对于1,000g，搅拌23g预烘焙的谷物粉和977g室内(house)去离子水15分钟，用H2SO4调节至pH5.8，且平衡30分钟，此时如果需要进行最终pH调节。调整为打开尺寸大约为1.5mm的带有吸头的8-道tipet用于将悬液递送到AxygenPCR平板的孔中。
AmyS和AmyS变体的培养上清在稀释缓冲液(水+0.005％Tween-80)中稀释为大约1μg/mL，10μL各稀释的上清转移至5-分钟、10-分钟和60-分钟反应平板，并通过抽吸样品混合。50μL轻矿物油等分式样转移到各孔。平板转移到Inheco单位预热到85℃。温育后的预定时间点(5、10和60分钟)，通过向各孔加入10μL的4NNaOH停止淀粉水解反应。通过PAHBAH测定法分析淀粉水解反应产物。
PAHBAH测定法：80μL0.5N的NaOH的等分式样加入到空PCR平板的各孔，然后加入20μL的PAHBAH反应物(5％w/v对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH，Sigma#H9882，溶解于0.5NHCl)，并抽吸混合(PAHBAH反应平板)。10μL淀粉水解反应上清加入到PAHBAH反应平板中。密封所有的平板并置于热循环仪中，程序为95℃2分钟，然后冷却至20℃。80μL显色的PAHBAH反应混合物样品转移到新的(读数)平板中，以分光光度计在405nm处测定吸光度。
污渍除去性能的清洁样品测定
在该测定中，枯草芽孢杆菌AmyS和AmyS变体的污渍除去性能使用CS-28稻淀粉污渍微量样品，在微量滴定板规模上测定。从CFTVlaardingen(荷兰)获得1/4”圆周直径的微量样品。两个微量样品置于96孔微量滴定板的各孔中。
滤过的培养液样品在适当的浓度测试，该适当的浓度用10mMNaCl、0.1mMCaCl2、0.005％Tween-80的混合物稀释到20×性能测试中的希望终浓度(测试中的终浓度为0.025-0.10ppm)得到。
在pH8和pH10均测定淀粉酶性能。
含有25mMHEPES(Sigma，H7523)、2mMCaCl2、0.005％Tween-80、pH8.0的190μl缓冲液，或含有25mMCAPS(Sigma，C2632)、2mMCaCl2、0.005％Tween-80，pH10.0的190μl缓冲液加入到含有微量样品的平板的各个孔中。10μL稀释的淀粉酶样品加入到含有各微量样品的孔中(以提供200μL/孔的总体积)。平板盖上平板盖，置于40℃的温箱(iEMS温箱)中以1150转/分钟振摇60分钟。在合适的条件下温育后，从各孔取出100μL的溶液，置于新的微量滴定板中，以分光光度计在488nm处测定吸光度。每孔含有2个微量样品和清洁剂，但没有淀粉酶样品的“空白对照”也包括在该测试中。
CS-28稻淀粉水解性能的计算：获得的吸光度值对空白值(在缺乏酶时温育的微量样品)校正。得到的吸光度-ΔOD488-是淀粉水解活性的度量。对于每个样品(AmyS或AmyS变体)的性能指数通过变体的活性除以野生型酶的活性计算。性能指数比较在相同的蛋白质浓度下，变体(实际值)和标准AmyS参考酶(理论值)的性能。
性能指数(PI)大于1(PI＞1)指示更好的变体(与标准相比，例如野生型)，而PI为1(PI＝1)指示变体的性能与标准一样，而PI小于1(PI＜1)指示变体的性能比标准差。因此，PI指示相比于野生型酶，变体性能的差异。
下列位点的变体使用本实施例中描述的测定评测：
P17A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
D19A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
T21A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
N28A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
S51A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
G72A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
V74A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y
A82A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
Q86A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
Q89A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y
A93A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
W115D，E，F，G，K，L，N，P，Q，R，S，V，Y
D117A，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W
P123A，D，E，G，K，L，M，P，Q，R，S，T，V
S124A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，N，P，Q，R，S，T，V，Y
D125A，D，E，G，K，M，Q，R，S，T，V
N127A，C，D，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
I130A，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W
G132A，C，D，E，F，G，H，L，M，N，P，R，S，T，V，W，Y
Q135A，F，G，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，Y
P145A，D，E，F，H，I，K，L，N，P，R，S，T，V，Y
G146A，C，D，E，G，H，K，L，P，R，S，T，V，W
G148A，C，D，E，F，G，H，L，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
S153A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
Y159A，C，D，E，F，G，H，K，L，N，R，S，T，V，W
W166C，E，F，G，H，I，K，L，M，P，R，S，T，V，Y
S169A，C，D，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，Y
K171C，D，E，G，H，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y
R179A，G，H，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y
G180A，C，D，F，G，H，I，K，L，N，P，R，S，T，V，Y
I181A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，P，R，S，T，V，Y
G182A，C，D，E，F，G，H，K，L，P，R，S，T，V，Y
K183A，C，E，F，G，H，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y
W187A，C，E，G，I，K，L，N，P，Q，R，S，V，W
G194A，E，G，H，K，L，M，P，R，S，T，V，W
P209A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
N224A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
S242A，C，D，G，I，K，L，M，Q，R，S，T，V
P245A，C，D，E，F，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，Y
G256A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W
D269A，C，D，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，Y
N271A，D，F，H，I，K，L，M，N，P，S，T，V，W，Y
T278A，E，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，W，Y
N281A，D，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，Y
G302C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，R，S，T，V，W，Y
A304A，D，E，F，H，L，M，N，P，R，S，T，V，W，Y
R308A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W，Y
T321A，C，F，H，I，L，P，Q，R，S，T，V，Y
Q358A，C，D，E，F，G，H，L，M，N，P，Q，R，S，T，V
P378C，D，F，G，H，I，L，N，P，R，S，T，V，Y
S382A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W
K383A，C，D，E，F，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y
T398A，C，D，E，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V
H405A，C，D，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y
T417A，D，E，H，I，L，M，P，Q，R，S，T，V，W
E418A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，Y
P420A，C，D，E，H，I，L，M，N，P，R，S，T，V，W，Y
G421A，D，E，F，G，H，I，L，N，P，Q，R，S，T，W，Y
P432A，D，E，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，Y
W437C，D，E，F，G，H，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y
Q443A，C，F，G，K，L，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
G446A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
G454A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V
S457A，C，D，E，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
T459A，D，G，I，K，L，Q，R，S，T，V，Y
T461A，D，E，F，G，I，K，L，N，P，R，S，T，V，W，Y
S464D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，V，W，Y
G474A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V
R483A，C，F，G，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，Y
实施例23.AmyS变体的性能
对于蛋白质的表达(表达)、水解谷物粉10分钟(谷物粉10)或水解谷物粉60分钟(谷物粉60)、pH4下对于DP7底物的活性(DP7pH4)或H4下对于DP7底物的活性(DP7pH5.8)，以及pH8下对于CS28稻淀粉污渍的微量样品清洁(清洁pH8)或pH10下对于CS28稻淀粉污渍的微量样品清洁(清洁pH10)，测试AmyS变体(如实施例22中所述)的性能。结果示于表23-1。通过实施例12描述的Bradford测定测定蛋白质表达。谷物粉水解和清洁微量样品测定按实施例12所述进行。AmyS变体的功能性定量为性能指数(Pi)(即，变体酶于野生型AmyS之间的性能比)。任何特性PI＞1指示变体的该特性改良(相对于对照)。ND指示获得的值在测定的范围之外。
显而易见的是大量的取代产生与野生型α-淀粉酶相比，具有一种或多种改良的性质的变体α-淀粉酶。这些取代包括在本发明的组合物和方法中。
实施例24.AmyS变体的改变的性质
本实施例显示一些嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS)变体(实施例22中所述)相对于亲本α-淀粉酶具有改变的特性。按实施例3所述实施AmyS变体的高通量热稳定性筛选。表24-1、24-2、24-3中显示了活性(按BODIPY测定法测定)和残余活性(在热应激后)的性能指数。
表24-1：AmyS蛋白质中具有突变的位点(显示在标注为变体的列中)在热应激后具有比野生型AmyS更好的活性和残余活性性能指数。
表24-2：AmyS蛋白质中具有突变的位点(显示在标注为变体的列中)在热应激后具有比野生型AmyS好至少20％的残余活性性能指数，和野生型AmyS至少一半的起始活性或表达的性能指数。
表24-3：AmyS蛋白质中具有突变的位点(显示在标注为变体的列中)具有比野生型AmyS高至少20％的活性或表达。
基于表23-1、24-1、24-2和表24-3中描述的AmyS位点的相对性能数据和稳定性数据，AmyS位点分类为如下所示的限制性的和非限制性的：对于至少一种性质具有≥20％中性突变的非限制性位点。这些位点当制备改造的α-淀粉酶时是优异的候选者，因为在这些位点的突变具有改良性能的高可能性。对于活性和稳定性，限制性位点具有＜20％中性突变。当改造α-淀粉酶时，这些位点一般保留(即，不突变)，因为在这些位点的突变倾向于降低，而不是提高性能。表23-1中的所有位点/位置均是非限制性的。
实施例25.AmyS蛋白质中的其他位点文库
除了实施例22中描述的AmyS变体之外，在具有截短的嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQIDNO：2)中产生其他位置的位点文库。该文库通过Geneart(GeneartGmbH，Josef-Engert-strasse11，D-93053Regensburg，DE)产生。表25-1显示产生的位置变体：
实施例26.实施例25中所述的变体的改变的性质。
本实施例显示嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS)变体(实施例25中所述)相对于亲本α-淀粉酶具有改变的特性。按实施例3所述实施AmyS变体的高通量热稳定性筛选。表26-1、26-2、26-3中显示了活性(按BODIPY测定法测定)和残余活性(在热应激后)的性能指数。
表26-1：AmyS蛋白质中具有突变的位点(显示在标注为变体的列中)在热应激后具有比野生型AmyS更好的活性和残余活性性能指数。
表26-2：AmyS蛋白质中具有突变的位点(显示在标注为变体的列中)在热应激后具有比野生型AmyS好至少20％的残余活性性能指数，和野生型AmyS至少一半的起始活性或表达的性能指数。
(variant：变体；activity：活性；residualactivity：残余活性)
表26-3：AmyS蛋白质中具有突变的位点(显示在标注为变体的列中)具有比野生型AmyS高至少20％的活性或表达。
表26-4显示AmyS在152个位点的2,666个变体的性能指数值(Pi)。在活性测定中小于或等于0.05的性能指数拟合为0.05，且在表26-4中显示为粗斜体。同时，对于稳定性测定，如果稳定性测定中活性的性能指数小于或等于0.05，相关的稳定性性能指数拟合为0.05。
表26-5列出152个位点的组合突变(2,250)的AmyS变体。这些变体对于至少一种性质(活性或稳定性)具有≥0.5的性能指数，和对于两种性质的＞0.05性能指数。
实施例27.限制性和非-限制性位点
基于实施例26中描述的AmyS位点的相对性能数据和稳定性数据，AmyS位点分类为如下所示的“限制性的”和“非限制性的”：对于至少一种性质具有≥20％中性突变的非限制性位点，和对于活性和稳定性具有＜20％中性突变的限制性位点。非限制性位点是设计具有改良的功能的优异的突变候选者，因为大量的突变是耐受的(以维持接近野生型性能)或具有改良的性能。限制性位点是突变的非优异候选者，因为突变一般是非耐受的。任何淀粉酶的性质可通过组合非限制性位点改良。表27-1显示AmyS中鉴定的两个限制性位点(％＝评测为符合中性突变定义的变体的百分比)。表27-2显示AmyS中鉴定的150非限制性位点(％＝评测为符合中性突变定义的变体的百分比，至少一种性质≥20％中性突变)。期望限制性和非-限制性位点在不同α-淀粉酶中是保守的。
实施例28.AmyS变体产生的粘度降低
AmyS变体产生的不同批次谷物粉(袋A、C、E、G)的粘度降低按实施例6所述监测，并与Xtra(Genencor)产生的粘度降低比较。结果显示与图32A和表28-1。在粘度计测定中改良的AmyS变体可通过以下标准鉴定：降低的最大粘度、降低的最终粘度；或相对于野生型酶产生最大或最终粘度所需的酶剂量，产生类似的最大或最终粘度所需的降低酶剂量。在表28-1中，AmyS变体改良的性质显示为粗体。
实施例29.植酸酶存在下，AmyS变体产生的粘度降低
有或无植酸酶BP111添加的AmySN193Y产生的谷物粉粘度降低按实施例6所述监测，但具有下列改变。粘度降低的效果在pH5.2、pH5.5和5.8测定。结果示于图32B和C。植酸酶(BP111)向AmySN193Y的添加造成粘度计中变体降低粘度性能的显著改良。
上文中提及的所有公开和专利均在此引入作为参考。所述本发明方法和系统的多种不背离本发明的精神和范围的修改和改变对本领域技术人员来说是显而易见的。虽然已经联系具体优选实施方式说明了本发明，应理解所要求保护的发明不应当不适当地限于这些具体实施例。实际上，那些对于本领域技术人员来说显而易见的实施本发明的上述方式的多种修改，都应落入所附权利要求书的范围内。

Claims (5)

1.具有α-淀粉酶活性和至少一种改变的特征的变体多肽，所述改变的特征改良酶的性能，所述变体多肽：
a)其氨基酸序列与选自AmyS(SEQIDNO：1)或AmyS的截短变体(SEQIDNO：2)的亲本α-淀粉酶多肽相比仅具有一种以下突变，其中所述突变改变来自亲本多肽的氨基酸残基，所述氨基酸残基选自I181A、I181P、I181C、I181E、I181Y、S242A、S242E、S242Q、G132A、N193Y和E188P，并且所述变体与亲本多肽相比在淀粉液化试验中显示提高的粘性降低；
b)获自与a)中的氨基酸序列具有至少97％序列同一性的多肽。
2.清洁组合物，其包含权利要求1的多肽。
3.淀粉液化组合物，其包含权利要求1的多肽。
4.使用α-淀粉酶变体水解可溶淀粉底物的方法，其包括使所述淀粉底物与权利要求1的变体α-淀粉酶接触。
5.权利要求4的方法，其还包括在与变体α-淀粉酶接触之前或同时，所述淀粉底物与植酸酶接触。
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