JP4417532B2 - 変異α−アミラーゼ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、優れた耐熱性を有し、特に洗剤用酵素として有用な変異液化型アルカリα−アミラーゼ及びその遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、α−アミラーゼ [EC.3.2.1.1]を洗剤用として利用する場合には、澱粉を高ランダムに分解でき、アルカリ性で安定で且つキレート成分、酸化漂白成分に対しても安定である液化型アルカリα−アミラーゼが好ましいとされている。しかしながら、液化型アミラーゼは一般に、酵素の構造維持にカルシウムイオンが重要であり、キレート剤の存在下ではその安定性が低下し、また作用至適pHに関しても中性ないし弱酸性領域であるものが殆どであった。
【０００３】
斯かる状況の下、本発明者らは、土壌中から分離した好アルカリ性Bacillus sp KSM-K38（FERM BP-6946）株及び同KSM-K36（FERM BP-6945）株の生産する酵素が、従来の液化型α−アミラーゼでは失活が認められる高い濃度のキレート剤によって全く活性の低下を示さず、更に界面活性剤や酸化剤に対する耐性を有していること、また、従来の液化型α−アミラーゼに比べて、アルカリ側で高い活性を有し洗剤用として有用であることを見出している(特願平１０−３６２４８７号)。
【０００４】
しかし、当該酵素は５０℃以上の温度では失活を示すことから、衣料や食器の洗浄が１０〜６０℃付近で行うのが一般的あることを考えるとその耐熱性がやや不十分であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アルカリ側で高い活性を有し、キレート成分、酸化漂白成分に対しても安定である液化型アルカリα−アミラーゼであって、且つ優れた耐熱性を有するα−アミラーゼを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、液化型アルカリα−アミラーゼについて種々の変異酵素を取得、検討した結果、ＫＳＭ−Ｋ３８由来アミラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）の特定のアミノ酸残基に変異を与えることにより、キレート剤耐性や酸化剤耐性の特性及びアルカリ領域に於ける高い比活性を失うことなく耐熱性が向上すること、またこれらの変異を組み合わせることによって更なる耐熱化が可能であることを見出した。
【０００７】
即ち、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有するα−アミラーゼにおいて、該アミノ酸配列の１１番目のＴｙｒ、１６番目のＧｌｕ、４９番目のＡｓｎ、８４番目のＧｌｕ、１４４番目のＳｅｒ、１６７番目のＧｌｎ、１６９番目のＴｙｒ、１７８番目のＡｌａ、１８８番目のＧｌｕ、１９０番目のＡｓｎ、２０５番目のＨｉｓ及び２０９番目のＧｌｎのうちのいずれかに相当するアミノ酸残基の１残基以上を置換又は欠失させてなる変異α−アミラーゼを提供するものである。また本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有するα−アミラーゼにおいて、該アミノ酸配列のアミノ末端から１１〜１００アミノ酸残基に相当する配列を他の液化型α−アミラーゼの該アミノ酸配列に相当するアミノ酸配列に置換させてなる変異α−アミラーゼを提供するものである。
【０００８】
また本発明は、これらの変異α−アミラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を有するベクター、該ベクターで形質転換された細胞、該形質転換細胞を培養することを特徴とするこれらの変異α−アミラーゼの製造方法を提供するものである。
更に本発明は、これらの変異α−アミラーゼを含有する洗浄剤組成物を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の変異α−アミラーゼは、配列番号１に示したアミノ酸配列又は該配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する液化型アルカリα−アミラーゼをコードする遺伝子を変異させて得られるものであるが、アミノ酸の欠失・置換により耐熱性を向上させた例は従来の液化型α−アミラーゼについても行われていた。例えば、B. amyloliquefaciens由来の酵素において１７７番目のＡｒｇから１７８番目のＧｌｙ残基を欠失させたもの（J. Biol. Chem., 264, 18933, 1989)、B. licheniformisの酵素において、１３３番目のＨｉｓをＴｙｒに置換したもの(J. Biol. Chem., 265, 15481, 1990)が報告されている。しかし、本発明で用いられる液化型アルカリα−アミラーゼは、従来の液化型α−アミラーゼとのアミノ酸配列同一性は低く、また上記の１７７番目のＡｒｇから１７８番目のＧｌｙ残基に相当する部位は既に欠失しており、また、１３３番目のＨｉｓ相当のアミノ酸は既にＴｙｒであり、従来酵素の例が必ずしも適用できるものではない。即ち、本発明における耐熱性を向上させるためのアミノ酸配列の変異はこれまでの例とは全く異なるものである。
【００１０】
当該液化型アルカリα−アミラーゼの例としては、本発明者らが土壌中から分離したBacillus sp. KSM-K38（FERM BP-6946）株由来であり、配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素（特願平１０−３６２４８７号）、或いは同KSM-K36(FERMBP-6945) 株由来であって配列番号１のアミノ酸配列と約９５％の配列同一性を有する酵素（配列番号４）（特願平１０−３６２４８７号）等が挙げられる。尚、アミノ酸配列の配列同一性はLipman-Pearson法（Science, 227, 1435, 1985）によって計算される。
【００１１】
本発明の変異α−アミラーゼの取得は、先ず液化型α−アミラーゼを生産する微生物より、当該液化型α−アミラーゼをコードする遺伝子をクローニングするが、その方法は、一般的な遺伝子組換え技術を用いれば良く、例えば、特開平８−３３６３９２号記載の方法を用いることができる。遺伝子の例としては、配列番号３及び配列番号５に示されるものが挙げられる。
【００１２】
次に得られた遺伝子に対して変異を与えるが、その方法としても一般的に行われている部位特異的変異の方法であればいずれも採用でき、例えば宝酒造社のSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット等を用いて行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ (polymerase chain reaction) 法 (PCR protocols, Academic press, New York, 1990)を用いることによって、遺伝子の任意の配列を他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。
【００１３】
本発明における耐熱化変異は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１１番目のＴｙｒに相当するアミノ酸残基をＰｈｅ、１６番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基をＰｒｏ、４９番目のＡｓｎに相当するアミノ酸残基をＳｅｒ、８４番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基をＧｌｎ、１４４番目のＳｅｒに相当するアミノ酸残基をＰｒｏ、１６７番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＧｌｕ、１６９番目のＴｙｒに相当するアミノ酸残基をＬｙｓ、１７８番目のＡｌａに相当するアミノ酸残基をＧｌｎ、１８８番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基をＡｓｐ、１９０番目のＡｓｎに相当するアミノ酸残基をＰｈｅ、２０５番目のＨｉｓに相当するアミノ酸残基をＡｒｇ又は２０９番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＶａｌに置換する変異が望ましい。
【００１４】
また、本発明の配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端（Ａｓｐ）から１１〜１００アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列、好ましくは、１番目のＡｓｐから１９番目のＧｌｙに相当する配列を、他の液化型α−アミラーゼの該アミノ酸配列に相当するアミノ酸配列に置換することによっても耐熱化を達成することができる。
【００１５】
置き換える他の液化型α−アミラーゼの例としては、例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する酵素が挙げられ、その配列の前記１番目のＡｓｐから１９番目のＧｌｙに相当する部位は１番目のＨｉｓから２１番目のＧｌｙである。当該酵素は、Bacillus sp. KSM-AP1378 (FERM BP-3048)株由来の液化型α−アミラーゼであり、その遺伝子配列は特開平８−３３６３９２号において開示されている。
【００１６】
本発明の変異α−アミラーゼにおいては、更に上記の各種アミノ酸残基の置換又は欠失及びアミノ酸配列の置換から選ばれる２種以上の置換又は欠失を組み合わせた変異も有効であり、組み合わせることにより、より耐熱性が向上した変異酵素を得ることができる。即ち、変異の組み合わせ方は、各種アミノ酸残基の置換又は欠失の２種以上を組み合わせたもの、アミノ酸配列の置換を２種以上組み合わせたもの及びアミノ酸残基の置換又は欠失とアミノ酸配列の置換を２種以上組み合わせたものが挙げられるが、好ましくは４９番目のＡｓｎに相当するアミノ酸残基をＳｅｒ、１６７番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＧｌｕ、１６９番目のＴｙｒに相当するアミノ酸残基をＬｙｓ、１９０番目のＡｓｎに相当するアミノ酸残基をＰｈｅ、２０５番目のＨｉｓに相当するアミノ酸残基をＡｒｇ若しくは２０９番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＶａｌに置換する変異、又は１番目のＡｓｐから１９番目のＧｌｙまでに相当する配列を配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目のＨｉｓから２１番目のＧｌｙまでのアミノ酸配列に置換する変異のうちいずれか２種以上の変異を適宜組み合わせるとよい。
【００１７】
更に、最適な組み合わせの例としては、４９番目のＡｓｎに相当するアミノ酸残基をＳｅｒ、１６７番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＧｌｕ、１６９番目のＴｙｒに相当するアミノ酸残基をＬｙｓ、１９０番目のＡｓｎに相当するアミノ酸残基をＰｈｅ、２０５番目のＨｉｓに相当するアミノ酸残基をＡｒｇ及び２０９番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＶａｌに置換する変異の組み合わせ、或いは１番目のＡｓｐから１９番目のＧｌｙまでに相当する配列を配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目のＨｉｓから２１番目のＧｌｙまでのアミノ酸配列に置換する変異と、１６７番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＧｌｕ、１６９番目のＴｙｒに相当するアミノ酸残基をＬｙｓ、１９０番目のＡｓｎに相当するアミノ酸残基をＰｈｅ、２０９番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＶａｌに置換する変異の組み合わせ等が挙げられる。
【００１８】
また、上記の変異に、耐熱性以外の特性を改良する変異、例えば、酸化剤耐性をより強化する１０７番目のＭｅｔに相当するアミノ酸残基をＬｅｕに置換する変異、更に衣料用洗剤における洗浄力を増強させる１８８番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基をＩｌｅに置換する変異等を組み合わせることも可能である。
【００１９】
かくして得られる本発明の変異α−アミラーゼは、高いキレート剤耐性の優れた特性及びアルカリ領域に於ける高い比活性を失うことなく、熱に対する安定性が向上することから、自動食器洗浄機用洗浄剤、衣料用洗浄剤、繊維糊抜き剤として有用である。洗浄剤組成物中の本発明変異α−アミラーゼの含有量は、０．００１〜１０重量％、特に０．０１〜５重量％が好ましい。
【００２０】
当該洗浄剤には、上記変異α−アミラーゼ以外に、更に枝切り酵素（例えばプルラナーゼ、イソアミラーゼ、ネオプルラナーゼなど）、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、プロトペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、パーオキシダーゼ、ラッカーゼ及びカタラーゼから選ばれる１種または２種以上の酵素を含有させることができる。
【００２１】
また、洗浄剤には洗浄成分としてアニオン界面活性剤、両性界面活性剤、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤等の界面活性剤を１〜９０重量％含有させることができる。また、キレート剤、アルカリ剤、無機塩、再汚染防止剤、塩素捕捉剤、還元剤、漂白剤、蛍光染料可溶化剤、香料、ケーキング防止剤、酵素の活性化剤、酸化防止剤、防腐剤、色素、青味付け剤、漂白活性化剤、酵素安定化剤、調節剤等を含有させることができる。
【００２２】
本発明の洗浄剤組成物は、上記変異α−アミラーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い、製造することができる。洗浄剤の形態は、用途に応じて選択することができ、例えば、液体、粉末、顆粒等にすることができる。また、本発明洗浄剤組成物は、衣料用洗浄剤、漂白洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、配水管洗浄剤、義歯洗浄剤等として使用できるが、特に衣料用洗浄剤、漂白洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤として好適に使用することができる。
【００２３】
また、本発明の変異α−アミラーゼは、澱粉液化・糖化用組成物として用いることができ、更にグルコアミラーゼ、マルターゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、ネオプルラナーゼ、などから選ばれる１種または２種以上の酵素を配合し、変異α−アミラーゼとともに澱粉に作用させることもできる。
【００２４】
更に、本発明の変異α−アミラーゼは、繊維の糊抜き剤組成物として用いることができ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ或いはネオプルラナーゼ等の酵素を共に含有させることもできる。
【００２５】
【実施例】
アミラーゼ活性及びタンパク質量の測定
各酵素のアミラーゼ活性及びタンパク質量は以下に示す方法で行った。
アミラーゼ活性測定は、３，５−ジニトロサリチル酸法（ＤＮＳ法）で測定した。５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ１０）中に可溶性澱粉を含む反応液中、５０℃で１５分間の反応を行った後、生成した還元糖をＤＮＳ法で定量することによって測定した。酵素の力価は１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。
蛋白量の測定は、牛血清アルブミンを標準として、Bio-Rad社のProtein Assay
キットを用いて定量した。
【００２６】
参考例１ アルカリ液化型アミラーゼのスクリーニング
土壌約０．５ｇを滅菌水に懸濁し、８０℃で１５分間加熱処理した。この熱処理液の上清を適当に滅菌水で希釈して、分離用寒天培地（培地Ａ）に塗布した。次いで、これを３０℃で２日間培養し、集落を形成させた。集落の周囲に澱粉溶解に基づく透明帯を形成するものを選出し、これをアミラーゼ生産菌として分離した。更に、分離菌を培地Ｂに接種し、３０℃で２日間好気的に振盪培養した。培養後、遠心分離した上清液について、キレート剤（ＥＤＴＡ）耐性能を測定し、更に最適作用pHを測定して、本発明のアルカリ液化型アミラーゼ生産菌をスクリーニングした。
【００２７】
上述の方法により、Bacillus sp.KSM-K38（FERM BP-6946）株及びBacillus sp. KSM-K36（FERM BP-6945）株を取得することができた。
【００２８】
ＫＳＭ−Ｋ３８株及びＫＳＭ−Ｋ３６株の菌学的性質を表１に示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】
参考例２ ＫＳＭ−Ｋ３８株及びＫＳＭ−Ｋ３６株の培養
参考例１の液体培地Ｂに、ＫＳＭ−Ｋ３８株あるいはＫＳＭ−Ｋ３６株を接種し、３０℃で２日間好気的に振盪培養した。遠心分離上清についてアミラーゼ活性（ｐＨ８．５）を測定した結果、培養液１Ｌ当たり、それぞれ５５７Ｕ及び１１７７Ｕの活性を有していた。
【００３１】
参考例３ アルカリ液化型アミラーゼの精製
参考例２で得られたＫＳＭ−Ｋ３８株の培養上清液に８０％飽和濃度になるように硫酸アンモニウムを加えて撹拌後、生成した沈殿を回収し、２ｍＭ ＣａＣｌ2を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、同緩衝液に対して一晩透析した。得られた透析内液を同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラムに添着し、同緩衝液を用いて０−１Ｍの食塩の濃度勾配によりタンパクを溶出した。活性画分を同緩衝液にて透析後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより得た活性画分を上記緩衝液にて透析することによってポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度１０％）及びソディウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）電気泳動で単一のバンドを与える精製酵素を得ることができた。尚、ＫＳＭ−Ｋ３６株の培養上清液からも同様の方法で精製酵素を得ることができた。
【００３２】
参考例４ 酵素特性
両精製酵素の特性は以下の通りである。
（１）作用
いずれも、澱粉、アミロース、アミロペクチン及びそれらの部分分解物のα−１，４グルコシド結合を分解し、アミロースからはグルコース（Ｇ１）、マルトース（Ｇ２）、マルトトリオース（Ｇ３）、マルトテトラオース（Ｇ４）、マルトペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ６）及びマルトヘプタオース（Ｇ７）を生成する。ただしプルランには作用しない。
（２）pH安定性（ブリットン−ロビンソン緩衝液）
いずれも、４０℃、３０分間処理条件下で、ｐＨ６．５〜１１．０の範囲で７０％以上の残存活性を示す。
（３）作用温度範囲及び最適作用温度
いずれも、２０〜８０℃の広範囲で作用し、最適作用温度は５０〜６０℃である。
（４）温度安定性
５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）中にて温度を変化させ、各温度で３０分間処理することにより失活の条件を調べると、いずれも４０℃で８０％以上の残存活性を示し、４５℃でも約６０％の残存活性を示した。
（５）分子量
いずれも、ソディウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した分子量は５５，０００±５，０００である。
（６）等電点
いずれも、等電点電気泳動法により測定した等電点は４．２付近である。
【００３３】
（７）界面活性剤の影響
直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、α−スルホン化脂肪酸エステルナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウム、ＳＤＳ、石鹸及びソフタノール等の各種界面活性剤０．１％溶液中で、ｐＨ１０、３０℃で３０分間処理しても、いずれも殆ど活性阻害を受けない（活性残存率９０％以上）。
（８）金属塩の影響
各種金属塩と共存させて、ｐＨ１０、３０℃で３０分間処理してその影響を調べた。
Ｋ３８は、１ｍＭのＭｎ2+により阻害され（阻害率約７５％）、１ｍＭのＳｒ2+及びＣｄ2+により若干阻害される（阻害率約３０％）。
Ｋ３６は、１ｍＭのＭｎ2+により阻害され（阻害率約９５％）、１mMのＨｇ2+、Ｂｅ2+及びＣｄ2+により若干阻害される（阻害率３０〜４０％）。
【００３４】
実施例１ 液化型α−アミラーゼ遺伝子のクローニング
ＫＳＭ−Ｋ３８株の菌体からSaitoとMiuraの方法（Biochim. Biophys. Acta, 72, 619, 1961）の方法によって抽出した染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーＫ３８ＵＳ（配列番号１９）及びＫ３８ＤＨ（配列番号２０）を用いて、ＰＣＲ反応によって配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する液化型アルカリα−アミラーゼ（以下Ｋ３８ＡＭＹと記載）をコードする遺伝子断片（約１．５ｋｂ）を増幅した。これを制限酵素ＳａｌＩによって切断後、発現ベクターｐＨＳＰ６４（特開平６−２１７７８１）のＳａｌＩ−ＳｍａＩ部位に挿入することによって、ｐＨＳＰ６４に含まれるBacillus sp. KSM-64 (FERM P-10482)株のアルカリセルラーゼ遺伝子に由来する強力プロモーターの下流に、Ｋ３８ＡＭＹの構造遺伝子が結合した組換えプラスミドｐＨＳＰ−Ｋ３８を構築した（図１）。
また、同様にBacillus sp. KSM-AP1378 (FERM BP-3048)株（特開平９−３３６３９２）から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーＬＡＵＳ（配列番号２１）とＬＡＤＨ（配列番号２２）を用いたＰＣＲ反応によって増幅した配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する液化型α−アミラーゼ（以下，ＬＡＭＹと記載）をコードする遺伝子断片（約１．５ｋｂ）を、上記と同様に発現ベクターｐＨＳＰ６４のＳａｌＩ−ＳｍａＩ部位に挿入することによって、組換えプラスミドｐＨＳＰ−ＬＡＭＹを構築した（図１）。
【００３５】
実施例２ 変異Ｋ３８ＡＭＹ遺伝子の調製−１
部位特異的変異には宝酒造社のSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキットを用いた。まず、実施例１で得られた組換えプラスミドｐＨＳＰ−Ｋ３８を鋳型とし、プライマーＣＬＵＢＧ（配列番号２３）及びＫ３８ＤＨ（配列番号２０）を用いてＰＣＲ反応を行うことによって、ＫＳＭ−６４株由来の強力プロモーターの上流から液化型アルカリα−アミラーゼ遺伝子の下流までの約２．１ｋｂの断片を増幅させ、これを上記キットに付属のプラスミドベクターｐＫＦ１９ｋのＳｍａＩ部位に挿入し、変異導入用組換えプラスミドｐＫＦ１９−Ｋ３８を構築した（図２）。
【００３６】
次に、配列番号６〜１５に示した各種の部位特異的変異導入用オリゴヌクレオチドプライマーをＴ４ＤＮＡキナーゼによって５’リン酸化した後、これと上記のｐＫＦ１９−Ｋ３８を用いて、キットの方法に従って変異導入反応を行い、反応産物によって大腸菌ＭＶ１１８４株（コンピテントセルＭＶ１１８４、宝酒造社製）の形質転換を行った。この結果得られた形質転換体から組換えプラスミドを抽出し、塩基配列の解析を行って変異の確認を行った。
【００３７】
また、変異導入した遺伝子は、上記と同様にして、発現プロモーター領域と変異Ｋ３８ＡＭＹ遺伝子部分を再度ｐＫＦ１９ｋのＳｍａＩ部位に挿入することにより、異なる変異を導入する際の鋳型プラスミドとなり、上記と同様の方法によって更に別の変異を導入した。
【００３８】
得られた各変異組換えプラスミドを鋳型とし、プライマーＣＬＵＢＧ（配列番号２３）とＫ３８ＤＨ（配列番号２０）を用いてＰＣＲ反応を行うことによって、各変異Ｋ３８ＡＭＹ遺伝子断片を増幅させ、これをＳａｌＩによって切断した後、発現ベクターｐＨＳＰ６４（特開平６−２１７７８１）のＳａｌＩ−ＳｍａＩ部位に挿入して、変異Ｋ３８ＡＭＹ生産用プラスミドを構築した（図１）。
【００３９】
実施例３ 変異Ｋ３８ＡＭＹ遺伝子の調製−２（ＬＡＭＹ遺伝子とのキメラ）
Ｋ３８ＡＭＹ遺伝子のＮ末領域をＬＡＭＹ遺伝子の相当する領域と置換する変異にはリコンビナントＰＣＲ法を用いた（図３）。まず、実施例１で得られた組換えプラスミドｐＨＳＰ−Ｋ３８を鋳型とし、プライマーＫ３８ＤＨ（配列番号２０）及びＬＡ−Ｋ３８（配列番号１７）を用いてＰＣＲ反応を行うことによって、配列番号１に示されるＫ３８ＡＭＹのアミノ酸配列のＧｌｎ２０からＣ末下流までの配列をコードする断片を増幅した。一方、組換えプラスミドｐＨＳＰ−ＬＡＭＹを鋳型とし、プライマーＣＬＵＢＧ（配列番号２３）とＬＡ−Ｋ３８Ｒ（配列番号１８）を用いたＰＣＲ反応によって、強力プロモーターの上流から、配列番号２のＬＡＭＹのアミノ酸配列の２１番目のＧｌｙまでをコードする遺伝子断片を増幅させた。次に、得られた両ＤＮＡ断片とプライマーＣＬＵＢＧ（配列番号２３）とＫ３８ＤＨ（配列番号２０）を用いた２回目のＰＣＲ反応を行うことによって、末端にプライマーＬＡ−Ｋ３８（配列番号１７）及びＬＡ−Ｋ３８Ｒ（配列番号１８）に由来する相補的な配列を持つ両断片が結合し、強力プロモーターの下流にＬＡＭＹの１番目のＨｉｓから２１番目のＧｌｙまでをコードする領域に続いてＫ３８ＡＭＹのＧｌｎ２０以降Ｃ末までをコードする領域が結合した置換変異酵素（ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹと略する）をコードする遺伝子断片（約２．１ｋｂ）が増幅された。これをＳａｌＩによって切断した後、発現ベクターｐＨＳＰ６４（特開平６−２１７７８１）のＳａｌＩ−ＳｍａＩ部位に挿入して、変異Ｋ３８ＡＭＹ生産用プラスミドを構築した（図１）。
【００４０】
実施例４ 変異液化型アルカリα−アミラーゼの生産
実施例２及び３で得られた各種変異Ｋ３８ＡＭＹ生産用プラスミドをプロトプラスト法 (Mol. Gen. Genet., 168, 111, 1979)により枯草菌ＩＳＷ１２１４株（leuA metB5 hsdM1）に導入し、得られた組換え枯草菌を液体培地（コーンスティープリカー、８％；肉エキス、１％；リン酸１カリウム、０．０２％；マルトース、５％；塩化カルシウム、５ｍＭ；テトラサイクリン、１５μｇ／ｍＬ）で３０℃で３日間培養した。得られた培養上清液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）にて透析し、同緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラムに吸着させ、塩化ナトリウムの濃度勾配で溶出させた。この溶出液を１０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ１０．０）にて透析することにより、各変異Ｋ３８ＡＭＹの精製酵素を得た。
【００４１】
実施例５ 耐熱性の検定−１
実施例１、２、４に記載の方法により、配列番号１における１１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換した酵素（Ｙ１１Ｆと略する）、４９番目のＡｓｎをＳｅｒに置換した酵素（Ｎ４９Ｓと略する）、８４番目のＧｌｕをＧｌｎに置換した酵素（Ｅ８４Ｑと略する）、１４４番目のＳｅｒをＰｒｏに置換した酵素（Ｓ１４４Ｐと略する）、１６７番目のＧｌｎをＧｌｕに置換した酵素（Ｑ１６７Ｅと略する）、１６９番目のＴｙｒをＬｙｓに置換した酵素（Ｙ１６９Ｋと略する）、１７８番目のＡｌａをＧｌｎに置換した酵素（Ａ１７８Ｑと略する）、１８８番目のＧｌｕをＡｓｐに置換した酵素（Ｅ１８８Ｄと略する）、１９０番目のＡｓｎをＰｈｅに置換した酵素（Ｎ１９０Ｆと略する）、及び２０９番目のＧｌｎをＶａｌに置換した酵素（Ｑ２０９Ｖと略する）の精製標品を取得し、次に示す手法で耐熱性を検定した。対照として野生型Ｋ３８ＡＭＹを用いた。
【００４２】
あらかじめ５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ１０．０）を５０℃にてプレインキュベートした中に、約１．２Ｕ／ｍＬとなるよう酵素を添加後、３０分後にサンプリングし、上記実施例に示す方法で残存するアミラーゼ活性を測定した。それぞれのスタート時の活性を１００％として相対活性を求め、アミラーゼ残存活性とした。結果を表２に示したが、野生型Ｋ３８ＡＭＹでは３０分後の残存活性が、１５％まで減少したことに対し、いずれの変異酵素も野生型に比べて高い残存活性を示した。
【００４３】
【表２】
【００４４】
実施例６ 耐熱性の検定−２
実施例５に示した変異のうち、Ｑ１６７Ｅ、Ｙ１６９Ｋ、Ｎ１９０Ｆ及びＱ２０９Ｖを次の様に組み合わせた変異酵素を実施例１、２、４に記載の方法により作製した。
Ｑ１６７Ｅ／Ｙ１６９Ｋ（配列番号１６のプライマー使用、ＱＥＹＫと略する）Ｎ１９０Ｆ／Ｑ２０９Ｖ（ＮＦＱＶと略する）
Ｑ１６７Ｅ／Ｙ１６９Ｋ／Ｎ１９０Ｆ／Ｑ２０９Ｖ（ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶと略する）
【００４５】
これらについて実施例５と同様の手法により耐熱性を検定した。ただし、熱処理の温度は５５℃とし、対照として、Ｑ１６７Ｅ、Ｙ１６９Ｋ、Ｎ１９０Ｆ及びＱ２０９Ｖを用いた。この結果、表３に示した様に、いずれの変異も、組み合わせによる耐熱性の向上が認められ、４種類の変異を組み合わせたＱＥＹＫ／ＮＦＱＶは５５℃においても３０分後に８５％の残存活性を示した。
【００４６】
【表３】
【００４７】
実施例７ 耐熱性の検定−３
実施例６に示した変異ＮＦＱＶに、実施例５で示した変異とＳ１４４Ｐを組み合わせた変異酵素、更にこれに１６番目のＧｌｕをＰｒｏに置換する変異（Ｅ１６Ｐと略する）と組み合せた変異酵素を実施例１、２、４に記載の方法により作製した。
Ｓ１４４Ｐ／ＮＦＱＶ（ＳＰ／ＮＦＱＶと略する）
Ｅ１６Ｐ／Ｓ１４４Ｐ／ＮＦＱＶ（ＥＰＳＰ／ＮＦＱＶと略する）
これらについて実施例５と同様の手法（５０℃）により耐熱性を検定した。
この結果、表４に示した様に、ＳＰ／ＮＦＱＶに対してＥ１６Ｐを組み合わせることで耐熱性の向上が認められた。
【００４８】
【表４】
【００４９】
実施例８ 耐熱性の検定−４
実施例４に示した変異のうちＱＥＹＫ／ＮＦＱＶに、配列番号１における１０７番目のＭｅｔをＬｅｕに置換した変異（Ｍ１０７Ｌと略する）、２０５番目のＨｉｓをＡｒｇに置換した変異（Ｈ２０５Ｒと略する）及び実施例３で示した変異のうちＮ４９Ｓを組み合わせた次のような変異酵素を実施例１、２、４に記載の方法により作製した。
Ｍ１０７Ｌ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶ（ＭＬ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶと略する）
Ｎ４９Ｓ／Ｍ１０７Ｌ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶ（ＮＳＭＬ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶと略する）
Ｎ４９Ｓ／Ｍ１０７Ｌ／Ｈ２０５Ｒ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶ（ＮＳＭＬＨＲ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶと略する）
これらについて実施例５と同様の手法により耐熱性を検定した。ただし、熱処理の温度は６０℃とした。
この結果、ＭＬ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶにＮ４９Ｓ、更にはＨ２０５Ｒを組み合わせることによって耐熱性は相加的に向上し、ＮＳＭＬＨＲ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶは６０℃においても３０分後に７５％の残存活性を示した（表５）。
【００５０】
【表５】
【００５１】
実施例９ 耐熱性の検定−５
実施例１、３、４に示した方法によって、Ｋ３８ＡＭＹのＡｓｐ１から１９番目のＧｌｙまでの配列がＬＡＭＹの１番目のＨｉｓから２１番目のＧｌｙまでの配列と置換した変異酵素ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹを取得した。この酵素の耐熱性を実施例５の方法によって検定した結果、表６に示した様に、置換による耐熱性の向上が認められた。
【００５２】
【表６】
【００５３】
実施例１０ 耐熱性の検定−６
実施例６に示した変異酵素ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶの遺伝子について、実施例１及び３と同様の方法により、１番目のＡｓｐから１９番目のＧｌｙまでの配列がＬＡＭＹの１番目のＨｉｓから２１番目のＧｌｙまでの配列と置換する変異を導入した。この遺伝子を用いて実施例４の方法により得られた変異酵素ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶについて実施例８と同様の手法により耐熱性を検定した（熱処理は６０℃）。
この結果、組み合わせによって耐熱性は相加的に向上し、ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶは６０℃に於いても３０分後に６３％の残存活性を示した（表７）。
【００５４】
【表７】
【００５５】
実施例１１ 自動食器洗浄機用洗浄剤組成物
表８に示す配合で自動食器洗浄機用洗浄剤組成物を製造し、本洗浄剤に各変異酵素を配合して洗浄試験を行った。この結果、同一活性値の酵素を添加した場合、変異酵素は野生型酵素と比較して優れた洗浄効果を示した。
【００５６】
【表８】
【００５７】
【発明の効果】
本発明の変異α−アミラーゼは、高いキレート剤耐性の優れた特性及びアルカリ領域における高い比活性を有し、更に熱に対する優れた安定性を有する。従って、自動食器洗浄機用洗浄剤、衣料用洗浄剤、澱粉液化、糖化用組成物、繊維糊抜き剤として有用である。
【００５８】
【配列表】
【００５９】
【００６０】
【００６１】
【００６２】
【００６３】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【００６７】
【００６８】
【００６９】
【００７０】
【００７１】
【００７２】
【００７３】
【００７４】
【００７５】
【００７６】
【００７７】
【００７８】
【００７９】
【００８０】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＫＳＭ−Ｋ３８株及びＫＳＭ−ＡＰ１３７８株由来のα−アミラーゼ生産用組換えプラスミドの構築方法を示す図である。
【図２】 ＫＳＭ−Ｋ３８株由来のα−アミラーゼ遺伝子の変異導入方法を示す模式図である。
【図３】 ＫＳＭ−Ｋ３８株由来のα−アミラーゼ遺伝子のＮ末配列をＫＳＭ−ＡＰ１３７８株由来のα−アミラーゼ遺伝子のＮ末領域と置換する方法を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、優れた耐熱性を有し、特に洗剤用酵素として有用な変異液化型アルカリα−アミラーゼ及びその遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、α−アミラーゼ [EC.3.2.1.1]を洗剤用として利用する場合には、澱粉を高ランダムに分解でき、アルカリ性で安定で且つキレート成分、酸化漂白成分に対しても安定である液化型アルカリα−アミラーゼが好ましいとされている。しかしながら、液化型アミラーゼは一般に、酵素の構造維持にカルシウムイオンが重要であり、キレート剤の存在下ではその安定性が低下し、また作用至適pHに関しても中性ないし弱酸性領域であるものが殆どであった。
【０００３】
斯かる状況の下、本発明者らは、土壌中から分離した好アルカリ性Bacillus sp KSM-K38（FERM BP-6946）株及び同KSM-K36（FERM BP-6945）株の生産する酵素が、従来の液化型α−アミラーゼでは失活が認められる高い濃度のキレート剤によって全く活性の低下を示さず、更に界面活性剤や酸化剤に対する耐性を有していること、また、従来の液化型α−アミラーゼに比べて、アルカリ側で高い活性を有し洗剤用として有用であることを見出している(特願平１０−３６２４８７号)。
【０００４】
しかし、当該酵素は５０℃以上の温度では失活を示すことから、衣料や食器の洗浄が１０〜６０℃付近で行うのが一般的あることを考えるとその耐熱性がやや不十分であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アルカリ側で高い活性を有し、キレート成分、酸化漂白成分に対しても安定である液化型アルカリα−アミラーゼであって、且つ優れた耐熱性を有するα−アミラーゼを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、液化型アルカリα−アミラーゼについて種々の変異酵素を取得、検討した結果、ＫＳＭ−Ｋ３８由来アミラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）の特定のアミノ酸残基に変異を与えることにより、キレート剤耐性や酸化剤耐性の特性及びアルカリ領域に於ける高い比活性を失うことなく耐熱性が向上すること、またこれらの変異を組み合わせることによって更なる耐熱化が可能であることを見出した。
【０００７】
即ち、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有するα−アミラーゼにおいて、該アミノ酸配列の１１番目のＴｙｒ、１６番目のＧｌｕ、４９番目のＡｓｎ、８４番目のＧｌｕ、１４４番目のＳｅｒ、１６７番目のＧｌｎ、１６９番目のＴｙｒ、１７８番目のＡｌａ、１８８番目のＧｌｕ、１９０番目のＡｓｎ、２０５番目のＨｉｓ及び２０９番目のＧｌｎのうちのいずれかに相当するアミノ酸残基の１残基以上を置換又は欠失させてなる変異α−アミラーゼを提供するものである。また本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有するα−アミラーゼにおいて、該アミノ酸配列のアミノ末端から１１〜１００アミノ酸残基に相当する配列を他の液化型α−アミラーゼの該アミノ酸配列に相当するアミノ酸配列に置換させてなる変異α−アミラーゼを提供するものである。
【０００８】
また本発明は、これらの変異α−アミラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を有するベクター、該ベクターで形質転換された細胞、該形質転換細胞を培養することを特徴とするこれらの変異α−アミラーゼの製造方法を提供するものである。
更に本発明は、これらの変異α−アミラーゼを含有する洗浄剤組成物を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の変異α−アミラーゼは、配列番号１に示したアミノ酸配列又は該配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する液化型アルカリα−アミラーゼをコードする遺伝子を変異させて得られるものであるが、アミノ酸の欠失・置換により耐熱性を向上させた例は従来の液化型α−アミラーゼについても行われていた。例えば、B. amyloliquefaciens由来の酵素において１７７番目のＡｒｇから１７８番目のＧｌｙ残基を欠失させたもの（J. Biol. Chem., 264, 18933, 1989)、B. licheniformisの酵素において、１３３番目のＨｉｓをＴｙｒに置換したもの(J. Biol. Chem., 265, 15481, 1990)が報告されている。しかし、本発明で用いられる液化型アルカリα−アミラーゼは、従来の液化型α−アミラーゼとのアミノ酸配列同一性は低く、また上記の１７７番目のＡｒｇから１７８番目のＧｌｙ残基に相当する部位は既に欠失しており、また、１３３番目のＨｉｓ相当のアミノ酸は既にＴｙｒであり、従来酵素の例が必ずしも適用できるものではない。即ち、本発明における耐熱性を向上させるためのアミノ酸配列の変異はこれまでの例とは全く異なるものである。
【００１０】
当該液化型アルカリα−アミラーゼの例としては、本発明者らが土壌中から分離したBacillus sp. KSM-K38（FERM BP-6946）株由来であり、配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素（特願平１０−３６２４８７号）、或いは同KSM-K36(FERMBP-6945) 株由来であって配列番号１のアミノ酸配列と約９５％の配列同一性を有する酵素（配列番号４）（特願平１０−３６２４８７号）等が挙げられる。尚、アミノ酸配列の配列同一性はLipman-Pearson法（Science, 227, 1435, 1985）によって計算される。
【００１１】
本発明の変異α−アミラーゼの取得は、先ず液化型α−アミラーゼを生産する微生物より、当該液化型α−アミラーゼをコードする遺伝子をクローニングするが、その方法は、一般的な遺伝子組換え技術を用いれば良く、例えば、特開平８−３３６３９２号記載の方法を用いることができる。遺伝子の例としては、配列番号３及び配列番号５に示されるものが挙げられる。
【００１２】
次に得られた遺伝子に対して変異を与えるが、その方法としても一般的に行われている部位特異的変異の方法であればいずれも採用でき、例えば宝酒造社のSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット等を用いて行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ (polymerase chain reaction) 法 (PCR protocols, Academic press, New York, 1990)を用いることによって、遺伝子の任意の配列を他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。
【００１３】
本発明における耐熱化変異は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１１番目のＴｙｒに相当するアミノ酸残基をＰｈｅ、１６番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基をＰｒｏ、４９番目のＡｓｎに相当するアミノ酸残基をＳｅｒ、８４番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基をＧｌｎ、１４４番目のＳｅｒに相当するアミノ酸残基をＰｒｏ、１６７番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＧｌｕ、１６９番目のＴｙｒに相当するアミノ酸残基をＬｙｓ、１７８番目のＡｌａに相当するアミノ酸残基をＧｌｎ、１８８番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基をＡｓｐ、１９０番目のＡｓｎに相当するアミノ酸残基をＰｈｅ、２０５番目のＨｉｓに相当するアミノ酸残基をＡｒｇ又は２０９番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＶａｌに置換する変異が望ましい。
【００１４】
また、本発明の配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端（Ａｓｐ）から１１〜１００アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列、好ましくは、１番目のＡｓｐから１９番目のＧｌｙに相当する配列を、他の液化型α−アミラーゼの該アミノ酸配列に相当するアミノ酸配列に置換することによっても耐熱化を達成することができる。
【００１５】
置き換える他の液化型α−アミラーゼの例としては、例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する酵素が挙げられ、その配列の前記１番目のＡｓｐから１９番目のＧｌｙに相当する部位は１番目のＨｉｓから２１番目のＧｌｙである。当該酵素は、Bacillus sp. KSM-AP1378 (FERM BP-3048)株由来の液化型α−アミラーゼであり、その遺伝子配列は特開平８−３３６３９２号において開示されている。
【００１６】
本発明の変異α−アミラーゼにおいては、更に上記の各種アミノ酸残基の置換又は欠失及びアミノ酸配列の置換から選ばれる２種以上の置換又は欠失を組み合わせた変異も有効であり、組み合わせることにより、より耐熱性が向上した変異酵素を得ることができる。即ち、変異の組み合わせ方は、各種アミノ酸残基の置換又は欠失の２種以上を組み合わせたもの、アミノ酸配列の置換を２種以上組み合わせたもの及びアミノ酸残基の置換又は欠失とアミノ酸配列の置換を２種以上組み合わせたものが挙げられるが、好ましくは４９番目のＡｓｎに相当するアミノ酸残基をＳｅｒ、１６７番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＧｌｕ、１６９番目のＴｙｒに相当するアミノ酸残基をＬｙｓ、１９０番目のＡｓｎに相当するアミノ酸残基をＰｈｅ、２０５番目のＨｉｓに相当するアミノ酸残基をＡｒｇ若しくは２０９番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＶａｌに置換する変異、又は１番目のＡｓｐから１９番目のＧｌｙまでに相当する配列を配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目のＨｉｓから２１番目のＧｌｙまでのアミノ酸配列に置換する変異のうちいずれか２種以上の変異を適宜組み合わせるとよい。
【００１７】
更に、最適な組み合わせの例としては、４９番目のＡｓｎに相当するアミノ酸残基をＳｅｒ、１６７番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＧｌｕ、１６９番目のＴｙｒに相当するアミノ酸残基をＬｙｓ、１９０番目のＡｓｎに相当するアミノ酸残基をＰｈｅ、２０５番目のＨｉｓに相当するアミノ酸残基をＡｒｇ及び２０９番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＶａｌに置換する変異の組み合わせ、或いは１番目のＡｓｐから１９番目のＧｌｙまでに相当する配列を配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目のＨｉｓから２１番目のＧｌｙまでのアミノ酸配列に置換する変異と、１６７番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＧｌｕ、１６９番目のＴｙｒに相当するアミノ酸残基をＬｙｓ、１９０番目のＡｓｎに相当するアミノ酸残基をＰｈｅ、２０９番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＶａｌに置換する変異の組み合わせ等が挙げられる。
【００１８】
また、上記の変異に、耐熱性以外の特性を改良する変異、例えば、酸化剤耐性をより強化する１０７番目のＭｅｔに相当するアミノ酸残基をＬｅｕに置換する変異、更に衣料用洗剤における洗浄力を増強させる１８８番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基をＩｌｅに置換する変異等を組み合わせることも可能である。
【００１９】
かくして得られる本発明の変異α−アミラーゼは、高いキレート剤耐性の優れた特性及びアルカリ領域に於ける高い比活性を失うことなく、熱に対する安定性が向上することから、自動食器洗浄機用洗浄剤、衣料用洗浄剤、繊維糊抜き剤として有用である。洗浄剤組成物中の本発明変異α−アミラーゼの含有量は、０．００１〜１０重量％、特に０．０１〜５重量％が好ましい。
【００２０】
当該洗浄剤には、上記変異α−アミラーゼ以外に、更に枝切り酵素（例えばプルラナーゼ、イソアミラーゼ、ネオプルラナーゼなど）、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、プロトペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、パーオキシダーゼ、ラッカーゼ及びカタラーゼから選ばれる１種または２種以上の酵素を含有させることができる。
【００２１】
また、洗浄剤には洗浄成分としてアニオン界面活性剤、両性界面活性剤、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤等の界面活性剤を１〜９０重量％含有させることができる。また、キレート剤、アルカリ剤、無機塩、再汚染防止剤、塩素捕捉剤、還元剤、漂白剤、蛍光染料可溶化剤、香料、ケーキング防止剤、酵素の活性化剤、酸化防止剤、防腐剤、色素、青味付け剤、漂白活性化剤、酵素安定化剤、調節剤等を含有させることができる。
【００２２】
本発明の洗浄剤組成物は、上記変異α−アミラーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い、製造することができる。洗浄剤の形態は、用途に応じて選択することができ、例えば、液体、粉末、顆粒等にすることができる。また、本発明洗浄剤組成物は、衣料用洗浄剤、漂白洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、配水管洗浄剤、義歯洗浄剤等として使用できるが、特に衣料用洗浄剤、漂白洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤として好適に使用することができる。
【００２３】
また、本発明の変異α−アミラーゼは、澱粉液化・糖化用組成物として用いることができ、更にグルコアミラーゼ、マルターゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、ネオプルラナーゼ、などから選ばれる１種または２種以上の酵素を配合し、変異α−アミラーゼとともに澱粉に作用させることもできる。
【００２４】
更に、本発明の変異α−アミラーゼは、繊維の糊抜き剤組成物として用いることができ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ或いはネオプルラナーゼ等の酵素を共に含有させることもできる。
【００２５】
【実施例】
アミラーゼ活性及びタンパク質量の測定
各酵素のアミラーゼ活性及びタンパク質量は以下に示す方法で行った。
アミラーゼ活性測定は、３，５−ジニトロサリチル酸法（ＤＮＳ法）で測定した。５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ１０）中に可溶性澱粉を含む反応液中、５０℃で１５分間の反応を行った後、生成した還元糖をＤＮＳ法で定量することによって測定した。酵素の力価は１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。
蛋白量の測定は、牛血清アルブミンを標準として、Bio-Rad社のProtein Assay
キットを用いて定量した。
【００２６】
参考例１ アルカリ液化型アミラーゼのスクリーニング
土壌約０．５ｇを滅菌水に懸濁し、８０℃で１５分間加熱処理した。この熱処理液の上清を適当に滅菌水で希釈して、分離用寒天培地（培地Ａ）に塗布した。次いで、これを３０℃で２日間培養し、集落を形成させた。集落の周囲に澱粉溶解に基づく透明帯を形成するものを選出し、これをアミラーゼ生産菌として分離した。更に、分離菌を培地Ｂに接種し、３０℃で２日間好気的に振盪培養した。培養後、遠心分離した上清液について、キレート剤（ＥＤＴＡ）耐性能を測定し、更に最適作用pHを測定して、本発明のアルカリ液化型アミラーゼ生産菌をスクリーニングした。
【００２７】
上述の方法により、Bacillus sp.KSM-K38（FERM BP-6946）株及びBacillus sp. KSM-K36（FERM BP-6945）株を取得することができた。
【００２８】
【００２９】
【表１】
参考例２ ＫＳＭ−Ｋ３８株及びＫＳＭ−Ｋ３６株の培養
参考例１の液体培地Ｂに、ＫＳＭ−Ｋ３８株あるいはＫＳＭ−Ｋ３６株を接種し、３０℃で２日間好気的に振盪培養した。遠心分離上清についてアミラーゼ活性（ｐＨ８．５）を測定した結果、培養液１Ｌ当たり、それぞれ５５７Ｕ及び１１７７Ｕの活性を有していた。
【００３１】
参考例３ アルカリ液化型アミラーゼの精製
参考例２で得られたＫＳＭ−Ｋ３８株の培養上清液に８０％飽和濃度になるように硫酸アンモニウムを加えて撹拌後、生成した沈殿を回収し、２ｍＭ ＣａＣｌ2を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、同緩衝液に対して一晩透析した。得られた透析内液を同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラムに添着し、同緩衝液を用いて０−１Ｍの食塩の濃度勾配によりタンパクを溶出した。活性画分を同緩衝液にて透析後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより得た活性画分を上記緩衝液にて透析することによってポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度１０％）及びソディウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）電気泳動で単一のバンドを与える精製酵素を得ることができた。尚、ＫＳＭ−Ｋ３６株の培養上清液からも同様の方法で精製酵素を得ることができた。
【００３２】
参考例４ 酵素特性
両精製酵素の特性は以下の通りである。
（１）作用
いずれも、澱粉、アミロース、アミロペクチン及びそれらの部分分解物のα−１，４グルコシド結合を分解し、アミロースからはグルコース（Ｇ１）、マルトース（Ｇ２）、マルトトリオース（Ｇ３）、マルトテトラオース（Ｇ４）、マルトペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ６）及びマルトヘプタオース（Ｇ７）を生成する。ただしプルランには作用しない。
（２）pH安定性（ブリットン−ロビンソン緩衝液）
いずれも、４０℃、３０分間処理条件下で、ｐＨ６．５〜１１．０の範囲で７０％以上の残存活性を示す。
（３）作用温度範囲及び最適作用温度
いずれも、２０〜８０℃の広範囲で作用し、最適作用温度は５０〜６０℃である。
（４）温度安定性
５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）中にて温度を変化させ、各温度で３０分間処理することにより失活の条件を調べると、いずれも４０℃で８０％以上の残存活性を示し、４５℃でも約６０％の残存活性を示した。
（５）分子量
いずれも、ソディウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した分子量は５５，０００±５，０００である。
（６）等電点
いずれも、等電点電気泳動法により測定した等電点は４．２付近である。
【００３３】
（７）界面活性剤の影響
直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、α−スルホン化脂肪酸エステルナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウム、ＳＤＳ、石鹸及びソフタノール等の各種界面活性剤０．１％溶液中で、ｐＨ１０、３０℃で３０分間処理しても、いずれも殆ど活性阻害を受けない（活性残存率９０％以上）。
（８）金属塩の影響
各種金属塩と共存させて、ｐＨ１０、３０℃で３０分間処理してその影響を調べた。
Ｋ３８は、１ｍＭのＭｎ2+により阻害され（阻害率約７５％）、１ｍＭのＳｒ2+及びＣｄ2+により若干阻害される（阻害率約３０％）。
Ｋ３６は、１ｍＭのＭｎ2+により阻害され（阻害率約９５％）、１mMのＨｇ2+、Ｂｅ2+及びＣｄ2+により若干阻害される（阻害率３０〜４０％）。
【００３４】
実施例１ 液化型α−アミラーゼ遺伝子のクローニング
ＫＳＭ−Ｋ３８株の菌体からSaitoとMiuraの方法（Biochim. Biophys. Acta, 72, 619, 1961）の方法によって抽出した染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーＫ３８ＵＳ（配列番号１９）及びＫ３８ＤＨ（配列番号２０）を用いて、ＰＣＲ反応によって配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する液化型アルカリα−アミラーゼ（以下Ｋ３８ＡＭＹと記載）をコードする遺伝子断片（約１．５ｋｂ）を増幅した。これを制限酵素ＳａｌＩによって切断後、発現ベクターｐＨＳＰ６４（特開平６−２１７７８１）のＳａｌＩ−ＳｍａＩ部位に挿入することによって、ｐＨＳＰ６４に含まれるBacillus sp. KSM-64 (FERM P-10482)株のアルカリセルラーゼ遺伝子に由来する強力プロモーターの下流に、Ｋ３８ＡＭＹの構造遺伝子が結合した組換えプラスミドｐＨＳＰ−Ｋ３８を構築した（図１）。
また、同様にBacillus sp. KSM-AP1378 (FERM BP-3048)株（特開平９−３３６３９２）から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーＬＡＵＳ（配列番号２１）とＬＡＤＨ（配列番号２２）を用いたＰＣＲ反応によって増幅した配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する液化型α−アミラーゼ（以下，ＬＡＭＹと記載）をコードする遺伝子断片（約１．５ｋｂ）を、上記と同様に発現ベクターｐＨＳＰ６４のＳａｌＩ−ＳｍａＩ部位に挿入することによって、組換えプラスミドｐＨＳＰ−ＬＡＭＹを構築した（図１）。
【００３５】
実施例２ 変異Ｋ３８ＡＭＹ遺伝子の調製−１
部位特異的変異には宝酒造社のSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキットを用いた。まず、実施例１で得られた組換えプラスミドｐＨＳＰ−Ｋ３８を鋳型とし、プライマーＣＬＵＢＧ（配列番号２３）及びＫ３８ＤＨ（配列番号２０）を用いてＰＣＲ反応を行うことによって、ＫＳＭ−６４株由来の強力プロモーターの上流から液化型アルカリα−アミラーゼ遺伝子の下流までの約２．１ｋｂの断片を増幅させ、これを上記キットに付属のプラスミドベクターｐＫＦ１９ｋのＳｍａＩ部位に挿入し、変異導入用組換えプラスミドｐＫＦ１９−Ｋ３８を構築した（図２）。
【００３６】
次に、配列番号６〜１５に示した各種の部位特異的変異導入用オリゴヌクレオチドプライマーをＴ４ＤＮＡキナーゼによって５’リン酸化した後、これと上記のｐＫＦ１９−Ｋ３８を用いて、キットの方法に従って変異導入反応を行い、反応産物によって大腸菌ＭＶ１１８４株（コンピテントセルＭＶ１１８４、宝酒造社製）の形質転換を行った。この結果得られた形質転換体から組換えプラスミドを抽出し、塩基配列の解析を行って変異の確認を行った。
【００３７】
また、変異導入した遺伝子は、上記と同様にして、発現プロモーター領域と変異Ｋ３８ＡＭＹ遺伝子部分を再度ｐＫＦ１９ｋのＳｍａＩ部位に挿入することにより、異なる変異を導入する際の鋳型プラスミドとなり、上記と同様の方法によって更に別の変異を導入した。
【００３８】
得られた各変異組換えプラスミドを鋳型とし、プライマーＣＬＵＢＧ（配列番号２３）とＫ３８ＤＨ（配列番号２０）を用いてＰＣＲ反応を行うことによって、各変異Ｋ３８ＡＭＹ遺伝子断片を増幅させ、これをＳａｌＩによって切断した後、発現ベクターｐＨＳＰ６４（特開平６−２１７７８１）のＳａｌＩ−ＳｍａＩ部位に挿入して、変異Ｋ３８ＡＭＹ生産用プラスミドを構築した（図１）。
【００３９】
実施例３ 変異Ｋ３８ＡＭＹ遺伝子の調製−２（ＬＡＭＹ遺伝子とのキメラ）
Ｋ３８ＡＭＹ遺伝子のＮ末領域をＬＡＭＹ遺伝子の相当する領域と置換する変異にはリコンビナントＰＣＲ法を用いた（図３）。まず、実施例１で得られた組換えプラスミドｐＨＳＰ−Ｋ３８を鋳型とし、プライマーＫ３８ＤＨ（配列番号２０）及びＬＡ−Ｋ３８（配列番号１７）を用いてＰＣＲ反応を行うことによって、配列番号１に示されるＫ３８ＡＭＹのアミノ酸配列のＧｌｎ２０からＣ末下流までの配列をコードする断片を増幅した。一方、組換えプラスミドｐＨＳＰ−ＬＡＭＹを鋳型とし、プライマーＣＬＵＢＧ（配列番号２３）とＬＡ−Ｋ３８Ｒ（配列番号１８）を用いたＰＣＲ反応によって、強力プロモーターの上流から、配列番号２のＬＡＭＹのアミノ酸配列の２１番目のＧｌｙまでをコードする遺伝子断片を増幅させた。次に、得られた両ＤＮＡ断片とプライマーＣＬＵＢＧ（配列番号２３）とＫ３８ＤＨ（配列番号２０）を用いた２回目のＰＣＲ反応を行うことによって、末端にプライマーＬＡ−Ｋ３８（配列番号１７）及びＬＡ−Ｋ３８Ｒ（配列番号１８）に由来する相補的な配列を持つ両断片が結合し、強力プロモーターの下流にＬＡＭＹの１番目のＨｉｓから２１番目のＧｌｙまでをコードする領域に続いてＫ３８ＡＭＹのＧｌｎ２０以降Ｃ末までをコードする領域が結合した置換変異酵素（ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹと略する）をコードする遺伝子断片（約２．１ｋｂ）が増幅された。これをＳａｌＩによって切断した後、発現ベクターｐＨＳＰ６４（特開平６−２１７７８１）のＳａｌＩ−ＳｍａＩ部位に挿入して、変異Ｋ３８ＡＭＹ生産用プラスミドを構築した（図１）。
【００４０】
実施例４ 変異液化型アルカリα−アミラーゼの生産
実施例２及び３で得られた各種変異Ｋ３８ＡＭＹ生産用プラスミドをプロトプラスト法 (Mol. Gen. Genet., 168, 111, 1979)により枯草菌ＩＳＷ１２１４株（leuA metB5 hsdM1）に導入し、得られた組換え枯草菌を液体培地（コーンスティープリカー、８％；肉エキス、１％；リン酸１カリウム、０．０２％；マルトース、５％；塩化カルシウム、５ｍＭ；テトラサイクリン、１５μｇ／ｍＬ）で３０℃で３日間培養した。得られた培養上清液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）にて透析し、同緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラムに吸着させ、塩化ナトリウムの濃度勾配で溶出させた。この溶出液を１０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ１０．０）にて透析することにより、各変異Ｋ３８ＡＭＹの精製酵素を得た。
【００４１】
実施例５ 耐熱性の検定−１
実施例１、２、４に記載の方法により、配列番号１における１１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換した酵素（Ｙ１１Ｆと略する）、４９番目のＡｓｎをＳｅｒに置換した酵素（Ｎ４９Ｓと略する）、８４番目のＧｌｕをＧｌｎに置換した酵素（Ｅ８４Ｑと略する）、１４４番目のＳｅｒをＰｒｏに置換した酵素（Ｓ１４４Ｐと略する）、１６７番目のＧｌｎをＧｌｕに置換した酵素（Ｑ１６７Ｅと略する）、１６９番目のＴｙｒをＬｙｓに置換した酵素（Ｙ１６９Ｋと略する）、１７８番目のＡｌａをＧｌｎに置換した酵素（Ａ１７８Ｑと略する）、１８８番目のＧｌｕをＡｓｐに置換した酵素（Ｅ１８８Ｄと略する）、１９０番目のＡｓｎをＰｈｅに置換した酵素（Ｎ１９０Ｆと略する）、及び２０９番目のＧｌｎをＶａｌに置換した酵素（Ｑ２０９Ｖと略する）の精製標品を取得し、次に示す手法で耐熱性を検定した。対照として野生型Ｋ３８ＡＭＹを用いた。
【００４２】
あらかじめ５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ１０．０）を５０℃にてプレインキュベートした中に、約１．２Ｕ／ｍＬとなるよう酵素を添加後、３０分後にサンプリングし、上記実施例に示す方法で残存するアミラーゼ活性を測定した。それぞれのスタート時の活性を１００％として相対活性を求め、アミラーゼ残存活性とした。結果を表２に示したが、野生型Ｋ３８ＡＭＹでは３０分後の残存活性が、１５％まで減少したことに対し、いずれの変異酵素も野生型に比べて高い残存活性を示した。
【００４３】
【表２】
実施例６ 耐熱性の検定−２
実施例５に示した変異のうち、Ｑ１６７Ｅ、Ｙ１６９Ｋ、Ｎ１９０Ｆ及びＱ２０９Ｖを次の様に組み合わせた変異酵素を実施例１、２、４に記載の方法により作製した。
Ｑ１６７Ｅ／Ｙ１６９Ｋ（配列番号１６のプライマー使用、ＱＥＹＫと略する）Ｎ１９０Ｆ／Ｑ２０９Ｖ（ＮＦＱＶと略する）
Ｑ１６７Ｅ／Ｙ１６９Ｋ／Ｎ１９０Ｆ／Ｑ２０９Ｖ（ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶと略する）
【００４５】
これらについて実施例５と同様の手法により耐熱性を検定した。ただし、熱処理の温度は５５℃とし、対照として、Ｑ１６７Ｅ、Ｙ１６９Ｋ、Ｎ１９０Ｆ及びＱ２０９Ｖを用いた。この結果、表３に示した様に、いずれの変異も、組み合わせによる耐熱性の向上が認められ、４種類の変異を組み合わせたＱＥＹＫ／ＮＦＱＶは５５℃においても３０分後に８５％の残存活性を示した。
【００４６】
【表３】
実施例７ 耐熱性の検定−３
実施例６に示した変異ＮＦＱＶに、実施例５で示した変異とＳ１４４Ｐを組み合わせた変異酵素、更にこれに１６番目のＧｌｕをＰｒｏに置換する変異（Ｅ１６Ｐと略する）と組み合せた変異酵素を実施例１、２、４に記載の方法により作製した。
Ｓ１４４Ｐ／ＮＦＱＶ（ＳＰ／ＮＦＱＶと略する）
Ｅ１６Ｐ／Ｓ１４４Ｐ／ＮＦＱＶ（ＥＰＳＰ／ＮＦＱＶと略する）
これらについて実施例５と同様の手法（５０℃）により耐熱性を検定した。
この結果、表４に示した様に、ＳＰ／ＮＦＱＶに対してＥ１６Ｐを組み合わせることで耐熱性の向上が認められた。
【００４８】
【表４】
実施例８ 耐熱性の検定−４
実施例４に示した変異のうちＱＥＹＫ／ＮＦＱＶに、配列番号１における１０７番目のＭｅｔをＬｅｕに置換した変異（Ｍ１０７Ｌと略する）、２０５番目のＨｉｓをＡｒｇに置換した変異（Ｈ２０５Ｒと略する）及び実施例３で示した変異のうちＮ４９Ｓを組み合わせた次のような変異酵素を実施例１、２、４に記載の方法により作製した。
Ｍ１０７Ｌ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶ（ＭＬ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶと略する）
Ｎ４９Ｓ／Ｍ１０７Ｌ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶ（ＮＳＭＬ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶと略する）
Ｎ４９Ｓ／Ｍ１０７Ｌ／Ｈ２０５Ｒ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶ（ＮＳＭＬＨＲ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶと略する）
これらについて実施例５と同様の手法により耐熱性を検定した。ただし、熱処理の温度は６０℃とした。
この結果、ＭＬ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶにＮ４９Ｓ、更にはＨ２０５Ｒを組み合わせることによって耐熱性は相加的に向上し、ＮＳＭＬＨＲ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶは６０℃においても３０分後に７５％の残存活性を示した（表５）。
【００５０】
【表５】
実施例９ 耐熱性の検定−５
実施例１、３、４に示した方法によって、Ｋ３８ＡＭＹのＡｓｐ１から１９番目のＧｌｙまでの配列がＬＡＭＹの１番目のＨｉｓから２１番目のＧｌｙまでの配列と置換した変異酵素ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹを取得した。この酵素の耐熱性を実施例５の方法によって検定した結果、表６に示した様に、置換による耐熱性の向上が認められた。
【００５２】
【表６】
実施例１０ 耐熱性の検定−６
実施例６に示した変異酵素ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶの遺伝子について、実施例１及び３と同様の方法により、１番目のＡｓｐから１９番目のＧｌｙまでの配列がＬＡＭＹの１番目のＨｉｓから２１番目のＧｌｙまでの配列と置換する変異を導入した。この遺伝子を用いて実施例４の方法により得られた変異酵素ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶについて実施例８と同様の手法により耐熱性を検定した（熱処理は６０℃）。
この結果、組み合わせによって耐熱性は相加的に向上し、ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶは６０℃に於いても３０分後に６３％の残存活性を示した（表７）。
【００５４】
【表７】
実施例１１ 自動食器洗浄機用洗浄剤組成物
表８に示す配合で自動食器洗浄機用洗浄剤組成物を製造し、本洗浄剤に各変異酵素を配合して洗浄試験を行った。この結果、同一活性値の酵素を添加した場合、変異酵素は野生型酵素と比較して優れた洗浄効果を示した。
【００５６】
【表８】
【発明の効果】
本発明の変異α−アミラーゼは、高いキレート剤耐性の優れた特性及びアルカリ領域における高い比活性を有し、更に熱に対する優れた安定性を有する。従って、自動食器洗浄機用洗浄剤、衣料用洗浄剤、澱粉液化、糖化用組成物、繊維糊抜き剤として有用である。
【００５８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＫＳＭ−Ｋ３８株及びＫＳＭ−ＡＰ１３７８株由来のα−アミラーゼ生産用組換えプラスミドの構築方法を示す図である。
【図２】 ＫＳＭ−Ｋ３８株由来のα−アミラーゼ遺伝子の変異導入方法を示す模式図である。
【図３】 ＫＳＭ−Ｋ３８株由来のα−アミラーゼ遺伝子のＮ末配列をＫＳＭ−ＡＰ１３７８株由来のα−アミラーゼ遺伝子のＮ末領域と置換する方法を示す図である。
Claims (7)
- 配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するα−アミラーゼにおいて、該アミノ酸配列の１１番目のＴｙｒをＰｈｅに、１６番目のＧｌｕをＰｒｏに、４９番目のＡｓｎをＳｅｒに、８４番目のＧｌｕをＧｌｎに、１４４番目のＳｅｒをＰｒｏに、１６７番目のＧｌｎをＧｌｕに、１６９番目のＴｙｒをＬｙｓに、１７８番目のＡｌａをＧｌｎに、１８８番目のＧｌｕをＡｓｐに、１９０番目のＡｓｎをＰｈｅに、２０５番目のＨｉｓをＡｒｇに、又は２０９番目のＧｌｎをＶａｌに置換させてなる変異α−アミラーゼ。
- 配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するα−アミラーゼにおいて、該アミノ酸配列の１番目のＡｓｐから１９番目のＧｌｙまでのアミノ酸配列を配列番号２の１番目のＨｉｓから２１番目のＧｌｙまでのアミノ酸配列に置換させてなる変異α−アミラーゼ。
- 配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するα−アミラーゼに対して、請求項１記載のアミノ酸残基の置換及び請求項２記載のアミノ酸配列の置換から選ばれる２種以上の置換を組み合わせて変異させた変異α−アミラーゼ。
- 請求項１〜３のいずれか１項記載の変異α−アミラーゼをコードする遺伝子又は当該遺伝子を含有するベクター。
- 請求項４に記載のベクターで形質転換された細胞。
- 請求項５に記載の形質転換細胞を培養することを特徴とする変異α−アミラーゼの製造方法。
- 請求項１〜３のいずれか１項記載の変異α−アミラーゼを含有する洗浄剤組成物。
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