JP2001509389A - ジスルフィド結合が導入されている変異体αアミラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 システイン残基の付加あるいは置換を介して１つか複数のジスルフィド結合を導入した、新規のα−アミラーゼ酵素を開示する。開示されたα−アミラーゼ酵素は安定性および/あるいは活性において改変された、あるいは改善された様相を示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、１つか複数のジスルフィド結合を導入した変異体α−アミラーゼに
向けられたものである。とりわけ、前記変異体α−アミラーゼにおいて２つのシ
ステイン残基の間にジスルフィド結合を作るために、１つか複数のシステイン残
基をα−アミラーゼ前駆体に導入するような突然変異によってジスルフィド結合
は導入されている。この変異体は、安定性および／または活性パターンのような
機能的特徴が変更されていることを特に考慮している。

【０００２】 発明の背景 α−アミラーゼ（α−１、４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、ＥＣ３
．２．１．１）はデンプンの内部α−１，４−グリコシド結合をほとんどランダ
ムに加水分解して小さな分子量のマルトデキストリンを生じる。α−アミラーゼ
は商品価値が大きく、デンプン加工の最初の段階（液化）；アルコール生産；洗
剤基質における洗浄剤として；および織物業界におけるデンプン糊抜きに用いら
れている。α−アミラーゼは桿菌やコウジカビを含む多種多様な微生物から作ら
れるが、商品としてのアミラーゼはほとんど、Bacillus licheniformis、Bacill
us amyloliquefaciens、Bacillus subtilisあるいはBacillus stearothermophil
usのような細菌から作られている。その熱安定性および商業的操作条件下の機能
のために、最近では商業的用途における好ましい酵素はBacillus licheniformis
から作られたものとなっている。

【０００３】 一般に、デンプンから果糖への加工は４つの段階からなっている：顆粒デンプ
ンの液化、液化デンプンからデキストロースへの糖化、精製、および果糖への異
性化である。デンプンの液化過程の目的はデンプンポリマー顆粒の濃縮懸濁液を
低い粘度を持った可溶性の短いデキストリン鎖溶液に転化することである。標準
的な設備で都合よく取り扱うために、またブドウ糖やそのほかの糖に効率的に転
化するためにこの段階は必須である。顆粒デンプンを液化するためには、顆粒デ
ンプンの温度を約７２℃より高く上げることによって顆粒をゼラチン化する必要
がある。加熱過程によって不溶性デンプン顆粒は即座に破壊され、水溶性デンプ
ン溶液となる。水溶性デンプン溶液はその後α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．
１．）によって液化する。

【０００４】 一般的な酵素液化過程には、顆粒デンプン懸濁液のｐＨを、Bacillus licheni
formis由来のα−アミラーゼの至適ｐＨである、ｐＨ６．０から６．５に、水酸
化カルシウム、水酸化ナトリウムまたは炭酸ナトリウムを付加して調整すること
が含まれている。水酸化カルシウムを加えるということには、失活に対してα−
アミラーゼを安定化させることが知られているカルシウムイオンを提供するとい
う利点もある。α−アミラーゼの添加に際して、懸濁液をポンプでジェット水流
に通して温度を即座に８０〜１１５℃に上げる。デンプンは直ちにゼラチン化し
、α−アミラーゼの存在によってα（１−４）グリコシド結合のランダム加水分
解を介して単量体に分解し、汲み出し易い液体となる。

【０００５】 液化過程の２番目の方法では、αーアミラーゼをデンプン懸濁液に入れ、懸濁
液を８０〜１００℃に保ち、デンプン顆粒を部分的に加水分解し、部分的に加水
分解したデンプン懸濁液をジェットを介して約１０５℃以上の温度に上げ、残っ
ていた顆粒構造をゼラチン化している。ゼラチン化したデンプンを冷却し、α−
アミラーゼを再び加えることによりデンプンをさらに加水分解することができる
。

【０００６】 この過程の３番目の方法は、乾燥製粉過程と呼ばれている。乾燥製粉では、穀
物全体を粉にひき、水と混合する。胚は浮揚分離あるいは同等の技術で任意選択
的に除く。デンプン、繊維、タンパク質および穀物のそのほかの組成物を含む混
合物を、α−アミラーゼを用いて液化する。乾燥製粉過程を用いる場合、技術的
には一般に低い温度で酵素液化を行う。一般に、デンプンから可溶性デキストリ
ンへの転化において、低い温度での液化は高い温度での液化よりも効率が悪いと
考えられている。

【０００７】 通常は、ゼラチン化の後、デンプン溶液は１０〜２０のＤＥが達成されるまで
、普通１〜３時間α−アミラーゼの存在下で高い温度に保つ。デキストロース同
等物（ＤＥ）は、還元糖全部の濃度を測定するための業界基準で、Ｄ−ブドウ糖
の乾燥重量として計算する。加水分解されていないデンプン顆粒のＤＥは実際に
はゼロであり、Ｄ−ブドウ糖のＤＥは１００と定められている。

【０００８】 α−アミラーゼを含んだデンプン溶液を保持できる最高温度は、その酵素が由
来する微生物とα−アミラーゼ分子の分子構造に依存している。枯草菌あるいは
Bacillus amyloliquefaciensの野生型から作られたα−アミラーゼは通常、それ
以上では温度による失活が急速に進むため約９０℃を越えない温度で用いられる
が、Bacillus licheniformisの野生型から作られたα−アミラーゼは約１１０℃
までの温度で用いられうる。デンプンとカルシウムイオンの存在はα−アミラー
ゼを失活に対して安定化させることが知られている。にもかかわらず、急速な失
活を防ぐためにα−アミラーゼは６を越えるｐＨで用いられる。Bacillus liche
niformisから得たα−アミラーゼは低い温度ではｐＨ５程度でデンプン基質にお
ける加水分解活性を示すことが知られている。しかしながら、通常のジェット温
度、たとえば１０２℃から１０９℃のデンプン加水分解で酵素を用いる場合、急
速な失活を避けるためにｐＨは少なくとも５．７より上に保たれなければならな
い。ｐＨが６を越えると望ましくない副産物、たとえばマルトースを生じるため
に、このｐＨの必要条件は残念なことに、加工条件の幅を狭くしている。従って
実際には、一般に、加水分解デンプンの満足のいく収量を達成するために、液化
ｐＨは５．９から６．０に保たれている。

【０００９】 液化のｐＨに関するもう１つの問題は、湿式製粉段階で得たトウモロコシデン
プン懸濁液のｐＨである、ｐＨ約４を５．９〜６．０に上げる必要があるという
ことである。このｐＨ調整には費用のかかる酸中和剤の添加が求められ、中和剤
を除くためにデンプンの最終転化産物のイオン交換精製が余分に必要になってく
る。さらに、液化過程の後で、グルコアミラーゼで液化デンプンをブドウ糖に糖
化する過程ではｐＨ４〜４．５が求められ；従ってｐＨは５．９〜６．０から４
〜４．５に戻すような調整をしなければならず；さらに薬品の添加と精製段階が
求められる。

【００１０】 液化に続いて、加工されたデンプンはグルコアミラーゼによってブドウ糖に糖
化される。たとえばアミラーゼによる不充分なアミロース加水分解のような、デ
ンプンの液化が不完全なことによってデンプンが糖化混合物に残っているような
場合に、この過程では問題が起きてくる。残っているデンプンはグルコアミラー
ゼによる加水分解には強い抵抗性を示す。それは収量の損失を表し、以下の過程
でのシロップの濾過に干渉する。

【００１１】 さらにα−アミラーゼの多くではその安定性のためにカルシウムイオンの添加
が必要なことが知られている。このことによって液化の費用はさらに高くなる。

【００１２】 米国特許第５，３２２，７７８号では、ＰＨ４．０から６．０の間での液化は
、二硫化物あるいはその塩、アスコルビン酸あるいはその塩、エリソルビン酸あ
るいはその塩のような抗酸化剤、あるいはブチル化ヒドロキシアニソール、ブチ
ル化ヒドロキシトルエンあるいはトコフェノールのようなフェノール系抗酸化剤
を液化懸濁液に加えることにより達成されている。この特許によれば、５ｍＭを
越える濃度で二硫化ナトリウムを加えなければならない。

【００１３】 米国特許第５，１８０，６６９号では、ｐＨ５．０から６．０の間での液化は
、破砕したデンプン懸濁液に入れる溶液を緩衝するのに必要な量より過剰の炭酸
イオンを加えることによって達成されている。炭酸イオンを加えることによって
ｐＨが高くなるという効果のために、懸濁液は一般に、水素イオンの元になるも
の、たとえば塩酸や硫酸のような無機酸を加えて中和する。

【００１４】 ＰＣＴ公開第ＷＯ９５/３５３８２号では、酸化安定性が改良された、Bacillu
s licheniformisのα−アミラーゼ における１０４、１２６、１８７、および/ あるいは１８８部位で変異を持った変異体α−アミラーゼが記載されている。

【００１５】 ＰＣＴ公開第ＷＯ９６/２３８７３号では、多数の変異体の何れかを持つ変異 体α−アミラーゼが記載されている。

【００１６】 ＰＣＴ公開第ＷＯ９４/０２５９７号では、酸化安定性が改善された変異体α −アミラーゼが記載され、そこでは１つか複数のメチオニンがシステインあるい
はメチオニン以外のアミノ酸で置換されている。

【００１７】 ＰＣＴ公開第ＷＯ９４/１８３１４号では、酸化安定性が改善された変異体α −アミラーゼが記載され、そこでは１つか複数のメチオニン、トリプトファン、
システイン、ヒスチジンあるいはチロシン残基が酸化されないアミノ酸と置換さ
れている。

【００１８】 ＰＣＴ公開第ＷＯ９１/００３５３号では、特異的な置換Ａｌａ−１１１−Ｔ ｈｒ、Ｈｉｓ−１３３−Ｔｙｒ、および/あるいはＴｈｒ−１４９−Ｉｌｅを含 むようにα−アミラーゼを遺伝子工学的に操作することによってBacillus lic
heniformis野生型のα−アミラーゼの液化に関する機能的特徴や問題の解決に迫
っている。

【００１９】 組換えＤＮＡ技術を用いて、どの残基がアミラーゼの触媒活性に重要なのかを
探る、および/あるいは様々なアミラーゼやグリコシラーゼの活性部位の中であ るアミノ酸を修飾した場合の効果を探るような研究が数多くの研究者によって行
われてきた（Vihinen et al., J. Biochem., Vol. 107 pp.267-272(1990); Hol
m et al., Protein Engineering, Vol. 3,pp.181-191(1990); Takase et al., Biochemica et Biophysics Acta , Vol. 1120, pp.281-288(1992); Matsui et al
., FEBS Letters, Vol. 310, pp.216-218(1992); Matsui et al., Biochemistry , Vol. 33, pp.451-458(1992); Sogaard et al., J. Biol. Chem., Vol. 268, p
p.22480-22484(1993); Sogaard et al., Carbohydrate Polymers, Vol. 21, pp.
137-146(1993); Svensson, Plant Mol. Biol., Vol. 25, pp.141-157(1994); Sv
ensson et al., J. Biotech., Vol. 29, pp.1-37(1993)）。研究者はまた、どの
残基が熱安定性に重要なのかも研究している（Suzuki et al., J. Biol. Chem.,
Vol. 264, pp.18933-18938(1989); Watanabe et al., Eur. J. Biochem., Vol.
226, pp.277-283(1994)）；そしてあるグループはBacillus licheniformisアミ ラーゼにおけるいろいろなヒスチジン残基に突然変異を導入する方法を用いた。
その理論的根拠は、Bacillus licheniformisアミラーゼはそのほかの似たような
バチルス・アミラーゼに比べて相対的に熱に安定であり、多くのヒスチジン残基
があり、それ故ヒスチジンを置き換えることが熱安定性に影響するということが
示唆されてきたことである。この研究によって１３３番目のヒスチジン残基およ
び２０９番目のアラニン残基で熱安定性変異を同定するという結果が得られた(D
elerck et al., J. Biol. Chem., Vol.265, pp.15481-15488(1990); FR2665 178
-A1; Joyet et al., Bio/Technology Vol. 10 pp.1579-1583(1992)）。

【００２０】 部位特異的変異誘発によってタンパク質にジスルフィド結合を導入することに
よって未変性の折りたたみ構造を安定させる手段が提供され（Viliafranca et a
l., Science Vol. 222, pp.782-788(1983)参照）, Hazes et al., Prot. Eng.,
Vol. 2, pp.119-125(1988)は、判っている三次元モデルで利用できるＮ、Ｃαお
よびＣ原子からＣβ部位の生成を始めるアルゴリズム形成を介してタンパク質に
ジスルフィド結合を導入していることを示唆している。最初の１組の残基はＣβ
−Ｃβの距離に基づいて選択される；Ｃα−ＣβおよびＣβ−Ｓγ結合の長さお
よびＣβにおける結合角度について理想的な値をもって、対における残基１のＳ
γと残基２のＣβの間の距離（Ｓγ２の結合角度によって測定される）が理想的
な場所にあるか、理想的な場所の極めて近傍にあるという必要条件を満たすよう
なＳγ部位を作成する；そして各システインについて２つの許容できるＳγ部位
が認められ、各ジスルフィド結合について４つの別々の構造ができ上がる。最終
的には４つの構造はエネルギーを最小化する処置を施され、理想的な幾何学およ
び最終的に計算されたエネルギーとの大きな偏差が除かれる。Sowdhamini et al
., Prot. Eng., Vol. 3, pp.95-103(1989)は、部位特異的変異誘発によってタン
パク質にジスルフィド結合を導入することによって未変性の折りたたみ構造を安
定させる手段が提供されることを開示し、システインジスルフィド架橋の導入の
ための可能性のある部位としてタンパク質の残基対の立体化学的安定性を評価す
るためのコンピュータ模型作成技術を提案している。著者は、張り詰めていない
ジスルフィド結合を作るために、システイン導入の可能性のある部位として、タ
ンパクの残基部位を考慮するための基本的条件は、ジスルフィド結合（Ｃα−Ｃ
α）を介して結合すべき２つのシステイン残基の間のアルファ炭素の距離は６．
５オングストロームより少ないか同等であること、およびジスルフィド結合（Ｃ
β−Ｃβ）を介して結合すべき２つのシステイン残基の間のベータ炭素の距離は
４．５オングストロームより少ないか同等であることを提案している。

【００２１】 従来技術による利点があるにもかかわらず、α−アミラーゼについては、商業
的液化過程をさらに効率良くし、しかし現行よりも低いｐＨで活性を持たせるよ
うな必要性がある。さらに、洗剤用途の条件下でさらに効果的であるような特性
を持つようアミラーゼを改善するという必要性もある。たとえば洗剤に関連した
強アルカリおよび高オキシダント値（漂白）あるいはアミラーゼが作用するより
低い温度といったような安定性の問題によって市販のアミラーゼは多くの条件下
では許容されないために、そのような条件下で、変異された、好ましくは向上し
た性能を有するアミラーゼが必要なのである。

【００２２】 発明の概要 改変された性能を持つα−アミラーゼを提供することが本発明の目的である。

【００２３】 高温における安定性を改善したα−アミラーゼを提供することが本発明のさら
なる目的である。

【００２４】 従って、本発明は、１つか複数のシステイン残基を導入した変異体α−アミラ
ーゼであって、導入したシステイン残基の少なくとも１つはもう１つのシステイ
ン残基とともにジスルフィド結合を形成することができるものを提供する。好ま
しくは、導入したシステイン残基およびジスルフィド結合をともに形成すべきも
う１つのシステイン残基は、α−アミラーゼ前駆体においてＣα−Ｃα結合距離
が約４．４〜６．８オングストロームおよびＣβ−Ｃβ結合距離が約３．４５〜
４．５オングストロームであるような部位に相当するものである。本発明の特に
好ましい実施の形態では、α−アミラーゼは細菌あるいは真菌に由来し、Bacill
us licheniformisのＥ１１９Ｃ/Ｓ１３０Ｃおよび/あるいはＤ１２４Ｃ/Ｒ１２ ７Ｃに相当する置換を備えている。最も好ましくは、α−アミラーゼはBacillus
由来である。

【００２５】 本発明はさらにそのような変異体α−アミラーゼをコードする核酸、そのよう
な核酸を備えているベクター、そのようなベクターで形質転換された宿主細胞お
よびそのような宿主細胞を用いて変異体α−アミラーゼを発現する方法を含む。

【００２６】 本発明はさらに、デンプンをブドウ糖やそのほかのデンプン誘導体に加工する
過程でデンプンを液化するために、洗濯洗剤や食器洗浄洗剤のような洗剤の添加
剤として、ベーキング目的で、および織布の糊抜きのために、本発明に基づいた
変異体α−アミラーゼの利用を含む。

【００２７】 好ましい実施の形態の詳細な説明 “α−アミラーゼ”とは、たとえばデンプン、アミロペクチン、あるいはアミ
ロースポリマーにおけるα（１−４）グリコシド結合を開裂あるいは加水分解す
るような酵素活性を意味する。ここで用いるα−アミラーゼには天然型α−アミ
ラーゼおよび組換え型α−アミラーゼが含まれる。本発明で好ましいα−アミラ
ーゼは、コウジカビ（すなわちA. oryzaeおよびA.nigar)由来の真菌α−アミラ ーゼ同様にBacillus licheniformis、 Bacillus amyloliquefaciensあるいはBa
cillus stearothermophilus に由来するα−アミラーゼである。

【００２８】 “組換え型α−アミラーゼ”とは、天然型α−アミラーゼに比べてα−アミラ
ーゼ配列において１つか複数のアミノ酸の置換、挿入あるいは欠失をコードする
ような変異体ＤＮＡ配列を作るように修飾された、天然型α−アミラーゼをコー
ドするＤＮＡ配列を持つα−アミラーゼを意味する。

【００２９】 “発現ベクター”とは、適切な宿主細胞においてＤＮＡの発現を行えるような
適切な制御配列に操作できるように結合した前記ＤＮＡ配列を備えるＤＮＡ構成
物を意味する。そのような制御配列には転写を遂行するプロモーター、そのよう
な転写を制御する任意のオペレーター配列、ｍＲＮＡのリボソームの適切な結合
部位をコードした配列、および転写と翻訳の停止を制御するような配列を含んで
もよい。 好ましいプロモーターは枯草菌ａｐｒＥプロモーターである。ベクタ ーは、プラスミド、ファージ粒子、あるいは単に可能性のあるゲノム挿入断片で
もよい。一旦適切な宿主細胞で形質転換されると、ベクターは複製し、宿主ゲノ
ムとは無関係に機能するか、あるいは場合によってはゲノム自体に組み込む可能
性もある。現在のところプラスミドが最も一般的なベクターであることから、本
発明では時折プラスミドとベクターを置き換え可能なように用いる。しかしなが
ら、本発明は当該分野で公知の、あるいは公知になる同等の機能を持つその他の
発現ベクターも含めることを意図している。

【００３０】 “宿主株”あるいは“宿主細胞”とは、本発明に基づいてα−アミラーゼをコ
ードしているＤＮＡを備えた発現ベクターの適切な宿主を意味する。本発明で有
用な宿主細胞は一般に、本発明に基づいたα−アミラーゼの発現が達成できるよ
うに形質転換できる微生物を含めた、原核宿主あるいは真核宿主である。特に、
Bacillus株のような、α−アミラーゼが由来した種や属の宿主株が適切である。
好ましくは、α−アミラーゼ陰性のBacillus株（遺伝子欠損）および/あるいは α−アミラーゼとプロテアーゼを欠損したBacillus株（■ａｍｙＥ、■ａｐｒ、
■ｎｐｒ）を用いる。宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクタ
ーによって形質転換あるいは形質移入する。そのように形質転換された宿主細胞
は、α−アミラーゼおよびその変異株（変異体）をコードしているベクターを複
製できるか、望ましいα−アミラーゼを発現することができる。

【００３１】 “液化”あるいは“液化する”とは、デンプンを短鎖の、あまり粘り気のない
デキストリンに転化する過程を意味する。一般に、この過程にはα−アミラーゼ
の添加と同時、あるいは添加後にデンプンのゼラチン化が含まれている。

【００３２】 本発明に基づいて、２番目のシステイン残基とジスルフィド結合を形成できる
ような１番目のシステイン残基を導入した変異体α−アミラーゼが提供される。
好ましくは、１番目のシステイン残基は前駆体α−アミラーゼに対する付加ある
いは置換を備えている。さらに、付加あるいは置換として２番目のシステイン残
基を取り込むことも可能であり、これは、有用なシステイン残基が分子の所望部
分を安定化するために有用な部位に存在していない場合、好ましいかもしれない
。Bacillus Licheniformisのα−アミラーゼに関しては、野生型分子はシステイ
ンを持っていないので、２つのシステイン残基を取り込むことが必要である。こ
こで用いられているようなアミノ酸の付加あるいは置換は、前駆体α−アミラー
ゼのアミノ酸配列自体のいかなる修飾についても言うが、好ましくは、発現され
たタンパクにおける置換されたあるいは付加されたシステインをコードするよう
に、前駆体α−アミラーゼをコードする核酸に変異を起させるために、遺伝子工
学的技術を用いることについて言う。前駆体α−アミラーゼには、天然型α−ア
ミラーゼおよび組換え型α−アミラーゼが含まれる。前駆体α−アミラーゼのア
ミノ酸配列をコードしている前駆体ＤＮＡ配列の修飾は、本発明に記載された方
法、および共通に所有され、参考により本発明に引用される米国特許第４，７６
０，０２５号および第５，１８５，２５８号に記載された方法によって行われう
る。

【００３３】 また、本発明で提供された変異体α−アミラーゼを備えるアミノ酸配列をコー
ドしている核酸分子（ＤＮＡ）、ベクターおよびファージを含むそのようなＤＮ
Ａを取り込むような発現系、そのようなＤＮＡで形質転換された宿主細胞、およ
びアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ分子に相当するＤＮＡのアンチセンス鎖
も提供する。同様に、本発明は宿主細胞に形質転換された発現系に取り込まれた
ＤＮＡを発現することによって変異体α−アミラーゼを作る方法を含んでいる。
本発明の変異体α−アミラーゼは、デンプンの液化において、洗濯洗剤、自動食
器洗浄器洗剤、固い表面を洗浄する製品の構成成分として、ベーキングを含めた
食品加工において、織布加工において糊抜き剤として、あるいはα−アミラーゼ
の活性が有用であるようなそのほかのいかなる応用において用いてもよい。

【００３４】 前駆体α−アミラーゼはα−アミラーゼを作る能力のあるいかなる原材料から
も製造される。α−アミラーゼの適切な原材料は、真菌、細菌、植物あるいは動
物を含む原核生物あるいは真核生物である。好ましくは、前駆体α−アミラーゼ
はBacillusから、さらに好ましくは、Bacillus licheniformis、 Bacillus amy
loliquefaciensあるいはBacillus stearothermophilus から作り、最も好ましく
は、前駆体α−アミラーゼはBacillus licheniformisから生産する。

【００３５】 植物、動物、および細菌にわたる範囲で現在までに配列決定されているエンド
型アミラーゼのほとんどすべてに相同性が認められている（Nakajima et al., A ppl. Microbiol. Biotechnol. , Vol. 23,pp.355-360(1986); Rogers, Biochem. Biophys. Res. Commun. , Vol. 128, pp.470-476(1985); Janecek, Eur. J. Bioc hem. , Vol. 224, pp.519-524(1994)）。図４に示したように、いくつかのBacill
usのアミラーゼには特に相同性の高い領域が４つあり、図中、高い相同性部分を
下線で表した。配列の配置はBacillusのエンド型アミラーゼの類縁関係を地図に
するためにも用いられている(Feng et al., J. Molec. Evol., Vol. 35, pp.351
-360(1987)）。Holm et al., Protein Engineering, Vol. 3, No.3, pp.181-191
(1990)の計算によれば、Bacillus stearothermophilusとBacillus licheniformi
sアミラーゼの間の相対的な配列相同性は約６６％であり、Bacillus lichenifor
misとBacillus amyloliquefaciensとの間では８１％である。配列の相同性は重 要であるけれども、アミラーゼとほかの酵素を比べた場合の構造的な相同性も重
要である。たとえば、真菌のアミラーゼと細菌のアミラーゼの構造的な相同性が
示唆されており、それ故真菌のアミラーゼも本発明に含まれている。

【００３６】 とりわけ、置換について、Bacillus licheniformisのα−アミラーゼにおける
Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃおよび/あるいはＤ１２４Ｃ／Ｒ１２７Ｃに相当する残 基での置換がここでは認められている。従って、Ｅ１１９のような特別の残基は
アミノ酸部位番号を引用する（すなわち＋１１９）。アミノ酸部位番号は、図２
に示すようBacillus licheniformisの完全なα−アミラーゼアミノ酸配列に割り
振られた番号である。しかしながら、本発明は、Bacillus licheniformisの完全
なα−アミラーゼの変異に限定するものではなく、Bacillus licheniformisのα
−アミラーゼにおいて特に認められた残基と同等であるような部位におけるアミ
ノ酸残基を含んでいるような前駆体α−アミラーゼにも拡張されている。相同で
ある（すなわち、１次構造についても３次構造についても所定の部位で一致する
）か、あるいはBacillus licheniformisにおけるα−アミラーゼの特定の残基、
あるいはその部位に類似する場合（すなわち、化学的にあるいは構造的に、同一
の、あるいは似たような、結合能、反応性あるいは相互作用する機能を持ってい
る）、前駆体α−アミラーゼの残基は、Bacillus licheniformisのα−アミラー
ゼの残基と同等である。

【００３７】 １次構造に対する相同性を確立するために、前駆体α−アミラーゼのアミノ酸
配列を、Bacillus licheniformisのα−アミラーゼの１次配列、特にその配列が
知られているようなあらゆるα−アミラーゼで変異性のないことが判っている残
基部分と直接比較する（図４参照）。ブタの膵臓α−アミラーゼ(Bulsson et al
., EMBO Journal, Vol. 6, pp.3909-3916(1987); Qian et al., Biochemistry,
Vol. 33, pp.6284-6294(1994); Larson et al., J. Mol. Biol., Vol. 235, pp.
1560-1584(1994)）; Aspergillus oryzaeのタカ−アミラーゼＡ（Matsuura et a
l., J. Biochem(Tokyo), Vol. 95, pp.697-702(1984)）；およびA. nigerの酸性
α−アミラーゼ(Boel et al., Biochemistry, Vol. 29, pp.6244-6249(1990)） で、前者２つの構造は似ているが、さらに大麦のα−アミラーゼ(Vallee et al.
, J. Mol. Biol., Vol. 236, pp.368-371(1994); Kadziola, J. Mol. Biol., Vo
l. 239, pp.104-121(1994)）で報告されている結晶構造の３次構造解析によって
同等な残基を定めることも可能である。α−アミラーゼの２次構造に関してもい
くつかの予備的な研究が出版されており（Suzuki et al., J. Biochem., Vol. 1
08, pp.379-381(1990); Lee et al., Arch Biochem. Biophys., Vol. 291, pp.2
55-257(1991);Chang et al., J. Mol. Biol., Vol. 229, pp.235-238(1993); Mi
zuno et al., J. Mol. Biol., Vol. 234, pp.1282-1283(1993)）、また、Bacill
us licheniformisのα−アミラーゼの結晶に関して少なくとも構造が１つ報告さ
れている（Machius et al., J. Mol. Biol., Vol. 246, pp.545-549(1995)）。 しかしながら、研究者の中には、グルカナーゼ間（MacGregor et al., Biochem. J. , Vol. 259, pp.0145-152(1989)）、およびα−アミラーゼとそのほかのデン
プン代謝酵素間（Jaspersen, J. Prot. Chem., Vol. 12, pp.791-805(1993); Ma
cGregor, Stark, Vol.45, pp.232-237(1993)）に共通の超２次構造があることを
予測するものもいるし、α−アミラーゼに対して似たような超２次構造を持つ酵
素間には配列の類似性があることを予測するものもいる(Janecek, FEBS Letters , Vol. 315, pp.23-26(1993); Janecek et al., J. Prot. Chem., Vol. 12, pp.
509-514(1993)）。Bacillus stearothermophilusの酵素の構造は、タカ−アミラ
ーゼＡの構造を見本にして作られた（Holm et al., Protein Engineering, Vol.
3, pp.181-191(1990)）。図４に示されている高度に保存されている４つの領域
は活性部位と考えられる多くの残基を含み（Matsuura et al., J. Biochem(Toky
o), Vol. 95, pp.697-702(1984); Buisson et al., EMBO Journal, Vol. 6, pp.
3909-3916(1987); Vihinen et al., J. Biochem., Vol. 107, pp.267-272(1990)
）、Bacillus licheniformisの番号システムの下では、Ｈｉｓ＋１０５；Ａｒｇ
＋２２９；Ａｓｐ＋２３１；Ｈｉｓ＋２３５；Ｇｌｕ＋２６１およびＡｓｐ＋３
２８が含まれている。

【００３８】 本発明の実践においては、適切な置換を特定するためにはある種のパラメータ
ーが有用である。特異的な酵素の結晶構造に関する情報を入手すべきである。上
で示したBacillus licheniformisのα−アミラーゼ、ｐｌｇ膵臓α−アミラーゼ
、 Aspergillus nigerおよびAspergillus oryzaeのα−アミラーゼ、および大麦
のα−アミラーゼがこの目的に有用である。標的酵素の結晶構造に関する情報と
ともに、特殊な条件下における酵素の不安定性に関する情報、好ましくは、酵素
の不安定性全体に寄与するような特別に不安定な残基や領域の存在に関する情報
を入手することが有用である。特別な例として、出願人はBacillus licheniform
isに由来するα−アミラーゼは酸化条件下で特に不安定な残基をいくつか有する
こと、すなわちＭ１９７およびＷ１３８を備えていることに気付いていた。本発
明の実践において出願人は、安定性を高めるようなＳ１４８Ｎ変異の能力のため
に、特にＳ１４８周辺の領域を調べた。この領域が、この置換によってさらに安
定になるような２次構造要素を持っているかもしれないという仮説によって、出
願人は二次構造の近傍領域にジスルフィド結合を導入することを介して酵素の安
定化を図ろうとした。

【００３９】 置換について特別な残基を特定するために、折りたたまれたタンパク質におけ
る各残基についてアルファ炭素とベータ炭素の距離を結晶構造から測定し、ジス
ルフィド結合について許容できる範囲にあるどの対が２つのシステイン残基とな
るのかを定めた。たとえば、結果として２つのシステイン残基となるような置換
に組み入れることを考慮されている残基対は、好ましくは約４．４から約６．８
オングストロームのアルファ炭素距離（Ｃα−Ｃα）を持つべきである。同様に
、ベータ炭素の距離（Ｃβ−Ｃβ）は約３．４５から４．５オングストロームと
なるべきである。炭素距離に関するこのような基準を満たすアミノ酸対を選択し
、上記Swodhamini et al.とHazes et al.によって要点が述べられている戦略を 利用して、システインに置換し、それに続く２つのシステイン間でジスルフィド
結合を形成することによって、起される可能性のあったタンパク質の撹乱を最小
限に抑えることができた。このような方法で、ジスルフィド結合の形成に有利な
条件を持つ１番目と２番目のシステインを選択することができる。出願人はこう
して特に好ましい置換としてＤ１２４−Ｒ１２７およびＥ１１９−Ｓ１３０を選
び出した。しかしながら、本発明に示された然るべき基準に当てはまる限り、ど
のような残基対を利用してもよい。

【００４０】 望ましい結果および予期していない結果を提供する改変した性能特性を示す、
本発明に基づいたα−アミラーゼは、一般にα−アミラーゼが用いられているよ
うな様々な応用で役に立つ。たとえば、低いｐＨでの改善された熱安定性、改善
されたｐＨ安定性、および/あるいは改善された酸化安定性を含む、改変された 性能特性を示す本発明に基づいたα−アミラーゼは、低いｐＨでのデンプンの液
化において有用である。熱安定性が高まることによってそれを組み込まれた製品
の保管寿命を延長することができる。酸化安定性を高めること、あるいは性能を
改善することは、洗剤製品において特に望ましく、そのような洗剤製品に使われ
ている漂白剤、過ホウ酸塩、過炭酸塩、あるいは過酸に入っているα−アミラー
ゼの保管寿命を延長することになる。それに対して、熱安定性あるいは酸化安定
性を減じることはデンプン分解活性の急速で効果的な停止が求められる工業過程
で役に立つ可能性がある。

【００４１】 低いｐＨでの安定性を改善した本発明のα−アミラーゼは、デンプン加工およ
び特にデンプンの液化において特に役立つであろう。商業的に望ましい液化過程
の間にある条件というのは、低いｐＨ、高い温度および酸化的条件の可能性を特
徴的に含んでおり、低いｐＨでの改善された性能、改善された熱安定性および改
善された酸化安定性を示すようなα−アミラーゼが求められている。従って、本
発明に基づいたα−アミラーゼで液化において特に役立つものは、約６より低い
ｐＨ、好ましくは、約５．６未満、最も好ましくは約５．０未満のｐＨで改善さ
れた性能を示すものである。さらに、約８０〜１２０℃、好ましくは約１００〜
１１０℃の間の温度で改善された熱安定性を示し、酸化剤の存在下で高い安定性
を示すような、本発明に基づいたα−アミラーゼは特に役に立つであろう。

【００４２】 たとえば抗酸化剤、カルシウム、イオン、塩あるいはエンドグリコシダーゼ、
セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼあるいはそのほかのアミラーゼ酵素などの
ようなほかの酵素を含む、液化において役立つことが当業者に知られている追加
成分を、意図する反応条件に応じて加えてもよい。たとえば、本発明に基づいた
α−アミラーゼと別の原材料から得たα−アミラーゼを組み合わせることによっ
て独特の作用を提供し、特別な液化条件の下での特殊な用途を見い出す可能性が
ある。特に、本発明に基づいたα−アミラーゼとBacillus stearothermophilus に由来するα−アミラーゼを組み合わせることによって、相補的な作用パターン
により５．５より低いｐＨ値での液化が高められる。

【００４３】 湿式あるいは乾燥どちらの製粉過程であれ、液化の間、デンプン、特に顆粒デ
ンプン懸濁液は、公知の液化技術に従って本発明のα−アミラーゼで処理される
。一般に、デンプン分解過程の第１段階では、デンプン懸濁液は相対的に高い温
度（約８０℃から約１１０℃の間）で加熱することによってゼラチン化する。デ
ンプン懸濁液をゼラチン化した後でα−アミラーゼによって液化する。

【００４４】 本発明のもう１つの実施の形態では、本発明に基づいたα−アミラーゼを備え
ている洗剤組成物が、液体、ゲル、あるいは顆粒形状であれ、役立つ可能性があ
る。そのような洗剤組成物は、保管寿命を改善するために熱安定性を増し、ある
いは普通洗剤に入っている漂白剤や過酸に対する抵抗性を改善するように酸化安
定性が増した、本発明に基づいたα−アミラーゼを加えることによって特に恩恵
を受けることになる。従って、本発明に基づいたα−アミラーゼは、約６．５か
ら約１２．０までのｐＨを持つ、公知の粉状、液体あるいはゲル状洗剤の中で有
利に製剤化できる。本発明に基づいたα−アミラーゼを備えている洗剤組成物は
、当技術分野で一般に知られている追加成分と同様に、エンドグリコシダーゼ、
セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼあるいは、特にBacillus stearothermophi
lusに由来するα−アミラーゼのようなほかのアミラーゼ酵素のようなその他の 酵素を含んでもよい。

【００４５】 本発明の好ましい実施の形態は、２つ以上のシステイン残基の置換に加えて、
安定性を与えあるいは活性を増すために当技術分野で知られている１つか複数の
置換を備える。たとえば、ここで参考として取り入れられる開示である、第ＷＯ
９４/１８３１４号に記載されているようなＭ１５、Ｍ１９７、あるいはＷ１３ ８のようなメチオニン残基あるいはトリプトファン残基の欠失あるいは置換；Ｐ
ＣＴ公開第ＷＯ９１/００３５３号に記載されているようなＨ１３３Ｙにおける 置換；DeClerk et al., J. Biol. Chem., Vol. 265, pp.15481-15488(1990)に記
載されているようなＡ２０９における置換；ＰＣＴ公開第ＷＯ９５/１０６０３ 号、第ＷＯ９６/２３８７３号および第ＷＯ９６/２３８７４号に記載されている
置換の何れか、である。特に好ましい実施の形態では、本発明に基づいたα−ア
ミラーゼはさらに、Bacillus licheniformisのα−アミラーゼにおけるＭ１５、
Ａ３３、Ａ５２、Ｓ８５、Ｎ９６、Ｖ１２８、Ｈ１３３、Ｓ１４８Ｎ、Ｓ１８７
、Ｎ１８８、Ａ２０９、Ａ２６９および/あるいはＡ３７９に相当する１つか複 数の残基における欠失あるいは置換を備えてもよい。本発明のアミラーゼの特別
な実施の形態は、Bacillus licheniformisにおけるＭ１５Ｔ／Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１
３０Ｃ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｌ／Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５
Ｔ／Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｔ／Ｅ１１９Ｃ
／Ｓ１３０Ｃ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ／Ａ２０９Ｖ、Ｍ１５Ｔ／Ｅ１１９Ｃ／
Ｓ１３０Ｃ／Ｎ１８８Ｓ／Ａ２０９Ｖ、Ｍ１５Ｔ／Ｅ１１９Ｃ／Ｖ１２８Ｅ／Ｓ
１３０Ｃ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｔ／Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃ／Ｓ１
８７Ｄ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｔ／Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃ／Ｈ１３３Ｙ、Ｍ１５
Ｔ／Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ／Ａ２０９Ｖ、Ｍ１５Ｔ
／Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃ／Ｈ１３３Ｙ／Ａ２０９ＶあるいはＭ１５Ｔ／Ｅ１１
９Ｃ／Ｓ１３０Ｃ／Ｈ１３３Ｙ／Ｓ１４８Ｎ／Ａ２０９Ｖ／Ａ３７９Ｓに相当す
る置換パターンを備えてもよい。

【００４６】 本発明に基づいたα−アミラーゼとプロテアーゼ酵素の組合せを備えている本
発明の実施の形態では好ましくは、デュラジム（Durazym)（ノボ・ノルディスク
）およびプラフェクト（登録商標）Ｏｘｐ（ジェネンコー・インターナショナル
社）のような市販の酵素同様に、本発明に参考として取り入れられる米国再発行
特許第３４，６０６号に記載されているような酸化的に安定なプロテアーゼが含
まれる。そのようなプロテアーゼ変異体（酸化的に安定なプロテアーゼ）を作る
方法、および特に、Bacillus amyloliquefaciensにおけるＭ２２２と同等な部位
でのメチオニンに対する置換を持っているそのような変異体は米国再発行特許第
３４，６０６号に記載されている。

【００４７】 本発明の別の実施の形態は、本発明に基づいたα−アミラーゼをコードするＤ
ＮＡおよびそのようなＤＮＡを備えている発現ベクターを含む。ＤＮＡ配列は、
よく知られた技術に従って、然るべき発現ベクターにおいて発現制御配列を、そ
れらを操作できるように結合することにより、および然るべき宿主を形質転換す
るように発現ベクターを扱うことによって発現させてもよい。本発明のＤＮＡ配
列の発現には多種多様の宿主/発現ベクターの組合せを用いることができる。役 に立つ発現ベクターには、たとえば、染色体断片、この目的に有用であることが
知られている様々なプラスミドやファージのような非染色体性および合成ＤＮＡ
配列がある。さらに、多種多様な発現制御配列も一般にこのようなベクターに用
いられている。たとえば、出願人は、Bacillusの形質転換体に好ましい発現制御
配列は枯草菌由来のａｐｒＥシグナルペプチドであることを発見した。

【００４８】 多種多様な宿主細胞も本発明のＤＮＡ配列の発現に有用である。このような宿
主細胞には大腸菌、シュードモナス、バチルス、ストレプトマイセス、いろいろ
な真菌、酵母および動物細胞などのような周知の原核細胞および真核細胞の宿主
がある。好ましくは、宿主は、精製と以後の過程を促進するために、本発明のα
−アミラーゼを細胞外で発現する。本発明の変異体α−アミラーゼの発現と精製
はそのような過程を実行するのに技術的に認知された手段を介して行ってもよい
。

【００４９】 本発明に基づいて改善されたα−アミラーゼは、野生型のBacillusα−アミラ
ーゼに比べて、いくつかの重要な利点を提供するように意図されている。たとえ
ば、利点の１つは、一般のデンプン液化法に典型的な低いｐＨと高い温度で活性
が高くなっているということである。もう１つの利点は、洗剤での用途を容易に
する高いｐＨと酸化に対する安定性の増強である。もう１つの利点は、デンプン
分子のさらに完全な加水分解が達成され、加工過程における残余デンプンを減ら
すということである。さらにもう１つの利点は、カルシウムイオン非存在下での
安定性が改善されるということである。さらにもう１つの利点は、厳しい条件下
での特異活性と安定性の双方を改善したために、野生型Bacillus licheniformis
α−アミラーゼと比べた場合、本発明に基づいたα−アミラーゼを同じタンパク
質量加えても優れた性能が得られるということである。言い換えれば、本発明に
基づいたアミラーゼの安定性が一般的に増加しているために、デンプンに対する
本発明のアミラーゼの増強された特異活性がこの変異体の潜在的に大きな性能の
恩恵を説明することになるのである。野生型酵素が失活しているような条件下で
も、本発明のアミラーゼは安定性が増しているために、活性を残すだけでなく、
特異活性が高まっているために活性を残しているアミラーゼは比で見ればさらに
高い活性を示すことになる。

【００５０】 以下は実施例として提示するものであり、請求項の範囲に限定するものとして
解釈すべきではない。ここで用いた略語、特にアミノ酸の３文字あるいは１文字
表記は、Dale, J. W., 細菌の分子遺伝学、John Wiley & Sons (1989) 補遺Ｂに
記載されている。

【００５１】 実施例１ プラスミドｐＨＰ．ＢＬの構成 図２に示したα−アミラーゼ遺伝子は、Bacillus licheniformis ＮＣＩＢ８ ０６１株からクローニングした（Gray et al., J. Bacteriology, Vol. 166, pp
.635-643(1986)）。シグナル配列における最後の３つの残基をコードしている１
．７２ｋｂのＰｓｔ１−Ｓｓｔ１断片、完全なタンパク質全体およびターミネー
ター領域をＭ１３ｍｐ１８でサブクローニングした。合成ターミネーターは、以
下のような合成オリゴヌクレオチドのカセットを用いてＢｃＩＩ部位とＳｓｔ１
部位の間に加えた。

【００５２】 ５’−ＧＡＴＣＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＡＡＡＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＧ
ＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＧＣＴ−３’（配列番号第７番） ３’−ＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴＧＧＣＣＧＧＡＡＣＣＧＧＧＧＣＧＧＣＣＡ
ＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＡＣ−５’ （配列番号第８番） これらは、Bacillus amyloliquefaciensのサブチリシン転写ターミネーターを含
むように設計されている(Wells et al., Nucleic Acid Research, Vol. 11, pp.
7911-7925(1983)）。

【００５３】 ｐＢＬａｐｒプラスミドはBacillus licheniformisのα−アミラーゼの遺伝子
を用いて構成した。図６に示すように、ｐＢＬａｐｒは、ｐＢＲ３２２由来のア
ンピシリン抵抗性遺伝子とｐＣ１９４由来のクロラムフェニコール抵抗性遺伝子
を含む６．１ｋｂのプラスミド、ａｐｒＥプロモーターおよびBacillus licheni
formisのα−アミラーゼ(“ＢＬＡＡ”）をコードする遺伝子を備えている。ａ ｐｒＥプロモーターは、枯草菌アルカリプロテアーゼのプロモーターとシグナル
配列をコードしている６６０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｐｓｔ１断片から構築した
。Ｐｓｔ１部位を取り除き、ａｐｒＥＩＢＬ のＡＡ 接合部近傍でＳｆｉｌ部位
を加えた。ＢＬＡＡ遺伝子は上述のような１７２０ｂｐのＰｓｔ１−Ｓｓｔ１断
片を備えている。ここで記述する作業では、ｐＢＬａｐｒは、完全なアミラーゼ
遺伝子のコード配列の先頭５’末端に隣接したＳｆｉｌ部位で構築された。特に
ｐＢＬａｐｒコンストラクトの５’末端は、以下の変異誘発オリゴヌクレオチド
に対する有意鎖テンプレートを得るためにＥｃｏＲＩ−Ｓｓｔ１断片でｐＢＬａ
ｐｒから Ｍ１３ＢＭ２０（ベーリンガー・マンハイム）にサブクローニングし た： ５’−ＣＣＣ ＡＴＴ ＡＡＧ ＡＴＴ ＧＧＣ ＣＧＣ ＣＴＧ ＧＧＣ ＣＧＡ Ｃ ＡＴ ＧＴＴ ＧＣＴ ＧＧ−３’ （配列番号第９番） この独特の制限部位の存在によって正確にスクリーニングできるようなＳｆｉｌ
部位（下線で示す）をこのプライマーに導入した。ＥｃｏＲＩ−Ｓｓｔ１断片を
ｐＢＬａｐｒにサブクローニングして戻すことによってＳｆｉｌ部位を含む新し
いプラスミドを作った。

【００５４】 ｐＨＰ１３プラスミド(Haima et al., Mol. Gen. Genet., Vol 209, pp335-34
2(1987)）（図５）はＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで分解し、できたベクターを ポリアクリルアミドゲルで精製し、溶出した。ｐＢＬａｐｒプラスミドはＨｉｎ
ｄＩＩＩ、Ａｓｐ７１８、およびＡｓｐ７１８とは別にＥｃｏＲＩで分解し、ゲ
ル精製した。２つのバンド、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８（１２０３ｂｐ）お
よびＡｓｐ７１８−ＥｃｏＲＩ（１２５３ｂｐ）をゲル精製し、ゲルから溶出し
、３方連結によってベクターに連結し、α−アミラーゼの発現に用いるプラスミ
ドであるｐＨＰ.ＢＬプラスミドを得た（図７）。

【００５５】 実施例２ Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃあるいは Ｄ１２４Ｃ／Ｒ１２７Ｃにおける置換を 備えているα−アミラーゼをコードするプラスミドの構成 １５番目のアミノ酸であるメチオニンに対するスレオニン置換を持ったｐＢＬ
ａｐｒプラスミドを米国特許出願第０８／１９４，６６４号（ＰＣＴ公開第ＷＯ
９４／１８３１４号）に従って構成した。さらにシステイン残基を導入するため
に、Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃおよび Ｄ１２４Ｃ／Ｒ１２７Ｃの置換をコードす る以下の変異誘発プライマーを、以下に述べるように多量体化法によってプラス
ミドの線形多重直列反復配列に望ましい変異を導入するための非変異誘発プライ
マーとともに用いた。

【００５６】１１９ＣＭ９０Ｃ ＡＡ ＣＣｇ Ｃｇｇ ＴＴＴ ｇＣｇ ＴＣｇＡＴＣ ＣＣｇ ＣＴｇ ＡＣＣ ｇＣ Ａ ＡＣＣ ｇＣｇ ＴＡＡ ＴＴＴ ｇＣｇ ｇＡｇ ＡＡＣ ＡＣＣ （配列番号大 １０番）１２４Ｃ／１２７Ｃ ＴＣｇ ＡＴＣ ＣＣｇ ＣＴＴ ｇＣＣ ｇＣＡ ＡＣＴｇＣｇ ＴＡＡ ＴＴＴ Ｃ Ａｇ ｇＡｇ ＡＡ （配列番号第１１番） 変異誘発プライマー（上記参照）で開始し、コード領域の３’末端で終了する
断片はＰＣＲで作成した。この断片をゲル精製し、以下のような望ましいシステ
イン変異をコードするプラスミドの、長い線形直列反復配列を作るのに用いた：
ベクター（ｐＢＬａｐｒ／Ｍ１５Ｔ）は制限酵素（Ｓａｌ１）で直線化し、キ
アゲン・キットを用いて精製した。多重体化反応は通常、１００(ｌの反応混合 物中に、ｐＨ８．０のトリス緩衝液５．４ｍＭ、１ｘＸＬ緩衝液（パーキンエル
マー、ブランチバーグ、ＮＪ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．１ｍＭのＭｇ（
ＯＡｃ）_２、３ｎｇ/(ｌの新しく作った断片、０．１５ｎｇ／(ｌの直線化した ベクター、４ＵのｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＸＬ（パーキンエルマー）が
含まれている。ＰＣＲ反応は典型的に、以下の条件下で温度サイクラーにおいて
行った：２０サイクル（９４℃で１５秒、６８℃で５分）および１５サイクル（
９４℃で１５秒、６８℃で１０分）。

【００５７】 作成された多重体は、常法により枯草菌感応細胞で直接形質転換した。プラス
ミドＤＮＡは常法で形質転換体から単離した。

【００５８】 変異体はジデオキシ配列決定法で確認した（Sanger et al., Proc. Natl. Aca d. Sci. USA , Vol. 74, pp.5463-5467(1977)）。

【００５９】 実施例３ 枯草菌におけるプラスミドの形質転換、 変異体α−アミラーゼの発現および精製 上述のプラスミドで形質転換した後、α−アミラーゼは枯草菌で発現させても
よい。ｐＨＰ１３は大腸菌および枯草菌で複製できるプラスミドである。Anagno
stopoulos et al., J. Bacter., Vol 81, pp741-746(1961)に記載されているよ うに、様々な変異体を含むプラスミドを大腸菌ＭＭ２９４株を用いて構成し、プ
ラスミドを単離した後、枯草菌で形質転換した。枯草菌株は２つのプロテアーゼ
（■ａｐｒ、■ｎｐｒ）（たとえば、Ferrari et al., 米国特許第５，２６４，
３５６号参照）およびアミラーゼ（■ａｍｙＥ）（たとえばStahl et al., J. B acter. , Vol. 158, pp.411-418(1984)参照）を欠損させてある。形質転換の後、
ｓａｃＵ（Ｈｙ）変異（Henner et al., J. Bacter. Vol. 170, pp.296-300(198
8)）をＰＢＳ−１介在性の形質導入によって導入した(Hoch, J. Bact., Vol. 15
4, pp.1513-1515(1983)）。

【００６０】 枯草菌から分泌されたアミラーゼは以下のように培養液から回収した：培養上
清に塩化ナトリウムを２０ｍＭになるまで加え、ｐＨ７．２のトリス緩衝液でｐ
Ｈをおよそ７．０に調整した。上清を７０℃で１５分間加熱し、遠心分離により
沈殿物を除いた。上清に硫酸アンモニウムを１．３Ｍまで加え、その後２０ｍｌ
のフェニルセファロースファーストフロー６（高い置換）樹脂（ファーマシア）
を加えた。撹拌した後、濾過によって樹脂を分離し、１Ｍの硫酸アンモニウム、
２０ｍＭのｐＨ７．０の酢酸アンモニウム、５ｍＭの塩化カルシウム中で洗浄し
た。結合したアミラーゼは２０ｍＭのｐＨ７．０の酢酸アンモニウム、５ｍＭの
塩化カルシウムで溶出し、７０％飽和硫酸アンモニウムを加えることによって沈
殿させた。沈殿した物質を遠心分離で回収し、最少量の２０ｍＭのｐＨ７．０の
酢酸アンモニウム、５ｍＭの塩化カルシウムに再溶解し、同じ緩衝液に対して透
析した。

【００６１】 野生型の特異活性を決める、可溶性基質アッセイを用いて濃度を測定した。

【００６２】 実施例４ α−アミラーゼ活性を測定するためのアッセイ 可溶性基質アッセイ：メガザイム（Ａｕｓｔ．）Ｐｔｙ社が供給している終点
アッセイキットに基づいて速度アッセイを開発した。１バイアルの基質（ｐ−ニ
トロフェニルマルトヘプタオシド、ＢＰＮＰＧ７）を１０ｍｌの無菌水に溶解し
、続いてアッセイ緩衝液（５０ｍＭリンゴ酸緩衝液、ｐＨ６．７、５ｍＭの塩化
カルシウム、０．００２％のツイーン２０）で１：４に希釈した。アッセイはキ
ュベットの中に１０(ｌのアミラーゼと７９０(ｌの基質を加えることによって２
５℃で行った。加水分解速度は７５秒後の４１０ｎｍにおける吸収の変化率で測
定した。アッセイは０．２吸収ユニット/分まで線形であった。

【００６３】 α−アミラーゼのタンパク質濃度は、Bradford, Anal. Biochem., Vol. 72, p
p.248(1976)の方法に基づいた標準バイオラッドアッセイ（バイオラッド・ラボ ラトリーズ）を用い、ウシ血清アルブミンを標準として測定した。

【００６４】 実施例５ 熱安定性に関する別の変異体α−アミラーゼの作成と試験 変異体B. licheniformisα−アミラーゼを、Ｍ１５ＴあるいはＭ１５Ｔ／Ｅ１
１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃにおける置換を持つよう作成した。様々な変異体について熱
による失活速度を以下の方法に従って測定した。アミラーゼの保存溶液を２０ｍ
Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．５の４ｍＭのＣａＣｌ_２に対して充分に透析し
た。各試料は等量の２つのバイアルに分け、一方にはジチオスレイトールを１０
ｍＭで加え、４℃で少なくとも一晩保管した。安定性を測定するために、これを
５０ｍＭの酢酸アンモニウム、５ｍＭのＣａＣｌ_２、０．００２％のツイーン２
０ｐＨ４．８で最終濃度が３０から５０(ｇ/ｍｌの間になるように＞５０倍に希
釈した。１０ｍＭのＤＴＴを含むこれらについて、希釈緩衝液には１ｍＭのＤＴ
Ｔが含まれていた。１００(ｌずつの等量溶液をエッペンドルフ管に入れて、８ ３℃のウオーターバスあるいはホットブロックに入れた。エッペンドルフ管を定
期的に取りだし、３０秒間隔と５分に測定し、失活を止めるために氷上に置いた
。残っている活性を実施例４に述べたような可溶性基質を用いて測定した。活性
の自然対数をインキュベート時間に対してプロットし、失活の速度定数を直線の
傾きから得た。様々な変異体の結果を表１に示した。

【００６５】

【表１】 表１に見られるように、ジスルフィド結合を形成できるように２つのシステイ
ンを導入した変異体酵素は、システインを導入していないＭ１５Ｔ変異体に比べ
て有意に安定性が増していることを示した。さらに表１で見られるように、Ｅ１
１９ＣとＳ１３０Ｃとの間にジスルフィド結合を導入した変異体酵素は、Ｍ１５
Ｔ変異体あるいはＤＴＴ処理したＭ１５Ｔ／Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃ変異体（す
なわちジスルフィド結合が還元されている、および/あるいは破壊されている） よりも有意に安定性が改善していることを示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】 Bacillus licheniformisのα−アミラーゼに相当するＥ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃ
およびＤ１２４Ｃ／Ｒ１２７Ｃの導入によって安定化した２次構造の領域を示す
図

【図２】 Gray et al., J. Bacteriology, Vol. 166, pp.635-643(1986)に記載されてい
る、Bacillus licheniformis由来のα−アミラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列（ＮＣＩ
Ｂ８０６１）（配列番号第１番）および転写産物の推定アミノ酸配列（配列番号
第２番）を示す図

【図３】 Bacillus licheniformis由来の完全なα−アミラーゼ酵素のアミノ酸配列（配
列番号第３番）を示す図

【図４】 ３つのBacillus α−アミラーゼの１次構造の配置を示す図である。Bacillus
licheniformisのα−アミラーゼ（Ａｍ−Ｌｉｃｈ）（配列番号第４番）はGray
et al., J. Bacteriology, Vol. 166, pp.635-643(1986)によって記載され；Ba
cillus amyloliquefaciensのα−アミラーゼ（Ａｍ−Ａｍｙｌｏ）（配列番号第
５番）はTakkinen et al., J. Biol. Chem., Vol. 258, pp.1007-1013(1983)に より記載され；およびBacillus stearothermophilusのα−アミラーゼ（Ａｍ− Ｓｔｅａｒｏ）（配列番号第６番）は、Ihara et al., J. Biochem., Vol. 98,
pp.95-103(1985)により記載されている

【図５】 プラスミドｐＨＰ１３を示す図であり、Ｃｍ^Ｒはクロラムフェニコール抵抗性
を表し、Ｅｍ^Ｒはエリスロマイシン抵抗性を表し、Ｒｅｐ ｐＴＡ１０６０はプ
ラスミドｐＴＡ１０６０の複製基点を表す

【図６】 プラスミドｐＢＬａｐｒを示す図であり、ＢＬＡＡはBacillus licheniformis
のα−アミラーゼ遺伝子を表し、；ａｐｒＥはａｐｒＥ遺伝子のプロモーターと
シグナルペプチドをコードする領域を表し；ＡｍｐＲはｐＢＲ３２２由来のアン
ピシリン抵抗性遺伝子を示し；ＣＡＴはｐＣ１９４由来のクロラムフェニコール
抵抗性遺伝子を表す

【図７】 Bacillus licheniformisのα−アミラーゼ遺伝子を持ったｐＨＰ．ＢＬプラス
ミドを示す図である

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｓ 3/12 (Ｃ１２Ｎ 9/28 //(Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:10） Ｃ１２Ｒ 1:10） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA13 CA04 CA06 DA06 DA07 EA04 GA11 HA01 HA06 4B050 CC04 DD02 FF09E LL02 LL04 4B064 AG01 CA03 CA19 CC24 CE10 DA10 DA19 4B065 AA15X AA15Y AB01 BD14 CA32 CA41 CA57 4H003 DA01 DA17 DA19 EC01 FA47

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １番目と２番目のシステイン残基の間にジスルフィド結合を
   形成することができる変異体αアミラーゼであって、前記異位型αアミラーゼは
   前駆体αアミラーゼに由来し、前記１番目のシステイン残基は前記前駆体αアミ
   ラーゼに対するアミノ酸の置換あるいは付加の結果生じることを特徴とする変異
   体αアミラーゼ。
2. 【請求項２】 前記１番目のシステインは、前記２番目のシステイン残基、
   あるいは前記前駆体αアミラーゼの２番目のシステイン残基に相当する残基との
   間で、Ｃα−Ｃα結合距離がおよそ４．４〜６．８オングストロームおよびＣβ
   −Ｃβ結合距離がおよそ３．４５から４．５オングストロームの間であるような
   前記前駆体αアミラーゼにおける残基に相当することを特徴とする請求項１記載
   の変異体αアミラーゼ。
3. 【請求項３】 前記αアミラーゼはＥ１１９Ｃ/Ｓ１３０Ｃおよび/あるいは
   Ｄ１２４Ｃ/Ｒ１２７Ｃバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis)
   に相当する置換を備えていることを特徴とする請求項２記載の変異体αアミラー
   ゼ。
4. 【請求項４】 前記αアミラーゼは細菌あるいは真菌に由来することを特徴
   とする請求項１記載の変異体αアミラーゼ。
5. 【請求項５】 前記αアミラーゼはバチルスに由来することを特徴とする請
   求項１記載の変異体αアミラーゼ。
6. 【請求項６】 前記αアミラーゼは、Bacillus licheniformis、 Bacillus
   stearothermophilusあるいはBacillus amyloliquefaciensに由来することを特 徴とする請求項５記載の変異体αアミラーゼ。
7. 【請求項７】 前記αアミラーゼは、バチルス・リケニフォルミス(Bacillu
   s licheniformis)におけるＭ１５、Ａ３３、Ａ５２、Ｓ８５、Ｎ９６、Ｖ１２９
   、Ｈ１３３、Ｓ１４８Ｎ、Ｓ１８７、Ｎ１８８、Ａ２０９、Ａ２６９および/あ るいはＡ３７９に相当する残基の欠失あるいは置換を備えていることを特徴とす
   る請求項１記載の変異体αアミラーゼ。
8. 【請求項８】 バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)にお
   けるＭ１５Ｔ／Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｌ／Ｅ１１９Ｃ／
   Ｓ１３０Ｃ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｔ／Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ
   １８８Ｓ、Ｍ１５Ｔ／Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ／Ａ２
   ０９Ｖ、Ｍ１５Ｔ／Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃ／Ｎ１８８Ｓ／Ａ２０９Ｖ、Ｍ１５
   Ｔ／Ｅ１１９Ｃ／Ｖ１２８Ｅ／Ｓ１３０Ｃ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｔ
   ／Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃ／Ｓ１８７Ｄ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｔ／Ｅ１１９Ｃ／
   Ｓ１３０Ｃ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ／Ａ２０９Ｖ、Ｍ１５Ｔ／Ｅ１１９Ｃ／Ｓ
   １３０Ｃ／Ｈ１３３Ｙ／Ｓ１４８Ｎ／Ｎ１８８Ｓ／Ａ２０９Ｖ／Ａ３７９Ｓある
   いはＭ１５Ｔ／Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃ／Ｈ１３３Ｙに相当する置換による前駆
   体αアミラーゼに由来するＤＮＡ配列の変異体である、α−アミラーゼをコード
   する変異体ＤＮＡ配列の発現産物であるα−アミラーゼ。
9. 【請求項９】 置換はさらにバチルス・リケニフォルミスにおけるＭ１５Ｔ
   、Ｗ１３８Ｙおよび/あるいはＭ１９７Ｔに相当する残基の置換あるいは欠失を 備えることを特徴とする請求項１記載の変異体αアミラーゼ。
10. 【請求項１０】 請求項１記載のα−アミラーゼをコードするＤＮＡ。
11. 【請求項１１】 請求項１０記載のＤＮＡを備えている発現ベクター。
12. 【請求項１２】 請求項１１記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞。
13. 【請求項１３】 低いｐＨでの働きを高めた請求項１、３あるいは７記載の
    α−アミラーゼ。
14. 【請求項１４】 請求項１記載のα−アミラーゼを含む洗剤組成物。
15. 【請求項１５】 前記洗剤は汚れた洗濯物や皿をきれいにするのに有用であ
    ることを特徴とする請求項１４記載の洗剤組成物。
16. 【請求項１６】 請求項１記載のα−アミラーゼをデンプン懸濁液に接触さ
    せる工程を含むデンプンを液化する方法。