KR20210059715A - 통합된 핵산 평가 방법 - Google Patents

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KR20210059715A
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아드리안 랭햄 브릭스
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주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드
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Abstract

세포 요법에 사용되는 유전자 조작된 세포와 같은 유전자 조작된 세포의 유전체에 통합된 핵산 서열을 평가하는 방법이 제공된다. 세포는 일반적으로 폴리뉴클레오타이드의 도입 및 폴리뉴클레오타이드 내 특정 서열, 예컨대 재조합 서열을 세포의 유전체로 통합함으로써 재조합 수용체와 같은 재조합 단백질을 발현하도록 유전적으로 조작된다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 통합된 핵산과 통합되지 않은 잔류 핵산을 구분하는 데 사용될 수 있다.

Description

통합된 핵산 평가 방법
본 발명은 일부 측면에서 세포 요법에 사용되는 유전자 조작된 세포와 같은 유전자 조작된 세포의 유전체(genome)에 통합된 핵산 서열을 평가하는 방법에 관한 것이다. 세포는 일반적으로 폴리뉴클레오타이드의 도입 및 폴리뉴클레오타이드 내의 특정 서열, 예컨대 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 세포의 유전체로 통합함으로써 재조합 수용체와 같은 재조합 단백질을 발현하도록 유전적으로 조작된다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 통합된 핵산과 통합되지 않은 잔류 핵산을 구분하는 데 사용될 수 있다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 8월 9일 출원된 미국 가출원 제62/716,972호 제목 “통합된 핵산 평가 방법”의 우선권을 주장하고, 이의 내용들은 그 전체가 참조로 포함된다.
서열 목록의 참조 포함
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록은 2019년 8월 3일에 생성된 735042016840SeqList.txt라는 제목의 파일로 제공되며 파일 크기는 53.2 킬로바이트이다. 전자 형식의 서열 목록 내 정보는 그 전체가 참조로 포함된다.
질병 및 병태를 치료하기 위한 입양 세포 요법과 같이 세포를 유전적으로 조작하기 위해 도입된 핵산의 복제수를 결정하기 위해 이용할 수 있는 방법들이 있다. 입양 세포 요법(키메라 항원 수용체 (CAR) 및/또는 기타 재조합 항원 수용체와 같이 관심있는 질병 또는 장애에 특이적인 재조합 수용체를 발현하는 세포의 투여를 포함)의 경우 통합된 핵산을, 일부 경우에는 대상체에게 세포를 투여하기 전에 통합되지 않은 잔류 핵산을 시기 적절하고 정확하게 평가해야 할 필요가 있을 수 있다. 개선된 접근법이 필요하다. 상기 필요를 충족시키는 방법 키트가 제공된다.
전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하는 방법이 본원에 제공된다. 임의 구현예의 일부에서, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을 분리하는 단계 - 상기 하나 이상의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전이 유전자 서열을 포함하는 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및 (b) 상기 고분자량 분획으로부터, 하나 이상의 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계를 포함한다.
전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을 분리하는 단계 - 상기 하나 이상의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및 (b) 하나 이상의 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계를 포함한다.
전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하는 방법이 본원에 또 제공되며, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을 분리하는 단계 - 상기 하나 이상의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전이 유전자 서열을 포함하는 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및 (b) 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계를 포함한다.
임의 구현예의 일부에서, 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정함으로써, 하나 이상의 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열을 평가한다.
전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하는 방법이 본원에 또 제공되며, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을 분리하는 단계 - 상기 하나 이상의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전이 유전자 서열을 포함하는 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및 (b) 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계 - 상기 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열은 상기 하나 이상의 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열을 나타냄 - 를 포함한다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열은 하나 이상의 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열을 나타낸다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, (b)에서 하나 이상의 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수(copy number)를 결정하는 단계를 포함한다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 분리하는 단계 전에, 상기 방법은 하나 이상의 세포로부터 디옥시리보핵산(DNA)을 단리하는 단계를 포함한다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 하나 이상의 세포 내에서 2배체 유전체당 또는 세포당 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 결정하는 단계를 포함한다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 세포는 세포의 집단을 포함하고, 여기서 상기 집단의 복수의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함한다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 세포는 세포의 집단을 포함하고, 여기서 상기 집단의 복수의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 것으로 의심된다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 복제수는 세포의 집단 중에서 2배체 유전체당 또는 세포당 평균 복제수이다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 분리하는 단계 전에, 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 예를 들어 세포의 집단 중의 세포에 도입되었으며 그 결과 하나 이상의 세포 중 적어도 하나의 조작된 세포가 생성된다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 적어도 하나의 조작된 세포는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 도입 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 임의적으로 (약) 37ºC ± 2°C에서, 96시간을 초과하여 인큐베이션되지 않았다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 적어도 하나의 조작된 세포는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 도입 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 임의적으로 (약) 37ºC ± 2°C에서, 72시간을 초과하여 인큐베이션되지 않았다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 적어도 하나의 조작된 세포는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 도입 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 임의적으로 (약) 37ºC ± 2°C에서, 48시간을 초과하여 인큐베이션되지 않았다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 세포는 DNA의 고분자량 분획의 분리 전에 냉동 보존되었다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 세포는 세포주이다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 세포는 대상체의 샘플에서 얻은 1차 세포이다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 세포는 면역 세포이다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 상기 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 상기 T 세포는 CD3+, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포이다.
대상체의 생물학적 샘플 내 전이 유전자 서열을 평가하는 방법이 본원에 제공된다. 임의 구현예의 일부에서, 제공된 방법은 (a) 대상체의 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을 분리하는 단계 - 여기서 상기 생물학적 샘플은 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및 (b) 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정함으로써 생물학적 샘플 전체 또는 일부에 존재하는 전이 유전자 서열을 평가하는 단계를 포함한다.
대상체의 생물학적 샘플 내 전이 유전자 서열을 평가하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 (a) 대상체의 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을 분리하는 단계 - 여기서 상기 생물학적 샘플은 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및 (b) 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정함으로써 생물학적 샘플 전체 또는 일부에 존재하는 전이 유전자 서열을 평가하는 단계를 포함한다.
대상체의 생물학적 샘플 내 전이 유전자 서열을 평가하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 (a) 대상체의 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을 분리하는 단계 - 여기서 상기 생물학적 샘플은 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및 (b) 생물학적 샘플 전체 또는 일부 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계를 포함한다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, (b)에서 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 생물학적 샘플의 전체 또는 일부 내 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 결정하는 단계를 포함한다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 분리하는 단계 전에 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 세포에서 DNA를 단리하는 단계가 포함된다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 생물학적 샘플은 전이 유전자 서열을 포함하는 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하는 조성물이 투여된 대상체에서 수득된다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플(tissue sample) 또는 체액 샘플이다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플이고 상기 조직은 종양이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 종양 생검이다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 생물학적 샘플은 체액 샘플이고 상기 체액 샘플은 혈액 또는 혈청 샘플이다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 분리하는 단계 전에, 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 예를 들어 세포의 집단 중의 세포에 도입되었으며 그 결과 하나 이상의 세포 중 적어도 하나의 조작된 세포가 생성된다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 생물학적 샘플 내 하나 이상의 세포는 면역 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD3+, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포이다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 분리하는 단계는 펄스 필드 겔 전기영동 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 분리하는 단계는 펄스 필드 겔 전기영동에 의해 수행된다.
또한, 전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하는 방법이 본원에 제공된다. 임의의 구현예의 일부에서, 상기 방법은 (a) 세포의 집단으로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을, 펄스 필드 겔 전기영동에 의해, 분리하는 단계 - 상기 세포의 집단은 복수의 조작된 세포를 포함하고 각각의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전이 유전자 서열을 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및 (b) 고분자량 분획 내의 전이 유전자 서열의 2배체 유전체당 또는 세포당 평균 복제수를 결정함으로써, 세포의 집단의 복수의 조작된 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열을 평가하는 단계를 포함한다.
또한, 전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하는 방법이 본원에 제공된다. 임의의 구현예의 일부에서, 상기 방법은 (a) 세포의 집단으로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을, 펄스 필드 겔 전기영동에 의해, 분리하는 단계 - 상기 세포의 집단은 복수의 조작된 세포를 포함하고 각각의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전이 유전자 서열을 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및 (b) 고분자량 분획으로부터, 세포의 집단의 복수의 조작된 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 2배체 유전체당 또는 세포당 평균 복제수를 결정하는 단계를 포함한다.
전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 (a) 세포의 집단으로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을, 펄스 필드 겔 전기영동에 의해, 분리하는 단계 - 상기 세포의 집단은 복수의 조작된 세포를 포함하고 각각의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및 (b) 세포의 집단의 복수의 조작된 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 2배체 유전체당 또는 세포당 평균 복제수를 결정하는 단계를 포함한다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 분리하는 단계 전에, 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 예를 들어 세포의 집단 중의 세포에 도입되며 그 결과 세포의 집단의 복수의 조작된 세포 중 적어도 하나가 생성된다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 세포의 집단은 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 조작된 세포에 도입한 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 임의적으로 (약) 37°C ± 2°C에서, 96시간을 초과하여 인큐베이션되지 않았다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 세포의 집단은 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 조작된 세포에 도입한 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 임의적으로 (약) 37°C ± 2°C에서, 72시간을 초과하여 인큐베이션되지 않았다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 세포의 집단은 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 조작된 세포에 도입한 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 임의적으로 (약) 37°C ± 2°C에서, 48시간을 초과하여 인큐베이션되지 않았다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 세포의 집단은 DNA의 고분자량 분획의 분리 전에 냉동 보존되었다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 고분자량 분획은 (약) 15 킬로베이스(kb)를 초과한다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 고분자량 분획은 (약) 17.5 킬로베이스(kb)를 초과한다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 고분자량 분획은 (약) 20 킬로베이스(kb)를 초과한다.
임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열은 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 연결된 조절 요소를 포함한다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 수행된다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, PCR은 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 디지털 PCR 또는 액적 디지털 PCR이다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, PCR은 액적 디지털 PCR이다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, PCR은 전이 유전자 서열의 적어도 일부에 상보적이거나 적어도 일부를 특이적으로 증폭할 수 있는 하나 이상의 프라이머를 사용하여 수행된다. 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 프라이머는 조절 요소의 서열에 상보적이거나 이 서열을 특이적으로 증폭할 수 있다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA의 질량 또는 중량당, 임의적으로 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA의 마이크로그램당 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함한다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA의 마이크로그램당 전이 유전자 서열의 질량 또는 중량을 마이크로그램 단위로 평가하는 단계를 포함한다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 하나 이상의 세포당, 임의적으로 CD3+, CD4+ 및/또는 CD8+ 세포당, 및/또는 재조합 단백질을 발현하는 세포당 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함한다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 생물학적 샘플 내에서 2배체 유전체당 또는 세포당 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함한다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 복제수는 생물학적 샘플 내 하나 이상의 세포 중에서 2배체 유전체당 또는 세포당 평균 복제수이다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 생물학적 샘플의 체적당, 임의적으로 생물학적 샘플의 마이크로리터당 또는 밀리리터당 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함한다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 대상체의 체중 또는 체표면적당 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함한다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계 및 질량, 중량 또는 복제수를 고분자량 분획 내 기준 유전자의 질량, 중량 또는 복제수로 또는 표준 곡선으로 정규화하는 단계를 포함한다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 기준 유전자는 하우스키핑 유전자이다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 기준 유전자는 알부민(ALB)을 암호화하는 유전자이다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 기준 유전자는 리보뉴클레아제 P 단백질 서브유닛 p30(RPP30)을 암호화하는 유전자이다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 단리된 DNA 내 기준 유전자의 복제수를 결정하는 단계는 기준 유전자의 적어도 일부에 상보적이거나 적어도 일부를 특이적으로 증폭할 수 있는 하나 이상의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수행된다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열은 완전한 바이러스 객(gag) 단백질을 암호화하지 않는다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열은 완전한 HIV 유전체, 복제 가능 바이러스 유전체, 및/또는 부가적 유전자를 포함하지 않으며, 부가적 유전자는 임의적으로 Nef, Vpu, Vif, Vpr, 및/또는 Vpx이다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 폴리뉴클레오타이드의 도입은 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 벡터를 사용한 형질도입에 의해 수행된다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터이다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터이고, 임의적으로 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8 벡터 중에서 선택된다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 폴리뉴클레오타이드의 도입은 물리적 전달 방법에 의해, 임의적으로 전기 천공법에 의해 수행된다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 재조합 단백질은 재조합 수용체이다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 재조합 수용체는 질병 또는 병태와 관련된 항원 또는 질병 또는 병태와 관련된 병변 환경의 세포에서 발현되는 항원에 특이적으로 결합한다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 질병 또는 병태는 암이다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9; CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG; NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 8족 A 멤버를 함유하는 류신 풍부 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 자연 살생 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1; TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2; 도파크롬 타우토메라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원, 또는 보편적 꼬리표(universal tag) 관련 항원, 및/또는 비오틴화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자 중에서 선택된다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 재조합 수용체는 재조합 T 세포 수용체(TCR) 또는 기능성 비-T 세포 수용체이다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, CAR은 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 인식 도메인 및 ITAM을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, ITAM을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의, 임의적으로 인간 CD3-제타 사슬의 세포내 도메인을 포함한다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 세포내 신호 전달 도메인은 또한 공자극 신호 전달 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 공자극 신호 전달 영역은 CD28 또는 4-1BB의, 임의적으로 인간 CD28 또는 인간 4-1BB의 신호 전달 도메인을 포함한다.
통합되지 않은 잔류 전이 유전자 서열을 평가하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은: (a) 제공된 구현예들 중 어느 하나의 방법을 수행하여, DNA의 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정함으로써 전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하는 단계; (b) 고분자량 분획을 분리하지 않고 단리된 DNA 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계; 및 (c) (a)에서 결정된 양을 (b)에서 결정된 양과 비교함으로써 통합되지 않은 잔류 재조합 서열의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 하나 이상의 세포 내에서 2배체 유전체당 또는 세포당 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 결정하는 단계를 포함한다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 세포는 세포의 집단을 포함하고, 여기서 상기 집단의 복수의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함한다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 세포는 세포의 집단을 포함하고, 여기서 상기 집단의 복수의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 것으로 의심된다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 복제수는 세포의 집단 중에서 2배체 유전체당 또는 세포당 평균 복제수이다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 양을 비교하는 단계는 (b)에서 결정된 복제수에서 (a)에서 결정된 복제수를 빼는 단계를 포함한다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 양을 비교하는 단계는 (a)에서 결정된 복제수 대 (b)에서 결정된 복제수의 비율을 결정하는 단계를 포함한다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, (b)에서 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 수행된다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, PCR은 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 디지털 PCR 또는 액적 디지털 PCR이다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, PCR은 액적 디지털 PCR이다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, PCR은 전이 유전자 서열의 적어도 일부에 상보적이거나 적어도 일부를 특이적으로 증폭할 수 있는 하나 이상의 프라이머를 사용하여 수행된다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, (b)에서 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 고분자량 분획을 분리하지 않고 단리된 DNA 내 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계 및 질량, 중량 또는 복제수를 고분자량 분획을 분리하지 않고 단리된 DNA 내 기준 유전자의 질량, 중량 또는 복제수로 또는 표준 곡선으로 정규화하는 단계를 포함한다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 기준 유전자는 하우스키핑 유전자이다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 기준 유전자는 알부민(ALB)을 암호화하는 유전자이다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 기준 유전자는 리보뉴클레아제 P 단백질 서브유닛 p30(RPP30)을 암호화하는 유전자이다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 단리된 DNA 내 기준 유전자의 질량, 중량 또는 복제수를 결정하는 단계는 기준 유전자의 적어도 일부에 상보적이거나 적어도 일부를 특이적으로 증폭할 수 있는 하나 이상의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수행된다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, (a)에서 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계와 (b)에서 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 동일한 프라이머 또는 동일한 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 수행된다.
제공된 임의의 구현예의 일부에서, 통합되지 않은 잔류 재조합 서열은 벡터 플라스미드, 선형 상보적 DNA(cDNA), 자가통합체(autointegrant) 또는 긴 말단 반복(LTR) 서클(circles) 중 하나 이상을 포함한다.
도 1은 15kb, 17.5kb 또는 20kb의 임계값을 초과하는 고분자량 DNA 분획을 펄스 필드 겔 전기영동(PFGE)에 의해 분리하기 전(겔 전; 표준 벡터 복제수(VCN) 분석) 또는 분리 후(통합 벡터 복제수(iVCN) 분석) 액적 디지털 PCR(ddPCR)에 의해 평가된 복제수를 보여준다. 복제수는 통합된 전이 유전자 서열의 일부(“전이 유전자”)를 특이적으로 증폭하는 프라이머; 패키징 플라스미드(수포성 구내염 인디애나 바이러스 G 단백질(“VSVg”)을 암호화하는 바이러스 패키징 플라스미드), 또는 유전체 대조군(리보뉴클레아제 P 단백질 서브유닛 p30(“RRP30”)을 유전자 암호화하는 유전자)을 이용하여 평가하였다. 평가는 형질도입된 세포의 샘플에서 또는 형질도입되지 않은 대조군, 첨가된(spiked) CAR 플라스미드 및 VSVg 플라스미드에서 수행하였다. 각 유전자의 복제수를 2배체 유전체의 수로(cp/2배체 유전체; 알부민 유전자에 특이적인 프라이머를 기준으로 사용하여) 또는 유전체 DNA 50ng당으로 정규화하였다.
도 2a-2b는 CAR을 암호화하는 전이 유전자 서열을 함유하는 렌티바이러스 제제로 형질도입된, 주르카트(Jurkat) T 세포(도 2a) 또는 인간 대상체에서 단리한 1차 T 세포(도 2b)에 대해 전이 유전자 서열을 표준 벡터 복제수(VCN) 분석법(PFGE를 거치지 않고, 고분자량 및 저분자량 DNA를 모두 함유한 유전체 DNA 샘플)과 통합된 벡터 복제수(iVCN) 분석법(PFGE 후에 고분자량 DNA 샘플에서)으로 다양한 시점에(time points)(형질도입 전(“이전”), 형질도입 이후 5분, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간, 또는 조작 공정 완료시 “완료”에) 평가한 복제수를 도시한다. 각 유전자의 복제수를 2배체 유전체의 수로(cp/2배체 유전체; 알부민 유전자에 특이적인 프라이머를 기준으로 사용하여) 정규화하였다.
도 3a는 형질도입 후에 혈청 또는 성장 인자가 없는 기본 배지(“기본”)에서 또는 IL-2, IL-5 및 IL-15를 함유한 무혈청 배지(“완전”)에서 인큐베이션하고, (1) 항-CD3/항-CD28 항체 접합 상자성 비드(“비드”)로, (2) 106 세포당 4.0μg의 농도의 항-CD3/항-CD28 Fab 접합 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약으로, 또는 (3) 106 세포당 0.8μg의 농도의 항-CD3/항-CD28 Fab 접합 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약으로 인큐베이션하여 자극된, 두 명의 상이한 인간 대상체(도너 A 및 도너 B)의 1차 T 세포를 사용하여, 예시적인 비팽창된 T 세포 조성물 제조 공정의 3일, 4일 또는 5일차에 평가한 통합된 복제수를 도시한다. 도 3b는 iVCN에 의해 결정된 복제수와 (유세포 분석으로 CD3+ 세포들 중 CD3+/활성화된 Cas3-/CAR+ 세포들의 백분율을 결정한) CAR-발현 세포의 백분율 사이의 상관관계를 도시한다.
도 4a-4e는 표 E1에 제시된 바와 같이, 상이한 자극 시약 및 집계 시간을 채용하는 여러 예시적인 팽창된 또는 비팽창된 T 세포 조성물 제조 공정 중에, 표준 VCN(PFGE를 거침)과 iVCN(PFGE 거치지 않음)으로 평가한 2배체 유전체당 복제수(도 4a), 통합된 전이 유전자의 분획(도 4b), 통합되지 않은 전이 유전자의 분획(도 4c), 2배체 유전체당 통합되지 않은 전이 유전자 복제수(도 4d) 및 CAR+ 세포당 통합된 복제수(도 4e)를 도시한다.
도 5는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 여러 도너들의 1차 T 세포를 조작하는 예시적인 조작 공정에서 여러 시점 중, 표준 VCN(PFGE 거치지 않음)과 iVCN(PFGE를 거침)으로 평가한 2배체 유전체당 복제수, 통합되지 않은 전이 유전자 복제수, 통합되지 않은 전이 유전자의 분획 및 통합된 전이 유전자의 분획을 도시한다. 평가한 시점에는 팽창 공정의 0일차부터 8일차까지 포함되는데, 물질 해동(TMAT; 0일차)시에, 활성화(AMAT; 1일차)시에, 형질도입(XMAT; 2일차)시에 또는 배양 개시 후 여러 시기(inoc+1 내지 inoc+6; 공정의 3 내지 8일차를 나타냄)에서가 포함된다.
도 6은 HT1080 인간 섬유아세포 세포주에서, 세포당 표준 VCN(PFGE 거치지 않음) 및 iVCN(PFGE를 거침)으로, 형질도입 후 12시간, 24시간, 48시간 또는 72시간에 평가한 2배체 유전체당 복제수를 도시한다.
도 7a는 팽창 공정(○) 또는 비팽창 공정(●)을 사용하여 CAR을 발현하도록 조작된, 상이한 인간 도너들의 1차 T 세포에서 생산된 세포 조성물에서 표준 VCN(PFGE 거치지 않음) 및 iVCN(PFGE를 거침)으로 평가한 총 세포 중 세포당 복제수 사이의 관계를 도시한다. 도 7b-7c는 표준 VCN(도 7b) 또는 iVCN(도 7c)로 평가한 세포 조성물에서 세포당 복제수와 유세포 분석으로 평가한 생존 가능한 CD45+ 세포들 중 CAR-발현 CD3+ 세포의 백분율(%CD3+CAR+)로 표시되는 CAR의 표면 발현 사이의 관계를 도시한다.
유전적으로 조작된 세포의 유전체에 통합된 핵산 서열의 통합을 평가하는 방법들이 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 상기 방법들은 세포의 유전자 조작에 사용되는 전이 유전자 서열과 같은 핵산 서열의 존재, 부재 및/또는 양을 결정하는 데 사용된다. 일부 측면에서, 상기 방법들은 세포 요법에서 사용되는 유전적으로 조작된 세포와 같은 세포의 유전체 내 전이 유전자 서열의 통합을 평가하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 세포는 일반적으로 세포의 유전체에 통합되도록, 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열과 같은 핵산 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드의 도입에 의해 재조합 수용체와 같은 재조합 단백질을 발현하도록 유전적으로 조작된다. 일부 측면에서, 제공된 방법들은 통합을 평가하고, 통합된 핵산과 통합되지 않은 잔류 핵산의 존재, 부재 또는 양을 구분 및/또는 결정하는 데 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드가 바이러스 형질도입과 같은 다양한 전달 방법 또는 전기 천공법과 같은 물리적 전달 방법을 사용하여 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 입양 세포 요법용으로 조작된 세포와 같은 조작된 세포는 전이 유전자 서열에 의해 암호화된 재조합 단백질의 발현 수준을 결정하거나, 및/또는 세포의 유전체에 안정적으로 통합된 것과 같은 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 복제수를 결정하는 것과 같이, 여러 특성 및 특징에 대해 모니터하거나 평가해야 한다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 통합되지 않은 잔류 핵산의 존재, 부재 및/또는 양에 대해 모니터해야 한다. 일부 측면에서, 상기 평가는 조작 또는 제조 공정 중에 하나 이상의 시점에 수행할 수 있다. 특히 세포 요법에 사용하기 위한 조작된 세포 및 세포 조성물의 경우, 전이 유전자 서열의 존재, 부재, 양, 복제수 및/또는 발현의 효율적이고 정확한 결정은 대상체에 투여할 때 조작된 세포의 적절하고 정확한 특성화 및 정의를 확보하고, 투여량을 정확히 결정하고, 및 세포 조성물의 효능과 안전성을 확보하기 위해 입양 세포 요법과 같이 중요하다. 통합된 및 통합되지 않은 잔류 핵산의 존재, 부재, 양, 복제수 및/또는 발현의 효율적이고 정확한 평가를 위해 상기 요건들을 만족하는 향상된 방법들이 필요하다.
일부 경우에, 평가는 조작 또는 제조 공정의 초기 단계 중에 및/또는 적시의 신뢰할 수 있는 방식으로 단축된 또는 축약된 제조 공정 중에 수행해야 할 수 있다. 예시적인 단축된 또는 축약된 제조 공정에는 예를 들어 형질도입 후에 세포의 팽창을 위해 더 짧은 또는 더 축약된 인큐베이션을 포함하지 않거나 포함하는 공정인, 비팽창된 제조 공정이 포함된다. 일부 측면에서, 특정 단축된 또는 축약된 공정은 세포를 실질적으로 팽창시키지 않거나 세포를 최소한으로만 팽창시키는 조건에서의 세포의 인큐베이션을 수반할 수 있다. 일부 경우에, 상기 공정은 형질도입에 의한 것과 같은 재조합 또는 이종 폴리뉴클레오타이드의 도입 이후 96시간, 72시간 또는 48시간 이내 동안 25°C보다 큰 온도에서, 임의적으로 (약) 37ºC ± 2°C에서 세포의 인큐베이션을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 존재, 부재 및/또는 양을 결정하는 것은 특히 이른 시점에 또는 비팽창 공정들, 예를 들어, 통합을 위해 핵산 서열의 도입 후에 더 짧은 인큐베이션, 배양 또는 발현 기간을 갖는 또는 조작된 세포의 특성 또는 특징의 평가 전에 또는 냉동 보존 전에 더 짧은 인큐베이션, 배양 또는 발현 기간을 갖는 공정들을 사용하여 하는 것은 어려울 수 있다. 일부 측면에서, 조작 또는 제조 공정의 초기 단계 중에 또는 비팽창 공정에서 세포에서 단리된 DNA로부터 결정된 존재, 부재 또는 양은 반응 또는 세포에 존재하는 핵산의 통합되지 않은 종(species)의 존재로 인해 과대평가로 귀결될 수 있다. 일부 측면에서, 제공된 구현예는 통합된 핵산의 존재, 부재 또는 양의 특이적인 결정을 가능하게 하고, 일부 경우에, 대상체에 세포를 투여하기 전의 통합되지 않은 잔류 핵산의 존재, 부재 또는 양의 특이적인 결정을 가능하게 한다.
제공된 구현예는 조작된 세포 또는 세포 조성물을 효율적으로 정확하게 평가하기 위한 요건을 위한 향상된 솔루션을 제공한다. 구체적으로, 축약된 또는 비팽창 공정을 사용하여, 또는 조작 공정의 이른 시점에 조작되는 세포를 위해 향상된 방법이 필요하다. 일부 측면에서, 제공된 구현예는 예를 들어 세포로부터 예를 들어 약 10 킬로베이스(kb)를 초과하는 고분자량 분획의 DNA의 분리를 포함하는 분석 방법과 같이 실시예 3 내지 5에서 본원에 기술된 관찰에 기반하고, 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 평가하면 샘플에서 통합된 전이 유전자 서열을 신뢰할 수 있게 검출할 수 있다. 통합되지 않은 잔류 서열로부터 분리된 통합된 전이 유전자 서열을 함유하는 제공된 방법이 특히 축약된 비팽창 공정 중에 유리함을 제공한다는 것이 밝혀졌다.
일부 측면에서, 에피솜유사 플라스미드, 자가통합체(autointegrant) 또는 기타 단편과 같은 통합되지 않은 또는 잔류 분자를 함유할 수 있는 더 소량 또는 저분자량 핵산 분자를 제외하고 유전체 DNA를 함유할 수 있는 큰 또는 고분자량 핵산 분자를 분리 또는 단리하는 방법에 기초한다. 일부 측면에서, 고분자량 핵산 분자는 또한 유전체에 통합된 전이 유전자 서열을 포함한다. 제공된 구현예는 통합되지 않은 잔류 서열로부터 (예를 들어, 세포의 유전체에 통합된) 통합된 서열을 구분하는 데 사용할 수 있으며, 따라서 초기 단계의 제조에서 또는 비팽창 공정에서도 통합된 서열의 정확하고 신뢰할 수 있는 결정이 가능하다는 점에서 장점을 제공한다.
일부 측면에서, 제공된 방법은 조작 또는 제조 공정 중의 특히 이른 시점에 또는 비팽창된, 단축된 또는 촉진된 조작 또는 제조 공정에 대해서 통합된 핵산의 복제수의 효율적이고 신뢰할 수 있는 결정을 가능하게 하며, 그에 의해 세포 요법에서 사용 또는 투여를 위한 세포의 특성화의 정확도 및 신뢰성을 향상시킨다. 일부 측면에서, 제공된 구현예는 비팽창된, 단축된 또는 촉진된 조작 또는 제조 공정 도중 또는 종료시와 같은 특정 시점에 에피솜유사 플라스미드, 자가통합체(autointegrant) 또는 기타 단편과 같은 통합되지 않은 또는 잔류 분자의 복제수를 포함하지 않고 통합된 복제수를 정확하게 결정할 수 있는 장점을 제공한다.
일부 측면에서, 제공된 구현예는 고분자량 분획의 분리 후에 고분자량 분획 내 복제수 평가는 특히 전이 유전자 서열의 유리하는 통합되지 않은 복제들을 보유할 수 있는 비팽창 공정을 사용하여 생성된 세포에 대해서 안정적으로 통합된 전이 유전자 서열의 복제수를 정확하게 결정할 수 있는 것으로 귀결된다는 관찰에 기초한다. 이와 비교하여, 통합된 전이 유전자 서열 대 통합되지 않은 전이 유전자 서열을 구분하지 않는 고분자량의 사전 분리 없는 복제수 결정은 특히 더 짧은 비팽창 공정 도중 및 이후에 안정적으로 통합된 전이 유전자 서열의 수를 정확하게 결정하는 데 한계가 있다. 예를 들어 실시예 3 내지 5에서 본원에 기술된 바와 같이, 축약된 비팽창 공정 동안에, 고분자량 단편의 분리를 채용하지 않는 방법(예를 들어, 벡터 복제수(VCN) 분석법이라 함)은 통합되지 않은 잔류 종(예를 들어, 에피솜유사 플라스미드, 자가통합체(autointegrant) 또는 기타 단편)도 검출되어 카운트될 수 있으므로 통합된 전이 유전자 서열의 위양성 또는 과대평가로 귀결될 수 있다. 본원에 제공된 구현예는 기존 VCN 분석법이 원인일 수 있는 위양성 또는 과대평가 없이 효율적이고 정확한 결정이 가능하므로 다양한 장점을 제공한다.
제공된 방법들을 수행하는 데 사용할 수 있는 키트 및 제조품도 제공된다.
본 출원에서 언급된 특허 문헌, 과학 논문 및 데이터베이스를 포함한 모든 출판물은 각각의 개별 출판물이 개별적으로 참조로 통합된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다. 본원에 제시된 정의가 본원에 참조로 포함된 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 출판물에 제시된 정의와 상반되거나 달리 부합하지 않는 경우, 본원에 제시된 정의가 본원에 참조로 포함된 정의보다 우선한다.
본원에 사용된 섹션 제목은 단지 조직화를 위한 목적이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
I. 통합된 핵산 평가 방법
세포의 유전자 조작에 사용되는, 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열과 같은 전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하는 방법들(일부 경우에, 통합된 벡터 복제수(iVCN) 분석법이라 부를 수 있음)이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법들은 재조합 수용체와 같은 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열과 같은 핵산 서열의 존재, 부재 및/또는 양을 결정하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 방법들은 하나 이상의 세포의 유전체에 통합된, 예를 들어, 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전이 유전자 서열을 포함하는 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 하나 이상의 유전적으로 조작된 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 세포 조작 공정, 예를 들어, 세포의 유전체에 통합될 수 있는 전이 유전자 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 데 사용되는 공정 이전, 도중 또는 이후의 여러 시점에 통합을 평가하는 데 채용될 수 있다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 또한 조작된 세포를 투여한 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플을 평가하여 해당 생물학적 샘플 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 및/또는 양을 검출 또는 결정하는 데 채용될 수 있다.
일부 측면에서, 제공된 방법은 통합을 평가하고, 벡터 플라스미드, 선형 상보적 DNA(cDNA), 자가통합체(autointegrant) 또는 긴 말단 반복(LTR) 서클(circles) 중 하나 이상과 같은 통합된 핵산 및/또는 통합되지 않은 잔류 핵산의 존재, 부재 및/또는 양을 구분 및/또는 결정하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 제공된 구현예는 조작된 세포를 투여한 대상체와 같은 대상체의 생물학적 샘플로부터 디옥시리보핵산(DNA)을 단리하는 단계를 포함하는, 대상체의 생물학적 샘플에서 전이 유전자 서열의 존재, 부재, 복제수를 평가하는 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 DNA 종과 같은 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을 분리하는 단계를 포함하는 전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 상기 분리는 펄스 필드 겔 전기영동(PFGE) 같은 방법으로 수행될 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 적어도 하나의 조작된 세포를 함유하거나 함유하는 것으로 의심된다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열은 세포의 유전체로 통합되었거나 통합될 것이다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 그리고 예를 들어 프로모터, 전사 및/또는 전사 후 조절 요소 또는 반응 요소, 또는 표지자(예를 들어, 대리 표지자) 등의 조절 요소를 포함한 기타 구성요소 또는 요소를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 예를 들어 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 디지털 PCR(dPCR) 또는 액적 디지털 PCR(ddPCR)과 같은 정량적 방법으로, 하나 이상의 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포의 집단으로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을, 펄스 필드 겔 전기영동에 의해, 분리하는 단계 - 상기 세포의 집단은 복수의 조작된 세포를 포함하고 각각의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및 세포의 집단의 복수의 조작된 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 2배체 유전체당 평균 복제수를 결정하는 단계를 포함하는, 전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 분리하는 단계 전에, 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 세포의 집단의 복수의 조작된 세포 중 적어도 하나에 도입되었다.
일부 측면에서, 제공된 방법은 조작된 세포로부터 단리된 총 DNA에 존재하는 DNA의 다른 분자 또는 종으로부터 고분자량 분획과 같은 특정 분획을 분리하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 약 10 킬로베이스(kb) 이상의 크기를 갖는 DNA를 함유하는 것과 같은 고분자량 분획을 분리하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 분리하는 단계는 전기영동 기반 방법과 같은 크기 또는 분자량에 기초해 핵산을 분리하는 방법을 사용하여 수행된다. 일부 측면에서, 상기 방법은 또한 단리된 DNA로부터 고분자량 분획을 분리하기 전에 하나 이상의 세포로부터 DNA를 단리하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 상기 방법은 하나 이상의 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 하나 이상의 분리된 분획 내, 예컨대 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 및/또는 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 및/또는 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은, 고분자량 분획으로부터, 하나 이상의 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 결정하는 단계는 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 또는 관련 방법과 같이 핵산 서열을 검출 및/또는 정량하는 방법에 기초할 수 있다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 세포 내 또는 근처에 및/또는 분석 샘플 내에 존재할 수 있는 통합되지 않은 전이 유전자 서열로부터 통합된 전이 유전자 서열을 구분하는 것을 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 세포의 유전체에 통합하기 위한 조건하에서 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포로부터 디옥시리보핵산(DNA)을 단리하는 단계, 및 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 고분자량 분획을 분리하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포로부터 단리된 디옥시리보핵산(DNA)으로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 고분자량 분획을 분리하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 분리하는 단계 전에, 세포는 세포의 유전체에 전이 유전자 서열을 통합하기 위한 조건하에서 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 분리된 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 대상체의 생물학적 샘플로부터 디옥시리보핵산(DNA)을 단리하는 단계; 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 고분자량 분획을 분리하는 단계; 및 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계를 포함하는, 대상체의 생물학적 샘플 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 방법이 또한 제공된다. 일부 측면에서, 생물학적 샘플은 전이 유전자 서열을 포함하는 조작된 세포가 투여된 대상체에서 수득된다.
일부 측면에서, 통합되지 않은 잔류 전이 유전자 서열을 평가하는 방법이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포의 유전체에 통합하기 위한 조건하에서 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포로부터 디옥시리보핵산(DNA)을 단리하는 단계, 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 고분자량 분획을 분리하는 단계, 및 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 복제수를 결정함으로써, 전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하는 단계를 포함하는 방법의 임의 단계를 수행하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 상기 방법은 또한 고분자량 분획을 분리하지 않고 단리된 DNA 내 전이 유전자 서열의 복제수를 결정하고, 이로써 전이 유전자 서열의 총 복제수를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 총 단리된 DNA(분획을 분리하지 않는 등으로)를 평가하여 결정된 복제수에서 고분자량 분획을 평가하여 결정된 복제수를 빼서 통합되지 않은 잔류 전이 유전자 서열의 복제수를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 결정된 복제수로부터 고분자량 분획을 평가하여 결정된 복제수를 총 단리된 DNA(분획을 분리하지 않는 등으로)를 평가하여 결정된 복제수로 나누어 통합되지 않은 잔류 전이 유전자 서열의 비율을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 통합되지 않은 잔류 전이 유전자 서열은 벡터 플라스미드, 선형 상보적 DNA(cDNA), 자가통합체(autointegrant) 또는 긴 말단 반복(LTR) 서클 중 하나 이상을 포함한다.
A. 고분자량 분획 분리
일부 측면에서, 제공된 구현예는 분자량 또는 크기에 기초하여 조작된 세포로부터 수득된 디옥시리보핵산(DNA)와 같은 핵산을 분리하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 또한 크기 또는 분자량 범위에 속하는 DNA 분자를 분리 또는 단리하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 통합된 전이 유전자 서열 또는 통합되지 않은 전이 유전자 서열의 특정 유형은 통상적인 범위의 크기 또는 분자량을 가질 수 있다. 일부 측면에서, 특정 크기 또는 분자량 범위가 해당 범위 내 크기 또는 분자량을 가진 DNA 분자를 분리 또는 단리하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 특정 크기 또는 분자량 범위 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양.
일부 구현예에서, 예를 들어 임계값보다 크거나 크기 또는 분자량 범위 내에 있는 DNA 분자를 함유하는 고분자량 분획이 분리 또는 단리된다. 일부 구현예에서, 고분자량 분획은 일차적으로 염색체 또는 유전체 DNA와 같은 큰 DNA를 함유하고, 플라스미드, 통합되지 않은 DNA 단편, 선형 상보적 DNA(cDNA), autointegrants, 긴 말단 반복(LTR) 서클 또는 유전체에 통합되지 않은 기타 잔류 종 또는 분자와 같이 크기가 임계값보다 작은 저분자를 함유하거나 분자를 거의 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 고분자량 분획은 일차적으로 염색체 또는 유전체 DNA와 같은 큰 DNA를 함유하고, 플라스미드, 통합되지 않은 DNA 단편, 선형 상보적 DNA(cDNA), autointegrants, 긴 말단 반복(LTR) 서클 또는 유전체에 통합되지 않은 기타 잔류 종 또는 분자와 같이 크기가 임계값보다 작은 분자가 없다. 일부 구현예에서, 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정함으로써, 검출된 전이 유전자 서열은 조작된 세포의 유전체에 통합된 것을 나타내고, 통합되지 않은 전이 유전자 서열의 검출을 최소화한다.
일부 구현예에서, 고분자량 분획은 크기가 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 DNA 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 고분자량 분획은 크기가 (약) 10, 11, 12, 12.5, 13, 14, 15, 16, 17, 17.5, 18, 19, 20, 25 또는 30 킬로베이스(kb) 또는 그 이상보다 큰 DNA 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 고분자량 분획은 크기가 약 10, 12.5, 15, 17.5 또는 20 킬로베이스(kb) 또는 그 이상보다 큰 DNA 분자를 포함한다. 일부 측면에서, 고분자량 분획은 유전체 DNA 또는 유전체 DNA 단편을 함유하고, DNA 샘플에 존재할 수 있는 통합되지 않은 또는 잔류 핵산 종을 배제하거나 분리한다. 일부 측면에서, 고분자량 분획, 예를 들어, DNA 샘플은 크기가 약 10, 11, 12, 12.5, 13, 14, 15, 16, 17, 17.5, 18, 19, 20, 25 또는 30 킬로베이스(kb) 또는 그 이상과 같은 임계값 위이다. 일부 구현예에서, 임계값은 약 10, 12.5, 15, 17.5 또는 20 킬로베이스(kb) 또는 그 이상보다 크다. 일부 구현예에서, 고분자량 분획은 (약) 15 킬로베이스(kb)를 초과한다. 일부 구현예에서, 고분자량 분획은 (약) 17.5 킬로베이스(kb)를 초과한다. 일부 구현예에서, 고분자량 분획은 (약) 20 킬로베이스(kb)를 초과한다.
일부 측면에서, 임계값은 도입된 폴리뉴클레오타이드의 크기의 (약) 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 또는 4배 또는 그 이상이다. 예를 들어, 일부 측면에서, 전이 유전자 서열을 함유하는 도입된 폴리뉴클레오타이드가 (약) 10kb이면, 임계값은 도입된 폴리뉴클레오타이드의 크기의 대략 2배인 20kb 이상일 수 있다. 일부 측면에서, 선형 상보적 DNA(cDNA), 자가통합체(autointegrant), 긴 말단 반복(LTR) 서클 또는 기타 유전체에 통합되지 않은 잔류 저분자량 종 또는 분자와 같은 고분자량 분획, 통합되지 않은 서열을 분리하기 위해 임계값을 사용하면 고분자량 종으로부터 분리될 수 있다.
일부 측면에서, 고분자량 분획은 일차로, 전이 유전자 서열의 통합의 완료 이전 또는 이후에, 제조 공정 및/또는 조작된 세포에 존재할 수 있는 통합되지 않은 및/또는 잔류 DNA 분자보다 큰 DNA 분자를 함유한다. 일부 측면에서, 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 및/또는 양을 결정함으로써, 카운트에 전이 유전자 서열을 함유하는 통합되지 않은 또는 잔류 핵산 분자의 복제수를 포함하지 않고, 통합된 서열의 복제수를 정확하게 결정할 수 있다. 일부 경우에, 전이 유전자 서열을 함유하는 통합되지 않은 또는 잔류 핵산 분자의 복제수를 포함하면 복제수의 과대평가 또는 부정확한 결정으로 귀결될 수 있다. 일부 측면에서, 특히 조작 또는 제조 공정의 초기 단계 중에 또는 비팽창 공정 또는 단축된 공정인 공정에서, 통합되지 않은 또는 잔류 분자의 존재는 결정된 복제수에 영향을 줄 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 예를 들어 임계값보다 작은 DNA 분자를 함유하는 저분자량 분획을 분리 또는 단리하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 저분자량 분획은 플라스미드, 통합되지 않은 DNA 단편, 선형 상보적 DNA(cDNA), 자가통합체(autointegrant), 긴 말단 반복(LTR) 서클 또는 유전체에 통합되지 않은 기타 잔류 종 또는 분자와 같이 크기가 임계값보다 작은 DNA 분자를 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 저분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정할 수 있다. 일부 경우에, 통합되지 않은 또는 잔류 DNA 분자의 존재, 부재 및/또는 양은 제조 또는 조작의 여러 단계에서 결정해야 할 수 있는데, 예컨대 조작의 경과를 결정하고 및/또는 세포에 전이 유전자 서열을 도입하는 데 사용되는 잔류 벡터 같은 잔류 핵산의 복제수를 평가해야 할 수 있다.
일부 구현예에서, 저분자량 분획은 크기가 (약) 20 킬로베이스(kb)보다 작은 DNA 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 고분자량 분획은 크기가 (약) 20, 19, 18, 17.5, 17, 16, 15, 14, 13, 12.5, 12, 11 또는 10 킬로베이스(kb) 또는 그 이하보다 작은 DNA 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 고분자량 분획 또는 저분자량 분획은 전기영동-, 미세유체역학- 또는 크로마토그래피-기반 방법을 사용하여 분리 또는 단리할 수 있다. 일부 구현예에서, 고분자량 분획은 펄스 필드 겔 전기영동(PFGE) 또는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 분리 또는 단리할 수 있다.
일부 구현예에서, 고분자량 분획은 펄스 필드 겔 전기영동(PFGE)을 사용하여 분리 또는 단리된다. 일부 측면에서, PFGE는 염색체 또는 유전체 DNA 같은 상대적으로 큰 핵산 분자의 분해능을 개선하기 위해 전기영동 시스템에 교류 전압 구배를 도입하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 전기영동 시스템의 전압은 세 방향 사이에서 주기적으로 전환되는데, 하나는 겔의 중심 축을 통과하여 흐르고 둘은 양쪽에서 60도 각도로 흐른다. 일부 측면에서, PFGE에 의해 핵산 분자를 분리 또는 단리하는 예시적인 시스템 및 방법은 예를 들어, 문헌[US 9599590; US 2017/0240882; 또는 US 2017/0254774]에 기술된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 고분자량 분획은 전기영동-기반 방법을 사용하여 분리 또는 단리된다. 일부 측면에서, 전기영동은 전기장의 존재 하에 분리 매트릭스를 통한 이동성을 통해 전하 및/또는 크기에 의해 생체분자를 분리한다. 일부 구현예에서, 전기영동 시스템은 크기 또는 분자량에 기초하여 핵산 분자를 포함하여 특정 분석물을 분획, 분석 및 수집하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 분획은 복수의 분자의 서브세트이거나 이를 포함한다. 일부 측면에서, 분획은 크기 또는 분자량에 의해, 또는 일부 측면에서, 전기장의 힘에 의한 본 개시 내용의 완충제 조성물을 통과해 이동하도록(즉, 전기영동 이동성) 구동될 때 다른 분자 또는 복수의 분획보다 더 빠르거나 느린 속도로 이동하게 하는 임의의 물리적 특성에 의해 정의 또는 결정될 수 있다.
일부 측면에서, PFGE 등의 전기영동은 장치 또는 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 측면에서, 상기 장치 또는 시스템은 자동화 시스템 또는 고처리량 시스템이다. PFGE를 수행하기 위한 예시적인 시스템으로는, 예를 들어, 문헌[US 9599590; US 2017/0240882; 또는 US 2017/0254774]에 기술된 것, 또는 Pippin Prep, Blue Pippin 또는 Pippin HT (Sage Science); CHEF Mapper® XA System, CHEF-DR® III Variable Angle System, CHEF-DR II System (Bio-Rad); 및 Biometra Rotaphor 8 System (Analytik Jena AG) 등을 들 수 있다.
일부 측면에서, 평가의 예시적인 샘플로는 핵산, 올리고뉴클레오타이드, DNA 분자, RNA 분자 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다. 일부 측면에서, 상기 샘플에는 아미노산, 펩타이드, 단백질 또는 이들의 임의의 조합이 포함될 수 있다. 일부 측면에서, 상기 샘플은 전체 세포 용해물, 또는 세포 용해물의 DNA 또는 단백질 분획, 예컨대 입양 세포 요법을 위해 조작된 세포의 용해물일 수 있다.
일부 측면에서, 제공된 구현예는 입양 세포 요법을 위해 조작된 세포 같은 세포의 핵산 분자의 단리, 분리 및 분석을 포함한다. 일부 측면에서, 제공된 구현예는 유전자 조작 또는 제조 공정의 여러 단계를 거친 세포의 핵산 분자의 단리, 분리 및 분석을 포함한다. 일부 측면에서, 핵산 분자는 리보뉴클레오시드(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; “RNA”) 또는 디옥시리보뉴클레오시드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘, 또는 데옥시시티딘; “DNA”)의 인산 에스터 중합체 형태, 또는 단일 가닥 형태 또는 이중 가닥 나선 형태의 포스포로티오에이트와 티오에스터 등 이들의 임의의 인산에스터 유사물을 포함한다. 일부 측면에서, 핵산 분자, 특히 DNA 또는 RNA 분자는 분자의 1차 및 2차 구조만을 지칭하며, 이를 특정 3차 형태로 한정하지 않는다. 일부 측면에서, 핵산 분자는 선형 또는 환형 DNA 분자(예를 들어, 제한 단편), 플라스미드, 및 염색체에서 발견되는 이중 가닥 DNA를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플의 핵산은 유전체 DNA, 이중 가닥 DNA(dsDNA), 단일 가닥 DNA(ssDNA), 부호화 DNA(또는 상보적 DNA, cDNA), 메신저 RNA(mRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 RNA(dsRNA), 모르폴리노, RNA 간섭(RNAi) 분자, 미토콘드리아 핵산, 엽록체 핵산, 바이러스 DNA, 바이러스 RNA, 및 별도의 유전 물질을 가진 다른 세포기관을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 샘플의 핵산은 또한 변형된, 합성 또는 비자연 발생 뉴클레오타이드 또는 구조 요소 또는 이노신, 삽입제(미국 특허 번호 4,835,263) 및 작은 홈 바인더(미국 특허 번호 5,801,115) 등의 염기 유사물과 같은 다른 대안적인/변형된 핵산 화학적 성질을 함유하는 핵산 유사물을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 고분자량 분획 또는 저분자량 분획을 단리 또는 분리하기 전에, 샘플은 전기영동 시스템에서 평가 전에 순 음전하를 주거나, 펩타이드 또는 단백질을 변성시키거나, DNA나 RNA 분자를 소화시키는 시약과 결합할 수 있다. 일부 측면에서, 샘플은 검출 목적으로 샘플 또는 그 단편에 형광, 자성 또는 방사성 특성을 주는 제제(agents)와 결합될 수 있다. 일부 실시예에서, dsDNA 샘플은 브롬화 에티듐과 혼합되어 전기영동 카세트에 적용되며, 이 샘플의 분획은 아주 밝은 녹색 LED를 사용하여 검출한다.
일부 측면에서, 전기영동 시스템과 같이 핵산 샘플을 분리 또는 단리하기 위한 시스템은 자동화되거나 및/또는 처리량이 높을 수 있다. 일부 측면에서, 전기영동 시스템은 전기영동 카세트와 같이 일회용의 소모품 또는 시약을 활용할 수 있다.
B. 핵산의 존재, 부재 또는 양 결정
일부 측면에서, 방법은 조작된 세포를 포함하는 세포의 집단 같은 하나 이상의 세포의 디옥시리보핵산(DNA)을 함유하는 샘플과 같은 샘플 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 하나 이상의 유전자 조작 또는 제조 단계를 거친 하나 이상의 세포의 DNA를 함유하는 샘플과 같은 샘플 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 핵산 서열, 예를 들어, 특정 DNA의 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 또는 관련 방법과 같은 핵산 서열을 정량화하는 데 사용되는 방법은 DNA를 함유하는 샘플로부터 분리 또는 단리된, DNA를 함유하는 샘플 내 또는 고분자량 분획과 같은 특정 분획 내 전이 유전자 서열의 복제수를 결정하는 데 채용될 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 예를 들어 핵산 분자를 정량화하기 위해 아래 기술하는 예시적인 분석법 중 어느 하나를 사용하여 복제수를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 특정 서열의 존재, 부재 및/또는 양은 전이 유전자 서열의 전부 또는 일부에 특이적으로 결합하거나 이를 인식할 수 있는 프로브 또는 프라이머를 사용하여 검출할 수 있다. 일부 구현예에서, 복제수는 전이 유전자 서열의 일부를 특이적으로 검출할 수 있는 프로브 또는 전이 유전자 서열의 일부를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 서열을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 측면에서, 상기 프로브 또는 프라이머 서열은 세포에 대해 이종성, 외인성 또는 전이 유전자를 가지는 전이 유전자 서열의 일부와 같은 전이 유전자 서열의 일부를 특이적으로 검출, 결합 또는 인식할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 프로브 또는 프라이머 서열은 세포의 유전체가 되거나 이에 통합되는 전이 유전자 서열의 일부와 같은 전이 유전자 서열의 일부를 특이적으로 검출, 결합 또는 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, qPCR 또는 다른 핵산 기반 방법에 사용되는 프라이머 또는 프로브는 재조합 단백질을 암호화하는 핵산, 및/또는 예를 들어 프로모터, 전사 및/또는 전사 후 조절 요소 또는 반응 요소, 또는 표지자(예를 들어, 대리 표지자) 등의 조절 요소를 포함한 플라스미드 및/또는 벡터의 기타 구성요소 또는 요소를 결합, 인식 및/또는 증폭하는 데 특이적이다. 일부 구현예에서, 프라이머 또는 프로브는 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 및/또는 전사 후 조절 요소를 포함한 조절 요소 같은 기타 구성요소 또는 요소에 결합할 수 있다. 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 프라이머는 예를 들어 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소 등의 조절 요소의 서열에 상보적이거나 이 서열을 특이적으로 증폭할 수 있다. 일부 측면에서, 프로브 또는 프라이머는 정량적 PCR(qPCR), 디지털 PCR(dPCR) 또는 액적 디지털 PCR(ddPCR)과 같은, 전이 유전자 서열의 존재, 부재 및/또는 양을 결정하는 예시적인 방법에 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 하나 이상의 세포 내에서 또는 하나 이상의 세포를 함유하는 생물학적 샘플 내에서 전이 유전자 서열의 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 결정하는 것과 같은 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 핵산 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계 또는 전이 유전자 서열의 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 평가하는 단계는 세포의 집단의 일부 또는 생물학적 샘플의 일부에서 수행할 수 있으며, 전체 샘플 또는 전체 세포의 집단에서 존재, 부재 또는 양을 결정하기 위해 정규화하고, 평균을 내고 및/또는 추정할 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열의 양은 전이 유전자 서열의 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 질량, 중량, 농도 또는 복제수는 평균 질량, 중량, 농도 또는 복제수이다. 일부 측면에서, 질량, 중량, 농도 또는 복제수는 세포당, 2배체 유전체당, 체적당, 질량 또는 그 등가물당 또는 그렇지 않으면 단위당이 되기 위해 정규화되고, 추정되고 또는 평균을 낸 것과 같이 단위당 평균 질량, 중량, 농도 또는 복제수이다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 하나 이상의 세포 내에서 2배체 유전체당 또는 세포당 전이 유전자 서열의 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세포는 세포의 집단을 포함하고, 여기서 상기 집단의 복수의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함한다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 세포는 세포의 집단을 포함하고, 여기서 상기 집단의 복수의 세포는 예를 들어 재조합 수용체 등의 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전이 유전자 서열을 포함하는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 복제수는 세포의 집단 중에서 2배체 유전체당 또는 세포당 평균 복제수이다.
일부 측면에서, 복제수를 결정하는 단계는 하나 이상의 세포 내 또는 생물학적 샘플 내 존재하는 전이 유전자 서열의 카피 수를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 복제수는 평균 복제수로 표현될 수 있다. 일부 측면에서, 특정 통합된 전이 유전자의 복제수는 세포당 (전이 유전자 서열을 함유하는) 구성 부분의 수를 포함한다. 일부 측면에서, 특정 통합된 전이 유전자의 복제수는 2배체 유전체당 (전이 유전자 서열을 함유하는) 구성 부분의 수를 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열의 복제수는 세포당 통합된 전이 유전자 서열의 수로 표현된다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열의 복제수는 특정 유형의 세포당, 예를 들어, 특정 표현형 표지자를 발현하는 세포당 또는 도입된 전이 유전자에 의해 암호화된 재조합 단백질을 발현하는 세포당 통합된 전이 유전자 서열의 수로 표현된다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열의 복제수는 2배체 유전체당 통합된 전이 유전자 서열의 수로 표현된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 세포는 세포의 집단을 포함하고, 여기서 상기 집단의 복수의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 복제수는 세포의 집단 중에서 2배체 유전체당 또는 세포당 평균 복제수이다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA의 질량 또는 중량당 전이 유전자 서열의 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열의 질량, 중량, 농도 또는 복제수는 하나 이상의 세포로부터 단리된, 예를 들어, 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내 또는 조작 공정을 거치고 있는 하나 이상의 세포 내 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA의 마이크로그램당으로 표현된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA의 마이크로그램당 전이 유전자 서열의 질량 또는 중량을 마이크로그램 단위로 평가하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 하나 이상의 세포당, 임의적으로 CD3+, CD4+ 및/또는 CD8+ 세포당, 및/또는 재조합 단백질을 발현하는 세포당 전이 유전자 서열의 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 하나 이상의 세포당, 임의적으로 특정 표현형 표지자를 발현하는 세포당, 예를 들어, 임의적으로 CD3+, CD4+ 및/또는 CD8+ 세포당, 생존 가능한 세포, 활성화된 캐스페이스 음성 세포(예를 들어, aCas3-) 또는 CD45+ 세포당, 및/또는 재조합 단백질을 발현하는 세포당 전이 유전자 서열의 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 세포상에 발현되는 표면 표지자 또는 표현형은 유세포 분석 또는 면역 염색법에 의한 것과 같은 세포 기반 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 측면에서, 재조합 단백질을 발현하는 세포는 유세포 분석 또는 면역 염색법에 의한 것과 같은 세포 기반 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열의 양은 CD3+, CD4+ 및/또는 CD8+ 세포와 같은 특정 세포의 수로, 및/또는 재조합 단백질을 발현하는 세포당으로, 또는 세포의 총수당으로, 예컨대 샘플 내 세포의 총수당으로 또는 조작 공정을 거친 세포의 총수당으로 정규화할 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열의 양은 특정 표현형 표지자, 예를 들어, CD3+, CD4+ 및/또는 CD8+ 세포, 생존 가능한 세포, 활성화된 캐스페이스 음성 세포(aCas3-) 또는 예를 들어, 와 같은 특정 세포의 수로, 및/또는 CD45+ 세포를 발현하는 특정 세포의 수로, 및/또는 재조합 단백질을 발현하는 세포당으로(예를 들어, CAR 발현 세포당으로), 또는 세포의 총수당으로, 예컨대 샘플 내 세포의 총수당으로 또는 조작 공정을 거친 세포의 총수당으로 정규화할 수 있다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 생물학적 샘플 내 2배체 유전체당 또는 세포당 전이 유전자 서열의 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 복제수는 생물학적 샘플 내 하나 이상의 세포 중에서 2배체 유전체당 또는 세포당 평균 복제수이다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 생물학적 샘플의 체적당, 임의적으로 생물학적 샘플의 마이크로리터당 또는 밀리리터당 전이 유전자 서열의 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 대상체의 체중 또는 체표면적당 전이 유전자 서열의 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 평가하는 단계 및 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 고분자량 분획 내 기준 유전자의 질량, 중량, 농도 또는 복제수로 또는 전이 유전자 서열의 알려진 양, 농도, 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 함유하는 샘플에 기초한 표준 곡선과 같은 표준 곡선으로 정규화하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 결정된 복제수는 정규화한 값으로 표현된다. 일부 구현예에서, 결정된 복제수는 유전체당 또는 세포당 전이 유전자 서열의 카피 수로 정량화된다. 일부 측면에서, 유전체당 값은 T 세포와 같은 통상적인 체세포는 2배체 유전체를 함유하므로 2배체 유전체당 전이 유전자 서열의 카피(copy)로 표현된다. 일부 측면에서, 결정된 복제수는 세포의 유전체 내 공지된 기준 유전자의 복제수에 대해 정규화할 수 있다. 일부 측면에서, 기준 유전자는 RRP30(리보뉴클레아제 P 단백질 서브유닛 p30을 암호화), 18S rRNA(18S 리보솜 RNA), 28S rRNA(28S 리보솜 RNA), TUBA(α-튜불린), ACTB(β-액틴), β2M(β2-마이크로글로불린), ALB(알부민), RPL32(리보솜 단백질 L32), TBP(TATA 서열 결합 단백질), CYCC(시클로필린 C), EF1A(신장 인자 1α), GAPDH(글리세르알데하이드-3-인산 탈수소효소), HPRT(히포크산틴 포스포리보실 전달효소) 또는 RPII(RNA 중합효소 II)이다. 일부 구현예에서, 결정된 복제수는 DNA의 마이크로그램당 전이 유전자 서열의 카피(copy)로 정량화된다.
일부 측면에서, 복제수는 복수의 세포 또는 세포의 집단, 예컨대 복수의 조작된 세포 또는 조작된 세포의 집단의 평균 또는 중간 복제수이다. 일부 측면에서, 복제수는 복수의 세포 또는 세포의 집단, 예컨대 복수의 조작된 세포 또는 조작된 세포의 집단의 평균 복제수이다. 일부 측면에서, 평균 복제수는 복수의 세포 또는 세포의 집단, 예컨대 조작 또는 제조 공정의 하나 이상의 단계를 거친 복수의 세포 또는 세포의 집단으로부터, 또는 대상체에 투여하기 위한 세포 조성물과 같은 세포 조성물에서 결정된다. 일부 측면에서, 정규화한 평균 복제수는 예를 들어 2배체 유전체 내 2개 카피에 존재하는 공지된 유전자와 같은 기준 유전자에 대해 정규화한 전이 유전자 서열의 평균 복제수로서 결정된다. 일부 측면에서, 통상적으로 2배체 유전체당 2개 카피에 존재하는 기준 유전자에 대한 정규화는 2배체 세포와 같은 세포 내 복제수에 해당할 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 정규화한 평균 복제수는 복수의 세포 또는 세포의 집단, 예를 들어, 통상적으로 2배체 유전체를 가진 T 세포들 중에서 검출된 전이 유전자 서열의 평균 복제수에 해당할 수 있다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, PCR은 아래 기술되는 바와 같은 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 디지털 PCR 또는 액적 디지털 PCR이다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양은 액적 디지털 PCR에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, PCR은 전이 유전자 서열의 적어도 일부에 상보적이거나 적어도 일부에 특이적으로 증폭할 수 있는 하나 이상의 프라이머를 사용하여, 일부 경우에, 기준 유전자의 적어도 일부에 상보적이거나 적어도 일부를 특이적으로 증폭할 수 있는 하나 이상의 프라이머를 사용하여 수행된다.
일부 측면에서, 하나 이상의 분획 내, 및/또는 복수의 조작된 세포 또는 조작된 세포의 집단으로부터 단리된 총 DNA 같은 특정 샘플 내 결정된 전이 유전자 서열의 존재, 부재 및/또는 양은 예를 들어 아래 섹션 I.C.에 기술된 바와 같이 통합되지 않은 또는 잔류 분자의 비율 또는 수와 같은 관심 있는 특정 비율을 계산하기 위한 기준으로 사용될 수 있다.
1. 정량적 PCR(qPCR)
일부 구현예에서, 조작된 세포의 유전체에 통합하기 위한, 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열과 같은 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양은 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR; 일부 경우에, 실시간 PCR로도 알려짐)에 의해 결정된다.
일부 측면에서, qPCR은 반응이 진행됨에 따라 측정 된 증폭 산물의 축적을 각 주기 후 산물 정량화와 함께 실시간으로 검출하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, qPCR은 샘플 내 전이 유전자 서열과 같은 특정 핵산 서열의 복제수를 결정하는 데 사용할 수 있다. 일부 측면에서, qPCR은 각 반응 웰(well)에서 증가하는 산물 DNA 양과 함께 증가하는 형광을 생성하는 형광성 리포터 분자를 채용한다. 일부 측면에서, 채용된 형광의 화학적 성질은 DNA-결합 염료 및 형광 표지된 서열-특이적 프라이머 또는 프로브를 포함한다. 일부 측면에서, qPCR은 지정된 파장에서 각 샘플을 조명하고 여기된 형광단에 의해 방출된 형광을 검출하는 능력을 가진 특수 열 순환기를 채용한다. 일부 측면에서, 측정된 형광은 앰플리콘의 총량에 비례하고, 시간에 따른 형광의 변화는 각 주기에 생산된 앰플리콘의 양을 계산하는 데 사용된다.
일부 측면에서, qPCR은 넓은 동적 범위에 걸쳐 정확성과 높은 감도로 특정 DNA(증폭 표적 서열, 예를 들어, 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열)의 초기 카피 수의 결정을 가능하게 한다. 일부 측면에서, qPCR은 정성적(서열의 존재 또는 부재) 또는 정량적(복제수)인 결과를 생성할 수 있다.
2. 디지털 PCR(dPCR)
일부 구현예에서, 조작된 세포의 유전체에 통합하기 위한, 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열과 같은 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양은 디지털 중합효소연쇄반응(dPCR)을 사용하여 결정된다. 일부 측면에서, dPCR은 높은 정확성과 감도로 전이 유전자 서열과 같은 특정 서열의 존재, 부재 또는 양의 결정을 가능하게 한다.
일부 구현예에서, dPCR은 핵산을 검출하고 증폭하기 위한 방법이며, 표적 핵산 분자의 정확한 정량적 분석 및 높은 감도의 검출을 가능하게 한다. 일부 측면에서, dPCR은 연속적인 개별 PCR 반응(또는 분할)으로 DNA를 한계 희석하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 한계 희석은 평가할 주형 핵산, 예를 들어, 전이 유전자 서열의 무작위 분포에 기초하여 나노유체역학과 에멀션의 화학적 성질을 이용한 분할의 원칙과, 주어진 비율의 양(positive)의 분할에 대해 존재하는 DNA의 양을 측정하기 위한 푸아송 통계를 채용할 수 있다. 일부 측면에서, dPCR은 일반적으로 선형이고, 민감하여 매우 적은 양의 DNA를 검출 또는 정량화할 수 있다. 일부 측면에서, dPCR은 표준 곡선 없이 단일 분자 계수법을 사용하여 DNA 샘플의 절대적 정량화를 가능하게 하며, 절대적 정량화는 웰(well)당 단일 분할에 대한 PCR로부터 얻을 수 있다(Pohl et al., (2004) Expert Rev. Mol. Diagn. 4(1), 41-47 참조).
일부 측면에서, dPCR 방법은 복수의 개별 PCR 반응을 병렬로 수행하기 위해 수천 개의 분할과 같은 복수의 분할을 생성하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 샘플 내 개별 핵산 분자가 많은 개별 영역 내에 위치하여 농축되도록 샘플을 분할한다. 마이크로 웰 플레이트, 모세관, 미세유체역학 또는 나노유체역학, 오일 에멀션, 에멀션 화학적 성질 및/또는 핵산 결합 표면이 있는 초소형 챔버 어레이를 사용하여 샘플을 분할할 수 있다. dPCR을 수행하기 위한 예시적인 조성물은 주형 핵산(예를 들어, 조작된 세포로부터 단리된 DNA), 형광-소광제(fluorescence-quencher) 프로브, 프라이머, 및 PCR 마스터 믹스(master mix) - 마스터 믹스는 DNA 중합효소, dNTP, MgCl2 및 반응 완충제를 최적의 농도로 함유함 - 를 포함할 수 있다. PCR 용액은 더 작은 반응들로 나눈 후 PCR을 개별적으로 실행한다. 샘플을 분할하면 분자 집단이 푸아송 분포를 따른다고 가정하여 상이한 분자의 수를 추정할 수 있으므로, 단일 분할에 서식하는 다중 표적 분자의 가능성을 설명할 수 있다.
일부 측면에서, dPCR은 디지털 방법에 의한 결과를 분석하는 단계를 포함한다(결과로 생긴 신호가 이진 값: “0” 또는 “1”을 갖기 때문에). 일부 측면에서, dPCR을 사용하여 대용량을 분석하고, 동시에 다양한 샘플을 분석할 수 있으며, 동시에 다수의 평가를 수행할 수 있다. 일부 측면에서, 디지털 PCR을 위해, 샘플 서열 주형(예를 들어, 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 함유할 가능성이 있음)의 평균 복제수에 희석하기 위해 준비된 샘플 서열 주형을 포함하는 각 분할은 0.5-1이다. 희석은 푸아송 분포에 나타나는 신호들에 대한 신뢰할 수 있는 정량화 결과를 얻기 위해 중요하다. 각 웰에서, 시험을 거친 서열(예를 들어, 전이 유전자 서열의 일부)에 특이적인 증폭 프라이머와 형광 프로브가 투입되고 에멀션 PCR이 수행된다. 일부 측면에서, 형광 신호를 나타내는 웰은 “1”의 값으로 계수되는데, 이는 1의 서열 복제수를 갖는 샘플이 웰에 투입되어 증폭 후에 해당 신호를 보이기 때문이며, 신호를 표시하지 않는 웰은 “0”으로 계수되는데, 이는 서열의 카피를 함유하지 않은 샘플이 웰에 투입되어 증폭이 없으므로 신호를 보이지 않기 때문이다. 푸아송의 작은 수 법칙을 사용하면, 샘플 내 표적 분자의 분포를 정확하게 어림할 수 있으며, 이는 PCR 산물 내 표적 서열의 절대 정량화를 가능하게 한다.
dPCR을 위한 상업적으로 이용 가능한 예시적인 장치 또는 시스템으로는 Raindrop™ 디지털 PCR 시스템(Raindance™ Technologies); QX200™ Droplet Digital™ PCR 시스템(Bio-Rad); BioMark™ HD 시스템 및 qdPCR 37K™ IFC(Fluidigm Corporation) 및 QuantStudio™ 3D 디지털 PCR 시스템(Life Technologies™)(예를 들어, Huggett et al. (2013) Clinical Chemistry 59: 1691-1693; Shuga, et al. (2013) Nucleic Acids Research 41(16): e159; Whale et al. (2013) PLoS One 3: e58177 참조) 등을 들 수 있다.
3. 액적 디지털 PCR(ddPCR)
일부 구현예에서, 조작된 세포의 유전체에 통합하기 위한, 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열과 같은 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양은 액적 디지털 중합효소연쇄반응(ddPCR)을 사용하여 결정된다. ddPCR은 디지털 PCR의 한 유형이며, 여기서 PCR 용액을 물-오일 에멀션 화학적 성질을 통해 더 작은 반응들로 나누거나 분할하여 수많은 액적을 생성한다. 일부 측면에서, 특정 계면활성제를 사용하여 유중수(water-in-oil)형 액적을 생성할 수 있다. (예를 들어, Hindson et al., (2011) Anal Chem 83(22): 8604-8610; Pinheiro et al., (2012) Anal Chem 84, 1003-1011 참조). 일부 측면에서, 각 개별 액적은 이후 개별 반응으로 실행된다. 일부 측면에서, PCR 샘플을 나노리터 크기 샘플로 분할하여 오일 액적으로 캡슐화한다. 일부 측면에서, 오일 액적은 웰들 각각에 진공을 가하는 액적 발생기를 사용하여 만들어진다. 예시적인 경우에, 20μL 샘플 용량으로 개별 반응을 위한 대략 20,000개의 액적을 만들 수 있다.
일부 측면에서, PCR 이후, 각 액적을 분석 또는 판독하여 원래 샘플 내 PCR-양성 액적(예를 들어, 형광 신호에 기초하여 각 액적에 할당된 이진 수 “0” 또는 “1”)의 분획을 결정한다. 그런 후 이 데이터를 푸아송 통계를 사용해 분석하여 원래 샘플 내 표적 DNA 서열 농도를 결정한다. 액적당 표적 분자 카피(CPD)의 푸아송 분포는 CPD=-ln(1-p)의 함수로 표현되는 형광 액적(p)의 분획에 기초하여 결정될 수 있다. 이 모델로 적어도 하나의 표적 분자를 함유한 샘플의 수가 증가하면 하나 초과의 표적 분자를 함유한 샘플의 확률이 증가함을 예측할 수 있다.
C. 예시적인 응용
일부 측면에서, 제공된 방법은 핵산 서열의 통합 및/또는 조작된 세포의 특성화를 평가하기 위한 다양한 응용 분야를 위해 조작된 세포와 조작된 세포를 함유한 세포 조성물을 평가하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 전이 유전자 서열과 같은 핵산 및/또는 조작된 세포의 통합을 특성화하기 위해, 조작 후에, 제형화 전에, 투여 전에 및/또는 투여시에 및/또는 조작 또는 제조 공정의 다양한 단계 및/또는 시점에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 조작된 세포를 함유한 세포 조성물에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 조작된 세포 또는 조작된 세포를 함유한 세포 조성물이 주입을 위해 방출되기 전에, 대상체에 투여될 준비가 되기 전에, 및/또는 대상체에 투여되기 전을 포함하여 제조 공정 동안에 하나 이상의 단계 또는 시점에 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 세포 또는 세포 조성물은 제공된 방법 중 하나 이상이 예를 들어 조작된 세포 또는 세포 조성물의 일부분에, 분획에, 및/또는 샘플에 수행된 것을 평가한 후에 주입을 위해 방출되고, 대상체에 투여를 위해 준비되고, 및/또는 대상체에 투여된다. 특정 구현예에서, 조작된 세포 또는 세포 조성물은 세포가 안전하다고 결정된 후에, 예를 들어, 멸균되고 및/또는 유해한 것이 없고, 및/또는 하나 이상의 방법을 완료하고 나서 통합된 전이 유전자 서열의 필수 임계 복제수보다 적거나 많은 수를 함유한다는 것과 같은 원하는 생물학적 특성을 보유하고 있다고 결정된 후에, 주입을 위해 방출되고, 대상체에 투여를 위해 준비되고, 및/또는 대상체에 투여된다.
일부 측면에서, 전이 유전자 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드가 바이러스 형질도입과 같은 다양한 전달 방법을 사용하여 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 입양 세포 요법용으로 조작된 세포와 같은 조작된 세포는 전이 유전자 서열에 의해 암호화된 재조합 단백질의 발현 수준을 결정하거나, 및/또는 세포의 유전체에 안정적으로 통합된 것과 같은 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 복제수를 결정하는 것과 같이, 여러 특성 및 특징에 대해 모니터하거나 평가해야 한다. 일부 측면에서, 상기 평가는 조작 또는 제조 공정 중에 하나 이상의 시점에 수행할 수 있다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 요법이 필요한 질병 또는 병태를 가진 대상체 등의 대상체에 조작된 세포 또는 세포 조성물을 투여한 후에 조작된 세포의 약동학적 매개변수 및/또는 생체이용률(bioavailability)을 평가 또는 결정하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 재조합 수용체 등의 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열이 도입된 조작된 세포와 같은 조작된 세포의 지속성, 팽창 및/또는 수를 특성화하기 위한 대용물로 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 제공된 방법의 예시적인 응용이 아래 기술된다. 일부 측면에서, 방법의 변형 및/또는 조작된 세포 또는 조작된 세포 조성물을 평가 또는 특성화하기 위한 다른 방법과의 조합 또한 세포 요법을 위한 조작된 세포의 특징 및 특성을 결정하는 데 사용될 수 있다.
1. 전이 유전자 서열의 통합 평가
일부 측면에서, 재조합 수용체 등의 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열과 같은 전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하기 위한 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 예를 들어 유전자 조작을 위해 세포에 통합하기 위한 조건하에서 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 도입한 후에, 세포의 유전체로 전이 유전자 서열의 통합 타이밍, 정도 또는 진행을 평가하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 일부 측면에서, 제공된 방법은 조작 또는 제조 공정의 하나 이상의 단계 도중 또는 후에, 세포에 통합하기 위한 조건하에서 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 도입한 후에, 세포의 유전체로 전이 유전자 서열의 통합 타이밍, 정도 또는 진행을 평가하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 통합된 전이 유전자 서열의 평가된 복제수는 복수의 세포 또는 세포의 집단 내 통합된 전이 유전자 서열의 평균 복제수이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을 분리하는 단계 - 상기 하나 이상의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전이 유전자 서열을 포함하는 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및 (b) 상기 고분자량 분획으로부터, 하나 이상의 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열은 하나 이상의 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열을 나타낸다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을 분리하는 단계 - 상기 하나 이상의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전이 유전자 서열을 포함하는 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및 (b) 상기 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정함으로써, 하나 이상의 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열을 평가하는 단계를 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열은 하나 이상의 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열을 나타낸다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, (b)에서 하나 이상의 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수(copy number)를 결정하는 단계를 포함한다.
전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하는 방법이 본원에 또 제공된다. 임의의 구현예의 일부에서, 상기 방법은 (a) 세포의 집단으로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을, 펄스 필드 겔 전기영동에 의해, 분리하는 단계 - 상기 세포의 집단은 복수의 조작된 세포를 포함하고 각각의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전이 유전자 서열을 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및 (b) 고분자량 분획 내의 전이 유전자 서열의 2배체 유전체당 또는 세포당 평균 복제수를 결정함으로써, 세포의 집단의 복수의 조작된 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열을 평가하는 단계를 포함한다.
전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하는 방법이 본원에 또 제공된다. 임의의 구현예의 일부에서, 상기 방법은 (a) 세포의 집단으로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을, 펄스 필드 겔 전기영동에 의해, 분리하는 단계 - 상기 세포의 집단은 복수의 조작된 세포를 포함하고 각각의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전이 유전자 서열을 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및 (b) 고분자량 분획으로부터, 세포의 집단의 복수의 조작된 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 2배체 유전체당 또는 세포당 평균 복제수를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 통합된 핵산 서열의 복제수는 세포 또는 복수의 세포 또는 세포의 집단으로부터 얻은 디옥시리보핵산(DNA) 샘플의 고분자량 분획에 존재하는 전이 유전자 서열의 전부 또는 일부와 같은 특정 핵산 서열의 복제수를 평가하여 결정될 수 있다. 일부 측면에서, 고분자량 분획은 유전체 DNA 또는 유전체 DNA 단편을 함유하고, DNA 샘플에 존재할 수 있는 통합되지 않은 또는 잔류 핵산 종을 배제하거나 분리한다. 일부 측면에서, 고분자량 분획, 예를 들어, DNA 샘플은 크기가 약 10, 11, 12, 12.5, 13, 14, 15, 16, 17, 17.5, 18, 19, 20, 25 또는 30 킬로베이스(kb) 또는 그 이상과 같은 임계값 위이다. 일부 구현예에서, 임계값은 약 10, 12.5, 15, 17.5 또는 20 킬로베이스(kb) 또는 그 이상보다 크다. 일부 구현예에서, 고분자량 분획은 (약) 15 킬로베이스(kb)를 초과한다. 일부 구현예에서, 고분자량 분획은 (약) 17.5 킬로베이스(kb)를 초과한다. 일부 구현예에서, 고분자량 분획은 (약) 20 킬로베이스(kb)를 초과한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 세포의 유전체에 통합하기 위한 조건하에서 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포로부터 디옥시리보핵산(DNA)을 단리하는 단계, 및 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 고분자량 분획을 분리하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포로부터 단리된 디옥시리보핵산(DNA)으로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 고분자량 분획을 분리하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 분리하는 단계 전에, 세포는 세포의 유전체에 전이 유전자 서열을 통합하기 위한 조건하에서 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 분리된 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 세포의 유전체에 통합하기 위한 조건하에서 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포로부터 디옥시리보핵산(DNA)을 단리하는 단계, 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 고분자량 분획을 분리하는 단계, 및 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 복제수를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 통합된 전이 유전자 서열의 분획은 통합된 복제수(PFGE후에 ddPCR에 의해, 예를 들어 본원에 기술된 통합된 벡터 복제수(iVCN) 분석법에 의해 결정됨)를 총 복제수(PFGE 없이 ddPCR에 의해, 예를 들어, 표준 벡터 복제수(VCN) 분석법에 의해 결정됨)로 나누어 결정된다. 일부 측면에서, 예를 들어 기준 유전자의 복제수로 정규화하거나, 유세포 분석에 의해 평가된 집단 내 CAR+ 세포의 수와 비교하는 것처럼 단백질 발현을 검출하는 방법에 의해 검출된 재조합 수용체 발현과 비교하는 등 비교 또는 정규화를 위해 다른 척도를 사용할 수 있다.
일부 측면에서, 재조합 수용체 등의 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열과 같은 전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하기 위한 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 재조합 수용체 등의 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하기 위한 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 예를 들어 프로모터, 전사 및/또는 전사 후 조절 요소 또는 반응 요소, 또는 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 연결된 표지자(예를 들어, 대리 표지자) 등의 조절 요소를 포함하는 전이 유전자 서열과 같은 전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하기 위한 방법이 제공된다. 임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열은 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 연결된 조절 요소를 포함한다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 예를 들어 유전자 조작을 위해 세포에 통합하기 위한 조건하에서 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 도입한 후에, 예를 들어 세포의 유전체로 전이 유전자 서열의 통합에 의해 유전자 조작의 타이밍, 정도 또는 진행을 평가하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 통합된 전이 유전자 서열의 평가된 복제수는 복수의 세포 또는 세포의 집단 내 통합된 전이 유전자 서열의 평균 복제수이다. 일부 구현예에서, 세포는 전이 유전자 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포의 집단에 존재하며, 여기서 상기 방법이 집단 내 복수의 세포 상에서 수행된다.
일부 측면에서, 제공된 방법은 전이 유전자 서열이 도입된 세포의 유전체로 도입된 전이 유전자 서열의 통합과 같이 유전자 조작의 타이밍, 정도 또는 진행을 결정 및 비교하기 위해 여러 시점 또는 단계에 또는 여러 상이한 샘플을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 전이 유전자 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 도입 후에 예를 들어 DNA 샘플을 여러 시점에 수득하는 시간 경로 실험을 통해, 전이 유전자 서열의 통합의 타이밍 및 정도를 평가하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 상기 방법은 조작된 세포 조성물을 위한 조작 또는 제조 공정의 여러 단계에 수행될 수 있다. 예를 들어, 제공된 방법은 팽창된 조작 공정 또는 비팽창된 조작 공정의 여러 단계에 수행될 수 있다.
일부 측면에서, 폴리뉴클레오타이드의 도입은 본원의 섹션 II.C 및 II.D에 기술된 것과 같이, 본원에 기술된 임의의 방법에 의해 수행된다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오타이드의 도입은 바이러스 형질도입에 의해 수행된다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오타이드의 도입은 물리적 전달 방법에 의해, 임의적으로 전기 천공법에 의해 수행된다.
일부 측면에서, 상기 방법은 통합의 대부분 또는 실질적으로 전체가 완료되는 시점을 결정하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 이 시점은 입양 세포 요법을 위한 조작된 세포 조성물과 같은 조작된 세포 조성물에서 예를 들어 본원에 제공된 방법에 따라 통합된 복제수를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 상기 방법은 통합의 대부분 또는 실질적으로 전체가 완료되지 않고 및/또는 통합되지 않은 잔류 서열이 세포 또는 세포 조성물에 존재하는 시점을 결정하는 데 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 상기 방법은 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 도입 후에 통합의 대부분 또는 실질적으로 전체가 완료되는, 세포의 적합한 인큐베이션 기간을 결정하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 상기 방법은 통합을 최대화하면서도 조작된 세포의 고갈을 감소시킬 수 있는 적합한 인큐베이션 기간의 결정을 가능하게 한다. 일부 측면에서, 세포 또는 세포의 집단 또는 복수의 세포는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입한 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 48, 54, 60, 66, 또는 72시간을 초과하여 인큐베이션되지 않는다. 일부 측면에서, 세포는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입한 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 72시간을 초과하여 인큐베이션되지 않는다. 일부 측면에서, 세포는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입한 이후에 약 30°C 초과 약 40°C 미만의 온도에서, 72시간을 초과하여 인큐베이션되지 않는다.
일부 구현예에서, 세포는 폴리뉴클레오타이드의 도입 및 전이 유전자 서열의 존재, 부재 및/또는 양의 결정 후에 냉동 보존되지 않는다.
일부 측면에서, 세포로부터 단리된 디옥시리보핵산(DNA)으로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 고분자량 분획을 분리하는 단계 - 여기서, 분리하기 전에, 세포는 바이러스 형질도입에 의해 세포의 유전체에 전이 유전자 서열의 통합을 위한 조건하에 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 도입되었고, 세포는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입한 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 48, 54, 60, 66, 또는 72시간을 초과하여 인큐베이션되지 않음 -; 및 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계를 포함하는 전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하기 위한 방법이 제공된다.
일부 측면에서, 바이러스 형질도입에 의해 세포의 유전체에 통합하기 위한 조건하에서 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포로부터 디옥시리보핵산(DNA)을 단리하는 단계 - 여기서, 세포는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입한 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 48, 54, 60, 66, 또는 72시간을 초과하여 인큐베이션되지 않음 -; 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 고분자량 분획을 분리하는 단계; 및 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계를 포함하는 전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하기 위한 방법이 제공된다.
2. 통합되지 않은 잔류 DNA의 수 평가
일부 측면에서, 통합되지 않은 잔류 전이 유전자 서열을 평가하는 방법이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포의 유전체에 통합하기 위한 조건하에서 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포로부터 디옥시리보핵산(DNA)을 단리하는 단계, 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 값 등의 본원에 기술된 임계값을 초과하는 DNA 샘플과 같은 고분자량 분획을 분리하는 단계, 및 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 결정함으로써, 전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하는 단계를 포함하는 방법의 임의 단계를 수행하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 통합되지 않은 잔류 전이 유전자 서열을 평가하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 DNA의 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 결정하기 위해, 본원에 기술된 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하기 위한 단계들을 수행하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 또한 고분자량 분획을 분리하지 않고 단리된 DNA 내 전이 유전자 서열의 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 결정함으로써 전이 유전자 서열의 총 복제수를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 고분자량 분획내 결정된 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 고분자량 분획을 분리하지 않고 총 단리된 DNA 내 결정된 질량, 중량, 농도 또는 복제수와 비교함으로써, 통합되지 않은 잔류 재조합 서열의 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 비교하는 것은 고분자량 분획을 분리하지 않고 결정된 질량, 중량, 농도 또는 복제수에서 고분자량 분획에 대해 결정된 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 빼는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 비교하는 것은 고분자량 분획을 분리하지 않고 결정된 질량, 중량, 농도 또는 복제수에 대한 고분자량 분획에 대해 결정된 질량, 중량, 농도 또는 복제수의 비율을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 고분자량 DNA를 분리하지 않고 복제수를 결정하는 단계는 본원, 예를 들어, 섹션 I.B에 기술된 임의의 것과 같은 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 고분자량 DNA를 분리하지 않고 복제수를 결정하는 단계는 예를 들어 문헌[Charrier et al., Gene Therapy (2011) 18, 479-487; Christodoulou et al., Gene Therapy (2016) 23, 113-118; Zhao et al., Human Gene Therapy Methods (2017) 28(4): 205-214; 및 Milone et al., Molecular Therapy: Methods & Clinical Development (2018) 8:210-221]에 기술된 방법을 사용하여 수행된다. 일부 측면에서, 고분자량 DNA를 분리하지 않은 복제수는 표준 벡터 복제수(VCN) 분석법을 포함한다.
일부 구현예에서, PCR은 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 디지털 PCR 또는 액적 디지털 PCR이다. 일부 구현예에서, PCR은 액적 디지털 PCR이다. 일부 구현예에서, PCR은 전이 유전자 서열의 적어도 일부에 상보적이거나 적어도 일부를 특이적으로 증폭할 수 있는 하나 이상의 프라이머를 사용하여 수행된다. 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 프라이머는 유전체에 통합되거나 통합될 전이 유전자 내 서열의 전부 또는 일부에 상보적이거나 전부 또는 일부를 특이적으로 증폭할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 프라이머는 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 일부에 상보적이거나 일부를 특이적으로 증폭할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 프라이머는 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소의 서열에 상보적이거나 이 서열을 특이적으로 증폭할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 프라이머는 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소의 서열에 상보적이거나 이 서열을 특이적으로 증폭할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 프라이머는 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 전사 후 조절 요소의 서열에 상보적이거나 이 서열을 특이적으로 증폭할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 프라이머는 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE)의 서열에 상보적이거나 이 서열을 특이적으로 증폭할 수 있다.
일부 구현예에서, 고분자량 분획을 분리하지 않고 복제수를 결정하는 단계는 고분자량 분획을 분리하지 않고 단리된 DNA 내 전이 유전자 서열의 복제수를 평가하는 단계 및 양 또는 농도를 고분자량 분획을 분리하지 않고 단리된 DNA 내 기준 유전자에 대해 정규화하거나 예를 들어 공지된 복제수의 표준 곡선으로 정규화하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 기준 유전자는 하우스키핑 유전자이다. 일부 구현예에서, 기준 유전자는 알부민(ALB)을 암호화하는 유전자이다. 일부 구현예에서, 기준 유전자는 리보뉴클레아제 P 단백질 서브유닛 p30(RPP30)을 암호화하는 유전자이다.
일부 구현예에서, 단리된 DNA 내 기준 유전자의 복제수를 결정하는 단계는 기준 유전자의 적어도 일부에 상보적이거나 적어도 일부를 특이적으로 증폭할 수 있는 하나 이상의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수행된다.
일부 구현예에서, 고분자량 분획 내 복제수를 결정하는 단계와 고분자량 분획을 분리하지 않고 복제수를 결정하는 단계는 동일한 프라이머 또는 동일한 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 수행된다.
일부 측면에서, 상기 방법은 또한 고분자량 분획을 분리하지 않고 단리된 DNA 내 전이 유전자 서열의 복제수를 결정하고, 이로써 전이 유전자 서열의 총 복제수를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 총 단리된 DNA(분획을 분리하지 않는 등으로)를 평가하여 결정된 복제수에서 고분자량 분획을 평가하여 결정된 복제수를 빼서 통합되지 않은 잔류 전이 유전자 서열의 복제수를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 결정된 복제수로부터 고분자량 분획을 평가하여 결정된 복제수를 총 단리된 DNA(분획을 분리하지 않는 등으로)를 평가하여 결정된 복제수로 나누어 통합되지 않은 잔류 전이 유전자 서열의 비율을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 통합되지 않은 잔류 전이 유전자 서열은 벡터 플라스미드, 선형 상보적 DNA(cDNA), 자가통합체(autointegrant) 또는 긴 말단 반복(LTR) 서클 중 하나 이상을 포함한다.
일부 측면에서, 통합된 전이 유전자 서열의 분획은 통합된 복제수(PFGE후에 ddPCR에 의해, 예를 들어 본원에 기술된 통합된 벡터 복제수(iVCN) 분석법에 의해 결정됨)를 총 복제수(PFGE 없이 ddPCR에 의해, 예를 들어, 표준 벡터 복제수(VCN) 분석법에 의해 결정됨)로 나누어 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 통합되지 않은 전이 유전자 서열의 분획은 1 - (통합된 전이 유전자 서열의 분획)으로 결정될 수 있다. 일부 측면에서, 통합되지 않은 전이 유전자 서열 복제수는 총 복제수에서 통합된 복제수를 빼서 결정될 수 있다.
3. 조작된 세포가 투여된 대상체의 샘플 내 전이 유전자 서열의 양 평가
일부 측면에서, 대상체의 생물학적 샘플 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 평가하기 위한 방법이 또한 제공된다. 일부 측면에서, 상기 대상체는 예를 들어 입양 세포 요법을 위해, 조작된 세포, 예를 들어, 세포에 전이 유전자 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하여 조작된 면역 세포를 투여하였다. 일부 측면에서, 상기 방법은 대상체의 생물학적 샘플로부터 디옥시리보핵산(DNA)을 단리하는 단계; 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 고분자량 분획을 분리하는 단계; 및 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 생물학적 샘플은 전이 유전자 서열을 포함하는 조작된 세포가 투여된 대상체에서 수득된다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 대상체에서 수득된 생물학적 샘플 내 복제수를 결정하는 단계와 같이 복제수를 결정하는 단계를 포함한다.
대상체의 생물학적 샘플 내 전이 유전자 서열을 평가하는 방법이 본원에 제공된다. 임의 구현예의 일부에서, 제공된 방법은 (a) 대상체의 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을 분리하는 단계 - 여기서 상기 생물학적 샘플은 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전이 유전자 서열을 포함하는 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및 (b) 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정함으로써 생물학적 샘플 전체 또는 일부에 존재하는 전이 유전자 서열을 평가하는 단계를 포함한다.
대상체의 생물학적 샘플 내 전이 유전자 서열을 평가하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 (a) 대상체의 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을 분리하는 단계 - 여기서 상기 생물학적 샘플은 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전이 유전자 서열을 포함하는 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및 (b) 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정함으로써 생물학적 샘플 전체 또는 일부에 존재하는 전이 유전자 서열을 평가하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체의 생물학적 샘플 내 전이 유전자 서열을 평가하기 위해 제공된 방법은 대상체의 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을 분리하는 단계 - 여기서 상기 생물학적 샘플은 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및 생물학적 샘플 전체 또는 일부 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 분리하는 단계 전에, 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 하나 이상의 세포 중 적어도 하나의 조작된 세포에 도입되었다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 생물학적 샘플의 전체 또는 일부 내 전이 유전자 서열의 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 투여된 세포의 약동학적(PK) 또는 약력학(PD) 매개변수를 결정하기 위한 기준으로 사용될 수 있다. 일부 측면에서, PK 또는 PD 매개변수는 핵산 기반 방법에 기초하여, 예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따르는 것과 같이 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 평가하는 것에 기초하여 측정될 수 있다. 일부 측면에서, PK 및 PD 매개변수는 세포의 특성 또는 표현형 측정에 기초하여, 예를 들어, 세포의 표면상에서 재조합 단백질의 발현 또는 세포 표면 표현형 또는 활성을 검출하여 측정할 수 있다. 일부 측면에서, 핵산 기반 방법과 세포 기반 방법의 조합을 포함하여 다양한 방법을 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 고분자량 분획을 분리하기 전에 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 세포로부터 DNA를 단리하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 전이 유전자 서열을 포함하는 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하는 조성물이 투여된 대상체에서 수득된다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 본원에 기술된 대상체에서 수득된 조직 샘플 또는 체액 샘플, 또는 기타 임의 샘플이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플이고 상기 조직은 종양이다. 일부 구현예에서, 조직 샘플은 종양 생검이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 체액 샘플이고 상기 체액 샘플은 혈액 또는 혈청 샘플이다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플 내 하나 이상의 세포는 본원에 기술된 임의 면역 세포 도는 그 집단을 포함하여 면역 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD3+, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포, 또는 특정 표현형을 포함하는 임의의 그와 같은 세포이다.
일부 측면에서, 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 방법 중 임의 방법과 본원에 기술된 서열의 질량, 중량, 농도 또는 복제수를 결정하는 정규화 또는 정량화 방법 중 임의 방법을 사용할 수 있다.
일부 측면에서, 제공된 방법은 T 세포의, 예를 들어, T 세포 기반 요법을 위해 투여된 T 세포의 노출, 수, 농도, 지속성 및 증식을 평가하기 위한 기준으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 세포, 예를 들어 면역 요법(예를 들어, T 세포 요법)을 위해 투여된 세포의 기능적 활성 또는 세포 표현형에 있어서의 변화 및/또는 세포의 노출 또는 장기 팽창 및/또는 지속성은 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외 시험(ex vivo)에서 T 세포의 특성을 평가하여 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분석법은 면역 요법(예를 들어, T 세포 요법)을 위해, 재조합 수용체를 발현하는 조작된 T 세포 등을 사용하여 세포 요법을 투여하기 전 또는 후에, 사용되는 T 세포의 기능을 결정하거나 확인하기 위해 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 노출, 수, 농도, 지속성 및 증식은 약동학적 매개변수와 관련이 있다. 일부 경우에, 약동학 특성은 투여 이후 최대(피크) 혈장 농도(Cmax), 피크 시간(즉, 최대 혈장 농도(Cmax)가 발생할 때; Tmax), 최저 혈장 농도(즉, 치료제, 예를 들어 CAR+ T 세포의 단위 용량들 사이의 최저 혈장 농도; Cmin), 배설 반감기(T1/2) 및 곡선 하 면적(즉, 시간 대 치료제 조작된 세포의 혈장 농도를 그려 생성된 곡선 하 면적; AUC)와 같은 매개변수를 측정하여 평가할 수 있다. 투여 이후 혈장 내 특정 치료제, 예를 들어, 조작된 세포의 농도는 제공된 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 통합된 전이 유전자 서열의 복제수는 대상체의 혈액 샘플과 같은 샘플에서 평가할 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 약동학적 매개변수를 결정하기 위해 유세포 분석 기반 방법 또는 면역 분석, ELISA, 또는 크로마토그래피/질량분광분석법 기반 분석법과 같은 기타 분석법 등의 PK를 결정하기 위한 다른 방법과 조합하여 또는 병행하여 사용할 수 있다. 총 세포 수를 검출 및/또는 추정하는 방법에는 문헌[Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177), Park et al, Molecular Therapy 15(4):825-833 (2007), Savoldo et al., JCI 121(5):1822-1826 (2011), Davila et al., (2013) PLoS ONE 8(4):e61338, Davila et al., Oncoimmunology 1(9):1577-1583 (2012), Lamers, Blood 2011 117:72-82, Jensen et al., Biol Blood Marrow Transplant 2010 September; 16(9): 1245-1256, Brentjens et al., Blood 2011 118(18):4817-4828]에 기술된 것이 포함된다.
일부 구현예에서, 투여된 세포, 예를 들어, 조작된 세포 조성물의 약동학 특성(PK)은 투여된 세포의 이용률, 예를 들어, 생체이용률을 평가하기 위해 결정된다. 일부 구현예에서, “노출”은 특정 기간에 걸쳐 치료제의 투여 후에 혈장(혈액 또는 혈청) 내 치료제, 예를 들어, 조작된 세포의 신체 노출을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 노출은 치료제, 예를 들어, 조작된 세포의 단위 용량 투여 후에 약동학적 분석에 의해 결정되는, 치료제 농도-시간 곡선 하 면적(AUC)으로 제시될 수 있다. 일부 경우에, AUC는 세포 요법에 투여된 세포에 대하여 세포수*일수/μL로, 또는 그에 대한 해당 단위로 표현된다. 일부 구현예에서, AUC는 샘플 환자 집단 등의 환자 집단 내 평균 AUC, 예를 들어, 하나 이상의 환자의 평균 AUC로 측정된다. 일부 구현예에서, 전신 노출(systemic exposure)은 예를 들어 0일부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28일 또는 그 이상까지, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15주 또는 그 이상까지, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 24, 48개월 또는 그 이상까지, 특정 기간 내 곡선 하 면적(AUC)을 지칭한다. 일부 구현예에서, AUC는 샘플 환자 집단과 같은 환자 집단의 평균 AUC 같은 측정된 약동학적(PK) 매개변수로부터 추정된 데이터 및 모든 측정된 데이터를 포함하여, 치료제, 예를 들어, 조작된 세포 투여 후에 0일부터 28일까지의 AUC(AUC0-28)로 측정된다. 일부 구현예에서, 시간에 따른 노출, 예를 들어, AUC0-28과 같이 특정 기간 동안의 AUC를 결정하기 위해, 여러 측정치 또는 시간에 따른 매개변수, 예를 들어, 세포 농도의 평가, 예를 들어, 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21 또는 28일 또는 그 이상일마다 취한 측정치를 사용하여 치료제 농도-시간 곡선을 생성한다.
일부 구현예에서, T 세포 투여 이후 및 요법 투여 이전, 도중 및/또는 이후 대상체 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 및/또는 양을 검출한다. 일부 구현예에서, T 세포 투여 이후 및 요법 투여 이전, 도중 및/또는 이후 대상체 내 재조합 수용체를 발현하는 세포(예를 들어, T 세포 기반 요법을 위해 투여된 CAR 발현 세포)의 존재, 부재 및/또는 양을 검출한다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열의 통합을 평가하기 위한 본원에 기술된 방법 중 임의 방법은 대상체의 혈액 또는 혈청 또는 장기 또는 조직 샘플(예를 들어, 질병 부위, 예를 들어, 종양 샘플) 내의 재조합 단백질을 발현하는 세포(예를 들어, T 세포 기반 요법을 위해 투여된 재조합 수용체를 발현하는 조작된 세포)의 양을 평가하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 지속성은 2배체 유전체당, 샘플의(예를 들어, 혈액 또는 혈청의) 체적 또는 면적당, 총 DNA 마이크로그램당 통합된 전이 유전자 서열의 복제수로, 또는 샘플의(예를 들어, 혈액 또는 혈청의) 마이크로리터당, 또는 샘플의 마이크로리터당 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 백혈구 세포 또는 T 세포의 총 수당 조작된 세포(예를 들어, 재조합 수용체 발현 세포)의 수로 정량화된다.
일부 구현예에서, 제공된 방법 중 임의 방법에 사용되는 프라이머 또는 프로브는 재조합 수용체를 암호화하는 핵산, 및/또는 예를 들어 프로모터, 전사 및/또는 전사 후 조절 요소 또는 반응 요소, 또는 표지자(예를 들어, 대리 표지자) 등의 조절 요소를 포함한 플라스미드 및/또는 벡터의 기타 구성요소 또는 요소를 결합, 인식 및/또는 증폭하는 데 특이적이다. 일부 구현예에서, 프라이머는 조절 요소에 특이적일 수 있다. 일부 구현예에서, 프라이머는 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소에 특이적이다. 일부 구현예에서, 프라이머는 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 수용체)을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE)의 전부 또는 일부를 증폭하는 데 특이적이다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열 세포는 조작된 세포의 투여 이후 4, 14, 15, 27 또는 28일 이상 후에 대상체에서 검출된다. 일부 측면에서, 세포는 조작된 세포 투여 이후 2, 4 또는 6주 이상 후 또는 3, 6 또는 12, 18 또는 24 또는 30 또는 36개월 이상 후 또는 1, 2, 3, 4, 5년 이상 후에 검출된다.
일부 구현예에서, 피크 수준 및/또는 AUC를 평가하고 및/또는 유전자 조작된 세포의 투여 시작 이후 적어도 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일 또는 21일의 시점에 대상체에서 샘플을 수득한다. 일부 구현예에서, 피크 수준 및/또는 AUC를 평가하고 및/또는 유전자 조작된 세포의 투여 시작 이후 (약) 11일 내지 22일, 12일 내지 18일 또는 14일 내지 16일(각 수치 포함) 사이 시점에 대상체에서 샘플을 수득한다.
팽창 및/또는 지속성을 나타내는 노출, 예를 들어, 입양 세포 요법을 위해 투여된 조작된 세포의 수 또는 농도는, 전이 유전자 서열의 최대 복제수, 또는 대상체가 노출되는 세포의 최대 수 또는 농도, 검출 가능한 세포 또는 특정 수나 백분율을 초과하는 세포의 지속 기간, 전이 유전자 서열의 복제수에 대한 곡선 하 면적(AUC), 시간에 따른 세포의 수 또는 농도, 및/또는 이들의 조합 및 이들의 지표의 관점에서 명시될 수 있다. 특정 샘플, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장 또는 조직, 예컨대 종양 샘플에서 핵산 또는 DNA의 총 양에 비해 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열의 복제수를 검출하기 위해 제공된 방법 및/또는 일반적으로 재조합 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 수용체를 발현하는 세포를 검출하는 유세포 분석법을 이용하여 상기 결과를 평가할 수 있다. 세포 기반 분석법 또한 재조합 수용체인 재조합 단백질에 의해 인식되는 항원을 발현하거나 질병 또는 병태의 세포에 대해 반응, 예를 들어 세포 독성 반응을 유도하고 및/또는 중화하고 및/또는 이에 결합할 수 있는 세포와 같은 기능성 세포의 수 또는 백분율 또는 농도를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 세포에 대한 대상체의 노출 증가는 세포의 팽창 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포(예를 들어 CAR 발현 세포)를 발현하는 수용체는 T 세포(예를 들어, CAR 발현 T 세포)의 투여 이후 대상체 내에서 팽창한다.
일부 구현예에서, 수용체를 발현하는 세포는 조작된 세포의 투여 이후 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60일 또는 그 이상일이 되는 시점에, 조작된 세포의 투여 이후 적어도 (약) 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24주 또는 그 이상 주 동안, 예를 들어, 제공된 방법에 의해 또는 유세포 분석 기반 검출 방법에 의해, 대상체의 혈청, 혈장, 혈액 또는 조직, 예를 들어, 종양 샘플에서 검출 가능하다.
일부 측면에서, 기술된 방법 중 임의 방법에 의해 측정한, 예를 들어 말초 혈액 또는 골수 또는 기타 구획 내에서, 100개 세포당 통합된 전이 유전자 서열의 질량, 중량, 농도 또는 복제수는 조작된 세포의 투여 이후 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 또는 적어도 약 6주, 또는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9, 10, 11, 또는 12개월 또는 적어도 2 또는 3년이 되는 시점에, 적어도 0.01, 적어도 0.1, 적어도 1, 또는 적어도 10일 수 있다. 일부 구현예에서, 유전체 DNA의 마이크로그램당 전이 유전자 서열의 복제수는 조작된 세포의 투여 이후 약 1주, 약 2주, 약 3주, 또는 적어도 약 4주가 되는 시점에 또는 상기 투여 이후 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 또는 적어도 2 또는 3년이 되는 시점에 적어도 100, 적어도 1000, 적어도 5000, 또는 적어도 10,000 또는 적어도 15,000 또는 적어도 20,000이다.
일부 측면에서, 조작된 세포에 도입된 전이 유전자 서열은 세포의 투여 이후, 예를 들어, T 세포의 투여 시작 이후 적어도 약 3개월, 적어도 약 6개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 1년, 적어도 약 2년, 적어도 약 3년 또는 3년 이상되는 시점에, 기술된 방법에 의해 대상체, 혈장, 혈청, 혈액, 조직 및/또는 그 질병 부위(예를 들어, 종양 부위)에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 조작된 세포의 투여 이후 시간이 흐름에 따라 대상체의 유체, 혈장, 혈청, 혈액, 조직, 장기 및/또는 질병 부위(예를 들어, 종양 부위) 내 재조합 단백질 세포의 농도에 대한 곡선 하 면적(AUC)을 측정한다.
II. 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 방법
일부 구현예에서, 통합된 핵산 평가를 위해 제공된 방법은 유전자 조작된 세포와 관련하여, 그리고 유전자 조작된 세포 생성을 위한 조작 또는 제조 공정 도중 하나 이상의 시점에 사용 또는 수행된다. 일부 측면에서, 제공된 방법이 구현 또는 수행되는 세포 또는 복수의 세포는 유전자 조작이 되었거나 유전자 조작 공정 중에 있는 세포를 포함하고, 입양 세포 요법과 같은 세포 요법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법이 구현 또는 수행되는 세포 또는 복수의 세포는 여러 조작 단계의 세포를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 서열을 포함한 전이 유전자 서열을 함유한 폴리뉴클레오타이드 도입 등에 의해 재조합 단백질을 발현하도록 조작된 T 세포 등의 면역 세포를 포함한다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 조작된 세포의 유전체 내 상기 전이 유전자 서열의 통합을 평가하는 데 사용된다.
일부 측면에서, 조작 또는 제조 공정은 T 세포 등의 면역 세포를 포함하여 세포의 자극, 활성화, 형질도입, 팽창, 배양 또는 증식을 포함한 하나 이상의 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 통합된 핵산을 평가하기 위한 제공된 방법은 유전자 조작된 T 세포와 같은 유전자 조작된 세포를 생성하거나 생산하는 공정의 일부로 수행될 수 있다.
일부 측면에서, 제공된 구현예는 단축된, 축약된 또는 비팽창된 제조 공정을 사용하는 것과 같이 팽창 단계를 포함하지 않는 조작 또는 제조 공정에 채용된다. 일부 측면에서, 단축된 또는 축약된 제조 공정은 재조합 수용체를 암호화하는 핵산의 도입 후에, 단축된 또는 축약된 팽창 단계를 포함하거나, 또는 팽창 단계를 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 단축된 또는 축약된 제조 공정은 세포가 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 조작된 세포에 도입한 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 임의적으로 (약) 37°C ± 2°C에서, 96시간을 초과하여 인큐베이션되지 않는 공정을 포함한다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 세포 요법을 위한 세포 또는 세포 조성물의 제조, 생성 또는 생산에 수반되는 하나 이상의 단계 또는 공정을 거치는 세포와 관련하여 사용된다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 세포를 조작하는 데 사용되는 전이 유전자 서열과 같은 핵산의 통합을 평가하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 요법은 재조합 수용체(예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR))와 같은 재조합 단백질을 발현하도록 조작된 T 세포와 같은 세포의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단계는 세포의 단리, 분리, 선택, 활성화 또는 자극, 형질도입, 배양, 팽창, 세척, 현탁, 희석, 농축 및/또는 제형화를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 요법을 생성하거나 생산하는 방법은 대상체로부터 세포를 단리, 준비, 처리, 하나 또는 자극 조건 하에서 배양하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은, 세포, 예를 들어 1차 세포가 생물학적 샘플로부터 단리, 예컨대 선택 또는 분리되는 단계; 선택된 세포가 형질도입을 위한 바이러스 제제(예를 들어, 통합을 위한 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 바이러스 제제)와 인큐베이션되고, 임의적으로 이어서 자극 시약의 존재 하에 상기 단리된 세포를 자극하는 단계; 상기 형질도입된 세포를 예컨대 상기 세포를 팽창시키기 위해 배양하는 단계; 상기 형질 도입된 세포를 조성물로 제형화하고 상기 조성물을 생물 의학 재료 용기에 도입시키는 단계의 순서로 수행되는 가공 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 제조 또는 조작 방법은 (a) 세포를 함유하는 생물학적 샘플(예를 들어, 전혈 샘플, 연막 샘플, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플, 비분획화 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집술 산물 또는 백혈구 성분채집술 산물)을 세척하는 단계; (b) 샘플로부터 세포(예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포)의 원하는 서브세트 또는 집단을 예를 들어 면역 친화도 기반 분리를 위한 면역 친화도 시약 또는 선택 시약과 세포를 인큐베이션함으로써 단리하는, 예를 들어 선택하는 단계; (c) 예컨대 재조합 수용체를 암호화하는 바이러스 벡터 입자와 상기 단리된, 예컨대 선택된 세포를 인큐베이션함으로써 재조합 수용체, 예를 들어 CAR을 암호화하는 제제를 상기 단리되거나 선택된 세포로 도입시키는 단계; (d) 예컨대 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 세포를 배양, 육성 또는 팽창시키는 단계; 및 (e) 예컨대 약학적으로 허용 가능한 완충제, 냉동 보존제 또는 기타 적합한 배지 중에 상기 형질도입된 세포를 제형화하는 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (f) 자극 조건에 세포를 노출시킴으로써 세포를 자극하는 단계를 더 포함할 수 있고, 이 단계는 세포를 바이러스 벡터 입자와 인큐베이션하기 이전, 도중 및/또는 이후에 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 희석, 농축 및/또는 완충제 교환과 같은 세척 또는 현탁 단계 중 하나 이상의 추가 단계가 상기 단계들 중 어느 하나의 단계 이전 또는 이후에 또한 수행될 수 있다. 일부 측면에서, 결과로 생성된 조작된 세포 조성물은 하나 이상의 생물 의학 배양 용기로 도입된다.
일부 구현예에서, 유전자 조작된 세포를 제조 또는 생산하기 위한 제공된 방법은 예를 들어 입양 세포 요법에서 임상적 이용을 위한 세포의 제조에서 하나, 그 이상 또는 모든 단계가 세포를 비멸균 조건에 노출시키지 않고 및 멸균실 또는 캐비닛을 사용할 필요 없이 수행되도록 수행된다. 상기 공정의 일부 구현예에서, 세포는 폐쇄된 시스템 내에서 모두 단리, 분리 또는 선택, 형질도입, 세척, 임의적으로 활성화 또는 자극 및 제형화된다. 상기 공정의 일부 측면에서, 세포는 폐쇄 시스템으로부터 발현되어 하나 이상의 생체 재료 용기로 도입된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 자동화된 방식으로 수행된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단계는 폐쇄된 시스템 또는 디바이스와 별개로 수행된다.
일부 구현예에서, 세포 요법을 제조, 생성 또는 생산하기 위한 방법 중 하나 이상의 다른 공정 단계를 수행하기 위해 폐쇄 시스템이 사용된다. 일부 구현예에서, 형질도입 및 조작 및 제형화 단계와 관련된 하나 이상 또는 모든 공정 단계, 예를 들어 단리, 선택 및/또는 농축, 가공, 인큐베이션 단계는 통합되거나 독립적인 시스템 및/또는 자동화되거나 프로그램 가능한 방식의 시스템, 디바이스 또는 장치를 사용하여 수행된다. 일부 측면에서, 시스템 또는 장치는 사용자가 가공, 단리, 조작 및 제형화 단계의 결과를 프로그램, 제어, 평가하고/거나 가공, 단리, 조작 및 제형화 단계의 다양한 측면을 조정할 수 있게 하는, 상기 시스템 또는 장치와 통신하는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 시스템은 문헌[WO2009/072003, US 20110003380 또는 WO2016/073602]에 기재된 바와 같은 시스템이다.
A. 세포의 단리 또는 선택
일부 구현예에서, 제공된 방법에 의해 평가 또는 분석되는 세포 또는 세포 조성물과 같은 조작된 세포는 1차 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 면역 세포 또는 농축된 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포이거나 또는 T 세포로 농축된다. 일부 구현예에서, 제공된 방법을 사용하여 평가 또는 분석할 세포는 T 세포이거나 T 세포로 농축된다. 일부 구현예에서, 세포는 CD4+ T 세포 또는 농축된 CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 CD8+ T 세포 또는 농축된 CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포 요법을 제조, 생성 또는 생산하기 위한 공정은 총 T 세포 예를 들어, CD3+ 또는 CD4+/CD8+ T 세포가 후속 단계의 공정을 수행하기 전에 인간 대상체로부터 수득된 샘플로부터 단리되거나 선택되는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 조작 또는 제조 방법은 특정 질병 또는 병태를 갖거나 세포 요법이 필요하거나 세포 요법이 투여될 대상체와 같은 대상체로부터 수득되거나 유래된 것과 같은 생물학적 샘플로부터의 세포 또는 이의 조성물의 단리를 위한 단계들을 포함한다. 일부 측면에서, 대상체는 세포가 단리, 가공 및/또는 조작되는 입양 세포 요법과 같은 특정 치료적 개입이 필요한 환자인 대상체와 같은 인간이다. 따라서, 일부 구현예에서 세포는 일차 세포, 예를 들어 1차 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 포함한다. 샘플은 대상체에서 직접 채취한 조직, 유체 및 기타 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원으로부터 직접 수득된 샘플 또는 가공된 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플에는 체액, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀, 조직 및 장기 샘플 (이로부터 유래된 가공 샘플 포함)이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
일부 측면에서, 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플이거나 또는 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술 산물이거나 이로부터 유래한다. 예시적인 샘플에는 전혈, 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간 , 폐, 위, 창자, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁경부, 고환, 난소, 편도 또는 기타 장기 및/또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 샘플에는 세포 요법, 예를 들어, 입양 세포 요법의 맥락에서 자가 및 동종이계 공급원으로부터의 샘플이 포함된다.
일부 실시예에서, 대상체의 순환 혈액으로부터의 세포는 예를 들어 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술에 의해 수득된다. 일부 측면에서, 샘플은 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 포함한 림프구를 함유하고, 일부 측면에서 적혈구 및 혈소판 이외의 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 대상체로부터 수집된 혈액 세포는, 예를 들어 혈장 분획을 제거하고 후속 가공 단계를 위한 적절한 완충제 또는 배지에 세포를 배치하기 위해 세척한다. 일부 구현예에서, 세포는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 세척된다. 일부 구현예에서, 세척 용액에는 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 많은 또는 모든 2가 양이온이 결여되어 있다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조업체의 지침에 따라 반자동 “병류(flow-through)” 원심분리기(예를 들어, Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter)로 달성된다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조업체의 지침에 따라 접선 유동 여과(tangential flow filtration, TFF)에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 세포는 세척 후 다양한 생체 적합성 완충제, 예를 들어 Ca++/Mg++이 없는 PBS에서 재현탁된다. 특정 구현예에서, 혈액 세포 샘플의 성분이 제거되고 이 세포는 배양 배지에서 직접 재현탁된다.
일부 구현예에서, 제조 방법은 형질도입 및 조작을 위해 단리, 선택 및/또는 농축 및/또는 인큐베이션 전이든 후이든 세포를 동결, 예를 들어, 냉동 보존하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 및 후속 해동 단계는 세포의 집단에서 과립구 및 어느 정도 단핵구를 제거한다. 일부 구현예에서, 세포는 예를 들어, 혈장 및 혈소판을 제거하기 위한 세척 단계 이후에 동결 용액에서 현탁된다. 일부 측면에서, 공지된 다양한 동결 용액 및 매개변수 중 어느 하나가 사용될 수 있다. 이어서, 상기를 DMSO 및 HSA의 최종 농도가 각각 10% 및 4%가 되도록 배지로 1:1로 희석시킨다. 이어서 세포를 일반적으로 분당 1°의 속도로 -80 ℃까지 동결시키고 액체 질소 저장 탱크의 기상(vapor phase)에서 저장한다.
일부 구현예에서, 세포 또는 집단의 단리는 하나 이상의 제조 단계 및/또는 비친화도 기반 세포 분리 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 세포는 하나 이상의 시약의 존재 하에 세척, 원심분리 및/또는 배양되어, 예를 들어 원치 않는 성분의 제거, 원하는 성분의 농축, 특정 시약에 민감한 세포를 용해하거나 제거한다. 일부 실시예에서, 세포는 하나 이상의 특성, 예컨대 밀도, 부착 특성, 크기, 특정 성분에 대한 민감성 및/또는 내성에 기초하여 분리된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 밀도 기반 세포 분리 방법, 예컨대 적혈구를 용해시켜 말초 혈액으로부터 백혈구의 조제 및 Percoll 또는 Ficoll 구배를 통한 원심분리를 포함한다.
일부 구현예에서, 선택 단계의 적어도 일부는 선택 시약과 함께 세포의 인큐베이션을 포함한다. 예를 들어 하나 이상의 상이한 세포 유형의 선택을 위한 하나 이상의 선택 시약을 이용하여 수행될 수 있는 선택 방법의 일부로서 선택 시약 또는 시약들과의 인큐베이션은 하나 이상의 특정 분자, 예컨대 표면 표지자, 예를 들어 표면 단백질, 세포내 표지자 또는 핵산의 세포 상 또는 세포 내 발현 또는 존재에 기초한다. 일부 구현예에서, 상기 표지자에 기초한 분리를 위한 선택 시약 또는 시약들을 사용하는 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 시약 또는 시약들은 친화도 또는 면역 친화도 기반 분리인 분리를 초래한다. 예를 들어, 일부 측면에서 선택은 하나 이상의 표지자, 전형적으로 세포 표면 표지자의 세포의 발현 또는 발현 수준에 기초하여, 예를 들어 상기 표지자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와의 인큐베이션 후 일반적으로 세척 단계 및 항체 또는 결합 파트너와 결합하지 않은 세포와 항체 또는 결합 파트너와 결합한 세포의 분리에 의한 세포 및 세포의 집단의 분리를 위한 시약 또는 시약들과의 인큐베이션을 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 및/또는 공정의 다른 측면은 문헌[WO 2015/164675]에 기술된 바와 같다.
상기 공정의 일부 측면에서, 일정 부피의 세포를 일정량의 원하는 친화도 기반 선택 시약과 혼합한다. 면역 친화도 기반 선택은 분리되는 세포와, 세포 상의 표지자, 예를 들어 고체 표면, 예를 들어 입자 상의 항체 또는 기타 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 분자 간의 양호하고 활발한 상호작용을 초래하는 임의의 시스템 또는 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 세포의 표지자에 특이적인 선택 제제(예를 들어, 항체)로 비드(예를 들어, 자성 비드) 같은 코팅된 입자를 사용하여 수행된다. 입자(예를 들어, 비드)는 일정한 세포 밀도 대 입자(예를 들어, 비드) 비율로 흔들거나 혼합하면서 튜브나 백과 같은 용기에서 세포와 배양 또는 혼합되어 양호한 상호작용의 활발한 촉진을 도울 수 있다. 다른 경우에, 상기 방법은 선택의 전부 또는 일부가 원심분리 챔버의 내부 공동에서 예를 들어, 원심분리 회전 하에서 수행되는 세포의 선택을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 친화도 기반 선택 시약과 같은 선택 시약과 함께 세포의 인큐베이션은 원심분리 챔버에서 수행된다. 특정 구현예에서, 단리 또는 분리는 문헌[WO2009/072003, US 20110003380 또는 WO2016/073602]에 기술된 시스템, 디바이스 또는 장치를 이용하여 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 선택 단계 또는 이의 일부(예를 들어, 항체 코팅된 입자, 예를 들어 자성 비드와의 인큐베이션)를 원심분리 챔버의 공동에서 수행함으로써, 사용자는 다양한 용액의 부피, 가공 중 용액의 첨가 및 이의 타이밍과 같은 특정 매개변수를 제어할 수 있으며, 이는 다른 이용 가능한 방법에 비해 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 인큐베이션 중 공동의 액체 부피를 감소시키는 능력은 선택에 사용되는 입자(예를 들어, 비드 시약)의 농도를 증가시킬 수 있어서 공동 내 세포의 총 수에는 영향을 주지 않고 용액의 화학적 전위를 증가시킬 수 있다. 이는 결국 가공되는 세포와 선택에 사용되는 입자 사이의 쌍 방향 상호작용을 증진할 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 시스템, 회로 및 제어와 연관된 경우, 챔버에서의 인큐베이션 단계 수행은 사용자가 인큐베이션 중에 원하는 시간에 용액의 교반에 영향을 미칠 수 있게 하고, 이는 또한 상호작용을 향상시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 선택 단계의 적어도 일부는 원심분리 챔버에서 수행되고, 이는 선택 시약과 세포의 인큐베이션을 포함한다. 상기 공정의 일부 측면에서, 일정 부피의 세포를 제조 업체의 지침에 따라 동일한 수의 세포 및/또는 동일한 부피의 세포의 선택을 위해 튜브 또는 용기에서 유사한 선택을 수행할 때 일반적으로 사용되는 것보다 훨씬 적은 원하는 친화도 기반 선택 시약의 양과 혼합한다. 일부 구현예에서, 제조사의 지침에 따라 동일한 수의 세포 및/또는 동일한 부피의 세포에 대해 튜브 또는 용기 기반 인큐베이션에서 세포의 선택을 위해 사용되는 동일한 선택 시약(들)의 양의 5% 이내, 10% 이내 , 15% 이내, 20% 이내, 25% 이내, 50% 이내 , 60% 이내, 70% 이내 또는 80% 이내 양의 선택 시약 또는 시약들의 양이 사용된다.
일부 구현예에서, 세포의 선택, 예를 들어 면역 친화도 기반 선택을 위해, 세포는 선택 시약, 예컨대 농축 및/또는 고갈이 바림직한 세포 상에는 있으나 임의적으로 지지체(scaffold) 예컨대 중합체 또는 표면, 예를 들어 비드, 예를 들어 자성 비드, 예컨대 CD4 및 CD8에 대해 특이적인 단클론 항체에 결합된 자성 비드에 결합된 항체와 같은 조성물 중의 다른 세포 상에는 없는 표면 표지자에 특이적으로 결합하는 분자와 같은 선택 시약을 갖는 선택 완충제를 또한 함유하는 챔버의 공동 내 조성물에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 기술된 바와 같이, 선택이 흔들거나 회전하는 튜브에서 수행될 경우 같은 수의 세포 또는 같은 부피의 세포와 대략 동일하거나 유사한 선택 효율을 달성하기 위해 전형적으로 사용되거나 필요한 선택 시약의 양과 비교하여 실질적으로 보다 적은 양(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 이내의 양)으로 챔버의 공동에 있는 세포에 선택 시약을 첨가한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 예를 들어 10mL 내지 200mL, 예컨대 10mL, 20mL, 30mL, 40mL, 50mL, 60mL, 70mL, 80mL, 90mL, 100mL, 150mL 또는 200mL 이상 또는 약 10mL, 20mL, 30mL, 40mL, 50mL, 60mL, 70mL, 80mL, 90mL, 100mL, 150mL 또는 200mL 이상 또는 약 10mL, 20mL, 30mL, 40mL, 50mL, 60mL, 70mL, 80mL, 90mL, 100mL, 150mL 또는 200mL 또는 10mL, 20mL, 30mL, 40mL, 50mL, 60mL, 70mL, 80mL, 90mL, 100mL, 150mL 또는 200mL의 시약의 인큐베이션을 갖는 표적 부피를 달성하기 위해 세포 및 선택 시약에 선택 완충제 첨가로 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 완충제 및 선택 시약은 세포에 첨가되기 전에 미리 혼합된다. 일부 구현예에서, 선택 완충제 및 선택 시약은 세포에 별도로 첨가된다. 일부 구현예에서, 선택 인큐베이션은 주기적으로 부드럽게 혼합하는 조건으로 수행되며, 이는 양호한 상호작용을 활발하게 촉진하는 데 도움이 될 수 있으며, 이로써 높은 선택 효율을 달성하면서 전반적으로 선택 시약을 보다 적게 사용하는 것이 가능할 수 있다.
일부 구현예에서, 선택 시약을 이용한 인큐베이션의 총 지속 기간은 (약) 5분 내지 (약) 6시간, 예컨대 30분 내지 3시간, 예를 들어 (약) 30분, 60분, 120분 또는 180분 이상이다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 일반적으로 스피닝(spinning)이 존재하는 것과 같은 혼합 조건 하에서 수행되며, 일반적으로 이는 상대적으로 낮은 힘 또는 속도, 예컨대 세포를 펠릿화하기 위해 사용되는 것보다 더 낮은 속도, 예컨대 (약) 600rpm 내지 (약) 1700rpm(예를 들어, (약) 600rpm, 1000rpm 또는 1500rpm 또는 1700rpm 또는 600rpm, 1000rpm 또는 1500rpm 또는 1700rpm 이상)에서, 예컨대 (약) 80g 내지 100g(예를 들어, (약) 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g 또는 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g 이상)의 챔버 또는 다른 용기의 벽 또는 샘플에서 RCF로 수행된다. 일부 구현예에서, 스핀은 상기와 같은 낮은 속도의 스핀과 이어지는 휴지 기간(rest period), 예컨대 스핀 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10초 동안의 휴지, 예컨대, 대략 1 또는 2초의 스핀과 이어지는 대략 5, 6, 7 또는 8초 동안의 휴지의 구간을 반복하여 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 공정은 챔버와 일체형인 완전히 폐쇄된 시스템 내에서 수행된다. 일부 구현예에서, 본 공정(및 일부 측면에서 또한 하나 이상의 추가 단계, 예컨대 성분채집술 샘플과 같은 세포를 함유하는 샘플을 세척하는 사전 세척 단계)은 자동화된 방식으로 수행되어, 자동화 프로그램을 이용하여 단일 폐쇄 시스템에서 세척 및 결합 단계를 완료하기 위해 세포, 시약 및 기타 성분이 적절한 시간 및 달성된 원심분리에서 챔버로 유입되고 챔버 밖으로 밀어내어진다.
일부 구현예에서, 세포 및 선택 시약 및/또는 시약들의 인큐베이션 및/또는 혼합 후, 인큐베이션된 세포는 특정 시약 또는 시약들의 존재 또는 부재에 기초하여 세포 선택을 위한 분리를 거친다. 일부 구현예에서, 분리는 선택 시약과 세포의 인큐베이션이 수행되었던 동일한 폐쇄 시스템에서 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 시약과 함께 인큐베이션 후, 선택 시약이 결합된 세포를 포함하는 인큐베이션된 세포는 세포의 면역 친화도 기반 분리를 위한 시스템으로 전달된다. 일부 구현예에서, 면역 친화도 기반 분리를 위한 시스템은 자성 분리 컬럼이거나 이를 함유한다.
상기 분리 단계는 시약, 예를 들어 항체 또는 결합 파트너에 결합된 세포가 추가 사용을 위해 유지되는 양성 선택 및/또는 시약, 예를 들어 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포가 유지되는 음성 선택에 기초할 수 있다. 일부 실시예에서, 두 분획 모두 추가 사용을 위해 유지된다. 일부 측면에서, 음성 선택은 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 항체가 이용 가능하지 않은 경우에 특히 유용할 수 있어서, 분리는 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발현된 표지자에 기초하여 가장 잘 수행된다.
일부 구현예에서, 공정 단계는 예컨대 친화도 기반 선택을 수행할 수 있는 시스템 또는 장치를 사용하여 인큐베이션된 것과 세포의 음성 및/또는 양성 선택을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 단리는 양성 선택에 의한 특정 세포의 집단에 대한 농축 또는 음성 선택에 의한 특정 세포의 집단의 고갈에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 양성 또는 음성 선택은 각각 양성 또는 음성 선택된 세포 상에서 발현(표지자+)되거나 상대적으로 보다 높은 수준으로 발현(표지자high)된 하나 이상의 표면 표지자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 다른 결합제와 세포를 인큐베이션함으로써 달성된다.
분리는 특정 표지자를 발현하는 특정 세포의 집단 또는 세포의 100% 농축 또는 제거로 귀결될 필요는 없다. 예를 들어, 표지자를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포에 대한 양성 선택 또는 농축은 상기 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 지칭하나, 상기 표지자를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재로 귀결될 필요는 없다. 마찬가지로, 표지자를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포의 음성 선택, 제거 또는 고갈은 상기 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 지칭하나, 상기 모든 세포의 완전한 제거로 귀결될 필요는 없다.
일부 실시예에서, 다수 라운드의 분리 단계가 수행되고, 여기서 한 단계에서 양성 또는 음성 선택된 분획은 후속 양성 또는 음성 선택과 같은 또 다른 분리 단계를 거친다. 일부 실시예에서, 단일 분리 단계는 예컨대 각각 음성 선택을 위해 표적화된 표지자에 대해 특이적인 다수의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 인큐베이션함으로써 동시에 다수의 표지자를 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있다. 마찬가지로, 다수의 세포 유형이 다양한 세포 유형에서 발현되는 복수의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 인큐베이션함으로써 동시에 양성 선택될 수 있다.
예를 들어, 일부 측면에서, 예컨대 하나 이상의 표면 표지자를 높은 수준으로 발현하거나 양성인 세포와 같은 T 세포, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포의 특정 하위 집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 상기 표지자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 결합 파트너와의 인큐베이션에 의해 선택된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 선택을 달성하기 위해 자성 비드 또는 상자성 비드와 같은 고체 지지체 또는 매트릭스에 예컨대 직접적으로 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, CD3+, CD28+ T 세포는 항-CD3/항-CD28 접합 자성 비드(예를 들어, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander, 및/또는 ExpACT® beads)를 사용하여 양성 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포는 B 세포, 단핵구 또는 다른 백혈구, 예컨대 CD14와 같은 비-T 세포 상에서 발현되는 표지자의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 측면에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계는 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포 독성 T 세포를 분리하는 데 사용된다. 상기 CD4+ 및 CD8+ 집단은, 하나 이상의 나이브(naive), 기억 및/또는 작동체(effector) T 세포 하위 집단 상에서 발현되거나 상대적으로 보다 높은 정도로 발현되는 표지자에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해 하위 집단으로 추가 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, CD8+ 세포는 예컨대 각각의 하위 집단과 관련된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해 나이브, 중앙 기억, 작동체 기억 및/또는 중앙 기억 줄기세포에 대해 추가로 농축되거나 고갈된다. 일부 구현예에서, 중앙 기억 T(TCM) 세포의 농축은 효능을 증가시키기 위해, 예컨대 투여 후의 장기간 생존, 팽창 및/또는 생착을 향상하기 위해 수행되며, 이는 일부 측면에서 상기 하위 집단에서 특히 견고하다. 문헌[Terakura et al., (2012) Blood.1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701]을 참조한다. 일부 구현예에서, TCM-농축 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 조합은 효능을 더욱 증진한다.
일부 구현예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 서브세트 모두에 존재한다. PBMC는 예컨대 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 사용하여 CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+ 분획에 대해 농축되거나 고갈될 수 있다.
일부 구현예에서, 중앙 기억 T(TCM) 세포의 농축은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 및/또는 CD127의 양성 또는 고도의 표면 발현에 기초하고; 일부 측면에서, 이는 CD45RA 및/또는 그랜자임 B를 발현하거나 고도로 발현하는 세포에 대한 음성 선택에 기초한다. 일부 측면에서, TCM 세포에 대해 농축된 CD8+ 집단의 단리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈 및 CD62L을 발현하는 세포에 대한 양성 선택 또는 농축에 의해 수행된다. 일 측면에서, 중앙 기억 T(TCM) 세포에 대한 농축은 CD4 발현에 기초하여 선택된 세포의 음성 분획으로 시작하여 수행되며, 이는 CD14 및 CD45RA의 발현에 기초한 음성 선택, 및 CD62L에 기초한 양성 선택을 거친다. 일부 측면에서, 상기 선택은 동시에 수행되며 다른 측면에서, 순차적으로, 어떠한 순서로든 수행된다. 일부 측면에서, CD8+ 세포의 집단 또는 하위 집단을 제조하는 데 사용된 동일한 CD4 발현 기반 선택 단계가 CD4+ 세포의 집단 또는 하위 집단을 생성하는 데 또한 사용되어, CD4 기반 분리로부터의 양성 및 음성 분획 모두가 유지되고, 임의적으로 하나 이상의 추가적인 양성 또는 음성 선택 단계 후에 방법의 후속 단계에서 사용된다. 일부 구현예에서, CD4+ 세포의 집단에 대한 선택 및 CD8+ 세포의 집단에 대한 선택은 동시에 수행된다. 일부 구현예에서, CD4+ 세포의 집단에 대한 선택 및 CD8+ 세포의 집단에 대한 선택은 어느 순서로든 순차적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 세포를 선택하는 방법은 문헌[미국 출원 공개 번호 US20170037369]에 기술된 바와 같은 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 선택된 CD4+ 세포의 집단 및 선택된 CD8+ 세포의 집단은 선택 후 결합될 수 있다. 일부 측면에서, 선택된 CD4+ 세포의 집단 및 선택된 CD8+ 세포의 집단은 백(bag)과 같은 용기에서 결합될 수 있다.
특정 실시예에서, PBMC 샘플 또는 다른 백혈구 샘플은, 음성 및 양성 분획 모두가 유지되는 CD4+ 세포의 선택을 거친다. 이어서 음성 분획은 CD14 및 CD45RA 또는 CD19의 발현에 기초한 음성 선택 및 CD62L 또는 CCR7과 같은 중앙 기억 T 세포에 특유한 표지자에 기초한 양성 선택을 거치고, 양성 및 음성 선택은 어느 순서로든 수행된다.
CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포의 집단을 식별하여 나이브, 중앙 기억 및 작동체 세포로 분류될 수 있다. CD4+ 림프구는 표준 방법으로 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 나이브 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ 또는 CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 중앙 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 일부 구현예에서, 작동체 CD4+ 세포는 CD62L- 및 CD45RO-이다.
일 실시예에서, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농축하기 위해, 단클론 항체 칵테일은 통상적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 양성 및/또는 음성 선택을 위한 세포의 분리가 가능하도록 자성 비드 또는 상자성 비드와 같은 고체 지지체 또는 매트릭스에 결합된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포 및 세포의 집단은 면역자성(또는 자성친화도) 분리 기법을 사용하여 분리되거나 단리된다(문헌[Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher ⓒ Humana Press Inc., Totowa, NJ]에서 검토됨).
일부 측면에서, 분리될 인큐베이션된 세포의 샘플 또는 조성물은 작고, 자화 가능 또는 자성 반응 물질, 예컨대 자성 반응성 입자 또는 미세입자, 예컨대 상자성 비드(예를 들어, Dynalbeads 또는 MACS® 비드)를 함유하는 선택 시약과 함께 인큐베이션된다. 자성 반응성 물질(예를 들어, 입자)은 일반적으로 분리가 바람직한, 예를 들어 음성 또는 양성 선택이 바람직한 세포 또는 세포의 집단에 존재하는 분자(예를 들어, 표면 표지자)에 특이적으로 결합하는 결합 파트너(예를 들어, 항체)에 직접 또는 간접적으로 부착된다.
일부 구현예에서, 자성 입자 또는 비드는 항체 또는 다른 결합 파트너와 같은 특이적인 결합 부재에 결합된 자성 반응성 물질을 포함한다. 자성 분리 방법에 사용할 공지된 많은 자성 반응성 물질이 공지되어 있으며, 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 문헌[Molday, 미국 특허 번호 4,452,773, 및 유럽 특허 명세서 EP 452342 B]에 기술된 것들이 있다. 문헌[Owen 미국 특허 번호 4,795,698 및 Liberti et al., 미국 특허 번호 5,200,084]에 기술된 것과 같은 콜로이드 크기의 입자가 사용될 수도 있다.
인큐베이션은 일반적으로 항체 또는 결합 파트너 또는 분자, 예컨대 자성 입자 또는 비드에 부착된 상기 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 2차 항체 또는 다른 시약이 샘플 내의 세포 상에 존재하는 경우 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 조건하에서 수행된다.
특정 구현예에서, 자성 반응성 입자는 1차 항체 또는 다른 결합 파트너, 2차 항체, 렉틴, 효소 또는 스트렙타비딘으로 코팅된다. 특정 구현예에서, 자성 입자는 하나 이상의 표지자에 특이적인 1차 항체의 코팅을 통해 세포에 부착된다. 특정 구현예에서, 비드보다는 세포가 1차 항체 또는 결합 파트너로 표지되고, 이어서 세포 유형 특이적 2차 항체- 또는 다른 결합 파트너(예를 들어, 스트렙타비딘)-코팅된 자성 입자가 첨가된다. 특정 구현예에서, 스트렙타비딘 코팅된 자성 입자는 비오틴이 부착된 1차 또는 2차 항체와 함께 사용된다.
일부 측면에서, 분리는 샘플이 자기장에 배치되는 절차로 달성되고, 이에 부착된 자성 반응성 또는 자화 가능 입자를 갖는 상기 세포는 자석에 끌려당겨지고 표지되지 않은 세포로부터 분리될 것이다. 양성 선택의 경우, 자석에 끌려당겨진 세포가 유지되고; 음성 선택의 경우, 끌려당겨지지 않은 세포(비표지 세포)가 유지된다. 일부 측면에서, 양성 및 음성 선택의 조합이 동일한 선택 단계 동안 수행되며, 상기 양성 및 음성 분획은 유지되고 추가적으로 가공되거나 추가적인 분리 단계를 거친다.
일부 구현예에서, 친화도 기반 선택은 자성 활성화 세포 분류(magnetic-activated cell sorting, MACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 통한 것이다. 자성 활성화 세포 분류(Magnetic Activated Cell Sorting, MACS), 예를 들어 CliniMACS 시스템은 이에 부착된 자화된 입자를 갖는 세포를 고순도로 선택할 수 있다. 특정 구현예에서, MACS는 외부 자기장의 적용 후에 비 표적 종 및 표적 종이 순차적으로 용리되는 방식으로 작동한다. 즉, 자화된 입자에 부착된 세포는 부착되지 않은 종이 용리되는 반면 제자리에 유지된다. 이어서, 상기 제1 용리 단계가 완료된 후, 자기장에 포획되고 용리가 방지된 종은 용리 및 회수될 수 있도록 상당한 방식으로 해제된다. 특정 구현예에서, 비 표적 세포는 표지되고 이종 세포의 집단으로부터 고갈된다.
일부 구현예에서, 자성 반응성 입자는 후속적인 인큐베이션, 배양 및/또는 조작될 세포에 부착되어 남아있고; 일부 측면에서, 상기 입자는 환자에게 투여하기 위한 세포에 부착되어 남아있는다. 일부 구현예에서, 자화 가능 또는 자성 반응성 입자는 세포로부터 제거된다. 세포에서 자화 가능 입자를 제거하는 방법은 공지되어 있고, 예를 들어 경쟁 비-표지 항체 및 절단 가능한 링커에 접합된 자화 가능 입자 또는 항체 등의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 자화 가능 입자는 생분해성이다.
일부 구현예에서, 세포 요법을 제조, 생성 또는 생산하는 공정은 CD4+ 및 CD8+ 세포가 별도로 단리된 다음 재조합 수용체, 예를 들어 CAR을 세포로 도입시키는 단계 전에 서로 혼합되는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, CD4+ 및 CD8+ 세포는 재조합 수용체를 암호화하는 제제의 도입 단계 및/또는 유전자 조작된 세포를 생산하기 위한 후속 공정 중 하나 이상의 단계 전에 1:5 내지 5:1의 CD4+ 대 CD8+ T 세포 비율, 예컨대 1:3 내지 3:1, 1:2 내지 2:1 또는 (약) 1:1의 CD4+ 대 CD8+ 세포의 비율로 혼합된다.
일부 구현예에서, 세포 요법을 제조, 생성 또는 생산하는 공정은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 별도로 단리하고, 선택되거나 단리된 CD4+ T 세포에 대한 하나 이상의 후속 단계를 별도로 수행하고 선택되거나 단리된 CD8+ T 세포에 대한 하나 이상의 후속 단계를 별도로 수행하는 단계를 포함한다. 상기 구현예의 측면에서, 재조합 수용체(예를 들어, CAR)로 유전자 조작된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 별도 조성물과 같은 형질도입된 세포는 세포를 제형화하는 단계 전에 단일 조성물로 결합될 수 있다. 상기 구현예의 다른 측면에서, 재조합 수용체(예를 들어, CAR)로 유전자 조작된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 별도 조성물과 같은 형질도입된 세포는 예컨대 대상체에게 별도로 투여하기 위해 별도로 제형화된다.
B. 세포의 활성화 및 자극
일부 구현예에서, 제공된 방법에 의해 평가 또는 분석된 세포와 같은 세포를 제조 또는 조작하기 위한 방법은 선택된 세포의 집단과 같은 단리된 세포를 자극하는 단계를 포함한다. 예를 들어 형질도입에 의한 통합을 위한 전이 유전자 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드의 도입과 같은 폴리뉴클레오타이드의 도입 전에 또는 이와 관련하여 인큐베이션이 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 형질도입 전에 자극은 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래한다.
일부 구현예에서, 제조 또는 조작은 세포, 예컨대 선택된 세포의 인큐베이션을 위한 단계를 포함하고, 상기 인큐베이션 단계는 세포의 배양, 육성, 자극, 활성화 및/또는 번식을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극제의 존재 하에 인큐베이션된다. 상기 조건은 집단에서 세포의 증식, 활성화 및/또는 생존을 유도하고, 항원 노출을 모방하고, 및/또는 재조합 항원 수용체의 도입과 같은 유전자 조작을 위해 세포를 프라이밍하도록 설계된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 자극 및/또는 활성화를 위한 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제(agents), 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체 및 세포를 활성화시키기 위해 설계된 임의의 기타 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 조건 또는 제제는 TCR 복합체의 세포내 신호 전달 도메인을 자극 또는 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 제제(예를 들어, 리간드)를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 제제는 TCR 성분, 예를 들어 항 CD3에 특이적인 것과 같이 예를 들어 ITAM 유도 신호의 활성화를 개시하기 위해 1차 신호를 전달하기에 적합한 제제 같이 T 세포에서 TCR/CD3 세포내 신호 전달 계단식 다단계 반응을 켜거나 개시한다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 T 세포 공자극 수용체(예를 들어, 항-CD28 또는 항-4-1BB)에 특이적인 것과 같은 공자극 신호를 촉진하는 하나 이상의 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제제 및/또는 리간드는 비드와 같은 고체 지지체 및/또는 하나 이상의 사이토카인에 결합될 수 있다. 자극제 중에는 항-CD3/항-CD28 비드(예를 들어, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander 및/또는 ExpACT® 비드)가 있다. 임의적으로, 팽창 방법은 (예를 들어, 적어도 약 0.5ng/mL 이상의 농도에서) 배양 배지에 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극제는 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, IL-2 농도는 약 10 유닛/mL 이상, 약 50 유닛/mL 이상, 약 100 유닛/mL 이상 또는 약 200 유닛/mL 이상이다.
상기 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제(agents), 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체 및 세포를 활성화시키기 위해 설계된 임의의 기타 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 인큐베이션은 예컨대 문헌[미국 특허 번호 6,040,177 Riddell et al., Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82 및/또는 Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701]에 기술된 기술에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 자극 조건 또는 자극제의 존재 하에서 인큐베이션의 적어도 일부는 예를 들어 문헌[WO2016/073602]에 기술된 바와 같은 원심분리 회전 하에서, 원심분리 챔버의 내부 공동에서 수행된다. 일부 구현예에서, 원심분리 챔버에서 수행되는 인큐베이션의 적어도 일부는 자극 및/또는 활성화를 유도하기 위한 시약 또는 시약들과 혼합하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 선택된 세포와 같은 세포는 원심분리 챔버에서 자극 조건 또는 자극제와 혼합된다. 상기 과정의 일부 측면에서, 일정 부피의 세포를 세포 배양 플레이트 또는 다른 시스템에서 유사한 자극을 수행할 때 일반적으로 사용되는 것보다 훨씬 적은 하나 이상의 자극 조건 또는 제제의 양과 혼합한다.
일부 구현예에서, 자극제는, 선택이 원심분리 챔버에서, 예를 들어 주기적으로 흔들거나 회전하는 튜브나 백에서 혼합되지 않고 수행될 경우 같은 수의 세포 또는 같은 부피의 세포와 대략 동일하거나 유사한 선택 효율을 달성하기 위해 전형적으로 사용되거나 필요한 자극제의 양과 비교하여 실질적으로 보다 적은 양(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 이내의 양)으로 챔버의 공동에 있는 세포에 첨가된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 예를 들어 10mL 내지 200mL, 예컨대 10mL, 20mL, 30mL, 40mL, 50mL, 60mL, 70mL, 80mL, 90mL, 100mL, 150mL 또는 200mL 이상 또는 약 10mL, 20mL, 30mL, 40mL, 50mL, 60mL, 70mL, 80mL, 90mL, 100mL, 150mL 또는 200mL 이상 또는 약 10mL, 20mL, 30mL, 40mL, 50mL, 60mL, 70mL, 80mL, 90mL, 100mL, 150mL 또는 200mL 또는 10mL, 20mL, 30mL, 40mL, 50mL, 60mL, 70mL, 80mL, 90mL, 100mL, 150mL 또는 200mL의 시약의 인큐베이션을 갖는 표적 부피를 달성하기 위해 세포 및 자극제에 인큐베이션 완충제 첨가로 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 완충제 및 자극제는 세포에 첨가하기 전에 미리 혼합된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 완충제 및 자극제는 세포에 별도로 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극 인큐베이션은 주기적으로 부드럽게 혼합하는 조건으로 수행되며, 이는 양호한 상호작용을 활발하게 촉진하는데 도움이 될 수 있으며, 이로써 세포의 자극 및 활성화를 달성하면서 전반적으로 자극제의 보다 적은 사용이 가능할 수 있다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 일반적으로 스피닝(spinning)이 존재하는 것과 같은 혼합 조건 하에서 수행되며, 일반적으로 이는 상대적으로 낮은 힘 또는 속도, 예컨대 세포를 펠릿화하기 위해 사용되는 것보다 더 낮은 속도, 예컨대 (약) 600rpm 내지 (약) 1700rpm(예를 들어, (약) 600rpm, 1000rpm 또는 1500rpm 또는 1700rpm 또는 600rpm, 1000rpm 또는 1500rpm 또는 1700rpm 이상)에서, 예컨대 (약) 80g 내지 100g(예를 들어, (약) 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g 또는 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g 이상)의 챔버 또는 다른 용기의 벽 또는 샘플에서 RCF로 수행된다. 일부 구현예에서, 스핀은 상기와 같은 낮은 속도의 스핀과 이어지는 휴지 기간(rest period), 예컨대 스핀 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10초 동안의 휴지, 예컨대, 대략 1 또는 2초의 스핀과 이어지는 대략 5, 6, 7 또는 8초 동안의 휴지의 구간을 반복하여 수행된다.
일부 구현예에서, 예를 들어 자극제와 인큐베이션의 총 지속 시간은 (약) 1시간 내지 96시간, 1시간 내지 72시간, 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간 또는 12시간 내지 24시간, 예컨대 (약) 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간 또는 72시간 이상이다. 일부 구현예에서, 추가 인큐베이션은 (약) 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간 또는 12시간 내지 24시간(수치 포함) 동안이다.
C. 전이 유전자 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드의 도입
일부 구현예에서, 제공된 방법은 전이 유전자 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 도입에 의해 조작된 세포를 평가하기 위해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법에 의해 평가 또는 분석된 세포와 같은 세포를 제조 또는 조작하기 위한 방법은 재조합 수용체와 같은 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 도입을 위한 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 전이 유전자 서열을 세포의 유전체에 통합하기 위한 조건 하에서 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 도입되었다. 세포에 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열과 같은 전이 유전자 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드의 도입은 여러 가지 상이한 전달 방법 중 임의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열을 통합하기 위한 조건은 예를 들어, 세포(예를 들어, 면역 세포)의 유전체에 전이 유전자 서열을 통합하기 위한 바이러스 형질도입 시스템을 사용하는 것과 같은 본원에 기술된 임의의 조건을 포함한다.
일부 측면에서, 재조합 수용체와 같은 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드는 벡터에 포함될 수 있다. 일부 측면에서, 상기 벡터에는 렌티바이러스 및 감마레트로바이러스 시스템을 포함한 바이러스 및 비-바이러스 시스템뿐만 아니라 PiggyBac 또는 Sleeping Beauty 기반 유전자 전달 시스템과 같은 트랜스포손 기반 시스템이 포함된다. 예시적인 방법은 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스), 형질도입, 트랜스포손 및 전기 천공법을 통한 것을 포함하여 핵산을 세포에 도입 또는 전달하기 위한 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드의 도입은 먼저 세포를 자극하고, 예컨대 세포를 증식, 생존 및/또는 활성화와 같은 반응을 유도하는 자극과 조합하고, 예를 들어 사이토카인 또는 활성화 표지자의 발현에 의해 측정된 바와 같이, 뒤이어 활성화된 세포의 형질도입 및 임상 적용에 충분한 수로 배양에서 팽창시켜 달성된다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 선형 또는 환형 핵산 분자, 예컨대 선형 또는 환형 DNA 또는 선형 RNA이며, 핵산 분자를 세포에 전달하기 위한 방법들 중 임의의 방법을 사용하여 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 형태로, 예를 들어, 비-바이러스 벡터로/내에서 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 비-바이러스 벡터는 유전자 전달을 위한 임의의 적합한 및/또는 공지된 방법, 예컨대(그러나 이에 한정되지 않는) 미세주입, 전기 천공법, 일시적 세포 압축 또는 압착(예컨대 문헌[Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27]에 기술된 것), 지질 매개 형질주입, 펩타이드 매개(예를 들어, 세포 관통 펩타이드) 또는 이들의 조합에 의해 형질도입 및/또는 형질주입을 위해 적합한 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드)이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전기 천공법을 통해 T 세포로 전달된다(예를 들어, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 및 Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437. 참조). 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전위(transposition)를 통해 T 세포로 전달된다(예를 들어, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; 및 Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126. 참조). 면역 세포에서 유전 물질을 도입하고 발현시키는 다른 방법에는 인산칼슘 형질주입(예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.에 기재된 바와 같음), 원형질체 융합, 양이온성 리포솜-매개 형질주입; 텅스텐 입자 촉진 미세 입자 충격(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); 및 인산스트론튬 DNA 공동 침전(Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))이 포함된다.
재조합 산물을 암호화하는 핵산 전달을 위한 다른 접근법 및 벡터는 예를 들어, 문헌[국제 특허 출원, 공개 번호: WO2014055668 및 미국 특허 번호 7,446,190]에 기재된 것이다.
일부 구현예에서, 세포(예를 들어, T 세포)는 팽창 도중 또는 후에 예를 들어, T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 바이러스 제제로 도입될 수 있다. 원하는 수용체의 폴리뉴클레오타이드 도입을 위한 상기 형질도입은 예를 들어 임의의 적합한 레트로바이러스 벡터로 수행될 수 있다. 이어서 유전자 변형 세포의 집단은 초기 자극(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 자극)으로부터 유리될 수 있으며, 후속적으로 제2 유형의 자극으로, 예를 들어 새로이 도입된 수용체를 통해 자극될 수 있다. 상기 제2 유형의 자극은 새로운 수용체의 프레임워크 내에서 직접 결합하는(예를 들어, 수용체 내의 불변 영역을 인지함으로써) 유전자 도입된 수용체의 펩타이드/MHC 분자, 즉 동종(교차 결합) 리간드(예를 들어, CAR의 천연 리간드) 또는 임의의 리간드(예컨대 항체) 형태의 항원 자극을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Cheadle et al, “Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy” Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 또는 Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014)]을 참조한다.
일부 경우에, 세포, 예를 들어, T 세포가 활성화되는 것이 필요하지 않은 벡터를 사용할 수 있다. 일부 상기의 경우에, 세포는 활성화되기 전에 선택 및/또는 형질도입될 수 있다. 따라서, 세포는 세포 배양 이전에 또는 이후에 조작될 수 있고, 일부 경우에는 배양의 적어도 일부와 동시에 또는 그 동안에 조작될 수 있다.
일부 측면에서, 세포는 또한 사이토카인 또는 다른 인자의 발현을 촉진하도록 조작된다. 추가 핵산 중에서, 예를 들어 도입을 위한 유전자는, 예컨대 전달된 세포의 생존력 및/또는 기능을 촉진함으로써 요법의 효능을 개선하기 위한 유전자; 예컨대 생체 내에서 생존 또는 국소화를 평가하기 위한 세포의 선택 및/또는 평가를 위한 유전자 표지자를 제공하기 위한 유전자; 문헌[Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); and Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)]에 기재된 바와 같이 예를 들어 생체 내에서 음성 선택에 세포를 예민하게 만들어 안정성을 개선하기 위한 유전자가 있고; 또한 우성 양성 선택 가능한 표지자를 음성 선택 가능한 표지자와 융합시켜 유래된 2작용성 선택 가능한 융합 유전자의 용도를 기술하는 문헌[WO 1992/008796 및 WO 1994/028143]을 참조한다. 예를 들어, 문헌[Riddell et al., 미국 특허 번호 6,040,177의 14-17열]을 참조한다.
일부 구현예에서, 도입은 재조합 단백질, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 분자와 조성물의 하나 이상의 세포를 접촉시킴으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 접촉은 회전 접종(예를 들어 원심분리 접종)과 같은 원심분리로 달성될 수 있다. 상기 방법은 문헌[WO2016/073602]에 기재된 바와 같은 임의의 것을 포함한다. 예시적인 원심분리 챔버는 Biosafe SA에 의해 생산 및 판매되는 챔버를 포함하며, Sepax® 및 Sepax® 2 시스템과 함께 사용하기 위한 챔버를 포함하고, A-200/F 및 A-200 원심분리 챔버 및 상기 시스템과 함께 사용하기 위한 다양한 키트를 포함한다. 예시적인 챔버, 시스템 및 공정 기기 및 캐비닛은 예를 들어 문헌[미국 특허 번호 6,123,655, 미국 특허 번호 6,733,433 및 US 2008/0171951 및 WO 00/38762]에 기재되어 있고, 각각의 내용은 본 명세서에 그 전체가 참조로 포함된다. 상기 시스템과 함께 사용하기 위한 예시적인 키트는 제품 이름 CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 또는 CS-900.2로 BioSafe SA에서 판매되는 일회용 키트를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 시스템은 시스템에서 수행되는 형질도입 단계 및 하나 이상의 다양한 다른 공정 단계, 예를 들어 본 명세서 또는 문헌[WO2016/073602]에 기재된 바와 같은 원심분리 챔버로 수행되거나 이와 관련하여 수행될 수 있는 하나 이상의 공정 단계의 양태를 작동, 자동화, 제어 및/또는 모니터링하기 위한 기기를 포함하여 다른 기기와 공동으로 포함되고/거나 이와 공동으로 배치된다. 일부 구현예에서 상기 기기는 캐비닛 내에 포함되어 있다. 일부 구현예에서, 기기에는 제어 회로, 원심분리기, 커버, 모터, 펌프, 센서, 디스플레이 및 사용자 인터페이스를 수용한 하우징을 포함한 캐비닛이 포함된다. 예시적인 디바이스가 문헌[미국 특허 번호 6,123,655, 미국 특허 번호 6,733,433 및 US 2008/0171951]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 시스템은 일련의 용기, 예를 들어 백, 튜브, 스톱콕, 클램프, 커넥터 및 원심분리 챔버를 포함한다. 일부 구현예에서, 백과 같은 용기는 동일한 백 또는 별도의 백과 같은 동일한 용기 또는 별도의 용기에 형질도입될 세포 및 바이러스 벡터 입자를 함유하는 백과 같은 하나 이상의 용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 시스템은 챔버 내로 들어오는 희석제 및/또는 세척 용액 및/또는 방법 중에 성분 및/또는 조성물을 희석, 재현탁 및/또는 세척하기 위한 기타 성분 같은 배지를 함유하는, 백 같은 하나 이상의 용기를 추가로 포함한다. 용기는 시스템의 하나 이상의 위치에, 예컨대 입력 라인, 희석 라인, 세척 라인, 폐기물 라인 및/또는 출력 라인에 대응하는 위치에 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 챔버는 예컨대 회전축 주위로 챔버를 회전시킬 수 있는 원심분리기와 결합되어 있다. 회전은 세포의 형질도입과 관련하여 및/또는 다른 공정 단계 중 하나 이상에서 인큐베이션 이전, 동중 및/또는 이후에 발생할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 하나 이상의 다양한 공정 단계는 예를 들어, 특정 힘으로 회전되면서 수행된다. 챔버는 챔버가 원심분리 중에 수직으로 위치하고 측면 벽과 축은 수직 또는 일반적으로 수직이며, 말단 벽은 수평 또는 일반적으로 수평이 되도록, 챔버는 전형적으로 수직 또는 일반적으로 수직 회전할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포, 바이러스 입자 및 시약을 함유하는 조성물을 일반적으로 상대적으로 작은 힘 또는 낮은 속도로, 예컨대 세포를 펠릿화하기 위해 사용되는 것보다 더 낮은 속도, 예컨대 (약) 600rpm 내지 1700rpm(예를 들어 (약) 600rpm, 1000rpm 또는 1500rpm 또는 1700rpm 또는 600rpm, 1000rpm 또는 1500rpm 또는 1700rpm 이상)으로 회전시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 회전은 예를 들어 챔버 또는 공동의 내벽 또는 외벽에서 측정된 바와 같은, (약) 100g 내지 3200g의 힘(예를 들어 (약) 100g, 200g, 300g, 400g, 500g, 1000g, 1500g, 2000g, 2500g, 3000g 또는 3200g 또는 (약)100g, 200 g, 300g, 400g, 500g, 1000g, 1500g, 2000g, 2500g, 3000g 또는 3200g 이상)으로, 예를 들어, 상대 원심력으로 수행된다. 용어 “상대 원심력” 또는 RCF는 일반적으로 회전축과 비교하여 공간의 특정 지점에서 지구의 중력에 대해 상대적인 물체 또는 물질(예컨대 세포, 샘플 또는 펠릿 및/또는 회전되는 챔버 또는 다른 용기의 지점)에 부여된 유효힘(effective force)으로 이해된다. 상기 값은 중력, 회전 속도 및 회전 반경(회전 축과 RCF를 측정하는 물체, 물질 또는 입자로부터의 거리)을 고려하여 잘 알려진 공식을 사용하여 결정될 수 있다.
D. 핵산 및 벡터
일부 구현예에서, 제공된 방법을 사용하여 평가 또는 분석한 세포는 유전자 조작된 면역 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포(예를 들어, T 세포)는 재조합 수용체와 같은 재조합 단백질을 발현하도록 유전자 조작된다. 일부 구현예에서, 재조합 단백질 또는 그 일부나 성분을 암호화하는 전이 유전자 서열을 함유한 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하여 수행된다. 일부 측면에서, 예를 들어 전이 유전자 서열을 함유한 폴리뉴클레오타이드의 일부는 서열의 통합을 위해 세포(예를 들어, 조작되는 세포)의 유전체에 도입된다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오타이드는 조작된 세포에 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 위한 바이러스 벡터 같은 벡터에 포함되어 있다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열을 함유한 폴리뉴클레오타이드는 벡터 분자에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스는 DNA 바이러스(예를 들어, dsDNA 또는 ssDNA 바이러스)이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 RNA 바이러스(예를 들어, ssRNA 바이러스)이다. 예시적인 바이러스 벡터/바이러스에는 예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스(AAV), 우두바이러스, 수두바이러스, 및 단순헤르페스바이러스 또는 본원의 다른 곳에 기술된 임의의 바이러스가 포함된다. 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 복제 원점, 프로모터 및 항체 내성을 암호화하는 유전자와 같은 추가 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포에 도입될 수 있다. 더욱이, 폴리뉴클레오타이드는 네이키드 핵산으로, 리포솜, 나노 입자 또는 폴록사머와 같은 물질과 복합된 핵산으로 도입될 수 있고, 또는 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 인테그라제 결함 렌티바이러스(IDLV))에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열과 같은 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스(AAV) 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 벡터와 같은 재조합 감염성 바이러스 입자를 사용하여 세포 내로 전달된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로바이러스 벡터(예를 들어 문헌[Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557] 참조) 또는 HIV-1 유래 렌티바이러스 벡터를 사용하여 T 세포 내로 전달된다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복 서열(long terminal repeat sequence, LTR), 예를 들어 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 골수증식 육종바이러스(myeloproliferative sarcoma virus, MPSV), 뮤린 배아줄기세포 바이러스(murine embryonic stem cell virus, MESV), 뮤린 줄기세포 바이러스(murine stem cell virus, MSCV), 비장 병소 형성 바이러스(spleen focus forming virus, SFFV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터를 갖는다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 임의의 조류 또는 포유류 세포 공급원으로부터 유래된 것을 포함한다. 레트로바이러스는 통상적으로 인간을 포함하여 몇몇 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미하는, 암포트로픽(amphotropic)이다. 일부 구현예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스의 객(gag), 폴(pol) 및/또는 엔브(env) 서열을 대체한다. 다수의 예시적인 레트로바이러스 시스템이 문헌[예를 들어, 미국 특허 번호 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109]에 기재되어 있다.
렌티바이러스 형질도입 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법이 예를 들어, 문헌[Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; 및 Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505]에 기재되어 있다.
다른 측면에서, 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 및/또는 비-바이러스 유전자 전달 방법에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 아데노 연관 바이러스(AAV)를 통해 세포에 전달된다. AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 및 이들의 조합을 포함하여 임의 AAV 벡터를 사용할 수 있다. 일부 예에서, AAV는 캡시드 혈청형과 비교하여 이종 혈청형인 LTR(예를 들어, AAV5, AAV6, or AAV8 캡시드를 갖는 AAV2 ITR)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제제(들)를 함유하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드는 재조합 AAV에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, AAV는 자신의 유전체를 본원에 기술된 바와 같이 숙주 세포(예를 들어, 표적 세포)의 유전체로 통합시킬 수 있다. 다른 구현예에서, AAV는 자기 상보성 아데노 연관 바이러스(scAAV), 예를 들어, 함께 어닐링하여 이중 가닥 DNA를 형성하는 두 가닥을 패키징하는 scAAV이다. 개시되는 방법에 사용될 수 있는 AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, 변형 AAV2(예를 들어, Y444F, Y500F, Y730F 및 S662V에서 변형), AAV3, 변형 AAV3(예를 들어, Y705F, Y731F 및/또는 T492V에서 변형), AAV4, AAV5, AAV6, 변형 AAV6(예를 들어, S663V 및/또는 T492V에서 변형), AAV7, AAV8, AAV 8.2, AAV9, AAV.rh10, 변형 AAV.rh10, AAV.rh32/33, 변형 AAV.rh32/33, AAV.rh43, 변형 AAV.rh43, AAV.rh64R1, 변형 AAV.rh64R1, 및 위형(pseudotyped) AAV, 예컨대 AAV2/8, AAV2/5 및 AAV2/6을 포함한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 벡터 내에 함유되거나 하나 이상의 벡터(들)에 클로닝될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 벡터(들)가 숙주 세포, 예를 들어, 조작을 위한 세포를 형질변환하거나 형질주입할 수 있다. 예시적인 벡터로는 플라스미드 및 바이러스 벡터와 같이 도입, 증식 및 팽창 또는 발현 또는 둘 모두를 위해 설계된 벡터가 포함된다. 일부 측면에서, 벡터는 발현 벡터, 예를 들어 재조합 발현 벡터이다. 일부 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 pUC 시리즈(Fermentas Life Sciences), pBluescript 시리즈(Stratagene, LaJolla, Calif.), pET 시리즈(Novagen, Madison, Wis.), pGEX 시리즈(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 또는 pEX 시리즈(Clontech, Palo Alto, Calif.)의 벡터일 수 있다. 일부 경우에, λG10, λGT11, λZapII(Stratagene), λEMBL4 및 λNM1149와 같은 박테리오파지 벡터도 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 식물 발현 벡터가 사용될 수 있고 식물 발현 벡터에는 pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19(Clontech)가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 동물 발현 벡터에는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo(Clontech)가 포함된다.
일부 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열 및/또는 추가 폴리펩타이드(들)는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터, 또는 트랜스포손을 통해 세포에 도입된다(예를 들어, Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063; Frecha et al. (2010) Molecular Therapy 18:1748-1757; and Hackett et al. (2010) Molecular Therapy 18:674-683 참조).
일부 구현예에서, 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 수용체)를 암호화하는 하나 이상의 전이 유전자 서열(들) 또는 벡터(들), 및/또는 추가 폴리펩타이드(들)가 팽창 도중 또는 후에 세포(예를 들어, T 세포)에 도입될 수 있다. 상기 전이 유전자 서열(들) 또는 벡터(들)의 도입은 예를 들어 임의의 적합한 레트로바이러스 벡터로 수행될 수 있다. 이어서 그 결과로 생성된 유전자 조작된 세포는 초기 자극(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 자극)으로부터 유리될 수 있으며, 후속적으로 제2 유형의 자극으로(예를 들어, 새로이 도입된 재조합 단백질, 예를 들어 재조합 수용체를 통해) 자극될 수 있다. 상기 제2 유형의 자극은 새로운 수용체의 프레임워크 내에서 직접 결합하는(예를 들어, 수용체 내의 불변 영역을 인식함으로써) 유전자 도입된 수용체의 펩타이드/MHC 분자, 즉 동종(교차 결합) 리간드(예를 들어, CAR의 천연 항원 및/또는 리간드) 또는 임의의 리간드(예컨대 항체) 형태의 항원 자극을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Cheadle et al, “Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy” Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 또는 Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014)]을 참조한다.
일부 경우에, 세포, 예를 들어, T 세포가 활성화되는 것이 필요하지 않은 벡터를 사용할 수 있다. 일부 상기의 경우에, 세포는 활성화 또는 자극 전에 선택 및/또는 형질도입될 수 있다. 따라서, 세포는 세포 배양 이전에 또는 이후에 조작될 수 있고, 일부 경우에는 배양의 적어도 일부와 동시에 또는 그 동안에 조작될 수 있다.
1. 형질도입을 위한 바이러스 벡터 입자의 제조
일부 구현예에서, 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열과 같은 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 재조합 감염성 바이러스 입자를 사용하여 세포내로 전달된다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 형질도입을 통해 도입된다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열은 바이러스 벡터에 포함되어 있다. 바이러스 벡터 유전체는 전형적으로 패키징 또는 생산자 세포주로 형질주입될 수 있는 플라스미드 형태로 작제된다. 상기 예 중 어느 하나에서, 재조합 수용체와 같은 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열은 일반적으로 바이러스 유전체의 비필수 영역에서와 같이 바이러스 벡터의 영역에 삽입되거나 위치된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 특정 바이러스 서열 자리에 바이러스 유전체로 삽입되어 복제 결함이 있는 바이러스를 생성한다.
유전체가 바이러스 벡터 유전체의 RNA 카피를 함유하는 레트로바이러스 입자를 생성하기 위해 다양한 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 성분이 바이러스 기반 유전자 전달 시스템을 만드는데 관여하는데, 첫째, 구조 단백질뿐만 아니라 바이러스 벡터 입자를 생성하는데 필요한 효소를 포함하는 패키징 플라스미드이고, 둘째, 바이러스 벡터 자체, 즉, 전달될 유전 물질이다. 생물학적 안전성 보호 장치를 상기 성분 중 하나 또는 둘 다의 설계에 도입할 수 있다.
일부 구현예에서, 패키징 플라스미드는 외피 단백질 이외의 HIV-1과 같은 모든 레트로바이러스 단백질을 함유할 수 있다(Naldini et al., 1998). 다른 구현예에서, 바이러스 벡터에는 독성과 관련된 유전자, 예를 들어 vpr, vif, vpu 및 nef 및/또는 Tat, 즉 HIV의 1차 전이 활성 인자(transactivator)와 같은 추가 바이러스 유전자가 결여될 수 있다. 일부 구현예에서, HIV 기반 렌티바이러스 벡터와 같은 렌티바이러스 벡터는 모 바이러스의 3가지 유전자: gag, pol 및 rev만을 포함하며, 이는 재조합을 통한 야생형 바이러스의 재구성 가능성을 감소 시키거나 제거한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 유전체는 바이러스 벡터 유전체로부터 전사된 바이러스 유전체 RNA를 바이러스 입자로 패키징하는 데 필요한 모든 성분을 함유하는 패키징 세포주에 도입된다. 대안적으로, 바이러스 벡터 유전체는 예를 들어 관심 재조합 단백질을 암호화는 하나 이상의 전이 유전자 서열 외에도 바이러스 성분을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 그러나, 일부 측면에서, 표적 세포에서 유전체의 복제를 방지하기 위하여, 복제에 필요한 내인성 바이러스 유전자는 제거되고 패키징 세포주에 별도로 제공된다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주는 입자를 생성하는데 필요한 성분을 함유하는 하나 이상의 플라스미드 벡터로 형질주입된다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 LTR, 시스-작용(cis-acting) 패키징 서열 및 관심 서열, 즉 CAR과 같은 항원 수용체를 암호화하는 핵산; 및 바이러스의 효소 성분 및/또는 구조 성분, 예컨대 Gag, pol 및/또는 rev를 암호화하는 하나 이상의 헬퍼 플라스미드를 포함한 바이러스 벡터 유전체를 함유하는 플라스미드로 형질주입된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 입자를 생성하는 다양한 유전 성분을 분리하기 위해 다중 벡터가 이용된다. 상기 일부 구현예에서, 패키징 세포에 별도의 벡터를 제공하는 것은 달리 복제 가능 바이러스를 생성할 수 있는 재조합 사건의 기회를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 모든 레트로바이러스 성분을 갖는 단일 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 입자, 예컨대 렌티바이러스 벡터 입자는 숙주 세포의 형질도입 효율을 증가시키기 위한 유사형이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 레트로바이러스 벡터 입자, 예컨대 렌티바이러스 벡터 입자는 VSV-G 당단백질을 갖는 유사형이고, 이는 형질도입될 수 있는 세포 유형을 확장하여 광범위한 세포 숙주 범위를 제공한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 예컨대 신드비스(Sindbis) 바이러스 외피, GALV 또는 VSV-G와 같은 이종향성(xenotropic), 다방성(polytropic) 또는 암포트로픽(amphotropic) 외피를 포함하는 비천연 외피 당단백질을 암호화하는 플라스미드 또는 폴리뉴클레오타이드로 형질주입된다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주는 바이러스 유전체 RNA를 렌티바이러스 벡터 입자로 패키징하기 위해 트랜스에서 요구되는 바이러스 조절 및 구조 단백질을 포함한 성분을 제공한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 렌티바이러스 단백질을 발현하고 기능성 렌티바이러스 벡터 입자를 생성할 수 있는 임의의 세포주일 수 있다. 일부 측면에서, 적합한 패키징 세포주에는 293(ATCC CCL X), 293T, HeLA(ATCC CCL 2), D17(ATCC CCL 183), MDCK(ATCC CCL 34), BHK(ATCC CCL-10) 및 Cf2Th(ATCC CRL 1430) 세포가 포함된다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주는 안정적으로 바이러스 단백질(들)을 발현한다. 예를 들어, 일부 측면에서, gag, pol, rev 및/또는 기타 구조 유전자를 함유하나 LTR 및 패키징 성분은 함유하지 않는 패키징 세포주가 작제될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 이종 단백질을 암호화하는 핵산 분자 및/또는 외피 당단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 바이러스 벡터 유전체와 함께 하나 이상의 바이러스 단백질을 암호화하는 핵산 분자로 일시적으로 형질주입될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 및 패키징 및/또는 헬퍼 플라스미드는 패키징 세포주 내로 형질주입 또는 감염을 통해 도입된다. 패키징 세포주는 바이러스 벡터 유전체를 함유하는 바이러스 벡터 입자를 생산한다. 형질주입 또는 감염을 위한 방법은 잘 알려져 있다. 비제한적인 예에는 인산 칼슘, DEAE-덱스트란 및 리포펙션(lipofection) 방법, 전기 천공법 및 미세주입이 포함된다.
재조합 플라스미드, 및 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열이 특수 세포주로(예를 들어, 인산 칼슘 침전에 의해) 도입될 때, 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사물이 바이러스 입자로 패키징되도록 허용할 수 있으며, 이어서 이는 배양 배지로 분비될 수 있다. 이어서 일부 구현예에서 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지가 수집되고, 임의적으로 농축 및 유전자 전달을 위해 사용된다. 예를 들어, 일부 측면에서, 패키징 플라스미드 및 전달 벡터를 패키징 세포주로 공-형질주입 후, 바이러스 벡터 입자는 배양 배지로부터 회수되어 당업자들에 의해 사용되는 표준 방법에 의해 적정된다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 입자의 생성을 허용하는 플라스미드의 도입에 의해 예시적인 HEK 293T 세포주와 같은 패키징 세포주에서 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포는 형질주입되고/거나 gag 및 pol을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 재조합 수용체, 예컨대 항원 수용체(예를 들어 CAR)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 rev 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 임의적 및/또는 추가적으로 형질주입되고/거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 VSV-G와 같은 비천연 외피 당단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 임의적 및/또는 추가적으로 형질주입되고/거나 이를 함유한다. 일부 상기 구현예에서, 세포(예를 들어, HEK 293T 세포)의 형질주입 후 대략 2일 후에, 세포 상청액은 재조합 렌티바이러스 벡터를 함유하고 이는 회수되어 적정될 수 있다.
회수 및/또는 생성된 레트로바이러스 벡터 입자는 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 표적 세포를 형질도입하는 데 사용될 수 있다. 일단 표적 세포에서, 바이러스 RNA는 역전사되고, 핵으로 들어가서 안정적으로 숙주 유전체에 통합된다. 바이러스 RNA의 통합 후 1 또는 2일 후, 재조합 단백질(예를 들어, 항원 수용체, 예컨대 CAR)의 발현이 검출될 수 있다.
E. 세포 배양 및/또는 팽창
일부 구현예에서, 제공된 방법을 사용하여 평가 및/또는 분석된 세포(예를 들어, 조작된 세포)가 폴리뉴클레오타이드의 도입 후 세포의 배양 및/또는 팽창을 위한 단계를 포함하지 않는 조작 또는 제조 방법을 사용하여, 또는 비팽창 제조 공정 사용과 같은 단축된 또는 축약된 조작 또는 제조 공정을 사용하여 생성된다. 일부 측면에서, 단축된 또는 축약된 제조 공정은 재조합 수용체를 암호화하는 핵산의 도입 후에, 단축된 또는 축약된 팽창 단계를 포함하거나, 또는 팽창 단계를 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입 후, 세포는 팽창을 위한 단축된 또는 축약된 인큐베이션 단계를 거치거나 팽창 단계를 거치지 않는다(예를 들어, 비팽창 제조 공정을 거친다). 일부 측면에서, 제공된 방법은 비팽창, 단축된 또는 축약된 제조 공정 도중 하나 이상의 시점에 수행된다.
일부 구현예에서, 제공된 방법을 사용하여 평가 및/또는 분석된 세포(예를 들어, 조작된 세포)가 조작된 세포를 배양(예를 들어, 증식 및/또는 팽창을 촉진하는 조건 하에서 세포를 배양)하기 위한 하나 이상의 단계를 포함할 수 있는 조작 또는 제조 방법을 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 조작된 세포를 배양하기 위한, 예를 들어 증식 및/또는 팽창을 촉진하는 조건 하에서 세포를 배양하기 위한 하나 이상의 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어 바이러스 형질도입을 통해 폴리뉴클레오타이드의 도입을 위한 공정의 적어도 일부 도중 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 도입 이후에, 세포는 예컨대 세포의 배양 또는 팽창을 위해 배양된다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 예를 들어 바이러스 형질도입을 통해 폴리뉴클레오타이드의 도입 후에 하나 이상의 시점에 예컨대 세포의 배양 또는 팽창 도중 하나 이상의 시점에 수행될 수 있다.
일부 측면에서, 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입 후에, 세포는 후속적으로 배양을 위해 백과 같은 용기로 옮겨진다. 일부 구현예에서, 세포의 배양 또는 팽창을 위한 용기는 관류 백과 같은 생물 반응기 백이다. 일부 구현예에서, 생물 반응기로 둘러싸인, 연결된 및/또는 제어 하에 배양된 세포는 생물 반응기 없이 배양된 세포, 예를 들어 예컨대 혼합, 흔들림, 이동 및/또는 관류 없이 정적 조건 하에서 배양된 세포보다 배양 도중 더 빠르게 팽창이 된다.
일부 구현예에서, 조작된 세포는 유전자 조작 단계 이후에, 예를 들어 형질도입 또는 형질주입에 의해 재조합 폴리펩타이드를 세포에 도입하는 단계 이후에 증식 및/또는 팽창을 촉진하는 조건 하에서 배양된다. 특정 구현예에서, 세포가 자극 조건 하에서 인큐베이션되고 재조합 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)로 형질도입되거나 형질주입된 후, 세포가 배양된다. 일부 구현예에서, 배양은 농축된 T 세포의 하나 이상의 배양 조성물을 생성한다.
일부 구현예에서, 조작된 세포는 첨가된 세포의 배양을 위한 세포 배지 및/또는 세포로, 예를 들어, 급이 포트(feed port)를 통해, 채워질 수 있는 용기에서 배양된다. 세포의 배양이 예를 들어, 세포의 팽창 및/또는 증식을 위해 바람직한 임의의 세포 공급원으로부터 세포가 유래될 수 있다.
일부 측면에서, 배양 배지는 T 세포와 같은 세포의 성장, 배양, 팽창 또는 증식을 지원하는 적응된 배양 배지이다. 일부 측면에서, 배지는 염, 아미노산, 비타민, 설탕 또는 이의 임의의 조합물의 혼합물을 함유하는 액체일 수 있다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 예컨대 배양 동안 세포의 배양, 팽창 또는 증식을 자극하기 위한 하나 이상의 자극 조건 또는 제제를 추가로 함유한다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 IL-2, IL-7 또는 IL-15로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 배양 또는 인큐베이션 동안 배양 배지에서 하나 이상의 사이토카인의 농도는 독립적으로 (약) 1 IU/mL 내지 1500 IU/mL, 예컨대 (약) 1 IU/mL 내지 100 IU/mL, 2 IU/mL 내지 50 IU/mL, 5 IU/mL 내지 10 IU/mL, 10 IU/mL 내지 500 IU/mL, 50 IU/mL 내지 250 IU/mL 또는 100 IU/mL 내지 200 IU/mL, 50 IU/mL 내지 1500 IU/mL, 100 IU/mL 내지 1000 IU/mL 또는 200 IU/mL 내지 600 IU/mL이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인의 농도는 독립적으로 (약) 1 IU/mL, 5 IU/mL, 10 IU/mL, 50 IU/mL, 100 IU/mL, 200 IU/mL, 500 IU/mL, 1000 IU/mL 또는 1500 IU/mL 이상이다.
일부 측면에서, 세포는 조작된 세포 및 배양 배지의 전달 후에 일부 시간 이상 동안 배양(예컨대, 인큐베이션)된다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 인간 T 림프구와 같은 1차 면역 세포의 성장에 적합한 온도, 예를 들어, 약 25℃ 이상, 일반적으로 약 30℃ 이상 및 일반적으로 (약) 37℃를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 25 내지 38℃, 예컨대 30 내지 37℃, 예를 들어 (약) 37℃ ± 2℃에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 배양, 예를 들어, 육성 또는 팽창이 원하는 또는 임계 밀도, 세포 수 또는 세포의 단위 용량으로 귀결될 때까지 기간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 그 이상 초과 또는 약 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 그 이상 초과 또는 약 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 그 이상 동안 수행된다.
일부 구현예에서, 세포는 세포 배양 중 이산화탄소의 표적량을 유지하기 위한 조건 하에서 인큐베이션된다. 일부 측면에서, 이는 성장 중 세포의 최적 배양, 팽창 및 증식을 보장한다. 일부 측면에서, 이산화탄소(CO2)의 양은 상기 가스의 10% 내지 0% (v/v) 사이, 예컨대 상기 가스의 8% 내지 2% (v/v)사이 , 예를 들어 (약) 5% (v/v) CO2의 양이다.
일부 구현예에서, 세포는 생물 반응기와 관련하여 사용되는 용기(예를 들어, 백)를 사용하여 인큐베이션된다. 일부 경우에, 생물 반응기는 움직임이나 흔들림에 노출될 수 있고, 이는 일부 측면에서, 산소 전달을 증가시킬 수 있다. 생체 반응기를 움직이는 것은 수평 축을 따라 회전하는 것, 수직 축을 따라 회전하는 것, 생물 반응기의 경사진 또는 기울어진 수평 축을 따라 흔들리는 움직임 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 흔들리면서 수행된다. 흔들리는 속도 및 흔들리는 각도는 원하는 교반을 달성하기 위해 조정될 수 있다. 일부 구현예에서 흔들기 각도는 (약) 20°, 19°, 18°, 17°, 16°, 15°, 14°, 13°, 12°, 11°, 10°, 9°, 8°, 7°, 6°, 5°, 4°, 3°, 2° 또는 1°이다. 특정 구현예에서, 흔들기 각도는 6 내지 16°이다. 다른 구현예에서, 흔들기 각도는 7 내지 16°이다. 다른 구현예에서, 흔들기 각도는 8-12°이다. 일부 구현예에서, 흔들기 속도는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40rpm이다. 일부 구현예에서, 흔들기 속도는 4 내지 12rpm, 예컨대 4 내지 6rpm(수치 포함) 사이이다. 세포 배양 팽창의 적어도 일부는 흔들림 동작, 예컨대 5° 내지 10° 사이, 예컨대 6°의 각도에서, 일정한 흔들림 속도, 예컨대 5 내지 15RPM 사이, 예컨대 6RMP 또는 10RPM의 속도로 수행된다. CD4+ 및 CD8+ 세포는 각각 임계 양 또는 임계 세포 밀도에 도달할 때까지 각각 별도로 팽창된다.
일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 정적 조건 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 예컨대 배양 중에 소비된 배지를 외부로 관류하고 신선한 배지를 안으로 관류하는 관류로 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 예컨대 급이 포트를 통해 세포 배양에 신선한 배양 배지를 관류하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 관류 중에 추가된 배양 배지는 하나 이상의 자극제, 예를 들어 하나 이상의 재조합 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15를 함유한다. 일부 구현예에서, 관류 중에 첨가된 배양 배지는 정적 인큐베이션 중에 사용된 것과 동일한 배양 배지이다.
일부 구현예에서, 인큐베이션 이후, 용기(예를 들어, 백)는 원심분리 챔버를 보유한 시스템에 다시 연결되는 것과 같이, 세포 요법을 제조, 생성 또는 생산하기 위한 하나 이상의 다른 공정 단계를 수행하기 위한 시스템에 다시 연결된다. 일부 측면에서, 배양된 세포는 배양된 세포의 제형을 위해 백에서 챔버의 내부 공동으로 전달된다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 배양(예를 들어, 육성 또는 팽창)이 원하는 또는 임계 밀도, 세포 수 또는 세포의 단위 용량으로 귀결될 때까지 기간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 생물 반응기로 둘러싸인, 연결된 및/또는 제어 하에 배양된 세포는 21일, 14일, 10일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일, 60시간, 48시간, 36시간, 24시간 또는 12시간 내에 임계 팽창, 세포 수 및/또는 밀도에 도달하거나 이를 달성한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 그 이상 초과 또는 약 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 그 이상 초과 또는 약 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 그 이상 수행된다. 일부 측면에서, 인큐베이션은 핵산의 도입 후에 예컨대 (약) 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 또는 96시간 미만 동안 단축 또는 축약된다. 일부 측면에서, 인큐베이션은 전이 유전자 서열을 세포의 유전체에 전달 및 통합하기에 충분히 수행된다.
일부 구현예에서, 세포는 단축된 또는 축약된 시간 동안 배양되거나 비팽창 제조 공정을 거친다. 일부 측면에서, 세포는 예를 들어 형질도입 또는 전기 천공법을 통해 핵산의 도입 후에 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 미만 동안 배양된다. 일부 구현예에서, 세포는 약 2 내지 3일, 3 내지 4일, 4 내지 5일, 5 내지 6일 또는 6 내지 7일 또는 그 이하 동안(각 수치 포함) 배양된다.
일부 측면에서, 상기 방법은 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 도입 후에 통합의 대부분 또는 실질적으로 전체가 완료되는, 세포의 적합한 인큐베이션 기간을 결정하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 상기 방법은 통합을 최대화하면서도 조작된 세포의 고갈을 감소시킬 수 있는 적합한 인큐베이션 기간의 결정을 가능하게 한다. 일부 측면에서, 세포 또는 세포의 집단 또는 복수의 세포는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입한 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 48, 54, 60, 66, 또는 72시간을 초과하여 인큐베이션되지 않는다. 일부 측면에서, 세포는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입한 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 72시간을 초과하여 인큐베이션되지 않는다. 일부 측면에서, 세포는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입한 이후에 약 30°C 초과 약 40°C 미만의 온도에서, 72시간을 초과하여 인큐베이션되지 않는다.
F. 평가를 위한 예시적인 세포
일부 측면에서, 제공된 방법은 팽창 또는 비팽창 제조 공정을 포함하여 세포 조작 동정의 단계 일부 또는 전부를 거친 복수의 세포 또는 단일의 단리된 세포상에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 하나 이상의 시점 도중에, 예컨대 세포 조작 공정의 하나 이상의 시점 도중 또는 이후에 수행된다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 팽창 단계를 포함하는, 또는 팽창 단계를 포함하지 않는 또는 단축되거나 축약된 공정인 조작 또는 제조 공정을 포함하여 세포 조작 또는 세포 제조 공정의 완료 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 세포 요법이 투여된 대상체의 샘플에서 수행될 수 있다. 일부 측면에서, 샘플은 세포 요법의 투여 후에 수득된, 대상체의 혈액 또는 혈청 또는 장기 또는 조직 샘플(예를 들어, 질병 부위, 예컨대 종양 샘플)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제공된 방법에 따라서 평가 및 분석되는 세포는 1차 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 면역 세포 또는 농축된 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포이거나 또는 T 세포로 농축된다. 일부 구현예에서, 세포는 CD4+ T 세포 또는 농축된 CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 CD8+ T 세포 또는 농축된 CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작된 세포 또는 농축된 유전자 조작된 세포의 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작될 세포 또는 유전자 되고 있는 세포를 포함하거나 유전자 조작된 세포이며, 예컨대 하나 이상의 단계가 진행 중인 또는 제조 또는 조작 공정의 단계 중인 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작되고 있거나 유전자 조작될 세포의 농축된 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작된 T 세포 또는 농축된 유전자 조작된 T 세포의 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 재조합 수용체와 같은 재조합 단백질 또는 그 일부를 발현하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 이전에 냉동 보존되었다. 일부 구현예에서, 세포는 이전에 냉동 보존되지 않았다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 냉동 보존 이전에 세포상에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체에 세포 또는 세포 조성물을 투여하기 전에 세포상에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 종양 세포를 특이적으로 표적화한다.
일부 구현예에서, 세포는 단축된 또는 축약된 시간 동안 배양되거나 비팽창 제조 공정을 거친다. 일부 측면에서, 세포는 예를 들어 형질도입 또는 전기 천공법을 통해 재조합 단백질을 암호화하는 핵산의 도입 후에 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 미만 동안 배양된다. 일부 구현예에서, 세포는 약 2 내지 3일, 3 내지 4일, 4 내지 5일, 5 내지 6일 또는 6 내지 7일 또는 그 이하 동안(각 수치 포함) 배양된다. 일부 측면에서, 세포는 예를 들어 형질도입 또는 전기 천공법을 통해 핵산의 도입 후 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일차에 선택된 하나 이상의 시점에 평가된다.
일부 측면에서, 제공된 방법은 폴리뉴클레오타이드의 도입 후 하지만 팽창 없이 하나 이상의 시점에 수행될 수 있는데, 예를 들어, 조작된 세포는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 도입 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 임의적으로 (약) 37°C ± 2°C에서, 96, 72 또는 48시간을 초과하여 인큐베이션되지 않았다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 따른 통합된 및/또는 통합되지 않은 전이 유전자 서열의 평가와 같은 하나 이상의 평가는 조작된 세포가 주입을 위해 방출되고, 대상체에 투여를 위해 준비되고, 및/또는 예컨대 세포 요법을 위해 대상체에 투여되기 전에 수행된다. 특정 구현예에서, 조작된 세포는 하나 이상의 평가가 예를 들어 조작된 세포의 일부분에, 분획에, 및/또는 샘플에 수행된 후에 주입을 위해 방출되고, 대상체에 투여를 위해 준비되고, 및/또는 대상체에 투여된다. 특정 구현예에서, 조작된 세포는 세포가 안전하다고 결정된 후에, 예를 들어, 멸균되고 및/또는 유해한 것이 없고, 및/또는 하나 이상의 평가를 완료하고 나서 원하는 생물학적 특성을 보유하고 있다고 결정된 후에, 주입을 위해 방출되고, 대상체에 투여를 위해 준비되고, 및/또는 대상체에 투여된다.
일부 측면에서, 전이 유전자 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드가 바이러스 형질도입과 같은 다양한 전달 방법을 사용하여 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 입양 세포 요법용으로 조작된 세포와 같은 조작된 세포는 전이 유전자 서열에 의해 암호화된 재조합 단백질의 발현 수준을 결정하거나, 및/또는 세포의 유전체에 안정적으로 통합된 것과 같은 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 복제수를 결정하는 것과 같이, 여러 특성 및 특징에 대해 모니터하거나 평가해야 한다. 일부 측면에서, 상기 평가는 조작 또는 제조 공정 중에 하나 이상의 시점에 수행할 수 있다.
III. 전이 유전자 서열
일부 측면에서, 제공된 구현예는 전이 유전자 서열의 통합을 평가하는 것과 관련하여 사용된다. 일부 측면에서, 조작을 위해, 예를 들어, 상기 섹션 II에 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열을 도입하기 위한 임의의 방법을 사용하여 세포에 도입된 폴리뉴클레오타이드는 세포의 유전체에 통합될 전이 유전자 서열을 함유한다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오타이드의 전이 유전자 서열 부분은 세포의 유전체에 통합되도록 설계된다. 일부 경우에, 전이 유전자 서열은 세포의 유전체에 통합되는 폴리뉴클레오타이드의 일부를 지칭할 수 있다.
일부 측면에서, 전이 유전자 서열(키메라 서열, 키메라 DNA 또는 재조합 DNA라고도 불림)은 상이한 유기체, 상이한 유전자 또는 상이한 변이체와 같은 상이한 공급원으로부터 온 구성 성분을 조합하여 인위적으로 형성된 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열은 예를 들어 상이한 공급원으로부터 온 상이한 핵산 분자 또는 단편의 인위적인 조합에 의한 분자 생물학적 조작을 거쳤다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 전이 유전자 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포의 유전체 서열과 비교하여 상이한 기원으로부터 온 서열의 적어도 일부를 함유한다. 예를 들어, 전이 유전자 서열의 적어도 일부는 일부 경우에 조작된 세포의 투여 후보자인 대상체로부터 단리된 1차 세포인 세포에 대해 이종성, 외인성이거나 또는 전이 유전자를 가진다.
일부 측면에서, 세포에 통합된 전이 유전자 서열은 세포의 유전체에 삽입 또는 통합되는, 코딩 및/또는 비코딩 서열 및/또는 이의 부분 코딩 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 통합은 무작위적, 반무작위적이거나 표적화될 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열은 자연 발생하지 않는 배열을 포함하는 핵산 서열 단편, 예컨대 하나로 합쳐진 상이한 기원들로부터 온 단편을 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열은 자연 발생 서열이 아니다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 완전한 바이러스 gag 단백질을 암호화하지 않는다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 완전한 HIV 유전체, 복제 가능 바이러스 유전체, 및/또는 부가적 유전자를 포함하지 않으며, 부가적 유전자는 임의적으로 Nef, Vpu, Vpx, Vif 및/또는 Vpr이다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열은 예를 들어 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 위한 방법에 따라서 세포에 도입된 폴리뉴클레오타이드에 함유된다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열은 하나 이상의 재조합 단백질의 전부 또는 일부를 암호화한다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열에 의해 암호화된 재조합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR)와 같은 재조합 수용체이다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 하나 이상의 추가 재조합 단백질을 암호화한다.
일부 측면에서, 전이 유전자 서열은 또한 하나 이상의 비코딩, 조절 또는 제어 요소, 예컨대 프로모터, 증진인자(enhancer), 전사 후 조절 요소(PRE), 인트론, 인슐레이터, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, Kozak 공통서열, 다중 시스트론 요소(예를 들어, 내부 리보솜 유입점(IRES), 2A 서열), 메신저 RNA(mRNA)의 비번역 부위(UTR)에 해당하는 서열, 및 스플라이스 수용체 또는 도너 서열을 함유한다.
일부 측면에서, 통합될 전이 유전자 서열의 임의의 부분은 본원에 제공된 임의의 방법에서 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하기 위해 검출될 수 있다. 일부 측면에서, 검출되는 전이 유전자 서열의 부분은 세포에 대해 이종성, 외인성이거나 전이 유전자를 가진 서열 내에 있는 부분일 수 있으며, 이로써 통합된 이종성, 외인성 또는 전이 유전자 서열이 세포의 임의의 유사한 내인성 유전체 서열로부터 특이적으로 검출되어 구분될 수 있다. 일부 측면에서, 예를 들어 상기 섹션 I의 본원에 기술된 임의의 존재, 부재 또는 양을 결정하기 위한 방법은 전이 유전자 서열의 일부를 특이적으로 검출할 수 있는 프로브 또는 전이 유전자 서열의 일부를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 서열을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 측면에서, 상기 프로브 또는 프라이머 서열은 세포에 대해 이종성, 외인성 또는 전이 유전자를 가지는 전이 유전자 서열의 일부와 같은 전이 유전자 서열의 일부를 특이적으로 검출, 결합 또는 인식할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 프로브 또는 프라이머 서열은 유전체에 통합되는 전이 유전자 서열의 일부와 같은 전이 유전자 서열의 일부를 특이적으로 검출, 결합 또는 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 바이러스 gag 단백질을 암호화하지 않는다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 암호화된 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 수용체)의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 프로모터를 함유한다. 일부 예에서, 전이 유전자 서열은 암호화된 재조합 단백질의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 2개 또는 3개 이상의 프로모터를 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 전이 유전자 서열이 도입되어야 하는 숙주 유형(예를 들어, 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물)에 특이적인 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈과 같은 조절 서열을 전이 유전자 서열이 DNA 기반인지 또는 RNA 기반인지 고려하여 적절한 것으로 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 프로모터, 증진인자, 전사 후 조절 요소(PRE), 인트론, 폴리아데닐화 신호, Kozak 공통서열, 내부 리보솜 유입점(IRES), 2A 서열 및 스플라이스 수용체 또는 도너와 같은 조절/제어 요소를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 재조합 단백질 및/또는 하나 이상의 추가 폴리펩타이드(들)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 비천연 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA pol I, pol II 또는 pol III 프로모터 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA 중합효소 II(예를 들어, CMV, SV40 초기 영역 또는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터)에 의해 인식된다. 다른 구현예에서, 프로모터는 RNA 중합효소 III(예를 들어, U6 또는 H1 프로모터)에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 시토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터 및 뮤린 줄기세포 바이러스의 긴 말단 반복에서 발견되는 프로모터와 같은 비-바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터일 수 있다. 기타 공지된 프로모터도 고려된다.
일부 구현예에서, 프로모터는 구성 프로모터(constitutive promoter)이거나 이를 포함한다. 예시적인 구성 프로모터에는 예를 들어 시미안 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 시토메갈로 바이러스 즉석 초기 프로모터(CMV), 인간 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 인간 신장 인자 1α 프로모터(EF1α), 마우스 포스포글리세린산 키나아제 1 프로모터(PGK) 및 CMV 초기 증진인자와 결합한 치킨 β-액틴 프로모터(CAGG)가 포함된다. 일부 구현예에서, 구성 프로모터는 합성 또는 변형 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 골수증식 육종바이러스 증진인자가 있는 변형된 MoMuLV LTR의 U3 영역을 함유하는 합성 프로모터인 MND 프로모터이거나 이를 포함한다(Challita et al. (1995) J. Virol. 69(2):748-755 참조). 일부 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 비-바이러스 프로모터이다. 일부 구현예에서, 예시적인 프로모터에는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 이의 변형된 형태 또는 MND 프로모터가 포함될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 프로모터는 조절되는 프로모터(예를 들어, 유도성 프로모터)이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 유도성 프로모터 또는 억제성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 Lac 작동유전자 서열, 테트라사이클린 작동유전자 서열, 갈락토스 작동유전자 서열 또는 독시사이클린 작동유전자 서열을 포함하거나 또는 이의 유사체이거나 Lac 억제인자 또는 테트라사이클린 억제인자 또는 이의 유사체에 의해 결합되거나 인식될 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 조절 요소, 예를 들어, 프로모터를 포함하지 않는다.
일부 측면에서, 전이 유전자 서열은 암호화된 재조합 단백질의 발현을 증진할 수 있는 조절 요소, 예컨대 시스-작용 전사 후 조절 요소와 같은 전사 후 조절 요소(PRE)를 함유한다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열은 암호화된 재조합 단백질의 발현을 증진할 수 있는 조절 요소, 예컨대 재조합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 전사 후 조절 요소(PRE)를 함유한다. 일부 구현예에서, 조절 요소는 우드척 간염 바이러스(WHV) 또는 B형 간염 바이러스(HBV)와 같은 간염 바이러스로부터 유래된 PRE와 같은 바이러스 전사 후 조절 요소 또는 이의 변형된 형태이며, 예를 들어, 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE), B형 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(HBVPRE)와 같은 간염 전사 후 조절 요소(HPRE)를 들 수 있다. WPRE 및 HBVPRE를 포함한 간염 바이러스 유래 PRE는 일반적으로 이에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현을 핵에서 전사 후 RNA 내보내기를 촉진함으로써 촉진할 수 있다(예를 들어, 증진할 수 있다). PRE에 함유된 시스-작용 서열 또는 요소에 의해 형성된 2차 및 3차 구조는 상기 기능을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 야생형 간염 바이러스 유래 PRE는 일반적으로 알파 하위 요소 및 베타 하위 요소를 포함하고, 이들 각각은 완전 PRE 전사 후 활성에 영향을 주고/거나 관여하는 줄기 고리 구조(stem loop structure)를 독립적으로 형성한다(Smith et al. (1998) Nucleic Acids Research, 26:4818-4827 참조). WPRE와 같은 일부 야생형 비인간 간염 바이러스 PRE는 또한 전사 후 활성을 더 증진할 수 있는 감마 하위 요소를 포함한다. 일부 하위 요소는 핵에서 RNA 내보내기를 예를 들어 CRM1-의존적 및/또는 독립적 내보내기 기작과 상호작용을 통하여 촉진하고, 세포 단백질을 위한 결합 부위를 제공하고, RNA(예를 들어, 재조합 및/또는 이종 RNA) 전사물의 총량을 증가시키고, RNA 안정성을 증가시키고, 폴리아데닐화 전사물의 수를 증가시키고 및/또는 상기 전사물에서 폴리아데닐화 꼬리의 크기를 증강시키는 구조를 갖는 RNA를 갖거나 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 전사 후 조절 요소는 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE)이다.
일부 경우에, 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 수용체)을 암호화하는 핵산 서열은 신호 펩타이드를 암호화하는 신호 서열을 함유한다. 일부 측면에서, 신호 서열은 천연 폴리펩타이드로부터 유래된 신호 펩타이드를 암호화할 수 있다. 다른 측면에서, 신호 서열은 서열 번호: 24에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되고 서열 번호: 25에 제시된 GMCSFR 알파 사슬의 예시적인 신호 펩타이드와 같은 이종 또는 비천연 신호 펩타이드를 암호화할 수 있다. 일부 경우에, 재조합 단백질(예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 재조합 수용체)를 암호화하는 핵산 서열은 신호 펩타이드를 암호화하는 신호 서열을 함유한다. 비 제한적인 예시적인 신호 펩타이드에는 예를 들어, 서열 번호: 24에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되고 서열 번호: 25에 제시된 GMCSFR 알파 사슬 신호 펩타이드 또는 서열 번호: 26에 제시된 CD8 알파 신호 펩타이드가 포함된다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 하나 이상의 추가 폴리펩타이드, 예를 들어, 하나 이상의 표지자(들) 및/또는 하나 이상의 작동체(effector) 분자를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 표지자(들)는 형질도입 표지자, 대리 표지자 및/또는 선택 표지자를 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 추가 폴리펩타이드(들)를 암호화하는 도입된 추가 핵산 서열 중에는 예컨대 전달된 세포의 생존력 및/또는 기능을 촉진함으로써 요법의 효능을 개선할 수 있는 핵산 서열; 예컨대 생체 내 생존 또는 국소화를 평가하기 위한 세포의 선택 및/또는 평가를 위한 유전자 표지자를 제공하기 위한 핵산 서열; 문헌[Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); and Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)]에 기술된 바와 같이 예를 들어 생체 내에서 음성 선택에 세포를 예민하게 만들어 안정성을 개선하기 위한 핵산 서열이 포함되고; 또한 우성의 양성 선택 가능한 표지자를 음성 선택 가능한 표지자와 융합시켜 유래된 2작용성 선택 가능한 융합 유전자의 용도를 기술하는 문헌[WO 1992008796 및 WO 1994028143와 미국 특허 번호 6,040,177]을 참조한다.
일부 구현예에서, 표지자는 형질도입 표지자 또는 대리 표지자이다. 형질도입 표지자 또는 대리 표지자는 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 수용체)을 암호화하는 핵산 서열이 도입된 세포를 검출하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 형질도입 표지자는 세포의 변형을 나타내거나 확인할 수 있다. 일부 구현예에서, 대리 표지자는 재조합 단백질(예를 들어, CAR과 같은 재조합 수용체)과 함께 세포 표면 상에 동시 발현되도록 제조된 단백질이다. 특정 구현예에서, 상기 대리 표지자는 거의 또는 전혀 활성을 갖지 않도록 변형된 표면 단백질이다. 특정 구현예에서, 대리 표지자는 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 수용체)을 암호화하는 동일한 전이 유전자 서열 상에 암호화된다. 일부 구현예에서, 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 수용체)를 암호화하는 핵산 서열은, 임의적으로 내부 리보솜 유입점(IRES)에 의해 분리되는, 표지자를 암호화하는 핵산 서열에 또는 자가 절단 펩타이드 또는 2A 서열과 같은 리보솜 스키핑을 일으키는 펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 외인성 표지 유전자는 일부 경우에 세포의 검출 또는 선택을 허용하도록 조작된 세포와 관련하여 사용될 수 있고, 일부 경우에 세포 제거 및/또는 세포 자살을 촉진하도록 조작된 세포와 관련하여 또한 사용될 수 있다.
예시적인 대리 표지자는 비기능적이며 신호 또는 일반적으로 전장 형태의 세포 표면 폴리펩타이드에 의해 전달되는 신호를 전달할 수 없거나 전달하지 않고/거나 내재화될 수 없거나 내재화되지 않는 절단 형태와 같은 세포 표면 폴리펩타이드의 절단 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 절단된 세포 표면 폴리펩타이드는 절단된 인간 표피 성장 인자 수용체 2(tHER2), 절단된 표피 성장 인자 수용체(tEGFR, 서열 번호: 7 또는 16에 제시된 예시적인 tEGFR 서열) 또는 전립선-특이적 막 항원(PSMA) 또는 절단된 PSMA(tPSMA)와 같은 이의 변형 형태와 같은 성장 인자 또는 다른 수용체의 절단 형태를 포함한다. 일부 측면에서, tEGFR은 항체 세툭시맙(Erbitux®) 또는 다른 치료용 항-EGFR 항체 또는 결합 분자에 의해 인식되는 에피토프를 함유할 수 있으며, 이는 tEGFR 작제물 및 암호화된 외인성 단백질로 조작된 세포를 확인 또는 선택하기 위해 및/또는 암호화된 외인성 단백질을 발현하는 세포를 제거 또는 분리하기 위해 사용될 수 있다. 문헌[미국 특허 번호 8,802,374 및 Liu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434]을 참조한다. 일부 측면에서, 표지자(예를 들어, 대리 표지자)에는 CD34의 전부 또는 일부(예를 들어, 절단 형태), NGFR, CD19 또는 절단된 CD19(예를 들어, 절단된 비-인간 CD19)가 포함된다. 절단된 EGFR(예를 들어, tEGFR)에 대한 예시적인 폴리펩타이드는 서열 번호: 7 또는 16에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 7 또는 16에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 표지자는 형광 단백질의 종 변이체, 단량체 변이체, 코돈-최적화된, 안정화된 및/또는 강화된 변이체를 포함하여, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP), 예컨대 슈퍼-폴드 GFP(super-fold GFP, sfGFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP), 예컨대 tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed 또는 DsRed2, 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청록 형광 단백질(blue green fluorescent protein, BFP), 강화된 청색 형광 단백질(EBFP) 및 노랑 형광 단백질(YFP) 및 이들의 변이체와 같은 형광 단백질과 같은 검출 가능한 단백질이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표지자는 루시퍼라아제, 대장균(E. Coli)의 lacZ 유전자, 분비 배아 알칼리 포스파타아제(SEAP), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(CAT)와 같은 효소이거나 이를 포함할 수 있다. 예시적인 발광 리포터 유전자에는 루시퍼라아제(luc), β-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), β-글루쿠로니다아제(GUS) 또는 이들의 변이체가 포함된다. 일부 측면에서, 효소의 발현은 효소의 발현 및 기능적 활성 시 검출될 수 있는 기질의 첨가에 의해 검출될 수 있다.
일부 구현예에서, 표지자는 선택 표지자이다. 일부 구현예에서, 선택 표지자는 외인성 제제 또는 약물에 대한 내성을 부여하는 폴리펩타이드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 표지자는 항생제 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, 선택 표지자는 포유류 세포에 대해 항생제 내성을 부여하는 항생제 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, 선택 표지자는 퓨로마이신 내성 유전자, 히그로마이신 내성 유전자, 블라스티사이딘 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 게네티신 내성 유전자 또는 제오신 내성 유전자 또는 이들의 변형된 형태이거나 이를 포함한다.
본원에 기술된 임의의 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 수용체) 및/또는 추가 폴리펩타이드는 임의의 조합, 방향 또는 배열에서 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 수용체)를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 함유하는 하나 이상의 전이 유전자 서열에 의해 암호화될 수 있다. 예를 들어, 하나, 둘 또는 셋 이상의 전이 유전자 서열은 하나, 둘 또는 셋 이상의 상이한 폴리펩타이드(예를 들어, 재조합 수용체), 또는 이의 부분 또는 성분, 및/또는 하나 이상의 추가 폴리펩타이드(예를 들어, 표지자 및/또는 작동체(effector) 분자)를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나의 전이 유전자 서열은 재조합 단백질(예를 들어, CAR과 같은 재조합 수용체) 또는 이의 부분 또는 성분을 암호화하는 핵산 서열, 및 하나 이상의 추가 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 하나의 벡터 또는 작제물은 재조합 단백질(예를 들어, CAR과 같은 재조합 수용체) 또는 이의 부분 또는 성분을 암호화하는 핵산 서열을 함유하고, 그리고 개별 벡터 또는 작제물은 하나 이상의 추가 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 수용체)를 암호화하는 핵산 서열 및 하나 이상의 추가 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 두 개의 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 수용체)을 암호화하는 핵산은 하나 이상의 추가 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 상부에 존재한다. 일부 구현예에서, 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 수용체)을 암호화하는 핵산은 하나 이상의 추가 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 하부에 존재한다.
특정 경우에, 하나의 전이 유전자 서열은 둘 이상의 상이한 폴리펩타이드 사슬, 예를 들어 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 수용체)을 암호화하는 핵산 서열, 및 하나 이상의 추가 폴리펩타이드(예를 들어, 표지자 및/또는 작동체 분자)를 함유한다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 상이한 폴리펩타이드 사슬, 예를 들어 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 수용체)을 암호화하는 핵산 서열, 및 하나 이상의 추가 폴리펩타이드가 두 개의 개별 전이 유전자 서열에 존재한다. 예를 들어, 두 개의 개별 전이 유전자 서열이 제공되고, 각각은 세포내 발현을 위해 세포로 개별적으로 전달되거나 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 표지자를 암호화하는 핵산 서열 및 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 수용체)을 암호화하는 핵산 서열이 세포의 유전체 내의 상이한 위치에 존재하거나 삽입된다. 일부 구현예에서, 표지자를 암호화하는 핵산 서열 및 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 수용체)을 암호화하는 핵산 서열은 두 개의 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열이 제1 및 제2 핵산 서열을 함유하는 것과 같이 상이한 폴리펩타이드 사슬의 각각을 암호화하는 코딩 서열은 동일하거나 상이할 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 둘 이상의 상이한 폴리펩타이드 사슬의 발현을 구동하는 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 핵산 분자는 다중 시스트론(이중 시스트론 또는 삼중 시스트론, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,060,273 참조)일 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 수용체)를 암호화하는 핵산 서열 및 하나 이상의 추가 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 임의적으로 내부 리보솜 유입점(IRES) 또는 자가 절단 펩타이드 또는 2A 요소와 같은 리보솜 스키핑을 일으키는 펩타이드를 암호화하는 핵산에 의해 분리된다. 예를 들어, 예시적인 표지자 및 임의적으로 리보솜 스키핑 서열 서열은 문헌[국제 출원 공개 번호 WO2014031687]에 개시된 바와 같은 어느 하나일 수 있다.
일부 구현예에서, 전사 단위는 단일 프로모터로부터의 메시지에 의해 (예를 들어, 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 수용체) 및 추가 폴리펩타이드를 암호화하는) 유전자 산물의 동시 발현을 허용하는 IRES를 함유하는 이중 시스트론 단위로 조작될 수 있다. 대안적으로, 일부 경우에, 단일 프로모터는 단일 개방형 해독틀(open reading frame, ORF)에 자가-절단 펩타이드(예를 들어, 2A 서열) 또는 프로테아제 인식 부위(예를 들어, 퓨린)를 암호화하는 서열에 의해 서로 분리된, (예를 들어, 표지자를 암호화하고 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 수용체)을 암호화하는) 두 개 또는 세 개의 유전자를 함유하는 RNA의 발현을 지시할 수 있다. 따라서, ORF는 번역 동안(2A의 경우) 또는 번역 후에 개별 단백질로 가공되는 단일 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 경우에, T2A와 같은 펩타이드는 리보솜이 2A 요소의 C-말단에서 펩타이드 결합의 합성을 건너뛰도록(리보솜 스키핑) 유발할 수 있으며, 이는 2A 서열의 말단과 다음 펩타이드 하부 사이의 분리로 이어진다(예를 들어, de Felipe, Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) and de Felipe et al. Traffic 5:616-626 (2004) 참조). 다양한 2A 요소가 공지되어 있다. 본원에 개시된 방법 및 시스템에 사용될 수 있는 2A 서열의 예에는 문헌[미국 특허 공개 번호 20070116690]에 기술된 바와 같은 구제역 바이러스(F2A, 예를 들어, 서열번호: 21), 말 비염 A 바이러스(E2A, 예를 들어, 서열번호: 20), 토세아 아시그나 바이러스(T2A, 예를 들어, 서열번호: 6 또는 17) 및 돼지 테스코 바이러스-1(P2A, 예를 들어, 서열번호: 18 또는 19)이 있으며, 하지만 이에 한정되지 않는다.
A. 재조합 수용체
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열의 통합을 위해 평가되는 세포 또는 세포 조성물은 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 재조합 수용체 및 전술한 기타 요소를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 통합된 전이 유전자 서열에 의해 암호화된 재조합 단백질은 재조합 수용체이다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열은 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, 본원, 예를 들어 섹션 I에 기술된 바와 같이 처리, 가공, 조작 및/또는 생성된 세포는 재조합 단백질, 예컨대 재조합 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)를 함유하거나 발현하거나, 함유 또는 발현하도록 조작된다. 특정 구현예에서, 기술된 제조 또는 조작을 위한 방법은, 전이 유전자 서열의 통합에 의해, 재조합 수용체와 같은 재조합 단백질을 발현하거나 함유하도록 조작된 세포 또는 세포를 함유하는 및/또는 세포를 위해 농축된 집단 또는 조성물을 생산하거나 및/또는 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 또는 T 세포의 집단 또는 조성물이 처리, 가공, 조작 및/또는 생산된다.
일부 측면에서, 암호화된 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR)이다. 재조합 수용체 중에는 키메라 수용체, 항원 수용체 및 키메라 수용체 또는 항원 수용체의 하나 이상의 성분을 함유하는 수용체가 있다. 재조합 수용체는 리간드-결합 도메인 또는 이의 결합 단편 및 새포내 신호 전달 도메인 또는 영역을 함유하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 세포에 의해 암호화된 재조합 수용체는 기능성 비-TCR 항원 수용체, 키메라 항원 수용체(CAR), 키메라 자가항체(CAAR), 재조합 T 세포 수용체(TCR) 및 다중 사슬 재조합 수용체의 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하여 전술한 임의의 것의 영역, 도메인 또는 성분을 포함한다. CAR과 같은 재조합 수용체는 일반적으로 하나 이상의 세포내 신호 전달 성분에, 일부 측면에서 링커 및/또는 막관통 도메인(들)을 통해 연결된 세포외 항원(또는 리간드) 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 세포로부터 발현된 예시적인 재조합 수용체는 둘 이상의 수용체 폴리펩타이드를 함유하고, 일부 경우에 상이한 성분, 도메인 또는 영역을 함유하는 다중 사슬 수용체를 포함한다. 일부 측면에서, 재조합 수용체는 함께 기능적 재조합 수용체를 포함하는 둘 이상의 폴리펩타이드를 함유한다. 일부 측면에서, 다중 사슬 수용체는 함께 기능적 재조합 수용체를 포함하는 두 개의 폴리펩타이드를 포함하는 이중 사슬 수용체이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 두 개의 상이한 수용체 폴리펩타이드, 예를 들어, TCR 알파(TCRα) 및 TCR 베타(TCRβ) 사슬; 또는 TCR 감마(TCRγ) 및 TCR 델타 (TCRδ) 사슬을 포함하는 TCR이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 하나 이상의 폴리펩타이드가 다른 수용체 폴리펩타이드의 발현, 활성 또는 기능을 조절, 변형 또는 제어하는 다중 사슬 수용체이다. 일부 측면에서, 다중 사슬 수용체는 수용체의 특이성, 활성, 항원(또는 리간드) 결합, 기능 및/또는 발현의 공간적 또는 시간적 조절 또는 제어를 허용한다.
1. 키메라 항원 수용체(CAR)
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 특정 세포 유형의 표면 상에 발현된 항원과 같은 특정 항원(또는 표지자 또는 리간드)에 대한 특이성을 갖는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 구현예에서, 항원은 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 이는 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에서, 항원은 정상 또는 비-표적화 세포 또는 조직과 비교하여 질병 또는 병태의 세포 상에서, 예를 들어 종양 또는 병원성 세포 상에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포 상에서 발현되고/거나 조작된 세포 상에서 발현된다.
특정 구현예에서, 키메라 수용체와 같은 재조합 수용체는 T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 세포질(세포내) 영역과 같은 세포질 신호 전달 도메인 또는 영역(상호 교환적으로 세포내 신호 전달 도메인 또는 영역으로도 불림), 예를 들어 T 세포 수용체(TCR) 성분의 세포질 신호 전달 도메인 또는 영역(예를 들어, CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 제타 사슬의 세포질 신호 전달 도메인 또는 영역 또는 이의 기능적 변이체 또는 신호 전달 부분)을 포함하고/거나 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)를 포함하는 세포내 신호 전달 영역을 함유한다.
일부 구현예에서, 키메라 수용체는 리간드(예를 들어, 항원) 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 리간드 결합 도메인을 더 함유하고 있다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 인식 도메인을 함유하는 CAR이다. 일부 구현예에서, 항원과 같은 리간드는 세포의 표면 상에 발현된 단백질이다. 일부 구현예에서, CAR은 TCR 유사 CAR이고 항원은 TCR과 마찬가지로 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 분자의 맥락에서 세포 표면 상에서 인식되는 세포내 단백질의 펩타이드 항원과 같은 가공된 펩타이드 항원이다.
CAR을 포함하는 예시적 항원 수용체 및 상기 수용체를 조작하고 세포 내로 도입하는 방법은 예를 들어 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061 및 미국 특허 출원 공개 번호 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국 특허 번호 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353 및 8,479,118 및 유럽 특허 출원 번호 EP2537416]에 기재된 것들 및/또는 문헌[Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75]에 기재된 것들을 포함한다. 일부 측면에서, 항원 수용체는 문헌[미국 특허 번호 7,446,190]에 기재된 바와 같은 CAR 및 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO/2014055668 A1]에 기재된 것을 포함한다. CAR의 예로는 전술한 간행물 중 어느 하나, 예컨대 문헌[WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, U.S. Patent No.: 7,446,190, US Patent No.: 8,389,282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; 및 Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)]에 개시된 바와 같은 CAR이 포함된다. 또한 문헌[WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국 특허 번호 7,446,190 및 미국 특허 번호 8,389,282]을 참조한다.
일부 구현예에서, 입양 요법에 의해 표적화될 특정 세포 유형에서 발현되는 항원(예를 들어, 암 표지자) 및/또는 감쇠 반응을 유도하도록 의도된 항원, 예컨대 정상 또는 비질병 세포 유형 상에서 발현된 항원과 같은 특정 항원(또는 표지자 또는 리간드)에 대한 특이성을 갖는 CAR이 작제된다. 따라서, CAR은 전형적으로 하나 이상의 항원 결합 분자, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 단편, 도메인 또는 부분 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인 및/또는 항체 분자를 세포외 부분에 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 단클론 항체(mAb)의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)로부터 유래된 단일 사슬 항체 단편(scFv)과 같은 항체 분자의 항원 결합 부분 또는 부분들을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항원 수용체와 같은 재조합 수용체의 일부로서 세포 상에 발현된다. 항원 수용체 중에는 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 기능성 비-TCR 항원 수용체가 있다. 일반적으로, 펩타이드 MHC 복합체를 겨냥하여 TCR 유사 특이성을 나타내는 항체 또는 항원 결합 단편을 함유하는 CAR은 또한 TCR 유사 CAR로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 유사 CAR의 MHC-펩타이드 복합체에 특이적인 세포외 항원 결합 도메인은 일부 측면에서 링커 및/또는 막관통 도메인(들)을 통해 하나 이상의 세포내 신호 전달 성분에 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 분자는 통상적으로 TCR과 같은 천연 항원 수용체를 통한 신호 및 임의적으로 공자극 수용체와 조합하여 상기 수용체를 통한 신호를 모방하거나 이와 유사할 수 있다.
일부 구현예에서, 키메라 수용체(예를 들어 CAR)와 같은 재조합 수용체는 항원(또는 리간드)에 특이적으로 결합하는 것과 같이 결합하는 리간드 결합 도메인을 포함한다. 키메라 수용체에 의해 표적화되는 항원 중에는 입양 세포 요법을 통해 표적화될 질병, 병태 또는 세포 유형의 맥락에서 발현되는 것이 있다. 질병 및 병태 중에는 혈액암, 면역계 암, 예컨대 림프종, 백혈병 및/또는 골수종, 예컨대 B, T 및 골수성 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종을 포함한 암 및 종양을 포함한 증식성, 신생물성 및 악성 질병 및 장애가 있다.
일부 구현예에서, 항원(또는 리간드)은 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 이는 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에서, 항원(또는 리간드)은 정상 또는 비-표적화 세포 또는 조직과 비교하여 질병 또는 병태의 세포 상에서, 예를 들어 종양 또는 병원성 세포 상에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포 상에서 발현되고/거나 조작된 세포 상에서 발현된다.
일부 구현예에서, CAR은 세포의 표면 상에 발현된 온전한 항원과 같은 항원을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어 scFv)을 함유한다.
일부 구현예에서, 항원(또는 리간드)은 종양 항원 또는 암 표지자이다. 일부 구현예에서, 항원(또는 리간드)은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 8족 A 멤버를 함유하는 류신 풍부 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 자연 살생 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토메라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원, 또는 보편적 꼬리표(universal tag) 관련 항원, 및/또는 비오틴화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 다수의 공지된 B 세포 표지자 중 어느 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 관련된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 BCMA, 예를 들어 인간 BCMA에 특이적인 항-BCMA CAR이다. 마우스 항-인간 BCMA 항체 및 인간 항-인간 항체를 포함하는 항-BCMA 항체를 함유하는 키메라 항원 수용체 및 상기 키메라 수용체를 발현하는 세포가 앞서 기재되었다. 문헌[Carpenter et al., Clin Cancer Res., 2013, 19(8):2048-2060, WO 2016/090320, WO2016090327, WO2010104949A2 및 WO2017173256]을 참조한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA CAR은 문헌[WO 2016/090320 또는 WO2016090327]에 기재된 항체로부터 유래된 가변 중쇄(VH) 및/또는 가변 경쇄(VL) 영역을 함유하는 scFv와 같은 항원 결합 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 30에 제시된 VH 및 서열 번호: 31에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 32에 제시된 VH 및 서열 번호: 33에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 34에 제시된 VH 및 서열 번호: 35에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 27에 제시된 VH 및 서열 번호: 28에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 41에 제시된 VH 및 서열 번호: 42에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 43에 제시된 VH 및 서열 번호: 44에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 45에 제시된 VH 및 서열 번호: 46에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, VH 또는 VL은 전술한 VH 또는 VL 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖고 BCMA에 대한 결합을 유지한다. 일부 구현예에서, VH 영역은 VL 영역에 대한 아미노 말단이다. 일부 구현예에서, VH 영역은 VL 영역에 대해 카르복시 말단이다.
일부 구현예에서, CAR은 CD19, 예를 들어 인간 CD19에 특이적인 항-CD19 CAR이다. 일부 구현예에서, scFv 및/또는 VH 도메인은 FMC63으로부터 유래한다. FMC63은 일반적으로 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대하여 발생된 마우스 단클론성 IgG1 항체를 지칭한다(Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). 일부 구현예에서, FMC63 항체는 서열 번호: 50 및 51에 각각 제시된 CDR-H1 및 CDR-H2 및 서열 번호: 52 또는 66에 제시된 CDR-H3 및 서열 번호: 47에 제시된 CDR-L1 및 서열 번호: 48 또는 67에 제시된 CDR-L2 및 서열 번호: 49 또는 68에 제시된 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, FMC63 항체는 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 47의 CDR-L1 서열, 서열 번호: 48의 CDR-L2 서열, 서열 번호: 49의 CDR-L3 서열을 함유하는 가변 경쇄 및/또는 서열 번호: 50의 CDR-H1 서열, 서열 번호: 51의 CDR-H2 서열, 및 서열 번호: 52의 CDR-H3 서열을 함유하는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 53에 제시된 가변 중쇄 영역 및 서열 번호: 54에 제시된 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 서열 번호: 29에 제시된다. 일부 구현예에서, scFv는 VH, 링커 및 VL 순서로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 VL, 링커 및 VH 순서로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 69에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호: 69에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 55에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 55에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 SJ25C1로부터 유래한다. SJ25C1은 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대하여 발생된 마우스 단클론성 IgG1 항체이다(Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). 일부 구현예에서, SJ25C1 항체는 서열 번호: 59-61에 각각 제시된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열 및 서열 번호: 56-58에 각각 제시된 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, SJ25C1 항체는 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 56의 CDR-L1 서열, 서열 번호: 57의 CDR-L2 서열, 서열 번호: 58의 CDR-L3 서열을 함유하는 가변 경쇄 및/또는 서열 번호: 59의 CDR-H1 서열, 서열 번호: 60의 CDR-H2 서열, 및 서열 번호: 61의 CDR-H3 서열을 함유하는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 62에 제시된 가변 중쇄 영역 및 서열 번호: 63에 제시된 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 서열 번호: 64에 제시된다. 일부 구현예에서, scFv는 VH, 링커 및 VL 순서로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 VL, 링커 및 VH 순서로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 65에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 65에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 CD20에 특이적인 항-CD20 CAR이다. 일부 구현예에서, scFv는 CD20에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, CD20에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 리툭시맙 scFv와 같은 리툭시맙이거나 이로부터 유래된 항체이다.
일부 구현예에서, CAR은 CD22에 특이적인 항-CD22 CAR이다. 일부 구현예에서, scFv는 CD22에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, CD22에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 m971 scFv와 같은 m971이거나 이로부터 유래된 항체이다.
일부 구현예에서, CAR은 GPRC5D에 특이적인 항-GPRC5D CAR이다. 일부 구현예에서, scFv는 GPRC5D에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, GPRC5D에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/090329 및 WO 2016/090312]에 제시된 항체 또는 항체 단편으로부터의 VH 및 VL이거나 이를 함유한다.
일부 구현예에서, 항체는 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역과 같은 두 개의 항체 도메인 또는 영역을 연결하는 하나 이상의 링커를 포함하는 scFv와 같은 항원 결합 단편이다. 링커는 전형적으로 펩타이드 링커, 예를 들어 가요성 및/또는 수용성 펩타이드 링커이다. 링커 중에는 글리신과 세린이 풍부하고/거나 일부 경우에는 트레오닌이 풍부한 것이 있다. 일부 구현예에서, 링커는 또한 용해도를 향상시킬 수 있는 리신 및/또는 글루타메이트와 같은 하전된 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 또한 하나 이상의 프롤린을 포함한다. 일부 측면에서, 글리신 및 세린(및/또는 트레오닌)이 풍부한 링커는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상기 아미노산(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이들은 (약) 50%, 55%, 60%, 70% 또는 75% 이상의 글리신, 세린 및/또는 트레오닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 실질적으로 전부 글리신, 세린 및/또는 트레오닌으로 구성된다. 링커는 일반적으로 약 5 내지 약 50개 아미노산 길이, 전형적으로 (약)10 내지 30, 예를 들어 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 아미노산 길이이고 일부 예에서 10 내지 25개 아미노산 길이이다. 예시적인 링커는 서열 GGGGS(4GS; 서열 번호: 36) 또는 GGGS(3GS; 서열 번호: 37)의 다양한 반복 횟수, 예컨대 상기 서열의 2, 3, 4 및 5회 사이의 반복을 갖는 링커를 포함한다. 예시적인 링커는 서열 번호: 38(GGGGSGGGGSGGGGS), 서열 번호:39(GSTSGSGKPGSGEGSTKG) 또는 서열 번호: 40(SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA)에 제시된 서열을 갖거나 이로 이루어진 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원은 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 바이러스성 항원(예컨대 HIV, HCV, HBV 등으로부터의 바이러스 항원), 세균성 항원 및/또는 기생 항원이다. 일부 구현예에서, CAR은 MHC-펩타이드 복합체로서 세포 표면 상에 제시된 종양 관련 항원과 같은 세포내 항원을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어 scFv)과 같은 TCR 유사 항체를 함유한다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체를 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항원 수용체와 같은 재조합 수용체의 일부로 세포 상에서 발현될 수 있다. 항원 수용체 중에는 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 기능성 비-TCR 항원 수용체가 있다. 일반적으로, 펩타이드 MHC 복합체를 겨냥하여 TCR 유사 특이성을 나타내는 항체 또는 항원 결합 단편을 함유하는 CAR은 또한 TCR 유사 CAR로 지칭될 수 있다.
“주요 조직적합성 복합체(Major histocompatibility complex, MHC)”에 대한 언급은 일부 경우에, 세포 기작에 의해 가공된 펩타이드 항원을 포함하여 폴리펩타이드의 펩타이드 항원과 복합체를 형성할 수 있는 다형성 펩타이드 결합 부위 또는 결합 고랑(groove)을 함유하는 단백질, 일반적으로 당단백질을 지칭한다. 일부 경우에, MHC 분자는 TCR 또는 TCR 유사 항체와 같은 T 세포 상의 항원 수용체에 의해 인식 가능한 형태로 항원 제시를 위해 펩타이드와의 복합체로, 즉 MHC-펩타이드 복합체를 포함하여 세포 표면 상에 표시되거나 발현될 수 있다. 일반적으로, MHC 클래스 I 분자는 일부 경우에, 3개의 α 도메인 및 비공유 결합된 β2 마이크로글로불린을 갖는, 막에 걸쳐있는 α 사슬을 갖는 이종이량체이다. 일반적으로 MHC 클래스 II 분자는 두 개의 막관통 당단백질, α 및 β로 구성되며, 둘 다 전형적으로 막에 걸쳐 있다. MHC 분자는 펩타이드에 결합하기 위한 항원 결합 부위 또는 부위들 및 적절한 항원 수용체에 의한 인식에 필요한 서열을 함유하는 MHC의 유효 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 분자는 시토솔에서 유래한 펩타이드를 세포 표면으로 전달하고, 여기서 MHC-펩타이드 복합체는 일반적으로 CD8+ T 세포와 같은, 일부 경우에는 CD4+ T 세포와 같은 T 세포에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 II 분자는 소포성 계(vesicular system)에서 유래한 펩타이드를 세포 표면으로 전달하며, 이는 전형적으로 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. 일반적으로, MHC 분자는 인간에서 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen, HLA) 및 마우스에서 H-2라고 통칭되는 연관된 유전자 자리(loci) 그룹에 의해 암호화된다. 따라서, 전형적으로 인간 MHC는 인간 백혈구 항원(HLA)으로도 지칭될 수 있다.
용어 “MHC-펩타이드 복합체(MHC-peptide complex)” 또는 “펩타이드-MHC 복합체(peptide-MHC complex)” 또는 이의 변형은 예컨대 일반적으로 MHC 분자의 결합 고랑(groove) 또는 틈에서 펩타이드의 비공유 상호작용에 의한 펩타이드 항원 및 MHC 분자의 복합체 또는 회합을 지칭한다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체는 세포의 표면 상에 존재하거나 표시된다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체는 TCR, TCR 유사 CAR 또는 이의 항원 결합 부분과 같은 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드의 펩타이드 항원 또는 에피토프와 같은 펩타이드는 예컨대 항원 수용체에 의한 인식을 위해 MHC 분자와 회합할 수 있다. 일반적으로, 펩타이드는 폴리펩타이드 또는 단백질과 같은 보다 긴 생물학적 분자의 단편으로부터 유래되거나 이를 기초로 한다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 전형적으로 약 8 내지 약 24개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 MHC 클래스 II 복합체에서 인식을 위해 (약) 9 내지 22개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 MHC 클래스 I 복합체에서 인식을 위해 (약) 8 내지 13개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체와 같은 MHC 분자의 맥락에서 펩타이드 인식시, TCR 또는 TCR 유사 CAR과 같은 항원 수용체는 T 세포 반응, 예컨대 T 세포 증식, 사이토카인 생성, 세포 독성 T 세포 반응 또는 다른 반응을 유도하는 T 세포에 대한 활성화 신호를 생성하거나 유발시킨다.
일부 구현예에서, TCR 유사 항체 또는 항원 결합 부분은 공지되어 있거나, 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어 미국 공개 출원 번호 US 2002/0150914; US 2003/0223994; US 2004/0191260; US 2006/0034850; US 2007/00992530; US20090226474; US20090304679; 및 국제 PCT 공개 번호 WO 03/068201 참조).
일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 특이적인 MHC-펩타이드 복합체를 함유하는 유효량의 면역원으로 숙주를 면역화함으로써 생산될 수 있다. 일부 경우에, MHC-펩타이드 복합체의 펩타이드는 종양 항원, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 범용 종양 항원, 골수종 항원 또는 기타 항원과 같이 MHC에 결합할 수 있는 항원의 에피토프이다. 일부 구현예에서, 이어서 유효량의 면역원이 면역 반응을 유발하기 위해 숙주에 투여되고, 여기서 면역원은 MHC 분자의 결합 고랑에서 펩타이드의 3차원 제시에 대하여 면역 반응을 유발하기에 충분한 기간 동안 이의 3차원 형태를 유지한다. 이어서 숙주로부터 수집된 혈청을 분석하여 MHC 분자의 결합 고랑에서 펩타이드의 3차원 제시를 인식하는 원하는 항체가 생성되고 있는지 여부를 결정한다. 일부 구현예에서, 생성된 항체를 분석하여 상기 항체가 MHC-펩타이드 복합체와 MHC 분자 단독, 관심 펩타이드 단독 및 MHC 및 무관한 펩타이드의 복합체를 구별할 수 있는지 확인할 수 있다. 이어서 원하는 항체를 단리할 수 있다.
일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 파지 항체 라이브러리와 같은 항체 라이브러리 디스플레이 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 라이브러리의 멤버가 CDR 또는 CDR들의 하나 이상의 잔기에서 돌연변이되는 돌연변이체 Fab, scFv 또는 기타 항체 형태의 파지 디스플레이 라이브러리가 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[미국 출원 공개 번호 US20020150914, US2014/0294841; 및 Cohen CJ. et al. (2003) J Mol. Recogn. 16:324-332]을 참조한다.
본 명세서에서 용어 “항체(antibody)”는 가장 넓은 의미로 사용되며, 온전한 항체 및 기능성(항원-결합) 항체 단편을 포함하는 다클론성 및 단클론성 항체를 포함하며, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단편 항원 결합(Fab) 단편, F(ab’)2 단편, Fab’ 단편, Fv 단편, 재조합 IgG(rIgG) 단편, 가변 중쇄(VH) 영역, 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함한 단일 사슬 항체 단편 및 단일 도메인 항체(예를 들어, sdAb, sdFv, 나노바디(nanobody)) 단편을 포함한다. 상기 용어는 유전자 조작된 및/또는 달리 변형된 형태의 면역글로불린, 예컨대 인트라바디(intrabodies), 펩티바디(peptibodies), 키메라 항체, 완전한 인간 항체, 인간화된 항체 및 이종 접합 항체, 다중 특이적(예를 들어, 이중 특이적) 항체, 디아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies) 및 테트라바디(tetrabodies), 탠덤 디-scFv, 탠덤 트리-scFv를 포괄한다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 “항체”는 이의 기능성 항체 단편을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 용어는 또한 IgG 및 이의 하위 클래스, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 임의의 클래스 또는 하위 클래스의 항체를 포함하는 온전한 또는 전장 항체를 포괄한다.
일부 경우에 용어 “초가변 영역(hypervariable region)” 또는 “HVR”과 동의어인 “상보성 결정 영역(complementarity determining region)” 및 “CDR”은 항원 특이성 및/또는 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 비인접 아미노산 서열을 지칭하는 것으로 공지되어 있다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에는 3개의 CDR(CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)이 있고 각각의 경쇄 가변 영역에는 3개의 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)이 있다. 일부 경우에 “프레임워크 영역(framework region)” 및 “FR”은 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 비-CDR 부분을 지칭하는 것으로 공지되어 있다. 일반적으로, 각각의 전장 중쇄 가변 영역에는 4개의 FR(FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4)이 있고, 각각의 전장 경쇄 가변 영역에는 4개의 FR(FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4)이 있다.
주어진 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌[Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (“Kabat” 넘버링 체계); Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (“Chothia” 넘버링 체계); MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), “Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography,” J. Mol. Biol. 262, 732-745.” (“Contact” 넘버링 체계); Lefranc MP et al., “IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,” Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(1):55-77 (“IMGT” 넘버링 체계); Honegger A and Pluckthun A, “Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,” J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):657-70, (“Aho” 넘버링 체계); 및 Martin et al., “Modeling antibody hypervariable loops: a combined algorithm,” PNAS, 1989, 86(23):9268-9272, (“AbM” 넘버링 체계)]에 기재된 것을 포함한 다수의 잘 알려진 체계 중 어느 하나를 사용하여 용이하게 결정될 수 있다.
주어진 CDR 또는 FR의 경계는 식별에 사용된 체계에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, Kabat 체계는 구조적 정렬을 기반으로 하는 반면 Chothia 체계는 구조 정보를 기반으로 한다. Kabat 및 Chothia 체계 모두에 대한 넘버링은 삽입 문자, 예를 들어 “30a”에 의해 수용되는 삽입(insertion) 및 일부 항체에서 나타나는 결실(deletion)이 있는 가장 일반적인 항체 영역 서열 길이에 기반한다. 이 두 체계는 상이한 위치에 특정 삽입 및 결실(“삽입-결실(indel)”)을 배치하여 차이가 있는 넘버링이 된다. Contact 체계는 복잡한 결정 구조의 분석에 기반하며 여러 측면에서 Chothia 넘버링 체계와 유사하다. AbM 체계는 Oxford Molecular’s AbM 항체 모델링 소프트웨어에서 사용된 것에 기초한 Kabat와 Chothia 정의 사이의 절충안이다.
하기 표 1은 Kabat, Chothia, AbM 및 Contact 체계에 의해 각각 확인된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3의 예시적인 위치 경계를 열거한다. CDR-H1의 경우, Kabat 및 Chothia 넘버링 체계 둘 다를 사용하여 잔기 넘버링이 나열된다. FR들은 예를 들어 CDR-L1 앞에 위치한 FR-L1, CDR-L1과 CDR-L2 사이에 위치한 FR-L2, CDR-L2와 CDR-L3 사이에 위치한 FR-L3과 같은 식으로 CDR들 사이에 위치한다. 도시된 Kabat 넘버링 체계는 H35A 및 H35B에 삽입을 배치하기 때문에, 도시된 Kabat 넘버링 관례를 사용하여 넘버링될 때 Chothia CDR-H1 루프의 끝은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 변한다.
Figure pct00001
따라서, 달리 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 영역, 예컨대 이의 가변 영역의 “CDR” 또는 “상보적 결정 영역(complementary determining region)” 또는 개별 지정 CDR(예를 들어, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)은 전술한 체계 중 어느 하나 또는 다른 공지된 체계에 의해 정의된 바와 같은 (또는 특정) 상보성 결정 영역을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 특정 CDR(예를 들어, CDR-H3)이 주어진 VH 또는 VL 영역 아미노산 서열에 있는 해당 CDR의 아미노산 서열을 함유한다고 언급될 경우, 상기 CDR은 전술한 체계 중 어느 하나 또는 다른 공지된 체계에 의해 정의된 바와 같은 가변 영역 내의 해당 CDR(예를 들어, CDR-H3)의 서열을 갖는다고 이해된다. 일부 구현예에서, 특정 CDR 서열이 명시된다. 제공된 항체의 예시적인 CDR 서열은 다양한 넘버링 체계를 사용하여 기재되지만, 제공된 항체는 전술한 다른 넘버링 체계 중 어느 하나 또는 당업자에게 공지된 다른 넘버링 체계에 따라 기재된 바와 같은 CDR을 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
마찬가지로, 달리 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 영역, 예컨대 이의 가변 영역의 FR 또는 개별 지정 FR(들)(예를 들어, FR-H1, FR-H2, FR-H3, FR-H4)은 공지된 체계 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같은 (또는 특정) 프레임워크 영역을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 경우에, CDR과 같은 특정 CDR, FR 또는 FR들 또는 CDR들의 식별을 위한 체계는 Kabat, Chothia, AbM 또는 Contact 방법 또는 다른 공지된 체계에 의해 정의된 바와 같이 명시된다. 다른 경우에, CDR 또는 FR의 특정 아미노산 서열이 제공된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질, 항체 및 이의 항원 결합 단편은 전장 항체의 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 항체의 중쇄 및 경쇄는 전장일 수 있거나 또는 항원 결합 부분(Fab, F(ab’)2, Fv 또는 단일 사슬 Fv 단편(scFv))일 수 있다. 다른 구현예에서, 항체 중쇄 불변 영역은 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE로부터 선택되고, 구체적으로 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택되고, 더 구체적으로, IgG1(예를 들어, 인간 IgG1)로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 항체 경쇄 불변 영역은 예를 들어, 카파 또는 람다, 특히 카파로부터 선택된다.
제공된 항체 중에는 항체 단편이 있다. “항체 단편(antibody fragment)”은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; 디아바디; 선형 항체; 가변 중쇄(VH) 영역, scFv와 같은 단일 사슬 항체 분자 및 단일 도메인 VH 단일 항체; 및 항체 단편들로 형성된 다중 특이적 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 항체는 scFv와 같은 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역을 포함하는 단일 사슬 항체 단편이다.
용어 “가변 영역(variable region)” 또는 “가변 도메인(variable domain)”은 항체가 항원에 결합하는데 관여하는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL) 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(framework region, FR) 및 3개의 CDR을 포함한다. (예를 들어, 문헌[Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)]을 참조한다). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보적 VL 또는 VH 도메인 라이브러리를 각각 선별하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
제공된 CAR에 포함된 항체 중에는 항체 단편이 있다. “항체 단편(antibody fragment)” 또는 “항원 결합 단편(antigen-binding fragment)”은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; 디아바디; 선형 항체; 중쇄 가변(VH) 영역, scFv와 같은 단일 사슬 항체 분자 및 VH 영역만을 포함하는 단일 도메인 항체; 및 항체 단편들로 형성된 다중 특이적 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 제공된 CAR에 있는 항원-결합 도메인은 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 영역을 포함하는 항체 단편이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 scFv와 같은 중쇄 가변(VH) 영역 및/또는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는 단일 사슬 항체 단편이다.
용어 “가변 영역(variable region)” 또는 “가변 도메인(variable domain)”은 항체가 항원에 결합하는데 관여하는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL) 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(framework region, FR) 및 3개의 CDR을 포함한다. (예를 들어, 문헌[Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)]을 참조한다). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보적 VL 또는 VH 도메인 라이브러리를 각각 선별하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다. 일부 구현예에서, CAR은 본원에 기술되거나 공지된 표적 항원 중 어느 하나 같이, 종양 세포 또는 암세포와 같은 표적화될 세포 또는 질병의 암 표지자 또는 세포 표면 항원과 같은 항원에 특이적으로 결합하는 항체 중쇄 도메인을 포함한다.
항체 단편은 온전한 항체의 단백질 가수 분해 소화 및 재조합 숙주 세포에 의한 생산을 포함하나 이에 국한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 합성 링커, 예를 들어 펩타이드 링커에 의해 연결된 둘 이상의 항체 영역 또는 사슬을 갖는 것과 같이 자연적으로 발생하지 않고/거나 자연적으로 발생하는 온전한 항체의 효소 소화에 의해 생성되지 않을 수 있는 배열을 포함하는 단편과 같은 재조합으로 생성된 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 scFv이다.
“인간화된(humanized)” 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 아미노산 잔기가 비인간 CDR로부터 유래되고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 아미노산 잔기가 인간 FR로부터 유래된 항체이다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 비인간 항체의 “인간화된 형태(humanized form)”는 모체 비인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서, 통상적으로 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화를 거친 비인간 항체의 변이체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체의 일부 FR 잔기는 비인간 항체(예를 들어, CDR 잔기가 유래된 항체)의 해당 잔기로 치환되어 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화도가 회복되거나 개선된다.
따라서, 일부 구현예에서, TCR 유사 CAR을 포함하는 키메라 항원 수용체는 항체 또는 항체 단편을 함유하는 세포외 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv를 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 단편을 함유하는 세포외 부분 및 세포내 신호 전달 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 1차 신호 전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호 전달 도메인, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호 전달 도메인 및/또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)를 포함하는 신호 전달 도메인이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예컨대 CAR, 예컨대 이의 항체 부분은 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 변이체 또는 변형된 버전의 적어도 일부, 예컨대 힌지 영역, 예를 들어 IgG4 힌지 영역 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역이거나 이를 포함할 수 있는 스페이서를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 스페이서 및/또는 힌지 영역을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgG4 또는 IgG1과 같은 인간 IgG의 것이다. 일부 측면에서, 불변 영역의 부분은 항원-인식 성분, 예를 들어, scFv와 막관통 도메인 사이에서 스페이서 영역으로 기능한다. 스페이서는 스페이서의 부재와 비교하여 항원 결합 후에 세포의 반응성 증가를 제공하는 길이일 수 있다.
일부 실시예에서, 스페이서는 (약) 12개 아미노산 길이이거나 또는 12개 이내의 아미노산 길이이다. 예시적인 스페이서는 적어도 약 10 내지 229개 아미노산, 약 10 내지 200개 아미노산, 약 10 내지 175개 아미노산, 약 10 내지 150개 아미노산, 약 10 내지 125개 아미노산, 약 10 내지 100개 아미노산, 약 10 내지 75개 아미노산, 약 10 내지 50개 아미노산, 약 10 내지 40개 아미노산, 약 10 내지 30개 아미노산, 약 10 내지 20개 아미노산, 또는 약 10 내지 15개 이상의 아미노산을 갖는 것을 포함하고, 열거된 범위 중 어느 하나의 종점 사이 임의의 정수를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 약 12개 이하의 아미노산, 약 119개 이하의 아미노산, 또는 약 229개 이하의 아미노산을 갖는다. 예시적인 스페이서는 IgG4 힌지 단독, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지, 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지를 포함한다. 예시적인 스페이서는 문헌[Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153, Hudecek et al. (2015) Cancer Immunol Res. 3(2): 125-135 또는 국제 특허 출원 공개 번호 WO2014031687, 미국 특허 번호 8,822,647 또는 US2014/0271635]에 기재된 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 면역글로불린 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지, CH2 및 CH3 중 하나 이상은 IgG4 또는 IgG2로부터 전부 또는 일부 유래한다. 일부 경우에, 힌지, CH2 및 CH3은 IgG4로부터 유래한다. 일부 측면에서, 힌지, CH2 및 CH3 중 하나 이상은 키메라이고 IgG4 및 IgG2로부터 유래한 서열을 함유한다. 일부 예에서, 스페이서는 IgG4/2 키메라 힌지, IgG2/4 CH2 및 IgG4 CH3 영역을 함유한다.
일부 구현예에서, 스페이서는 IgG4 및/또는 IgG2로부터 전부 또는 일부 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서는 IgG4, IgG2 및/또는 IgG2 및 IgG4로부터 유래된 힌지, CH2 및/또는 CH3 서열(들) 중 하나 이상을 함유하는 키메라 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서는 하나 이상의 도메인 내의 하나 이상의 단일 아미노산 돌연변이와 같은 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 예에서, 아미노산 변형은 IgG4의 힌지 영역에서 세린(S)을 프롤린(P)으로 치환한 것이다. 일부 구현예에서, 아미노산 변형은 글리코실화 이질성을 감소시키기 위해 아스파라긴(N)을 글루타민(Q)으로 치환한 것이며, 예컨대 서열 번호: 70에 제시된 IgG4 중쇄 불변 영역 서열의 CH2 영역에서 177번 위치에 해당하는 위치(Uniprot 수탁 번호 P01861; EU 넘버링에 의한 297번 위치 및 서열 번호: 4에 제시된 힌지-CH2-CH3 스페이서 서열의 79번 위치에 해당하는 위치)에서 N의 Q로의 치환 또는 서열 번호: 71에 제시된 IgG2 중쇄 불변 영역 서열의 CH2 영역에서 176번 위치에 해당하는 위치(Uniprot 수탁 번호 P01859; EU 넘버링에 의한 297번 위치에 해당하는 위치)에서 N의 Q로의 치환이다.
일부 측면에서, 스페이서는 서열 번호:1에 제시된 힌지 단독 스페이서와 같은 IgG4 또는 IgG1의 힌지 단독 같은 IgG의 힌지 영역 단독을 함유하며, 서열 번호: 2에 제시된 서열에 의해 암호화된다. 다른 구현예에서, 스페이서는 CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지(예를 들어, IgG4 힌지)이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 3에 제시된 바와 같이 CH2 및 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지(예를 들어, IgG4 힌지)이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 4에 제시된 바와 같이 CH3 도메인에만 연결된 Ig 힌지(예를 들어, IgG4 힌지)이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 글리신-세린 풍부 서열 또는 공지된 가요성 링커(flexible linker)와 같은 다른 가요성 링커이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgD의 것이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 5에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 1, 3, 4 및 5 중 어느 하나에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는다.
항원 인식 도메인은 일반적으로 CAR의 경우에 TCR 복합체와 같은 항원 수용체 복합체를 통한 자극 또는 활성화 및/또는 다른 세포 표면 수용체를 통한 신호를 모방하는 신호 전달 성분과 같은 하나 이상의 세포내 신호 전달 성분에 연결된다. 따라서, 일부 구현예에서, 항원 결합 성분(예를 들어, 항체)은 하나 이상의 막관통 영역 및 세포내 신호 전달 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 세포외 도메인에 융합된다. 일 구현예에서, 수용체, 예를 들어 CAR에 있는 도메인 중 하나와 자연적으로 회합하는 막관통 도메인이 사용된다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 상기 도메인의 결합을 피하도록 아미노산 치환에 의해 변형되거나 선택되어 수용체 복합체의 다른 멤버와의 상호 작용이 최소화된다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래된다. 공급원이 천연인 경우, 일부 측면에서, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래된다. 막 관통 영역은 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154로부터 유래된 것을 포함한다(즉 적어도 이들의 막관통 영역(들)을 포함한다). 대안적으로 일부 구현예에서 막관통 도메인은 합성이다. 일부 측면에서, 합성 막관통 도메인은 주로 루신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 일부 측면에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플릿(triplet)이 합성 막관통 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 일부 구현예에서, 연결은 링커, 스페이서 및/또는 막관통 도메인에 의한 것이다.
세포내 신호 전달 영역 중에는 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공자극 수용체와 조합으로 상기 수용체를 통한 신호 및/또는 공자극 수용체 단독을 통한 신호를 모방하거나 이와 유사한 것이 있다. 일부 구현예에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커, 예를 들어 글리신 및 세린, 예를 들어 글리신-세린 더블릿(doublet)을 함유하는 것과 같은 2 내지 10개 아미노산 길이의 링커가 CAR의 막관통 도메인과 세포질 신호 전달 도메인 사이에 존재하고 연결을 형성한다.
수용체, 예를 들어 CAR은 일반적으로 하나 이상의 세포내 신호 전달 성분 또는 성분들을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체는 T-세포 활성화 및 세포 독성을 매개하는 TCR CD3 사슬, 예를 들어 CD3 제타 사슬과 같은 TCR 복합체의 세포내 성분을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, ROR1 결합 항체는 하나 이상의 세포 신호 전달 모듈에 연결된다. 일부 구현예에서, 세포 신호 전달 모듈은 CD3 막관통 도메인, CD3 세포내 신호 전달 도메인 및/또는 기타 CD 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체, 예를 들어 CAR은 또한 Fc 수용체 γ, CD8, CD4, CD25 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가 분자의 일부를 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, CAR은 CD3-제타(CD3-ζ) 또는 Fc 수용체 γ와 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이에 키메라 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR의 결찰시, CAR의 세포질 도메인 또는 세포내 신호 전달 영역은 면역 세포, 예를 들어 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포의 정상 작동체 기능 또는 반응 중 하나 이상을 활성화시킨다. 예를 들어, 일부 맥락에서, CAR은 T 세포의 기능, 예컨대 세포 용해 활성 또는 T-헬퍼 활성, 예컨대 사이토카인 또는 기타 인자의 분비를 유도한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체 성분 또는 공자극 분자의 세포내 신호 전달 영역의 절단 부분은 예를 들어 그것이 작동체 기능 신호를 형질도입하는 경우 온전한 면역 자극 사슬 대신에 사용된다. 일부 구현예에서, 예를 들어 세포내 도메인 또는 도메인들을 포함하는 세포내 신호 전달 영역은 T 세포 수용체(TCR)의 세포질 서열 및 일부 측면에서 천연 맥락에서 항원 수용체 결합 후에 신호 전달을 개시하기 위해 상기 수용체와 협력하여 작용하는 공-수용체 및/또는 상기 분자의 임의의 유도체 또는 변이체 및/또는 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열의 세포질 서열을 포함한다.
천연 TCR의 맥락에서, 완전한 활성화는 일반적으로 TCR을 통한 신호 전달뿐만 아니라 공자극 신호가 필요하다. 따라서, 일부 구현예에서, 완전한 활성화를 촉진하기 위해, 2차 또는 공자극 신호를 생성하기 위한 성분이 CAR에 또한 포함된다. 다른 구현예에서, CAR은 공자극 신호를 생성하기 위한 성분을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 추가의 CAR이 동일한 세포에서 발현되고 2차 또는 공자극 신호를 생성하기 위한 성분을 제공한다.
일부 측면에서, T 세포 활성화는 두 종류의 세포질 신호 전달 서열, 즉 TCR을 통한 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 서열(1차 세포질 신호 전달 서열) 및 항원-비의존적 방식으로 작용하여 2차 또는 공자극 신호를 제공하는 서열(2차 세포질 신호 전달 서열)에 의해 매개되는 것으로 설명된다. 일부 측면에서, CAR은 상기 신호 전달 성분 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
일부 측면에서, CAR은 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호 전달 서열을 포함한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호 전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호 전달 모티프를 함유할 수 있다. 1차 세포질 신호 전달 서열을 함유하는 ITAM의 예에는 TCR 또는 CD3 제타, FcR 감마 또는 FcR 베타로부터 유래된 것이 포함된다. 일부 구현예에서, CAR의 세포질 신호 전달 분자(들)은 CD3 제타로부터 유래된 세포질 신호 전달 도메인, 이의 부분 또는 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, CAR은 공자극 수용체, 예컨대 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 및 ICOS의 신호 전달 영역 및/또는 막관통 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 동일한 CAR은 신호 전달 영역 및 공자극 성분 둘 다를 포함한다.
일부 구현예에서, 신호 전달 영역은 하나의 CAR 내에 포함되는 반면, 공자극 성분은 다른 항원을 인식하는 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, CAR은 활성화 또는 자극성 CAR 및 공자극 CAR을 포함하며, 둘 다 동일한 세포 상에서 발현된다(WO2014/055668 참조).
특정 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 CD3(예를 들어, CD3-제타) 세포내 도메인에 연결된 CD28 막관통 및 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 CD3 제타 세포내 도메인에 연결된 키메라 CD28 및 CD137(4-1BB, TNFRSF9) 공자극 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 세포질 부분에서 하나 이상의, 예를 들어 2개 이상의 공자극 도메인 및 활성화 도메인, 예를 들어 1차 활성화 도메인을 포함한다. 예시적인 CAR에는 CD3-제타, CD28 및 4-1BB의 세포내 성분이 포함된다.
일부 경우에, CAR은 제1, 제2 및/또는 제3 세대 CAR로 지칭된다. 일부 측면에서, 제1 세대 CAR은 항원 결합 시 CD3 사슬 유도 신호만을 제공하는 것이고; 일부 측면에서, 제2 세대 CAR은 상기 신호 및 CD28 또는 CD137과 같은 공자극 수용체로부터 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 것과 같은 공자극 신호를 제공하는 것이고; 일부 측면에서, 제3 세대 CAR은 일부 측면에서 상이한 공자극 수용체의 다중 공자극 도메인을 포함하는 것이다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 본원에 기술된 항체 또는 단편을 함유하는 세포외 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 항원 수용체는 본원에 기술된 항체 또는 단편을 함유하는 세포외 부분 및 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv 또는 단일 도메인 VH 항체를 포함하고, 세포내 도메인은 ITAM을 함유한다. 일부 측면에서, 세포내 신호 전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 제타 사슬의 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 세포외 도메인과 세포내 신호 전달 영역 사이에 배치된 막관통 도메인을 포함한다.
일부 측면에서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 함유한다. 세포외 도메인과 막관통은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인과 막관통은 본원에 기술된 임의 것과 같은 스페이서에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공자극 분자의 세포내 도메인을, 예컨대 막관통 도메인과 세포내 신호 전달 도메인 사이에 함유한다. 일부 측면에서, T 세포 공자극 분자는 CD28 또는 4-1BB이다.
일부 구현예에서, CAR은 항체(예를 들어, 항체 단편), CD28의 막관통 부분 또는 이의 기능적 변이체이거나 이를 함유하는 막관통 도메인, 및 CD28의 신호 전달 부분 또는 이의 기능적 변이체와 CD3 제타의 신호 전달 부분 또는 이의 기능적 변이체를 함유하는 세포내 신호 전달 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, CAR은 항체(예를 들어, 항체 단편), CD28의 막관통 부분 또는 이의 기능적 변이체이거나 이를 함유하는 막관통 도메인, 및 4-1BB의 신호 전달 부분 또는 이의 기능적 변이체와 CD3 제타의 신호 전달 부분 또는 이의 기능적 변이체를 함유하는 세포내 신호 전달 도메인을 함유한다. 일부 상기 구현예에서, 수용체는 Ig 분자, 예컨대 인간 Ig 분자의 일부, 예컨대 Ig 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지, 예컨대 힌지 전용 스페이서를 함유하는 스페이서를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 수용체(예를 들어 CAR)의 막관통 도메인은 인간 CD28 또는 이의 변이체의 막관통 도메인 예를 들어, 인간 CD28의 27-아미노산 막관통 도메인(수탁 번호: P10747.1)이거나 또는 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 8에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 막관통 도메인이며; 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 일부를 함유하는 막관통 도메인은 서열 번호: 9에 제시된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공자극 분자의 세포내 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, T 세포 공자극 분자는 CD28 또는 4-1BB이다.
일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 인간 CD28의 세포내 공자극 신호 전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체 또는 이의 일부, 예컨대 이의 41개의 아미노산 도메인 및/또는 천연 CD28 단백질의 186-187 위치에서 LL의 GG로의 치환을 갖는 상기 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 서열 번호: 10 또는 11에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 10 또는 11에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 영역은 4-1BB 또는 이의 기능성 변이체 또는 이의 일부의 세포내 공자극 신호 전달 도메인, 예컨대 인간 4-1BB 또는 이의 기능성 변이체 또는 이의 일부의 42-아미노산 세포질 도메인(수탁 번호: Q07011.1), 예컨대 서열 번호: 12에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 12에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 인간 CD3 사슬, 임의적으로 CD3 제타 자극성 신호 전달 도메인 또는 이의 기능성 변이체, 예컨대 인간 CD3ζ의 동형 단백질 3의 112 AA 세포질 도메인(수탁 번호: P20963.2) 또는 문헌[미국 특허 번호 7,446,190 또는 미국 특허 번호 8,911,993]에 기술된 바와 같은 CD3 제타 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 서열 번호: 13, 14 또는 15에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 13, 14 또는 15에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 스페이서는 IgG의 힌지 영역 단독, 예컨대 IgG4 또는 IgG1의 힌지 단독, 예컨대 서열 번호: 1에 제시된 힌지 단독 스페이서를 함유한다. 다른 구현예에서, 스페이서는 CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지(예를 들어, IgG4 힌지)이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 3에 제시된 바와 같이 CH2 및 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지(예를 들어, IgG4 힌지)이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 4에 제시된 바와 같이 CH3 도메인에만 연결된 Ig 힌지(예를 들어, IgG4 힌지)이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 글리신-세린 풍부 서열 또는 공지된 가요성 링커(flexible linker)와 같은 다른 가요성 링커이거나 이를 포함한다.
2. T 세포 수용체(TCR)
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 종양, 바이러스 또는 자가 면역 단백질의 항원과 같은 표적 폴리펩타이드의 펩타이드 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 인식하는 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원 결합 부분이다.
일부 구현예에서, “T 세포 수용체(T cell receptor)”또는 “TCR”은 가변 α 및 β 사슬(각각 TCRα 및 TCRβ로도 공지) 또는 가변 γ 및 δ 사슬(각각 TCRγ 및 TCRδ로도 공지) 또는 이의 항원 결합 부분을 함유하는 분자이고 이는 MHC 분자에 결합된 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태이다. 통상적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 이들을 발현하는 T 세포는 별개의 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포 표면 상에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로 TCR은 T 세포(또는 T 림프구)의 표면 상에서 발견되며, 이는 일반적으로 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원의 인식을 담당한다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 “TCR”은 완전한(full) TCR뿐만 아니라 이의 항원 결합 부분 또는 항원 결합 단편을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태 또는 γδ 형태의 TCR을 포함하는 온전한 또는 전장 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 전장 미만의 TCR이지만 MHC-펩타이드 복합체에 결합하는 것과 같이 MHC 분자에서 결합된 특정 펩타이드에 결합하는 항원 결합 부분이다. 일부 경우에, TCR의 항원 결합 부분 또는 단편은 전장 또는 온전한 TCR의 구조적 도메인의 일부만을 함유할 수 있으나, 그럼에도 완전한 TCR이 결합하는 MHC-펩타이드 복합체와 같은 펩타이드 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 항원 결합 부분은 특정 MHC-펩타이드 복합체에 결합하기 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한 TCR의 가변 α 사슬 및 가변 β 사슬과 같은 TCR의 가변 도메인을 함유한다. 일반적으로, TCR의 가변 사슬은 펩타이드, MHC 및/또는 MHC-펩타이드 복합체의 인식에 관여하는 상보성 결정 영역을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR의 가변 도메인은 초가변 루프 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 함유하며, 이는 일반적으로 항원 인식 및 결합 능력 및 특이성에 대한 1차 기여자이다. 일부 구현예에서, TCR의 CDR 또는 이의 조합은 주어진 TCR 분자의 항원 결합 부위의 전부 또는 실질적으로 전부를 형성한다. TCR 사슬의 가변 영역 내의 다양한 CDR은 일반적으로 CDR에 비해 TCR 분자 중에서 일반적으로 가변성을 덜 나타내는 프레임워크 영역(FR)으로 분리된다(예를 들어, Jores et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988 참조; 또한 Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003 참조). 일부 구현예에서, CDR3은 항원 결합 또는 특이성을 담당하는 주요 CDR이거나, 항원 인식을 위한 및/또는 펩타이드-MHC 복합체의 가공된 펩타이드 부분과의 상호작용을 위한 주어진 TCR 가변 영역상에서 3개의 CDR 중 가장 중요한 CDR이다. 일부 맥락에서, 알파 사슬의 CDR1은 특정 항원 펩타이드의 N-말단 부분과 상호작용할 수 있다. 일부 맥락에서, 베타 사슬의 CDR1은 상기 펩타이드의 C-말단 부분과 상호작용할 수 있다. 일부 맥락에서, CDR2는 MHC-펩타이드 복합체의 MHC 부분과의 상호작용 또는 이의 인식을 담당하는 1차 CDR이거나 이에 가장 강력하게 기여한다. 일부 구현예에서, β 사슬의 가변 영역은 초가변 영역(CDR4 또는 HVR4)을 더 함유할 수 있으며, 이는 일반적으로 항원 인식이 아닌 초항원 결합에 관여한다(Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).
일부 구현예에서, TCR은 또한 불변 도메인, 막관통 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 함유할 수 있다(예를 들어, 문헌[Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997] 참조). 일부 측면에서, TCR의 각 사슬은 1개의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 1개의 면역글로불린 불변 도메인, 막관통 영역 및 C-말단 끝에 짧은 세포질 꼬리를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 신호 전달 매개에 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 회합한다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 하나 이상의 불변 도메인을 함유한다. 예를 들어, 주어진 TCR 사슬(예를 들어, α-사슬 또는 β-사슬)의 세포외 부분은 세포막에 인접한 2개의 면역글로불린 유사 도메인, 예컨대 가변 도메인(예를 들어, Vα 또는 Vβ; 전형적으로 Kabat 넘버링 Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.에 기초한 1 내지 116 아미노산) 및 불변 도메인(예를 들어 α 사슬 불변 도메인 즉 Cα, 전형적으로 Kabat 넘버링에 기초한 사슬의 117 내지 259 위치 또는 β 사슬 불변 도메인 또는 Cβ, 전형적으로 Kabat에 기초한 사슬의 117 내지 295 위치)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 2개의 사슬에 의해 형성된 TCR의 세포외 부분은 2개의 막 근위 불변 도메인과 2개의 막 원위 가변 도메인을 함유하고, 상기 가변 도메인 각각은 CDR을 함유한다. TCR의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 이황화물 결합을 형성하여 이로써 2개의 TCR 사슬을 연결하는 짧은 연결 서열을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 각각의 α 및 β 사슬에 추가 시스테인 잔기를 가질 수 있어서, TCR은 불변 도메인에서 2개의 이황화물 결합을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 막관통 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 양으로 하전된다. 일부 경우에, TCR 사슬은 세포질 꼬리를 함유한다. 일부 경우에, 이 구조는 TCR이 CD3 및 이의 서브유닛과 같은 다른 분자와 회합하도록 허용한다. 예를 들어, 막관통 영역을 가진 불변 도메인을 함유하는 TCR은 세포막에 단백질을 고정하고 CD3 신호 전달 장치 또는 복합체의 불변 서브유닛과 회합할 수 있다. CD3 신호 전달 서브유닛(예를 들어 CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ 사슬)의 세포내 꼬리는 TCR 복합체의 신호 전달 용량에 관여하는 하나 이상의 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 즉 ITAM을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR은 2개의 사슬 α 및 β(또는 임의적으로 γ 및 δ)의 이종이량체이거나 단일 사슬 TCR 작제물일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 예컨대 이황화물 결합 또는 이황화물 결합들에 의해 연결되는 2개의 별개의 사슬(α 및 β 사슬 또는 γ 및 δ 사슬)을 함유하는 이종이량체이다.
일부 구현예에서, TCR은 Vα, β 사슬의 서열과 같은 공지된 TCR 서열(들)로부터 생성될 수 있으며, 이에 대해 실질적으로 전장 코딩 서열이 용이하게 이용가능하다. V 사슬 서열을 포함한 전장 TCR 서열을 세포 공급원으로부터 수득하는 방법은 잘 알려져 있다. 일부 구현예에서, TCR을 암호화하는 핵산은 예컨대 주어진 세포 또는 세포들 내의 또는 이로부터 단리된 TCR 암호화 핵산의 중합효소연쇄반응(PCR) 증폭에 의해 또는 공개적으로 이용 가능한 TCR DNA 서열의 합성에 의해 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 생물학적 공급원, 예컨대 세포, 예컨대 T 세포(예를 들어, 세포 독성 T 세포), T 세포 혼성세포 또는 기타 공개적으로 이용 가능한 공급원으로부터 수득된다. 일부 구현예에서, T 세포는 생체 내 단리된 세포로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 흉선에서 선택된 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 네오에피토프 제한(neoepitope-restricted) TCR이다. 일부 구현예에서, T 세포는 배양된 T 세포 혼성세포(hybridoma) 또는 클론일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분 또는 이의 항원 결합 단편은 TCR 서열에 대한 지식을 이용해 합성하여 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 표적 폴리펩타이드 항원 또는 이의 표적 T 세포 에피토프에 대한 후보 TCR의 라이브러리를 스크리닝하여 확인되거나 선택된 TCR로부터 생성된다. TCR 라이브러리는 PBMC, 비장 또는 기타 림프구 기관에 존재하는 세포를 포함하여 대상체로부터 단리된 T 세포로부터의 Vα 및 Vβ 레퍼토리를 증폭하여 생성될 수 있다. 일부 경우에, T 세포는 종양 침윤성 림프구(tumor-infiltrating lymphocyte, TIL)로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 라이브러리는 CD4+ 또는 CD8+ 세포로부터 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR는 정상적인 건강한 대상체의 T 세포 공급원, 즉 정상 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR는 유병 대상체의 T 세포 공급원, 즉 유병 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, 인간으로부터 수득된 T 세포와 같은 샘플에서 예컨대 RT-PCR에 의해 Vα 및 Vβ의 유전자 레퍼토리를 증폭시키기 위해 퇴화(degenerate) 프라이머가 사용된다. 일부 구현예에서, scTv 라이브러리는 증폭된 산물이 클로닝되거나 조립되어 링커에 의해 분리되는 나이브(naive) Vα 및 Vβ 라이브러리로부터 조립될 수 있다. 대상체와 세포의 공급원에 따라, 라이브러리는 HLA 대립유전자 특이적일 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, TCR 라이브러리는 모(parent) 또는 지지체(scaffold) TCR 분자의 돌연변이 유발 또는 다양화에 의해 생성될 수 있다. 일부 측면에서, TCR은 예를 들어 α 또는 β 사슬의 예컨대 돌연변이 유발에 의해 유도 진화를 거친다. 일부 측면에서, TCR의 CDR 내 특정 잔기가 변경된다. 일부 구현예에서, 선택된 TCR은 친화도 성숙에 의해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 예컨대, 펩타이드에 대한 CTL 활성을 평가하기 위해 스크리닝에 의해 선택될 수 있다. 일부 측면에서, 예를 들어 항원 특이적 T 세포에 존재하는 TCR은 예컨대 결합 활성, 예를 들어 항원에 대한 특정 친화도 또는 친화력에 의해 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 조작된 항원 수용체는 재조합 T 세포 수용체(TCR) 및/또는 자연적으로 발생하는 T 세포로부터 클로닝된 TCR을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 항원(예를 들어, 암 항원)에 대한 높은 친화도 T 세포 클론이 환자로부터 확인되고, 단리되고, 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 TCR 클론이 인간 면역 계통 유전자(예를 들어, 인간 백혈구 항원 시스템 즉 HLA)로 조작된 전이 유전자를 가진 마우스에서 생성되었다. 예를 들어, 종양 항원(예를 들어, Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180 및 Cohen et al. (2005) J Immunol. 175:5799-5808 참조)을 참조한다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대하여 TCR을 단리하기 위해 파지 디스플레이가 사용된다(예를 들어, 문헌[Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med. 14:1390-1395 and Li (2005) Nat Biotechnol. 23:349-354] 참조).
일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분은 변형되었거나 조작된 것이다. 일부 구현예에서, 특정 MHC-펩타이드 복합체에 대한 더 높은 친화도를 갖는 것과 같은 변경된 특성을 가진 TCR을 생성하기 위해 유도 진화 방법이 사용된다. 일부 구현예에서, 유도 진화는 효모 디스플레이(Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92), 파지 디스플레이(Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54) 또는 T 세포 디스플레이(Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84)를 포함하되 이에 국한되지 않는 디스플레이 방법에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 디스플레이 접근 방식은 공지된 모(parent) 또는 기준 TCR 조작 또는 변형하는 것을 수반한다. 예를 들어, 일부 경우에, 하나 이상의 CDR 잔기에서 돌연변이된 돌연변이를 일으킨 TCR을 생성하기 위한 주형(template)으로 야생형 TCR이 사용될 수 있고, 원하는 변경된 특성, 예컨대 원하는 표적 항원에 대한 보다 높은 친화도를 갖는 돌연변이가 선택된다.
일부 구현예에서, 관심 TCR의 제조 또는 생성에 사용하기 위한 표적 폴리펩타이드의 펩타이드는 공지되어 있거나 당업자에 의해 용이하게 식별될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 항원 결합 부분을 생성하는데 사용하기에 적합한 펩타이드는 하기 기재된 표적 폴리펩타이드와 같은 관심 표적 폴리펩타이드에서 HLA 제한 모티프의 존재에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 이용 가능한 컴퓨터 예측 모델을 사용하여 식별된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 결합 부위를 예측하기 위해, 상기 모델은 ProPred1(Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237) 및 SYFPEITHI(Schuler et al. (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007 참조)를 포함하되 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, MHC 제한 에피토프는 HLA-A0201이며, 이는 모든 백인의 약 39-46%에서 발현되고 따라서, TCR 또는 다른 MHC-펩타이드 결합 분자를 제조하는데 사용하기 위한 MHC 항원의 적합한 선택을 의미한다.
컴퓨터 예측 모델을 사용한 프로테아솜 및 면역 프로테아솜에 대한 HLA-A0201 결합 모티프 및 절단 부위는 공지되어 있다. MHC 클래스 I 결합 부위를 예측하기 위해, 상기 모델은 ProPred1(Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001에 보다 상세하게 기재됨) 및 SYFPEITHI(Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93 2007 참조)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분은 결합 특성과 같은 하나 이상의 특질이 변경된 재조합으로 생산된 천연 단백질 또는 이의 돌연변이 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 인간, 마우스, 래트 또는 기타 포유동물과 같은 다양한 동물 종 중 하나에서 유래될 수 있다. TCR은 세포 결합 또는 가용성 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법의 목적을 위해, TCR은 세포의 표면 상에 발현된 세포 결합 형태이다.
일부 구현예에서, TCR은 전장 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, TCR은 2량체 TCR(dTCR)이다. 일부 구현예에서, TCR은 단일 사슬 TCR(sc-TCR)이다. 일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR은 문헌[WO 03/020763, WO 04/033685, WO2011/044186]에 기술된 바와 같은 구조를 가지고 있다.
일부 구현예에서, TCR은 막관통 서열에 해당하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 세포질 서열에 해당하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 CD3과 TCR 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR을 포함하는 임의의 TCR은 T 세포 표면 상에 활성 TCR을 생성하는 신호 전달 도메인에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 세포의 표면 상에 발현된다.
일부 구현예에서 dTCR은 TCR α 사슬 가변 영역 서열에 해당하는 서열이 TCR α 사슬 불변 영역 세포외 서열에 해당하는 서열의 N 말단에 융합된 제1 폴리펩타이드 및 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 해당하는 서열이 TCR β 사슬 불변 영역 세포외 서열에 해당하는 N 말단 서열에 융합된 제2 폴리펩타이드를 함유하고, 제1 및 제2 폴리펩타이드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 이 결합은 천연 이량체 αβ TCR에 존재하는 천연 사슬 간 이황화물 결합에 해당할 수 있다. 일부 구현예에서, 사슬 간 이황화물 결합은 천연 TCR에 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인이 dTCR 폴리펩타이드 쌍의 불변 영역 세포외 서열에 편입될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비천연 이황화물 결합이 모두 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 막에 고정하는 막관통 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, dTCR은 가변 α 도메인, 불변 α 도메인 및 이 불변 α 도메인의 C-말단에 부착된 제1 2량체화(dimerization) 모티프를 함유하는 TCR α 사슬, 및 가변 β 도메인, 불변 β 도메인 및 이 불변 β 도메인의 C-말단에 부착된 제2 2량체화 모티프를 포함하는 TCR β 사슬을 함유하고, 여기에서 제1 및 제2 2량체화 모티프는 용이하게 상호작용하여 TCR α 사슬과 TCR β 사슬을 서로 연결하는 제1 2량체화 모티프에 있는 아미노산과 제2 2량체화 모티프에 있는 아미노산 사이에서 공유결합을 형성한다.
일부 구현예에서, TCR은 scTCR이다. 전형적으로, scTCR은 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다(예를 들어, Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (USA) 89, 4759 (1992); Wulfing, C. and Pluckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993); 국제 출원 공개 번호 WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO2011/044186; 및 Schlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996) 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 도입된 비천연 사슬 간 이황화물 결합을 함유하여 TCR 사슬의 회합을 용이하게 한다(예를 들어, 국제 출원 공개 번호 WO 03/020763 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 비이황화물 연결 절단형 TCR이며 여기에서 이종 루신 지퍼(heterologous leucine zipper)가 이의 C-말단에 융합하여 사슬 결합을 촉진한다(예를 들어, 국제 출원 공개 번호 WO99/60120 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 펩타이드 링커를 통해 TCRβ 가변 도메인에 공유적으로 연결된 TCRα 가변 도메인을 함유하고 있다(예를 들어, 국제 출원 공개 번호 WO99/18129 참조).
일부 구현예에서, scTCR은 TCR α 사슬 가변 영역에 해당하는 아미노산 서열로 구성된 제1 분절, TCR β 사슬 불변 도메인 세포외 서열에 해당하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 해당하는 아미노산 서열로 구성된 제2 분절, 및 제2 분절의 N 말단에 제1 분절의 C 말단을 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 α 사슬 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 α 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제1 분절 및 β 사슬 세포외 불변 서열의 N 말단에 융합된 β 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제2 분절 및 막관통 서열 및 임의적으로 제2 분절의 N 말단에 제1 분절의 C 말단을 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 β 사슬 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 TCRβ 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제1 분절 및 α 사슬 세포외 불변 서열의 N 말단에 융합된 α 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제2 분절 및 막관통 서열 및 임의적으로 제2 분절의 N 말단에 제1 분절의 C 말단을 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 TCR 분절을 연결하는 scTCR의 링커는 TCR 결합 특이성을 유지하면서 단일 폴리펩타이드 가닥을 형성할 수 있는 임의의 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 예를 들어, 화학식 -P-AA-P-를 가질 수 있고, 여기서 P는 프롤린이고 AA는 아미노산 서열을 나타내며 여기서 아미노산은 글리신과 세린이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 분절은 이의 가변 영역 서열이 상기 결합을 향해 배향되도록 쌍을 이룬다. 따라서, 일부 경우에, 링커는 제1 분절의 C 말단과 제2 분절의 N 말단 사이(또는 그 반대)의 거리를 포괄할 수 있는 충분한 길이를 가지나 표적 리간드와 scTCR의 결합을 차단하거나 감소시킬 정도로 너무 길지 않다. 일부 구현예에서, 링커는 (약) 10 내지 45개의 아미노산, 예컨대 10 내지 30개의 아미노산 또는 26 내지 41개의 아미노산 잔기, 예를 들어 29, 30, 31 또는 32개의 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 화학식 -PGGG-(SGGGG) 5-P-을 갖고 여기서 P는 프롤린이고, G는 글리신이고 S는 세린이다(서열 번호: 22). 일부 구현예에서, 링커는 서열 GSADDAKKDAAKKDGKS(서열 번호: 23)를 갖는다.
일부 구현예에서, scTCR은 β 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기에 α 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기를 연결하는 공유 이황화물 결합을 함유한다. 일부 구현예에서, 천연 TCR에서 사슬 간 이황화물 결합은 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인이 scTCR 폴리펩타이드의 제1 및 제2 분절의 불변 영역 세포외 서열로 편입될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비천연 이황화물 결합이 모두 바람직할 수 있다.
도입된 사슬 간 이황화물 결합을 함유하는 dTCR 또는 scTCR의 일부 구현예에서, 천연 이황화물 결합은 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 천연 사슬 간 이황화물 결합을 형성하는 천연 시스테인 중 하나 이상이 다른 잔기, 예컨대 세린 또는 알라닌으로 치환된다. 일부 구현예에서, 도입된 이황화물 결합은 제1 및 제2 분절에 있는 비시스테인 잔기를 시스테인으로 돌연변이시킴으로써 형성될 수 있다. TCR의 예시적인 비천연 이황화물 결합은 문헌[국제 출원 공개 번호 WO2006/000830]에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 표적 항원에 대해 (약) 10-5 내지 10-12 M 및 그 안의 모든 개별 수치 및 범위의 평형 결합 상수를 갖는 친화도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 MHC-펩타이드 복합체 또는 리간드이다.
일부 구현예에서, α 및 β 사슬과 같은 TCR을 암호화하는 핵산 또는 핵산들은 PCR, 클로닝 또는 기타 적합한 수단에 의해 증폭되어 적합한 발현 벡터 또는 벡터들로 클로닝될 수 있다. 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있으며, 임의의 적합한 숙주를 형질전환하거나 형질주입시키는 데 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 플라스미드 및 바이러스와 같이 증식 및 팽창 또는 발현 또는 둘 모두를 위해 설계된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 벡터가 도입되어야 하는 숙주 유형(예를 들어, 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물)에 특이적인 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈과 같은 조절 서열을, 벡터가 DNA 기반인지 또는 RNA 기반인지 고려하여 적절한 것으로 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 TCR 또는 항원 결합 부분(또는 다른 MHC-펩타이드 결합 분자)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 비천연 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 시토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터 및 뮤린 줄기세포 바이러스의 긴 말단 반복에서 발견되는 프로모터와 같은 비-바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터일 수 있다. 기타 공지된 프로모터도 고려된다.
일부 구현예에서, T 세포 클론이 수득된 후, TCR 알파 및 베타 사슬이 단리되고 유전자 발현 벡터로 클로닝된다. 일부 구현예에서, TCR 알파 및 베타 유전자는 두 사슬이 동시 발현되도록 피코르나바이러스 2A 리보솜 스킵 펩타이드를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, TCR의 유전적 전달은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 통해 또는 트랜스포손을 통해 달성된다(예를 들어, 문헌[Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063; Frecha et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:1748-1757; 및 Hackett et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:674-683] 참조).
일부 구현예에서, TCR을 암호화하는 벡터를 생성하기 위해, α 및 β 사슬은 관심 TCR을 발현하는 T 세포 클론으로부터 단리된 총 cDNA로부터 PCR 증폭되고 발현 벡터로 클로닝된다. 일부 구현예에서, α 및 β 사슬은 동일한 벡터로 클로닝된다. 일부 구현예에서, α 및 β 사슬은 상이한 벡터로 클로닝된다. 일부 구현예에서, 생성된 α 및 β 사슬은 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스, 벡터로 편입된다.
3. 키메라 자가항체 수용체(CAAR)
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 키메라 자가항체 수용체(chimeric autoantibody receptor, CAAR)이다. 일부 구현예에서, CAAR은 자가항체에 특이적이다. 일부 구현예에서, CAAR을 발현하도록 조작된 T 세포와 같은 CAAR을 발현하는 세포는 정상적인 항체 발현 세포가 아닌 자가항체 발현 세포에 특이적으로 결합하여 이를 사멸하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CAAR 발현 세포는 자가면역 질환과 같은 자가항원 발현과 관련된 자가면역 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CAAR 발현 세포는 궁극적으로 자가항체를 생산하고 세포 표면에 자가항체를 나타내는 B 세포를 표적화할 수 있고, 치료적 개입을 위한 질병 특이적 표적으로 상기 B 세포를 표시할 수 있다. 일부 구현예에서, CAAR 발현 세포는 항원 특이적 키메라 자가항체 수용체를 이용하여 질병을 유발하는 B 세포를 표적화함으로써 자가면역 질환에서 병원성 B 세포를 효율적으로 표적화하고 사멸시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 문헌[미국 특허 출원 공개 번호 US 2017/0051035]에 기술된 어느 하나와 같은 CAAR이다.
일부 구현예에서, CAAR은 자가항체 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호 전달 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 1차 신호 전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호 전달 도메인, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호 전달 도메인 및/또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)를 포함하는 신호 전달 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 2차 또는 공자극 신호 전달 영역(2차 세포내 신호 전달 영역)을 포함한다.
일부 구현예에서, 자가항체 결합 도메인은 자가항원 또는 이의 단편을 포함한다. 자가항원의 선택은 표적화되는 자가항체의 유형에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 자가 항원은 특정 질병 상태, 예를 들어 자가면역 질환, 예컨대 자가항체 매개 자가면역 질환과 관련된 B 세포와 같은 표적 세포 상의 자가항체를 인식하기 때문에 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 자가면역 질환은 심상성 천포창(pemphigus vulgaris, PV)을 포함한다. 예시적인 자가항원은 데스모글레인 1(desmoglein 1, Dsg1) 및 Dsg3을 포함한다.
4. 다중 표적화
일부 구현예에서, 세포 및 방법은 세포 상에 2개 이상의 유전자 조작 수용체의 발현과 같은 다중 표적화 전략을 포함하며, 각각은 상이한 항원 중 동일한 것을 인식하고 전형적으로 각각은 상이한 세포내 신호 전달 성분을 포함한다. 상기 다중 표적화 전략은 예를 들어, 문헌[WO 2014055668(활성화 및 공자극 CAR의 조합, 예를 들어, 표적 외, 예를 들어 정상 세포 상에 개별적으로 존재하나 치료될 질병 또는 병태의 세포에만 함께 존재하는 2개의 상이한 항원을 표적화하는 것을 기술) 및 Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013)(활성화 및 억제성 CAR을 발현하는 세포, 예컨대 활성화 CAR이 정상 또는 비-질병 세포 및 치료될 질병 또는 병태의 세포 둘 다에서 발현되는 하나의 항원에 결합하고, 억제성 CAR이 치료가 바람직하지 않은 세포 또는 정상 세포에서만 발현되는 다른 항원에 결합함을 기술)]에 기술되어 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 세포는 일반적으로 제1 수용체에 의해 인식되는 항원, 예를 들어 제1 항원에 특이적인 결합시 세포에 대한 활성화 또는 자극 신호를 유도할 수 있는 제1 유전자 조작 항원 수용체(예를 들어, CAR 또는 TCR)를 발현하는 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 또한 일반적으로 제2 수용체에 의해 인식되는 제2 항원에 특이적인 결합시 면역 세포에 대해 공자극 신호를 유도할 수 있는 제2 유전자 조작된 항원 수용체(예를 들어, CAR 또는 TCR), 예를 들어, 키메라 공자극 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 상이하다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 유전자 조작 항원 수용체(예를 들어 CAR 또는 TCR)는 세포에 대한 활성화 또는 자극 신호를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체는 ITAM 또는 ITAM 유사 모티프를 함유하는 세포내 신호 전달 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 수용체에 의해 유도된 활성화는 면역 반응의 개시, 예컨대 ITAM 인산화 및/또는 ITAM 매개 신호 전달 계단식 다단계 반응의 개시, 면역학적 시냅스의 형성 및/또는 결합된 수용체(예를 들어, CD4 또는 CD8 등) 근처 분자의 클러스터링, 하나 이상의 전사 인자, 예컨대 NF-κB 및/또는 AP-1의 활성화, 및/또는 사이토카인과 같은 인자의 유전자 발현, 증식 및/또는 생존의 유도를 초래하는 세포에서의 신호 전달 또는 단백질 발현의 변화를 수반한다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 수용체는 CD28, CD137(4-1BB), OX40 및/또는 ICOS와 같은 공자극 수용체의 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 수용체는 상이한 공자극 수용체의 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 제1 수용체는 CD28 공자극 신호 전달 영역을 함유하고 제2 수용체는 4-1BB 공자극 신호 전달 영역을 함유하거나 반대로 함유한다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 수용체는 ITAM 또는 ITAM 유사 모티프를 함유하는 세포내 신호 전달 도메인 및 공자극 수용체의 세포내 신호 전달 도메인 둘 다를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 수용체는 ITAM 또는 ITAM 유사 모티프를 함유하는 세포내 신호 전달 도메인을 함유하고 제2 수용체는 공자극 수용체의 세포내 신호 전달 도메인을 함유한다. 동일한 세포에서 유도된 활성화 또는 자극 신호와 결합한 공자극 신호는 면역 반응, 예컨대 강력하고 지속적인 면역 반응, 예컨대 유전자 발현의 증가, 사이토카인 및 기타 인자의 분비 및 T 세포 매개 작동체 기능, 예컨대 세포 사멸을 초래하는 것이다.
일부 구현예에서, 제1 수용체 단독의 결찰 또는 제2 수용체 단독의 결찰은 모두 강력한 면역 반응을 유도하지 못한다. 일부 측면에서, 하나의 수용체만 결찰되는 경우에, 세포는 항원에 내성화되거나 반응하지 않게 되거나 억제되고/거나 증식 또는 인자 분비 또는 작동체 기능을 수행하도록 유도되지 않는다. 그러나, 일부 상기 구현예에서, 복수의 수용체가 결찰되고 예컨대 제1 및 제2 항원을 발현하는 세포와의 조우 시, 예를 들어, 하나 이상의 사이토카인 분비, 증식, 지속성 및/또는 표적 세포의 세포 독성 사멸과 같은 면역 작동체 기능의 수행에 의해 나타난 바와 같이 전체 면역 활성화 또는 자극과 같은 원하는 반응이 달성된다.
일부 구현예에서, 2개의 수용체는 각각 세포에 활성화 및 억제 신호를 유도하는데, 항원에 수용체 중 하나가 결합하면 세포를 활성화하거나 반응을 유도하지만, 항원에 제2 억제 수용체가 결합하면 해당 반응을 억제하거나 약화시키는 신호를 유도한다. 활성화 CAR 및 억제성 CAR 즉 iCAR을 조합하는 예가 있다. 예를 들어, 상기 전략은 활성화 CAR이 질병 또는 병태에서 발현되나 정상 세포에서도 발현되는 항원에 결합하고, 억제성 수용체는 정상 세포에서 발현되나 질병 또는 병태의 세포에서는 발현되지 않는 별개의 항원에 결합하는 것과 같이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 다중 표적화 전략은 특정 질환 또는 병태와 관련된 항원이 비질환 세포에서 발현되고/거나 조작된 세포 자체에서 일시적으로(예를 들어, 유전자 조작과 함께 자극시) 또는 상시적으로 발현되는 경우에 사용된다. 상기 경우에, 2개의 별도의 및 개별적으로 특이적인 항원 수용체의 결찰을 요구함으로써, 특이성, 선택성 및/또는 효능이 향상될 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 항원, 예를 들어, 제1 및 제2 항원이 암세포 상과 같은 표적화되는 세포, 조직 또는 질병 또는 병태에서 발현된다. 일부 측면에서, 세포, 조직, 질병 또는 병태는 다발성 골수종 또는 다발성 골수종 세포이다. 일부 구현예에서, 복수의 항원 중 하나 이상은 일반적으로 정상 또는 비질병 세포 또는 조직 및/또는 조작된 세포 자체와 같이 세포 요법으로 표적화하는 것이 바람직하지 않은 세포 상에서도 발현된다. 상기 구현예에서, 세포의 반응을 달성하기 위해 다중 수용체의 결찰을 요구함으로써, 특이성 및/또는 효능이 달성된다.
IV. 투여 방법
일부 측면에서, 조작된 세포, 예를 들어 전이 유전자 서열이 통합된 세포는 예를 들어 본원에 제공된 방법을 사용하여 평가된 조작된 세포를 함유하는 조작된 세포 또는 조성물 중 임의의 것을 투여하는 것을 포함한 치료 방법과 관련하여 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 투여하기 전에 조작된 세포 또는 세포 조성물을 테스트, 특성화 및/또는 평가하기 위해, 예를 들어, 조작 또는 제조 공정의 하나 이상의 단계 중 통합된 핵산(예를 들어, 전이 유전자 서열)의 존재, 부재 및/또는 양을 테스트하기 위해 및/또는 제형화 후 테스트를 위해, 투여를 위해 방출되고, 및/또는 대상체에 투여를 위해 준비되었는지 평가하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 구현예를 사용하여 평가된, 재조합 수용체를 발현하는 조작된 세포 또는 동일한 것을 포함한 조성물은 다양한 증상의 치료, 진단 및 예방에 유용하다. 예를 들어, 조작된 세포를 포함하는 조작된 세포 또는 조성물은 대상체에서 다양한 질병 및 장애를 치료하는 데 유용하다. 상기 방법 및 용도는 예를 들어, 조작된 세포 또는 동일한 것을 함유하는 조성물을 종양 또는 암과 같은 질병, 병태 또는 장애를 가진 대상체에 투여하는 것을 포함한 치료 방법 및 용도를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 구현예를 사용하여 평가된 조작된 세포 또는 조성물은 질병 또는 장애의 치료에 효과적인 유효량으로 투여된다. 용도는 상기 방법 및 치료에서, 및 상기 치료 방법을 수행하기 위한 약제의 제조에서 조작된 세포 또는 조성물의 용도를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법, 예를 들어 치료 방법은 평가된 조작된 세포 또는 동일한 것을 포함한 조성물을 질병 또는 병태가 있거나 있는 것으로 의심되는 대상체에게 투여함으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이를 통해 대상체에서 질병 또는 병태 또는 장애를 치료한다.
일부 측면에서, 조작된 세포 또는 조작된 세포 조성물은 질병 또는 장애를 가진 대상체와 같은 대상체에게 투여할 수 있다. 입양 세포 요법을 위한 세포의 투여 방법은 공지되어 있으며 제공된 방법 및 조성물과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 입양 T 세포 요법 방법은 예를 들어, 문헌[미국 특허 출원 공개 번호 2003/0170238(Gruenberg et al); 미국 특허 번호 4,690,915(Rosenberg); Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85]에 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌[Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338]을 참조한다.
치료되는 질병 또는 병태는 항원의 발현이 예를 들어 질병, 병태 또는 장애의 원인, 악화 또는 그렇지 않으면 이에 수반되며, 상기 질병, 병태 또는 장애의 병인과 관련되고/거나 병인에 수반되는 임의의 것일 수 있다. 예시적인 질병 및 병태는 악성 종양 또는 세포의 형질전환(예를 들어, 암), 자가면역 또는 염증성 질환 또는 예를 들어 세균, 바이러스 또는 기타 병원체로 인한 감염성 질환과 관련된 질병 또는 병태를 포함할 수 있다. 치료할 수 있는 다양한 질병 및 병태와 관련된 항원을 포함하는 예시적인 항원들이 상기에 기술되어 있다. 특정 구현예에서, 키메라 항원 수용체 또는 전이 유전자 TCR은 질병 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합한다.
질병, 병태 및 장애 중에는 고형 종양, 혈액학적 악성 종양 및 흑색종을 포함한 종양이 있고, 국소화 및 전이성 종양, 감염성 질병, 예컨대 바이러스 또는 기타 병원체, 예를 들어 HIV, HCV, HBV, CMV, HPV로 인한 감염 및 기생충 질병 및 자가면역 질환 및 염증성 질환이 포함된다. 일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 병태는 종양, 암, 악성 종양, 신생물 또는 기타 증식성 질병 또는 장애이다. 상기 질병은 백혈병, 림프종, 예를 들어, 급성 골수성(또는 골수형성) 백혈병(acute myeloid (or myelogenous) leukemia, AML), 만성 골수성(또는 골수형성) 백혈병(chronic myeloid (or myelogenous) leukemia, CML), 급성 림프구성(또는 림프아구성) 백혈병(acute lymphocytic (or lymphoblastic) leukemia, ALL), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL), 모발 세포 백혈병(hairy cell leukemia, HCL), 작은 림프구성 림프종(small lymphocytic lymphoma, SLL), 외투 세포 림프종(Mantle cell lymphoma, MCL), 변연부 림프종, 버킷 림프종, 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma, HL), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma, NHL), 역형성 거대 세포 림프종(Anaplastic large cell lymphoma, ALCL), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 불응성 여포성 림프종, 확산성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL) 및 다발성 골수종(multiple myeloma, MM)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 급성 림프아구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 성인 ALL, 만성 림프아구성 백혈병(chronic lymphoblastic leukemia, CLL), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma, NHL) 및 확산성 거대 B세포 림프종(Diffuse Large B-Cell Lymphoma, DLBCL)에서 선택된 B 세포 악성 종양이다. 일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 NHL이고 상기 NHL은 공격적인 NHL, 확산성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), NOS(비활동성으로부터 다시 형질전환됨), 1차 종격동 거대 B 세포 림프종(primary mediastinal large B cell lymphoma, PMBCL), T 세포/조직세포 풍부 거대 B 세포 림프종(T cell/histocyte-rich large B cell lymphoma, TCHRBCL), 버킷 림프종, 외투 세포 림프종(MCL) 및/또는 여포성 림프종(FL), 임의적으로, 여포성 림프종 3B 등급(follicular lymphoma Grade 3B, FL3B)으로 이루어진 그룹에서 선택된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 바이러스, 레트로바이러스, 박테리아 및 원생 동물 감염, 면역 결핍, 시토메갈로 바이러스(Cytomegalovirus, CMV), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV), 아데노바이러스, BK 폴리오마바이러스 같은 감염성 질병 또는 병태이나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 자가면역 또는 염증성 질병 또는 병태, 예컨대 관절염, 예를 들어 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis, RA), I 형 당뇨병, 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 염증성 장질환, 건선, 피부 경화증, 자가면역 갑상선 질환, 그레이브병, 크론병, 다발성 경화증, 천식 및/또는 이식과 관련된 질병 또는 병태이다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애와 관련된 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9; CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG; NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 절단형 표피 성장 인자 단백질(tEGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 8족 A 멤버를 함유하는 류신 풍부 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 자연 살생 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1; TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2; 도파크롬 타우토메라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원, 또는 보편적 꼬리표(universal tag) 관련 항원, 및/또는 비오틴화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 다수의 공지된 B 세포 표지자 중 어느 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 관련된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 바이러스 항원(예를 들어, HIV, HCV, HBV로부터의 바이러스 항원), 박테리아 항원, 및/또는 기생충 항원과 같은 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 VH 도메인)은 CD19와 같은 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편으로부터 유래하거나 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, 세포 요법(예를 들어, 입양 T 세포 요법)은 자가 전달에 의해 수행되며, 세포는 세포 요법을 받을 대상체 또는 상기 대상체로부터 유래된 샘플로부터 단리 및/또는 달리 제조된다. 따라서, 일부 측면에서, 세포는 대상체, 예를 들어 치료가 필요한 환자로부터 유래되고, 세포는 단리 및 가공 후에 동일한 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 B 세포 악성 종양이다. 일부 구현예에서, B 세포 악성 종양은 백혈병 또는 림프종이다. 일부 측면에서, 질병 또는 병태는 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 성인 ALL, 만성 림프아구성 백혈병(CLL), 비호지킨 림프종(NHL) 또는 확산성 거대 B-세포 림프종(DLBCL)이다. 일부 경우에, 질병 또는 병태는 NHL이거나 예컨대 공격적인 NHL, 확산성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), NOS(비활동성으로부터 다시 형질전환됨), 1차 종격동 거대 B 세포 림프종(PMBCL), T 세포/조직세포 풍부 거대 B 세포 림프종(TCHRBCL), 버킷 림프종, 외투 세포 림프종(MCL) 및/또는 여포성 림프종(FL), 임의적으로, 여포성 림프종 3B 등급(FL3B)인 NHL을 포함한다. 일부 측면에서, CAR과 같은 재조합 수용체는, B 세포 악성 종양과 관련된 병변 환경의 세포에서 발현되거나 질병 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 다수의 공지된 B 세포 표지자 중 어느 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 관련된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30 또는 이의 조합물이다.
일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 다발성 골수종과 같은 골수종이다. 일부 측면에서, CAR과 같은 재조합 수용체는 다발성 골수종과 관련된 병변 환경의 세포에서 발현되거나 질병 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다발성 골수종과 관련된 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 항원, 예를 들어 질병 특이적 항원 및/또는 관련 항원과 같은 제2 또는 추가 항원은 다발성 골수종, 예컨대 B 세포 성숙 항원(BCMA), G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D), CD38(환형 ADP 리보오스 가수 분해 효소), CD138(신데칸-1, 신데칸, SYN-1), CS-1(CS1, CD2 서브세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24), BAFF-R, TACI 및/또는 FcRH5 상에서 발현된다. 다른 예시적인 다발성 골수종 항원은 CD56, TIM-3, CD33, CD123, CD44, CD20, CD40, CD74, CD200, EGFR, β2-마이크로글로불린, HM1.24, IGF-1R, IL-6R, TRAIL-R1 및 액티빈(activin) 수용체 IIA형(ActRIIA)을 포함한다. 문헌[Benson and Byrd, J. Clin. Oncol. (2012) 30(16): 2013-15; Tao and Anderson, Bone Marrow Research (2011):924058; Chu et al., Leukemia (2013) 28(4):917-27; Garfall et al., Discov Med. (2014) 17(91):37-46]을 참조한다. 일부 구현예에서, 항원은 림프성 종양, 골수종, 에이즈 관련 림프종 및/또는 CD38과 같은 이식 후 림프구 증식에 존재하는 것을 포함한다. 상기 항원에 대해 유도된 항체 또는 항원 결합 단편은 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[미국 특허 번호 8,153,765; 8,603477, 8,008,450; 미국 공개 번호 US20120189622 또는 US20100260748; 및/또는 국제 PCT 공개 번호 WO2006099875, WO2009080829 또는 WO2012092612 또는 WO2014210064]에 기술된 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, scFv)은 다중 특이적 항체, 다중 특이적 키메라 수용체, 예컨대 다중 특이적 CAR 및/또는 다중 특이적 세포에 함유되어 있다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애는 G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D)의 발현 및/또는 B 세포 성숙 항원(BCMA)의 발현과 연관된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애는 B 세포 관련 장애이다. 제공된 방법의 제공된 임의의 구현예의 일부에서, BCMA와 연관된 질병 또는 장애는 자가면역 질병 또는 장애이다. 제공된 방법의 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 자가면역 질환 또는 장애는 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 루푸스 신염, 염증성 장질환, 류마티스 관절염, ANCA 관련 혈관염, 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenia purpura, ITP), 혈전성 혈소판 감소성 자반증(thrombotic thrombocytopenia purpura, TTP), 자가 면역성 혈소판 감소증, 샤가스병(Chagas’ disease), 그레이브병(Grave’s disease), 베게너 육아종증(Wegener’s granulomatosis), 다발성 결절성 동맥염(poly-arteritis nodosa), 쇼그렌 증후군(Sjogren’s syndrome), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 피부 경화증(scleroderma), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 건선(psoriasis), IgA 신장병(nephropathy), IgM 다발성 신경병(polyneuropathies), 혈관염(vasculitis), 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 레이노드 증후군(Reynaud’s syndrome), 항인지질 증후군(anti-phospholipid syndrome), 굿파스처 병(Goodpasture’s disease), Kawasaki disease(가와사키 병), 자가면역 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 중증 근무력증(myasthenia gravis) 또는 진행성 사구체 신염(progressive glomerulonephritis)이다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애는 암이다. 일부 구현예에서, 암은 GPRC5D-발현 암이다. 일부 구현예에서, 암은 혈장 세포 악성 종양이고 혈장 세포 악성 종양은 다발성 골수종(multiple myeloma, MM) 또는 형질 세포종(plasmacytoma)이다. 일부 구현예에서, 암은 다발성 골수종(MM)이다. 일부 구현예에서, 암은 재발성/불응성 다발성 골수종이다.
일부 구현예에서, 세포 요법(예를 들어, 입양 T 세포 요법)은 동종이계 전달에 의해 수행되며, 세포는 세포 요법을 받을 예정이거나 최종적으로 받은 대상체, 예를 들어 제1 대상체 외의 대상체로부터 단리 및/또는 달리 제조된다. 상기 구현예에서, 이어서 세포는 상이한 대상체, 예를 들어, 같은 종의 제2 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 구현예에서, 제2 대상체는 제1 대상체와 동일한 HLA 클래스(HLA class) 또는 수퍼타입(supertype)을 발현한다.
세포는, 임의의 적합한 수단, 예를 들어 볼루스 주입, 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사, 안구내(intraocular) 주사, 안구주위(periocular) 주사, 망막하(subretinal) 주사, 유리체내(intravitreal) 주사, 중격-경유성(trans-septal) 주사, 공막하(subscleral) 주사, 맥락막내(intrachoroidal) 주사, 전방내(intracameral) 주사, 결막하 주사(subconjectval injection, subconjuntival injection), 서브 테논(sub-Tenon) 주사, 안구뒤(retrobulbar) 주사, 안구주위(peribulbar) 주사 또는 후부 점막 주사(posterior juxtascleral) 전달에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 이는 비경구, 폐내 및 비강내 및 국소 치료가 바람직한 경우 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 주어진 단위 용량이 세포의 단일 볼루스 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 이는 예를 들어, 3일 이내의 기간에 걸쳐 세포의 다중 볼루스 투여에 의해, 또는 세포의 지속적인 주입 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 단위 용량 또는 임의의 추가 요법, 예를 들어 림프구 고갈 요법, 중재 요법 및/또는 병용 요법의 투여는 외래 환자 전달을 통해 수행된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 치료될 질병의 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 유형, 질병의 중증도 및 진행 과정, 세포가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 대상체의 임상 이력과 세포에 대한 반응 및 주치의의 재량에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서 조성물 및 세포는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 대상체에 적합하게 투여된다.
일부 구현예에서, 세포는 다른 치료적 개입, 예컨대 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 제제, 예컨대 세포 독성제 또는 치료제와 예컨대 동시에 또는 순차적으로, 임의 순서로 병용 치료의 일부로서 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 또는 다른 치료적 개입과 관련하여 동시이든 순차적이든 임의의 순서로 공동-투여된다. 일부 맥락에서, 세포는 세포의 집단이 하나 이상의 추가 치료 제제의 효과를 강화하도록(또는 그 역으로 강화하도록) 충분히 가까운 시점에 다른 요법과 공동-투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제보다 앞서 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 제제는 예를 들어, 지속성을 향상시키기 위해 IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 화학적 치료제의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체는 예를 들어 투여 전에 종양 부담을 감소시키기 위한 화학적 치료제, 예를 들어, 조절 화학적 치료제를 투여받는다.
일부 측면에서 면역 고갈(예를 들어, 림프구 고갈) 요법으로 대상체를 사전 조절하면 입양 세포 요법(ACT)의 효과를 향상시킬 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 대상체는 세포 요법의 개시 전에 대상체에 시클로포스파미드, 플루다라빈 또는 이의 조합물과 같은 림프구 고갈제 또는 화학적 치료제와 같은 사전 조절제를 투여받는다. 예를 들어, 대상체는 세포 요법의 개시 적어도 2일 전, 예컨대 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7일 전에 사전 조절제를 투여받을 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 세포 요법의 개시 7일 이내 전, 예컨대 6, 5, 4, 3 또는 2일 이내 전에 사전 조절제를 투여받는다.
일부 구현예에서, 대상체는 (약) 20mg/kg 내지 100mg/kg, 예컨대 (약) 40mg/kg 내지 80mg/kg의 단위 용량으로 시클로포스파미드로 사전 조절된다. 일부 측면에서, 대상체는 (약) 60mg/kg의 시클로포스파미드로 사전 조절된다. 일부 구현예에서, 시클로포스파미드는 단일 단위 용량으로 투여될 수 있거나, 예컨대 매일, 격일 또는 3일마다 주어진 복수의 단위 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 시클로포스파미드는 1일 또는 2일 동안 매일 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 림프구 고갈제가 시클로포스파미드를 포함하는 경우, 대상체에 (약) 100mg/m2 내지 500mg/m2, 예컨대 (약) 200 mg/m2 내지 400mg/m2 또는 250mg/m2 내지 350mg/m2(수치 포함)의 단위 용량으로 시클로포스파미드가 투여된다. 일부 경우에, 대상체에 약 300mg/m2의 시클로포스파미드가 투여된다. 일부 구현예에서, 시클로포스파미드는 단일 단위 용량으로 투여될 수 있거나, 예컨대 매일, 격일 또는 3일마다 주어진 복수의 단위 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 시클로포스파미드는 예컨대 1 내지 5일 동안, 예를 들어 3 내지 5일 동안 매일 투여된다. 일부 경우에, 대상체에 세포 요법의 개시 전 3일 동안 매일 약 300mg/m2의 시클로포스파미드가 투여된다.
일부 구현예에서, 림프구 고갈제가 플루다라빈을 포함하는 경우, 대상체에 (약) 1mg/m2 내지 100mg/m2, 예컨대 (약) 10mg/m2 내지 75mg/m2, 15mg/m2 내지 50mg/m2, 20 mg/m2 내지 40 mg/m2 또는 24mg/m2 내지 35mg/m2(수치 포함)의 단위 용량으로 플루다라빈이 투여된다. 일부 경우에, 대상체에 약 30mg/m2의 플루다라빈이 투여된다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 단일 단위 용량으로 투여될 수 있거나, 예컨대 매일, 격일 또는 3일마다 주어진 복수의 단위 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 예컨대 1 내지 5일 동안, 예를 들어 3 내지 5일 동안 매일 투여된다. 일부 경우에, 대상체에 세포 요법의 개시 전 3일 동안 매일 약 30mg/m2의 플루다라빈이 투여된다.
일부 구현예에서, 림프구 고갈제는 시클로포스파미드 및 플루다라빈의 조합과 같은 제제의 조합물을 포함한다. 따라서, 제제의 조합물은 상기 기재된 바와 같은 임의의 단위 용량 또는 투여 스케줄의 시클로포스파미드 및 상기 기재된 바와 같은 임의의 단위 용량 또는 투여 스케줄의 플루다라빈을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 대상체에 제1 또는 후속 단위 용량 전에 60mg/kg(~2g/m2)의 시클로포스파미드 및 3 내지 5 단위 용량의 25mg/m2 플루다라빈이 투여된다.
일부 구현예에서 세포의 투여 후에, 조작된 세포의 집단의 생물학적 활성이 예를 들어, 공지된 다수의 방법 중 하나에 의해 측정된다. 평가 매개변수는 생체 내에서, 예를 들어 영상화에 의해 또는 생체 외 시험에서, 예를 들어 ELISA 또는 유세포 분석에 의해 항원에 조작된 또는 천연 T 세포 또는 다른 면역 세포를 특이적으로 결합하는 것을 포함한다. 특정 구현예서, 조작된 세포가 표적 세포를 파괴하는 능력은 예를 들어 문헌[Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), 및 Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)]에 기술된 세포 독성 분석과 같은 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포의 생물학적 활성은 하나 이상의 사이토카인, 예컨대 CD107a, IFNγ, IL-2 및 TNF의 발현 및/또는 분비를 분석하여 측정된다. 일부 측면에서, 생물학적 활성은 종양 부담 또는 부하 감소와 같은 임상 결과를 평가하여 측정된다.
특정 구현예에서, 조작된 세포는 이들의 치료적 또는 예방적 효능이 증가하도록 임의의 다수의 방법으로 추가 변형된다. 예를 들어, 집단에 의해 발현된 조작된 CAR 또는 TCR은 표적화 모이어티에 링커를 통해 직접적으로든 간접적으로든 접합될 수 있다. 화합물, 예를 들어 TCR 또는 CAR을 표적화 모이어티에 접합시키는 실시는 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995) 및 미국 특허 5,087,616]을 참조한다.
일부 구현예에서, 세포는 다른 치료적 개입, 예컨대 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 제제, 예컨대 세포 독성제 또는 치료제와 예컨대 동시에 또는 순차적으로, 임의 순서로 병용 치료의 일부로서 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 또는 다른 치료적 개입과 관련하여 동시이든 순차적이든 임의의 순서로 공동-투여된다. 일부 맥락에서, 세포는 세포의 집단이 하나 이상의 추가 치료 제제의 효과를 강화하도록(또는 그 역으로 강화하도록) 충분히 가까운 시점에 다른 요법과 공동-투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제보다 앞서 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 제제는 예를 들어, 지속성을 향상시키기 위해 IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다.
A. 투약(dosing)
일부 구현예에서, 단위 용량의 세포가 제공된 방법 및/또는 제공된 제조 물품 또는 조성물과 부합되게 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 단위 용량의 크기 또는 시기는 대상체에서 특정 질병 또는 병태에 대한 작용으로서 결정된다. 일부 경우에, 제공된 기재의 관점에서 특정 질병에 대한 단위 용량의 크기 또는 시기는 경험적으로 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 (약) 2 x 105의 세포/kg 내지 (약) 2 x 106의 세포/kg, 예컨대 (약) 4 x 105의 세포/kg 내지 (약) 1 x 106의 세포/kg 또는 (약) 6 x 105의 세포/kg 내지 (약) 8 x 105의 세포/kg를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 대상체 체중 1 킬로그램 당 2 x 105 이내의 세포(예를 들어 항원 발현, 예컨대 CAR 발현 세포)(세포/kg), 예컨대 (약) 3 x 105 이내의 세포/kg, (약) 4 x 105 이내의 세포/kg, (약) 5 x 105 이내의 세포/kg, (약) 6 x 105 이내의 세포/kg, (약) 7 x 105 이내의 세포/kg, (약) 8 x 105 이내의 세포/kg, (약) 9 x 105 이내의 세포/kg, (약) 1 x 106 이내의 세포/kg 또는 (약) 2 x 106 이내의 세포/kg를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 대상체의 체중 1 킬로그램 당 약 또는 적어도 (약) 2 x 105의 세포(예를 들어 항원 발현, 예컨대 CAR 발현 세포)(세포/kg), 예컨대 약 또는 적어도 (약) 3 x 105 세포/kg, 약 또는 적어도 (약) 4 x 105 세포/kg, 약 또는 적어도 (약) 5 x 105 세포/kg, 약 또는 적어도 (약) 6 x 105 세포/kg, 약 또는 적어도 (약) 7 x 105 세포/kg, 약 또는 적어도 (약) 8 x 105 세포/kg, 약 또는 적어도 (약) 9 x 105 세포/kg, 약 또는 적어도 (약) 1 x 106 세포/kg, 또는 약 또는 적어도 (약) 2 x 106의 세포/kg를 포함한다.
특정 구현예에서, 세포 또는 세포의 하위 유형의 개별 집단은 (약) 10만 내지 (약) 1000억 세포의 범위로 및/또는 대상체의 체중 1kg 당 세포의 양으로, 예컨대, 예를 들어, (약) 10만 내지 (약) 500억 세포(예를 들어, (약) 5백만 세포, (약) 2천5백만 세포, (약) 5억 세포, (약) 10억 세포, (약) 50억 세포, (약) 200억 세포, (약) 300억 세포, (약) 400억 세포 또는 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위), (약) 1백만 내지 (약) 500억 세포(예를 들어, (약) 5백만 세포, (약) 2천5백만 세포, (약) 5억 세포, (약) 10억 세포, (약) 50억 세포, (약) 200억 세포, (약) 300억 세포, (약) 400억 세포 또는 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위), 예컨대 (약) 1천만 내지 (약) 1000억 세포(예를 들어, (약) 2천만 세포, (약) 3천만 세포, (약) 4천만 세포, (약) 6천만 세포, (약) 7천만 세포, (약) 8천만 세포, (약) 9천만 세포, (약) 100억 세포, (약) 250억 세포, (약) 500억 세포, (약) 750억 세포, (약) 900억 세포 또는 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위) 및 일부 경우에 (약) 1억 세포 내지 (약) 500억 세포(예를 들어, (약) 1억2천만 세포, (약) 2억5천만 세포, (약) 3억5천만 세포, (약) 6억5천만 세포, (약) 8억 세포, (약) 9억 세포, (약) 30억 세포, (약) 300억 세포, (약) 450억 세포) 또는 상기 범위 사이의 임의의 수치 및/또는 대상체의 체중 1kg당 세포의 양으로 대상체에 투여된다. 투여량은 질병 또는 장애 및/또는 환자 및/또는 다른 치료의 구체적인 속성에 따라 달라질 수 있다.
일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 세포 단위 용량이 대상체의 체표면적 또는 체중에 기초하거나 결부되지 않도록 균일한 세포 단위 용량 또는 고정된 세포 단위 용량이다. 일부 구현예에서, 상기 수치는 재조합 수용체 발현 세포의 수를 지칭하고; 다른 구현예에서, 이는 투여된 T 세포 또는 PBMC 또는 총 세포의 수를 지칭한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우, 단위 용량은 약 5 x 108개 미만의 총 재조합 수용체(예를 들어, CAR) 발현 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를, 예를 들어, 약 1 x 106 내지 5 x 108의 상기 세포 수 범위내, 예컨대 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 또는 5 x 108 , (약) 1 x 106 내지 (약) 5 x 108의 상기 세포 수 범위내, 예컨대 (약) 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 1.5 x 108, 또는 5 x 108 총 상기 세포 수, 또는 전술한 수치 중 임의의 2개 사이의 범위내 수를 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우에, 단위 용량은 (약) 1 x 106개 초과의 총 재조합 수용체(예를 들어, CAR)-발현 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 (약) 2 x 109개 미만의 총 재조합 수용체(예를 들어, CAR)-발현 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를, 예를 들어, (약) 2.5 x 107 내지 (약) 1.2 x 109개의 상기 세포 수 범위내, 예컨대, (약) 2.5 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 1.5 x 108, 8 x 108 또는 1.2 x 109개의 총 상기 세포 수, 또는 전술한 수치 중 임의의 2개 사이의 범위내 수를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 조작된 세포의 단위 용량은 (약) 1 x 105 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 (CAR+) T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 2.5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 1 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 5 x 106개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 2.5 x 106개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 1 x 106개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 2.5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 5 x 106개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 2.5 x 106개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 2.5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 1 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 5 x 106개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 2.5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 1 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 2.5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 107 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 107 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 107 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 107 내지 (약) 5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 107 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 107 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 107 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 108 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 108 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, 또는 (약) 2.5 x 108 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 조작된 세포의 단위 용량은 (약) 2.5 x 107 내지 (약) 1.5 x 108개의 총 CAR-발현 세포, 예컨대 (약) 5 x 107 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 조작된 세포의 단위 용량은 적어도 또는 약 1 x 105개의 CAR-발현 세포, 적어도 또는 약 2.5 x 105개의 CAR-발현 세포, 적어도 또는 약 5 x 105개의 CAR-발현 세포, 적어도 또는 약 1 x 106개의 CAR-발현 세포, 적어도 또는 약 2.5 x 106개의 CAR-발현 세포, 적어도 또는 약 5 x 106개의 CAR-발현 세포, 적어도 또는 약 1 x 107개의 CAR-발현 세포, 적어도 또는 약 2.5 x 107개의 CAR-발현 세포, 적어도 또는 약 5 x 107개의 CAR-발현 세포, 적어도 또는 약 1 x 108개의 CAR-발현 세포, 적어도 또는 약 1.5 x 108개의 CAR-발현 세포, 적어도 약 5 x 106개의 CAR-발현 세포, 적어도 또는 적어도 약 1 x 107개의 CAR-발현 세포, 적어도 또는 적어도 약 2.5 x 107개의 CAR-발현 세포, 적어도 또는 적어도 약 5 x 107개의 CAR-발현 세포, 적어도 또는 적어도 약 1 x 108개의 CAR-발현 세포, 적어도 또는 적어도 약 2.5 x 108개의 CAR-발현 세포, 또는 적어도 또는 적어도 약 5 x 108개의 CAR-발현 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 요법은 (약) 1 x 105 내지 (약) 5 x 108개의 총 재조합 수용체-발현 세포, 총 T 세포 또는 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), (약) 5 x 105 내지 (약) 1 x 107개의 총 재조합 수용체-발현 세포, 총 T 세포 또는 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 107개의 총 재조합 수용체-발현 세포, 총 T 세포 또는 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)(각 수치 포함)의 세포 수를 포함하는 단위 용량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 요법은 적어도 (약) 1 x 105개 이상의 총 재조합 수용체-발현 세포, 총 T 세포 또는 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 예컨대 적어도 (약) 1 x 106개 이상, 적어도 (약) 1 x 107개 이상, 적어도 (약) 1 x 108개 이상의 상기 세포의 수를 포함하는 세포의 단위 용량의 세포 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 수는 CD3-발현 또는 CD8-발현의 총 수를 기준으로 하고, 일부 경우에는 또한 재조합 수용체-발현(예를 들어 CAR-발현) 세포의 총 수를 기준으로 한다. 일부 구현예에서, 세포 요법은 (약) 1 x 105 내지 (약) 5 x 108개의 CD3-발현 또는 CD8-발현 총 T 세포 또는 CD3-발현 또는 CD8-발현 재조합 수용체-발현 세포, (약) 5 x 105 내지 (약) 1 x 107개의 CD3-발현 또는 CD8-발현 총 T 세포 또는 CD3-발현 또는 CD8-발현 재조합 수용체-발현 세포, 또는 (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 107개의 CD3-발현 또는 CD8-발현 총 T 세포 또는 CD3-발현 또는 CD8-발현 재조합 수용체-발현 세포(각 수치 포함)의 세포 수를 포함하는 단위 용량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 요법은 (약) 1 x 105 내지 (약) 5 x 108개의 총 CD3-발현/CAR-발현 또는 CD8-발현/CAR-발현 세포, (약) 5 x 105 내지 (약) 1 x 107개의 총 CD3-발현/CAR-발현 또는 CD8-발현/CAR-발현 세포 또는 (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 107개의 CD3-발현/CAR-발현 또는 CD8-발현/CAR-발현 세포(각 수치 포함)의 세포 수를 포함하는 단위 용량의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 단위 용량의 T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 단위 용량에 포함된 단위 용량의 CD8+ T 세포는 (약) 1 x 106 내지 5 x 108개의 총 재조합 수용체(예를 들어, CAR)-발현 CD8+ 세포, 예를 들어, (약) 5 x 106 내지 1 x 108개의 상기 세포의 범위내, 예컨대 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 7.5 x 107, 1 x 108, 1.5 x 108, 또는 5 x 108개의 총 상기 세포 수, 또는 전술한 수치 중 임의의 2개 사이의 범위내 수를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 다중 단위 용량으로 투여되고, 각각의 단위 용량 또는 총 용량은 전술한 수치 중 어느 하나 내에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 (약) 1 x 107 내지 (약) 0.75 x 108개의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 5 x 107개의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 0.25 x 108개의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포(각 수치 포함)의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 (약) 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 7.5 x 107, 1 x 108, 1.5 x 108, 2.5 x 108, 또는 5 x 108개의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 단위 용량의 세포, 예를 들어 재조합 수용체-발현 T 세포가 단일 단위 용량으로 대상체에 투여되거나 2주, 1개월, 3개월, 6개월, 1년 이상의 기간 내에 1회만 투여된다.
입양 세포 요법의 맥락에서, 주어진 “단위 용량(dose)”의 투여는 단일 조성물 및/또는 단일 비중단 투여, 예를 들어 단일 주사 또는 연속 주입으로서 주어진 세포의 양 또는 수의 투여를 포괄하며 또한 다중 개별 조성물 또는 주입제로 제공된 경우 명시된 기간에 걸쳐, 예컨대 3일 이내에 걸쳐 분할된 단위 용량 또는 복수의 조성물로서 주어진 세포의 양 또는 수의 투여를 포괄한다. 따라서, 일부 맥락에서, 단위 용량은 단일 시점에서 주어된 또는 개시된, 명시된 세포 수의 단일 또는 연속 투여이다. 그러나, 일부 맥락에서, 단위 용량은 3일 동안 또는 2일 동안 하루에 한 번 또는 하루의 기간에 걸쳐 다중 주입에 의한 것과 같이 3일 이내의 기간에 걸쳐 다중 주사 또는 주입으로 투여된다.
따라서, 일부 측면에서, 단위 용량의 세포는 단일 약학 조성물로 투여된다. 일부 구현예에서, 단위 용량의 세포는 총체적으로 단위 용량의 세포를 함유하는 복수의 조성물로 투여된다.
일부 구현예에서, 용어 “분할 단위 용량(split dose)”은 1일 이상에 걸쳐 투여되도록 분할된 단위 용량을 지칭한다. 상기 유형의 투약은 본 방법에 포괄되고 단일 단위 용량으로 간주된다.
따라서, 단위 용량의 세포는 분할 단위 용량, 예를 들어, 시간에 걸쳐 투여되는 분할 단위 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단위 용량은 2일 또는 3일에 걸쳐 대상체에 투여될 수 있다. 분할 투약에 대한 예시적인 방법은 첫 날에 단위 용량의 25%를 투여하고 두 번째 날에 단위 용량의 나머지 75%를 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 단위 용량의 33%가 첫 날에 투여되고 두 번째 날에 나머지 67%가 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 단위 용량의 10%가 첫 날에 투여되고, 단위 용량의 30%가 두 번째 날에 투여되며, 단위 용량의 60%가 셋째 날에 투여된다. 일부 구현예에서, 분할 단위 용량은 3일 초과 기간에 걸쳐 확대되지 않는다.
일부 구현예에서, 단위 용량의 세포는 복수의 조성물 또는 용액, 예컨대 제1 및 제2, 임의적으로 그 이상의 투여로 투여될 수 있고, 각각은 단위 용량의 세포를 일부 함유한다. 일부 측면에서, 각각이 상이한 세포의 집단 및/또는 하위 유형의 세포를 함유하는 복수의 조성물이 임의적으로 특정 기간 내에 별도로 또는 독립적으로 투여된다. 예를 들어, 세포의 집단 및/또는 하위 유형의 세포는 각각 CD8+ 및 CD4+ T 세포 및/또는 각각 CD8+- 및 CD4+-농축 집단, 예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함할 수 있고 각각은 개별적으로 재조합 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단위 용량의 투여는 CD8+ T 세포의 단위 용량 또는 CD4+ T 세포의 단위 용량을 포함하는 제1 조성물의 투여 및 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 다른 단위 용량을 포함하는 제2 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물 또는 단위 용량의 투여, 예를 들어, 복수의 세포 조성물의 투여는 세포 조성물의 별도 투여를 수반한다. 일부 측면에서, 별도 투여는 동시든 순차적이든 임의의 순서로 수행된다. 일부 구현예에서, 단위 용량은 제1 조성물 및 제2 조성물을 포함하고, 제1 조성물 및 제2 조성물은 (약) 0 내지 (약) 12시간 간격으로, (약) 0 내지 (약) 6시간 간격으로 또는 (약) 0 내지 (약) 2시간 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 조성물의 투여 개시 및 제2 조성물의 투여 개시는 (약) 2시간 이내, (약) 1시간 이내 또는 (약) 30분 이내의 간격, (약) 15분 이내, (약) 10분 이내 또는 (약) 5분 이내의 간격으로 수행된다. 일부 구현예에서, 제1 조성물의 투여 개시 및/또는 완료 및 제2 조성물의 투여 개시 및/또는 완료는 (약) 2시간 이내, (약) 1시간 이내 또는 (약) 30분 이내의 간격, (약) 15분 이내, (약) 10분 이내 또는 (약) 5분 이내의 간격으로 수행된다.
일부 조성물에서, 제1 조성물, 예를 들어, 단위 용량의 제1 조성물은 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 조성물에서, 제1 조성물, 예를 들어, 단위 용량의 제1 조성물은 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 조성물은 제2 조성물 전에 투여된다.
일부 구현예에서, 단위 용량의 세포 또는 세포 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ 세포 대 재조합 수용체를 발현하는 CD8+ 세포 및/또는 CD4+ 세포 대 CD8+ 세포의 정의된 비율 또는 표적 비율을 포함하고, 상기 비율은 임의적으로 대략 1:1이거나 대략 1:3 내지 대략 3:1 사이, 예컨대 대략 1:1이다. 일부 측면에서, 표적 비율 또는 원하는 비율의 상이한 세포의 집단(예컨대 CD4+:CD8+ 비율 또는 CAR+CD4+:CAR+CD8+ 비율, 예를 들어, 1:1)을 갖는 조성물 또는 단위 용량의 투여는 집단들 중 하나를 함유하는 세포 조성물의 투여 후 집단들 중 다른 것을 포함하는 별도의 세포 조성물의 투여를 수반하고, 상기 투여는 표적 비율 또는 원하는 비율이거나 대략적인 표적 비율 또는 원하는 비율로 수행된다. 일부 측면에서, 정의된 비율로 단위 용량의 세포 또는 세포 조성물의 투여는 T 세포 요법의 팽창, 지속성 및/또는 항종양 활성의 향상으로 이어진다.
일부 구현예에서, 대상체는 세포의 다중 단위 용량, 예를 들어 2 이상의 단위 용량 또는 다중 연속 단위 용량을 받는다. 일부 구현예에서, 2 단위 용량이 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 연속적인 단위 용량, 예를 들어 제2 단위 용량을 받는데, 이는 첫 번째 단위 용량 후 대략 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일에 투여된다. 일부 구현예에서, 다중 연속 단위 용량은 제1 단위 용량 후에 투여되어 추가적인 단위 용량 또는 단위 용량들은 연속 단위 용량의 투여 후에 투여된다. 일부 측면에서, 추가 단위 용량으로 대상체에 투여되는 세포의 수는 제1 단위 용량 및/또는 연속 단위 용량과 동일하거나 이와 유사하다. 일부 구현예에서, 추가 단위 용량 또는 단위 용량들은 선행 단위 용량들보다 더 크다.
일부 측면에서, 제1 및/또는 연속 단위 용량의 크기는 하나 이상의 기준 예컨대 선행 치료, 예를 들어 화학요법에 대한 대상체의 반응, 대상체에서 질병 부담, 예컨대 종양 부하, 부피, 크기 또는 전이의 정도, 범위 또는 유형, 단계 및/또는 대상체가 독성 결과, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경 독성을 발달시킬 가능성 또는 발생률 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응에 기초하여 결정된다.
일부 측면에서, 제1 단위 용량의 투여와 연속 단위 용량의 투여 사이의 시간은 약 9 내지 약 35일, 약 14일 내지 약 28일 또는 15일 내지 27일이다. 일부 구현예에서, 연속 단위 용량의 투여는 제1 단위 용량의 투여 후 약 14일 초과 및 약 28일 미만의 시점에 수행한다. 일부 측면에서, 제1 단위 용량 및 연속 단위 용량 사이 시간은 약 21일이다. 일부 구현예에서, 추가 단위 용량 또는 단위 용량들, 예를 들어, 연속 단위 용량들은 연속 단위 용량 투여 후 투여된다. 일부 측면에서, 추가 연속 단위 용량 또는 단위 용량들은 선행 단위 용량 투여 후 약 14일 이상 및 약 28일 미만에 투여된다. 일부 구현예에서, 추가 단위 용량은 선행 단위 용량 후 약 14일 미만, 예를 들어, 선행 단위 용량 후 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13일에 투여된다. 일부 구현예에서, 선행 단위 용량 후 약 14일 미만 및/또는 선행 단위 용량 후 약 28일 이상에는 어떤 단위 용량도 투여되지 않는다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 재조합 수용체 발현 세포의 단위 용량은 제1 단위 용량의 T 세포 및 연속 단위 용량의 T 세포를 포함한 2 단위 용량(예를 들어, 2배 단위 용량)을 포함하며, 여기서 제1 단위 용량 및 제2 단위 용량 중 하나 또는 둘 모두는 T 세포의 분할 단위 용량 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 일반적으로 질병 부담을 감소시키는데 효과적일 만큼 충분히 크다.
일부 구현예에서, 세포는 원하는 투여량으로 투여되며, 이는 일부 측면에서 원하는 단위 용량 또는 세포 수 또는 세포 유형(들) 및/또는 원하는 비율의 세포 유형을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서 세포의 투여량은 세포의 총 수(또는 체중 1kg당 수) 및 개별 집단 또는 하위 유형의 원하는 비율, 예컨대 CD4+ 대 CD8+ 비율에 기초한다. 일부 구현예에서, 세포의 투여량은 개별 집단의 세포 또는 개별 세포 유형의 원하는 총 수(또는 체중 1kg당 수)에 기초한다. 일부 구현예에서, 투여량은 개별 집단에서 원하는 총 세포 수, 원하는 비율 및 원하는 세포의 총 수와 같은 상기 특성의 조합에 기초한다.
일부 구현예에서, CD8+ 및 CD4+ T 세포와 같은 세포의 집단 또는 하위 유형의 세포는 원하는 T 세포의 단위 용량과 같이 원하는 총 세포의 단위 용량의 허용된 차이로 또는 허용된 차이 내로 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 단위 용량은 원하는 세포 수 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중 단위 당 원하는 세포 수, 예를 들어 세포/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 단위 용량은 최소 세포 수 또는 체중 단위당 최소 세포 수 이상이다. 일부 측면에서, 원하는 단위 용량으로 투여되는 총 세포 중, 개별 집단 또는 하위 유형은 원하는 산출 비율(예컨대 CD4+ 대 CD8+ 비율)로 또는 부근의 비율로, 예를 들어 상기 비율의 특정 허용된 차이 또는 오차 내로 존재한다.
일부 구현예에서, 세포는 CD4+ 세포의 원하는 단위 용량 및/또는 CD8+ 세포의 원하는 단위 용량과 같은 하나 이상의 개별 세포의 집단 또는 하위 유형의 세포의 원하는 단위 용량의 허용된 차이 또는 차이 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 단위 용량은 원하는 하위 유형 또는 집단의 세포 수 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중 단위 당 원하는 상기 세포 수, 예를 들어 세포/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 단위 용량은 집단 또는 하위 유형의 최소 세포 수 이상 또는 체중 단위당 집단 또는 하위 유형의 최소 세포 수이다.
따라서, 일부 구현예에서, 투여량은 총 세포의 원하는 고정 단위 용량 및 원하는 비율에 기초하고/거나 하나 이상, 예를 들어 각각의 개별 하위 유형 또는 하위 집단의 원하는 고정 단위 용량에 기초한다. 따라서, 일부 구현예에서, 투여량은 T 세포의 원하는 고정 또는 최소 단위 용량 및 CD4+ 대 CD8+ 세포의 원하는 비율에 기초하고/거나 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포의 원하는 고정 또는 최소 단위 용량에 기초한다.
일부 구현예에서, 세포는 CD4+ 및 CD8+ 세포 또는 하위 유형과 같은 다중 세포의 집단 또는 하위 유형의 원하는 산출 비율의 허용된 범위에서 또는 범위 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 비율은 특정 비율일 수 있거나 비율의 범위일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 원하는 비율(예를 들어, CD4+ 대 CD8+ 세포의 비율)은 (약) 5:1 내지 (약) 5:1(또는 약 1:5 초과 내지 약 5:1 미만), 또는 (약) 1:3 내지 (약) 3:1(또는 약 1:3 초과 내지 약 3:1 미만), 예컨대 (약) 2:1 내지 (약) 1:5(또는 약 1:5 초과 내지 약 2:1 미만), 예컨대 (약) 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5 또는 1:5이다. 일부 측면에서, 허용된 차이는 원하는 비율의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4% 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50% (상기 범위 사이의 임의의 수치 포함) 이내이다.
특정 구현예에서, 세포의 수 및/또는 농도는 재조합 수용체(예를 들어, CAR) 발현 세포의 수를 지칭한다. 다른 구현예에서, 세포의 수 및/또는 농도는 투여된 모든 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 수 또는 농도를 지칭한다.
일부 측면에서, 단위 용량의 크기는 하나 이상의 기준 예컨대 선행 치료, 예를 들어 화학요법에 대한 대상체의 반응, 대상체에서 질병 부담, 예컨대 종양 부하, 부피, 크기 또는 전이의 정도, 범위 또는 유형, 단계 및/또는 대상체가 독성 결과, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경 독성을 발달시킬 가능성 또는 발생률 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응에 기초하여 결정된다.
일부 구현예에서, 방법은 또한 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포의 하나 이상의 추가 단위 용량의 투여 및/또는 림프구 고갈 요법을 포함하고/거나 방법 중 하나 이상의 단계가 반복된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 단위 용량은 초기 단위 용량과 동일하다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 단위 용량은 초기 단위 용량과 상이하며, 예를 들어, 초기 단위 용량보다 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 또는 그 이상과 같이 더 높거나, 초기 단위 용량보다 예를 들어 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 또는 그 이상과 같이 더 낮다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 단위 용량의 투여는 초기 치료 또는 임의의 선행 치료에 대한 대상체의 반응, 대상체에서 질병 부담, 예컨대 종양 부하, 부피, 크기 또는 전이의 정도, 범위 또는 유형, 단계 및/또는 대상체가 독성 결과, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경 독성을 발달시킬 가능성 또는 발생률 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응에 기초하여 결정된다.
B. 투여된 세포 평가
일부 경우에, 제공된 방법은 예를 들어 전이 유전자 서열이 통합된 세포를 함유하는 조작된 세포 또는 세포 조성물의 투여 후, 대상체의 샘플에서 조작된 세포의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 본원, 예를 들어 상기 섹션 II에 기술된 방법을 사용하여 생성된 것과 같은 조작된 세포 또는 세포 조성물이 투여된 대상체로부터 수득된 특정 샘플 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 평가하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 투여된 조작된 세포의 약동학적(PK) 또는 약력학(PD) 매개변수를 평가하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 약동학적 매개변수에는 투여 이후 최대(피크) 혈장 농도(Cmax), 피크 시간(즉, 최대 혈장 농도(Cmax)가 발생할 때; Tmax), 최저 혈장 농도(즉, 치료제, 예를 들어 CAR+ T 세포의 단위 용량들 사이의 최저 혈장 농도; Cmin), 배설 반감기(T1/2) 및 곡선 하 면적(즉, 시간 대 치료제 CAR+ T 세포의 혈장 농도를 그려 생성된 곡선 하 면적; AUC)이 포함된다.
일부 측면에서, 예시적인 구현예는 약동학적 매개변수, 예를 들어 혈액에 조작된 세포를 함유하는 조작된 세포 또는 조성물이 투여된 대상체로부터 수득된 샘플 내 CAR+ T 세포의 수 또는 농도, 및/또는 대상체의 샘플에 존재하는 전이 유전자 서열의 양 도는 농도를 평가 및/또는 모니터링하는 단계를 수반한다. 일부 측면에서, 예시적인 구현예는 약동학적 매개변수, 예를 들어 혈액 내 CAR+ T 세포의 수 또는 농도를 평가 및/또는 모니터링하는 단계를 수반한다. 일부 구현예에서, 방법은 혈액 내 CAR+ T 세포 수 및/또는 농도를, 예를 들어 상기 섹션 I.C.3에 기술된 바와 같이 혈액 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 및/또는 양을 결정하여 모니터링하는 단계를 수반한다.
V. 키트 및 제조품
본원에 제공된 방법을 수행하기 위한 시약, 예를 들어 통합된 전이 유전자 서열의 존재, 부재 및/또는 양을 평가하기 위한 시약을 함유하는 것과 같은 키트 및 제조품이 또한 제공된다. 일부 측면에서, 키트 또는 제조품은 또한 조작된 세포를 생성하기 위한 조작 또는 제조 공정에 사용하기 위한 시약 및/또는 핵산을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 샘플로부터 핵산을 단리하고 및/또는 크기 또는 분자량에 기초하여 핵산을 분리 또는 단리하고 및/또는 통합된 전이 유전자 서열의 존재, 부재 및/또는 양을 결정하는 데 필요한 시약 및/또는 소모품을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 펄스 필드 겔 전기영동(PFGE)용 시약 및 소모품과 같은 DNA의 고분자량 또는 저분자량 분획을 분리 또는 단리하기 위한 시약 및/또는 소모품을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 DNA의 고분자량 또는 저분자량 분획을 분리 또는 단리하는 단계들을 수행하기 위한 매트릭스 또는 겔 또는 매트릭스나 겔을 함유하는 카트리지를 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열의 전부 또는 일부에 특이적인, 하나 이상의 프로브 및/또는 프라이머 쌍과 같은 하나 이상의 프라이머를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 측면에서, 상기 프로브 및 프라이머는 전이 유전자 서열의 전부 또는 일부에 결합하거나 이를 인식 또는 검출할 수 있다. 일부 측면에서, 키트는 정량적 PCR(qPCR), 디지털 PCR(dPCR) 또는 액적 디지털 PCR(ddPCR)과 같은 중합효소연쇄반응(PCR)에 필요한 시약 및 또는 소모품을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 임의적으로 다른 성분, 예를 들어 PCR 프라이머, 중합효소와 같은 PCR 시약, 완충제, 뉴클레오타이드, 추가적인 분석법, 예를 들어 세포내 사이토카인 염색, 유세포 분석, 염색질 면역침강 및/또는 추가 분석법을 위한 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 추가적인 분석법을 위한 시약은 특정 분자의 발현 또는 수준을 측정하기 위한 시험관 내 분석법을 수행하기 위한 성분을 포함한다. 일부 경우에, 시험관 내 분석은 면역분석, 앱타머(aptamer) 기반 분석, 조직학적 또는 세포학적 분석 또는 mRNA 발현 수준 분석이다. 일부 구현예에서, 시험관 내 분석은 효소결합면역흡착분석(ELISA), 면역블로팅, 면역침강법, 방사선면역분석(RIA), 면역 염색법, 유세포 분석법, 표면 플라스몬 공명(SPR), 화학발광 분석, 측면 유동 면역분석, 억제 분석 및 산염기도 분석 중에서 선택된다. 일부 측면에서, 시약은 분자에 특이적으로 결합하는 결합 시약이다. 일부 경우에, 결합 시약은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 앱타머 또는 핵산 프로브이다. 키트의 다양한 성분은 별도의 용기들에 존재할 수 있거나 또는 특정 호환 가능 성분들이 단일 용기 속에 사전 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 제공된 방법을 실시하기 위해 키트의 성분을 사용하기 위한 지침을 더 포함한다.
VI. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 기술 및 과학 용어 또는 전문 용어는 청구된 주제가 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에서 정의되며, 본원에 상기 정의를 포함하는 것이 당업계에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 반드시 해석되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는, 용어 “전이 유전자” 또는 “전이 유전자 서열”(일부 경우에, 키메라, 재조합, 이종, 외인성 서열 또는 키메라, 재조합, 이종, 외인성 DNA로도 불림)은 상이한 미생물, 상이한 유전자 또는 상이한 변이체와 같은 상이한 공급원으로부터 온 구성 성분을 조합하여 인위적으로 형성된 핵산 서열을 지칭한다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열은 예를 들어 상이한 공급원으로부터 온 상이한 핵산 분자 또는 단편의 인위적인 조합에 의한 분자 생물학적 조작을 거쳤다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 전이 유전자 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포의 유전체 서열과 비교하여 상이한 기원으로부터 온 서열의 적어도 일부를 함유한다. 일부 경우에, 전이 유전자 서열의 적어도 일부는 전이 유전자 서열이 도입된 세포에 대해 이종성, 외인성이거나 또는 전이 유전자를 가진다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열은 전이 유전자 서열이 도입된 세포의 유전체에 통합된 서열을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수 형태(“a”, “an” 및 “the”)는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, 단수 형태(“a” 또는 “an”)는 “적어도 하나(at least one)” 또는 “하나 이상(one or more)”을 의미한다. 본 명세서에 기재된 측면 및 변형은 측면 및 변형으로 “구성되는(consisting)” 및/또는 “필수적으로 구성되는(consisting essentially of)”을 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서에 사용된 용어 “약(about)”은 본 기술 분야의 당업자에게 용이하게 알려진 각각의 수치에 대한 일반적인 오차 범위를 지칭한다. 본 명세서에서 “약”의 수치 또는 매개변수에 대한 언급은 상기 수치 또는 매개변수 자체에 관한 구현예를 포함(설명)한다. 예를 들어, “약 X”를 지칭하는 기재는 “X”의 기재를 포함한다.
본 개시를 통해, 청구된 주제의 다양한 측면이 범위 형식으로 제시된다. 범위 형식의 기재는 단지 편의 및 간결성을 위한 것이며 청구된 주제의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 기재는 모든 가능한 하위 범위 및 상기 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 수치의 범위가 제공되는 경우, 상기 범위의 상한 내지 하한 사이 각각의 사이에 오는 수치와 상기 언급된 범위에서 임의의 다른 언급되거나 사이에 오는 수치가 청구된 주제 내에 포함되는 것으로 이해된다. 상기 더 작은 범위의 상한 내지 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계를 조건으로 청구된 주제 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 상기 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 청구된 주제에 포함된다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 조성물은 세포를 포함하여 둘 이상의 산물, 물질 또는 화합물의 임의의 혼합물을 지칭한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 이들의 임의의 조합물일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 세포 또는 세포의 집단이 특정 표지자에 대해 “양성(positive)”이라는 진술은 특정 표지자, 통상적으로 표면 표지자가 세포 상에 또는 세포 내에 검출 가능하게 존재함을 지칭한다. 표면 표지자를 언급할 때, 상기 용어는 유세포 분석에 의해, 예를 들어, 이 표지자에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출된 바와 같은 표면 발현의 존재를 지칭하며, 이 염색은 달리 동일한 조건 하에서 동종형-매칭된 대조군으로 같은 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 상위 수준에서 및/또는 표지자에 대해 양성인 것으로 공지된 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서 및/또는 표지자에 대해 음성인 것으로 공지된 세포에 대한 것보다 실질적으로 더 높은 수준에서 유세포 분석에 의해 검출 가능하다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 세포 또는 세포의 집단이 특정 표지자에 대해 “음성(negative)”이라는 진술은 특정 표지자, 통상적으로 표면 표지자가 세포 상에 또는 세포 내에 실질적으로 검출 가능하게 존재하지 않음을 지칭한다. 표면 표지자를 언급할 때, 상기 용어는 유세포 분석에 의해, 예를 들어, 이 표지자에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출된 바와 같은 표면 발현의 부재를 지칭하며, 이 염색은 달리 동일한 조건 하에서 동종형-매칭된 대조군으로 같은 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 상위 수준에서 및/또는 표지자에 대해 양성인 것으로 공지된 세포에 대한 것보다 실질적으로 더 낮은 수준에서 및/또는 표지자에 대해 음성인 것으로 공지된 세포에 대한 것과 비교하여 실질적으로 유사한 수준에서 유세포 분석에 의해 검출되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 “벡터(vector)”는 이에 연결된 다른 핵산을 번식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 및 이것이 도입된 숙주 세포의 유전체에 편입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이것이 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 본 명세서에서 “발현 벡터(expression vector)”로 지칭된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, “아미노산 서열 동일성 백분율(percent (%) amino acid sequence identity)” 및 “동일성 백분율(percent identity)”이 아미노산 서열(기준 폴리펩타이드 서열)에 대하여 사용될 때, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고 최대 백분율의 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하다면 갭을 도입한 후 기준 폴리펩타이드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열(예를 들어, 대상체 항체 또는 단편) 내 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 다양한 공지된 방법으로 달성될 수 있다. 서열을 정렬하기 위한 적절한 매개변수는 비교되는 서열의 전장에 대한 최대 정렬 달성을 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, “작동 가능하게 연결된”은 DNA 서열(예를 들어, 이종 핵산) 및 조절 서열(들)과 같은 성분들의 회합을 포함할 수 있으며, 이는 적절한 분자(예를 들어, 전사 활성제 단백질)가 상기 조절 서열에 결합할 때 유전자 발현이 가능하게 되는 방식으로 이루어진다. 따라서, 기술된 성분이 의도된 방식으로 작용하도록 허용하는 관계에 있음을 의미한다.
아미노산 치환은 폴리펩타이드에서 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비보존적 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 치환은 관심 결합 분자(예를 들어, 항체)에 도입될 수 있고, 그 산물은 원하는 활성, 예를 들어 유지/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별된다.
아미노산은 일반적으로 하기와 같은 공통적인 측쇄(side-chain) 특성에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르루신(Norleucine), Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
일부 구현예에서, 보존적 치환은 상기 클래스 중 하나의 멤버를 동일한 클래스의 다른 멤버로 교환하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비보존적 아미노산 치환은 상기 클래스 중 하나의 멤버를 다른 클래스로 교환하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, “대상체(subject)”는 인간 또는 다른 동물과 같은 포유동물이며, 통상적으로 인간이다.
VII. 예시적인 구현예
제공된 구현예 중에는 하기가 있다:
1. 전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은:
(a) 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을 분리하는 단계 - 상기 하나 이상의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함한 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및
(b) 상기 하나 이상의 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
2. 구현예 1에 있어서, 상기 분리하는 단계 전에, 상기 하나 이상의 세포로부터 디옥시리보핵산(DNA)을 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 상기 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 상기 하나 이상의 세포 내에서 2배체 유전체당 또는 세포당 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 세포의 집단을 포함하고, 여기서 상기 집단의 복수의 세포는 상기 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는, 방법.
5. 구현예 4에 있어서, 상기 복제수는 상기 세포의 집단 중에서 2배체 유전체당 또는 세포당 평균 복제수인, 방법.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 분리하는 단계 전에, 상기 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 상기 하나 이상의 세포 중 적어도 하나의 조작된 세포에 도입된 것을 특징으로 하는 방법.
7. 구현예 6에 있어서, 상기 적어도 하나의 조작된 세포는 상기 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 도입 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 임의적으로 (약) 37°C ± 2°C에서, 96시간을 초과하여 인큐베이션되지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
8. 구현예 6에 있어서, 상기 적어도 하나의 조작된 세포는 상기 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 도입 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 임의적으로 (약) 37°C ± 2°C에서, 72시간을 초과하여 인큐베이션되지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
9. 구현예 6에 있어서, 상기 적어도 하나의 조작된 세포는 상기 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 도입 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 임의적으로 (약) 37°C ± 2°C에서, 48시간을 초과하여 인큐베이션되지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 DNA의 고분자량 분획의 분리 전에 냉동 보존된 것을 특징으로 하는 방법.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 세포주인, 방법.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 대상체의 샘플로부터 수득된 1차 세포인, 방법.
13. 구현예 12에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 면역 세포인, 방법.
14. 구현예 13에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포인, 방법.
15. 구현예 14에 있어서, 상기 T 세포는 CD3+, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포인, 방법.
16. 대상체의 생물학적 샘플 내 전이 유전자 서열을 평가하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은:
(a) 대상체의 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을 분리하는 단계 - 상기 생물학적 샘플은 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함한 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및
(b) 상기 생물학적 샘플의 전부 또는 일부 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
17. 구현예 16에 있어서, (b)에서 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 상기 생물학적 샘플의 전체 또는 일부 내 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
18. 구현예 16에 있어서, 상기 분리하는 단계 전에, 상기 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 세포로부터 DNA를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
19. 구현예 16 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 상기 전이 유전자 서열을 포함하는 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하는 조성물이 투여된 대상체로부터 수득되는 것을 특징으로 하는, 방법.
20. 구현예 16 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 조직 또는 체액 샘플인, 방법.
21. 구현예 20에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 조직 샘플이고 상기 조직은 종양인, 방법.
22. 구현예 21에 있어서, 상기 조직 샘플은 종양 생검인, 방법.
23. 구현예 20에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 체액 샘플이고 상기 체액 샘플은 혈액 또는 혈청 샘플인, 방법.
24. 구현예 16 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 분리하는 단계 전에, 상기 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 상기 하나 이상의 세포 중 적어도 하나의 조작된 세포에 도입된 것을 특징으로 하는 방법.
25. 구현예 16 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 샘플 내 하나 이상의 세포는 면역 세포를 포함하는, 방법.
26. 구현예 25에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포인, 방법.
27. 구현예 26에 있어서, 상기 T 세포는 CD3+, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포인, 방법.
28. 구현예 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 분리하는 단계는 펄스 필드 겔 전기영동 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수행되는, 방법.
29. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 분리하는 단계는 펄스 필드 겔 전기영동에 의해 수행되는, 방법.
30. 전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은:
(a) 세포의 집단으로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을, 펄스 필드 겔 전기영동에 의해, 분리하는 단계 - 상기 세포의 집단은 복수의 조작된 세포를 포함하고 각각의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및
(b) 상기 세포의 집단의 복수의 조작된 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 2배체 유전체당 또는 세포당 평균 복제수를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
31. 구현예 30에 있어서, 상기 분리하는 단계 전에, 상기 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 상기 세포의 집단의 복수의 조작된 세포 중 적어도 하나에 도입된 것을 특징으로 하는, 방법.
32. 구현예 31에 있어서, 상기 세포의 집단은 상기 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 조작된 세포에 도입한 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 임의적으로 (약) 37°C ± 2°C에서, 96시간을 초과하여 인큐베이션되지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
33. 구현예 31에 있어서, 상기 세포의 집단은 상기 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 조작된 세포에 도입한 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 임의적으로 (약) 37°C ± 2°C에서, 72시간을 초과하여 인큐베이션되지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
34. 구현예 31에 있어서, 상기 세포의 집단은 상기 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 조작된 세포에 도입한 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 임의적으로 (약) 37°C ± 2°C에서, 48시간을 초과하여 인큐베이션되지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
35. 구현예 30 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포의 집단은 DNA의 고분자량 분획의 분리 전에 냉동 보존된 것을 특징으로 하는 방법.
36. 구현예 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 고분자량 분획은 (약) 15 킬로베이스(kb)를 초과하는 것을 특징으로 하는 방법.
37. 구현예 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 고분자량 분획은 (약) 17.5 킬로베이스(kb)를 초과하는 것을 특징으로 하는 방법.
38. 구현예 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 고분자량 분획은 (약) 20 킬로베이스(kb)를 초과하는 것을 특징으로 하는 방법.
39. 구현예 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 수행되는, 방법.
40. 구현예 39에 있어서, 상기 PCR은 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 디지털 PCR 또는 액적 디지털 PCR인, 방법.
41. 구현예 39 또는 구현예 40에 있어서, 상기 PCR은 액적 디지털 PCR인, 방법.
42. 구현예 39 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 상기 PCR은 상기 전이 유전자 서열의 적어도 일부에 상보적이거나 적어도 일부를 특이적으로 증폭할 수 있는 하나 이상의 프라이머를 사용하여 수행되는, 방법.
43. 구현예 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 상기 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA의 질량 또는 중량당, 임의적으로 상기 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA의 마이크로그램당 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
44. 구현예 43에 있어서, 상기 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA의 마이크로그램당 전이 유전자 서열의 질량 또는 중량을 마이크로그램 단위로 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
45. 구현예 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 상기 하나 이상의 세포당, 임의적으로 CD3+, CD4+ 및/또는 CD8+ 세포당, 및/또는 재조합 단백질을 발현하는 세포당 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
46. 구현예 16 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 상기 생물학적 샘플 내에서 2배체 유전체당 또는 세포당 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
47. 구현예 46에 있어서, 상기 복제수는 상기 생물학적 샘플 내 하나 이상의 세포 중에서 2배체 유전체당 또는 세포당 평균 복제수인, 방법.
48. 구현예 16 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 상기 생물학적 샘플의 체적당, 임의적으로 상기 생물학적 샘플의 마이크로리터당 또는 밀리리터당 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
49. 구현예 16 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 상기 대상체의 체중 또는 체표면적당 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
50. 구현예 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 상기 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계 및 상기 질량, 중량 또는 복제수를 상기 고분자량 분획 내 기준 유전자의 질량, 중량 또는 복제수로 또는 표준 곡선으로 정규화하는 단계를 포함하는, 방법.
51. 구현예 50에 있어서, 상기 기준 유전자는 하우스키핑 유전자인, 방법.
52. 구현예 50 또는 구현예 51에 있어서, 상기 기준 유전자는 알부민(ALB)을 암호화하는 유전자인, 방법.
53. 구현예 50 또는 구현예 51에 있어서, 상기 기준 유전자는 리보뉴클레아제 P 단백질 서브유닛 p30(RPP30)을 암호화하는 유전자인, 방법.
54. 구현예 50 내지 53에 있어서, 상기 단리된 DNA 내 기준 유전자의 복제수를 결정하는 단계는 상기 기준 유전자의 적어도 일부에 상보적이거나 적어도 일부를 특이적으로 증폭할 수 있는 하나 이상의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수행되는, 방법.
55. 구현예 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 완전한 바이러스 gag(객) 단백질을 암호화하지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
56. 구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 완전한 HIV 유전체, 복제 가능 바이러스 유전체, 및/또는 부가적 유전자를 포함하지 않으며, 부가적 유전자는 임의적으로 Nef, Vpu, Vif, Vpr, 및/또는 Vpx인, 방법.
57. 구현예 6 내지 15, 24 내지 29 및 31 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드의 도입은 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 벡터를 사용한 형질도입에 의해 수행되는, 방법.
58. 구현예 57에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터인, 방법.
59. 구현예 57 또는 구현예 58에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
60. 구현예 57에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV 벡터이고, 임의적으로 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8 벡터 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
61. 구현예 6 내지 15, 24 내지 29 및 31 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드의 도입은 물리적 전달 방법에 의해, 임의적으로 전기 천공법에 의해 수행되는, 방법.
62. 구현예 1 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질은 재조합 수용체인, 방법.
63. 구현예 62에 있어서, 상기 재조합 수용체는 질병 또는 병태와 관련된 항원 또는 질병 또는 병태와 관련된 병변 환경의 세포에서 발현되는 항원에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 방법.
64. 구현예 63에 있어서, 상기 질병 또는 병태는 암인, 방법.
65. 구현예 63 또는 구현예 64에 있어서, 상기 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9; CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG; NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 8족 A 멤버를 함유하는 류신 풍부 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 자연 살생 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1; TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2; 도파크롬 타우토메라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원, 또는 보편적 꼬리표(universal tag) 관련 항원, 및/또는 비오틴화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
66. 구현예 62 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 수용체는 T 세포 수용체(TCR) 또는 기능성 비-T 세포 수용체인, 방법.
67. 구현예 62 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 방법.
68. 구현예 67에 있어서, 상기 CAR은 상기 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 인식 도메인 및 ITAM을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는, 방법.
69. 구현예 68에 있어서, ITAM을 포함하는 상기 세포내 신호 전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의, 임의적으로 인간 CD3-제타 사슬의 세포내 도메인을 포함하는, 방법.
70. 구현예 68 또는 구현예 69에 있어서, 상기 세포내 신호 전달 도메인은 공자극 신호 전달 영역을 더 포함하는, 방법.
71. 구현예 70에 있어서, 상기 공자극 신호 전달 영역은 CD28 또는 4-1BB의, 임의적으로 인간 CD28 또는 인간 4-1BB의 신호 전달 도메인을 포함하는, 방법.
72. 통합되지 않은 잔류 전이 유전자 서열을 평가하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은:
(a) 구현예 1 내지 15 및 28 내지 71 중 임의의 구현예의 방법을 수행하여, DNA의 고분자량 분획 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정함으로써 전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하는 단계;
(b) 고분자량 분획을 분리하지 않고 단리된 DNA 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계; 및
(c) (a)에서 결정된 양을 (b)에서 결정된 양과 비교함으로써 통합되지 않은 잔류 재조합 서열의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
73. 구현예 72에 있어서, 상기 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 상기 하나 이상의 세포 내에서 2배체 유전체당 또는 세포당 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
74. 구현예 72 또는 구현예 73에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 세포의 집단을 포함하고, 여기서 상기 집단의 복수의 세포는 상기 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는, 방법.
75. 구현예 74에 있어서, 상기 복제수는 상기 세포의 집단 중에서 2배체 유전체당 또는 세포당 평균 복제수인, 방법.
76. 구현예 72 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 상기 복제수를 비교하는 단계는 (b)에서 결정된 복제수에서 (a)에서 결정된 복제수를 빼는 단계를 포함하는, 방법.
77. 구현예 72 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 상기 복제수를 비교하는 단계는 (a)에서 결정된 복제수 대 (b)에서 결정된 복제수의 비율을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
78. 구현예 72 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 상기 (b)에서 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 수행되는, 방법.
79. 구현예 78에 있어서, 상기 PCR은 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 디지털 PCR 또는 액적 디지털 PCR인, 방법.
80. 구현예 78 또는 구현예 79에 있어서, 상기 PCR은 액적 디지털 PCR인, 방법.
81. 구현예 78 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 상기 PCR은 상기 전이 유전자 서열의 적어도 일부에 상보적이거나 적어도 일부를 특이적으로 증폭할 수 있는 하나 이상의 프라이머를 사용하여 수행되는, 방법.
82. 구현예 72 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 상기 (b)에서 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 고분자량 분획을 분리하지 않고 단리된 DNA 내 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계 및 질량, 중량 또는 복제수를 고분자량 분획을 분리하지 않고 단리된 DNA 내 기준 유전자의 질량, 중량 또는 복제수로 또는 표준 곡선으로 정규화하는 단계를 포함하는, 방법.
83. 구현예 72에 있어서, 상기 기준 유전자는 하우스키핑 유전자인, 방법.
84. 구현예 82 또는 구현예 83에 있어서, 상기 기준 유전자는 알부민(ALB)을 암호화하는 유전자인, 방법.
85. 구현예 82 또는 구현예 83에 있어서, 상기 기준 유전자는 리보뉴클레아제 P 단백질 서브유닛 p30(RPP30)을 암호화하는 유전자인, 방법.
86. 구현예 82 내지 85에 있어서, 상기 단리된 DNA 내 기준 유전자의 질량, 중량 또는 복제수를 결정하는 단계는 상기 기준 유전자의 적어도 일부에 상보적이거나 적어도 일부를 특이적으로 증폭할 수 있는 하나 이상의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수행되는, 방법.
87. 구현예 72 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 상기 (a)에서 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계와 상기 (b)에서 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 동일한 프라이머 또는 동일한 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 수행되는, 방법.
88. 구현예 72 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 상기 통합되지 않은 잔류 재조합 서열은 벡터 플라스미드, 선형 상보적 DNA(cDNA), 자가통합체(autointegrant) 또는 긴 말단 반복(LTR) 서클(circles) 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
VIII. 실시예들
하기 실시예들은 예시적인 목적으로만 포함되며 본 발명의 범위를 한정하려는 의도는 아니다.
실시예 1: 펄스 필드 겔 전기영동으로 재조합 단백질을 발현하도록 조작된 세포에서 통합된 전이 유전자 복제수를 평가하는 방법
재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 함유한 바이러스 벡터로 형질도입된 세포에서 벡터 복제수를 평가하기 위한 방법에서 고분자량 DNA를 분리하기 위한 전략으로 펄스 필드 겔 전기영동(PFGE)의 사용을 살펴보았다.
주르카트 T 세포주를 재조합 단백질을, 이 경우에는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 전이 유전자 서열을 함유한 렌티바이러스 제제로 형질도입하였다. 그 세포들을 3일 동안 배양한 후, 유전체 DNA를 세포들로부터 단리하였다. 대조군으로, 전이 유전자 서열을 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입되지 않은 세포로부터 유전체 DNA를 단리하였고, 단리된 유전체 DNA에 재조합 단백질을 암호화하는 플라스미드와 수포성 구내염 인디애나 바이러스 G 단백질(VSVg)을 암호화하는 비통합 바이러스 패키징 플라스미드의 공지된 양을 첨가하였다.
고분자량 DNA 종을 15kb, 17.5kb 또는 20kb 미만의 저분자량 비염색체 DNA 종으로부터 분리하기 위해 DNA 샘플에 BluePippin (Sage Science, Beverly, MA) 기기를 사용하여 자동화된 펄스 필드 겔 전기영동(PFGE)을 시행하였다.
전이 유전자 서열(“전이 유전자”)에 고유한 서열에 특이적인 프라이머를 사용하여 고분자량 DNA 샘플에 액적 디지털 PCR(ddPCR)과 같은 예시적인 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 방법을 수행하였다. 비교를 위해, ddPCR을 또한 수행하였는데, 형질도입된 세포에서 세포의 염색체에 통합될 것으로 예상되지 않은 첨가된 DNA 또는 잔류 패키징 플라스미드를 검출하기 위해 VSVg 암호화 서열(“패키징 플라스미드”)에 특이적인 프라이머와, 모든 샘플에서 유전체 DNA를 검출하기 위해 하우스키핑 유전자에 특이적인 프라이머(예를 들어, 리보뉴클레아제 P 단백질 서브유닛 p30(RRP30; “유전체 대조군”)를 사용하여 수행하였다. 알부민(ALB) 유전자에 특이적인 프라이머를 정규화를 위한 기준으로 사용하였다. 또한 PFGE를 거치지 않은(겔 전) DNA 샘플에서 반응을 수행하였다. ddPCR을 위해, 샘플을 각 프라이머 세트와 프로브를 함유한 혼합물에 추가하고, 액적 발생기를 사용하여 액적을 생성하고, 생성된 액적을 PCR 플레이트로 전달하고, 다음 PCR 조건: 95ºC 10분; 2ºC/sec 증감발량(ramp rate)에서 [94ºC 30초; 60ºC 1분] x 39 사이클; 98ºC 10분; 및 4ºC 무기한; 조건에서 증폭을 수행하였다. 증폭 이후에, 액적 판독기에서 액적으로부터 신호를 측정하였다. 각 유전자의 복제수를 2배체 유전체의 수로(cp/2배체, 알부민(ALB) 유전자에 특이적인 프라이머를 기준으로 증폭을 사용하여) 또는 유전체 DNA 50ng당으로 정규화하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, 첨가된 CAR 암호화 플라스미드 및 VSVg 패키징 플라스미드를 함유한 비형질도입된 샘플에서, 전이 유전자 서열 및 VSVg 서열은 PFGE를 거치지 않은(겔 전) 샘플에서만 검출되었다. 이와는 대조적으로, 유전체 대조군 서열은 15kb, 17.5kb 또는 20kb 이상의 더 고분자량 DNA에 대해 PFGE를 거친 모든 샘플에서 검출되었다. 이 결과는 분리된 DNA의 PCR 증폭 전의 PFGE는 통합되지 않은 더 저분자량 플라스미드의 분리를 달성했다는 것을 보여주었다.
형질도입된 샘플에서, 전이 유전자 서열은 PFGE 이전(겔 전)의 샘플과 15kb, 17.5kb 또는 20kb를 넘는 PFGE를 거친 샘플 모두에서 검출되었다(도 1 하단 패널). VSVg 패키징 플라스미드 서열은 겔 전 샘플에서 발견되었고 더 고분자량 DNA에서는 거의 검출할 수 없었다. 바이러스 생산으로 인한 잔류 플라스미드 서열에서 유래할 가능성이 있는 이 서열들은 세포의 유전체에 통합될 것으로 예상되지 않았다. 염색체 DNA를 포함한 유전체 DNA 또한 모든 샘플에서 검출되었으며, RRP30 하우스키핑 유전자의 복제수는 모든 샘플에서 대략 2배체 유전체당 2 카피인 것으로 관찰되었다.
PFGE를 포함한 분석법은 통합되지 않은 저분자량 핵산 종을 제거하면서 통합된 서열 또는 유전체 서열의 검출을 가능하게 했다. 따라서, 결과는 단리된 DNA로부터 전이 유전자 서열의 PCR 증폭 전에 고분자량 DNA를 분리하기 위해 PFGE를 사용하는 것은 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 복제수의 특이적인 결정을 용이하게 하기 위해 통합된 벡터 복제수(iVCN) 분석법으로서 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 2: 세포 제조 공정 동안 여러 시점에 펄스 필드 겔 전기영동(PFGE)을 거치고 또는 거치지 않고 액적 디지털 PCR(ddPCR)에 의해 평가된 전이 유전자 복제수의 비교
qPCR에 의한 벡터 복제수 분석 전에 PFGE에 의한 고분자량 종의 분리를 수반하는 실시예 1에 설명된 iVCN 방법을 사용하여 주르카트 T 세포주와 1차 T 세포 모두에서 세포 조작 공정 중에 여러 시점에 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 예시적인 전이 유전자 서열의 통합된 복제수를 평가하였다. 이 방법을 펄스 필드 겔 전기영동(PFGE)에 의한 고분자량 및 저분자량 DNA 종의 분리를 포함하지 않은 표준 벡터 복제수(VCN) 분석법과 비교하였다.
연구를 위해, 세포로부터 유전체 DNA를 제조하여 (1) 일반적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 15kb 초과의 분리를 위한 임계값을 사용하는 iVCN 방법(“iVCN”) 및 PippinHT(Sage Science, Beverly, MA) 기기, 또는 (2) 유전체 DNA가 처음에 PFGE에 의해 분리되지 않은 표준 VCN 방법(“VCN”)으로 전이 유전자 서열 복제수의 평가를 진행하였다. 두 분석법에서, 전이 유전자 복제수는 전이 유전자에 고유한 서열에 특이적인 프라이머를 사용하는 ddPCR에 의해 결정되었고, 기준 유전자(예를 들어, 알부민(ALB) 유전자)에 특이적인 프라이머를 사용하여 결정된 바와 같이 2배체 유전체로 정규화하였다.
A. 주르카트 세포주
주르카트 T 세포를 일반적으로 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 CAR을 암호화하는 전이 유전자 서열을 함유한 렌티바이러스 제제로 형질도입하였다. 형질도입 이전(“이전”), 형질도입 후 5분, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간 시점에 세포 샘플을 수득하고 전이 유전자 복제수의 분석을 위해 사용하였다.
도 2a에 도시된 바와 같이, 주르카트 세포를 조작하는 공정에서 여러 시점에 유전체 내 통합된 복제수(iVCN)를 검출하기 위해 PFGE를 거친 전이 유전자 복제수 평가는 이 세포들에서 약 6시간이 될 때까지 전이 유전자 통합을 검출할 수 없었고 검출된 복제수가 일반적으로 안정기에 이른 약 48시간까지 증가하였음을 보여주었다. 이와는 대조적으로, 표준 VCN 방법에 의해 세포내 전이 유전자의 복제수를 검출한, PFGE를 거치지 않은 전이 유전자 복제수 평가는 실질적인 전이 유전자 서열의 검출이 훨씬 더 이른 시점에 시작되었음을 입증하였다. 이 관찰은 세포 조작 후 이 초기 시점들에서 생산자 플라스미드, 선형 또는 환형 상보적 DNA(cDNA)또는 자가통합체(autointegrant)와 같은, 표준 VCN 방법에 의한 비통합 전이 유전자 서열의 검출과 일치한다. PFGE를 거치지 않고 결정된 전이 유전자 복제수는 약 96시간에 iVCN 통합된 복제수 평가(PFGE를 거침)에 의해 검출된 것과 비슷한 수준으로 감소하였고, 이는 전이 유전자 통합이 비록 약 48시간에 완료되었더라도 PFGE를 거치지 않는 표준 VCN 방법이 이 세포들에서 형질도입 후 약 96시간까지 정확하지 않았음을 나타낸다.
B. 1차 세포 조작
인간 대상체로부터 온 1차 T 세포를 예시적인 조작 공정을 사용하여 CAR을 발현하도록 조작하였다. 백혈구 성분채집술 샘플로부터 단리된 PBMC로부터 별도의 CD4+ 및 CD8+ 세포 조성물을 선택하고, 선택한 세포 조성물을 냉동 보존하였다. 이어서 별도의 CD4+ 및 CD8+ 세포 조성물을 해동하고 생존 가능한 CD4+ T 세포 대 생존 가능한 CD8+ T 세포 1:1의 비율로 혼합하였다. 혼합된 조성물의 대략 300 x 106개의 T 세포(150 x 106 CD4+ 및 150 x 106 CD8+ T 세포)를 18 내지 30시간 동안 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유한 무혈청 배지에서 비드 대 세포 비율 1:1로 항-CD3 및 항-CD28 항체가 부착된 상자성 폴리스티렌-코팅된 비드의 존재 하에서 자극하였다.
인큐베이션 후에, 자극된 세포 조성물로부터 약 100 x 106개의 생존 가능한 세포를 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유한 무혈청 배지로 세척 및 재현탁하였다. 세포를 60분 동안 대략 1600g에서 회전 접종에 의해 항-BCMA CAR을 암호화하는 렌티바이러스 제제로 형질도입하였다. 회전 접종 후, 세포를 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유한 무혈청 배지에서 세척 및 재현탁하고, 약 18 내지 30시간 동안 약 37 ºC에서 인큐베이션하였다. 상기 항-BCMA CAR는 BCMA에 특이적인 scFv 항원 결합 도메인, CD28 막관통 영역, 4-1BB 공자극 신호 전달 영역 및 CD3-제타 유래 세포내 신호 전달 도메인을 함유했다.
이어서 상기 세포는 인큐베이션 및 형질도입 단계 중 사용된 바와 같은 사이토카인 농도의 2배를 함유하는 배지 약 500mL에 담아 생물 반응기(예를 들어, 흔들리는 동작 생물 반응기)로 전달하여 팽창을 위해 배양하였다. 설정된 생존 가능한 세포 밀도가 달성될 때, 관류가 개시되었으며, 여기서 배지는 연속 혼합으로 반연속 관류에 의해 대체되었다. 세포는 약 3 x109개 세포의 임계 세포 수(TNC)가 달성될 때까지 생물 반응기에서 배양되었으며, 이 달성은 통상적으로 6 내지 7일의 팽창을 수반하는 공정에서 발생했다. 항-CD3 및 항-CD28 항체 접합 상자성 비드가 자기장에 노출됨으로써 세포 조성물에서 제거되었다. 그런 후 세포를 모아서 동결보호제로 제형화하였다.
상기 기술된 바와 같이 iVCN 및 표준 VCN 방법으로 DNA의 분석을 위해, 형질도입 이전(“이전”), 형질도입 후 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간 및 조작 공정 완료(“완료”) 시점에 세포 샘플을 수득하였다.
도 2b에 도시된 바와 같이, PFGE 이후 결정된(iVCN) 바와 같이 전이 유전자 복제수는 형질도입 후 약 24시간까지는 검출되지 않았으며 약 48 내지 72시간까지 증가하였다. PFGE를 거치지 않은 분석법에서(VCN), 전이 유전자 복제수는 초기 시점(24 및 48시간)에 훨씬 더 높았으나, 이후에 약 96시간 쯤에 통합된 복제수 평가(iVCN)에 의해 검출된 것과 유사한 수준으로 감소하였다. 두 분석법에서, 평가된 복제수는 형질도입 후 96시간 이상에서 수득된 샘플 에서 유사하였다.
결과는 PFGE를 거친 벡터 복제수 평가(iVCN)는 형질도입 후 시점들에서 전이 유전자 통합의 일정한 타이밍을 보여줌을 확인해준다. 이 관찰들은 또한 PFGE를 수반하지 않는 표준 VCN 방법에 의한 평가는 유전체로 통합이 발생하기 전에 시점들에 세포 내 전이 유전자 서열을 검출할 수 있을 보여주고, 따라서 표준 VCN 방법은 형질도입 후 4일 미만의 샘플에서 벡터 복제수를 평가하는 데 전적으로 적절하지 않을 수 있음을 입증하였다.
실시예 3: 여러 비팽창 제조 공정 도중 펄스 필드 겔 전기영동(PFGE)을 이용한 통합된 전이 유전자 복제수의 평가
유전자 조작된 T 세포 조성물을 생산하기 위한 예시적인 공정들 도중 여러 시점에 일반적으로 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같은 iVCN 및 VCN 방법을 사용하여 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 전이 유전자의 복제수를 평가하였다. 예시적인 공정들은 형질도입 후 팽창 단계를 포함하지 않았으며, 자극 시약, 배양 배지 및 수확 시간이 달랐다.
각 공정마다, 별도의 CD4+ 및 CD8+ 1차 인간 T 세포 조성물을 인간 백혈구 성분채집술로부터 단리된 PBMC로부터 두 명의 상이한 인간 대상체(도너 A 및 도너 B)로부터 선택하였다. 선택한 세포를 냉동 보존하였고, 이어서 해동하고 생존 가능한 CD4+ T 세포 대 생존 가능한 CD8+ T 세포 1:1의 비율로 혼합하였다. 혼합된 세포 조성물을 다음과 같은 자극 시약으로 인큐베이션하여 자극하였다: (1) 항-CD3/항-CD28 항체 접합 상자성 비드(“비드”), (2) 106 세포당 4.0μg의 농도로, 항-CD3/항-CD28 Fab 접합 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약, 또는 (3) 106 세포당 0.8μg의 농도로, 항-CD3/항-CD28 Fab 접합 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약. 인큐베이션은 대략 18 내지 30시간 동안 재조합 사이토카인이 있는 무혈청 배지에서 수행하였다.
그런 후 세포를 세척하고 CAR을 암호화하는 전이 유전자 서열을 함유한 렌티바이러스 제제로 회전 접종에 의해 형질도입하였다. 그런 후 세포를 혈청, 성장 인자 또는 재조합 사이토카인이 없는 기본 배지(“기존”)로 또는 재조합 IL-2, IL-5, 및 IL-15 사이토카인을 함유한 무혈청 배지(“완전”)로 인큐베이션하였다. 비드 시약으로 인큐베이션 개시 후 96시간 후에, 세포를 자기장에 노출시켜 상자성 비드를 제거하였다. 올리고머 자극 시약으로 인큐베이션 개시 후 24시간, 48시간 또는 96시간 후에, 세포를 10분 동안 비오틴에 노출시켜 올리고머 스트렙타비딘 시약을 해리 및 제거하였다. 세포를 세척하고 동결보호제로 제형화하였다.
세포를 해동하고 수확된 세포로부터 유전체 DNA를 제조하였다. 전이 유전자 복제수의 평가를 위해, 상기 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이, 15kb 초과의 고분자량 분획에 대해 PFGE를 거친 DNA에 전이 유전자 서열에 특이적인 프라이머를 사용하는 ddPCR을 수행하였다. 세포 샘플은 또한 CAR, CD3 및 활성화된 캐스페이스 3 (aCas3)의 발현을 위해 염색하여, 유세포 분석에 의해 평가하였다.
결과는 도 3a-3b에 도시되어 있다. 도 3a에 도시된 바와 같이, 올리고머 시약을 사용하여 자극된 세포의 경우, iVCN에 의해 측정된 통합된 전이 유전자 복제수는 자극 개시 후에 24시간 또는 48시간 동안 인큐베이션이 수행된 샘플에서는 증가하였지만, 더 증가하지는 않았다. 표준 VCN(PFGE 거치지 않음)에 의해 측정된 전이 유전자 복제수는 자극 개시 후에 약 96시간까지 iVCN에 의해 측정된 통합된 전이 유전자 복제수보다 실질적으로 더 높게 유지되었다. 이 결과는 표준 VCN 방법(PFGE 거치지 않음)이 이 공정에서 96시간 시점까지는 정확하지 않았다는 관찰과 일치한다. 비드 시약을 사용하여 자극한 세포의 경우, 96시간에, 완전한 배지로 인큐베이션된 세포와 비교하여 기본 배지로 인큐베이션된 세포에 대해 더 높은 통합된 복제수가 관찰되었다. 도 3b에 도시된 바와 같이, 통합된 전이 유전자 복제수는 CAR-발현 세포의 백분율과 상관관계가 있었다(유세포 분석으로 CD3+ 세포들 중 CD3+/활성화된 Cas3-/CAR+ 세포들의 백분율을 결정). 이 결과는 특히 세포 조작을 위한 공정에서 인큐베이션 시간, 배지 또는 시약을 포함하여 상이한 매개변수의 영향을 평가할 때 통합된 복제수를 평가하기 위한 iVCN 분석법의 유용성을 더 뒷받침한다.
실시예 4: 여러 세포 제조 공정 동안 펄스 필드 겔 전기영동(PFGE)을 거치고 또는 거치지 않고 액적 디지털 PCR(ddPCR)에 의해 평가된 통합된 및 통합되지 않은 전이 유전자 복제수의 비교
유전자 조작된 T 세포 조성물을 생산하기 위한 예시적인 여러 공정 도중 수득된 DNA 샘플에, 펄스 필드 겔 전기영동(PFGE)을 거치고 또는 거치지 않고, ddPCR을 수행하여 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 통합된 및 통합되지 않은 전이 유전자의 수를 평가하였다.
A. T 세포 조작을 위한 예시적인 공정
예시적인 공정에는 조작된 세포가 팽창을 거친 공정(팽창 공정) 및 세포가 팽창되지 않은 공정(비팽창 공정)이 포함되었다.
1) 팽창 공정 - 항-CD3/항-CD28 비드
실시예 2.B에 기술된 바와 같은 팽창 공정이 일반적으로 수행되었다.
2) 비팽창 공정 - 항-CD3/항-CD28 비드
실시예 3에 기술된 바와 유사하게 항-CD3/항-CD28 항체 접합 비드를 사용하여 비팽창 공정을 수행하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포를 선택하여 1:1 비율로 혼합하여 대략 600 x 106개의 T 세포(300 x 106개 CD4+ 및 300 x 106개 CD8+ T 세포)를 함유한 투입 조성물을 생산하였다. 혼합한 투입 세포 조성물을 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유한 무혈청 배지에서 비드 대 세포 1:1의 비율로 항-CD3/항-CD28 항체 접합 비드의 존재 하에 18 내지 30시간 동안 자극하였다. 자극 이후에, 세포를 세척하고 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유한 무혈청 배지에서 재현탁하였다. 이후에 세포를 30분 동안 대략 693g에서 회전 접종에 의해 팽창 공정에서 사용되는 동일한 항-BCMA CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입하였다.
한 갈래(arm)에서, 회전 접종 후, 세포를 무혈청 및 성장 인자 또는 재조합 사이토카인 무첨가 기본 배지(기본 배지)에서 재현탁하고 항-CD3/항-CD28 비드로 자극 개시 후 약 96시간 동안 인큐베이터에서 약 37.0ºC로 인큐베이션하였다. 다른 갈래(arm)에서, 회전 접종 후, 세포를 성장 인자 또는 재조합 사이토카인 무첨가 기본 배지(기본 배지)에서 재현탁하는 것을 제외하고 비슷한 공정을 수행하고 항-CD3/항-CD28 비드로 자극 개시 후 약 72시간 동안 인큐베이터에서 약 37.0ºC로 인큐베이션하였다.
3) 비팽창 공정 - 항-CD3/항-CD28 Fab 올리고머 시약
실시예 3에 기술된 바와 유사하게 항-CD3/항-CD28 Fab 올리고머 시약을 사용하여 비팽창 공정을 수행하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포를 선택하여 1:1 비율로 혼합하여 대략 600 x 106개의 T 세포(300 x 106개 CD4+ 및 300 x 106개 CD8+ T 세포)를 함유한 투입 조성물을 생산하였다. 혼합된 투입 세포 조성물의 세포를, 18 내지 30시간 동안 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유한 무혈청 배지에서 수행되어, 실시예 2에 기술된 바와 같이 생성된 480μg (또는 1x106 세포당 0.8 μg) 항-CD3/항-CD28 Fab 접합 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약으로 인큐베이션하여 자극하였다. 자극 이후에, 세포를 30분 동안 693g에서 회전 접종에 의해 팽창 공정에서 사용되는 동일한 항-BCMA CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입하였다.
공정의 한 갈래에서, 회전 접종 후에, 세포를 세척하고 혈청, 첨가된 성장 인자 또는 재조합 사이토카인이 없는 기본 배지(기본 배지)에서 재현탁하고, 인큐베이터에서 37.0ºC로 인큐베이션하였다. 형질도입 개시 후 약 24시간(자극 개시 후 약 48시간)에, 인큐베이션 도중에 1.0mM D-비오틴을 첨가하고 세포와 함께 혼합하여 올리고머 스트렙타비딘 시약으로부터 항-CD3 및 항-CD28 Fab 시약을 해리시켰다. 세포를 약 48시간(자극 개시 후 96시간) 동안 더 인큐베이션한 후, 세척하고 동결보호제로 제형화하였다.
공정의 다른 갈래에서, 회전 접종 후에, 세포를 세척하고 혈청, 첨가된 성장 인자 또는 재조합 사이토카인이 없는 기본 배지(기본 배지)에서 재현탁하고, 인큐베이터에서 37.0ºC로 인큐베이션하였다. 형질도입 개시 후 약 24시간에, 인큐베이션 도중에 1.0mM D-비오틴을 첨가하고 세포와 함께 혼합하여 올리고머 스트렙타비딘 시약으로부터 항-CD3 및 항-CD28 Fab 시약을 해리시켰다. 세포를 추가로 24시간(자극 개시 후 72시간) 동안 더 인큐베이션한 후, 세척하고 동결보호제로 제형화하였다.
4) 공정 요약
표 E1은 모의 빈 벡터를 사용하여 공정에 더하여 상기 기술된 바와 같은 공정의 특징을 요약한다.
Figure pct00002
B. 전이 유전자 복제수의 평가
세포를 해동하고 수확된 세포로부터 유전체 DNA를 제조하였다. 통합된 전이 유전자 복제수의 평가를 위해, 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이, 일반적으로 10kb 초과의 고분자량 분획에 대해 PFGE를 거친 DNA(“iVCN”)에 전이 유전자 서열에 특이적인 프라이머를 사용하는 ddPCR을 수행하였다. 비교를 위해, PFGE를 거치지 않은 DNA(“VCN”, 고분자량 및 저분자량 DNA 모두)에 전이 유전자 서열에 특이적인 프라이머를 사용하는 ddPCR을 또한 수행하였다. 세포 샘플을 또한 유세포 분석에 의해 평가하였다.
결과는 도 4a-4e에 도시되어 있다. 도 4a에 도시된 바와 같이, 더 짧은 비팽창 공정들의 각각이 iVCN(PFGE를 거침)에 의해 결정된 복제수보다 더 높은 VCN(PFGE 거치지 않음)에 의해 결정된 복제수를 나타낸 세포를 생산하였으며, 이는 통합되지 않은 전이 유전자 서열이 이 더 짧은 공정들에 의해 조작된 샘플에 존재한다는 것을 나타낸다. iVCN을 사용한 복제수를 VCN에 의한 것으로 나누어 결정된 통합된 전이 유전자의 분획은 비팽창 공정들을 사용하여 생산된 세포에서 실질적으로 더 낮았다(도 4b). 이와 유사하게, ‘1 - 통합된 전이 유전자의 분획’으로 결정된 통합되지 않은 전이 유전자의 분획은 비팽창 공정들을 사용하여 생산된 세포에서 실질적으로 더 높았다(도 4c). 도 4d에 도시된 바와 같이, VCN에서 iVCN을 빼서 결정된, 통합되지 않은 전이 유전자 복제수는 더 짧은 공정들을 사용하여 생산된 세포에서 평균 약 0.8 내지 1.3이었다. PFGE를 거치지 않고 표준 VCN을 사용한, CAR+ 세포당 전이 유전자 복제수는 도 4e에 도시되어 있다. 이 결과는 세포를 조작하기 위한 공정에서 통합된 및 통합되지 않은 전이 유전자 복제수를 평가하는 데 iVCN 방법의 유용성을 더 뒷받침한다.
실시예 5: 여러 팽창 세포 제조 공정 도중 통합된 및 통합되지 않은 전이 유전자 복제수의 비교
형질도입 후 세포를 팽창시키는 단계를 포함한 T 세포 유전자 조작을 위한 공정에서 여러 시점에 ddPCR에 의해 펄스 필드 겔 전기영동(PFGE)을 거친 또는 거치지 않은 DNA 내 전이 유전자 복제수를 평가하였다.
상이한 인간 도너들로부터 온 1차 T 세포를 실시예 2.B에 기술된 바와 같이 CAR을 발현하도록 조작하였다. 팽창 공정의 0일차부터 시작하여 8일차까지, 물질 해동(TMAT; 0일차)시에, 활성화(AMAT; 1일차)시에, 형질도입(XMAT; 2일차)시에 또는 세포 팽창을 위해 배양 개시 후 여러 시기(inoc+1 내지 inoc+6; 공정의 3 내지 8일차를 나타냄)를 포함하여, 매일 샘플을 수득하였다. 세포 샘플로부터 유전체 DNA를 제조하였다. 통합된 전이 유전자 복제수의 평가를 위해, 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 고분자량 분획에 대해 PFGE를 거친 DNA(“iVCN”)에 전이 유전자 서열에 특이적인 프라이머를 사용하는 ddPCR을 수행하였다. 비교를 위해, PFGE를 거치지 않은 DNA(“VCN”, 고분자량 및 저분자량 DNA 모두)에 전이 유전자 서열에 특이적인 프라이머를 사용하는 ddPCR을 또한 수행하였다. 일반적으로 상기 실시예 4에 기술된 바와 같이 통합되지 않은 전이 유전자 복제수, 통합된 전이 유전자의 분획 및 통합되지 않은 전이 유전자의 분획을 또한 결정하였다.
대표적인 결과는 도 5에 도시되어 있다. 도시된 바와 같이, 형질도입 1일차에 또는 형질도입 후 초기 시점에(예를 들어, inoc+1, inoc+2), PFGE를 거치지 않은 유전체 DNA 샘플로부터 결정된 표준 VCN 방법에 의해 결정된 바와 같이 복제수는 통합되지 않은 전이 유전자의 실질적인 분획을 포함하였다. 형질도입 후 이후 시점에, iVCN(PFGE를 거침)과 표준 VCN(PFGE 거치지 않음)에 의해 결정된 바와 같이 복제수는 거의 동일하였으며, 이는 이 시점에 전이 유전자의 통합되지 않은 카피가 더이상 세포에 존재하지 않음을 나타낸다.
실시예 6: 섬유아세포 내 전이 유전자 통합의 평가
펄스 필드 겔 전기영동(PFGE)을 거친 유전체 DNA에 대해 ddPCR에 의한 전이 유전자 복제수 분석에 의해 렌티바이러스 형질도입을 통해 섬유아세포 세포주에 도입된 전이 유전자의 통합을 평가하였다.
HT1080 인간 섬유육종 세포주(ATCC® CCL-121™)를 재조합 단백질을, 이 경우에는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 전이 유전자 서열을 함유한 렌티바이러스 제제로 형질도입하였다. 형질도입 후에 세포를 배양하였고, 형질도입 후 12, 24, 48 또는 72시간에 수확하였다. 수확한 세포로부터 유전체 DNA를 제조하였다. 일반적으로 상기 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이, PFGE 후 고분자량 DNA 샘플(“iVCN”)에서 그리고 PFGE를 거치지 않은 DNA 샘플(“VCN”, 고분자량 및 저분자량 DNA 모두)에서 전이 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하는 ddPCR에 의해 전이 유전자 복제수를 결정하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, HT1080 섬유아세포 세포주로의 전이 유전자 통합이 형질도입 후 24시간에 완성되었다. 섬유아세포 세포주에서 완전한 통합 타이밍은 상기 실시예들에서 보여준 바와 같이, 주르카트 세포와 1차 인간 T 세포를 포함하여 T 세포에서 관찰된 것보다 더 빨랐다. 이 결과는 특정 세포 유형이 세포의 유전체로 더 빠른 렌티바이러스 통합을 거친다는 것을 보여준다.
실시예 7: 투여된 조작된 T 세포의 전이 유전자 서열의 양 및 약동학적 매개변수를 결정하기 위해 재조합 수용체-발현 T 세포의 평가
ddPCR과 PFGE를 이용하는 예시적인 방법을 사용하여 조작된 T 세포가 투여된 대상체에서 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열의 양을 평가한다.
증식성 질병 또는 장애, 예를 들어 암과 같은 질병 또는 장애를 가진 대상체들에 암세포와 같은 질병 또는 장애와 관련된 세포에 의해 발현되는 특정 항원을 표적화할 수 있는, 재조합 수용체와 같은 재조합 단백질을 발현하는 T 세포와 같은 조작된 세포를 투여한다. 일부 실시예에서, 재조합 수용체는 암세포에 의해 발현되는 또는 그와 관련된 항원과 같은 암 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 측면에서, 상기 실시예 1 내지 6에 기술된 바와 같이 예컨대 팽창 또는 비팽창 공정을 사용하여, 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자 서열을 단리된 1차 인간 T 세포, 예컨대 단리된 1차 CD4+ 및/또는 CD8+ 인간 T 세포에 도입하여, T 세포 치료 조성물을 생성한다. 대상체들에 조작된 세포를 포함하는 T 세포 치료 조성물을 투여한다.
세포 조성물의 투여 후 여러 시점에, 조작된 세포가 투여된 대상체의 생물학적 샘플에 존재하는 전이 유전자 서열의 양을 통합된 전이 유전자 복제수를 평가하기 위해 본원에 기술된 방법을 사용하여 결정한다. 일부 측면에서, T 세포 치료 조성물의 투여 이전, 도중 및/또는 이후에 대상체의 혈액 또는 혈청 또는 기관 또는 조직 샘플(예를 들어, 질병 부위, 예를 들어 종양 샘플)에 있는 세포를 수득한다. 샘플로부터 유전체 DNA를 제조한다. 일부 측면에서, 일반적으로 상기 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이, PFGE 후에 고분자량 DNA 샘플(“iVCN”)로부터 전이 유전자의 일부를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하는 ddPCR에 의해 생물학적 샘플에 존재하는 전이 유전자 서열의 양을 결정한다. 일부 측면에서, PFGE를 거치지 않은 DNA 샘플(“VCN”, 고분자량 및 저분자량 DNA 모두)로부터 동일한 프라이머를 사용하는 ddPCR에 의해 복제수를 또한 평가한다. 일부 측면에서, 일부 경우에 세포 샘플은 또한 재조합 단백질(예를 들어, CAR)을 발현하는 샘플 내 세포의 집단을 결정하기 위해 재조합 단백질(예를 들어, CAR)의 발현을 위해 염색하여, 유세포 분석에 의해 평가할 수 있다.
일부 실시예에서, 생물학적 샘플 내 전이 유전자 서열의 양은 DNA의 양당, 예컨대 DNA의 마이크로그램당, 또는 샘플의 부피당, 예컨대 샘플의(예를 들어, 혈액 또는 혈청의) 마이크로리터당, 또는 총 세포수당, 예컨대 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 백혈구 또는 T 세포당, 임의적으로 부피당, 예를 들어 샘플의 마이크로리터당, 또는 세포당, 예컨대 2배체 T 세포 유전체당 또는 CAR-발현 세포당 임의적으로 부피당, 예를 들어 샘플의 마이크로리터당 재조합 단백질(예를 들어, CAR)을 암호화하는 통합된 전이 유전자 카피로 정량화된다. 방법에 기초하여 또는 유세포 분석과 같은 다른 방법에 의해 결정될 수 있는 예시적인 약동학적(PK) 매개변수에는, 재조합 단백질을 발현하는 전이 유전자 서열 또는 특정 세포의 최대(피크) 혈장 농도(Cmax), 예컨대 CD3+ CAR+ 세포, CD4+ CAR+ 세포 및/또는 CD8+ CAR+ T 세포의 Cmax; Cmax가 달성되는 시점(Tmax), 예컨대 전이 유전자 서열, CD3+ CAR+ 세포, CD4+ CAR+ 세포 및/또는 CD8+ CAR+ T 세포의 Tmax, 및/또는 투여 후 특정 시간에 대한 곡선 하 면적(AUC), 예컨대 전이 유전자 서열, CD3+ CAR+ 세포, CD4+ CAR+ 세포 및/또는 CD8+ CAR+ T 세포의 AUC0-28가 포함된다.
실시예 8: 세포 제조 공정 동안 재조합 수용체의 표면 발현에 대한 표준 VCN 분석법과 iVCN 분석법의 상관관계
상기 기술된 벡터 복제수(VCN)와 iVCN 분석법이 렌티바이러스 형질도입에 의해 T 세포에 도입된, 재조합 수용체(예를 들어, 키메라 항원 수용체, CAR)를 암호화하는 전이 유전자의 복제수를 결정하는 데 사용되었으며, 결과는 CAR의 표면 발현과 상관관계가 있었다. 이 연구에서, 상기 분석법들을 일반적으로 실시예 2.B에 기술된 바와 같은 팽창 공정, 또는 일반적으로 실시예 4.A.3에 기술된 바와 같은 비팽창 공정을 사용하여, 여기서 세포를 항-CD3/항-CD28 Fab 접합 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약으로 활성화한 후 이어서 형질도입과 수확 전 재조합 사이토카인이 첨가되지 않은 기본 배지(무사이토카인 배지)에서 짧은 인큐베이션을 거치는 변형을 적용하여, CAR을 발현하도록 조작된 상이한 인간 도너들로부터 온 1차 T 세포로부터 생산된 세포 조성물에 수행하였다.
단축된 비팽창 공정 또는 팽창 공정에서 조작 공정의 끝에 세포 샘플로부터 유전체 DNA가 제조되었다. VCN 및 iVCN 분석법을 실시예 1에 기술된 바와 같이 15kb 초과의 분리를 위한 임계값(“iVCN”) 및 PippinHT(Sage Science, Beverly, MA) 기기, 또는 유전체 DNA가 처음에 PFGE에 의해 분리되지 않은(“VCN”) 표준 VCN 방법을 사용하여 수행하였다.
결과는 VCN 분석법을 사용하여 평가된 전이 유전자 복제수는 iVCN에 의해 평가된 전이 유전자 복제수와 일반적으로 상관관계가 있다는 것을 보여주었다(도 7a). 하지만, 비팽창 공정을 사용해 제조된 세포의 경우, VCN에 의해 수득된 값이, 비팽창 공정을 사용하여 생성된 세포를 함유한 샘플에 존재할 수 있는 통합되지 않은 전이 유전자 서열을 검출하는 VCN 분석법과 일치하는, iVCN에 의해 수득된 값보다 더 높았다. 이와는 대조적으로, 팽창 공정을 사용하여 제조된 세포의 경우, VCN과 iVCN에 의해 수득된 값이 거의 동일하였다(VCN = iVCN 선 근처). 이 차이들은 팽창 공정과 비교하여 더 짧은 비팽창 공정에서 샘플 내 더 많은 양의 유리된 통합되지 않은 전이 유전자 서열 카피의 존재 때문일 가능성이 있다. 이 결과들은 고분자량 및 저분자량 DNA 모두를 검출할 수 있는 표준 VCN 분석법이, 특히 유리된 통합되지 않은 전이 유전자 서열 카피가 여전히 샘플 내에 존재할 수 있는, 전이 유전자 도입 후 초기에 세포를 평가하는 데 사용할 때, iVCN 분석법과 비교하여 한계가 있다는 관찰과 일치한다.
CAR의 표면 발현에 대한 iVCN 또는 VCN 분석법의 상관관계 정도를 평가하기 위해, 비팽창 또는 팽창 공정으로부터 온 세포 샘플을 CD3, CD45 및 CAR의 발현에 대해 유세포 분석에 의해 평가하여 생존 가능한 CD45+ 세포 중에 CD3+CAR+ 세포의 백분율을 결정하였다. 도 7b에 도시된 바와 같이, VCN 분석법은 비팽창 공정에 의한 것보다 팽창 공정에 의해 조작된 샘플에 대한 CAR+ 세포의 백분율에 더 나은 상관관계를 보였으며, 이는 표면 CAR 발현에 기여하지 않은 통합되지 않은 CAR DNA 서열의 존재 때문일 가능성이 있다. 도 7c에 도시된 바와 같이, iVCN은 비팽창 또는 팽창 공정에 의해 조작된 세포들 중에서 CAR의 발현에 대해 비슷한 상관관계를 보였다. 모든 샘플에 대해, CAR 발현과 세포당 복제수의 상관관계는 VCN 분석법(R2 = 0.5903)에 의해 결정된 바와 같은 세포당 복제수와 비교하여 iVCN 분석법(R2 = 0.8952)에 의한 것이 더 높았다.
결과들은 특히 유리된 통합되지 않은 전이 유전자 서열 카피를 유지할 수 있는 비팽창 공정을 사용하여 생성된 세포에 대해, 안정적으로 통합된 전이 유전자 서열의 복제수를 정확하게 결정하는 데 iVCN 분석법의 유용성을 뒷받침한다. 통합된 전이 유전자 서열 대 통합되지 않은 전이 유전자 서열을 구분하지 않는 VCN 분석법은 특히 더 짧은 비팽창 공정 도중 및 이후에 안정적으로 통합된 전이 유전자 서열의 수를 정확하게 결정하는 데 한계가 있다.
본 발명은 본 발명의 다양한 측면을 설명하기 위해, 예를 들어 제공되는 특정 개시된 구현예로 범위를 제한하려는 것이 아니다. 기술된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 본 명세서의 기재 및 가르침에서 명백해질 것이다. 상기 변형은 본 개시의 진정한 범위와 정신에서 벗어나지 않고 실시될 수 있으며, 본 개시의 범위에 속하도록 의도된다.
하기 표 1에 서열을 첨부한다.
서열
# 서열 주석
1 ESKYGPPCPPCP 스페이서 (IgG4힌지) (aa)
호모 사피엔스
2 GAATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCT 스페이서 (IgG4힌지) (nt)호모 사피엔스
3 ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 힌지-CH3 스페이서 호모 사피엔스
4 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 힌지-CH2-CH3 스페이서 호모 사피엔스
5 RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH IgD-힌지-Fc 호모 사피엔스
6 LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR T2A 인공적인
7 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM tEGFR 인공적인
8 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV CD28 (수탁 번호 P10747의 아미노산 153-179) 호모 사피엔스
9 IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV CD28 (수탁 번호 P10747의 아미노산 114-179) 호모 사피엔스
10 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS CD28 (수탁 번호 P10747의 아미노산 180-220) 호모 사피엔스
11 RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS CD28 (LL이 GG로) 호모 사피엔스
12 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL 4-1BB (수탁 번호 Q07011.1의 아미노산 214-255) 호모 사피엔스
13 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CD3 제타 호모 사피엔스
14 RVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CD3 제타 호모 사피엔스
15 RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CD3 제타 호모 사피엔스
16 RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM tEGFR 인공적인
17 EGRGSLLTCGDVEENPGP T2A 인공적인
18 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A
19 ATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A
20 QCTNYALLKLAGDVESNPGP E2A
21 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP F2A
22 -PGGG-(SGGGG)5-P- 여기에서 P는 프롤린, G는 글리신 및 S는 세린 링커
23 GSADDAKKDAAKKDGKS 링커
24 atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatccca GMCSFR 알파 사슬 신호 서열
25 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP GMCSFR 알파 사슬 신호 서열
26 MALPVTALLLPLALLLHA CD8 알파 신호 펩타이드
27 EVQLVQSGAEMKKPGASLKLSCKASGYTFIDYYVYWMRQAPGQGLESMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAMYYCARSQRDGYMDYWGQGTLVTVSS 가변 중쇄(VH) 항-BCMA
28 QSALTQPASVSASPGQSIAISCTGTSSDVGWYQQHPGKAPKLMIYEDSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSNTRSSTLVFGGGTKLTVLG 가변 경쇄(VL) 항-BCMA
29 GSTSGSGKPGSGEGSTKG 링커
30 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSS 가변 중쇄(VH) 항-BCMA
31 DIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIK 가변 경쇄(VL) 항-BCMA
32 QIQLVQSGPDLKKPGETVKLSCKASGYTFTNFGMNWVKQAPGKGFKWMAWINTYTGESYFADDFKGRFAFSVETSATTAYLQINNLKTEDTATYFCARGEIYYGYDGGFAYWGQGTLVTVSA 가변 중쇄(VH) 항-BCMA
33 DVVMTQSHRFMSTSVGDRVSITCRASQDVNTAVSWYQQKPGQSPKLLIFSASYRYTGVPDRFTGSGSGADFTLTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKLDIK 가변 경쇄(VL) 항-BCMA
34 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGHVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARYSGSFDNWGQGTLVTVSS 가변 중쇄(VH) 항-BCMA
35 SYELTQPPSASGTPGQRVTMSCSGTSSNIGSHSVNWYQQLPGTAPKLLIYTNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDGSLNGLVFGGGTKLTVLG 가변 경쇄(VL) 항-BCMA
36 GGGGS 링커
37 GGGS 링커
38 GGGGSGGGGSGGGGS 링커
39 GSTSGSGKPGSGEGSTKG 링커
40 SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA 링커
41 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIANYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYSKSIVSYMDYWGQGTLVTVSS 가변 중쇄(VH) 항-BCMA
42 LPVLTQPPSTSGTPGQRVTVSCSGSSSNIGSNVVFWYQQLPGTAPKLVIYRNNQRPSGVPDRFSVSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGYVFGTGTKVTVLG 가변 경쇄(VL) 항-BCMA
43 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYGSYRWEDSWGQGTLVTVSS 가변 중쇄(VH) 항-BCMA
44 QAVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVFWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSASYVFGTGTKVTVLG 가변 경쇄(VL) 항-BCMA
45 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQRLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQDRITVTRDTSSNTGYMELTRLRSDDTAVYYCARSPYSGVLDKWGQGTLVTVSS 가변 중쇄(VH) 항-BCMA
46 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGFDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGYVFGTGTKVTVLG 가변 경쇄(VL) 항-BCMA
47 RASQDISKYLN CDR L1
48 SRLHSGV CDR L2
49 GNTLPYTFG CDR L3
50 DYGVS CDR H1
51 VIWGSETTYYNSALKS CDR H2
52 YAMDYWG CDR H3
53 EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS VH
54 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT VL
55 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS scFv
56 KASQNVGTNVA CDR L1
57 SATYRNS CDR L2
58 QQYNRYPYT CDR L3
59 SYWMN CDR H1
60 QIYPGDGDTNYNGKFKG CDR H2
61 KTISSVVDFYFDY CDR H3
62 EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSS VH
63 DIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR VL
64 GGGGSGGGGSGGGGS 링커
65 EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR scFv
66 HYYYGGSYAMDY HC-CDR3
67 HTSRLHS LC-CDR2
68 QQGNTLPYT LC-CDR3
69 gacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgccacctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaagctggaaatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaagcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgcccgactacggcgtgagctggatccggcagccccccaggaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagc scFv를 암호화하는 서열
70 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 인간 IgG4 Fc (Uniprot P01861)
71 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 인간 IgG2 Fc (Uniprot P01859)
SEQUENCE LISTING <110> Juno Therapeutics, Inc. BRIGGS, Adrian Wrangham <120> METHODS FOR ASSESSING INTEGRATED NUCLEIC ACIDS <130> 735042016840 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> 62/716,972 <151> 2018-08-09 <160> 71 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> spacer (IgG4hinge) (aa) <400> 1 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> spacer (IgG4hinge) (nt) <400> 2 gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Hinge-CH3 spacer <400> 3 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg 1 5 10 15 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 20 25 30 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 35 40 45 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 50 55 60 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 65 70 75 80 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 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Ser Ile Val Ser Tyr Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light (VL) Anti-BCMA <400> 42 Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Val Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Val Val Phe Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Val 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Val Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 43 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy (VH) Anti-BCMA <400> 43 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Ser Tyr Arg Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 44 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light (VL) Anti-BCMA <400> 44 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Phe Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Ser Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 45 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy (VH) Anti-BCMA <400> 45 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Ile Thr Val Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Gly Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Tyr Ser Gly Val Leu Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 46 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light (VL) Anti-BCMA <400> 46 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Phe Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 47 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L1 <400> 47 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L2 <400> 48 Ser Arg Leu His Ser Gly Val 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L3 <400> 49 Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly 1 5 <210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H1 <400> 50 Asp Tyr Gly Val Ser 1 5 <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H2 <400> 51 Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H3 <400> 52 Tyr Ala 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Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr 100 105 <210> 55 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv <400> 55 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly 100 105 110 Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys 115 120 125 Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser 130 135 140 Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser 145 150 155 160 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile 165 170 175 Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn 195 200 205 Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr 210 215 220 Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L1 <400> 56 Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L2 <400> 57 Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L3 <400> 58 Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 59 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H1 <400> 59 Ser Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 60 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H2 <400> 60 Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 61 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H3 <400> 61 Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 62 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 62 Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 63 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 63 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 64 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 65 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv <400> 65 Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys 145 150 155 160 Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn 180 185 190 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 195 200 205 Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe 210 215 220 Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Glu Ile Lys Arg 245 <210> 66 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC-CDR3 <400> 66 His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 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cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600 agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660 gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720 gtgaccgtga gcagc 735 <210> 70 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> IgG4 Fc <300> <308> Uniprot P01861 <309> 1986-07-21 <400> 70 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 71 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> IgG2 Fc <300> <308> Uniprot P01859 <309> 1986-07-21 <400> 71 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325

Claims (90)

  1. 전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은:
    (a) 하나 이상의 세포로부터 단리된 디옥시리보핵산(DNA)으로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 DNA의 고분자량 분획을 분리하는 단계 - 상기 하나 이상의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함한 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및
    (b) 상기 고분자량 분획으로부터, 상기 하나 이상의 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a)에서 분리하는 단계 전에, 상기 하나 이상의 세포로부터 디옥시리보핵산(DNA)을 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (b)에서 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 상기 하나 이상의 세포 내에서 2배체 유전체당 또는 세포당 상기 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 세포의 집단을 포함하고, 여기서 상기 집단의 복수의 세포는 상기 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는, 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 복제수는 상기 세포의 집단 중에서 2배체 유전체당 또는 세포당 평균 복제수인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a)에서 분리하는 단계 전에, 상기 재조합 단백질을 암호화하는 상기 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 상기 하나 이상의 세포 중 적어도 하나의 조작된 세포에 도입된 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 적어도 하나의 조작된 세포는 상기 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 도입 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 임의적으로 (약) 37°C ± 2°C에서, 96시간을 초과하여 인큐베이션되지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 적어도 하나의 조작된 세포는 상기 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 도입 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 임의적으로 (약) 37°C ± 2°C에서, 72시간을 초과하여 인큐베이션되지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 적어도 하나의 조작된 세포는 상기 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 도입 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 임의적으로 (약) 37°C ± 2°C에서, 48시간을 초과하여 인큐베이션되지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 (a)에서 DNA의 고분자량 분획의 분리 전에 냉동 보존된 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 세포주인, 방법.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 대상체의 샘플로부터 수득된 1차 세포인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 면역 세포인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 T 세포는 CD3+, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포인, 방법.
  16. 대상체의 생물학적 샘플 내 전이 유전자 서열을 평가하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은:
    (a) 대상체의 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을 분리하는 단계 - 상기 생물학적 샘플은 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함한 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및
    (b) 상기 고분자량 분획으로부터, 상기 생물학적 샘플의 전부 또는 일부 내 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 (b)에서 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 상기 생물학적 샘플의 전체 또는 일부 내 상기 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 분리하는 단계 전에, 상기 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 세포로부터 DNA를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 상기 전이 유전자 서열을 포함하는 적어도 하나의 조작된 세포를 포함하는 조성물이 투여된 대상체로부터 수득되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 조직 샘플 또는 체액 샘플인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 조직 샘플이고 상기 조직은 종양인, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 조직 샘플은 종양 생검(tumor biopsy)인, 방법.
  23. 23. 제20항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 체액 샘플이고 상기 체액 샘플은 혈액 또는 혈청 샘플인, 방법.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a)에서 분리하는 단계 전에, 상기 재조합 단백질을 암호화하는 상기 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 상기 하나 이상의 세포 중 적어도 하나의 조작된 세포에 도입된 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플 내 하나 이상의 세포는 면역 세포를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 T 세포는 CD3+, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포인, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리하는 단계는 펄스 필드 겔 전기영동 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수행되는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리하는 단계는 펄스 필드 겔 전기영동에 의해 수행되는, 방법.
  30. 전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은:
    (a) 세포의 집단으로부터 단리된 DNA로부터 (약) 10 킬로베이스(kb)보다 큰 디옥시리보핵산(DNA)의 고분자량 분획을, 펄스 필드 겔 전기영동에 의해, 분리하는 단계 - 상기 세포의 집단은 복수의 조작된 세포를 포함하고 각각의 세포는 재조합 단백질을 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하거나 포함하는 것으로 의심됨 -; 및
    (b) 상기 고분자량 분획으로부터, 상기 세포의 집단의 복수의 조작된 세포의 유전체에 통합된 전이 유전자 서열의 2배체 유전체당 또는 세포당 평균 복제수를 결정하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 (a)에서 분리하는 단계 전에, 상기 재조합 단백질을 암호화하는 상기 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 상기 세포의 집단의 복수의 조작된 세포 중 적어도 하나에 도입된 것을 특징으로 하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 세포의 집단은 상기 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 조작된 세포에 도입한 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 임의적으로 (약) 37°C ± 2°C에서, 96시간을 초과하여 인큐베이션되지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 세포의 집단은 상기 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 조작된 세포에 도입한 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 임의적으로 (약) 37°C ± 2°C에서, 72시간을 초과하여 인큐베이션되지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 세포의 집단은 상기 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 조작된 세포에 도입한 이후에 25°C를 초과하는 온도에서, 임의적으로 (약) 37°C ± 2°C에서, 48시간을 초과하여 인큐베이션되지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포의 집단은 (a)에서 DNA의 고분자량 분획의 분리 전에 냉동 보존된 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고분자량 분획은 (약) 15 킬로베이스(kb)를 초과하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고분자량 분획은 (약) 17.5 킬로베이스(kb)를 초과하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고분자량 분획은 (약) 20 킬로베이스(kb)를 초과하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는, 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 수행되는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 PCR은 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 디지털 PCR 또는 액적 디지털 PCR인, 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 PCR은 액적 디지털 PCR인, 방법.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PCR은 상기 전이 유전자 서열의 적어도 일부에 상보적이거나 적어도 일부를 특이적으로 증폭할 수 있는 하나 이상의 프라이머를 사용하여 수행되는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 하나 이상의 프라이머는 상기 조절 요소의 서열에 상보적이거나 상기 서열을 특이적으로 증폭할 수 있는, 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 상기 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA의 질량 또는 중량당, 임의적으로 상기 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA의 마이크로그램당 상기 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 하나 이상의 세포로부터 단리된 DNA의 마이크로그램당 상기 전이 유전자 서열의 질량 또는 중량을 마이크로그램 단위로 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
  47. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 상기 하나 이상의 세포당, 임의적으로 CD3+, CD4+ 및/또는 CD8+ 세포당, 및/또는 재조합 단백질을 발현하는 세포당 상기 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
  48. 제16항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 상기 생물학적 샘플 내에서 2배체 유전체당 또는 세포당 상기 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 복제수는 상기 생물학적 샘플 내 하나 이상의 세포 중에서 2배체 유전체당 또는 세포당 평균 복제수인, 방법.
  50. 제16 항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 상기 생물학적 샘플의 체적당, 임의적으로 상기 생물학적 샘플의 마이크로리터당 또는 밀리리터당 상기 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
  51. 제16항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 상기 대상체의 체중 또는 체표면적당 상기 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
  52. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이 유전자 서열의 양을 결정하는 단계는 상기 고분자량 분획 내 상기 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계 및 상기 질량, 중량 또는 복제수를 상기 고분자량 분획 내 기준 유전자의 질량, 중량 또는 복제수로 또는 표준 곡선으로 정규화하는 단계를 포함하는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 기준 유전자는 하우스키핑 유전자인, 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 기준 유전자는 알부민(ALB)을 암호화하는 유전자인, 방법.
  55. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 기준 유전자는 리보뉴클레아제 P 단백질 서브유닛 p30(RPP30)을 암호화하는 유전자인, 방법.
  56. 제52항 내지 제55항에 있어서, 상기 단리된 DNA 내 기준 유전자의 상기 복제수를 결정하는 단계는 상기 기준 유전자의 적어도 일부에 상보적이거나 적어도 일부를 특이적으로 증폭할 수 있는 하나 이상의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수행되는, 방법.
  57. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 완전한 바이러스 gag 단백질을 암호화하지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 완전한 HIV 유전체, 복제 가능 바이러스 유전체, 및/또는 부가적 유전자를 포함하지 않으며, 상기 부가적 유전자는 임의적으로 Nef, Vpu, Vif, Vpr, 및/또는 Vpx인, 방법.
  59. 제6항 내지 15항, 제24항 내지 제29항 및 제31항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드의 도입은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 벡터를 사용한 형질도입에 의해 수행되는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터인, 방법.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
  62. 제59항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV 벡터이고, 임의적으로 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8 벡터 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  63. 제6항 내지 제15항, 제24항 내지 제29항 및 제31항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드의 도입은 물리적 전달 방법에 의해, 임의적으로 전기 천공법에 의해 수행되는, 방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 재조합 수용체인, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 재조합 수용체는 질병 또는 병태와 관련된 항원 또는 질병 또는 병태와 관련된 병변 환경의 세포에서 발현되는 항원에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 질병 또는 병태는 암인, 방법.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 상기 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9; CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG; NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 8족 A 멤버를 함유하는 류신 풍부 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 자연 살생 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1; TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2; 도파크롬 타우토메라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원, 또는 보편적 꼬리표(universal tag) 관련 항원, 및/또는 비오틴화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  68. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 수용체는 T 세포 수용체(TCR) 또는 기능성 비-T 세포 수용체인, 방법.
  69. 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 CAR은 상기 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 인식 도메인 및 ITAM을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, ITAM을 포함하는 상기 세포내 신호 전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의, 임의적으로 인간 CD3-제타 사슬의 세포내 도메인을 포함하는, 방법.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 상기 세포내 신호 전달 도메인은 공자극 신호 전달 영역을 더 포함하는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 공자극 신호 전달 영역은 CD28 또는 4-1BB의, 임의적으로 인간 CD28 또는 인간 4-1BB의 신호 전달 도메인을 포함하는, 방법.
  74. 통합되지 않은 잔류 전이 유전자 서열을 평가하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은:
    (1) 제1항 내지 제15항 및 제28항 내지 제73항 중 어느 한 항의 방법을 수행하여, 상기 DNA의 고분자량 분획 내 상기 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정함으로써 전이 유전자 서열의 유전체 통합을 평가하는 단계;
    (2) 상기 고분자량 분획을 분리하지 않고 단리된 DNA 내 상기 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계; 및
    (3) (1)에서 결정된 양을 (2)에서 결정된 양과 비교함으로써 상기 통합되지 않은 잔류 재조합 서열의 양을 결정하는 단계;
    를 포함하는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 상기 하나 이상의 세포 내에서 2배체 유전체당 또는 세포당 상기 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 세포의 집단을 포함하고, 여기서 상기 집단의 복수의 세포는 상기 재조합 단백질을 암호화하는 상기 전이 유전자 서열을 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는, 방법.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 상기 복제수는 상기 세포의 집단 중에서 2배체 유전체당 또는 세포당 평균 복제수인, 방법.
  78. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양을 비교하는 단계는 (2)에서 결정된 복제수에서 (1)에서 결정된 복제수를 빼는 단계를 포함하는, 방법.
  79. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양을 비교하는 단계는 (1)에서 결정된 복제수 대 (2)에서 결정된 복제수의 비율을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  80. 제74항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (2)에서 전이 유전자 서열의 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 수행되는, 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 PCR은 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 디지털 PCR 또는 액적 디지털 PCR인, 방법.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서, 상기 PCR은 액적 디지털 PCR인, 방법.
  83. 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PCR은 상기 전이 유전자 서열의 적어도 일부에 상보적이거나 적어도 일부를 특이적으로 증폭할 수 있는 하나 이상의 프라이머를 사용하여 수행되는, 방법.
  84. 제74항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (2)에서 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 상기 고분자량 분획을 분리하지 않고 단리된 DNA 내 상기 전이 유전자 서열의 질량, 중량 또는 복제수를 평가하는 단계 및 상기 질량, 중량 또는 복제수를 상기 고분자량 분획을 분리하지 않고 단리된 DNA 내 기준 유전자의 질량, 중량 또는 복제수로 또는 표준 곡선으로 정규화하는 단계를 포함하는, 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 기준 유전자는 하우스키핑 유전자인, 방법.
  86. 제84항 또는 제85항에 있어서, 상기 기준 유전자는 알부민(ALB)을 암호화하는 유전자인, 방법.
  87. 제84항 또는 제85항에 있어서, 상기 기준 유전자는 리보뉴클레아제 P 단백질 서브유닛 p30(RPP30)을 암호화하는 유전자인, 방법.
  88. 제84항 내지 제87항에 있어서, 상기 단리된 DNA 내 기준 유전자의 질량, 중량 또는 복제수를 결정하는 단계는 상기 기준 유전자의 적어도 일부에 상보적이거나 적어도 일부를 특이적으로 증폭할 수 있는 하나 이상의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수행되는, 방법.
  89. 제74항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (1)에서 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계와 상기 (2)에서 존재, 부재 또는 양을 결정하는 단계는 동일한 프라이머 또는 동일한 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 수행되는, 방법.
  90. 제74항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 통합되지 않은 잔류 재조합 서열은 벡터 플라스미드, 선형 상보적 DNA(cDNA), 자가통합체(autointegrant) 또는 긴 말단 반복(LTR) 서클(circles) 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
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