PL208712B1

PL208712B1 - Rozpuszczalny receptor komórek T (sTCR), rozpuszczalna αβ-postać receptora komórek T (sTCR), wielowartościowy kompleks receptora komórek T (TCR), sposób wykrywania kompleksów MHC-peptyd, środek farmaceutyczny zawierający sTCR i/lub wielowartościowy kompleks TCR, cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarz, sposób otrzymywania całości lub części łańcucha α TCR albo całości lub części łańcucha β TCR, sposób otrzymywania rozpuszczalnego receptora komórek T (sTCR), sposób otrzymywania rozpuszczalnej αβ-postaci receptora komórek T (sTCR) oraz sposób wykrywania kompleksów MHC-peptyd

Info

Publication number: PL208712B1
Application number: PL368980A
Authority: PL
Inventors: Bent Karsten Jakobsen; Meir Glick
Original assignee: Avidex Ltd
Priority date: 2001-08-31
Filing date: 2002-08-30
Publication date: 2011-05-31
Also published as: WO2003020763A3; CA2457652A1; DE60203125D1; US20080125369A1; IL160359A; US7763718B2; WO2003020763A2; ES2239246T3; US7329731B2; NO20041325L; AU2002321581B2; JP2005514006A; HK1066018A1; IL160359A0; PL368980A1; NO331877B1; US20050009025A1; PT1421115E; WO2003020763A9; DE60203125T2

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy rozpuszczalnego receptora komórek T (sTCR), rozpuszczalnej αβ-postaci receptora komórek T (sTCR), wielowartościowego kompleksu receptora komórek T (TCR), sposobu wykrywania kompleksów MHC-peptyd, środka farmaceutycznego zawierającego sTCR i/lub wielowartościowy kompleks TCR, cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej sekwencję kodującą (i) lub (ii) sTCR, wektora zawierającego cząsteczkę kwasu nukleinowego, komórki gospodarza zawierającej wektor, sposobu otrzymywania (i) całości lub części łańcucha α TCR albo (ii) całości lub części łańcucha β TCR, sposobu otrzymywania rozpuszczalnego receptora komórek T (sTCR), sposobu otrzymywania rozpuszczalnej αβ-postaci receptora komórek T (sTCR) oraz sposobu wykrywania kompleksów MHC-peptyd.

Jak opisano w WO 99/60120, TCR uczestniczą w rozpoznawaniu określonych kompleksów główny kompleks zgodności tkankowej (MHC)-peptyd przez komórki T i, jako takie, są niezbędne do funkcjonowania składowej komórkowej układu immunologicznego.

Przeciwciała i TCR są jedynymi dwoma typami cząsteczek, które rozpoznają antygeny w specyficzny sposób, a zatem TCR jest jedynym receptorem dla konkretnych antygenów peptydowych prezentowanych w MHC, a obcy peptyd często jest jedynym sygnałem nieprawidłowości wewnątrz komórki. Rozpoznawanie przez komórki T zachodzi gdy komórka T i komórka prezentująca antygen (APC) są w bezpośrednim kontakcie fizycznym i jest zapoczątkowywane przez ligację TCR specyficznych dla antygenu z kompleksami pMHC.

TCR jest heterodimerycznym białkiem powierzchniowym komórki z nadrodziny immunoglobulin, które jest związane z niezmiennymi białkami kompleksu CD3 uczestniczącymi w pośredniczeniu w przekazywaniu sygnału. TCR występuje w postaciach αβ i γδ, które są strukturalnie podobne, ale komórki T wyrażające je mają całkiem odmienne lokalizacje anatomiczne i prawdopodobnie różne funkcje. Zewnątrzkomórkowa część receptora składa się z dwóch błonowych bliższych domen stałych oraz dwóch błonowych dalszych domen zmiennych niosących polimorficzne pętle analogiczne do regionów determinujących dopasowanie (CDR) przeciwciał. To właśnie pętle tworzą miejsce wiązania cząsteczki TCR i determinują specyficzność względem peptydu. Ligandy MHC klasy I i klasy II także są białkami z nadrodziny immunoglobulin, ale są wyspecjalizowane do prezentowania antygenu, z polimorficznym miejscem wiązania peptydu, które umożliwia im prezentowanie szerokiego wachlarza krótkich fragmentów peptydowych na powierzchni komórki APC.

Rozpuszczalne TCR są użyteczne, nie tylko do celów badania specyficznych oddziaływań TCRpMHC, ale także potencjalnie jako narzędzie diagnostyczne do wykrywania zakażenia lub do wykrywania markerów choroby autoimmunologicznej. Rozpuszczalne TCR mają także zastosowanie w wybarwianiu, np. do wybarwiania komórek na obecność konkretnego antygenu peptydowego prezentowanego w kontekście MHC. Podobnie, rozpuszczalne TCR można stosować do dostarczania środka terapeutycznego, np. związku cytotoksycznego lub związku immunostymulującego, do komórek prezentujących konkretny antygen. Rozpuszczalne TCR można także stosować do hamowania komórek T, np. tych reagujących na autoimmunologiczny antygen peptydowy.

Białka, które składają się z więcej niż jednej podjednostki polipeptydu oraz, które zawierają domenę transbłonową może być trudne do wytworzenia w postaci rozpuszczalnej gdyż, w wielu przypadkach, białko jest stabilizowane przez region transbłonowy. Jest tak w przypadku TCR i odzwierciedla to literatura naukowa opisująca skrócone formy TCR, zawierające albo tylko domeny zewnątrzkomórkowe albo domeny zewnątrzkomórkowe i cytoplazmatyczne, które mogą być rozpoznawane przez przeciwciała specyficzne względem TCR (co oznacza, że część rekombinowanego TCR rozpoznawana przez przeciwciało została prawidłowo zwinięta), ale nie mogą być wytwarzane z dobrą wydajnością, nie są trwałe w niskich stężeniach i/lub nie mogą rozpoznawać kompleksów MHC-peptyd. Te dane literaturowe zebrano w WO 99/60120.

Wiele publikacji opisuje wytwarzanie heterodimerów TCR, które zawierają natywny mostek disulfidowy łączący poszczególne podjednostki (Garboczi i inni, (1996), Nature 384 (6605): 134-41; Garboczi i inni, (1996), J Immunol 157(12): 5403-10; Chang i inni, (1994), PNAS USA 91: 1140811412; Davodeau i inni, (1993), J. Biol. Chem. 268(21): 15455-15460; Golden i inni, (1997), J. Imm. Meth. 206: 163-169; opis patentowy US 6080840). Jednakże, pomimo, że takie TCR mogą być rozpoznawane przez przeciwciała specyficzne dla TCR, nie wykazano aby jakikolwiek z nich rozpoznawał swój natywny ligand w jakimkolwiek innym niż względnie wysokim stężeniu i/lub były one nietrwałe.

PL 208 712 B1

W WO 99/60120, opisano rozpuszczalny TCR, który jest prawidłowo zwinięty, tak, że jest zdolny rozpoznawać swój natywny ligand, jest trwały przez pewien okres i może być wytwarzany w rozsądnych ilościach. Ten TCR zawiera zewnątrzkomórkową domenę łańcucha α lub γ TCR zdimeryzowaną odpowiednio z zewnątrzkomórkową domeną łańcucha β lub δ TCR, przez parę C-końcowych peptydów dimeryzujących, takich jak suwaki leucynowe. Ta strategia wytwarzania TCR ma ogólne zastosowanie do wszystkich TCR.

W Reiter i inni, Immunity, 1995, 2:281-287, opisano szczegóły konstrukcji rozpuszczalnej cząsteczki zawierającej stabilizowane mostkami disulfidowymi domeny zmienne α i β TCR, z których jedna jest połączona ze skróconą formą egzotoksyny Pseudomonas (PE38). Jedną z podanych przyczyn wytwarzania tej cząsteczki było przezwyciężenie wrodzonej niestabilności jednołańcuchowych TCR. Pozycja nowego wiązania disulfidowego w domenach zmiennych TCR została zidentyfikowana przez homologię z domenami zmiennymi przeciwciał, do których wcześniej wprowadzono takie wiązanie (np.

patrz Brinkmann, i inni (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7538-7542 oraz Reiter, i inni (1994)

Biochemistry 33: 5451-5459). Jednakże, ponieważ nie występuje taka homologia pomiędzy przeciwciałem, a domenami stałymi TCR, taka technika nie mogłaby być zastosowana do zidentyfikowania odpowiednich miejsc dla nowych międzyłańcuchowych wiązań disulfidowych pomiędzy stałymi domenami TCR.

Uwzględniając znaczenie rozpuszczalnych TCR, pożądane byłoby dostarczenie alternatywnego sposobu wytwarzania takich cząsteczek.

Wynalazek dotyczy rozpuszczalnego receptora komórek T (sTCR), zawierającego (i) całość lub część łańcucha α TCR, z wyjątkiem jego domeny transbłonowej, oraz (ii) całość lub część łańcucha β TCR, z wyjątkiem jego domeny transbłonowej, gdzie każdy z (i) i (ii) zawiera funkcjonalną domenę zmienną i co najmniej część domeny stałej łańcucha TCR, przy czym (i) i (ii) są połączone ze sobą wiązaniem disulfidowym pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za

Thr 48 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 57 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01;

Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 77 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01;

Tyr 10 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 17 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01;

Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Asp 59 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01; albo

Ser 15 egzonu 1 TRAC*01 i Glu 15 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.

Korzystny jest sTCR, w którym (i) i/lub (ii) zawiera całość zewnątrzkomórkowej stałej domeny Ig łańcucha TCR.

Korzystny jest sTCR, w którym (i) i/lub (ii) zawiera całość domeny zewnątrzkomórkowej łańcucha TCR.

Korzystny jest sTCR, w którym międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe nie występuje w natywnym TCR.

Korzystny jest sTCR, w którym niesparowana reszta cysteiny obecna w natywnym łańcuchu β TCR nie występuje.

Korzystny jest sTCR, w którym każdy z (i) i (ii) zawiera funkcjonalną domenę zmienną pierwszego TCR zfuzowaną z całością lub częścią stałej domeny drugiego TCR, przy czym pierwszy i drugi TCR pochodzą z tego samego gatunku.

Korzystny jest sTCR, w którym domeny stałe drugiego TCR są skrócone na N-końcu od reszt tworzących nienatywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe.

Korzystny jest sTCR, w którym jeden lub obydwa łańcuchy są przeprowadzone w pochodną lub zfuzowane z ugrupowaniem na swoim C- i/lub N-końcu z którym może być zfuzowane ugrupowanie.

Korzystny jest sTCR, w którym jeden lub obydwa łańcuchy zawierają resztę cysteiny na swoim C- i/lub N-końcu, z którym może być zfuzowane ugrupowanie.

Korzystny jest sTCR, który ponadto zawiera wykrywalny znacznik.

Korzystny jest sTCR, który jest związany ze środkiem terapeutycznym.

Wynalazek dotyczy także rozpuszczalnej αβ-postaci receptora komórek T (sTCR), w której kowalencyjne wiązanie disulfidowe łączy reszty cysteiny podstawione za

Thr 48 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 57 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01;

Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 77 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01;

Tyr 10 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 17 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01;

Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Asp 59 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01 albo

Ser 15 egzonu 1 TRAC*01 i Glu 15 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.

PL 208 712 B1

Korzystny jest sTCR, który ponadto zawiera wykrywalny znacznik.

Korzystny jest sTCR, który jest związany ze środkiem terapeutycznym.

Wynalazek dotyczy również rozpuszczalnego receptora komórek T (sTCR), który zawiera (i) całość lub część łańcucha α TCR, z wyjątkiem jego domeny transbłonowej, oraz (ii) całość lub część łańcucha β TCR, z wyjątkiem jego domeny transbłonowej, gdzie każdy z (i) i (ii) zawiera funkcjonalną domenę zmienną i co najmniej część domeny stałej łańcucha TCR i są one połączone ze sobą wiązaniem disulfidowym pomiędzy resztami domeny stałej, nie występującym w natywnym TCR i gdzie międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe nie występuje w natywnym TCR.

Korzystny jest sTCR, który zawiera całość zewnątrzkomórkowej stałej domeny Ig łańcucha

TCR.

Korzystny jest sTCR, w którym wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi resztami, których węgle β są od siebie w odległości mniejszej niż 0,6 nm w natywnej strukturze TCR.

Korzystny jest sTCR, w którym wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 48 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 57 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.

Korzystny jest sTCR, w którym wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 77 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.

Korzystny jest sTCR, w którym wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Tyr 10 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 17 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.

Korzystny jest sTCR, w którym wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Asp 59 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.

Korzystny jest sTCR, w którym wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Ser 15 egzonu 1 TRAC*01 i Glu 15 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.

Korzystny jest sTCR, w którym natywne łańcuchy α i β TCR są skrócone na C-końcu, tak, że reszty cysteiny tworzące natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe są usunięte.

Korzystny jest sTCR, w którym reszty cysteiny tworzące natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe są zastąpione inną resztą.

Korzystny jest sTCR, w którym reszty cysteiny tworzące natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe są zastąpione seryną lub alaniną.

Korzystny jest sTCR, w którym każdy z (i) i (ii) zawiera funkcjonalną domenę zmienną pierwszego TCR zfuzowaną z całością lub częścią stałej domeny drugiego TCR, przy czym pierwszy i drugi

TCR pochodzą z tego samego gatunku.

PL 208 712 B1

Korzystny jest sTCR, który ponadto zawiera wykrywalny znacznik.

Korzystny jest sTCR, który jest związany ze środkiem terapeutycznym.

Wynalazek dotyczy ponadto rozpuszczalnej αβ-postaci receptora komórek T (sTCR), w której kowalencyjne wiązanie disulfidowe łączy resztę regionu immunoglobulinowego domeny stałej łańcucha α z resztą regionu immunoglobulinowego domeny stałej łańcucha β, przy czym międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe nie występuje w natywnym TCR.

Korzystny jest sTCR, w którym wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 77 egzonu

TRBC1*01 lub TRBC2*01.

Korzystny jest sTCR, w którym wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Tyr 10 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 17 egzonu

TRBC1*01 lub TRBC2*01.

Korzystny jest sTCR, w którym wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Asp 59 egzonu

TRBC1*01 lub TRBC2*01.

Korzystny jest sTCR, w którym wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Ser 15 egzonu 1 TRAC*01 i Glu 15 egzonu

TRBC1*01 lub TRBC2*01.

Korzystny jest sTCR, który ponadto zawiera wykrywalny znacznik.

Korzystny jest sTCR, który jest związany ze środkiem terapeutycznym.

Wynalazek dotyczy też wielowartościowego kompleksu receptora komórek T (TCR), który zawiera wiele sTCR określonych powyżej.

Korzystny jest kompleks, który zawiera multimer sTCR.

Korzystny jest kompleks, który zawiera dwie lub trzy lub cztery lub większą liczbę cząsteczek receptora komórek T, związanych ze sobą, korzystnie przez cząsteczkę łącznikową.

Korzystny jest kompleks, w którym sTCR lub multimery sTCR są obecne w dwuwarstwie lipidowej i są połączone z cząstką.

Wynalazek dotyczy także sposobu wykrywania kompleksów MHC-peptyd, polegającego na tym, że:

PL 208 712 B1 (i) dostarcza się rozpuszczalny TCR lub wielowartościowy kompleks receptora komórek T;

(ii) kontaktuje się rozpuszczalny TCR lub wielowartościowego kompleksu TCR z kompleksami MHC-peptyd; oraz (iii) wykrywa się wiązanie rozpuszczalnego TCR lub wielowartościowego kompleksu TCR z kompleksami MHC-peptyd przy czym stosuje się rozpuszczalny TCR określony powyżej lub wielowartościowy kompleks receptora komórek T określony powyżej.

Wynalazek dotyczy również środka farmaceutycznego zawierającego substancję czynną razem z farmaceutycznie dopuszczalnym noś nikiem, który jako substancję czynną zawiera sTCR okreś lony powyżej i/lub wielowartościowy kompleks TCR określony powyżej.

Wynalazek dotyczy ponadto cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej sekwencję kodującą (i) lub (ii) sTCR określonego powyżej lub sekwencję do niej komplementarną.

Wynalazek dotyczy też wektora zawierającego cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną powyżej.

Wynalazek dotyczy także komórki gospodarza zawierającej wektor określony powyżej.

Wynalazek dotyczy również sposobu otrzymywania (i) lub (ii), określonych powyżej polegającego na inkubacji komórki gospodarza w warunkach wywołujących ekspresję peptydu, a następnie oczyszczeniu polipeptydu przy czym stosuje się komórkę gospodarza określoną powyżej.

Korzystnie sposób ponadto polega na mieszaniu (i) i (ii) w odpowiednich warunkach ponownego zwijania.

Wynalazek dotyczy także sposobu otrzymywania rozpuszczalnego receptora komórek T (sTCR), polegającego na tym, że:

inkubuje się komórkę gospodarza, zawierają wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego (i) całość lub część łańcucha α TCR, z wyjątkiem jego domeny transbłonowej, oraz komórkę gospodarza, zawierającą wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego (ii) całość lub część łańcucha β TCR, z wyjątkiem jego domeny transbłonowej, w warunkach wywołujących ekspresję (i) i (ii);

oczyszcza się (i) i (ii); oraz miesza się (i) i (ii) w warunkach ponownego zwijania, przy czym każdy z (i) i (ii) zawiera funkcjonalną domenę zmienną i co najmniej część domeny stałej łańcucha TCR oraz miesza się (i) i (ii) w warunkach ponownego zwijania tak że są one połączone ze sobą wią zaniem disulfidowym pomiędzy resztami domeny stałej, nie występującym w natywnym TCR.

Korzystny jest sposób, w którym (i) i/lub (ii) zawiera całość zewnątrzkomórkowej stałej domeny Ig łańcucha TCR.

Korzystny jest sposób, w którym (i) i/lub (ii) zawiera całość domeny zewnątrzkomórkowej łańcucha TCR.

Korzystny jest sposób, w którym międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe nie występuje w natywnym TCR.

Korzystny jest sposób, w którym natywne łańcuchy α i β TCR są skrócone na C-końcu, tak, że reszty cysteiny tworzące natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe są usunięte.

Korzystny jest sposób, w którym reszty cysteiny tworzące natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe są zastąpione inną resztą.

Korzystny jest sposób, w którym reszty cysteiny tworzące natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe są zastąpione seryną lub alaniną.

Korzystny jest sposób, w którym niesparowana reszta cysteiny obecna w natywnym łańcuchu β TCR nie występuje.

Korzystny jest sposób, w którym wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi resztami, których węgle β są od siebie w odległości mniejszej niż 0,6 nm w natywnej strukturze TCR.

Korzystny jest sposób, w którym wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 48 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 57 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.

Korzystny jest sposób, w którym wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 77 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.

PL 208 712 B1

Korzystny jest sposób, w którym wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Tyr 10 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 17 egzonu

TRBC1*01 lub TRBC2*01.

Korzystny jest sposób, w którym wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Asp 59 egzonu

TRBC1*01 lub TRBC2*01.

Korzystny jest sposób, w którym wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Ser 15 egzonu 1 TRAC*01 i Glu 15 egzonu

TRBC1*01 lub TRBC2*01.

Korzystny jest sposób, w którym każdy z (i) i (ii) zawiera funkcjonalną domenę zmienną pierwszego TCR zfuzowaną z całością lub częścią stałej domeny drugiego TCR, przy czym pierwszy i drugi TCR pochodzą z tego samego gatunku.

Korzystny jest sposób, w którym domeny stałe drugiego TCR są skrócone na N-końcu od reszt tworzących nienatywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe.

Korzystny jest sposób, w którym jeden lub obydwa łańcuchy są przeprowadzone w pochodną lub zfuzowane z ugrupowaniem na swoim C- i/lub N-końcu.

Korzystny jest sposób, w którym jeden lub obydwa łańcuchy zawierają resztę cysteiny na swoim C- i/lub N-końcu, z którym może być zfuzowane ugrupowanie.

Korzystny jest sposób, w którym sTCR ponadto zawiera wykrywalny znacznik.

Korzystny jest sposób, w którym sTCR jest związany ze środkiem terapeutycznym.

Korzystny jest sposób, który ponadto polega na połączeniu zawierającego wiele sTCR z wytworzeniem wielowartościowego kompleksu receptora komórek T (TCR).

Korzystny jest sposób, w którym sTCR są połączone z wytworzeniem multimeru sTCR.

Korzystny jest sposób, w którym dwie lub trzy lub cztery lub większa liczba cząsteczek receptora komórek T są związane ze sobą, korzystnie przez cząsteczkę łącznikową.

Korzystny jest sposób, w którym sTCR lub multimery sTCR są obecne w dwuwarstwie lipidowej i są połączone z cząstką.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu otrzymywania rozpuszczalnej αβ-postaci receptora komórek T (sTCR), polegającego na tym, że:

inkubuje się komórkę gospodarza, zawierającą wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego łańcuch α TCR, oraz komórkę gospodarza, zawierającą wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego łańcuch β TCR, w warunkach wywołujących ekspresję odpowiednich łańcuchów TCR, oczyszcza się odpowiednie łańcuchy TCR; oraz miesza się odpowiednie łańcuchy TCR w warunkach ponownego zwijania, przy czym odpowiednie łańcuchy TCR miesza się tak że kowalencyjne wiązanie disulfidowe łączy resztę regionu immunoglobulinowego domeny stałej łańcucha α z resztą regionu immunoglobulinowego domeny stałej łańcucha β.

PL 208 712 B1

Korzystny jest sposób, w którym wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Tyr 10 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 17 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.

Korzystny jest sposób, w którym wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Asp 59 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.

Korzystny jest sposób, w którym wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Ser 15 egzonu 1 TRAC*01 i Glu 15 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.

Korzystny jest sposób, w którym sTCR ponadto zawiera wykrywalny znacznik.

(i) dostarcza się rozpuszczalny TCR lub wielowartościowy kompleks receptora komórek T;

(ii) kontaktuje się rozpuszczalny TCR lub wielowartościowego kompleksu TCR z kompleksami MHC-peptyd; oraz (iii) wykrywa się wiązanie rozpuszczalnego TCR lub wielowartościowego kompleksu TCR z kompleksami MHC-peptyd przy czym stosuje się rozpuszczalny TCR wytworzony sposobem określonym powyżej lub wielowartościowy kompleks receptora komórek T wytworzony sposobem określonym powyżej.

sTCR według wynalazku mają zaletę taką, że nie zawierają heterologicznych polipeptydćw, które mogą być immunogenne lub, które mogą wywoływać szybkie usuwanie sTCR z organizmu. Ponadto, TCR według wynalazku mają strukturę trójwymiarową wysoce podobną do natywnych TCR od których pochodzą oraz, ze względu na strukturalne podobieństwo, istnieje niewielkie prawdopodobieństwo aby były immunogenne. sTCR według wynalazku mogą służyć do rozpoznawania kompleksów MHC klasy I-peptyd lub MHC klasy Il-peptyd.

TCR według wynalazku są rozpuszczalne. W kontekście tego zgłoszenia, rozpuszczalność definiuje się jako zdolność TCR do oczyszczenia jako mono-rozproszonego heterodimeru w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) (KCl 2,7 mM, KH2PO4 1,5 mM, NaCl 137 mM i Na2PO4 8 mM, pH 7,1-7,5. Life Technologies, Gibco BRL) w stężeniu 1 mg/ml i >90% wspomnianego TCR pozostającego w postaci mono-rozproszonego heterodimeru po inkubacji w 25°C przez 1 godzinę. Aby ocenić rozpuszczalność TCR, najpierw oczyszcza się go jak opisano w przykładzie 2. Po oczyszczeniu

100 μg TCR analizuje się metodą analitycznej chromatografii z wykluczeniem wielkości, np. stosując kolumnę Pharmacia Superdex 75 HR równoważoną w PBS. Kolejne 100 μg TCR inkubuje się w 25°C przez 1 godzinę, a następnie analizuje metodą chromatografii z wykluczeniem wielkości jak powyżej.

Następnie zapis z chromatografii z wykluczeniem wielkości analizuje się przez całkowanie i porównuje powierzchnie pod pikami odpowiadającymi mono-rozproszonemu heterodimerowi. Odpowiednie piki

PL 208 712 B1 można zidentyfikować przez porównanie z pozycją elucji wzorców białkowych o znanej masie cząsteczkowej. Mono-rozproszony heterodimeryczny rozpuszczalny TCR ma masę cząsteczkową około 50 kDa. Jak stwierdzono powyżej, TCR według wynalazku są rozpuszczalne. Jednakże, jak wyjaśniono dalej bardziej szczegółowo, TCR mogą być sprzęgane z ugrupowaniem, tak, że powstały kompleks jest nierozpuszczalny lub mogą być prezentowane na powierzchni nierozpuszczalnego stałego nośnika.

Zastosowana tutaj numeracja reszt aminokwasowych TCR oparta jest na systemie IMGT opisanym w The T Cell Receptor Factsbook, 2001, LeFranc & LeFranc, Academic Press. W tym systemie, stała domena łańcucha α ma następujące oznaczenie: TRAC*01, gdzie „TR” oznacza gen receptora komórek T; „A” oznacza gen łańcucha α; C oznacza region stały; oraz „*01” oznacza allel 1. Stała domena łańcucha β ma następujące oznaczenie: TRBC1*01. W tym przypadku, istnieją dwa możliwe geny regionu stałego „C1” i „C2”. Ulegająca translacji domena kodowana przez każdy allel może być tworzona z kodu genetycznego kilku egzonów; zatem są one także wyszczególnione. Aminokwasy są numerowane według egzonu konkretnej domeny, w której są obecne.

Zewnątrzkomórkowa część natywnego TCR składa się z dwóch polipeptydćw (αβ lub γδ), z których każdy ma błonową bliższą domenę stałą oraz błonową dalszą domenę zmienną (patrz fig. 1). Każda z domen stałych i zmiennych zawiera wewnątrzłańcuchowe wiązanie disulfidowe. Domeny zmienne zawierają wysoce polimorficzne pętle analogiczne do regionów determinujących dopasowanie (CDR) przeciwciał. CDR3 TCR oddziaływuje z peptydem prezentowanym przez MHC, a CDR 1 i 2 oddziaływują z peptydem i MHC. Różnorodność sekwencji TCR jest tworzona przez somatyczną zmianę sprzężonych genów zmiennych (V), różnorodności (D), łączących (J) oraz genów stałych. Funkcjonalne polipeptydy łańcucha α są tworzone przez zmianę regionów V-J-C, podczas gdy łańcuchy β składają się z regionów V-D-J-C. Zewnątrzkomórkowa domena stała ma błonowy region bliższy i region immunoglobulinowy. Bł onowy region bliż szy obejmuje aminokwasy pomię dzy domeną transbłonową a błonową bliższą resztą cysteiny. Stała domena immunoglobulinowa obejmuje pozostałe reszty aminokwasowe domeny stałej, od błonowej bliższej cysteiny do początku regionu łączącego i charakteryzuje się obecnoś cią zwinię cia typu immunoglobulinowego. Istnieje pojedyncza stał a domena łańcucha α, znana jako Cal lub TRAC*01, oraz dwie różne stałe domeny β, znane jako Οβ1 lub TRBC1*01 i Οβ2 lub TRBC2*01. Różnica pomiędzy tymi różnymi domenami stałymi β dotyczy reszt aminokwasowych 4, 5 i 37 egzonu 1. Zatem, TRBC1*01 ma 4N, 5K i 37F w swoim egzonie 1, a TRBC2*01 ma 4K, 5N i 37Y w swoim egzonie 1. Rozmiar każdej z domen zewnątrzkomórkowych TCR jest w pewnym stopniu zmienny.

Według wynalazku, wiązanie disulfidowe jest wprowadzone pomiędzy resztami umiejscowionymi w domenach stałych (lub ich częściach) danych łańcuchów. Poszczególne łańcuchy TCR zawierają wystarczające domeny zmienne aby mogły oddziaływać ze swoim kompleksem pMHC. Takie oddziaływanie mierzy się za pomocą instrumentu BIAcore 3000™ lub BIAcore 2000™, jak opisano odpowiednio w przykładzie 3 lub w WO 99/6120.

W jednej postaci, poszczególne łańcuchy sTCR według wynalazku także zawierają swoje wewnątrzłańcuchowe wiązania disulfidowe. TCR według wynalazku może zawierać cały zewnątrzkomórkowy stały region Ig danych łańcuchów TCR oraz korzystnie całą domenę zewnątrzkomórkową poszczególnych łańcuchów, tj. włącznie z błonowym regionem bliższym. W natywnym TCR, występuje wiązanie disulfidowe łączące konserwatywne błonowe regiony bliższe poszczególnych łańcuchów. W jednej postaci wynalazku, to wiązanie disulfidowe nie jest obecne. Można to osiągnąć przez zmutowanie odpowiednich reszt cystein (odpowiednio aminokwas 4, egzon 2 genu TRAC*01 i aminokwas 2 obydwu genów TRBC1*01, jak i TRBC2*01) do innego aminokwasu lub skrócenie poszczególnych łańcuchów, tak, żeby reszty cysteiny nie były zawarte. Korzystny rozpuszczalny TCR według wynalazku zawiera natywne łańcuchy α i β TCR skrócone na C-końcu, tak, że reszty cysteiny, które tworzą natywne wiązanie międzyłańcuchowe są usunięte, skrócone na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub 10 resztach N-końcowych względem reszt cysteiny. Należy jednak zauważyć, że natywne wiązanie międzyłańcuchowe może być obecne w TCR według wynalazku oraz, że w pewnych postaciach, tylko jeden z łańcuchów TCR ma natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe. Ta cysteina może być stosowana do przyłączania ugrupowań do TCR.

Jednakże odpowiednie łańcuchy TCR mogą być krótsze. Ponieważ stałe domeny nie uczestniczą bezpośrednio w kontakcie z ligandami peptyd-MHC, punkt skrócenia na C-końcu może zostać zasadniczo zmieniony bez utraty funkcjonalności.

Alternatywnie, może być obecny większy niż korzystny fragment domeny stałej, tj. domeny stałe mogą nie być skrócone bezpośrednio zaraz przed cysteinami tworzącymi międzyłańcuchowe wiązanie

PL 208 712 B1 disulfidowe. Przykładowo może być zawarta cała domena stała, za wyjątkiem domeny transbłonowej (tj. domeny zewnątrzkomórkowa i cytoplazmatyczna). W tym przypadku korzystne może być zmutowanie jednej lub większej liczby reszt cystein, tworzących międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe w komórkowym TCR, do innej reszty aminokwasowej, która nie uczestniczy w tworzeniu wiązania disulfidowego, albo wydeletowanie jednej lub większej liczby z tych reszt.

Peptyd sygnałowy można pominąć jeżeli rozpuszczalny TCR ma być wyrażany w komórkach prokariotycznych, np. E. coli, ponieważ nie pełni ona żadnej funkcji w dojrzałym TCR pod względem jego zdolności wiązania ligandu i może w pewnych okolicznościach przeciwdziałać tworzeniu funkcjonalnego rozpuszczalnego TCR. W większości przypadków, miejsce cięcia w którym peptyd sygnałowy jest usuwany z dojrzałych łańcuchów TCR przewiduje się, ale nie wyznacza się go doświadczalnie. Modyfikacja metodami inżynierii genetycznej wyrażanych łańcuchów TCR, tak, że są one o kilka, tj. np. do 10 aminokwasów dłuższe lub krótsze na N-końcu może nie mieć znaczenia dla funkcjonalności (tj. zdolności rozpoznawania pMHC) rozpuszczalnego TCR. Można wprowadzić pewne addycje, nieobecne w oryginalnej sekwencji białka. Przykładowo można dodać krótką sekwencję znacznika, która może ułatwić oczyszczanie łańcuchów TCR, pod warunkiem, że nie oddziaływuje ona z prawidłową strukturą i zwijaniem miejsca wiązania antygenu TCR.

W przypadku ekspresji w E. coli, resztę metioniny można wstawić metodami inżynierii genetycznej w N-końcowym miejscu startu przewidywanej dojrzałej sekwencji białka, aby umożliwić inicjację translacji.

Dużo mniej niż wszystkie reszty w domenach zmiennych łańcuchów TCR wystarcza do specyficzności i funkcjonalności antygenu. Zatem, do tej domeny można wprowadzić znaczącą liczbę mutacji bez wpływu na specyficzność i funkcjonalność antygenu. Dużo mniej niż wszystkie reszty w domenach stałych łańcuchów TCR wystarcza do specyficzności i funkcjonalności antygenu. Zatem, do tego regionu można wprowadzić znaczącą liczbę mutacji bez wpływu na specyficzność i funkcjonalność antygenu.

Łańcuch β TCR zawiera resztę cysteiny, która nie jest sparowana w komórkowym lub natywnym TCR. Korzystne jest usunięcie lub zmutowanie tej reszty cysteiny do innej reszty aby zapobiec nieprawidłowemu parowaniu międzyłańcuchowemu lub wewnątrzłańcuchowemu. Podstawienia tej reszty cysteiny inną resztą, np. seryny lub alaniny, może mieć znaczący korzystny wpływ na skuteczność ponownego zwijania in vitro.

Wiązanie disulfidowe można wytworzyć przez zmutowanie na poszczególnych łańcuchach reszt nie cysteinowych do cysteiny i spowodowanie utworzenia wiązania pomiędzy zmutowanymi resztami. Korzystne są reszty, których odpowiednie węgle β są w odległości od siebie 6 A (0,6 nm) lub mniej, korzystnie w zakresie 3,5 A (0,35 nm) do 5,9 A (0,59 nm) w natywnym TCR, tak aby mogło powstać wiązanie disulfidowe pomiędzy resztami cysteiny wprowadzonymi w miejsce natywnych reszt. Korzystne jest aby wiązanie disulfidowe znajdowało się pomiędzy resztami w stałym regionie immunoglobulinowym, jednakże, może być ono pomiędzy resztami regionu błonowego bliższego. Korzystnymi pozycjami, do których można wprowadzić cysteiny do wytworzenia wiązania disulfidowego są następujące reszty w egzonie 1 TRAC*01 dla łańcucha α TCR i TRBC1*01 lub TRBC2*01 dla łańcucha β TCR:

Łańcuch α TCR	Łańcuch β TCR	Odległość pomiędzy natywnymi węglami β (nm)
Thr 48	Ser 57	0,473
Thr 45	Ser 77	0,533
Tyr 10	Ser 17	0,359
Thr 45	Asp 59	0,560
Ser 15	Glu 15	0,59

Jeden sTCR według wynalazku pochodzi z A6 Tax TCR (Garboczi i inni. Nature, 1996, 384(6605): 134-141). W jednej postaci, sTCR zawiera cały łańcuch α TCR leżący po stronie N-końca reszty 4 egzonu 2 TRAC*01 (reszty aminokwasowe 1-182 łańcucha α według numeracji stosowanej w Garboczi i inni) oraz cały łańcuch β TCR leżący po stronie N-końca reszty 2 egzonu 2 TRBC1*01 i TRCB2*01 (reszty aminokwasowe 1-210 łańcucha β według numeracji stosowanej w Garboczi i inni). Aby wytworzyć wiązanie disulfidowe treoninę 48 z egzonu 1 TRAC*01 (treonina 158 łańcucha α

PL 208 712 B1 według numeracji stosowanej w Garboczi i inni) i serynę 57 egzonu 1 zarówno TRBC1*01, jak i TRBC2*01 (seryna 172 łańcucha β według numeracji stosowanej w Garboczi i inni) można zmutować do cysteiny. Te aminokwasy są umiejscowione w β nici D domeny stałej odpowiednio łańcuchów α i β TCR.

Należy zauważyć, że na fig. 3a i 3b, resztami 1 (według numeracji stosowanej w Garboczi i inni) są odpowiednio K i N. N-końcowa reszta metioniny nie występuje w natywnym A6 Tax TCR oraz, jak wspomniano powyżej, jest czasami obecna gdy dane łańcuchy wytwarza się w bakteryjnych układach ekspresji.

Obecnie, gdy zidentyfikowano reszty w ludzkich TCR, które mogą być zmutowane do reszt cysteiny do wytworzenia nowego międzyłańcuchowego wiązania disulfidowego, fachowiec będzie w stanie zmutować jakikolwiek TCR w ten sam sposób z wytworzeniem rozpuszczalnej formy tego TCR mającego nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe. W przypadku ludzi, fachowiec musi tylko poszukać następujących motywów w poszczególnych łańcuchach TCR aby zidentyfikować resztę do zmutowania (reszta zacieniona jest resztą do wprowadzenia mutacji do cysteiny).

Thr 48 łańcucha α: DSDVYITDKTVLDMRSMDFK (aminokwasy 3958 egzonu 1 genu TRAC*01)

Thr 45 łańcucha a: QSKDSDVYITiDKTVLDMRSM (aminokwasy 3655 egzonu 1 genu TRAC*01)

Tyr 10 łańcucha a: DIQNPDPAVYQLRDSKSSDK (aminokwasy 120 egzonu 1 genu TRAC*01)

Ser 15 łańcucha a: DPAVYQLRDSKSSDKSVCLF (aminokwasy 625 egzonu 1 genu TRAC*01)

Ser 57 łańcucha β: NGKEVHSGVSTDPQPLKEQP (aminokwasy 4867 egzonu 1 genów TRBCl*01 i TRBC2*01)

Ser 77 łańcucha β: ALNDSRYALSSRLRVSATFW(aminokwasy 6887 egzonu 1 genów TRBCl*01 i TRBC2*01)

Ser 17 łańcucha β: PPEVAVFEPSEAEISHTQKA (aminokwasy 827 egzonu 1 genów TRBCl*01 i TRBC2*01)

Asp 59 łańcucha β: KEVHSGVSTE)PQPLKEQPAL (aminokwasy 5069 egzonu 1 genów TRBCl*01 i TRBC2*01)

Glu 15 łańcucha β: VFPPEVAVFĘPSEAEISHTQ (aminokwasy 625 egzonu 1 genów TRBCl*01 i TRBC2*01)

U innych gatunków, łańcuchy TCR mogą nie zawierać regionu wykazującego 100% identyczności z powyższymi motywami. Jednakże, fachowiec będzie w stanie zastosować powyższe motywy do identyfikacji równoważnej części łańcucha α lub β TCR, a tym samym reszty do zmutowania do cysteiny. W tym celu można zastosować techniki porównywania sekwencji. Przykładowo program ClustalW, dostępny ze strony internetowej European Bioinformatics Institute (http://www.ebi.ac.uk/index.html) można stosować do porównania powyższych motywów z konkretną sekwencją łańcucha TCR w celu zlokalizowania części sekwencji TCR odpowiedniej do zmutowania.

PL 208 712 B1

Wynalazek obejmuje zakresem ludzkie połączone wiązaniem disulfidowym αβ TCR, a także połączone wiązaniem disulfidowym αβ TCR innych ssaków, włącznie z mysimi, szczurzymi, świńskimi, kozimi i owczymi. Jak wspomniano powyżej, fachowiec będzie w stanie wyznaczyć miejsca równoważne opisanym powyżej znajdywanym u ludzi miejscom, w których można wprowadzić reszty cysteiny do wytworzenia międzyłańcuchowego wiązania disulfidowego. Przykładowo poniżej przedstawiono sekwencje aminokwasowe mysich domen rozpuszczalnych Ca i Ce razem z motywami pokazującymi mysie reszty równoważne wspomnianym powyżej resztom ludzkim, które mogą być zmutowane do cystein do wytworzenia międzyłańcuchowego wiązania disulfidowego (gdzie odpowiednie reszty zacieniono):

Mysia rozpuszczalna domena Ca:

PYIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAM

DSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVP Mysia rozpuszczalna domena Cp:

EDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGREVHSGV

STDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNI

SAEAWGRAD

Mysi	odpowiednik	ludzkiej	Thr	48	łańcucha	a;
ESGTFITDKTVLDMKAMDSK
Mysi	odpowiednik	ludzkiej	Thr	45	łańcucha	a
KTMESGTFITDKTYLDMKAM
Mysi	odpowiednik	ludzkiej	Tyr	10	łańcucha	a
YIQNPEPAVYQLKDPRSQDS
Mysi	odpowiednik	ludzkiej	Ser	15	łańcucha	a
AVYQLKDPRSQDSTLCLFTD
Mysi	odpowiedni k	ludzkiej	Ser	57	łańcucha	β
NGREVHSGVSTDPQAYKESN
Mysi	odpowiednik	ludzkiej	Ser	77	łańcucha	β
KESNYSYCLŚSRLRVSATFW
Mysi	odpowiednik	ludzkiej	Ser	17	łańcucha	β
PPKVSLFEPSKAEIANKQKA
Mysi	odpowiednik	ludzkiego	Asp	59	łańcucha	β
REVHSGVSTDPQAYKESNYS
Mysi	odpowiednik	ludzkiego	Glu	15	łańcucha	β

VTPPKVSLFEPSKAEIANKQ

PL 208 712 B1

W korzystnej postaci wynalazku, każdy z (i) i (ii) TCR zawiera funkcjonalną domenę zmienną pierwszego TCR zfuzowaną z całością lub częścią domeny stałej drugiego TCR, przy czym pierwszy i drugi TCR pochodzą z tego samego gatunku, oraz międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe pomiędzy resztami wspomnianej odpowiedniej całości lub części domeny stałej nie występuje w natywnym TCR. W jednej postaci, pierwszy i drugi TCR są pochodzenia ludzkiego. Innymi słowy, domeny stałe połączone wiązaniem disulfidowym działają jako zrąb do którego mogą być zfuzowane domeny zmienne. Powstały TCR będzie zasadniczo identyczny z natywnym TCR, z którego otrzymano pierwszy TCR. Taki układ pozwala na łatwą ekspresję jakiejkolwiek funkcjonalnej domeny zmiennej na trwałym zrębie domeny stałej.

Domeny stałe A6 Tax sTCR opisano powyżej, lub w rzeczywistości stałe domeny któregokolwiek z opisanych powyżej zmutowanych αβ TCR mających nowe wiązanie międzyłańcuchowe, można zastosować jako zrąb, z którym można zfuzować heterologiczne domeny zmienne. Korzystne jest, gdy białko fuzyjne zachowuje możliwie w jak największym stopniu konformację heterologicznych domen zmiennych. Zatem, korzystne jest aby heterologiczne domeny zmienne były połączone z domenami stałymi w jakimkolwiek punkcie pomiędzy wprowadzonymi resztami cysteiny α N-końcem domeny stałej. Dla A6 Tax TCR, wprowadzone reszty cysteiny na łańcuchach α i β są korzystnie umiejscowione w pozycji odpowiednio treoniny 48 egzonu 1 TRAC*01 (treonina 158 łańcucha α według numeracji stosowanej w Garboczi i inni) i seryny 57 egzonu 1 zarówno w TRBC1*01, jak i TRBC2*01 (seryna 172 łańcucha β według numeracji stosowanej w Garboczi i inni). Zatem, korzystne jest gdy miejsca przyłączenia heterologicznych domen zmiennych łańcucha α i β są pomiędzy 48 (159 według numeracji stosowanej w Garboczi i inni) lub 58 (173 według numeracji stosowanej w Garboczi i inni) a N-końcem domen stałych odpowiednio α lub β.

Reszty w domenach stałych heterologicznych łańcuchów α i β odpowiadające miejscom przyłączenia w A6 Tax TCR można zidentyfikować przez homologię sekwencji. Białko fuzyjne korzystnie konstruuje się jako zawierające całą sekwencję heterologiczną od N-końca do miejsca przyłączenia.

Jak omówiono bardziej szczegółowo poniżej, sTCR według wynalazku może być przeprowadzone w pochodną lub może być zfuzowane z ugrupowaniem na swoim C- lub N-końcu. C-koniec jest korzystny, gdyż jest on oddalony od domeny wiążącej. W jednej postaci, jeden z lub obydwa łańcuchy TCR mają resztę cysteiny na swoim C- i/lub N-końcu, z którą może być zfuzowane takie ugrupowanie.

Rozpuszczalny TCR (który korzystnie jest pochodzenia ludzkiego) według wynalazku może być dostarczony w zasadniczo czystej postaci lub jako oczyszczony lub wyizolowany preparat. Przykładowo może być on dostarczony w postaci zasadniczo wolnej od innych białek.

Wiele rozpuszczalnych TCR według wynalazku można dostarczyć w postaci wielowartościowego kompleksu. Zatem, wynalazek dostarcza, w jednej postaci, wielowartościowy kompleks receptora komórek T (TCR), który zawiera wiele opisanych tutaj rozpuszczalnych receptorów komórek T. Każdy z wielu rozpuszczalnych TCR jest korzystnie identyczny.

W innym aspekcie, wynalazek dostarcza sposób wykrywania kompleksów MHC-peptyd, który to sposób obejmuje:

(i) dostarczenie opisanego rozpuszczalnego receptora komórek T lub wielowartościowego kompleksu receptora komórek T;

(ii) skontaktowanie rozpuszczalnego receptora komórek T lub wielowartościowego kompleksu TCR z kompleksami MKC-peptyd; oraz (iii) wykrycie wiązania rozpuszczalnego receptora komórek T lub wielowartościowego kompleksu TCR z kompleksami MHC-peptyd.

W wielowartościowym kompleksie według wynalazku, TCR mogą być w postaci multimerów i/lub mogą być obecne na lub związane z dwuwarstwą lipidową, np. liposomem.

W najprostszej postaci, wielowartościowy kompleks TCR według wynalazku zawiera multimer dwóch lub trzech lub czterech lub większej liczby cząsteczek receptora komórek T połączonych (np. kowalencyjnie lub w inny sposób sprzężonych) ze sobą, korzystnie przez cząsteczkę łącznikową. Odpowiednia cząsteczka łącznikowa obejmuje, ale nie wyłącznie, wielowartościowe cząsteczki przyłączające, takie jak awidyna, streptawidyna, neutrawidyna i ekstrawidyna, z których każda ma cztery miejsca wiązania biotyny. Zatem biotynylowane cząsteczki TCR można formować w multimery receptorów komórek T mające wiele miejsc wiążących TCR. Liczba cząsteczek TCR w multimerze będzie zależeć od liczby TCR względem liczby cząsteczek łącznika stosowanych do wytworzenia multimerów, a także od obecności lub braku jakichkolwiek innych biotynylowanych cząsteczek. Korzystne multimery są dimerycznymi, trimerycznymi lub tetramerycznymi kompleksami TCR.

PL 208 712 B1

Struktury, które są dużo większe niż tetramery TCR można stosować do śledzenia lub kierowania do komórek wyrażających specyficzny kompleks MHC-peptyd. Korzystnie struktury mają średnicę w zakresie od 10 nm do 10 μm. Każda struktura może zawierać wiele cząsteczek TCR odległych od siebie wystarczająco aby umożliwić równoczesne wiązanie dwóch lub większej liczby cząsteczek TCR na strukturze z dwoma lub większą liczbą kompleksów MHC-peptyd na komórce, aby tak zwiększyć zdolność wiązania multimerycznie wiążącego ugrupowania z komórką.

Odpowiednie struktury do zastosowania w wynalazku obejmują struktury błonowe, takie jak liposomy i struktury stałe, którymi są korzystnie cząstki, takie jak perełki, np. perełki lateksu. Odpowiednie są także inne struktury, które mogą być zewnętrznie powleczone cząsteczkami receptora komórek T. Korzystnie, struktury te są powleczone raczej multimerami receptora komórek T, niż pojedynczymi cząsteczkami receptora komórek T.

W przypadku liposomów, cząsteczki lub multimery receptorów komórek T mogą być połączone z błoną lub inaczej z nią związane. Techniki przeprowadzania tego są dobrze znane fachowcom.

Znacznik lub inna cząsteczka, taka jak ugrupowanie toksyczne lub terapeutyczne, mogą być włączone do wielowartościowego kompleksu TCR według wynalazku. Przykładowo znacznik lub inna cząsteczka mogą być włączone w mieszany multimer cząsteczkowy. Przykładem takiej cząsteczki multimerycznej jest tetramer zawierający trzy cząsteczki TCR i jedną cząsteczkę peroksydazy. Można to osiągnąć przez zmieszanie TCR i enzymu w stosunku molowym 3:1 w celu wytworzenia tetramerycznych kompleksów, oraz oddzielenie wymaganego kompleksu od jakichkolwiek innych kompleksów nie zawierających prawidłowego stosunku cząsteczek. Te mieszane cząsteczki mogą zawierać jakąkolwiek kombinację cząsteczek, pod warunkiem, że zawada przestrzenna nie zagraża wymaganej funkcji cząsteczek. Lokalizacja miejsc wiążących na cząsteczce streptawidyny jest odpowiednia dla mieszanych tetramerów, gdyż istnieje małe prawdopodobieństwo wystąpienia zawady przestrzennej.

Możliwe są także alternatywne sposoby biotynylowania TCR. Przykładowo można zastosować chemiczne biotynylowanie. Można zastosować alternatywne znaczniki biotynylowania, jednakże pewne aminokwasy w biotynowej sekwencji znacznika są niezbędne (Schatz, (1993). Biotechnology NY 11(10): 1138-43). Mieszanina stosowana do biotynylowania może być także różnoraka. Enzym wymaga Mg-ATP i niskiej siły jonowej, jednakże oba te warunki można zmieniać, np. możliwe jest zastosowanie wyższej siły jonowej i dłuższego czasu reakcji. Możliwe jest zastosowanie cząsteczki innej niż awidyna lub streptawidyna do wytworzenia multimerów TCR. Jakakolwiek cząsteczka wiążąca biotynę w sposób wielowartościowy będzie odpowiednia. Alternatywnie, można opracować całkowicie inne połączenie (takie jak znacznika poli-histydynowego z chelatowanym jonem niklu (Quiagen Product Guide 1999, rozdział 3 „Protein Expression, Purification, Detection and Assay” str. 35-37). Korzystnie, znacznik jest umiejscowiony w kierunku C-końca białka tak by zminimalizować ilość zawad przestrzennych w oddziaływaniu z kompleksami peptyd-MHC.

Jeden lub obydwa łańcuchy TCR mogą być znakowane wykrywalnym znacznikiem, np. znacznikiem odpowiednim do celów diagnostycznych. Zatem, wynalazek dostarcza sposób wykrywania kompleksów MHC-peptyd, który to sposób obejmuje kontaktowanie kompleksów MHC-peptyd z TCR lub multimerycznym kompleksem TCR według wynalazku, który jest specyficzny względem kompleksu MHC-peptyd; oraz wykrycie wiązania TCR lub multimerycznego kompleksu TCR z kompleksem MHCpeptyd. W tetramerycznych TCR utworzonych z użyciem biotynylowanych heterodimerów, można zastosować fluorescencyjną streptawidynę (dostępną w handlu) aby dostarczyć wykrywalny znacznik. Znakowany fluorescencyjnie tetramer jest odpowiedni do zastosowania w analizie FACS, np. do wykrycia komórek prezentujących antygen, przenoszących peptyd względem którego TCR jest specyficzny.

Innym sposobem wykrywania rozpuszczalnych TCR według wynalazku jest zastosowanie TCRspecyficznych przeciwciał, w szczególności przeciwciał monoklonalnych. Istnieje wiele dostępnych handlowo przeciwciał przeciw-TCR, takich jak aFl i eFl, które rozpoznają stałe regiony odpowiednio łańcucha α i β.

TCR (lub jego wielowartościowy kompleks) według wynalazku może alternatywnie lub dodatkowo być związany (np. kowalencyjnie lub połączony w inny sposób) ze środkiem terapeutycznym, który może być np. ugrupowaniem toksycznym do zastosowania w uśmiercaniu komórek lub czynnikiem immunostymulującym, takim jak interleukina lub cytokina. Wielowartościowy kompleks TCR według wynalazku może mieć wzmocnioną zdolność wiązania pMHC w porównaniu z niemultimerycznym heterodimerem receptora komórek T. Zatem, wielowartościowe kompleksy TCR według wynalazku są szczególnie użyteczne do śledzenia lub skierowania do komórek prezentujących konkretne antygeny

PL 208 712 B1 in vitro lub in vivo oraz są także użyteczne jako półprodukty do wytwarzania dalszych wielowartościowych kompleksów TCR o takich zastosowaniach. Zatem TCR lub wielowartościowy kompleks TCR można dostarczać w farmaceutycznie dopuszczalnym preparacie do zastosowania in vivo.

Wynalazek także dostarcza sposób dostarczania środka terapeutycznego do komórki docelowej, który to sposób obejmuje skontaktowanie potencjalnych komórek docelowych z TCR lub wielowartościowym kompleksem TCR według wynalazku w warunkach pozwalających na przyłączenie TCR lub wielowartościowego kompleksu TCR do komórki docelowej, który to TCR lub wielowartościowy kompleks TCR jest specyficzny względem kompleksów MHC-peptyd i jest związany ze środkiem terapeutycznym.

W szczególności, rozpuszczalny TCR lub wielowartościowy kompleks TCR można stosować do dostarczania środków terapeutycznych do miejsca komórek prezentujących konkretny antygen. Będzie to użyteczne w wielu sytuacjach, a w szczególności w przypadku nowotworów. Środek terapeutyczny można dostarczać tak, że będzie on wywierał swoje działanie miejscowo, ale nie tylko na komórkę z którą się wiąże. Zatem, jedna konkretna strategia przewiduje cząsteczki przeciwnowotworowe sprzężone z receptorami komórek T lub wielowartościowymi kompleksami TCR specyficznymi względem antygenów nowotworowych.

Do tego celu można zastosować wiele środków terapeutycznych, np. związki radioaktywne, enzymy (np. perforynę) lub związki chemioterapeutyczne (np. cisplatynę). Aby zapewnić działanie efektów toksycznych w wymaganym miejscu toksyna może być umieszczona wewnątrz liposomu sprzężonego ze strepatwidyną, tak, żeby związek był uwalniany powoli. Będzie to zapobiegać działaniu uszkadzającemu podczas transportu w organizmie i zapewni, że toksyna będzie wywierać maksymalne działanie po związaniu TCR z odpowiednimi komórkami prezentującymi antygen.

Inne odpowiednie środki terapeutyczne obejmują:

- niskocząsteczkowe środki cytotoksyczne, czyli związki zdolne do uśmiercania komórek ssaczych, o masie cząsteczkowej niższej niż 700 daltonów. Takie związki mogą także zawierać toksyczne metale zdolne do wywierania działania toksycznego. Ponadto, należy rozumieć, że te niskocząsteczkowe środki cytotoksyczne obejmują także proleki, czyli związki, które rozkładają się lub ulegają przemianie w warunkach fizjologicznych z uwolnieniem środków cytotoksycznych. Przykłady takich środków obejmują cisplatynę, pochodne maytanzyny, rachelmycynę, kalicheamicynę, docetaksel, etopozyd, gemcytabinę, ifosfamid, irinotekan, melfalan, mitoksantron, sól sodową porfimeru - fotofrynu II, temozolmid, topotekan, glukuronian trimetreksatu, aurystatynę E, winkrystynę i doksorubicynę;

- cytotoksyny peptydowe, tj. białka lub ich fragmenty o zdolnościach uś miercania komórek ssaczych. Przykłady obejmują rycynę, toksynę błonicy, bakteryjną egzotoksynę A Pseudomonas, DNAazę i RNAazę ;

- radionuklidy, czyli nietrwał e izotopy pierwiastków, które rozpadaj ą się z równoczesną emisj ą jednej lub większej liczby cząstek α lub β albo promieni γ. Przykłady obejmują jod 131, ren 186, ind 111, itr 90, bizmut 210 i 213, aktyn 225 i astat 213;

- proleki, takie jak skierowane przeciwciał ami proleki enzymowe;

- immunostymulanty, czyli ugrupowania, które stymulują odpowiedź immunologiczną . Przykłady obejmują cytokiny, takie jak IL-2, chemokiny, takie jak IL-8, czynnik płytkowy 4, białko stymulujące wzrost czerniaka itd., przeciwciała lub ich fragmenty, aktywatory dopełniacza, ksenogenne domeny białkowe, alogene domeny białkowe, wirusowe/bakteryjne domeny białkowe oraz wirusowe/bakteryjne peptydy.

Rozpuszczalne TCR lub wielowartościowe kompleksy TCR według wynalazku można sprzęgać z enzymem zdolnym do przekształcenia proleku w lek. Umożliwia to przekształcenie proleku w lek tylko w miejscu w którym jest to wymagane (tj. do którego dotarł sTCR).

Przykłady odpowiednich docelowych kompleksów MHC-peptyd dla TCR według wynalazku obejmują, ale nie tylko, epitopy wirusowe, takie jak epitopy HTLV-1 (np. peptyd Tax w kontekście HLAA2; HTLV-1 jest związany z białaczką), epitopy HIV, epitopy EBV, epitopy CMV; epitopy czerniaka (np. epitop MAGE-1 w kontekście HLA-A1) oraz inne nowotworowo-specyficzne epitopy (np. epitop związany z komórkowym rakiem nerek G250 w kontekście HLA-A2); oraz epitopy związane z zaburzeniami autoimmunologicznymi, takimi jak reumatoidalne zapalenie stawów. Dodatkowe związane z chorobami docelowe pMHC, odpowiednie do zastosowania w wynalazku, wymieniono w HLA Factbook (Barclay (Ed) Academic Press), a wiele innych identyfikuje się.

Wiele terapii przeciw chorobom można potencjalnie wzmocnić przez umiejscowienie leku dzięki specyficzności rozpuszczalnych TCR.

PL 208 712 B1

W chorobach wirusowych dla których istnieją leki, np. HIV, SIV, EBV, CMV, korzystne będzie uwolnienie lub aktywacja leku w pobliżu zakażonych komórek. W chorobach nowotworowych, umiejscowienie w pobliżu nowotworu lub przerzutu wzmocni działanie toksyn lub immunostymulatorów. W chorobach autoimmunologicznych, leki immunosupresorowe mogą być uwalniane powoli, wywierając bardziej lokalne działanie przez dłuższy okres czasu przy minimalnym wpływie na ogólną zdolność immunologiczną pacjenta. Przy zapobieganiu odrzuceniu przeszczepu, działanie leków immunosupresyjnych może być zoptymalizowane w ten sam sposób. Przy dostarczaniu szczepionek, antygen szczepionkowy może być umiejscowiony w pobliżu komórki prezentującej antygen, tak wzmacniając wydajność antygenu. Metodę tę można także stosować w celach obrazowania.

Rozpuszczalne TCR według wynalazku można stosować do modulowania aktywacji komórek T przez wiązanie ze specyficznymi pMHC i w ten sposób hamowanie aktywacji komórek T. Choroby autoimmunologiczne związane z zapaleniem kierowanym komórkami T i/lub uszkodzeniem tkanek będą podatne na to rozwiązanie, np. cukrzyca typu I. Do tego zastosowania potrzebna jest wiedza na temat specyficznego epitopu peptydowego prezentowanego przez odpowiedni pMHC.

Leki według wynalazku zazwyczaj będzie się dostarczać jako część jałowego, preparatu farmaceutycznego, który normalnie będzie zawierać farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Ten preparat farmaceutyczny może być w jakiejkolwiek odpowiedniej postaci (zależnie od wymaganego sposobu podawania pacjentowi). Może być on dostarczony w postaci jednostki dawkowanej i zazwyczaj będzie dostarczany w szczelnym pojemniku oraz może być dostarczany jako część zestawu. Taki zestaw normalnie (ale nie koniecznie) będzie zawierał instrukcje stosowania. Może on zawierać wiele wspomnianych postaci jednostek dawkowanych.

Preparat farmaceutyczny może być dostosowany do podawania dowolną odpowiednią drogą, np. doustnie (włącznie z podawaniem podpoliczkowym lub podjęzykowym), doodbytyniczo, donosowo, domiejscowo (włącznie z podawaniem podpoliczkowym, podjęzykowym lub przezskórnym), dopochowowo lub pozajelitowe (włącznie z podawaniem podskórnym, domięśniowym, dożylnym lub śródskórnym). Takie środki można wytwarzać dowolnym sposobem znanym w dziedzinie farmacji, np. przez zmieszanie składnika czynnego z nośnikiem (ami) lub zaróbką (ami) w jałowych warunkach.

Preparaty farmaceutyczne dostosowane do podawania doustnego mogą być w postaci odrębnych jednostek, takich jak kapsułki lub tabletki; jako proszki lub granulki; jako roztwory, syropy lub zawiesiny (w postaci płynów wodnych i niewodnych; lub jako jadalne pianki lub musy; lub jako emulsje). Odpowiednie zaróbki do tabletek lub twardych kapsułek żelatynowych obejmują laktozę, skrobię kukurydzianą lub jej pochodne, kwas stearynowy lub jego sole. Odpowiednie zaróbki do zastosowania do miękkich kapsułek żelatynowych obejmują np. oleje roślinne, woski, tłuszcze, półstałe lub płynne poliole itd.

Przy wytwarzaniu roztworów i syropów, zaróbki które można stosować, obejmują np. wodę, poliole i cukry. Do wytwarzania zawiesin oleje (np. olei roślinnych) można stosować do wytwarzania zawiesin typu olej w wodzie lub woda w oleju. Preparaty farmaceutyczne dostosowane do podawania przezskórnego mogą być w postaci osobnych plasterków, które mają pozostawać w bliskim kontakcie z naskórkiem biorcy przez przedłużony okres czasu. Przykładowo środek czynny można podawać z plasterka przez jontoforezę, jak ogólnie opisano w Pharmaceutical Research, 3(6):318 (1986). Preparaty farmaceutyczne dostosowane do podawania miejscowego można formułować w postacie maści, kremów, zawiesin, lotonów, proszków, roztworów, past, żeli, sprejów, aerozoli lub olejków. W przypadku zakażeń oka lub innych tkanek zewnętrznych, np. ust i skóry, preparaty korzystnie stosuje się w postaci domiejscowej maści lub kremu. Przy formułowaniu w maści, składnik czynny można stosować z dowolnym podłożu parafinowym lub mieszającym się z wodą. Alternatywnie, składnik czynny można formułować w postaci kremu z podłożem kremu olej w wodzie lub woda w oleju. Preparaty farmaceutyczne dostosowane do podawania miejscowego do oczu obejmują krople do oczu, w których składnik czynny jest rozpuszczony lub przeprowadzony w zawiesinę w odpowiednim nośniku, w szczególności w wodnym rozpuszczalniku. Preparaty farmaceutyczne dostosowane do podawania miejscowego do jamy ustnej obejmują pastylki do ssania, pastylki i płyny do płukania ust.

Preparaty farmaceutyczne dostosowane do podawania doodbytniczego mogą być obecne w postaci czopków lub lewatyw. Preparaty farmaceutyczne dostosowane do podawania donosowego w których nośnik jest stały obejmują gruboziarnisty proszek o rozmiarze cząstek, np. 20 - 500 μm, który podaje się w taki sposób w jaki zażywa się tabakę, tj. przez gwałtowne wdychanie przez przewód nosowy z pojemnika proszku trzymanego w pobliżu nosa. Odpowiednie preparaty, w których nośnik jest ciekły, do podawania w postaci spreju donosowego lub kropli do nosa, obejmują wodne lub

PL 208 712 B1 olejowe roztwory składnika czynnego. Preparaty farmaceutyczne dostosowane do podawania przez inhalacje obejmują drobnoziarniste pyły lub mgiełki, które mogą być wytwarzane przez różnego typu ciśnieniowe aerozole, rozpylacze lub insuflatory z odmierzanymi dawkami. Preparaty farmaceutyczne do podawania dopochwowego mogą być w postaci pesariów, tamponów, kremów, żeli, past, pianek lub sprejów. Preparaty farmaceutyczne dostosowane do podawania pozajelitowego obejmują wodne i niewodne jałowe roztwory do wstrzykiwań, które mogą zawierać przeciwutleniacze, bufory, środki bakteriostatyczne i substancje rozpuszczone, które sprawią, że preparat jest zasadniczo izotoniczny z krwią zamierzonego biorcy; oraz wodne i niewodne jałowe zawiesiny, które mogą zawierać środki suspendujące i zagęszczające. Zaróbki, które można stosować do roztworów do wstrzykiwania obejmują np. wodę, alkohole, poliole, glicerynę i oleje roślinne. Preparaty mogą być w pojemnikach pojedynczych dawek lub wielodawkowych, np. w szczelnie zamkniętych ampułkach lub fiolkach i mogą być przechowywane w stanie wysuszonym sublimacyjnie (liofilizowanym) wymagającym tylko dodania jałowego płynnego nośnika, np. wody do zastrzyków, bezpośrednio przed użyciem. Roztwory i zawiesiny do wstrzykiwania można przygotowywać bezpośrednio przed użyciem z jałowych proszków, granulek i tabletek.

Preparaty farmaceutyczne mogą zawierać środki konserwujące, środki zwiększające rozpuszczalność, środki stabilizujące, środki zwilżające, środki emulgujące, środki słodzące, barwniki, środki zapachowe, sole (same substancje według wynalazku mogą być w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych soli), bufory, środki powlekające lub przeciwutleniacze. Dodatkowo poza substancją według wynalazku mogą one również zawierać terapeutycznie czynne środki.

Dawki substancji według wynalazku mogą różnić się w szerokim zakresie, zależnie od leczonej choroby lub zaburzenia, wieku lub stanu leczonego osobnika itd., a lekarz ostatecznie ustali dawki odpowiednie do stosowania. Dawkowanie można powtarzać zależnie od potrzeb. Gdy pojawią się skutki uboczne ilość i/lub częstość dawkowania można zmniejszyć, zgodnie z normalną praktyką kliniczn ą .

Techniki klonowania genów można zastosować do dostarczenia sTCR według wynalazku, korzystnie w zasadniczo czystej postaci. Techniki te ujawniono np. w J. Sambrook i inni Molecular Cloning wydanie 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Zatem, w kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję kodującą łańcuch rozpuszczalnego TCR według wynalazku lub sekwencję do niej komplementarną. Takie sekwencje kwasu nukleinowego można uzyskiwać przez wyizolowanie kwasu nukleinowego kodującego TCR z klonów komórek T i wprowadzenie odpowiednich mutacji (przez insercję, delecję lub podstawienie).

Cząsteczka kwasu nukleinowego może być w postaci wyizolowanej lub zrekombinowanej. Może ona być wprowadzona do wektora i wektor może być wprowadzony do komórki gospodarza. Takie wektory i odpowiedni gospodarze tworzą jeszcze inne aspekty wynalazku.

Wynalazek dostarcza także sposób otrzymywania łańcucha TCR, który to sposób obejmuje inkubację takich komórek gospodarzy w warunkach wywołujących ekspresję łańcucha TCR, a następnie oczyszczenie polipeptydu.

Rozpuszczalne TCR według wynalazku można uzyskiwać przez ekspresję w bakterii, takiej jak E. coli w postaci ciałek inkluzyjnych, a następnie ponowne zwinięcie in vitro.

Ponowne zwinięcie łańcuchów TCR może zajść in vitro w odpowiednich warunkach zwijania. W szczególnej postaci, TCR o prawidłowej konformacji uzyskuje się przez zwijanie rozpuszczonych łańcuchów TCR w buforze do zwijania zawierającym środek zwiększający rozpuszczalność, np. mocznik. Korzystnie, mocznik może być obecny w stężeniu co najmniej 0,1M lub co najmniej 1M lub co najmniej 2,5M lub około 5M. Alternatywnym środkiem zwiększającym rozpuszczalność, który może być stosowany, jest guanidyna, w stężeniu 0,1M - 8M, korzystnie co najmniej 1M lub co najmniej 2,5M. Przed zwijaniem, korzystnie stosuje się środek redukujący aby zapewnić całkowitą redukcję reszt cysteiny. W razie potrzeby można stosować dalsze środki denaturujące, takie jak DTT i guanidyna. Różne środki denaturujące i redukujące można zastosować przed etapem zwijania (np. mocznik, β-merkaptoetanol). Inaczej podczas zwijania można zastosować pary redoks, takie jak para redoks cystamina/cysteamina, DTT lub β-merkaptoetanol/tlen atmosferyczny oraz cysteina w postaci zredukowanej i utlenionej.

Skuteczność zwijania można także zwiększyć przez dodanie pewnych innych składników białkowych, np. białek opiekuńczych (chaperonów), do mieszaniny do zwijania. Ulepszone zwijanie osiągnięto także przez przepuszczenie białka przez kolumny z unieruchomionymi mini-chaperonami

PL 208 712 B1 (Altamirano i inni (1999). Nature Biotechnology 17: 187-191; Altamirano i inni (1997). Proc Natl Acad Sci USA 94(8): 3576-8).

Alternatywnie, rozpuszczalne TCR według wynalazku można otrzymać przez ekspresję w eukariotycznym układzie komórkowym, takim jak komórki owadzie.

Oczyszczanie TCR można osiągnąć na wiele różnych sposobów. Można zastosować alternatywne metody chromatografii jonowymiennej lub inne metody oczyszczania białek, takie jak chromatografia żelowa lub chromatografia powinowactwa.

Rozpuszczalne TCR lub wielowartościowe kompleksy TCR według wynalazku także znajdują zastosowanie w przeszukiwaniu środków, takich jak związki chemiczne o małych cząsteczkach, które mają zdolność hamowania wiązania TCR z kompleksem pMHC. Zatem, w kolejnym aspekcie, wynalazek dostarcza sposób poszukiwania środka hamującego wiązanie receptora komórek T z kompleksem peptyd-MHC, polegający na monitorowaniu wiązania rozpuszczalnego receptora komórek T według wynalazku z kompleksem peptyd-MHC w obecności środka oraz wybranie środków hamujących takie wiązanie.

Odpowiednie techniki do takiej metody przeszukiwania obejmują metodę opartą na Surface Plasmon Resonance (powierzchniowy rezonans plazmonowy) opisaną w WO 01/22084. Innymi dobrze znanymi technikami, które mogą tworzyć podstawę tej metody przeszukiwania są scyntylacyjna analiza zbliżeniowa - Scintillation Proximity Analysis (SPA) i amplifikowana luminescencyjna próba zbliżeniowa - Amplified Luminescent Proximity Assay.

Środki wybrane metodami przeszukiwania według wynalazku można stosować jako leki lub jako podstawę programu opracowania leku, przez modyfikację lub inne ulepszenie do osiągnięcia charakterystyki, dzięki którym stają się one bardziej odpowiednie do podawania jako lek. Takie leki można stosować do leczenia stanów, w których występuje niepożądany składnik odpowiedzi komórek T. Takie stany obejmują nowotwory (np. nerki, jajnika, jelita, głowy i szyi, jąder, płuc, żołądka, szyjki macicy, pęcherza, prostaty lub czerniaka), choroby autoimmunologiczne, odrzucenie przeszczepu i chorobę przeszczep przeciw gospodarzowi.

Korzystne cechy każdego aspektu wynalazku są jak dla każdego innego aspektu z niezbędnymi zmianami. Wspomniane tutaj dokumenty wprowadza się w najszerszym zakresie zezwalanym przez prawo.

P r z y k ł a d y

Wynalazek jest dokładniej opisany w poniższych przykładach, które nie ograniczają zakresu wynalazku w jakimkolwiek stopniu.

W opisie znajdują się odniesienia do dołączonych rysunków, na których:

Fig. 1 przedstawia schematyczny wykres rozpuszczalnego TCR z wprowadzonym międzyłańcuchowym wiązaniem disulfidowym według wynalazku;

Fig. 2a i 2b przedstawiają odpowiednio sekwencje kwasów nukleinowych łańcuchów α i β rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane tak, że wprowadzono kodon cysteiny. Zacienienie wskazuje wprowadzony kodon cysteiny;

Fig. 3a przedstawia sekwencję aminokwasową zewnątrzkomórkowego łańcucha α A6 TCR, zawierającą mutację T₄₈ C (podkreślona) zastosowaną do wytworzenia nowego międzyłańcuchowego wiązania disulfidowego, a fig. 3b przedstawia sekwencję aminokwasową zewnątrzkomórkowego łańcucha β A6 TCR, zawierającą mutację S₅₇ C (podkreślona) zastosowaną do wytworzenia nowego międzyłańcuchowego wiązania disulfidowego;

Fig. 4 przedstawia chromatogram uzyskany po chromatografii anionowymiennej rozpuszczalnego A6 TCR, przedstawiający elucję białek z kolumny POROS 50HQ z gradientem 0-500 mM NaCl, co wskazano poprzez kropkowaną linię;

Fig. 5 - A. Redukująca SDS-PAGE (wybarwiona Coomassie) frakcji z kolumny z fig. 4, jak zaznaczono. B. Nieredukująca SDS-PAGE (wybarwiona Coomassie) frakcji z kolumny z fig. 4, jak zaznaczono. Pik 1 wyraźnie zawiera głównie połączony nie disulfidowo łańcuch β, pik 2 zawiera heterodimer TCR, który jest połączony międzyłańcuchowo przez wiązanie disulfidowe, a ramię wynika z zanieczyszczeń E. coli, zmieszanych z sTCR połączonym międzyłańcuchowo przez wiązanie disulfidowe, co jest słabo widoczne na tym zdjęciu;

Fig. 6 przedstawia chromatogram z chromatografii z wykluczeniem wielkości, połączonych frakcji piku 1 z fig. 5. Białko eluowane jest w postaci pojedynczego głównego piku odpowiadającego heterodimerowi;

PL 208 712 B1

Fig. 7 przedstawia krzywą odpowiedzi BIAcore specyficznego wiązania połączonego disulfidowo A6 rozpuszczalnego TCR z kompleksem HLA-A2-tax. Wstawka przedstawia odpowiedź wiązania w porównaniu z kontrolą dla pojedynczego wstrzyknięcia połączonego disulfidowo A6 rozpuszczalnego TCR;

Fig. 8a przedstawia sekwencję łańcucha α A6 TCR zawierającą nową resztę cysteiny zmutowaną z wprowadzeniem miejsca restrykcyjnego BamH1. Zacienienie wskazuje mutacje wprowadzone z wytworzeniem miejsca restrykcyjnego BamH1. Fig. 8b i 8c przedstawiają sekwencje DNA łańcuchów α i β JM22 TCR zmutowane z wprowadzeniem dodatkowych reszt cysteiny z wytworzeniem nienatywnego wiązania disulfidowego;

Fig. 9a i 9b przedstawiają odpowiednio zewnątrzkomórkowe sekwencje aminokwasowe łańcuchów α i β JM22 TCR wytworzone z sekwencji DNA z fig. 8a i 8b;

Fig. 10 przedstawia chromatogram uzyskany po chromatografii anionowymiennej rozpuszczalnego połączonego disulfidowo JM22 TCR pokazujący elucję białek z kolumny POROS 50HQ z gradientem 0-500 mM NaCl, co wskazano przez kropkowaną linię;

Fig. 11a przedstawia redukującą SDS-PAGE (wybarwioną Coomassie) frakcji z kolumny z fig. 10, jak wskazano, oraz fig. 11b przedstawia nieredukującą SDS-PAGE (wybarwioną Coomassie) frakcji z kolumny z fig. 10, jak wskazano. Pik 1 wyraźnie zawiera heterodimer TCR, który jest połączony disulfidowo między łańcuchami.

Fig. 12 przedstawia chromatogram chromatografii z wykluczeniem wielkości połączonych frakcji z piku 1 na fig. 10. Białko eluowane jest jako pojedynczy główny pik odpowiadający heterodimerowi. Wydajność wynosi 80%;

Fig. 13 - A. Krzywa odpowiedzi BIAcore specyficznego wiązania połączonego disulfidowo JM22 rozpuszczalnego TCR z kompleksem HLA-Flu. B. Odpowiedź wiązania w porównaniu z kontrolą dla pojedynczego wstrzyknięcia połączonego disulfidowo JM22 rozpuszczalnego TCR;

Fig. 14a i 14b przedstawiają sekwencje DNA łańcucha α i β NY-ESO zmutowane z wprowadzeniem dodatkowych reszt cysteiny z wytworzeniem nienatywnego wiązania disulfidowego;

Fig. 15a i 15b pokazują odpowiednio zewnątrzkomórkowe sekwencje aminokwasowe łańcuchów α i β NY-ESO TCR wytworzone z sekwencji DNA z fig. 14a i 14b.

Fig. 16 przedstawia chromatogram uzyskany po chromatografii anionowymiennej rozpuszczalnego połączonego disulfidowo NY-ESO TCR pokazujący elucję białek z kolumny POROS 50HQ z gradientem 0-500 mM NaCl, co wskazano przez kropkowaną linię;

Fig. 17 - A przedstawia redukującą SDS-PAGE (wybarwioną Coomassie) frakcji z kolumny z fig. 16, jak wskazano, oraz fig. B przedstawia nieredukującą SDS-PAGE (wybarwioną Coomassie) frakcji z kolumny z fig. 16, jak wskazano. Piki 1 i 2 wyraźnie zawierają heterodimer TCR, który jest połączony disulfidowo między łańcuchami.

Fig. 18. przedstawia chromatogram chromatografii z wykluczeniem wielkości połączonych frakcji z piku 1 (A) i piku 2 (B) z fig. 17. Białko eluowane jest jako pojedynczy główny pik odpowiadający heterodimerowi.

Fig. 19 przedstawia krzywą odpowiedzi BIAcore specyficznego wiązania połączonego disulfidowo NY-ESO rozpuszczalnego TCR z kompleksem HLA-NYESO. A. pik 1, B. pik 2.

Fig. 20a i 20b przedstawiają sekwencje DNA odpowiednio łańcucha α i β rozpuszczalnego NY-ESO TCR mutowane z wprowadzeniem nowego kodonu cysteiny (wskazanego przez zacienienie). Sekwencje zawierają cysteinę uczestniczącą w natywnym międzyłańcuchowym wiązaniu disulfidowym (wskazaną przez wytłuszczony kodon);

Fig. 21a i 21b pokazują odpowiednio zewnątrzkomórkowe sekwencje aminokwasowe łańcuchów α i β NY-ESO TCR wytworzone z sekwencji DNA z fig. 20a i 20b.

Fig. 22 przedstawia chromatogram uzyskany po chromatografii anionowymiennej rozpuszczalnego NY-ESO TCRa^cyse^cys pokazujący elucję białek z kolumny POROS 50HQ z gradientem 0-500 mM NaCl, co wskazano przez kropkowaną linię;

Fig. 23 przedstawia chromatogram uzyskany po chromatografii anionowymiennej rozpuszczalnego NY-ESO TCRa^cys pokazujący elucję białek z kolumny POROS 50HQ z gradientem 0-500 mM NaCl, co wskazano przez kropkowaną linię;

Fig. 24 przedstawia chromatogram uzyskany po chromatografii anionowymiennej rozpuszczalnego NY-ESO TCRe^cys pokazujący elucję białek z kolumny POROS 50HQ z gradientem 0-500 mM

NaCl, co wskazano przez kropkowaną linię;

PL 208 712 B1

Fig. 25 przedstawia redukującą SDS-PAGE (wybarwioną Coomassie) frakcji NY-ESO TCRa^cyse^cys, TCRa^cys i TCRe^cys z kolumn anionowymiennych z fig. odpowiednio 22-24. Ścieżki 1 i 7 oznaczają markery MW, ścieżka 2 pik oznacza NYESOdsTCR1g4 α-cys β (EB/084/033); ścieżka 3 oznacza mały pik NYESOdsTCR1g4 α-cys β (EB/084/033), ścieżka 4 oznacza NYESOdsTCR1g4 α β-cys (EB/084/034), ścieżka 5 oznacza mały pik NYESOdsTCR1g4 α-cys β-cys (EB/084/035) i ścieżka 6 oznacza pik NYESOdsTCR1g4 α-cys β-cys (EB/084/035);

Fig. 26 przedstawia nieredukującą SDS-PAGE (wybarwioną Coomassie) frakcji NY-ESO TCRα^cys β^ονδ, TCRα^cys i TCRβ^cys z kolumn anionowymiennych z fig. odpowiednio 22-24. Ścieżki 1 i 7 oznaczają markery MW, ścieżka 2 pik oznacza NYESOdsTCR1g4 α-cys β (EB/084/033); ścieżka 3 oznacza mały pik NYESOdsTCR1g4 α-cys β (EB/084/033), ścieżka 4 oznacza NYESOdsTCR1g4 α β-cys (EB/084/034), ścieżka 5 oznacza mały pik NYESOdsTCR1g4 α-cys β-cys (EB/084/035) oraz ścieżka 6 oznacza pik NYESOdsTCR1g4 α-cys β-cys (EB/084/035);

Fig. 27 przedstawia chromatogram chromatografii z wykluczeniem wielkości rozpuszczalnego NY-ESO TCRα^οysβ^οys pokazujący elucję białek z połączonych frakcji z fig. 22. Białko eluowane jest jako pojedynczy główny pik odpowiadający heterodimerowi.

Fig. 28 przedstawia chromatogram chromatografii z wykluczeniem wielkości rozpuszczalnego NY-ESO TCRα^οys pokazujący elucję białek z połączonych frakcji z fig. 22. Białko eluowane jest jako pojedynczy główny pik odpowiadający heterodimerowi.

Fig. 29 przedstawia chromatogram chromatografii z wykluczeniem wielkości rozpuszczalnego NY-ESO TCRβ^οys pokazujący elucję białek z połączonych frakcji z fig. 22. Białko eluowane jest jako pojedynczy główny pik odpowiadający heterodimerowi.

Fig. 30 przedstawia krzywą odpowiedzi BIAcore specyficznego wiązania połączonego disulfidowo NY-ESO TCRα^οysβ^οys z kompleksem HLA-NY-ESO.

Fig. 31 przedstawia krzywą odpowiedzi BIAcore specyficznego wiązania połączonego disulfidowo NY-ESO TCRα^οys z kompleksem HLA-NY-ESO.

Fig. 32 przedstawia krzywą odpowiedzi BIAcore specyficznego wiązania połączonego disulfidowo NY-ESO TCRβ^οys z kompleksem HLA-NY-ESO.

Fig. 33a i 33b przedstawiają sekwencje DNA odpowiednio łańcucha α i β rozpuszczalnego AH-1.23 TCR zmutowane z wprowadzeniem nowego kodonu cysteiny (wskazanego przez zacienienie). Sekwencje zawierają cysteinę uczestniczącą w natywnym międzyłańcuchowym wiązaniu disulfidowym (wskazaną przez wytłuszczony kodon);

Fig. 34a i 34b pokazują odpowiednio zewnątrzkomórkowe sekwencje aminokwasowe łańcuchów α i β AH-1.23 TCR wytworzone z sekwencji DNA z fig. 33a i 33b.

Fig. 35 przedstawia chromatogram uzyskany po chromatografii anionowymiennej rozpuszczalnego AH-1.23 TCR pokazujący elucję białek z kolumny PROS 50HQ z gradientem 0-500 mM NaCl, co wskazano przez kropkowaną linię;

Fig. 36 przedstawia redukującą SDS-PAGE (10% żel Bis-Tris, wybarwiony Coomassie) frakcji AH-1.23 TCR z kolumny anionowymiennej z fig. 35. Badane białka pochodzą z frakcji z kolumny anionowymiennej z TCR 1.23 S-S z ponownego zwijania 3. Ścieżka 1 - markery MW, ścieżka 2 - B4, ścieżka 3 - C2, ścieżka 4 - C3, ścieżka 5 - C4, ścieżka 6 - C5, ścieżka 7 - C6, ścieżka 8 - C7, ścieżka 9 - C8 oraz ścieżka 10 - C9;

Fig. 37 przedstawia nieredukującą SDS-PAGE (10% żel Bis-Tris, wybarwiony Coomassie) frakcji AH-1.23 TCR z kolumny anionowymiennej z fig. 35. Badane białka pochodzą z frakcji z kolumny anionowymiennej z TCR 1.23 S-S z ponownego zwijania 3. Ścieżka 1 - markery MW, ścieżka 2 - B4, ścieżka 3 - C2, ścieżka 4 - C3, ścieżka 5 - C4, ścieżka 6 - C5, ścieżka 7 - C6, ścieżka 8 - C7, ścieżka 9 - C8 oraz ścieżka 10 - C9;

Fig. 38 przedstawia chromatogram z chromatografii z wykluczeniem wielkości rozpuszczalnego AH-1.23 TCR pokazujący elucję białek z połączonych frakcji z fig. 35. Białko eluowane jest jako pojedynczy główny pik odpowiadający heterodimerowi.

Fig. 39a i 39b przedstawiają odpowiednio sekwencje DNA i aminokwasową łańcucha α rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane z wprowadzeniem nowej cysteiny w pozycji 48 egzonu 1 TRAC*01. Zacienione nukleotydy wskazują wprowadzony nowy kodon cysteiny, a podkreślony aminokwas wskazuje wprowadzoną cysteinę;

Fig. 40a i 40b przedstawiają odpowiednio sekwencje DNA i aminokwasową łańcucha α rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane z wprowadzeniem nowej cysteiny w pozycji 45 egzonu 1

PL 208 712 B1

TRAC*01. Zacienione nukleotydy wskazują wprowadzony nowy kodon cysteiny, a podkreślony aminokwas wskazuje wprowadzoną cysteinę;

Fig. 41a i 41b przedstawiają odpowiednio sekwencje DNA i aminokwasową łańcucha α rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane z wprowadzeniem nowej cysteiny w pozycji 61 egzonu 1 TRAC*01. Zacienione nukleotydy wskazują wprowadzony nowy kodon cysteiny, a podkreślony aminokwas wskazuje wprowadzoną cysteinę;

Fig. 42a i 42b przedstawiają odpowiednio sekwencje DNA i aminokwasową łańcucha α rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane z wprowadzeniem nowej cysteiny w pozycji 50 egzonu 1 TRAC*01. Zacienione nukleotydy wskazują wprowadzony nowy kodon cysteiny, a podkreślony aminokwas wskazuje wprowadzoną cysteinę;

Fig. 43a i 43b przedstawiają odpowiednio sekwencje DNA i aminokwasową łańcucha α rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane z wprowadzeniem nowej cysteiny w pozycji 10 egzonu 1 TRAC*01. Zacienione nukleotydy wskazują wprowadzony nowy kodon cysteiny, a podkreślony aminokwas wskazuje wprowadzoną cysteinę;

Fig. 44a i 44b przedstawiają odpowiednio sekwencje DNA i aminokwasową łańcucha α rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane z wprowadzeniem nowej cysteiny w pozycji 15 egzonu 1 TRAC*01. Zacienione nukleotydy wskazują wprowadzony nowy kodon cysteiny, a podkreślony aminokwas wskazuje wprowadzoną cysteinę;

Fig. 45a i 45b przedstawiają odpowiednio sekwencje DNA i aminokwasową łańcucha α rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane z wprowadzeniem nowej cysteiny w pozycji 12 egzonu 1 TRAC*01. Zacienione nukleotydy wskazują wprowadzony nowy kodon cysteiny, a podkreślony aminokwas wskazuje wprowadzoną cysteinę;

Fig. 46a i 46b przedstawiają odpowiednio sekwencje DNA i aminokwasową łańcucha α rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane wprowadzeniem nowej cysteiny w pozycji 22 egzonu 1 TRAC*01. Zacienione nukleotydy wskazują wprowadzony nowy kodon cysteiny i zacieniony aminokwas wskazuje wprowadzoną cysteinę;

Fig. 47a i 47b przedstawiają odpowiednio sekwencje DNA i aminokwasową łańcucha α rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane wprowadzeniem nowej cysteiny w pozycji 52 egzonu 1 TRAC*01. Zacienione nukleotydy wskazują wprowadzony nowy kodon cysteiny, a podkreślony aminokwas wskazuje wprowadzoną cysteinę;

Fig. 48a i 48b przedstawiają odpowiednio sekwencje DNA i aminokwasową łańcucha α rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane wprowadzeniem nowej cysteiny w pozycji 43 egzonu 1 TRAC*01. Zacienione nukleotydy wskazują wprowadzony nowy kodon cysteiny, a podkreślony aminokwas wskazuje wprowadzoną cysteinę;

Fig. 49a i 49b przedstawiają odpowiednio sekwencje DNA i aminokwasową łańcucha α rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane wprowadzeniem nowej cysteiny w pozycji 57 egzonu 1 TRAC*01. Zacienione nukleotydy wskazują wprowadzony nowy kodon cysteiny, a podkreślony aminokwas wskazuje wprowadzoną cysteinę;

Fig. 50a i 50b przedstawiają odpowiednio sekwencje DNA i aminokwasową łańcucha β rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane wprowadzeniem nowej cysteiny w pozycji 77 egzonu 1 TRBC2*01. Zacienione nukleotydy wskazują wprowadzony nowy kodon cysteiny, a podkreślony aminokwas wskazuje wprowadzoną cysteinę;

Fig. 51a i 51b przedstawiają odpowiednio sekwencje DNA i aminokwasową łańcucha β rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane wprowadzeniem nowej cysteiny w pozycji 17 egzonu 1 TRBC2*01. Zacienione nukleotydy wskazują wprowadzony nowy kodon cysteiny, a podkreślony aminokwas wskazuje wprowadzoną cysteinę;

Fig. 52a i 52b przedstawiają odpowiednio sekwencje DNA i aminokwasową łańcucha β rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane wprowadzeniem nowej cysteiny w pozycji 13 egzonu 1 TRBC2*01. Zacienione nukleotydy wskazują wprowadzony nowy kodon cysteiny, a podkreślony aminokwas wskazuje wprowadzoną cysteinę;

Fig. 53a i 53b przedstawiają odpowiednio sekwencje DNA i aminokwasową łańcucha β rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane wprowadzeniem nowej cysteiny w pozycji 59 egzonu 1 TRBC2*01. Zacienione nukleotydy wskazują wprowadzony nowy kodon cysteiny, a podkreślony aminokwas wskazuje wprowadzoną cysteinę;

Fig. 54a i 54b przedstawiają odpowiednio sekwencje DNA i aminokwasową łańcucha β rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane wprowadzeniem nowej cysteiny w pozycji 79 egzonu 1

PL 208 712 B1

TRBC2*01. Zacienione nukleotydy wskazują wprowadzony nowy kodon cysteiny, a podkreślony aminokwas wskazuje wprowadzoną cysteinę;

Fig. 55a i 55b przedstawiają odpowiednio sekwencje DNA i aminokwasową łańcucha β rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane wprowadzeniem nowej cysteiny w pozycji 14 egzonu 1 TRBC2*01. Zacienione nukleotydy wskazują wprowadzony nowy kodon cysteiny, a podkreślony aminokwas wskazuje wprowadzoną cysteinę;

Fig. 56a i 56b przedstawiają odpowiednio sekwencje DNA i aminokwasową łańcucha β rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane z wprowadzeniem nowej cysteiny w pozycji 55 egzonu 1 TRBC2*01. Zacienione nukleotydy wskazują wprowadzony nowy kodon cysteiny, a podkreślony aminokwas wskazuje wprowadzoną cysteinę;

Fig. 57a i 57b przedstawiają odpowiednio sekwencje DNA i aminokwasową łańcucha β rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane z wprowadzeniem nowej cysteiny w pozycji 63 egzonu 1 TRBC2*01. Zacienione nukleotydy wskazują wprowadzony nowy kodon cysteiny, a podkreślony aminokwas wskazuje wprowadzoną cysteinę;

Fig. 58a i 58b przedstawiają odpowiednio sekwencje DNA i aminokwasową łańcucha β rozpuszczalnego A6 TCR, zmutowane z wprowadzeniem nowej cysteiny w pozycji 15 egzonu 1 TRBC2*01. Zacienione nukleotydy wskazują wprowadzony nowy kodon cysteiny, a podkreślony aminokwas wskazuje wprowadzoną cysteinę;

Fig. 59-64 przedstawiają chromatogramy z chromatografii anionowymiennej rozpuszczalnych A6 TCR zawierających nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe pomiędzy: odpowiednio resztami 48 egzonu 1 TRAC*01 i 57 egzonu 1 TRBC2*01; resztami 45 egzonu 1 TRAC*01 i 77 egzonu 1 TRBC2*01; resztami 10 egzonu 1 TRAC*01 i 17 egzonu 1 TRBC2*01; resztami 45 egzonu 1 TRAC*01 i 59 egzonu 1-TRBC2*01; resztami 52 egzonu 1 TRAC*01 i 55 egzonu 1 TRBC2*01; resztami 15 egzonu 1 TRAC*01 i 15 egzonu 1 TRBC2*01, pokazujące elucję białek z kolumny POROS 50 z gradientem 0-500 mM NaCl, co wskazano przez kropkowaną linię;

Fig. 65a i 65b przedstawiają, odpowiednio, redukującą i nieredukującą SDS-PAGE (wybarwioną Coomassie) rozpuszczalnego A6 TCR zawierającego nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe pomiędzy resztami 48 egzonu 1 TRAC*01 i 57 egzonu 1 TRBC2*01, analizowane frakcje pochodzą z kolumny anionowymiennej z fig. 59;

Fig. 66a i 66b przedstawiają, odpowiednio, redukującą i nieredukującą SDS-PAGE (wybarwioną Coomassie) rozpuszczalnego A6 TCR zawierającego nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe pomiędzy resztami 45 egzonu 1 TRAC*01 i 77 egzonu 1 TRBC2*01, analizowane frakcje pochodzą z kolumny anionowymiennej z fig. 60;

Fig. 67a i 67b przedstawiają, odpowiednio, redukującą i nieredukującą SDS-PAGE (wybarwioną Coomassie) rozpuszczalnego A6 TCR zawierającego nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe pomiędzy resztami 10 egzonu 1 TRAC*01 i 17 egzonu 1 TRBC2*01, analizowane frakcje pochodzą z kolumny anionowymiennej z fig. 61;

Fig. 68a i 68b przedstawiają, odpowiednio, redukującą i nieredukującą SDS-PAGE (wybarwioną Coomassie) rozpuszczalnego A6 TCR zawierającego nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe pomiędzy resztami 45 egzonu 1 TRAC*01 i 59 egzonu 1 TRBC2*01, analizowane frakcje pochodzą z kolumny anionowymiennej z fig. 62;

Fig. 69a i 69b przedstawiają, odpowiednio, redukującą i nieredukującą SDS-PAGE (wybarwioną Coomassie) rozpuszczalnego A6 TCR zawierającego nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe pomiędzy resztami 52 egzonu 1 TRAC*01 i 55 egzonu 1 TRBC2*01, analizowane frakcje pochodzą z kolumny anionowymiennej z fig. 63;

Fig. 70a i 70b przedstawiają, odpowiednio, redukującą i nieredukującą SDS-PAGE (wybarwioną Coomassie) rozpuszczalnego A6 TCR zawierającego nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe pomiędzy resztami 15 egzonu 1 TRAC*01 i 15 egzonu 1 TRBC2*01, analizowane frakcje pochodzą z kolumny anionowymiennej z fig. 64;

Fig. 71 przedstawia chromatogram z chromatografii z wykluczeniem wielkości rozpuszczalnego A6 TCR zawierającego nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe pomiędzy resztami 48 egzonu 1 TRAC*01 i 57 egzonu 1 TRBC2*01, pokazujący elucję białek z kolumny do filtracji na żelu Superdex 200 HL. Analizowane frakcje zostały zebrane z kolumny anionowymiennej z fig. 59;

Fig. 72 przedstawia chromatogram z chromatografii z wykluczeniem wielkości rozpuszczalnego

A6 TCR zawierającego nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe pomiędzy resztami 45 egzonu 1

PL 208 712 B1

TRAC*01 i 77 egzonu 1 TRBC2*01, pokazujący elucję białek z kolumny do filtracji na żelu Superdex 200 HL. Analizowane frakcje zostały zebrane z kolumny anionowymiennej z fig. 60;

Fig. 73 przedstawia chromatogram z chromatografii z wykluczeniem wielkości rozpuszczalnego A6 TCR zawierającego nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe pomiędzy resztami 10 egzonu 1 TRAC*01 i 17 egzonu 1 TRBC2*01, pokazujący elucję białek z kolumny do filtracji na żelu Superdex 200 HL. Analizowane frakcje zostały zebrane z kolumny anionowymiennej z fig. 61;

Fig. 74 przedstawia chromatogram z chromatografii z wykluczeniem wielkości rozpuszczalnego A6 TCR zawierającego nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe pomiędzy resztami 45 egzonu 1 TRAC*01 i 59 egzonu 1 TRBC2*01, pokazujący elucję białek z kolumny do filtracji na żelu Superdex 200 HL. Analizowane frakcje zostały zebrane z kolumny anionowymiennej z fig. 62;

Fig. 75 przedstawia chromatogram z chromatografii z wykluczeniem wielkości rozpuszczalnego A6 TCR zawierającego nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe pomiędzy resztami 52 egzonu 1 TRAC*01 i 55 egzonu 1 TRBC2*01, pokazujący elucję białek z kolumny do filtracji na żelu Superdex 200 HL. Analizowane frakcje zostały zebrane z kolumny anionowymiennej z fig. 63;

Fig. 76 przedstawia chromatogram z chromatografii z wykluczeniem wielkości rozpuszczalnego A6 TCR zawierającego nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe pomiędzy resztami 15 egzonu 1 TRAC*01 i 15 egzonu 1 TRBC2*01, pokazujący elucję białek z kolumny do filtracji na żelu Superdex 200 HL. Analizowane frakcje zostały zebrane z kolumny anionowymiennej z fig. 64 i

Fig. 77-80 przedstawiają krzywe odpowiedzi BIAcore pokazujące, odpowiednio wiązanie rozpuszczalnego A6 TCR zawierającego nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe pomiędzy: resztami 48 egzonu 1 TRAC*01 i 57 egzonu 1 TRBC2*01; resztami 45 egzonu 1 TRAC*01 i 77 egzonu 1 TRBC2*01; resztami 10 egzonu 1 TRAC*01 i 17 egzonu 1 TRBC2*01; oraz resztami 45 egzonu 1 TRAC*01 i 59 egzonu 1 TRBC2*01 z HLA-A2-tax pMHC.

Fig. 81 przedstawia analizę BIAcore pokazującą niespecyficzne wiązanie rozpuszczalnego A6 TCR zawierającego nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe pomiędzy resztami 52 egzonu 1 TRAC*01 i 55 egzonu 1 TRBC2*01 z HLA-A2-tax oraz z HLA-A2-NY-ES0 pMHC;

Fig. 82 przedstawia krzywą odpowiedzi BIAcore wiązania rozpuszczalnego A6 TCR zawierającego nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe pomiędzy resztami 15 egzonu 1 TRAC*01 i 15 egzonu 1 TRBC2*01 z HLA-A2-tax pMHC;

Fig. 83a przedstawia mapę gęstości elektronowej wokół modelu sekwencji 1BD2 (łańcuch A Thr164, łańcuch B Ser 174). Mapa jest poziomicowana na poziomach 1,0, 2,0 i 3,0 σ. Fig. 83b przedstawia mapę gęstości elektronowej po rozwinięciu z Cys w dwóch pozycjach A164 i B174. Mapa jest poziomicowana na tych samych poziomach σ jak dla fig. 83a;

Fig. 84 porównuje struktury 1BD2 TCR z NY-ESO TCR według wynalazku przez nałożenie wspomnianych struktur w przedstawieniu wstążkowo-spiralowym.

Fig. 85a i 85b przedstawiają odpowiednio sekwencję DNA i aminokwasową łańcucha β NY-ESO TCR zawierające miejsce rozpoznania dla biotyny. Miejsce rozpoznania dla biotyny jest wyróżnione;

Fig. 86a i 86b przedstawiają odpowiednio sekwencję DNA i aminokwasową łańcucha β NY-ESO TCR zawierające znacznik heksahistydynowy. Znacznik hekashistydynowy jest wyróżniony;

Fig. 87 przedstawia elucję rozpuszczalnego NY-ESO TCR zawierającego nowe wiązanie disulfidowe oraz sekwencję rozpoznania dla biotyny z kolumny anionowymiennej POROS 50HQ z gradientem 0-500 mM NaCl, co wskazano przez kropkowaną linię;

Fig. 88 przedstawia elucję rozpuszczalnego NY-ESO TCR zawierającego nowe wiązanie disulfidowe oraz znacznik heksahistydynowy z kolumny anionowymiennej POROS 50HQ z gradientem 0 - 500 mM NaCl, co wskazano przez kropkowaną linię;

Fig. 89 przedstawia profil elucji z chromatografii filtracji żelowej połączonych frakcji NY-ESO znakowanego biotyną z kolumny anionowymiennej zilustrowanej na fig. 87;

Fig. 90 przedstawia profil elucji z chromatografii filtracji żelowej połączonych frakcji NY-ESO znakowanego heksahistydyną z kolumny anionowymiennej zilustrowanej na fig. 88;

Fig. 91a-h przedstawiają histogramy FACS ilustrujące intensywność wybarwienia osiągniętą z 25000 zdarzeń dla HLA-A2-pozytywnej transformowanej EBV linii komórek B (PP LOL) inkubowanej z następującymi stężeniami peptydu NY-ESO i fluorescencyjnych tetramerów NY-ESO TCR odpowiednio: NYESO 0 TCR 5 pg, NYESO 10^-4 M TCR 5 pg, NYESO 10^-5 M TCR 5 pg, NYESO 10^-6 M TCR 5 pg, NYESO 0 TCR 10 pg, NYESO 10^-4 m TCR 10 pg, NYESO 10^-5 M TCR 10 pg, NYESO 10^-6 M TCR 10 pg;

Fig. 92 przedstawia sekwencję DNA łańcucha β A6 TCR zawierającego stały region TRBC1*01;

PL 208 712 B1

Fig. 93 przedstawia chromatogram z chromatografii anionowymiennej rozpuszczalnego A6 TCR zawierającego stały region TRBC1*01 pokazujący elucję białek z kolumny POROS 50HQ z gradientem 0-500 mM NaCl, co wskazano przez kropkowaną linię;

Fig. 94 - A. Redukująca SDS-PAGE (wybarwiona Coomassie) frakcji z kolumny z fig. 93, jak wskazano. B. Nieredukująca SDS-PAGE (wybarwiona Coomassie) frakcji z kolumny z fig. 93, jak wskazano;

Fig. 95 - Chromatografia z wykluczeniem wielkości połączonych frakcji z piku 2 z fig. 93. Pik 1 zawiera heterodimer TCR, który jest połączony międzyłańcuchowo przez wiązanie disulfidowe;

Fig. 96 - A. Analiza BIAcore specyficznego wiązania połączonego disulfidowo rozpuszczalnego A6 TCR z kompleksem HLA-Flu. B. Odpowiedź wiązania porównana z kontrolą pojedynczego wstrzyknięcia połączonego disulfidowo rozpuszczalnego A6 TCR;

Fig. 97 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego zmutowanego łańcucha β A6 TCR zawierającego „wolną” cysteinę;

Fig. 98 - Chromatografia anionowymienna A6 TCR zawierającego „wolną” cysteinę przedstawiająca elucję białka z kolumny POROS 50HQ z gradientem 0-500 mM NaCl, co wskazano kropkowaną linią;

Fig. 99 - A. Redukująca SDS-PAGE (wybarwiona Coomassie) frakcji z kolumny z fig. 98, jak wskazano. B. Nieredukująca SDS-PAGE (wybarwiona Coomassie) frakcji z kolumny z fig. 98, jak wskazano;

Fig. 100 - Chromatografia z wykluczeniem wielkości połączonych frakcji z piku 2 z fig. 98. Pik 1 zawiera heterodimer TCR, który jest połączony międzyłańcuchowo przez wiązanie disulfidowe;

Fig. 101 - A. Analiza BIAcore specyficznego wiązania połączonego disulfidowo rozpuszczalnego A6 TCR zawierającego „wolną” cysteinę z kompleksem HLA-Flu. B. Odpowiedź wiązania porównana z kontrolą pojedynczego wstrzyknięcia połączonego disulfidowo rozpuszczalnego A6 TCR;

Fig. 102 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego zmutowanego łańcucha β A6 TCR zawierającego resztę seryny zmutowana do „wolnej” cysteiny;

Fig. 103 - Chromatografia anionowymienna A6 TCR zawierającego resztę seryny zmutowano do „wolnej” cysteiny przedstawiająca elucję białka z kolumny POROS 50HQ z gradientem 0-500 mM NaCl, co wskazane kropkowaną linią.

Fig. 104 - A. Redukująca SDS-PAGE (wybarwiona Coomassie) frakcji z kolumny z fig. 103, jak wskazano. B. Nieredukująca SDS-PAGE (wybarwiona Coomassie) frakcji z kolumny z fig. 103, jak wskazano. Pik 2 wyraźnie zawiera heterodimer TCR, który jest połączony disulfidowo między łańcuchami;

Fig. 105 - Chromatografia z wykluczeniem wielkości połączonych frakcji z piku 2 z fig. 103. Pik 1 zawiera heterodimer TCR, który jest połączony międzyłańcuchowo przez wiązanie disulfidowe;

Fig. 106 - A. Analiza BIAcore specyficznego wiązania połączonego disulfidowo rozpuszczalnego A6 TCR zawierającego resztę seryny zmutowaną do „wolnej” cysteiny z kompleksem HLA-Flu. B. Odpowiedź wiązania porównana z kontrolą pojedynczego wstrzyknięcia połączonego disulfidowo rozpuszczalnego A6 TCR;

Fig. 107 przedstawia sekwencję nukleotydową pYX112;

Fig. 108 przedstawia sekwencję nukleotydową pYX122;

Fig. 109 przedstawia sekwencje DNA i białkową pre-proczynnika płciowego α zfuzowaną z łańcuchem α TCR;

Fig. 110 przedstawia sekwencje DNA i białkową pre-proczynnika płciowego α zfuzowaną z łańcuchem β TCR;

Fig. 111 przedstawia analizę Western Blot rozpuszczalnego TCR wyrażonego w S. cerevisiae szczep SEY6210. Ścieżka C zawiera 60 ng oczyszczonego rozpuszczalnego NY-ESO TCR jako kontrolę. Ścieżki 1 i 2 zawierają białka zebrane z dwóch oddzielnych hodowli drożdżowych transformowanych TCR;

Fig. 112 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego wstawki KpnI do EcoRI plazmidu pEX172. Pozostałą częścią plazmidu jest pBlueScript II KS-;

Fig. 113 przedstawia schematyczny diagram łańcuchów TCR do klonowania w bakulowirusie;

Fig. 114 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego połączonego disulfidowo konstruktu A6 α

TCR jako wstawkę BamHI do wstawienia do plazmidu ekspresyjnego pAcAB3;

Fig. 115 przedstawia konstrukt połączonego disulfidowo A6 β TCR jako wstawkę BamHI do wstawienia do plazmidu ekspresyjnego pAcAB3; oraz

PL 208 712 B1

Fig. 116 przedstawia wybarwiony Coomassie żel i analizę Western Blot przeciw wytwarzanemu w bakteriach połączonemu disulfidowo A6 TCR i owadziemu połączonemu disulfidowo A6 TCR.

W poniższych przykładach, o ile nie zaznaczono inaczej, wytwarzane rozpuszczalne łańcuchy TCR są skrócone bezpośrednio C-końcowo z resztami cysteiny, które tworzą natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe.

P r z y k ł a d 1. Projektowanie starterów i mutageneza łańcuchów α i β A6 Tax TCR

W celu zmutowania A6 Tax treoniny 48 z egzonu 1 TRAC*01 do cysteiny zaprojektowano następujące startery (mutację przedstawiono małymi literami):

5'-C ACA GAC AAA tgT GTG CTA GAC AT

5'-AT GTC TAG CAC Aca TTT GTC TGT G

W celu zmutowania A6 Tax seryny 57 z egzonu 1 zarówno TRBC1*01, jak i TRBC2*01 do cysteiny zaprojektowano następujące startery (mutację przedstawiono małymi literami):

5'-C AGT GGG GTC tGC ACA GAC CC

5'-GG GTC TGT GCa GAC CCC ACT G

Mutageneza PCR

Plazmidy ekspresyjne zawierające geny łańcucha α lub β A6 Tax TCR zmutowano za pomocą odpowiednio starterów dla łańcucha α lub starterów dla łańcucha β w następujący sposób. 100 ng plazmidu zmieszano z 5 pl 10 mM dNTP, 25 pl 10x buforu Pfu (Stratagene), 10 jednostkami polimerazy Pfu (Stratagene) i końcową objętość doprowadzono do 240 pl H2O. 48 pl tej mieszaniny uzupełniono starterami rozcieńczonymi do końcowego stężenia 0,2 pM w końcowej objętości reakcji 50 pl. Po początkowym etapie denaturacji przez 30 sekund w 95°C, mieszaninę poddano 15 cyklom denaturacji (95°C, 30 s), hybrydyzacji (55°C, 60 s) i wydłużania (73°C, 8 min) w aparacie do PCR Hybaid PCR express. Następnie produkt strawiono przez 5 godzin w 37°C przy użyciu 10 jednostek enzymu restrykcyjnego DpnI (New England Biolabs). 10 pl strawionej reakcji transformowano do kompetentnych bakterii XL1-Blue i hodowano przez 18 godzin w 37°C. Pojedyncze kolonie zebrano i hodowano przez noc w 5 ml TYP + ampicylina (16 g/l Bacto-Trypton, 16 g/l ekstrakt drożdżowy, 5 g/l NaCl, 2,5 g/l K2HPO4, 100 mg/l ampicyliny). Plazmidowy DNA oczyszczono w kolumnie do preparatów na małą skalę Qiagen zgodnie z instrukcjami producenta i sekwencję potwierdzono przez zautomatyzowane sekwencjonowanie w centrum sekwencjonowania w Department of Biochemistry, Oxford University. Poszczególne zmutowane sekwencje kwasów nukleinowych i aminokwasowe przedstawiono na fig. 2a i 3a dla łańcucha α oraz fig. 2b i 3b dla łańcucha β.

P r z y k ł a d 2. Ekspresja, ponowne zwijanie i oczyszczanie rozpuszczalnego TCR

Plazmidy ekspresyjne zawierające odpowiednio zmutowany łańcuch α i β transformowano osobno do szczepu BL21pLysS E. coli i pojedyncze oporne na ampicylinę kolonie hodowano w 37°C w pożywce TYP (100 pg/ml ampicyliny) do OD600 0,4 przed indukcją ekspresji białka 0,5 mM IPTG. Komórki zebrano po trzech godzinach po indukcji przez odwirowanie przez 30 minut przy 4000 obrotów/minutę w Beckman J-6B. Osady komórek ponownie przeprowadzono w zawiesinę w buforze zawierającym 50 mM Tris-HCl, 25% (wag./obj.) sacharozę, 1 mM NaEDTA, 0,1% (wag./obj.) azydek sodu, 10 mM DTT, pH 8,0. Po prowadzonym przez noc etapie zamrażania-rozmrażania, zawiesinę komórek poddano działaniu ultradźwięków w 1-minutowych impulsach łącznie przez około 10 minut w sonikatorze Milsonix XL2020 z użyciem typowego 12 mm trzpienia. Osady ciałek inkluzyjnych odzyskano przez odwirowanie przez 30 minut przy 13000 obrotów/minutę w wirówce Beckman J2-21. Następnie przeprowadzono trzy przemycia detergentem w celu usunięcia szczątków komórek i składników błon. Za każdym razem osad ciałek inkluzyjnych homogenizowano w buforze Triton (50 mM TrisHCl, 0,5% Triton-X100, 200 mM NaCl, 10 mM NaEDTA, 0,1% (wag./obj.) azydek sodu, 2 mM DTT, pH 8,0) przed sprowadzeniem do osadu przez odwirowanie przez 15 minut przy 13000 obrotów/minutę w Beckman J2-21. Detergent i sól usunięto przez podobne przemycie w następującym buforze: 50 mM Tris-HCl, 1 mM NaEDTA, 0,1% (wag./obj.) azydek sodu, 2 mM DTT, pH 8,0. Ostatecznie, ciałka inkluzyjne podzielono na porcje po 30 mg i zamrożono w -70°C. Wydajność białka ciałek inkluzyjnych oznaczono ilościowo przez rozpuszczenie w 6M guanidynie^HCl i pomiary w teście wiązania barwnika Bradford (PerBio).

Około 30 mg (czyli 1 pmol) każdego rozpuszczonego łańcucha z ciałek inkluzyjnych rozmrożono z zamrożonych porcji, następnie próbki zmieszano i mieszaninę rozcieńczono do 15 ml roztworem guanidyny (6M chlorowodorek guanidyny, 10 mM octan sodu, 10 mM EDTA) aby zapewnić całkowitą denaturację łańcucha. Następnie roztwór guanidyny zawierający całkowicie zredukowane i zdenaturowane łańcuchy TCR wstrzyknięto do 1 litra następującego buforu do ponownego zwijania: 100 mM

PL 208 712 B1

Tris pH 8,5, 400 mM L-arginina, 2 mM EDTA, 5 mM zredukowany glutation, 0,5 mM utleniony glutation, 5M mocznik, 0,2 mM PMSF. Roztwór pozostawiono na 24 godziny. Następnie zwinięte łańcuchy dializowano dwukrotnie, najpierw wobec 10 litrów 100 mM mocznika, następnie wobec 10 litrów 100 mM mocznika, 10 mM Tris pH 8,0. Etapy zarówno ponownego zwijania, jak i dializy prowadzono w 6-8°C.

sTCR oddzielono od produktów rozpadu i zanieczyszczeń przez naniesienie dializowanych zwiniętych łańcuchów na kolumnę anionowymienną POROS 50HQ i elucję związanego białka gradientem 0-500 mM NaCl w ilości stanowiącej 50 objętości kolumny stosując zestaw do oczyszczania Akta (Pharmacia) jak na fig. 4. Frakcje pików przechowywano w 4°C i analizowano na barwionych Coomassie SDS-PAGE (fig. 5) przed połączeniem frakcji i zatężeniem. Ostatecznie, sTCR oczyszczano i charakteryzowano na kolumnie do filtracji żelowej Superdex 200HR (fig. 6) wstępnie równoważonej buforem HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3,5 mM EDTA, 0,05% nonidet p40). Pik eluowany przy względnej masie cząsteczkowej około 50 kDa połączono i zatężono przed scharakteryzowaniem metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego BIAcore.

P r z y k ł a d 3. Charakteryzacja powierzchniowym rezonansem plazmonowym BIAcore wiązania sTCR ze specyficznymi pMHC

Biosensor powierzchniowego rezonansu plazmonowego (BIAcore 3000™) zastosowano do zanalizowania wiązania sTCR ze swoim ligandem peptyd-MHC. Umożliwiono to przez wytworzenie pojedynczych kompleksów pMHC (opisanych poniżej), które unieruchomiono na powierzchni wiążącej powleczonej streptawidyną w sposób pół-zorientowany, pozwalających skutecznie badać wiązanie rozpuszczalnego receptora komórek T równocześnie z aż czterema różnymi pMHC (unieruchomionymi na osobnych celkach przepływowych). Ręczne wstrzyknięcie kompleksu HLA umożliwia łatwe manipulowanie precyzyjnym poziomem unieruchomionych cząsteczek klasy I.

Takie unieruchomione kompleksy są zdolne do wiązania zarówno receptorów komórek T, jak i koreceptorów CD8aa, które obydwa można wstrzykiwać w rozpuszczalnej fazie. Specyficzne wiązanie TCR osiąga się nawet w niskich stężeniach (co najmniej 40 μg/ml), co sugeruje, że TCR jest względnie trwały. Obserwowane właściwości wiązania pMHC przez sTCR wydają się być jakościowo i ilościowo podobne gdy sTCR stosuje się w fazie rozpuszczalnej lub unieruchomionej. Jest to istotną kontrolą częściowej aktywności rodzajów rozpuszczalnych, a także sugeruje, że biotynylowane kompleksy pMHC są biologicznie tak samo czynne jako nie biotynylowane kompleksy.

Kompleksy biotynylowane HLA-A2 klasy I - peptyd ponownie zwijano in vitro z wyrażonych w bakteriach składowych podjednostek z ciałek inkluzyjnych i syntetycznego peptydu, a następnie oczyszczano i biotynylowano enzymatycznie in vitro (O'Callaghan i inni (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). Ciężki łańcuch HLA wyrażono z C-końcowym znacznikiem biotynylacji, który zastąpił transbłonową i cytoplazmatyczną domenę białka w odpowiednim konstrukcie. Otrzymano poziom ekspresji w ciałkach inkluzyjnych ~75 mg/l hodowli bakteryjnej. Łańcuch lekki HLA lub e2-mikroglobulinę także wyrażono w ciałkach inkluzyjnych w E. coli z odpowiedniego konstruktu, przy wydajności ~500 mg/l hodowli bakteryjnej.

Komórki E. coli zlizowano i ciałka inkluzyjne oczyszczono do około 80% czystości. Białko z ciałek inkluzyjnych zdenaturowano w 6M guanidynie^HCl, 50 mM Tris pH 8,1, 100 mM NaCl, 10 mM DTT, 10 mM EDTA i ponownie zwijano w stężeniu 30 mg/l łańcucha ciężkiego, 30 mg/l e2m w 0,4 M L-argininie^HCl, 100 mM Tris pH 8,1, 3,7 mM cystaminie, 6,6 mM β-cysteaminie, z 4 mg/ml peptydu (np. tax 11-19) przez dodanie pojedynczego impulsu zdenaturowanego białka do buforu do ponownego zwijania w < 5°C. Reakcję zwijania zostawiono do zakończenia w 4°C na co najmniej 1 godzinę.

Bufor wymieniono przez dializę w 10 objętościach 10 mM Tris pH 8,1. Dwie zmiany buforu były konieczne do wystarczającego obniżenia siły jonowej roztworu. Następnie roztwór białka przesączono przez 1,5 μm filtr z octanu celulozy i naniesiono na kolumnę anionowymienną POROS 50HQ (objętość złoża 8 ml). Białko wyeluowano z liniowym gradientem 0-500 mM NaCl. Kompleks HLA-A2-peptyd wyeluowano przy około 250 mM NaCl i zebrano frakcje pików, dodano koktajl inhibitorów proteaz (Calbiochem) i frakcje schłodzono w lodzie.

W znakowanych przez biotynylację kompleksach HLA wymieniono bufor na 10 mM Tris pH 8,1, mM NaCl stosując kolumnę Pharmacia do szybkiego odsalania równoważoną tym samym buforem.

Bezpośrednio po elucji, frakcje zawierające białko schłodzono w lodzie i dodano koktajl inhibitorów proteaz (Calbiochem). Następnie dodano odczynniki do biotynylacji: 1 mM biotynę, 5 mM ATP (buforowany do pH 8), 7,5 mM MgCl₂ i 5 μg/ml enzymu BirA (oczyszczonego według OCallaghan i inni

PL 208 712 B1 (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). Następnie mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej przez noc.

Biotynylowane kompleksy HLA oczyszczono stosując chromatografię żelową. Kolumnę Pharmacia Superdex 75 HR 10/30 wstępnie zrównoważono przesączoną PBS, 1 ml biotynylowanej mieszaniny reakcyjnej naniesiono i kolumnę rozwijano w PBS przy 0,5 ml/min. Biotynylowane kompleksy HLA wyeluowano w pojedynczym piku przy około 15 ml. Frakcje zawierające białko połączono, schłodzono w lodzie i dodano koktajl inhibitorów proteaz. Stężenie białka oznaczono za pomocą testu wiązania Coomassie (PerBio) i równe porcje biotynylowanych kompleksów HLA przechowywano zamrożone w -20°C. Streptawidynę unieruchomiono znanymi metodami sprzęgania amin.

Oddziaływania pomiędzy A6 Tax sTCR zawierającym nowe wiązanie międzyłańcuchowe a jego kompleksem ligand/MHC lub nieistotnym połączeniem HLA-peptyd, których wytwarzanie opisano powyżej, analizowano na BIAcore 3000™ biosensorze powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR). SPR mierzy zmiany we współczynniku załamania wyrażonym w jednostkach odpowiedzi (RU) w pobliż u powierzchni czujnika w mał ej celce przepł ywowej, a zasada ta moż e być stosowana do wykrywania oddziaływań receptora i ligandu oraz do analizowania ich powinowactwa i parametrów kinetycznych. Sondujące celki przepływowe przygotowano przez unieruchomienie poszczególnych kompleksów HLA-peptyd w osobnych celkach przepływowych przez wiązanie pomiędzy biotyną sprzężoną na β2m a streptawidyną, którą chemicznie sprzężono z aktywowaną powierzchnią celek przepływowych. Następnie przeprowadzono test przez przepuszczenie sTCR nad powierzchniami różnych celek przepływowych przy stałym natężeniu przepływu, mierząc odpowiedź SPR. Początkowo specyficzność oddziaływania potwierdzono przez przepuszczenie sTCR stałym natężeniu przepływu 5 μl min^-1nad dwoma różnymi powierzchniami; jedną powleczoną ~5000 RU specyficznego kompleksu peptydHLA oraz drugą powleczoną ~5000 RU niespecyficznego kompleksu peptyd-HLA (wstawka na fig. 7). Wstrzyknięcia rozpuszczalnego sTCR przy stałym natężeniu przepływu w różnych stężeniach nad kompleks peptyd-HLA zastosowano do zdefiniowania rezonansu tła. Wartości tych pomiarów kontrolnych odjęto od wartości uzyskanych dla specyficznego kompleksu peptyd-HLA i zastosowano do obliczenia powinowactwa wiązania wyrażonego jako stała dysocjacji, Kd (Price & Dwek, Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists (wydanie 2) 1979, Clarendon Press, Oxford), jak na fig. 7.

Uzyskana wartość Kd (1,8 μΜ) jest zbliżona do opisanej dla oddziaływania pomiędzy A6 Tax sTCR bez nowego wiązania disulfidowego i pMHC (0,91 μΜ - Ding i inni, 1999, Immunity 11:45-56).

P r z y k ł a d 4. Wytwarzanie rozpuszczalnego JM22 TCR zawierającego nowe wiązanie disulfidowe

Łańcuch β rozpuszczalnego A6 TCR otrzymany w przykładzie 1 zawiera w natywnej sekwencji miejsce restrykcyjne Bglll (AAGCTT) odpowiednie do zastosowania jako miejsce ligacji.

Mutagenezę PCR przeprowadzono jak dokładniej opisano poniżej w celu wprowadzenia miejsca restrykcyjnego BamHl (GGATCC) do łańcucha α rozpuszczalnego A6 TCR, 5' w stosunku do nowego kodonu cysteinowego. Sekwencję opisaną na fig. 2a zastosowano jako matrycę do mutagenezy. Zastosowano następujące startery:

|BamHI|

5' -ATATCCAGAACCCgGAtCCTGCCGTGTA-3'

5' -TACACGGCAGGAaTCcGGGTTCTGGATAT-3'

100 ng plazmidu zmieszano z 5 μl 10 mM dNTP, 25 μl 10x buforu Pfu (Stratagene), 10 jednostkami polimerazy Pfu (Stratagene) i końcową objętość doprowadzono do 240 gl H₂O. 48 μl tej mieszaniny uzupełniono starterami rozcieńczonymi do końcowego stężenia 0,2 μΜ w końcowej objętości reakcji 50 gl. Po początkowym etapie denaturacji przez 30 sekund w 95°C, mieszaninę poddano 15 cyklom denaturacji (95°C, 30 s), hybrydyzacji (55°C, 60 s) i wydłużania (73°C, 8 min) w aparacie do PCR Hybaid PCR express. Następnie produkt strawiono przez 5 godzin w 37°C przy użyciu 10 jednostek enzymu restrykcyjnego DpnI (New England Biolabs). 10 gl strawionej reakcji transformowano do kompetentnych bakterii XL1-Blue i hodowano przez 18 godzin w 37°C. Pojedyncze kolonie zebrano i hodowano przez noc w 5 ml TYP + ampicylina (16 g/l Bacto-Trypton, 16 g/l ekstrakt drożdżowy, 5 g/l NaCl, 2,5 g/l K2HPO4, 100 mg/l ampicyliny). Plazmidowy DNA oczyszczono w kolumnie do preparatów na małą skalę Qiagen zgodnie z instrukcjami producenta i sekwencję potwierdzono

PL 208 712 B1 przez zautomatyzowane sekwencjonowanie w centrum sekwencjonowania w Department of Biochemistry, Oxford University. Mutacje wprowadzone do łańcucha α były „ciche”, zatem sekwencja aminokwasowa tego łańcucha pozostała niezmieniona w stosunku do przedstawionej na fig. 3a. Sekwencję DNA dla zmutowanego łańcucha α przedstawiono na fig. 8a.

Aby wytworzyć rozpuszczalny JM22 TCR zawierający nowe wiązanie disulfidowe, jako matryce zastosowano plazmidy A6 TCR zawierające miejsca restrykcyjne w łańcuchu α BamH1 i w łańcuchu β Bglll. Zastosowano następujące startery:

I Ndel|

5' -GGAGATATACATATGCAACTACTAGAACAA-3'

5' -TACACGGCAGGATCCGGGTTCTGGATATT-3' |BamHI|

INdel |

5' -GGAGATATACATATGGTGGATGGTGGAATC-3'

5' -CCCAAGCTTAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC-3' |Bglll|

Konstrukty łańcuchów α i β JM22 TCR otrzymano poprzez klonowanie PCR w następujący sposób. Reakcje PCR prowadzono stosując startery przedstawione powyżej i matryce zawierające łańcuchy JM22 TCR. Produkty PCR strawiono odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i wklonowano do pGMT7 uzyskując plazmidy ekspresyjne. Sekwencję wstawek w plazmidzie potwierdzono przez automatyzowane sekwencjonowanie DNA. Fig. 8b i 8c przedstawiają sekwencję DNA zmutowanych łańcuchów odpowiednio α i β JM22 TCR oraz fig. 9a i 9b przedstawiają powstałe sekwencje aminokwasowe.

Poszczególne łańcuchy TCR wyrażono, poddano współzwijaniu i oczyszczono jak opisano w przykładach 1 i 2. Fig. 10 przedstawia elucję białka rozpuszczalnego połączonego disulfidowo JM22 TCR z kolumny POROS 50HQ z gradientem 0-500 mM NaCl, co wskazano przez kropkowaną linię. Fig. 11 przedstawia wyniki dla żeli z redukującej SDS-PAGE (wybarwionego Coomassie) i nieredukującej SDS-PAGE (wybarwionego Coomassie) frakcji z kolumny przedstawionej na fig. 10. Pik 1 wyraźnie zawiera heterodimer TCR, który jest połączony disulfidowo między łańcuchami. Fig. 12 przedstawia elucję białka z kolumny w wykluczeniem wielkości z połączonych frakcji piku 1 z fig. 10.

Analizę BIAcore wiązania JM22 TCR z pMHC przeprowadzono jak opisano w przykładzie 3. Fig. 13a przedstawia analizę BIAcore specyficznego wiązania połączonego disulfidowo JM22 rozpuszczalnego TCR z kompleksem HLA-Flu. Fig. 13b przedstawia odpowiedź wiązania w porównaniu z kontrolą dla pojedynczego wstrzknię cia połączonego disulfidowo JM22 rozpuszczalnego TCR.

Określone, że Kd połączonego disulfidowo TCR dla kompleksu HLA-flu wynosi 7,9 ± 0,51 μM.

P r z y k ł a d 5. Wytwarzanie rozpuszczalnego NY-ESO TCR zawierającego nowe wiązanie disulfidowe cDNA kodujący NY-ESO TCR wyizolowano z komórek T dostarczonych przez Enzo Cerundolo (Instituto of Molecular Medicine, University of Oxford) znanymi technikami. cDNA kodujący NY-ESO TCR wytworzono przez potraktowanie mRNA odwrotną transkryptazą.

Aby wytworzyć rozpuszczalny NY-ESO TCR zawierający nowe wiązanie disulfidowe jako matryce zastosowano plazmidy A6 TCR zawierające miejsca restrykcyjne w łańcuchu α BamH1 i w łańcuchu β Bglll, jak opisano w przykładzie 4. Zastosowano następujące startery:

I Ndel|

5' -GGAGATATACATATGCAGGAGGTGACACAG-3'

5' -TACACGGCAGGATCCGGGTTCTGGATATT-3' |BamHI| | Ndel|

5' -GGAGATATACATATGGGTGTCACTCAGACC-3'

5' -CCCAAGCTTAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC -3'

IBglll|

PL 208 712 B1

Konstrukty łańcuchów α i β NY-ESO TCR otrzymano drogą klonowania PCR w następujący sposób. Reakcje PCR prowadzono stosując startery przedstawione powyżej i matryce zawierające łańcuchy NY-ESO TCR. Produkty PCR strawiono odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i wklonowano do pGMT7 uzyskując plazmidy ekspresyjne. Sekwencję wstawek w plazmidzie potwierdzono przez zautomatyzowane sekwencjonowanie DNA. Fig. 14a i 14b przedstawiają sekwencję DNA zmutowanych łańcuchów odpowiednio α i β NY-ESO TCR oraz fig. 15a i 15b przedstawiają powstałe sekwencje aminokwasowe.

Poszczególne łańcuchy TCR wyrażono, poddano współzwijaniu i oczyszczono jak opisano w przykładach 1 i 2, z wyjątkiem poniższych zmian w procedurze:

Denaturacja rozpuszczalnych TCR: 30 mg rozpuszczonych ciałek inkluzyjnych łańcucha β TCR i 60 mg rozpuszczonych ciałek inkluzyjnych łańcucha α TCR rozmrożono z zamrożonych porcji. Ciałka inkluzyjne rozcieńczono do końcowego stężenia 5 mg/ml w 6M roztworze guanidyny i dodano DTT (2M roztwór podstawowy) do końcowego stężenia 10 mM. Mieszaninę inkubowano w 37°C przez 30 minut.

Ponowne zwijanie rozpuszczonych TCR: 1 litr buforu do ponownego zwijania mieszano energicznie w 5°C ± 3°C. Parę redoks (2-merkaptoetyloamina i cystamina w końcowych stężeniach odpowiednio 6,6 mM i 3,7 mM) dodano około 5 minut przed dodaniem zdenaturowanych łańcuchów TCR. Białko pozostawiono do zwinięcia na około 5 godzin ± 15 minut w trakcie mieszania w 5°C ± 3°C.

Dializa zwiniętych rozpuszczalnych TCR: zwinięte TCR dializowano w błonie Spectrapor 1 (Spectrum; nr produktu 132670) wobec 10 l 10 mM Tris pH 8,1 w 5°C ± 3°C przez 18 - 20 godzin. Po tym czasie, bufor do dializy wymieniono na świeży 10 mM Tris pH 8,1 (10 l) i dializę kontynuowano w 5°C ± 3°C przez kolejnych 20 - 22 godzin.

Fig. 16 przedstawia elucję rozpuszczalnego białka, połączonego disulfidowo NY-ESO TCR z kolumny POROS 50HQ z gradientem 0-500 mM NaCl, co wskazano przez kropkowaną linię. Fig. 17 przedstawia wyniki dla żeli redukującej SDS-PAGE (wybarwionego Coomassie) i nieredukującej SDSPAGE (wybarwionego Coomassie) frakcji z kolumny przedstawionej na fig. 16. Piki 1 i 2 wyraźnie zawierają heterodimer TCR, który jest połączony disulfidowo między łańcuchami. Fig. 18 przedstawia elucję białka z kolumny w wykluczeniem wielkości z połączonych frakcji piku 1 (A) i piku 2 (B) z fig. 17. Białko eluowane jest jako pojedynczy główny pik odpowiadający heterodimerowi.

Analizę BIAcore wiązania NY-ESO TCR z pMHC prowadzono jak opisano w przykładzie 3. Fig. 19 przedstawia analizę BIAcore specyficznego wiązania połączonego disulfidowo NY-ESO rozpuszczalnego TCR z kompleksem HLA-NYESO. A. pik 1, B. pik 2.

Określono, że Kd połączonego disulfidowo TCR dla tego kompleksie HLA-NY-ESO wynosi 9,4 ± 0,84 pM.

P r z y k ł a d 6. Wytwarzanie rozpuszczalnego NY-ESO TCR zawierającego nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe oraz co najmniej jedną z dwóch cystein wymaganych do utworzenia natywnego międzyłańcuchowego wiązania disulfidowego.

Aby wytworzyć rozpuszczalny NY-ESO TCR zawierający nowe wiązanie disulfidowe oraz co najmniej jedną z reszt cystein uczestniczących w natywnym międzyłańcuchowym wiązaniu disulfidowym jako matryce zastosowano plazmidy zawierające miejsca restrykcyjne w łańcuchu α BamH1 i w łańcuchu β Bglll, jak opisano w przykładzie 4. Zastosowano następujące startery:

INdel |

5' -GGAGATATACATATGCAGGAGGTGACACAG-3'

5' -CCCAAGCTTAACAGGAACTTTCTGGGCTGGGGAAGAA-3' |Hindlll|

INdel |

5' -GGAGATATACATATGGGTGTCACTCAGACC-3'

5' -CCCAAGCTTAACAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC -3'

IBglll|

Konstrukty łańcuchów α i β NY-ESO TCR otrzymano drogą klonowania PCR w następujący sposób. Reakcje PCR prowadzono stosując startery przedstawione powyżej i matryce zawierające

PL 208 712 B1 łańcuchy NY-ESO TCR. Produkty PCR strawiono odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i wklonowano do pGMT7 uzyskując plazmidy ekspresyjne. Sekwencję wstawek w plazmidzie potwierdzono przez zautomatyzowane sekwencjonowanie DNA. Fig. 20a i 20b przedstawiają sekwencję DNA zmutowanych łańcuchów odpowiednio α i β NY-ESO TCR oraz fig. 21a i 21b przedstawiają powstałe sekwencje aminokwasowe.

Aby wytworzyć rozpuszczalny NY-ESO TCR zawierający zarówno nienatywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe, jak i natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe, DNA wyizolowano stosując obydwa powyższe startery. Aby wytworzyć rozpuszczalne NY-ESO TCR z nienatywnym międzyłańcuchowym wiązaniem disulfidowym oraz tylko jedną z reszt cystein uczestniczących w natywnym międzyłańcuchowym wiązaniu disulfidowym, DNA wyizolowano stosując powyższe startery razem z odpowiednim starterem z przykładu 5.

Poszczególne łańcuchy TCR wyrażono, poddano współzwijaniu i oczyszczono jak opisano w przykładzie 5.

Fig. 22-24 przedstawiają elucję białka rozpuszczalnego NY-ESO TCRα^οysβ^οys (tj. z nienatywnymi i natywnymi cysteinami w obydwu łańcuchach), TCRα^οys (z nienatywnymi cysteinami w obydwu łańcuchach i natywną cysteiną tylko w łańcuchu α) oraz TCRβ^οys (z nienatywnymi cysteinami w obydwu łańcuchach i natywną cysteina tylko w łańcuchu β) z kolumny anionowymiennej POROS 50HQ z gradientem 0-500 mM NaCl, co wskazano przez kropkowaną linię. Fig. 25 i 26 odpowiednio przedstawiają wyniki dla żeli redukującej SDS-PAGE (wybarwionych Coomassie) i nieredukującej SDSPAGE (wybarwionych Coomassie) frakcji z kolumn NY-ESO TCRα^οys β^⁸, TCRα^οys i TCRβ^οys zilustrowanych na fig. 22-24. To wyraźnie wskazuje, że powstały heterodimery TCR, które są połączone międzyłańcuchowo wiązaniami disulfidowymi. Fig. 27-29 przedstawiają profile elucji białka z kolumny w wykluczeniem wielkości z połączonych frakcji z kolumn anionowymiennych NY-ESO TCRα^οys βΧ TCRα^οys i TCRβ^οys zilustrowanych odpowiednio na fig. 22-24. Białka eluowane były jako pojedynczy pik odpowiadający heterodimerowi TCR.

Analizę BIAcore wiązania sTCR z pMHC przeprowadzono jak opisano w przykładzie 3. Fig. 30-32 przedstawiają analizę BIAcore specyficznego wiązania NY-ESO odpowiednio TCRα^οys βΧ TCRα^οysi TCRβ^οys z kompleksem HLA-NYESO.

TCRα^οys β^ wykazywał Kd 18,08 ± 2,075 μΜ, TCRα^οys wykazywał Kd 19,24 ± 2,01 μΜ i TCRβ^οyswykazywał Kd 22,5 ± 4,0 692 μΜ.

P r z y k ł a d 7. Wytwarzanie rozpuszczalnego AH-1.23 TCR zawierającego nowe wiązanie disulfidowe cDNA kodujący AH-1.23 TCR wyizolowano z komórek T dostarczonych przez Hill Gaston (Medical School, Addenbrooke's Hospital, Cambridge) znanymi technikami. cDNA kodujący NY-ESO TCR wytworzono przez traktowanie mRNA odwrotną transkryptazą.

Aby wytworzyć rozpuszczalny AH-1.23 TCR zawierający nowe wiązanie disulfidowe jako matryce zastosowano plazmidy TCR zawierające miejsca restrykcyjne w łańcuchu α BamH1 i w łańcuchu β Bglll, jak opisano w przykładzie 4. Zastosowano następujące startery:

INdel [

5' -GGGAAGCTTACATATGAAGGAGGTGGAGCAGAATTCTGG-3'

5' -TACACGGCAGGATCCGGGTTCTGGATATT-3' !BamHI|

INdel |

5' -TTGGAATTCACATATGGGCGTCATGCAGAACCCAAGACAC-3'

5' -CCCAAGCTTAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC-3'

IBglll |

Konstrukty łańcuchów α i β AH-1.23 TCR otrzymano drogą klonowania PCR w następujący sposób. Reakcje PCR prowadzono stosując startery przedstawione powyżej i matryce zawierające łańcuchy AH-1.23 TCR. Produkty PCR strawiono odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i wklonowano do pGMT7 uzyskując plazmidy ekspresyjne. Sekwencję wstawek w plazmidzie potwierdzono przez zautomatyzowane sekwencjonowanie DNA. Fig. 33a i 33b przedstawiają sekwencję DNA zmutowaPL 208 712 B1 nych łańcuchów odpowiednio α i β AH-1.23 TCR oraz fig. 34a i 34b przedstawiają powstałe sekwencje aminokwasowe.

Poszczególne łańcuchy TCR wyrażono, poddano współzwijaniu i oczyszczono jak opisano w przykł adzie 5.

Fig. 35 przedstawia elucję białka rozpuszczalnego połączonego disulfidowo AH-1.23 TCR z anionowymiennej kolumny POROS 50HQ z gradientem 0-500 mM NaCl, co wskazano przez kropkowaną linię. Fig. 36 i 37 przedstawiają wyniki dla żeli redukującej SDS-PAGE (wybarwionego Coomassie) i nieredukującej SDS-PAGE (wybarwionego Coomassie) frakcji z kolumny przedstawionej na fig. 35. Żele te wyraźnie pokazują, obecność heterodimeru TCR, który jest połączony disulfidowo pomiędzy łańcuchami. Fig. 38 przedstawia profil elucji białka z kolumny do filtracji żelowej Superdex 75 HR połączonych frakcji z kolumny anionowymiennej zilustrowanej na fig. 35. Białko eluowane jest jako pojedynczy główny pik odpowiadający heterodimerowi.

P r z y k ł a d 8. Wytwarzanie rozpuszczalnych A6 TCR zawierających nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe w alternatywnych pozycjach, w regionie immunoglobulinowym domeny stałej.

Poniższe doświadczenia przeprowadzono w celu zbadania czy możliwe było utworzenie funkcjonalnych rozpuszczalnych TCR zawierających nowe wiązanie disulfidowe w regionie immunoglobulinowym TCR w pozycji innej niż pomiędzy treoniną 48 egzonu 1 TRAC*01 a seryną 57 egzonu 1 w TRBC1*01/TRBC2*01.

W celu zmutowania łańcucha α A6 TCR zaprojektowano następujące startery (numery w nazwach starterów odnoszą się do pozycji mutowanej reszty aminokwasowej z egzonu 1 TRAC*01, zmutowane reszty przedstawiono małymi literami):

Mutacja T48—>C

5' -CACAGACAAAtgTGTGCTAGACAT-3'

5' -ATGTCTAGCACAcaTTTGTCTGTG-3'

Mutacja Y10—»C

5' -CCCTGCCGTGTgCCAGCTGAGAG-3' '

5' -CTCTCAGCTGGcACACGGCAGGG-3'

Mutacja L12—»C

5' -CCGTGTACCAGtgcAGAGACTCTAAATC-3' ’ -GATTTAGAGTCTCTgcaCTGGTACACGG- 3'

Mutacja S15—»C

5' -CAGCTGAGAGACTgTAAATCCAGTGAC-3'

5' -GTCACTGGATTTAcAGTCTCTCAGCTG-3'

Mutacja V22—>C

5' -CAGTGACAAGTCTtgCTGCCTATTCAC-3'

5' -GTGAATAGGCAGcaAGACTTGTCACTG-3'

Mutacja Y43—»C

5' -GATTCTGATGTGTgTATCACAC-ACAAAT-3'

5' -ATTTGTCTGTGATAcACACATCAGAATC-3'

Mutacja T45—>C

5' -CTGATGTGTATATCtgtGACAAAACTGTGC-3'

5' -GCACAGTTTTGTCacaGATATACACATCAG-3'

Mutacja L50—»C

PL 208 712 B1

5' -AGACAAAACTGTGtgtGACATGAGGTCT-3'

5' -AGACCTCATGTCacaCACAGTTTTGTCT-3'

Mutacja M52—»C ' -ACTGTGCTAGACt gtAGGTCTATGGAC-3'

5'-GTCCATAGACCTacaGTCTAGCACAGT-3'

Mutacja S61—>C

5' -CTTCAAGAGCAACtGTGCTGTGGCC-3'

5' -GGCCACAGCACaGTTGCTCTTGAAG-3'

W celu zmutowania łańcucha β A6 TCR zaprojektowano następujące startery (numery w nazwach starterów odnoszą się do pozycji mutowanej reszty aminokwasowej z egzonu 1 TRBC2*01, zmutowane reszty przedstawiono małymi literami):

Mutacja S57—»C 5'-CAGTGGGGTCtGCACAGACCC-3'

5' -GGGTCTGTGCaGACCCCACTG-3'

Mutacja V13->C

5' -CCGAGGTCGCTtgtTTTGAGCCATCAG-3'

5' -CTGATGGCTCAAAacaAGCGACCTCGG-3'

Mutacja F14—»C

5'-GGTCGCTGTGtgtGAGCCATCAGA-3'

5' -TCTGATGGCTCacaCACAGCGACC-3'

Mutacja S17—>C

5' -GTGTTTGAGCCATgtGAAGCAGAGATC-3'

5' -GATCTCTGCTTCacATGGCTCAAACAC-3'

Mutacja G55—>C

5' -GAGGTGCACAGTtGtGTCAGCACAGAC-3'

5' -GTCTGTGCTGACaCaACTGTGCACCTC-3'

Mutacja D59—>C

5' -GGGTCAGCACAtgCCCGCAGCCC-3'

5' -GGGCTGCGGGcaTGTGCTGACCC-3'

Mutacja L63—»C

PL 208 712 B1

5' -CCCGCAGCCCtgCAAGGAGCAGC-3'

5' -GCTGCTCCTTGCaGGGCTGCGGG-3'

Mutacja S77—>C

5' -AGATACGCTCTGtGCAGCCGCCT-3'

5' -AGGCGGCTGCaCAGAGCGTATCT-3'

Mutacja R79-»C

5' -CTCTGAGCAGCtGCCTGAGGGTC-3'

5' -GACCCTCAGGCaGCTGCTCAGAG-3'

Mutacja E15—>C 5 ' -GCTGTGTTTtgtCCATCAGAA-3 '

5’-TTCTGATGGacaAAACACAGC-3 '

Mutagenezę PCR, amplifikację konstruktów α i β TCR, ligację i oczyszczanie plazmidu przeprowadzono jak opisano w przykładzie 1 stosując odpowiednie kombinacje powyższych starterów w celu wytworzenia rozpuszczalnych TCR zawierających nowe międzyłańcuchowe wiązania disulfidowe pomiędzy następującymi parami aminokwasów:

Łańcuch α TCR	Łańcuch β TCR	Zastosowany starter α	Zastosowany starter β
Thr 48	Ser 57	T48 >C	S57>C
Thr 45	Ser 77	T45 >C	S77>C
Ser 61	Ser 57	S61>C	S57>C
Leu 50	Ser 57	L50>C	S57>C
Tyr 10	Ser 17	Y10>C	S17>C
Ser 15	Val 13	S15>C	V13>C
Thr 45	Asp 59	T45>C	D59>C
Leu 12	Ser 17	L12>C	S17>C
Ser 61	Arg 79	S61>C	R79>C
Leu 12	Phe 14	L12>C	F14>C
Val 22	Phe 14	V22>C	F14>C
Met 52	Gly 55	M52>C	G55>C
Tyr 43	Leu 63	Y43>C	L63>C
Ser 15	Glu 15	S15>C	E15>C

Fig. 39 - 58 przedstawiają sekwencje DNA i aminokwasowe zmutowanych łańcuchów A6 TCR amplifikowanych za pomocą powyższych starterów. Kodony kodujące zmutowane cysteiny wyróżniono.

Poszczególne łańcuchy TCR wyrażono, poddano współzwijaniu i oczyszczono jak opisano w przykładzie 5. Po oczyszczaniu na kolumnie anionowymiennej POROS 50HQ, białka analizowano na żelach SDS-Page w celu oszacowania czy powstały jakiekolwiek prawidłowo zwinięte rozpuszczal34

PL 208 712 B1 ne TCR. Żele te oceniono także ustalając w oczyszczonym materiale obecność lub brak disulfidowo połączonego białka o prawidłowej masie cząsteczkowej. Badane TCR zawierające poniższe nowe międzyłańcuchowe wiązania disulfidowe nie wytworzyły disulfidowo połączonego białka o prawidłowej masie cząsteczkowej w bakteryjnym systemie ekspresji i nie oznaczano ich dalej. Jednakże, dostępne są alternatywne prokariotyczne lub eukariotyczne systemy ekspresyjne.

Łańcuch α TCR	Łańcuch β TCR
Ser 61	Ser 57
Leu 50	Ser 57
Ser 15	Val 13
Leu 12	Ser 17
Ser 61	Arg 79
Leu 12	Phe 14
Val 22	Phe 14
Tyr 43	Leu 63

Fig. 59 - 64 odpowiednio ilustrują elucję rozpuszczalnych TCR zawierających nowe międzyłańcuchowe wiązania disulfidowe pomiędzy następującymi resztami: Thr 48-Ser 57, Thr 45-Ser 77, Tyr 10-Ser 17, Thr 45-Asp 59, Met 52-Gly 55 i Ser 15-Glu 15 z kolumny anionowymiennej POROS 200HQ z gradientem 0-500 mM NaCl, co wskazano przez kropkowaną linię. Fig. 65 - 70 przedstawiają wyniki dla żeli redukującej SDS-PAGE (wybarwionych Coomassie) nieredukującej SDS-PAGE (wybarwionych Coomassie) odpowiednio z kolumn zilustrowanych na fig. 59 - 64. Te żele wyraźnie wskazują obecność heterodimerów TCR, które są połączone międzyłańcuchowo wiązaniem disulfidowym.

Fig. 71 - 76 przedstawiają profile elucji z kolumny do filtracji żelowej Superdex 200 HR połączonych frakcji z kolumn anionowymiennych zilustrowanych na fig. 59 - 64.

Analizę BIAcore wiązania TCR z pMHC przeprowadzono jak opisano w przykładzie 3. Fig. 77 - 82 przedstawiają wykresy BIAcore wykazujące zdolność oczyszczonych rozpuszczalnych TCR do wiązania kompleksów HLA-A2 tax pMHC.

Thr 48-Ser 57 wykazywał Kd 7,8 μΜ, Thr 45-Ser 77 wykazywał K_d 12,7 μΜ, Tyr 10-Ser 17 wykazywał K_d 34 μΜ, Thr 45-Asp 59 wykazywał Kd 14,9 μΜ oraz Ser 15-Glu 15 wykazywał Kd 6,3 μΜ. Met 52-Gly 55 był zdolny do wiązania swojego natywnego „docelowego” kompleksu HLA-A2 tax, pomimo, że także wiązał w podobny sposób „nieistotny” kompleks docelowy, kompleks HLA-A2-NY-ESO (patrz fig. 81).

P r z y k ł a d 9. Rentgenografia strukturalna połączonego disulfidowo receptora komórek T NY-ESO, specyficznego względem kompleksu NY-ESO-HLA-A2

NY-ESO dsTCR sklonowane w sposób opisany w przykładzie 5 i wyrażone w sposób opisany poniżej.

Plazmidy ekspresyjne zawierające odpowiednio zmutowany łańcuch α i β transformowano osobne do szczepu BL21 pLysS E. coli i pojedyncze operne na ampicylinę kolonie hodowano w 37°C w pożywce TYP (100 μg/ml ampicyliny) do OD₆₀₀ 0,7 przed indukcją ekspresji białka 0,5 mM IPTG. Komórki zebrano po 18 godzinach po indukcji przez odwirowanie przez 30 minut przy 4000 obrotów/minutę w Beckman J-6B. Osady komórek ponownie przeprowadzono w zawiesinę w buforze zawierającym 10 mM Tris-HCl pH 8,1, 10 γπΜ MgCl2, 150 mM NaCl, 2 γπΜ DTT, 10% gliceryny. Na każdy 1 litr hodowli bakteryjnej dodano 100 μl lizozymu (20 mg/ml) i 100 μl Dnazy I (20 μg/ml). Po inkubacji na lodzie przez 30 minut, zawiesinę bakterii poddano działaniu ultradźwięków w 1-minutowych impulsach łącznie przez około 10 minut w sonikatorze Μί^Νχ XL2020 za pomocą typowego 12 mm trzpienia. Osady ciałek inkluzyjnych odzyskano przez odwirowanie przez 30 minut przy 13000 obrotów/minutę w wirówce Beckman J2-21 (4°C). Następnie przeprowadzono trzy przemycia buforem do przemywania Triton (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 0,5% Triton-X100, 100 γπΜ NaCl, 10 mM NaEDTA, 0,1% (wag./obj.), 2 γπΜ DTT) w celu usunięcia szczątków komórek i składników błon. Za każdym razem osad ciałek inkluzyjnych homogenizowano w buforze do przemywania Triton przed przeprowadzeniem do osadu przez odwirowanie przez 15 minut przy 13000 obrotów/minutę w Beckman J2-21.

PL 208 712 B1

Detergent i sól usunięto przez podobne przemycie w buforze (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 100 mM NaCl, 10 mM NaEDTA, 0,1% (wag./obj.) azydek sodu, 2 mM DTT). Ostatecznie, ciałka inkluzyjne rozpuszczono w 6M buforze guanidynowym (6M chlorowodorek guanidyny, 50 mM Tris, pH 8,1, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT), podzielono na porcje po 120 mg i zamrożono w -70°C. Ciałka inkluzyjne oznaczono ilościowo przez rozpuszczenie w 6M guanidynie^HCl i pomiary w teście wiązania barwnika Bradford (PerBio).

Około 60 mg (tj. 2,4 pmola) zamrożonego rozpuszczonego łańcucha α zmieszano z 30 mg (tj. 1,2 pmola) zamrożonego rozpuszczonego łańcucha β. Mieszaninę TCR rozcieńczono do końcowej objętości 18 ml buforem 6M guanidyny i podgrzano do 37°C przez 30 minut aby zapewnić całkowitą denaturację łańcucha. Następnie roztwór guanidyny zawierający całkowicie zredukowane i zdenaturowane łańcuchy TCR zmieszano z 1 litrem zimnego buforu do ponownego zwijania (100 mM Tris pH 8,1, 400 mM L-arginina· HCl, 2 mM EDTA, 6,6 mM 2-merkaptoetyloamina, 3,7 mM cystamina, 5M mocznik). Roztwór pozostawiono na 5 godzin w chłodni (5°C ± 3°C) aby umożliwić zwinięcie. Następnie zwinięte łańcuchy dializowano wobec 12 litrów wody przez 18-20 godzin, następnie 12 litrów 10 mM Tris pH 8,1 przez 18-20 godzin (5°C ± 3°C). Do tej dializy zastosowano błonę do dializy Spectrapor 1 (Spectrum Laboratories nr produktu 132670), która odcina masę cząsteczkową 6-8000 kDa. Dializowane białko przesączono przez filtry o średnicy porów 0,45 pm (Schleicher and Schuell, nr 10 404012) do jednostki filtracyjnej Nalgene.

Zwinięte NY-ESO TCR oddzielono od produktów rozpadu i zanieczyszczeń przez naniesienie dializowanych zwiniętych łańcuchów na kolumnę anionowymienną POROS 50HQ (Applied Biosystems) stosując zestaw do oczyszczania Akta (Amersham Biotech). Kolumnę POROS 50 HQ wstępnie równoważono 10 objętościami kolumny buforu A (10 mM Tris pH 8,1) przed naniesieniem białka. Związane białko wyeluowano z gradientem 0-500 mM NaCl przez 7 objętości kolumny. Frakcje pików (1 ml) analizowano na denaturującej SDS-PAGE stosując redukujący i nieredukujący bufor do próbek. Frakcje pików zawierające heterodimeryczny kompleks α-β dalej oczyszczano stosując kolumnę do filtracji żelowej Superdex 75HR wstępnie równoważoną w 25 mM MES pH 6,5. Pik białkowy wyeluowany przy względnej masie cząsteczkowej około 50 kDa połączono, zatężono do 42 mg/ml w koncentratorach wirówkowych Ultrafree (Millipore, nr katalogowy UFV2BGC40) i przechowywano -80°C.

Krystalizację NY-ESO TCR metodą wiszącej kropli w 18°C stosując 1 pl roztworu białka (8,4 mg/ml) w 5 mM MES pH 6,5 zmieszanego z równą objętością buforu do krystalizacji. Kryształy pojawiały się w kilku różnych warunkach przy zastosowaniu buforów Crystal Screen (Hampton Research). Pojedyncze regularne kryształy (< 100 pm) otrzymano w buforze 30% PEG 4000, 0,1M Na cytrynian pH 5,6, 0,2M octan amonu i zastosowano do określenia struktury.

Kryształy NY-ESO TCR błyskawicznie zamrożono i zbadano pod względem dyfrakcji w wiązce promieni Rentgena synchrotronu Daresbury. Dyfrakcję kryształów badano do rozdzielczości 0,25 nm (2,5 A). Jeden zestaw wyników zebrano i opracowano uzyskując 98,6% kompletnego zestawu amplitud, które były sensowne do około 0,27 nm (2,7 A), ale użyteczne do 0,25 nm (2,5 A). Czynnik łączenia R, tj. zgodności pomiędzy wieloma pomiarami krystalograficznie równoważnych odbić, wynosi 10,8% dla wszystkich danych. Grupą przestrzenną była P21, z wymiarami komórki a=4,25 nm (42,5 A), b=5,95 nm (59,5 A), c=8,17 nm (81,7 A), β=91,5°. Wymiary komórki oraz symetria oznaczały obecność dwóch kopii w komórce. Jednostka asymetryczna, au lub minimalna objętość, która musi być zbadana, zawierała tylko 1 cząsteczkę i drugą cząsteczkę w komórce wygenerowano przez operację symetrii 21. Pozycjonowanie cząsteczki w au jest dowolnie przyjęte w kierunku y. Pod warunkiem prawidłowej pozycji w płaszczyźnie x-z, można ją przemieszczać dowolnie w kierunku y. Nazywa się to wolnym parametrem, w tej „biegunowej” grupie przestrzennej.

Baza danych PDB ma tylko jeden zapis zawierający heterodimeryczny A/B TCR, 1BD2. Ten zapis zawiera także współrzędne HLA-pokrewnego peptydu w kompleksie TCR. Łańcuch B TCR był taki sam w NY-ESO, ale łańcuch A zawierał niewielkie różnice w domenie C i istotne różnice w domenie N. Przy zastosowaniu modelu 1BD2 A/B do zastąpienia cząsteczki, MR, otrzymano niepoprawne rozwiązanie, na co wskazuje nadmierne pokrywanie z symetrycznie równoważnymi cząsteczkami. Przy zastosowaniu samego łańcucha B otrzymano lepsze rozwiązanie, które nie wykazywało istotnego kolidowania z sąsiadami. Współczynnik korelacji wynosił 49%, krystalograficzny czynnik R 50% oraz najbliższe przybliżenie (środek ciężkości do c-o-g) wynosiło 0,49 nm (49A). Rotację i operację translacji potrzebne do przekształcenia wyjściowego modelu łańcucha B do równoważnika MR zastosowano dla łańcucha A. Tak wygenerowano hybrydowe rozwiązanie MR, upakowane dobrze w komórce, przy minimalnym kolidowaniu.

PL 208 712 B1

Mapy gęstości elektronowej zgadzały się z tym modelem i umożliwiły ich skorygowanie tak by pasowały do sekwencji NY-ESO TCR. Ale wyjściowy model miał wiele luk, w szczególności brakujące łańcuchy boczne, które są charakterystyczne dla słabo uporządkowanych części modelu. Wiele pętli w kształcie spinki do włosów pomiędzy nićmi miało bardzo niską gęstość i było bardzo trudne do modelowania. Krystalograficzny czynnik R modelu wynosił 30%. Czynnik R oznacza resztę, czyli różnicę pomiędzy obliczonymi a obserwowanymi amplitudami.

Jak pokazują fig. 83a i 83b, sekwencja wejściowa z 1BD2 nie pasuje bardzo dobrze do gęstości. Zmiana modelu dla Cys w pozycjach 164 w łańcuchu A i 174 w łańcuchu B, a następnie dalsze udoskonalenie, wyraźnie pokazało, że to przypisanie sekwencji znacznie lepiej pasuje do gęstości. Ale różnice w odniesieniu do wielkości łańcucha bocznego są minimalne, a więc występowało niewielkie zaburzenia modelu. Gęstość w tym regionie była w niewielkim stopniu zmieniona.

Najistotniejszym aspektem tej pracy był fakt, że nowy TCR jest bardzo podobny pod względem struktury do opublikowanego modelu (1BD2). Porównanie może zawierać cały TCR, domeny stałe lub niewielką część w pobliżu miejsca mutacji.

Wartości odchylenia r.m.s wymieniono w tabeli poniżej. Porównanie struktur przedstawiono na fig. 84.

	Kompletny łańcuch A	Kompletny łańcuch B	Stały łańcuch A	Stały łańcuch B	Krótki fragment
Przesunięcie r.m.s	2,831	1,285	1,658	1,098	0,613
Średnie przesunięcie	2,178	1,001	1,235	0,833	0,546
Maksymalne przesunięcie	9,885	6,209	6,830	4,490	1,330

(Wszystkie wartości są w A)

Krótki fragment dotyczy pojedynczej nici łańcucha A (A157 - A169) i pojedynczej nici łańcucha B (B170 - B183), które są teraz połączone przez mostek disulfidowy. Odchylenia obliczono tylko dla atomów łańcucha głównego.

Wyniki te pokazują, że wprowadzenie wiązania disulfidowego ma minimalny wpływ na lokalną strukturę TCR wokół wiązania. Trochę większe efekty obserwuje się przy porównaniu TCR z opublikowana strukturą (1BD2) A6 TCR, ale wzrost przesunięcia RMS w znacznym stopniu wynika z konformacji pętli (patrz fig. 84). Te pętle nie tworzą części struktury rdzenia TCR, która jest tworzona przez serię β-kartek, które są charakterystyczne dla zwinięcia Ig. Odchylenie RMS dla całego łańcucha α jest szczególnie duże, ze względu na różnicę sekwencji domen zmiennych pomiędzy A6 (1BD2) a NY-ESO TCR. Jednakże, A6 i NY-ESO TCR mają taką samą domenę zmienną β i odchylenie RMS dla całego łańcucha β pokazuje, że struktura tej domeny zmiennej jest także utrzymywana w TCR z nowym wiązaniem disulfidowym. Zatem te dane wskazują, że struktura rdzenia TCR jest utrzymywana w strukturze krystalicznej TCR z nowym wiązaniem disulfidowym.

P r z y k ł a d 10. Wytwarzanie rozpuszczalnych NY-ESO TCR zawierających nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe oraz C-końcowe miejsca znacznikowe w łańcuchu β.

Aby wytworzyć rozpuszczalny NY-ESO TCR zawierający nowe wiązanie disulfidowe, jako matryce zastosowano plazmidy A6 TCR zawierające miejsca restrykcyjne w łańcuchu α BamH1 i w łańcuchu β Bglll, jak opisano w przykładzie 4.

Konstrukty łańcucha eNY-ESO TCR otrzymano przez klonowanie PCR w następujący sposób. Przeprowadzono reakcje PCR stosując startery przedstawione poniżej oraz matryce zawierające łańcuchy NY-ESO TCR.

INdel |

Fwd5' -GGAGATATACATATGGGTGTCACTCAGAAC-3'

Rev5' -CCACCGGATCCGTCTGCTCTACCCCAGGC-3' !BamHI|

Produkty PCR strawiono odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i wklonowano do pGMT7 uzyskując plazmidy ekspresyjne. Sekwencję wstawek w plazmidzie potwierdzono przez zautomatyzowane sekwencjonowanie DNA. Fig. 85a przedstawiają sekwencję DNA łańcucha β NY-ESO TCR

PL 208 712 B1 zawierającego miejsce rozpoznania dla biotyny oraz fig. 85b przedstawia powstałą sekwencję aminokwasową.

Konstrukt łańcucha α wytworzono w sposób opisany w przykładzie 5. Poszczególne łańcuchy TCR wyrażono, poddano współzwijaniu i oczyszczono jak opisano w przykładzie 5.

Aby wytworzyć rozpuszczalny NY-ESO TCR zawierający nienatywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe i znacznik heksa-histydynowy na C-końcu łańcucha β, zastosowano te same startery co powyżej i matrycę NY-ESO. Produkty PCR strawiono restrykcyjnie odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i wklonowano do pGMT7 zawierającego sekwencje heksa-histydynową z uzyskaniem plazmidów ekspresyjnych. Fig. 86a przedstawia sekwencję DNA łańcucha β NY-ESO TCR zawierającego znacznik heksa-histydynowy, a fig. 86b przedstawia powstałą sekwencję aminokwasową.

Fig. 87 przedstawia elucję białka rozpuszczalnego połączonego disulfidowo NY-ESO TCR zawierającego nowe wiązanie disulfidowe i sekwencję rozpoznania dla biotyny z kolumny anionowymiennej POROS 50HQ z gradientem 0-500 mM NaCl, co wskazano przez kropkowaną linię. Fig. 88 przedstawia elucję rozpuszczalnego NY-ESO TCR zawierającego nowe wiązanie disulfidowe i znacznik heksa-histydynowy z kolumny anionowymiennej POROS 50HQ z gradientem 0-500 mM NaCl, co wskazano przez kropkowaną linię.

Fig. 89 i 90 przedstawiają profile elucji białka metodą chromatografii żelowej z kolumn anionowymiennych NY-ESO-biotynowo i NY-ESO-heksa-histidynowo znakowanych zilustrowanych odpowiednio na fig. 87 i 88. Białko eluowane było jako pojedynczy główny pik, odpowiadający heterodimerowi TCR.

Analizę BIAcore wiązania sTCR z pMHC przeprowadzono jak opisano w przykładzie 3. NY-ESO-biotyna TCR wykazywał Kd 7,5 μΜ. NY-ESO-heksa-histydyna TCR wykazywał Kd 9,6 μΜ.

P r z y k ł a d 11. Wybarwianie komórek za pomocą znakowanych fluorescencyjnie tetramerów rozpuszczalnego NY-ESO TCR zawierających nowe międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe.

Przygotowanie tetramerów TCR

NY-ESO rozpuszczalne TCR zawierające nowe wiązanie disulfidowe oraz sekwencję rozpoznania dla biotyny otrzymane jak w przykładzie 10 zastosowano do wytworzenia rozpuszczalnych tetramerów TCR wymaganych do wybarwienia komórek. W 2,5 ml roztworu rozpuszczalnego TCR (około 0,2 mg/ml) wymieniono bufor na bufor do reakcji biotynylacji (50 mM Tris pH 8,0, 10 γπΜ MgCl2) z zastosowaniem kolumny PD-10 (Pharmacia). Eluat (3,5 ml) zatężono do 1 ml z użyciem zagęszcza Centricon (Amicon) o odcięciu masy cząsteczkowej 10 kDa. Do próby dodano ATP do 10 mM z roztworu podstawowego (0,1 g/ml doprowadzono do pH 7,0). Dodano koktajl inhibitorów proteaz (koktajl inhibitorów proteaz Set 1, Calbiochem Biochemicals), o objętości wystarczającą do uzyskania końcowego stężenia koktajlu proteazowego 1/100 podstawowego roztworu, a następnie 1 mM biotyny (dodanej z roztworu podstawowego 0,2Μ) i 20 μg/ml enzymu (roztwór podstawowy 0,5 mg/ml). Następnie mieszaninę inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Nadmiar biotyny usunięto z roztworu metodą chromatografii z wykluczeniem wielkości na kolumnie S75 HR. Poziom biotynylacji obecnej na NY-ESO TCR określono metodą opartą na HPLC z wykluczeniem wielkości w następujący sposób. 50 μl próby biotynylowanego NY-ESO TCR (2 mg/ml) inkubowano z 50 μl kulek agarozowych powlekanych streptawidyną (Sigma) przez 1 godzinę. Następnie kulki odwirowano i 50 μl niezwiązanej próby analizowano na kolumnie TSK 2000 SW (Tosoohaas) przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min (200 mM bufor fosforanowy pH 7,0) przez 30 minut. Obecność biotynylowanego NY-ESO TCR wykryto spektrometrem UV zarówno przy 214 nm, jak i 280 nm. Biotynylowany NY-ESO analizowano względem kontrolnego niebiotynylowanego NY-ESO TCR. Procent biotynylacji obliczono przez odjęcie powierzchni piku biotynylowanego białka od piku nie biotynylowanego białka.

Tetrameryzację biotynylowanego rozpuszczalnego TCR otrzymano stosując koniugat neutrawidyna-fikoerytryna (Cambridge Biosciences, UK). Stężenie biotynylowanego rozpuszczalnego TCR zmierzono stosując test białkowy Coomassie (Pierce) oraz obliczono, że stosunek rozpuszczalnego TCR 0,8 mg/mg koniugatu neutrawidyna-fikoertryna osiąga wysycenie neutrawidyny-PE przez biotynylowany TCR przy stosunku 1:4. 19,5 μl 6,15 mg/ml roztworu biotynylowanego NY-ESO rozpuszczalnego TCR w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) dodano powoli do 150 μl rozpuszczalnego 1 mg/ml neutrawidyna-PE w lodzie z delikatnym mieszaniem. Następnie do tego roztworu dodano 100,5 μl PBS aby uzyskać końcowe stężenie tetrameru NY-ESO TCR 1 mg/ml.

Procedura wybarwiania

Cztery próbki 0,3x10⁶ HLA-A2 pozytywnej transformowanej EBV linii komórek B (PP LCL) w 0,5 ml PBS inkubowano w różnych stężeniach (0, 10^-4, 10^-5 i 10^-6 Μ) peptydu HLA-A2 NYESO

PL 208 712 B1 (SLLMWITQC) przez 2 godziny w 37°C. Następnie komórki PP LOL przemyto dwukrotnie roztworem buforowanych soli Hanksa (HBSS) (Gibco, UK).

Każdą z czterech próbek podzielono na równe części i wybarwiono biotynylowanym połączonym disulfidowo NY-ESO TCR świeżo tetrameryzowanym za pomocą neutrawidyny-fikoerytryny. Komórki inkubowano z 5 lub 10 μg tetramerycznych kompleksów dsTCR znakowanych fikoerytryną na lodzie przez 30 minut i przemyto HBSS. Komórki ponownie przemyto, przeprowadzono w zawiesinę w HBSS i analizowano za pomocą FACSVantage. Zebrano 25000 zdarzeń i dane analizowano z użyciem oprogramowania WinMIDI.

Wyniki

Fig. 91a-h przedstawia histogramy danych z FACSVantage wygenerowanych dla każdej z próbek przygotowanych w sposób opisany powyżej. Poniższa tabela wymienia procent pozytywnie wybarwionych komórek obserwowany dla każdej z próbek:

Próbka	Pozytywnie wybarwione komórki (%)
0 peptydu NY-ESO, 5 pg TCR	0,75
10^-4 M peptydu NY-ESO, 5 pg TCR	84,39
10^-5 M peptydu NY-ESO, 5 pg TCR	35,29
10‘⁶ M peptydu NY-ESO, 5 pg TCR	7,98
0 peptydu NY-ESO, 10 pg TCR	0,94
10·⁴ M peptydu NY-ESO, 10 pg TCR	88,51
10·⁵ M peptydu NY-ESO, 10 pg TCR	8,25
10·⁶ M peptydu NY-ESO, 10 pg TCR	3,45

Dane te wyraźnie pokazują, że część komórek znakowanych przez tetramery NY-ESO TCR wzrasta w sposób skorelowany ze stężeniem peptydu (SLLMWITQC), w którym były inkubowane. Zatem, te tetramery NY-ESO TCR są ugrupowaniami odpowiednimi do specyficznego znakowania komórek w oparciu o ekspresję kompleksu HLA-A2 NY-ESO.

W przykładzie tym zastosowano fluorescencyjnie sprzężony tetramer NY-ESO TCR. Jednakże, podobnych poziomów wiązania komórek należy oczekiwać, gdy znacznik zostanie zastąpiony odpowiednim ugrupowaniem terapeutycznym.

P r z y k ł a d 12. Wytwarzanie rozpuszczalnego A6 TCR z nowym wiązaniem disulfidowym zawierającego region stały Cp1

Wszystkie poprzednie przykłady opisują wytwarzanie rozpuszczalnych TCR z nowym wiązaniem disulfidowym zawierającym region stały Ce2. Ten przykład pokazuje, że z powodzeniem można wytwarzać rozpuszczalne TCR zawierające region stały Ce1.

Zaprojektowanie starterów do łączącego PCR obejmującego domeny V do Cp1 łańcucha β A6 TCR.

Do konstruktu PCR domeny V łańcucha β A6 TCR zaprojektowano następujące startery:

5' -GGAGATATACATATGAACGCTGGTGTCACT-3'

5' -CCTTGTTCAGGTCCTCTGTGACCGTGAG-3'

Do konstruktu PCR Ce1 zaprojektowano następujące startery:

5' -CTCACGGTCACAGAGGACCTGAACAAGG-3'

5' -CCCAAGCTTAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC-3'

Konstrukty β VTCR i Οβ1 osobno amplifikowano z zastosowaniem znanej technologii PCR. Połączono je ze sobą za pomocą fuzyjnej (ang. stitching) PCR. Plazmidowy DNA oczyszczono w kolumnie do oczyszczania na małą skalę Qiagen zgodnie z instrukcjami producenta i sekwencję potwierPL 208 712 B1 dzono przez zautomatyzowane sekwencjonowanie w centrum sekwencjonowania Department of Biochemistry, Oxford University. Sekwencję A6+Cβ1 przedstawiono na fig. 92.

Następnie łańcuch A6+Cβ1 sparowano z łańcuchem α A6 TCR przez międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe po wprowadzeniu cysteiny w domenie C obu łańcuchów.

Rozpuszczalne TCR wyrażono i zwijano jak opisano w przykładzie 2.

Oczyszczanie zwiniętego rozpuszczalnego TCR sTCR oddzielono od produktów rozpadu i zanieczyszczeń przez naniesienie dializowanych zwiniętych łańcuchów na kolumnę anionowymienną POROS 50HQ i elucję związanego białka gradientem 0-500 mM NaCl przez 50 objętości kolumny stosując zestaw do oczyszczania Akta (Pharmacia) jak na fig. 93. Frakcje pików przechowywano w 4°C i analizowano na barwionych Coomassie SDS-PAGE (fig. 94) przed połączeniem frakcji i zagęszczeniem. Ostatecznie, sTCR oczyszczano i charakteryzowano na kolumnie do filtracji żelowej Superdex 200HR (fig. 95) wstępnie równoważonej buforem HBS-EP (10 ιηΜ HEPES pH 7,4, 150 ιηΜ NaCl, 3,5 ιηΜ EDTA, 0,05% nonidet p40). Pik eluowany przy względnej masie cząsteczkowej około 50 kDa połączono i zatężono przed scharakteryzowaniem metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego BIAcore.

Analizę BIAcore wiązania połączonego disulfidowo A6 TCR z pMHC przeprowadzono jak opisano w przykładzie 3. Fig. 96 przedstawia analizę BIAcore specyficznego wiązania połączonego disulfidowo A6 rozpuszczalnego TCR z pokrewnym mu pMHC.

Rozpuszczalny A6 TCR z nowym wiązaniem disulfidowym zawierający stały region Cβ1 wykazywał K_d 2,42 ± 0,55 μΜ dla swojego pokrewnego pMHC. Wartość ta jest bardzo podobna do Kd 1,8 μΜ określonej dla rozpuszczalnego A6 TCR z nowym wiązaniem disulfidowym zawierającym region stały Cβ2, co określono w przykładzie 3.

P r z y k ł a d 13. Wytwarzanie rozpuszczalnego A6 TCR z nowym wiązaniem disulfidowym zawierającego „wolną” cysteinę w łańcuchu β

Regiony stałe łańcucha β TCR zawierają resztę cysteiny (reszta 75 w egzonie 1 TRBC1*01 i TRBC2*01), która nie uczestniczy w tworzeniu ani międzyłańcuchowego, ani w wewnątrzłańcuchowego wiązania disulfidowego. Wszystkie poprzednie przykłady opisują wytwarzanie rozpuszczalnych TCR z nowym wiązaniem disulfidowym w którym „wolna” cysteina została zmutowana do alaniny w celu uniknięcia możliwego wytworzenia jakichkolwiek „nieprawidłowych” wiązań disulfidowych, które mogą spowodować obniżoną wydajność funkcjonalnego TCR. Przykład ten pokazuje, że można wytwarzać rozpuszczalne TCR zawierające tą „wolną” cysteinę.

Zaprojektowanie starterów i mutageneza łańcucha β TCR

W celu zmutowania alaniny z łańcucha β TCR (reszta 75 w egzonie 1 TRBC1*01 i TRBC2*01) do cysteiny, zaprojektowano następujące startery (mutacje wskazano małymi literami):

5'-T GAC TCC AGA TAC tgT CTG AGC AGC CG

5'-CG GCT GCT CAG Aca GTA TCT GGA GTC A

Mutagenezę PCR, ekspresję i zwijanie rozpuszczalnego TCR przeprowadzono jak opisano w przykładzie 2.

Oczyszczanie zwiniętego rozpuszczalnego TCR sTCR oddzielono od produktów rozpadu i zanieczyszczeń przez naniesienie dializowanych zwiniętych łańcuchów na kolumnę anionowymienną POROS 50HQ i elucję związanego białka gradientem 0-500 mM NaCl przez 50 objętości kolumny stosując zestaw do oczyszczania Akta (Pharmacia) jak na fig. 98. Frakcje pików przechowywano w 4°C i analizowano na barwionych Coomassie SDS-PAGE (fig. 94) przed połączeniem frakcji i zagęszczeniem. Ostatecznie, sTCR oczyszczano i charakteryzowano na kolumnie do filtracji żelowej Superdex 200HR (fig. 100) wstępnie równoważonej buforem HBS-EP (10 ιηΜ HEPES pH 7,4, 150 ιηΜ NaCl, 3,5 ιηΜ EDTA, 0,05% nonidet p40). Pik eluowany przy względnej masie cząsteczkowej około 50 kDa połączono i zatężono przed scharakteryzowaniem metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego BIAcore.

Analizę BIAcore wiązania połączonego disulfidowo A6 TCR z pMHC przeprowadzono jak opisano w przykładzie 3. Fig. 101 przedstawia analizę BIAcore specyficznego wiązania połączonego disulfidowo A6 rozpuszczalnego TCR z pokrewnym mu pMHC.

Rozpuszczalny A6 TCR z nowym wiązaniem disulfidowym zawierający „wolną” cysteinę w łańcuchu β wykazywał K_d 21,39 ± 3,55 μΜ dla swojego pokrewnego pMHC.

P r z y k ł a d 14. Wytwarzanie A6 TCR z nowym wiązaniem disulfidowym w którym „wolna” cysteina w łańcuchu β jest zmutowana do seryny

PL 208 712 B1

Przykład ten pokazuje, że z powodzeniem można wytworzyć rozpuszczalne TCR z nowym wiązaniem disulfidowym w których „wolna” cysteina łańcucha β (reszta 75 egzonu 1 TRBC1*01 i TRBC2*01) jest zmutowana do seryny.

Zaprojektowanie starterów i mutageneza łańcucha β TCR

W celu zmutowania alaniny z łańcucha β TCR, która została poprzednio podstawiona w miejsce natywnej cysteiny (reszta 75 w egzonie 1 TRBC1*01 i TRBC2*01), do seryny, zaprojektowano następujące startery (mutacje wskazano małymi literami):

5'-T GAC TCC AGA TAC tCT CTG AGC AGC CG

5'-CG GCT GCT CAG AGa GTA TCT GGA GTC A

Mutagenezę PCR (powodującą wytworzenie zmutowanego łańcucha β, jak pokazano na fig. 102), ekspresję i zwijanie rozpuszczalnego TCR przeprowadzono jak opisano w przykładzie 2.

Oczyszczanie zwiniętego rozpuszczalnego TCR sTCR oddzielono od produktów rozpadu i zanieczyszczeń przez naniesienie dializowanych zwiniętych łańcuchów na kolumnę anionowymienną POROS 50HQ i elucję związanego białka gradientem 0-500 mM NaCl przez 50 objętości kolumny stosując zestaw do oczyszczania Akta (Pharmacia) jak na fig. 103. Frakcje pików przechowywano w 4°C i analizowano na barwionych Coomassie SDS-PAGE (fig. 104) przed połączeniem frakcji i zagęszczeniem. Ostatecznie, sTCR oczyszczano i charakteryzowano na kolumnie do filtracji żelowej Superdex 200HR (fig. 105) wstępnie równoważonej buforem HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3,5 mM EDTA, 0,05% nonidet p40). Pik eluowany przy względnej masie cząsteczkowej około 50 kDa połączono i zatężono przed scharakteryzowaniem metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego BIAcore.

Analizę BIAcore wiązania połączonego disulfidowo A6 TCR z pMHC przeprowadzono jak opisano w przykładzie 3. Fig. 106 przedstawia analizę BIAcore specyficznego wiązania połączonego disulfidowo A6 rozpuszczalnego TCR z pokrewnym mu pMHC.

Rozpuszczalny A6 TCR z nowym wiązaniem disulfidowym, w którym „wolna” cysteina w łańcuchu β została zmutowana do seryny, wykazywał Kd 2,98 ± 0,27 pM dla swojego pokrewnego pMHC. Wartość ta jest bardzo podobna do Kd 1,8 pM określonej dla rozpuszczalnego A6 TCR z nowym wiązaniem disulfidowym, w którym „wolna” cysteina w łańcuchu β została zmutowana do alaniny, co określono w przykładzie 3.

P r z y k ł a d 15. Klonowanie łańcuchów α i β NY-ESO TCR zawierających nowe wiązanie disulfidowe w drożdżowych wektorach ekspresyjnych

Łańcuchy α i β NY-ESO TCR sfuzowano z C-końcem sekwencji pre-proczynnika płciowego α z Saccharomyces cerevisiae i wklonowano do drożdżowych wektorów ekspresyjnych odpowiednio pYX122 i pYX112 (patrz fig. 107 i 108).

Zaprojektowano następujące startery do PCR aby amplifikować sekwencję pre-proczynnika płciowego α ze szczepu SEY6210 S. cerevisiae (Robinson i inni (1991), Mol Cell Biol. 11 (12): 581324) do sfuzowania z łańcuchem α TCR.

5'-TCT GAA TTC ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT AC-3'

5'-TCA CCT CCT GGG CTT CAG CCT CTC TTT TAT C -3'

Następujące startery zaprojektowano do PCR aby amplifikować sekwencję pre-proczynnika płciowego α ze szczepu SEY6210 S. ceravisiae do sfuzowania z łańcuchem β TCR.

5'-TCT GAA TTC ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT AC-3'

5'-GTG TCT CGA GTT AGT CTG CTC TAC CCC AGG C-3'

Drożdżowy DNA wypreparowano przez przeprowadzenie w zawiesinę kolonii szczepu SEY6210 S. cerevisiae w 30 pl 0,25% SDS w wodzie i ogrzewanie przez 3 minuty w 90°C. Sekwencje pre-proczynnika płciowego α do zfuzowania z łańcuchami α i β TCR wytworzono przez amplifikację PCR 0,25 pl drożdżowego DNA z poszczególnymi wymienionymi powyżej parami starterów stosując następujące warunki PCR. 12,5 pmoli każdego startera zmieszano z 200 pM dNTP, 5 pl 10x buforu Pfu i 1,25 jednostki polimerazy Pfu (Stratagene) w końcowej objętości 50 pl. Po początkowym etapie denaturacji przez 30 s w 92°C, mieszaninę reakcyjną poddano 30 cyklom denaturacji (92°C, 30 s), hybrydyzacji (46,9°C, 60 s) i wydłużania (72°C, 2 min.) w aparacie do PCR Hybaid PCR express.

Następujące startery zaprojektowano do amplifikacji PCR łańcucha α TCR do sfuzowania z wymienioną powyżej sekwencją pre-proczynnika płciowego α.

5'-GGC TGA AGC CCA GGA GGT GAC ACA GAT TCC-3'

5'-CTC CTC TCG AGT TAG GAA CTT TCT GGG CTG GG-3'

PL 208 712 B1

Następujące startery zaprojektowano do amplifikacji PCR łańcucha β TCR do sfuzowania z wymienioną powyżej sekwencją pre-proczynnika płciowego α.

5'-GGC TGA AGC CGG CGT CAC TCA GAC CCC AAA AT-3'

5'-GTG TCT CGA GTT AGT CTG CTC TAC CCC AGG C-3'

Warunki PCR do amplifikacji łańcuchów α i β TCR były takie same jak wspomniane powyżej, z wyjątkiem następujących zmian: jako matrycowe DNA zastosowano do amplifikacji łańcuchów α i β TCR odpowiednio łańcuchy α i β NY-ESO TCR (jak przygotowane przykładzie 5), a temperatura hybrydyzacji wynosiła 60,1°C.

Następnie produkty PCR zastosowano w reakcji łączenia PCR stosując komplementarne częściowo pokrywające się sekwencje wprowadzone do początkowych produktów PCR do wytworzenia pełnej długości chimerycznego genu. Powstałe produkty PCR strawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Xhol i wklnowano do pYX122 lub pYX112 strawionych tymi samymi enzymami. Powstałe plazmidy oczyszczono w kolumnie do oczyszczania na małą skalę Qiagen™ według instrukcji producenta i sekwencje zweryfikowano przez zautomatyzowane sekwencjonowanie w centrum sekwencjonowania Genetics Ltd, Queensway, New Milton, Hampshire, United Kingdom. Fig. 109 i 110 przedstawiają sekwencje DNA i białkowe sklonowanych chimerycznych produktów.

P r z y k ł a d 16. Ekspresja rozpuszczalnego NY-ESO TCR zawierającego nowe wiązanie disulfidowe w drożdżach

Plazmidy do ekspresji w drożdżach zawierające łańcuchy α i β TCR odpowiednio wytworzone w sposób opisany w przykładzie 15 kotransfekowano do szczepu SEY6210 S. cerevisiae z zastosowaniem procedury, którą podali Agatep i inni (1998) (Technical Tips Online (http://tto.trends.com) 1:51:P01525). Pojedynczą kolonię rosnącą na syntetycznym agarze dropout (SD) zawierającym histydynę i uracyl (Qbiogene, Illkirch, Francja) hodowano przez noc w 30°C w 10 ml pożywki SD zawierającej histydynę i uracyl. Nocną hodowlę podhodowano w stosunku 1:10 w 10 ml świeżej pożywki SD zawierającej histydynę i uracyl i hodowano przez 4 godziny w 30°C. Hodowlę odwirowano przez 5 minut przy 3800 obrotów/minutę w Heraeus Megafuge 2.0R (Kendro Laboratory Products Ltd, Bishop's Stortford, Hertfordshire, UK) i zebrano supernatant. 5 μl złoża StratClean Resin (Stratagene) zmieszano z supernatantem i trzymano obracając w wytrząsarce do krwi przez noc w 4°C. Złoże StrataClean odwirowano przy 3800 obrotów/minutę Heraeus Megafuge 2.0R i pożywkę odrzucono. 25 μl redukującego buforu do próbek (950 μl buforu Laemmli do próbek (Biorad) zawierającego 50 μl 2M DTT) dodano do żywicy i próbki ogrzewano w 95°C przez 5 minut, a następnie ochłodzono na lodzie przed naniesieniem 20 μl mieszaniny na żel SDS-PAGE przy stałym natężeniu 0,8 mA/cm² powierzchni żelu na 1 godzinę. Białka z żelu przeniesiono na błony Immuno-Blot PVDF (Bio-Rad) i wyznakowano przeciwciałem przeciw łańcuchowi α TCR jak opisano w przykładzie 17 poniżej, z następującymi zmianami. Pierwszorzędowe przeciwciało (przeciw łańcuchowi α TCR) i drugorzędowe przeciwciało zastosowano w rozcieńczeniach odpowiednio 1:200 i 1:1000. Fig. 111 przedstawia zdjęcie wywołanej błony. Wynik pokazuje, że hodowla drożdży wydziela TCR do pożywki na niskim poziomie.

P r z y k ł a d 17. Wyrażanie łańcucha α i β disulfidowego A6 Tax TCR w bakulowirusie

Strategia klonowania

Łańcuchy α i β disulfidowego A6 Tax TCR sklonowane z pGMT7 do wektora opartego na pBlueScript KS2- nazwanego pEX172. Wektor ten zaprojektowano do klonowania różnych łańcuchów β MHC klasy II do ekspresji w komórkach owadzich za pomocą sekwencji liderowej z DRB1*0101, miejsca Agel do wstawienia różnych sekwencji kodujących peptydy, regionu łącznikowego, a następnie miejsc Mlul i Sall do wklonowania łańcuchów DRe przed sekwencją suwaka leucynowego Jun. Sekwencję, która pEX 172 różni się od pBlueScript II KS-, umiejscowioną pomiędzy miejscami KpnI a EcoRI pBlueScript II KS-, przedstawiono na fig. 112. W celu sklonowania łańcuchów TCR w komórkach owadzich, ten pEX172 przecięto Agel i Sall w celu usunięcia regionu łącznikowego i miejsca Mlul i łańcuchy TCR można wprowadzić w miejsce, w którym zaczyna się sekwencja peptydowa. Sekwencje TCR sklonowane z pGMT7 za pomocą miejsca RspEI na 5'-końcu (ma ono Agel-kompatybilne lepkie końce) i miejsca SalI na 3'-końcu. Aby dostarczyć miejsce trawienia do usunięcia sekwencji liderowej DRe, pierwsze trzy reszty łańcucha DRe (GDT) zostały zachowane. Aby zapobiec transkrypcji sekwencji suwaka leucynowego Jun konieczne było wprowadzenie kodonu stop przed miejscem SalI. Schemat tego konstruktu przedstawiono na fig. 113. Gdy łańcuchy TCR wstawiono do plazmidu fragment BamHI wycięto i subklonowano do wektora pAcAB3, który ma miejsca rekombinacji homologicznej dla bakulowirusa. Wektor pAcAB3 ma dwa rozbieżne promotory, jeden z miejscem klonowania

PL 208 712 B1

BamHI oraz drugi z miejscem klonowania Bglll. W łańcuchu β A6 TCR istnieje miejsce Bglll, tak, że łańcuch β A6 TCR wstawiono w miejsce Bglll, a następnie łańcuch α subklonowano w miejsce BamHI.

Zgodnie z powyższą strategią klonowania zaprojektowano następujące startery (homologię z wektorem wskazano dużymi literami):

A6a: F: 5'-gtagtccggagacaccggaCAGAAGGAAGTGGAGCAGAAC R: 5'-gtaggtcgacTAGGAACTTTCTGGGCTGGG

Α6β: F: 5'-gtagtccggagacaccggaAACGCTGGTGTCACTCAGA R: 5'-gtaggtcgacTAGTCTGCTCTACCCCAGG

PCR, klonowanie i subklonowanie

Plazmidy ekspresyjne zawierające geny dla łańcuchów a i β disulfidowego A6 Tax TCR zastosowano jako matryce w następujących reakcjach PCR. 100 ng plazmidu a zmieszano z 1 pl 10 mM dNTP, 5 pl 10x buforu Pfu (Stratagene), 1,25 jednostki polimerazy Pfu (Stratagene), 50 pmol powyższych starterów A6a i końcową objętość doprowadzono do 50 pl z użyciem H2O. Podobną mieszaninę reakcyjną przygotowano dla łańcucha β, stosując plazmid β i parę starterów β. Mieszaniny reakcyjne poddano 35 cyklom denaturacji (95°C, 60 s), hybrydyzacji (50°C, 60 s) i wydłużania (72°C, 8 min) w aparacie do PCR Hybaid PCR express. Produkt trawiono przez 2 godziny w 37°C z użyciem 10 jednostek enzymu restrykcyjnego BspEI, a następnie przez kolejne 2 godziny z użyciem 10 jednostek Sall (New England Biolabs). Te strawione mieszaniny reakcyjne wligowano do pEX172, który strawiono Agel i SalI, wtransformowano do kompetentnych bakterii XL1-Blue i hodowano przez 18 godzin w 37°C. Pojedynczą kolonię pobrano z każdego z preparatów a i β i hodowano przez noc w 5 ml TYP + ampicylina (16 g/l Bacto-Trypton, 16 g/l ekstraktu drożdżowego, 5 g/l NaCl, 2,5 g/l K2HPO4, 100 mg/l Ampicyliny). Plazmidowy DNA oczyszczono w kolumnie QIAgen do oczyszczania na małą skalę zgodnie z instrukcjami producenta i sekwencję potwierdzono przez zautomatyzowane sekwencjonowanie w Genetix. Sekwencje aminokwasowe wstawek BamHI przedstawiono na fig. 114 i 115 odpowiednio dla łańcucha a i β.

Te konstrukty łańcuchów a i β disulfidowego A6 Tax TCR w pEX172 strawiono przez 2 godziny w 37°C enzymem restrykcyjnym BamHI (New England Biolabs). Wstawkę BamHI łańcucha a wligowano do wektora pAcAB3 (Pharmingen-BD Biosciences: 21216P), który strawiono enzymem Bglll. Plazmid ten wtransformowano do kompetentnych bakterii XL1-Blue i hodowano przez 18 godzin w 37°C. Pojedynczą kolonię pobrano z tej płytki i hodowano przez noc w 5 ml TYP + ampicylina i plazmidowy DNA oczyszczono jak wcześniej. Ten plazmid strawiono BamHI i wstawkę BamHI łańcucha β wligowano, transformowano do kompetentnych bakterii XL1-Blue, hodowano przez noc, zebrano do TYP-ampicyliny i hodowano do wykonania preparatów na małą skalę, jak wcześniej w kolumnie QIAgen. Poprawną orientację obydwu łańcuchów a i β potwierdzono przez sekwencjonowanie za pomocą następujących starterów:

pAcAB3 a do przodu: 5'-gaaattatgcatttgaggatg pAcAB3 β do przodu: 5'-attaggcctctagagatccg

Transfekcja, zakażenie, ekspresja i analiza A6 TCR w komórkach owadzich

Plazmid ekspresyjny zawierający łańcuch a i β transfekowano do komórek sf9 (Pharmingen-BD Biosciences: 21300C) hodowanych w pożywce wolnej od surowicy (Pharmingen-BD Biosciences: 551411), stosując zestaw do transfekcji Baculogold (Pharmingen-BD Biosciences: 21100K) według instrukcji producenta. Po 5 dniach w 27°C, 200 pl ośrodka, w którym hodowano te transfekowane komórki, dodano do 100 ml komórek High Five przy 1x10⁶ komórek/ml w pożywce wolnej od surowicy. Po kolejnych 6 dniach w 27°C, 1 ml tej pożywki usunięto i odwirowano przy 13000 obrotów/minutę w mikrowirówce Hereus przez 5 minut aby usunąć resztki komórek.

pl tego supernatantu owadziego połączonego disulfidowo A6 TCR analizowano względem pozytywnych kontroli 5 pg i 10 pg bakteryjnego połączonego disulfidowo A6 TCR na prefabrykowanym żelu 4-20% Tris/glicyna (Invitrogen: EC60252). Zredukowane próbki przygotowano przez dodanie 10 pl redukującego buforu do próbek (950 pl buforu do próbek Laemmli (Bio-Rad: 161-0737) 50 pl 2M DTT) i ogrzewanie w 95°C przez 5 minut, ochłodzenie do temperatury pokojowej na 10 minut, a następnie naniesiono w ilości 20 pl. Nie zredukowane próbki przygotowano przez dodanie 10 pl buforu do próbek Laemmli i naniesienie 20 pl.

Żel rozwijano przy 150 woltach przez 1 godzinę w zbiorniku do żeli Novex - Xcell, po czym żel wybarwiono 50 ml barwnika Coomassie do żeli przez 1 godzinę z delikatnym wytrząsaniem (1,1 g proszku Coomassie w 500 ml metanolu mieszano przez 1 godzinę, dodano 100 ml kwasu octowego i doprowadzono do 1 litra H2O i mieszano przez 1 godzinę, a następnie przesączono przez filtr 0,45 pm).

PL 208 712 B1

Żel odbarwiano trzykrotnie po 30 minut z delikatnym wytrząsaniem w 50 ml odbarwiacza (skład jak barwnika do żeli Coomassie, ale bez proszku Coomassie).

Analizy Western Blots przeprowadzono przez wykonanie SDS-PAGE jak powyżej, ale białka przeniesiono na błony Immuno-Blot PVDF (Bio-Rad: 162-0174), a nie wybarwiano żeli Coomassie. Sześć kawałków bibuły filtracyjnej przycięto do rozmiaru żelu i namoczono w buforze do transferu (2,39 g Glicyny, 5,81 g zasady Tris, 0,77 g DTT rozpuszczono w 500 ml H2O, dodano 200 ml metanolu i doprowadzono do 1000 ml z użyciem H2O). Błonę PVDF przygotowano przez namoczenie w metanolu przez 1 minutę, a następnie w buforze do transferu przez 2 minuty. Trzy bibuły filtracyjne umieszczono na anodowej powierzchni aparatu Immno-blot (Pharmacia - Novablot), po czym błonę umieszczono na powierzchni, położono żel i ostatecznie trzy kolejne bibuły filtracyjne położono po stronie katodowej. Immuno-blot prowadzono przez 1 godzinę przy stałym natężeniu 0,8 mA/cm² powierzchni żelu.

Po transferze błonę zablokowano w 7,5 ml buforu do blokowania (4 tabletki soli buforowanej Tris (Sigma: T5030), 3 g odtłuszczonego mleka w proszku (Sigma: M7409), 30 pl Tween 20 doprowadzono do 30 ml z użyciem H2O) przez 60 min z delikatnym wytrząsaniem. Błonę przemyto trzykrotnie po 5 minut w buforze do płukania TBS (20 tabletek TBS, 150 pl Tween 20 doprowadzone do 300 ml z użyciem H2O). Następnie błonę inkubowano z pierwszorzędowym przeciwciałem w rozcieńczeniu 1:50 przeciw łańcuchowi α TCR klon 3A8 (Serotec: MCA987) lub przeciw łańcuchowi β TCR klon 8A3 (Serotec: MCA988) w 7,5 ml buforu blokującego przez 1 godzinę z delikatnym wytrząsaniem. Błonę przemyto jak wcześniej buforem do płukania TBS. Następnie przeprowadzono inkubację z drugorzędowym przeciwciałem przeciw-mysim znakowanym HRP (Santa Cruz Biotech: Sc-2005) w rozcieńczeniu 1 do 1000 w 7,5 ml buforu blokującego przez 30 minut z delikatnym wytrząsaniem. Błonę przemyto jak wcześniej, a następnie przemyto w 30 ml H2O z 2 tabletkami TBS.

Wiązanie przeciwciał wykrywano przez kolorymetryczną detekcję Opti-4CN (Biorad: 170-8235) (1,4 ml rozcieńczalnika Opt-4CN, 12,6 ml H2O, 0,28 ml substratu Opti-4CN). Błony barwiono przez 30 minut, a następnie przemyto H2O przez 15 minut. Błony wysuszono w temperaturze pokojowej i zeskanowane obrazy dopasowano do obrazu żelu barwionego Coomassie (fig. 116).

Wyniki

Z fig. 116 widać, że tworzone są obydwa disulfidowe TCR w postaci heterodimeru, który jest trwały na żelu SDS. Obydwa one rozpadają się na łańcuchy α i β pod wpływem zredukowania. Owadzi heterodimer disulfidowego TCR miał niewiele wyższą masę cząsteczkową niż w wersji wytwarzanej w bakteriach, prawdopodobnie w wyniku glikozylacji w komórkach owadzich. Można zaobserwować, że w tym przypadku komórki owadzie wytwarzają łańcuch α w nadmiarze oraz wolny łańcuch α może być obserwowany w nie zredukowanej ścieżce analizy przeciw-α western blot.

Dane te wyraźnie pokazują, że bakulowirusowy system ekspresji opisany powyżej dostarcza realną alternatywę dla prokariotycznej ekspresji rozpuszczalnych TCR zawierających nowe wiązania disulfidowe.

PL 208 712 B1

Wykaz sekwencji <110> Avidex Ltd

Jakobsen, Bent Karsten Glick, Meir

<120>	Substancje
<130>	P325660WO/NJL
<140>	PCT/GB02/03986
<141>	2002-08-30
<150>	GB 0121187.9
<151>	2001-08-31
<150>	GB021914S.8
<151>	2002-08-16
<150>	US60/404182
<1S1>	2002-08-16
<160>	183
<170>	Patentln wersja 3.1
<210>	1
<211>	20
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	1
Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp	Lys Thr Val	Leu Asp Met Arg Ser
1	5	10	15
Met Asp Phe Lys

<21C> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Gin Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp 15 10 15

Met Arg Ser Met 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens

PL 208 712 B1

Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His 15 10 15

Thr Gin Lys Ala 20 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Lys Glu 1

Val

His

Ser 5

Gly

Val

Ser Thr Asp Pro Gin 10

Pro

Leu

Lys 15

Glu

Gin Pro

Ala

Leu

20

<210>

9

<211>

20

<212>

PRT

<213>

Homo

sapiens

<400>

9

Val Phe

Pro

Glu

Val

Ala

Val

Phe

Glu

Pro

Ser

Glu

Ala

Glu

Ile

J.

5

IG

15

Ser His

Thr

Gin

20

<210>

10

<211>

91

<212>

PRT

<213>

Mus musculus

<400>

10

Pro Tyr

Ile

Gin

Asn

Pro

Glu

Pro

Ala

Val

Tyr

Gin

Leu

Lys

Asp

Pro

1

5

10

15

Arg Ser

Gin

Asp

Ser

Thr

Leu

Cys

Leu

Phe

Thr

Asp

Phe

Asp

Ser

Gin

20

25

30

Ile Asn Vai

Pro

Lys

Thr

Met

Glu

Ser

Gly

Thr

Phe

Ile

Thr

Asp

Lys

35

40

45

Thr Val

. Leu

Asp

Met

Lys

Ala

Met

Asp

Ser

Lys

Ser

Asn

Gly

Ala

Ile

50

55

60

PL 208 712 B1

Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu 65 70 75 80

Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro 85 90

<210>	11
<211>	126
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	11
Glu Asp Leu Arg Asn

Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 20 25 30

Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 35 40 45

Gly Arg Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys 50 55 60

Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala 55 70 75 80

Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe 85 90 95

His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro 100 105 110

Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp 115 120 125 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12

Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala 15 10 15

Met Asp Ser Lys 20

PL 208 712 B1 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13

Lys Thr	Met Glu Ser	Gly	Thr	Phe	Ile	Thr Asp	Lys	Thr	Val	Leu	Asp
1	5					10				15
Met Lys	Ala Met
	20
<210>	14
<211>	20
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	14
Tyr Ile	! Gin Asn Pro	Glu	Pro	Ala	Val	Tyr Gin	Leu	Lys	Asp	Pro	Arg
1	5					10				15

Ser Gin Asp Ser 20 <210> 15 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15

Ala Val Tyr Gin Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gin Asp Ser Thr Leu Cys 15 10 15

Leu Phe Thr Asp 20 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16

Asn Gly Arg Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gin Ala Tyr ¹ 5 10 15

Lys Glu Ser Asn 20

PL 208 712 B1

<212> <213>	DNA Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Starter
<400>	31

ggagatatac atatgcagga ggtgacacag <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213 > Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter <400> 32 tacacggcag gatccgggtt ctggatatt <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter <400> 33 ggagatatac atatgggtgt cactcagacc <210> 34 <211> 34 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter <400> 34 cccaagctta gtctgctcta ccccaggcct cggc <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter <400> 35 ggagatatac atatgcagga ggtgacacag 30 <210> 36 <211> 37 <212> DNA

PL 208 712 B1

PL 208 712 B1 <220>

<223> Starter <400> 41 ttggaattca catatgggcg tcatgcagaa cccaagacac <210> 42 <211> 34 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter <400> 42 cccaagetta gtctgctcta ccccaggcct cggc 34 <210> 43 <211> 24 <212 > DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter <400> 43 cacagacaaa tgtgtgctag acat <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter <400> 44 atgtctagca cacatttgtc tgtg 24 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter <400> 45 ccctgccgtg tgccagctga gag <210>

<211>

<212>

<213>

DNA

Sekwencja sztuczna

PL 208 712 B1

<210>	51
<211>	27 -
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>

PL 208 712 B1 <223> Starter <400> 51 cagtgacaag tcttgctgcc tattcac <210> 52 <211> 27 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter <400> 52 gtgaataggc agcaagactt gtcactg <210> 53 <211> 28 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter <400> 53 gattctgatg tgtgtatcac agacaaat <210> 54 <211> 28 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter <400> 54 atttgtctgt gatacacaca tcagaatc <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter <400> 55 ctgatgtgta tatctgtgac aaaactgtgc

<210>	56
<211>	30
<212>	DNA -
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Starter

PL 208 712 B1

<210>	61
<211>	25
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Starter

PL 208 712 B1 <400? 61 cttcaagagc aactgtgctg tggcc <210> 62 <211> 25 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Primer <400> 62 ggccacagca cagttgctct tgaag <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Primer <400> 63 cagtggggtc tgcacagacc c <210> 64 <211> 21 <212? DNA <213? Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter <400> 64 gggtctgtgc agaccccact g <210> 65 <211? 27 <212> DNA <213? Sekwencja sztuczna <220?

<223> Starter <400> 65 ccgaggtcgc ttgttttgag ccatcag

<210?	66
<211?	27
<212?	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220> <223?	Starter
<400>	66

PL 208 712 B1

PL 208 712 B1 <213 > Homo sapiens <400> 107

atgcagaagg	aagtggagca	gaactctgga	cccctcagtg	ttccagaggg	agccattgcc	60
tctctcaact	gcacttacag	tgaccgaggt	tcccagtcct	tcttctggta	cagacaatat	120
tctgggaaaa	gccctgagtt	gataatgtcc	atatactcca	atggtgacaa	agaagatgga	ISO
aggtttacag	cacagctcaa	taaagccagc	cagtatgttt	ctctgctcat	cagagactcc	240
cagcccagtg	attcagccac	ctacctctgt	gccgttacaa	ctgacagctg	ggggaaattg	300
cagtttggag	cagggaccca	ggttgtggtc	accccagata	tccagaaccc	tgaccctgcc	360
gtgtaccagc	tgagagactc	taaatccagt	gacaagtctg	tctgcctatt	caccgatttt	420
gattctcaaa	caaatgtgtc	acaaagtaag	gattctgatg	tgtatatcac	agacaaatgt	480
gtgctagaca	tgaggtctat	ggacttcaag	agcaacagtg	ctgtggcctg	gagcaacaaa	540
tctgactttg	catgtgcaaa	cgccttcaac	aacagcatta	ttccagaaga	caccttcttc	600
cccagcccag	aaagttccta	a				621

<210> 108 <211> 741 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 108 atgaacgctg	gtgtcactca	gaccccaaaa	ttccaggtcc	tgaagacagg	acagagcatg	60
acactgcagt	gtgcccagga	tatgaaccat	gaatacatgt	cctggtatcg	acaagaccca	120
ggcatggggc	tgaggctgat	tcattactca	gttggtgctg	gtatcactga	ccaaggagaa	130
gtccccaatg	gctacaatgt	otccagatca	accacagagg	atttcccgct	caggctgctg	240
tcggctgctc	cctcccagac	atctgtgtao	ttctgtgcca	gcaggccggg	actagcggga	300

gggcgaccag agcagtactt cgggccgggc accaggctca cggtcacaga ggacctgaaa 3S0 aacgtgttcc cacccgaggt cgctgtgttt gagccatcag aagcagagat ctcccacacc 420 caaaaggcca cactggtgtg cctggccaca ggcttctacc ccgaccacgt ggagctgagc 480 tggtgggtga atgggaagga ggtgcacagt ggggtctgca cagacccgca gcccctcaag 540 gagcagcccg ccctcaatga ctccagatac gctctgagca gccgcctgag ggtctcggcc 600 accttctggc aggacccccg caaccacttc cgctgtcaag tccagttcta cgggctctcg 660 gagaatgacg agtggaccca ggatagggcc aaacccgtca cccagatcgt cagcgccgag 720 gcctggggta gagcagacta a . 741 <210> 109 <211> 245

PL 208 712 B1 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109

Asn Ala Gly Val Thr Gin Thr Pro Lys Phe Gin Val Leu Lys Thr Gly 15 10 15

Gin Ser Met Thr Leu Gin Cys Ala Gin Asp Met Asn His Glu Tyr Met 20 25 30

Ser Trp Tyr Arg Gin Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr 35 40 45

Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gin Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr 50 55 60

Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu Ser 65 70 75 80

Ala Ala Pro Ser Gin Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Pro Gly 85 90 ⁹⁵

Leu Ala Gly Gly Arg Pro Glu Gin Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu 100 105 HO

Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val 115 120 125

Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gin Lys Ala Thr Leu 130 135 140

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp ₁₄₅ 150 155 160

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gin

165 170 175

Pro Leu Lys Glu Gin Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser 130 185 190

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gin Asp Pro Arg Asn His 195 200 205

Phe Arg Cys Gin Val Gin Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp 210 215 220

PL 208 712 B1

Thr Gin Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gin Ile Val Ser Ala Glu Ala 225 230 235 240

Trp Gly Arg Ala Asp 245 <210> 110 <211> 621 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 110

atgcagaagg	aagtggagca	gaactctgga	cccctcagtg	ttccagaggg	agccattgcc	60
tctctcaact	gcacttacag	tgaccgaggt	tcccagtcct	tcttctggta	cagacaatat	120
tctgggaaaa	gccctgagtt	gataatgtcc	atatactcca	atggtgacaa	agaagatgga	180
aggtttacag	cacagctcaa	taaagccagc	cagtatgttt	ctctgctcat	cagagactcc	240
cagcccagtg	attcagccac	ctacctctgt	gccgttacaa	ctgacagctg	ggggaaattg	300
cagtttggag	cagggaccca	ggttgtggtc	accccagata	tccagaaccc	ggatcctgcc	3S0
gtgtaccagc	tgagagactc	taaatccagt	gacaagtctg	tctgcctatt	caccgatttt	420
gattctcaaa	caaatgtgtc	acaaagtaag	gattctgatg	tgtatatcac	agacaaatgt	480
gtgctagaca	tgaggtctat	ggacttcaag	agcaacagtg	ctgtggcctg	gagcaacaaa	540
tctgactttg	catgtgcaaa	cgccttcaac	aacagcatta	ttccagaaga	caccttcttc	600
cccagcccag	aaagttccta	a				621

<210> 111 <211> 615 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 111

atgcaactac	tagaacaaag	tcctcagttt	ctaagcatcc	aagagggaga	aaatctcact	60
gtgtactgca	actcctcaag	tgttttttcc	agcttacaat	ggtacagaca	ggagcctggg	120
gaaggtcctg	tcctcctggt	gacagtagtt	acgggtggag	aagtgaagaa	gctgaagaga	180
ctaacctttc	agtttggtga	tgcaagaaag	gacagttctc	tccacatcac	tgcggcccag	240
cctggtgata	caggcctcta	cctctgtgca	ggagcgggaa	gccaaggaaa	tctcatcttt	300
ggaaaaggca	ctaaactctc	tgttaaacca	aatatccaaa	acccggatcc	tgccgtgtac	350
cagctgagag	actctaaatc	cagtgacaag	tctgtctgcc	tattcaccga	ttttgattct	420
caaacaaatg	tgtcacaaag	taaggattct	gatgtgtata	tcacagacaa	atgtgtgcta	480
gacatgaggt	ctatggactt	caagagcaac	agtgctgtgg	cctggagcaa	caaatctgac	540

PL 208 712 B1 tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc attattccag aagacacctt cttccccagc 600 ccagaaagtt cctaa 615 <210> 112 <211> 735 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 112

atggtggatg	gtggaatcae	tcagtcccca	aagtacctgt	tcagaaagga	aggacagaat	60
gtgaccctga	gttgtgaaca	gaatttgaac	cacgatgcca	tgtactggta	ccgacaggac	120
ccagggcaag	ggctgagatt	gatctactac	tcacagatag	taaatgactt	tcagaaagga	180
gatatagctg	aagggtacaa	cgtctctcgg	gagaagaagg	aatcctttcc	tctcactgtg	240
acatcggccc	aaaagaaccc	gacagctttc	tatctctgtg	ccagtagttc	gaggagctcc	300
tacgagcagt	acttcgggcc	gggcaccagg	ctcacggtca	cagaggacct	gaaaaacgtg	360
ttcccacccg	aggtcgctgt	gtttgagcca	tcagaagcag	agatctccca	cacccaaaag	420
gccacactgg	tgtgcctggc	cacaggcttc	taccccgacc	acgtggagct	gagctggtgg	480
gtgaatggga	aggaggtgca	cagtggggtc	tgcacagacc	cgcagcccct	caaggagcag	540
cccgccctca	atgactccag	atacagcctg	agcagccgcc	tgagggtctc	ggccaccttc	600
tggcagaacc	cccgcaacca	cttccgctgt	caagtccagt	tctacgggct	ctcggagaat	560
gacgagtgga	cccaggatag	ggccaaacct	gtcacccaga	ttgtcagcgc	cgaggcctgg	720
ggtagagcag	actaa					735

<210> <211> <212> <213>	113 204 PRT Homo	sapiens
<400>	113
Met Gin Leu	Leu Glu Gin Ser Pro Gin Phe Leu Ser Ile Gin Glu Gly

10 15

Glu Asn Leu Thr Val Tyr Cys Asn Ser Ser Ser Val Phe Ser Ser Leu 20 25 30

Gin Trp Tyr Arg Gin Glu Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu Val Thr 35 40 45

Val Val Thr Gly Gly Glu Val Lys Lys Leu Lys Arg Leu Thr Phe Gin 50 55 60

PL 208 712 B1

Phe Gly 65

Asp

Ala

Arg

Lys 70

Asp

Ser

Ser Leu

His 75

Ile

Thr

Ala

Gin 80

Pro

Gly

Asp

Thr

Gly

Leu

Tyr

Leu

Cys

Ala

Gly

Ala

Gly

Ser

Gin

Gly

85

90

95

Asn

Leu

Ile

Phe

Gly

Lys

Gly

Thr

Lys

Leu

Ser

Val

Lys

Pro

Asn

Ile

100

105

110

Gin

Asn

Pro

Asp

Pro

Ala

Val

Tyr

Gin

Leu

Arg

Asp

Ser

Lys

Ser

115

120

125

Asp

Lys

Ser

Val

Cys

Leu

Phe

Thr

Asp

Phe

Asp

Ser

Gin

Thr

Asn

Val

130

135

140

Ser

Gin

Ser

Lys

Asp

Ser

Asp

Val

Tyr

Ile

Thr

Asp

Lys

Cys

Val

Leu

145

150

155

160

Asp

Met

Arg

Ser

Met

Asp

Phe

Lys

Ser

Asn

Ser

Ala

Val

Ala

Trp

Ser

165

170

175

Asn

Lys

Ser

Asp

Phe

Ala

Cys

Ala

Asn

Ala

Phe

Asn

Ser

Ile

180

185

190

Pro

Glu

Asp

Thr

Phe

Pro

Ser

Pro

Glu

Ser

195 200

<210>	114
<211>	244
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	114
Met val Asp	Gly Gly Ile Thr Gin Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys

10 15

Glu. Gly Gin Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gin Asn Leu Asn His Asp 20 25 30

Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gin Asp Pro Gly Gin Gly Leu Arg Leu Ile 35 40 45

Tyr Tyr

Ser Gin

Ile Val Asn Asp Phe Gin Lys Gly Asp

Ile Ala Glu

50

55

60

Gly

Tyr

Ser

Val

Ser

Arg

Glu

Lys

Glu

Ser

Phe

Pro

Leu

Thr

Val

65

70

75

80

PL 208 712 B1

Thr Ser Ala Gin Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser 85 90 95

Ser Arg Ser Ser Tyr Glu Gin Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr 100 105 HO

Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe 115 120 125

Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gin Lys Ala Thr Leu Val 130 135 140

Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp 145 150 155 160

Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gin Pro 165 170 175

Leu Lys Glu Gin Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190

Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gin Asn Pro Arg Asn His Phe 195 200 205

Arg Cys Gin Val Gin Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr 210 215 220

Gin Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gin Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp 225 230 235 240

Gly Arg Ala Asp

<210>	115	sapiens
<211>	627
<212>	DNA
<213>	Homo
<400> 115 atgcaggagg	ygacacagat	tcctgcagct	ctgagtgtcc	cagaaggaga	aaacttggtt	60
ctcaactgca	gtttcactga	tagcgctatt	tacaacctcc	agtggtttag	gcaggaccct	120
gggaaaggtc	tcacatctct	gttgcttatt	cagtcaagtc	agagagagca	aacaagtgga	180
agacttaatg	cctcgctgga	taaatcatca	ggacgtagta	ctttatacat	tgcagcttct	240
cagcctggtg	actcagccac	ctacctctgt	gctgtgaggc	ccacatcagg	aggaagctac	300

PL 208 712 B1

atacctacat	ttggaagagg	aaccagcctt	attgttcatc	cgtatatcca	gaaccctgac	360
cctgccgtgt	accagctgag	agactctaaa	tccagtgaca	agtctgtctg	cctattcacc	420
gattttgatt	ctcaaacaaa	tgtgtcacaa	agtaaggatt	ctgatgtgta	tatcacagac	480
aaatgtgtgc	tagacatgag	gtctatggac	ttcaagagca	acagtgctgt	ggcctgaagc	540
aacaaatctg	actttgcatg	tgcaaacgcc	ttcaacaaca	gcattattcc	agaagacacc	600
ttcttcccca	gcccagaaag	ttcctaa				627

<210> 11S <211> 729 <212> DNA <213> Homo sapiens <400? 11S

atgggtgtca	ctcagacccc	aaaattccag	gtcctgaaga	caggacagag	catgacactg	60
cagtgtgccc	aggatatgaa	ccatgaatac	atgtcctggt	atcgacaaga	cccaggcatg	120
gggctgaggc	tgattcatta	ctcagttggt	gctggtatca	ctgaccaagg	agaagtcccc	18C
aatggctaca	atgtctccag	atcaaccaca	gaggatttcc	cgctcaggct	gctgtcggct	240
gctccctccc	agacatctat	gtacttctgt	gccagcagtt	acgtcgggaa	caccggggag	300
ctgttttttg	gagaaggctc	taggctgacc	gtactggagg	acctgaaaaa	cgtgttccca	360
cccgaggtcg	ctgtgtttga	gccatcagaa	gcagagatct	cccacaccca	aaaggccaca	420
ctggtgtgcc	tggccacagg	cttctacccc	gaccacgtgg	agctgagctg	gtgggtgaat	480
gggaaggagg	tgcacagtgg	ggtctgcaca	gacccgcagc	ccctcaagga	gcagcccgcc	540
ctcaatgact	ccagatacgc	tctgagcagc	cgcctgaggg	tctcggccac	cttctggcag	600
gacccccgca	accacttccg	ctgtcaagtc	cagttctacg	ggctctcgga	gaatgacgag	660
tggacccagg	atagggccaa	acccgtcacc	cagatcgtca	gcgccgaggc	ctggggtaga	720

gcagactaa <210> 117 <211> 208 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> miac_feature różne cechy <222? ¢4)..(4) <223> X oznacza jakikolwiek aminokwas <400> 117

Met Gln Glu Xaa Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu Gly

PL 208 712 B1

Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr Asn 20 25 30

Leu Gin Trp Phe Arg Gin Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu 35 40 45

Leu Ile Gin Ser Ser Gin Arg Glu Gin Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala 50 55 50

Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ser ₆₅ 70 75 80

Gin Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg Pro Thr Ser 85 90 95

Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val 100 105 HO

His Pro Tyr Ile Gin Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gin Leu Arg Asp 115 120 125

Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser 130 135 140

Gin Thr Asn Val Ser Gin Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp 145 150 155 150

Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala 165 170 175

Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn 180 185 190

Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 118 <211> 244 <212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 118

Met Gly Val Thr Gin Thr Pro Lys Phe Gin Val Leu Lys Thr Gly Gin 15 10 15

PL 208 712 B1

Ser Met Thr Leu Gin Cys Ala Gin Asp Met Asn His Glu Tyr Met Ser 20 25 30

Trp Tyr Arg Gin Asp Pro Gly Met Glu Thr Gly Leu Arg Leu Ile His 35 40 45

Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gin Gly Glu Val Pro Asn Gly 50 55 60

Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu 65 70 75 80

Ser Ala Ala Pro Ser Gin Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr 85 90 95

Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu Thr 100 105 110

Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe 115 120 125

Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gin Lys Ala Thr Leu Val 130 135 140

Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp 145 150 155 160

Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gin Pro 165 170 175

Leu Lys Glu Gin Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser 180 185 190

Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gin Asp Pro Arg Asn His Phe 195 200 205

Arg Cys Gin Val Gin Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr 210 215 220

Gin Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gin Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp 225 230 235 240

Gly Arg Ala Asp

PL 208 712 B1 <210> 119 <211> 630 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 119 atgcaggagg	ygacacagat	tcctgcagct	ctgagtgtcc	cagaaggaga	aaacttggtt	60
ctcaactgca	gtttcactga	tagcgctatt	tacaacctcc	agtggtttag	gcaggaccct	120
gggaaaggtc	tcacatctct	gttgcttatt	cagtcaagtc	agagagagca	aacaagtgga	180
agacttaatg	cctcgctgga	taaatcatca	ggacgtagta	ctttatacat	tgcagcttct	240
cagcctggtg	actcagccac	ctacctctgt	gctgtgaggc	ccacatcagg	aggaagctac	300
atacctacat	ttggaagagg	aaccagcctt	attgttcatc	cgtatatcca	gaaccctgac	360
cctgccgtgt	accagctgag	agactctaaa	tccagtgaca	agtctgtctg	cctattcacc	420
gattttgatt	ctcaaacaaa	tgtgtcacaa	agtaaggatt	ctgatgtgta	tatcacagac	480
aaatgtgtgc	tagacatgag	gtctatggac	ttcaagagca	acagtgctgt	ggcctggagc	540
aacaaatctg	actttgcatg	tgcaaacgcc	ttcaacaaca	gcattattcc	agaagacacc	600
ttcttcccca	gcccagaaag	ttcctgttaa				630

<210> 120 <211> 732 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 120

atgggtgtca	ctcagacccc	aaaattccag	gtcctgaaga	caggacagag	catgacactg	60
cagtgtgccc	aggatatgaa	ccatgaatac	atgtcctggt	atcgacaaga	cccaggcatg	120
gggctgaggc	tgattcatta	ctcagttggt	gctggtatca	ctgaccaagg	agaagtcccc	180
aatggctaca	atgtctccag	atcaaccaca	gaggatttcc	cgctcaggct	gctgtcggct	240
gctccctccc	agacatctgt	gtacttctgt	gccagcagtt	acgtcgggaa	caccggggag	300
ctgttttttg	gagaaggctc	taggctgacc	gtactggagg	acctgaaaaa	cgtgttccca	360
cccgaggtcg	ctgtgtttga	gccatcagaa	gcagagatct	cccacaccca	aaaggccaca	420
ctggtgtgcc	tggccacagg	cttctacccc	gaccacgtgg	agctgagctg	gtgggtgaat	480
gggaaggagg	tgcacagtgg	ggtctgcaca	gacccgcagc	ccctcaagga	gcagcccgcc	540
ctcaatgact	ccagatacgc	tctgagcagc	cgcctgaggg	tctcggccac	cttctggcag	600
gacccccgca	accacttccg	ctgtcaagtc	cagttctacg	ggctctcgga	gaatgacgag	660
tggacccagg	atagggccaa	acccgtcacc	cagatcatca	gcgccgaggc	ctggggtaga	720
gcagactgtt	aa					732

PL 208 712 B1 <210> 121 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> misc_feature różne cechy <222> (4) . . (4) <223> X oznacza jakikolwiek aminokwas <400> 121

Met Gin Glu Xaa Thr Gin Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu Gly 15 10 15

Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr Asn 20 25 30

Leu Gin Trp Phe Arg Gin Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu 35 40 45

Leu Ile Gin Ser Ser Gin Arg Glu Gin Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala 50 55 60

Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ser 65 70 75 80

Gin Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg Pro Thr Ser 85 90 95

Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val 100 105 110

His Pro Tyr Ile Gin Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gin Leu Arg Asp 115 120 125

Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser 130 135 140

Gin Thr Asn Val Ser Gin Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp 145 150 155 160

Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala 165 170 175

Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn

180 185 190

PL 208 712 B1

Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205

Cys <210> 122 <211> 243 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122

Met Gly Val Thr Gin Thr Pro Lys Phe Gin Val Leu Lys Thr Gly Gin 1 5 10 15

Ser Met Thr Leu Gin Cys Ala Gin Asp Met Asn His Glu Tyr Met Ser 20 25 30

Trp Tyr Arg Gin Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr Ser 35 40 45

Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gin Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr Asn 50 55 50

Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu Ser Ala ₆₅ 70 75 80

Ala Pro Ser Gin Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr Val Gly 85 90 95

Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu Thr Val Leu 100 105 110

Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro 115 120 125

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gin Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 130 135 140

Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 145 150 155 160

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gin Pro Leu Lys 165 170 175

Glu Gin Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu

PL 208 712 B1

180

190

185

Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gin Asp Pro Arg Asn His Phe Arg Cys 195 200 205

Gin Val Gin Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gin Asp 210 215 220

Arg Ala Lys Pro Val Thr Gin Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg 225 230 235 240

Ala Asp Cys <210> 123 <211> 624 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 123

atgaaggagg	tggagcagaa	ttctggaccc	ctcagtgttc	cagagggagc	cattgcctct	60
ctcaactgca	cttacagtga	ccgaggttcc	cagtccttct	tctggtacag	acaatattct	120
gggaaaagcc	ctgagttgat	aatgttcata	tactccaatg	gtgacaaaga	agatggaagg	180
tttacagcac	agctcaataa	agccagccag	tatgtttctc	tgctcatcag	agactcccag	240
cccagtgatt	cagccaccta	cctctgtgcc	gtgaaggggg	ggtctggggg	ttaccagaaa	300
gttacctttg	gaactggaac	aaagctccaa	gtcatcccaa	atatccagaa	cccggatcct	360
gccgtgtacc	agctgagaga	ctctaaatcc	agtgacaagt	ctgtctgcct	attcaccgat	420
tttgattctc	aaacaaatgt	gtcacaaagt	aaggattctg	atgtgtatat	cacagacaaa	480
tgtgtgctag	acatgaggtc	tatggacttc	aagagcaaca	gtgctgtggc	ctggagcaac	540
aaatctgact	ttgcatgtac	aaacgccttc	aacaacagca	ttattccaga	agacacottc	600
ttccccagcc	cagaaagttc	ctaa				624

<210> 124 <211> 735 <212> DNA.

<213> Homo sapiens <400> 124

atgggcgtca	tgcagaaccc	aagacacctg	gtcaggagga	ggggacagga	ggcaagactg	60
agatgcagoc	caatgaaagg	acacagtcat	gtttactggt	atcggcagct	cccagaggaa	120
ggtctgaaat	tcatggttta	tctccagaaa	gaaaatatca	tagatgagtc	aggaatgcca	180
aaggaacgat	tttctgctga	atttcccaaa	gagggcccca	gcatcctgag	gatccagcag	240

PL 208 712 B1

gtagtgcgag	gagattcggc	agcttatttc	tgtgccagct	caccacagac	agggggcaca	300
gatacgcagt	attttggccc	aggcacccgg	ctgacagtgc	tcgaggacct	gaaaaacgtg	360
ttcccacccg	aggtcgctgt	gtttgagcca	tcagaagcag	agatctccca	cacccaaaag	420
gccacactgg	tgtgcctggc	cacaggcttc	taccccgacc	acgtggagct	gagctggtgg	480
gtgaatggga	aggaggtgca	cagtggggtc	tgcacagacc	ogcagcccct	caaggagcag	540
cccgccctca	atgactccag	atacgctctg	agcagccgcc	tgagggtctc	ggccaccttc	SCO
tggcaggacc	cccgcaacca	cttccgctgt	caagtccagt	tctacgggct	ctcggagaat	660
gacgagtgga	cccaggatag	ggccaaaccc	gtcacccaga	tcgtcagcgc	cgaggcctgg	720
ggtagagcag	actaa					735

<210>	125
<211>	207
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	125
Met Lys Glu	Val Glu Gin Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly

10 15

Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg, Gly Ser Gin Ser 20 25 30

Phe Phe Trp Tyr Arg Gin Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met 35 40 45

Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gin 50 55 60

Leu Asn Lys Ala Ser Gin Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gin 65 70 75 80

Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Lys Gly Gly Ser Gly 85 90 95

Gly Tyr Gin Lys Val Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Gin Val Ile 100 105 110

Pro Asn Ile Gin Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gin Leu Arg Asp Ser 115 120 125

Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gin 130 135 140

PL 208 712 B1

Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 145 150 155 160

Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 165 170 175

Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 180 185 190

Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205

<210>	126
<211>	244
<212>	PRT
<213>	Homo

<400> 126

Met Gly Val Met Gln Asn Pro Arg His Leu Val Arg Arg Arg Gly Gln 15 10 15

Glu Ala Arg Leu Arg Cys Ser Pro Met Lys Gly His Ser His Val Tyr 20 25 30

Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Glu Glu Gly Leu Lys Phe Met Val Tyr Leu 35 40 45

Gln Lys Glu Asn Ile Ile Asp Glu Ser Gly Met Pro Lys Glu Arg Phe 50 55 60

Ser Ala Glu Phe Pro Lys Glu Gly Pro Ser Ile Leu Arg Ile Gln Gln 65 70 75 80

Val Val Arg Gly Asp Ser Ala Ala Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Pro Gln 85 90 95

Thr Gly Gly Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr 100 105 110

Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe 115 120 125

Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val

130 135 140

PL 208 712 B1

Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp 145 150 155 160

Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gin Pro 165 170 ¹⁷⁵

Leu Lys Glu Gin Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser 180 185 190

Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gin Asp Pro Arg Asn His Phe 195 200 205

Arg Cys Gin Val Gin Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr 210 215 220

Gin Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gin Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp 225 230 235 240

Gly Arg Ala Asp <210> 127 <211> 621 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 127

atgcagaagg	aagtggagca	gaactctgga	cccctcagtg	ttccagaggg	agccattgcc	60
tctctcaact	gcacttacag	tgaccgaggt	tcccagtcct	tcttctggta	cagacaatat	120
tctgggaaaa	gccctgagtt	gataatgtcc	atatactcca	atggtgacaa	agaagatgga	180
aggtttacag	cacagctcaa	taaagccagc	cagtatgttt	ctctgctcat	cagagactcc	240
cagcccagtg	attcagccac	ctacctctgt	gccgttacaa	ctgacagctg	ggggaaattg	300
cagtttggag	cagggaccca	ggttgtggtc	accccagata	tccagaaccc	tgaccctgcc	360
gtgtaccagc	tgagagactc	taaatccagt	gacaagtctg	tctgcctatt	caccgatttt	420
gattctcaaa	caaatgtgtc	acaaagtaag	gattctgatg	tgtatatcac	agacaaatgt	480
gtgctagaca	tgaggtctat	ggacttcaag	agcaacagtg	ctgtggcctg	gagcaacaaa	540
tctgactttg	catgtgcaaa	cgccttcaac	aacagcatta	ttccagaaga	caccttcttc	600
cccagcccag	aaagttccta	a				621

<210> 128 <211> 206 <212> PRT <213> Homo sapiens

PL 208 712 B1 <400> 128

Met Gin Lys Glu Val Glu Gin Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu 15 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gin 20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gin Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile 35 40 45

Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala 50 55 60

Gin Leu Asn Lys Ala Ser Gin Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser 65 70 75 80

Gin Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Thr Asp Ser 85 90 95

Trp Gly Lys Leu Gin Phe Gly Ala Gly Thr Gin Val Val Val Thr Pro 100 105 110

Asp Ile Gin Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gin Leu Arg Asp Ser Lys 115 120 125

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gin Thr 130 135 140

Asn Val Ser Gin Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys 145 150 155 160

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala 165 170 175

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser 180 185 190

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205

<210>	129
<211>	621
<212>	DNA
<213>	Homo
<400>	129

sapiens

PL 208 712 B1

atgcagaagg	aagtggagca	gaactctgga	cccctcagtg	ttccagaggg	agccattgcc	60
tctctcaact	gcacttacag	tgaccgaggt	tcccagtcct	tcttctggta	cagacaatat	120
tctgggaaaa	gccctgagtt	gataatgtcc	atatactcca	atggtgacaa	agaagatgga	180
aggtttacag	cacagctcaa	taaagccagc	cagtatgttt	ctctgctcat	cagagactcc	240
cagcccagtg	attcagccac	ctaoctctgt	gccgttacaa	ctgacagctg	ggggaaattg	300
cagtttggag	cagggaccca	ggttgtggtc	accccagata	tccagaaccc	tgaccctgcc	360
gtgtaccagc	tgagagactc	taaatccagt	gacaagtctg	tctgcctatt	caccgatttt	420
gattctcaaa	caaatgtgtc	acaaagtaag	gattctgatg	tgtatatctg	tgacaaaact	480
gtgctagaca	tgaggtctat	ggacttcaag	agcaacagtg	ctgtggcctg	gagcaacaaa	540
tctgactttg	catgtgcaaa	cgccttcaac	aacagcatta	ttccagaaga	caccttcttc	600
cccagcccag	aaagttccta	a				621

<210>	130
<211>	206
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	130
Met Gin Lys	Glu Val Glu Gin Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu

10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gin 20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gin Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile 35 40 45

Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala 50 55 60

Gin Leu Asn Lys Ala Ser Gin Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser 65 70 75 80

Gin Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Thr Asp Ser 85 90 95

Trp Gly Lys Leu Gin Phe Gly Ala Gly Thr Gin Val Val Val Thr Pro 100 105 110

Asp Ile Gin Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gin Leu Arg Asp Ser Lys 115 120 125

PL 208 712 B1

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gin Thr 130 135 140

Asn Val Ser Gin Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Cys Asp Lys Thr 145 150 155 160

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala 165 170 175

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser 180 185 190

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205

<210>	131
<211>	621
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<400>	131

atgcagaagg aagtggagca gaactctgga cccctcagtg ttccagaggg agccattgcc 60 tctctcaact gcacttacag tgaccgaggt tcccagtcct tcttctggta cagacaatat 120 tctgggaaaa gccctgagtt gataatgtcc atatactcca atggtgacaa agaagatgga 180 aggtttacag cacagctcaa taaagccagc cagtatgttt ctctgctcat cagagactcc 240 cagcccagtg attcagccac ctacctctgt gccgttacaa ctgacagctg ggggaaattg 300 cagtttggag cagggaccca ggttgtggtc accccagata tccagaaccc tgaccctgcc 360 gtgtaccago tgagagactc taaatccagt gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt 420 gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag gattctgatg tgtatatcac agacaaaact 480 gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag agcaactgtg ctgtggcctg gagcaacaaa 540 tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc 600 cccagcccag aaagttccta a 521

<210>	132
<211>	206
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	132
Met Gin Lys	Glu Val Glu Gin Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu

10 15

PL 208 712 B1

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gin 20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gin Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile 35 40 45

Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala 50 55 S0

Gin Leu Asn Lys Ala Ser Gin Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser 65 70 75 80

Gin Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Thr Asp Ser 85 90 95

Trp Gly Lys Leu Gin Phe Gly Ala Gly Thr Gin Val Val Val Thr Pro 100 105 110

Asp Ile Gin Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gin Leu Arg Asp Ser Lys 115 120 125

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gin Thr 130 135 140

Asn Val Ser Gin Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr 145 150 155 160

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Cys Ala Val Ala 165 170 175

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser 180 185 190

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 133 <211> 621 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 133

atgcagaagg	aagtggagca	gaactctgga	cccctcagtg	ttccagaggg	agccattgcc	60
tctctcaact	gcacttacag	tgaccgaggt	tcccagtcct	tcttctggta	cagacaatat	120
tctgggaaaa	gccctgagtt	gataatgtcc	atatactcca	atggtgacaa	agaagatgga	180
aggtttacag	cacagctcaa	taaagccagc	cagtatgttt	ctctgctcat	cagagactcc	240

PL 208 712 B1

cagcccagtg	attcagccac	ctacctctgt	gccgttacaa	ctgacagctg	ggggaaattg	300
cagtttggag	cagggaccca	ggttgtggtc	accccagata	tccagaaccc	tgaccctgcc	360
gtgtaccagc	tgagagactc	taaatccagt	gacaagtctg	tctgcctatt	caccgatttt	420
gattctcaaa	caaatgtgtc	acaaagtaag	gattctgatg	tgtatatcac	agacaaaact	480
gtgtgtgaca	tgaggtctat	ggacttcaag	agcaacagtg	ctgtggcctg	gagcaacaaa	540
tctgactttg	catgtgcaaa	cgccttcaac	aacagcatta	ttccagaaga	caccttcttc	600
cccagcccag	aaagttccta	a				621

<210>	134
<211?	206
<212?	PRT
<213?	Homo	sapiens
<400>	134
Met Gln Lys	Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu

5 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln 20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile 35 40 45

Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala 50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser 65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Thr Asp Ser 85 90 95

Trp Gly Lys Leu Gln Phe Gly Ala Gly Thr Gln Val Val Val Thr Pro 100 105 110

Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys 115 120 125

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr 130 135 140

Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr

145 150 155 160

PL 208 712 B1

Val Cys Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala 165 170 175

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser 180 185 190

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 135 <211> 621 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 135 atgcagaagg	aagtggagca	gaactctgga	cccctcagtg	ttccagaggg	agccattgcc	60
tctctcaact	gcacttacag	tgaccgaggt	tcccagtcct	tcttctggta	cagacaatat	120
tctgggaaaa	gccctgagtt	gataatgtcc	atatactcca	atggtgacaa	agaagatgga	180
aggtttacag	cacagctcaa	taaagccagc	cagtatgttt	ctctgctcat	cagagactcc	240
cagcccagtg	attcagccac	ctacctctgt	gccgttacaa	ctgacagctg	ggggaaattg	300
cagtttggag	cagggaccca	ggttgtggtc	accccagata	tccagaaccc	tgaccctgcc	360
gtgtgccagc	tgagagactc	taaatccagt	gacaagtctg	tctgcctatt	caccgatttt	420
gattctcaaa	caaatgtgtc	acaaagtaag	gattctgatg	tgtatatcac	agacaaaact	480
gtgctagaca	tgaggtctat	ggacttcaag	agcaacagtg	ctgtggcctg	gagcaacaaa	540
tctgactttg	catgtgcaaa	cgccttcaac	aacagcatta	ttccagaaga	caccttcttc	600
cccagcccag	aaagttccta	a				621

<210> 136 <211> 206 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136

Met Gin Lys Glu Val Glu Gin Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu 15 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gin 20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gin Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile 35 40 45

PL 208 712 B1

Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala 50 55 60

Gin Leu Asn Lys Ala Ser Gin Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser 65 70 75 80

Gin Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Thr Asp Ser 85 90 95

Trp Gly Lys Leu Gin Phe Gly Ala Gly Thr Gin Val Val Val Thr Pro 100 105 110

Asp Ile Gin Asn Pro Asp Pro Ala Val Cys Gin Leu Arg Asp Ser Lys 115 120 125

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gin Thr 130 135 140

Asn Val Ser Gin Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr 145 150 155 160

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala 165 170 175

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser 180 185 190

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 137 <211> 621 <212> DNA <213 > Homo sapiens

<400> 137 atgcagaagg	aagtggagca	gaactctgga	cccctcagtg	ttccagaggg	agccattgcc	60
tctctcaact	gcacttacag	tgaccgaggt	tcccagtcct	tcttctggta	cagacaatat	120
tctgggaaaa	gccctgagtt	gataatgtcc	atatactcca	atggtgacaa	agaagatgga	180
aggtttacag	cacagctcaa	taaagccagc	cagtatgttt	ctctgctcat	cagagactcc	240
cagcccagtg	attcagccac	ctacctctgt	gccgttacaa	ctgacagctg	ggggaaattg	300
cagtttggag	cagggaccca	ggttgtggtc	accccagata	tccagaaccc	tgaccctgcc	360
gtgtaccagc	tgagagactg	taaatccagt	gacaagtctg	tctgcctatt	caccgatttt	420

PL 208 712 B1 gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag gattctgatg tgtatatcac agacaaaact 480 gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaaa 540 tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc 600 cccagcccag aaagttccta a 621

<210>	138
<211>	206
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	138
Met Gin Lys	Glu Val Glu Gin Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu

10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gin 20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gin Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile 35 40 45

Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala 50 55 60

Gin Leu Asn Lys Ala Ser Gin Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser 65 70 75 80

Gin Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Thr Asp Ser 85 90 95

Trp Gly Lys Leu Gin Phe Gly Ala Gly Thr Gin Val Val Val Thr Pro 100 105 110

Asp Ile Gin Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gin Leu Arg Asp Cys Lys 115 120 125

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gin Thr 130 135 140

Asn Val Ser Gin Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr 145 150 155 160

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala 165 170 175

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser

PL 208 712 B1

190

180

185

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 139 <211> 621 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 139 atgcagaagg	aagtggagca	gaactctgga	cccctcagtg	ttccagaggg	agccattgcc	60
tctctcaact	gcacttacag	tgaccgaggt	tcccagtcct	tcttctggta	cagacaatat	120
tctgggaaaa	gccctgagtt	gataatgtcc	atatactcca	atggtgacaa	agaagatgga	180
aggtttacag	cacagctcaa	taaagccagc	cagtatgttt	ctctgctcat	cagagactcc	240
cagcccagtg	attcagccac	ctacctctgt	gccgttacaa	ctgacagctg	ggggaaattg	300
cagtttggag	cagggaccca	ggttgtggtc	accccagata	tccagaaccc	tgaccctgcc	360
gtgtaccagt	gcagagactc	taaatccagt	gacaagtctg	tctgcctatt	caccgatttt	420
gattctcaaa	caaatgtgtc	acaaagtaag	gattctgatg	tgtatatcac	agacaaaact	480
gtgctagaca	tgaggtctat	ggacttcaag	agcaacagtg	ctgtggcctg	gagcaacaaa	540
tctgactttg	catgtgcaaa	cgccttcaac	aacagcatta	ttccagaaga	caccttcttc	600
cccagcccag	aaagttccta	a				621

<210>	140
<211>	206
<212>	PRT
<213>	Homo
<400>	140
Met Gin Lys

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gin 20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gin Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile 35 40 45

Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala 50 55 60

Gin Leu Asn Lys Ala Ser Gin Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser

70 75 80

PL 208 712 B1

Gin Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Thr Asp Ser 85 90 95

Trp Gly Lys Leu Gin Phe Gly Ala Gly Thr Gin Val Val Val Thr Pro 100 105 110

Asp Ile Gin Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gin Cys Arg Asp Ser Lys 115 120 125

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gin Thr 130 135 140

Asn Val Ser Gin Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr 145 150 155 ISO

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala 165 170 175

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser 180 185 190

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 141 <211> 621 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 141

atgcagaagg	aagtggagca	gaactctgga	cccctcagtg	ttccagaggg	agccattgcc	60
tctctcaact	gcacttacag	tgaccgaggt	tcccagtcct	tcttctggta	cagacaatat	120
tctgggaaaa	gccctgagtt	gataatgtcc	atatactcca	atggtgacaa	agaagatgga	180
aggtttacag	cacagctcaa	taaagccagc	cagtatgttt	ctctgctcat	cagagactcc	240
cagcccagtg	attcagccac	ctacctctgt	gccgttacaa	ctgacagctg	ggggaaattg	300
cagtttggag	cagggaccca	ggttgtggtc	accccagata	tccagaaccc	tgaccctgcc	360
gtgtaccagc	tgagagactc	taaatccagt	gacaagtctt	gctgcctatt	caccgatttt	420
gattctcaaa	caaatgtgtc	acaaagtaag	gattctgatg	tgtatatcac	agacaaaact	480
gtgctagaca	tgaggtctat	ggacttcaag	agcaacagtg	ctgtggcctg	gagcaacaaa	540
tctgactttg	catgtgcaaa	cgccttcaac	aacagcatta	ttccagaaga	caccttcttc	600
cccagcccag	aaagttccta	a				621

PL 208 712 B1 <210> 142 <211> 206 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142

Met .Gin Lys Glu Val Glu Gin Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu 15 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gin 20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gin Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile 35 40 45

Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala 50 55 60

Gin Leu Asn Lys Ala Ser Gin Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser 65 70 75 80

Gin Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Thr Asp Ser 85 90 95

Trp Gly Lys Leu Gin Phe Gly Ala Gly Thr Gin Val Val Val Thr Pro 100 105 110

Asp Ile Gin Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gin Leu Arg Asp Ser Lys 115 120 125

Ser Ser Asp Lys Ser Cys Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gin Thr 130 135 140

Asn Val Ser Gin Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr 145 150 155 160

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala 165 170 175

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser 180 185 190

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205

PL 208 712 B1 <210> 143 <211> 621 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 143

atgcagaagg	aagtggagca	gaactctgga	cccctcagtg	ttccagaggg	agccattgcc	60
tctctcaact	gcacttacag	tgaccgaggt	tcccagtcct	tcttctggta	cagacaatat	120
tctgggaaaa	gccctgagtt	gataatgtcc	atatactcca	atggtgacaa	agaagatgga	180
aggtttacag	cacagctcaa	taaagccagc	cagtatgttt	ctctgctcat	cagagactcc	240
cagcccagtg	attcagccac	ctacctctgt	gccgttacaa	ctgacagctg	ggggaaattg	300
cagtttggag	cagggaccca	ggttgtggtc	accccagata	tccagaaccc	tgaccctgcc	360
gtgtaccagc	tgagagactc	taaatccagt	gacaagtctg	tctgcctatt	caccgatttt	420
gattctcaaa	caaatgtgtc	acaaagtaag	gattctgatg	tgtatatcac	agacaaaact	480
gtgctagact	gtaggtctat	ggacttcaag	agcaacagtg	ctgtggcctg	gagcaacaaa	540
tctgactttg	catgtgcaaa	cgccttcaac	aacagcatta	ttccagaaga	caccttcttc	600
cccagcccag	aaagttccta	a				621

<210>	144
<211>	206
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	144
Met Gin Lys	Glu Val Glu Gin Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu

10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gin 20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gin Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile 35 40 45

Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala 50 55 60

Gin Leu Asn Lys Ala Ser Gin Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser 65 70 75 80

Gin Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Thr Asp Ser 85 90 95

Trp Gly Lys Leu Gin Phe Gly Ala Gly Thr Gin Val Val Val Thr Pro

PL 208 712 B1

110

100

105

Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys 115 120 125

Ser Ser Asp Lyś Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr .130 135 140

Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr 145 150 155 160

Val Leu Asp Cys Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala 165 170 175

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser 180 185 190

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210? 145 <211? 621 <212? DNA <213? Homo sapiens

<400? 145 atgcagaagg	aagtggagca	gaactctgga	cccctcagtg	ttccagaggg	agccattgcc	60
tctctcaact	gcacttacag	tgaccgaggt	tcccagtcct	tcttctggta	cagacaatat	120
tctgggaaaa	gccctgagtt	gataatgtcc	atatactcca	atggtgacaa	agaagatgga	180
aggtttacag	cacagctcaa	taaagccagc	cagtatgttt	ctctgctcat	cagagactcc	240
cagcccagtg	attcagccac	ctacctctgt	gccgttacaa	ctgacagctg	ggggaaattg	300
cagtttggag	cagggaccca	ggttgtggtc	accccagata	tccagaaccc	tgaccctgcc	360
gtgtaccagc	tgagagactc	taaatccagt	gacaagtctg	tctgcctatt	caccgatttt	420
gattctcaaa	caaatgtgtc	acaaagtaag	gattctgatg	tgtgtatcac	agacaaaact	480
gtgctagaca	tgaggtctat	ggacttcaag	agcaacagtg	ctgtggcctg	gagcaacaaa	540
tctgactttg	catgtgcaaa	cgccttcaac	aacagcatta	ttccagaaga	caccttcttc	600
cccagcccag	aaagttccta	a				621
<210? 146
<211? 206
<212? PRT
<213? Homo sapiens

PL 208 712 B1 <400> 146

Met Gin Lys Glu Val Glu Gin Asri Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu 15 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gin 20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gin Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile 35 40 45

Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala 50 55 60

Gin Leu Asn Lys Ala Ser Gin Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser 65 70 75 80

Gin Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Thr Asp Ser 85 90 95

Trp Gly Lys Leu Gin Phe Gly Ala Gly Thr Gin Val Val Val Thr Pro 100 105 110

Asp Ile Gin Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gin Leu Arg Asp Ser Lys 115 120 125

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gin Thr 130 135 140

Asn Val Ser Gin Ser Lys Asp Ser Asp Val Cys Ile Thr Asp Lys Thr 145 150 155 160

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala 165 170 175

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser 180 185 190

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 e210> 147 <211> 741 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 147 atgaacgctg gtgtcactca gaccccaaaa ttccaggtcc tgaagacagg acagagcatg

PL 208 712 B1

acactgcagt	gtgcccagga	tatgaaccat	gaatacatgt	cctggtatcg	acaagaccca	120
ggcatggggc	tgaggctgat	tcattactca	gttggtgctg	gtatcactga	ccaaggagaa	180
gtccccaatg	gctacaatgt	ctccagatca	accacagagg	atttcccgct	caggctgctg	240
tcggctgctc	cctcccagac	atctgtgtac	ttctgtgcca	gcaggccggg	actagcggga	300
gggcgaccag	agcagtactt	cgggccgggc	accaggctca	cggtcacaga	ggacctgaaa	360
aacgtgttcc	cacccgaggt	cgctgtgttt	gagccatcag	aagcagagat	ctcccacacc	420
caaaaggcca	cactggtgtg	cctggccaca	ggcttctacc	ccgaccacgt	ggagctgagc	480
tggtgggtga	atgggaagga	ggtgcacagt	ggggtctgca	cagacccgca	gcccctcaag	540
gagcagcccg	ccctcaatga	ctccagatac	gctctgagca	gccgcctgag	ggtctcggcc	600
accttctggc	aggacccccg	caaccacttc	cgctgtcaag	tccagttcta	cgggctctcg	660
gagaatgacg	agtggaccca	ggatagggcc	aaacccgtca	cccagatcgt	cagcgccgag	720
gcctggggta	gagcagacta	a				741

<210>	148
<211>	246
<212>	PRT
<213>	Homo
<400>	148

Met Asn Ala Gly Val Thr Gin Thr Pro Lys Phe Gin Val Leu Lys Thr 15 10 15

Gly Gin Ser Met Thr Leu Gin Cys Ala Gin Asp Met Asn His Glu Tyr 20 25 30

Met Ser Trp Tyr Arg Gin Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His 35 40 45

Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gin Gly Glu Val Pro Asn Gly 50 55 50

Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu

70 75 80

Ser Ala Ala Pro Ser Gin Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Pro

90 95

Gly Leu Ala Gly Gly Arg Pro Glu Gin Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg

100 105 110

PL 208 712 B1

Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 115 120 125

Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gin Lys Ala Thr 130 135 140

Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 145 150 155 160

Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro 165 170 175

Gin Pro Leu Lys Glu Gin Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu 180 185 190

Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gin Asp Pro Arg Asn 195 200 205

His Phe Arg Cys Gin Val Gin Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 210 215 220

Trp Thr Gin Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gin Ile Val Ser Ala Glu 225 230 235 240

Ala Trp Gly Arg Ala Asp 245 <210> 149 <211> 741 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 149

atgaacgctg	gtgtcactca	gaccccaaaa	ttccaggtcc	tgaagacagg	acagagcatg	60
acactgcagt	gtgcccagga	tatgaaccat	gaatacatgt	cctggtatcg	acaagaccca	120
ggcatggggc	tgaggctgat	tcattactca	gttggtgctg	gtatcactga	ccaaggagaa	180
gtccccaatg	gctacaatgt	ctccagatca	accacagagg	atttcccgct	caggctgctg	240
tcggctgctc	cctcccagac	atctgtgtac	ttctgtgcca	gcaggccggg	actagcggga	300
gggcgaccag	agcagtactt	cgggccgggc	accaggctca	cggtcacaga	ggacctgaaa	360
aacgtgttcc	cacccgaggt	cgctgtgttt	gagccatcag	aagcagagat	ctcccacacc	420
caaaaggcca	cactggtgtg	cctggccaca	ggcttctacc	ccgaccacgt	ggagctgagc	480
tggtgggtga	atgggaagga	ggtgcacagt	ggggtcagca	cagacccgca	gcccctcaag	540
gagcagcccg	ccctcaatga	ctccagatac	gctctgtgta	gccgcctgag	ggtctcggcc	600

PL 208 712 B1

accttctggc	aggacccccg caaccacttc cgctgtcaag tccagttcta cgggctctcg	660
gagaatgacg	agtggaccca ggatagggcc aaacccgtca cccagatcgt cagcgccgag	720
gcctggggta	gagcagacta a	741

<210> <211> <212> <213>	150 246 PRT Homo	sapiens
<400>	150
Met Asn Ala	Gly Val Thr Gin Thr Pro Lys Phe Gin Val Leu Lys Thr

10 15

Gly Gin Ser Met Thr Leu Gin Cys Ala Gin Asp Met Asn His Glu Tyr 20 25 30

Met Ser Trp Tyr Arg Gin Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His 35 40 45

Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gin Gly Glu Val Pro Asn Gly 50 55 S0

Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu 65 70 75 80

Ser Ala Ala Pro Ser Gin Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Pro 85 90 95

Gly Leu Ala Gly Gly Arg Pro Glu Gin Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg 100 105 110

Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 115 120 125

Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gin Lys Ala Thr 130 135 140

Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 145 150 155 160

Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro 165 170 175

Gin Pro Leu Lys Glu Gin Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu

180 185 190

100

PL 208 712 B1

Cys Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gin Asp Pro Arg Asn 195 20(5 205

His Phe Arg Cys Gin Val Gin Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 210 215 220

Trp Thr Gin Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gin Ile Val Ser Ala Glu 225 230 235 240

Ala Trp Gly Arg Ala Asp 245 <210> 151 <211> 741 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 151

atgaacgctg	gtgtcactca	gaccccaaaa	ttccaggtcc	tgaagacagg	acagagcatg	60
acactgcagt	gtgcccagga	tatgaaccat	gaatacatgt	cctggtatcg	acaagaccca	120
ggcatggggc	tgaggctgat	tcattactca	gttggtgotg	gtatcactga	ccaaggagaa	180
gtccccaatg	gctacaatgt	ctccagatca	accacagagg	atttcccgct	caggctgctg	240
tcggctgctc	cctcccagac	atctgtgtac	ttctgtgcca	gcaggccggg	actagcggga	300
gggcgaccag	agcagtactt	cgggccgggc	accaggctca	cggtcacaga	ggacctgaaa	360
aacgtgttcc	cacccgaggt	cgctgtgttt	gagccatgtg	aagcagagat	ctcccacacc	420
caaaaggcca	cactggtgtg	cctggccaca	ggcttctacc	ccgaccacgt	ggagctgagc	480
tggtgggtga	atgggaagga	ggtgcacagt	ggggtcagca	cagacccgca	gccoctcaag	540
gagcagcccg	ccctcaatga	ctccagatac	gctctgagca	gccgcctgag	ggtctcggcc	600
accttctggc	aggacccccg	caaccacttc	cgctgtcaag	tccagttcta	cgggctctcg	660
gagaatgacg	agtggaccca	ggatagggcc	aaacccgtca	cccagatcgt	cagcgccgag	720
gcctggggta	gagcagacta	a				741

<210>	152
<211>	246
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens

<400> 152

Met Asn Ala Gly Val Thr Gin Thr Pro Lys Phe Gin Val Leu Lys Thr 15 10 15

PL 208 712 B1

101

102

PL 208 712 B1 <210> 153 <211> 741 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 153

atgaacgctg	gtgtcactca	gaccccaaaa	ttccaggtcc	tgaagacagg	acagagcatg	60
acactgcagt	gtgcccagga	tatgaaccat	gaatacatgt	cctggtatcg	acaagaccca	120
ggcatggggc	tgaggctgat	tcattactca	gttggtgctg	gtatcactga	ccaaggagaa	180
gtccccaatg	gctacaatgt	ctccagatca	accacagagg	atttcccgct	caggctgctg	240
tcggctgctc	cctcccagac	atctgtgtac	ttctgtgcca	gcaggccggg	actagcggga	300
gggcgaccag	agcagtactt	cgggccgggc	accaggctca	cggtcacaga	ggacctgaaa	360
aacgtgttcc	cacccgaggt	cgcttgtttt	gagccatcag	aagcagagat	ctcccacacc	420
caaaaggcca	cactggtgtg	cctggccaca	ggcttctacc	ccgaccacgt	ggagctgagc	480
tggtgggtga	atgggaagga	ggtgcacagt	ggggtcagca	cagacccgca	gcccctcaag	540
gagcagcccg	ccctcaatga	ctccagatac	gctctgagca	gccgcctgag	ggtctcggcc	600
accttctggc	aggacccccg	caaccacttc	cgctgtcaag	tccagttcta	cgggctctcg	560
gagaatgacg	agtggaccca	ggatagggcc	aaacccgtca	cccagatcgt	cagcgccgag	720
gcctggggta	gagcagacta	a				741

<210> 154 <211> 246 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154

Met Asn Ala Gly Val Thr Gin Thr Pro Lys Phe Gin Val Leu Lys Thr 15 10 15

Gly Gin Ser Met Thr Leu Gin Cys Ala Gin Asp Met Asn His Glu Tyr 20 25 30

Met Ser Trp Tyr Arg Gin Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His 35 40 45

Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gin Gly Glu Val Pro Asn Gly 50 55 60

Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu 65 70 75 80

Ser Ala Ala Pro Ser Gin Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Pro

PL 208 712 B1

103

90 95

Gly Leu Ala Gly Gly Arg Pro Gili Gin Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg 100 105 110

Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 115 120 125

Cys Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gin Lys Ala Thr 130 135 140

Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 145 150 155 160

Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro 165 170 175

Gin Pro Leu Lys Glu Gin Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu 180 185 190

Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gin Asp Pro Arg Asn 195 200 205

His Phe Arg Cys Gin Val Gin Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 210 215 220

Trp Thr Gin Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gin Ile Val Ser Ala Glu 225 230 235 240

Ala Trp Gly Arg Ala Asp 245

<210>	155
<211>	741
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens

<400> 155 atgaacgctg	gtgtcactca	gaccccaaaa	ttccaggtcc	tgaagacagg	acagagcatg	60
acactgcagt	gtgcccagga	tatgaaccat	gaatacatgt	cctggtatcg	acaagaccca	120
ggcatggggc	tgaggctgat	tcattactca	gttggtgctg	gtatcactga	ccaaggagaa	180
gtccccaatg	gctacaatgt	ctccagatca	accacagagg	atttcccgct	caggctgctg	240
tcggctgctc	cctcccagac	atctgtgtac	ttctgtgcca	gcaggccggg	actagcggga	300
gggcgaccag	agcagtactt	cgggccgggc	accaggctca	cggtcacaga	ggacctgaaa	360

104

PL 208 712 B1

aacgtgttcc	cacccgaggt	cgctgtgttt	gagccatcag	aagcagagat	ctcccacacc	420
caaaaggcca	cactggtgtg	cctggccaća	ggcttctacc	ccgaccacgt	ggagctgagc	480
tggtgggtga	atgggaagga	ggtgcacagt	ggggtcagca	catgcccgca	gcccctcaag	540
gagcagcccg	ccctcaatga	ctccagatac	gctctgagca	gccgcctgag	ggtctcggcc	600
accttctggc	aggacccccg	caaccacttc	cgctgtcaag	tccagttcta	cgggctctcg	660
gagaatgacg	agtggaccca	ggatagggcc	aaacccgtca	cccagatcgt	cagcgccgag	720
gcctggggta	gagcagacta	a				741

<210>	156
<211>	246
<212>	PRT
<213?	Homo	sapiens
<400?	156
Met Asn Ala	Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr

10 15

Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr 20 25 30

Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His 35 40 ⁴⁵

Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly 50 55 50

Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu 65 70 75 80

Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Pro 85 90 95

Gly Leu Ala Gly Gly Arg Pro Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg 100 105 110

Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 115 120 125

Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr 130 135 140

Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 145 150 155 160

PL 208 712 B1

105

Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Cys Pro 165 170 175

Gin Pro Leu Lys Glu Gin Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu 180 185 190

Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gin Asp Pro Arg Asn 195 200 205

His Phe Arg Cys Gin Val Gin Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 210 215 220

Trp Thr Gin Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gin Ile Val Ser Ala Glu 225 230 235 240

Ala Trp Gly Arg Ala Asp 245 <210> 157 <211> 741 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 157

atgaacgctg	gtgtcactca	gaccccaaaa	ttccaggtcc	tgaagacagg	acagagcatg	60
acactgcagt	gtgcccagga	tatgaaccat	gaatacatgt	cctggtatcg	acaagaccca	120
ggcatggggc	tgaggctgat	tcattactca	gttggtgctg	gtatcactga	ccaaggagaa	180
gtccccaatg	gctacaatgt	ctccagatca	accacagagg	atttcccgct	caggctgctg	240
tcggctgctc	cctcccagac	atctgtgtac	ttctgtgcca	gcaggccggg	actagcggga	300
gggcgaccag	agcagtactt	cgggccgggc	accaggctca	cggtcacaga	ggacctgaaa	360
aacgtgttcc	cacccgaggt	cgctgtgttt	gagccatcag	aagcagagat	ctcccacacc	420
caaaaggcca	cactggtgtg	cctggccaca	ggcttctacc	ccgaccacgt	ggagctgagc	480
tggtgggtga	atgggaagga	ggtgcacagt	ggggtcagca	cagacccgca	gcccctcaag	540
gagcagcccg	ccctcaatga	ctccagatac	gctctgagca	gctgcctgag	ggtctcggcc	600
accttctggc	aggacccccg	caaccacttc	cgctgtcaag	tccagttcta	cgggctctcg	660
gagaatgacg	agtggaccca	ggatagggcc	aaacccgtca	cccagatcgt	cagcgccgag	720
gcctggggta	gagcagacta	a				741

<210> 158 <211> 246 <212> PRT

106

PL 208 712 B1 <213> Homo sapiens <400> 158

Met Asn Ala Gly Val Thr Gin Thr Pro Lys Phe Gin Val Leu Lys Thr 1 5 10 15

Gly Gin Ser Met Thr Leu Gin Cys Ala Gin Asp Met Asn His Glu Tyr 20 25 30

Met Ser Trp Tyr Arg Gin Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His 35 40 45

Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gin Gly Glu Val Pro Asn Gly 50 55 60

Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu 65 70 75 80

Ser Ala Ala Pro Ser Gin Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Pro 85 90 95

Gly Leu Ala Gly Gly Arg Pro Glu Gin Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg 100 105 110

Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 115 120 125

Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gin Lys Ala Thr 130 135 140

Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 145 150 155 ISO

Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro 165 170 175

Gin Pro Leu Lys Glu Gin Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu 180 185 190

Ser Ser Cys Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gin Asp Pro Arg Asn 195 200 205

His Phe Arg Cys Gin Val Gin Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 210 215 220

Trp Thr Gin Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gin Ile Val Ser Ala Glu

PL 208 712 B1

107

225 230 235 240

Ala Trp Gly Arg Ala Asp 245 <210> 159 <211.> 741 <212> DNA <213 > Homo sapiens <400> 159

atgaacgctg	gtgtcactca	gaccccaaaa	ttccaggtcc	tgaagacagg	acagagcatg	60
acactgcagt	gtgcccagga	tatgaaccat	gaatacatgt	cctggtatcg	acaagaccca	120
ggcatggggc	tgaggctgat	tcattactca	gttggtgctg	gtatcactga	ccaaggagaa	180
gtccccaatg	gctacaatgt	ctccagatca	accacagagg	atttcccgct	caggctgctg	240
tcggctgctc	cctcccagac	atctgtgtac	ttctgtgcca	gcaggccggg	actagcggga	300
gggcgaccag	agcagtactt	cgggccgggc	accaggctca	cggtcacaga	ggacctgaaa	360
aacgtgttcc	cacccgaggt	cgctgtgtgt	gagccatcag	aagcagagat	ctcccacacc	420
caaaaggcca	cactggtgtg	cctggccaca	ggcttctacc	ccgaccacgt	ggagctgagc	480
tggtgggtga	atgggaagga	ggtgcacagt	ggggtcagca	cagacccgca	gcccctcaag	540
gagcagcccg	ccctcaatga	ctccagatac	gctctgagca	gccgcctgag	ggtctcggcc	600
accttctggc	aggacccccg	caaccacttc	cgctgtcaag	tccagttcta	cgggctctcg	660
gagaatgacg	agtggaccca	ggatagggcc	aaacccgtca	cccagatcgt	cagcgccgag	720
gcctggggta	gagcagacta	a				741

<210>	160
<211>	246
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	160
Met Asn Ala	Gly Val Thr Gin Thr Pro Lys Phe Gin Val Leu Lys Thr

10 15

Gly Gin Ser Met Thr Leu Gin Cys Ala Gin Asp Met Asn His Glu Tyr 20 25 30

Met Ser Trp Tyr Arg Gin Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His 35 40 45

Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gin Gly Glu Val Pro Asn Gly

55 60

108

PL 208 712 B1

Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu 55 70 75 80

Ser Ala Ala Pro Ser Gin Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Pro 85 90 95

Gly Leu Ala Gly Gly Arg Pro Glu Gin Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg 100 105 HO

Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 115 120 125

Val Cys Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gin Lys Ala Thr 130 135 140

Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 145 150 155 160

Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro 165 170 175

Gin Pro Leu Lys Glu Gin Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu 180 185 190

Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gin Asp Pro Arg Asn 195 200 205

His Phe Arg Cys Gin Val Gin Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 210 215 220

Trp Thr Gin Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gin Ile Val Ser Ala Glu 225 230 235 240

Ala Trp Gly Arg Ala Asp 245 <210> 161 <211? 741 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 161 atgaacgctg	gtgtcactca	gaccccaaaa	ttccaggtcc	tgaagacagg	acagagcatg	60
acactgcagt	gtgcccagga	tatgaaccat	gaatacatgt	cctggtatcg	acaagaccca	120
ggcatggggc	tgaggctgat	tcattactca	gttggtgctg	gtatcactga	ccaaggagaa	180

PL 208 712 B1

109

gtccccaatg	gctacaatgt	ctccagatca	accacagagg	atttcccgct	caggctgctg	240
tcggctgctc	cctcccagac	atctgtgtac	ttctgtgcca	gcaggccggg	actagcggga	300
gggcgaccag	agcagtactt	cgggccgggc	accaggctca	cggtcacaga	ggacctgaaa	360
aacgtgttcc	cacccgaggt	cgctgtgttt	gagccatcag	aagcagagat	ctcccacacc	420
caaaaggcca	cactggtgtg	cctggccaca	ggcttctacc	ccgaccacgt	ggagctgagc	480
tggtgggtga	atgggaagga	ggtgcacagt	tgtgtcagca	cagacccgca	gcccctcaag	540
gagcagcccg	ccctcaatga	ctccagatac	gctctgagca	gccgcctgag	ggtctcggcc	600
accttctggc	aggacccccg	caaccacttc	cgctgtcaag	tccagttcta	cgggctctcg	660
gagaatgacg	agtggaccca	ggatagggcc	aaacccgtca	cccagatcgt	cagcgccgag	720
gcctggggta	gagcagacta	a				741

<210> 162 <211> 246 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 162

Met Asn Ala Gly Val Thr Gin Thr Pro Lys Phe Gin Val Leu Lys Thr 15 10 15

Gly Gin Ser Met Thr Leu Gin Cys Ala Gin Asp Met Asn His Glu Tyr 20 25 30

Met Ser Trp Tyr Arg Gin Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His 35 40 45

Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gin Gly Glu Val Pro Asn Gly 50 55 60

Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu 65 70 75 80

Ser Ala Ala Pro Ser Gin Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Pro 85 90 95

Gly Leu Ala Gly Gly Arg Pro Glu Gin Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg 100 105 110

Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala

115 120 125

110

PL 208 712 B1

Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gin Lys Ala Thr 130 135 140

Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 145 150 155 160

Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Cys Val Ser Thr Asp Pro 165 170 175

Gin Pro Leu Lys Glu Gin Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu 180 185 190

Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gin Asp Pro Arg Asn 195 200 205

His Phe Arg Cys Gin Val Gin Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 210 215 220

Trp Thr Gin Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gin Ile Val Ser Ala Glu 225 230 235 240

Ala Trp Gly Arg Ala Asp 245 <210> 163 <211> 741 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 163

atgaacgctg	gtgtcactca	gaccccaaaa	ttccaggtcc	tgaagacagg	acagagcatg	60
acactgcagt	gtgcccagga	tatgaaccat	gaatacatgt	cctggtatcg	acaagaccca	120
ggcatggggc	tgaggctgat	tcattactca	gttggtgctg	gtatcactga	ccaaggagaa	180
gtccccaatg	gctacaatgt	ctccagatca	accacagagg	atttcccgct	caggctgctg	240
tcggctgctc	cctcccagac	atctgtgtac	ttctgtgcca	gcaggccggg	actagcggga	300
gggcgaccag	agcagtactt	cgggccgggc	accaggctca	cggtcacaga	ggacctgaaa	360
aacgtgttcc	cacccgaggt	cgctgtgttt	gagccatcag	aagcagagat	ctcccacacc	420
caaaaggcca	cactggtgtg	cctggccaca	ggcttctacc	ccgaccacgt	ggagctgagc	480
tggtgggtga	atgggaagga	ggtgcacagt	ggggtcagca	cagacccgca	gccctgcaag	540
gagcagcccg	ccctcaatga	ctccagatac	gctctgagca	gccgcctgag	ggtctcggcc	600
accttctggc	aggacccccg	caaccacttc	cgctgtcaag	tccagttcta	cgggctctcg	660
gagaatgacg	agtggaccca	ggatagggcc	aaacccgtca	cccagatcgt	cagcgccgag	720

PL 208 712 B1

111 gcctggggta gagcagacta a 741

<210>	164
<211>	246
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	164
Met Asn Ala	Gly Val Thr Gin Thr Pro Lys Phe Gin Val Leu Lys Thr

10 15

Gly Gin Ser Met Thr Leu Gin Cys Ala Gin Asp Met Asn His Glu Tyr 20 25 30

Met Ser Trp Tyr Arg Gin Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His 35 40 45

Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gin Gly Glu Val Pro Asn Gly 50 55 60

Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu 65 70 75 80

Ser Ala Ala Pro Ser Gin Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Pro 85 90 95

Gly Leu Ala Gly Gly Arg Pro Glu Gin Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg 100 105 110

Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 115 120 125

Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gin Lys Ala Thr 130 135 140

Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 145 150 155 160

Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro 165 170 175

Gin Pro Cys Lys Glu Gin Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu 180 185 190

Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gin Asp Pro Arg Asn

195 200 205

112

PL 208 712 B1

His Phe Arg Cys Gin Val Gin Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 210 215 220

Trp Thr Gin Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gin Ile Val Ser Ala Glu 225 230 235 240

Ala Trp Gly Arg Ala Asp 245 <210> 165 <211> 741 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 165

atgaacgctg	gtgtcactca	gaccccaaaa	ttccaggtcc	tgaagacagg	acagagcatg	60
acactgcagt	gtgcccagga	tatgaaccat	gaatacatgt	cctggtatcg	acaagaccca	120
ggcatggggc	tgaggctgat	tcattactca	gttggtgctg	gtatcactga	ccaaggagaa	180
gtccccaatg	gctacaatgt	ctccagatca	accacagagg	atttcccgct	caggctgctg	240
tcggctgctc	cctcccagac	atctgtgtac	ttctgtgcca	gcaggccggg	actagcggga	300
gggcgaccag	agcagtactt	cgggccgggc	accaggctca	cggtcacaga	ggacctgaaa	360
aacgtgttcc	cacccgaggt	cgctgtgttt	tgtccatcag	aagcagagat	ctcccacacc	420
caaaaggcca	cactggtgtg	cctggccaca	ggcttctacc	ccgaccacgt	ggagctgagc	480
tggtgggtga	atgggaagga	ggtgcacagt	ggggtcagca	cagacccgca	gcccctcaag	540
gagcagcccg	ccctcaatga	ctccagatac	gctctgagca	gccgcctgag	ggtctcggcc	600
accttctggc	aggacccccg	caaccacttc	cgctgtcaag	tccagttcta	cgggctctcg	660
gagaatgacg	agtggaccca	ggatagggcc	aaacccgtca	cccagatcgt	cagcgccgag	720
gcctggggta	gagcagacta	a				741

<210> 166 <211> 246 <212> PRT <213=· Homo sapiens <400> 166

Met Asn Ala Gly Val Thr Gin Thr Pro Lys Phe Gin Val Leu Lys Thr 15 10 15

Gly Gin Ser Met Thr Leu Gin Cys Ala Gin Asp Met Asn His Glu Tyr 20 25 30

PL 208 712 B1

113

Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His 35 40 45

Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly 50 55 60

Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu 65 70 75 80

Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Pro 85 90 95

Gly Leu Ala Gly Gly Arg Pro Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg 100 105 110

Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 115 120 125

Val Phe Cys Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr 130 135 140

Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 145 150 155 160

Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro 165 170 175

Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu 180 185 190

Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn 195 200 205

His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 210 215 220

Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu 225 230 235 240

Ala Trp Gly Arg Ala Asp 245 <210> 167 <211? 783 <212> DNA <213> Homo sapiens

114

PL 208 712 B1

<400> 167 atgggtgtca	ctcagacccc	aaaattccag	gtcctgaaga	caggacagag	catgacactg	60
cagtgtgccc	aggatatgaa	ccatgaatac	atgtcctggt	atcgacaaga	cccaggcatg	120
gggctgaggc	tgattcatta	ctcagttggt	gctggtatca	ctgaccaagg	agaagtcccc	180
aatggctaca	atgtctccag	atcaaccaca	gaggatttcc	cgctcaggct	gctgtcggct	240
gctccctccc	agacatctgt	gtacttctgt	gccagcagtt	acgtcgggaa	caccggggag	300
ctgttttttg	gagaaggctc	taggctgacc	gtactggagg	acctgaaaaa	cgtgttccca	360
cccgaggtcg	ctgtgtttga	gccatcagaa	gcagagatct	cccacaccca	aaaggccaca	420
ctggtgtgcc	tggccacagg	cttctacccc	gaccacgtgg	agctgagctg	gtgggtgaat	480
gggaaggagg	tgcacagtgg	ggtctgcaca	gacccgcagc	ccctcaagga	gcagcccgcc	540
ctcaatgact	ccagatacgc	tctgagcagc	cgcctgaggg	tctcggccac	cttctggcag	600
gacccccgca	accacttccg	ctgtcaagtc	cagttctacg	ggctctcgga	gaatgacgag	660
tggacccagg	atagggccaa	acccgtcacc	cagatcgtca	gcgccgaggc	ctggggtaga	720
gcagacggat	ccggtggtgg	tctgaacgat	atttttgaag	ctcagaaaat	cgaatggcat	780

taa
<210>	168
<211>	260
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens

<4 00 > 168

Met Gly Val Thr Gin Thr Pro Lys Phe Gin Val Leu Lys Thr Gly Gin 15 10 15

Ser Met Thr Leu Gin Cys Ala Gin Asp Met Asn His Glu Tyr Met Ser 20 25 30

Trp Tyr Arg Gin Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr Ser 35 40 45

Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gin Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr Asn 50 55 60

Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu Ser Ala

70 75 80

Ala Pro Ser Gin Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr Val Gly

90 95

PL 208 712 B1

115

Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu Thr Val Leu 100 105 110

Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro 115 120 125

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gin Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 130 135 140

Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 145 150 155 160

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gin Pro Leu Lys 165 170 175

Glu Gin Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu 180 185 190

Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gin Asp Pro Arg Asn His Phe Arg Cys 195 200 205

Gin Val Gin Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gin Asp 210 215 220

Arg Ala Lys Pro Val Thr Gin Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg 225 230 235 240

Ala Asp Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gin Lys 245 250 255

Ile Glu Trp His 260 <210> 169 <211> 762 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 169 atgggtgtca	ctcagacccc	aaaattccag	gtcctgaaga	caggacagag	catgacactg	60
cagtgtgccc	aggatatgaa	ccatgaatac	atgtcctggt	atcgacaaga	cccaggcatg	120
gggctgaggc	tgattcatta	ctcagttggt	gctggtatca	ctgaccaagg	agaagtcccc	180
aatggctaca	atgtctccag	atcaaccaca	gaggatttcc	cgctcaggct	gctgtcggct	240
gctccctccc	agacatctgt	gtacttctgt	gccagcagtt	acgtcgggaa	caccggggag	300

116

PL 208 712 B1

ctgttttttg	gagaaggctc	taggctgacc	gtactggagg	acctgaaaaa	cgtgttccca	360
cccgaggtcg	ctgtgtttga	gccatcagaa	gcagagatct	cccacaccca	aaaggccaca	420
ctggtgtgcc	tggccacagg	cttctacccc	gaccacgtgg	agctgagctg	gtgggtgaat	480
gggaaggagg	tgcacagtgg	ggtctgcaca	gacccgcagc	ccctcaagga	gcagcccgcc	540
ctcaatgact	ccagatacgc	tctgagcagc	cgcctgaggg	tctcggccac	cttctggcag	600
gacccccgca	accacttccg	ctgtcaagtc	cagttctacg	ggctctcgga	gaatgacgag	660
tggacccagg	atagggccaa	acccgtcacc	cagatcgtca	gcgccgaggc	ctggggtaga	720
gcagacggat	ccggtggtgg	tcatcatcac	catcatcact	aa		762

<210> 170 <211> 253 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 170

Met Gly Val Thr Gin Thr Pro Lys Phe Gin Val 15 10

Leu Lys Thr Gly Gin 15

Ser Met Thr Leu Gin Cys Ala Gin Asp Met Asn His Glu Tyr Met Ser 20 25 30

Trp Tyr Arg Gin Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr Ser 35 40 45

Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gin Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr Asn 50 55 60

Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu Ser Ala 65 70 75 80

Ala Pro Ser Gin Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr Val Gly 85 90 95

Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu Thr Val Leu 100 105 110

Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro 115 120 125

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gin Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 130 135 140

Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

PL 208 712 B1

117

145 150 155 160

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gin Pro Leu Lys 165 170 175

Glu Gin Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu 180 185 190

Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gin Asp Pro Arg Asn His Phe Arg Cys 195 200 205

Gin Val Gin Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gin Asp 210 215 220

Arg Ala Lys Pro Val Thr Gin Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg 225 230 235 240

<400> 171

atgaacgctg	gtgtcactca	gaccccaaaa	ttccaggtcc	tgaagacagg	acagagcatg	60
acactgcagt	gtgcccagga	tatgaaccat	gaatacatgt	cctggtatcg	acaagaccca	120
ggcatggggc	tgaggctgat	tcattactca	gttggtgctg	gtatcactga	ccaaggagaa	180
gtccccaatg	gctacaatgt	ctccaaatca	accacagagg	atttcccgct	caggctgctg	240
tcggctgctc	cctcccagac	atctgtgtac	ttctgtgcca	gcaggccggg	actagcggga	300
gggcgaccag	agcagtactt	cgggccgggc	accaggctca	cggtcacaga	ggacctgaac	360
aaggtgttcc	cacccgaggt	cgctgtgttt	gagccatcag	aagcagagat	ctcccacacc	420
caaaaggcca	cactggtgtg	cctggccaca	ggcttcttcc	ccgaccacgt	ggagctgagc	480
tggtgggtga	atgggaagga	ggtgcacagt	ggggtctgca	cagacccgca	gcccctcaag	540
gagcagcccg	ccctcaatga	ctccagatac	tctctgagca	gccgcctgag	ggtctcggcc	600
accttctggc	aggacccccg	caaccacttc	cgctgtcaag	tccagttcta	cgggctctcg	660
gagaatgacg	agtggaccca	ggatagggcc	aaacccgtca	cccagatcgt	cagcgccgag	720
gcctggggta	gagcagacta	a				741

<210> 172

118

PL 208 712 B1

<211> 741
<212> DNA
<213> Homo	sapiens
<400> 172
atgaacgctg	gtgtcactca	gaccccaaaa	ttccaggtcc	tgaagacagg	acagagcatg	60
acactgcagt	gtgćccagga	tatgaaccat	gaatacatgt	cctggtatcg	acaagaccca	120
ggcatggggc	tgaggctgat	tcattactca	gttggtgctg	gtatcactga	ccaaggagaa	180
gtccccaatg	gctacaatgt	ctccagatca	accacagagg	atttcccgct	caggctgctg	240
tcggctgctc	cctcccagac	atctgtgtac	ttctgtgcca	gcaggccggg	actagcggga	300
gggcgaccag	agcagtactt	cgggccgggc	accaggctca	cggtcacaga	ggacctgaaa	360
aacgtgttcc	cacccgaggt	cgctgtgttt	gagccatcag	aagcagagat	ctcccacacc	420
caaaaggcca	cactggtgtg	cctggccaca	ggcttctacc	ccgaccacgt	ggagctgagc	480
tggtgggtga	atgggaagga	ggtgcacagt	ggggtctgca	cagacccgca	gcccctcaag	540
gagcagcccg	ccctcaatga	ctccagatac	tgtctgagca	gccgcctgag	ggtctcggcc	600
accttctggc	aggacccccg	caaccacttc	cgctgtcaag	tccagttcta	cgggctctcg	660
gagaatgacg	agtggaccca	ggatagggcc	aaacccgtca	cccagatcgt	cagcgccgag	720
gcctggggta	gagcagacta	a				741

<210? 173
<211> 741
<212? DNA
<213 > Homo	sapiens
<400? 173
atgaacgctg	gtgtcactca	gaccccaaaa	ttccaggtcc	tgaagacagg	acagagcatg	60
acactgcagt	gtgcccagga	tatgaaccat	gaatacatgt	cctggtatcg	acaagaccca	120
ggcatggggc	tgaggctgat	tcattactca	gttggtgctg	gtatcactga	ccaaggagaa	180
gtccccaatg	gctacaatgt	ctccagatca	accacagagg	atttcccgct	caggctgctg	240
tcggctgctc	cctcccagac	atctgtgtac	ttctgtgcca	gcaggccggg	actagcggga	300
gggcgaccag	agcagtactt	cgggccgggc	accaggctca	cggtcacaga	ggacctgaaa	360
aacgtgttcc	cacccgaggt	cgctgtgttt	gagccatcag	aagcagagat	ctcccacacc	420
caaaaggcca	cactggtgtg	cctggccaca	ggcttctacc	ccgaccacgt	ggagctgagc	480
tggtgggtga	atgggaagga	ggtgcacagt	ggggtctgca	cagacccgca	gcccctcaag	540
gagcagcccg	ccctcaatga	ctccagatac	tctctgagca	gccgcctgag	ggtctcggcc	600
accttctggc	aggacccccg	caaccacttc	cgctgtcaag	tccagttcta	cgggctctcg	660
gagaatgacg	agtggaccca	ggatagggcc	aaacccgtca	cccagatcgt	cagcgccgag	720

PL 208 712 B1

119 gcctggggta gagcagacta a

<210> 174 <211> S671 <212> DNA <213> Wektor ekspresji pYX112
<400> 174 gaattcacca	tggatcctag	ggcccacaag	cttacgcgtc	gacccgggta	tccgtatgat	60
gtgcctgact	acgcatgata	tctcgagctc	agctagctaa	ctgaataagg	aacaatgaac	120
gtttttcctt	tctcttgttc	ctagtattaa	tgactgaccg	atacatccct	tttttttttt	180
gtctttgtct	agctccagct	tttgttccct	ttagtgaggg	ttaattcaat	tcactggccg	240
tcgttttaca	acgtcgtgac	tgggaaaacc	ctggcgttac	ccaacttaat	cgccttgcag	300
cacatccccc	tttcgccagc	tggcgtaata	gcgaagaggc	ccgcaccgat	cgcccttccc	360
aacagttgcg	cagcctgaat	ggcgaatggc	gcgacgcgcc	ctgtagcggc	gcattaagcg	420
cggcgggtgt	ggtggttacg	cgcagcgtga	ccgctacact	tgccagcgcc	ctagcgcccg	480
ctcctttcgc	tttcttccct	tcctttctcg	ccacgttcgc	cggctttccc	cgtcaagctc	540
taaatcgggg	gctcccttta	gggttccgat	ttagtggttt	acggcacctc	gaccccaaaa	600
aacttgatta	gggtgatggt	tcacgtagtg	ggccatcgcc	ctgatagacg	gtttttcgcc	660
ctttgacgtt	ggagtccacg	ttctttaata	gtggactctt	gttccaaact	ggaacaacac	720
tcaaccctat	ctcggtctat	tcttttgatt	tataagggat	tttgccgatt	tcggcctatt	780
ggttaaaaaa	tgagctgatt	taacaaaaat	ttaacgcgaa	ttttaacaaa	atattaacgt	840
ttacaatttc	ctgatgcggt	attttctcct	tacgcatctg	tgcggtattt	cacaccgcat	900
agggtaataa	ctgatataat	taaattgaag	ctctaatttg	tgagtttagt	atacatgcat	960
ttacttataa	tacagttttt	tagttttgct	ggccgcatct	tctcaaatat	gcttcccagc	1020
ctgcttttct	gtaacgttca	ccctgtacct	tagcatccct	tccctttgca	aatagtcctc	1030
ttccaacaat	aataatgtca	gatcctgtag	agaccacatc	atccacggtt	ctatactgtt	1140
gacccaatgc	gtctcccttg	tcatctaaac	ccacaccggg	tgtcataatc	aaccaatcgt	1200
aaccttcatc	tcttccaccc	atgtctcttt	gagcaataaa	gccgataaca	aaatctttgt	1260
cgctcttcgc	aatgtcaaca	gtacccttag	tatattctcc	agtagatagg	gagcccttgc	1320
atgacaattc	tgctaacatc	aaaaggcctc	taggttcctt	tgttacttct	tctgccgcct	1380
gcttcaaacc	gctaacaata	cctggcccca	gcacaccgtg	tgcattcgta	atgtctgccc	1440
attctgctat	tctgtataca	cccgcagagt	actgcaattt	gactgtatta	ccaatgtcag	1500
caaattttct	gtcttcgaag	agtaaaaaat	tgtacttggc	ggataatgcc	tttagcggct	1560

120

PL 208 712 B1

taactgtgcc	ctccatcgaa	aaatcagtca	atatatccac	atgtgttttt	agtaaacaaa	1620
ttttgggacc	taatgcttca	actaactcca	gtaattcctt	ggtggtacga	acatccaatg	1680
aagcacacaa	gtttgtttgc	ttttcgtgca	tgatattaaa	tagcttggca	gcaacaggac	1740
taggatgagt	agcagcacgt	tccttatatg	tagctttcga	catgatttat	cttcgtttcc	1800
tgcaggtttt	tgttctgtgc	agttgggtta	agaatactgg	gcaatttcat	gtttcttcaa	1860
cactacatat	gcgtatatat	accaatctaa	gtctgtgctc	cttccttcgt	tcttccttct	1920
gttcggagat	taccgaatca	aaaaaatttc	aaagaaaccg	aaatcaaaaa	aaagaataaa	1980
aaaaaaatga	tgaattgaat	tgaaaagctg	tggtatggtg	cactctcagt	acaatctgct	2040
ctgatgccgc	atagttaagc	cagccccgac	acccgccaac	acccgctgac	gcgccctgac	2100
gggcttgtct	gctcccggca	tccgcttaca	gacaagctgt	gaccgtctcc	gggagctgca	2160
tgtgtcagag	gttttcaccg	tcatcaccga	aacgcgcgag	acgaaagggc	ctcgtgatac	2220
gcctattttt	ataggttaat	gtcatgataa	taatggtttc	ttaggacgga	tcgcttgcct	2280
gtaacttaca	cgcgcctcgt	atcttttaat	gatggaataa	tttgggaatt	tactctgtgt	2340
ttatttattt	ttatgttttg	tatttggatt	ttagaaagta	aataaagaag	gtagaagagt	2400
tacggaatga	agaaaaaaaa	ataaacaaag	gtttaaaaaa	tttcaacaaa	aagcgtactt	2460
tacatatata	tttattagac	aagaaaagca	gattaaatag	atatacattc	gattaacgat	2520
aagtaaaatg	taaaatcaca	ggattttcgt	gtgtggtctt	ctacacagac	aagatgaaac	2580
aattcggcat	taatacctga	gagcaggaag	agcaagataa	aaggtagtat	ttgttggcga	2640
tccccctaga	gtcttttaca	tcttcggaaa	acaaaaacta	ttttttcttt	aatttctttt	2700

tttactttct atttttaatt tatatattta tattaaaaaa tttaaattat aattattttt 2760 atagcacgtg atgaaaagga cccaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct 2820 atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccgtga 2880 taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc 2940 cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 3000 aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 3060 aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact 3120

tttaaagttc	tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc	3180
gctcgccgca	tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag	3240
catcttacgg	atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat	3300
aacactgcgg	ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt	3360

PL 208 712 B1

121

ttggacaaca	tgggggatca	tgtaactcgc	cttgatcgtt	gggaaccgga	gctgaatgaa	3420
gccataccaa	acgacgagcg	tgacaccacg	atgcctgtag	caatggcaac	aacgttgcgc	3480
aaactattaa	ctggcgaact	acttactcta	gcttcccggc	aacaattaat	agactggatg	3540
gaggcggata	aagttgcagg	accacttctg	cgctcggccc	ttccggctgg	ctggtttatt	3600
gctg.ataaat	ctggagccgg	tgagcgtggg	tctcgcggta	tcattgcagc	actggggcca	3660
gatggtaagc	cctcccgtat	cgtagttatc	tacacgacgg	ggagtcaggc	aactatggat	3720
gaacgaaata	gacagatcgc	tgagataggt	gcctcactga	ttaagcattg	gtaactgtca	3780
gaccaagttt	actcatatat	actttagatt	gatttaaaac	ttcattttta	atttaaaagg	3840
atctaggtga	agatcctttt	tgataatctc	atgaccaaaa	tcccttaacg	tgagttttcg	3900
ttccactgag	cgtcagaccc	cgtagaaaag	atcaaaggat	cttcttgaga	tccttttttt	3960
ctgcgcgtaa	tctgctgctt	gcaaacaaaa	aaaccaccgc	taccagcggt	ggtttgtttg	4020
ccggatcaag	agctaccaac	tctttttccg	aaggtaactg	gcttcagcag	agcgcagata	4080
ccaaatactg	tccttctagt	gtagccgtag	ttaggccacc	acttcaagaa	ctctgtagca	4140
ccgcctacat	acctcgctct	gctaatcctg	ttaccagtgg	ctgctgccag	tggcgataag	4200
tcgtgtctta	ccgggttgga	ctcaagacga	tagttaccgg	ataaggcgca	gcggtcgggc	4260
tgaacggggg	gttcgtgcac	acagcccagc	ttggagcgaa	cgacctacac	cgaactgaga	4320
tacctacagc	gtgagctatg	agaaagcgcc	acgcttcccg	aagggagaaa	ggcggacagg	4380
tatccggtaa	gcggcagggt	cggaacagga	gagcgcacga	gggagcttcc	agggggaaac	4440
gcctggtatc	tttatagtcc	tgtcgggttt	cgccacctct	gacttgagcg	tcgatttttg	4500
tgatgctcgt	caggggggcg	gagcctatgg	aaaaacgcca	gcaacgcggc	ctttttacgg	4560
ttcctggcct	tttgctggcc	ttttgctcac	atgttctttc	ctgcgttatc	ccctgattct	4620
gtggataacc	gtattaccgc	ctttgagtga	gctgataccg	gtcgccgcag	ccgaacgacc	4680
gagcgcagcg	agtcagtgag	cgaggaagcg	gaagagcgcc	caatacgcaa	accgcctctc	4740
cccgcgcgtt	ggccgattca	ttaatgcagc	tggcacgaca	ggtttcccga	ctggaaagcg	4800
ggcagtgagc	gcaacgcaat	taatgtgagt	tacctcactc	attaggcacc	ccaggcttta	4860
cactttatgc	ttccggctcc	tatgttgtgt	ggaattgtga	gcggataaca	atttcacaca	4920
ggaaacagct	atgaccatga	ttacgccaag	ctcgaaatac	gactcactat	agggcgaatt	4980
gggtaccggg	ccggccgtcg	agcttgatgg	catcgtggtg	tcacgctcgt	cgtttggtat	5040
ggcttcattc	agctccggtt	cccaacgatc	aaggcgagtt	acatgatccc	ccatgttgtg	5100
aaaaaaagcg	gttagctctt	cggtcctccg	atcgttgtca	gaagtaagtt	ggccgcagtg	5160
ttatcactca	tggttatggc	aggaactgca	taattctctt	actgtcatgc	catccgtaag	5220

122

PL 208 712 B1 atgcttttct gtgactggtg tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac 5280 cgagttgctc ttgcccggcg tcaacacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa 5340 aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt 5400 tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt 5460 tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa 5520 gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt 5580

atcagggtta	ttgtctcatg	agcgatacat	atttgaatgt	atttagaaaa	ataaacaaat	5640
aggggttccg	cgcacatttc	cccgaaaagt	gccacctgac	gtctaagaaa	ccattattat	5700
catgacatta	acctataaaa	ataggcgtat	cacgaggccc	tttcgtcttc	aagaattggg	5760
gatctacgta	tggtcattct	tcttcagatt	ccctcatgga	gaagtgcggc	agatgtatat	5820
gacagagtcg	ccagtttcca	agagacttta	ttcaggcact	tccatgatag	gcaagagaga	5880
agacccagag	atgttgttgt	cctagttaca	catggtattt	attccagagt	attcctgatg	5940
aaatggttta	gatggacata	cgaagagttt	gaatcgttta	ccaatgttcc	taacgggagc	6000
gtaatggtga	tggaactgga	cgaatccatc	aatagatacg	tcctgaggac	cgtgctaccc	6060
aaatggactg	attgtgaggg	agacctaact	acatagtgtt	taaagattac	ggatatttaa	6120
cttacttaga	ataatgccat	ttttttgagt	tataataatc	ctacgttagt	gtgagcggga	6180
tttaaactgt	gaggacctca	atacattcag	acacttctga	cggtatcacc	ctacttattc	6240
ccttcgagat	tatatctagg	aacccatcag	gttggtggaa	gattacccgt	tctaagactt	6300
ttcagcttcc	tctattgatg	ttacactcgg	acaccccttt	tctggcatcc	agtttttaat	6360
cttcagtggc	atgtgagatt	ctccgaaatt	aattaaagca	atcacacaat	tctctcggat	6420
accacctcgg	ttgaaactga	caggtggttt	gttacgcatg	ctaatgcaaa	ggagcctata	6480
tacctttggc	tcggctgctg	taacagggaa	tataaagggc	agcataattt	aggagtttag	6540
tgaacttgca	acatttacta	ttttcccttc	ttacgtaaat	atttttcttt	ttaattctaa	6600
atcaatcttt	ttcaattttt	tgtttgtatt	cttttcttgc	ttaaatctat	aactacaaaa	6660

aacacataca g 6671 <210> 175 <211> 6743 <212> DNA <213> Wektor ekspresji pYX122 < 4 0 0 > 175 gaattcacca tggatcctag ggcccacaag cttacgcgtc gacccgggta tccgtatgat 60 gtgcctgact acgcatgata tctcgagctc agctagctaa ctgaataagg aacaatgaac 120

PL 208 712 B1

123

gtttttcctt	tctcttgttc	ctagtattaa	tgactgaccg	atacatccct	tttttttttt	180
gtctttgtct	agctccagct	tttgttccct	ttagtgaggg	ttaattcaat	tcactggccg	240
tcgttttaca	acgtcgtgac	tgggaaaacc	ctggcgttac	ccaacttaat	cgccttgcag	300
cacatccccc	tttćgccagc	tggcgtaata	gcgaagaggc	ccgcaccgat	cgcccttccc	360
aacagttgcg	cagcctgaat	ggcgaatggc	gcgacgcgcc	ctgtagcggc	gcattaagcg	420
cggcgggtgt	ggtggttacg	cgcagcgtga	ccgctacact	tgccagcgcc	ctagcgcccg	480
ctcctttcgc	tttcttccct	tcctttctcg	ccacgttcgc	cggctttccc	cgtcaagctc	540
taaatcgggg	gctcccttta	gggttccgat	ttagtggttt	acggcacctc	gaccccaaaa	600
aacttgatta	gggtgatggt	tcacgtagtg	ggccatcgcc	ctgatagacg	gtttttcgcc	660
ctttgacgtt	ggagtccacg	ttctttaata	gtggactctt	gttccaaact	ggaacaacac	720
tcaaccctat	ctcggtctat	tcttttgatt	tataagggat	tttgccgatt	tcggcctatt	780
ggttaaaaaa	tgagctgatt	taacaaaaat	ttaacgcgaa	ttttaacaaa	atattaacgt	840
ttacaatttc	ctgatgcggt	attttctcct	tacgcatctg	tgcggtattt	cacaccgcat	900
agatccgtcg	agttcaagag	aaaaaaaaag	aaaaagcaaa	aagaaaaaag	gaaagcgcgc	950
ctcgttcaga	atgacacgta	tagaatgatg	cattaccttg	tcatcttcag	tatcatactg	1020
ttcgtataca	tacttactga	cattcatagg	tatacatata	tacacatgta	tatatatcgt	1080
atgctgcagc	tttaaataat	cggtgtcact	acataagaac	acctttggtg	gagggaacat	1140
cgttggttcc	attgggcgag	gtggcttctc	ttatggcaac	cgcaagagcc	ttgaacgcac	1200
tctcactacg	gtgatgatca	ttcttgcctc	gcagacaatc	aacgtggagg	gtaattctgc	1260
ttgcctctgc	aaaactttca	agaaaatgcg	ggatcatctc	gcaagagaga	tctcctactt	1320
tctccctttg	caaaccaagt	tcgacaactg	cgtacggcct	gttcgaaaga	tctaccaccg	1380
ctctggaaag	tgcctcatcc	aaaggcgcaa	atcctgatcc	aaaccttttt	actccacgcg	1440
ccagtagggc	ctctttaaat	gcttgaccga	gagcaatccc	gcagtcttca	gtggtgtgat	1500
ggtcgtctat	gtgtaagtca	ccaatgcact	caacgattag	cgaccagccg	gaatgcttgg	1560
ccagagcatg	tatcatatgg	tccagaaacc	ctatacctgt	gtggacgtta	atcacttgcg	1620
attgtgtggc	ctgttctgct	actggttctg	cctctttttc	tgggaagatc	gagtgctcta	1680
tcgctagggg	accagccttt	aaagagatcg	caatctgaat	cttggtttca	tttgtaatac	1740
gctttactag	ggctttctgc	tctgtcatct	ttgccttcgt	ttatcttgcc	tgctcatttt	1800
ttagtatatt	cttcgaagaa	atcacattac	tttatataat	gtataattca	ttatgtgata	1860
atgccaatcg	ctaagaaaaa	aaaagagtca	tccgctaggg	gaaaaaaaaa	aatgaaaatc	1920

124

PL 208 712 B1

attaccgagg	cataaaaaaa	tatagagtgt	actagaggag	gccaagagta	atagaaaaag	1980
aaaattgcgg	gaaaggactg	tgttatgact	tccctgacta	atgccgtgtt	caaacgatac	2040
ctggcagtga	ctcctagcgc	tcaccaagct	cttaaaacgg	gaatttatgg	tgcactctca	2100
gtacaatctg	ctctgatgcc	gcatagttaa	gccagccccg	acacccgcca	acacccgctg	2160
acgcgccctg	acgggcttgt	ctgctcccgg	catccgctta	cagacaagct	gtgaccgtct	2220
ccgggagctg	catgtgtcag	aggttttcac	cgtcatcacc	gaaacgcgcg	agacgaaagg	2280
gcctcgtgat	acgcctattt	ttataggtta	atgtcatgat	aataatggtt	tcttaggacg	2340
gatcgcttgc	ctgtaactta	cacgcgcctc	gtatctttta	atgatggaat	aatttgggaa	2400
tttactctgt	gtttatttat	ttttatgttt	tgtatttgga	ttttagaaag	taaataaaga	2460
aggtagaaga	gttacggaat	gaagaaaaaa	aaataaacaa	aggtttaaaa	aatttcaaca	2520
aaaagcgtac	tttacatata	tatttattag	acaagaaaag	cagattaaat	agatatacat	2580
tcgattaacg	ataagtaaaa	tgtaaaatca	caggattttc	gtgtgtggtc	ttctacacag	2640
acaagatgaa	acaattcggc	attaatacct	gagagcagga	agagcaagat	aaaaggtagt	2700
atttgttggc	gatcccccta	gagtctttta	catcttcgga	aaacaaaaac	tattttttct	2760
ttaatttctt	tttttacttt	ctatttttaa	tttatatatt	tatattaaaa	aatttaaatt	2820
ataattattt	ttatagcacg	tgatgaaaag	gacccaggtg	gcacttttcg	gggaaatgtg	2880
cgcggaaccc	ctatttgttt	atttttctaa	atacattcaa	atatgtatcc	gctcatgaga	2940
caataaccgt	gataaatgct	tcaataatat	tgaaaaagga	agagtatgag	tattcaacat	3000
ttccgtgtcg	cccttattcc	cttttttgcg	gcattttgcc	ttcctgtttt	tgctcaccca	3060
gaaacgctgg	tgaaagtaaa	agatgctgaa	gatcagttgg	gtgcacgagt	gggttacatc	3120
gaactggatc	tcaacagcgg	taagatcctt	gagagttttc	gccccgaaga	acgttttcca	3180
atgatgagca	cttttaaagt	tctgctatgt	ggcgcggtat	tatcccgtat	tgacgccggg	3240

caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca 3300 gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata 3360 accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag 3420 ctaaccgctt ttttggacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg 3480 gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca 3540 acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta 3600 atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct 3660 ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca 3720 gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag 3780

PL 208 712 B1

125

gcaactatgg	atgaacgaaa	tagacagatc	gctgagatag	gtgcctcact	gattaagcat	3840
tggtaactgt	cagaccaagt	ttactcatht	atactttaga	ttgatttaaa	acttcatttt	3900
taatttaaaa	ggatctaggt	gaagatcctt	tttgataatc	tcatgaccaa	aatcccttaa	3960
cgtgagtttt	cgttccactg	agcgtcagac	cccgtagaaa	agatcaaagg	atcttcttga	4020
gatccttttt	ttctgcgcgt	aatctgctgc	ttgcaaacaa	aaaaaccacc	gctaccagcg	4080
gtggtttgtt	tgccggatca	agagctacca	actctttttc	cgaaggtaac	tggcttcagc	4140
agagcgcaga	taccaaatac	tgtccttcta	gtgtagccgt	agttaggcca	ccacttcaag	4200
aactctgtag	caccgcctac	atacctcgct	ctgctaatcc	tgttaccagt	ggctgctgcc	4260
agtggcgata	agtcgtgtct	taccgggttg	gactcaagac	gatagttacc	ggataaggcg	4320
cagcggtcgg	gctgaacggg	gggttcgtgc	acacagccca	gcttggagcg	aacgacctac	4380
accgaactga	gatacctaca	gcgtgagcta	tgagaaagcg	ccacgcttcc	cgaagggaga	4440
aaggcggaca	ggtatccggt	aagcggcagg	gtcggaacag	gagagcgcac	gagggagctt	4500
ccagggggaa	acgcctggta	tctttatagt	cctgtcgggt	ttcgccacct	ctgacttgag	4560
cgtcgatttt	tgtgatgctc	gtcagggggg	cggagcctat	ggaaaaacgc	cagcaacgcg	4620
gcctttttac	ggttcctggc	cttttgctgg	ccttttgctc	acatgttctt	tcctgcgtta	4680
tcccctgatt	ctgtggataa	ccgtattacc	gcctttgagt	gagctgatac	cgctcgccgc	4740
agccgaacga	ccgagcgcag	cgagtcagtg	agcgaggaag	cggaagagcg	cccaatacgc	4800
aaaccgcctc	tccccgcgcg	ttggccgatt	cattaatgca	gctggcacga	caggtttccc	4860
gactggaaag	cgggcagtga	gcgcaacgca	attaatgtga	gttacctcac	tcattaggca	4920
ccccaggctt	tacactttat	gcttccggct	cctatgttgt	gtggaattgt	gagcggataa	4980
caatttcaca	caggaaacag	ctatgaccat	gattacgcca	agctcgaaat	acgactcact	5040
atagggcgaa	ttgggtaccg	ggccggccgt	cgagcttgat	ggcatcgtgg	tgtcacgctc	5100
gtcgtttggt	atggcttcat	tcagctccgg	ttcccaacga	tcaaggcgag	ttacatgatc	5160
ccccatgttg	taaaaaaaag	cggttagctc	ttcggtcctc	cgatcgttgt	cagaagtaag	5220
ttggccgcag	tgttatcact	catggttatg	gcaggaactg	cataattctc	ttactgtcat	5280
gccatccgta	agatgctttt	ctgtgactgg	tgtactcaac	caagtcattc	tgagaatagt	5340
gtatgcggcg	accgagttgc	tcttgcccgg	cgtcaacacg	ggataatacc	gcgccacata	5400
gcagaacttt	aaaagtgctc	atcattagaa	aacgttcttc	ggggcgaaaa	ctctcaagga	5460
tcttaccgct	gttgagatcc	agttcgatgt	aacccactcg	tgcacccaac	tgatcttcag	5520
catcttttac	tttcaccagc	gtttctgggt	gagcaaaaac	aggaaggcaa	aatgccgcaa	5580

126

PL 208 712 B1

aaaagggaat	aagggcgaca	cggaaatgtt	gaatactcat	actcttcctt	tttcaatatt	5640
attgaagcat	ttatcagggt	tattgtctca	tgagcgatac	atatttgaat	gtatttagaa	5700
aaataaacaa	ataggggttc	cgcgcacatt	tccccgaaaa	gtgccacctg	acgtctaaga	5760
aaccattatt	atcatgacat	taacctataa	aaataggcgt	atcacgaggc	cctttcgtct	5820
tcaagaattg	gggatctacg	tatggtcatt	cttcttcaga	ttccctcatg	gagaagtgcg	5880
gcagatgtat	atgacagagt	cgccagtttc	caagagactt	tattcaggca	cttccatgat	5940
aggcaagaga	gaagacccag	agatgttgtt	gtcctagtta	cacatggtat	ttattccaga	6000
gtattcctga	tgaaatggtt	tagatggaca	tacgaagagt	ttgaatcgtt	taccaatgtt	6060
cctaacggga	gcgtaatggt	gatggaactg	gacgaatcca	tcaatagata	cgtcctgagg	6120
accgtgctac	ccaaatggac	tgattgtgag	ggagacctaa	ctacatagtg	tttaaagatt	6180
acggatattt	aacttactta	gaataatgcc	atttttttga	gttataataa	tcctacgtta	6240
gtgtgagcgg	gatttaaact	gtgaggacct	caatacattc	agacacttct	gacggtatca	6300
ccctacttat	tcccttcgag	attatatcta	ggaacccatc	aggttggtgg	aagattaccc	6360
gttctaagac	ttttcagctt	cctctattga	tgttacactc	ggacacccct	tttctggcat	6420
ccagttttta	atcttcagtg	gcatgtgaga	ttctccgaaa	ttaattaaag	caatcacaca	6480
attctctcgg	ataccacctc	SSJttgaaact	gacaggtggt	ttgttacgca	tgctaatgca	6540
aaggagccta	tatacctttg	gctcggctgc	tgtaacaggg	aatataaagg	gcagcataat	6600
ttaggagttt	agtgaacttg	caacatttac	tattttccct	tcttacgtaa	atatttttct	6660
ttttaattct	aaatcaatct	ttttcaattt	tttgtttgta	ttcttttctt	gcttaaatct	6720

ataactacaa aaaacacata cag 6743

<210> <211> <212> <213>	176 296 PRT Homo	sapiens
<400>	176
Met Arg Phe	Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin 20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Leu Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

PL 208 712 B1

127

128

PL 208 712 B1 <210> 177 <211> 903 <212> DNA <213> Hómo sapiens

<400> 177 gaattcatga gatttccttc	aatttttact	gcagttttat	tcgcagcatc	ctccgcatta	60
gctgctccag	tcaacactac	aacagaagat	gaaacggcac	aaattccggc	tgaagctgtc	120
atcggttact	tagatttaga	aggggatttc	gatgttgctg	ttttgccatt	ttccaacagc	180
acaaataacg	ggttattgtt	tataaatact	actattgcca	gcattgctgc	taaagaagaa	240
ggggtatctt	tggataaaag	agaggctgaa	gcccaggagg	tgacacagat	tcctgcagct	300
ctgagtgtcc	cagaaggaga	aaacttggtt	ctcaactgca	gtttcactga	tagcgctatt	360
tacaacctcc	agtggtttag	gcaggaccct	gggaaaggtc	tcacatctct	gttgcttatt	420
cagtcaagtc	agagagagca	aacaagtgga	agacttaatg	cctcgctgga	taaatcatca	480
ggacgtagta	ctttatacat	tgcagcttct	cagcctggtg	actcagccac	ctacctctgt	540
gctgtgaggc	ccacatcagg	aggaagctac	atacctacat	ttggaagagg	aaccagcctt	600
attgttcatc	cgtatatcca	gaacccggat	cctgccgtgt	accagctgag	agactctaaa	660
tccagtgaca	agtctgtctg	cctattcacc	gattttgatt	ctcaaacaaa	tgtgtcacaa	720
agtaaggatt	ctgatgtgta	tatcacagac	aaatgtgtgc	tagacatgag	gtctatggac	780
ttcaagagca	acagtgctgt	ggcctggagc	aacaaatctg	actttgcatg	tgcaaacgcc	840
ttcaacaaca	gcattattcc	agaagacacc	ttcttcccca	gcccagaaag	ttcctaactc	900

gag 903

<210>	178
<211>	330
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	178
Met Arg Phe	Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin 20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Leu Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

PL 208 712 B1

129

130

PL 208 712 B1

Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile 305 310 315 320

Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp 325 330 <210? 179 <211? 1005 <212? DNA <213? Homo sapiens

<400? 179 gaattcatga	gatttccttc	aatttttact	gcagttttat	tcgcagcatc	ctccgcatta	60
gctgctccag	tcaacactac	aacagaagat	gaaacggcac	aaattccggc	tgaagctgtc	120
atcggttact	tagatttaga	aggggatttc	gatgttgctg	ttttgccatt	ttccaacagc	180
acaaataacg	ggttattgtt	tataaatact	actattgcca	gcattgctgc	taaagaagaa	240
ggggtatctt	tggataaaag	agaggctgaa	gccggcgtca	ctcagacccc	aaaattccag	300
gtcctgaaga	caggacagag	catgacactg	cagtgtgccc	aggatatgaa	ccatgaatac	360
atgtcctggt	atcgacaaga	cccaggcatg	gggctgaggc	tgattcatta	ctcagttggt	420
gctggtatca	ctgaccaagg	agaagtcccc	aatggctaca	atgtctccag	atcaaccaca	480
gaggatttcc	cgctcaggct	gctgtcggct	gctccctccc	agacatctgt	gtacttctgt	540
gccagcagtt	acgtcgggaa	caccggggag	ctgttttttg	gagaaggctc	taggctgacc	600
gtactggagg	acctgaaaaa	cgtgttccca	cccgaggtcg	ctgtgtttga	gccatcagaa	660
gcagagatct	cccacaccca	aaaggccaca	ctggtgtgcc	tggccacagg	cttctacccc	720
gaccacgtgg	agctgagctg	gtgggtgaat	gggaaggagg	tgcacagtgg	ggtctgcaca	780
gacccgcagc	ccctcaagga	gcagcccgcc	ctcaatgact	ccagatacgc	tctgagcagc	840
cgcctgaggg	tctcggccac	cttctggcag	gacccccgca	accacttccg	ctgtcaagtc	900
cagttctacg	ggctctcgga	gaatgacgag	tggacccagg	atagggccaa	acccgtcacc	960
cagatcgtca	gcgccgaggc	ctggggtaga	gcagactaac	tcgag		1005

PL 208 712 B1

131

gttccacgcg	gtagtggagg cggtggttcc ggagacacgc gttagtaggt cgacggaggc	180
ggtgggggta	gaatcgcccg gctggaggaa aaagtgaaaa ccttgaaagc tcagaactcg	240
gagctggcgt	ccacggccaa catgctcagg gaacaggtgg cacagcttaa acagaaagtc	300
atgaactact	aggatcc	317

<210> 181 <211> 884 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 181 ggatccagca	tggtgtgtct	gaagctccct	ggaggctcct	gcatgacagc	gctgacagtg	60
acactgatgg	tgctgagctc	cccactggct	ttgtccggag	acaccggaga	caccggacag	120
aaggaagtgg	agcagaactc	tggacccctc	agtgttccag	agggagccat	tgcctctctc	180
aactgcactt	acagtgaccg	aggttcccag	tccttcttct	ggtacagaca	atattctggg	240
aaaagccctg	agttgataat	gtccatatac	tccaatggtg	acaaagaaga	tggaaggttt	300
acagcacagc	tcaataaagc	cagccagtat	gtttctctgc	tcatcagaga	ctcccagccc	360
agtgattcag	ccacctacct	ctgtgccgtt	acaactgaca	gctgggggaa	attgcagttt	420
ggagcaggga	cccaggttgt	ggtcacccca	gatatccaga	accctgaccc	tgccgtgtac	480
cagctgagag	actctaaatc	cagtgacaag	tctgtctgcc	tattcaccga	ttttgattct	540
caaacaaatg	tgtcacaaag	taaggattct	gatgtgtata	tcacagacaa	atgtgtgcta	600
gacatgaggt	ctatggactt	caagagcaac	agtgctgtgg	cctggagcaa	caaatctgac	660
tttgcatgtg	caaacgcctt	caacaacagc	attattccag	aagacacctt	cttccccagc	720
ccagaaagtt	cctaagtcga	cggaggcggt	gggggtagaa	tcgcccggct	ggaggaaaaa	780
gtgaaaacct	tgaaagctca	gaactcggag	ctggcgtcca	cggccaacat	gctcagggaa	840
caggtggcac	agcttaaaca	gaaagtcatg	aactactagg	atcc		884

<210> 182 <211> 1004

<212> DNA <213> Home	i sapiens
<400> 182 ggatccagca	tggtgtgtct	gaagctccct	ggaggctcct	gcatgacagc	gctgacagtg	60
acactgatgg	tgctgagctc	cccactggct	ttgtccggag	acaccggaga	caccggaaac	120
gctggtgtca	ctcagacccc	aaaattccag	gtcctgaaga	caggacagag	catgacactg	180
cagtgtgccc	aggatatgaa	ccatgaatac	atgtcctggt	atcgacaaga	cccaggcatg	240
gggctgaggc	tgatteatta	ctcagttggt	gctggtatca	ctgaccaagg	agaagtcccc	300

132

PL 208 712 B1

aatggctaca	atgtctccag	atcaaccaca	gaggatttcc	cgctcaggct	gctgtcggct	360
gctccctccc	agacatctgt	gtacttctgt	gccagcaggc	cgggactagc	gggagggcga	420
ccagagcagt	acttcgggcc	gggcaccagg	ctcacggtca	cagaggacct	gaaaaacgtg	480
ttcccacccg	aggtcgctgt	gtttgagcca	tcagaagcag	agatctccca	cacccaaaag	540
gccacactgg	tgtgcctggc	cacaggcttc	taccccgacc	acgtggagct	gagctggtgg	600
gtgaatggga	aggaggtgca	cagtggggtc	tgcacagacc	cgcagcccct	caaggagcag	660
cccgccctca	atgactccag	atacgctctg	agcagccgcc	tgagggtctc	ggccaccttc	720
tggcaggacc	cccgcaacca	cttccgctgt	caagtccagt	tctacgggct	ctcggagaat	780
gacgagtgga	cccaggatag	ggccaaaccc	gtcacccaga	tcgtcagcgc	cgaggcctgg	840
ggtagagcag	actaagtcga	cggaggcggt	gggggtagaa	tcgcccggct	ggaggaaaaa	900
gtgaaaacct	tgaaagctca	gaactcggag	ctggcgtcca	cggccaacat	gctcagggaa	960
caggtggcac	agcttaaaca	gaaagtcatg	aactactagg	atcc		1004

<210> 183 <211> 206 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 183

Met Gin Lys Glu Val Glu Gin Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu 15 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gin 20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gin. Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile 35 40 45

Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala 50 55 60

Gin Leu Asn Lys Ala Ser Gin Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser 65 70 75 80

Gin Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Thr Asp Ser 85 90 95

Trp Gly Lys Leu Gin Phe Gly Ala Gly Thr Gin Val Val Val Thr Pro 100 105 110

PL 208 712 B1

133

Asp

Ile

Gin 115

Asn Pro

Asp

Pro Ala Val 120

Tyr

Gin

Leu

Arg 125

Asp

Ser

Lys

Ser

Asp

Lys

Ser

Val

Cys

Leu

Phe

Thr

Asp

Phe

Asp

Ser

Gin

Thr

130

135

140

Asn

Val

Ser

Gin

Ser

Lys

Asp

Ser

Asp

Val

Tyr

Ile

Thr

Asp

Lys

Cys

145

150

155

160

Val

Leu

Asp

Met

Arg

Ser

Met

Asp

Phe

Lys

Ser

Asn

Ser

Ala

Val

Ala

165

170

175

Trp

Ser

Asn

Lys

Ser

Asp

Phe

Ala

Cys

Ala

Asn

Ala

Phe

Asn

Ser

180

185

190

Ile

Pro

Glu

Asp

Thr

Phe

Pro

Ser

Pro

Glu

Ser

195

200

205

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Rozpuszczalny receptor komórek T (sTCR), zawierają cy (i) cał o ść lub część ł a ń cucha α TCR, z wyjątkiem jego domeny transbłonowej, oraz (ii) całość lub część łańcucha β TCR, z wyjątkiem jego domeny transbłonowej, gdzie każdy z (i) i (ii) zawiera funkcjonalną domenę zmienną i co najmniej część domeny stałej łańcucha TCR, znamienny tym, że (i) i (ii) są połączone ze sobą wiązaniem disulfidowym pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za

Thr 48 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 57 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01;

Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 77 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01;

Tyr 10 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 17 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01;

Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Asp 59 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01; albo Ser 15 egzonu 1 TRAC*01 i Glu 15 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
2. sTCR według zastrz. 1, znamienny tym, ż e (i) i/lub (ii) zawiera całość zewnątrzkomórkowej stałej domeny Ig łańcucha TCR.
3. sTCR według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że (i) i/lub (ii) zawiera całość domeny zewnątrzkomórkowej łańcucha TCR.
4. sTCR wedł ug zastrz. 1-3, znamienny tym, ż e mi ę dzył ań cuchowe wią zanie disulfidowe nie występuje w natywnym TCR.
5. sTCR według zastrz. 1-4, znamienny tym, że niesparowana reszta cysteiny obecna w natywnym łańcuchu β TCR nie występuje.
6. sTCR według zastrz. 1-5, znamienny tym, ż e każdy z (i) i (ii) zawiera funkcjonalną domenę zmienną pierwszego TCR zfuzowaną z całością lub częścią stałej domeny drugiego TCR, przy czym pierwszy i drugi TCR pochodzą z tego samego gatunku.
7. sTCR według zastrz. 6, znamienny tym, ż e domeny stałe drugiego TCR są skrócone na N-końcu od reszt tworzących nienatywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe.
8. sTCR wedł ug zastrz. 1-7, znamienny tym, ż e jeden lub obydwa ł a ń cuchy są przeprowadzone w pochodną lub zfuzowane z ugrupowaniem na swoim C- i/lub N-końcu z którym może być zfuzowane ugrupowanie.
9. sTCR według zastrz. 1-8, znamienny tym, że jeden lub obydwa łańcuchy zawierają resztę cysteiny na swoim C- i/lub N-końcu, z którym może być zfuzowane ugrupowanie.
10. sTCR według zastrz. 1-9, znamienny tym, że ponadto zawiera wykrywalny znacznik.

134

PL 208 712 B1
11. sTCR według zastrz. 1 - 10, znamienny tym, że jest związany ze środkiem terapeutycznym.
12. Rozpuszczalna αβ-postać receptora komórek T (sTCR), znamienna tym, że kowalencyjne wiązanie disulfidowe łączy reszty cysteiny podstawione za

Thr 48 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 57 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01;

Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 77 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01;

Tyr 10 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 17 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01;

Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Asp 59 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01 albo

Ser 15 egzonu 1 TRAC*01 i Glu 15 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
13. sTCR według zastrz. 12, znamienny tym, że międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe nie występuje w natywnym TCR.
14. sTCR według zastrz. 12 albo 13, znamienny tym, że niesparowana reszta cysteiny obecna w natywnym łańcuchu β TCR nie występuje.
15. sTCR według zastrz. 14, znamienny tym, że każdy z (i) i (ii) zawiera funkcjonalną domenę zmienną pierwszego TCR zfuzowaną z całością lub częścią stałej domeny drugiego TCR, przy czym pierwszy i drugi TCR pochodzą z tego samego gatunku.
16. sTCR według zastrz. 15, znamienny tym, że domeny stałe drugiego TCR są skrócone na N-końcu od reszt tworzących nienatywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe.
17. sTCR według zastrz. 12 - 16, znamienny tym, że jeden lub obydwa łańcuchy są przeprowadzone w pochodną lub zfuzowane z ugrupowaniem na swoim C- i/lub N-końcu z którym może być zfuzowane ugrupowanie.
18. sTCR według zastrz. 12 - 17, znamienny tym, że jeden lub obydwa łańcuchy zawierają resztę cysteiny na swoim C- i/lub N-końcu, z którym może być zfuzowane ugrupowanie.
19. sTCR według zastrz. 12 - 18, znamienny tym, że ponadto zawiera wykrywalny znacznik.
20. sTCR według zastrz. 12 - 19, znamienny tym, że jest związany ze środkiem terapeutycznym.
21. Rozpuszczalny receptor komórek T (sTCR), znamienny tym, że zawiera (i) całość lub część łańcucha α TCR, z wyjątkiem jego domeny transbłonowej, oraz (ii) całość lub część łańcucha β TCR, z wyjątkiem jego domeny transbłonowej, gdzie każdy z (i) i (ii) zawiera funkcjonalną domenę zmienną i co najmniej część domeny stałej łańcucha TCR i są one połączone ze sobą wiązaniem disulfidowym pomiędzy resztami domeny stałej, nie występującym w natywnym TCR i gdzie międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe nie występuje w natywnym TCR.
22. sTCR według zastrz. 21, znamienny tym, że zawiera całość zewnątrzkomórkowej stałej domeny Ig łańcucha TCR.
23. sTCR według zastrz. 21 albo 22, znamienny tym, że (i) i/lub (ii) zawiera całość domeny zewnątrzkomórkowej łańcucha TCR.
24. sTCR według zastrz. 21 - 23, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi resztami, których węgle β są od siebie w odległości mniejszej niż 0,6 nm w natywnej strukturze TCR.
25. sTCR według zastrz. 21 - 24, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 48 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 57 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
26. sTCR według zastrz. 21 - 24, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 77 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
27. sTCR według zastrz. 21 - 24, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Tyr 10 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 17 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
28. sTCR według zastrz. 21 - 24, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Asp 59 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
29. sTCR według zastrz. 21 - 24, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Ser 15 egzonu 1 TRAC*01 i Glu 15 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
30. sTCR według zastrz. 21 - 29, znamienny tym, że natywne łańcuchy α i β TCR są skrócone na C-końcu, tak, że reszty cysteiny tworzące natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe są usunięte.

PL 208 712 B1

135
31. sTCR według zastrz. 21 - 29, znamienny tym, że reszty cysteiny tworzące natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe są zastąpione inną resztą.
32. sTCR według zastrz. 31, znamienny tym, że reszty cysteiny tworzące natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe są zastąpione seryną lub alaniną.
33. sTCR według zastrz. 21 - 32, znamienny tym, że niesparowana reszta cysteiny obecna w natywnym ł a ń cuchu β TCR nie występuje.
34. sTCR według zastrz. 21, 22 i 24 - 33, znamienny tym, że każdy z (i) i (ii) zawiera funkcjonalną domenę zmienną pierwszego TCR zfuzowaną z całością lub częścią stałej domeny drugiego TCR, przy czym pierwszy i drugi TCR pochodzą z tego samego gatunku.
35. sTCR według zastrz. 34, znamienny tym, że domeny stałe drugiego TCR są skrócone na N-końcu od reszt tworzących nienatywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe.
36. sTCR według zastrz. 21 - 35, znamienny tym, że jeden lub obydwa łańcuchy są przeprowadzone w pochodną lub zfuzowane z ugrupowaniem na swoim C- i/lub N-końcu z którym może być zfuzowane ugrupowanie.
37. sTCR według zastrz. 21 - 36, znamienny tym, że jeden lub obydwa łańcuchy zawierają resztę cysteiny na swoim C- i/lub N-końcu, z którym może być zfuzowane ugrupowanie.
38. sTCR według zastrz. 21 - 37, znamienny tym, że ponadto zawiera wykrywalny znacznik.
39. sTCR według zastrz. 21 - 38, znamienny tym, że jest związany ze środkiem terapeutycznym.
40. Rozpuszczalna αβ-postać receptora komórek T (sTCR), znamienna tym, że kowalencyjne wiązanie disulfidowe łączy resztę regionu immunoglobulinowego domeny stałej łańcucha α z resztą regionu immunoglobulinowego domeny stałej łańcucha β, przy czym międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe nie występuje w natywnym TCR.
41. sTCR według zastrz. 40, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi resztami, których węgle β są od siebie w odległości mniejszej niż 0,6 nm w natywnej strukturze TCR.
42. sTCR według zastrz. 40 albo 41, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 48 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 57 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
43. sTCR według zastrz. 40 albo 41, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 77 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
44. sTCR według zastrz. 40 albo 41, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Tyr 10 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 17 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
45. sTCR według zastrz. 40 albo 41, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Asp 59 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
46. sTCR według zastrz. 40 albo 41, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Ser 15 egzonu 1 TRAC*01 i Glu 15 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
47. sTCR według zastrz. 40 - 46, znamienny tym, że natywne łańcuchy α i β TCR są skrócone na C-końcu, tak, że reszty cysteiny tworzące natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe są usunięte.
48. sTCR według zastrz. 40 - 46, znamienny tym, że reszty cysteiny tworzące natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe są zastąpione inną resztą.
49. sTCR według zastrz. 48, znamienny tym, że reszty cysteiny tworzące natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe są zastąpione seryną lub alaniną.
50. sTCR według zastrz. 40 - 49, znamienny tym, że niesparowana reszta cysteiny obecna w natywnym łańcuchu β TCR nie występuje.
51. sTCR według zastrz. 41 - 50, znamienny tym, że każdy z (i) i (ii) zawiera funkcjonalną domenę zmienną pierwszego TCR zfuzowaną z całością lub częścią stałej domeny drugiego TCR, przy czym pierwszy i drugi TCR pochodzą z tego samego gatunku.
52. sTCR według zastrz. 51, znamienny tym, że domeny stałe drugiego TCR są skrócone na N-końcu od reszt tworzących nienatywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe.

136

PL 208 712 B1
53. sTCR według zastrz. 40 - 52, znamienny tym, że jeden lub obydwa łańcuchy są przeprowadzone w pochodną lub zfuzowane z ugrupowaniem na swoim C- i/lub N-końcu z którym może być zfuzowane ugrupowanie.
54. sTCR według zastrz. 40 - 53, znamienny tym, że jeden lub obydwa łańcuchy zawierają resztę cysteiny na swoim C- i/lub N-końcu, z którym może być zfuzowane ugrupowanie.
55. sTCR według zastrz. 40 - 54, znamienny tym, że ponadto zawiera wykrywalny znacznik.
56. sTCR według zastrz. 40 - 55, znamienny tym, że jest związany ze środkiem terapeutycznym.
57. Wielowartościowy kompleks receptora komórek T (TCR), znamienny tym, że zawiera wiele sTCR określonych w zastrz. 1 - 25.
58. Kompleks według zastrz. 57, znamienny tym, że zawiera multimer sTCR.
59. Kompleks według zastrz. 58, znamienny tym, że zawiera dwie lub trzy lub cztery lub większą liczbę cząsteczek receptora komórek T, związanych ze sobą, korzystnie przez cząsteczkę łącznikową.
60. Kompleks według zastrz. 57 - 59, znamienny tym, że sTCR lub multimery sTCR są obecne w dwuwarstwie lipidowej i są połączone z cząstką.
61. Sposób wykrywania kompleksów MHC-peptyd, polegający na tym, że:

(i) dostarcza się rozpuszczalny TCR lub wielowartościowy kompleks receptora komórek T;

(ii) kontaktuje się rozpuszczalny TCR lub wielowartościowego kompleksu TCR z kompleksami MHC-peptyd; oraz (iii) wykrywa się wiązanie rozpuszczalnego TCR lub wielowartościowego kompleksu TCR z kompleksami MHC-peptyd, znamienny tym, że stosuje się rozpuszczalny TCR określony w zastrz. 1 56 lub wielowartościowy kompleks receptora komórek T określony w zastrz. 57 - 60,
62. Środek farmaceutyczny zawierający substancję czynną razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera sTCR określony w zastrz. 1 - 56 i/lub wielowartościowy kompleks TCR określony w zastrz. 57 - 60.
63. Cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że zawiera sekwencję kodującą (i) lub (ii) sTCR określonego w zastrz. 1 - 56 lub sekwencję do niej komplementarną.
64. Wektor, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 63.
65. Komórka gospodarz, znamienna tym, że zawiera wektor określony w zastrz. 64.
66. Sposób otrzymywania (i) całości lub części łańcucha α TCR lub (ii) całości lub części łańcucha β TCR, określonych w zastrz. 1 - 56, polegający na inkubacji komórki gospodarza w warunkach wywołujących ekspresję peptydu, a następnie oczyszczeniu polipeptydu, znamienny tym, że stosuje się komórkę gospodarza określoną w zastrz. 65,
67. Sposób według zastrz. 66, znamienny tym, że ponadto polega na mieszaniu (i) i (ii) w odpowiednich warunkach ponownego zwijania.
68. Sposób otrzymywania rozpuszczalnego receptora komórek T (sTCR), polegający na tym, że: inkubuje się komórkę gospodarza, zawierają wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego (i) całość lub część łańcucha α TCR, z wyjątkiem jego domeny transbłonowej, oraz komórkę gospodarza, zawierającą wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego (ii) całość lub część łańcucha β TCR, z wyjątkiem jego domeny transbłonowej, w warunkach wywołujących ekspresję (i) i (ii);

oczyszcza się (i) i (ii); oraz miesza się (i) i (ii) w warunkach ponownego zwijania, znamienny tym, że każdy z (i) i (ii) zawiera funkcjonalną domenę zmienną i co najmniej część domeny stałej łańcucha TCR oraz miesza się (i) i (ii) w warunkach ponownego zwijania tak że są one połączone ze sobą wiązaniem disulfidowym pomiędzy resztami domeny stałej, nie występującym w natywnym TCR.
69. Sposób według zastrz. 68, znamienny tym, że (i) i/lub (ii) zawiera całość zewnątrzkomórkowej stałej domeny Ig łańcucha TCR.
70. Sposób według zastrz. 68 albo 69, znamienny tym, że (i) i/lub (ii) zawiera całość domeny zewnątrzkomórkowej łańcucha TCR.
71. Sposób według zastrz. 68 - 70, znamienny tym, że międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe nie występuje w natywnym TCR.
72. Sposób według zastrz. 71, znamienny tym, że natywne łańcuchy α i β TCR są skrócone na C-końcu, tak, że reszty cysteiny tworzące natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe są usunięte.
73. Sposób według zastrz. 71, znamienny tym, że reszty cysteiny tworzące natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe są zastąpione inną resztą.

PL 208 712 B1

137
74. Sposób według zastrz. 73, znamienny tym, że reszty cysteiny tworzące natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe są zastąpione seryną lub alaniną.
75. Sposób według zastrz. 68 - 74, znamienny tym, że niesparowana reszta cysteiny obecna w natywnym ł a ń cuchu β TCR nie występuje.
76. Sposób według zastrz. 68 - 75, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi resztami, których węgle β są od siebie w odległości mniejszej niż 0,6 nm w natywnej strukturze TCR.
77. Sposób według zastrz. 68 - 76, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 48 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 57 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
78. Sposób według zastrz. 68 - 76, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 77 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
79. Sposób według zastrz. 68 - 76, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Tyr 10 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 17 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
80. Sposób według zastrz. 68 - 76, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Asp 59 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
81. Sposób według zastrz. 68 - 76, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Ser 15 egzonu 1 TRAC*01 i Glu 15 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
82. Sposób według zastrz. 68, 69 i 71 - 81, znamienny tym, że każdy z (i) i (ii) zawiera funkcjonalną domenę zmienną pierwszego TCR zfuzowaną z całością lub częścią stałej domeny drugiego TCR, przy czym pierwszy i drugi TCR pochodzą z tego samego gatunku.
83. Sposób według zastrz. 82, znamienny tym, że domeny stałe drugiego TCR są skrócone na N-końcu od reszt tworzących nienatywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe.
84. Sposób według zastrz. 68 - 83, znamienny tym, że jeden lub obydwa łańcuchy są przeprowadzone w pochodną lub zfuzowane z ugrupowaniem na swoim C- i/lub N-końcu.
85. Sposób według zastrz. 68 - 84, znamienny tym, że jeden lub obydwa łańcuchy zawierają resztę cysteiny na swoim C- i/lub N-końcu, z którym może być zfuzowane ugrupowanie.
86. Sposób według zastrz. 68 - 85, znamienny tym, że sTCR ponadto zawiera wykrywalny znacznik.
87. Sposób według zastrz. 68 - 86, znamienny tym, że sTCR jest związany ze środkiem terapeutycznym.
88. Sposób według zastrz. 68 - 87, znamienny tym, że ponadto polega na połączeniu zawierającego wiele sTCR z wytworzeniem wielowartościowego kompleksu receptora komórek T (TCR).
89. Sposób według zastrz. 88, znamienny tym, że sTCR są połączone z wytworzeniem multimeru sTCR.
90. Sposób według zastrz. 89, znamienny tym, że dwie lub trzy lub cztery lub większa liczba cząsteczek receptora komórek T są związane ze sobą, korzystnie przez cząsteczkę łącznikową.
91. Sposób według zastrz. 88, 89 albo 90, znamienny tym, że sTCR lub multimery sTCR są obecne w dwuwarstwie lipidowej i są połączone z cząstką.
92. Sposób otrzymywania rozpuszczalnej αβ-postaci receptora komórek T (sTCR), polegający na tym, że:

inkubuje się komórkę gospodarza, zawierającą wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego łańcuch α TCR, oraz komórkę gospodarza, zawierającą wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego łańcuch β TCR, w warunkach wywołujących ekspresję odpowiednich łańcuchów TCR, oczyszcza się odpowiednie łańcuchy TCR; oraz miesza się odpowiednie łańcuchy TCR w warunkach ponownego zwijania, znamienny tym, że odpowiednie łańcuchy TCR miesza się tak że kowalencyjne wiązanie disulfidowe łączy resztę regionu immunoglobulinowego domeny stałej łańcucha α z resztą regionu immunoglobulinowego domeny stałej łańcucha β.
93. Sposób według zastrz. 92, znamienny tym, że międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe nie występuje w natywnym TCR.

138

PL 208 712 B1
94. Sposób wedł ug zastrz. 93, znamienny tym, ż e natywne ł a ń cuchy α i β TCR są skrócone na C-końcu, tak, że reszty cysteiny tworzące natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe są usunięte.
95. Sposób według zastrz. 93, znamienny tym, ż e reszty cysteiny tworzące natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe są zastąpione inną resztą.
96. Sposób według zastrz. 95, znamienny tym, ż e reszty cysteiny tworzące natywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe są zastąpione seryną lub alaniną.
97. Sposób według zastrz. 92 - 96, znamienny tym, że niesparowana reszta cysteiny obecna w natywnym ł a ń cuchu β TCR nie występuje.
98. Sposób według zastrz. 92 - 97, znamienny tym, ż e wią zanie disulfidowe, które nie wystę puje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi resztami, których węgle β są od siebie w odległości mniejszej niż 0,6 nm w natywnej strukturze TCR.
99. Sposób według zastrz. 92 - 98, znamienny tym, ż e wią zanie disulfidowe, które nie wystę puje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 48 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 57 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
100. Sposób według zastrz. 92 - 98, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 77 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
101. Sposób według zastrz. 92 - 98, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Tyr 10 egzonu 1 TRAC*01 i Ser 17 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
102. Sposób według zastrz. 92 - 98, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Thr 45 egzonu 1 TRAC*01 i Asp 59 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
103. Sposób według zastrz. 92 - 98, znamienny tym, że wiązanie disulfidowe, które nie występuje w natywnym TCR, istnieje pomiędzy resztami cysteiny podstawionymi za Ser 15 egzonu 1 TRAC*01 i Glu 15 egzonu 1 TRBC1*01 lub TRBC2*01.
104. Sposób według zastrz. 92, 93 - 103, znamienny tym, że każdy z (i) i (ii) zawiera funkcjonalną domenę zmienną pierwszego TCR zfuzowaną z całością lub częścią stałej domeny drugiego TCR, przy czym pierwszy i drugi TCR pochodzą z tego samego gatunku.
105. Sposób według zastrz. 104, znamienny tym, że domeny stałe drugiego TCR są skrócone na N-końcu od reszt tworzących nienatywne międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe.
106. Sposób według zastrz. 92 - 105, znamienny tym, że jeden lub obydwa łańcuchy są przeprowadzone w pochodną lub zfuzowane z ugrupowaniem na swoim C- i/lub N-końcu.
107. Sposób według zastrz. 92 - 106, znamienny tym, że jeden lub obydwa łańcuchy zawierają resztę cysteiny na swoim C- i/lub N-końcu, z którym może być zfuzowane ugrupowanie.
108. Sposób według zastrz. 92 - 107, znamienny tym, że sTCR ponadto zawiera wykrywalny znacznik.
109. Sposób według zastrz. 92 - 108, znamienny tym, że sTCR jest związany ze środkiem terapeutycznym.
110. Sposób według zastrz. 92 - 109, znamienny tym, że ponadto polega na połączeniu zawierającego wiele sTCR z wytworzeniem wielowartościowego kompleksu receptora komórek T (TCR).
111. Sposób według zastrz. 110, znamienny tym, że sTCR są połączone z wytworzeniem multimeru sTCR.
112. Sposób według zastrz. 111, znamienny tym, że dwie lub trzy lub cztery lub większa liczba cząsteczek receptora komórek T są związane ze sobą, korzystnie przez cząsteczkę łącznikową.
113. Sposób według zastrz. 110, 111 albo 112, znamienny tym, że sTCR lub multimery sTCR są obecne w dwuwarstwie lipidowej i są połączone z cząstką.
114. Sposób wykrywania kompleksów MHC-peptyd, polegający na tym, że:

(i) dostarcza się rozpuszczalny TCR lub wielowartościowy kompleks receptora komórek T;

(ii) kontaktuje się rozpuszczalny TCR lub wielowartościowego kompleksu TCR z kompleksami MHC-peptyd; oraz (iii) wykrywa się wiązanie rozpuszczalnego TCR lub wielowartościowego kompleksu TCR z kompleksami MHC-peptyd, znamienny tym, że stosuje się rozpuszczalny TCR wytworzony sposobem określonym w zastrz. 68 - 87 i 92 - 109 lub wielowartościowy kompleks receptora komórek T wytworzony sposobem określonym w zastrz. 88 - 91 i 110 - 113.