CN1348000A - 高生产能力的α－淀粉酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供高生产能力的突变α－淀粉酶,其来自具有SEQ ID No.1或2代表的氨基酸序列或显示与该序列有60%同源性的α－淀粉酶,并被构建成用另外的氨基酸残基替代或缺失了参与生产能力的特定氨基酸残基。本发明还提供编码此突变α－淀粉酶的基因、载体、转化细胞和生产突变α－淀粉酶的方法,该方法包括培养该转化细胞。本发明还提供含有突变α－淀粉酶的洗涤剂组合物。根据本发明,能够从重组微生物中生产高产量的α－淀粉酶,使得它们的工业生产成本能够大大降低。这导致了具有耐热性、螯合剂抗性和氧化剂抗性并可作为洗涤剂用酶使用的液化碱性α－淀粉酶的产量增加。

Description

高生产能力的α-淀粉酶
技术领域
本发明涉及生产能力提高了的突变α-淀粉酶。
背景技术
α-淀粉酶[EC.3.2.1.1.]已被广泛应用于工业领域，例如，淀粉工业、酿造工业、纤维工业、制药工业和食品工业。其中那些能高度随机降解淀粉的酶适合用于洗涤剂。常规已知的如：来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的α-淀粉酶，来自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)嗜碱性菌株KSM-AP1378(FERM BP-3048)(WO94/26881)的液化碱性α-淀粉酶和具有改良的耐热性和氧化剂抗性的改良酶(WO98/44126)。
本发明人近来发现了来自芽孢杆菌属嗜碱性菌株KSM-K38(FERMBP-6946)的具有螯合剂和氧化作用抗性的液化碱性α-淀粉酶(日本专利申请平10-362487，日本专利申请平10-362488)；和耐热性提高了的改良酶(日本专利申请平11-163569)。
除这些特性外，考虑到这些酶的工业生产，用于洗涤剂的酶还要具有高生产能力。尽管应用蛋白质工程技术做了各种试验以提高用于洗涤剂的α-淀粉酶的耐热性和氧化剂抗性，但对生产能力的改进还没有被认为是足够的，也没有试图通过突变结构基因增加产量的报道。
本发明的目的是提供具有优秀生产能力的突变α-淀粉酶。
发明公开
本发明人在微生物中导入用定点诱变构建的突变α-淀粉酶结构基因并评价α-淀粉酶的生产能力。结果发现，由于α-淀粉酶基因上有一个位点参与生产能力的提高，所以将该位点突变了的重组基因导入微生物可能会产生生产能力大大提高的α-淀粉酶。
因此，本发明一方面提供了一种突变的α-淀粉酶，该酶从具有SEQ ID No.1所代表的氨基酸序列或显示与该序列有至少60％同源性的α-淀粉酶衍生而来，衍生方式是替代或缺失相应于该氨基酸序列的Pro18、Gln86、Glu130、Asn154、Arg171、Ala186、Glu212、Val222、Tyr243、Pro260、Lys269、Glu276、Asn277、Arg310、Glu360、Gln391、Trp439、Lys444、Asn471和Gly476中任何一个的至少一个氨基酸残基。
本发明另一方面提供了一种突变α-淀粉酶，该酶从具有SEQ IDNo.2所代表的氨基酸序列或显示与该序列有至少60％同源性的α-淀粉酶衍生而来，衍生方式是替代或缺失相应于该氨基酸序列的Asp128、Gly140、Ser144、Arg168、Asn181、Glu207、Phe272、Ser375、Trp434和Glu466中任何一个的至少一个氨基酸残基。
本发明再一方面，还提供了编码这种突变α-淀粉酶的基因、包含该基因的载体、用该载体转化的细胞和突变α-淀粉酶的生产方法，该方法包括培养该转化细胞。
本发明再一方面还提供了包含该突变α-淀粉酶的洗涤剂组合物。
附图简述
图1说明了一种构建用于生产来自菌株KSM-1378或KSM-K38的α-淀粉酶的重组质粒的方法。
图2是图解说明向来自菌株KSM-1378或KSM-K38的α-淀粉酶基因导入突变的方法。
实施本发明的最佳方式
术语“高生产能力的突变α-淀粉酶”在此是指通过培养重组微生物其生产产量与突变前相比增加至少5％、优选至少10％、更优选至少20％的α-淀粉酶。
本发明构建了突变α-淀粉酶，使得在构成α-淀粉酶的氨基酸中，参与生产能力的氨基酸残基被另外的氨基酸残基替代或被缺失。这里可用的α-淀粉酶的实例包括来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)或地衣芽孢杆菌的液化α-淀粉酶，以及来自芽孢杆菌属嗜碱性微生物的液化碱性α-淀粉酶，其中优选具有SEQ IDNo.1或SEQ ID No.2所代表的氨基酸序列的α-淀粉酶和与上述氨基酸序列有至少60％同源性的α-淀粉酶。
具有SEQ ID No.1所代表的氨基酸序列的α-淀粉酶或与其有至少60％同源性的α-淀粉酶的实例，包括来自芽孢杆菌属菌株KSM-AP1378(FERM BP-3048)的液化碱性α-淀粉酶(日本专利申请公开文本平8-336392)和通过蛋白质工程技术构建的上述酶在耐热性和氧化剂抗性上的改良酶(WO98/44126)。
具有SEQ ID No.2所代表的氨基酸序列的α-淀粉酶或与其有至少60％同源性的α-淀粉酶的实例，包括来自芽孢杆菌属菌株KSM-K38(FERM BP-6946)的液化碱性α-淀粉酶和通过蛋白质工程技术构建的上述酶在耐热性上的改良酶(日本专利申请平11-163569)。
氨基酸序列的同源性用Lipman-Pearson方法计算(科学(Science)227，1435(1985))。
本发明的突变α-淀粉酶可通过首先从产生α-淀粉酶的微生物中克隆编码α-淀粉酶的基因获得。为此目的，通常利用基因重组技术，例如可使用日本专利申请公开文本平8-336392中描述的方法。这里可使用的基因实例包括编码SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所代表氨基酸序列的SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所代表的基因。也可使用来自上述基因而且耐热性和氧化剂抗性提高了的突变基因。
为了对这样通过克隆获得的基因进行突变，可采用通常使用的任何定点诱变方法。例如，可使用“定点诱变系统Mutan-SuperExpress Km”试剂盒(Takara Shuzo有限公司产品)进行突变。
用于获得本发明的高生产能力α-淀粉酶的突变可通过例如以下方式实现：在具有SEQ ID No.1所代表的氨基酸序列或与该序列有至少60％同源性的α-淀粉酶中替代或缺失相应于该氨基酸序列中Pro18、Gln86、Glu130、Asn154、Arg171、Ala186、Glu212、Val222、Tyr243、Pro260、Lys269、Glu276、Asn277、Arg310、Glu360、Gln391、Trp439、Lys444、Asn471和Gly476之任一个的至少一个氨基酸残基；或在具有SEQ ID No.2所代表的氨基酸序列或与该序列有至少60％同源性的另一种α-淀粉酶中替代或缺失相应于该氨基酸序列中Asp128、Gly140、Ser144、Arg168、Asn181、Glu207、Phe272、Ser375、Trp434和Glu466之任一个的至少一个氨基酸残基。优选的突变包括，在SEQ ID No.1的氨基酸序列中用Ser或Thr替代相应于Pro18的氨基酸残基，用Glu替代相应于Gln86的氨基酸残基，用Val或Gln替代相应于Glu130的氨基酸残基，用Asp替代相应于Asn154的氨基酸残基，用Cys或Gln替代相应于Arg171的氨基酸残基，用Val或Asn替代相应于Ala186的氨基酸残基，用Asp替代相应于Glu212的氨基酸残基，用Glu替代相应于Val222的氨基酸残基，用Cys或Ser替代相应于Tyr243的氨基酸残基，用Glu替代相应于Pro260的氨基酸残基，用Gln替代相应于Lys269的氨基酸残基，用His替代相应于Glu276的氨基酸残基，用Ser或Phe替代相应于Asn277的氨基酸残基，用Ala替代相应于Arg310的氨基酸残基，用Gln替代相应于Glu360的氨基酸残基，用Glu替代相应于Gln391的氨基酸残基，用Arg替代相应于Trp439的氨基酸残基，用Arg替代相应于Lys444的氨基酸残基，用Asp或Glu替代相应于Asn471的氨基酸残基，或用Asp替代相应于Gly476的氨基酸残基；或在SEQ ID No.2的氨基酸序列中，用Val或Gln替代相应于Asp128的氨基酸残基，用Ser替代相应于Gly140的氨基酸残基，用Pro替代相应于Ser144的氨基酸残基，用Gln替代相应于Arg168的氨基酸残基，用Val替代相应于Gln181的氨基酸残基，用Asp替代相应于Glu270的氨基酸残基，用Ser替代相应于Phe272的氨基酸残基，用Pro替代相应于Ser375的氨基酸残基，用Arg替代相应于Trp434的氨基酸残基，或用Asp替代相应于Glu466的氨基酸残基。
在SEQ ID No.1的氨基酸序列的突变中，那些通过用Glu替代相应于Gln86的氨基酸残基，用Val或Gln替代相应于Glu130的氨基酸残基，用Asn替代相应于Ala186的氨基酸残基，用Ser替代相应于Tyr243的氨基酸残基，用Glu替代相应于Pro260的氨基酸残基，用Gln替代相应于Lys269的氨基酸残基，用Phe替代相应于Asn277的氨基酸残基，以及用Asp或Glu替代相应于Asn471的氨基酸残基产生的突变，能够使α-淀粉酶在培养基或其脱盐并浓缩的溶液中的溶解性提高。更具体地说，上述突变可以将在脱盐并浓缩的溶液中4℃贮存一周后α-淀粉酶的残余活性与突变前的活性相比提高至少5％，特别地提高10％。因此，对于通过这种氨基酸突变获得的本发明突变α-淀粉酶，可以以高产率得到高浓度的发酵浓缩液，并且在发酵生产之后可有效地进行酶的配制处理如超滤。
两个或多个各种氨基酸残基的替代或缺失的组合对这种氨基酸突变也是有效的。也可将上面举例说明的突变与改善酶特性的突变结合起来，例如，在具有SEQ ID No.1所代表的氨基酸序列或与该序列有至少60％同源性的α-淀粉酶中，通过缺失相应于Arg181或Gly182的氨基酸残基以提高耐热性的突变，通过用Thr替代相应于Met222的氨基酸残基以提高氧化剂抗性的突变，或通过用Gln替代的相应于Lys484的氨基酸残基以提高溶解性的突变；或在具有SEQ ID No.2所代表的氨基酸序列或与该序列有至少60％同源性的α-淀粉酶中，通过用Leu替代相应于Met107的氨基酸残基以进一步加强氧化剂抗性的突变，或通过用Ile替代相应于Glu188的氨基酸残基以提高洗衣用洗涤剂的去污力的突变。
通过以下方式可得到高产率的突变α-淀粉酶：将突变α-淀粉酶结构基因与控制基因和合适的载体适当地结合在一起，由此构建用于生产α-淀粉酶的质粒，将产生的质粒导入微生物如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或大肠杆菌(Escherichia coli)，优选枯草芽孢杆菌，并培养产生的重组微生物。
如后面实施例所示，这样获得的突变α-淀粉酶的生产能力提高大约10-500％，同时保持了作为酶的生化特性，因此具有优秀的特性。通过对具有耐热性、螯合剂抗性、氧化剂抗性和高溶解性的液化碱性α-淀粉酶的氨基酸残基进行上述突变，可产生在重组微生物中生产能力大大提高但并不丧失上述原有特性的有用的酶。
除了本发明的α-淀粉酶外，本发明的洗涤剂组合物还可以包含选自如下酶的一种或一种以上酶：脱支酶(例如支链淀粉酶、异淀粉酶、新支链淀粉酶(neopullulanase))、α-葡糖苷酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、果胶酶、原果胶酶、果胶酸裂合酶、过氧化物酶、漆酶和过氧化氢酶。
另外，洗涤剂组合物还可包含常规加至洗涤剂中的成分，例如，表面活性剂(如阴离子表面活性剂、两性表面活性剂、非离子表面活性剂和阳离子表面活性剂)、螯合剂、碱性剂(alkali agents)、无机盐、抗再沉积剂、氯清除剂、还原剂、漂白剂、荧光染料促溶剂、香料、防结块剂、酶活化剂、抗氧化剂、杀菌剂、上蓝剂(blueing agents)、漂白活化剂、酶稳定剂和调节剂。
本发明的洗涤剂组合物可以用本领域已知的方式从可通过上述方法获得的高生产能力的α-淀粉酶和上述已知的洗涤剂成分相结合生产。可根据使用目的选择洗涤剂的形式，实例包括液态、粉末或颗粒。本发明的洗涤剂组合物适合用作洗衣洗涤剂、漂白洗涤剂、自动洗碟机使用的洗涤剂、管道清洁剂和假牙清洁剂，其中尤其适合用作洗衣洗涤剂、漂白洗涤剂和自动洗碟机使用的洗涤剂。
本发明高生产能力的α-淀粉酶也可用作淀粉液化糖化组合物。而且，这些突变α-淀粉酶在加入选自葡糖淀粉酶、麦芽糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶和新支链淀粉酶的一种或一种以上酶之后，可被允许作用于淀粉。
并且，本发明的突变α-淀粉酶可用作纤维的退浆组合物，而且象支链淀粉酶、异淀粉酶或新支链淀粉酶之类的酶也可加到该组合物中。实施例淀粉酶活性和蛋白含量的测定
根据下述方法检测从重组枯草芽孢杆菌产生的每一种酶的淀粉酶活性和蛋白含量。
淀粉酶活性用3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)测定。在含有可溶性淀粉的40mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH10)的反应混合物中50℃反应15分钟后，用DNS法定量分析形成的还原糖。作为酶的滴度，在一分钟内形成相当于1μmol葡萄糖的还原糖的酶量定义为一个单位。
蛋白含量用“蛋白检测试剂盒”(Protein Assay Kit)(Bio-RadLaboratories产品)测定，以牛血清蛋白为标准品。参考实施例1：液化碱性淀粉酶的筛选
将大约0.5克泥土悬浮于灭菌水中，产生的悬浮液在80℃加热处理15分钟。热处理混合物的上清用足量的灭菌水稀释，然后涂在一种分离用的琼脂培养基(培养基A)上。然后该培养基在30℃培养2天以生长菌落。选择并分离由于淀粉分解而在其周围形成透明区的菌落作为产淀粉酶菌株。产生的分离菌株接种于培养基B，然后在30℃通气振荡培养2天。培养后测定离心获得的上清的螯合剂(EDTA)抗性，另外，测定最适工作pH。由此获得了菌株芽孢杆菌属KSM-K38(FERM BP-6946)。
培养基A：胰蛋白胨                  1.5％
         豆胨                      0.5％
         氯化钠                    0.5％
         有色淀粉(colored starch)  0.5％
         琼脂                      1.5％
         碳酸钠                    0.5％
               (pH10)培养基B：胰蛋白胨                1.5％
     豆胨                    0.5％
     氯化钠                  0.5％
     可溶性淀粉              1.0％
     碳酸钠                  0.5％
           (pH10)菌株KSM-K38的真菌学特性见表1。
表1
                  菌株KSM-K38
(a)显微镜观察 细胞为杆状，菌株K36大小为1.0-1.2μm×2.4-5.4μm，菌株K38大小为1.0-1.2μm×1.8-3.8μm。在它们的近末端或中心形成椭圆形内生孢子(1.0-1.2μm×1.2-1.4μm)。它们有鞭毛，能运动。革兰氏染色为阳性。抗酸性：阴性。
(b)在各种培养基中生长。该菌株是嗜碱性的，因此在以后叙述的试验的培养基中加入0.5％碳酸钠。·营养琼脂平板培养·营养琼脂斜面培养·营养肉汤·在营养肉汤明胶中穿刺培养·石蕊牛奶培养基 细胞生长良好。菌落为圆形，表面光滑并且外周缘光滑。菌落颜色为浅黄褐色。细胞能生长。细胞能生长。细胞生长良好。看不到明胶液化。生长无变化。
(c)生理特性·硝酸盐还原和反硝化作用·MR-试验·V-P试验·吲哚产生·硫化氢产生·淀粉水解·柠檬酸利用·无机氮源利用·着色剂产生·脲酶·氧化酶·过氧化氢酶·生长范围·对氧的行为·O-F试验·糖利用在含盐培养基中生长 硝酸盐还原：阳性  反硝化作用：阴性不可测定，因为培养基是碱性培养基。阴性阴性阴性阳性在Christensen’s培养基中为阳性，但在Koser’s培养基和Simmon’s培养基中为阴性。利用硝酸盐，但不利用铵盐。阴性阴性阴性阳性生长的温度范围：15-40℃，最适生长温度：30℃，生长的pH范围：pH9.0-11.0，最适生长pH范围：相同需氧细胞不生长利用L-半乳糖、D-木糖、阿拉伯糖、乳糖、甘油、蜜二糖、核糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、D-甘露醇、淀粉、蜜三糖和D-果糖。当盐浓度为12％时细胞能够生长，但当盐浓度为15％时不能生长。
参考实施例2：菌株KSM-K38的培养
在参考实施例1的液体培养基B中接种菌株KSM-K38，然后在30℃通气振荡培养2天。检测离心分离的每一份上清中的淀粉酶活性。结果1L培养基中的活性为1179U。参考实施例3：液化碱性淀粉酶的纯化
向参考实施例2中获得的菌株KSM-K38的培养基上清中加入硫酸胺到80％的饱和度，然后搅拌。收集由此生成的沉淀并溶于含有2mMCaCl2的10mM Tris-HCl缓冲液中(pH7.5)，产生的溶液对该缓冲液透析过夜。透析物上样到用相同缓冲液平衡的DEAE-Toyopearl650M柱上，用在相同缓冲液中的0-1M NaCl线性梯度洗脱蛋白。对相同缓冲液透析后经凝胶过滤柱层析获得的活性组分对该缓冲液透析，由此获得了在聚丙烯酰胺凝胶电泳(凝胶浓度：10％)和十二烷基磺酸钠(SDS)电泳中显示一条带的纯化酶。参考实施例4：酶学特性
纯化酶的特性如下：
(1)作用对象
它作用于淀粉、直链淀粉、支链淀粉和其部分降解产物α-1，4-葡糖苷键，降解它们并从直链淀粉生产葡萄糖(G1)、麦芽糖(G2)、麦芽三糖(G3)、麦芽四糖(G4)、麦芽五糖(G5)、麦芽六糖(G6)和麦芽七糖(G7)。但它不作用于普鲁兰(pullulan)。
(2)pH稳定性(Britton-Robinson缓冲液)
在pH6.5-11.0范围内、在处理条件下40℃处理30分钟，显示残余活性为70％或更高。
(3)工作温度范围和最适工作温度
它在20-80℃的很宽温度范围内起作用，最适工作温度为50-60℃。
(4)温度稳定性
通过在50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH10)中改变温度，然后在每一温度处理30分钟，来测定酶丧失活性时的温度。在40℃酶的残余活性为80％或更多，甚至在45℃酶的残余活性约为60％。
(5)分子量
用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的分子量为55,000±5,000。
(6)等电点
用等电聚焦电泳测定的等电点约为4.2。
(7)表面活性剂的影响
在0.1％表面活性剂的溶液中在pH10、30℃处理30分钟，它的活性几乎不受抑制(活性残余比为90％或更多)，这些表面活性剂例如支链烷基苯磺酸钠、烷基硫酸酯钠盐、聚氧乙烯烷基硫酸酯钠盐、α-烯烃磺酸钠、α-磺化脂肪酸酯钠盐、烷基磺酸钠、SDS、肥皂和softanol。
(8)金属盐的影响
在含有各种不同金属盐的每一个反应系统中于pH10、30℃处理30分钟，研究它们的影响。它的活性被1mM Mn2+抑制(抑制比：约75％)，被1mM Sr2+和Cd2+轻度抑制(抑制比为约30％)。实施例1：连接有α-淀粉酶基因的各种不同重组质粒的制备
根据WO98/44126中叙述的方法，通过缺失来自芽孢杆菌属菌株KSM-AP1378(FERM BP-3048)并且具有SEQ ID No.1所代表氨基酸序列的α-淀粉酶(“LAMY”)的Arg181和Gly1812；和通过在这种缺失突变之外，再用Thr替代SEQ ID No.1所代表的氨基酸序列的Met202，分别构建编码耐热性提高了的突变α-淀粉酶(下文将描述为“ΔRG”)和氧化剂抗性和耐热性都提高了的突变α-淀粉酶(“ΔRG-M202T”)的基因。以这些基因为模板，用引物LAUS(SEQ IDNo.5)和LADH(SEQ ID No.6)通过PCR反应扩增编码这些突变α-淀粉酶的基因片段(约1.5kb)。用限制性酶SalI酶切后，将每一片段插入表达载体pHSP64(日本专利申请公开文本平6-217781)的SalI-SmaI位点，由此构建连接有各个突变α-淀粉酶结构基因的质粒，其中结构基因位于来自芽孢杆菌属菌株KSM-64(FERM P-10482)的碱性纤维素酶基因的强启动子下游。
同时，用Saito和Miura的方法(生物化学生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)，72，619(1961))，从芽孢杆菌属菌株KSM-K38(FERM BP-6946)的细胞抽提染色体DNA作为模板，用表2所示的引物K38US(SEQ ID No.7)和K38DH(SEQ ID No.8)进行PCR反应，由此扩增编码具有SEQ ID No.2所代表氨基酸序列的α-淀粉酶(下文将描述为“K38AMY”)的结构基因片段(约1.5kb)。经限制性酶SalI酶切后，将产生的片段插入到表达载体pHSP64的SalI-SmaI位点，以构建一个连接有K38AMY结构基因的重组质粒(图1)，其中结构基因位于pHSP64含有的来自芽孢杆菌属菌株KSM-64(FERM P-10482)碱性纤维素酶基因的强启动子下游。以该重组质粒为模板，用引物CLUBG(SEQ ID No.9)和K38DH(SEQ ID No.8)进行PCR反应，扩增含有该强启动子和连接在其上的K38AMY的基因片段。
用下述的重组PCR方法构建了一个编码K38AMY和LAMY之间的嵌合α-淀粉酶的基因。具体地说，以菌株KSM-K38(FERM BP6946)的染色体DNA为模板，用表2所示的引物K38DH(SEQ ID No.8)和LA-K38(SEQ ID No.10)进行PCR反应，以扩增编码SEQ ID No.2所代表的K38AMY氨基酸序列中从Gln20向下游到C-末端的序列的片段。用上述含有LAMY基因和强启动子的重组质粒为模板，用表2所示的引物CLUBG(SEQ ID No.9)和LA-K38R(SEQ ID No.11)进行PCR反应，以扩增编码SEQ ID No.1的LAMY氨基酸序列中从上游强启动子到Gly21的基因片段。通过用产生的两个DNA片段和表2所示的引物CLUBG(SEQ ID No.9)和K38DH(SEQ ID No.8)进行第二次PCR反应，将产生的其末端有分别来自引物LA-K38(SEQ IDNo.10)和LA-K38R(SEQ ID No.11)的互补序列的两个片段组合在一起，由此扩增了嵌合α-淀粉酶(下文将描述为“LA-K38AMY”)的基因片段(约2.1kb)，该嵌合α-淀粉酶连续地连接有编码强启动子下游从LAMY的His1到Gly21的区段和编码从K38AMY的Gln20到C-末端的区段。
用“定点诱变系统Mutan-Super Express Km”试剂盒(TakaraShuzo有限公司产品)，将下述突变导入K38AMY和LA-K38AMY。首先，将K38AMY和LA-K38AMY的基因片段插入该试剂盒附带的质粒载体pKF19k的SmaI位点，以构建诱变重组质粒(图2)。用T4 DNA激酶将表2中的定点诱变寡核苷酸引物N190F(SEQ ID No.50)5’-磷酸化。用该引物和上述诱变重组质粒，按照试剂盒的方法进行诱变。并且用反应的产物转化大肠杆菌MV1184(“感受态细胞MV1184”，Takara Shuzo有限公司产品)。从这样获得的转化体抽提重组质粒，然后分析碱基序列，借以证实用Phe替代Asn190的突变。通过相继利用引物A209V(SEQ ID No.51)和QEYK(SEQ IDNo.49)以上面的类似方式将诱变反应重复引入该突变基因，由此分别用Phe和Val替代SEQ ID No.2所代表的K38AMY氨基酸序列的Asn190和Gln209，并用SEQ ID No.1所代表的LAMY氨基酸序列的His1-Gly21序列替代SEQ ID No.2所代表的K38AMY氨基酸序列的Asp1-Gly19序列；分别用Glu、Lys、Phe和Val替代K38AMY氨基酸序列的Gln167、Tyr169、Asn190和Gln209，并用LAMY氨基酸序列的His1-Gly21序列替代K38AMY氨基酸序列的Asp1-Gly19序列；以及分别用  Glu、Lys、Phe和Val替代K38AMY的氨基酸序列Gln167、Tyr169、Asn190和Gln209，分别构建了编码一种耐热性提高了的突变α-淀粉酶(此后将描述为“LA-K38AMY/NFQV”)、一种大大提高了耐热性的突变α-淀粉酶(“LA-K38AMY/QEYK/NFQV”)和一种提高了耐热性的突变α-淀粉酶(“QEYK/NFQV”)的基因。
以这些基因为模板，用引物K38US(SEQ ID No.7)和K38DH(SEQ ID No.8)进行PCR反应以扩增编码突变α-淀粉酶的结构基因片段(约1.5kb)。然后以上述类似方法将其插入表达载体pHSP64的SalI-SmaI位点，由此构建连接了这些突变α-淀粉酶的结构基因的重组质粒(图1)。实施例2：引入突变以提高α-淀粉酶的生产能力
用“定点诱变系统Mutan-Super Express Km”试剂盒(Takara Shuzo有限公司产品)进行定点诱变以提高重组枯草芽孢杆菌的淀粉酶生产能力。以实施例1中获得的各种重组质粒为模板，对ARG和ARG/M202T用引物CLUBG(SEQ ID No.9)和LADH(SEQ IDNo.6)进行PCR反应，而对K38AMY、LA-K38AMY/NFQV、LA-K38AMY/QEYK/NFQV和QEYK/NFQV用引物CLUBG(SEQ ID No.9)和K38DH(SEQ ID No.8)进行PCR反应，由此扩增从来自菌株KSM-64的上游强启动子到下游α-淀粉酶基因的约2.1kb的片段。将这些扩增片段插入上述试剂盒附带的质粒载体pKF19k的SmaI位点，由此构建各种诱变重组质粒(图2)。
用T4 DNA激酶将表2中列出的用于定点诱变的各种寡核苷酸引物(SEQ ID Nos.12-51)5’-磷酸化，并利用产生的产物和上面的诱变重组质粒按照试剂盒描述的方法进行诱变。用反应产物转化菌株大肠杆菌MV1184(“感受态细胞MV1184”，Takara Shuzo有限公司产品)。从产生的转化体中抽提重组质粒，然后分析碱基序列以证实突变。
表2
   SeQIDNo. 引物 碱基序列(5’-3’) 使用目的
    5     LAUS  GAGTCGACCAGCACAAGCCCATCATAATGG 用于重组的PCR
    6     LADH  TAAAGCTTCAATTTATATTGG
    7     K38US  GGGTCGACCAGCACAAGCCGATGGATTGAACGGTACGATG
    8     K38DH  TAAAGCTTTTGTTATTGGTTCACGTACAC
    9     CLUBG  CCAGATCTACTTACCATTTTAGAGTCA
    10     LA-K38  ATTTGCCAAATGACGGGCAGCATTGGAATCGGTT
    11     LA-K38R  AACCGATTCCAATGCTGCCCGTCATTTGGCAAAT
    12     P18S  TTTGAATGGCATTTGTCAAATGACGGGGAACCAC 定点诱变(ΔRG)
    13     Q86E  ACAAGGAGTCAGTTGGAAGGTGCCGTGACATCT
    14     E130V  CGAAACCAAGTAATATCAGGT
    15     N154D  AATACCCATTCCGATTTTAAATGGCGC
    16     R171C  GATTGGGATCAGTCATGYCAGCTTCAGAACAAA
    17     A186V  AAATTCACCGGAAAGGTATGGGACTGGGAAGTA
    18     E212D  TCATCCAGATGTAATCAATG
    19     V222E  CTTAGAAATTGGGGAGAATGGTATACAAATACA
    20     Y243C  GTGAAACATATTAAATGCAGCTATACGAGAGAT
    21     P260E  AACACCACAGGTAAAGAAATGTTTGCAGTTGCA
    22     K269Q  AGAATTTTGGCAAAATGACCT
    23     E276H  TTGCTGCAATCCATAACTATTTAAAT
    24     N277S  CTTGCTGCAATCGAAAGYTATTTAAATAAAACA
    25     R310A  GGCTATTTTGATATGGCAAATATTTTAAATGGT
    26     E360Q  TCTGACAAGGCAGCAAGGTTA
    27     Q391E  GATCCACTTCTGGAAGCACGTCAAACG
    28     W439R  GGGGGTAATAAAAGAATGTATGTCGGG
    29     K444R  ATGTATGTCGGGCGACATAAAGCTGG
    30     N471D  GATGGTTGGGGGGATTTCACTGTAA
    31     G476D  TTCACTGTAAACGATGGGGCAGTTTCG
    32     K484Q  GGTTTGGGTGCAGCAATAAAT
    33     P18X  TTTGAATGGCATTTGNNNAATGACGGGAACCAC 定点诱变(用于ΔRG/M2027)
    34     A186X  AAATTCACCGGAAAGNNNTGGGACTGGGAAGTA
    35     Y243X  GTGAAACATATTAAANNNAGCTATACGAGAGAT
    36     N277X  CTTGCTGCAATCGAANNNTATTTAAATAAAACA
    37     N471E  GATGGTTGGGGGGAATTCACTGTAA
    38     D128V  CCAACGAATCGTTGGCAGGTAATTTCAGGTGCCTACACG 定点诱变(用于K38AMY)
    39     G140S  ATTGATGCGTGGACGAGTTTCGACTTTTCAGGG
    40     S144P  TTTCGACTTTCCAGGGCGTAA
    41     R168Q  GGTGTTGACTGGGATCAGCAATATCAAGAAAATCATATTTTCC
    42     N181V  CATATTTTCCGCTTTGCAAATACGGTNTGGAACAGGCGAGTG
    43     E207D  AATATCGACTTTAGTCATCCAGATGTACAAGATGAGTTGAAGGA
    44     F272S  GACGTAGGTGCTCTCGAATCTTATTTAGATGAAATGAATTGGG
    45     S375P  CGATAACATTCCAGCTAAAAA
    46     W434R  GACCTGGTGGTTCCAAGAGAATGTATGTAGGACGTCAG
    47     E466D  AATGGCGATGGATGGGGCGATTTCTTTACGAATGGAGGATCT
    48     D128X  CCAACGAATCGTTGGCAGNNNATTTCAGGTGCCTACACG
    49     QEYK  GTTGACTGGGATGAGCGCAAACAAGAAAATCAT
    50     N190F  TGGATGAAGAGTTCGGTAATTATGA
    51     Q209  AGTCATCCAGAGGTCGTAGATGAGTTGAAGGAT
在碱基序列中“N”是指A、T、G和C的混合碱基，而“Y”是指T和C的混合碱基。
通过再次以上述类似的方式将一个表达启动子区和突变α-淀粉酶基因部分插入pKF19k的SmaI位点，当引入另一突变位点时，该引入突变的基因成为模板质粒。这样以上述方法的类似方式引入另一个突变。
用这些如此获得的突变重组质粒作为模板，用引物CLUBG(SEQID No.9)和LADH(SEQ ID No.6)或引物CLUBS(SEQ ID No.9)和K38DH(SEQ ID No.8)进行PCR，扩增突变基因片段。用SalI将它们切割后，插入表达载体pHSP64的SalI-SmaI位点，以构建产生突变α-淀粉酶的各种质粒(图1)。实施例3：突变α-淀粉酶的生产
根据原生质体方法将实施例2中获得的产生突变α-淀粉酶的各种质粒均导入枯草芽孢杆菌ISW1214(LeuA metBS5 hsdM1)中。如此获得的重组枯草芽孢杆菌在液体培养基中(4％玉米浸液、1％胰蛋白胨、1％肉膏、0.1％磷酸二氢钾(monopotassium phosphate)、0.01％硫酸镁、2％麦芽糖、0.1％氯化钙、15μg/ml四环素)于30℃培养4天。用培养基上清测量每一个突变α-淀粉酶的活性。实施例4：淀粉酶生产能力的评价-1
分析下列每一种酶的淀粉酶生产能力；用Ser替代了ΔRG的Pro18的酶(以下将简写为“P18S/ΔRG”)、用Glu替代了Gln86的酶(“Q86E/ΔRG”)、用Val替代了Glu130的酶(“E130V/ΔRG”)、用Asp替代了A8n154的酶(“N154D/ΔRG”)、用Cys替代了Arg171的酶(“R171C/ΔRG”)、用Val替代了Ala186的酶(“A186V/ΔRG”)、用Asp替代了Glu212的酶(“E212D/ΔRG”)、用Glu替代了Val222的酶(“V222E/ΔRG”)、用Cys替代了Tyr243的酶(“Y243C/ΔRG”)、用Glu替代了Pro260的酶(“P260E/ΔRG”)、用Gln替代了Lys269的酶(“K269E/ΔRG”)、用His替代了Glu276的酶(“E276H/ΔRG”)、用Ser替代了Asn277的酶(“N277S/ΔRG”)、用Ala替代了Arg310的酶(“R310A/ΔRG”)、用Gln替代了Glu360的酶(“E360Q/ΔRG”)、用Glu替代了Gln391的酶(“Q391E/ΔRG”)、用Arg替代了Trp439的酶(“W439R/ΔRG”)、用Arg替代了Lys444的酶(“K444R/ΔRG”)、用Asp替代了Asn471的酶(“N471D/ΔRG”)和用Asp替代了Gly476的酶(“G476D/ΔRG”)。用ΔRG作对照。将ΔRG的淀粉酶生产能力定为100％，测定淀粉酶生产能力的相对值(％)。结果见表3。
     表3
         酶             相对淀粉酶
                        生产能力(％)
        ΔRG               100
      P18S/ΔRG            277
      Q86E/ΔRG            119
      E130V/ΔRG           362
      N154D/ΔRG           146
      R171C/ΔRG           235
      A186V/ΔRG           485
      E212D/ΔRG           327
      V222E/ΔRG           135
      Y243C/ΔRG           350
      P260E/ΔRG           142
      K269Q/ΔRG           142
      E276H/ΔRG           231
      N277S/ΔRG           312
      R310A/ΔRG           208
      E360Q/ΔRG           162
      Q391E/ΔRG           127
      W439R/ΔRG           312
      K444R/ΔRG           112
      N471D/ΔRG           292
      G476D/ΔRG           296
任何一个突变酶都显示了比ΔRG高的淀粉酶生产能力，表明在重组枯草芽孢杆菌中，突变提高了淀粉酶的生产能力。特别地，E130V/ΔRG、A186V/ΔRG、E212D/ΔRG、Y243C/ΔRG、N277S/ΔRG和W439R/ΔRG中每一种酶的淀粉酶生产能力都比ΔRG高至少3倍，并且最突出的是，A186V/ΔRG显示了显著高的生产能力，比ΔRG几乎高5倍。实施例5：淀粉酶生产能力的评价-2
以与实施例1、2和3描述的方法类似的方式，分析下列每一种酶的淀粉酶生产能力：用Thr替代了ΔRG/MT的Pro18的酶(以下将简写为“P18T/ΔRG/MT”)、用Glu替代了Gln86的酶(“Q86E/ΔRG/MT”)、用Val替代了Glu130的酶(“E130V/ΔRG/MT”)、用Asn替代了Ala186的酶(“A186N/ΔRG/MT”)、用Ser替代了Tyr243的酶(“Y243S/ΔRG/MT”)、用Phe替代了Asn277的酶(“N277F/ΔRG/MT”)和用Glu替代了Asn471的酶(“N471E/ΔRG/MT”)。用ΔRG/MT作对照。结果见表4。
表4
       酶            相对淀粉酶生产能力(％)
     ΔRG/MT                  100
   P18T/ΔRG/MT               200
   Q86E/ΔRG/MT               144
   E130V/ΔRG/MT              344
   A186N/ΔRG/MT              344
   Y243S/ΔRG/MT              189
   N277F/ΔRG/MT              256
   N471E/ΔRG/MT              211
可以看出，与ΔRG/MT相比，上述任何一种突变酶都显示了高的淀粉酶生产能力。特别地，E130V/ΔRG/MT和A186N/ΔRG/MT中每一种酶的生产能力都比ΔRG/MT高至少3倍。实施例6：淀粉酶生产能力的评价-3
根据实施例1、2、3中所用的方法，分析下列每一种酶的淀粉酶生产能力：用Val替代了K38AMY的Asp128的酶(以下将简写为“D128V”)、用Ser替代了Gly140的酶(“G140S”)、用Pro替代了Ser144的酶(“S144P”)、用Gln替代了Arg168的酶(“R168Q”)、用Val替代了Asn181的酶(“N181V”)、用Asp替代了Glu207的酶(“E207D”)、用Ser替代了Phe272的酶(“F272S”)、用Pro替代了Ser375的酶(“S375P”)、用Arg替代了Trp434的酶(“W434R”)和用Asp替代了Glu466的酶(“E466D”)。用K38AMY作对照。结果见表5。
     表5
           酶          相对淀粉酶生产能力(％)
          K38AMY               100
          D128V                325
          G140S                209
          S144P                197
          R168Q                264
          N181V                207
          E207D                109
          F272S                175
          S375P                115
          W434R                124
          E466D                212
可以看出，与野生型K38AMY相比，任何一种突变酶都显示了高的淀粉酶生产能力。特别地，D128V显示了比K38AMY高至少3倍的高生产能力。实施例7：淀粉酶生产能力的评价-4
根据实施例3描述的方法分析实施例6显示的突变体中具有S144P和N181V双突变的突变酶S144P/N181V(以下将简写为“SPNV”)的淀粉酶生产能力。用K38AMY、S144P和N181V作对照。结果见表6。
      表6
              酶           相对淀粉酶生产能力(％)
             K38AMY              100
             S144P               197
             N181V               207
             SPNV                257
结果如表6所示，双突变带来淀粉酶生产能力的进一步提高。实施例8：淀粉酶生产能力的评价-5
根据实施例1、2、3中描述的方法，分析下列每种酶的淀粉酶生产能力：用Gln替代耐热性提高了的LA-K38AMY/NFQV基因中的Arg168获得的酶(以下将简写为“R168Q/LA-K38AMY/NFQV”)，用Asp替代上述基因的Glu466获得的酶(“E466D/LA-K38AMY/NFQV”)和将实施例6的双突变引入该基因的酶(“SPNV/LA-K38AMY/NFQV”)。用LA-K38AMY/NFQV作对照。结果见表7。
表7
         酶            相对淀粉酶生产能力(％)
     LA-K38AMY/NFQV            100
     R168Q/LA-K38AMY/NFQV      304
     E466D/LA-K38AMY/NFQV      264
     SPNV/LA-K38AMY/NFQV       154
结果发现，该实施例中获得的每一种酶都显示了比LA-K38AMY/NFQV高至少约1.5倍的淀粉酶生产能力。特别地，R168Q/LA-K38AMY/NFQV显示了高约3倍的淀粉酶生产能力。实施例9：淀粉酶生产能力的评价-6
根据实施例1、2和3描述的方法，分析下列每一种酶的淀粉酶生产能力：用Val替代耐热性提高了的酶LA-K38AMY/QEYK/NFQV基因中的Asp128获得的酶(以下将简写为“D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV”)，和将实施例6的双突变引入了该基因的酶(“SPNV/LA-K38AMY/QEYK/NFQV”)。用LA-K38AMY/QEYK/NFQV作对照。结果见表8。
表8
       酶                相对淀粉酶生产能力(％)LA-K38AMY/QEYK/NFQV             100D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV       602SPNV/LA-K38AMY/QEYK/NFQV        427
结果发现，该实施例获得的任何一种突变酶都显示了比LA-K38AMY/QEYK/NFQV显著高的淀粉酶生产能力。特别地，D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV显示了生产能力的急剧增加(约6倍)。实施例10：淀粉酶生产能力的评价-7
根据实施例1和2描述的方法，向实施例9所示突变酶里生产能力急剧增加的D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV中引入用Leu替代Met107以提高氧化剂抗性的突变(以下该突变将简写为“M107L”)(“ML/DV/LA-K38AMY/QEYK/NFQV”)。
然后，根据实施例4的方法，分析突变酶MM/DV/LA-K38AMY/QEYK/NFQV基因的淀粉酶生产能力。用D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV作对照。结果见表9。
表9
       酶                     相对淀粉酶生产能力(％)
D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV              100
M107L/D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV        115
突变酶ML/DV/LA-K38AMY/QEYK/NFQV的相对淀粉酶生产能力为115％，表明引入用以增强氧化剂抗性的M107L突变没有对重组枯草芽孢杆菌的高淀粉酶生产能力产生不利影响。实施例11：淀粉酶生产能力的评价8
根据实施例1、2和3描述的方法，分析用Gln替代耐热性提高了的酶QEYK/NFQV基因的Asp128获得的酶(产生的酶以下将简写为“D128Q/QEYK/NFQV”)的淀粉酶生产能力。用QEYK/NFQV作对照。结果见表10。
表10
       酶          相对淀粉酶生产能力(％)
    QEYK/NFQV               100
 D128Q/QEYK/NFQV            247
可见突变酶显示的生产能力比QEYK/NFQV高至少2倍。
实施例12：溶解性分析
将表11所示的突变酶制品在4℃贮存一周后，分离离心形成的沉淀(13000rpm，10分钟，4℃)。用与离心前体积相同的含有2mMCaCl2的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)悬浮沉淀。产生的悬浮液用相同缓冲液稀释约500倍以使前者溶于后者，并检测所获溶液的酶活性。上清用类似方法稀释并且也检测它的酶活性。将每一种沉淀溶液和上清的酶活性与在4℃贮存前该制品的酶活性相比，评价每一种突变酶的溶解性。结果汇总于表11。
表11
    酶   在4℃贮存后的残余活性(％)
   上清    沉淀
 ΔRGΔRG Gln86→GluΔRG Pro260→GluΔRG Lys269→GlnΔRG Asn471→AspΔRG Lys484→Gln     558370747471     401118272324
结果发现，当通过缺失Arg181和Gly182使耐热性提高了的改良α-淀粉酶(ΔRG)在4℃贮存一周时，出现了该酶的沉淀，并且上清中剩余的活性只有约一半。另一方面，通过在ΔRG-LAMY上进一步引入突变获得的突变酶在上清中显示了高的活性残余比，表明突变提高了溶解性。特别地，用Glu替代了Gln86的酶显示了最高的酶溶解性，并且在该实施例条件下上清中剩余80％的酶。实施例13：用于自动洗碟机的洗涤剂组合物
制备含有如表12所示成分的用于自动洗碟机的洗涤剂组合物，然后加入在增加生产能力的方法中获得的各种突变酶。结果当和对照酶活性相等时，与对照酶相比，高产突变酶显示了相似或更强的去污力。
表12
    洗涤剂组合物     (％)
Pluronic L-61碳酸钠重碳酸钠过碳酸钠1号硅酸钠柠檬酸三钠聚丙二醇“Silicone KST-04”(Toshiba Silicone产品)“Sokalan CP-45”(BASF产品)     2.224.724.710.012.020.02.20.24.0
工业应用能力
根据使用本发明的突变α-淀粉酶，可以从重组微生物得到高产α-淀粉酶，使得它们的工业生产成本能够大大降低。本发明中用于增加生产能力的突变对酶的生化特性没有不利影响，因此能够产生具有耐热性、螯合剂抗性和氧化剂抗性并可作为洗涤剂用酶使用的高生产能力的液化碱性α-淀粉酶。
序列表<110>KAO CORPORATION<120>高生产能力的α-淀粉酶<130>P04831210<160>51<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>485<212>PRT<213>芽孢杆菌属KSM-AP1378<400>1His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His
              5              10                      15Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala
         20              25                      30Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
     35              40                      45Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
 50              55                      60Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly65              70                      75                  80Thr Arg Ser Gln Leu Gln Gly Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly
         85                      90                  95Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
    100                     105                 110Gly Thr Glu Met Val Asn Ala Val Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn
115                     120                 125Gln Glu Ile Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130                 135                 140Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr145                 150                 155                 160His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys
            165                 170                 175Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
        180                 185                 190Ile Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met
    195                 200                 205Asp His Pro Glu Val Ile Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr
210                 215                 220Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His225                 230                 235                 240Ile Lys Tyr Ser Tyr Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr
            245                 250                 255Thr Gly Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
        260                 265                 270Ala Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val
    275                 280                 285Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly
290                 295                 300Gly Tyr Phe Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys305                 310                 315                 320His Pro Ile His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
            325                 330                 335Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Ser Trp Phe Lys Pro Leu Ala
        340                 345                 350Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
    355                 360                 365Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ser Met Lys Ser
370                 375                 380Lys Ile Asp Pro Leu Leu Gln Ala Arg Gln Thr Tyr Ala Tyr Gly Thr385                 390                 395                 400Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu
            405                 410                 415Gly Asp Ser Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp
        420                 425                 430Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys His Lys Ala Gly
    435                 440                 445Gln Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile
450                 455                 460Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Thr Val Asn Gly Gly Ala Val Ser465                 470                 475                 480Val Trp Val Lys Gln
            485<210>2<211>480<212>PRT<213>芽孢杆菌属KSM-K38<400>2Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Tyr Glu Trp His Leu Glu
              5                  10                  15Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asp Asp Ala Ala Ala Leu
         20                  25                  30Ser Asp Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly
     35                  40                  45Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
 50                  55                  60Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys65                  70                  75                  80Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu Lys Ser Asn Asp Ile Asn
             85                  90                  95Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Met Gly Ala Asp Phe Thr
        100                 105                 110Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro Thr Asn Arg Trp Gln Asp
    115                 120                 125Ile Ser Gly Ala Tyr Thr Ile Asp Ala Trp Thr Gly Phe Asp Phe Ser
130                 135                 140Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Phe His Phe145                 150                 155                 160Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln Glu Asn His Ile Phe Arg
            165                 170                 175Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val Asp Glu Glu Asn Gly Asn
        180                 185                 190Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp Phe Ser His Pro Glu Val
    195                 200                 205Gln Asp Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser Trp Phe Thr Asp Glu Leu Asp
210                 215                 220Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys His Ile Pro Phe Trp Tyr225                 230                 235                 240Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg Asn Glu Ala Asp Gln Asp Leu
            245                 250                 255Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp Asp Val Gly Ala Leu Glu Phe
        260                 265                 270Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met Ser Leu Phe Asp Val Pro Leu
    275                 280                 285Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Gln Gln Gly Gly Ser Tyr Asp Met
290                 295                 300Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val Glu Ala His Pro Met His Ala305                 310                 315                 320Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Glu Ser Leu Glu
            325                 330                 335Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu
        340                 345                 350Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly
    355                 360                 365Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys Lys Asp Met Ile Asp Glu Leu
370                 375                 380Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe385                 390                 395                 400Asp His Trp Asp Val Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Ser Ser Ser Arg
            405                 410                 415Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asn Gly Pro Gly Gly Ser
        420                 425                 430Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Gln Thr Trp Thr Asp
    435                 440                 445Leu Thr Gly Asn Asn Gly Ala Ser Val Thr Ile Asn Gly Asp Gly Trp
450                 455                 460Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Tyr Val Asn Gln465                 470                 475                 480<210>3<211>1786<212>DNA<213>芽孢杆菌属KSM-AP1378<220><221>信号肽<222>(155)..(247)<220><221>成熟肽<222>(248)..(1702)<220><221>CDS<222>(155)..(1702)<400>3cagcgtgata atataaattt gaaatgaaca cctatgaaaa tatggtagcg attgcgcgac 60gagaaaaaac ttgggagtta ggaagtgata ttaaaggatt ttttttgact tgttgtgaaa 120acgcttgcat aaattgaagg agagggtgct tttt atg aaa ctt cat aac cgt ata 175att agc gta cta tta aca cta ttg tta gct gta gct gtt ttg ttt cca 223tat atg acg gaa cca gca caa gcc cat cat aat ggg acg aat ggg acc 271
                            His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr
                              1                   5atg atg cag tat ttt gaa tgg cat ttg cca aat gac ggg aac cac tgg 319Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp
 10                  15                  20aac agg tta cga gat gac gca gct aac tta aag agt aaa ggg att acc 367Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr25                  30                  35                  40gct gtt tgg att cct cct gca tgg aag ggg act tcg caa aat gat gtt 415Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val
             45                  50                  55ggg tat ggt gcc tat gat ttg tac gat ctt ggt gag ttt aac caa aag 463Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys
         60                  65                  70gga acc gtc cgt aca aaa tat ggc aca agg agt cag ttg caa ggt gcc 511Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Arg Ser Gln Leu Gln Gly Ala
     75                  80                  85gtg aca tct ttg aaa aat aac ggg att caa gtt tat ggg gat gtc gtg 559Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val
 90                  95                 100atg aat cat aaa ggt gga gca gac ggg aca gag atg gta aat gcg gtg 607Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Gly Thr Glu Met Val Asn Ala Val105                 110                 115                 120gaa gtg aac cga agc aac cga aac caa gaa ata tca ggt gaa tac acc 655Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn Gln Glu Ile Ser Gly Glu Tyr Thr
            125                 130                 135att gaa gca tgg acg aaa ttt gat ttc cct gga aga gga aat acc cat 703Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His
        140                 145                 150tcc aac ttt aaa tgg cgc tgg tat cat ttt gat ggg aca gat tgg gat 751Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp
    155                 160                 165cag tca cgt cag ctt cag aac aaa ata tat aaa ttc aga ggt acc gga 799Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly
170                 175                 180aag gca tgg gac tgg gaa gta gat ata gag aac ggc aac tat gat tac 847Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Ile Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr185                 190                 195                 200ctt atg tat gca gac att gat atg gat cat cca gaa gta atc aat gaa 895Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His Pro Glu Val Ile Asn Glu
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        220                 225                 230ttt aga atc gat gct gtg aaa cat att aaa tac agc tat acg aga gat 991Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys Tyr Ser Tyr Thr Arg Asp
    235                 240                 245tgg cta aca cat gtg cgt aac acc aca ggt aaa cca atg ttt gca gtt 1039Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr Thr Gly Lys Pro Met Phe Ala Val
250                 255                 260gca gaa ttt tgg aaa aat gac ctt gct gca atc gaa aac tat tta aat 1087Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Ala Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn265                 270                 275                 280aaa aca agt tgg aat cac tcc gtg ttc gat gtt cct ctt cat tat aat 1135Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn
            285                 290                 295ttg tac aat gca tct aat agt ggt ggc tat ttt gat atg aga aat att 1183Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly Gly Tyr Phe Asp Met Arg Asn Ile
        300                 305                 310tta aat ggt tct gtc gta caa aaa cac cct ata cat gca gtc aca ttt 1231Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys His Pro Ile His Ala Val Thr Phe
    315                 320                 325gtt gat aac cat gac tct cag cca gga gaa gca ttg gaa tcc ttt gtt 1279Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val
330                 335                 340caa tcg tgg ttc aaa cca ctg gca tat gca ttg att ctg aca agg gag 1327Gln Ser Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu345                 350                 355                 360caa ggt tac cct tcc gta ttt tac ggt gat tac tac ggt ata cca act 1375Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr
            365                 370                 375cat ggt gtt cct tcg atg aaa tct aaa att gat cca ctt ctg cag gca 1423His Gly Val Pro Ser Met Lys Ser Lys Ile Asp Pro Leu Leu Gln Ala
        380                 385                 390cgt caa acg tat gcc tac gga acc caa cat gat tat ttt gat cat cat 1471Arg Gln Thr Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe Asp His His
    395                 400                 405gat att atc ggc tgg acg aga gaa ggg gac agc tcc cac cca aat tca 1519Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser His Pro Asn Ser
410                 415                 420gga ctt gca act att atg tcc gat ggg cca ggg ggt aat aaa tgg atg 1567Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met425                 430                 435                 440tat gtc ggg aaa cat aaa gct ggc caa gta tgg aga gat atc acc gga 1615Tyr Val Gly Lys His Lys Ala Gly Gln Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly
            445                 450                 455aat agg tct ggt acc gtc acc att aat gca gat ggt tgg ggg aat ttc 1663Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe
        460                 465                 470act gta aac gga ggg gca gtt tcg gtt tgg gtg aag caa taaataagga 1712Thr Val Asn Gly Gly Ala Val Ser Val Trp Val Lys Gln
    475                 480                 485acaagaggcg aaaattactt tcctacatgc agagctttcc gatcactcat acacccaata 1772taaattggaa gctt 1786<210>4<211>1753<212>DNA<213>芽孢杆菌属KSM-K38<220><221>信号肽<222>(162)..(224)<220><221>成熟肽<222>(225)..(1664)<220><221>CDS<222>(162)..(1664)<400>4gtatgcgaaa cgatgcgcaa aactgcgcaa ctactagcac tcttcaggga ctaaaccacc 60ttttttccaa aaatgacatc atataaacaa atttgtctac caatcactat ttaaagctgt 120ttatgatata tgtaagcgtt atcattaaaa ggaggtattt g atg aga aga tgg gta 176gta gca atg ttg gca gtg tta ttt tta ttt cct tcg gta gta gtt gca 224gat gga ttg aac ggt acg atg atg cag tat tat gag tgg cat ttg gaa 272Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Tyr Glu Trp His Leu Glu1               5                  10                  15aac gac ggg cag cat tgg aat cgg ttg cac gat gat gcc gca gct ttg 320Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asp Asp Ala Ala Ala Leu
         20                  25                  30agt gat gct ggt att aca gct att tgg att ccg cca gcc tac aaa ggt 368Ser Asp Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly
     35                  40                  45aat agt cag gcg gat gtt ggg tac ggt gca tac gat ctt tat gat tta 416Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
 50                  55                  60gga gag ttc aat caa aag ggt act gtt cga acg aaa tac gga act aag 464Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys65                  70                  75                  80gca cag ctt gaa cga gct att ggg tcc ctt aaa tct aat gat atc aat 512Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu Lys Ser Asn Asp Ile Asn
             85                  90                  95gta tac gga gat gtc gtg atg aat cat aaa atg gga gct gat ttt acg 560Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Met Gly Ala Asp Phe Thr
        100                 105                 110gag gca gtg caa gct gtt caa gta aat cca acg aat cgt tgg cag gat 608Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro Thr Asn Arg Trp Gln Asp
    115                 120                 125att tca ggt gcc tac acg att gat gcg tgg acg ggt ttc gac ttt tca 656Ile Ser Gly Ala Tyr Thr Ile Asp Ala Trp Thr Gly Phe Asp Phe Ser
130                 135                 140ggg cgt aac aac gcc tat tca gat ttt aag tgg aga tgg ttc cat ttt 704Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Phe His Phe145                 150                 155                 160aat ggt gtt gac tgg gat cag cgc tat caa gaa aat cat att ttc cgc 752Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln Glu Asn His Ile Phe Arg
            165                 170                 175ttt gca aat acg aac tgg aac tgg cga gtg gat gaa gag aac ggt aat 800Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val Asp Glu Glu Asn Gly Asn
        180                 185                 190tat gat tac ctg tta gga tcg aat atc gac ttt agt cat cca gaa gta 848Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp Phe Ser His Pro Glu Val
    195                 200                 205caa gat gag ttg aag gat tgg ggt agc tgg ttt acc gat gag tta gat 896Gln Asp Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser Trp Phe Thr Asp Glu Leu Asp
210                 215                 220ttg gat ggt tat cgt tta gat gct att aaa cat att cca ttc tgg tat 944Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys His Ile Pro Phe Trp Tyr225                 230                 235                 240aca tct gat tgg gtt cgg cat cag cgc aac gaa gca gat caa gat tta 992Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg Asn Glu Ala Asp Gln Asp Leu
            245                 250                 255ttt gtc gta ggg gaa tat tgg aag gat gac gta ggt gct ctc gaa ttt 1040Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp Asp Val Gly Ala Leu Glu Phe
        260                 265                 270tat tta gat gaa atg aat tgg gag atg tct cta ttc gat gtt cca ctt 1088Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met Ser Leu Phe Asp Val Pro Leu
    275                 280                 285aat tat aat ttt tac cgg gct tca caa caa ggt gga agc tat gat atg 1136Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Gln Gln Gly Gly Ser Tyr Asp Met
290                 295                 300cgt aat att tta cga gga tct tta gta gaa gcg cat ccg atg cat gca 1184Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val Glu Ala His Pro Met His Ala305                 310                 315                 320gtt acg ttt gtt gat aat cat gat act cag cca ggg gag tca tta gag 1232Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Glu Ser Leu Glu
            325                 330                 335tca tgg gtt gct gat tgg ttt aag cca ctt gct tat gcg aca att ttg 1280Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu
        340                 345                 350acg cgt gaa ggt ggt tat cca aat gta ttt tac ggt gat tac tat ggg 1328Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly
    355                 360                 365att cct aac gat aac att tca gct aaa aaa gat atg att gat gag ctg 1376Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys Lys Asp Met Ile Asp Glu Leu
370                 375                 380ctt gat gca cgt caa aat tac gca tat ggc acg cag cat gac tat ttt 1424Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe385                 390                 395                 400gat cat tgg gat gtt gta gga tgg act agg gaa gga tct tcc tcc aga 1472Asp His Trp Asp Val Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Ser Ser Ser Arg
            405                 410                 415cct aat tca ggc ctt gcg act att atg tcg aat gga cct ggt ggt tcc 1520Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asn Gly Pro Gly Gly Ser
        420                 425                 430aag tgg atg tat gta gga cgt cag aat gca gga caa aca tgg aca gat 1568Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Gln Thr Trp Thr Asp
    435                 440                 445tta act ggt aat aac gga gcg tcc gtt aca att aat ggc gat gga tgg 1616Leu Thr Gly Asn Asn Gly Ala Ser Val Thr Ile Asn Gly Asp Gly Trp
450                 455                 460ggc gaa ttc ttt acg aat gga gga tct gta tcc gtg tac gtg aac caa 1664Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Tyr Val Asn Gln465                 470                 475                 480taacaaaaag ccttgagaag ggattcctcc ctaactcaag gctttcttta tgtcgcttag 1724cttaacgctt ctacgacttt gaagcttta 1753<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>5gagtcgacca gcacaagccc atcataatgg 30<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>6taaagcttca atttatattg g 21<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>7gggtcgacca gcacaagccg atggattgaa cggtacgatg 40<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>8taaagctttt gttattggtt cacgtacac 29<210>9<211>27<212>DNA<213>人工序列      nce<400>9ccagatctac ttaccatttt agagtca 27<210>10<211>34<212>DNA<213>人工序列      lce<400>10atttgccaaa tgacgggcag cattggaatc ggtt 34<210>11<211>34<212>DNA<213>人工序列      lce<400>11aaccgattcc aatgctgccc gtcatttggc aaat 34<210>12<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>12tttgaatggc atttgtcaaa tgacggggaa ccac 34<210>13<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>13acaaggagtc agttggaagg tgccgtgaca tct 33<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>14cgaaaccaag taatatcagg t 21<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>15aatacccatt ccgattttaa atggcgc 27<210>16<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>16gattgggatc agtcatgyca gcttcagaac aaa 33<210>17<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>17aaattcaccg gaaaggtatg ggactgggaa gta 33<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>18tcatccagat gtaatcaatg 20<210>19<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>19cttagaaatt ggggagaatg gtatacaaat aca 33<210>20<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>20gtgaaacata ttaaatgcag ctatacgaga gat 33<210>21<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>21aacaccacag gtaaagaaat gtttgcagtt gca 33<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>22agaattttgg caaaatgacc t 21<210>23<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>23ttgctgcaat ccataactat ttaaat 26<210>24<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>24cttgctgcaa tcgaaagyta tttaaataaa aca 33<210>25<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>25ggctattttg atatggcaaa tattttaaat ggt 33<210>26<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>26tctgacaagg cagcaaggtt a 21<210>27<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>27gatccacttc tggaagcacg tcaaacg 27<210>28<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>28gggggtaata aaagaatgta tgtcggg 27<210>29<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>29atgtatgtcg ggcgacataa agctgg 26<210>30<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>30gatggttggg gggatttcac tgtaa 25<210>31<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>31ttcactgtaa acgatggggc agtttcg 27<210>32<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>32ggtttgggtg cagcaataaa t<210>33<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>33tttgaatggc atttgnnnaa tgacgggaac cac 33<210>34<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>34aaattcaccg gaaagnnntg ggactgggaa gta 33<210>35<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>35gtgaaacata ttaaannnag ctatacgaga gat 33<210>36<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>36cttgctgcaa tcgaannnta tttaaataaa aca 33<210>37<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>37gatggttggg gggaattcac tgtaa 25<210>38<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>38ccaacgaatc gttggcaggt aatttcaggt gcctacacg 39<210>39<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>39attgatgcgt ggacgagttt cgacttttca ggg 33<210>40<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>40tttcgacttt ccagggcgta a 21<210>41<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>41ggtgttgact gggatcagca atatcaagaa aatcatattt tcc 43<210>42<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>42catattttcc gctttgcaaa tacggtntgg aacaggcgag tg 42<210>43<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>43aatatcgact ttagtcatcc agatgtacaa gatgagttga agga 44<210>44<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>44gacgtaggtg ctctcgaatc ttatttagat gaaatgaatt ggg 43<210>45<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>45cgataacatt ccagctaaaa a 21<210>46<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>46gacctggtgg ttccaagaga atgtatgtag gacgtcag 38<210>47<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>47aatggcgatg gatggggcga tttctttacg aatggaggat ct 42<210>48<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>48ccaacgaatc gttggcagnn natttcaggt gcctacacg 39<210>49<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>49gttgactggg atgagcgcaa acaagaaaat cat 33<210>50<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>50tggatgaaga gttcggtaat tatga 25<210>51<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>51agtcatccag aggtcgtaga tgagttgaag gat 33

Claims (8)

1.突变的α-淀粉酶，其从具有SEQ ID No.1所代表的氨基酸序列或显示与该序列有至少60％同源性的α-淀粉酶衍生而来，衍生方式是替代或缺失相应于该氨基酸序列的Pro18、Gln86、Glu130、Asn154、Arg171、Ala186、Glu212、Val222、Tyr243、Pro260、Lys269、Glu276、Asn277、Arg310、Glu360、Gln391、Trp439、Lys444、Asn471和Gly476中任何一个的至少一个氨基酸残基。
2.突变的α-淀粉酶，其从具有SEQ ID No.2所代表的氨基酸序列或显示与该序列有至少60％同源性的α-淀粉酶衍生而来，衍生方式是替代或缺失相应于该氨基酸序列的Asp128、Gly140、Ser144、Arg168、Asn181、Glu207、Phe272、Ser375、Trp434和Glu466中任何一个的至少一个氨基酸残基。
3.根据权利要求1的突变α-淀粉酶，其中替代或缺失至少一个氨基酸残基是用Ser或Thr替代相应于Pro18的氨基酸残基，用Glu替代相应于Gln86的氨基酸残基，用Val或Gln替代相应于Glu130的氨基酸残基，用Asp替代相应于Asn154的氨基酸残基，用Cys或Gln替代相应于Arg171的氨基酸残基，用Val或Asn替代相应于Ala186的氨基酸残基，用Asp替代相应于Glu212的氨基酸残基，用Glu替代相应于Val222的氨基酸残基，用Cys或Ser替代相应于Tyr243的氨基酸残基，用Glu替代相应于Pro260的氨基酸残基，用Gln替代相应于Lys269的氨基酸残基，用His替代相应于Glu276的氨基酸残基，用Ser或Phe替代相应于Asn277的氨基酸残基，用Ala替代相应于Arg310的氨基酸残基，用Gln替代相应于Glu360的氨基酸残基，用Glu替代相应于Gln391的氨基酸残基，用Arg替代相应于Trp439的氨基酸残基，用Arg替代相应于Lys444的氨基酸残基，用Asp或Glu替代相应于Asn471的氨基酸残基，或用Asp替代相应于Gly476的氨基酸残基。
4.根据权利要求2的突变α-淀粉酶，其中替代或缺失至少一个氨基酸残基是用Val或Gln替代相应于Asp128的氨基酸残基，用Ser替代相应于Gly140的氨基酸残基，用Pro替代相应于Ser144的氨基酸残基，用Gln替代相应于Arg168的氨基酸残基，用Val替代相应于Gln181的氨基酸残基，用Asp替代相应于Glu270的氨基酸残基，用Ser替代相应于Phe272的氨基酸残基，用Pro替代相应于Ser375的氨基酸残基，用Arg替代相应于Trp434的氨基酸残基，或用Asp替代相应于Glu466的氨基酸残基。
5.编码权利要求1-4之任意一项的突变α-淀粉酶的基因，或含有所述基因的载体。
6.用根据权利要求5的载体转化的细胞。
7.用于生产突变α-淀粉酶的方法，包括培养权利要求6的转化细胞。
8.洗涤剂组合物，其含有权利要求1-4之任意一项的突变α-淀粉酶。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100396777C (zh) * 2005-10-28 2008-06-25 南开大学 一种嗜热碱性α-淀粉酶及其编码基因
CN105483099A (zh) * 2008-06-06 2016-04-13 丹尼斯科美国公司 具有改良特性的嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(AMYS)变体
CN112662734A (zh) * 2011-06-30 2021-04-16 诺维信公司 用于筛选α-淀粉酶的方法
CN113454214A (zh) * 2019-03-21 2021-09-28 诺维信公司 α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR9507229A (pt) * 1994-03-29 1997-09-16 Novo Nordisk As Amilase composição detergente aditivo detergente uso de um detergente e de uma amilase construç~o de dna vetor de expressão recombinante célula e processo para produzir amilase
CN101532001A (zh) * 2000-03-08 2009-09-16 诺维信公司 具有改变的特性的变体
DE50107849D1 (de) 2000-07-28 2005-12-01 Henkel Kgaa Neues amylolytisches enzym aus bacillus sp. a 7-7 (dsm 12368) sowie wasch- und reinigungsmittel mit diesem neuen amylolytischen enzym
AU2002221061A1 (en) * 2000-12-05 2002-06-18 Miz Co., Ltd. Method of laundering clothes and detergent composition therefor
WO2002092797A2 (en) 2001-05-15 2002-11-21 Novozymes A/S Alpha-amylase variant with altered properties
JP4346368B2 (ja) * 2002-08-02 2009-10-21 花王株式会社 組換え枯草菌
DE102004047776B4 (de) 2004-10-01 2018-05-09 Basf Se Gegen Di- und/oder Multimerisierung stabilisierte Alpha-Amylase-Varianten, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung
DK2132316T3 (da) 2007-03-23 2015-06-22 Danisco Us Inc Forøget amylaseproduktion ved n-terminal addition til modent amylaseprotein
JP5520828B2 (ja) 2007-11-05 2014-06-11 ダニスコ・ユーエス・インク 改変される特徴を有するバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ変異体
US7541026B2 (en) 2007-11-05 2009-06-02 Danisco Us Inc., Genencor Division Alpha-amylase variants with altered properties
RU2526516C2 (ru) 2008-02-04 2014-08-20 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Варианты альфа-амилазы ts-23 с измененными свойствами
BRPI0920891B1 (pt) 2008-09-25 2023-01-10 Danisco Us Inc Mistura de alfa-amilase e método para produção de um açúcar fermentável
MX2011010041A (es) 2009-04-01 2011-11-18 Danisco Us Inc Composiciones y metodos que comprenden variantes de alfa-amilasa con propiedades alteradas.
JP5735775B2 (ja) * 2009-10-21 2015-06-17 花王株式会社 改変プロモーター
CN102884183B (zh) 2010-01-04 2015-09-16 诺维信公司 趋于钙耗竭和酸性pH的α-淀粉酶的稳定化
EP2357220A1 (en) 2010-02-10 2011-08-17 The Procter & Gamble Company Cleaning composition comprising amylase variants with high stability in the presence of a chelating agent
JP6204352B2 (ja) 2011-06-30 2017-09-27 ノボザイムス アクティーゼルスカブ α−アミラーゼ変異体
EP2540824A1 (en) 2011-06-30 2013-01-02 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions comprising amylase variants reference to a sequence listing

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69433032T2 (de) 1993-05-19 2004-06-03 Kao Corp. VERFLÜSSIGENDE -[alpha]-AMYLASE, VERFAHREN ZU IHRER HERSTELLUNG, UND SIE ENTHALTENDE WASCHMITTELZUSAMMENSETZUNG
AR000862A1 (es) 1995-02-03 1997-08-06 Novozymes As Variantes de una ó-amilasa madre, un metodo para producir la misma, una estructura de adn y un vector de expresion, una celula transformada por dichaestructura de adn y vector, un aditivo para detergente, composicion detergente, una composicion para lavado de ropa y una composicion para la eliminacion del
ES2329528T3 (es) 1995-02-03 2009-11-26 Novozymes A/S Metodo para diseñar mutantes alfa-amilasa con propiedades determinadas.
BR9708887B1 (pt) * 1996-04-30 2014-10-29 Novozymes As "variante de uma alfa-amilase, uso da mesma, construção de dna, vetor de expressão recombinante, célula de bactéria ou fungo, aditivo e composição detergente".
WO1998005748A1 (en) 1996-08-01 1998-02-12 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising improved amylase for dingy fabric clean-up
US6486113B1 (en) 1997-03-31 2002-11-26 Kao Corporation Mutant α-amylases
US6204232B1 (en) * 1997-10-30 2001-03-20 Novo Nordisk A/S α-amlase mutants
JP3541697B2 (ja) * 1998-11-20 2004-07-14 ソニーケミカル株式会社 フレキシブル配線板の製造方法
JP2000184883A (ja) 1998-12-21 2000-07-04 Kao Corp 新規アミラーゼ
JP4077095B2 (ja) 1998-12-21 2008-04-16 花王株式会社 新規アミラーゼ
US6410295B1 (en) * 1999-03-30 2002-06-25 Novozymes A/S Alpha-amylase variants
US6309871B1 (en) * 1999-03-31 2001-10-30 Novozymes A/S Polypeptides having alkaline α-amylase activity
ATE422538T1 (de) 1999-03-31 2009-02-15 Novozymes As Polypeptide mit alkaliner alpha-amylase-aktivität und für diese kodierende nukleinsäuren
JP4417532B2 (ja) 1999-06-10 2010-02-17 花王株式会社 変異α−アミラーゼ
CN100523182C (zh) 1999-06-10 2009-08-05 花王株式会社 突变α-淀粉酶

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100396777C (zh) * 2005-10-28 2008-06-25 南开大学 一种嗜热碱性α-淀粉酶及其编码基因
CN105483099A (zh) * 2008-06-06 2016-04-13 丹尼斯科美国公司 具有改良特性的嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(AMYS)变体
CN105483099B (zh) * 2008-06-06 2020-06-23 丹尼斯科美国公司 具有改良特性的嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(AMYS)变体
CN112662734A (zh) * 2011-06-30 2021-04-16 诺维信公司 用于筛选α-淀粉酶的方法
CN113454214A (zh) * 2019-03-21 2021-09-28 诺维信公司 α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸

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