BR112021002245A2 - métodos para avaliar ácidos nucleicos integrados - Google Patents

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Abstract

"MÉTODOS PARA AVALIAR ÁCIDOS NU-CLEICOS INTEGRADOS" A presente invenção refere-se a métodos para avaliar as sequências de ácido nucleico integradas a um genoma de uma célula geneticamente modificada, como uma célula geneticamente modificada usada em terapia celular. As células são geralmente geneticamente modificadas para expressar uma proteína recombinante, como um receptor recombinante, por meio da introdução de um polinucleotídeo e integração de certas sequências no polinucleotídeo, como sequências recombinantes, no genoma da célula. Em alguns aspectos, os métodos fornecidos podem ser usados para distinguir ácidos nucleicos integrados e ácidos nucleicos residuais não integrados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO- DOS PARA AVALIAR ÁCIDOS NUCLEICOS INTEGRADOS". Referência cruzada a pedidos relacionados
[001] Este pedido reivindica prioridade do pedido provisório Nor- te-americano nº 62/716.972, depositado em 9 de agosto de 2018, inti- tulado "MÉTODOS PARA AVALIAR ÁCIDOS NUCLEICOS INTEGRA- DOS", cujo teor é incorporado por referência na sua íntegra. Incorporação por referência de listagem de sequências
[002] O presente pedido está sendo depositado junto com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de Se- quências é fornecida como um arquivo intitulado 735042016840SeqList.txt, criado em 3 de agosto de 2019, com 53,2 kilobytes de tamanho. As informações no formato eletrônico da Lista- gem de Sequência são incorporadas por referência em sua íntegra. Campo
[003] O presente pedido refere-se em alguns aspectos a métodos para analisar sequências de ácido nucleico integradas em um genoma de uma célula geneticamente modificada, como uma célula genetica- mente modificada usada em terapia celular. As células são geralmente geneticamente modificadas para expressar uma proteína recombinan- te, como um receptor recombinante, por meio da introdução de um po- linucleotídeo e integração de certas sequências no polinucleotídeo, tal como uma sequência transgene que codifica a proteína recombinante, no genoma da célula. Em alguns aspectos, os métodos fornecidos po- dem ser usados para distinguir ácidos nucleicos integrados e ácidos nucleicos residuais não integrados. Antecedentes
[004] Métodos estão disponíveis para determinar o número de cópias de ácidos nucleicos introduzidos para geneticamente modificar uma célula, como para terapia celular adotiva para o tratamento de doenças e condições. Para terapias celulares adotivas (incluindo aque- las envolvendo a administração de células que expressam receptores recombinantes específicos para uma doença ou distúrbio de interesse, tais como receptores de antígenos quiméricos (CARs) e/ou outros re- ceptores de antígenos recombinantes) podem requerer avaliação opor- tuna e precisa de ácidos nucleicos integrados e, em alguns casos, áci- dos nucleicos residuais não integrados, antes da administração de cé- lulas a um indivíduo. Métodos aprimorados são necessários. São for- necidos métodos e kits que atendem a essas necessidades. Sumário
[005] São fornecidos aqui métodos para avaliar a integração ge- nômica de uma sequência de transgene. Em algumas das modalida- des, os métodos envolvem: (a) separar uma fração de alto peso mole- cular de ácido desoxirribonucleico (DNA) maior ou maior do que cerca de 10 quilobases (kb) do DNA isolado de uma ou mais células, as refe- ridas uma ou mais células que compreendem, ou são suspeitas de compreender, pelo menos uma célula modificada compreendendo uma sequência de transgene que inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante; e (b) da fração de alto peso molecular, determinar a presença, ausência ou quantidade de sequên- cias de transgene integrada no genoma de uma ou mais células.
[006] É fornecido aqui um método para avaliar a integração ge- nômica de uma sequência de transgene, o método compreendendo: (a) separar uma fração de alto peso molecular de ácido desoxirribonu- cleico (DNA) maior ou superior a cerca de 10 quilobases (kb) do DNA isolado de uma ou mais células, as referidas uma ou mais células compreendendo, ou suspeitas de compreender, pelo menos uma célu- la modificada compreendendo uma sequência de transgene que codi- fica uma proteína recombinante; e (b) determinar a presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene integrada no genoma de uma ou mais células.
[007] Também são fornecidos aqui métodos para avaliar a inte- gração genômica de uma sequência de transgene, os métodos envol- vendo: (a) a separação de uma fração de alto peso molecular de ácido desoxirribonucleico (DNA) maior ou superior a cerca de 10 quilobases (kb) do DNA isolado de uma ou mais células, as referidas uma ou mais células compreendendo, ou suspeitas de compreender, pelo menos uma célula modificada compreendendo uma sequência de transgene compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante; e (b) determinar a presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene na fração de alto peso mole- cular.
[008] Em algumas das modalidades, a determinação da presen- ça, ausência ou quantidade de sequências de transgene na fração de alto peso molecular avalia, desse modo, as sequências de transgene integradas no genoma de uma ou mais células.
[009] Também são fornecidos aqui métodos para avaliação da integração genômica de uma sequência de transgene, os métodos en- volvendo: (a) a separação de uma fração de alto peso molecular de ácido desoxirribonucleico (DNA) maior ou superior a cerca de 10 qui- lobases (kb) do DNA isolado de uma ou mais células, as referidas uma ou mais células compreendendo, ou suspeitas de compreender, pelo menos uma célula modificada compreendendo uma sequência de transgene compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codi- fica uma proteína recombinante; e (b) determinar a presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene na fração de alto peso mo- lecular, em que as sequências de transgene na fração de alto peso molecular representam as sequências de transgene que foram inte- gradas no genoma de uma ou mais células.
[0010] Em algumas das modalidades fornecidas, as sequências de transgene na fração de alto peso molecular representam as sequên- cias de transgene que foram integradas no genoma de uma ou mais células. Em algumas das modalidades fornecidas, a determinação da presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene inte- gradas no genoma de uma ou mais células em (b) compreende a de- terminação da massa, peso ou número de cópias de sequências de transgene na fração de alto peso molecular.
[0011] Em algumas das modalidades fornecidas, antes da separa- ção, os métodos incluem o isolamento do ácido desoxirribonucleico (DNA) de uma ou mais células. Em algumas das modalidades forneci- das, a determinação da presença, ausência ou quantidade de sequên- cias de transgene compreende a determinação da massa, peso ou número de cópias da sequência de transgene por genoma diploide ou por célula em uma ou mais células.
[0012] Em algumas das modalidades fornecidas, uma ou mais cé- lulas compreendem uma população de células na qual uma pluralidade de células da população compreende a sequência de transgene que codifica a proteína recombinante. Em algumas das modalidades forne- cidas, as referidas uma ou mais células compreendem uma população de células em que uma pluralidade de células da população 27 é sus- peita de compreender a sequência de transgene que codifica a proteí- na recombinante.
[0013] Em algumas das modalidades fornecidas, o número de có- pias é um número médio ou média de cópias por genoma diploide ou por célula entre a população de células.
[0014] Em algumas das modalidades fornecidas, antes da separa- ção, um polinucleotídeo compreendendo a sequência de transgene que codifica a proteína recombinante foi introduzido em uma célula, por exemplo, de uma população de células, para resultar em pelo me- nos uma célula modificada de uma ou mais células. Em algumas das modalidades fornecidas, a pelo menos uma célula modificada não foi incubada a uma temperatura superior a 25°C, opcionalmente a ou cer- ca de 37°C ± 2°C, por mais de 96 horas após a introdução do polinu- cleotídeo compreendendo a sequência de transgene. Em algumas das modalidades fornecidas, a pelo menos uma célula modificada não foi incubada a uma temperatura superior a 25°C, opcionalmente a ou cer- ca de 37°C ± 2°C, por mais de 72 horas após a introdução do polinu- cleotídeo compreendendo a sequência de transgene. Em algumas das modalidades fornecidas, a pelo menos uma célula modificada não foi incubada a uma temperatura superior a 25°C, opcionalmente a ou cer- ca de 37°C ± 2°C, por mais de 48 horas após a introdução do polinu- cleotídeo compreendendo a sequência de transgene.
[0015] Em algumas das modalidades fornecidas, uma ou mais cé- lulas foram criopreservadas antes da separação da fração de alto peso molecular de DNA. Em algumas das modalidades fornecidas, as refe- ridas uma ou mais células são uma linha celular. Em algumas das mo- dalidades fornecidas, as referidas uma ou mais células é uma célula primária obtida de uma amostra de um indivíduo. Em algumas das modalidades fornecidas, as referidas uma ou mais células são células imunes. Em algumas das modalidades fornecidas, a célula imune é uma célula T ou uma célula NK. Em algumas das modalidades forne- cidas, a célula T é uma célula T CD3+, CD4+ e/ou CD8+.
[0016] São fornecidos aqui métodos para avaliar uma sequência de transgene em uma amostra biológica de um indivíduo. Em algumas das modalidades, os métodos fornecidos envolvem: (a) separar uma fração de alto peso molecular de ácido desoxirribonucleico (DNA) mai- or ou maior que cerca de 10 quilobases (kb) do DNA isolado de uma ou mais células presentes em uma amostra de um indivíduo, em que a amostra biológica compreende, ou é suspeita de compreender, pelo menos uma célula modificada compreendendo uma sequência de transgene que codifica uma proteína recombinante; e (b) determinar a presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene na fra- ção de alto peso molecular, avaliando assim as sequências de trans- gene presentes em toda ou uma parte da amostra biológica.
[0017] É fornecido aqui um método para avaliar uma sequência de transgene em uma amostra biológica de um indivíduo, o método com- preendendo: (a) separar uma fração de alto peso molecular de ácido desoxirribonucleico (DNA) maior ou maior que cerca de 10 quilobases (kb) de DNA isolado de uma ou mais células presentes em uma amos- tra biológica de um indivíduo, em que a amostra biológica compreen- de, ou é suspeita de compreender, pelo menos uma célula modificada compreendendo uma sequência de transgene que codifica uma prote- ína recombinante; e (b) determinar a presença, ausência ou quantida- de de sequências de transgene na fração de alto peso molecular, ava- liando assim as sequências de transgene presentes em toda ou uma parte da amostra biológica.
[0018] É fornecido aqui um método para avaliar uma sequência de transgene em uma amostra biológica de um indivíduo, o método com- preendendo: (a) separar uma fração de alto peso molecular de ácido desoxirribonucleico (DNA) maior ou maior que cerca de 10 quilobases ( kb) de DNA isolado de uma ou mais células presentes em uma amostra biológica de um indivíduo, em que a amostra biológica com- preende, ou é suspeita de compreender, pelo menos uma célula modi- ficada compreendendo uma sequência de transgene que codifica uma proteína recombinante; e (b) determinar a presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene em toda ou uma parte da amostra biológica.
[0019] Em algumas das modalidades fornecidas, a determinação da presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene em (b) compreende a determinação da massa, peso ou número de cópias da sequência de transgene em toda ou uma parte da amostra biológi- ca.
[0020] Em algumas das modalidades fornecidas, antes da separa- ção, isolar o DNA de uma ou mais células presentes na amostra bioló- gica. Em algumas das modalidades fornecidas, a amostra biológica é obtida de um indivíduo que recebeu uma composição que compreende pelo menos uma célula modificada compreendendo a sequência de transgene. Em algumas das modalidades fornecidas, a amostra bioló- gica é uma amostra de tecido ou amostra de fluido corporal. Em algu- mas das modalidades fornecidas, a amostra biológica é uma amostra de tecido e o tecido é um tumor. Em algumas modalidades, a amostra de tecido é uma biópsia de tumor. Em algumas das modalidades for- necidas, a amostra biológica é uma amostra de fluido corporal e a amostra de fluido corporal é uma amostra de sangue ou soro.
[0021] Em algumas das modalidades fornecidas, antes da separa- ção, um polinucleotídeo compreendendo a sequência de transgene que codifica a proteína recombinante foi introduzido em uma célula, por exemplo, de uma população de células, para resultar em pelo me- nos uma célula modificada de uma ou mais células.
[0022] Em algumas das modalidades fornecidas, as referidas uma ou mais células na amostra biológica compreendem uma célula imune. Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula T ou uma célu- la NK. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T CD3+, CD4+ e/ou CD8+.
[0023] Em algumas das modalidades fornecidas, a separação é realizada por eletroforese em gel de campo de pulso ou cromatografia por exclusão de tamanho. Em algumas modalidades, a separação é realizada por eletroforese em gel de campo de pulso.
[0024] São também fornecidos aqui métodos para avaliar a inte- gração genômica de uma sequência de transgene. Em algumas das modalidades, os métodos envolvem: (a) separar, por eletroforese em gel de campo de pulso, uma fração de alto peso molecular de ácido desoxirribonucleico (DNA) maior ou superior a cerca de 10 quilobases (kb) de DNA isolado de uma população de células, a referida popula- ção de células compreendendo uma pluralidade de células modifica- das em que cada uma compreende, ou é suspeita de compreender, uma sequência de transgene que compreende uma sequência de áci- do nucleico que codifica uma proteína recombinante; e (b) determinar o número médio de cópias ou média por genoma diploide ou por célula da sequência da sequência de transgene na fração de alto peso mole- cular, avaliando assim as sequências de transgene integradas no ge- noma da pluralidade de células modificadas da população de células.
[0025] Também são fornecidos aqui métodos para avaliar a inte- gração genômica de uma sequência de transgene. Em algumas das modalidades, os métodos envolvem: (a) separar, por eletroforese em gel de campo de pulso, uma fração de alto peso molecular de ácido desoxirribonucleico (DNA) maior ou superior a cerca de 10 quilobases (kb) de DNA isolado de uma população de células, a referida popula- ção de células compreendendo uma pluralidade de células modifica- das em que cada uma compreende, ou é suspeita de compreender, uma sequência de transgene que compreende uma sequência de áci- do nucleico que codifica uma proteína recom binante; e (b) da fração de alto peso molecular, determinar o número médio de cópias ou mé- dia por genoma diploide ou por célula da sequência de transgene inte- grada no genoma da pluralidade de células modificadas da população de células.
[0026] É aqui fornecido um método para avaliar a integração ge- nômica de uma sequência de transgene, o método compreendendo: (a) separar, por eletroforese em gel de campo de pulso, uma fração de alto peso molecular de ácido desoxirribonucleico (DNA) maior ou maior que cerca de 10 quilobases (kb) de DNA isolado de uma população de células, a referida população de células compreendendo uma plurali- dade de células modificadas em que cada uma compreende, ou é suspeita de compreender, uma sequência de transgene que codifica uma proteína recombinante; e (b) determinar o número médio de có- pias ou média por genoma diploide ou por célula da sequência de transgene integrada no genoma da pluralidade de células modificadas da população de células.
[0027] Em algumas das modalidades fornecidas, antes da separa- ção, um polinucleotídeo compreendendo a sequência de transgene que codifica a proteína recombinante foi introduzido em uma célula, por exemplo, de uma população de células, para resultar em pelo me- nos uma da pluralidade de células modificadas da população de célu- las. Em algumas das modalidades fornecidas, a população de células não foi incubada a uma temperatura superior a 25°C, opcionalmente a ou cerca de 37°C ± 2°C, por mais de 96 horas após a introdução do polinucleotídeo compreendendo a sequência de transgene na pelo menos uma célula modificada. Em algumas das modalidades forneci- das, a população de células não foi incubada a uma temperatura supe- rior a 25°C, opcionalmente a ou cerca de 37°C ± 2°C, por mais de 72 horas após a introdução do polinucleotídeo compreendendo a sequên- cia de transgene na pelo menos uma célula modificada. Em algumas das modalidades fornecidas, a população de células não foi incubada a uma temperatura superior a 25°C, opcionalmente a ou cerca de 37°C ± 2°C, por mais de 48 horas após a introdução do polinucleotídeo compreendendo a sequência de transgene na pelo menos uma célula modificada. Em algumas das modalidades fornecidas, a população de células foi criopreservada antes da separação da fração de alto peso molecular de DNA.
[0028] Em algumas das modalidades fornecidas, a fração de alto peso molecular é maior ou maior do que cerca de 15 quilobases (kb). Em algumas das modalidades fornecidas, a fração de alto peso mole- cular é maior ou maior do que cerca de 17,5 quilobases (kb). Em al- gumas das modalidades fornecidas, a fração de alto peso molecular é maior ou maior do que cerca de 20 quilobases (kb).
[0029] Em algumas modalidades, a sequência de transgene com- preende um elemento regulador ligado a uma sequência de ácido nu- cleico que codifica uma proteína recombinante.
[0030] Em algumas das modalidades fornecidas, a determinação da presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene é realizada por reação em cadeia da polimerase (PCR). Em algumas das modalidades fornecidas, a PCR é a reação em cadeia da polime- rase quantitativa (qPCR), PCR digital ou PCR digital de gota. Em al- gumas das modalidades fornecidas, a PCR é PCR digital de gota. Em algumas das modalidades fornecidas, a PCR é realizada usando um ou mais iniciadores que são complementares ou são capazes de am- plificar especificamente pelo menos uma porção da sequência de transgene. Em algumas das modalidades, um ou mais iniciadores são complementares ou são capazes de amplificar especificamente as se- quências do elemento regulador.
[0031] Em algumas das modalidades fornecidas, a determinação da quantidade de sequência de transgene compreende avaliar a mas- sa, peso ou número de cópias da sequência de transgene por massa ou peso do DNA isolado de uma ou mais células, opcionalmente por micrograma de DNA isolado de uma ou mais células. Em algumas das modalidades fornecidas, a determinação da quantidade de sequência de transgene compreende a avaliação da massa ou peso da sequên- cia de transgene em micrograma, por micrograma de DNA isolado de uma ou mais células. Em algumas das modalidades fornecidas, a de- terminação da quantidade de sequência de transgene compreende avaliar a massa, peso ou número de cópias da sequência de transge- ne por uma ou mais células, opcionalmente por células CD3+, CD4+ e/ou CD8+, e/ou por célula que expressa a proteína recombinante.
[0032] Em algumas das modalidades fornecidas, a determinação da presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene compreende avaliar a massa, peso ou número de cópias da sequência de transgene por genoma diploide ou por célula na amostra biológica. Em algumas das modalidades fornecidas, o número de cópias é um número médio ou média de cópias por genoma diploide ou por célula entre uma ou mais células na amostra biológica.
[0033] Em algumas das modalidades fornecidas, a determinação da quantidade de sequência de transgene compreende avaliar a mas- sa, peso ou número de cópias da sequência de transgene por volume da amostra biológica, opcionalmente por microlitro ou por mililitro da amostra biológica. Em algumas das modalidades fornecidas, a deter- minação da quantidade de sequência de transgene compreende avali- ar a massa, peso ou número de cópias da sequência de transgene por peso corporal ou área de superfície corporal do indivíduo. Em algumas das modalidades fornecidas, a determinação da quantidade de se- quência de transgene compreende avaliar a massa, peso ou número de cópias da sequência de transgene na fração de alto peso molecular e normalizar a massa, peso ou número de cópias para a massa, peso ou número de cópias de um gene de referência na fração de alto peso molecular ou para uma curva padrão. Em algumas das modalidades fornecidas, o gene de referência é um gene de manutenção. Em algu- mas das modalidades fornecidas, o gene de referência é um gene que codifica a albumina (ALB). Em algumas das modalidades fornecidas, o gene de referência é um gene que codifica a subunidade p30 da prote- ína P da ribonuclease (RPP30). Em algumas das modalidades forneci- das, o número de cópias de um gene de referência no DNA isolado é realizado por PCR usando um ou mais iniciadores que são comple- mentares ou são capazes de amplificar especificamente pelo menos uma porção do gene de referência.
[0034] Em algumas das modalidades fornecidas, a sequência de transgene não codifica uma proteína gag viral completa. Em algumas das modalidades fornecidas, a sequência de transgene não compre- ende um genoma de HIV completo, um genoma viral competente para replicação e/ou genes acessórios, cujos genes acessórios são opcio- nalmente Nef, Vpu, Vif, Vpr e/ou Vpx.
[0035] Em algumas das modalidades fornecidas, a introdução do polinucleotídeo é realizada por transdução com um vetor viral compre- endendo o polinucleotídeo. Em algumas das modalidades fornecidas, o vetor viral é um vetor retroviral ou um vetor gama-retroviral. Em al- gumas das modalidades fornecidas, o vetor viral é um vetor lentiviral. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor AAV, opcionalmente selecionado entre os vetores AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 ou AAV8.
[0036] Em algumas das modalidades fornecidas, a introdução do polinucleotídeo é realizada por um método de liberação física, opcio- nalmente por eletroporação.
[0037] Em algumas das modalidades fornecidas, a proteína re- combinante é um receptor recombinante. Em algumas das modalida- des fornecidas, o receptor recombinante se liga especificamente a um antígeno associado a uma doença ou condição ou um antígeno que é expresso em células do ambiente de uma lesão associada a uma do- ença ou condição. Em algumas das modalidades fornecidas, a doença ou condição é um câncer. Em algumas das modalidades fornecidas, o antígeno é selecionado de integrina αvβ6 (integrina avb6), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecido como CAIX ou G250) , um antígeno de cân-
cer de testículo, antígeno de câncer/testículo 1B (CTAG, também co- nhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembriônico (CEA), uma ciclina, ciclina A2, Ligante 1 de Quimiocina de Motif CC (CCL-1 ), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, condroiti- na sulfato proteoglicano 4 (CSPG4), proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), mutação do receptor do fator de crescimento epi- dérmico tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicopro- teína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor A2 de efrina (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc como 5 (FCRL5; também conheci- do como receptor Fc homólogo 5 ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), uma proteína de ligação a folato (FBP), receptor de folato alfa, gangliosídeo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), glipicano-3 (GPC3), receptor acopla- do à proteína G classe C grupo 5 membro D (GPRC5D), Her2/neu (re- ceptor tirosina quinase erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb -B4), dímeros de erbB, antígeno associado ao melanoma de alto peso molecular humano (HMW-MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno de leucócito humano A1 (HLA-A1), antígeno de leucócito humano A2 (HLA-A2), IL-22 receptor alfa (IL-22Rα), receptor IL-13 alfa 2 (IL- 13Rα2), receptor de domínio de inserção de quinase (kdr), cadeia leve kappa, molécula de adesão de células L1 (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, Leucina Repetição rica contendo 8 membros da família A (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado ao melanoma (MAGE) -A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citome- galovírus murino (CMV) , mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes do membro D do grupo 2 natural killer (NKG2D), melan A (MART-1), mo- lécula de adesão de células neurais (NCAM), antígeno oncofetal, Antí- geno preferencialmente expresso de melanoma (PRAME), receptor de progesterona , um antígeno específico da próstata, próstata antígeno de células-tronco (PSCA), antígeno de membrana específico da prós- tata (PSMA), Receptor Tirosina Quinase Órfão Receptor 1 (ROR1), survivina, glicoproteína de trofoblasto (TPBG também conhecido como 5T4), glicoproteína associada a tumor 72 (TAG72), proteína relaciona- da à tirosinase 1 (TRP1, também conhecido como TYRP1 ou gp75), proteína relacionada à tirosinase 2 (TRP2, também conhecida como dopacrome tautomerase, dopacrome delta-isomerase ou DCT), recep- tor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor do fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGFR2 ), Wilms Tumor 1 (WT-1), um antígeno específico de patógeno ou expresso por patóge- no, ou um antígeno associado a um marcador universal e/ou molécu- las biotiniladas e/ou moléculas expressas por HIV, HCV, HBV ou ou- tros patógenos . Em algumas das modalidades fornecidas, o receptor recombinante é um receptor de células T recombinantes (TCR) ou um receptor de células não T funcionais.
[0038] Em algumas das modalidades fornecidas, o receptor re- combinante é um receptor de antígeno quimérico (CAR). Em algumas de quaisquer das modalidades fornecidas, o CAR compreende um domínio de reconhecimento de antígeno extracelular que se liga espe- cificamente ao antígeno e um domínio de sinalização intracelular com- preendendo um ITAM. Em algumas das modalidades fornecidas, o domínio de sinalização intracelular compreendendo um ITAM compre- ende um domínio intracelular de uma cadeia CD3-zeta (CD3ζ), opcio- nalmente, uma cadeia CD3-zeta humana. Em algumas das modalida- des fornecidas, o domínio de sinalização intracelular compreende ain- da uma região de sinalização coestimulatória. Em algumas modalida- des, a região de sinalização coestimuladora compreende um domínio de sinalização de CD28 ou 4-1BB, opcionalmente CD28 humano ou 4- 1BB humano.
[0039] É aqui fornecido um método para avaliar uma sequência de transgene residual não integrada, o método compreendendo: (a) reali- zar o método de qualquer uma das modalidades fornecidas, para de- terminar a presença, ausência ou quantidade de sequências de trans- gene na alta fração de peso molecular de DNA, avaliando assim a in- tegração genômica de uma sequência de transgene; (b) determinar a presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene no DNA isolado sem separar a fração de alto peso molecular; e (c) com- parar a quantidade determinada em (a) com a quantidade determinada em (b), determinando assim a quantidade da sequência recombinante residual não integrada.
[0040] Em algumas das modalidades fornecidas, a determinação da presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene compreende a determinação da massa, peso ou número de cópias da sequência de transgene por genoma diploide ou por célula em uma ou mais células. Em algumas das modalidades fornecidas, as referidas uma ou mais células compreendem uma população de células em que uma pluralidade de células da população compreende a sequência de transgene que codifica a proteína recombinante. Em algumas das mo- dalidades fornecidas, as referidas uma ou mais células compreendem uma população de células em que uma pluralidade de células da po- pulação é suspeita de compreender a sequência de transgene que co- difica a proteína recombinante. Em algumas das modalidades forneci- das, o número de cópias é um número médio ou média de cópias por genoma diploide ou por célula entre a população de células.
[0041] Em algumas das modalidades fornecidas, comparar a quantidade compreende subtrair o número de cópias determinado em (a) do número de cópias determinado em (b). Em algumas das moda- lidades fornecidas, comparar a quantidade compreende determinar a razão do número de cópias determinado em (a) para o número de có- pias determinado em (b).
[0042] Em algumas das modalidades fornecidas, a determinação da presença, ausência ou quantidade em (b) é realizada por reação em cadeia da polimerase (PCR). Em algumas das modalidades forne- cidas, a PCR é a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), PCR digital ou PCR digital de gota. Em algumas das modalidades for- necidas, a PCR é PCR digital de gota. Em algumas das modalidades fornecidas, a PCR é realizada usando um ou mais iniciadores que são complementares ou são capazes de amplificar especificamente pelo menos uma porção da sequência de transgene.
[0043] Em algumas das modalidades fornecidas, determinar a pre- sença, ausência ou quantidade em (b) compreende avaliar a massa, o peso ou o número de cópias da sequência de transgene no DNA iso- lado sem separar a fração de alto peso molecular e normalizar a mas- sa, peso ou número de cópias para a massa, peso ou número de có- pias de um gene de referência no DNA isolado sem separar a fração de alto peso molecular ou para uma curva padrão. Em algumas das modalidades fornecidas, o gene de referência é um gene de manuten- ção. Em algumas das modalidades fornecidas, o gene de referência é um gene que codifica a albumina (ALB). Em algumas das modalidades fornecidas, o gene de referência é um gene que codifica a subunidade p30 da proteína P da ribonuclease (RPP30).
[0044] Em algumas das modalidades fornecidas, a determinação da massa, peso ou número de cópias de um gene de referência no DNA isolado é realizada por PCR usando um ou mais iniciadores que são complementares ou capazes de amplificar especificamente em pelo menos uma porção do gene de referência.
[0045] Em algumas das modalidades fornecidas, a determinação da presença, ausência ou quantidade em (a) e a determinação da pre- sença, ausência ou quantidade em (b) é realizada por reação em ca- deia da polimerase (PCR) usando o mesmo iniciador ou os mesmos conjuntos de iniciadores.
[0046] Em algumas das modalidades fornecidas, a sequência re- combinante não integrada residual compreende um ou mais de plas- mídeos de vetor, DNA complementar linear (cDNA), autointegrantes ou círculos de repetição terminal longa (LTR). Breve Descrição dos Desenhos
[0047] A FIG. 1 mostra o número de cópias conforme avaliado por PCR digital de gotículas (ddPCR) antes (pré-gel; ensaio de número de cópias de vetor padrão (VCN)) ou após a separação da fração de DNA de alto peso molecular, acima de um limite de 15 kb, 17,5 kb ou 20 kb por eletroforese em gel de campo de pulso (PFGE) (ensaio de número de cópia de vetor integrado (iVCN)). O número de cópias foi avaliado usando iniciadores que amplificam especificamente uma parte das se- quências integradas do transgene ("transgene"); plasmídeo de empa- cotamento (plasmídeo de empacotamento viral que codifica a proteína G do vírus da estomatite vesicular Indiana ("VSVg")) ou um controle genômico (gene que codifica para a subunidade da proteína P da ribo- nuclease p30 ("RRP30")). A avaliação foi realizada em uma amostra de células transduzidas, ou em um controle não transduzido, plasmí- deo CAR estimulado e plasmídeo VSVg. O número de cópias de cada gene foi normalizado para o número de genomas diploides (genoma cp/diploide; usando iniciadores específicos para o gene da albumina como referência) ou por 50 ng de DNA genômico.
[0048] As FIGS. 2A-2B representam o número de cópias conforme avaliado pelo ensaio de número de cópias de vetor padrão (VCN) (amostras de DNA genômico que não foram submetidas a PFGE, con- tendo DNA de alto e baixo peso molecular) e ensaio de número de có- pias de vetor integrado (iVCN) ( em amostras de DNA de alto peso molecular após PFGE) de sequências de transgene em vários pontos do tempo (antes da transdução ("pré"), em 5 minutos, 6 horas, 12 ho-
ras, 24 horas, 48 horas, 72 horas e 96 horas após a transdução , ou na conclusão do processo de modificação, "conclusão") para células T Jurkat (FIG. 2A) ou células T primárias isoladas de indivíduos huma- nos (FIG. 2B), transduzidas com uma preparação lentiviral contendo sequências de transgene que codificam um CAR. O número de cópias de cada gene foi normalizado para o número de genomas diploides (cp/genoma diploide; usando iniciadores específicos para o gene da albumina como referência).
[0049] A FIG. 3A mostra o número de cópias integradas avaliado no dia 3, 4 ou 5 de processos de fabricação de composição de células T não expandidas exemplares, usando células T primárias de dois in- divíduos humanos diferentes (doador A e doador B) que foram estimu- lados e estimulados por incubação com ( 1) esferas (beads) paramag- néticas conjugadas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28 ("esferas"), (2) reagentes de muteína oligoméricos de estreptavidina conjugados com Fab anti-CD3/anti-CD28 a uma concentração de 4,0 µg por 106 célu- las, ou (3) anti-CD3/anti-CD28 Fab conjugado com reagentes muteíni- cos de estreptavidina oligoméricos a uma concentração de 0,8 µg por 106 células, incubados em meio basal sem soro ou fatores de cresci- mento ("basal") ou meio livre de soro contendo IL-2, IL-5 e IL-15 ("completo") após a transdução. A FIG. 3B representa a correlação entre o número de cópias conforme determinado por iVCN e a porcen- tagem de células que expressam CAR (conforme determinado pela porcentagem de células CD3+/Cas3-/CAR+ ativadas entre células CD3+ por citometria de fluxo).
[0050] As FIGS. 4A-4E representam o número de cópias por ge- noma diploide conforme avaliado por VCN padrão (sem PFGE) e iVCN (com PFGE) (FIG. 4A), fração de transgene integrado (FIG. 4B), fração de transgene não integrado (FIG. 4C), número de cópias do transgene não integrado por genoma diploide (FIG. 4D) e número de cópias inte-
gradas por célula CAR+ (FIG. 4E), durante vários exemplos de pro- cessos de fabricação de composição de células T expandidas ou não expandidas que empregam diferentes reagentes estimulantes e horá- rios de coleta, conforme estabelecido na Tabela E1.
[0051] A FIG. 5 representa o número de cópias por genoma diploi- de conforme avaliado por VCN padrão (sem PFGE) e iVCN (com PFGE), número de cópias do transgene não integrado, fração do transgene não integrado e fração do transgene integrado, durante vá- rios pontos do tempo em uma engenharia exemplar processo para manipular células T primárias de vários doadores para expressar um receptor de antígeno quimérico (CAR). Os pontos do tempo avaliados incluem do dia 0 ao dia 8 dos processos expandidos, incluindo no ma- terial descongelado (TMAT; dia 0), na ativação (AMAT; dia 1), na transdução (XMAT; dia 2) ou em vários momentos após o início de cul- tivo (inoc+ 1 a inoc+ 6; representando os dias 3-8 do processo).
[0052] A FIG. 6 mostra o número de cópias por genoma diploide conforme avaliado por VCN padrão (sem PFGE) e iVCN (com PFGE) por célula, na linha de células de fibroblastos humanos HT1080, em 12, 24, 48 ou 72 horas após a transdução.
[0053] A FIG. 7A mostra a relação entre o número de cópias por célula entre células totais, conforme avaliado por VCN padrão (sem PFGE) e iVCN (com PFGE), em composições de células produzidas a partir de células T primárias de diferentes doadores humanos que fo- ram projetadas para expressar um CAR usando um processo expandi- do (○) ou um processo não expandido (●). As As FIGS. 7B-7C mos- tram a relação entre o número de cópias por célula nas composições de células avaliadas por VCN padrão (FIG. 7B) ou iVCN (FIG. 7C) e a expressão de superfície do CAR, conforme indicado pela porcentagem de expressão de Células CAR CD3+ ( % de CD3+ CAR+) entre as cé- lulas CD45+ viáveis avaliadas por citometria de fluxo.
Descrição Detalhada
[0054] São fornecidos aqui métodos para avaliar a integração de sequências de ácido nucleico integradas em um genoma de uma célu- la geneticamente modificada. Em alguns aspectos, os métodos são usados para determinar a presença, ausência e/ou quantidade de se- quências de ácido nucleico, como sequências de transgene usadas para modificação genética de uma célula. Em alguns aspectos, os mé- todos podem ser usados para avaliar a integração de sequências de transgene no genoma de uma célula, como uma célula geneticamente modificada usada em terapia celular. Em alguns aspectos, as células são geneticamente modificadas para expressar uma proteína recombi- nante, como um receptor recombinante, pela introdução de um polinu- cleotídeo contendo sequências de ácido nucleico, tal como uma se- quência transgene que codifica uma proteína recombinante, para ser integrada no genoma da célula. Em alguns aspectos, os métodos for- necidos podem ser usados para avaliar a integração e distinguir e/ou determinar a presença, ausência ou quantidade de ácidos nucleicos integrados e ácidos nucleicos residuais não integrados.
[0055] Em alguns aspectos, o polinucleotídeo contendo uma se- quência de transgene que codifica uma proteína recombinante é intro- duzido na célula usando vários métodos de liberação, como transdu- ção viral ou métodos de liberação física, como eletroporação. Em al- gumas modalidades, as células modificadas, tais como células modifi- cadas para terapia de células adotivas, devem ser monitoradas ou avaliadas para várias características e recursos, tais como determinar o nível de expressão da proteína recombinante codificada pelas se- quências de transgene, e/ou determinar o número de cópias das se- quências de transgene que são integradas ao genoma da célula, como integrado de forma estável no genoma da célula. Em algumas modali- dades, as células modificadas devem ser monitoradas quanto à pre-
sença, ausência e/ou quantidade de ácidos nucleicos residuais não integrados. Em alguns aspectos, tal avaliação pode ser realizada em um ou mais pontos do tempo durante o processo de modificação ou fabricação. Particularmente para células modificadas e composições de células para uso em terapia celular, a determinação eficiente e pre- cisa da presença, ausência, quantidade, número de cópias e/ou ex- pressão das sequências de transgene é crítica, como a terapia de cé- lulas adotivas, para garantir a adequada e precisa caracterização e definição das células modificadas, para determinar com precisão a do- sagem e para garantir a eficácia e segurança das composições de cé- lulas quando administradas a um indivíduo. Métodos melhorados para satisfazer tais requisitos para avaliação eficiente e precisa da presen- ça, ausência, quantidade, número de cópias e/ou expressão dos áci- dos nucleicos residuais integrados e não integrados são necessários.
[0056] Em alguns casos, a avaliação pode precisar ser realizada durante um estágio inicial do processo de modificação ou manufatura e/ou durante um processo de manufatura que é reduzido ou abreviado, de maneira oportuna e confiável. Processos de fabricação encurtados ou abreviados exemplares incluem um processo de fabricação não ex- pandido, por exemplo, um processo que não inclui ou inclui uma incu- bação mais curta ou mais abreviada para a expansão das células após a transdução. Em alguns aspectos, certos processos encurtados ou abreviados podem envolver uma incubação das células sob condições que não expandem substancialmente as células ou apenas expande minimamente as células. Em alguns casos, tais processos podem in- cluir a incubação das células a uma temperatura superior a 25°C, op- cionalmente a ou cerca de 37°C ± 2°C por não mais que 96, 72 ou 48 horas após a introdução de um polinucleotídeo recombinante ou hete- rólogo, como por transdução.
[0057] Em alguns casos, determinar a presença, ausência e/ou quantidade de sequências de transgene integradas ao genoma de uma célula pode ser difícil, particularmente em pontos do tempo inici- ais ou usando processos que não são expandidos, por exemplo, pro- cessos que têm um período mais curto de incubação, cultivo ou ex- pansão após a introdução de sequências de ácido nucleico para inte- gração, ou um período mais curto de incubação, cultivo ou expansão antes da avaliação das características ou características das células modificadas ou antes da criopreservação. Em alguns aspectos, a pre- sença, ausência ou quantidade determinada de DNA isolado de célu- las durante os estágios iniciais do processo de modificação ou fabrica- ção ou em um processo não expandido pode resultar em uma supe- restimativa, devido à presença de espécies não integradas de ácidos nucléicos presentes na reação ou nas células. Em alguns aspectos, as modalidades fornecidas permitem a determinação específica da pre- sença, ausência ou quantidade de ácidos nucleicos integrados e, em alguns casos, ácidos nucleicos residuais não integrados, antes da ad- ministração de células a um indivíduo.
[0058] As modalidades fornecidas oferecem soluções melhoradas para o requisito de avaliação eficiente e precisa das células modifica- das ou composições de células. Em particular, métodos melhorados são necessários para células modificadas usando um processo abre- viado ou não expandido, ou em pontos do tempo iniciais no processo de modificação. Em alguns aspectos, as modalidades fornecidas são baseadas em uma observação aqui descrita, por exemplo, nos Exem- plos 3 a 5, que um método de ensaio que inclui a separação da fração de alto peso molecular de DNA de uma célula, por exemplo, maior do que cerca de 10 quilobases (kb), e avaliar a presença, ausência ou quantidade das sequências de transgene na fração de alto peso mole- cular pode detectar com segurança sequências de transgene integra- das em uma amostra. Verificou-se que o método fornecido, que con-
tém sequências de transgene integradas que são separadas de se- quências residuais não integradas, oferece uma vantagem, particular- mente durante processos abreviados não expandidos.
[0059] Em alguns aspectos, as modalidades fornecidas são base- adas em métodos para separar ou isolar moléculas de ácido nucleico grandes ou de alto peso molecular, que podem conter DNA genômico, além de moléculas de ácido nucleico menores ou de baixo peso mole- cular que podem conter não integradas ou moléculas residuais, como plasmídeos epissomais, autointegrantes ou outros fragmentos. Em al- guns aspectos, as moléculas de ácido nucleico de alto peso molecular também incluem sequências de transgene que foram integradas no genoma. As modalidades fornecidas fornecem uma vantagem de que podem ser usadas para distinguir sequências integradas (por exemplo, integradas no genoma da célula) de sequências residuais não integra- das, permitindo, portanto, a determinação precisa e confiável de se- quências integradas, mesmo em estágios iniciais de fabricação ou em processos não expandidos.
[0060] Em alguns aspectos, os métodos fornecidos permitem a determinação eficiente e confiável do número de cópias de ácidos nu- cleicos integrados, em particular, no ponto de tempo inicial durante o processo de modificação ou fabricação ou para uma modificação ou fabricação não expandida, reduzida ou acelerada processos, melho- rando assim a precisão e confiabilidade da caracterização de células para uso ou administração em terapia celular. Em alguns aspectos, as modalidades fornecidas oferecem uma vantagem de determinar com precisão o número de cópias integradas em pontos do tempo específi- cos, como durante ou no final de um processo de fabricação ou modi- ficação não expandido, encurtado ou acelerado, sem incluir números de cópias de não moléculas integradas ou residuais, tais como plas- mídeos epissomais, autointegrantes ou outros fragmentos.
[0061] Em alguns aspectos, as modalidades fornecidas são base- adas em uma observação de que a avaliação do número de cópias na fração de alto peso molecular após a separação da fração pode resul- tar na determinação precisa do número de cópias da sequência de transgene integrada de forma estável, particularmente para células ge- radas usando um processo não expandido que pode reter cópias livres e não integradas de sequências de transgene. Em comparação, a de- terminação do número de cópias sem separação prévia de alto peso molecular, que não distingue sequências de transgene integradas vs. não integradas, é limitada na determinação precisa do número de se- quências de transgene integradas de forma estável, especialmente durante e após um período mais curto, não expandido processo. Con- forme descrito neste documento, por exemplo, nos Exemplos 3-5, du- rante um processo abreviado e não expandido, os métodos que não empregam a separação de fragmentos de alto peso molecular (por exemplo, denominado ensaio de número de cópia de vetor (VCN)), podem resultar em falsos positivos ou superestimação de sequências de transgene integradas, como espécies residuais não integradas (por exemplo, plasmídeos epissomais, autointegrantes ou outros fragmen- tos) também podem ser detectados e esferados. As modalidades for- necidas neste documento fornecem várias vantagens, pois permitem a determinação eficiente e precisa sem falso positivo ou superestimação que pode resultar de ensaios VCN existentes.
[0062] Também são fornecidos kits e artigos de fabricação que podem ser usados para executar os métodos fornecidos.
[0063] Todas as publicações, incluindo documentos de patentes, artigos científicos e bancos de dados, referidos neste pedido são in- corporados por referência em sua totalidade para todos os fins, na mesma medida como se cada publicação individual fosse individual- mente incorporada por referência. Se uma definição estabelecida nes-
te documento for contrária ou de outra forma inconsistente com uma definição estabelecida nas patentes, pedidos, pedidos publicados e outras publicações que são incorporadas neste documento por refe- rência, a definição estabelecida neste documento prevalece sobre a definição que é incorporada neste documento por referência.
[0064] Os títulos das seções usados neste documento são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados como limitan- do o assunto descrito. I. MÉTODOS PARA AVALIAR ÁCIDOS NUCLEICOS INTEGRADOS
[0065] São fornecidos aqui métodos para avaliar a integração ge- nômica (em alguns casos, pode ser chamado de ensaio de número de cópia de vetor integrado (iVCN)) de sequências de transgene, como uma sequência de transgene que codifica uma proteína recombinante, usada na modificação genética de uma célula . Em algumas modalida- des, os métodos são usados para determinar a presença, ausência e/ou quantidade de sequências de ácido nucleico, como sequências de transgene que codificam uma proteína recombinante, como um re- ceptor recombinante. Em algumas modalidades, os métodos envolvem determinar a presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene integrada no genoma de uma ou mais células, por exemplo, uma ou mais células geneticamente modificadas que compreendem, ou suspeita-se que compreendam, pelo menos uma célula modificada compreendendo uma sequência de transgene que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante. Em alguns aspectos, os métodos fornecidos podem ser empregados para avaliar a integração em vários pontos do tempo antes, durante ou depois de um processo de modificação celular, por exemplo, um pro- cesso usado para introduzir polinucleotídeos contendo sequências de transgene que podem ser integrados no genoma da célula. Em alguns aspectos, os métodos fornecidos também podem ser empregados pa-
ra avaliar amostras biológicas obtidas de um indivíduo que recebeu células modificadas, para detectar ou determinar a presença, ausência e/ou quantidade de sequências de transgene na amostra biológica.
[0066] Em alguns aspectos, os métodos fornecidos podem ser usados para avaliar a integração e para distinguir e/ou determinar a presença, ausência e/ou quantidade de ácidos nucleicos integrados e/ou ácidos nucleicos residuais não integrados, como um ou mais de plasmídeos de vetor, DNA complementar linear (cDNA), autointegran- tes ou círculos de repetição terminal longa (LTR). Em alguns aspectos, as modalidades fornecidas incluem métodos para avaliar a presença, ausência, número de cópias das sequências de transgene em uma amostra biológica de um indivíduo que envolve o isolamento de ácido desoxirribonucleico (DNA) de uma amostra biológica de um indivíduo, como um indivíduo que foi administrado células modificadas.
[0067] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para avaliar a integração genômica de uma sequência de transgene que envolve a separação de uma fração de alto peso molecular de ácido desoxirribonucleico (DNA), como espécies de DNA que são maiores ou maiores que cerca de 10 quilobases (kb) , de DNA isolado de uma ou mais células. Em alguns aspectos, essa separação pode ser reali- zada por métodos como eletroforese em gel de campo de pulso (PFGE). Em alguns aspectos, uma ou mais células contêm, ou são suspeitas de conter, pelo menos uma célula modificada compreenden- do uma sequência de transgene que codifica uma proteína recombi- nante. Em alguns aspectos, a sequência de transgene é ou deve ser integrada no genoma da célula. Em algumas modalidades, as sequên- cias de transgene incluem sequência de ácido anucleico que codifica a proteína recombinante e outros componentes ou elementos, incluindo elementos reguladores, por exemplo, promotores, elementos regulado- res transcricionais e/ou pós-transcricionais ou elementos de resposta,
ou marcadores, por exemplo, marcadores substitutos. Em alguns as- pectos, os métodos envolvem determinar a presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene integrada no genoma de uma ou mais células, por exemplo, por métodos quantitativos, como reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), PCR digital (dPCR) ou PCR digital de gota (ddPCR).
[0068] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para avaliar a integração genômica de uma sequência de transgene, que envolve a separação, por eletroforese em gel de campo de pulso, uma fração de alto peso molecular de ácido desoxirribonucleico (DNA) mai- or ou superior a cerca de 10 quilobases ( kb) de DNA isolado de uma população de células, a referida população de células compreendendo uma pluralidade de células modificadas em que cada uma compreen- de, ou se suspeita que compreenda, uma sequência de transgene que codifica uma proteína recombinante; e determinar o número médio de cópias ou média por genoma diploide da sequência de transgene inte- grada no genoma da pluralidade de células modificadas da população de células.
[0069] Em algumas modalidades, antes da separação, um polinu- cleotídeo compreendendo a sequência de transgene que codifica a proteína recombinante foi introduzido em pelo menos uma da plurali- dade de células modificadas da população de células.
[0070] Em alguns aspectos, os métodos fornecidos envolvem a separação de uma fração particular, como uma fração de alto peso molecular, de outras moléculas ou espécies de DNA presentes no DNA total isolado de células modificadas. Em alguns aspectos, os mé- todos envolvem a separação de uma fração de alto peso molecular, como conter DNA com um tamanho de cerca de 10 quilobases (kb) ou maior. Em alguns aspectos, a etapa de separação é realizada usando métodos para separar ácidos nucleicos com base no tamanho ou peso molecular, como métodos com base em eletroforese. Em alguns as- pectos, os métodos também envolvem isolar o DNA de uma ou mais células antes da separação da fração de alto peso molecular do DNA isolado.
[0071] Em alguns aspectos, os métodos envolvem determinar a presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene inte- grada no genoma de uma ou mais células. Em alguns aspectos, os métodos envolvem a determinação da presença, ausência e/ou quan- tidade das sequências de transgene em uma ou mais das frações se- paradas, como na fração de alto peso molecular. Em alguns aspectos, os métodos envolvem determinar a presença, ausência e/ou quantida- de das sequências de transgene na fração de alto peso molecular. Em alguns aspectos, os métodos envolvem, a partir da fração de alto peso molecular, determinar a presença, ausência ou quantidade de sequên- cias de transgene integrada no genoma de uma ou mais células. Em alguns aspectos, a determinação pode ser com base em métodos para detectar e/ou quantificar sequências de ácido nucleico, como reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) ou métodos relaciona- dos. Em alguns aspectos, os métodos fornecidos permitem distinguir a sequência de transgene integrada das sequências de transgene não integradas que podem estar presentes nas ou perto das células e/ou na amostra de análise.
[0072] Em algumas modalidades, os métodos envolvem o isola- mento do ácido desoxirribonucleico (DNA) de uma célula que foi intro- duzida com um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de transgene sob condições para integração em um genoma da célula e a separação de uma fração de alto peso molecular de maior do que ou maior do que cerca de 10 quilobases (kb) do DNA isolado. Em algu- mas modalidades, os métodos envolvem a separação de uma fração de alto peso molecular maior ou superior a cerca de 10 quilobases (kb)
do ácido desoxirribonucleico (DNA) isolado de uma célula, em que an- tes da separação, a célula foi introduzida com um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de transgene sob condições para in- tegração da sequência de transgene em um genoma da célula. Em alguns aspectos, os métodos fornecidos envolvem a determinação da presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene na fra- ção separada de alto peso molecular.
[0073] Em alguns aspectos, também são fornecidos métodos para determinar a presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene em uma amostra biológica de um indivíduo que envolve o isolamento de ácido desoxirribonucleico (DNA) de uma amostra bioló- gica de um indivíduo; separar uma fração de alto peso molecular maior ou maior que cerca de 10 quilobases (kb) do DNA isolado; e determi- nar a presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene na fração de alto peso molecular. Em alguns aspectos, a amostra bio- lógica é obtida de um indivíduo ao qual foram administradas células modificadas compreendendo a sequência de transgene.
[0074] Em alguns aspectos, também são fornecidos métodos para avaliar uma sequência de transgene não integrada residual. Em algu- mas modalidades, os métodos envolvem a execução de etapas de qualquer um dos métodos, incluindo o isolamento de ácido desoxirri- bonucleico (DNA) de uma célula que foi introduzida com um polinucle- otídeo compreendendo uma sequência de transgene sob condições para integração em um genoma da célula e a separação de uma fra- ção de peso molecular superior ou superior a cerca de 10 quilobases (kb) do DNA isolado; determinar o número de cópias da sequência de transgene na fração de alto peso molecular, avaliando assim a inte- gração genômica de uma sequência de transgene.
[0075] Em alguns aspectos, os métodos também envolvem a de- terminação do número de cópias da sequência de transgene no DNA isolado sem separar a fração de alto peso molecular, determinando assim o número total de cópias das sequências de transgene. Em al- guns aspectos, os métodos envolvem determinar o número de cópias da sequência residual não integrada do transgene subtraindo o núme- ro de cópias determinado avaliando a fração de alto peso molecular do número de cópias determinado avaliando o DNA isolado total (tal como sem separar frações) . Em alguns aspectos, os métodos envolvem de- terminar a proporção da sequência de transgene não integrada residu- al dividindo o número de cópias determinado avaliando a fração de alto peso molecular do número de cópias determinado pelo número de cópias determinado avaliando o DNA isolado total (tal como sem sepa- rar frações). Em algumas modalidades, a sequência de transgene não integrada residual compreende um ou mais plasmídeos de vetor, DNA complementar linear (cDNA), autointegrantes ou círculos de repetição terminal longa (LTR). A. Separação da Fração de Alto Peso Molecular
[0076] Em alguns aspectos, as modalidades fornecidas envolvem a separação de ácidos nucleicos, como ácido desoxirribonucleico (DNA) obtido de células modificadas, com base em seu peso molecu- lar ou tamanho. Em alguns aspectos, o método também compreende separar ou isolar moléculas de DNA que se enquadram em uma faixa de tamanho ou peso molecular. Em alguns aspectos, tipos particulares de sequências de transgene integradas ou sequências de transgene não integradas podem ter uma faixa típica de tamanho ou peso mole- cular. Em alguns aspectos, um determinado tamanho ou intervalo de peso molecular pode ser usado para separar ou isolar moléculas de DNA com tamanhos ou peso molecular dentro dessa faixa. Em alguns aspectos, a presença, ausência ou quantidade das sequências de transgene dentro de um determinado tamanho ou faixa de peso mole- cular.
[0077] Em algumas modalidades, uma fração de alto peso molecu- lar, por exemplo, contendo moléculas de DNA que são maiores do que um valor limite ou dentro de um tamanho ou faixa de peso molecular, é separada ou isolada. Em algumas modalidades, a fração de alto pe- so molecular contém principalmente moléculas de DNA grandes, como DNA cromossômico ou genômico, e contém moléculas baixas ou qua- se nenhuma que são menores do que o valor limite para o tamanho, como plasmídeos, fragmentos de DNA não integrados, complementa- res lineares DNA (cDNA), autointegrantes, círculos de repetição termi- nal longa (LTR) ou outras espécies ou moléculas residuais que não foram integradas ao genoma. Em algumas modalidades, a fração de alto peso molecular contém principalmente moléculas de DNA gran- des, como DNA cromossômico ou genômico, e são livres de moléculas que são menores do que o valor limite para tamanho, como plasmí- deos, fragmentos de DNA não integrados, DNA complementar linear ( cDNA), autointegrantes, círculos de repetição terminal longa (LTR) ou outras espécies ou moléculas residuais que não foram integradas no genoma. Em algumas modalidades, ao determinar a presença, ausên- cia ou quantidade das sequências de transgene na fração de alto peso molecular, as sequências de transgene detectadas representam aque- las que foram integradas no genoma da célula modificada e minimizam a detecção de sequências de transgene não integradas.
[0078] Em algumas modalidades, a fração de alto peso molecular compreende moléculas de DNA que são maiores ou maiores do que cerca de 10 quilobases (kb) de tamanho. Em algumas modalidades, a fração de alto peso molecular compreende moléculas de DNA que são maiores ou maiores do que cerca de 10, 11, 12, 12,5, 13, 14, 15, 16, 17, 17,5, 18, 19, 20, 25 ou 30 quilobases (kb) ou mais em tamanho. Em algumas modalidades, a fração de alto peso molecular compreen- de moléculas de DNA que são maiores ou maiores que cerca de 10,
12,5, 15, 17,5 ou 20 quilobases (kb) ou mais em tamanho. Em alguns aspectos, a fração de alto peso molecular contém DNA genômico ou fragmentos de DNA genômico e exclui ou separa espécies de ácido nucleico não integradas ou residuais que podem estar presentes na amostra de DNA. Em alguns aspectos, a fração de alto peso molecu- lar, por exemplo, amostras de DNA que estão acima de um valor limi- te, como cerca de 10, 11, 12, 12,5, 13, 14, 15, 16, 17, 17,5, 18, 19, 20, 25 ou 30 quilobases (kb) ou mais. Em algumas modalidades, o valor limite é maior ou maior que cerca de 10, 12,5, 15, 17,5 ou 20 quiloba- ses (kb) ou mais. Em algumas modalidades, a fração de alto peso mo- lecular é maior ou maior do que cerca de 15 quilobases (kb). Em al- gumas modalidades, a fração de alto peso molecular é maior ou maior que cerca de 17,5 quilobases (kb). Em algumas modalidades, a fração de alto peso molecular é maior ou maior do que cerca de 20 quiloba- ses (kb).
[0079] Em alguns aspectos, o valor limite é cerca de ou igual ou superior a 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 ou 4 vezes o tamanho do polinucleotí- deo introduzido. Por exemplo, em alguns aspectos, se o polinucleotí- deo introduzido contendo as sequências de transgene é igual ou cerca de 10 kb, o valor limite pode ser igual ou superior a 20 kb, aproxima- damente duas vezes o tamanho do polinucleotídeo introduzido. Em alguns aspectos, usar o valor limite para separar a fração de alto peso molecular, sequências não integradas, como DNA complementar linear (cDNA), autointegrantes, círculos de repetição terminal longa (LTR) ou outras espécies ou moléculas residuais de baixo peso molecular que não sido integrado no genoma, pode ser separado das espécies de alto peso molecular.
[0080] Em alguns aspectos, a fração de alto peso molecular con- tém principalmente moléculas de DNA que são maiores do que as mo- léculas de DNA não integradas e/ou residuais que podem estar pre-
sentes no processo de fabricação e/ou na célula modificada, antes ou depois conclusão da integração das sequências de transgene. Em al- guns aspectos, em virtude da determinação da presença, ausência e/ou quantidade das sequências de transgene na fração de alto peso molecular, o número de cópias de sequências integradas pode ser de- terminado com precisão, sem incluir o número de cópias de núcleos não integrados ou moléculas residuais de ácido contendo as sequên- cias de transgene na esferagem. Em alguns casos, a inclusão do nú- mero de cópias de moléculas de ácido nucleico não integradas ou re- siduais contendo as sequências de transgene pode resultar em supe- restimação ou determinação imprecisa do número de cópias. Em al- guns aspectos, particularmente durante os estágios iniciais do proces- so de modificação ou fabricação ou em um processo que é um pro- cesso não expandido, ou um processo encurtado, a presença de mo- léculas não integradas ou residuais pode afetar o número de cópias determinado.
[0081] Em algumas modalidades, o método compreende separar ou isolar uma fração de baixo peso molecular, por exemplo, contendo moléculas de DNA que são menores do que um valor limite. Em algu- mas modalidades, a fração de baixo peso molecular pode conter mo- léculas de DNA que são menores do que o valor limite para tamanho, como plasmídeos, fragmentos de DNA não integrados, DNA comple- mentar linear (cDNA), autointegrantes, círculos de repetição terminal longa (LTR) ou outras espécies ou moléculas residuais que não foram integradas ao genoma. Em alguns aspectos, a presença, ausência ou quantidade das sequências de transgene na fração de baixo peso mo- lecular pode ser determinada. Em alguns casos, a presença, ausência e/ou quantidade de moléculas de DNA não integradas ou residuais pode precisar ser determinada em vários estágios de fabricação ou engenharia, como para determinar o processo de modificação e/ou para avaliar o número de cópias de ácidos nucleicos residuais, tais como vetores residuais usados para introduzir as sequências de trans- gene nas células.
[0082] Em algumas modalidades, a fração de baixo peso molecu- lar compreende moléculas de DNA com tamanho menor ou menor que cerca de 20 quilobases (kb). Em algumas modalidades, a fração de alto peso molecular compreende moléculas de DNA que são menores ou menores do que cerca de 20, 19, 18, 17,5, 17, 16, 15, 14, 13, 12,5, 12, 11 ou 10 quilobases (kb) ou menos em tamanho.
[0083] Em algumas modalidades, a fração de alto ou baixo peso molecular pode ser separada ou isolada usando métodos com base em eletroforese, microfluídica ou cromatografia. Em algumas modali- dades, a fração de alto peso molecular pode ser separada ou isolada usando eletroforese em gel de campo de pulso (PFGE) ou cromatogra- fia de exclusão de tamanho.
[0084] Em algumas modalidades, a fração de alto peso molecular é separada ou isolada usando eletroforese em gel de campo de pulso (PFGE). Em alguns aspectos, o PFGE envolve a introdução de um gradiente de voltagem alternada em um sistema de eletroforese para melhorar a resolução de moléculas de ácido nucleico maiores, como o DNA cromossômico ou genômico. Em alguns aspectos, a voltagem do sistema de eletroforese é alternada periodicamente entre três dire- ções: uma que passa pelo eixo central do gel e duas que fazem um ângulo de 60 graus em cada lado. Em alguns aspectos, sistemas e métodos exemplares para separar ou isolar moléculas de ácido nuclei- co por PFGE incluem aqueles descritos, por exemplo, na US 9599590, US 2017/0240882, ou US 2017/0254774.
[0085] Em algumas modalidades, a fração de alto peso molecular é separada ou isolada usando um método com base em eletroforese. Em alguns aspectos, a eletroforese separa biomoléculas por carga e/ou tamanho por meio de mobilidade através de uma matriz de sepa- ração na presença de um campo elétrico. Em algumas modalidades, os sistemas de eletroforese podem ser usados para fracionar, analisar e coletar analitos específicos, incluindo moléculas de ácido nucleico, com base no tamanho ou peso molecular. Em alguns aspectos, uma fração é ou inclui um subconjunto da pluralidade de moléculas. Em al- guns aspectos, uma fração pode ser definida ou determinada pelo ta- manho ou peso molecular, ou em alguns aspectos, por qualquer pro- priedade física que faça com que ela migre a uma taxa mais rápida ou mais lenta do que outras moléculas ou frações de uma pluralidade quando conduzida para migrar através uma composição tampão da invenção pela força de um campo elétrico (ou seja, mobilidade ele- troforética).
[0086] Em alguns aspectos, a eletroforese, como PFGE, pode ser realizada usando um aparelho ou sistema. Em alguns aspectos, o apa- relho ou sistema é um sistema automatizado ou sistema de alto rendi- mento. Sistemas exemplares para realizar PFGE incluem aqueles descritos, por exemplo, em US 9599590; US 2017/0240882; ou US 2017/0254774, ou aparelho ou sistema comercialmente disponível, tal como Pippin Prep, Blue Pippin ou Pippin HT (Sage Science); Sistema CHEF Mapper® XA, Sistema de ângulo variável CHEF-DR® III, Siste- ma CHEF-DR II (Bio-Rad); e Biometra Rotaphor 8 System (Analytik Jena AG).
[0087] Em alguns aspectos, amostras exemplares para avaliação incluem um ácido nucleico, um oligonucleotídeo, uma molécula de DNA, uma molécula de RNA ou qualquer combinação dos mesmos. Em alguns aspectos, a amostra pode incluir um aminoácido, um peptí- deo, uma proteína ou qualquer combinação dos mesmos. Em alguns aspectos, a amostra pode ser um lisado de células inteiras, ou o DNA ou fração de proteína de um lisado de células, como lisado de células modificadas para terapia celular adotiva.
[0088] Em alguns aspectos, as modalidades fornecidas envolvem o isolamento, separação e análise de moléculas de ácido nucleico de células, como células modificadas para terapia celular adotiva. Em al- guns aspectos, as modalidades fornecidas envolvem o isolamento, se- paração e análise de moléculas de ácido nucleico de células passando por vários estágios ou etapas de um processo de modificação ou fabri- cação genética. Em alguns aspectos, a molécula de ácido nucleico in- clui a forma polimérica de éster de fosfato de ribonucleosídeos (ade- nosina, guanosina, uridina ou citidina; "RNA") ou desoxirribonucleosí- deos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina ou desoxiciti- dina; "DNA") ou quaisquer análogos de fosfoéster destes, tais como fosforotioatos e tioésteres, na forma de fita simples ou em hélice de fita dupla. Em alguns aspectos, a molécula de ácido nucleico e, em parti- cular, a molécula de DNA ou RNA, refere-se apenas à estrutura primá- ria e secundária da molécula e não a limita a quaisquer formas terciá- rias particulares. Em alguns aspectos, a molécula de ácido nucleico pode incluir DNA de fita dupla encontrado, em moléculas de DNA line- ares ou circulares (por exemplo, fragmentos de restrição), plasmídeos e cromossomos.
[0089] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos das amos- tras podem incluir DNA genômico, DNA de fita dupla (dsDNA), DNA de fita simples (ssDNA), DNA codificador (ou DNA complementar, cDNA), RNA mensageiro (mRNA), curto RNA interferente (siRNA), RNA em gancho curto (shRNA), microRNA (miRNA), RNA de fita simples, RNA de fita dupla (dsRNA), um morfolino, molécula de RNA de interferência (RNAi), ácido nucleico mitocondrial, ácido nucleico de cloroplasto, DNA viral, RNA viral e outras organelas com material genético separa- do. Em alguns aspectos, os ácidos nucleicos da amostra também po- dem incluir análogos de ácido nucleico que contêm nucleotídeos ou elementos estruturais modificados, sintéticos ou não naturais ou outras químicas de ácido nucleico alternativas/modificadas, como análogos de base, como inosina, intercaladores (Patente Norte-americana No.
4.835.263) e ligantes de sulcos menores (Patente Norte-americana No. 5.801.115).
[0090] Em algumas modalidades, antes de isolar ou separar uma fração de alto ou baixo peso molecular, as amostras podem ser com- binadas com um reagente que transmite uma carga negativa líquida, desnatura um peptídeo ou proteína ou digere uma molécula de DNA ou RNA antes da avaliação em um sistema de eletroforese. Em alguns aspectos, as amostras podem ser combinadas com agentes que con- ferem propriedades fluorescentes, magnéticas ou radioativas à amos- tra ou frações da mesma para fins de detecção. Em alguns exemplos, uma amostra de dsDNA é misturada com brometo de etídio, aplicada ao cassete de eletroforese e frações da amostra são detectadas usan- do um LED verde ultrabrilhante.
[0091] Em alguns aspectos, um sistema para separar ou isolar as amostras de ácido nucleico, como um sistema de eletroforese, pode ser automatizado e/ou de alto rendimento. Em alguns aspectos, o sis- tema de eletroforese pode utilizar consumíveis ou reagentes descartá- veis, como um cassete de eletroforese. B. Determinar a presença, ausência ou quantidade de ácidos nu- cléicos
[0092] Em alguns aspectos, os métodos envolvem a determinação da presença, ausência ou quantidade de uma sequência de transgene em uma amostra, tal como uma amostra contendo ácido desoxirribo- nucleico (DNA) de uma ou mais células, tal como uma população de células que inclui células modificadas. Em alguns aspectos, os méto- dos envolvem determinar a presença, ausência ou quantidade de uma sequência de transgene em uma amostra, como uma amostra conten-
do DNA de uma ou mais células passando por um ou mais estágios ou etapas de fabricação ou modificação genética. Em alguns aspectos, a determinação da presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene pode ser realizada usando métodos para determinar a pre- sença, ausência ou quantidade de uma sequência de ácido nucleico, por exemplo, sequência particular de DNA. Em particular, os métodos usados para quantificar as sequências de ácido nucleico, como reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) ou métodos relaciona- dos, podem ser empregados na determinação do número de cópias da sequência de transgene em uma amostra contendo DNA, ou em uma fração particular, como a fração de alto peso molecular, que é separa- da ou isolada de amostras contendo DNA. Em algumas modalidades, a determinação da presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene compreende determinar o número de cópias, por exem- plo, usando qualquer um dos ensaios exemplares descritos abaixo pa- ra quantificar as moléculas de ácido nucleico.
[0093] Em alguns aspectos, a presença, ausência e/ou quantidade de uma sequência particular pode ser detectada usando uma sonda ou um iniciador, que pode ligar ou reconhecer especificamente toda ou uma porção da sequência de transgene. Em algumas modalidades, o número de cópias pode ser determinado usando sondas que podem detectar especificamente uma porção da sequência de transgene, ou sequências de iniciador que podem amplificar especificamente uma porção da sequência de transgene. Em alguns aspectos, as sequên- cias de sonda ou iniciador podem detectar, ligar ou reconhecer especi- ficamente uma porção da sequência de transgene, como uma porção da sequência de transgene que é heteróloga, exógena ou transgênica para a célula. Em alguns aspectos, a sonda ou iniciador as sequências podem detectar, ligar ou reconhecer especificamente uma parte da sequência de transgene, como uma parte da sequência de transgene que deve ser ou que está integrada no genoma da célula. Em algumas modalidades, os iniciadores ou sondas usados para qPCR ou outros métodos com base em ácido nucleico são específicos para a ligação, reconhecimento e/ou amplificação de ácidos nucleicos que codificam a proteína recombinante e/ou outros componentes ou elementos do plasmídeo e/ou vetor, incluindo elementos reguladores, por exemplo, promotores, elementos reguladores transcricionais e/ou pós- transcricionais ou elementos de resposta, ou marcadores, por exem- plo, marcadores substitutos. Em algumas modalidades, os iniciadores ou sondas podem se ligar a sequências de ácido nucleico que codifi- cam a proteína recombinante e/ou outros componentes ou elementos, tais como elementos reguladores, incluindo elementos reguladores pós-transcricionais. Em algumas das modalidades, um ou mais inicia- dores são complementares ou são capazes de amplificar especifica- mente sequências de um elemento regulador, por exemplo, um ele- mento regulador operacionalmente ligado à sequência de ácido nuclei- co que codifica a proteína recombinante. Em alguns aspectos, as son- das ou iniciadores podem ser usados para métodos exemplares para determinar a presença, ausência e/ou quantidade de sequências de transgene, tais como PCR quantitativo (qPCR), PCR digital (dPCR) ou PCR digital de gotícula (ddPCR).
[0094] Em alguns aspectos, a determinação da presença, ausên- cia ou quantidade compreende determinar a quantidade da sequência de transgene, tal como determinar a massa, peso, concentração ou número de cópias das sequências de transgene, em uma ou mais cé- lulas ou em uma amostra biológica contendo uma ou mais células. Em alguns aspectos, a determinação da presença, ausência ou quantida- de de uma sequência de ácido nucleico, ou avaliação da massa, peso, concentração ou número de cópias das sequências de transgene pode ser realizada em uma porção de uma população de células ou em uma porção de uma amostra biológica e pode ser normalizada, calculada a média e/ou extrapolada para determinar a presença, ausência ou quantidade em toda a amostra ou população inteira de células. Em al- guns aspectos, a quantidade de sequência de transgene pode incluir a massa, peso, concentração ou número de cópias da sequência de transgene. Em alguns aspectos, a massa, peso, concentração ou nú- mero de cópias é uma massa, peso, concentração ou número médio de cópias. Em alguns aspectos, a massa, peso, concentração ou nú- mero de cópias é uma massa média, peso, concentração ou número de cópias por unidade, tal como por célula, por genoma diploide, por volume, por massa ou equivalente, ou normalizado de outra forma, ex- trapolado ou calculado para ser por unidade.
[0095] Em algumas modalidades, a determinação da presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene compreende de- terminar a massa, peso, concentração ou número de cópias da se- quência de transgene por genoma diploide ou por célula em uma ou mais células. Em algumas modalidades, uma ou mais células compre- endem uma população de células em que uma pluralidade de células da população compreende a sequência de transgene que codifica a proteína recombinante. Em algumas das modalidades fornecidas, as referidas uma ou mais células compreende uma população de células em que uma pluralidade de células da população é suspeita de com- preender a sequência de transgene que inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína recombinante, por exemplo, um re- combinante receptor. Em algumas modalidades, o número de cópias é um número médio ou média de cópias por genoma diploide ou por cé- lula entre a população de células.
[0096] Em alguns aspectos, determinar o número de cópias com- preende determinar o número de cópias das sequências de transgene presentes em uma ou mais células, ou em uma amostra biológica. Em alguns aspectos, o número de cópias pode ser expresso como um número médio ou média de cópias. Em alguns aspectos, o número de cópias de um transgene integrado particular inclui o número de inte- grantes (contendo sequências de transgene) por célula. Em alguns aspectos, o número de cópias de um transgene integrado particular inclui o número de integrantes (contendo sequências de transgene) por genoma diploide. Em alguns aspectos, o número de cópias da se- quência de transgene é expresso como o número de sequências de transgene integradas por célula. Em alguns aspectos, o número de cópias da sequência de transgene é expresso como o número de se- quências de transgene integradas por um tipo particular de célula, por exemplo, por célula que expressa um marcador fenotípico particular ou por célula que expressa a proteína recombinante codificada pelo transgene introduzido. Em alguns aspectos, o número de cópias da sequência de transgene é expresso como o número de sequências de transgene integradas por genoma diploide. Em alguns aspectos, uma ou mais células compreendem uma população de células em que uma pluralidade de células da população compreende a sequência de transgene que codifica a proteína recombinante. Em algumas modali- dades, o número de cópias é um número médio ou média de cópias por genoma diploide ou por célula entre a população de células.
[0097] Em algumas modalidades, a determinação da quantidade de sequência de transgene compreende avaliar a massa, peso, con- centração ou número de cópias da sequência de transgene por massa ou peso do DNA isolado de uma ou mais células. Em alguns aspectos, a massa, peso, concentração ou número de cópias da sequência de transgene é expresso por micrograma de DNA isolado de uma ou mais células, por exemplo, uma ou mais células em uma amostra biológica obtida de um indivíduo ou em uma ou mais células que estão em pro- cesso de modificação. Em algumas modalidades, a determinação da quantidade de sequência de transgene compreende avaliar a massa ou o peso da sequência de transgene em micrograma, por micrograma de DNA isolado de uma ou mais células.
[0098] Em algumas modalidades, a determinação da quantidade de sequência de transgene compreende avaliar a massa, peso, con- centração ou número de cópias da sequência de transgene por uma ou mais células, opcionalmente por célula CD3+, CD4+ e/ou CD8+, e/ou por célula que expressa a proteína recombinante. Em algumas modalidades, a determinação da quantidade de sequência de transge- ne compreende avaliar a massa, peso, concentração ou número de cópias da sequência de transgene por uma ou mais células, opcional- mente por células que expressam um marcador fenotípico particular, por exemplo, opcionalmente por CD3+, Célula CD4+ e/ou CD8+, por célula viável, célula negativa para caspase ativada (por exemplo, aCas3-) ou célula CD45+ e/ou por célula que expressa a proteína re- combinante. Em alguns aspectos, os marcadores de superfície ou fe- nótipos expressos na célula podem ser determinados usando métodos com base em células, tal como por citometria de fluxo ou imunocolora- ção. Em alguns aspectos, as células que expressam a proteína re- combinante podem ser determinadas usando métodos com base em células, tal como por citometria de fluxo ou imunocoloração. Em alguns aspectos, a quantidade de sequências de transgene pode ser normali- zada para o número de células particulares, tal como células CD3+, CD4+ e/ou CD8+ e/ou por célula que expressa a proteína recombinan- te, ou por número total de células, como por número total de células na amostra ou por número total de células passando por um processo de modificação. Em alguns aspectos, a quantidade de sequências de transgene pode ser normalizada para o número de células particula- res, como células que expressam um marcador fenotípico particular, por exemplo, células CD3+, CD4+ e/ou CD8+, células viáveis, células negativas para caspase ativada (por exemplo, aCas3-) ou células CD45+ e/ou por célula que expressa a proteína recombinante (por exemplo, por célula que expressa CAR), ou por número total de célu- las, tal como por número total de células na amostra ou por número total de células submetidas um processo de modificação.
[0099] Em algumas modalidades, a determinação da presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene compreende ava- liar a massa, peso, concentração ou número de cópias da sequência de transgene por genoma diploide ou por célula na amostra biológica. Em algumas modalidades, o número de cópias é um número médio ou média de cópias por genoma diploide ou por célula entre uma ou mais células na amostra biológica.
[00100] Em algumas modalidades, a determinação da quantidade de sequência de transgene compreende avaliar a massa, peso, con- centração ou número de cópias da sequência de transgene por volume da amostra biológica, opcionalmente por microlitro ou por mililitro da amostra biológica.
[00101] Em algumas modalidades, a determinação da quantidade de sequência de transgene compreende avaliar a massa, peso, con- centração ou número de cópias da sequência de transgene por peso corporal ou área de superfície corporal do indivíduo.
[00102] Em algumas modalidades, a determinação da quantidade de sequência de transgene compreende avaliar a massa, peso, con- centração ou número de cópias da sequência de transgene na fração de alto peso molecular e normalizar a massa, peso, concentração ou número de cópias para a massa , peso, concentração ou número de cópias de um gene de referência na fração de alto peso molecular ou para uma curva padrão, tal como uma curva padrão com base em amostras contendo uma quantidade conhecida, concentração, massa, peso, concentração ou número de cópias de sequências de transgene.
[00103] Em algumas modalidades, o número de cópias determinado é expresso como um valor normalizado. Em algumas modalidades, o número de cópias determinado é quantificado como um número de cópias da sequência de transgene por genoma ou por célula. Em al- guns aspectos, o valor por genoma é expresso como uma cópia da sequência de transgene por genoma diploide, pois uma célula somáti- ca típica, tal como uma célula T, contém um genoma diploide. Em al- guns aspectos, o número de cópias determinado pode ser normalizado em relação ao número de cópias de um gene de referência conhecido no genoma da célula. Em alguns aspectos, o gene de referência é RRP30 (codificando a subunidade da proteína P da ribonuclease p30), 18S rRNA (18S RNA ribossômico), 28S rRNA (28S RNA ribossômico), TUBA (α-tubulina), ACTB (β-actina), β2M ( β2-microglobulina), ALB (albumina), RPL32 (proteína ribossomal L32), TBP (proteína de liga- ção à sequência TATA), CYCC (ciclofilina C), EF1A (fator de alonga- mento 1α), GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase), HPRT ( hipoxantina fosforibosil transferase) ou RPII (RNA polimerase II). Em algumas modalidades, o número de cópias determinado é quantificado como cópia da sequência de transgene por micrograma de DNA.
[00104] Em alguns aspectos, o número de cópias é um número médio, médio ou mediancopia de uma pluralidade ou população de células, como uma pluralidade ou população de células modificadas. Em alguns aspectos, o número de cópias é um número médio ou mé- dia de cópias de uma pluralidade ou população de células, tal como uma pluralidade ou população de células modificadas. Em alguns as- pectos, o número médio ou média de cópias é determinado a partir de uma pluralidade ou população de células, tal como uma pluralidade ou população de células passando por uma ou mais etapas do processo de modificação ou fabricação, ou em uma composição celular, tal co- mo uma composição celular para administração a um indivíduo. Em alguns aspectos, um número médio de cópias normalizado é determi- nado, por exemplo, como um número médio de cópias ou média das sequências de transgene normalizadas para um gene de referência, como um gene conhecido que está presente em duas cópias em um genoma diploide. Em alguns aspectos, a normalização para um gene de referência que está tipicamente presente em duas cópias por ge- noma diploide, pode corresponder ao número de cópias em uma célu- la, como uma célula diploide. Assim, em alguns aspectos, a média normalizada ou o número médio de cópias pode corresponder ao nú- mero médio de cópias ou média das sequências de transgene detec- tadas entre uma pluralidade ou uma população de células, por exem- plo, células T que normalmente têm um genoma diploide.
[00105] Em algumas modalidades, a determinação da presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene é realizada por reação em cadeia da polimerase (PCR). Em algumas modalidades, a PCR é a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), PCR digital ou PCR digital de gotículas, tal como qualquer um descrito abai- xo. Em algumas modalidades, a presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene é determinada por PCR digital de gotículas. Em algumas modalidades, a PCR é realizada usando um ou mais ini- ciadores que são complementares ou são capazes de amplificar espe- cificamente pelo menos uma porção da sequência de transgene e, em alguns casos, um ou mais iniciadores que são complementares ou ca- pazes de amplificar especificamente pelo menos uma porção de um gene de referência.
[00106] Em alguns aspectos, a presença, ausência e/ou quantidade das sequências de transgene determinadas em uma ou mais das fra- ções e/ou em uma amostra particular, tal como o DNA total isolado de uma pluralidade ou população de células modificadas, pode ser usada como uma base para calcular razões ou proporções de interesse parti-
culares, como a proporção ou número de moléculas não integradas ou residuais, por exemplo, conforme descrito na Seção IC abaixo.
1. PCR Quantitativa (qPCR)
[00107] Em algumas modalidades, a presença, ausência ou quanti- dade das sequências de transgene, tais como sequências de transge- ne que codificam uma proteína recombinante, para integração no ge- noma da célula modificada, é determinada pela reação de cadeia da polimerase quantitativa (qPCR; em alguns casos, também conhecido como PCR em tempo real).
[00108] Em alguns aspectos, qPCR pode ser usado para detectar o acúmulo de produto de amplificação medido conforme a reação pro- gride, em tempo real, com quantificação do produto após cada ciclo. Desse modo, em alguns aspectos, qPCR pode ser usado para deter- minar o número de cópias de uma sequência de ácido nucleico parti- cular, como a sequência de transgene, em uma amostra. Em alguns aspectos, qPCR emprega molécula repórter fluorescente em cada ca- vidade de reação que produz fluorescência aumentada com uma quantidade crescente de DNA do produto. Em alguns aspectos, as químicas de fluorescência empregadas incluem corantes de ligação a DNA e iniciadores ou sondas específicas para sequências marcadas com fluorescência. Em alguns aspectos, qPCR emprega um termoci- clador especializado com a capacidade de iluminar cada amostra em um comprimento de onda especificado e detectar a fluorescência emi- tida pelo fluoróforo excitado. Em alguns aspectos, a fluorescência me- dida é proporcional à quantidade total de amplicon; a mudança na fluo- rescência ao longo do tempo é usada para calcular a quantidade de amplicon produzida em cada ciclo.
[00109] Em alguns aspectos, qPCR permite a determinação do nú- mero inicial de cópias de um determinado DNA (sequência alvo de amplificação, por exemplo, uma sequência de transgene que codifica uma proteína recombinante) com precisão e alta sensibilidade em uma ampla faixa dinâmica. Em alguns aspectos, qPCR pode gerar resulta- dos que são qualitativos (a presença ou ausência de uma sequência) ou quantitativos (número de cópias).
2. PCR digital (dPCR)
[00110] Em algumas modalidades, a presença, ausência ou quanti- dade das sequências de transgene, como sequências de transgene que codificam uma proteína recombinante, para integração no genoma da célula modificada, é determinada usando a reação em cadeia de polimerase digital (dPCR). Em alguns aspectos, a dPCR permite a de- terminação da presença, ausência ou quantidade de uma sequência particular, tal como a sequência de transgene, com alta precisão e sensibilidade.
[00111] Em algumas modalidades, dPCR é um método para detec- tar e quantificar ácidos nucleicos e permite uma análise quantitativa precisa e a detecção altamente sensível de uma molécula de ácido nucleico alvo. Em alguns aspectos, dPCR envolve uma diluição limi- tante de DNA em uma sucessão de reações de PCR individuais (ou partições). Em alguns aspectos, a diluição limitada pode empregar os princípios de partição com nanofluídicos e químicas de emulsão, com base na distribuição aleatória do ácido nucleico modelo a ser avaliado, por exemplo, sequências de transgene e estatísticas de Poisson para medir as quantidades de DNA presentes para uma determinada pro- porção de partições positivas. Em alguns aspectos, a dPCR é geral- mente linear e sensível, capaz de detectar ou quantificar quantidades muito pequenas de DNA. Em alguns aspectos, a dPCR permite a quantificação absoluta de uma amostra de DNA usando um método de esferagem de molécula única sem uma curva padrão, e a quantifica- ção absoluta pode ser obtida a partir de PCR para uma única partição por cavidade (ver Pohl et al., (2004) Expert Rev. Mol. Diagn. 4 (1), 41-
47).
[00112] Em alguns aspectos, os métodos de dPCR podem ser usa- dos para gerar uma pluralidade de partições, como milhares de parti- ções, para realizar uma pluralidade de reações de PCR individuais em paralelo. Em alguns aspectos, uma amostra é particionada de modo que as moléculas de ácido nucleico individuais dentro da amostra se- jam localizadas e concentradas em muitas regiões separadas. Placas de microcavidades, capilares, micro ou nanofluídicos, emulsão de óleo, química de emulsão e/ou matrizes de câmaras miniaturizadas com superfícies de ligação de ácido nucleico podem ser usadas para particionar as amostras. Composições exemplares para realizar dPCR podem incluir ácido nucleico modelo (por exemplo, DNA isolado de células modificadas), sondas inibidoras de fluorescência, iniciadores e uma mistura principal de PCR, que contém DNA polimerase, dNTPs, MgCl2 e tampões de reação em concentrações ideais. A solução de PCR é dividida em reações menores e são então feitas para executar a PCR individualmente. O particionamento da amostra permite estimar o número de moléculas diferentes, assumindo que a população de mo- léculas segue a distribuição de Poisson, o que explica a possibilidade de múltiplas moléculas alvo habitarem uma única partição.
[00113] Em alguns aspectos, dPCR envolve a análise dos resulta- dos por um método digital (porque o sinal resultante tem um valor bi- nário: "0" ou "1"). Em alguns aspectos, o dPCR pode ser usado para analisar um grande volume, analisar várias amostras ao mesmo tempo e várias avaliações podem ser realizadas ao mesmo tempo. Em al- guns aspectos, para PCR digital, cada partição compreendendo um modelo de sequência de amostra (por exemplo, potencialmente con- tendo uma sequência de transgene que codifica uma proteína recom- binante) preparada de modo a ser diluída para um número médio de cópias da sequência é 0,5-1. A diluição é importante para obter resul-
tados confiáveis de quantificação, para sinais que aparecem em uma distribuição de Poisson. Em cada cavidade, os iniciadores de amplifi- cação específicos para a sequência testada (por exemplo, uma porção das sequências de transgene) e uma sonda fluorescente são dispen- sados e a PCR de emulsão é realizada. Em alguns aspectos, uma ca- vidade exibindo um sinal fluorescente é esferado como um valor de "1", porque uma amostra com um número de cópia de sequência de 1 é distribuída para a cavidade e mostra o sinal após a amplificação, e uma cavidade sem sinal é esferada como "0", porque uma amostra que não contém uma cópia da sequência é dispensada na cavidade e não mostra nenhum sinal devido à não amplificação. Usando a lei dos pequenos números de Poisson, a distribuição da molécula alvo dentro da amostra pode ser aproximada com precisão, permitindo uma quan- tificação absoluta das sequências alvo no produto de PCR.
[00114] Aparelhos ou sistemas exemplares comercialmente dispo- níveis para dPCR incluem Raindrop™ Digital PCR System (Raindan- ce™ Technologies); Sistema de PCR QX200™ Droplet Digital™ (Bio- Rad); BioMark™ HD System e qdPCR 37K™ IFC (Fluidigm Corpora- tion) e QuantStudio™ 3D Digital PCR System (Life Technologies™) (ver, por exemplo, Huggett et al. (2013) Clinical Chemistry 59: 1691– 1693; Shuga, et al. (2013) Nucleic Acids Research 41 (16): e159; Wha- leet al. (2013) PLoS One 3: e58177).
3. PCR digital de gota (ddPCR)
[00115] Em algumas modalidades, a presença, ausência ou quanti- dade das sequências de transgene, como sequências de transgene que codificam uma proteína recombinante, para integração no genoma da célula modificada, é determinada usando reação em cadeia da po- limerase digital de gotículas (ddPCR). ddPCR é um tipo de PCR digi- tal, no qual a solução de PCR é dividida ou particionada em reações menores através de uma emulsão química de água-óleo, para gerar várias gotas. Em alguns aspectos, tensoativos específicos podem ser usados para gerar as gotículas de água em óleo. (ver, por exemplo, Hindson et al., (2011) Anal Chem 83 (22): 8604–8610; Pinheiro et al., (2012) Anal Chem 84, 1003–1011). Em alguns aspectos, cada gota individual é subsequentemente executada como reação individual. Em alguns aspectos, a amostra de PCR é particionada em amostras de tamanho de nanolitro e encapsulada em gotículas de óleo. Em alguns aspectos, as gotículas de óleo são executadas usando um gerador de gotículas que aplica vácuo a cada uma das cavidades. Em um caso exemplar, aproximadamente 20.000 gotículas de óleo para reações individuais podem ser feitas a partir de um volume de amostra de 20 μL.
[00116] Em alguns aspectos, após a PCR, cada gota é analisada ou lida para determinar a fração de gotas positivas para PCR (por exem- plo, binário "0" ou "1" atribuído em cada gota com base no sinal de flu- orescência) na amostra original. Os dados são então analisados usando estatísticas de Poisson para determinar a concentração da se- quência de DNA alvo na amostra original. A distribuição de Poisson das cópias da molécula alvo por gotícula (CPD) pode ser determinada com base na fração de gotículas fluorescentes (p), representada pela função CPD = -ln (1-p). Este modelo pode prever que conforme o nú- mero de amostras contendo pelo menos uma molécula alvo aumenta, a probabilidade das amostras contendo mais de uma molécula alvo aumenta. C. Aplicações exemplares
[00117] Em alguns aspectos, os métodos fornecidos podem ser usados para avaliar células modificadas e composições celulares con- tendo células modificadas, para uma variedade de aplicações para avaliar a integração de sequências de ácido nucleico e/ou caracteriza- ção de células modificadas. Por exemplo, os métodos podem ser usa-
dos após a modificação, antes da formulação, antes da administração e/ou administração e/ou em vários estágios e/ou pontos do tempo do processo de modificação ou fabricação, para caracterizar a integração de ácidos nucleicos, como a sequência de transgenes e/ou células modificadas. Em algumas modalidades, os métodos podem ser usa- dos em composições de células contendo uma ou mais células modifi- cadas.
[00118] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos podem ser realizados em um ou mais estágios ou pontos do tempo durante o processo de fabricação, incluindo antes que as células modificadas ou composições celulares contendo as células modificadas sejam libera- das para infusão, prontas para administração a um indivíduo, e/ou ad- ministradas a um indivíduo. Em algumas modalidades, células modifi- cadas ou composições de células são liberadas para infusão, prontas para administração a um indivíduo e/ou administradas a um indivíduo após a avaliação de um ou mais dos métodos fornecidos terem sido realizados, por exemplo, em uma porção, fração e/ou amostra de célu- las modificadas ou composições de células. Em modalidades particula- res, as células modificadas ou composições celulares são liberadas para infusão, prontas para administração a um indivíduo e/ou adminis- tradas a um indivíduo após as células serem determinadas como se- guras, por exemplo, estéreis e/ou livres e/ou têm características bioló- gicas desejadas após a conclusão de um ou mais métodos, tais como conter menos do que ou mais do que um número de cópias limite ne- cessário de sequências de transgene integradas.
[00119] Em alguns aspectos, o polinucleotídeo contendo sequên- cias de transgene é introduzido na célula usando vários métodos de liberação, como transdução viral. Em algumas modalidades, as células modificadas, tais como células modificadas para terapia de células adotivas, devem ser monitoradas ou avaliadas quanto a várias carac-
terísticas e recursos, tais como determinar o nível de expressão da proteína recombinante codificada pelas sequências de transgene, e/ou determinar o número de cópias das sequências de transgene que são integradas ao genoma da célula, como integrado de forma estável no genoma da célula. Em alguns aspectos, tal avaliação pode ser realiza- da em um ou mais pontos do tempo durante o processo de modifica- ção ou fabricação.
[00120] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos podem ser usados para avaliar ou determinar os parâmetros farmacocinéticos e/ou biodisponibilidade de células modificadas após a administração da célula modificada ou composição celular a um indivíduo, tal como um indivíduo com uma doença ou condição para terapia. Em alguns aspectos, os métodos fornecidos podem ser usados como um proxy para caracterizar a persistência, expansão e/ou número de células modificadas, como células modificadas introduzidas com uma sequên- cia de transgene que codifica uma proteína recombinante, como um receptor recombinante.
[00121] Em alguns aspectos, descritos abaixo são aplicações exemplares dos métodos fornecidos. Em alguns aspectos, variações dos métodos e/ou combinação com outros métodos para avaliar ou caracterizar as células modificadas ou composições de células modifi- cadas também podem ser usadas para determinar os aspectos e ca- racterísticas das células modificadas para terapia celular.
1. Avaliação da integração de sequências de transgene
[00122] Em alguns aspectos, são fornecidos métodos para avaliar a integração genômica de sequências de transgene, como sequências de transgene que codificam uma proteína recombinante, como um re- ceptor recombinante. Em alguns aspectos, os métodos fornecidos po- dem ser usados para avaliar o tempo, extensão ou progressão da in- tegração de sequências de transgene em um genoma da célula, após a introdução de um polinucleotídeo compreendendo sequências de transgene sob condições para integração em uma célula, por exemplo, para modificação genética. Em algumas modalidades, em alguns as- pectos, os métodos fornecidos podem ser usados para avaliar o tem- po, extensão ou progressão da integração das sequências de transge- ne em um genoma da célula, após a introdução de um polinucleotídeo compreendendo sequências de transgene sob condições para integra- ção em uma célula, durante ou após uma ou mais etapas ou estágios do processo de modificação ou fabricação. Em alguns aspectos, o número de cópias avaliado de sequências de transgene integradas é um número médio de cópias de sequências de transgene integradas em uma pluralidade ou uma população de células.
[00123] Em algumas modalidades, os métodos envolvem: (a) sepa- rar uma fração de alto peso molecular de ácido desoxirribonucléico (DNA) maior ou maior que cerca de 10 quilobases (kb) do DNA isolado de uma ou mais células, as referidas uma ou mais células compreen- dem, ou suspeita-se que compreendam, pelo menos uma célula modi- ficada compreendendo uma sequência de transgene que inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante; (b) da fração de alto peso molecular, determinar a presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene integrada no genoma de uma ou mais células. Em algumas modalidades, as sequências de transgene na fração de alto peso molecular representam as sequên- cias de transgene que foram integradas no genoma de uma ou mais células.
[00124] Em algumas modalidades, os métodos envolvem (a) sepa- rar uma fração de alto peso molecular de ácido desoxirribonucléico (DNA) maior ou maior que cerca de 10 quilobases (kb) do DNA isolado de uma ou mais células, o referido um ou mais célula compreendendo, ou suspeita de compreender, pelo menos uma célula modificada com-
preendendo uma sequência de transgene que compreende uma se- quência de ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante; e (b) determinar a presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene na fração de alto peso molecular, avaliando assim as se- quências de transgene integradas no genoma de uma ou mais células.
[00125] Em algumas das modalidades, as sequências de transgene na fração de alto peso molecular representam as sequências de trans- gene que foram integradas no genoma de uma ou mais células. Em algumas das modalidades fornecidas, a determinação da presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene integrada no ge- noma de uma ou mais células em (b) compreende a determinação da massa, peso ou número de cópias da sequência de transgene na fra- ção de alto peso molecular.
[00126] Também são fornecidos aqui métodos para avaliar a inte- gração genômica de uma sequência de transgene. Em algumas das modalidades, os métodos envolvem: (a) separar, por eletroforese em gel de campo de pulso, uma fração de alto peso molecular de ácido desoxirribonucleico (DNA) maior ou superior a cerca de 10 quilobases (kb) de DNA isolado de uma população de células, a referida popula- ção de células compreendendo uma pluralidade de células modifica- das em que cada uma compreende, ou é suspeita de compreender, uma sequência de transgene que compreende uma sequência de áci- do nucleico que codifica uma proteína recombinante; e (b) determinar o número médio de cópias ou média por genoma diploide ou por célula da sequência da sequência de transgene na fração de alto peso mole- cular, avaliando assim as sequências de transgene integradas no ge- noma da pluralidade de células modificadas da população de células.
[00127] Também são fornecidos aqui métodos para avaliar a inte- gração genômica de uma sequência de transgene. Em algumas das modalidades, os métodos envolvem: (a) separar, por eletroforese em gel de campo de pulso, uma fração de alto peso molecular de ácido desoxirribonucleico (DNA) maior ou superior a cerca de 10 quilobases (kb) de DNA isolado de uma população de células, a referida popula- ção de células compreendendo uma pluralidade de células modifica- das em que cada uma compreende, ou é suspeita de compreender, uma sequência de transgene que compreende uma sequência de áci- do nucleico que codifica uma proteína recombinante; e (b) da fração de alto peso molecular, determinar o número médio de cópias ou mé- dia por genoma diploide ou por célula da sequência de transgene inte- grada no genoma da pluralidade de células modificadas da população de células.
[00128] Em alguns aspectos, o número de cópias de sequências de ácido nucleico integradas pode ser determinado avaliando o número de cópias de uma sequência de ácido nucleico particular, tal como to- da ou uma parte das sequências de transgene, que estão presentes em uma fração de alto peso molecular de uma amostra de ácido deso- xirribonucleico (DNA) obtida de uma célula ou de uma pluralidade ou população de células. Em alguns aspectos, a fração de alto peso mo- lecular contém DNA genômico ou fragmentos de DNA genômico e ex- clui ou separa espécies de ácido nucleico não integradas ou residuais que podem estar presentes na amostra de DNA. Em alguns aspectos, a fração de alto peso molecular, por exemplo, amostras de DNA que estão acima de um valor limite, tal como cerca de 10, 11, 12, 12,5, 13, 14, 15, 16, 17, 17,5, 18, 19, 20, 25 ou 30 quilobases (kb) ou mais. Em algumas modalidades, o valor limite é maior ou maior que cerca de 10, 12,5, 15, 17,5 ou 20 quilobases (kb) ou mais. Em algumas modalida- des, a fração de alto peso molecular é maior ou maior do que cerca de 15 quilobases (kb). Em algumas modalidades, a fração de alto peso molecular é maior ou maior que cerca de 17,5 quilobases (kb). Em al- gumas modalidades, a fração de alto peso molecular é maior ou maior do que cerca de 20 quilobases (kb).
[00129] Em algumas modalidades, os métodos envolvem o isola- mento do ácido desoxirribonucleico (DNA) de uma célula que foi intro- duzida com um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de transgene sob condições para integração em um genoma da célula e a separação de uma fração de alto peso molecular de maior do que ou maior do que cerca de 10 quilobases (kb) do DNA isolado. Em algu- mas modalidades, os métodos envolvem a separação de uma fração de alto peso molecular maior ou superior a cerca de 10 quilobases (kb) do ácido desoxirribonucleico (DNA) isolado de uma célula, em que an- tes da separação, a célula foi introduzida com um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de transgene sob condições para in- tegração da sequência de transgene em um genoma da célula. Em alguns aspectos, os métodos fornecidos envolvem a determinação da presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene na fra- ção separada de alto peso molecular.
[00130] Em algumas modalidades, os métodos incluem o isolamen- to de ácido desoxirribonucleico (DNA) de uma célula que foi introduzi- da com um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de trans- gene sob condições para integração em um genoma da célula; separar uma fração de alto peso molecular maior ou maior que cerca de 10 quilobases (kb) do DNA isolado; e determinar a presença, ausência ou número de cópias da sequência de transgene na fração de alto peso molecular.
[00131] Em alguns aspectos, a fração de sequências de transgene integradas é determinada dividindo o número de cópias integradas (conforme determinado por ddPCR após PFGE, por exemplo, um en- saio de número de cópias de vetor integrado (iVCN) descrito neste do- cumento) pelo número de cópias total (como determinado por ddPCR sem PFGE, por exemplo, por um ensaio de número de cópia de vetor padrão (VCN)). Em alguns aspectos, outras medidas podem ser usa- das para comparação ou normalização, por exemplo, normalizadas para o número de cópias de um gene de referência, ou comparadas à expressão do receptor recombinante, conforme detectado por métodos para detectar a expressão da proteína, como em comparação com o número de células CAR+ em uma população avaliada por citometria de fluxo.
[00132] Em alguns aspectos, são fornecidos métodos para avaliar a integração genômica de sequências de transgene, tal como a sequên- cia de um transgene que codifica uma proteína recombinante, como um receptor recombinante. Em alguns aspectos, são fornecidos méto- dos para avaliar a integração genômica de sequências de transgene que contêm sequências de ácido nucleico que codificam uma proteína recombinante, como um receptor recombinante. Em alguns aspectos, são fornecidos métodos para avaliar a integração genômica de se- quências de transgene, como uma sequência de transgene que inclui elementos reguladores, por exemplo, promotores, elementos regulado- res transcricionais e/ou pós-transcricionais ou elementos de resposta ou marcadores, por exemplo, marcadores substitutos que estão liga- dos à sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína recombi- nante. Em algumas das modalidades, a sequência de transgene com- preende um elemento regulador ligado à sequência de ácido nucleico que codifica a proteína recombinante. Em alguns aspectos, os méto- dos fornecidos podem ser usados para avaliar o momento, a extensão ou o progresso da modificação genética, por exemplo, por integração de sequências de transgene em um genoma da célula, após a introdu- ção de um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de trans- gene sob condições para integração em uma célula, por exemplo, para modificação genética. Em alguns aspectos, o número de cópias avali- ado de sequências de transgene integradas é um número médio de cópias de sequências de transgene integradas em uma pluralidade ou uma população de células. Em algumas modalidades, a célula está presente em uma população de células que foram introduzidas com o polinucleotídeo codificando a sequência de transgene, em que o mé- todo é realizado em uma pluralidade de células na população.
[00133] Em alguns aspectos, os métodos fornecidos podem ser rea- lizados em vários pontos do tempo, etapas ou estágios ou usando vá- rias amostras diferentes para determinar e comparar o momento, a extensão ou o progresso da modificação genética, como a integração das sequências de transgene introduzidas no genoma da célula na qual as sequências de transgene são introduzidas. Em alguns aspec- tos, os métodos fornecidos podem ser usados para avaliar o tempo e a extensão da integração da sequência de transgene, por exemplo, por meio de um experimento de curso de tempo em que as amostras de DNA são obtidas em vários pontos do tempo após a introdução do po- linucleotídeo que codifica a sequência de transgene. Em alguns aspec- tos, os métodos podem ser realizados em vários estágios de um pro- cesso de modificação ou fabricação para composições de células mo- dificadas. Por exemplo, os métodos fornecidos podem ser realizados em vários estágios de um processo de modificação expandido ou um processo de modificação não expandido.
[00134] Em alguns aspectos, a introdução do polinucleotídeo é rea- lizada por qualquer um dos métodos aqui descritos, tais como aqueles descritos nas Seções II.C e II.D neste documento. Em alguns aspec- tos, a introdução do polinucleotídeo é realizada por transdução viral. Em alguns casos, a introdução do polinucleotídeo é realizada por um método de liberação física, opcionalmente por eletroporação.
[00135] Em alguns aspectos, os métodos podem ser usados para determinar o ponto de tempo em que a maioria ou substancialmente toda a integração é concluída. Em alguns aspectos, este ponto de tempo pode ser usado para avaliar o número de cópias integradas, por exemplo, de acordo com os métodos fornecidos neste documento, em uma composição de célula modificada, tal como uma composição de célula modificada para terapia celular adotiva. Em alguns aspectos, os métodos podem ser usados para determinar o ponto de tempo em que a maioria ou substancialmente toda a integração não foi concluída e/ou sequências residuais não integradas estão presentes nas células ou composição celular.
[00136] Em alguns aspectos, os métodos podem ser usados para determinar um tempo adequado de incubação da célula após a intro- dução dos polinucleotídeos que compreendem as sequências de transgene, em que a maioria ou substancialmente toda a integração é concluída. Em alguns aspectos, os métodos permitem a determinação do tempo adequado de incubação que pode maximizar a integração, mas reduz a exaustão das células modificadas. Em alguns aspectos, a célula ou população ou pluralidade de células não é incubada a uma temperatura superior a 25°C por mais de 48, 54, 60, 66 ou 72 horas após a introdução do polinucleotídeo compreendendo a sequência de transgene na célula. Em alguns aspectos, a célula não é incubada a uma temperatura superior a 25°C por mais de 72 horas após a intro- dução do polinucleotídeo que compreende a sequência de transgene na célula. Em alguns aspectos, a célula não é incubada a uma tempe- ratura superior a cerca de 30°C e inferior a cerca de 40°C por mais de 72 horas após a introdução do polinucleotídeo compreendendo a se- quência de transgene na célula.
[00137] Em algumas modalidades, a célula não é criopreservada após a introdução do polinucleotídeo e a determinação da presença, ausência e/ou quantidade das sequências de transgene.
[00138] Em alguns aspectos, são fornecidos métodos para avaliar a integração genômica de uma sequência de transgene que envolve a separação de uma fração de alto peso molecular maior ou maior que cerca de 10 quilobases (kb) de ácido desoxirribonucleico (DNA) isola- do de uma célula, em que antes da separação, a célula foi introduzida com um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de transgene sob condições para integração da sequência de transgene em um ge- noma da célula por transdução viral, e a célula não é incubada a uma temperatura superior a 25°C durante mais de 48, 54, 60, 66 ou 72 ho- ras após a introdução do polinucleotídeo compreendendo a sequência de transgene na célula; e determinar a presença, ausência ou quanti- dade de sequências de transgene na fração de alto peso molecular.
[00139] Em alguns aspectos, são fornecidos métodos para avaliar a integração genômica de uma sequência de transgene que envolve o isolamento do ácido desoxirribonucleico (DNA) de uma célula que foi introduzida com um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de transgene sob condições para integração em um genoma da célula por transdução viral, e a célula não é incubada a uma temperatura su- perior a 25°C por mais de 48, 54, 60, 66 ou 72 horas após a introdução do polinucleotídeo compreendendo a sequência de transgene na célu- la; separando um alto peso molecular fração em peso maior ou maior do que cerca de 10 quilobases (kb) do DNA isolado; e determinar a presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene na fra- ção de alto peso molecular.
2. Avaliação do número de DNA residual não integrado
[00140] Em alguns aspectos, também são fornecidos métodos para avaliar uma sequência de transgene não integrada residual. Em algu- mas modalidades, os métodos envolvem a execução de etapas de qualquer um dos métodos, incluindo o isolamento de ácido desoxirri- bonucleico (DNA) de uma célula que foi introduzida com um polinucle- otídeo compreendendo uma sequência de transgene sob condições para integração em um genoma da célula e a separação de um fração de alto peso molecular, tais como amostras de DNA acima de um valor limite aqui descrito, tal como maior ou maior que cerca de 10 quiloba- ses (kb), do DNA isolado; determinar a massa, peso, concentração ou número de cópias da sequência de transgene na fração de alto peso molecular, avaliando assim a integração genômica de uma sequência de transgene.
[00141] Em alguns aspectos, são fornecidos métodos para avaliar uma sequência de transgene não integrada residual. Em algumas mo- dalidades, os métodos envolvem realizar as etapas para determinar a presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene, con- forme descrito neste documento, para determinar a massa, peso, con- centração ou número de cópias das sequências de transgene na fra- ção de alto peso molecular do DNA. Em algumas modalidades, os mé- todos também envolvem a determinação da massa, peso, concentra- ção ou número de cópias da sequência de transgene no DNA isolado sem separar a fração de alto peso molecular, determinando assim o número total de cópias da sequência de transgene; Em algumas mo- dalidades, os métodos envolvem comparar a massa, peso, concentra- ção ou número de cópias determinado na fração de alto peso molecu- lar com massa, peso, concentração ou número de cópias determinado no DNA isolado total sem separar a fração de alto peso molecular, de- terminando assim a massa, peso, concentração ou número de cópias da sequência recombinante não integrada residual.
[00142] Em algumas modalidades, a comparação envolve subtrair a massa, peso, concentração ou número de cópias determinado para a fração de alto peso molecular da massa, peso, concentração ou núme- ro de cópias determinado sem separar a fração de alto peso molecu- lar. Em algumas modalidades, a comparação envolve determinar a ra- zão de massa, peso, concentração ou número de cópias determinado para a fração de alto peso molecular para massa, peso, concentração ou número de cópias determinado sem separar a fração de alto peso molecular.
[00143] Em algumas modalidades, a determinação do número de cópias sem separar o DNA de alto peso molecular é realizada por rea- ção em cadeia da polimerase (PCR), tal como qualquer aqui descrito, por exemplo, na Seção I.B. Em algumas modalidades, a determinação do número de cópias sem separar o DNA de alto peso molecular é realizada usando métodos descritos, por exemplo, em Charrier et al., Gene Therapy (2011) 18, 479-487; Christodoulou et al., Gene Therapy (2016) 23, 113–118; Zhao et al., Human Gene Therapy Methods (2017) 28 (4): 205-214; e Milone et al., Molecular Therapy: Methods & Clinical Development (2018) 8: 210-221. Em alguns aspectos, o núme- ro de cópias sem separar o DNA de alto peso molecular inclui ensaios de número de cópias de vetor padrão (VCN).
[00144] Em algumas modalidades, a PCR é a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), PCR digital ou PCR digital de gota. Em algumas modalidades, a PCR é PCR digital de gotículas. Em al- gumas modalidades, a PCR é realizada usando um ou mais iniciado- res que são complementares ou são capazes de amplificar especifi- camente pelo menos uma porção da sequência de transgene. Em al- gumas modalidades, um ou mais iniciadores são complementares ou capazes de amplificar especificamente toda ou uma porção das se- quências no transgene que é ou deve ser integrado no genoma. Em algumas modalidades, um ou mais iniciadores são complementares ou são capazes de amplificar especificamente uma porção da sequência de ácido nucleico que codifica a proteína recombinante. Em algumas modalidades, um ou mais iniciadores são complementares ou são ca- pazes de amplificar especificamente as sequências do elemento regu- lador que está operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico que codifica a proteína recombinante. Em algumas modalidades, um ou mais iniciadores são complementares ou são capazes de amplificar especificamente as sequências de um elemento regulador que está operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico que codifica a proteína recombinante. Em algumas modalidades, um ou mais inicia- dores são complementares ou são capazes de amplificar especifica- mente sequências de um elemento regulador pós-transcricional que está operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico que codi- fica a proteína recombinante. Em algumas modalidades, um ou mais iniciadores são complementares ou são capazes de amplificar especi- ficamente as sequências de um elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite da marmota (WPRE) que está operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico que codifica a proteína recombi- nante.
[00145] Em algumas modalidades, a determinação do número de cópias sem separar a fração de alto peso molecular compreende ava- liar o número de cópias da sequência de transgene no DNA isolado sem separar a fração de alto peso molecular e normalizar a quantida- de ou a concentração de um gene de referência no DNA isolado sem separar a fração de alto peso molecular ou a uma curva padrão, por exemplo, de um número de cópias conhecido. Em algumas modalida- des, o gene de referência é um gene de manutenção. Em algumas modalidades, o gene de referência é um gene que codifica albumina (ALB). Em algumas modalidades, o gene de referência é um gene que codifica a subunidade p30 da proteína P da ribonuclease (RPP30).
[00146] Em algumas modalidades, o número de cópias de um gene de referência no DNA isolado é realizado por PCR usando um ou mais iniciadores que são complementares ou são capazes de amplificar es- pecificamente pelo menos uma porção do gene de referência.
[00147] Em algumas modalidades, a determinação do número de cópias na fração de alto peso molecular e a determinação do número de cópias sem separar a fração de alto peso molecular é realizada por reação em cadeia da polimerase (PCR) usando o mesmo iniciador ou os mesmos conjuntos de iniciadores.
[00148] Em alguns aspectos, os métodos também envolvem deter- minar o número de cópias da sequência de transgene no DNA isolado sem separar a fração de alto peso molecular, determinando assim o número total de cópias das sequências de transgene. Em alguns as- pectos, os métodos envolvem determinar o número de cópias da se- quência residual não integrada do transgene subtraindo o número de cópias determinado avaliando a fração de alto peso molecular do nú- mero de cópias determinado avaliando o DNA isolado total (tal como sem separar frações). Em alguns aspectos, os métodos envolvem de- terminar a proporção da sequência de transgene não integrada residu- al dividindo o número de cópias determinado avaliando a fração de alto peso molecular do número de cópias determinado pelo número de cópias determinado avaliando o DNA isolado total (tal como sem sepa- rar frações). Em algumas modalidades, a sequência de transgene não integrada residual compreende um ou mais plasmídeos de vetor, DNA complementar linear (cDNA), autointegrantes ou círculos de repetição terminal longa (LTR).
[00149] Em alguns aspectos, a fração de sequências de transgene integradas pode ser determinada dividindo o número de cópias inte- gradas (conforme determinado por ddPCR após PFGE, por exemplo, um ensaio de número de cópias de vetor integrado (iVCN) descrito neste documento) pelo número de cópias total ( conforme determinado por ddPCR sem PFGE, por exemplo, por um ensaio de número de có- pia de vetor padrão (VCN)). Em algumas modalidades, a fração de se- quências de transgene não integradas pode ser determinada como 1 - (fração de sequências de transgene integradas). Em alguns aspectos, o número de cópias da sequência de transgene não integrado pode ser determinado subtraindo o número de cópias integradas do número total de cópias.
3. Avaliação da Quantidade de Sequências de Transgene em uma Amostra de células modificadas administradas em um Indivíduo
[00150] Em alguns aspectos, também são fornecidos métodos para avaliar a presença, ausência ou quantidade de sequências de trans- gene em uma amostra biológica de um indivíduo. Em alguns aspectos, o indivíduo foi administrado com células modificadas, por exemplo, cé- lulas imunes modificadas por introdução de polinucleotídeos contendo sequências de transgene nas células, por exemplo, para terapia celu- lar adotiva. Em alguns aspectos, os métodos envolvem o isolamento de ácido desoxirribonucleico (DNA) de uma amostra biológica de um indivíduo; separar uma fração de alto peso molecular maior ou maior que cerca de 10 quilobases (kb) do DNA isolado; e determinar a pre- sença, ausência ou quantidade de sequências de transgene na fração de alto peso molecular. Em alguns aspectos, a amostra biológica é ob- tida de um indivíduo ao qual foram administradas células modificadas compreendendo a sequência de transgene. Em alguns aspectos, a de- terminação da presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene compreende a determinação do número de cópias, tal como a determinação do número de cópias em uma amostra biológica obtida do indivíduo.
[00151] São fornecidos aqui métodos para avaliar uma sequência de transgene em uma amostra biológica de um indivíduo. Em algumas das modalidades, os métodos fornecidos envolvem: (a) separar uma fração de alto peso molecular de ácido desoxirribonucleico (DNA) mai- or ou maior que cerca de 10 quilobases (kb) do DNA isolado de uma ou mais células presentes em uma amostra de um indivíduo, em que a amostra biológica compreende, ou é suspeita de compreender, pelo menos uma célula modificada compreendendo uma sequência de transgene que inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante; e (b) determinar a presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene na fração de alto peso mole- cular, avaliando assim as sequências de transgene presentes em toda ou uma parte da amostra biológica.
[00152] É fornecido aqui um método para avaliar uma sequência de transgene em uma amostra biológica de um indivíduo, o método com- preendendo: (a) separar uma fração de alto peso molecular de ácido desoxirribonucleico (DNA) maior ou maior que cerca de 10 quilobases ( kb) de DNA isolado de uma ou mais células presentes em uma amostra biológica de um indivíduo, em que a amostra biológica com- preende, ou é suspeita de compreender, pelo menos uma célula modi- ficada compreendendo uma sequência de transgene que inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante ; e (b) determinar a presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene na fração de alto peso molecular, avaliando assim as se- quências de transgene presentes em toda ou uma parte da amostra biológica.
[00153] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos para ava- liar uma sequência de transgene em uma amostra biológica de um in- divíduo envolve a separação de uma fração de alto peso molecular de ácido desoxirribonucleico (DNA) maior ou superior a cerca de 10 qui- lobases (kb) de DNA isolado de uma ou mais células presentes em uma amostra biológica de um indivíduo, em que a amostra biológica compreende, ou se suspeita que compreenda, pelo menos uma célula modificada compreendendo uma sequência de transgene que codifica uma proteína recombinante; e determinar a presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene em toda ou uma parte da amostra biológica. Em algumas modalidades, antes da separação, um polinucleotídeo compreendendo a sequência de transgene que codifi-
ca a proteína recombinante foi introduzido em pelo menos uma célula modificada de uma ou mais células. Em algumas modalidades, a de- terminação da presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene compreende determinar a massa, peso, concentração ou número de cópias da sequência de transgene em toda ou uma parte da amostra biológica.
[00154] Em algumas modalidades, o método pode ser usado como base para determinar os parâmetros farmacocinéticos (PK) ou farma- codinâmicos (PD) das células administradas. Em alguns aspectos, os parâmetros PK ou PD podem ser medidos com base em um método à base de ácido nucleico, por exemplo, avaliando a presença, ausência ou quantidade de sequências de transgene, tal como de acordo com os métodos aqui fornecidos. Em alguns aspectos, os parâmetros PK e PD podem ser medidos com base na medição de propriedades ou fe- nótipos celulares, por exemplo, detectando a expressão de uma prote- ína recombinante na superfície das células ou fenótipos ou atividade da superfície celular. Em alguns aspectos, uma variedade de métodos pode ser usada, incluindo a combinação de métodos com base em ácido nucleico e métodos com base em células. Em algumas modali- dades, os métodos envolvem o isolamento do DNA de uma ou mais células presentes na amostra biológica antes da separação da fração de alto peso molecular.
[00155] Em algumas modalidades, a amostra biológica é obtida de um indivíduo ao qual foi administrada uma composição que compre- ende pelo menos uma célula modificada compreendendo a sequência de transgene. Em algumas modalidades, a amostra biológica é uma amostra de tecido ou amostra de fluido corporal, ou qualquer outra amostra obtida de um indivíduo aqui descrito. Em algumas modalida- des, a amostra biológica é uma amostra de tecido e o tecido é um tu- mor. Em algumas modalidades, a amostra de tecido é uma biópsia de tumor. Em algumas modalidades, a amostra biológica é uma amostra de fluido corporal e a amostra de fluido corporal é uma amostra de sangue ou soro.
[00156] Em algumas modalidades, uma ou mais células na amostra biológica compreendem uma célula imune, incluindo qualquer célula imune ou sua população aqui descrita. Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula T ou uma célula NK. Em algumas modali- dades, a célula T é uma célula T CD3+, CD4+ e/ou CD8+, ou qualquer célula que compreende um fenótipo particular.
[00157] Em alguns aspectos, qualquer um dos métodos para de- terminar a presença, ausência ou quantidade das sequências de transgene e qualquer um dos métodos de normalização ou quantifica- ção para determinar a massa, peso, concentração ou número de có- pias das sequências aqui descritas podem ser usados.
[00158] Em alguns aspectos, os métodos fornecidos podem ser usados como base para avaliar a exposição, número, concentração, persistência e proliferação das células T, por exemplo, células T admi- nistradas para a terapia com base em células T. Em algumas modali- dades, a exposição ou expansão prolongada e/ou persistência das cé- lulas e/ou alterações nos fenótipos celulares ou atividade funcional das células, por exemplo, células administradas para imunoterapia, por exemplo, terapia com células T, nos métodos aqui fornecidos, pode ser medida avaliando as características das células T in vitro ou ex vivo. Em algumas modalidades, tais ensaios podem ser usados para determinar ou confirmar a função das células T usadas para a imuno- terapia, por exemplo, terapia com células T, antes ou após a adminis- tração da terapia com células, tal como com células T modificadas que expressam um receptor recombinante.
[00159] Em alguns aspectos, a exposição, número, concentração, persistência e proliferação estão relacionados a parâmetros farmaco-
cinéticos. Em alguns casos, a farmacocinética pode ser avaliada me- dindo parâmetros como a concentração plasmática máxima (pico) (Cmax), o tempo de pico (ou seja, quando a concentração plasmática máxima (Cmax) ocorre; Tmax), a concentração plasmática mínima (ou seja, ou concentração plasmática mínima entre as doses de um agen- te terapêutico, por exemplo, células CAR+ T; Cmin), a meia-vida de eli- minação (T1/2) e a área sob a curva (ou seja, a área sob a curva ge- rada pelo gráfico de tempo versus concentração plasmática células modificadas do agente terapêutico; AUC), após a administração. A concentração de um agente terapêutico particular, por exemplo, célu- las modificadas, no plasma após a administração pode ser medida usando os métodos fornecidos. Por exemplo, em alguns aspectos, o número de cópias da sequência de transgene integrado pode ser ava- liado em amostras, como amostras de sangue de um indivíduo. Em alguns aspectos, outros métodos para determinar PK, tais como méto- dos com base em citometria de fluxo, ou outros ensaios, como um imunoensaio, ELISA ou ensaios com base em cromatogra- fia/espectrometria de massa podem ser usados em combinação ou em paralelo para determinar um ou mais farmacocinéticos parâmetros. Outros métodos para detectar e/ou extrapolar para o número total de células incluem aqueles descritos em Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5 (177), Park et al., Molecular Therapy 15 (4): 825-833 (2007), Savoldo et al., JCI 121 (5): 1822-1826 (2011), Davila et al., (2013) PLoS ONE 8 (4): e61338, Davila et al., Oncoimmunology 1 (9): 1577- 1583 (2012), Lamers, Blood 2011 117: 72-82, Jensen et al., Biol Blood Marrow Transplant, Setembro de 2010; 16 (9): 1245–1256, Brentjens et al., Blood 2011 118 (18): 4817-4828.
[00160] Em algumas modalidades, a farmacocinética (PK) das célu- las administradas, por exemplo, composição de células modificadas, é determinada para avaliar a disponibilidade, por exemplo, biodisponibi-
lidade, das células administradas.
Em algumas modalidades, "exposi- ção" pode se referir à exposição corporal de um agente terapêutico, por exemplo, células modificadas no plasma (sangue ou soro) após a administração do agente terapêutico ao longo de um determinado pe- ríodo de tempo.
Em algumas modalidades, a exposição pode ser esta- belecida como a área sob a curva de concentração-tempo do agente terapêutico (AUC), conforme determinado por análise farmacocinética após a administração de uma dose do agente terapêutico, por exem- plo, células modificadas.
Em alguns casos, a AUC é expressa em célu- las * dias/µL, para células administradas em terapia celular ou em uni- dades correspondentes das mesmas.
Em algumas modalidades, a AUC é medida como uma AUC média em uma população de pacien- tes, tal como uma amostra da população de pacientes, por exemplo, a AUC média de um ou mais pacientes.
Em algumas modalidades, a ex- posição sistêmica se refere à área sob a curva (AUC) dentro de um certo período de tempo, por exemplo, do dia 0 ao dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28 dias ou mais, ou semana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais, ou mês 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 24, 48 ou mais.
Em algumas modalidades, a AUC é medida como uma AUC do dia 0 ao dia 28 (AUC0-28) após a adminis- tração do agente terapêutico, por exemplo, células modificadas, inclu- indo todos os dados medidos e dados extrapolados dos parâmetros farmacocinéticos (PK) medidos, tais como uma AUC média de uma população de pacientes, como uma amostra da população de pacien- tes.
Em algumas modalidades, para determinar a exposição ao longo do tempo, por exemplo, AUC por um determinado período de tempo, como AUC0-28, uma curva de concentração de agente terapêutico- tempo é gerada, usando várias medições ou avaliação de parâmetros, por exemplo, concentrações de células, ao longo do tempo, por exem- plo, medições feitas a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
21 ou 28 dias ou mais.
[00161] Em algumas modalidades, a presença, ausência e/ou quan- tidade de sequências de transgene no indivíduo após a administração das células T e antes, durante e/ou após a administração da terapia é detectada. Em algumas modalidades, a presença, ausência e/ou quan- tidade de células que expressam o receptor recombinante (por exem- plo, células que expressam CAR administradas para terapia com base em células T) no indivíduo após a administração das células T e antes, durante e/ou após a administração da terapia ser detectada. Em al- guns aspectos, qualquer um dos métodos aqui descritos para avaliar a integração das sequências de transgene pode ser usado para avaliar a quantidade de células que expressam a proteína recombinante (por exemplo, células modificadas que expressam um receptor recombi- nante administrado para terapia com base em células T) no sangue ou amostra de soro ou órgão ou tecido (por exemplo, local da doença, por exemplo, amostra de tumor) do indivíduo. Em alguns aspectos, a per- sistência é quantificada como cópias de sequências de transgene inte- gradas por genoma diploide, por volume ou área da amostra, por exemplo, de sangue ou soro, por micrograma de DNA total, ou como o número de células modificadas (por exemplo, receptor recombinante expressando células) por microlitro da amostra, por exemplo, de san- gue ou soro, ou por número total de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou glóbulos brancos ou células T por microlitro da amostra.
[00162] Em algumas modalidades, os iniciadores ou sonda usados para qualquer um dos métodos fornecidos são específicos para a liga- ção, reconhecimento e/ou amplificação de ácidos nucleicos que codifi- cam o receptor recombinante e/ou outros componentes ou elementos do plasmídeo e/ou vetor, incluindo elementos reguladores, por exem- plo, promotores, elementos reguladores transcricionais e/ou pós-
transcricionais ou elementos de resposta, ou marcadores, por exem- plo, marcadores substitutos. Em algumas modalidades, os iniciadores podem ser específicos para elementos reguladores. Em algumas mo- dalidades, os iniciadores são específicos para um elemento regulador operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico que codifica a proteína recombinante. Em algumas modalidades, os iniciadores são específicos para amplificar a totalidade ou parte de um elemento regu- lador pós-transcricional do vírus da hepatite da marmota (WPRE) que está operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico que codi- fica a proteína recombinante, por exemplo, receptor recombinante.
[00163] Em algumas modalidades, as células sequenciais do trans- gene são detectadas no indivíduo em ou pelo menos 4, 14, 15, 27 ou 28 dias após a administração das células modificadas. Em alguns as- pectos, as células são detectadas em ou pelo menos em 2, 4 ou 6 se- manas após, ou 3, 6 ou 12, 18 ou 24, ou 30 ou 36 meses, ou 1, 2, 3, 4, 5 ou mais anos, após a administração das células modificadas.
[00164] Em algumas modalidades, os níveis de pico e/ou AUC são avaliados e/ou a amostra é obtida do indivíduo em um momento que é de pelo menos 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias , 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias ou 21 dias após o início da administração das células geneticamente modificadas. Em algumas modalidades, os níveis de pico e/ou AUC são avaliados e/ou a amostra é obtida do indivíduo em um momento que está entre ou entre cerca de 11 a 22 dias, 12 a 18 dias ou 14 a 16 dias, cada in- clusive, após início da administração das células geneticamente modi- ficadas.
[00165] A exposição, por exemplo, número ou concentração de cé- lulas modificadas administradas para terapia celular adotiva, indicativa de expansão e/ou persistência, pode ser declarada em termos de nú- mero máximo de cópias das sequências de transgene, ou número má-
ximo ou concentração de células ao qual o indivíduo é exposto, dura- ção de células detectáveis ou células acima de um certo número ou porcentagem, área sob a curva (AUC) para o número de cópias das sequências de transgene, número ou concentração de células ao lon- go do tempo e/ou combinações dos mesmos e indicadores disso. Tais resultados podem ser avaliados usando os métodos fornecidos para detectar o número de cópias de sequências de transgene que codifi- cam uma proteína recombinante em comparação com a quantidade total de ácido nucleico ou DNA na amostra particular, por exemplo, sangue, soro, plasma ou tecido, como uma amostra de tumor, e/ou ensaios de citometria de fluxo que detectam células que expressam o receptor geralmente usando anticorpos específicos para a proteína recombinante. Ensaios com base em células também podem ser usa- dos para detectar o número ou porcentagem ou concentração de célu- las funcionais, tais como células capazes de se ligar e/ou neutralizar e/ou induzir respostas, por exemplo, respostas citotóxicas, contra célu- las da doença ou condição ou expressar o antígeno reconhecido pela proteína recombinante que é um receptor recombinante.
[00166] Em alguns aspectos, o aumento da exposição do indivíduo às células inclui o aumento da expansão das células. Em algumas modalidades, células expressando o receptor, por exemplo, células que expressam CAR se expandem no indivíduo após a administração das células T, por exemplo, células T que expressam CAR.
[00167] Em algumas modalidades, as células que expressam o re- ceptor são detectáveis no soro, plasma, sangue ou tecido, por exem- plo, amostra de tumor, do indivíduo, por exemplo, pelos métodos for- necidos ou método de detecção com base em citometria de fluxo, pelo menos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 ou mais dias após a administração das células modificadas, por pelo menos pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou 24 ou mais semanas após a administração das células modificadas.
[00168] Em alguns aspectos, a massa, peso, concentração ou nú- mero de cópias de sequências de transgene integradas, por 100 célu- las, por exemplo no sangue periférico ou medula óssea ou outro com- partimento, conforme medido por qualquer um dos métodos descritos, podem estar em pelo menos 0,01, pelo menos 0,1, pelo menos 1 ou pelo menos 10, em cerca de 1 semana, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 5 semanas, ou pelo menos cerca de 6 semanas, ou pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses ou pelo menos 2 ou 3 anos após a administração das células modificadas. Em algumas modalidades, o número de cópias das sequências de transgene, por micrograma de DNA genômico, é de pelo menos 100, pelo menos 1000, pelo menos 5000 ou pelo menos
10.000, ou pelo menos 15.000 ou pelo menos 20.000 por vez cerca de 1 semana, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, ou pelo menos cerca de 4 semanas após a administração das células modificadas ou pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses ou pelo menos 2 ou 3 anos após tal administração.
[00169] Em alguns aspectos, as sequências de transgene introduzi- das nas células modificadas podem ser detectáveis pelos métodos descritos no indivíduo, plasma, soro, sangue, tecido e/ou local da do- ença, por exemplo, local do tumor, em um momento que é pelo menos cerca de 3 meses, pelo menos cerca de 6 meses, pelo menos cerca de 12 meses, pelo menos cerca de 1 ano, pelo menos cerca de 2 anos, pelo menos cerca de 3 anos, ou mais de 3 anos, após a admi- nistração das células, por exemplo, após o início da administração das células T. Em algumas modalidades, a área sob a curva (AUC) para concentração de células de proteína recombinante em um fluido,
plasma, soro, sangue, tecido, órgão e/ou local de doença, por exem- plo, local do tumor, do indivíduo ao longo do tempo após a administra- ção da célula modificada, é medida. II. MÉTODOS PARA INTRODUZIR UM POLINUCLEOTÍDEO COM-
PREENDENDO UMA SEQUÊNCIA DE TRANSGENE
[00170] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos para ava- liar os ácidos nucleicos integrados são usados ou realizados em cone- xão com células geneticamente modificadas, e em uma ou mais vezes durante um processo de modificação ou fabricação para gerar células geneticamente modificadas. Em alguns aspectos, a célula ou a plurali- dade de células para as quais os métodos fornecidos são implementa- dos ou realizados incluem células que foram geneticamente modifica- das ou estão em processo de modificação genética e podem ser usa- das em terapia celular, como terapia celular adotiva. Em algumas mo- dalidades, a célula ou pluralidade de células para as quais os métodos fornecidos são implementados ou realizados incluem células em várias etapas ou estágios de modificação. Em alguns aspectos, as células incluem células imunes, como células T, que foram modificadas para expressar uma proteína recombinante, tal como, por introdução de um polinucleotídeo contendo sequências de transgene que incluem se- quências que codificam a proteína recombinante. Em alguns aspectos, os métodos fornecidos são usados para avaliar a integração de tais sequências de transgene no genoma da célula modificada.
[00171] Em alguns aspectos, o processo de modificação ou fabrica- ção inclui uma ou mais etapas, incluindo estimulação, ativação, trans- dução, expansão, cultivo ou proliferação de células, incluindo células imunes, como células T. Em algumas modalidades, os métodos forne- cidos para avaliar os ácidos nucleicos integrados podem ser realizados como parte de um processo para gerar ou produzir células genetica- mente modificadas, como células T geneticamente modificadas.
[00172] Em alguns aspectos, as modalidades fornecidas são em- pregadas em um processo de modificação ou fabricação que é encur- tado, abreviado ou não inclui uma etapa de expansão, como o uso de um processo de fabricação não expandido. Em alguns aspectos, o processo de fabricação encurtado ou abreviado inclui uma etapa de expansão encurtada ou abreviada, ou não inclui uma etapa de expan- são, após a introdução dos ácidos nucleicos que codificam o receptor recombinante. Em alguns aspectos, o processo de fabricação encurta- do ou abreviado inclui processos nos quais as células não foram incu- badas a uma temperatura superior a 25 °C, opcionalmente a ou cerca de 37 °C ± 2 °C, durante mais de 96 horas após a introdução do poli- nucleotídeo compreendendo a sequência de transgene em pelo menos uma célula modificada.
[00173] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos são usa- dos em conexão com células que estão passando por uma ou mais etapas ou processos envolvidos na fabricação, geração ou produção de células ou composições celulares para uma terapia celular. Em al- guns aspectos, os métodos fornecidos podem ser usados para avaliar a integração de ácidos nucleicos, como sequências de transgene que são usadas para manipular as células. Em algumas modalidades, a terapia celular inclui a administração de células, como células T, modi- ficadas para expressar proteína recombinante, como um receptor re- combinante, por exemplo, um receptor de antígeno quimérico (CAR). Em algumas modalidades, uma ou mais etapas compreendem o iso- lamento, separação, seleção, ativação ou estimulação, transdução, cultivo, expansão, lavagem, suspensão, diluição, concentração e/ou formulação das células.
[00174] Em algumas modalidades, os métodos de geração ou pro- dução de uma terapia celular incluem isolar células de um indivíduo, preparar, processar, cultivar sob uma ou mais condições estimulantes.
Em algumas modalidades, o método inclui etapas de processamento realizadas em uma ordem na qual: células, por exemplo, células pri- márias, são primeiro isoladas, tais como, selecionadas ou separadas, de uma amostra biológica; as células selecionadas são incubadas com preparações virais para transdução (por exemplo, preparações virais contendo polinucleotídeos que incluem as sequências de transgene para integração), opcionalmente após uma etapa de estimulação das células isoladas na presença de um reagente de estimulação; cultivar as células transduzidas, de modo a expandir as células; formular as células transduzidas em uma composição e introduzir a composição em um recipiente de material biomédico.
[00175] Em algumas modalidades, os métodos de fabricação ou modificação podem incluir um ou mais de (a) lavar uma amostra bioló- gica contendo células (por exemplo, uma amostra de sangue total, uma amostra de leucocitose, uma amostra de células mononucleares de sangue periférico (PBMC), uma amostra de células T não fraciona- das, uma amostra de linfócitos, uma amostra de glóbulos brancos, um produto de aférese ou um produto de leucaferese), (b) isolar, por exemplo, selecionar, a partir da amostra, um subconjunto ou popula- ção desejada de células (por exemplo, células T CD4+ e/ou CD8+), por exemplo, por incubação de células com um reagente de seleção ou imunoafinidade para separação baseada em imunoafinidade; (c) introdução de um agente que codifica um receptor recombinante, por exemplo, um CAR, nas células isoladas ou selecionadas, tal como, incubando as células isoladas, tal como células selecionadas, com partículas de vetor viral que codificam o receptor recombinante, (d) cul- tura, cultivo ou expansão das células, usando métodos conforme des- crito e (e) formular as células transduzidas, tal como, em um tampão farmaceuticamente aceitável, criopreservativo ou outro meio adequa- do. Em algumas modalidades, os métodos podem incluir ainda (f) es-
timular células expondo as células a condições de estimulação, que podem ser realizadas antes, durante e/ou após a incubação de células com partículas de vetor viral. Em algumas modalidades, uma ou mais etapas adicionais de lavagem ou suspensão, tais como, diluição, con- centração e/ou permuta de tampão de células, também podem ser rea- lizadas antes ou após qualquer uma das etapas acima. Em alguns as- pectos, a composição de células modificadas resultante é introduzida em um ou mais recipientes de cultura biomédica.
[00176] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos para pre- parar ou produzir células geneticamente modificadas são realizados de modo que uma, mais ou todas as etapas na preparação de células pa- ra uso clínico, por exemplo, em terapia celular adotiva, sejam realiza- das sem expor as células a condições não estéreis e sem a necessi- dade de usar uma sala ou gabinete estéril. Em algumas modalidades de tal processo, as células são isoladas, separadas ou selecionadas, transduzidas, lavadas, opcionalmente ativadas ou estimuladas e for- muladas, tudo dentro de um sistema fechado. Em alguns aspectos de tal processo, as células são expressas a partir de um sistema fechado e introduzidas em um ou mais vasos de biomateriais. Em algumas modalidades, os métodos são realizados de forma automatizada. Em algumas modalidades, uma ou mais das etapas são realizadas sepa- radamente do sistema fechado ou dispositivo.
[00177] Em algumas modalidades, um sistema fechado é usado para realizar uma ou mais das outras etapas de processamento de um método para a fabricação, geração ou produção de uma terapia celu- lar. Em algumas modalidades, uma ou mais ou todas as etapas de processamento, por exemplo, isolamento, seleção e/ou enriquecimen- to, processamento, incubação em conexão com transdução e modifi- cação, e as etapas de formulação são realizadas usando um sistema, dispositivo ou aparato em um sistema integrado ou autônomo e/ou de forma automatizada ou programável. Em alguns aspectos, o sistema ou aparato inclui um computador e/ou programa de computador em comunicação com o sistema ou aparato, o que permite que um usuário programe, controle, avalie o resultado e/ou ajuste vários aspectos do processamento, isolamento, modificação e etapas de formulação. Em um exemplo, o sistema é um sistema como descrito em WO2009/072003, US 20110003380 ou WO2016/073602. A. Isolamento ou Seleção de Células
[00178] Em algumas modalidades, as células que são modificadas, como células ou composições de células que são avaliadas ou anali- sadas pelos métodos fornecidos, são células primárias. Em algumas modalidades, as células são células imunes ou células imunes enri- quecidas. Em algumas modalidades, as células são células T ou enri- quecidas com células T. Em algumas modalidades, as células a serem avaliadas ou analisadas usando os métodos fornecidos são células T ou enriquecidas com células T. Em algumas modalidades, as células são células T CD4+ ou células T CD4+ enriquecidas. Em algumas mo- dalidades, as células são células T CD8+ ou células T CD8+ enrique- cidas. Em algumas modalidades, o processo de fabricação, geração ou produção de uma terapia celular inclui uma etapa na qual células T totais, por exemplo, células T CD3+ ou CD4+/CD8+ são isoladas ou selecionadas a partir de uma amostra obtida de um indivíduo humano, antes de realizar as etapas subsequentes do processo.
[00179] Em algumas modalidades, o método de modificação ou fa- bricação inclui etapas para o isolamento de células ou composições das mesmas a partir de amostras biológicas, tais como aquelas obti- das ou derivadas de um indivíduo, tal como aquele que tem uma do- ença ou condição particular ou precisa de uma terapia celular ou à qual a terapia celular será administrada. Em alguns aspectos, o indiví- duo é um ser humano, como um indivíduo que precisa de uma inter-
venção terapêutica particular, como a terapia celular adotiva para a qual as células estão sendo isoladas, processadas e/ou modificadas. Consequentemente, as células em algumas modalidades são células primárias, por exemplo, células humanas primárias. Em algumas mo- dalidades, as células compreendem células T CD4+ e CD8+. Em al- gumas modalidades, as células compreendem células T CD4+ ou CD8+. As amostras incluem tecido, fluido e outras amostras retiradas diretamente do indivíduo. A amostra biológica pode ser uma amostra obtida diretamente de uma fonte biológica ou uma amostra que é pro- cessada. As amostras biológicas incluem, porém, não estão limitadas a, fluidos corporais, como sangue, plasma, soro, fluido cerebrospinal, fluido sinovial, urina e suor, amostras de tecido e órgãos, incluindo amostras processadas derivadas dos mesmos.
[00180] Em alguns aspectos, a amostra é sangue ou uma amostra derivada de sangue, ou é ou é derivada de um produto de aférese ou leucaferese. Amostras exemplares incluem sangue total, células mo- nonucleares de sangue periférico (PBMCs), leucócitos, medula óssea, timo, biópsia de tecido, tumor, leucemia, linfoma, nódulo linfático, teci- do linfóide associado ao intestino, tecido linfoide associado à mucosa, baço, outros tecidos linfoides, fígado, pulmão, estômago, intestino, có- lon, rim, pâncreas, mama, osso, próstata, colo do útero, testículos, ovários, amígdalas ou outro órgão e/ou células derivadas deles. As amostras incluem, no contexto da terapia celular, por exemplo, terapia celular adotiva, amostras de fontes autólogas e alogênicas.
[00181] Em alguns exemplos, as células do sangue circulante de um indivíduo são obtidas, por exemplo, por aférese ou leucaferese. As amostras, em alguns aspectos, contêm linfócitos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outros glóbulos brancos nucleados, glóbulos vermelhos e/ou plaquetas, e em alguns aspectos contém cé- lulas diferentes de glóbulos vermelhos e plaquetas.
[00182] Em algumas modalidades, as células sanguíneas coletadas do indivíduo são lavadas, por exemplo, para remover a fração de plasma e para colocar as células em um tampão ou meio apropriado para as etapas de processamento subsequentes. Em algumas modali- dades, as células são lavadas com solução salina tamponada com fos- fato (PBS). Em algumas modalidades, a solução de lavagem carece de cálcio e/ou magnésio e/ou muitos ou todos os cátions divalentes. Em alguns aspectos, uma etapa de lavagem é realizada em uma cen- trífuga de "fluxo direto" semiautomática (por exemplo, o processador de células Cobe 2991, Baxter) de acordo com as instruções do fabri- cante. Em alguns aspectos, uma etapa de lavagem é realizada por fil- tração de fluxo tangencial (TFF) de acordo com as instruções do fabri- cante. Em algumas modalidades, as células são ressuspensas em uma variedade de tampões biocompatíveis após a lavagem, como, por exemplo, PBS livre de Ca++/Mg++. Em certas modalidades, os com- ponentes de uma amostra de células sanguíneas são removidos e as células diretamente ressuspensas no meio de cultura.
[00183] Em algumas modalidades, os métodos de preparação in- cluem etapas para congelamento, por exemplo, criopreservação, das células, antes ou após o isolamento, seleção e/ou enriquecimento e/ou incubação para transdução e modificação. Em algumas modalidades, a etapa de congelamento e descongelamento subsequente remove granulócitos e, até certo ponto, monócitos na população de células. Em algumas modalidades, as células são suspensas em uma solução de congelamento, por exemplo, após uma etapa de lavagem para re- mover o plasma e as plaquetas. Qualquer uma de uma variedade de soluções e parâmetros de congelamento conhecidos em alguns aspec- tos pode ser usada. Isto é então diluído 1:1 com meio de modo que a concentração final de DMSO e HSA seja 10 % e 4 %, respectivamen- te. As células são geralmente congeladas a -80 °C a uma taxa de 1° por minuto e armazenadas na fase de vapor de um tanque de armaze- namento de nitrogênio líquido.
[00184] Em algumas modalidades, o isolamento das células ou po- pulações inclui uma ou mais etapas de preparação e/ou separação de células com base em não afinidade. Em alguns exemplos, as células são lavadas, centrifugadas e/ou incubadas na presença de um ou mais reagentes, por exemplo, para remover componentes indesejados, en- riquecer componentes desejados, lisar ou remover células sensíveis a reagentes específicos. Em alguns exemplos, as células são separadas com base em uma ou mais propriedades, como densidade, proprieda- des aderentes, tamanho, sensibilidade e/ou resistência a componentes específicos. Em algumas modalidades, os métodos incluem métodos de separação de células com base na densidade, como a preparação de glóbulos brancos a partir do sangue periférico por lise dos glóbulos vermelhos e centrifugação através de um gradiente de Percoll ou Fi- coll.
[00185] Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da eta- pa de seleção inclui a incubação de células com um reagente de sele- ção. A incubação com um reagente ou reagentes de seleção, por exemplo, como parte dos métodos de seleção que podem ser realiza- dos usando um ou mais reagentes de seleção para a seleção de um ou mais tipos de células diferentes com base na expressão ou presen- ça em ou sobre a célula de uma ou mais moléculas específicas, como marcadores de superfície, por exemplo, proteínas de superfície, mar- cadores intracelulares ou ácido nucleico. Em algumas modalidades, qualquer método conhecido usando um reagente ou reagentes de se- leção para separação com base em tais marcadores pode ser usado. Em algumas modalidades, o reagente ou reagentes de seleção resul- tam em uma separação que é baseada em afinidade ou imunoafinida- de. Por exemplo, a seleção em alguns aspectos inclui a incubação com um reagente ou reagentes para separação de células e popula- ções de células com base na expressão das células ou nível de ex- pressão de um ou mais marcadores, normalmente marcadores de su- perfície celular, por exemplo, por incubação com um anticorpo ou par- ceiro de ligação que se liga especificamente a tais marcadores, segui- do geralmente por etapas de lavagem e separação de células que se ligaram ao anticorpo ou parceiro de ligação, daquelas células que não se ligaram ao anticorpo ou parceiro de ligação. Em algumas modalida- des, a seleção e/ou outros aspectos do processo são descritos em WO 2015/164675.
[00186] Em alguns aspectos de tais processos, um volume de célu- las é misturado com uma quantidade de um reagente de seleção ba- seado em afinidade desejado. A seleção baseada em imunoafinidade pode ser realizada usando qualquer sistema ou método que resulte em uma interação energética favorável entre as células sendo separadas e a molécula que se liga especificamente ao marcador na célula, por exemplo, o anticorpo ou outro parceiro de ligação na superfície sólida, por exemplo, partícula. Em algumas modalidades, os métodos são realizados usando partículas, como esferas, por exemplo, esferas magnéticas, que são revestidas com um agente de seleção (por exemplo, anticorpo) específico para o marcador das células. As partí- culas (por exemplo, esferas) podem ser incubadas ou misturadas com células em um recipiente, como um tubo ou saco, enquanto agita ou mistura, com uma relação de densidade celular para partícula (por exemplo, esfera) constante para ajudar na promoção de interações energeticamente favorecidas. Em outros casos, os métodos incluem a seleção de células nas quais toda ou uma parte da seleção é realizada na cavidade interna de uma câmara centrífuga, por exemplo, sob rota- ção centrífuga. Em algumas modalidades, a incubação de células com reagentes de seleção, como reagentes de seleção com base em imu-
noafinidade, é realizada em uma câmara centrífuga. Em certas moda- lidades, o isolamento ou separação é realizado usando um sistema, dispositivo ou aparato descrito em WO2009/072003, US 20110003380 ou WO2016/073602.
[00187] Em algumas modalidades, conduzindo tais etapas de sele- ção ou porções das mesmas (por exemplo, incubação com partículas revestidas de anticorpo, por exemplo, esferas magnéticas) na cavida- de de uma câmara centrífuga, o usuário é capaz de controlar certos parâmetros, como o volume de várias soluções, adição de solução du- rante o processamento e tempo do mesmo, o que pode fornecer van- tagens em comparação com outros métodos disponíveis. Por exemplo, a capacidade de diminuir o volume de líquido na cavidade durante a incubação pode aumentar a concentração das partículas (por exemplo, reagente de esfera) usadas na seleção e, portanto, o potencial químico da solução, sem afetar o número total de células na cavidade. Isso, por sua vez, pode realçar as interações de pares entre as células que estão sendo processadas e as partículas usadas para seleção. Em algumas modalidades, a realização da etapa de incubação na câmara, por exemplo, quando associada aos sistemas, circuitos e controle co- mo aqui descritos, permite ao usuário efetuar a agitação da solução no (s) tempo (s) desejado (s) durante a incubação, que também pode me- lhorar a interação.
[00188] Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da eta- pa de seleção é realizada em uma câmara centrífuga, que inclui a in- cubação de células com um reagente de seleção. Em alguns aspectos de tais processos, um volume de células é misturado com uma quanti- dade de um reagente de seleção baseado em afinidade desejado que é muito menor do que o normalmente empregado ao realizar seleções similares em um tubo ou recipiente para a seleção do mesmo número de células e/ou volume de células de acordo com as instruções do fa-
bricante. Em algumas modalidades, uma quantidade de reagente ou reagente de seleção que é/são não mais que 5 %, não mais que 10 %, não mais que 15 %, não mais que 20 %, não mais que 25 %, não mais que 50 %, não mais que 60 %, não mais que 70 % ou não mais que 80 % da quantidade do (s) mesmo (s) reagente (s) de seleção emprega- dos para a seleção de células em um tubo ou incubação baseada em recipiente para o mesmo número de células e/ou o mesmo volume de células de acordo com as instruções do fabricante é empregada.
[00189] Em algumas modalidades, para seleção, por exemplo, se- leção baseada em imunoafinidade das células, as células são incuba- das na cavidade da câmara em uma composição que também contém o tampão de seleção com um reagente de seleção, como uma molécu- la que especificamente liga-se a um marcador de superfície em uma célula que se deseja enriquecer e/ou empobrecer, mas não em outras células na composição, como um anticorpo, que opcionalmente é aco- plado a uma estrutura como um polímero ou superfície, por exemplo, esfera, por exemplo, esfera magnética, como esferas magnéticas aco- pladas a anticorpos monoclonais específicos para CD4 e CD8. Em al- gumas modalidades, conforme descrito, o reagente de seleção é adi- cionado às células na cavidade da câmara em uma quantidade que é substancialmente menor que (por exemplo, não é mais que 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % ou 80 % da quantidade) em comparação com a quantidade do reagente de seleção que é tipica- mente usada ou seria necessário para atingir a mesma ou similar efici- ência de seleção do mesmo número de células ou o mesmo volume de células quando a seleção é realizada em um tubo com agitação ou ro- tação. Em algumas modalidades, a incubação é realizada com a adi- ção de um tampão de seleção às células e reagente de seleção para atingir um volume alvo com incubação do reagente de, por exemplo, 10 mL a 200 mL, tal como pelo menos ou cerca de pelo menos ou cer-
ca de 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 150 mL ou 200 mL. Em algumas modalidades, o tampão de seleção e o reagente de seleção são pré-misturados antes da adi- ção às células. Em algumas modalidades, o tampão de seleção e o reagente de seleção são adicionados separadamente às células. Em algumas modalidades, a incubação de seleção é realizada com condi- ção de mistura suave periódica, o que pode ajudar na promoção de interações energeticamente favorecidas e, assim, permitir o uso de menos reagente de seleção geral, ao mesmo tempo que atinge uma alta eficiência de seleção.
[00190] Em algumas modalidades, a duração total da incubação com o reagente de seleção é de ou cerca de 5 minutos a 6 horas, tal como 30 minutos a 3 horas, por exemplo, pelo menos ou cerca de pelo menos 30 minutos, 60 minutos, 120 minutos ou 180 minutos.
[00191] Em algumas modalidades, a incubação geralmente é reali- zada sob condições de mistura, como na presença de rotação, geral- mente a uma força ou velocidade relativamente baixa, como uma velo- cidade menor do que aquela usada para peletizar as células, como de ou de cerca de 600 rpm a 1700 rpm (por exemplo, a ou cerca de ou pelo menos 600 rpm, 1000 rpm ou 1500 rpm ou 1700 rpm), tal como em um RCF na amostra ou parede da câmara ou outro recipiente de ou de cerca de 80 g a 100 g (por exemplo, em ou cerca de ou pelo menos 80 g, 85 g, 90 g, 95 g ou 100 g). Em algumas modalidade, o giro é realizado usando intervalos repetidos de um giro em velocidade tão baixa seguido por um período de descanso, como um giro e/ou descanso durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 segundos, como um giro de aproximadamente 1 ou 2 segundos seguido por um descanso de aproximadamente 5, 6, 7 ou 8 segundos.
[00192] Em algumas modalidades, tal processo é realizado dentro do sistema totalmente fechado ao qual a câmara é parte integrante.
Em algumas modalidades, este processo (e em alguns aspectos tam- bém uma ou mais etapas adicionais, como uma etapa de lavagem an- terior lavando uma amostra contendo as células, como uma amostra de aférese) é realizado de forma automatizada, de modo que as célu- las, reagente e outros componentes sejam puxados para dentro e em- purrados para fora da câmara em momentos apropriados e centrifuga- ção efetuada, de modo a completar a etapa de lavagem e ligação em um único sistema fechado usando um programa automatizado.
[00193] Em algumas modalidades, após a incubação e/ou mistura das células e reagentes e/ou reagentes de seleção, as células incuba- das são submetidas a uma separação para selecionar células com ba- se na presença ou ausência do reagente ou reagentes particulares. Em algumas modalidades, a separação é realizada no mesmo sistema fechado em que a incubação de células com o reagente de seleção foi realizada. Em algumas modalidades, após a incubação com os rea- gentes de seleção, as células incubadas, incluindo células nas quais o reagente de seleção se ligou, são transferidas em um sistema para separação das células com base em imunoafinidade. Em algumas modalidades, o sistema para separação baseada em imunoafinidade é ou contém uma coluna de separação magnética.
[00194] Essas etapas de separação podem ser baseadas na sele- ção positiva, em que as células que se ligaram aos reagentes, por exemplo, anticorpo ou parceiro de ligação, são retidas para outro uso e/ou seleção negativa, em que as células que não se ligaram ao rea- gente, por exemplo, anticorpo ou parceiro de ligação, são retidas. Em alguns exemplos, ambas as frações são retidas para outro uso. Em alguns aspectos, a seleção negativa pode ser particularmente útil onde nenhum anticorpo está disponível que identifique especificamente um tipo de célula em uma população heterogênea, de modo que a sepa- ração seja melhor realizada com base em marcadores expressos por células diferentes da população desejada.
[00195] Em algumas modalidades, as etapas do processo ainda incluem a seleção negativa e/ou positiva das células incubadas, como o uso de um sistema ou aparato que pode realizar uma seleção base- ada em afinidade. Em algumas modalidades, o isolamento é realizado por enriquecimento para uma determinada população de células por seleção positiva ou depleção de uma determinada população de célu- las por seleção negativa. Em algumas modalidades, a seleção positiva ou negativa é realizada incubando células com um ou mais anticorpos ou outro agente de ligação que se ligam especificamente a um ou mais marcadores de superfície expressos ou expressos (marcador+) em um nível relativamente mais alto (marcadoralto) nas células positivamente ou negativamente selecionadas, respectivamente.
[00196] A separação não precisa resultar em 100 % de enriqueci- mento ou remoção de uma determinada população de células ou célu- las que expressam um determinado marcador. Por exemplo, a seleção positiva ou enriquecimento de células de um tipo particular, como aquelas que expressam um marcador, refere-se ao aumento do núme- ro ou porcentagem de tais células, mas não precisa resultar em uma ausência completa de células que não expressam o marcador. Da mesma forma, a seleção negativa, remoção ou esgotamento de célu- las de um tipo particular, como aquelas que expressam um marcador, refere-se à diminuição do número ou porcentagem de tais células, mas não precisa resultar na remoção completa de todas essas células.
[00197] Em alguns exemplos, múltiplas rodadas de etapas de sepa- ração são realizadas, onde a fração selecionada positiva ou negativa- mente de uma etapa é submetida a outra etapa de separação, como uma seleção positiva ou negativa subsequente. Em alguns exemplos, uma única etapa de separação pode esgotar células que expressam vários marcadores simultaneamente, como por meio da incubação de células com uma pluralidade de anticorpos ou parceiros de ligação, cada um específico para um marcador alvejado para seleção negativa. Da mesma forma, vários tipos de células podem ser simultaneamente selecionados positivamente incubando células com uma pluralidade de anticorpos ou parceiros de ligação expressos nos vários tipos de célu- las.
[00198] Por exemplo, em alguns aspectos, subpopulações específi- cas de células T, como células positivas ou que expressam níveis ele- vados de um ou mais marcadores de superfície, por exemplo, células CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, e/ou T CD45RO +, são isoladas por técnicas de seleção positiva ou negativa. Em algumas modalidades, tais células são selecionadas por incubação com um ou mais anticorpos ou parceiros de ligação que se ligam especificamente a tais marcadores. Em algumas modalidades, o anticorpo ou parceiro de ligação pode ser conjugado, como direta ou indiretamente, a um suporte sólido ou matriz para efetuar a seleção, como uma esfera magnética ou esfera paramagnética. Por exemplo, células T CD3+, CD28+ podem ser selecionadas positivamente usan- do esferas magnéticas conjugadas com anti-CD3/anti-CD28 (por exemplo, esfera DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander e/ou ExpACT®).
[00199] Em algumas modalidades, as células T são separadas de uma amostra de PBMC por seleção negativa de marcadores expres- sos em células não T, como células B, monócitos ou outros glóbulos brancos, como CD14. Em alguns aspectos, uma etapa de seleção CD4+ ou CD8+ é usada para separar células T auxiliares CD4+ e CD8+ citotóxicas. Tais populações CD4+ e CD8+ podem ser ainda classificadas em subpopulações por seleção positiva ou negativa para marcadores expressos ou expressos em um grau relativamente mais alto em uma ou mais subpopulações de células T ingênuas, de memó-
ria e/ou efetoras.
[00200] Em algumas modalidades, as células CD8+ são ainda enri- quecidas ou esgotadas de células-tronco ingênuas, de memória cen- tral, de memória efetora e/ou de memória central, como por seleção positiva ou negativa com base em antígenos de superfície associados à respectiva subpopulação. Em algumas modalidades, o enriqueci- mento para células T de memória central (TCM) é realizado para au- mentar a eficácia, como para melhorar a sobrevivência a longo prazo, expansão e/ou enxerto após a administração, o que em alguns aspec- tos é particularmente robusto em tais subpopulações. Veja Terakura et al., (2012) Blood.1: 72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 689-701. Em algumas modalidades, a combinação de células T CD4+ e células T CD8+ enriquecidas com TCM realça ainda mais a eficácia.
[00201] Em modalidades, as células T de memória estão presentes em ambos os subconjuntos CD62L+ e CD62L- de linfócitos de sangue periférico CD8+. PBMC pode ser enriquecido ou esgotado de frações CD62L-CD8+ e/ou CD62L+CD8+, como o uso de anticorpos anti-CD8 e anti-CD62L.
[00202] Em algumas modalidades, o enriquecimento para células T de memória central (TCM) é baseado na expressão de superfície posi- tiva ou alta de CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 e/ou CD 127; em alguns aspectos, é baseado na seleção negativa para células que ex- pressam ou expressam elevadamente CD45RA e/ou granzima B. Em alguns aspectos, o isolamento de uma população CD8+ enriquecida para células TCM é realizado pela depleção de células que expressam CD4, CD14, CD45RA, e seleção positiva ou enriquecimento para célu- las que expressam CD62L. Em um aspecto, o enriquecimento para células T de memória central (TCM) é realizado começando com uma fração negativa de células selecionadas com base na expressão de CD4, que é submetida a uma seleção negativa com base na expres-
são de CD14 e CD45RA, e uma seleção positiva com base em CD62L. Essas seleções em alguns aspectos são realizadas simultaneamente e em outros aspectos são realizadas sequencialmente, em qualquer or- dem. Em alguns aspectos, a mesma etapa de seleção baseada na ex- pressão de CD4 usada na preparação da população ou subpopulação de células CD8+ também é usada para gerar a população ou subpopu- lação de células CD4+, de modo que ambas as frações positivas e ne- gativas da separação baseada em CD4 são retidas e usadas em eta- pas subsequentes dos métodos, opcionalmente após uma ou mais etapas de seleção positiva ou negativa adicionais. Em algumas moda- lidades, a seleção para a população de células CD4+ e a seleção para a população de células CD8+ são realizadas simultaneamente. Em algumas modalidades, a população de células CD4+ e a seleção para a população de células CD8+ são realizadas sequencialmente, em qualquer ordem. Em algumas modalidades, os métodos para selecio- nar células podem incluir aqueles descritos no pedido publicado dos EUA. No. US20170037369. Em algumas modalidades, a população de células CD4+ selecionadas e a população de células CD8+ seleciona- das podem ser combinadas após a seleção. Em alguns aspectos, a população de células CD4+ selecionadas e a população de células CD8+ selecionadas podem ser combinadas em um recipiente, como um saco.
[00203] Em um exemplo particular, uma amostra de PBMCs ou ou- tra amostra de glóbulos brancos é submetida à seleção de células CD4+, onde ambas as frações negativa e positiva são retidas. A fração negativa é então submetida à seleção negativa com base na expres- são de CD14 e CD45RA ou CD19, e seleção positiva com base em um marcador característico de células T de memória central, como CD62L ou CCR7, onde as seleções positivas e negativas são realizadas em qualquer ordem.
[00204] As células T auxiliares CD4+ podem ser classificadas em células ingênuas, de memória central e efetoras por meio da identifica- ção de populações de células que possuem antígenos de superfície celular. Os linfócitos CD4+ podem ser obtidos por métodos padrão. Em algumas modalidades, os linfócitos T CD4+ ingênuos são células T CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ ou CD4+. Em algumas modalidades, as células CD4+ de memória central são CD62L+ e CD45RO+. Em algu- mas modalidades, as células efetoras CD4+ são CD62L- e CD45RO-.
[00205] Em um exemplo, para enriquecer células CD4+ por seleção negativa, um coquetel de anticorpos monoclonais tipicamente inclui anticorpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR e CD8. Em al- gumas modalidades, o anticorpo ou parceiro de ligação é ligado a um suporte ou matriz sólida, como uma esfera magnética ou esfera para- magnética, para permitir a separação de células para seleção positiva e/ou negativa. Por exemplo, em algumas modalidades, as células e as populações de células são separadas ou isoladas usando técnicas de separação imunomagnética (ou afinidade magnética) (revisadas em Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Proto- cols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Editado por: SA Brooks e U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, NJ).
[00206] Em alguns aspectos, a amostra incubada ou composição de células a serem separadas é incubada com um reagente de sele- ção contendo material pequeno, magnetizável ou magneticamente responsivo, como partículas magneticamente responsivas ou micro- partículas, como esferas paramagnéticas (por exemplo, como Dynal- beads ou esferas MACS®). O material magneticamente responsivo, por exemplo, partícula, geralmente é direta ou indiretamente ligado a um parceiro de ligação, por exemplo, um anticorpo, que se liga especi- ficamente a uma molécula, por exemplo, marcador de superfície, pre- sente na célula, células ou população de células que ele é desejado separar, por exemplo, que é desejado selecionar negativamente ou positivamente.
[00207] Em algumas modalidades, a partícula magnética ou esfera compreende um material magneticamente responsivo ligado a um membro de ligação específico, como um anticorpo ou outro parceiro de ligação. Muitos materiais responsivos magneticamente bem conheci- dos para uso em métodos de separação magnética são conhecidos, por exemplo, aqueles descritos em Molday, Patente Norte-americana No. 4.452.773, e na Especificação de Patente Europeia EP 452342 B, que são aqui incorporadas por referência. Partículas de tamanho co- loidal, tais como aquelas descritas em patente dos Estados Unidos Owen No. 4.795.698, e Liberti et al., Patente Norte-americana No.
5.200.084 também podem ser usadas.
[00208] A incubação geralmente é realizada sob condições em que os anticorpos ou parceiros de ligação, ou moléculas, tais como, anti- corpos secundários ou outros reagentes, que se ligam especificamente a tais anticorpos ou parceiros de ligação, que estão ligados à partícula magnética ou esfera, especificamente ligam-se às moléculas da super- fície celular, se presentes nas células da amostra.
[00209] Em certas modalidades, as partículas responsivas magneti- camente são revestidas em anticorpos primários ou outros parceiros de ligação, anticorpos secundários, lectinas, enzimas ou estreptavidi- na. Em certas modalidades, as partículas magnéticas são ligadas às células por meio de um revestimento de anticorpos primários específi- cos para um ou mais marcadores. Em certas modalidades, as células, em vez das esferas, são marcadas com um anticorpo primário ou par- ceiro de ligação e, em seguida, partículas magnéticas revestidas com anticorpo secundário específico do tipo de célula ou outro parceiro de ligação (por exemplo, estreptavidina) são adicionadas. Em certas mo- dalidades, partículas magnéticas revestidas com estreptavidina são usadas em conjunto com anticorpos primários ou secundários biotini- lados.
[00210] Em alguns aspectos, a separação é alcançada em um pro- cedimento no qual a amostra é colocada em um campo magnético, e as células com partículas magneticamente responsivas ou magnetizá- veis ligadas às mesmas serão atraídas para o ímã e separadas das células não marcadas. Para a seleção positiva, as células que são atraídas pelo ímã são retidas; para a seleção negativa, as células que não são atraídas (células não marcadas) são retidas. Em alguns as- pectos, uma combinação de seleção positiva e negativa é realizada durante a mesma etapa de seleção, onde as frações positivas e nega- tivas são retidas e posteriormente processadas ou sujeitas a outras etapas de separação.
[00211] Em algumas modalidades, a seleção baseada em afinidade é por meio de classificação de células ativadas magneticamente (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Classificação de Células Ativa- das Magnéticas (MACS), por exemplo, os sistemas CliniMACS são capazes de seleção de alta pureza de células com partículas magneti- zadas ligadas a elas. Em certas modalidades, a MACS opera em um modo em que as espécies não alvo e alvo são sequencialmente eluí- das após a aplicação do campo magnético externo. Ou seja, as células ligadas às partículas magnetizadas são mantidas no lugar enquanto as espécies não ligadas são eluídas. Então, após a conclusão dessa pri- meira etapa de eluição, as espécies que ficaram presas no campo magnético e foram impedidas de serem eluídas são liberadas de al- guma maneira para que possam ser eluídas e recuperadas. Em certas modalidades, as células não alvo são marcadas e esgotadas da popu- lação heterogênea de células.
[00212] Em algumas modalidades, as partículas responsivas mag- neticamente são deixadas ligadas às células que devem ser subse-
quentemente incubadas, cultivadas e/ou modificadas; em alguns as- pectos, as partículas são deixadas ligadas às células para administra- ção a um paciente. Em algumas modalidades, as partículas magneti- záveis ou responsivas magneticamente são removidas das células. Métodos para remover partículas magnetizáveis de células são conhe- cidos e incluem, por exemplo, o uso de anticorpos não marcados con- correntes, partículas magnetizáveis ou anticorpos conjugados com li- gantes cliváveis, etc. Em algumas modalidades, as partículas magneti- záveis são biodegradáveis.
[00213] Em algumas modalidades, o processo de fabricação, gera- ção ou produção de uma terapia celular inclui uma etapa na qual as células CD4+ e CD8+ são isoladas separadamente e então misturadas antes da etapa de introdução de um receptor recombinante, por exem- plo, CAR, nas células. Em algumas modalidades, as células CD4+ e CD8+ são misturadas em uma relação de 1:5 a 5:1 de células T CD4+ para CD8+, tais como, 1:3 a 3:1, 1:2 a 2:1 ou em ou cerca de uma re- lação de 1:1 de células CD4+ para CD8+ antes da introdução do agen- te que codifica o receptor recombinante e/ou uma ou mais das etapas de processamento subsequentes para a produção de células geneti- camente modificadas.
[00214] Em algumas modalidades, o processo para fabricar, gerar ou produzir uma terapia celular inclui uma etapa de isolar separada- mente as células T CD4+ e CD8+ e realizar separadamente uma ou mais etapas subsequentes nas células T CD4+ selecionadas ou isola- das e separadamente realizar uma ou mais etapas subsequentes nas células T CD8+ selecionadas ou isoladas. Em aspectos de tal modali- dade, as células transduzidas, tais como, composições separadas de células T CD4+ e CD8+ geneticamente modificadas com um receptor recombinante, por exemplo, CAR, podem ser combinadas como uma única composição antes da etapa de formulação das células. Em ou-
tros aspectos de tal modalidade, as células transduzidas, tais como, composições separadas de células T CD4+ e células T CD8+ geneti- camente modificadas com um receptor recombinante, por exemplo, CAR, são formuladas separadamente, tal como, para administração separada a um indivíduo. B. Ativação e Estimulação de Células
[00215] Em algumas modalidades, os métodos para a fabricação ou modificação de células, tais como, células que são avaliadas ou anali- sadas pelos métodos fornecidos, incluem uma etapa de estimulação das células isoladas, tais como, populações de células selecionadas. A incubação pode ser antes ou em conexão com a introdução do polinu- cleotídeo, tal como, a introdução do polinucleotídeo contendo uma se- quência de transgene para integração, por exemplo, por transdução. Em algumas modalidades, a estimulação resulta na ativação e/ou pro- liferação das células, por exemplo, antes da transdução.
[00216] Em algumas modalidades, a fabricação ou modificação in- clui etapas para incubações de células, tais como, células seleciona- das, nas quais as etapas de incubação podem incluir cultura, cultivo, estimulação, ativação e/ou propagação de células. Em algumas moda- lidades, as composições ou células são incubadas na presença de condições estimulantes ou um agente estimulador. Tais condições in- cluem aquelas concebidas para induzir a proliferação, ativação e/ou sobrevivência de células na população, para imitar a exposição ao an- tígeno e/ou para preparar as células para modificação genética, tal como, para a introdução de um receptor de antígeno recombinante.
[00217] Em algumas modalidades, as condições para estimulação e/ou ativação podem incluir um ou mais de meios específicos, tempe- ratura, conteúdo de oxigênio, conteúdo de dióxido de carbono, tempo, agentes, por exemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, íons e/ou fatores estimuladores, tais como, citocinas, quimiocinas, antígenos,
parceiros de ligação, proteínas de fusão, receptores solúveis recombi- nantes e quaisquer outros agentes projetados para ativar as células.
[00218] Em algumas modalidades, os agentes ou condições estimu- lantes incluem um ou mais agentes, por exemplo, ligante, que é capaz de estimular ou ativar um domínio de sinalização intracelular de um complexo de TCR. Em alguns aspectos, o agente ativa ou inicia a cas- cata de sinalização intracelular de TCR/CD3 em uma célula T, tais como, agentes adequados para liberar um sinal primário, por exemplo, para iniciar a ativação de um sinal induzido por ITAM, tais como, aque- les específicos para um componente de TCR, por exemplo, anti-CD3. Em algumas modalidades, as condições de estimulação incluem um ou mais agentes que promovem um sinal coestimulador, tal como, um específico para um receptor coestimulador de células T, por exemplo, anti-CD28 ou anti-4-1BB. Em algumas modalidades, tais agentes e/ou ligantes podem ser ligados a um suporte sólido, tal como, uma esfera e/ou uma ou mais citocinas. Entre os agentes estimulantes estão as esferas anti-CD3/anti-CD28 (por exemplo, esferas DYNABEADS® M- 450 CD3/CD28 T Cell Expander, e/ou esferas ExpACT®). Opcional- mente, o método de expansão pode compreender ainda a etapa de adicionar anticorpo anti-CD3 e/ou anti CD28 ao meio de cultura (por exemplo, a uma concentração de pelo menos cerca de 0,5 ng/mL). Em algumas modalidades, os agentes estimulantes incluem IL-2, IL-7 e/ou IL-15. Em alguns aspectos, a concentração de IL-2 é de pelo menos cerca de 10 unidades/mL, pelo menos cerca de 50 unidades/mL, pelo menos cerca de 100 unidades/mL ou pelo menos cerca de 200 unida- des/mL.
[00219] As condições podem incluir um ou mais dos meios particu- lares, temperatura, conteúdo de oxigênio, conteúdo de dióxido de car- bono, tempo, agentes, por exemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióti- cos, íons e/ou fatores estimuladores, tais como, citocinas, quimiocinas,
antígenos, parceiros de ligação, proteínas de fusão, receptores solú- veis recombinantes e quaisquer outros agentes projetados para ativar as células.
[00220] Em alguns aspectos, a incubação é realizada de acordo com técnicas, tais como, aquelas descritas na Patente Norte- americana No. 6.040.177 de Riddell et al., Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 651–660, Terakura et al. (2012) Blood.1: 72–82 e/ou Wang et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 689-701.
[00221] Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da in- cubação na presença de uma ou mais condições estimulantes ou agentes estimuladores é realizada na cavidade interna de uma câmara centrífuga, por exemplo, sob rotação centrífuga, tal como, descrito em WO2016/073602. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da incubação realizada em uma câmara centrífuga inclui a mistura com um reagente ou reagentes para induzir estimulação e/ou ativação. Em algumas modalidades, as células, tais como, as células seleciona- das, são misturadas com uma condição estimulante ou agente estimu- lador na câmara centrífuga. Em alguns aspectos de tais processos, um volume de células é misturado com uma quantidade de uma ou mais condições ou agentes estimulantes que é muito menor do que o nor- malmente empregado ao realizar estímulos similares em uma placa de cultura de células ou outro sistema.
[00222] Em algumas modalidades, o agente estimulante é adicio- nado às células na cavidade da câmara em uma quantidade que é substancialmente menor que (por exemplo, não é mais que 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % ou 80 % da quantidade) em comparação com a quantidade do agente estimulador que é tipicamen- te usado ou seria necessário para atingir a mesma ou similar eficiência de seleção do mesmo número de células ou o mesmo volume de célu- las quando a seleção é realizada sem mistura em uma câmara centrí-
fuga, por exemplo, em um tubo ou saco com agitação ou rotação pe- riódica. Em algumas modalidades, a incubação é realizada com a adi- ção de um tampão de incubação às células e agente estimulador para atingir um volume alvo com a incubação do reagente de, por exemplo, 10 mL a 200 mL, tal como pelo menos ou cerca de pelo menos ou cer- ca de ou 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 150 mL ou 200 mL. Em algumas modalidades, o tam- pão de incubação e o agente estimulador são pré-misturados antes da adição às células. Em algumas modalidades, o tampão de incubação e o agente estimulador são adicionados separadamente às células. Em algumas modalidades, a incubação estimulante é realizada com condi- ção de mistura suave periódica, o que pode ajudar na promoção de interações energeticamente favorecidas e, assim, permitir o uso de menos agente estimulador geral enquanto se atinge a estimulação e ativação das células.
[00223] Em algumas modalidades, a incubação geralmente é reali- zada sob condições de mistura, tal como, na presença de rotação, ge- ralmente a uma força ou velocidade relativamente baixa, tal como, uma velocidade menor do que aquela usada para sedimentar as célu- las, tal como de ou de cerca de 600 rpm a 1700 rpm (por exemplo, a ou cerca de ou pelo menos 600 rpm, 1000 rpm ou 1500 rpm ou 1700 rpm), tal como, em um RCF na amostra ou parede da câmara ou outro recipiente de ou de cerca de 80 g a 100 g (por exemplo, em ou cerca de ou pelo menos 80 g, 85 g, 90 g, 95 g ou 100 g). Em algumas moda- lidades, o giro é realizado usando intervalos repetidos de um giro em velocidade tão baixa seguido por um período de descanso, tal como, um giro e/ou descanso durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 segundos, tal como, um giro de aproximadamente 1 ou 2 segundos seguido por um descanso de aproximadamente 5, 6, 7 ou 8 segundos.
[00224] Em algumas modalidades, a duração total da incubação,
por exemplo, com o agente estimulador, está entre ou entre cerca de 1 hora e 96 horas, 1 hora e 72 horas, 1 hora e 48 horas, 4 horas e 36 horas, 8 horas e 30 horas ou 12 horas e 24 horas, tal como pelo me- nos ou cerca de pelo menos 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas ou 72 horas. Em algumas modalidades, a incubação adicional é por um tempo entre ou cerca de entre 1 hora e 48 horas, 4 horas e 36 horas, 8 horas e 30 horas ou 12 horas e 24 horas, inclusive. C. Introdução de Polinucleotídeo Contendo Sequências de Trans- gene
[00225] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos podem ser realizados para avaliar células que são modificadas pela introdu- ção de polinucleotídeos que codificam as sequências de transgene. Em algumas modalidades, os métodos para a fabricação ou modifica- ção de células, tais como, células que são avaliadas ou analisadas pe- los métodos fornecidos, incluem uma etapa para a introdução de um polinucleotídeo contendo sequências de transgene que codificam uma proteína recombinante, tal como, um receptor recombinante. Em al- gumas modalidades, as células modificadas foram introduzidas com um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de transgene, sob condições para integração da sequência de transgene em um genoma da célula. A introdução do polinucleotídeo contendo uma sequência de transgene, tais como, sequências de transgene que codificam uma proteína recombinante, na célula pode ser realizada usando qualquer um de uma série de métodos de liberação diferentes. Em alguns as- pectos, a condição para integração da sequência de transgene inclui qualquer uma descrita aqui, por exemplo, usando sistemas de trans- dução viral para integração da sequência de transgene no genoma da célula, por exemplo, uma célula imune.
[00226] Em alguns aspectos, o polinucleotídeo contendo sequên- cias de transgene que codificam uma proteína recombinante, tal como,
um receptor recombinante, pode ser compreendido em um vetor. Em alguns aspectos, tais vetores incluem sistemas virais e não virais, in- cluindo sistemas lentivirais e gamarretrovirais, bem como, sistemas baseados em transposões, tais como, sistemas de transferência de genes baseados em Sleeping Beauty ou PiggyBac. Métodos exempla- res incluem aqueles para introdução ou liberação de ácidos nucleicos em uma célula, incluindo via viral, por exemplo, retroviral ou lentiviral, transdução, transposons e eletroporação.
[00227] Em algumas modalidades, a introdução do polinucleotídeo é realizada estimulando primeiro a célula, tal como, combinando-a com um estímulo que induz uma resposta, tais como, proliferação, sobrevi- vência e/ou ativação, por exemplo, conforme medido pela expressão de uma citocina ou marcador de ativação, seguidos pela transdução das células ativadas e expansão em cultura para números suficientes para aplicações clínicas.
[00228] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é uma molécu- la de ácido nucleico linear ou circular, tal como, um DNA linear ou cir- cular ou RNA linear, e pode ser liberado usando qualquer um dos mé- todos para liberar moléculas de ácido nucleico na célula. Em modali- dades particulares, o polinucleotídeo é introduzido nas células na for- ma de nucleotídeo, por exemplo, como ou dentro de um vetor não vi- ral. Em algumas modalidades, o vetor não viral é ou inclui um polinu- cleotídeo, por exemplo, um polinucleotídeo de DNA ou RNA, que é adequado para transdução e/ou transfecção por qualquer método não viral adequado e/ou conhecido para liberação de gene, tal como, po- rém, não limitado a, microinjeção, eletroporação, compressão de célu- las transitórias ou compressão (tal como descrito em Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27), transfecção mediada por lipídios, liberação mediada por peptídeos, por exemplo, peptídeos de penetração celular, ou uma combinação dos mesmos.
[00229] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinan- tes são transferidos para células T via eletroporação (veja, por exem- plo, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8 (3): e60298 e Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7 (16): 1431-1437). Em algumas modalida- des, os ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para células T via transposição (veja, por exemplo, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21 (4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2 , e74; e Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Outros métodos de introdução e expressão de material genético em células imunes incluem transfecção de fosfato de cálcio (por exemplo, como descrito em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque. N.Y.), fusão de protoplastos, transfecção mediada por lipossoma catiônico; bombardeamento de micropartículas facilitado por partículas de tungsténio (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); e coprecipitação com DNA de fosfato de estrôncio (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).
[00230] Outros métodos e vetores para a transferência dos ácidos nucleicos que codificam os produtos recombinantes são aqueles des- critos, por exemplo, no pedido de patente internacional, Publicação Nº: WO2014055668 e Patente Norte-americana Nº 7.446.190.
[00231] Em algumas modalidades, as células, por exemplo, células T, podem ser transduzidas durante ou após a expansão, por exemplo, com uma preparação viral contendo polinucleotídeos que contêm as sequências de transgene que codificam uma proteína recombinante, tais como, um receptor de célula T (TCR) ou um receptor de antígeno quimérico (CAR). Esta transdução para a introdução do polinucleotí- deo do receptor desejado pode ser realizada com qualquer vetor retro- viral adequado, por exemplo. A população de células geneticamente modificadas pode então ser libertada do estímulo inicial (o estímulo anti-CD3/anti-CD28, por exemplo) e subsequentemente estimulada com um segundo tipo de estímulo, por exemplo, através de um recep- tor introduzido de novo). Este segundo tipo de estímulo pode incluir um estímulo antigênico na forma de uma molécula de peptídeo/MHC, o ligante cognato (reticulação) do receptor geneticamente introduzido (por exemplo, ligante natural de um CAR) ou qualquer ligante (tal co- mo um anticorpo) que se liga diretamente na estrutura do novo recep- tor (por exemplo, reconhecendo regiões constantes dentro do recep- tor). Veja, por exemplo, Cheadle et al, "Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy" Methods Mol Biol. 2012; 907: 645-66 ou Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014).
[00232] Em alguns casos, pode ser usado um vetor que não requei- ra que as células, por exemplo, células T, sejam ativadas. Em alguns desses casos, as células podem ser selecionadas e/ou transduzidas antes da ativação. Assim, as células podem ser modificadas antes ou após a cultura das células e, em alguns casos, ao mesmo tempo ou durante pelo menos uma parte da cultura.
[00233] Em alguns aspectos, as células ainda são modificadas para promover a expressão de citocinas ou outros fatores. Entre os ácidos nucleicos adicionais, por exemplo, os genes para introdução são aque- les para melhorar a eficácia da terapia, tal como, por meio da promo- ção da viabilidade e/ou função das células transferidas; genes para fornecer um marcador genético para seleção e/ou avaliação das célu- las, tal como, para avaliar a sobrevivência ou localização in vivo; ge- nes para melhorar a segurança, por exemplo, tornando a célula susce- tível à seleção negativa in vivo, conforme descrito por Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11: 6 (1991); e Riddell et al., Human Gene The- rapy 3: 319-338 (1992); veja também WO 1992/008796 e WO 1994/028143 que descrevem o uso de genes de fusão selecionáveis bifuncionais derivados da fusão de um marcador selecionável positivo dominante com um marcador selecionável negativo. Veja, por exem- plo, Riddell et al., Patente Norte-americana No. 6.040.177, nas colunas 14-17.
[00234] Em algumas modalidades, a introdução é realizada pelo esferato de uma ou mais células de uma composição com uma molé- cula de ácido nucleico que codifica a proteína recombinante, por exemplo, receptor recombinante. Em algumas modalidades, o esferato pode ser efetuado com centrifugação, tal como espinoculação (por exemplo, inoculação centrífuga). Tais métodos incluem qualquer um dos descritos em WO2016/073602. Câmaras centrífugas exemplares incluem aquelas produzidas e vendidas por Biosafe SA, incluindo aquelas para uso com o sistema Sepax® e Sepax® 2, incluindo câma- ras centrífugas A-200/F e A-200 e vários kits para uso com tais siste- mas. Câmaras, sistemas e instrumentação de processamento e gabi- netes exemplares são descritos, por exemplo, na Patente Norte- americana No. 6.123.655, Patente Norte-americana No. 6.733.433 e US 2008/0171951 e WO 00/38762, os conteúdos de cada um dos quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Kits exemplares para uso com tais sistemas incluem, porém, não estão li- mitados a, kits de uso único vendidos pela BioSafe SA sob os nomes de produto CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 ou CS-900.2.
[00235] Em algumas modalidades, o sistema é incluído e/ou colo- cado em associação com outra instrumentação, incluindo instrumenta- ção para operar, automatizar, controlar e/ou monitorar aspectos da etapa de transdução e uma ou mais várias outras etapas de proces- samento realizadas no sistema, por exemplo, uma ou mais etapas de processamento que podem ser realizadas com ou em conexão com o sistema de câmara centrífuga, conforme descrito neste documento ou em WO2016/073602. Esta instrumentação em algumas modalidades está contida em um gabinete. Em algumas modalidades, a instrumen-
tação inclui um gabinete, que inclui um compartimento contendo circui- tos de controle, uma centrífuga, uma tampa, motores, bombas, senso- res, monitores e uma interface de usuário. Um dispositivo exemplar é descrito na Patente Norte-americana No. 6.123.655, Patente Norte- americana No. 6.733.433 e US 2008/0171951.
[00236] Em algumas modalidades, o sistema compreende uma sé- rie de recipientes, por exemplo, sacos, tubos, torneiras, braçadeiras, conectores e uma câmara de centrífuga. Em algumas modalidades, os recipientes, tais como, sacos, incluem um ou mais recipientes, tais como, sacos, contendo as células a serem transduzidas e as partícu- las do vetor viral, no mesmo recipiente ou recipientes separados, tais como, o mesmo saco ou sacos separados. Em algumas modalidades, o sistema inclui ainda um ou mais recipientes, tais como, sacos, con- tendo meio, tais como, diluente e/ou solução de lavagem, que é puxa- do para dentro da câmara e/ou outros componentes para diluir, res- suspender e/ou lavar os componentes e/ou composições durante os métodos. Os recipientes podem ser conectados em uma ou mais posi- ções no sistema, tais como, em uma posição correspondente a uma linha de entrada, linha de diluente, linha de lavagem, linha de esgoto e/ou linha de saída.
[00237] Em algumas modalidades, a câmara é associada a uma centrífuga, que é capaz de efetuar a rotação da câmara, tais como, em torno de seu eixo de rotação. A rotação pode ocorrer antes, durante e/ou após a incubação em conexão com a transdução das células e/ou em uma ou mais das outras etapas de processamento. Assim, em al- gumas modalidades, uma ou mais das várias etapas de processamen- to são realizadas sob rotação, por exemplo, a uma força particular. A câmara é tipicamente capaz de rotação vertical ou geralmente vertical, de modo que a câmara assenta verticalmente durante a centrifugação e a parede lateral e o eixo são verticais ou geralmente verticais, com a
(s) parede (s) de extremidade horizontal ou geralmente horizontal.
[00238] Em algumas modalidades, a composição contendo células, partículas virais e reagente pode ser girada, geralmente a uma força ou velocidade relativamente baixa, tal como velocidade menor do que aquela usada para sedimentar as células, tal como de ou cerca de 600 rpm a 1700 rpm (por exemplo, a cerca de ou pelo menos 600 rpm, 1000 rpm, ou 1500 rpm ou 1700 rpm). Em algumas modalidades, a rotação é realizada com uma força, por exemplo, uma força centrífuga relativa, de ou cerca de 100 g a 3200 g (por exemplo, em ou cerca de ou pelo menos em ou cerca de 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g ou 3200 g), conforme medido, por exemplo, em uma parede interna ou externa da câmara ou cavidade. O termo "força centrífuga relativa" ou RCF é geralmente entendido como a força eficaz transmitida a um objeto ou substância (como uma célula, amostra ou pélete e/ou um ponto na câmara ou outro recipiente sendo girado), em relação a a força gravitacional da Terra, em um ponto específico no espaço, em comparação com o eixo de rotação. O valor pode ser determinado usando fórmulas bem conhecidas, levando em consideração a força gravitacional, a velocidade de rotação e o raio de rotação (distância do eixo de rotação e do objeto, substância ou partícula em que o RCF está sendo medido). D. Ácidos Nucleicos e Vetores
[00239] Em algumas modalidades, as células avaliadas ou analisa- das usando os métodos fornecidos incluem células imunes, que são geneticamente modificadas. Em algumas modalidades, as células, por exemplo, células T, são geneticamente modificadas para expressar uma proteína recombinante, tal como, um receptor recombinante. Em algumas modalidades, a modificação é realizada pela introdução de um ou mais polinucleotídeo(s) que contêm sequências de transgene que codificam as proteínas recombinantes ou porções ou componen-
tes das mesmas. Em alguns aspectos, uma porção do polinucleotídeo, por exemplo, contendo as sequências de transgene, é introduzida para integração da sequência no genoma da célula, por exemplo, a célula sendo modificada. Em alguns aspectos, o polinucleotídeo é compre- endido em um vetor, tal como, um vetor viral, para introdução do poli- nucleotídeo na célula modificada.
[00240] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo contendo as sequências de transgene pode ser compreendido em uma molécula de vetor. Em algumas modalidades, o vírus é um vírus de DNA (por exemplo, vírus dsDNA ou ssDNA). Em algumas modalidades, o vírus é um vírus de RNA (por exemplo, um vírus ssRNA). Os vetores/vírus vi- rais exemplares incluem, por exemplo, retrovírus, lentivírus, adenoví- rus, vírus adeno-associados (AAV), vírus vaccinia, poxvírus e vírus de herpes simples ou qualquer um dos vírus descritos em outro lugar nes- te documento. Um polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula como parte de uma molécula de vetor com sequências adicionais, tais como, por exemplo, origens de replicação, promotores e genes que codificam resistência a antibióticos. Além disso, os polinucleotídeos podem ser introduzidos como ácido nucleico puro, tais como, ácido nucleico complexado com materiais, tais como, um lipossoma, nano- partícula ou poloxâmero, ou podem ser liberados por vírus (por exem- plo, adenovírus, AAV, herpesvírus, retrovírus, lentivírus e lentivírus de- feituoso da integrase (IDLV)).
[00241] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreenden- do as sequências de transgene, tal como, uma sequência de transge- ne que codifica uma proteína recombinante, é transferido para células usando partículas de vírus infecciosas recombinantes, tais como, por exemplo, vetores derivados do vírus símio 40 (SV40), adenovírus, ví- rus adeno-associado (AAV) e vírus da imunodeficiência humana (HIV). Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para células T usando vetores lentivirais recombinantes ou vetores retrovirais, tais como, vetores gama-retrovirais (veja, por exemplo, Koste et al. (2014) Gene Therapy, 3 de abril de 2014. doi:
10.1038/gt. 2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28 (10): 1137- 46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 29 de novembro de 2011 (11 ): 550–557 ou ve- tores lentivirais derivados do HIV-1.
[00242] Em algumas modalidades, o vetor retroviral tem uma se- quência de repetição terminal longa (LTR), por exemplo, um vetor re- troviral derivado do vírus da leucemia murina Moloney (MoMLV), vírus do sarcoma mieloproliferativo (MPSV), vírus da célula tronco embrio- nária murina (MESV), vírus de células tronco murinas (MSCV), vírus formador de foco de baço (SFFV) ou vírus da imunodeficiência huma- na (HIV). Em algumas modalidades, os retrovírus incluem aqueles de- rivados de qualquer fonte de células de aves ou mamíferos. Os retroví- rus são tipicamente anfotrópicos, o que significa que são capazes de infectar células hospedeiras de várias espécies, incluindo humanos. Em algumas modalidades, o gene a ser expresso substitui as sequên- cias retrovirais gag, pol e/ou env. Vários sistemas retrovirais ilustrati- vos foram descritos (por exemplo, Patentes Norte-americanas Nos.
5.219.740; 6.207.453; 5.219.740; Miller e Rosman (1989) Bio Techni- ques 7: 980-990; Miller, AD (1990) Human Gene Therapy 1: 5-14 ; Scarpa et al. (1991) Virology 180: 849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037; e Boris-Lawrie e Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109.
[00243] Métodos de transdução lentiviral são conhecidos. Métodos exemplares são descritos em, por exemplo, Wang et al. (2012) J. Immunother. 35 (9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101: 1637– 1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; e Cava- lieri et al. (2003) Blood. 102 (2): 497-505.
[00244] Em outros aspectos, o polinucleotídeo é liberado por méto- dos de transferência de genes virais e/ou não virais. Em algumas mo- dalidades, o polinucleotídeo é liberado na célula por meio de um vírus adenoassociado (AAV). Qualquer vetor AAV pode ser usado, incluin- do, porém, não limitado a, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 e combinações dos mesmos. Em alguns casos, o AAV compreende LTRs que são de um serótipo heterólogo em comparação com o serótipo de capsídeo (por exemplo, ITRs de AAV2 com capsí- deos de AAV5, AAV6 ou AAV8). Em algumas modalidades, o polinu- cleotídeo contendo o (s) agente (s) e/ou polinucleotídeo é liberado por um AAV recombinante. Em algumas modalidades, o AAV pode incor- porar seu genoma ao de uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula alvo como descrito aqui. Em outra modalidade, o AAV é um ví- rus adeno-associado autocomplementar (scAAV), por exemplo, um scAAV que empacota ambas as fitas que se anelam juntas para formar DNA de fita dupla. Os serótipos de AAV que podem ser usados nos métodos descritos incluem AAV1, AAV2, AAV2 modificado (por exem- plo, modificações em Y444F, Y500F, Y730F e/ou S662V), AAV3, AAV3 modificado (por exemplo, modificações em Y705F, Y731F e/ou T492V ), AAV4, AAV5, AAV6, AAV6 modificado (por exemplo, modifi- cações em S663V e/ou T492V), AAV7, AAV8, AAV 8.2, AAV9, AAV.rh10, AAV.rh10 modificado, AAV.rh32/33, AAV.rh32/33 modifica- do, AAV.rh43, AAV.rh43 modificado, AAV.rh64R1, AAV.rh64R1 modifi- cado e AAV pseudotipado, tais como, AAV2/8, AAV2/5 e AAV2/6 tam- bém podem ser usados nos métodos descritos.
[00245] Em algumas modalidades, a sequência de transgene está contida em um vetor ou pode ser clonada em um ou mais vetores. Em algumas modalidades, um ou mais vetor(es) pode(m) ser usado(s) para transformar ou transfectar uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula para modificação. Os vetores exemplares incluem vetores concebidos para introdução, propagação e expansão ou para expres- são ou ambos, tais como, plasmídeos e vetores virais. Em alguns as- pectos, o vetor é um vetor de expressão, por exemplo, um vetor de expressão recombinante. Em algumas modalidades, os vetores de ex- pressão recombinantes podem ser preparados usando técnicas de DNA recombinante padrão.
[00246] Em algumas modalidades, o vetor pode ser um vetor da série pUC (Fermentas Life Sciences), a série pBluescript (Stratagene, LaJolla, Califórnia), a série pET (Novagen, Madison, Wis.), a série pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) ou a série pEX (Clontech, Palo Alto, Califórnia). Em alguns casos, vetores de bacteriófagos, tais como, λG10, λGT11, λZapII (Stratagene), λEMBL4 e λNM1149, tam- bém podem ser usados. Em algumas modalidades, os vetores de ex- pressão de plantas podem ser usados e incluem pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 e pBIN19 (Clontech). Em algumas modalidades, os vetores de expressão animal incluem pEUK-Cl, pMAM e pMAMneo (Clontech).
[00247] Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral, tal co- mo, um vetor retroviral. Em algumas modalidades, a sequência de transgene e/ou polipeptídeo (s) adicional (is) são introduzidos na célula por meio de vetores retrovirais ou lentivirais, ou via transposons (veja, por exemplo, Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13: 1050–1063; Frecha et al. (2010) Molecular Therapy 18: 1748–1757; e Hackett et al. (2010) Mo- lecular Therapy 18: 674–683).
[00248] Em algumas modalidades, uma ou mais sequências de transgene ou vetores que codificam uma proteína recombinante, por exemplo, receptor recombinante, e/ou polipeptídeo (s) adicional (is) podem ser introduzidos nas células, por exemplo, células T, durante ou após a expansão. Esta introdução da (s) sequência (s) de transge-
ne ou vetor (es) pode ser realizada com qualquer vetor retroviral ade- quado, por exemplo. As células geneticamente modificadas resultantes podem então ser liberadas do estímulo inicial (por exemplo, estímulo anti-CD3/anti-CD28) e, posteriormente, ser estimuladas com um se- gundo tipo de estímulo (por exemplo, por meio de uma proteína re- combinante introduzida de novo, por exemplo, receptor recombinante). Este segundo tipo de estímulo pode incluir um estímulo antigênico na forma de uma molécula de peptídeo/MHC, o ligante cognato (reticula- ção) do receptor geneticamente introduzido (por exemplo, antígeno natural e/ou ligante de um CAR) ou qualquer ligante (tal como um anti- corpo) que se liga diretamente na estrutura do novo receptor (por exemplo, reconhecendo regiões constantes dentro do receptor). Veja, por exemplo, Cheadle et al, "Chimeric antigen receptors for T-cell ba- sed therapy" Methods Mol Biol. 2012; 907: 645-66 ou Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Me- dicine Vol. 65: 333-347 (2014).
[00249] Em alguns casos, um vetor pode ser usado que não requer que as células, por exemplo, células T, sejam ativadas. Em alguns desses casos, as células podem ser selecionadas e/ou transduzidas antes da ativação ou estimulação. Assim, as células podem ser modifi- cadas antes ou após a cultura das células e, em alguns casos, ao mesmo tempo ou durante pelo menos uma parte da cultura.
1. Preparação de Partículas de Vetor Viral para Transdução
[00250] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreenden- do as sequências de transgene, tal como, uma sequência de transge- ne que codifica uma proteína recombinante, é transferido para as célu- las usando partículas de vírus infecciosas recombinantes. Em alguns aspectos, o polinucleotídeo é introduzido por meio de transdução viral. Em alguns aspectos, as sequências de transgene são compreendidas em um vetor viral. O genoma do vetor viral é tipicamente construído em uma forma de plasmídeo que pode ser transfectada em uma linha de células de empacotamento ou produtora. Em qualquer um desses exemplos, as sequências de transgene que codificam uma proteína recombinante, tal como, um receptor recombinante, são inseridas ou localizadas em uma região do vetor viral, tal como, geralmente em uma região não essencial do genoma viral. Em algumas modalidades, as sequências de transgene são inseridas no genoma viral no lugar de certas sequências virais para produzir um vírus com deficiência de re- plicação.
[00251] Qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos pode ser usado para produzir partículas retrovirais cujo genoma con- tém uma cópia de RNA do genoma do vetor viral. Em algumas modali- dades, pelo menos dois componentes estão envolvidos na produção de um sistema de liberação de genes baseado em vírus: primeiro, plasmídeos de empacotamento, abrangendo as proteínas estruturais, bem como, as enzimas necessárias para gerar uma partícula de vetor viral e, segundo, o próprio vetor viral, ou seja, o material genético a ser transferido. As salvaguardas de biossegurança podem ser introduzidas no projeto de um ou de ambos os componentes.
[00252] Em algumas modalidades, o plasmídeo de empacotamento pode conter todas as proteínas retrovirais, tal como, HIV-1, além das proteínas de envelope (Naldini et al., 1998). Em outras modalidades, os vetores virais podem não ter genes virais adicionais, tais como, aqueles que estão associados à virulência, por exemplo, vpr, vif, vpu e nef, e/ou Tat, um transativador primário do HIV. Em algumas modali- dades, os vetores lentivirais, tais como, vetores lentivirais baseados em HIV, compreendem apenas três genes do vírus parental: gag, pol e rev, o que reduz ou elimina a possibilidade de reconstituição de um vírus de tipo selvagem através de recombinação.
[00253] Em algumas modalidades, o genoma do vetor viral é intro-
duzido em uma linhagem de células de empacotamento que contém todos os componentes necessários para empacotar o RNA genômico viral, transcrito do genoma do vetor viral, em partículas virais. Alterna- tivamente, o genoma do vetor viral pode compreender um ou mais ge- nes que codificam componentes virais, além de uma ou mais sequên- cias de transgene, por exemplo, que codificam uma proteína recombi- nante, de interesse. Em alguns aspectos, a fim de evitar a replicação do genoma na célula alvo, no entanto, os genes virais endógenos ne- cessários para a replicação são removidos e fornecidos separadamen- te na linhagem de células de empacotamento.
[00254] Em algumas modalidades, uma linhagem de células de empacotamento é transfectada com um ou mais vetores de plasmídeo contendo os componentes necessários para gerar as partículas. Em algumas modalidades, uma linhagem de células de empacotamento é transfectada com um plasmídeo contendo o genoma do vetor viral, in- cluindo os LTRs, a sequência de empacotamento de ação cis e a se- quência de interesse, isto é, um ácido nucleico que codifica um recep- tor de antígeno, tal como, um CAR; e um ou mais plasmídeos auxilia- res que codificam os componentes enzimáticos e/ou estruturais do ví- rus, tais como, Gag, pol e/ou rev. Em algumas modalidades, vários vetores são utilizados para separar os vários componentes genéticos que geram as partículas do vetor retroviral. Em algumas dessas moda- lidades, o fornecimento de vetores separados para a célula de empa- cotamento reduz a chance de eventos de recombinação que podem, de outra forma, gerar vírus competentes para replicação. Em algumas modalidades, um único vetor de plasmídeo com todos os componentes retrovirais pode ser usado.
[00255] Em algumas modalidades, a partícula de vetor retroviral, tal como, a partícula de vetor lentiviral, é pseudotipada para aumentar a eficiência de transdução das células hospedeiras. Por exemplo, uma partícula de vetor retroviral, tal como, uma partícula de vetor lentiviral, em algumas modalidades é pseudotipada com uma glicoproteína VSV- G, que fornece uma ampla faixa de células hospedeiras estendendo os tipos de células que podem ser transduzidas. Em algumas modalida- des, uma linhagem de células de empacotamento é transfectada com um plasmídeo ou polinucleotídeo que codifica uma glicoproteína de envelope não nativa, de modo a incluir envelopes xenotrópicos, poli- trópicos ou anfotrópicos, tal como, envelope do vírus Sindbis, GALV ou VSV-G.
[00256] Em algumas modalidades, a linhagem de células de empa- cotamento fornece os componentes, incluindo proteínas regulatórias e estruturais virais, que são necessários em trans para o empacotamen- to do RNA genômico viral em partículas de vetor lentiviral. Em algumas modalidades, a linhagem de células de empacotamento pode ser qualquer linhagem de células que seja capaz de expressar proteínas lentivirais e produzir partículas de vetor lentiviral funcional. Em alguns aspectos, as linhas de células de empacotamento adequadas incluem células 293 (ATCC CCL X), 293T, HeLA (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) e Cf2Th (ATCC CRL 1430).
[00257] Em algumas modalidades, a linhagem de células de empa- cotamento expressa estavelmente a (s) proteína (s) viral (ais). Por exemplo, em alguns aspectos, uma linhagem de células de empaco- tamento contendo gag, pol, rev e/ou outros genes estruturais, mas sem o LTR e os componentes de empacotamento pode ser construída. Em algumas modalidades, uma linhagem de células de empacotamen- to pode ser transfectada transitoriamente com moléculas de ácido nu- cleico que codificam uma ou mais proteínas virais juntamente com o genoma do vetor viral contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína heteróloga e/ou um ácido nucleico que codifica uma glicoproteína de envelope.
[00258] Em algumas modalidades, os vetores virais e os plasmí- deos de empacotamento e/ou auxiliares são introduzidos por meio de transfecção ou infecção na linhagem de células de empacotamento. A linhagem de células de empacotamento produz partículas de vetor vi- ral que contêm o genoma do vetor viral. Os métodos de transfecção ou infecção são bem conhecidos. Exemplos não limitantes incluem fosfato de cálcio, DEAE-dextrana e métodos de lipofecção, eletroporação e microinjeção.
[00259] Quando um plasmídeo recombinante e o LTR retroviral e as sequências de empacotamento são introduzidos em uma linhagem ce- lular especial (por exemplo, por precipitação com fosfato de cálcio), as sequências de empacotamento podem permitir a transcrição de RNA do plasmídeo recombinante a ser empacotado em partículas virais, que então podem ser secretadas nos meios de cultura. O meio con- tendo os retrovírus recombinantes em algumas modalidades é então coletado, opcionalmente concentrado e usado para a transferência de genes. Por exemplo, em alguns aspectos, após a cotransfecção dos plasmídeos de empacotamento e a transferência do vetor para a li- nhagem celular de empacotamento, as partículas do vetor viral são recuperadas do meio de cultura e tituladas por métodos padrão usa- dos por aqueles versados na técnica.
[00260] Em algumas modalidades, um vetor retroviral, tal como, um vetor lentiviral, pode ser produzido em uma linhagem de células de empacotamento, tal como, uma linhagem de células HEK 293T exem- plar, por introdução de plasmídeos para permitir a geração de partícu- las lentivirais. Em algumas modalidades, uma célula de empacotamen- to é transfectada e/ou contém um polinucleotídeo que codifica gag e pol e um polinucleotídeo que codifica um receptor recombinante, tal como, um receptor de antígeno, por exemplo, um CAR. Em algumas modalidades, a linhagem de células de empacotamento é opcional- mente e/ou adicionalmente transfectada com e/ou contém um polinu- cleotídeo que codifica uma proteína rev. Em algumas modalidades, a linhagem de células de empacotamento é opcionalmente e/ou adicio- nalmente transfectada com e/ou contém um polinucleotídeo que codifi- ca uma glicoproteína de envelope não nativa, tal como, VSV-G. Em algumas de tais modalidades, aproximadamente dois dias após a transfecção de células, por exemplo, células HEK 293T, o sobrenadan- te da célula contém vetores lentivirais recombinantes, que podem ser recuperados e titulados.
[00261] Partículas de vetor retroviral recuperadas e/ou produzidas podem ser usadas para transduzir células alvo usando os métodos como descrito. Uma vez nas células alvo, o RNA viral é transcrito re- versamente, importado para o núcleo e integrado de forma estável no genoma do hospedeiro. Um ou dois dias após a integração do RNA viral, a expressão da proteína recombinante, por exemplo, receptor de antígeno, tal como, CAR, pode ser detectada. E. Cultivo e/ou Expansão de Células
[00262] Em algumas modalidades, as células, por exemplo, células modificadas, avaliadas ou analisadas usando os métodos fornecidos, são geradas usando um método de modificação ou fabricação que não inclui uma etapa de cultivo e/ou expansão das células após a introdu- ção do polinucleotídeo, ou um processo de modificação ou fabricação que é abreviado ou encurtado, tal como, o uso de um processo de fa- bricação não expandido. Em alguns aspectos, o processo de fabrica- ção encurtado ou abreviado inclui uma etapa de expansão encurtada ou abreviada, ou não inclui uma etapa de expansão, após a introdução dos ácidos nucleicos que codificam o receptor recombinante. Em al- guns aspectos, após a introdução do polinucleotídeo compreendendo sequências de transgene na célula, as células são submetidas a uma etapa de incubação encurtada ou abreviada para expansão ou não são submetidas a uma etapa de expansão, por exemplo, estão sujeitas a um processo de fabricação não expandido. Em alguns aspectos, os métodos fornecidos são realizados em um ou mais pontos de tempo durante um processo de fabricação não expandido, encurtado ou abreviado.
[00263] Em algumas modalidades, as células, por exemplo, células modificadas, avaliadas ou analisadas usando os métodos fornecidos, são geradas usando um método de modificação ou fabricação que po- de incluir uma ou mais etapas para o cultivo de células modificadas, por exemplo, cultivo de células sob condições que promovem a prolife- ração e/ou expansão. Em algumas modalidades, os métodos forneci- dos incluem uma ou mais etapas para o cultivo de células modificadas, por exemplo, cultivo de células sob condições que promovem a prolife- ração e/ou expansão. Em algumas modalidades, durante pelo menos uma parte do processo para a introdução do polinucleotídeo, por exemplo, por meio de transdução viral e/ou subsequente à introdução do polinucleotídeo, as células são cultivadas, tal como, para cultivo ou expansão das células. Em alguns aspectos, os métodos fornecidos podem ser realizados uma ou mais vezes após a introdução do polinu- cleotídeo, por exemplo, por meio de transdução viral, tal como, em um ou mais pontos de tempo durante a cultura ou expansão das células.
[00264] Em alguns aspectos, após a introdução do polinucleotídeo que compreende as sequências de transgene na célula, as células são subsequentemente transferidas para um recipiente, tal como, um saco para cultura. Em algumas modalidades, o recipiente para cultivo ou expansão das células é um saco de biorreator, tal como, um saco de perfusão. Em algumas modalidades, as células cultivadas enquanto fechadas, conectadas e/ou sob o controle de um biorreator sofrem ex- pansão durante o cultivo mais rapidamente do que as células que são cultivadas sem um biorreator, por exemplo, células que são cultivadas em condições estáticas, tais como, sem mistura, oscilação, movimento e/ou perfusão.
[00265] Em algumas modalidades, as células modificadas são culti- vadas sob condições que promovem a proliferação e/ou expansão subsequente a uma etapa de modificação genética, por exemplo, a introdução de um polipeptídeo recombinante nas células por transdu- ção ou transfecção. Em modalidades particulares, as células são culti- vadas após as células terem sido incubadas sob condições estimulan- tes e transduzidas ou transfectadas com um polinucleotídeo recombi- nante, por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um receptor re- combinante. Em algumas modalidades, o cultivo produz uma ou mais composições cultivadas de células T enriquecidas.
[00266] Em algumas modalidades, as células modificadas são culti- vadas em um recipiente que pode ser carregado, por exemplo, através da porta de alimentação, com meios de células e/ou células para cultu- ra das células adicionadas. As células podem ser de qualquer fonte de células para a qual a cultura das células é desejada, por exemplo, para expansão e/ou proliferação das células.
[00267] Em alguns aspectos, o meio de cultura é um meio de cultu- ra adaptado que suporta esse crescimento, cultivo, expansão ou proli- feração das células, tais como, as células T. Em alguns aspectos, o meio pode ser um líquido contendo uma mistura de sais, aminoácidos, vitaminas, açúcares ou qualquer combinação dos mesmos. Em algu- mas modalidades, o meio de cultura contém ainda uma ou mais condi- ções ou agentes estimulantes, tal como, para estimular o cultivo, ex- pansão ou proliferação de células durante a cultura. Em algumas mo- dalidades, a condição de estimulação é ou inclui uma ou mais citoci- nas selecionadas de IL-2, IL-7 ou IL-15. Em algumas modalidades, a citocina é uma citocina recombinante. Em algumas modalidades, a concentração de uma ou mais citocinas no meio de cultura durante a cultura ou incubação, independentemente, é de ou cerca de 1 IU/mL a 1500 IU/mL, tal como de ou cerca de 1 IU/mL a 100 IU/mL, 2 IU/mL a 50 IU/mL, 5 IU/mL a 10 IU/mL, 10 IU/mL a 500 IU/mL, 50 IU/mL a 250 IU/mL ou 100 IU/mL para 200 IU/mL, 50 IU/mL a 1500 IU/mL, 100 IU/mL a 1000 IU/mL ou 200 IU/mL a 600 IU/mL. Em algumas modali- dades, a concentração de uma ou mais citocinas, independentemente, é pelo menos ou pelo menos cerca de 1 IU/mL, 5 IU/mL, 10 IU/mL, 50 IU/mL, 100 IU/mL, 200 IU/mL, 500 IU/mL, 1000 IU/mL ou 1500 IU/mL.
[00268] Em alguns aspectos, as células são cultivadas, tais como, incubadas, por pelo menos uma porção de tempo após a transferência das células modificadas e meios de cultura. Em algumas modalidades, as condições de estimulação geralmente incluem uma temperatura adequada para o crescimento de células imunes primárias, tais como, linfócitos T humanos, por exemplo, pelo menos cerca de 25 graus Cel- sius (°C), geralmente pelo menos cerca de 30 °C, e geralmente a ou cerca de 37 °C. Em algumas modalidades, as células são incubadas a uma temperatura de 25 a 38 °C, tal como 30 a 37 °C, por exemplo a cerca de 37 °C ± 2 °C. Em algumas modalidades, a incubação é reali- zada por um período de tempo até a cultura, por exemplo, cultivo ou expansão, resulta em uma densidade desejada ou limiar, número ou dose de células. Em algumas modalidades, a incubação é maior ou maior que cerca de ou é por cerca de ou 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias ou mais.
[00269] Em algumas modalidades, as células são incubadas sob condições para manter uma quantidade alvo de dióxido de carbono na cultura de células. Em alguns aspectos, isso garante ótimo cultivo, ex- pansão e proliferação das células durante o crescimento. Em alguns aspectos, a quantidade de dióxido de carbono (CO2) está entre 10 % e 0 % (v/v) do referido gás, tal como, entre 8 % e 2 % (v/v) do referido gás, por exemplo, uma quantidade de ou cerca de 5 % (v/v) de CO2.
[00270] Em algumas modalidades, as células são incubadas usan- do recipientes, por exemplo, sacos, que são usados em conexão com um biorreator. Em alguns casos, o biorreator pode ser submetido a movimento ou balanço, o que, em alguns aspectos, pode aumentar a transferência de oxigênio. O movimento do biorreator pode incluir, po- rém, não é limitado a, girar ao longo de um eixo horizontal, girar ao longo de um eixo vertical, um movimento de balanço ao longo de um eixo horizontal inclinado ou inclinado do biorreator ou qualquer combi- nação dos mesmos. Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da incubação é realizada com balanço. A velocidade e o ângulo de ba- lanço podem ser ajustados para atingir uma agitação desejada. Em algumas modalidades, o ângulo do balanço é ou é de cerca de 20°, 19°, 18°, 17°, 16°, 15°, 14°, 13°, 12°, 11°, 10°, 9°, 8°, 7°, 6°, 5°, 4°, 3°, 2° ou 1°. Em certas modalidades, o ângulo do balanço está entre 6 a 16°. Em outras modalidades, o ângulo do balanço está entre 7 a 16°. Em outras modalidades, o ângulo do balanço está entre 8 a 12°. Em algumas modalidades, a taxa de balanço é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 rpm. Em algumas mo- dalidades, a taxa de balanço está entre 4 e 12 rpm, tal como, entre 4 e 6 rpm, inclusive. Pelo menos uma parte da expansão da cultura de cé- lulas é realizada com um movimento de balanço, tal como, em um ân- gulo entre 5° e 10°, tal como, 6°, a uma velocidade de balanço cons- tante, tal como, uma velocidade entre 5 e 15 RPM , tal como, 6 RMP ou 10 RPM. As células CD4+ e CD8+ são expandidas separadamente até que cada uma atinja uma quantidade limite ou densidade celular.
[00271] Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da incu- bação é realizada em condições estáticas. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da incubação é realizada com perfusão, tal como, para perfundir o meio gasto e perfundir em meio fresco durante a cultura. Em algumas modalidades, o método inclui uma etapa de perfusão de meio de cultura fresco na cultura de células, tal como, através de uma porta de alimentação. Em algumas modalidades, o meio de cultura adicionado durante a perfusão contém um ou mais agentes estimulantes, por exemplo, uma ou mais citocinas recombi- nantes, tais como, IL-2, IL-7 e/ou IL-15. Em algumas modalidades, o meio de cultura adicionado durante a perfusão é o mesmo meio de cul- tura usado durante uma incubação estática.
[00272] Em algumas modalidades, após a incubação, o recipiente, por exemplo, saco, é reconectado a um sistema para realizar uma ou mais outras etapas de processamento para a fabricação, geração ou produção da terapia celular, tal como, reconectado ao sistema que contém a câmara centrífuga. Em alguns aspectos, as células cultiva- das são transferidas do saco para a cavidade interna da câmara para formulação das células cultivadas.
[00273] Em algumas modalidades, a incubação é realizada por um período de tempo até a cultura, por exemplo, cultivo ou expansão, re- sulta em uma densidade desejada ou limiar, número ou dose de célu- las. Em algumas modalidades, as células cultivadas enquanto fecha- das, conectadas e/ou sob controle de um biorreator alcançam ou atin- gem uma expansão limiar, esferagem de células e/ou densidade em 21 dias, 14 dias, 10 dias, 8 dias, 7 dias, 6 dias, 5 dias, 4 dias, 3 dias, 2 dias, 60 horas, 48 horas, 36 horas, 24 horas ou 12 horas. Em algumas modalidades, a incubação é realizada durante mais ou mais que cerca de ou é durante cerca de ou durante 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias ou mais. Em al- guns aspectos, a incubação é encurtada ou abreviada, tal como, por menos ou menos que cerca de ou é durante cerca de ou durante 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas ou 96 horas, após a introdução do ácido nucleico. Em alguns aspectos, a incubação é suficiente para permitir a liberação e integração da sequência de transgene no geno- ma das células.
[00274] Em algumas modalidades, as células são cultivadas por um período de tempo reduzido ou abreviado ou estão sujeitas a um pro- cesso de fabricação não expandido. Em alguns aspectos, as células são cultivadas por menos ou menos que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias após a introdução dos ácidos nucleicos, por exemplo, por meio de transdução ou eletroporação. Em algumas modalidades, as células são cultivadas por cerca de 2-3 dias, 3-4 dias, 4-5 dias, 5-6 dias ou 6-7 dias ou menos, cada inclusive.
[00275] Em alguns aspectos, os métodos podem ser usados para determinar um comprimento adequado de incubação da célula após a introdução dos polinucleotídeos que compreendem as sequências de transgene, nas quais a maioria ou substancialmente toda a integração é concluída. Em alguns aspectos, os métodos permitem a determina- ção do comprimento adequado de incubação que pode maximizar a integração, mas reduz a exaustão das células modificadas. Em alguns aspectos, a célula ou população ou pluralidade de células não são in- cubadas a uma temperatura superior a 25 °C durante mais de 48, 54, 60, 66 ou 72 horas após a introdução do polinucleotídeo compreen- dendo a sequência de transgene na célula. Em alguns aspectos, a cé- lula não é incubada a uma temperatura superior a 25 °C durante mais de 72 horas após a introdução do polinucleotídeo que compreende a sequência de transgene na célula. Em alguns aspectos, a célula não é incubada a uma temperatura superior a cerca de 30 °C e inferior a cer- ca de 40 °C durante mais de 72 horas após a introdução do polinucleo- tídeo compreendendo a sequência de transgene na célula. F. Células Exemplares para Avaliação
[00276] Em alguns aspectos, os métodos fornecidos podem ser rea-
lizados em uma pluralidade de células ou uma única célula isolada que foi submetida a algumas ou todas as etapas de um processo de modi- ficação de células, incluindo um processo de fabricação expandido ou não expandido. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos são realizados durante um ou mais pontos no tempo, tais como, durante ou após um ou mais pontos no tempo de um processo de modificação de células. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos são realiza- dos após a conclusão de um processo de modificação ou fabricação de células, incluindo processos de modificação ou fabricação que in- cluem uma etapa de expansão, ou que não incluem uma etapa de ex- pansão, ou é um processo abreviado ou reduzido. Em algumas moda- lidades, os métodos fornecidos podem ser realizados em uma amostra de um indivíduo que recebeu uma terapia celular. Em alguns aspectos, a amostra pode incluir o sangue ou soro ou órgão ou amostra de teci- do (por exemplo, sítio da doença, tal como, uma amostra de tumor) do indivíduo, obtido após a administração da terapia celular.
[00277] Em algumas modalidades, as células que são modificadas e avaliadas de acordo com os métodos fornecidos são células primá- rias. Em algumas modalidades, as células são células imunes ou célu- las imunes enriquecidas. Em algumas modalidades, as células são cé- lulas T ou enriquecidas com células T. Em algumas modalidades, as células são células T CD4+ ou células T CD4+ enriquecidas. Em al- gumas modalidades, as células são células T CD8+ ou células T CD8+ enriquecidas. Em algumas modalidades, as células compreendem cé- lulas geneticamente modificadas ou uma população enriquecida de células geneticamente modificadas. Em algumas modalidades, as cé- lulas compreendem células a serem geneticamente modificadas ou sendo geneticamente modificadas ou que foram geneticamente modi- ficadas, tais como, células em uma ou mais etapas ou etapas de um processo de fabricação ou modificação. Em algumas modalidades, as células compreendem uma população enriquecida de células a serem geneticamente modificadas ou sendo geneticamente modificadas. Em algumas modalidades, as células compreendem células T modificadas geneticamente ou uma população enriquecida de células T modifica- das geneticamente. Em algumas modalidades, as células são modifi- cadas para expressar uma proteína recombinante, tal como, um recep- tor recombinante ou uma porção do mesmo. Em algumas modalida- des, o receptor recombinante é ou compreende um receptor de antí- geno quimérico (CAR). Em algumas modalidades, as células foram previamente criopreservadas. Em algumas modalidades, as células não foram criopreservadas anteriormente. Em algumas modalidades, os métodos podem ser realizados em células antes da criopreserva- ção. Em algumas modalidades, os métodos podem ser realizados em células antes da administração das células ou composições de células a um indivíduo. Em algumas modalidades, as células alvejam especifi- camente uma célula tumoral.
[00278] Em algumas modalidades, as células são cultivadas por um período de tempo reduzido ou abreviado ou estão sujeitas a um pro- cesso de fabricação não expandido. Em alguns aspectos, as células são cultivadas durante menos ou menos do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias após a introdução dos ácidos nucleicos que codificam a proteína recombinante, por exemplo, por meio de transdução ou ele- troporação. Em algumas modalidades, as células são cultivadas du- rante cerca de 2-3 dias, 3-4 dias, 4-5 dias, 5-6 dias ou 6-7 dias ou me- nos, cada inclusive. Em alguns aspectos, as células que são avaliadas em um ou mais pontos de tempo selecionados a partir do dia 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 após a introdução dos ácidos nucleicos, por exemplo, por meio de transdução ou eletroporação.
[00279] Em alguns aspectos, os métodos fornecidos podem ser rea- lizados uma ou mais vezes após a introdução do polinucleotídeo, mas sem expansão, por exemplo, a célula modificada não foi incubada a uma temperatura superior a 25 °C, opcionalmente a ou cerca de 37 °C ± 2 °C, durante mais de 96, 72 ou 48 horas após a introdução do poli- nucleotídeo compreendendo a sequência de transgene.
[00280] Em modalidades particulares, uma ou mais avaliações, tal como, avaliação de sequências de transgene integradas e/ou não in- tegradas de acordo com os métodos fornecidos aqui, são realizadas antes das células modificadas serem liberadas para infusão, prontas para administração a um indivíduo, e/ou administradas a um indivíduo, tal como, para terapia celular. Em modalidades particulares, as células modificadas são liberadas para infusão, prontas para administração a um indivíduo e/ou administradas a um indivíduo após uma ou mais avaliações terem sido realizadas, por exemplo, em uma porção, fração e/ou amostra de células modificadas. Em modalidades particulares, as células modificadas são liberadas para infusão, prontas para adminis- tração a um indivíduo e/ou administradas a um indivíduo após as célu- las modificadas serem determinadas como seguras, por exemplo, es- téreis e/ou livres e/ou têm as características biológicas desejadas após a conclusão de uma ou mais avaliações.
[00281] Em alguns aspectos, o polinucleotídeo contendo sequên- cias de transgene é introduzido na célula usando vários métodos de libaração, tal como, transdução viral. Em algumas modalidades, as cé- lulas modificadas, tais como, células modificadas para terapia de célu- las adotivas, devem ser monitoradas ou avaliadas para várias caracte- rísticas e aspectos, tal como, determinar o nível de expressão da pro- teína recombinante codificada pelas sequências de transgene, e/ou determinar o número de cópias das sequências de transgene que são integradas ao genoma da célula, tal como, integradas de forma estável no genoma da célula. Em alguns aspectos, tal avaliação pode ser rea- lizada em um ou mais pontos de tempo durante o processo de modifi-
cação ou fabricação. III. SEQUÊNCIAS DE TRANSGENE
[00282] Em alguns aspectos, as modalidades fornecidas são usa- das em conexão com a avaliação da integração de sequências de transgene. Em alguns aspectos, os polinucleotídeos introduzidos nas células para modificação, por exemplo, usando qualquer um dos mé- todos para a introdução de uma sequência polinucleotídica descrita na Seção II acima, contêm sequências de transgene que devem ser inte- gradas no genoma da célula. Em alguns aspectos, a porção da se- quência de transgene do polinucleotídeo é designada para ser integra- da no genoma da célula. Em alguns casos, a sequência de transgene pode se referir a uma porção do polinucleotídeo que está integrada no genoma da célula.
[00283] Em alguns aspectos, as sequências de transgene (também chamadas de sequências quiméricas, DNA quimérico ou DNA recom- binante) incluem sequências de ácido nucleico que foram formadas artificialmente combinando constituintes de diferentes fontes, tais co- mo, diferentes organismos, diferentes genes ou diferentes variantes. Em alguns aspectos, as sequências de transgene foram submetidas a uma manipulação biológica molecular, por exemplo, por combinação artificial de diferentes moléculas de ácido nucleico ou fragmentos de diferentes fontes. Em algumas modalidades, as sequências de trans- gene contêm pelo menos alguma porção das sequências que são de uma origem diferente em comparação com a sequência genômica das células nas quais o polinucleotídeo contendo a sequência de transge- ne é introduzido. Por exemplo, pelo menos uma porção da sequência de transgene é heteróloga, exógena ou transgênica para a célula, que em alguns casos é uma célula primária isolada de um indivíduo que é candidato à administração das células modificadas.
[00284] Em alguns aspectos, a sequência de transgene que é inte-
grada na célula, inclui sequências codificantes e/ou não codificantes e/ou sequências codificantes parciais das mesmas, que são inseridas ou integradas no genoma da célula. Em alguns aspectos, a integração pode ser aleatória, semialeatória ou alvejada. Em alguns aspectos, as sequências de transgene podem conter fragmentos de sequência de ácido nucleico compreendendo arranjos que não ocorrem naturalmen- te, tais como, fragmentos de diferentes origens unidos. Em alguns as- pectos, a sequência de transgene não é uma sequência de ocorrência natural. Em algumas modalidades, a sequência de transgene não codi- fica uma proteína gag viral completa. Em algumas modalidades, a se- quência de transgene não compreende um genoma de HIV completo, um genoma viral competente para replicação e/ou genes acessórios, cujos genes acessórios são opcionalmente Nef, Vpu, Vpx, Vif e/ou Vpr. Em alguns aspectos, a sequência de transgene está contida no polinu- cleotídeo que é introduzido na célula, por exemplo, de acordo com os métodos para a introdução do polinucleotídeo aqui descrito. Em alguns aspectos, a sequência de transgene codifica a totalidade ou uma por- ção de uma ou mais proteínas recombinantes. Em alguns aspectos, a proteína recombinante codificada pela sequência de transgene é um receptor recombinante, tal como, um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de célula T recombinante (TCR). Em algumas modalidades, a sequência de transgene codifica uma ou mais proteí- nas recombinantes adicionais.
[00285] Em alguns aspectos, a sequência de transgene também contém um ou mais elementos não codificantes, reguladores ou de controle, tais como, um promotor, um realçador, um elemento regula- dor pós-transcricional (PRE), um íntron, um isolador, um sinal de poli- adenilação, uma sequência de terminação da transcrição, uma se- quência de consenso Kozak, um elemento multicistrônico (por exem- plo, sítios de entrada do ribossoma interno (IRES), uma sequência
2A), sequências correspondentes a regiões não translatadas (UTR) de um RNA mensageiro (mRNA) e receptor de emenda ou sequências de doadores.
[00286] Em alguns aspectos, qualquer porção da sequência de transgene a ser integrada pode ser detectada para determinar a pre- sença, ausência ou quantidade da sequência de transgene em qual- quer um dos métodos aqui fornecidos. Em alguns aspectos, a porção da sequência de transgene que é detectada pode ser uma porção que está dentro da sequência que é heteróloga, exógena ou transgênica para a célula, de modo que a sequência integrada heteróloga, exóge- na ou transgênica pode ser especificamente detectada e distinguida de quaisquer sequências genômicas endógenas similares da célula. Em alguns aspectos, o método para determinar a presença, ausência ou quantidade, tal como qualquer aqui descrito, por exemplo na Seção I acima, pode ser realizado usando sondas que podem detectar especi- ficamente uma porção da sequência de transgene, ou sequências de iniciador que podem especificamente amplificar uma porção da se- quência de transgene. Em alguns aspectos, as sequências de sonda ou iniciador podem detectar, ligar ou reconhecer especificamente uma porção da sequência de transgene, tal como, uma porção da sequên- cia de transgene que é heteróloga, exógena ou transgênica para a cé- lula. Em alguns aspectos, as sequências de sonda ou iniciador podem detectar, ligar ou reconhecer especificamente uma porção da sequên- cia de transgene, tal como, uma porção da sequência de transgene que está integrada no genoma. Em algumas modalidades, a sequência de transgene não codifica uma proteína gag viral.
[00287] Em algumas modalidades, a sequência de transgene con- tém um ou mais promotores que estão operativamente ligados para controlar a expressão da proteína recombinante codificada, por exem- plo, receptor recombinante. Em alguns exemplos, a sequência de transgene contém dois, três ou mais promotores operativamente liga- dos para controlar a expressão da proteína recombinante codificada. Em algumas modalidades, a sequência de transgene pode conter se- quências regulatórias, tais como, códons de iniciação e terminação da transcrição e translação, que são específicos para o tipo de hospedei- ro (por exemplo, bactéria, fungo, planta ou animal) no qual a sequên- cia de transgene deve ser introduzida, conforme apropriado e levando em consideração se a sequência de transgene é baseada em DNA ou RNA. Em algumas modalidades, a sequência de transgene pode con- ter elementos reguladores/de controle, tais como, um promotor, um realçador, um elemento regulador pós-transcricional (PRE), um íntron, um sinal de poliadenilação, uma sequência de consenso Kozak, sítios de entrada de ribossoma interno (IRES), uma sequência 2A e um doa- dor ou receptor de emenda. Em algumas modalidades, a sequência de transgene pode conter um promotor não nativo operacionalmente liga- do à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína recombinante e/ou um ou mais polipeptídeo(s) adicional(is). Em algumas modalida- des, o promotor é selecionado a partir de um promotor de RNA pol I, pol II ou pol III. Em algumas modalidades, o promotor é reconhecido pela RNA polimerase II (por exemplo, um CMV, região inicial de SV40 ou promotor tardio principal de adenovírus). Em outra modalidade, o promotor é reconhecido pela RNA polimerase III (por exemplo, um promotor U6 ou H1). Em algumas modalidades, o promotor pode ser um promotor não viral ou um promotor viral, tais como, um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor de SV40, um promotor de RSV e um promotor encontrado na repetição de terminal longo do ví- rus de célula tronco de murino. Outros promotores conhecidos também são contemplados.
[00288] Em algumas modalidades, o promotor é ou compreende um promotor constitutivo. Promotores constitutivos exemplares incluem,
por exemplo, promotor precoce de vírus símio 40 (SV40), promotor precoce imediato de citomegalovírus (CMV), promotor de Ubiquitina C humana (UBC), promotor de fator de alongamento humano 1α (EF1α), promotor de fosfoglicerato cinase 1 de camundongo (PGK) , e promo- tor de β-Actina de frango acoplado ao realçador precoce de CMV (CAGG). Em algumas modalidades, o promotor constitutivo é um pro- motor sintético ou modificado. Em algumas modalidades, o promotor é ou compreende um promotor MND, um promotor sintético que contém a região U3 de um LTR MoMuLV modificado com realçador do vírus do sarcoma mieloproliferativo (veja, Challita et al. (1995) J. Virol. 69 (2): 748-755). Em algumas modalidades, o promotor é um promotor específico de tecido. Em outra modalidade, o promotor é um promotor viral. Em outra modalidade, o promotor é um promotor não viral. Em algumas modalidades, os promotores exemplares podem incluir, po- rém, não estão limitados a, promotor do fator de alongamento humano 1 alfa (EF1α) ou uma forma modificada do mesmo ou o promotor MND.
[00289] Em algumas modalidades, o promotor é um promotor regu- lado (por exemplo, promotor induzível). Em algumas modalidades, o promotor é um promotor induzível ou um promotor reprimível. Em al- gumas modalidades, o promotor compreende uma sequência de ope- rador Lac, uma sequência de operador de tetraciclina, uma sequência de operador de galactose ou uma sequência de operador de doxicicli- na, ou é um análogo das mesmas ou é capaz de ser ligado ou reco- nhecido por um repressor Lac ou um repressor de tetraciclina, ou um análogo dos mesmos. Em algumas modalidades, a sequência de transgene não inclui um elemento regulatório, por exemplo, promotor.
[00290] Em alguns aspectos, a sequência de transgene contém um elemento regulatório que pode realçar a expressão da proteína recom- binante codificada, tal como, um elemento regulatório pós-
transcricional (PRE), tais como, elementos reguladores pós- transcricionais de ação cis.
Em alguns aspectos, a sequência de transgene contém um elemento regulatório que pode realçar a expres- são da proteína recombinante codificada, tal como, um elemento regu- latório pós-transcricional (PRE), operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína recombinante.
Em algumas modalidades, o elemento regulatório é um elemento regulatório pós- transcricional viral ou uma forma modificada do mesmo, tal como, um PRE derivado de vírus da hepatite, tais como, o vírus da hepatite da marmota (WHV) ou vírus da hepatite B (HBV), por exemplo, elementos reguladores pós-transcricionais da hepatite (HPREs), tais como, o elemento regulatório pós-transcricional do vírus da hepatite da marmo- ta (WPRE), elemento regulatório pós-transcricional do vírus da hepati- te B (HBVPRE). PREs derivados do vírus da hepatite, incluindo WPREs e HBVPREs, podem geralmente promover, por exemplo, real- çar, a expressão de sequências de codificação operacionalmente liga- das aos mesmos, facilitando a exportação de RNA pós-transcricional do núcleo.
Estruturas secundárias e terciárias formadas por sequên- cias de ação cis ou elementos contidos nos PREs podem promover tais funções.
Por exemplo, os PREs derivados do vírus da hepatite de tipo selvagem geralmente incluem um subelemento alfa e um subele- mento beta, que cada um forma independentemente estruturas alça de tronco, que afetam e/ou estão envolvidas na atividade pós- transcricional de PRE completa (Smith et al. (1998) Nucleic Acids Re- search, 26: 4818-4827). Alguns PREs de vírus da hepatite não huma- na de tipo selvagem, tal como, WPRE, também incluem um subele- mento gama que pode realçar ainda mais a atividade pós- transcricional.
Tais subelementos podem ter ou codificar RNAs com estruturas que promovem a exportação de RNA do núcleo, por exem- plo, através da interação com maquinaria de exportação dependente e/ou independente de CRM1, fornecem sítios de ligação para proteí- nas celulares, realçam a quantidade total de RNA, por exemplo, RNA recombinante e/ou heterólogo, transcritos, aumentam a estabilidade do RNA, aumentam o número de transcritos poliadenilados e/ou aumen- tam o tamanho das caudas poliadeniladas em tais transcritos. Em al- gumas modalidades, o elemento regulatório pós-transcricional é um elemento regulatório pós-transcricional do vírus da hepatite da marmo- ta (WPRE).
[00291] Em alguns casos, a sequência de ácido nucleico que codifi- ca a proteína recombinante, por exemplo, receptor recombinante, con- tém uma sequência de sinal que codifica um peptídeo de sinal. Em al- guns aspectos, a sequência de sinal pode codificar um peptídeo de sinal derivado de um polipeptídeo nativo. Em outros aspectos, a se- quência de sinal pode codificar um peptídeo de sinal heterólogo ou não nativo, tal como, o peptídeo de sinal exemplar da cadeia alfa GMCSFR estabelecida em SEQ ID NO: 25 e codificado pela sequên- cia de nucleotídeo estabelecida em SEQ ID NO: 24. Em alguns casos, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína recombinante, por exemplo, receptor recombinante, tal como, um receptor de antíge- no quimérico (CAR), contém uma sequência de sinal que codifica um peptídeo de sinal. Peptídeos de sinal exemplares não limitantes inclu- em, por exemplo, o peptídeo de sinal de cadeia alfa GMCSFR estabe- lecido em SEQ ID NO: 25 e codificado pela sequência de nucleotídeos estabelecida em SEQ ID NO: 24, ou o peptídeo sinal CD8 alfa estabe- lecido em SEQ ID NO: 26.
[00292] Em algumas modalidades, a sequência de transgene con- tém uma sequência de ácido nucleico que codifica um ou mais poli- peptídeos adicionais, por exemplo, um ou mais marcador(es) e/ou uma ou mais moléculas efetoras. Em algumas modalidades, um ou mais marcador(es) inclui um marcador de transdução, um marcador substi-
tuto e/ou um marcador de seleção. Entre as sequências de ácido nu- cleico adicionais introduzidas, por exemplo, codificando para um ou mais polipeptídeo(s) adicional(is), incluem sequências de ácido nuclei- co que podem melhorar a eficácia da terapia, tais como, por meio da promoção da viabilidade e/ou função das células transferidas; sequên- cias de ácido nucleico para fornecer um marcador genético para sele- ção e/ou avaliação das células, tal como, para avaliar a sobrevivência ou localização in vivo; sequências de ácido nucléico para melhorar a segurança, por exemplo, tornando a célula susceptível à seleção ne- gativa in vivo, cono descrito por Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11: 6 (1991); e Riddell et al., Human Gene Therapy 3: 319-338 (1992); veja também WO 1992008796 e WO 1994028143 que descrevem o uso de genes de fusão selecionáveis bifuncionais derivados da fusão de um marcador selecionável positivo dominante com um marcador selecionável negativo e Patente Norte-americana Nº 6.040.177.
[00293] Em algumas modalidades, o marcador é um marcador de transdução ou um marcador substituto. Um marcador de transdução ou um marcador substituto pode ser usado para detectar células que foram introduzidas com a sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante, por exemplo, receptor recombinante. Em algumas modalidades, o marcador de transdução pode indicar ou con- firmar a modificação de uma célula. Em algumas modalidades, o mar- cador substituto é uma proteína que é feita para ser coexpressa na superfície celular com a proteína recombinante, por exemplo, receptor recombinante, tal como, um CAR. Em modalidades particulares, tal marcador substituto é uma proteína de superfície que foi modificada para ter pouca ou nenhuma atividade. Em certas modalidades, o mar- cador substituto é codificado na mesma sequência de transgene que codifica a proteína recombinante, por exemplo, receptor recombinante. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína recombinante, por exemplo, receptor recombinante, está operacionalmente ligada a uma sequência de ácido nucleico que codi- fica um marcador, opcionalmente separada por um sítio de entrada de ribossoma interno (IRES), ou um ácido nucleico que codifica um peptí- deo de autoclivagem ou um peptídeo que causa o salto do ribossoma, tal como, uma sequência 2A. Genes marcadores extrínsecos podem, em alguns casos, ser utilizados em conexão com células modificadas para permitir a detecção ou seleção de células e, em alguns casos, também para promover a eliminação celular e/ou suicídio celular.
[00294] Marcadores substitutos exemplares podem incluir formas truncadas de polipeptídeos da superfície celular, tais como, formas truncadas que não são funcionais e não transduzem ou não são capa- zes de transduzir um sinal ou um sinal normalmente transduzido pela forma de comprimento total da polipeptídeo de superfície celular e/ou não são ou não são capazes de internalizar. Polipeptídeos de superfí- cie celular truncados exemplares, incluindo formas truncadas de fato- res de crescimento ou outros receptores, tais como, um receptor de fator de crescimento epidérmico humano truncado 2 (tHER2), um re- ceptor de fator de crescimento epidérmico truncado (tEGFR, sequên- cia de tEGFR exemplar estabelecida em SEQ ID NO: 7 ou 16 ) ou um antígeno de membrana específico da próstata (PSMA) ou forma modi- ficada dos mesmos, tal como, um PSMA truncado (tPSMA). Em alguns aspectos, tEGFR pode conter um epítopo reconhecido pelo anticorpo cetuximabe (Erbitux®) ou outro anticorpo anti-EGFR terapêutico ou molécula de ligação, que pode ser usado para identificar ou selecionar células que foram modificadas com o construto tEGFR e uma proteína exógena codificada e/ou para eliminar ou separar células que expres- sam a proteína exógena codificada. (Veja, Patente Norte-americana No. 8.802.374 e Liu et al., Nature Biotech. Abril de 2016; 34 (4): 430– 434). Em alguns aspectos, o marcador, por exemplo, marcador substi-
tuto inclui a totalidade ou parte (por exemplo, forma truncada) de CD34, um NGFR, um CD19 ou um CD19 truncado, por exemplo, um CD19 não humano truncado. Um polipeptídeo exemplar para um EGFR truncado (por exemplo, tEGFR) compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7 ou 16 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais identidade de sequência para SEQ ID NO: 7 ou 16.
[00295] Em algumas modalidades, o marcador é ou compreende uma proteína detectável, tal como, uma proteína fluorescente, tais co- mo, a proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente verde realçada (EGFP), tais como, GFP super negrito (sfGFP), proteína fluo- rescente vermelha (RFP), tais como, tdTomato, mCherry, mStrawber- ry, AsRed2, DsRed ou DsRed2, proteína fluorescente ciano (CFP), proteína fluorescente verde azulado (BFP), proteína fluorescente azul realçado (EBFP) e proteína fluorescente amarela (YFP), e variantes das mesmas, incluindo variantes de espécies, variantes monoméricas, variantes otimizadas de códons, estabilizadas e/ou realçadas das pro- teínas fluorescentes. Em algumas modalidades, o marcador é ou com- preende uma enzima, tais como, uma luciferase, o gene lacZ de E. co- li, fosfatase alcalina, fosfatase alcalina embrionária secretada (SEAP), cloranfenicol acetil transferase (CAT). Genes repórter emissores de luz exemplares incluem luciferase (luc), β-galactosidase, cloranfenicol acetil transferase (CAT), β-glucuronidase (GUS) ou variantes dos mesmos. Em alguns aspectos, a expressão da enzima pode ser detec- tada pela adição de um substrato que pode ser detectado na expres- são e atividade funcional da enzima.
[00296] Em algumas modalidades, o marcador é um marcador de seleção. Em algumas modalidades, o marcador de seleção é ou com- preende um polipeptídeo que confere resistência a agentes exógenos ou fármacos. Em algumas modalidades, o marcador de seleção é um gene de resistência a antibióticos. Em algumas modalidades, o marca- dor de seleção é um gene de resistência a antibióticos que confere re- sistência a antibióticos a uma célula de mamífero. Em algumas moda- lidades, o marcador de seleção é ou compreende um gene de resis- tência à Puromicina, um gene de resistência à Higromicina, um gene de resistência à Blasticidina, um gene de resistência à Neomicina, um gene de resistência à Geneticina ou um gene de resistência à Zeocina ou uma forma modificada dos mesmos.
[00297] Qualquer uma das proteínas recombinantes, por exemplo, receptor recombinante, e/ou o(s) polipeptídeo(s) adicional(is) aqui des- crito(s) pode ser codificado por uma ou mais sequências de transgene contendo uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam proteína recombinante, por exemplo, receptor recombinante, em quaisquer combinações, orientação ou disposições. Por exemplo, uma, duas, três ou mais sequências de transgene podem codificar um, dois, três ou mais polipeptídeos diferentes, por exemplo, receptor re- combinante, ou porções ou componentes dos mesmos, e/ou um ou mais polipeptídeos adicionais, por exemplo, um marcador e/ou uma molécula efetora. Em algumas modalidades, uma sequência de trans- gene contém uma sequência de ácido nucleico que codifica uma prote- ína recombinante, por exemplo, receptor recombinante, tal como um CAR, ou porção ou componentes do mesmo, e uma sequência de áci- do nucleico que codifica um ou mais polipeptídeo (s) adicional (is). Em algumas modalidades, um vetor ou construto contém uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante, por exem- plo, receptor recombinante, tal como, um CAR, ou parte ou componen- tes do mesmo, e um vetor ou construto separado contém uma se- quência de ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptídeos adi- cionais. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína recombinante, por exemplo, receptor recombinante, e a sequência de ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptí- deo(s) adicional(is) estão operacionalmente ligadas a dois promotores diferentes. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a proteína recombinante, por exemplo, receptor recombinante, está pre- sente a montante do ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptí- deo(s) adicional(is). Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a proteína recombinante, por exemplo, receptor recombinante, está presente a jusante do ácido nucleico que codifica um ou mais po- lipeptídeo(s) adicional(is).
[00298] Em certos casos, uma sequência de transgene contém se- quências de ácido nucleico que codificam duas ou mais cadeias poli- peptídicas diferentes, por exemplo, uma proteína recombinante, por exemplo, receptor recombinante, e um ou mais polipeptídeos adicio- nais, por exemplo, um marcador e/ou uma molécula efetora. Em algu- mas modalidades, as sequências de ácido nucleico que codificam du- as ou mais cadeias polipeptídicas diferentes, por exemplo, uma proteí- na recombinante, por exemplo, receptor recombinante e um ou mais polipeptídeo(s) adicional(is), estão presentes em duas sequências de transgene separadas. Por exemplo, duas sequências de transgene separadas são fornecidas e cada uma pode ser transferida individual- mente ou introduzida na célula para expressão na célula. Em algumas modalidades, as sequências de ácido nucleico que codificam o marca- dor e as sequências de ácido nucleico que codificam a proteína re- combinante, por exemplo, receptor recombinante, estão presentes ou inseridas em diferentes locais dentro do genoma da célula. Em algu- mas modalidades, as sequências de ácido nucleico que codificam o marcador e as sequências de ácido nucleico que codificam a proteína recombinante, por exemplo, receptor recombinante, estão operacio- nalmente ligadas a dois promotores diferentes.
[00299] Em algumas modalidades, tais como, aquelas em que a sequência de transgene contém uma primeira e uma segunda sequên- cia de ácido nucleico, as sequências de codificação que codificam ca- da uma das diferentes cadeias polipeptídicas podem ser operativa- mente ligadas a um promotor, que pode ser o mesmo ou diferente. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico pode conter um promotor que conduz a expressão de duas ou mais cadeias polipeptí- dicas diferentes. Em algumas modalidades, tais moléculas de ácido nucleico podem ser multicistrônicas (bicistrônicas ou tricistrônicas, ve- ja, por exemplo, Patente Norte-americana nº 6.060.273). Em algumas modalidades, as sequências de ácido nucleico que codificam a proteí- na recombinante, por exemplo, receptor recombinante, e as sequên- cias de ácido nucleico que codificam um ou mais polipeptídeos adicio- nais estão operativamente ligadas ao mesmo promotor e são opcio- nalmente separadas por um sítio de entrada de ribossoma interno (IRES), ou um ácido nucleico que codifica um peptídeo autoclivável ou um peptídeo que causa o salto do ribossoma, tal como, um elemento 2A. Por exemplo, um marcador exemplar e, opcionalmente, uma se- quência de salto de ribossoma, podem ser qualquer um como descrito na publicação PCT. No. WO2014031687.
[00300] Em algumas modalidades, as unidades de transcrição po- dem ser modificadas como uma unidade bicistrônica contendo um IRES, que permite a coexpressão de produtos gênicos (por exemplo, codificação da proteína recombinante, por exemplo, receptor recombi- nante e o polipeptídeo adicional) por uma mensagem de um único promotor. Alternativamente, em alguns casos, um único promotor pode direcionar a expressão de um RNA que contém, em uma única estrutu- ra de leitura aberta (ORF), dois ou três genes (por exemplo, codifican- do o marcador e codificando a proteína recombinante, por exemplo, receptor recombinante) separados um do outro por sequências que codificam um peptídeo de autoclivagem (por exemplo, sequências 2A) ou um sítio de reconhecimento de protease (por exemplo, furina). A ORF codifica assim um único polipéptido, que, durante (no caso de 2A) ou após a translação, é processado nas proteínas individuais. Em alguns casos, o peptídeo, tal como, um T2A, pode causar com que o ribossoma salte (salto do ribossoma) a síntese de uma ligação peptídi- ca no terminal C de um elemento 2A, levando à separação entre a ex- tremidade da sequência 2A e o próximo peptídeo a jusante (veja, por exemplo, de Felipe, Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) e de Feli- pe et al. Traffic 5: 616-626 (2004)). Vários elementos 2A são conheci- dos. Exemplos de sequências 2A que podem ser usadas nos métodos e sistema descritos aqui, sem limitação, sequências 2A do vírus da febre aftosa (F2A, por exemplo, SEQ ID NO: 21), vírus da rinite A equina (E2A, por exemplo, SEQ ID NO: 20), Thosea asigna vírus (T2A, por exemplo, SEQ ID NO: 6 ou 17) e teschovírus-1 porcino (P2A, por exemplo, SEQ ID NO: 18 ou 19) conforme descrito na Pub. De Patente Norte-americana No. 20070116690. A. Receptores Recombinantes
[00301] Em algumas modalidades, as células ou composições celu- lares que são avaliadas para a integração de sequências de transge- ne, contêm sequências de transgene que codificam uma proteína re- combinante. Em algumas modalidades, as sequências de transgene incluem sequências de ácido nucleico que codificam um receptor re- combinante e outros elementos como descrito acima. Em algumas modalidades, a proteína recombinante codificada pelas sequências de transgene integradas é um receptor recombinante. Em alguns aspec- tos, as sequências de transgene codificam um receptor recombinante ou uma porção do mesmo. Em algumas modalidades, as células que são tratadas, processadas, modificadas e/ou produzidas conforme aqui descrito, por exemplo, na Seção I, contêm ou expressam, ou são modificadas para conter ou expressar, uma proteína recombinante, tal como, um receptor recombinante, por exemplo, um receptor de antí- geno quimérico (CAR) ou um receptor de células T (TCR). Em certas modalidades, os métodos de fabricação ou modificação descritos pro- duzem e/ou são capazes de produzir células, ou populações ou com- posições contendo e/ou enriquecidas para células, que são modifica- das para expressar ou conter uma proteína recombinante, tal como, um receptor recombinante, por virtude da integração das sequências de transgene. Em algumas modalidades, células T, ou populações ou composições de células T, são tratadas, processadas, modificadas e/ou produzidas.
[00302] Em alguns aspectos, o receptor recombinante codificado é um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de célula T recombinante (TCR). Entre os receptores recombinantes estão os re- ceptores quiméricos, receptores de antígenos e receptores contendo um ou mais componentes de receptores quiméricos ou receptores de antígenos. Os receptores recombinantes podem incluir aqueles que contêm domínios de ligação ao ligante ou fragmentos de ligação dos mesmos e domínios ou regiões de sinalização intracelular. Em algu- mas modalidades, os receptores recombinantes codificados pelas cé- lulas modificadas incluem receptores de antígenos não-TCR funcio- nais, receptores de antígenos quiméricos (CARs), receptor de autoan- ticorpos quiméricos (CAAR), receptores de células T recombinantes (TCRs) e regiões, domínios ou componentes de qualquer um dos ante- riores, incluindo uma ou mais cadeias polipeptídicas de um receptor recombinante de cadeias múltiplas. O receptor recombinante, tal co- mo, um CAR, geralmente inclui o domínio de ligação ao antígeno ex- tracelular (ou ligante) ligado a um ou mais componentes de sinalização intracelular, em alguns aspectos por meio de ligantes e/ou domínio(s) de transmembrana. Em algumas modalidades, os receptores recombi-
nantes exemplares expressos a partir da célula modificada incluem receptores de cadeias múltiplas que contêm dois ou mais polipeptí- deos de receptor, que, em alguns casos, contêm diferentes componen- tes, domínios ou regiões. Em alguns aspectos, o receptor recombinan- te contém dois ou mais polipeptídeos que, juntos, compreendem um receptor recombinante funcional. Em alguns aspectos, o receptor de cadeias múltiplas é um receptor de cadeia dupla, compreendendo dois polipeptídeos que, juntos, compreendem um receptor recombinante funcional. Em algumas modalidades, o receptor recombinante é um TCR compreendendo dois polipeptídeos receptores diferentes, por exemplo, uma cadeia TCR alfa (TCRα) e uma TCR beta (TCRβ); ou uma cadeia TCR gama (TCRγ) e uma TCR delta (TCRδ). Em algumas modalidades, o receptor recombinante é um receptor de cadeias múlti- plas em que um ou mais dos polipeptídeos regula, modifica ou controla a expressão, atividade ou função de outro polipeptídeo receptor. Em alguns aspectos, os receptores de múltiplas cadeias permitem a regu- lação espacial ou temporal ou o controle da especificidade, atividade, ligação do antígeno (ou ligante), função e/ou expressão do receptor.
1. Receptores de Antígenos Quiméricos (CARs)
[00303] Em algumas modalidades, o receptor recombinante codifi- cado é o receptor de antígeno quimérico (CAR) com especificidade para um determinado antígeno (ou marcador ou ligante), tal como um antígeno expresso na superfície de um determinado tipo de célula. Em algumas modalidades, o antígeno é um polipeptídeo. Em algumas mo- dalidades, é um carboidrato ou outra molécula. Em algumas modalida- des, o antígeno é seletivamente expresso ou superexpresso em célu- las da doença ou condição, por exemplo, o tumor ou células patogêni- cas, em comparação com células ou tecidos normais ou não alveja- dos. Em outras modalidades, o antígeno é expresso em células nor- mais e/ou é expresso nas células modificadas.
[00304] Em modalidades particulares, o receptor recombinante, tal como receptor quimérico, contém uma região de sinalização intracelu- lar, que inclui um domínio ou região de sinalização citoplasmática (também indistintamente chamado de domínio ou região de sinaliza- ção intracelular), como uma região citoplasmática (intracelular) capaz de induzir um sinal de ativação primário em uma célula T, por exem- plo, um domínio de sinalização citoplasmática ou região de um com- ponente receptor de células T (TCR) (por exemplo, um domínio de si- nalização citoplasmática ou região de uma cadeia zeta de uma cadeia CD3-zeta (CD3ζ) ou uma variante funcional ou porção de sinalização da mesma) e/ou que compreende um motivo de ativação com base em tirosina de imunorreceptor (ITAM).
[00305] Em algumas modalidades, o receptor quimérico contém ainda um domínio de ligação ao ligante extracelular que se liga especi- ficamente a um antígeno ligante (por exemplo, antígeno). Em algumas modalidades, o receptor quimérico é um CAR que contém um domínio de reconhecimento de antígeno extracelular que se liga especifica- mente a um antígeno. Em algumas modalidades, o ligante, como um antígeno, é uma proteína expressa na superfície das células. Em al- gumas modalidades, o CAR é um CAR do tipo TCR e o antígeno é um antígeno peptídico processado, como um antígeno peptídico de uma proteína intracelular, que, como um TCR, é reconhecido na superfície celular no contexto de uma molécula de complexo principal de histo- compatibilidade (MHC).
[00306] Receptores de antígeno exemplares, incluindo CARs e mé- todos para a modificação e introdução de tais receptores em células, incluem aqueles descritos, por exemplo, na publicação de pedido de patente internacional números WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, os números de publicação do pe-
dido de patente Norte Americana US2002131960, US2013287748, US20130149337, Patentes Norte Americanas Nos.: 6.451.995,
7.446.190, 8.252.592, 8.339.645, 8.398.282, 7.446.179, 6.410.319,
7.453.795, 7.454.795 e 7.484.791, 7.484.791 e 7.484.209, 7.484.209 e
7.484.209. Pedido de patente europeia número EP2537416, e/ou aqueles descritos por Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388–398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., Outubro de 2012; 24(5): 633-39; Wu et al., Can- cer, 18 de março de 2012 (2): 160-75. Em alguns aspectos, os recep- tores de antígeno incluem um CAR conforme descrito na Patente Nor- te Americana No.: 7.446.190 e aqueles descritos na Publicação do Pedido de Patente Internacional No.: WO/2014055668 A1. Exemplos de CARs incluem CARs conforme divulgado em qualquer uma das pu- blicações acima mencionadas, como WO2014031687, US 8.339.645, US 7.446.179, US 2013/0149337, Patente Norte Americana No.:
7.446.190, Patente Norte Americana No.: 8.389.282, Kochenderfer et al., 2013 , Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35 (9): 689-701; e Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5 (177). Veja também WO2014031687, US
8.339.645, US 7.446.179, US 2013/0149337, Patente Norte Americana No.: 7.446.190 e Patente Norte Americana No.: 8.389.282.
[00307] Em algumas modalidades, o CAR é construído com uma especificidade para um antígeno particular (ou marcador ou ligante), como um antígeno expresso em um tipo de célula particular a ser alve- jada por terapia adotiva, por exemplo, um marcador de câncer e/ou um antígeno destinado a induzir uma resposta de amortecimento, tal como um antígeno expresso em um tipo de célula normal ou não doente. Assim, o CAR tipicamente inclui em sua porção extracelular uma ou mais moléculas de ligação ao antígeno, como um ou mais fragmentos de ligação ao antígeno, domínio ou porção, ou um ou mais domínios variáveis de anticorpo e/ou moléculas de anticorpo. Em algumas mo- dalidades, o CAR inclui uma porção de ligação ao antígeno ou porções de uma molécula de anticorpo, como um fragmento de anticorpo de cadeia única (scFv) derivado das cadeias pesada variável (VH) e leve variável (VL) de um anticorpo monoclonal (mAb).
[00308] Em algumas modalidades, o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo é expresso nas células como parte de um re- ceptor recombinante, como um receptor de antígeno. Entre os recepto- res de antígenos estão os receptores de antígenos funcionais não TCR, tal como os receptores de antígenos quiméricos (CARs). Geral- mente, um CAR contendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que exibe especificidade do tipo TCR direcionado contra complexos de peptídeo-MHC também pode ser referido como um CAR do tipo TCR. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antí- geno extracelular específico para um complexo MHC-peptídeo de um CAR do tipo TCR está ligado a um ou mais componentes de sinaliza- ção intracelular, em alguns aspectos por meio de ligantes e/ou domí- nio(s) de transmembrana(s). Em algumas modalidades, tais moléculas podem tipicamente imitar ou aproximar um sinal através de um recep- tor de antígeno natural, tal como um TCR, e, opcionalmente, um sinal através de tal receptor em combinação com um receptor coestimula- dor.
[00309] Em algumas modalidades, o receptor recombinante, tal co- mo um receptor quimérico (por exemplo, CAR), inclui um domínio de ligação ao ligante que se liga, tal como se liga especificamente, a um antígeno (ou um ligante). Entre os antígenos alvejados pelos recepto- res quiméricos estão aqueles expressos no contexto de uma doença, condição ou tipo de célula a ser alvejada por meio da terapia celular adotiva. Entre as doenças e condições estão doenças e distúrbios pro- liferativos, neoplásicos e malignos, incluindo cânceres e tumores, in-
cluindo cânceres hematológicos, cânceres do sistema imunológico, tal como linfomas, leucemias e/ou mielomas, tal como leucemias B, T e mieloide, linfomas e mielomas múltiplos.
[00310] Em algumas modalidades, o antígeno (ou um ligante) é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, é um carboidrato ou outra mo- lécula. Em algumas modalidades, o antígeno (ou um ligante) é seleti- vamente expresso ou superexpresso nas células da doença ou condi- ção, por exemplo, o tumor ou células patogênicas, em comparação com células ou tecidos normais ou não alvejados. Em outras modali- dades, o antígeno é expresso em células normais e/ou é expresso nas células modificadas.
[00311] Em algumas modalidades, o CAR contém um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, scFv) que reco- nhece especificamente um antígeno, como um antígeno intacto, ex- presso na superfície de uma célula.
[00312] Em algumas modalidades, o antígeno (ou um ligante) é um antígeno tumoral ou marcador de câncer. Em algumas modalidades, o antígeno (ou um ligante), o antígeno é ou inclui integrina αvβ6 (integri- na avb6), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecido como CAIX ou G250), um antígeno câncer-testículo, antígeno câncer/testículo 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoem- briônico (CEA), uma ciclina, ciclina A2, Ligante 1 de quimiocina de Mo- tivo C-C (CCL -1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, sulfato de condroitina proteoglicano 4 (CSPG4), proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR ), mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor A2 de efrina (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc tipo 5 (FCRL5;
também conhecido como homólogo de receptor Fc 5 ou FCRH5), re- ceptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), uma proteína de ligação a fola- to (FBP), receptor de folato alfa, gangliosídeo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), glipican-3 (GPC3), receptor de classe C acoplado a proteína G membro do grupo 5 (GPRC5D), Her2/neu (receptor tirosina cinase erb-B2), Her3 (erb- B3), Her4 (erb-B4), dímeros erbB, antígeno associado ao melanoma de alto peso molecular humano (HMW-MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno de leucócito humano A1 (HLA-A1), antígeno de leucócito humano A2 (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22Rα), receptor alfa 2 de IL-13 (IL-13Rα2), receptor de domínio de inserção de cinase (kdr), cadeia leve capa, molécula de adesão de célula L1 (L1-CAM ), Epítopo CE7 de L1-CAM, repetição rica em leucina con- tendo 8 membros da família A (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado a melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesoteli- na (MSLN), c-Met, citomegalovírus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes exterminadores naturais (NKG2D) do grupo 2 mem- bro D, melan A (MART-1), molécula de adesão de células neurais (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno preferencialmente expresso de melanoma (PRAME), receptor de progesterona, um antígeno específi- co da próstata, antígeno de células tronco da próstata (PSCA), antíge- no de membrana específico da próstata (PSMA), Receptor Tirosina Cinase Órfão Receptor 1 (ROR1), survivina, glicoproteína de trofoblas- to (TPBG também conhecido como 5T4), glicoproteína associada a tumor 72 (TAG72), proteína relacionada à tirosinase 1 (TRP1, também conhecido como TYRP1 ou gp75), proteína relacionada à tirosinase 2 (TRP2, também conhecida como dopacromo tautomerase, dopacromo delta-isomerase ou DCT), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor do fator de crescimento endotelial vascu- lar 2 (VEGFR2), Tumor 1 de Wilm (WT-1), um antígeno específico do patógeno ou expresso pelo patógeno, ou um antígeno associado a um marcador universal, e/ou moléculas biotiniladas e/ou moléculas ex- pressas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos. Os antígenos alve- jados pelos receptores em algumas modalidades incluem antígenos associados a uma malignidade de células B, como qualquer um de uma série de marcadores de células B. Em algumas modalidades, o antígeno é ou inclui CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igcapa, Iglambda, CD79a, CD79b ou CD30.
[00313] Em algumas modalidades, o CAR é um CAR anti-BCMA que é específico para BCMA, por exemplo, BCMA humano. Recepto- res de antígenos quiméricos contendo anticorpos anti-BCMA, incluindo anticorpos de camundongo anti-BCMA humano e anticorpos humanos anti-humanos, e células que expressam tais receptores quiméricos fo- ram previamente descritos. Veja Carpenter et al., Clin Cancer Res., 2013, 19 (8): 2048-2060, WO 2016/090320, WO2016090327, WO2010104949A2 e WO2017173256. Em algumas modalidades, o anti-BCMA CAR contém um domínio de ligação ao antígeno, tal como um scFv, contendo uma região variável pesada (VH) e/ou variável leve (VL) derivada de um anticorpo descrito em WO 2016/090320 ou WO2016090327 . Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno, tal como um scFv, contém um VH apresentado na SEQ ID NO: 30 e um VL apresentado na SEQ ID NO:31. Em algumas modali- dades, o domínio de ligação ao antígeno, tal como um scFv, contém um VH apresentado na SEQ ID NO: 32 e um VL apresentado na SEQ ID NO:33. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antíge- no, tal como um scFv, contém um VH apresentado na SEQ ID NO: 34 e um VL apresentado na SEQ ID NO: 35. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno, tal como um scFv, contém um VH apresentado na SEQ ID NO: 27 e um VL apresentado na SEQ ID NO:28. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno,
tal como um scFv, contém um VH apresentado na SEQ ID NO: 41 e um VL apresentado na SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, o do- mínio de ligação ao antígeno, tal como um scFv, contém um VH apre- sentado na SEQ ID NO: 43 e um VL apresentado na SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno, tal como um scFv, contém um VH apresentado na SEQ ID NO: 45 e um VL apresentado na SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades, o VH ou VL tem uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais identidade de sequência com qualquer uma das sequências VH ou VL anteriores e retém a ligação a BCMA. Em algumas modalidades, a região VH é o terminal amino da região VL. Em algumas modalidades, a região VH é carbóxi-terminal para a região VL.
[00314] Em algumas modalidades, o CAR é um CAR anti-CD19 que é específico para CD19, por exemplo, CD19 humano. Em algumas modalidades, os domínios scFv e/ou VH são derivados de FMC63. FMC63 geralmente se refere a um anticorpo IgG1 monoclonal de ca- mundongo criado contra células Nalm-1 e -16 que expressam CD19 de origem humana (Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). Em algumas modalidades, o anticorpo FMC63 compreende um CDR- H1 e um CDR-H2 apresentado na SEQ ID NOS: 50 e 51 respectiva- mente, e um CDR-H3 apresentado na SEQ ID NO: 52 ou 66 e um CDR-L1 apresentado na SEQ ID NO: 47 e uma sequência CDR-L2 apresentada na SEQ ID NO: 48 ou 67 e uma CDR-L3 apresentada na SEQ ID NO: 49 ou 68. Em algumas modalidades, o anticorpo FMC63 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53 e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 54.
[00315] Em algumas modalidades, o scFv compreende uma cadeia leve variável contendo uma sequência CDR-L1 da SEQ ID NO: 47, uma sequência CDR-L2 da SEQ ID NO: 48 e uma sequência CDR-L3 da SEQ ID NO: 49 e/ou uma cadeia pesada variável contendo uma sequência CDR-H1 da SEQ ID NO: 50, uma sequência CDR-H2 da SEQ ID NO: 51 e uma sequência CDR-H3 da SEQ ID NO: 52. Em al- gumas modalidades, o scFv compreende uma região de cadeia pesa- da variável apresentada na SEQ ID NO: 53 e uma região de cadeia leve variável apresentada na SEQ ID NO: 54. Em algumas modalida- des, as cadeias pesadas variáveis e leves variáveis são conectadas por um ligante. Em algumas modalidades, o ligante é apresentado na SEQ ID NO: 29. Em algumas modalidades, o scFv compreende, em ordem, um VH, um ligante e um VL. Em algumas modalidades, o scFv compreende, em ordem, um VL, um ligante e um VH. Em algumas mo- dalidades, o scFv é codificado por uma sequência de nucleotídeos apresentados na SEQ ID NO: 69 ou uma sequência que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 % , 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência para SEQ ID NO: 69. Em algumas modalidades, o scFv compreende a se- quência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 55 ou uma se- quência que apresente pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de iden- tidade de sequência para SEQ ID NO: 55.
[00316] Em algumas modalidades, o scFv é derivado de SJ25C1. SJ25C1 é um anticorpo IgG1 monoclonal de camundongo criado con- tra células Nalm 1 e 16 expressando CD19 de origem humana (Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). Em algumas modalida- des, o anticorpo SJ25C1 compreende uma sequência CDR-H1, uma CDR-H2 e uma CDR-H3 apresentada na SEQ ID NOS: 59 a 61, res- pectivamente, e uma sequência CDR-L1, uma CDR-L2 e uma CDR-L3 apresentada na SEQ ID NOS: 56 a 58, respectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo SJ25C1 compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 62 e uma região variável da cadeia leve (VL) que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 63. Em alguns mo- dalidades, o svFv compreende uma cadeia leve variável contendo uma sequência CDR-L1 da SEQ ID NO:56, uma sequência CDR-L2 da SEQ ID NO:57 e uma sequência CDR-L3 da SEQ ID NO:58 e/ou um cadeia pesada variável contendo uma sequência CDR-H1 da SEQ ID NO: 59, uma sequência CDR-H2 da SEQ ID NO: 60 e uma sequência CDR-H3 da SEQ ID NO: 61. Em algumas modalidades, o scFv com- preende uma região variável de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO:62 e uma região variável de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO:63. Em algumas modalidades, a cadeia pesada variável e a ca- deia leve variável são conectadas por um ligante. Em algumas modali- dades, o ligante é apresentado na SEQ ID NO:64. Em algumas moda- lidades, o scFv compreende, em ordem, um VH, um ligante e um VL. Em algumas modalidades, o scFv compreende, em ordem, um VL, um ligante e um VH. Em algumas modalidades, o scFv compreende a se- quência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 65 ou uma se- quência que apresente pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de iden- tidade de sequência para SEQ ID NO:65.
[00317] Em algumas modalidades, o CAR é um CAR anti-CD20 que é específico para CD20. Em algumas modalidades, o scFv contém um VH e um VL derivado de um anticorpo ou fragmento de anticorpo espe- cífico para CD20. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a CD20 é um anticorpo que é ou é derivado de Rituximabe, tal como é Rituximabe scFv.
[00318] Em algumas modalidades, o CAR é um CAR anti-CD22 que é específico para CD22. Em algumas modalidades, o scFv contém um VH e um VL derivado de um anticorpo ou fragmento de anticorpo espe- cífico para CD22. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a CD22 é um anticorpo que é ou é derivado de m971, como é m971 scFv.
[00319] Em algumas modalidades, o CAR é um CAR anti-GPRC5D que é específico para GPRC5D. Em algumas modalidades, o scFv contém um VH e um VL derivado de um anticorpo ou fragmento de an- ticorpo específico para GPRC5D. Em algumas modalidades, o anticor- po ou fragmento de anticorpo que se liga a GPRC5D é ou contém um VH e um VL de um anticorpo ou fragmento de anticorpo estabelecido nos Pedidos de Patente Internacional, Publicação Número WO 2016/090329 e WO 2016/090312.
[00320] Em algumas modalidades, o anticorpo é um fragmento de ligação ao antígeno, como um scFv, que inclui um ou mais ligantes que unem dois domínios ou regiões de anticorpo, como uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL). O ligante é tipicamente um ligante peptídico, por exemplo, um ligante peptídico flexível e/ou solúvel. Entre os ligantes estão aqueles ricos em glicina e serina e/ou em alguns casos treonina. Em algumas modalidades, os ligantes incluem ainda resíduos carregados, como lisina e/ou glutamato, que podem melhorar a solubilidade. Em algu- mas modalidades, os ligantes incluem ainda uma ou mais prolinas. Em alguns aspectos, os ligantes ricos em glicina e serina (e/ou treonina) incluem pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % desse(s) aminoácido(s). Em algumas mo- dalidades, eles incluem pelo menos ou cerca de 50 %, 55 %, 60 %, 70 % ou 75 %, glicina, serina e/ou treonina. Em algumas modalidades, o ligante é composto substancialmente inteiramente por glicina, serina e/ou treonina. Os ligantes geralmente têm entre cerca de 5 e cerca de
50 aminoácidos de comprimento, tipicamente entre cerca de 10 e cer- ca de 30, por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30, e em alguns exemplos entre 10 e 25 aminoácidos de comprimento. Ligantes exemplares incluem ligan- tes com vários números de repetições da sequência GGGGS (4GS; SEQ ID NO: 36) ou GGGS (3GS; SEQ ID NO: 37), tal como entre 2, 3, 4 e 5 repetições de tal sequência. Ligantes exemplares incluem aque- les que têm ou consistem de uma sequência apresentada na SEQ ID NO:38 (GGGGSGGGGSGGGGS), SEQ ID NO:39 (GSTSGSGK- PGSGEGSTKG) ou SEQ ID NO: 40 (SRGGGGSGGGGSGGGGSLE- MA).
[00321] Em algumas modalidades, o antígeno é ou inclui um antí- geno específico do patógeno ou expresso pelo patógeno. Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno viral (como um antígeno viral de HIV, HCV, HBV, etc.), antígenos bacterianos e/ou antígenos parasi- tários. Em algumas modalidades, o CAR contém um anticorpo do tipo TCR, como um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, scFv) que reconhece especificamente um antígeno intracelu- lar, como um antígeno associado a tumor, apresentado na superfície celular como um complexo MHC-peptídeo. Em algumas modalidades, um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo que reco- nhece um complexo MHC-peptídeo pode ser expresso nas células como parte de um receptor recombinante, como um receptor de antí- geno. Entre os receptores de antígenos estão os receptores de antí- genos funcionais não TCR, como os receptores de antígenos quiméri- cos (CARs). Geralmente, um CAR contendo um anticorpo ou fragmen- to de ligação ao antígeno que exibe especificidade do tipo TCR direci- onado contra complexos de peptídeo-MHC também pode ser referido como um CAR do tipo TCR.
[00322] A referência ao "complexo principal de histocompatibilida-
de" (MHC) refere-se a uma proteína, geralmente uma glicoproteína, que contém um sítio de ligação de peptídeo polimórfico ou sulco de ligação que pode, em alguns casos, complexar com antígenos peptídi- cos de polipeptídeos, incluindo antígenos peptídicos processados pela maquinaria da célula. Em alguns casos, as moléculas de MHC podem ser exibidas ou expressas na superfície da célula, incluindo como um complexo com peptídeo, isto é, complexo MHC-peptídeo, para apre- sentação de um antígeno em uma conformação reconhecível por um receptor de antígeno em células T, como um TCRs ou anticorpo tipo TCR. Geralmente, as moléculas de MHC de classe I são heterodíme- ros com uma cadeia α abrangendo a membrana, em alguns casos com três domínios α, e uma microglobulina β2 associada não covalente- mente. Geralmente, as moléculas de MHC de classe II são compostas de duas glicoproteínas transmembrana, α e β, ambas as quais tipica- mente atravessam a membrana. Uma molécula de MHC pode incluir uma porção eficaz de um MHC que contém um sítio ou sítios de liga- ção ao antígeno para ligar um peptídeo e as sequências necessárias para o reconhecimento pelo receptor de antígeno apropriado. Em al- gumas modalidades, as moléculas MHC de classe I liberam peptídeos originários do citosol à superfície celular, onde um complexo MHC- peptídeo é reconhecido pelas células T, como geralmente células T CD8 +, mas em alguns casos células T CD4 +. Em algumas modalida- des, as moléculas de MHC de classe II liberam peptídeos originários do sistema vesicular à superfície celular, onde são tipicamente reco- nhecidos por células T CD4 +. Geralmente, as moléculas de MHC são codificadas por um grupo de loci ligados, que são coletivamente de- nominados H-2 no camundongo e antígeno leucocitário humano (HLA) em humanos. Portanto, o MHC tipicamente humano também pode ser referido como antígeno leucocitário humano (HLA).
[00323] O termo "complexo MHC-peptídeo" ou "complexo peptídeo-
MHC" ou variações dos mesmos, refere-se a um complexo ou associ- ação de um antígeno peptídico e uma molécula MHC, tal como, geral- mente, por interações não covalentes do peptídeo no sulco de ligação ou fenda da molécula de MHC. Em algumas modalidades, o complexo MHC-peptídeo está presente ou exibido na superfície das células. Em algumas modalidades, o complexo MHC-peptídeo pode ser especifi- camente reconhecido por um receptor de antígeno, como um TCR, CAR do tipo TCR ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos.
[00324] Em algumas modalidades, um peptídeo, tal como um antí- geno peptídico ou epítopo, de um polipeptídeo pode se associar a uma molécula de MHC, tal como para reconhecimento por um receptor de antígeno. Geralmente, o peptídeo é derivado de ou com base em um fragmento de uma molécula biológica mais longa, como um polipeptí- deo ou proteína. Em algumas modalidades, o peptídeo normalmente tem cerca de 8 a cerca de 24 aminoácidos de comprimento. Em algu- mas modalidades, um peptídeo tem um comprimento de ou cerca de 9 a 22 aminoácidos para reconhecimento no complexo MHC de Classe II. Em algumas modalidades, um peptídeo tem um comprimento de ou cerca de 8 a 13 aminoácidos para reconhecimento no complexo MHC de Classe I. Em algumas modalidades, após o reconhecimento do peptídeo no contexto de uma molécula de MHC, como o complexo MHC-peptídeo, o receptor de antígeno, como TCR ou CAR do tipo TCR, produz ou dispara um sinal de ativação para a célula T que induz uma resposta de células T, como proliferação de células T, produção de citocinas, uma resposta de células T citotóxicas ou outra resposta.
[00325] Em algumas modalidades, um anticorpo tipo TCR ou por- ção de ligação ao antígeno são conhecidos ou podem ser produzidos por métodos conhecidos (veja, por exemplo, os pedidos publicados Norte Americanos Nos. 2002/0150914; US 2003/0223994; US 2004/0191260; US 2006/0034850; US 2007/00992530;
US20090226474; US20090304679; e Publicação Internacional PCT Nº WO 03/068201).
[00326] Em algumas modalidades, um anticorpo ou porção de liga- ção ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um comple- xo MHC-peptídeo, pode ser produzido imunizando um hospedeiro com uma quantidade eficaz de um imunógeno contendo um complexo MHC-peptídeo específico. Em alguns casos, o peptídeo do complexo MHC-peptídeo é um epítopo de antígeno capaz de se ligar ao MHC, como um antígeno tumoral, por exemplo, um antígeno tumoral univer- sal, antígeno de mieloma ou outro antígeno, conforme descrito abaixo. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz do imunógeno é en- tão administrada a um hospedeiro para desencadear uma resposta imune, em que o imunógeno retém uma forma tridimensional do mes- mo por um período de tempo suficiente para provocar uma resposta imune contra a apresentação tridimensional do peptídeo no sulco de ligação da molécula de MHC. O soro coletado do hospedeiro é então testado para determinar se os anticorpos desejados que reconhecem uma apresentação tridimensional do peptídeo no sulco de ligação da molécula de MHC estão sendo produzidos. Em algumas modalidades, os anticorpos produzidos podem ser avaliados para confirmar que o anticorpo pode diferenciar o complexo MHC-peptídeo da molécula de MHC sozinha, o peptídeo de interesse sozinho e um complexo de MHC e peptídeo irrelevante. Os anticorpos desejados podem então ser isolados.
[00327] Em algumas modalidades, um anticorpo ou porção de liga- ção ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um comple- xo MHC-peptídeo pode ser produzido empregando métodos de exibi- ção de biblioteca de anticorpos, como bibliotecas de anticorpos de fa- go. Em algumas modalidades, bibliotecas de exibição de fago de Fab mutante, scFv ou outras formas de anticorpo podem ser geradas, por exemplo, em que os membros da biblioteca são mutados em um ou mais resíduos de um CDR ou CDRs. Veja, por exemplo Pedido publi- cado nos EUA No. US20020150914, US2014/0294841; e Cohen CJ. et al. (2003) J Mol. Reconhecer. 16: 324-332.
[00328] O termo "anticorpo" aqui é usado no sentido mais amplo e inclui anticorpos policlonais e monoclonais, incluindo anticorpos intac- tos e fragmentos de anticorpos funcionais (ligação ao antígeno), inclu- indo fragmentos de fragmentos de ligação ao antígeno (Fab), frag- mentos de F(ab')2, fragmentos de Fab', fragmentos de Fv, fragmentos de IgG recombinante (rIgG), regiões de cadeia pesada variável (VH) capazes de se ligar especificamente ao antígeno, fragmentos de anti- corpo de cadeia única, incluindo fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) e fragmentos de anticorpos de domínio único (por exemplo, sdAb, sdFv, nanocorpo) . O termo abrange formas geneticamente mo- dificadas e/ou modificadas de imunoglobulinas, tais como intracorpos, pepticorpos, anticorpos quiméricos, anticorpos totalmente humanos, anticorpos humanizados e anticorpos heteroconjugados, multiespecífi- cos, por exemplo, biespecíficos, anticorpos, diacorpos, triacorpos e tetracorpos, tandem di-scFv, tandem tri-scFv. A menos que indicado de outra forma, o termo "anticorpo" deve ser entendido como abran- gendo fragmentos de anticorpo funcionais do mesmo. O termo tam- bém abrange anticorpos intactos ou de comprimento total, incluindo anticorpos de qualquer classe ou subclasse, incluindo IgG e suas sub- classes, IgM, IgE, IgA e IgD.
[00329] Os termos "região determinante de complementaridade" e "CDR", sinônimos de "região hipervariável" ou "HVR", são conhecidos, em alguns casos, por se referir a sequências não contíguas de amino- ácidos dentro de regiões variáveis de anticorpo, que conferem especi- ficidade de antígeno e/ou afinidade de ligação. Em geral, existem três CDRs em cada região variável da cadeia pesada (CDR-H1, CDR-H2,
CDR-H3) e três CDRs em cada região variável da cadeia leve (CDR- L1, CDR-L2, CDR-L3). "Regiões de estrutura" e "FR" são conhecidas, em alguns casos, por se referir às porções não CDR das regiões vari- áveis das cadeias pesadas e leves. Em geral, existem quatro FRs em cada região variável de cadeia pesada de comprimento total (FR-H1, FR-H2, FR-H3 e FR-H4) e quatro FRs em cada região variável de ca- deia leve de comprimento total (FR- L1, FR-L2, FR-L3 e FR-L4).
[00330] Os limites precisos da sequência de aminoácidos de um dado CDR ou FR podem ser facilmente determinados usando qualquer um de uma série de esquemas bem conhecidos, incluindo aqueles descritos por Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunolo- gical Interest", 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeração "Kabat"); Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (esquema de numeração "Chothia"); MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Esferact analysis and binding site topography," J. Mol. Bi- ol. 262, 732-745." (Esquema de numeração de "Esferact"); Lefranc MP et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol, Jan 2003; 27 (1): 55-77 (esquema de numeração "IMGT"); Honegger A e Plückthun A, "Yet another numbering scheme for immu- noglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 8 de junho de 2001; 309 (3): 657-70, (esquema de numera- ção "Aho"); e Martin et al., "Modeling antibody hypervariable loops: a combined algorithm," PNAS, 1989, 86 (23): 9268-9272, (esquema de numeração "AbM").
[00331] Os limites de um determinado CDR ou FR podem variar dependendo do esquema usado para a identificação. Por exemplo, o esquema de Kabat é baseado em alinhamentos estruturais, enquanto o esquema de Chothia é baseado em informações estruturais. A nu-
meração para os esquemas de Kabat e Chothia é baseada nos com- primentos de sequência de região de anticorpo mais comuns, com in- serções acomodadas por letras de inserção, por exemplo, "30a" e de- leções aparecendo em alguns anticorpos. Os dois esquemas colocam certas inserções e exclusões ("indels") em posições diferentes, resul- tando em numeração diferencial. O esquema de Esferact é baseado na análise de estruturas cristalinas complexas e é semelhante em mui- tos aspectos ao esquema de numeração de Chothia. O esquema AbM é um meio-termo entre as definições de Kabat e Chothia baseadas nas usadas pelo software de modelagem de anticorpos AbM da Oxford Molecular.
[00332] A Tabela 1, abaixo, lista limites de posição exemplares de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 e CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 conforme identificado por Kabat, Chothia, AbM e esquemas de esferato, respec- tivamente. Para CDR-H1, a numeração de resíduos é listada usando os esquemas de numeração de Kabat e Chothia. FRs estão localiza- dos entre CDRs, por exemplo, com FR-L1 localizado antes de CDR- L1, FR-L2 localizado entre CDR-L1 e CDR-L2, FR-L3 localizado entre CDR-L2 e CDR-L3 e assim por diante. Observa-se que, porque o es- quema de numeração de Kabat mostrado coloca inserções em H35A e H35B, o final da alça Chothia CDR-H1 quando numerado usando a convenção de numeração Kabat mostrada varia entre H32 e H34, de- pendendo do comprimento da alça. Tabela 1. Limites dos CDRs de acordo com vários esquemas de nu- meração. CDR Kabat Chothia AbM Esferact CDR-L1 L24--L34 L24--L34 L24--L34 L30--L36 CDR-L2 L50--L56 L50--L56 L50--L56 L46--L55 CDR-L3 L89--L97 L89--L97 L89--L97 L89--L96 CDR-H1 H31-- H26-- H26-- H30-- (Numeração Kabat ) 1 H35B H32..34 H35B H35B
CDR Kabat Chothia AbM Esferact CDR-H1 H31--H35 H26--H32 H26--H35 H30--H35 (Numeração Chothia2) CDR-H2 H50--H65 H52--H56 H50--H58 H47--H58 CDR-H3 H95--H102 H95--H102 H95--H102 H93--H101 1 - Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Inte- rest," 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 2 - Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948
[00333] Assim, a menos que especificado de outra forma, um "CDR" ou "região determinante complementar" ou CDRs específicos individuais (por exemplo, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3), de um deter- minado anticorpo ou região do mesmo, tal como uma região variável do mesmo, deve ser entendida como abrangendo uma (ou a específi- ca) região determinante complementar conforme definido por qualquer um dos esquemas acima mencionados, ou outros esquemas conheci- dos. Por exemplo, onde é afirmado que um CDR particular (por exem- plo, um CDR-H3) contém a sequência de aminoácidos de um CDR correspondente em uma determinada sequência de aminoácidos da região VH ou VL, entende-se que tal CDR tem uma sequência do CDR correspondente (por exemplo, CDR-H3) dentro da região variável, con- forme definido por qualquer um dos esquemas acima mencionados, ou outros esquemas conhecidos. Em algumas modalidades, sequências CDR específicas são especificadas. Sequências de CDR exemplares de anticorpos fornecidos são descritas usando vários esquemas de numeração, embora seja entendido que um anticorpo fornecido pode incluir CDRs conforme descrito de acordo com qualquer um dos outros esquemas de numeração acima mencionados ou outros esquemas de numeração conhecidos por alguém versado na técnica.
[00334] Da mesma forma, a menos que especificado de outra for- ma, um FR ou FR(s) individual(is) especificado(s) (por exemplo, FR-
H1, FR-H2, FR-H3, FR-H4), de um determinado anticorpo ou região do mesmo, tal como uma região variável da mesma, deve ser entendida como englobando uma (ou a específica) região de estrutura, conforme definido por qualquer um dos esquemas conhecidos. Em alguns ca- sos, o esquema para identificação de um determinado CDR, FR ou FRs ou CDRs é especificado, como o CDR conforme definido pelo mé- todo de Kabat, Chothia, AbM ou de Esferact, ou outros esquemas co- nhecidos. Em outros casos, a sequência de aminoácidos particular de um CDR ou FR é fornecida.
[00335] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação ao antí- geno, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos reconhecem especificamente um antígeno de um anticorpo de com- primento total. Em algumas modalidades, as cadeias pesadas e leves de um anticorpo podem ser de comprimento total ou podem ser uma porção de ligação ao antígeno (um Fab, F(ab')2, Fv ou um fragmento Fv de cadeia única (scFv)). Em outras modalidades, a região constan- te da cadeia pesada do anticorpo é escolhida de, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE, particularmente escolhi- da de, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, mais particularmente, IgG1 (por exemplo, IgG1 humana). Em outra modalidade, a região constante da cadeia leve do anticorpo é escolhida, por exemplo, capa ou lambda, particularmente capa.
[00336] Entre os anticorpos fornecidos estão fragmentos de anti- corpos. Um "fragmento de anticorpo" refere-se a uma molécula dife- rente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um an- ticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; diacorpos; anticorpos line- ares; regiões de cadeia pesada variável (VH), moléculas de anticorpo de cadeia única, tais como scFvs e anticorpos únicos VH de domínio único; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. Em modalidades particulares, os anticorpos são frag- mentos de anticorpos de cadeia única compreendendo uma região va- riável da cadeia pesada e/ou uma região variável da cadeia leve, como scFvs.
[00337] O termo "região variável" ou "domínio variável" refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvi- da na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da ca- deia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anti- corpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domí- nio compreendendo quatro regiões estruturais conservadas (FRs) e três CDRs. (Veja, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6ª ed., WH Freeman e Co., página 91 (2007). Um único domínio VH ou VL po- de ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antígeno particular po- dem ser isolados usando um domínio VH ou VL de um anticorpo que se liga ao antígeno para rastrear uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Veja, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 ( 1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).
[00338] Entre os anticorpos incluídos nos CARs fornecidos estão fragmentos de anticorpos. Um "fragmento de anticorpo" ou "fragmento de ligação ao antígeno" refere-se a uma molécula diferente de um an- ticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; diacorpos; anticorpos lineares; regiões variáveis de cadeia pesada (VH), moléculas de anticorpo de cadeia única, tais como scFvs e anticorpos de domínio único compreendendo apenas a região VH; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. Em algumas modalidades, o domínio de li- gação ao antígeno nos CARs fornecidos é ou compreende um frag- mento de anticorpo que compreende uma região de cadeia pesada variável (VH) e uma cadeia leve variável (VL). Em modalidades particu- lares, os anticorpos são fragmentos de anticorpo de cadeia única compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e/ou uma região variável de cadeia leve (VL), como scFvs.
[00339] O termo "região variável" ou "domínio variável" refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvi- da na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da ca- deia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anti- corpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domí- nio compreendendo quatro regiões estruturais conservadas (FRs) e três CDRs. (Veja, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6ª ed., W.H. Freeman e Co., página 91 (2007). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um determinado antígeno podem ser isolados usando um domínio VH ou VL de um anticorpo que se liga ao antígeno para rastrear uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Veja, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).
[00340] Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticor- pos que compreendem a totalidade ou uma parte do domínio variável da cadeia pesada ou a totalidade ou uma parte do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano. Em algumas modalidades, o CAR compreende um domínio de cadeia pesada de anticorpo que se liga especificamente ao antígeno, tal como um mar- cador de câncer ou antígeno de superfície celular de uma célula ou doença a ser alvejada, tal como uma célula tumoral ou uma célula cancerosa, tal como qualquer um dos antígenos alvo aqui descritos ou conhecidos.
[00341] Os fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por vá- rias técnicas, incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como a produção por células hospedei- ras recombinantes. Em algumas modalidades, os anticorpos são frag- mentos produzidos de forma recombinante, como fragmentos que compreendem arranjos que não ocorrem naturalmente, como aqueles com duas ou mais regiões ou cadeias de anticorpos unidas por ligan- tes sintéticos, por exemplo, ligantes de peptídeo, e/ou que podem não ser produzidos por digestão enzimática de um anticorpo intacto de ocorrência natural. Em algumas modalidades, os fragmentos de anti- corpo são scFvs.
[00342] Um anticorpo "humanizado" é um anticorpo em que todos ou substancialmente todos os resíduos de aminoácidos de CDR são derivados de CDRs não humanos e todos ou substancialmente todos os resíduos de aminoácidos de FR são derivados de FRs humanos. Um anticorpo humanizado opcionalmente pode incluir pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticor- po humano. Uma "forma humanizada" de um anticorpo não humano refere-se a uma variante do anticorpo não humano que foi submetido à humanização, normalmente para reduzir a imunogenicidade para hu- manos, enquanto retém a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental. Em algumas modalidades, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos corres- pondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo do qual os resíduos de CDR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo.
[00343] Assim, em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico, incluindo CARs do tipo TCR, inclui uma porção extracelular contendo um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em algumas moda- lidades, o anticorpo ou fragmento inclui um scFv. Em alguns aspectos, o receptor de antígeno quimérico inclui uma porção extracelular con- tendo o anticorpo ou fragmento e uma região de sinalização intracelu- lar. Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização intracelular. Em algumas mo- dalidades, o domínio de sinalização intracelular é ou compreende um domínio de sinalização primário, um domínio de sinalização que é ca- paz de induzir um sinal de ativação primário em uma célula T, um do- mínio de sinalização de um componente de receptor de célula T (TCR) e/ou um domínio de sinalização compreendendo um motivo de ativa- ção com base em tirosina imunorreceptor (ITAM).
[00344] Em algumas modalidades, o receptor recombinante, tal co- mo o CAR, tal como a porção de anticorpo do mesmo, inclui ainda um espaçador, que pode ser ou incluir pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina ou variante ou versão modificada da mesma, tal como uma região de articulação, por exemplo, uma re- gião de articulação de IgG4 e/ou uma região CH1/CL e/ou Fc. Em al- gumas modalidades, o receptor recombinante compreende ainda um espaçador e/ou uma região de articulação. Em algumas modalidades, a região ou porção constante é de uma IgG humana, como IgG4 ou IgG1. Em alguns aspectos, a porção da região constante serve como uma região espaçadora entre o componente de reconhecimento de antígeno, por exemplo, scFv e domínio transmembrana. O espaçador pode ser de um comprimento que proporciona maior responsividade da célula após a ligação ao antígeno, em comparação com a ausência do espaçador.
[00345] Em alguns exemplos, o espaçador tem cerca de 12 amino- ácidos de comprimento ou não tem mais de 12 aminoácidos de com-
primento. Espaçadores exemplares incluem aqueles com pelo menos cerca de 10 a 229 aminoácidos, cerca de 10 a 200 aminoácidos, cerca de 10 a 175 aminoácidos, cerca de 10 a 150 aminoácidos, cerca de 10 a 125 aminoácidos, cerca de 10 a 100 aminoácidos, cerca de 10 a 75 aminoácidos, cerca de 10 a 50 aminoácidos, cerca de 10 a 40 aminoá- cidos, cerca de 10 a 30 aminoácidos, cerca de 10 a 20 aminoácidos ou cerca de 10 a 15 aminoácidos e incluindo qualquer número inteiro en- tre os pontos finais de qualquer um dos intervalos listados. Em algu- mas modalidades, uma região espaçadora tem cerca de 12 aminoáci- dos ou menos, cerca de 119 aminoácidos ou menos, ou cerca de 229 aminoácidos ou menos. Espaçadores exemplares incluem articulação de IgG4 sozinha, articulação de IgG4 ligada a domínios CH2 e CH3 ou articulação de IgG4 ligada ao domínio CH3. Espaçadores exemplares incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos em Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19: 3153, Hudecek et al. (2015) Cancer Immunol Res. 3 (2): 125–135 ou Pat. Internacional Aplicativo. Bar. No. WO2014031687, Patente Norte Americana No. 8.822.647 ou US2014/0271635. Em algumas modalidades, o espaçador inclui uma sequência de uma região de articulação de imunoglobulina, uma regi- ão CH2 e CH3. Em algumas modalidades, uma ou mais das articula- ções, CH2 e CH3 é derivada total ou parcialmente de IgG4 ou IgG2. Em alguns casos, da articulação, CH2 e CH3 é derivada de IgG4. Em al- guns aspectos, um ou mais da articulação, CH2 e CH3 é quimérico e contém a sequência derivada de IgG4 e IgG2. Em alguns exemplos, o espaçador contém uma articulação quimérica IgG4/2, uma CH2 IgG2/4 e uma região CH3 IgG4.
[00346] Em algumas modalidades, o espaçador pode ser derivado total ou parcialmente de IgG4 e/ou IgG2. Em algumas modalidades, o espaçador pode ser um polipeptídeo quimérico contendo uma ou mais de uma articulação, sequência(s) CH2 e/ou CH3 derivadas de IgG4,
IgG2 e/ou IgG2 e IgG4. Em algumas modalidades, o espaçador pode conter mutações, como uma ou mais mutações de um único aminoáci- do em um ou mais domínios. Em alguns exemplos, a modificação de aminoácido é uma substituição de uma prolina (P) por uma serina (S) na região de articulação de um IgG4. Em algumas modalidades, a mo- dificação de aminoácido é uma substituição de uma glutamina (Q) por uma asparagina (N) para reduzir a heterogeneidade de glicosilação, tal como uma substituição de N para Q em uma posição correspondente à posição 177 na região CH2 da sequência da região constante da ca- deia pesada de IgG4 apresentada na SEQ ID NO: 70 (Uniprot No. de Acesso P01861; posição correspondente à posição 297 pela numera- ção EU e posição 79 da sequência espaçadora de articulação-CH2- CH3 apresentada na SEQ ID NO: 4) ou uma substituição N para Q nu- ma posição correspondente à posição 176 na região CH2 da sequência da região constante da cadeia pesada de IgG2 apresentada na SEQ ID NO: 71 (Nº de Acesso Uniprot P01859; posição correspondente à posição 297 pela numeração EU).
[00347] Em alguns aspectos, o espaçador contém apenas uma re- gião de articulação de uma IgG, tal como apenas uma articulação de IgG4 ou IgG1, tal como o espaçador apenas da articulação apresenta- da na SEQ ID NO: 1, e é codificado pela sequência apresentada na SEQ ID NO: 2. Em outras modalidades, o espaçador é uma articulação de Ig, por exemplo, uma articulação de IgG4, ligada a um domínio CH2 e/ou CH3. Em algumas modalidades, o espaçador é uma articulação de Ig, por exemplo, uma articulação de IgG4, ligada aos domínios CH2 e CH3, tal como apresentado na SEQ ID NO: 3. Em algumas modali- dades, o espaçador é uma articulação de Ig, por exemplo, uma articu- lação de IgG4 ligada a um domínio CH3 apenas, tal como apresentado na SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o espaçador é ou com- preende uma sequência rica em glicina-serina ou outro ligante flexível,
como ligantes flexíveis conhecidos. Em algumas modalidades, a regi- ão ou porção constante é de IgD. Em algumas modalidades, o espa- çador possui a sequência apresentada na SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o espaçador possui uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos ou pelo menos cerca de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 3, 4 e 5.
[00348] O domínio de reconhecimento de antígeno geralmente está ligado a um ou mais componentes de sinalização intracelular, como componentes de sinalização que imitam a estimulação ou ativação por meio de um complexo de receptor de antígeno, tal como um complexo de TCR, no caso de um CAR e/ou sinal através de outro receptor de superfície celular. Assim, em algumas modalidades, o componente de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo) está ligado a uma ou mais regiões de sinalização de transmembrana e intracelular. Em al- gumas modalidades, o domínio de transmembrana é fundido ao domí- nio extracelular. Em uma modalidade, um domínio de transmembrana que está naturalmente associado a um dos domínios no receptor, por exemplo, CAR, é usado. Em alguns casos, o domínio de transmem- brana é selecionado ou modificado por substituição de aminoácidos para evitar a ligação de tais domínios aos domínios de transmembrana das mesmas proteínas de membrana de superfície ou diferentes para minimizar interações com outros membros do complexo receptor.
[00349] O domínio de transmembrana em algumas modalidades é derivado de uma fonte natural ou sintética. Onde a fonte é natural, o domínio em alguns aspectos é derivado de qualquer proteína ligada à membrana ou transmembrana. As regiões de transmembrana incluem aquelas derivadas de (ou seja, compreendem pelo menos a(s) regi- ão(ões) de transmembrana da cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de células T, CD28, épsilon CD3, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Al- ternativamente, o domínio de transmembrana em algumas modalida- des é sintético. Em alguns aspectos, o domínio de transmembrana sin- tético compreende resíduos predominantemente hidrofóbicos, como leucina e valina. Em alguns aspectos, um tripleto de fenilalanina, tripto- fano e valina será encontrado em cada extremidade de um domínio de transmembrana sintético. Em algumas modalidades, a ligação é por ligantes, espaçadores e/ou domínio(s) de transmembrana(s).
[00350] Entre as regiões de sinalização intracelular estão aquelas que imitam ou aproximam um sinal através de um receptor de antíge- no natural, um sinal através de tal receptor em combinação com um receptor coestimulador e ou um sinal através de um receptor coestimu- lador sozinho. Em algumas modalidades, um ligante de oligo- ou poli- peptídeo curto, por exemplo, um ligante de entre 2 e 10 aminoácidos de comprimento, tal como um contendo glicinas e serinas, por exem- plo, dupleto de glicina-serina, está presente e forma uma ligação entre o domínio de transmembrana e o domínio de sinalização citoplasmáti- ca do CAR.
[00351] O receptor, por exemplo, o CAR, geralmente inclui pelo menos um componente ou componentes de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o receptor inclui um componente intracelu- lar de um complexo de TCR, como uma cadeia TCR CD3 que medeia a ativação de células T e citotoxicidade, por exemplo, cadeia zeta de CD3. Assim, em alguns aspectos, o anticorpo de ligação a ROR1 está ligado a um ou mais módulos de sinalização de célula. Em algumas modalidades, os módulos de sinalização de célula incluem domínio de transmembrana CD3, domínios de sinalização intracelular CD3 e/ou outros domínios de transmembrana CD. Em algumas modalidades, o receptor, por exemplo, CAR, inclui ainda uma porção de uma ou mais moléculas adicionais, como o receptor Fc γ, CD8, CD4, CD25 ou CD16. Por exemplo, em alguns aspectos, o CAR inclui uma molécula quimérica entre CD3-zeta (CD3-ζ) ou receptor Fc γ e CD8, CD4, CD25 ou CD16.
[00352] Em algumas modalidades, após a ligação do CAR, o domí- nio citoplasmático ou região de sinalização intracelular do CAR ativa pelo menos uma das funções efetoras normais ou respostas da célula imune, por exemplo, células T projetadas para expressar o CAR. Por exemplo, em alguns contextos, o CAR induz uma função de uma célu- la T, tal como atividade citolítica ou atividade T auxiliar, como secreção de citocinas ou outros fatores. Em algumas modalidades, uma porção truncada de uma região de sinalização intracelular de um componente receptor de antígeno ou molécula coestimuladora é usada no lugar de uma cadeia imunoestimuladora intacta, por exemplo, se transduz o sinal da função efetora. Em algumas modalidades, as regiões de sina- lização intracelular, por exemplo, compreendendo domínio ou domí- nios intracelulares, incluem as sequências citoplasmáticas do receptor de células T (TCR) e, em alguns aspectos, também aquelas de corre- ceptores que no contexto natural agem em conjunto com tais recepto- res para iniciar a transdução de sinal após o envolvimento do receptor de antígeno e/ou qualquer derivado ou variante de tais moléculas e/ou qualquer sequência sintética que tenha a mesma capacidade funcio- nal.
[00353] No contexto de um TCR natural, a ativação completa ge- ralmente requer não apenas a sinalização através do TCR, mas tam- bém um sinal coestimulador. Assim, em algumas modalidades, para promover a ativação completa, um componente para gerar sinal se- cundário ou coestimulador também está incluído no CAR. Em outras modalidades, o CAR não inclui um componente para gerar um sinal coestimulador. Em alguns aspectos, um CAR adicional é expresso na mesma célula e fornece o componente para gerar o sinal secundário ou coestimulador.
[00354] A ativação de células T é, em alguns aspectos, descrita como sendo mediada por duas classes de sequências de sinalização citoplasmática: aquelas que iniciam a ativação primária dependente de antígeno por meio do TCR (sequências de sinalização citoplasmática primárias) e aquelas que atuam de uma maneira independente de an- tígeno para fornecer um sinal secundário ou coestimulador (sequên- cias de sinalização citoplasmática secundárias). Em alguns aspectos, o CAR inclui um ou ambos os componentes de sinalização.
[00355] Em alguns aspectos, o CAR inclui uma sequência de sinali- zação citoplasmática primária que regula a ativação primária do com- plexo de TCR. As sequências de sinalização citoplasmáticas primárias que atuam de forma estimulante podem conter motivos de sinalização que são conhecidos como motivos de ativação com base em tirosina imunorreceptor ou ITAMs. Exemplos de ITAM contendo sequências de sinalização citoplasmática primárias incluem aquelas derivadas de TCR ou CD3 zeta, FcR gama ou FcR beta. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de sinalização citoplasmática no CAR contém um domínio de sinalização citoplasmática, sua porção ou sequência deri- vada de CD3 zeta.
[00356] Em algumas modalidades, o CAR inclui uma região de sina- lização e/ou porção de transmembrana de um receptor coestimulador, como CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 e ICOS. Em alguns aspectos, o mesmo CAR inclui a região de sinalização e os componentes co- estimuladores.
[00357] Em algumas modalidades, a região de sinalização está in- cluída dentro de um CAR, enquanto o componente coestimulador é fornecido por outro CAR que reconhece outro antígeno. Em algumas modalidades, os CARs incluem CARs ativadores ou estimuladores e
CARs coestimuladores, ambos expressos na mesma célula (veja WO2014/055668).
[00358] Em certas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende um domínio de transmembrana e de sinalização CD28 ligado a um domínio intracelular CD3 (por exemplo, CD3-zeta). Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende domínios coestimuladores quiméricos CD28 e CD137 (4-1BB, TNFRSF9), ligados a um domínio intracelular CD3 zeta.
[00359] Em algumas modalidades, o CAR abrange um ou mais, por exemplo, dois ou mais, domínios coestimuladores e um domínio de ativação, por exemplo, domínio de ativação primário, na porção cito- plasmática. CARs exemplares incluem componentes intracelulares de CD3-zeta, CD28 e 4-1BB.
[00360] Em alguns casos, CARs são referidos como CARs de pri- meira, segunda e/ou terceira geração. Em alguns aspectos, um CAR de primeira geração é aquele que fornece apenas um sinal induzido pela cadeia CD3 mediante ligação ao antígeno; em alguns aspectos, um CARs de segunda geração é aquele que fornece tal sinal e sinal coestimulador, tal como um incluindo um domínio de sinalização intra- celular de um receptor coestimulador, como CD28 ou CD137; em al- guns aspectos, um CAR de terceira geração em alguns aspectos é aquele que inclui vários domínios coestimuladores de diferentes recep- tores coestimuladores.
[00361] Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quiméri- co inclui uma porção extracelular contendo o anticorpo ou fragmento aqui descrito. Em alguns aspectos, o receptor de antígeno quimérico inclui uma porção extracelular contendo o anticorpo ou fragmento aqui descrito e um domínio de sinalização intracelular. Em algumas modali- dades, o anticorpo ou fragmento inclui um scFv ou um anticorpo VH de domínio único e o domínio intracelular contém um ITAM. Em alguns aspectos, o domínio de sinalização intracelular inclui um domínio de sinalização de uma cadeia zeta de uma cadeia CD3-zeta (CD3ζ). Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico inclui um do- mínio de transmembrana disposto entre o domínio extracelular e a re- gião de sinalização intracelular.
[00362] Em alguns aspectos, o domínio de transmembrana contém uma porção de transmembrana de CD28. O domínio extracelular e a transmembrana podem ser ligados direta ou indiretamente. Em algu- mas modalidades, o domínio extracelular e a transmembrana são liga- dos por um espaçador, tal como qualquer um aqui descrito. Em algu- mas modalidades, o receptor de antígeno quimérico contém um domí- nio intracelular de uma molécula coestimuladora de células T, tal como entre o domínio de transmembrana e o domínio de sinalização intrace- lular. Em alguns aspectos, a molécula coestimuladora de células T é CD28 ou 4-1BB.
[00363] Em algumas modalidades, o CAR contém um anticorpo, por exemplo, um fragmento de anticorpo, um domínio transmembrana que é ou contém uma porção transmembrana de CD28 ou uma variante funcional do mesmo, e um domínio de sinalização intracelular conten- do uma porção de sinalização de CD28 ou funcional variante do mes- mo e uma porção de sinalização de CD3 zeta ou variante funcional do mesmo. Em algumas modalidades, o CAR contém um anticorpo, por exemplo, fragmento de anticorpo, um domínio de transmembrana que é ou contém uma porção de transmembrana de CD28 ou uma variante funcional do mesmo e um domínio de sinalização intracelular contendo uma porção de sinalização de 4-1BB ou variante funcional do mesmo e uma porção de sinalização de CD3 zeta ou variante funcional do mesmo. Em algumas dessas modalidades, o receptor inclui ainda um espaçador contendo uma porção de uma molécula de Ig, tal como uma molécula de Ig humana, tal como uma articulação de Ig, por exemplo,
uma articulação de IgG4, tal como um espaçador de apenas uma arti- culação.
[00364] Em algumas modalidades, o domínio de transmembrana do receptor, por exemplo, o CAR é um domínio de transmembrana de CD28 humano ou variante deste, por exemplo, um domínio de trans- membrana de 27 aminoácidos de um CD28 humano (Nº de Acesso: P10747.1 ), ou é um domínio de transmembrana que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8 ou uma se- quência de aminoácidos que exibe pelo menos ou pelo menos cerca de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais identidade de sequência para a SEQ ID NO: 8; em algumas modalidades, a porção contendo o domí- nio de transmembrana do receptor recombinante compreende a se- quência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9 ou uma se- quência de aminoácidos possuindo pelo menos ou pelo menos cerca de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais identidade de sequência com o mesmo.
[00365] Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quiméri- co contém um domínio intracelular de uma molécula coestimuladora de células T. Em alguns aspectos, a molécula coestimuladora de célu- las T é CD28 ou 4-1BB.
[00366] Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelu- lar compreende um domínio de sinalização coestimulador intracelular de CD28 humano ou variante funcional ou porção do mesmo, tal como um domínio de 41 aminoácidos do mesmo e/ou tal domínio com uma substituição LL por GG nas posições 186-187 de uma proteína CD28 nativa. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular pode compreender a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10 ou 11 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos ou pelo menos cerca de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais iden- tidade de sequência com a SEQ ID NO: 10 ou 11. Em algumas moda- lidades, a região intracelular compreende um domínio de sinalização coestimulador intracelular de 4-1BB ou variante funcional ou porção da mesma, tal como um domínio citoplasmático de 42 aminoácidos de um humano 4 -1BB (No. de Acesso Q07011.1) ou variante funcional ou porção desta, tal como a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12 ou uma sequência de aminoácidos que apresente pelo menos ou pelo menos cerca de 85 %, 86 % , 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais iden- tidade de sequência para SEQ ID NO: 12.
[00367] Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelu- lar compreende uma cadeia CD3 humana, opcionalmente um domínio de sinalização estimulador CD3 zeta ou variante funcional do mesmo, tal como um domínio citoplasmático 112 AA da isoforma 3 de CD3ζ humano (Nº de Acesso: P20963.2 ) ou um domínio de sinalização zeta de CD3 como descrito na Patente Norte Americana No.: 7.446.190 ou na Patente Norte Americana No. 8.911.993. Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende a sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 13, 14 ou 15 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos ou pelo menos cerca de 85 %, 86 %, 87 %, 88 % , 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais identidade de sequência para SEQ ID NO: 13, 14 ou 15.
[00368] Em alguns aspectos, o espaçador contém apenas uma re- gião de articulação de uma IgG, tal como apenas uma articulação de IgG4 ou IgG1, tal como o espaçador de apenas uma articulação apre- sentada na SEQ ID NO: 1. Em outras modalidades, o espaçador é uma articulação de Ig, por exemplo, e uma articulação de IgG4, ligada a um domínio CH2 e/ou CH3. Em algumas modalidades, o espaçador é uma articulação de Ig, por exemplo, uma articulação de IgG4, ligada aos domínios CH2 e CH3, tal como apresentado na SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o espaçador é uma articulação de Ig, por exemplo, uma articulação de IgG4, ligada a um domínio CH3 apenas, tal como apresentado na SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o espaçador é ou compreende uma sequência rica em glicina-serina ou outro ligante flexível, como ligantes flexíveis conhecidos.
2. Receptores de células T (TCRs)
[00369] Em algumas modalidades, o receptor recombinante codifi- cado é um receptor de células T (TCR) ou porção de ligação ao antí- geno do mesmo que reconhece um epítopo de peptídeo ou epítopo de célula T de um polipeptídeo alvo, como um antígeno de um tumor, pro- teína viral ou autoimune.
[00370] Em algumas modalidades, um "receptor de células T" ou "TCR" é uma molécula que contém cadeias α e β variáveis (também conhecidas como TCRα e TCRβ, respectivamente) ou cadeias γ e δ variáveis (também conhecidas como TCRα e TCRβ, respectivamente), ou suas porções de ligação ao antígeno, e que é capaz de se ligar es- pecificamente a um peptídeo ligado a uma molécula de MHC. Em al- gumas modalidades, o TCR está na forma αβ. Normalmente, os TCRs que existem nas formas αβ e γδ são geralmente estruturalmente se- melhantes, mas as células T que os expressam podem ter funções ou localizações anatômicas distintas. Um TCR pode ser encontrado na superfície de uma célula ou na forma solúvel. Geralmente, um TCR é encontrado na superfície das células T (ou linfócitos T), onde geral- mente é responsável pelo reconhecimento de antígenos ligados às moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC).
[00371] A menos que de outra maneira declarado, o termo "TCR" deve ser entendido como abrangendo TCRs completos, bem como porções de ligação ao antígeno ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR intacto ou de comprimento total, incluindo TCRs na forma αβ ou forma γδ. Em algumas modalidades, o TCR é uma porção de ligação ao antígeno que é menor do que um TCR de tamanho natural, porém que se liga a um peptídeo específico ligado em uma molécula de MHC, tal como se liga a um complexo de MHC-peptídeo. Em alguns casos, uma porção de ligação ao antígeno ou fragmento de um TCR pode conter apenas uma porção dos domínios estruturais de um TCR de tamanho natural ou intacto, porém ainda é capaz de ligar o epítopo do peptídeo, tal co- mo o complexo de MHC-peptídeo, ao qual o TCR completo se liga. Em alguns casos, uma porção de ligação ao antígeno contém os domínios variáveis de um TCR, tal como cadeia α variável e cadeia β variável de um TCR, suficiente para formar um sítio de ligação para ligação a um complexo de MHC-peptídeo específico. Geralmente, as cadeias variá- veis de um TCR contêm regiões de determinação de complementari- dade envolvidas no reconhecimento do complexo de peptídeo, MHC e/ou MHC-peptídeo.
[00372] Em algumas modalidades, os domínios variáveis do TCR contêm alças hipervariáveis ou regiões de determinação de comple- mentaridade (CDRs), que geralmente são os contribuintes primários para o reconhecimento do antígeno e capacidades de ligação e espe- cificidade. Em algumas modalidades, uma CDR de um TCR ou combi- nação dos mesmos formam todos ou substancialmente todos os sítios de ligação ao antígeno de uma determinada molécula de TCR. As vá- rias CDRs dentro de uma região variável de uma cadeia de TCR ge- ralmente são separados por regiões estruturais (FRs), que geralmente exibem menos variabilidade entre as moléculas de TCR em compara- ção com as CDRs (veja, por exemplo, Jores e outro, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87: 9138, 1990; Chothia e outro, EMBO J. 7: 3745, 1988; ve-
ja da mesma forma Lefranc e outro, Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003). Em algumas modalidades, CDR3 é a principal CDR responsá- vel pela ligação ou especificidade ao antígeno, ou é a mais importante entre as três CDRs em uma determinada região variável de TCR para reconhecimento de antígeno e/ou para interação com a porção de pep- tídeo processada do complexo de peptídeo-MHC. Em alguns contex- tos, a CDR1 da cadeia alfa pode interagir com a parte N-terminal de certos peptídeos antigênicos. Em alguns contextos, a CDR1 da cadeia beta pode interagir com a parte C-terminal do peptídeo. Em alguns contextos, a CDR2 contribui mais fortemente ou é a CDR primária res- ponsável pela interação com ou reconhecimento da porção de MHC do complexo de MHC-peptídeo. Em algumas modalidades, a região vari- ável da cadeia β pode conter uma outra região hipervariável (CDR4 ou HVR4), que geralmente está envolvida na ligação do superantígeno e não no reconhecimento do antígeno (Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8: 411-426) .
[00373] Em algumas modalidades, um TCR pode da mesma forma conter um domínio constante, um domínio de transmembrana e/ou uma cauda citoplasmática curta (veja, por exemplo, Janeway e outro, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3ª Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997). Em alguns aspectos, cada cadeia do TCR pode possuir um domínio variável de imunoglobulina N-terminal, um domínio constante de imunoglobulina, uma região de transmembrana e uma cauda citoplasmática curta na extremidade C- terminal. Em algumas modalidades, um TCR está associado a proteí- nas invariantes do complexo de CD3 envolvido na mediação da trans- dução de sinal.
[00374] Em algumas modalidades, uma cadeia de TCR contém um ou mais domínios constantes. Por exemplo, a porção extracelular de uma determinada cadeia de TCR (por exemplo, cadeia α ou cadeia β)
pode conter dois domínios semelhantes a imunoglobulinas, tal como um domínio variável (por exemplo, Vα ou Vβ; tipicamente em 1 a 116 aminoácidos com base em numeração de Kabat Kabat e outro, "Se- quences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5ª ed.) e um domínio constante (por exemplo, domínio constante de cadeia α ou Cα, tipicamente posições 117 a 259 da cadeia com ba- se na numeração de Kabat ou domínio constante da cadeia β ou Cβ, tipicamente posições 117 a 295 da cadeia com base em Kabat) adja- centes à membrana celular. Por exemplo, em alguns casos, a porção extracelular do TCR formada pelas duas cadeias contém dois domí- nios constantes proximais à membrana e dois domínios variáveis distais à membrana, em que cada um dos domínios variáveis contém CDRs. O domínio constante do TCR pode conter sequências de cone- xão curtas em que um resíduo de cisteína forma uma ligação de dis- sulfeto, desse modo ligando as duas cadeias do TCR. Em algumas modalidades, um TCR pode ter um resíduo de cisteína adicional em cada uma das cadeias α e β, de modo que o TCR contenha duas liga- ções de dissulfeto nos domínios constantes.
[00375] Em algumas modalidades, as cadeias de TCR contêm um domínio de transmembrana. Em algumas modalidades, o domínio de transmembrana é positivamente carregado. Em alguns casos, a cadeia de TCR contém uma cauda citoplasmática. Em alguns casos, a estru- tura permite que o TCR se associe a outras moléculas como o CD3 e subunidades dos mesmos. Por exemplo, um TCR contendo domínios constantes com uma região de transmembrana pode ancorar a proteí- na na membrana celular e se associar a subunidades invariantes do aparato ou complexo de sinalização de CD3. As caudas intracelulares de subunidades de sinalização de CD3 (por exemplo, cadeias de CD3γ, CD3δ, CD3ε e CD3ζ) contêm um ou mais motivos de ativação à base de tirosina imunorreceptora ou ITAM que estão envolvidos na capacidade de sinalização do complexo TCR.
[00376] Em algumas modalidades, o TCR pode ser um heterodíme- ro de duas cadeias α e β (ou opcionalmente γ e δ) ou pode ser um construtor de TCR de cadeia única. Em algumas modalidades, o TCR é um heterodímero contendo duas cadeias separadas (cadeias α e β ou cadeias γ e δ) que estão ligadas, tal como por uma ligação de dis- sulfeto ou ligações de dissulfeto.
[00377] Em algumas modalidades, o TCR pode ser gerado a partir de uma(s) sequência(s) de TCR conhecida(s), tsl como sequências de cadeias Vα, β, para as quais uma sequência de codificação substanci- almente completa está facilmente disponível. Métodos para obter se- quências de TCR de tamanho natural, incluindo sequências de cadeia V, a partir de fontes de células são bem conhecidos. Em algumas mo- dalidades, os ácidos nucleicos que codificam o TCR podem ser obti- dos a partir de uma variedade de fontes, tal como por reação em ca- deia de polimerase (PCR) amplificação de ácidos nucleicos de codifi- cação de TCR dentro ou isolados de uma determinada célula ou célu- las, ou síntese de sequências de DNA de TCR publicamente disponí- vel.
[00378] Em algumas modalidades, o TCR é obtido a partir de uma fonte biológica, tal como a partir de células, tal como a partir de uma célula T (por exemplo, célula T citotóxica), hibridomas de células T ou outra fonte publicamente disponível. Em algumas modalidades, as cé- lulas T podem ser obtidas a partir de células isoladas in vivo. Em al- gumas modalidades, o TCR é um TCR timicamente selecionado. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR restrito a neoepítopos. Em algumas modalidades, as células T podem ser um hibridoma ou clone de células T cultivadas. Em algumas modalidades, o TCR ou porção de ligação ao antígeno do mesmo ou fragmento de ligação ao antíge-
no do mesmo pode ser gerado sinteticamente a partir do conhecimen- to da sequência do TCR.
[00379] Em algumas modalidades, o TCR é gerado a partir de um TCR identificado ou selecionado a partir da avaliação de uma bibliote- ca de TCRs candidatos contra um antígeno de polipetídeo alvo ou epí- topo de célula T alvo do mesmo. Bibliotecas de TCR podem ser gera- das por amplificação do repertório de Vα e Vβ de células T isoladas de um indivíduo, incluindo células presentes em PBMCs, baço ou outro órgão linfoide. Em alguns casos, as células T podem ser amplificadas a partir de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs). Em algumas modali- dades, as bibliotecas de TCR podem ser geradas a partir de células CD4+ ou CD8+. Em algumas modalidades, os TCRs podem ser ampli- ficados a partir de uma fonte de células T de um indivíduo normal ou saudável, isto é, bibliotecas de TCR normais. Em algumas modalida- des, os TCRs podem ser amplificados a partir de uma fonte de células T de um indivíduo doente, isto é, bibliotecas de TCR doentes. Em al- gumas modalidades, os iniciadores degenerados são usados para amplificar o repertório de genes de Vα e Vβ, tal como por RT-PCR em amostras, tal como células T, obtidas de humanos. Em algumas moda- lidades, as bibliotecas de scTv podem ser montadas a partir de biblio- tecas de Vα e Vβ virgens em que os produtos amplificados são clona- dos ou reunidos para serem separados por um ligante. Dependendo da fonte do indivíduo e das células, as bibliotecas podem ser específi- cas do alelo de HLA. Alternativamente, em algumas modalidades, as bibliotecas de TCR podem ser geradas por mutagênese ou diversifica- ção de uma molécula de TCR origem ou de estrutura. Em alguns as- pectos, os TCRs são submetidos à evolução direcionada, tal como por mutagênese, por exemplo, da cadeia α ou β. Em alguns aspectos, re- síduos específicos dentro de CDRs do TCR são alterados. Em algu- mas modalidades, os TCRs selecionados podem ser modificados por maturação de afinidade. Em algumas modalidades, as células T espe- cíficas do antígeno podem ser selecionadas, tal como por triagem para avaliar a atividade de CTL contra o peptídeo. Em alguns aspectos, TCRs, por exemplo, presentes em células T específicas do antígeno, podem ser selecionadas, tal como por atividade de ligação, por exem- plo, afinidade ou avidez particular para o antígeno.
[00380] Em algumas modalidades, os receptores de antígenos ge- neticamente construídos incluem receptores de células T recombinan- tes (TCRs) e/ou TCRs clonados de células T de ocorrência natural. Em algumas modalidades, um clone de células T de alta afinidade para um antígeno alvo (por exemplo, um antígeno de câncer) é identificado, iso- lado de um paciente e introduzido nas células. Em algumas modalida- des, o clone de TCR para um antígeno alvo foi gerado em camundon- gos transgênicos projetados com genes do sistema imunológico hu- mano (por exemplo, o sistema de antígeno de leucócito humano, ou HLA). Veja, por exemplo, antígenos tumorais (veja, por exemplo, Parkhurst e outro (2009) Clin Cancer Res. 15: 169-180 e Cohen e ou- tro (2005) J Immunol. 175: 5799-5808. Em algumas modalidades, exi- bição de fago é usada para isolar TCRs contra um antígeno alvo (veja, por exemplo, Varela-Rohena e outro (2008) Nat Med. 14: 1390–1395 e Li (2005) Nat Biotechnol. 23: 349–354.
[00381] Em algumas modalidades, o TCR ou porção de ligação ao antígeno do mesmo é aquele que foi modificado ou projetado. Em al- gumas modalidades, métodos de evolução direcionada são usados para gerar TCRs com propriedades alteradas, tal como com maior afi- nidade para um complexo de MHC-peptídeo específico. Em algumas modalidades, a evolução dirigida é obtida por métodos de exibição in- cluindo, porém não limitados a, exibição de levedura (Holler e outro (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler e outro (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 97, 5387-92), exibição de fago (Li e outro (2005) Nat Biotechnol,
23, 349-54), ou exibição de células T (Chervin e outro (2008) J Immu- nol Methods, 339, 175-84). Em algumas modalidades, as abordagens de exibição envolvem a engenharia, ou modificação, de um conhecido TCR precursor ou de referência. Por exemplo, em alguns casos, um TCR tipo silvestre pode ser usado como um modelo para a produção de TCRs mutagenizados em que em um ou mais resíduos dos CDRs são mutados, e mutantes com uma propriedade alterada desejada, como maior afinidade para um antígeno alvo, são selecionados.
[00382] Em algumas modalidades, os peptídeos de um polipeptídeo alvo para uso na produção ou geração de um TCR de interesse são conhecidos ou podem ser facilmente identificados por um especialista na técnica. Em algumas modalidades, os peptídeos adequados para uso na geração de TCRs ou porções de ligação ao antígeno podem ser determinados com base na presença de um motivo restrito a HLA em um polipeptídeo alvo de interesse, tal como um polipeptídeo alvo descrito abaixo. Em algumas modalidades, os peptídeos são identifi- cados usando modelos de previsão de computador disponíveis. Em algumas modalidades, para prever sítios de ligação de MHC classe I, tais modelos incluem, porém não são limitados a, ProPred1 (Singh e Raghava (2001) Bioinformatics 17 (12): 1236-1237, e SYFPEITHI (veja Schuler e outro (2007)) Immunoinformatics Methods in Molecular Bio- logy, 409 (1): 75-93 2007). Em algumas modalidades, o epítopo restri- to ao MHC é HLA-A0201, que é expresso em aproximadamente 39-46 % de todos os caucasianos e, portanto, representa uma escolha ade- quada de antígeno de MHC para uso na preparação de um TCR ou outra molécula de ligação de peptídeo de MHC.
[00383] Os motivos de ligação de HLA-A0201 e os sítios de cliva- gem para proteassomas e proteassomas imunológicos usando mode- los de predição de computador são conhecidos. Para prever sítios de ligação de MHC classe I, tais modelos incluem, porém não são limita-
dos a, ProPred1 (descrito em mais detalhes em Singh e Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17 (12): 1236-1237 2001) e SYFPEITHI (veja Schuler e outro SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoin- formatics Methods in Molecular Biology, vol 409 (1): 75-93 2007).
[00384] Em algumas modalidades, o TCR ou porção de ligação ao antígeno do mesmo pode ser uma proteína natural produzida de forma recombinante ou forma mutada da mesma em que uma ou mais pro- priedades, como a característica de ligação, foram alteradas. Em al- gumas modalidades, um TCR pode ser derivado de uma de várias es- pécies animais, tais como humano, camundongo, rato ou outro mamí- fero. Um TCR pode ser ligado à célula ou na forma solúvel. Em algu- mas modalidades, para os propósitos dos métodos fornecidos, o TCR está na forma ligada à célula, expressa na superfície de uma célula.
[00385] Em algumas modalidades, o TCR é um TCR de tamanho natural. Em algumas modalidades, o TCR é uma porção de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR dimérico (dTCR). Em algumas modalidades, o TCR é um TCR de cadeia única (sc-TCR). Em algumas modalidades, um dTCR ou scTCR tem as es- truturas descritas em WO 03/020763, WO 04/033685, WO2011/044186.
[00386] Em algumas modalidades, o TCR contém uma sequência correspondente à sequência transmembrana. Em algumas modalida- des, o TCR contém uma sequência correspondente a sequências cito- plasmáticas. Em algumas modalidades, o TCR é capaz de formar um complexo de TCR com CD3. Em algumas modalidades, qualquer um dos TCRs, incluindo um dTCR ou scTCR, pode ser ligado a domínios de sinalização que produzem um TCR ativo na superfície de uma célu- la T. Em algumas modalidades, o TCR é expresso na superfície das células.
[00387] Em algumas modalidades, um dTCR contém um primeiro polipeptídeo em que uma sequência correspondendo a uma sequência de região variável de cadeia α de TCR é fundida ao terminal N de uma sequência correspondendo a uma sequência extracelular de região constante de cadeia α de TCR e um segundo polipeptídeo em que uma sequência correspondente a uma sequência da região variável da cadeia β de TCR é fundida ao terminal N de uma sequência corres- pondente a uma sequência extracelular da região constante da cadeia β de TCR, o primeiro e o segundo polipeptídeos sendo ligados por uma ligação de dissulfeto. Em algumas modalidades, a ligação pode corresponder à ligação de dissulfeto intercadeia nativa presente em TCRs αβ diméricos nativos. Em algumas modalidades, as ligações de dissulfeto intercadeia não estão presentes em um TCR nativo. Por exemplo, em algumas modalidades, uma ou mais cisteínas podem ser incorporadas nas sequências extracelulares da região constante do par de polipeptídeo de dTCR. Em alguns casos, tanto uma ligação de dissulfeto nativa quanto uma não nativa podem ser desejáveis. Em al- gumas modalidades, o TCR contém uma sequência de transmembra- na para ancorar à membrana.
[00388] Em algumas modalidades, um dTCR contém uma cadeia α de TCR contendo um domínio α variável, um domínio α constante e um primeiro motivo de dimerização ligado ao terminal C do domínio α constante, e uma cadeia β de TCR compreendendo um domínio β va- riável, um domínio β constante e um primeiro motivo de dimerização ligado ao terminal C do domínio β constante, em que o primeiro e o segundo motivos de dimerização interagem facilmente para formar uma ligação covalente entre um aminoácido no primeiro motivo de di- merização e um aminoácido no segundo motivo de dimerização ligan- do as cadeias TCR α e TCR β juntas.
[00389] Em algumas modalidades, o TCR é um scTCR. Normal-
mente, um scTCR pode ser gerado usando métodos conhecidos, Veja, por exemplo, Soo Hoo, W. F. e outro PNAS (EUA) 89, 4759 (1992); Wülfing, C. e Plückthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. e outro PNAS (EUA) 90 3830 (1993); Publicação internacional PCT Nos. WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO2011/044186; e Schlueter, C. J. e outro J. Mol. Biol. 256, 859 (1996). Em algumas modalidades, um scTCR contém uma ligação intercadeia de dissulfeto não nativa introduzida para facilitar a associação das cadeias de TCR (veja por exemplo PCT publicado in- ternacional No. WO 03/020763). Em algumas modalidades, um scTCR é um TCR truncado não ligado por dissulfeto em que zíperes de leuci- na heterólogos fundidos aos terminais C do mesmo facilitam a associ- ação de cadeia (veja por exemplo PCT publicado internacional nº WO99/60120). Em algumas modalidades, um scTCR contém um do- mínio variável TCRα covalentemente ligado a um domínio variável TCRβ por meio de um ligante peptídico (veja por exemplo, Internatio- nal publicado PCT No. WO99/18129).
[00390] Em algumas modalidades, um scTCR contém um primeiro segmento constituído por uma sequência de aminoácidos correspon- dente a uma região variável de cadeia α de TCR, um segundo seg- mento constituído por uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência de região variável de cadeia β de TCR fundida ao terminal N de uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência extracelular do domínio constante da cadeia β de TCR e uma sequência de ligação ligando o terminal C do primeiro segmento ao terminal N do segundo segmento.
[00391] Em algumas modalidades, um scTCR contém um primeiro segmento constituído por uma sequência de região variável de cadeia α fundida ao terminal N de uma sequência de domínio constante ex- tracelular de cadeia α e um segundo segmento constituído por uma sequência de região variável de cadeia β fundida ao terminal N de uma constante extracelular de cadeia β de sequência e sequência de transmembrana e, opcionalmente, uma sequência ligante ligando o terminal C do primeiro segmento ao terminal N do segundo segmento.
[00392] Em algumas modalidades, um scTCR contém um primeiro segmento constituído por uma sequência de região variável de cadeia β de TCR fundida ao terminal N de uma sequência de domínio cons- tante extracelular de cadeia β e um segundo segmento constituído por uma sequência de região variável de cadeia α fundida ao terminal N. de uma constante extracelular de cadeia α de sequência e sequência de transmembrana e, opcionalmente, uma sequência ligante ligando o terminal C do primeiro segmento ao terminal N do segundo segmento.
[00393] Em algumas modalidades, o ligante de um scTCRs que liga o primeiro e o segundo segmentos de TCR pode ser qualquer ligante capaz de formar um único filamento polipeptídico, enquanto retém a especificidade de ligação de TCR. Em algumas modalidades, a se- quência de ligação pode, por exemplo, ter a fórmula -P-AA-P- em que P é prolina e AA representa uma sequência de aminoácido em que os aminoácidos são glicina e serina. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo segmentos são pareados de modo que as sequências da região variável dos mesmos sejam orientadas para tal ligação. Portan- to, em alguns casos, o ligante tem um comprimento suficiente para abranger a distância entre o terminal C do primeiro segmento e o ter- minal N do segundo segmento, ou vice-versa, porém não é muito lon- go para bloquear ou reduzir a ligação do scTCR ao ligante alvo. Em algumas modalidades, o ligante pode conter de ou cerca de 10 a 45 aminoácidos, tais como 10 a 30 aminoácidos ou 26 a 41 resíduos de aminoácidos, por exemplo, 29, 30, 31 ou 32 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante tem a fórmula -PGGG- (SGGGG)5-P- em que P é prolina, G é glicina e S é serina (SEQ ID NO: 22). Em algumas mo-
dalidades, o ligante tem a sequência GSADDAKKDAAKKDGKS (SEQ ID NO: 23)
[00394] Em algumas modalidades, o scTCR contém uma ligação de dissulfeto covalente ligando um resíduo da região de imunoglobulina do domínio constante da cadeia α a um resíduo da região de imuno- globulina do domínio constante da cadeia β. Em algumas modalida- des, a ligação de dissulfeto intercadeia em um TCR nativo não está presente. Por exemplo, em algumas modalidades, uma ou mais cisteí- nas podem ser incorporadas nas sequências extracelulares da região constante do primeiro e segundo segmentos do polipeptídeo scTCR. Em alguns casos, tanto uma ligação de dissulfeto nativa quanto uma não nativa podem ser desejáveis.
[00395] Em algumas modalidades de um dTCR ou scTCR contendo ligações de dissulfeto intercadeia introduzidas, as ligações de dissulfe- to nativas não estão presentes. Em algumas modalidades, uma ou mais das cisteínas nativas que formam ligações de dissulfeto interca- deias nativas são substituídas por outro resíduo, como por uma serina ou alanina. Em algumas modalidades, uma ligação de dissulfeto intro- duzida pode ser formada pela mutação de resíduos de não cisteína no primeiro e segundo segmentos em cisteína. As ligações dissulfeto não nativas exemplares de um TCR são descritas no PCT International pu- blicado No. WO2006/000830.
[00396] Em algumas modalidades, o TCR ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo exibe uma afinidade com uma constante de ligação de equilíbrio para um antígeno alvo entre cerca de 10-5 e 10-12 M e todos os valores e faixas individuais. Em algumas modalidades, o antígeno alvo é um complexo de MHC-peptídeo ou ligante.
[00397] Em algumas modalidades, o ácido nucleico ou ácidos nu- cleicos que codificam um TCR, tais como cadeias α e β, podem ser amplificados por PCR, clonagem ou outros meios adequados e clona-
dos em um vetor ou vetores de expressão adequados. O vetor de ex- pressão pode ser qualquer vetor de expressão recombinante adequa- do e pode ser usado para transformar ou transfectar qualquer hospe- deiro adequado. Os vetores adequados incluem aqueles concebidos para propagação e expansão ou para expressão ou ambos, tais como plasmídeos e vírus.
[00398] Em algumas modalidades, os vetores de expressão recom- binantes podem ser preparados usando técnicas de DNA recombinan- te padrões. Em algumas modalidades, os vetores podem conter se- quências regulatórias, tais como códons de iniciação e de terminação de transcrição e tradução, que são específicos para o tipo de hospe- deiro (por exemplo, bactéria, fungo, planta ou animal) no qual o vetor deve ser introduzido, quando apropriado e levando em consideração se o vetor é baseado em DNA ou RNA. Em algumas modalidades, o vetor pode conter um promotor não nativo operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica o TCR ou porção de ligação ao antígeno (ou outra molécula de ligação de MHC-peptídeo). Em al- gumas modalidades, o promotor pode ser um promotor não viral ou um promotor viral, tal como um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor de SV40, um promotor de RSV e um promotor encontrado na repetição de terminal longo do vírus de célula tronco de murino. Outros promotores conhecidos também são contemplados.
[00399] Em algumas modalidades, após o clone de células T ser obtido, as cadeias alfa e beta de TCR são isoladas e clonadas em um vetor de expressão gênica. Em algumas modalidades, os genes alfa e beta de TCR são ligados por meio de um peptídeo de salto ribossômi- co de picornavírus 2A de modo que ambas as cadeias sejam coex- pressivas. Em algumas modalidades, a transferência genética do TCR é realizada por meio de vetores retrovirais ou lentivirais ou por meio de transposons (veja, por exemplo, Baum e outro (2006) Molecular The-
rapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13: 1050- 1063; Frecha e outro (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18: 1748–1757; e Hackett e outro (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Ge- ne Therapy. 18: 674–683.
[00400] Em algumas modalidades, para gerar um vetor que codifica um TCR, as cadeias α e β são amplificadas por PCR a partir do cDNA total isolado de um clone de células T que expressa o TCR de interes- se e clonado em um vetor de expressão. Em algumas modalidades, as cadeias α e β são clonadas no mesmo vetor. Em algumas modalida- des, as cadeias α e β são clonadas em vetores diferentes. Em algu- mas modalidades, as cadeias α e β geradas são incorporadas em um retroviral, por exemplo, lentiviral, vetor.
3. Receptor de Autoanticorpo Quimérico (CAAR)
[00401] Em algumas modalidades, o receptor recombinante codifi- cado é um receptor quimérico de autoanticorpos (CAAR). Em algumas modalidades, o CAAR é específico para um autoanticorpo. Em algu- mas modalidades, uma célula que expressa o CAAR, tal como uma célula T projetada para expressar um CAAR, pode ser usada para se ligar especificamente a e matar células que expressam autoanticorpos, porém não células que expressam anticorpos normais. Em algumas modalidades, as células que expressam CAAR podem ser usadas pa- ra tratar uma doença autoimune associada à expressão de autoantí- genos, tal como doenças autoimunes. Em algumas modalidades, as células que expressam CAAR podem ter como alvo células B que, em última análise, produzem os autoanticorpos e exibem os autoanticor- pos em suas superfícies celulares, marcam essas células B como al- vos específicos da doença para intervenção terapêutica. Em algumas modalidades, as células que expressam CAAR podem ser usadas pa- ra direcionar e matar de forma eficiente as células B patogênicas em doenças autoimunes, direcionando as células B causadoras de doen- ças usando um receptor de autoanticorpo quimérico específico do an- tígeno. Em algumas modalidades, o receptor recombinante é um CA- AR, tal como qualquer um descrito na Publicação do Pedido de Paten- te U.S. No. US 2017/0051035.
[00402] Em algumas modalidades, o CAAR compreende um domí- nio de ligação de autoanticorpo, um domínio de transmembrana e uma região de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização in- tracelular. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intrace- lular é ou compreende um domínio de sinalização primário, um domí- nio de sinalização que é capaz de induzir um sinal de ativação primário em uma célula T, um domínio de sinalização de um componente de receptor de célula T (TCR) e/ou um domínio de sinalização compreen- dendo um motivo de ativação à base de tirosina imunorreceptora (ITAM). Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende uma região de sinalização secundária ou coestimuladora (regiões de sinalização intracelular secundárias).
[00403] Em algumas modalidades, o domínio de ligação de autoan- ticorpo compreende um autoantígeno ou um fragmento do mesmo. A escolha do autoantígeno pode depender do tipo de autoanticorpo que está sendo direcionado. Por exemplo, o autoantígeno pode ser esco- lhido porque reconhece um autoanticorpo em uma célula alvo, como uma célula B, associada a um estado de doença particular, por exem- plo, uma doença autoimune, tal como uma doença autoimune mediada por autoanticorpos. Em algumas modalidades, a doença autoimune inclui pênfigo vulgar (PV). Autoantígenos exemplares incluem desmo- gleína 1 (Dsg1) e Dsg3.
4. Multidirecionamento
[00404] Em algumas modalidades, as células e os métodos incluem estratégias de multidirecionamento, tais como a expressão de dois ou mais receptores geneticamente modificados na célula, cada um reco- nhecendo o mesmo de um antígeno diferente e, tipicamente, cada um incluindo um componente de sinalização intracelular diferente. Tais estratégias de multidirecionamento são descritas, por exemplo, em WO 2014055668 (descrevendo combinações de CARs ativadores e coestimuladores, por exemplo, alvejar dois antígenos diferentes pre- sentes individualmente fora do alvo, por exemplo, células normais, po- rém presentes juntas apenas nas células da doença ou condição a ser tratada) e Fedorov e outro, Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013) (descrevendo células que expressam um CAR ativador e inibi- dor, tais como aquelas em que o CAR ativador liga-se a um antígeno expresso em células normais ou não doentes e células da doença ou condição a ser tratada, e o CAR inibidor liga-se a outro antígeno ex- presso apenas em células normais ou nas células que não se deseja tratar).
[00405] Por exemplo, em algumas modalidades, as células incluem um receptor que expressa um primeiro receptor de antígeno genetica- mente modificado (por exemplo, CAR ou TCR) que é capaz de induzir um sinal de ativação ou estimulação para a célula, geralmente median- te ligação específica ao antígeno reconhecido pelo primeiro receptor, por exemplo, o primeiro antígeno. Em algumas modalidades, a célula inclui ainda um segundo receptor de antígeno geneticamente modifi- cado (por exemplo, CAR ou TCR), por exemplo, um receptor coestimu- lador quimérico, que é capaz de induzir um sinal coestimulador para a célula imune, geralmente mediante ligação específica a um segundo antígeno reconhecido pelo segundo receptor. Em algumas modalida- des, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são iguais. Em algu- mas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são dife- rentes.
[00406] Em algumas modalidades, o primeiro e/ou segundo recep- tor de antígeno geneticamente modificado (por exemplo, CAR ou TCR) é capaz de induzir um sinal de ativação ou estimulação para a célula. Em algumas modalidades, o receptor inclui um componente de sinali- zação intracelular contendo ITAM ou motivos semelhantes a ITAM. Em algumas modalidades, a ativação induzida pelo primeiro receptor en- volve uma transdução de sinal ou mudança na expressão da proteína na célula, resultando na iniciação de uma resposta imune, tal como fosforilação de ITAM e/ou iniciação da cascata de transdução de sinal mediada por ITAM, formação de um sinapse imunológica e/ou agru- pamento de moléculas perto do receptor de ligação (por exemplo, CD4 ou CD8, etc.), ativação de um ou mais fatores de transcrição, tais co- mo NF-κB e/ou AP-1, e/ou indução da expressão gênica de fatores como citocinas, proliferação e/ou sobrevivência.
[00407] Em algumas modalidades, o primeiro e/ou segundo recep- tor inclui domínios de sinalização intracelular de receptores coestimu- ladores, tais como CD28, CD137 (4-1BB), OX40 e/ou ICOS. Em algu- mas modalidades, o primeiro e o segundo receptores incluem um do- mínio de sinalização intracelular de um receptor coestimulador que são diferentes. Em uma modalidade, o primeiro receptor contém uma regi- ão de sinalização coestimuladora de CD28 e o segundo receptor con- tém uma região de sinalização coestimuladora 4-1BB ou vice-versa.
[00408] Em algumas modalidades, o primeiro e/ou segundo recep- tor inclui um domínio de sinalização intracelular contendo ITAM ou mo- tivos semelhantes a ITAM e um domínio de sinalização intracelular de um receptor coestimulador.
[00409] Em algumas modalidades, o primeiro receptor contém um domínio de sinalização intracelular contendo ITAM ou motivos seme- lhantes a ITAM e o segundo receptor contém um domínio de sinaliza- ção intracelular de um receptor coestimulador. O sinal coestimulador em combinação com o sinal de ativação ou estimulação induzido na mesma célula é aquele que resulta em uma resposta imune, tal como uma resposta imune robusta e prolongada, tal como aumento da ex- pressão gênica, secreção de citocinas e outros fatores, e funções efe- toras mediadas por células T, tal como morte celular.
[00410] Em algumas modalidades, nem a ligação do primeiro recep- tor apenas, nem a ligação do segundo receptor apenas induz uma resposta imune robusta. Em alguns aspectos, se apenas um receptor for ligado, a célula torna-se tolerada ou não responde ao antígeno, ou é inibida e/ou não é induzida a proliferar ou secretar fatores ou realizar funções efetoras. Em algumas dessas modalidades, no entanto, quan- do a pluralidade de receptores é ligada, tal como no encontro de uma célula que expressa o primeiro e o segundo antígenos, uma resposta desejada é alcançada, tal como ativação ou estimulação imunológica completa, por exemplo, como indicado pela secreção de uma ou mais citocinas, proliferação, persistência e/ou realização de uma função efe- tora imunológica, tal como morte citotóxica de uma célula-alvo.
[00411] Em algumas modalidades, os dois receptores induzem, respectivamente, um sinal de ativação e um inibidor para a célula, de modo que a ligação por um dos receptores ao seu antígeno ativa a cé- lula ou induz uma resposta, porém a ligação do segundo receptor ini- bidor ao seu antígeno induz um sinal que suprime ou amortece essa resposta. Exemplos são combinações de CARs ativadores e CARs ou iCARs inibidores. Tal estratégia pode ser usada, por exemplo, em que o CAR de ativação liga-se a um antígeno expresso em uma doença ou condição, porém que é da mesma forma expresso em células normais, e o receptor inibidor liga-se a um antígeno separado que é expresso nas células normais, porém não células da doença ou condição.
[00412] Em algumas modalidades, a estratégia de múltiplos alvos é empregada em um caso em que um antígeno associado a uma doen-
ça ou condição particular é expresso em uma célula não doente e/ou é expresso na própria célula modificada, seja transitoriamente (por exemplo, mediante estimulação em associação com a engenharia ge- nética) ou permanentemente. Em tais casos, ao exigir a ligação de dois receptores de antígenos específicos separados e individualmente, a especificidade, seletividade e/ou eficácia podem ser melhoradas.
[00413] Em algumas modalidades, a pluralidade de antígenos, por exemplo, o primeiro e o segundo antígenos, são expressos na célula, tecido ou doença ou condição sendo alvo, como na célula cancerosa. Em alguns aspectos, a célula, tecido, doença ou condição é mieloma múltiplo ou uma célula de mieloma múltiplo. Em algumas modalidades, um ou mais da pluralidade de antígenos geralmente é da mesma for- ma expresso em uma célula que não se deseja atingir com a terapia celular, tal como uma célula ou tecido normal ou não doente e/ou as próprias células modificadas. Em tais modalidades, ao requerer liga- ção de múltiplos receptores para obter uma resposta da célula, a es- pecificidade e/ou eficácia é obtida. IV. MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO
[00414] Em alguns aspectos, as células modificadas, por exemplo, células em que as sequências de transgene estão integradas, podem ser usadas em conexão com um método de tratamento, por exemplo, incluindo a administração de qualquer uma das células modificadas ou composições contendo células modificadas que foram avaliadas usan- do os métodos fornecidos aqui. Em alguns aspectos, os métodos for- necidos podem ser usados para testar, avaliar, caracterizar e/ou avali- ar as células modificadas ou composições celulares antes da adminis- tração, por exemplo, para testar a presença, ausência e/ou quantidade dos ácidos nucleicos integrados (por exemplo, sequências de transge- ne) durante uma ou mais etapas do processo de engenharia ou fabri- cação e/ou para teste pós-formulação, avaliação para liberação para administração e/ou pronto para ser administrado ao indivíduo.
[00415] Em algumas modalidades, as células modificadas que ex- pressam um receptor de composições recombinantes compreendendo o mesmo, estimadas ou avaliadas usando as modalidades descritas aqui, são úteis em uma variedade de indicações terapêuticas, diagnós- ticas e profiláticas. Por exemplo, as células modificadas ou composi- ções compreendendo as células modificadas são úteis no tratamento de uma variedade de doenças e distúrbios em um indivíduo. Métodos e usos incluem métodos e usos terapêuticos, por exemplo, envolvendo a administração das células modificadas, ou composições contendo as mesmas, a um indivíduo com uma doença, condição ou distúrbio, co- mo um tumor ou câncer. Em algumas modalidades, as células projeta- das ou composições estimadas ou avaliadas usando as modalidades fornecidas aqui são administradas em uma quantidade eficaz para efe- tuar o tratamento da doença ou distúrbio. Os usos incluem o uso de células ou composições modificadas em tais métodos e tratamentos, e na preparação de um medicamento para realizar tais métodos terapêu- ticos. Em algumas modalidades, os métodos, por exemplo, métodos terapêuticos, são realizados pela administração das células estimadas ou avaliadas por engenharia, ou composições compreendendo as mesmas, ao indivíduo tendo ou suspeito de ter a doença ou condição. Em algumas modalidades, esses métodos desse modo tratam a doen- ça ou condição ou distúrbio no indivíduo.
[00416] Em alguns aspectos, as células modificadas ou a composi- ção de células modificadas podem ser administradas a um indivíduo, tal como um indivíduo tendo uma doença ou distúrbio. Os métodos pa- ra administração de células para terapia celular adotiva são conheci- dos e podem ser usados em conexão com os métodos e composições fornecidos. Por exemplo, métodos de terapia com células T adotivas são descritos, por exemplo, em Publicação de Pedido de Patente US
No. 2003/0170238 de Gruenberg e outro; Patente US No. 4.690.915 de Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8 (10): 577-85). Veja, por exemplo, Themeli e outro (2013) Nat Biotechnol. 31 (10): 928-933; Tsukahara e outro (2013) Biochem Biophys Res Commun 438 (1): 84-9; Davila e outro (2013) PLoS ONE 8 (4): e61338.
[00417] A doença ou condição que é tratada pode ser qualquer uma em que a expressão de um antígeno está associada e/ou envolvida na etiologia de uma condição ou distúrbio de doença, por exemplo causa, agrava ou de outra maneira está envolvida em tal doença, condição ou distúrbio. Doenças e condições exemplares podem incluir doenças ou condições associadas com malignidade ou transformação de células (por exemplo, câncer), doença autoimune ou inflamatória ou uma do- ença infecciosa, por exemplo, causada por uma bactéria, viral ou outro patógeno. Antígenos exemplares, que incluem antígenos associados a várias doenças e condições que podem ser tratadas, são descritos acima. Em modalidades particulares, o receptor de antígeno quimérico ou TCR transgênico liga-se especificamente a um antígeno associado à doença ou condição.
[00418] Entre as doenças, condições e distúrbios estão tumores, incluindo tumores sólidos, malignidades hematológicas e melanomas, e incluindo tumores localizados e metastáticos, doenças infecciosas, tal como infecção por um vírus ou outro patógeno, por exemplo, HIV, HCV, HBV, CMV, HPV e doenças parasitárias e doenças autoimunes e inflamatórias. Em algumas modalidades, a doença, distúrbio ou con- dição é um tumor, câncer, malignidade, neoplasia ou outra doença ou distúrbio proliferativo. Essas doenças incluem, porém não estão limita- das a leucemia, linfoma, por exemplo, leucemia mieloide aguda (ou mieloide) (AML), leucemia mieloide crônica (ou mieloide) (CML), leu- cemia linfocítica aguda (ou linfoblástica) (LLA), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia de células pilosas (HCL), linfoma linfocítico pequeno (SLL), linfoma de células de revestimento (MCL), linfoma da zona marginal, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin (HL), linfoma não Hodgkin (NHL), linfoma células grandes anaplásico (ALCL), linfo- ma folicular, linfoma folicular refratário, linfoma de células B grandes difuso (DLBCL) e mieloma múltiplo (MM). Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma malignidade de células B selecionada entre leucemia linfoblástica aguda (ALL), ALL adulto, leucemia linfoblástica crônica (CLL), linfoma não Hodgkin (NHL) e Linfoma Difuso de Células B Grandes (DLBCL). Em algumas modalidades, a doença ou condição é NHL e o NHL é selecionado a partir do grupo que consiste em NHL agressivo, linfoma de células B grandes difuso (DLBCL), NOS (de no- vo e transformado de indolente), linfoma de células B grandes medias- tinal primário (PMBCL), Linfoma de células B grandes rico em células T/histócitos (TCHRBCL), linfoma de Burkitt, linfoma de células de re- vestimento (MCL) e/ou linfoma folicular (FL), opcionalmente, linfoma folicular de grau 3B (FL3B).
[00419] Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma doença ou condição infecciosa, tal como, porém não limitada a, infec- ções virais, retrovirais, bacterianas e protozoárias, imunodeficiência, citomegalovírus (CMV), vírus Epstein-Barr (EBV), adenovírus, Polio- mavírus BK. Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma doença ou condição autoimune ou inflamatória, tal como artrite, por exemplo, artrite reumatoide (AR), diabetes Tipo I, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), doença inflamatória intestinal, psoríase, escleroder- mia, doença da tireoide autoimune, doença de Grave, doença de Crohn, esclerose múltipla, asma e/ou uma doença ou condição asso- ciada ao transplante.
[00420] Em algumas modalidades, o antígeno associado à doença ou distúrbio é ou inclui integrina αvβ6 (integrina avb6), antígeno de ma- turação de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9
(CA9, da mesma forma conhecida como CAIX ou G250 ), um antígeno de câncer-testículo, antígeno de câncer/testículo 1B (CTAG, da mes- ma forma conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carci- noembriônico (CEA), uma ciclina, ciclina A2, Ligante 1 de Quimiocina de Motivo C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), proteína do fator de crescimento epidérmico truncado (tEGFR), mutação do re- ceptor do fator de crescimento epidérmico tipo III (EGFR vIII), glicopro- teína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc como 5 (FCRL5 ; da mesma forma conhecido como homólogo de re- ceptor Fc 5 ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), uma proteína de ligação de folato (FBP), receptor de folato alfa, gangliosí- deo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp 100), glipicano-3 (GPC3), receptor acoplado à proteína G classe C grupo 5 membro D (GPRC5D), Her2/neu (receptor de tirosina cinase erb-B2), Her3 (erb- B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, antí- geno associado a melanoma de alto peso molecular humano (HMW- MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno de leucócito hu- mano A1 (HLA-A1), antígeno de leucócito humano A2 (HLA- A2), re- ceptor alfa de IL-22 (IL-22Rα), receptor alfa 2 de IL-13 (IL-13Rα2), re- ceptor de domínio de inserção de cinase (kdr), cadeia leve capa, mo- lécula de adesão de célula L1 (L1-CAM), epítopo de CE7 de L1-CAM, repetição rica em leucina contendo 8 membros da família A (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado a melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomegalovírus de murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes do membro D do grupo 2 de morte natural (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão de célula neural (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno prefe-
rencialmente expresso de melanoma (PRAME), receptor de progeste- rona, um antígeno específico da próstata, antígeno de células tronco da próstata (PSCA), antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), Receptor Órfão do Tipo Tirosina Cinase Receptora 1 (ROR1), survivina, glicoproteína de trofoblasto (TPBG da mesma forma conhe- cida como 5T4), glicoproteína associada a tumor 72 (TAG72), proteína 1 relacionada à tirosinase (TRP1, da mesma forma conhecida como TYRP1 ou gp75), proteína relacionada à tirosinase 2 (TRP2, da mes- ma forma conhecida como dopacromo tautomerase, dopacromo delta- isomerase ou DCT) receptor de fator de crescimento endotelial vascu- lar (VEGFR), receptor de fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGFR2), Tumor de Wilms 1 (WT-1), um antígeno específico de pa- tógeno ou expresso por patógeno, ou um antígeno associado com um marcador universal e/ou moléculas biotiniladas e/ou moléculas expres- sas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos. Os antígenos alvejados pelos receptores em algumas modalidades incluem antígenos associ- ados a uma malignidade de células B, tal como qualquer um de uma série de marcadores de células B. Em algumas modalidades, o antí- geno é ou inclui CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igcapa, Iglambda, CD79a, CD79b ou CD30. Em algumas modalidades, o antígeno é ou inclui um antígeno específico do patógeno ou expres- so pelo patógeno, tal como um antígeno viral (por exemplo, um antí- geno viral de HIV, HCV, HBV), antígenos bacterianos e/ou antígenos parasitários.
[00421] Em algumas modalidades, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, scFv ou domínio VH) reconhece es- pecificamente um antígeno, tal como CD19. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é derivado de, ou é uma variante de anticorpos ou fragmento de ligação ao antígeno que liga-se especificamente ao CD19. Em algumas modalidades, a terapia celular, por exemplo, terapia de células T adotivas, é realizada por transferência autóloga, em que as células são isoladas e/ou prepara- das de outra forma a partir do indivíduo que receberá a terapia celular, ou de uma amostra derivada de tal indivíduo. Desse modo, em alguns aspectos, as células são derivadas de um indivíduo, por exemplo, pa- ciente, que necessita de um tratamento e as células, após isolamento e processamento, são administradas ao mesmo indivíduo.
[00422] Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma malignidade de células B. Em algumas modalidades, a malignidade de células B é uma leucemia ou um linfoma. Em alguns aspectos, a do- ença ou condição é leucemia linfoblástica aguda (ALL), ALL adulta, leucemia linfoblástica crônica (CLL), linfoma não Hodgkin (NHL) ou Linfoma Difuso de Células B Grandes (DLBCL). Em alguns casos, a doença ou condição é um NHL, tal como ou incluindo um NHL que é um NHL agressivo, linfoma de células B grandes difuso (DLBCL), NOS (de novo e transformado de indolente), linfoma de células B grandes mediastinal primário (PMBCL), linfoma de células B grandes rico em células T/histócitos (TCHRBCL), linfoma de Burkitt, linfoma de células de revestimento (MCL) e/ou linfoma folicular (FL), opcionalmente, lin- foma folicular Grau 3B (FL3B). Em alguns aspectos, o receptor recom- binante, tal como um CAR, liga-se especificamente a um antígeno as- sociado à doença ou condição ou expresso em células do ambiente de uma lesão associada à malignidade de células B. Os antígenos direci- onados pelos receptores em algumas modalidades incluem antígenos associados a uma malignidade de células B, tal como qualquer um de uma série de marcadores de células B. Em algumas modalidades, o antígeno direcionado pelo receptor é CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igcapa, Iglambda, CD79a, CD79b ou CD30, ou combinações dos mesmos.
[00423] Em algumas modalidades, a doença ou condição é um mi-
eloma, tal como um mieloma múltiplo.
Em alguns aspectos, o receptor recombinante, tal como um CAR, liga-se especificamente a um antíge- no associado à doença ou condição ou expresso em células do ambi- ente de uma lesão associada ao mieloma múltiplo.
Os antígenos dire- cionados pelos receptores em algumas modalidades incluem antíge- nos associados ao mieloma múltiplo.
Em alguns aspectos, o antígeno, por exemplo, o segundo antígeno ou antígeno adicional, tal como o antígeno específico da doença e/ou antígeno relacionado, é expresso em mieloma múltiplo, tal como o antígeno de maturação de células B (BCMA), receptor acoplado à proteína G classe C Grupo 5 membro D (GPRC5D), CD38 (ADP ribose hidrolase cíclica), CD138 (sindecano-1, sindecano, SYN-1), CS-1 (CS1, CD2 subconjunto 1, CRACC, SLAMF7, CD319 e 19A24), BAFF-R, TACI e/ou FcRH5. Outros antí- genos de mieloma múltiplo exemplares incluem CD56, TIM-3, CD33, CD123, CD44, CD20, CD40, CD74, CD200, EGFR, β2-Microglobulina, HM1.24, IGF-1R, IL-6R, TRAIL-R1, e o receptor de ativina tipo IIA (Ac- tRIIA). Ver Benson e Byrd, J.
Clin.
Oncol. (2012) 30 (16): 2013-15; Tao e Anderson, Bone Marrow Research (2011): 924058; Chu e outro, Leukemia (2013) 28 (4): 917-27; Garfall e outro, Discov Med. (2014) 17 (91): 37-46. Em algumas modalidades, os antígenos incluem aqueles presentes em tumores linfoides, mieloma, linfoma associado à AIDS e/ou linfoproliferações pós-transplante, tal como CD38. Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dirigidos contra tais antígenos são conhecidos e incluem, por exemplo, aqueles descritos em Patente U.S.
Nº 8.153.765; 8.603477, 8.008.450; U.S.
Pub.
No.
US20120189622 ou US20100260748; e/ou Publicação Internacional PCT Nos.
WO2006099875, WO2009080829 ou WO2012092612 ou WO2014210064. Em algumas modalidades, tais anticorpos ou frag- mentos de ligação ao antígeno dos mesmos (por exemplo, scFv) estão contidos em anticorpos multiespecíficos, receptores quiméricos multi-
específicos, tais como CARs multiespecíficos e/ou células multiespecí- ficas.
[00424] Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio está asso- ciado à expressão do receptor acoplado à proteína G classe C grupo 5 membro D (GPRC5D) e/ou à expressão do antígeno de maturação das células B (BCMA).
[00425] Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é um dis- túrbio relacionado às células B. Em algumas das modalidades forneci- das dos métodos fornecidos, a doença ou distúrbio associado ao BCMA é uma doença ou distúrbio autoimune. Em algumas das moda- lidades fornecidas dos métodos fornecidos, a doença ou distúrbio au- toimune é lúpus eritematoso sistêmico (SLE), nefrite do lúpus, doença inflamatória intestinal, artrite reumatoide, vasculite associada a ANCA, púrpura de trombocitopenia idiopática (ITP), púrpura de trombocitope- nia trombótica (TTP), trombocitopenia autoimune, doença de Chagas, Doença de Grave, Granulomatose de Wegener, poliarterite nodosa, síndrome de Sjögren, pênfigo vulgar, esclerodermia, esclerose múlti- pla, psoríase, nefropatia por IgA, polineuropatias por IgM, vasculite, diabetes melito, síndrome de Reynaud, síndrome antifosfolipídica, do- ença de Goodpasture, doença de Kawasaki, anemia hemolítica autoi- mune, miastenia grave ou glomerulonefrite progressiva.
[00426] Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é um cân- cer. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer que expressa GPRC5D. Em algumas modalidades, o câncer é uma malignidade de células plasmáticas e a malignidade de células plasmáticas é mieloma múltiplo (MM) ou plasmocitoma. Em algumas modalidades, o câncer é mieloma múltiplo (MM). Em algumas modalidades, o câncer é um mi- eloma múltiplo reincidente/refratário.
[00427] Em algumas modalidades, a terapia celular, por exemplo, terapia adotiva com células T, é realizada por transferência alogênica,
em que as células são isoladas e/ou preparadas de outro modo a partir de um indivíduo diferente de um indivíduo que deve receber ou que finalmente recebe a célula terapia, por exemplo, um primeiro indivíduo. Em tais modalidades, as células são em seguida administradas a um indivíduo diferente, por exemplo, um segundo indivíduo da mesma es- pécie. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo indivíduos são geneticamente idênticos. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo indivíduos são geneticamente semelhantes. Em algumas modalidades, o segundo indivíduo expressa a mesma classe HLA ou supertipo que o primeiro indivíduo.
[00428] As células podem ser administradas por qualquer meio adequado, por exemplo, por infusão em bolo, por injeção, por exem- plo, injeções intravenosas ou subcutâneas, injeção intraocular, injeção periocular, injeção subretinal, injeção intravítrea, injeção trans-septal, injeção subescleral, injeção intracoroidal, injeção intracameral, injeção subconjuntiva, injeção subconjuntival, injeção subtenoniana, injeção retrobulbar, injeção peribulbar ou liberação justascleral posterior. Em algumas modalidades, elas são administradas por via parenteral, in- trapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local, adminis- tração intralesional. Infusões parenterais incluem administração intra- muscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Em algumas modalidades, uma determinada dose é administrada por uma única administração de bolo das células. Em algumas modalidades, é administrada por múltiplas administrações de bolo das células, por exemplo, durante um período de não mais do que 3 dias, ou por admi- nistração de infusão contínua das células. Em algumas modalidades, a administração da dose de células ou quaisquer terapias adicionais, por exemplo, a terapia de linfodepleção, terapia de intervenção e/ou tera- pia de combinação, é realizada por meio de liberação ambulatorial.
[00429] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada pode depender do tipo de doença a ser tratada, do tipo de células ou receptores recombinantes, da gravidade e do curso da do- ença, se as células são administradas para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, a história clínica do indivíduo e resposta às células, e a critério do médico assistente. As composições e células são, em algumas modalidades, adequadamente administradas ao indi- víduo em um momento ou ao longo de uma série de tratamentos.
[00430] Em algumas modalidades, as células são administradas como parte de um tratamento de combinação, como simultaneamente ou sequencialmente com, em qualquer ordem, outra intervenção tera- pêutica, como um anticorpo ou célula modificada ou receptor ou agen- te, como um agente citotóxico ou terapêutico. As células em alguma modalidade são coadministradas com um ou mais agentes terapêuti- cos adicionais ou em conexão com outra intervenção terapêutica, si- multaneamente ou sequencialmente em qualquer ordem. Em alguns contextos, as células são coadministradas com outra terapia suficien- temente próxima no tempo de modo que as populações de células aumentem o efeito de um ou mais agentes terapêuticos adicionais, ou vice-versa. Em algumas modalidades, as células são administradas antes de um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, as células são administradas após um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, um ou mais agen- tes adicionais incluem uma citocina, tal como IL-2, por exemplo, para aumentar a persistência. Em algumas modalidades, os métodos com- preendem a administração de um agente quimioterapêutico.
[00431] Em algumas modalidades, é administrado ao indivíduo um agente quimioterapêutico, por exemplo, um agente quimioterapêutico condicionador, por exemplo, para reduzir a carga tumoral antes da administração.
[00432] Indivíduos de pré-condicionamento com terapias de imuno-
depleção (por exemplo, linfodepleção) em alguns aspectos podem me- lhorar os efeitos da terapia de células adotivas (ACT).
[00433] Desse modo, em algumas modalidades, ao indivíduo é ad- ministrado um agente de pré-condicionamento, tal como um agente linfodepletador ou quimioterapêutico, tal como a ciclofosfamida, fluda- rabina ou combinações dos mesmos, a um indivíduo antes do início da terapia celular. Por exemplo, o indivíduo pode ser administrado com um agente de pré-condicionamento pelo menos 2 dias antes, tal como pelo menos 3, 4, 5, 6 ou 7 dias antes do início da terapia celular. Em algumas modalidades, o indivíduo é administrado com um agente de pré-condicionamento não mais do que 7 dias antes, tal como não mais do que 6, 5, 4, 3 ou 2 dias antes, do início da terapia celular.
[00434] Em algumas modalidades, o indivíduo é pré-condicionado com ciclofosfamida em uma dose entre ou dentre cerca de 20 mg/kg e 100 mg/kg, tal como entre ou dentre cerca de 40 mg/kg e 80 mg/kg. Em alguns aspectos, o indivíduo é pré-condicionado com ou com cer- ca de 60 mg/kg de ciclofosfamida. Em algumas modalidades, a ciclo- fosfamida pode ser administrada em uma dose única ou pode ser ad- ministrada em uma pluralidade de doses, tal como administrada diari- amente, em dias alternados ou a cada três dias. Em algumas modali- dades, a ciclofosfamida é administrada uma vez ao dia por um ou dois dias. Em algumas modalidades, onde o agente linfodepletor compre- ende ciclofosfamida, o indivíduo recebe ciclofosfamida em uma dose entre ou dentre cerca de 100 mg/m2 e 500 mg/m2, tal como entre ou dentre cerca de 200 mg/m2 e 400 mg/m2, ou 250 mg/m2 e 350 mg/m2, inclusive. Em alguns casos, o indivíduo recebe cerca de 300 mg/m2 de ciclofosfamida. Em algumas modalidades, a ciclofosfamida pode ser administrada em uma dose única ou pode ser administrada em uma pluralidade de doses, tal como administrada diariamente, em dias al- ternados ou a cada três dias. Em algumas modalidades, a ciclofosfa-
mida é administrada diariamente, por exemplo, por 1-5 dias, por exemplo, por 3 a 5 dias. Em alguns casos, o indivíduo recebe cerca de 300 mg/m2 de ciclofosfamida, diariamente, durante 3 dias, antes do início da terapia celular.
[00435] Em algumas modalidades, onde o agente linfodepletor compreende fludarabina, o indivíduo recebe fludarabina em uma dose entre ou dentre cerca de 1 mg/m2 e 100 mg/m2, tal como entre ou den- tre cerca de 10 mg/m2 e 75 mg/m2, 15 mg/m2 e 50 mg/m2, 20 mg/m2 e 40 mg/m2 ou 24 mg/m2 e 35 mg/m2, inclusive. Em alguns casos, o indi- víduo recebe cerca de 30 mg/m2 de fludarabina. Em algumas modali- dades, a fludarabina pode ser administrada em uma dose única ou po- de ser administrada em uma pluralidade de doses, tal como adminis- trada diariamente, em dias alternados ou a cada três dias. Em algu- mas modalidades, a fludarabina é administrada diariamente, tal como por 1-5 dias, por exemplo, por 3 a 5 dias. Em alguns casos, o indivíduo recebe cerca de 30 mg/m2 de fludarabina, diariamente, durante 3 dias, antes do início da terapia celular.
[00436] Em algumas modalidades, o agente linfodepletor compre- ende uma combinação de agentes, tal como uma combinação de ciclo- fosfamida e fludarabina. Desse modo, a combinação de agentes pode incluir ciclofosfamida em qualquer dose ou cronograma de administra- ção, tal como aqueles descritos acima, e fludarabina em qualquer dose ou cronograma de administração, tal como aqueles descritos acima. Por exemplo, em alguns aspectos, o indivíduo recebe 60 mg/kg (~2 g/m2) de ciclofosfamida e 3 a 5 doses de 25 mg/m2 de fludarabina an- tes da primeira dose ou da dose subsequente.
[00437] Após a administração das células, a atividade biológica das populações de células modificadas em algumas modalidades é medi- da, por exemplo, por qualquer um de um número de métodos conheci- dos. Os parâmetros para avaliar incluem a ligação específica de uma célula T modificada ou natural ou outra célula imune ao antígeno, in vivo, por exemplo, por imagem, ou ex vivo, por exemplo, por ELISA ou citometria de fluxo. Em certas modalidades, a capacidade das células modificadas de destruir células alvo pode ser medida usando quais- quer métodos conhecidos adequados, tal como ensaios de citotoxici- dade descritos em, por exemplo, Kochenderfer e outro, J. Immunothe- rapy, 32 (7): 689-702 (2009), e Herman e outro J. Immunological Me- thods, 285 (1): 25-40 (2004). Em certas modalidades, a atividade bio- lógica das células é medida pelo ensaio da expressão e/ou secreção de uma ou mais citocinas, tal como CD107a, IFNγ, IL-2 e TNF. Em al- guns aspectos, a atividade biológica é medida avaliando o resultado clínico, tal como a redução na carga ou carga tumoral.
[00438] Em certas modalidades, as células modificadas são tam- bém modificadas de várias maneiras, de modo que sua eficácia tera- pêutica ou profilática seja aumentada. Por exemplo, o CAR ou TCR modificado expresso pela população pode ser conjugado direta ou in- diretamente através de um ligante para uma porção de alvejamento. A prática da conjugação de compostos, por exemplo, CAR ou TCR, para alvejar porções é conhecida. Veja, por exemplo, Wadwa e outro, J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995) e Patente U.S. 5.087.616.
[00439] Em algumas modalidades, as células são administradas como parte de um tratamento de combinação, tal como simultanea- mente ou sequencialmente com, em qualquer ordem, outra interven- ção terapêutica, tal como um anticorpo ou célula modificada ou recep- tor ou agente, tal como um agente citotóxico ou terapêutico. As células em algumas modalidades são coadministradas com um ou mais agen- tes terapêuticos adicionais ou em conexão com outra intervenção te- rapêutica, simultaneamente ou sequencialmente em qualquer ordem. Em alguns contextos, as células são coadministradas com outra tera- pia suficientemente próxima no tempo de modo que as populações de células aumentem o efeito de um ou mais agentes terapêuticos adicio- nais, ou vice-versa. Em algumas modalidades, as células são adminis- tradas antes de um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em al- gumas modalidades, as células são administradas após um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes adicionais incluem uma citocina, tal como IL-2, por exemplo, para realçar a persistência. A. Dosagem
[00440] Em algumas modalidades, uma dose de células é adminis- trada a indivíduos de acordo com os métodos fornecidos e/ou com os artigos fornecidos de fabricação ou composições. Em algumas modali- dades, o tamanho ou o momento das doses é determinado em função da doença ou condição particular no indivíduo. Em alguns casos, o tamanho ou momento das doses para uma doença específica, em vis- ta da descrição fornecida, pode ser determinado empiricamente.
[00441] Em algumas modalidades, a dose de células compreende entre em ou cerca de 2 x 105 das células/kg e em ou cerca de 2 x 106 das células/kg, tal como entre em ou cerca de 4 x 105 das células/kg e em ou cerca de 1 x 106 das células/kg ou entre em ou cerca de 6 x 105 das células/kg e em ou cerca de 8 x 105 das células/kg. Em algumas modalidades, a dose de células compreende não mais do que 2 x 105 das células (por exemplo, expressão de antígeno, como células que expressam CAR) por quilograma de peso corporal do indivíduo (célu- las/kg), tal como não mais do que em ou cerca de 3 x 105 células/kg, não mais do que ou cerca de 4 x 105 células/kg, não mais do que ou cerca de 5 x 105 células/kg, não mais do que ou cerca de 6 x 105 célu- las/kg, não mais que em ou cerca de 7 x 105 células/kg, não mais que ou cerca de 8 x 105 células/kg, não mais que ou cerca de 9 x 105 célu- las/kg, não mais que ou cerca de 1 x 106 células/kg, ou não mais do que ou cerca de 2 x 106 células/kg. Em algumas modalidades, a dose de células compreende pelo menos ou pelo menos cerca de ou em ou cerca de 2 x 105 das células (por exemplo, que expressam antígeno, tal como células que expressam CAR) por quilograma de peso corpo- ral do indivíduo (células/kg) , tal como pelo menos ou pelo menos cer- ca de ou em ou cerca de 3 x 105 células/kg, pelo menos ou pelo me- nos cerca de ou em ou cerca de 4 x 105 células/kg, em menos ou pelo menos cerca de ou cerca de 5 x 105 células/kg, pelo menos ou pelo menos cerca de ou em ou cerca de 6 x 105 células/kg, pelo menos ou pelo menos cerca de ou em ou cerca de 7 x 105 células/kg, pelo me- nos ou pelo menos cerca de ou em ou cerca de 8 x 105 células/kg, pe- lo menos ou pelo menos cerca de ou em ou cerca de 9 x 105 célu- las/kg, pelo menos ou pelo menos cerca de ou em ou cerca de 1 x 106 células/kg, ou pelo menos ou pelo menos cerca de ou em ou cerca de 2 x 106 células/kg.
[00442] Em certas modalidades, as células, ou populações indivi- duais de subtipos de células, são administradas ao indivíduo em uma faixa de ou cerca de 0,1 milhão a ou cerca de 100 bilhões de células e/ou essa quantidade de células por quilograma de peso corporal do indivíduo, tal como, por exemplo, em ou cerca de 0,1 milhão a ou cer- ca de 50 bilhões de células (por exemplo, em ou cerca de 5 milhões de células, em ou cerca de 25 milhões de células, em ou cerca de 500 milhões de células, em ou cerca de 1 bilhão células, em ou cerca de 5 bilhões de células, em ou cerca de 20 bilhões de células, em ou cerca de 30 bilhões de células, em ou cerca de 40 bilhões de células, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores anteriores), em ou cerca de 1 milhão em ou em ou cerca de 50 bilhões de células (por exemplo, em ou cerca de 5 milhões de células, em ou cerca de 25 mi- lhões de células, em ou cerca de 500 milhões de células, em ou cerca de 1 bilhão de células, em ou cerca de 5 bilhões de células, em ou cerca de 20 bilhões de células, em ou cerca de 30 bilhões de células,
em ou cerca de 40 bilhões de células, ou uma faixa definida por quais- quer dois dos valores anteriores), tal como em ou cerca de 10 milhões a ou cerca de 100 bilhões de células (por exemplo, em ou cerca de 20 milhões de células, em ou cerca de 30 milhões de células, em ou cer- ca de 40 milhões de células, em ou cerca de 60 milhões de células, em ou cerca de 70 milhões de células, em ou cerca de 80 milhões de células, em ou cerca de 90 milhões de células, em ou cerca de 10 bi- lhões de células, em ou cerca de 25 bilhões de células, em ou cerca de 50 bilhões de células, em ou cerca de 75 bilhões de células, em ou cerca de 90 bilhões de células, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores anteriores), e em alguns casos em ou cerca de 100 milhões de células a ou cerca de 50 bilhões de células (por exemplo, em ou cerca de 120 milhões de células, em ou cerca de 250 milhões de células, em ou cerca de 350 milhões de células, cerca de 450 mi- lhões de células, em ou cerca de 650 milhões de células, em ou cerca de 800 milhões de células, em ou cerca de 900 milhões de células, em ou cerca de 3 bilhões de células, em ou cerca de 30 bilhões de célu- las, em ou cerca de 45 bilhões células) ou qualquer valor entre essas faixas e/ou por quilograma de peso corporal do indivíduo. As dosagens podem variar dependendo dos atributos específicos da doença ou dis- túrbio e/ou paciente e/ou outros tratamentos.
[00443] Em algumas modalidades, a dose de células é uma dose plana de células ou uma dose fixa de células de modo que a dose de células não seja ligada ou baseada na área de superfície corporal ou peso de um indivíduo. Em algumas modalidades, tais valores referem- se a números de células que expressam receptores recombinantes; em outras modalidades, eles se referem ao número de células T ou PBMCs ou células totais administradas.
[00444] Em algumas modalidades, por exemplo, quando o indivíduo é um humano, a dose inclui menos do que cerca de 5 x 108 células expressando o receptor recombinante total (por exemplo, CAR), célu- las T ou células mononucleares de sangue periférico (PBMCs), por exemplo, na faixa de cerca de 1 x 106 a 5 x 108 de tais células, tais como 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108 ou 5 x 108, em ou cerca de 1 x 106 a ou cerca de 5 x 108 de tais células, tal como em ou cerca de 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 1,5 x 108 ou 5 x 108 no to- tal de tais células, ou a faixa entre quaisquer dois dos valores anterio- res. Em algumas modalidades, por exemplo, quando o indivíduo é um humano, a dose inclui mais do que ou cerca de 1 x 106 células expres- sando o receptor recombinante total (por exemplo, CAR), células T ou células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) e menos do que em ou cerca de 2 x 109 células expressando o receptor recombinante total (por exemplo, CAR), células T ou células mononucleares de san- gue periférico (PBMCs), por exemplo, na faixa de ou cerca de 2,5 x 107 a ou cerca de 1,2 x 109 tais células, tais como em ou cerca de 2,5 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 1,5 x 108, 8 x 108 ou 1,2 x 109 no total de tais cé- lulas, ou a faixa entre quaisquer dois dos valores anteriores.
[00445] Em algumas modalidades, a dose de células geneticamente modificadas compreende de ou cerca de 1 x 105 até ou cerca de 5 x 108 células T que expressam CAR totais (CAR+), a partir de ou cerca de 1 x 105 até ou cerca de 2,5 x 108 células T que expressam CAR to- tais, a partir de ou cerca de 1 x 105 até ou cerca de 1 x 108 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 105 até ou cerca de 5 x 107 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 105 até ou cerca de 2,5 x 107 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 105 até ou cerca de 1 x 107 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 105 até ou cerca de 5 x 106 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 105 até ou cerca de 2,5 x 106 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 105 até ou cerca de 1 x 106 células T que ex-
pressam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 106 até ou cerca de 5 x 108 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 106 até ou cerca de 2,5 x 108 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 106 até ou cerca de 1 x 108 células T que ex- pressam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 106 até ou cerca de 5 x 107 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 106 até ou cerca de 2,5 x 107 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 106 até ou cerca de 1 x 107 células T que ex- pressam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 106 até ou cerca de 5 x 106 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 106 até ou cerca de 2,5 x 106 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 2,5 x 106 até ou cerca de 5 x 108 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 2,5 x 106 até ou cerca de 2,5 x 108 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 2,5 x 106 até ou cerca de 1 x 108 células T que expressam CAR to- tais, a partir de ou cerca de 2,5 x 106 até ou cerca de 5 x 107 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 2,5 x 106 até ou cerca de 2,5 x 107 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 2,5 x 106 até ou cerca de 1 x 107 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 2,5 x 106 até ou cerca de 5 x 106 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 5 x 106 até ou cerca de 5 x 108 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 5 x 106 até ou cerca de 2,5 x 108 células T que expres- sam CAR totais, a partir de ou cerca de 5 x 106 até ou cerca de 1 x 108 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 5 x 106 até ou cerca de 5 x 107 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 5 x 106 até ou cerca de 2,5 x 107 células T que expres- sam CAR totais, a partir de ou cerca de 5 x 106 até ou cerca de 1 x 107 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 107 até ou cerca de 5 x 108 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 107 até ou cerca de 2,5 x 108 células T que expres- sam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 107 até ou cerca de 1 x 108 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 107 até ou cerca de 5 x 107 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 107 até ou cerca de 2,5 x 107 células T que expres- sam CAR totais, a partir de ou cerca de 2,5 x 107 até ou cerca de 5 x 108 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 2,5 x 107 até ou cerca de 2,5 x 108 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 2,5 x 107 até ou cerca de 1 x 108 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 2,5 x 107 até ou cerca de 5 x 107 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 5 x 107 até ou cerca de 5 x 108 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 5 x 107 até ou cerca de 2,5 x 108 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 5 x 107 até ou cerca de 1 x 108 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 108 até ou cerca de 5 x 108 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de 1 x 108 até ou cerca de 2,5 x 108 células T que expressam CAR totais, a partir de ou cerca de or 2.5 x 108 até ou cer- ca de 5 x 108 células T que expressam CAR totais. Em algumas moda- lidades, a dose de células geneticamente modificadas compreende de ou a partir de 2.5 x 107 até ou cerca de 1,5 x 108 células T que expres- sam CAR totais, tal como a partir de ou cerca de 5 x 107 até ou cerca de 1 x 108 células T que expressam CAR totais.
[00446] Em algumas modalidades, a dose de células geneticamente modificadas compreende pelo menos ou cerca de 1 x 105 células que expressam CAR, pelo menos até cerca de 2,5 x 105 células que ex- pressam CAR, pelo menos até cerca de 5 x 105 células que expressam CAR, pelo menos até cerca de 1 x 106 células que expressam CAR, pelo menos até cerca de 2,5 x 106 células que expressam CAR, pelo menos até cerca de 5 x 106 células que expressam CAR, pelo menos até cerca de 1 x 107 células que expressam CAR, pelo menos até cer- ca de 2,5 x 107 células que expressam CAR, pelo menos até cerca de 5 x 107 células que expressam CAR, pelo menos até cerca de 1 x 108 células que expressam CAR, pelo menos até cerca de 1,5 x 108 célu- las que expressam CAR, pelo menos cerca de 5 x 106 células que ex- pressam CAR, pelo menos ou até pelo menos cerca de 1 x 107 células que expressam CAR, pelo menos ou até pelo menos cerca de 2,5 x 107 células que expressam CAR, pelo menos ou até pelo menos cerca de 5 x 107 células que expressam CAR, pelo menos ou até pelo menos cerca de 1 x 108 células que expressam CAR, pelo menos ou até pelo menos cerca de 2,5 x 108 células que expressam CAR, ou pelo menos ou até pelo menos cerca de 5 x 108 células que expressam CAR.
[00447] Em algumas modalidades, a terapia celular compreende a administração de uma dose que compreende uma série de células de ou a partir de cerca de 1 x 105 até ou cerca de 5 x 108 células que ex- pressam receptor recombinante totais, células T totais ou células mo- nonucleares de sangue periférico total (PBMCs), a partir de ou cerca de 5 x 105 até ou cerca de 1 x 107 células que expressam receptor re- combinante totais, células T totais ou células mononucleares de san- gue periférico totais (PBMCs) ou de ou a partir de cerca de 1 x 106 até ou cerca de 1 x 107 células que expressam receptor recombinante to- tais, células T totais ou células mononucleares de sangue periférico totais (PBMCs), cada qual inclusive. Em algumas modalidades, a tera- pia celular compreende a administração de uma dose de células com- preendendo um número de células pelo menos ou pelo menos cerca de 1 x 105 células que expressam receptor recombinante totais, células T totais ou células mononucleares de sangue periférico totais (PBMCs), tais pelo menos ou pelo menos 1 x 106, pelo menos ou pelo menos cerca de 1 x 107, pelo menos ou pelo menos cerca de 1 x 108 de tais células. Em algumas modalidades, o número é com referência ao número total de células expressando CD3 ou CD8, em alguns ca- sos da mesma forma expressando receptor recombinante (por exem- plo, expressando CAR). Em algumas modalidades, a terapia celular compreende a administração de uma dose que compreende um núme- ro de células de ou a partir de cerca de 1 x 105 até ou cerca de 5 x 108 células T totais que expressam CD3 ou CD8 ou células que expres- sam receptor recombinante que expressam CD3 ou CD8, de ou a par- tir de cerca de 5 x 105 até ou cerca de 1 x 107 células T totais que ex- pressam CD3 ou CD8 ou células que expressam receptor recombinan- te que expressam CD3 ou CD8, ou de ou a partir de cerca de 1 x 106 até ou cerca de 1 x 107 células T totais que expressam CD3 ou CD8 ou células que expressam receptor recombinante que expressam CD3 ou CD8, cada qual inclusive. Em algumas modalidades, a terapia celu- lar compreende a administração de uma dose que compreende um número de células de ou a partir de cerca de 1 x 105 até ou cerca de 5 x 108 células que expressam CD3/que expressam CAR ou que ex- pressam CD8/que expressam CAR totais, de ou a partir de cerca de 5 x 105 até ou cerca de 1 x 107 células que expressam CD3/que expres- sam CAR ou expressando CD8/expressando CAR, ou de ou cerca de 1 x 106 até ou cerca de 1 x 107 células que expressando CD3/expressando CAR ou que expressam CD8/que expressam CAR totais, cada qual inclusive.
[00448] Em algumas modalidades, as células T da dose incluem células T CD4+, células T CD8+ ou células T CD4+ e CD8+.
[00449] Em algumas modalidades, por exemplo, onde o indivíduo é humano, as células T CD8+ da dose, incluindo em uma dose incluindo células T CD4+ e CD8+, incluem entre cerca de 1 x 106 e cerca de 5 x 108 células CD8+ que expressam receptor recombinante totais (por exemplo, CAR), por exemplo, na faixa de ou cerca de 5 x 106 até ou cerca de 1 x 108 de tais células, tal como 1 x 107, 2,5 x 107, 5 x 107, 7,5 x 107, 1 x 108, 1,5 x 108 ou 5 x 108 no total de tais células, ou a faixa entre quaisquer dois dos valores anteriores. Em algumas modalidades, o paciente recebe doses múltiplas e cada uma das doses ou a dose total pode estar dentro de qualquer um dos valores anteriores. Em al- gumas modalidades, a dose de células compreende a administração de ou a partir de cerca de 1 x 107 até ou cerca de 0,75 x 108 células T CD8+ que expressam receptor recombinante totais, de ou a partir de cerca de 1 x 107 até ou cerca de 5 x 107 células T CD8+ que expres- sam receptor recombinante totais, de ou a partir de cerca de 1 x 107 até ou cerca de 0,25 x 108 células T CD8+ que expressam receptor re- combinante totais, cada qual inclusive. Em algumas modalidades, a dose de células compreende a administração de pelo menos 1 x 107, 2,5 x 107, 5 x 107, 7,5 x 107, 1 x 108, 1,5 x 108, 2,5 x 108 ou 5 x 108 de células T CD8+ que expressam receptor recombinante totais.
[00450] Em algumas modalidades, a dose de células, por exemplo, células T expressando receptor recombinante, é administrada ao indi- víduo como uma dose única ou é administrada apenas uma vez dentro de um período de duas semanas, um mês, três meses, seis meses, 1 ano ou mais.
[00451] No contexto da terapia celular adotiva, a administração de uma determinada "dose" abrange a administração de uma determina- da quantidade ou número de células como uma única composição e/ou administração única ininterrupta, por exemplo, como uma única injeção ou infusão contínua, e da mesma forma abrange a administra- ção da determinada quantidade ou número de células como uma dose dividida ou como uma pluralidade de composições, fornecidas em múl- tiplas composições ou infusões individuais, durante um período de tempo especificado, tal como em não mais do que 3 dias. Desse mo- do, em alguns contextos, a dose é uma administração única ou contí- nua do número especificado de células, dada ou iniciado em um único ponto no tempo. Em alguns contextos, no entanto, a dose é adminis- trada em múltiplas injeções ou infusões durante um período de não mais do que três dias, como uma vez por dia durante três dias ou por dois dias ou por múltiplas infusões durante um único dia.
[00452] Desse modo, em alguns aspectos, as células da dose são administradas em uma única composição farmacêutica. Em algumas modalidades, as células da dose são administradas em uma pluralida- de de composições, coletivamente contendo as células da dose.
[00453] Em algumas modalidades, o termo "dose dividida" se refere a uma dose que é dividida de modo que seja administrada durante mais de um dia. Este tipo de dosagem está abrangido pelos presentes métodos e é considerado uma dose única.
[00454] Desse modo, a dose de células pode ser administrada co- mo uma dose dividida, por exemplo, uma dose dividida administrada ao longo do tempo. Por exemplo, em algumas modalidades, a dose pode ser administrada ao indivíduo durante 2 dias ou durante 3 dias. Métodos exemplares para a dosagem dividida incluem a administração de 25 % da dose no primeiro dia e a administração dos 75 % restantes da dose no segundo dia. Em outras modalidades, 33 % da dose pode ser administrada no primeiro dia e os 67 % restantes administrados no segundo dia. Em alguns aspectos, 10 % da dose é administrada no primeiro dia, 30 % da dose é administrada no segundo dia e 60 % da dose é administrada no terceiro dia. Em algumas modalidades, a dose dividida não é distribuída durante mais do que 3 dias.
[00455] Em algumas modalidades, as células da dose podem ser administradas por administração de uma pluralidade de composições ou soluções, tal como uma primeira e uma segunda, opcionalmente mais, cada uma contendo algumas células da dose. Em alguns aspec- tos, a pluralidade de composições, cada uma contendo uma população diferente e/ou subtipos de células, são administradas separadamente ou independentemente, opcionalmente dentro de um determinado pe- ríodo de tempo. Por exemplo, as populações ou subtipos de células podem incluir células T CD8+ e CD4+, respectivamente, e/ou popula- ções enriquecidas com CD8+- e CD4+-, respectivamente, por exemplo, células T CD4+ e/ou CD8+, cada uma individualmente incluindo células geneticamente modificadas para expressar o receptor recombinante. Em algumas modalidades, a administração da dose compreende a administração de uma primeira composição compreendendo uma dose de células T CD8+ ou uma dose de células T CD4+ e a administração de uma segunda composição compreendendo a outra da dose de cé- lulas T CD4+ e as células T CD8+.
[00456] Em algumas modalidades, a administração da composição ou dose, por exemplo, a administração da pluralidade de composições de células, envolve a administração das composições de células sepa- radamente. Em alguns aspectos, as administrações separadas são realizadas simultaneamente, ou sequencialmente, em qualquer ordem. Em algumas modalidades, a dose compreende uma primeira composi- ção e uma segunda composição, e a primeira composição e a segun- da composição são administradas até ou cerca de 0 até ou cerca de 12 horas de intervalo, a partir de ou cerca de 0 até ou cerca de 6 horas de intervalo ou a partir de ou cerca de 0 até ou cerca de 2 horas de intervalo. Em algumas modalidades, o início da administração da pri- meira composição e o início da administração da segunda composição são realizados não mais do que ou cerca de 2 horas, não mais do que ou cerca de 1 hora, ou não mais do que ou cerca de 30 minutos de intervalo, não mais do que ou cerca de 15 minutos, não mais do que ou cerca de 10 minutos ou não mais do que ou cerca de 5 minutos de intervalo. Em algumas modalidades, o início e/ou conclusão da admi- nistração da primeira composição e a conclusão e/ou início da admi- nistração da segunda composição são realizados não mais do que ou cerca de 2 horas, não mais do que ou cerca de 1 hora, ou não mais do que ou cerca de 30 minutos de intervalo, não mais do que ou cerca de 15 minutos, não mais do que ou cerca de 10 minutos ou não mais do que ou cerca de 5 minutos de intervalo.
[00457] Em alguma composição, a primeira composição, por exem- plo, a primeira composição da dose, compreende células T CD4+. Em alguma composição, a primeira composição, por exemplo, a primeira composição da dose, compreende células T CD8+. Em algumas moda- lidades, a primeira composição é administrada antes da segunda com- posição.
[00458] Em algumas modalidades, a dose ou composição de célu- las inclui uma relação definida ou alvo de células CD4+ que expressam um receptor recombinante para células CD8+ que expressam um re- ceptor recombinante e/ou de células CD4+ para células CD8+, cuja re- lação opcionalmente é aproximadamente 1:1 ou está entre aproxima- damente 1:3 e aproximadamente 3:1, tal como aproximadamente 1:1. Em alguns aspectos, a administração de uma composição ou dose com o alvo ou relação desejada de diferentes populações de células (tal como relação de CD4+:CD8+ ou relação de CAR+ CD4+:CAR+CD8+, por exemplo, 1:1) envolve a administração de uma composição celular contendo uma das populações e, em seguida, a administração de uma composição celular separada compreendendo a outra das populações, em que a administração está em ou aproximadamente no alvo ou rela- ção desejada. Em alguns aspectos, a administração de uma dose ou composição de células em uma relação definida leva a expansão, per- sistência e/ou atividade anti-tumoral da terapia com células T.
[00459] Em algumas modalidades, o indivíduo recebe doses múlti- plas, por exemplo, duas ou mais doses ou doses consecutivas múlti- plas das células. Em algumas modalidades, duas doses são adminis- tradas a um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo recebe a dose consecutiva, por exemplo, a segunda dose, é administrada apro- ximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 dias após a primeira dose. Em algumas modalidades, múltiplas doses consecutivas são administradas após a primeira dose, de modo que uma dose ou doses adicionais são administradas após a adminis- tração da dose consecutiva. Em alguns aspectos, o número de células administradas ao indivíduo na dose adicional é igual ou semelhante à primeira dose e/ou dose consecutiva. Em algumas modalidades, a do- se ou doses adicionais são maiores do que as doses anteriores.
[00460] Em alguns aspectos, o tamanho da primeira e/ou dose con- secutiva é determinado com base em um ou mais critérios, tal como a resposta do indivíduo ao tratamento anterior, por exemplo, quimiotera- pia, carga de doença no indivíduo, tal como carga tumoral, volume, tamanho ou grau, extensão ou tipo de metástase, estágio e/ou proba- bilidade ou incidência do indivíduo desenvolvendo resultados tóxicos, por exemplo, CRS, síndrome de ativação de macrófago, síndrome de lise tumoral, neurotoxicidade e/ou uma resposta imune do hospedeiro contra as células e/ou receptores recombinantes sendo administrados.
[00461] Em alguns aspectos, o tempo entre a administração da pri- meira dose e a administração da dose consecutiva é de cerca de 9 a cerca de 35 dias, cerca de 14 a cerca de 28 dias ou 15 a 27 dias. Em algumas modalidades, a administração da dose consecutiva ocorre em um ponto de tempo mais do que cerca de 14 dias após e menos do que cerca de 28 dias após a administração da primeira dose. Em al- guns aspectos, o tempo entre a primeira e a dose consecutiva é de cerca de 21 dias. Em algumas modalidades, uma dose ou doses adici- onais, por exemplo, doses consecutivas, são administradas após a administração da dose consecutiva. Em alguns aspectos, a dose ou doses consecutivas adicionais são administradas pelo menos cerca de 14 e menos do que cerca de 28 dias após a administração de uma do-
se anterior. Em algumas modalidades, a dose adicional é administrada menos do que cerca de 14 dias após a dose anterior, por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 dias após a dose anterior. Em algumas modalidades, nenhuma dose é administrada menos do que cerca de 14 dias após a dose anterior e/ou nenhuma dose é administrada mais do que cerca de 28 dias após a dose anterior.
[00462] Em algumas modalidades, a dose de células, por exemplo, células que expressam receptor recombinante, compreende duas do- ses (por exemplo, uma dose dupla), compreendendo uma primeira do- se de células T e uma dose células T consecutiva, em que uma ou ambas da primeira dose e da segunda dose compreendem a adminis- tração da dose dividida de células T.
[00463] Em algumas modalidades, a dose de células é geralmente grande o suficiente para ser eficaz na redução da carga de doença.
[00464] Em algumas modalidades, as células são administradas em uma dosagem desejada, que em alguns aspectos inclui uma dose de- sejada ou número de células ou tipo(s) de células e/ou uma relação desejada de tipos de células. Desse modo, a dosagem de células em algumas modalidades é baseada em um número total de células (ou número por kg de peso corporal) e uma relação desejada das popula- ções individuais ou subtipos, tal como a relação de CD4+ para CD8+. Em algumas modalidades, a dosagem de células é baseada em um número total desejado (ou número por kg de peso corporal) de células nas populações individuais ou de tipos de células individuais. Em al- gumas modalidades, a dosagem é baseada em uma combinação de tais características, tal como um número desejado de células totais, relação desejada e número total de células desejado nas populações individuais.
[00465] Em algumas modalidades, as populações ou subtipos de células, como células T CD8+ e CD4+, são administradas em ou dentro de uma diferença tolerada de uma dose desejada de células totais, tal como uma dose desejada de células T. Em alguns aspectos, a dose desejada é um número desejado de células ou um número desejado de células por unidade de peso corporal do indivíduo a quem as célu- las são administradas, por exemplo, células/kg. Em alguns aspectos, a dose desejada é igual ou superior a um número mínimo de células ou número mínimo de células por unidade de peso corporal. Em alguns aspectos, entre as células totais administradas na dose desejada, as populações individuais ou subtipos estão presentes em ou próximas de uma relação de saída desejada (tal como a relação de CD4+ para CD8+), por exemplo, dentro de uma certa diferença tolerada ou erro de tal proporção.
[00466] Em algumas modalidades, as células são administradas em ou dentro de uma diferença tolerada de uma dose desejada de uma ou mais das populações individuais ou subtipos de células, tal como uma dose desejada de células CD4+ e/ou uma dose desejada de células CD8+. Em alguns aspectos, a dose desejada é um número desejado de células do subtipo ou população, ou um número desejado de tais células por unidade de peso corporal do indivíduo a quem as células são administradas, por exemplo, células/kg. Em alguns aspectos, a dose desejada é igual ou superior a um número mínimo de células da população ou subtipo, ou número mínimo de células da população ou subtipo por unidade de peso corporal.
[00467] Desse modo, em algumas modalidades, a dosagem é ba- seada em uma dose fixa desejada de células totais e uma relação de- sejada e/ou com base em uma dose fixa desejada de um ou mais, por exemplo, cada um dos subtipos ou subtipos individuais populações. Desse modo, em algumas modalidades, a dosagem é baseada em uma dose desejada de células T e uma relação desejada de células CD4+ para células CD8+, e/ou é baseada em uma dose fixa ou mínima desejada de células CD4+ e/ou CD8+.
[00468] Em algumas modalidades, as células são administradas em ou dentro de uma faixa tolerada de uma relação de saída desejada de múltiplas populações de células ou subtipos, tais como células CD4+ e CD8+ ou subtipos. Em alguns aspectos, a relação desejada pode ser uma relação específica ou pode ser uma faixa de relações. por exem- plo, em algumas modalidades, a relação desejada (por exemplo, rela- ção de células CD4+ para células CD8+) está entre em ou cerca de 5:1 e em ou cerca de 5:1 (ou maior do que cerca de 1:5 e menor do que cerca de 5:1), ou entre em ou cerca de 1:3 e em ou cerca de 3:1 (ou maior do que cerca de 1:3 e menos do que cerca de 3:1), tal como en- tre em ou cerca de 2: 1 e em ou cerca de 1:5 (ou maior do que cerca de 1:5 e menor do que cerca de 2:1, tal como em ou cerca de 5:1,
4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1,
1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, or 1:5. Em alguns aspec- tos, a diferença tolerada está dentro de cerca de 1 %, cerca de 2 %, cerca de 3 %, cerca de 4 % cerca de 5 %, cerca de 10 %, cerca de 15 %, cerca de 20 %, cerca de 25 %, cerca de 30 %, cerca de 35 %, cer- ca de 40 %, cerca de 45 %, cerca de 50 % da proporção desejada, in- cluindo qualquer valor entre essas faixas.
[00469] Em modalidades particulares, os números e/ou concentra- ções de células referem-se ao número de células que expressam re- ceptor recombinante (por exemplo, CAR). Em outras modalidades, os números e/ou concentrações de células referem-se ao número ou concentração de todas as células, células T ou células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) administradas.
[00470] Em alguns aspectos, o tamanho da dose é determinado com base em um ou mais critérios, tal como resposta do indivíduo ao tratamento anterior, por exemplo, quimioterapia, carga de doença no indivíduo, tal como carga tumoral, volume, tamanho ou grau, extensão ou tipo de metástase, estágio e/ou probabilidade ou incidência do indi- víduo desenvolver resultados tóxicos, por exemplo, CRS, síndrome de ativação de macrófago, síndrome de lise tumoral, neurotoxicidade e/ou uma resposta imune do hospedeiro contra as células e/ou receptores recombinantes sendo administrados.
[00471] Em algumas modalidades, os métodos da mesma forma incluem a administração de uma ou mais doses adicionais de células que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) e/ou terapia de linfodepleção e/ou uma ou mais etapas dos métodos são repetidas. Em algumas modalidades, uma ou mais doses adicionais são iguais à dose inicial. Em algumas modalidades, uma ou mais doses adicionais são diferentes da dose inicial, por exemplo, mais alta, tal como 2 ve- zes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes ou 10 vezes ou mais superior à dose inicial, ou inferior, tal como, por exemplo, superior, tal como 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 ve- zes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes ou 10 vezes ou inferior à dose inicial. Em algumas modalidades, a administração de uma ou mais doses adi- cionais é determinada com base na resposta do indivíduo ao tratamen- to inicial ou qualquer tratamento anterior, carga de doença no indiví- duo, tal como carga tumoral, volume, tamanho ou grau, extensão ou tipo de metástase, estágio e/ou probabilidade ou incidência do indiví- duo desenvolver resultados tóxicos, por exemplo, CRS, síndrome de ativação de macrófagos, síndrome de lise tumoral, neurotoxicidade e/ou uma resposta imune do hospedeiro contra as células e/ou recep- tores recombinantes sendo administrados. B. Avaliação das Células Administradas
[00472] Em alguns casos, os métodos fornecidos podem ser usa- dos para determinar a presença, ausência ou número de células modi- ficadas em uma amostra de um indivíduo, após a administração das células modificadas ou composições celulares, por exemplo, contendo células em que as sequências de transgene estão integradas. Em al- guns aspectos, os métodos fornecidos podem ser usados para avaliar a presença, ausência ou quantidade da sequência de transgene em uma amostra particular obtida de um indivíduo que recebeu as células modificadas ou composição celular, tais como aquelas geradas usan- do métodos aqui descritos, por exemplo, na Seção II acima. Em alguns aspectos, os métodos fornecidos podem ser usados para avaliar os parâmetros farmacocinéticos (PK) ou farmacodinâmicos (PD) das célu- las modificadas administradas. Em algumas modalidades, os parâme- tros farmacocinéticos incluem a concentração plasmática máxima (pi- co) (Cmáx), o tempo de pico (isto é, quando a concentração plasmática máxima (Cmáx) ocorre; Tmáx), a concentração plasmática mínima (isto é, a concentração plasmática mínima entre as doses de um agente tera- pêutico, por exemplo, células T CAR+; Cmin), a meia-vida de eliminação (T1/2) e a área sob a curva (isto é, a área sob a curva gerada pelo grá- fico do tempo versus concentração plasmática do agente terapêutico células T CAR+; AUC) , após a administração.
[00473] Em alguns aspectos, uma modalidade exemplar envolve avaliar e/ou monitorar parâmetros farmacocinéticos, por exemplo, nú- mero ou concentração de células T CAR+ em uma amostra obtida de um indivíduo que recebeu as células modificadas ou composição con- tendo as células modificadas, por exemplo, no sangue e/ou a quanti- dade ou concentração de sequências de transgene presentes em uma amostra do indivíduo. Em alguns aspectos, uma modalidade exemplar envolve avaliar e/ou monitorar parâmetros farmacocinéticos, por exemplo, número ou concentração de células T CAR+ no sangue. Em algumas modalidades, os métodos envolvem o monitoramento dos números e/ou concentração de células T CAR+ no sangue, por exem- plo, determinando a presença, ausência e/ou quantidade da sequência de transgene no sangue, tal como descrito na Seção I.C.3 acima. V. KITS E ARTIGOS DE FABRICAÇÃO
[00474] Da mesma forma são fornecidos kits e artigos de fabrica- ção, tais como aqueles contendo reagentes para realizar os métodos fornecidos aqui, por exemplo, reagentes para avaliar a presença, au- sência e/ou quantidade de sequências de transgene integradas. Em alguns aspectos, os kits ou artigos de fabricação podem da mesma forma conter reagentes e/ou ácidos nucleicos para uso em processos de modificação ou fabricação para gerar as células modificadas.
[00475] Em algumas modalidades, os kits podem conter reagentes e/ou consumíveis requeridos para isolar ácidos nucleicos das amos- tras e/ou separar ou isolar os ácidos nucleicos com base no tamanho ou peso molecular e/ou determinar a presença, ausência e/ou quanti- dade da sequência de transgene integrada. Em algumas modalidades, os kits contêm reagentes e/ou consumíveis para separar ou isolar a fração de alto ou baixo peso molecular do DNA, tal como reagentes e consumíveis para eletroforese em gel em campo pulsante (PFGE). Em algumas modalidades, os kits contêm uma matriz ou gel ou cartuchos que contêm matriz ou gel para realizar as etapas de separação ou iso- lamento da fração de alto ou baixo peso molecular do DNA. Em algu- mas modalidades, são fornecidos kits que compreendem uma ou mais sondas e/ou um ou mais iniciadores, tal como um par de iniciadores, específicos para toda ou uma porção da sequência de transgene. Em alguns aspectos, as sondas e/ou iniciador podem ligar-se especifica- mente ou reconhecer ou detectar toda ou uma porção da sequência de transgene. Em alguns aspectos, o kit pode conter reagentes e consu- míveis necessários para a reação em cadeia de polimerase (PCR), tal como para PCR quantitativo (qPCR), PCR digital (dPCR) ou PCR digi- tal de gotículas (ddPCR).
[00476] Em algumas modalidades, os kits contêm opcionalmente outros componentes, por exemplo: iniciadores de PCR, reagentes de PCR, tal como polimerase, tampão, nucleotídeos, reagentes para en- saios adicionais, por exemplo, coloração de citocina intracelular, cito- metria de fluxo, imunoprecipitação da cromatina e/ou análise adicional. Em algumas modalidades, os reagentes para ensaios adicionais inclu- em componentes para realizar um ensaio in vitro para medir a expres- são ou o nível de moléculas específicas. Em alguns casos, o ensaio in vitro é um imunoensaio, um ensaio baseado em aptâmero, um ensaio histológico ou citológico ou um ensaio de nível de expressão de mRNA. Em algumas modalidades, o ensaio in vitro é selecionado den- tre um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), imunomancha- mento, imunoprecipitação, radioimunoensaio (RIA), imunocoloração, ensaio de citometria de fluxo, ressonância de plasmônio superficial (SPR), ensaio de quimioluminescência, imunoensaio de fluxo lateral, ensaio de inibição e ensaio de avidez. Em alguns aspectos, o reagente é um reagente de ligação que se liga especificamente às moléculas. Em alguns casos, o reagente de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um aptâmero ou uma sonda de ácido nucleico. Os vários componentes do kit podem estar presentes em recipientes separados ou certos componentes compatíveis podem ser pré-combinados em um único recipiente. Em algumas modalida- des, os kits também contêm instruções para usar os componentes do kit para praticar os métodos fornecidos. VI. DEFINIÇÕES
[00477] A menos que de outra maneira definido, todos os termos da técnica, notações e outros termos técnicos e científicos ou terminolo- gia usados são pretendidos ter o mesmo significado que é geralmente entendido por alguém versado na técnica ao qual o assunto reivindica- do pertence. Em alguns casos, os termos com geralmente significados compreendidos são definidos aqui para maior clareza e/ou para pronta referência, e a inclusão de tais definições aqui não deve necessaria- mente ser interpretada como representando uma diferença substancial sobre o que é geralmente entendido na técnica.
[00478] Quando aqui utilizado, o termo "transgene" ou "sequências de transgene" (em alguns casos, da mesma forma chamadas de se- quências quiméricas, recombinantes, heterólogas, exógenas ou DNA quimérico, recombinante, heterólogo, exógeno) referem-se a sequên- cias de ácido nucleico que foram formadas artificialmente combinando- se constituintes de diferentes fontes, tal como diferentes organismos, diferentes genes ou diferentes variantes. Em alguns aspectos, as se- quências de transgene foram submetidas a uma modificação biológica molecular, por exemplo, por combinação artificial de diferentes molé- culas de ácido nucleico ou fragmentos de diferentes fontes. Em algu- mas modalidades, as sequências de transgene contêm pelo menos alguma porção das sequências que são de uma origem diferente em comparação com a sequência genômica das células em que o polinu- cleotídeo contendo a sequência de transgene é introduzido. Em alguns casos, pelo menos uma porção da sequência de transgene é heterólo- ga, exógena ou transgênica para a célula em que a sequência de transgene é introduzida e pode incluir sequências de codificação e/ou não codificação. Em alguns aspectos, a sequência de transgene pode se referir a sequências que são integradas ao genoma da célula em que a sequência de transgene é introduzida.
[00479] Quando aqui utilizadas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto claramente dite o contrário. Por exemplo, "um" ou "uma" significa "pelo menos um" ou "um ou mais". Entende-se que os aspectos e variações aqui descri- tos incluem "consistindo" e/ou "consistindo essencialmente em" aspec- tos e variações.
[00480] O termo "cerca de", quando aqui utilizado, refere-se à faixa de erro usual para o respectivo valor facilmente conhecido pela pessoa versada neste campo técnico. Referência a "cerca de" um valor ou pa- râmetro aqui inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas a esse valor ou parâmetro por si próprio. Por exemplo, a descrição refe- rente a "cerca de X" inclui a descrição de "X".
[00481] Ao longo desta descrição, vários aspectos do assunto rei- vindicado são apresentados em um formato de faixa. Deve ser enten- dido que a descrição em formato de faixa é meramente por conveniên- cia e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação infle- xível no escopo do assunto reivindicado. Desta maneira, a descrição de uma faixa deve ser considerada como tendo especificamente des- crito todas as subfaixas possíveis, bem como valores numéricos indi- viduais dentro dessa faixa. Por exemplo, onde uma faixa de valores é fornecida, entende-se que cada valor intermediário, entre o limite su- perior e inferior dessa faixa e qualquer outro valor declarado ou inter- mediário nessa faixa declarada, está englobado dentro do assunto rei- vindicado. Os limites superior e inferior dessas faixas menores podem ser independentemente incluídos nas faixas menores e são da mesma forma abrangidos dentro do assunto reivindicado, indivíduo a qualquer limite especificamente excluído na faixa declarada. Quando a faixa de- clarada inclui um ou ambos os limites, faixas excluindo um ou ambos os limites incluídos estão da mesma forma incluídas no assunto reivin- dicado. Isso aplica-se independentemente da amplitude da faixa.
[00482] Quando aqui utilizado, uma composição refere-se a qual- quer mistura de dois ou mais produtos, substâncias ou compostos, in- cluindo células. Pode ser uma solução, uma suspensão, líquido, pó, uma pasta, aquosa, não aquosa ou qualquer combinação dos mes- mos.
[00483] Quando aqui utilizado, uma declaração de que uma célula ou população de células é "positiva" para um marcador específico refe-
re-se à presença detectável em ou na célula de um marcador particu- lar, tipicamente um marcador de superfície. Quando se refere a um marcador de superfície, o termo se refere à presença de expressão de superfície detectada por citometria de fluxo, por exemplo, por man- chamento com um anticorpo que especificamente liga-se ao marcador e detecção do referido anticorpo, em que o manchamento é detectável por citometria de fluxo em um nível substancialmente acima do man- chamento detectado realizando o mesmo procedimento com um con- trole compatível com isotipo sob outras condições de outra maneira idênticas e/ou em um nível substancialmente similar ao da célula co- nhecida como positiva para o marcador e/ou em um nível substancial- mente mais alto do que para uma célula conhecida ser negativa para o marcador.
[00484] Quando aqui utilizado, uma declaração de que uma célula ou população de células é "negativa" para um marcador específico re- fere-se à ausência de presença substancial detectável em ou na célula de um marcador específico, tipicamente um marcador de superfície. Quando se refere a um marcador de superfície, o termo se refere à ausência de expressão de superfície detectada por citometria de fluxo, por exemplo, por manchamento com um anticorpo que liga-se especi- ficamente ao marcador e detecção do referido anticorpo, em que o manchamento não é detectado por citometria de fluxo em um nível substancialmente acima do manchamento detectado realizando o mesmo procedimento com um controle compatível com isotipo sob condições idênticas de outra forma e/ou em um nível substancialmente inferior ao da célula conhecida como positiva para o marcador e/ou em um nível substancialmente semelhante ao de uma célula conhecida por ser negativa para o marcador.
[00485] O termo "vetor", quando aqui utilizado, refere-se a uma mo- lécula de ácido nucleico capaz de propagar outro ácido nucleico ao qual está ligada. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual foi introduzido. Certos vetores são ca- pazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais estão operacionalmente ligados. Esses vetores são aqui referidos como "ve- tores de expressão".
[00486] Quando aqui utilizado, "porcentagem ( %) de identidade de sequência de aminoácidos" e "porcentagem de identidade" quando usadas em relação a uma sequência de aminoácidos (sequência de polipeptídeo de referência) são definidas como a porcentagem de re- síduos de aminoácidos em uma sequência candidata (por exemplo, o anticorpo do indivíduo ou fragmento) que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência de polipeptídeo de referência, após ali- nhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência e não considerar quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. O alinhamento para propósitos de determinação da porcen- tagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser obtido de várias maneiras conhecidas, por exemplo, usando software de compu- tador disponível publicamente, como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências podem ser determinados, incluindo quais- quer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências sendo comparadas.
[00487] Em algumas modalidades, "operacionalmente ligado" pode incluir a associação de componentes, como uma sequência de DNA, por exemplo, um ácido nucleico heterólogo) e uma(s) sequência(s) re- guladora(s), de modo a permitir a expressão gênica quando as molé- culas apropriadas (por exemplo, proteínas ativadoras da transcrição) estão ligadas à sequência regulatória. Portanto, isso significa que os componentes descritos estão em uma relação que permite que funcio- nem da maneira pretendida.
[00488] Uma substituição de aminoácido pode incluir a substituição de um aminoácido em um polipeptídeo por outro aminoácido. A substi- tuição pode ser uma substituição conservadora de aminoácido ou uma substituição não conservadora de aminoácido. As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em uma molécula de ligação, por exemplo, anticorpo, de interesse e os produtos selecionados para uma atividade desejada, por exemplo, ligação de antígeno reti- da/melhorada, imunogenicidade diminuída ou ADCC ou CDC melho- rado.
[00489] Os aminoácidos geralmente podem ser agrupados de acor- do com as seguintes propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
[00490] Em algumas modalidades, as substituições conservadoras podem envolver a troca de um membro de uma dessas classes por outro membro da mesma classe. Em algumas modalidades, as substi- tuições não conservadoras de aminoácidos podem envolver a troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.
[00491] Quando aqui utilizado, um "indivíduo" é um mamífero, tal como um humano ou outro animal, e normalmente é humano. VII. MODALIDADES EXEMPLARES
[00492] Entre as modalidades fornecidas são:
[00493] 1. Um método para avaliar a integração genômica de uma sequência de transgene, o método compreendendo: (a) separar uma fração de alto peso molecular de ácido de- soxirribonucleico (DNA) maior ou maior do que cerca de 10 quilobases (kb) do DNA isolado de uma ou mais células, a referida uma ou mais células compreendendo, ou suspeita de compreender, pelo menos uma célula modificada compreendendo uma sequência de transgene que codifica uma proteína recombinante; (b) determinar a presença, ausência ou quantidade da se- quência de transgene integrada no genoma de uma ou mais células.
[00494] 2. O método da modalidade 1, em que, antes da separação, isolar o ácido desoxirribonucleico (DNA) de uma ou mais células.
[00495] 3. O método da modalidade 1 ou modalidade 2, em que a determinação da presença, ausência ou quantidade da sequência de transgene compreende determinar a massa, peso ou número de có- pias da sequência de transgene por genoma diploide ou por célula em uma ou mais células.
[00496] 4. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 1-3, em que a uma ou mais células compreendem uma população de células em que uma pluralidade de células da população compreende a sequência de transgene que codifica a proteína recombinante.
[00497] 5. O método da modalidade 4, em que o número de cópias é uma média ou número de cópias médio por genoma diploide ou por célula entre a população de células.
[00498] 6. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-5, em que, antes da separação, um polinucleotídeo compreendendo a sequência de transgene que codifica a proteína recombinante foi in- troduzido em pelo menos uma célula modificada de uma ou mais célu- las.
[00499] 7. O método da modalidade 6, em que a pelo menos uma célula modificada não foi incubada em uma temperatura superior a
25°C, opcionalmente em ou cerca de 37°C ± 2°C, por mais do que 96 horas após a introdução do polinucleotídeo compreendendo a sequên- cia de transgene.
[00500] 8. O método da modalidade 6, em que a pelo menos uma célula modificada não foi incubada em uma temperatura superior a 25°C, opcionalmente em ou cerca de 37°C ± 2°C, por mais do que 72 horas após a introdução do polinucleotídeo compreendendo a sequên- cia de transgene.
[00501] 9. O método da modalidade 6, em que a pelo menos uma célula modificada não foi incubada em uma temperatura superior a 25°C, opcionalmente em ou cerca de 37°C ± 2°C, por mais do que 48 horas após a introdução do polinucleotídeo compreendendo a sequên- cia de transgene.
[00502] 10. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que uma ou mais células foram criopreservadas antes da separação da fração de alto peso molecular de DNA.
[00503] 11. O método de acordo com qualquer uma das modalida- des 1-10, em que uma ou mais células é uma linhagem celular.
[00504] 12. O método de acordo com qualquer uma das modalida- des 1-11, em que a uma ou mais células são células primárias obtidas de uma amostra de um indivíduo.
[00505] 13. O método de acordo com qualquer modalidade 12, em que a uma ou mais células é uma célula imune.
[00506] 14. O método da modalidade 13, em que a célula imune é uma célula T ou uma célula NK.
[00507] 15. O método da modalidade 14, em que a célula T é uma célula T CD3+, CD4+ e/ou CD8+.
[00508] 16. Método para avaliar uma sequência de transgene em uma amostra biológica de um indivíduo, o método compreendendo: (a) separar uma fração de alto peso molecular de ácido de-
soxirribonucleico (DNA) maior ou maior do que cerca de 10 quilobases (kb) do DNA isolado de uma ou mais células presentes em uma amos- tra biológica de um indivíduo, em que a amostra biológica compreen- de, ou é suspeita de compreender, pelo menos, uma célula modificada compreendendo uma sequência de transgene que codifica uma prote- ína recombinante; e (b) determinar a presença, ausência ou quantidade da se- quência de transgene em toda ou uma parte da amostra biológica.
[00509] 17. O método da modalidade 16, em que a determinação da presença, ausência ou quantidade da sequência de transgene em (b) compreende a determinação da massa, peso ou número de cópias da sequência de transgene em toda ou uma parte da amostra biológi- ca.
[00510] 18. O método da modalidade 16, em que, antes da separa- ção, isolar o DNA de uma ou mais células presentes na amostra bioló- gica.
[00511] 19. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 16-18, em que a amostra biológica é obtida de um indivíduo que rece- beu uma composição que compreende pelo menos uma célula modifi- cada compreendendo a sequência de transgene.
[00512] 20. O método de acordo com qualquer uma das modalida- des 16-19, em que a amostra biológica é uma amostra de tecido ou fluido corporal.
[00513] 21. O método da modalidade 20, em que a amostra biológi- ca é uma amostra de tecido e o tecido é um tumor.
[00514] 22. O método da modalidade 21, em que a amostra de teci- do é uma biópsia de tumor.
[00515] 23. O método da modalidade 20, em que a amostra biológi- ca é uma amostra de fluido corporal e a amostra de fluido corporal é uma amostra de sangue ou soro.
[00516] 24. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 16-23, em que, antes da separação, um polinucleotídeo compreen- dendo a sequência de transgene que codifica a proteína recombinante foi introduzido em pelo menos uma célula modificada de uma ou mais células.
[00517] 25. O método de acordo com qualquer uma das modalida- des 16-24, em que uma ou mais células na amostra biológica compre- endem uma célula imune.
[00518] 26. O método da modalidade 25, em que a célula imune é uma célula T ou uma célula NK.
[00519] 27. O método da modalidade 26, em que a célula T é uma célula T CD3+, CD4+ e/ou CD8+.
[00520] 28. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-27, em que a separação é realizada por eletroforese em gel em campo pulsante ou cromatografia de exclusão de tamanho.
[00521] 29. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-28, em que a separação é realizada por eletroforese em gel em campo pulsante.
[00522] 30. Método para avaliar a integração genômica de uma se- quência de transgene, o método compreendendo: (a) separar, por eletroforese em gel em campo pulsante, uma fração de alto peso molecular de ácido desoxirribonucleico (DNA) maior ou maior do que cerca de 10 quilobases (kb) do DNA isolado de uma população de células, a referida população de células compreen- dendo uma pluralidade de células modificadas que cada um compre- ende, ou são suspeitos de compreender, uma sequência de transgene que codifica uma proteína recombinante; e (b) determinar a média ou número de cópias médio por ge- noma diploide ou por célula da sequência de transgene integrada no genoma da pluralidade de células modificadas da população de célu-
las.
[00523] 31. O método da modalidade 30, em que, antes da separa- ção, um polinucleotídeo compreendendo a sequência de transgene que codifica a proteína recombinante foi introduzido em pelo menos uma da pluralidade de células modificadas da população de células.
[00524] 32. O método da modalidade 31, em que a população de células não foi incubada em uma temperatura superior a 25°C, opcio- nalmente em ou cerca de 37°C ± 2°C, por mais do que 96 horas após a introdução do polinucleotídeo compreendendo a sequência de trans- gene na pelo menos uma célula modificada.
[00525] 33. O método da modalidade 31, em que a população de células não foi incubada em uma temperatura superior a 25°C, opcio- nalmente em ou cerca de 37°C ± 2°C, por mais do que 72 horas após a introdução do polinucleotídeo compreendendo a sequência de trans- gene na pelo menos uma célula modificada.
[00526] 34. O método da modalidade 31, em que a população de células não foi incubada em uma temperatura superior a 25°C, opcio- nalmente em ou cerca de 37°C ± 2°C, por mais do que 48 horas após a introdução do polinucleotídeo compreendendo a sequência de trans- gene na pelo menos uma célula modificada.
[00527] 35. O método de acordo com qualquer uma das modalida- des 30-34, em que a população de células foi criopreservada antes da separação da fração de alto peso molecular de DNA.
[00528] 36. O método de acordo com qualquer uma das modalida- des 1-35, em que a fração de alto peso molecular é maior ou maior do que cerca de 15 quilobases (kb).
[00529] 37. O método, de acordo com qualquer uma das modalida- des 1-35, em que a fração de alto peso molecular é maior ou maior do que cerca de 17,5 quilobases (kb).
[00530] 38. O método, de acordo com qualquer uma das modalida-
des 1-35, em que a fração de alto peso molecular é maior ou maior do que cerca de 20 quilobases (kb).
[00531] 39. O método, de acordo com qualquer uma das modalida- des 1-38, em que a determinação da presença, ausência ou quantida- de da sequência de transgene é realizada por reação em cadeia de polimerase (PCR).
[00532] 40. O método da modalidade 39, em que a PCR é a reação em cadeia de polimerase quantitativa (qPCR), PCR digital ou PCR di- gital de gotículas.
[00533] 41. O método da modalidade 39 ou modalidade 40, em que a PCR é PCR digital de gotículas.
[00534] 42. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 39-41, em que a PCR é realizada usando um ou mais iniciadores que são complementares ou capazes de especificamente amplificar pelo menos uma porção da sequência de transgene.
[00535] 43. O método de acordo com qualquer uma das modalida- des 1-42, em que a determinação da quantidade da sequência de transgene compreende avaliar a massa, peso ou número de cópias da sequência de transgene por massa ou peso do DNA isolado de uma ou mais células, opcionalmente por micrograma de DNA isolado de uma ou mais células.
[00536] 44. O método da modalidade 43, em que a determinação da quantidade da sequência de transgene compreende avaliar a mas- sa ou peso da sequência de transgene em micrograma, por microgra- ma de DNA isolado de uma ou mais células.
[00537] 45. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-42, em que a determinação da quantidade da sequência de transge- ne compreende avaliar a massa, peso ou número de cópias da se- quência de transgene por uma ou mais células, opcionalmente por cé- lulas CD3+, CD4+ e/ou CD8+, e/ou por célula que expressa a proteína recombinante.
[00538] 46. O método de acordo com qualquer uma das modalida- des 16-42, em que a determinação da presença, ausência ou quanti- dade da sequência de transgene compreende avaliar a massa, peso ou número de cópias da sequência de transgene por genoma diploide ou por célula na amostra biológica.
[00539] 47. O método da modalidade 46, em que o número de có- pias é uma média ou número de cópias médio por genoma diploide ou por célula entre uma ou mais células na amostra biológica.
[00540] 48. O método de acordo com qualquer uma das modalida- des 16-42, em que a determinação da quantidade da sequência de transgene compreende avaliar a massa, peso ou número de cópias da sequência de transgene por volume da amostra biológica, opcional- mente por microlitro ou por mililitro da amostra biológica.
[00541] 49. O método de acordo com qualquer uma das modalida- des 16-42, em que a determinação da quantidade da sequência de transgene compreende avaliar a massa, peso ou número de cópias da sequência de transgene por peso corporal ou área de superfície corpo- ral do indivíduo.
[00542] 50. O método de acordo com qualquer uma das modalida- des 1-42, em que a determinação da quantidade da sequência de transgene compreende a avaliação da massa, peso ou número de có- pias da sequência de transgene na fração de alto peso molecular e normalização da massa, peso ou número de cópias para a massa, pe- so ou número de cópias de um gene de referência na fração de alto peso molecular ou para uma curva padrão.
[00543] 51. O método da modalidade 50, em que o gene de refe- rência é um gene de manutenção.
[00544] 52. O método da modalidade 50 ou modalidade 51, em que o gene de referência é um gene que codifica a albumina (ALB).
[00545] 53. O método da modalidade 50 ou modalidade 51, em que o gene de referência é um gene que codifica a subunidade p30 da pro- teína P da ribonuclease (RPP30).
[00546] 54. O método da modalidade 50-53, em que o número de cópias de um gene de referência no DNA isolado é realizado por PCR usando um ou mais iniciadores que são complementares a ou são ca- pazes de especificamente amplificar pelo menos uma porção do gene de referência.
[00547] 55. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-54, em que a sequência de transgene não codifica uma proteína gag viral completa.
[00548] 56. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-55, em que a sequência de transgene não compreende um genoma de HIV completo, um genoma viral competente para replicação e/ou genes acessórios, cujos genes acessórios são opcionalmente Nef, Vpu, Vif, Vpr e/ou Vpx.
[00549] 57. O método de acordo com qualquer uma das modalida- des 6-15, 24-29 e 31-55, em que a introdução do polinucleotídeo é realizada por transdução com um vetor viral compreendendo o polinu- cleotídeo.
[00550] 58. O método da modalidade 57, em que o vetor viral é um vetor retroviral ou um vetor gama-retroviral.
[00551] 59. O método da modalidade 57 ou modalidade 58, em que o vetor viral é um vetor lentiviral.
[00552] 60. Método, de acordo com a modalidade 57, em que o ve- tor viral é um vetor AAV, opcionalmente selecionado entre os vetores AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 ou AAV8.
[00553] 61. O método de acordo com qualquer uma das modalida- des 6-15, 24-29 e 31-55, em que a introdução do polinucleotídeo é realizada por um método de liberação física, opcionalmente por eletro-
poração.
[00554] 62. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-61, em que a proteína recombinante é um receptor recombinante.
[00555] 63. Método, de acordo com a modalidade 62, em que o re- ceptor recombinante liga-se especificamente a um antígeno associado a uma doença ou condição ou a um antígeno que é expresso em célu- las do ambiente de uma lesão associada a uma doença ou condição.
[00556] 64. O método da modalidade 63, em que a doença ou con- dição é um câncer.
[00557] 65. O método da modalidade 63 ou modalidade 64, em que o antígeno é selecionado a partir de αvβ6 integrina (avb6 integrina), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, da mesma forma conhecido como CAIX ou G250), um antígeno de câncer-testículo, antígeno de câncer/testículo 1B (CTAG, da mesma forma conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antí- geno carcinoembriônico (CEA), uma ciclina, ciclina A2, Ligante 1 de Quimiocina de Motivo CC (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, sulfato de condroitina proteoglicano 4 (CSPG4), prote- ína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinB2, recep- tor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc tipo 5 (FCRL5; da mesma forma conhecido como Fc receptor homólogo 5 ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), uma proteína de ligação de folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicloproteína 100 (gp100), glipicano-3 (GPC3), receptor acoplado à proteína G classe C grupo 5 membro D (GPRC5D), Her2/neu (receptor de tirosina cinase erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb -B4), dímeros de erbB, antígeno associado ao melanoma de alto peso molecular humano (HMW-MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno de leucócito humano A1 (HLA- A1), antígeno de leucócito humano A2 (HLA-A2), receptor de IL-22 alfa (IL-22Rα), receptor de IL-13 alfa 2 (IL-13Rα2), receptor de domínio de inserção de cinase (kdr), cadeia leve capa, molécula de adesão de cé- lulas L1 (L1-CAM), epítopo de CE7 de L1-CAM, Repetição rica em Leucina contendo 8 membros da família A (LRRC8A), Lewis Y, antíge- no associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomegalovírus de murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes de morte natura grupo 2 membro D (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão de célu- las neurais (NCAM), antígeno oncofetal, preferencialmente antígeno expresso de melanoma (PRAME), receptor de progesterona , um antí- geno específico da próstata, antígeno de cpelula tronco da próstata (PSCA), antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), Re- ceptor de Tirosina Cinase semelhante a Receptor Órfão 1 (ROR1), survivina, glicoproteína de trofoblasto (TPBG da mesma forma conhe- cido como 5T4), glicoproteína associada ao tumor 72 (TAG72), proteí- na relacionada à tirosinase 1 (TRP1, da mesma forma conhecido como TYRP1 ou gp75), proteína relacionada à tirosinase 2 (TRP2, da mes- ma forma conhecida como dopacromo tautomerase, dopacromo delta- isomerase ou DCT), receptor de fator de crescimento endotelial vascu- lar (VEGFR), receptor de fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGFR2), Tumor de Wilms 1 (WT-1), um antígeno específico do pa- tógeno ou expresso pelo patógeno ou um antígeno associado a um marcador universal e/ou moléculas biotiniladas e/ou moléculas expres- sas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos.
[00558] 66. O método, de acordo com qualquer uma das modalida- des 62-65, em que o receptor recombinante é um receptor de células T (TCR) ou um receptor de células não T funcional.
[00559] 67. O método, de acordo com qualquer uma das modalida- des 62-66, em que o receptor recombinante é um receptor de antígeno quimérico (CAR).
[00560] 68. O método da modalidade 67, em que o CAR compreen- de um domínio de reconhecimento de antígeno extracelular que liga-se especificamente ao antígeno e um domínio de sinalização intracelular compreendendo um ITAM.
[00561] 69. O método da modalidade 68, em que o domínio de sina- lização intracelular compreendendo um ITAM compreende um domínio intracelular de uma cadeia CD3-zeta (CD3ζ), opcionalmente uma ca- deia CD3-zeta humana.
[00562] 70. O método da modalidade 68 ou modalidade 69, em que o domínio de sinalização intracelular compreende ainda uma região de sinalização coestimuladora.
[00563] 71. O método da modalidade 70, em que a região de sinali- zação coestimuladora compreende um domínio de sinalização de CD28 ou 4-1BB, opcionalmente CD28 humano ou 4-1BB humano.
[00564] 72. Método para avaliar uma sequência de transgene não integrada residual, o método compreendendo: (a) realizar o método de acordo com qualquer uma das mo- dalidades 1-15 e 28-71, para determinar a presença, ausência ou quantidade das sequências de transgene na fração de alto peso mole- cular do DNA, desse modo avaliando a integração genômica de uma sequência de transgene; (b) determinar a presença, ausência ou quantidade da se- quência de transgene no DNA isolado sem separar a fração de alto peso molecular; (c) comparar a quantidade determinada em (a) com a quan- tidade determinada em (b), desse modo determinando a quantidade da sequência recombinante residual não integrada.
73. O método da modalidade 72, em que a determinação da presença, ausência ou quantidade da sequência de transgene compreende determinar a massa, peso ou número de cópias da se- quência de transgene por genoma diploide ou por célula em uma ou mais células.
[00565] 74. O método da modalidade 72 ou modalidade 73, em que uma ou mais células compreendem uma população de células em que uma pluralidade de células da população compreende a sequência de transgene que codifica a proteína recombinante.
[00566] 75. O método da modalidade 74, em que o número de có- pias é uma média ou número de cópias médio por genoma diploide ou por célula entre a população de células.
[00567] 76. O método de acordo com qualquer uma das modalida- des 72-75, em que a comparação do número de cópias compreende subtrair o número de cópias determinado em (a) do número de cópias determinado em (b).
[00568] 77. O método de acordo com qualquer uma das modalida- des 72-75, em que comparar o número de cópias compreende deter- minar a relação do número de cópias determinado em (a) para o nú- mero de cópias determinado em (b).
[00569] 78. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 72-77, em que a determinação da presença, ausência ou quantidade em (b) é realizada por reação em cadeia de polimerase (PCR).
[00570] 79. O método da modalidade 78, em que a PCR é a reação em cadeia de polimerase quantitativa (qPCR), PCR digital ou PCR di- gital de gotículas.
[00571] 80. O método da modalidade 78 ou modalidade 79, em que o PCR é PCR digital de gotículas.
[00572] 81. O método de acordo com qualquer uma das modalida- des 78-80, em que a PCR é realizada usando um ou mais iniciadores que são complementares ou são capazes de especificamente amplifi- car pelo menos uma porção da sequência de transgene.
[00573] 82. O método de acordo com qualquer uma das modalida- des 72-81, em que determinar a presença, ausência ou quantidade em (b) compreende avaliar a massa, peso ou número de cópias da se- quência de transgene no DNA isolado sem separar a fração de alto peso molecular e normalizar a massa, peso ou número de cópias para a massa, peso ou número de cópias de um gene de referência no DNA isolado sem separar a fração de alto peso molecular ou para uma cur- va padrão.
[00574] 83. O método da modalidade 72, em que o gene de refe- rência é um gene de manutenção.
[00575] 84. O método da modalidade 82 ou modalidade 83, em que o gene de referência é um gene que codifica a albumina (ALB).
[00576] 85. O método da modalidade 82 ou modalidade 83, em que o gene de referência é um gene que codifica a subunidade p30 da pro- teína P da ribonuclease (RPP30).
[00577] 86. O método da modalidade 82-85, em que a determina- ção da massa, peso ou número de cópias de um gene de referência no DNA isolado é realizada por PCR usando um ou mais iniciadores que são complementares ou são capazes de especificamente amplifi- car pelo menos uma porção do gene de referência.
[00578] 87. O método de acordo com qualquer uma das modalida- des 72-86, em que a determinação da presença, ausência ou quanti- dade em (a) e a determinação da presença, ausência ou quantidade em (b) é realizada por reação em cadeia de polimerase (PCR) usando o mesmo iniciador ou os mesmos conjuntos de iniciadores.
[00579] 88. O método de acordo com qualquer uma das modalida- des 72-87, em que a sequência recombinante não integrada residual compreende um ou mais de plasmídeos de vetor, DNA complementar linear (cDNA), autointegrantes ou círculos de repetição de terminal longos (LTR). VIII. EXEMPLOS
[00580] Os exemplos a seguir são incluídos para propósitos ilustra- tivos apenas e não são pretendidos limitar o âmbito da invenção. Exemplo 1: Método para Avaliar o Número de Cópias de Transge- ne Integrado em Células Modificadas para Expressar uma Proteí- na Recombinante com Eletroforese em Gel em Campo Pulsante
[00581] O uso de eletroforese em gel em campo pulsante (PFGE) foi investigado como uma estratégia para separar DNA de alto peso molecular em métodos para avaliar o número de cópias do vetor em células transduzidas com um vetor viral contendo uma sequência de transgene que codifica uma proteína recombinante.
[00582] Uma linha de células T Jurkat foi transduzida com uma pre- paração lentiviral contendo uma sequência de transgene que codifica uma proteína recombinante, neste caso um receptor de antígeno qui- mérico (CAR). As células foram cultivadas por 3 dias e, em seguida, o DNA genômico foi isolado das células. Como um controle, o DNA ge- nômico foi isolado de células que não foram transduzidas com um len- tivírus que codifica a sequência de transgene, e o DNA genômico iso- lado foi enriquecido com uma quantidade conhecida de um plasmídeo que codifica a proteína recombinante e um plasmídeo de acondicio- namento viral não integrado que codifica Proteína G do vírus da esto- matite vesicular Indiana (VSVg).
[00583] As amostras de DNA foram submetidas a eletroforese em gel em campo pulsante automatizado (PFGE) usando o dispositivo BluePippin (Sage Science, Beverly, MA) para separar espécies de DNA de alto peso molecular de espécies de DNA não cromossômicas de baixo peso molecular abaixo de um limite de 15 kb, 17,5 kb ou 20 kb.
[00584] Métodos de reação em cadeia de polimerase quantitativa exemplares (qPCR), tal como PCR digital de gotículas (ddPCR), foram realizados na amostra de DNA de alto peso molecular usando iniciado- res específicos para uma sequência única para a sequência de trans- gene ("transgene"). Para comparação, o ddPCR foi da mesma forma realizado com iniciadores específicos para sequências de codificação de VSVg ("plasmídeo de acondicionamento") para detectar o DNA en- riquecido que não se espera integrar no cromossomo das células ou plasmídeos de acondicionamento residuais nas células transduzidas, e com iniciadores específicos para um gene de manutenção para detec- tar DNA genômico em todas as amostras (por exemplo, iniciadores para um gene que codifica a subunidade da proteína P da ribonu- clease P30 (RRP30; "controle genômico"). Iniciadores específicos para o gene da albumina (ALB) foram usados como referência para norma- lização. As reações foram da mesma forma realizadas em amostras de DNA que não foram submetidas a PFGE (pré-gel). Para ddPCR, as amostras foram adicionadas a uma mistura contendo cada conjunto de iniciador e sondas, gotículas foram geradas usando um gerador de go- tículas, gotas geradas foram transferidas para uma placa de PCR e a amplificação foi realizada nas seguintes condições de PCR: 95ºC 10 min; [94ºC 30 seg; 60ºC 1 min] x 39 ciclos a 2ºC/s de taxa de rampa; 98ºC 10 min; e 4ºC indefinidamente. Após amplificação, o sinal das gotículas foi medido em um leitor de gotículas. O número de cópias de cada gene foi normalizado para o número de genomas diploides (ge- noma cp/diploide, usando amplificação com iniciadores específicos para o gene da albumina (ALB) como referência) ou por 50 ng de DNA genômico.
[00585] Como mostrado na FIG. 1, em amostra não transduzida que continha plasmídeo de codificação de CAR enriquecido e plasmí- deo de acondicionamento de VSVg, sequências de transgene e se-
quências de VSVg foram detectadas apenas em amostras que não foram submetidas a PFGE (pré-gel). Em contraste, sequências de con- trole genômico foram detectadas em todas as amostras submetidas a PFGE para DNA de maior peso molecular de 15 kb, 17,5 kb ou 20 kb ou superior. Este resultado demonstrou que PFGE antes da amplifica- ção por PCR de DNA separado, obteve a separação de plasmídeos de baixo peso molecular não integrados.
[00586] Em amostras transduzidas, as sequências de transgene foram detectadas em ambas as amostras antes de PFGE (pré-gel) e nas amostras submetidas a PFGE acima de 15 kb, 17,5 kb ou 20 kb (FIG. 1 painel inferior). A sequência de plasmídeo de acondicionamen- to VSVg foi encontrada nas amostras de pré-gel e era quase indetec- tável no DNA de peso molecular mais alto. Estas sequências, que possivelmente derivam de sequências de plasmídeo residuais da pro- dução viral, não foram esperadas integrar ao genoma das células. O DNA genômico, incluindo o DNA cromossomômico, foi da mesma for- ma detectado em todas as amostras: o número de cópias do gene de manutenção RRP30 foi observado em aproximadamente 2 cópias por genoma diploide em todas as amostras.
[00587] O ensaio incluindo PFGE permitiu a detecção de sequên- cias integradas ou genômicas ao remover espécies de ácido nucleico de baixo peso molecular não integradas. Desse modo, os resultados mostram que o uso de PFGE para separar DNA de alto peso molecu- lar, antes da amplificação por PCR de sequências de transgene do DNA isolado, pode ser usado como um ensaio de número de cópia de vetor integrado (iVCN) para facilitar a determinação específica do nú- mero de cópia de sequências de transgene que se integraram ao ge- noma. Exemplo 2: Comparação do Número de Cópias de Transgene Ava- liado por PCR Digital de Gotículas (ddPCR) com ou sem Eletrofo-
rese em gel em Campo Pulsante (PFGE) em Vários Pontos de Tempo Durante o Processo de Fabricação de Células
[00588] O método de iVCN descrito no Exemplo 1, envolvendo a separação de espécies de alto peso molecular por PFGE antes da análise do número de cópias do vetor por qPCR, foi usado para avaliar o número de cópias integradas de sequências de transgene exempla- res que codificam um receptor de antígeno quimérico (CAR) em vários momentos pontos durante processos de engenharia de células em uma linha de células T Jurkat e células T primárias. O método foi com- parado a um ensaio de número de cópias de vetor padrão (VCN) que não incluiu a separação das espécies de DNA de alto e baixo peso molecular por eletroforese em gel em campo pulsante (PFGE).
[00589] Para os estudos, o DNA genômico foi preparado a partir das células e submetido à avaliação do número de cópias da sequên- cia de transgene por (1) o método de iVCN, geralmente como descrito no Exemplo 1 acima, usando um valor limite para separação de> 15 kb ("iVCN") e o dispositivo de PippinHT (Sage Science, Beverly, MA), ou (2) um método de VCN padrão no qual o DNA genômico não foi sepa- rado primeiro por PFGE ("VCN"). Em ambos os ensaios, o número de cópias do transgene foi determinado por ddPCR usando iniciadores específicos para uma sequência única para o transgene e normalizado para um genoma diploide, como determinado usando iniciadores es- pecíficos para um gene de referência (por exemplo, albumina (ALB) gene). A. Linhagem Celular Jurkat
[00590] As células T Jurkat foram transduzidas com uma prepara- ção lentiviral contendo sequências de transgene que codificam um CAR, geralmente como descrito no Exemplo 1 acima. Amostras de cé- lulas foram obtidas antes da transdução ("pré"), em 5 minutos, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas e 96 horas após a transdução,
e usadas para análise do número de cópias do transgene.
[00591] Como mostrado na FIG. 2A, a avaliação do número de có- pias do transgene com PFGE para detectar o número de cópias inte- gradas (iVCN) no genoma durante vários momentos no processo de engenharia de células Jurkat mostrou que a integração do transgene não foi detectável até cerca de 6 horas nessas células, e aumentou até cerca de 48 horas, momento em que o número de cópias detectado geralmente estabilizou. Em contraste, a avaliação do número de có- pias do transgene sem PFGE, que detectou o número de cópias do transgene nas células pelo método de VCN padrão, demonstrou de- tecção substancial da sequência de transgene começando em mo- mentos muito precoces. Esta observação é consistente com a detec- ção de sequências de transgene não integradas pelo método de VCN padrão, tal como plasmídeos produtores, DNA complementar linear ou circular (cDNA) ou autointegrantes, nesses momentos iniciais após a engenharia celular. O número de cópias do transgene como determi- nado sem PFGE mais tarde diminuiu para níveis similares aos detec- tados pela avaliação do número de cópias integrado de iVCN (com PFGE) por volta de 96 horas, indicando que embora a integração do transgene estivesse completa em aproximadamente 48 horas, o méto- do de VCN padrão sem PFGE não era ser preciso até cerca de 96 ho- ras ou após a transdução nessas células. B. Modificação Celular Primária
[00592] As células T primárias de indivíduos humanos foram proje- tadas para expressar um CAR usando um processo de engenharia exemplar. Composições separadas de células CD4+ e CD8+ foram selecionadas a partir de PBMCs isoladas de uma amostra de leucafe- rese, e as composições de células selecionadas foram criopreserva- das. As composições separadas de células T CD4+ e CD8+ foram subsequentemente descongeladas e misturadas na proporção de 1:1 de células T CD4+ viáveis para células T CD8+ viáveis. Aproximada- mente 300 x 106 células T (150 x 106 células T CD4+ e 150 x 106 célu- las T CD8+) da composição misturada foram estimuladas na presença de esferas revestidas de poliestireno paramagnético com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 ligados em uma relação de 1:1 de esfera para célula em meio isento de soro contendo IL-2, IL-7 e IL-15 recombinan- tes por entre 18 a 30 horas.
[00593] Após a incubação, aproximadamente 100 x 106 células viá- veis da composição de célula estimulada foram lavadas e ressuspen- sas em meio isento de soro contendo IL-2, IL-7 e IL-15 recombinante. As células foram transduzidas com uma preparação lentiviral que codi- fica um CAR anti-BCMA por espinoculação a aproximadamente 1600 g por 60 minutos. Após a espinoculação, as células foram lavadas e res- suspensas em meio livre de soro contendo IL-2, IL-7 e IL-15 recombi- nantes, e incubadas por cerca de 18 a 30 horas a cerca de 37°C. O CAR anti-BCMA continha um domínio de ligação ao antígeno scFv es- pecífico para BCMA, uma região transmembrana de CD28, uma região de sinalização coestimuladora 4-1BB e um domínio de sinalização in- tracelular derivado de CD3-zeta.
[00594] As células foram em seguida cultivadas para expansão por transferência para um biorreator (por exemplo, um biorreator de movi- mento de balanço) em cerca de 500 mL de meio contendo duas vezes a concentração de citocinas como usado durante as etapas de incuba- ção e transdução. Quando uma densidade celular viável definida foi obtida, a perfusão foi iniciada, onde o meio foi substituído por perfusão semicontínua com mistura contínua. As células foram cultivadas no biorreator até que um número limite de células (TNC) fosse obtido de cerca de 3 x109 células, o que tipicamente ocorria em um processo envolvendo 6-7 dias de expansão. As esferas paramagnéticas conju- gadas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 foram removidas da com-
posição celular por exposição a um campo magnético. As células fo- ram em seguida coletadas e formuladas com um crioprotetor.
[00595] Para a análise de DNA por iVCN e métodos de VCN padrão como descrito acima, as amostras de células foram obtidas antes da transdução ("pré"), 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 120 horas após a transdução e na conclusão do processo de modificação ("con- clusão").
[00596] Como mostrado na FIG. 2B, o número de cópias do trans- gene, como determinado após PFGE (iVCN), não foi detectado até cerca de 24 horas após a transdução e aumentou até cerca de 48 a 72 horas. No ensaio sem PFGE (VCN), o número de cópias do transgene era muito maior nos momentos iniciais (24 e 48 horas), porém depois diminuiu para níveis similares aos detectados pela avaliação integrada do número de cópias (iVCN) por volta de 96 horas. Em ambos os en- saios, o número de cópias avaliado foi similar em amostras obtidas 96 horas ou mais pós-transdução.
[00597] Os resultados confirmam que a avaliação do número de cópias do vetor com PFGE (iVCN) revela o tempo consistente de inte- gração do transgene em momentos após a transdução. As observa- ções mostram ainda que a avaliação por métodos de VCN padrão que não envolvem PFGE pode detectar sequências de transgene em célu- las às vezes antes da integração no genoma ter ocorrido e, desse mo- do, demonstrou que os métodos de VCN padrão podem não ser intei- ramente apropriados para avaliar o número de cópias do vetor em amostras menos do que 4 dias após a transdução. Exemplo 3. Avaliação do Número de Cópias de Transgene Inte- grado com Eletroforese em Gel em Campo Pulsante (PFGE) du- rante vários processos de fabricação não expandidos
[00598] O número de cópias de transgenes que codificam um re- ceptor de antígeno quimérico (CAR) foi avaliado usando os métodos de iVCN e VCN geralmente como descrito nos Exemplos 1 e 2, em vários momentos durante processos exemplares para a produção de uma composição de células T. geneticamente construída. Os proces- sos exemplares não envolveram uma etapa de expansão após a transdução e diferiram no reagente estimulador, meio de cultura e tempos de colheita.
[00599] Para cada processo, composições separadas de células T humanas primárias CD4+ e CD8+ foram selecionadas de dois indiví- duos humanos diferentes (doador A e doador B) a partir de PBMCs isoladas de amostras de leucaferese humana. As células selecionadas foram criopreservadas, subsequentemente descongeladas e mistura- das na proporção de 1:1 de células T CD4+ viáveis para células T CD8+ viáveis. A composição de células misturadas foi estimulada por incubação com um reagente estimulador como segue: (1) esferas pa- ramagnéticas conjugadas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28 ("esfe- ras"), (2) reagentes de muteína de estreptavidina oligomérica conjuga- da com Fab anti-CD3/anti-CD28 em uma concentração de 4,0 µg por 106 células, ou (3) reagentes de muteína de estreptavidina oligoméri- cos conjugados com Fab anti-CD3/anti-CD28 em uma concentração de 0,8 µg por 106 células. A incubação foi realizada em meio isento de soro com citocinas recombinantes por aproximadamente 18 a 30 ho- ras.
[00600] As células foram em seguida lavadas e transduzidas por espinoculação com uma preparação lentiviral contendo sequências de transgene que codificam um CAR. As células foram em seguida incu- badas com meio basal isento de soro, fatores de crescimento ou cito- cinas recombinantes ("basal") ou meio isento de soro contendo citoci- nas IL-2, IL-5 e IL-15 recombinantes ("completo"). Depois de 96 horas após o início da incubação com o reagente de esfera, as células foram expostas a um campo magnético para remover as esferas paramagné-
ticas. Depois de 24 horas, 48 horas ou 96 horas após o início da incu- bação com o reagente estimulador oligomérico, as células foram ex- postas à biotina durante 10 minutos para dissociar e remover os rea- gentes de estreptavidina oligoméricos. As células foram lavadas e for- muladas com um crioprotetor.
[00601] As células foram descongeladas e o DNA genômico foi pre- parado a partir de células colhidas. Para avaliação do número de có- pias do transgene, ddPCR usando iniciadores específicos para a se- quência de transgene foi realizado em DNA que foi submetido a PFGE para fração de alto peso molecular > 15 kb, como descrito nos Exem- plos 1 e 2 acima. As amostras celulares foram da mesma forma avali- adas por citometria de fluxo, manchamento para expressão do CAR, CD3 e caspase 3 ativada (aCas3).
[00602] Os resultados são mostrados nas FIGS. 3A-3B. Como mos- trado na FIG. 3A, para células estimuladas usando o reagente oligo- mérico, o número de cópias do transgene integrado medido por iVCN aumentou em amostras em que a incubação foi realizada por 24 horas ou 48 horas após o início do estímulo, porém não aumentou mais. O número de cópias do transgene medido pelo VCN padrão (sem PFGE) permaneceu substancialmente maior do que o número de cópias do transgene integrado medido por iVCN, até cerca de 96 horas após o início do estímulo. Este resultado é consistente com a observação de que um método de VCN padrão (sem PFGE) não era preciso até o ponto de tempo de 96 horas neste processo. Para células estimuladas usando o reagente de esfera, em 96 horas, maior número de cópias integradas foi observado para células incubadas com meio basal em comparação com células incubadas com meio completo. Como mos- trado na FIG. 3B, o número de cópias do transgene integrado correla- cionado com a porcentagem de células que expressam CAR (como determinado pela porcentagem de células CD3+/Cas3- ativadas/CAR+ entre células CD3+ por citometria de fluxo). Este resultado suporta ainda a utilidade do ensaio de iVCN para avaliar o número de cópias integradas, particularmente ao avaliar o impacto de diferentes parâme- tros, incluindo o tempo de incubação, meios ou reagentes, em um pro- cesso para células modificadas. Exemplo 4: Comparação do Número de Cópias do Transgene In- tegrado e Não Integrado Avaliado por PCR Digital de Gotículas (ddPCR) com ou sem Eletroforese em Gel em Campo Pulsante (PFGE) durante Vários Processos de Modificação de Células
[00603] O número de transgenes integrados e não integrados que codificam um receptor de antígeno quimérico (CAR) foi avaliado por ddPCR em amostras de DNA, com ou sem eletroforese em gel em campo pulsante (PFGE), obtido durante vários processos exemplares para a produção de uma composição de células T de modificação ge- nética. A. Processos exemplares para Modificar Células T
[00604] Os processos exemplares incluíram processos em que cé- lulas modificadas foram submetidas à expansão celular (processo ex- pandido) e processos em que as células não foram expandidas (pro- cesso não expandido). 1) Processo expandido - esferas anti-CD3/anti-CD28
[00605] Um processo expandido geralmente como descrito no Exemplo 2.B foi realizado. 2) Processo não expandido - esferas anti-CD3/anti-CD28
[00606] Um processo não expandido usando esferas conjugados de anticorpo anti-CD3/anti-CD28 foi realizado semelhante ao descrito no Exemplo 3. Células T CD4+ e CD8+ foram selecionadas e misturadas a uma relação de 1:1 para produzir uma composição de entrada con- tendo aproximadamente 600 x 106 células T (300 x 106 células T CD4+ e 300 x 106 células T CD8+). A composição de células de entrada mis-
turada foi estimulada incubando as células por 18-30 horas na presen- ça de esferas conjugadas de anticorpo anti-CD3/anti-CD28 em uma relação de 1:1 de esfera para célula em meio isento de soro contendo IL-2, IL-7 e IL-15 recombinantes. Após o estímulo, as células foram lavadas e ressuspensas em meio isento de soro contendo IL-2, IL-7 e IL-15 recombinantes. As células foram em seguida transduzidas com um vetor lentiviral que codifica o mesmo CAR anti-BCMA usado no processo expandido por espinoculação em aproximadamente 693 g por 30 minutos.
[00607] Em um braço, após a espinoculação, as células foram res- suspensas em meio basal isento de soro e sem adição de fatores de crescimento ou citocinas recombinantes (meio basal) e incubadas a cerca de 37,0°C em uma incubadora por cerca de 96 horas após o iní- cio do estímulo com as esferas anti-CD3/anti-CD28. Em outro braço, um processo semelhante foi realizado, exceto que, após a espinocula- ção, as células fossem ressuspensas em meio basal sem fatores de crescimento adicionados ou citocinas recombinantes (meio basal) e permitidas a incubar a cerca de 37,0°C em uma incubadora por cerca de 72 horas após iniciação do estímulo com as esferas anti-CD3/anti- CD28. 3) Processo Não Expandido - reagente oligomérico de Fab anti- CD3/anti-CD28
[00608] Um processo não expandido usando reagente oligomérico de Fab anti-CD3/anti-CD28 foi realizado semelhante ao descrito no Exemplo 3. Células T CD4+ e CD8+ foram selecionadas e misturadas em uma relação de 1:1 para produzir uma composição de entrada con- tendo aproximadamente 600 x 106 células T (300 x 106 células T CD4+ e 300 x 106 células T CD8+). As células da composição de células de entrada misturada foram estimuladas por incubação com 480 µg (ou 0,8 µg por 1x106 células) reagentes de muteína oligoméricos de es-
treptavidina conjugados com Fab anti-CD3/anti-CD28 gerados como descrito no Exemplo 2, que foi realizado em meio isento de soro con- tendo IL-2, IL-7 e IL-15 recombinantes durante entre 18-30 horas. Após o estímulo, as células foram transduzidas com um vetor lentiviral que codifica o mesmo CAR anti-BCMA utilizado no processo expandi- do, por espinoculação durante 30 minutos.
[00609] Em um braço do processo, após a espinoculação, as célu- las foram lavadas e ressupensas em meio basal isento de soro, fatores de crescimento adicionados ou citocinas recombinantes (meio basal) e incubadas a cerca de 37,0°C em incubadora. Cerca de 24 horas após o início da transdução (aproximadamente 48 horas após o início do estímulo), 1,0 mM de D-biotina foi adicionada durante a incubação e misturada com as células para dissociar os reagentes de Fab anti-CD3 e anti-CD28 dos reagentes de estreptavidina oligomérica. As células foram incubadas adicionalmente por cerca de 48 horas (96 horas após o início do estímulo) e, em seguida, foram lavadas e formuladas com um crioprotetor.
[00610] Em outro braço do processo, após a espinoculação, as cé- lulas foram lavadas e ressupensas em meio basal isento de soro, fato- res de crescimento adicionados ou citocinas recombinantes (meio ba- sal) e incubadas a cerca de 37,0°C em incubadora. Cerca de 24 horas após o início da transdução, 1,0 mM de D-biotina foi adicionada duran- te a incubação e misturada com as células para dissociar os reagentes de Fab anti-CD3 e anti-CD28 do reagente de estreptavidina oligoméri- co. As células foram incubadas por mais 24 horas (72 horas após o início do estímulo) e, em seguida, foram lavadas e formuladas com um crioprotetor. 4) Resumo dos Processos
[00611] Tabela E1 resume características dos processos descritos acima, além de um processo que usa um vetor vazio simulado.
Tabela E1: Resumo de Processos Braço Rea- Número Transdução Expansão Remoção Colheita gente de de células de reagente estímulo estimulador 1 Esferas 1,5 x 106 Espinoculação & Até TNC Lavagem e Após a re- CD4 e 1,5x incubação du- de ~ 3x109 remoção moção das 106 CD8 rante 18-30 ho- células, das esferas esferas ras cerca de 6- (debead) 7 dias Dia após número limite 6 2 Esferas 3,0x10 Espinoculação & Nenhum Lavagem e Após a re- CD4 e incubação du- remoção moção das 3,0x106 rante cerca de das esferas esferas CD8 72 horas em Cerca de 96 horas após o meio basal início do estímulo 3 Esferas 3,0x106 Espinoculação & Nenhum Lavagem e Após a re- CD4 e incubação du- remoção moção das 3,0x106 rante cerca de das esferas esferas CD8 48 horas em Cerca de 72 horas após o meio basal início do estímulo 4 Oligo. 3,0x106 Espinoculação & Nenhum Biotina adi- 96 horas CD4 e incubação du- cionada du- após o início
0.2X 3,0x106 rante 72 horas rante incu- do estímulo CD8 em meio basal bação cerca de 24 horas após estí- mulo 5 Oligo. 3,0x106 Espinoculação & Nenhum Biotina adi- 72 horas CD4 e incubação du- cionada du- após o início
0.2X 3,0x106 rante 48 horas rante incu- do estímulo CD8 em meio basal bação cerca de 24 horas após o início do estímulo 6 (Simula- 1,5 x 106 Transdução si- Nenhum Biotina adi- 96 horas do) CD4 e 1,5x mulada & incu- cionada cer- após o início 10 6 bação estática ca de 24 do estímulo Oligo. CD8 durante 24 horas horas após em meio com- o início do pleto estímulo
0.2X
B. Avaliação do número da Cópia de Transgene
[00612] As células foram descongeladas e o DNA genômico foi pre- parado a partir das células colhidas. Para avaliação do número de có- pias do transgene integrado, ddPCR usando iniciadores específicos para a sequência de transgene foi realizado no DNA que foi indivíduo a PFGE para fração de alto peso molecular > 10 kb geralmente como descrito nos Exemplos 1 e 2 ("iVCN"). Para comparação, o ddPCR usando os iniciadores específicos para a sequência de transgene foi da mesma forma realizado em DNA que não havia sido submetido a PFGE ("VCN", tanto DNA de alto e baixo peso molecular). As amostras de células foram da mesma forma avaliadas por citometria de fluxo.
[00613] Os resultados são mostrados nas FIGS. 4A-4E. Como mos- trado na FIG. 4A, cada um dos processos mais curtos não expandidos produziu células que exibiram número de cópias como determinado por VCN (sem PFGE) que era maior do que o número de cópias como determinado por iVCN (com PFGE), indicando que sequências de transgene não integradas estavam presentes nas amostras que foram projetadas por esses processos mais curtos. A fração de transgene integrado, que foi determinada dividindo o número de cópias usando iVCN por VCN, foi substancialmente menor em células produzidas usando processos não expandidos (FIG. 4B). Imilarmente, a fração do transgene não integrado, que foi determinada como 1 - fração do transgene integrado, foi substancialmente maior nas células produzi- das usando os processos não expandidos (FIG. 4C). Como mostrado na FIG. 4D, o número de cópias do transgene não integrado, determi- nado subtraindo o iVCN de VCN, estava entre cerca de 0,8 e 1,3 em média, em células produzidas usando os processos mais curtos. Usando um VCN padrão sem PFGE, o número de cópias do transgene por célula CAR+ é mostrado na FIG. 4E. Esses resultados suportam ainda a utilidade do método de iVCN para avaliar o número de cópias do transgene integrado e não integrado em um processo para células modificadas. Exemplo 5: Comparação do Número de Cópias do Transgene In- tegrado e Não Integrado durante Vários Processos de Fabricação de Células Expandidas
[00614] O número de cópias do transgene em DNA com ou sem eletroforese em gel em campo pulsante (PFGE), foi avaliado por ddPCR em vários momentos em um processo para células T de gené- tica construída que incluiu uma etapa de expansão das células após a transdução.
[00615] As células T primárias de doadores humanos diferentes fo- ram modificadas para expressar um CAR, como descrito no Exemplo
2.B. As amostras foram obtidas diariamente a partir do dia 0 ao dia 8 do processo expandido, incluindo em material descongelado (TMAT; dia 0), na ativação (AMAT; dia 1), na transdução (XMAT; dia 2) ou em vários momentos após a iniciação de cultivo para expandir as células (inoc+1 a inoc+6; representando os dias 3-8 do processo). O DNA ge- nômico foi preparado a partir das amostras de células. Para avaliação do número de cópias do transgene integrado, ddPCR usando iniciado- res específicos para a sequência de transgene foi realizado no DNA que foi submetido a PFGE para fração de alto peso molecular, como descrito nos Exemplos 1 e 2 ("iVCN"). Para comparação, o ddPCR usando os iniciadores específicos para a sequência de transgene foi da mesma forma realizado em DNA que não foi indivíduo a PFGE ("VCN", tanto DNA de alto e baixo peso molecular). O número de có- pias do transgene não integrado, a fração do transgene integrado e a fração do transgene não integrado foram da mesma forma determina- dos, geralmente como descrito no Exemplo 4 acima.
[00616] Resultados representativos são mostrados na FIG. 5. Como mostrado, no dia da transdução ou em pontos de tempo iniciais após a transdução (por exemplo, inoc+ 1, inoc+ 2), número de cópias como determinado pelo método VCN padrão, determinado a partir de amos- tras de DNA genômico não submetidas a PFGE, incluído uma fração substancial de transgenes não integrados. Em momentos posteriores após a transdução, o número de cópias como determinado por iVCN (com PFGE) e VCN padrão (sem PFGE) eram quase o mesmo, indi- cando que as cópias não integradas do transgene não estavam mais presentes nas células nestes momentos. Exemplo 6: Avaliação da Integração do Transgene em Fibroblas- tos
[00617] A integração do transgene introduzido em uma linhagem celular de de fibroblastos por meio de transdução lentiviral foi avaliada por análise do número de cópias do transgene por ddPCR no DNA ge- nômico que foi submetido a eletroforese em gel em campo pulsante (PFGE).
[00618] A linhagem celular de fibrossarcoma humano HT1080 (ATCC® CCL-121 ™) foi transduzida com uma preparação lentiviral contendo uma sequência de transgene que codifica uma proteína re- combinante, neste caso um receptor de antígeno quimérico (CAR). Após a transdução, as células foram cultivadas e colhidas 12, 24, 48 ou 72 horas após a transdução. O DNA genômico foi preparado a par- tir de células colhidas. O número de cópias do transgene foi determi- nado por ddPCR usando iniciadores específicos para o transgene, em amostras de DNA de alto peso molecular após PFGE ("iVCN") e em amostras de DNA que não foram submetidas a PFGE ("VCN", tanto em DNA de alto e baixo peso molecular), geralmente como descrito nos Exemplos 1 e 2 acima.
[00619] Como mostrado na FIG. 6, a integração do transgene na linhagem celular de fibroblastos HT1080 foi concluída 24 horas após a transdução. O tempo de integração completa na linhagem celular de fibroblastos foi mais rápido do que o observado em células T, incluindo células Jurkat e células T humanas primárias, como mostrado nos exemplos acima. Este resultado revela que certos tipos de células so- frem integração lentiviral mais rápida no genoma das células. Exemplo 7: Avaliação de Células T Expressando Receptor Re- combinante para Determinar a Quantidade de Sequência de Transgene e Parâmetros Farmacocinéticos de Células T Modifica- das Administradas
[00620] Um método exemplar empregando ddPCR e PFGE é usado para avaliar a quantidade de uma sequência de transgene que codifica uma proteína recombinante, tal como um receptor de antígeno quimé- rico (CAR), em um indivíduo que recebeu células T modificadas.
[00621] Indivíduos que têm uma doença ou distúrbio, tal como uma doença ou distúrbio proliferativo, por exemplo, um câncer, são admi- nistrados com células modificadas, tal como células T, que expressam uma proteína recombinante, como um receptor recombinante que po- de ter como alvo um antígeno específico que é expresso por células associadas à doença ou distúrbio, tal como células cancerosas. Em alguns exemplos, o receptor recombinante é um receptor de antígeno quimérico (CAR) que é específico para um antígeno de câncer, como um antígeno expresso por ou associado à células cancerosas. Em al- guns aspectos, as composições de células T terapêuticas são geradas pela introdução de sequências de transgene que codificam o receptor recombinante em células T humanas primárias isoladas, tais como cé- lulas T humanas primárias CD4+ e/ou CD8+ isoladas, tal como usando um processo expandido ou não expandido como descrito nos Exem- plos 1-6 acima. Os indivíduos são administrados com uma composição terapêutica de células T compreendendo as células modificadas.
[00622] Em vários momentos após a administração da composição celular, a quantidade de sequências de transgene que estão presentes em amostras biológicas de um indivídio que recebeu as células modifi- cadas é determinada usando os métodos descritos aqui para avaliar o número de cópias do transgene integrado. Em alguns aspectos, as cé- lulas no sangue ou soro ou órgão ou amostra de tecido (por exemplo, sítio da doença, por exemplo, amostra de tumor) do indivíduo são obti- das, antes, durante e/ou após a administração da composição de célu- las T terapêuticas. O DNA genômico é preparado a partir das amos- tras. Em alguns aspectos, a quantidade de sequências de transgene que estão presentes em uma amostra biológica é determinada por ddPCR usando iniciadores que podem amplificar especificamente uma porção do transgene, a partir de amostras de DNA de alto peso mole- cular após PFGE ("iVCN"), geralmente como descrito nos exemplos 1 e 2 acima. Em alguns aspectos, o número de cópias é da mesma for- ma avaliado por ddPCR usando os mesmos iniciadores de amostras de DNA que não foram submetidas a PFGE ("VCN", DNA de alto e baixo peso molecular). Em alguns aspectos, as amostras de células em alguns casos podem da mesma forma ser avaliadas por citometria de fluxo, manchamento para expressão da proteína recombinante, por exemplo, CAR, para determinar a proporção de células na amostra que expressam a proteína recombinante, por exemplo, CAR.
[00623] Em alguns exemplos, a quantidade de sequências de transgene em uma amostra biológica é quantificada como cópias do transgene integrado que codifica a proteína recombinante, por exem- plo, CAR, por quantidade de DNA, tal como micrograma de DNA, ou por volume de amostra, como microlitro de amostra, por exemplo, de sangue ou soro, ou por número total de células, tal como por células mononucleares de sangue periférico totais (PBMCs) ou leucócitos ou células T, opcionalmente por volume, por exemplo, por microlitro da amostra, ou por célula, tal como por genoma de célula T diploide ou por célula que expressa CAR, opcionalmente por volume, por exem-
plo, por microlitro da amostra. Parâmetros farmacocinéticos (PK) exemplares que podem ser determinados com base no método de iVCN ou por outros métodos, tal como citometria de fluxo, incluem concentrações plasmáticas máximas (pico) (Cmáx) de sequências de transgene ou células específicas que expressam a proteína recombi- nante, tal como Cmáx de células CD3+ CAR+, células CD4+ CAR+ e/ou células T CD8+ CAR+; o momento em que Cmáx é obtido (Tmáx), tal como o Tmáx de sequências de transgene, células CD3+ CAR+, células CD4+ CAR+ e/ou células T CD8+ CAR+ e/ou área sob a curva (AUC) durante um tempo específico após a administração, tal como a AUC0- 28, de sequências de transgene, células CD3+ CAR+, células CD4+ CAR+ e/ou células T CD8+ CAR+. Exemplo 8: Correlação de Ensaio de VCN Padrão e Ensaio de iVCN para Expressão de Superfície do Receptor Recombinante durante os Processos de Fabricação de Células
[00624] O número de cópias do vetor (VCN) e os ensaios de iVCN descritos acima foram usados para determinar o número de cópias de um transgene que codifica um receptor recombinante, por exemplo receptor de antígeno quimérico (CAR), introduzido nas células T por transdução lentiviral, e os resultados foram correlacionados à expres- são de superfície do CAR. Neste estudo, os ensaios foram realizados em composições de células produzidas a partir de células T primárias de diferentes doadores humanos que foram projetadas para expressar um CAR usando um processo expandido, geralmente como descrito no Exemplo 2.B, ou um processo não expandido geralmente como descrito no Exemplo 4.A.3, com uma modificação em que as células foram ativadas com um reagente de muteína de estreptavidina oligo- mérica conjugada com Fab anti-CD3/anti-CD28 seguido de transdução e uma curta incubação em meio basal que não inclui a adição de cito- cinas recombinantes (meio isento de citocinas) antes da colheita.
[00625] O DNA genômico foi preparado a partir das amostras de células no final do processo para modificação no processo encurtado, não expandido ou no processo expandido. Os ensaios de VCN e iVCN foram realizados como descrito nos Exemplos 1 usando um valor limite para separação de > 15 kb ("iVCN") e o dispositivo de PippinHT (Sage Science, Beverly, MA), ou (2) um método de VCN padrão em cujo DNA genômico não foi separado primeiro por PFGE ("VCN").
[00626] Os resultados mostraram que o número de cópias do trans- gene avaliado usando o ensaio de VCN geralmente está correlaciona- do com o número de cópias do transgene avaliado por iVCN (FIG. 7A). No entanto, para células fabricadas usando o processo não expandido, os valores obtidos por VCN foram maiores do que os valores obtidos por iVCN, consistente com o ensaio de VCN detectando sequências de transgene não integradas que poderiam estar presentes em amos- tras contendo células geradas usando processo não expandido. Em contraste, para as células fabricadas usando o processo expandido, os valores obtidos por VCN e iVCN foram quase idênticos (próximos da linha de VCN = iVCN). Essas diferenças são provavelmente devido à presença de uma maior quantidade de cópias livres e não integradas de sequências de transgene em amostras no processo não expandido mais curto em comparação com o processo expandido. Estes resulta- dos são consistentes com a observação de que um ensaio de VCN padrão que é capaz de detectar DNA de alto e baixo peso molecular tem limitações em comparação com um ensaio de iVCN, particular- mente quando usado para avaliar células logo após a introdução do transgene, tal como em um processo encurtado para modificar células T, onde cópias livres e não integradas de sequências de transgene podem ainda estar presentes na amostra.
[00627] Para avaliar o grau de correlação do ensaio de iVCN ou VCN com a expressão de superfície do CAR, as amostras de células do processo não expandido ou expandido foram avaliadas por citome- tria de fluxo para expressão de CD3, CD45 e o CAR para determinar a porcentagem de células CD3+ CAR+ entre células CD45+ viáveis. Como mostrado nas FIGS. 7B, o ensaio de VCN exibiu melhor corre- lação com a porcentagem de células CAR+ para amostras modificadas pelo processo expandido do que pelo processo não expandido, prova- velmente devido à presença de sequências de DNA de CAR não inte- gradas que não contribuíram para a expressão de CAR de superfície. Como mostrado na FIG. 7C, iVCN mostrou correlação semelhante com a expressão do CAR entre as células que foram projetadas pelo processo não expandido ou expandido. Para todas as amostras, a cor- relação da expressão do CAR com o número de cópias por célula foi maior pelo ensaio de iVCN (R2 = 0,8952) em comparação com o nú- mero de cópias por célula como determinado pelo ensaio de VCN (R2 = 0,5903).
[00628] Os resultados suportam a utilidade do ensaio de iVCN para determinar com precisão o número de cópias da sequência de trans- gene estavelmente integrado, particularmente para células geradas usando um processo não expandido que pode reter cópias livres e não integradas de sequências de transgene. O ensaio de VCN, que não distingue sequências de transgene integradas vs. não integradas, é limitado na determinação precisa do número de sequências de trans- gene estavelmente integradas, especialmente durante e após um pro- cesso mais curto não expandido.
[00629] A presente invenção não é pretendida ser limitada em es- copo às modalidades particulares descritas, que são fornecidas, por exemplo, para ilustrar vários aspectos da invenção. Várias modifica- ções nas composições e métodos descritos se tornarão aparentes a partir da descrição e dos ensinamentos aqui. Tais variações podem ser praticadas sem se afastar do verdadeiro escopo e espírito da des-
crição e são pretendidas cair dentro do escopo da presente descrição. Sequências # SEQUÊNCIA ANOTAÇÃO 1 ESKYGPPCPPCP espaçador (articulação de IgG) (aa) Homo sapiens 2 GAATCTAAGTACGGACCGCCCTG espaçador (articulação CCCCCCTTGCCCT de IgG4) (nt) Homo sapiens 3 ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTL Articulação-CH3 espaça- PPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS dor Homo sapiens
DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
K 4 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFL Espaçador de articula- FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV ção-CH2-CH3 Homo sa- SQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT piens
KPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEA
LHNHYTQKSLSLSLGK 5 RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGS IgD-articulação-Fc Homo LAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKE sapiens
KEKEEQEERETKTPECPSHTQPLG VYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVV GSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVE EGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSL WNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMA LREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPE AASWLLCEVSGFSPPNILLMWLED QREVNTSGFAPARPPPQPGSTTF WAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVV # SEQUÊNCIA ANOTAÇÃO
SHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH 6 LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGP T2A artificial
R 7 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVC tEGFR artificial
NGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCT SISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLD PQELDILKTVKEITGFLLIQAWPEN RTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSL AVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIIS GNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKT KIISNRGENSCKATGQVCHALCSP EGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRE CVDKCNLLEGEPREFVENSECIQC HPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQC AHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTL VWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCT GPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGA
LLLLLVVALGIGLFM 8 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF CD28 (aminoácidos 153- WV 179 de No. de Acesso P10747) Homo sapiens 9 IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGK CD28 (aminoácidos 114- HLCPSPLFPGPSKP 179 de No. de Acesso FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF P10747) Homo sapiens
WV 10 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPT CD28 (aminoácidos 180- RKHYQPYAPPRDFAAYRS 220 de P10747) Homo sapiens 11 RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGP CD28 (LL a GG) Homo TRKHYQPYAPPRDFAAYRS sapiens 12 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQE 4-1BB (aminoácidos 214- EDGCSCRFPEEEEGGCEL 255 de Q07011.1) Homo sapiens 13 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNE CD3 zeta Homo sapiens
LNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMG # SEQUÊNCIA ANOTAÇÃO GKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAE AYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQG
LSTATKDTYDALHMQALPPR 14 RVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNE CD3 zeta Homo sapiens
LNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMG GKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAE AYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQG
LSTATKDTYDALHMQALPPR 15 RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNE CD3 zeta Homo sapiens
LNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMG GKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAE AYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQG
LSTATKDTYDALHMQALPPR 16 RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHF tEGFR artificial
KNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHT PPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAW PENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHG QFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDG DVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTS GQKTKIISNRGENSCKATGQVCHA LCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSR GRECVDKCNLLEGEPREFVENSE CIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDN CIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGE NNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCT YGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATG
MVGALLLLLVVALGIGLFM 17 EGRGSLLTCGDVEENPGP T2A artificial 18 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A 19 ATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A 20 QCTNYALLKLAGDVESNPGP E2A 21 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP F2A 22 -PGGG-(SGGGG)5-P- wherein P is Ligante proline, G is glycine and S is serine 23 GSADDAKKDAAKKDGKS Ligante
# SEQUÊNCIA ANOTAÇÃO 24 atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgag Sequência de sinal de ttaccacacccagcattcctcctgatccca cadeia alfa de GMCSFR 25 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP Sequência de sinal de cadeia alfa de GMCSFR 26 MALPVTALLLPLALLLHA peptídeo de sinal de CD8 alfa 27 EVQLVQSGAEMKKPGASLKLSCK Anti-BCMA pesado vari- ASGYTFIDYYVYWMRQAPGQGLE ável (VH)
SMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVT MTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAM YYCARSQRDGYMDYWGQGTLVT
VSS 28 QSALTQPASVSASPGQSIAISCTGT Anti-BCMA leve variável SSDVGWYQQHPGKAPKLMIYEDS (VL)
KRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTIS GLQAEDEADYYCSSNTRSSTLVFG
GGTKLTVLG 29 GSTSGSGKPGSGEGSTKG Ligante 30 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKAS Anti-BCMA pesado vari- GYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWM ável (VH)
GWINTETREPAYAYDFRGRFAFSL ETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCA
LDYSYAMDYWGQGTSVTVSS 31 DIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRA Anti-BCMA leve variável SESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPT (VL)
LLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRT DFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTI
PRTFGGGTKLEIK 32 QIQLVQSGPDLKKPGETVKLSCKA Anti-BCMA pesado vari- SGYTFTNFGMNWVKQAPGKGFK ável (VH)
WMAWINTYTGESYFADDFKGRFA FSVETSATTAYLQINNLKTEDTATY FCARGEIYYGYDGGFAYWGQGTL
VTVSA 33 DVVMTQSHRFMSTSVGDRVSITC Anti-BCMA leve variável
# SEQUÊNCIA ANOTAÇÃO RASQDVNTAVSWYQQKPGQSPKL (VL) LIFSASYRYTGVPDRFTGSGSGAD FTLTISSVQAEDLAVYYCQQHYST
PWTFGGGTKLDIK 34 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKG Anti-BCMA pesado vari- SGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLE ável (VH)
WMGIIYPGDSDTRYSPSFQGHVTI SADKSISTAYLQWSSLKASDTAMY
YCARYSGSFDNWGQGTLVTVSS 35 SYELTQPPSASGTPGQRVTMSCS Anti-BCMA leve variável GTSSNIGSHSVNWYQQLPGTAPKL (VL)
LIYTNNQRPSGVPDRFSGSKSGTS ASLAISGLQSEDEADYYCAAWDGS
LNGLVFGGGTKLTVLG 36 GGGGS Ligante 37 GGGS Ligante 38 GGGGSGGGGSGGGGS Ligante 39 GSTSGSGKPGSGEGSTKG Ligante 40 SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA Ligante 41 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCK Anti-BCMA pesado vari- ASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLE ável (VH)
WMGRIIPILGIANYAQKFQGRVTMT EDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYY CARSGYSKSIVSYMDYWGQGTLV
TVSS 42 LPVLTQPPSTSGTPGQRVTVSCSG Anti-BCMA leve variável SSSNIGSNVVFWYQQLPGTAPKLV (VL)
IYRNNQRPSGVPDRFSVSKSGTSA SLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSL
SGYVFGTGTKVTVLG 43 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCK Anti-BCMA pesado vari- ASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLE ável (VH)
WMGRIIPILGTANYAQKFQGRVTIT ADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYY CARSGYGSYRWEDSWGQGTLVT # SEQUÊNCIA ANOTAÇÃO
VSS 44 QAVLTQPPSASGTPGQRVTISCSG Anti-BCMA leve variável SSSNIGSNYVFWYQQLPGTAPKLLI (VL)
YSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSA SLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSL
SASYVFGTGTKVTVLG 45 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCK Anti-BCMA pesado vari- ASGYTFTDYYMHWVRQAPGQRLE ável (VH)
WMGWINPNSGGTNYAQKFQDRIT VTRDTSSNTGYMELTRLRSDDTAV YYCARSPYSGVLDKWGQGTLVTV
SS 46 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTG Anti-BCMA leve variável SSSNIGAGFDVHWYQQLPGTAPKL (VL)
LIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTS ASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSS
LSGYVFGTGTKVTVLG 47 RASQDISKYLN CDR L1 48 SRLHSGV CDR L2 49 GNTLPYTFG CDR L3 50 DYGVS CDR H1 51 VIWGSETTYYNSALKS CDR H2 52 YAMDYWG CDR H3 53 EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTV VH
SGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEW LGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKD NSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCA KHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTV
SS 54 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRA VL
SQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIY HTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYS LTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYT
FGGGTKLEIT 55 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRA scFv
# SEQUÊNCIA ANOTAÇÃO SQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIY HTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYS LTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYT FGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEG STKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSV TCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRK GLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRL TIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAI YYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGT
SVTVSS 56 KASQNVGTNVA CDR L1 57 SATYRNS CDR L2 58 QQYNRYPYT CDR L3 59 SYWMN CDR H1 60 QIYPGDGDTNYNGKFKG CDR H2 61 KTISSVVDFYFDY CDR H3 62 EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKA VH
SGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLE WIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATL TADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVY FCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTV
TVSS 63 DIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCK VL
ASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPL IYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDF TLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYP
YTSGGGTKLEIKR 64 GGGGSGGGGSGGGGS Ligante 65 EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKA scFv
SGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLE WIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATL TADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVY FCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTV TVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIEL TQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQ # SEQUÊNCIA ANOTAÇÃO NVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYS ATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLT ITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTS
GGGTKLEIKR 66 HYYYGGSYAMDY HC-CDR3 67 HTSRLHS LC-CDR2 68 QQGNTLPYT LC-CDR3 69 gacatccagatgacccagaccacctccagcct scFv de codificação de gagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatc sequência agctgccgggccagccaggacatcagcaagt acctgaactggtatcagcagaagcccgacggc accgtcaagctgctgatctaccacaccagccgg ctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggc agcggctccggcaccgactacagcctgaccat ctccaacctggaacaggaagatatcgccacct acttttgccagcagggcaacacactgccctaca cctttggcggcggaacaaagctggaaatcacc ggcagcacctccggcagcggcaagcctggca gcggcgagggcagcaccaagggcgaggtga agctgcaggaaagcggccctggcctggtggcc cccagccagagcctgagcgtgacctgcaccgt gagcggcgtgagcctgcccgactacggcgtga gctggatccggcagccccccaggaagggcctg gaatggctgggcgtgatctggggcagcgagac cacctactacaacagcgccctgaagagccggc tgaccatcatcaaggacaacagcaagagcca ggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccga cgacaccgccatctactactgcgccaagcacta ctactacggcggcagctacgccatggactactg gggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagc 70 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAA Fc de IgG4 Humano LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS (Uniprot P01861)
GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDK RVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV # SEQUÊNCIA ANOTAÇÃO DVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHE
ALHNHYTQKSLSLSLGK 71 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAA Fc de IgG2 Humano LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS (Uniprot P01859)
GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVD KTVERKCCVECPPCPAPPVAGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQ DWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKT ISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWES NGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK

Claims (90)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para avaliar a integração genômica de uma se- quência de transgene, o método caracterizado pelo fato de que com- preende: (a) separar uma fração de alto peso molecular de ácido de- soxirribonucleico (DNA) maior ou maior do que cerca de 10 quilobases (kb) do DNA isolado de uma ou mais células, as referidas uma ou mais células compreendendo, ou são suspeitas de compreender, pelo me- nos uma célula compreendendo uma sequência transgene que codifi- ca uma proteína recombinante; (b) a partir da fração de alto peso molecular, determinar a presença, ausência ou quantidade da sequência de transgene integra- da no genoma de uma ou mais células.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, antes da separação em (a), isolar o ácido desoxirri- bonucleico (DNA) de uma ou mais células.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que a determinação da presença, ausência ou quan- tidade da sequência de transgene em (b) compreende determinar a massa, peso ou número de cópias da sequência de transgene por ge- noma diploide ou por célula em uma ou mais células.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que uma ou mais células compreen- dem uma população de células em que uma pluralidade de células da população compreende a sequência de transgene que codifica a prote- ína recombinante.
5. Método, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracteri- zado pelo fato de que o número de cópias é uma média ou número de cópias médio por genoma diploide ou por célula entre a população de células.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que, antes da separação em (a), um polinucleotídeo compreendendo a sequência de transgene que codifi- ca a proteína recombinante foi introduzido em pelo menos uma célula modificada de uma ou mais células.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma célula modificada não foi incubada em uma temperatura superior a 25°C, opcionalmente em ou cerca de 37°C ± 2°C, por mais do que 96 horas após a introdução do polinu- cleotídeo compreendendo a sequência de transgene.
8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma célula modificada não foi incubada em uma temperatura superior a 25°C, opcionalmente em ou cerca de 37°C ± 2°C, por mais do que 72 horas após a introdução do polinu- cleotídeo compreendendo a sequência de transgene.
9. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma célula modificada não foi incubada em uma temperatura superior a 25°C, opcionalmente em ou cerca de 37°C ± 2°C, por mais do que 48 horas após a introdução do polinu- cleotídeo compreendendo a sequência de transgene.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que uma ou mais células foram criopreservadas antes da separação da fração de alto peso molecular de DNA em (a).
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que uma ou mais células são uma linhagem celular.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais células é uma célula primária obtida de uma amostra de um indivíduo.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que uma ou mais células são uma célula imune.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que a célula imune é uma célula T ou uma célula NK.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que a célula T é uma célula T CD3+, CD4+ e/ou CD8+.
16. Método para avaliar uma sequência de transgene em uma amostra biológica de um indivíduo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) separar uma fração de alto peso molecular de ácido de- soxirribonucleico (DNA) maior ou maior do que cerca de 10 quilobases (kb) de DNA isolado de uma ou mais células presentes em uma amos- tra biológica de um indivíduo, em que a amostra biológica compreen- de, ou é suspeita de compreender, pelo menos, uma célula modificada compreendendo uma sequência de transgene que codifica uma prote- ína recombinante; e (b) a partir da fração de alto peso molecular, determinar a presença, ausência ou quantidade da sequência de transgene em toda ou uma parte da amostra biológica.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracteriza- do pelo fato de que a determinação da presença, ausência ou quanti- dade da sequência de transgene em (b) compreende a determinação da massa, peso ou número de cópias da sequência de transgene em toda ou uma parte da amostra biológica.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, ca- racterizado pelo fato de que, antes da separação, isola o DNA de uma ou mais células presentes na amostra biológica.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 16 a 18, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é ob-
tida de um indivíduo que recebeu uma composição que compreende pelo menos uma célula modificada compreendendo a sequência de transgene.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 16 a 19, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra de tecido ou amostra de fluido corporal.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracteriza- do pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra de tecido e o tecido é um tumor.
22. Método, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, ca- racterizado pelo fato de que a amostra de tecido é uma biópsia de tu- mor.
23. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracteriza- do pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra de fluido cor- poral e a amostra de fluido corporal é uma amostra de sangue ou soro.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 16 a 23, caracterizado pelo fato de que, antes da separação em (a), um polinucleotídeo compreendendo a sequência de transgene que codifica a proteína recombinante foi introduzido em pelo menos uma célula modificada de uma ou mais células.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 16 a 24, caracterizado pelo fato de que uma ou mais células na amostra biológica compreendem uma célula imune.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracteriza- do pelo fato de que a célula imune é uma célula T ou uma célula NK.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracteriza- do pelo fato de que a célula T é uma célula T CD3+, CD4+ e/ou CD8+.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 27, caracterizado pelo fato de que a separação é realizada por eletroforese em gel em campo pulsante ou cromatografia de exclu-
são de tamanho.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 28, caracterizado pelo fato de que a separação é realizada por eletroforese em gel em campo pulsante.
30. Método para avaliar a integração genômica de uma se- quência de transgene, o método caracterizado pelo fato de que com- preende: (a) separar, por eletroforese em gel em campo pulsante, uma fração de alto peso molecular de ácido desoxirribonucleico (DNA) maior ou maior do que cerca de 10 quilobases (kb) do DNA isolado de uma população de células, a referida população de células compreen- dendo uma pluralidade de células modificadas que cada qual compre- ende, ou é suspeita de compreender, uma sequência de transgene que codifica uma proteína recombinante; e (b) a partir da fração de alto peso molecular, determinar a média ou número de cópias médio por genoma diploide ou por célula da sequência de transgene integrada no genoma da pluralidade de células modificadas da população de células.
31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracteriza- do pelo fato de que, antes da separação em (a), um polinucleotídeo compreendendo a sequência de transgene que codifica a proteína re- combinante foi introduzido em pelo menos uma da pluralidade de célu- las modificadas da população de células.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracteriza- do pelo fato de que a população de células não foi incubada em uma temperatura superior a 25°C, opcionalmente em ou cerca de 37°C ± 2°C, por mais do que 96 horas após a introdução do polinucleotídeo compreendendo a sequência de transgene na pelo menos uma célula modificada.
33. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracteriza-
do pelo fato de que a população de células não foi incubada em uma temperatura superior a 25°C, opcionalmente em ou cerca de 37°C ± 2°C, por mais do que 72 horas após a introdução do polinucleotídeo compreendendo a sequência de transgene na pelo menos uma célula modificada.
34. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracteriza- do pelo fato de que a população de células não foi incubada em uma temperatura superior a 25°C, opcionalmente em ou cerca de 37°C ± 2°C, por mais do que 48 horas após a introdução do polinucleotídeo compreendendo a sequência de transgene na pelo menos uma célula modificada.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 34, caracterizado pelo fato de que a população de células foi criopreservada antes da separação da fração de alto peso molecular de DNA em (a).
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 35, caracterizado pelo fato de que a fração de alto peso mo- lecular é maior ou maior do que cerca de 15 quilobases (kb).
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 35, caracterizado pelo fato de que a fração de alto peso mo- lecular é maior ou maior do que cerca de 17,5 quilobases (kb).
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 35, caracterizado pelo fato de que a fração de alto peso mo- lecular é maior ou maior do que cerca de 20 quilobases (kb).
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 38, caracterizado pelo fato de que a sequência de transgene compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína recombinante.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 39, caracterizado pelo fato de que a determinação da presen-
ça, ausência ou quantidade da sequência de transgene é realizada por reação em cadeia da polimerase (PCR).
41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracteriza- do pelo fato de que a PCR é reação em cadeia de polimerase quantita- tiva (qPCR), PCR digital ou PCR digital de gotículas.
42. Método, de acordo com a reivindicação 40 ou 41, carac- terizado pelo fato de que a PCR é PCR digital de gotículas.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 40 a 42, caracterizado pelo fato de que a PCR é realizada usan- do um ou mais iniciadores que são complementares ou são capazes de especificamente amplificar pelo menos uma porção da sequência de transgene.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracteriza- do pelo fato de que um ou mais iniciadores são complementares ou são capazes de especificamente amplificar as sequências do elemento regulador.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 44, caracterizado pelo fato de que a determinação da quanti- dade da sequência de transgene compreende avaliar a massa, peso ou número de cópias da sequência de transgene por massa ou peso de DNA isolado de uma ou mais células, opcionalmente por microgra- ma de DNA isolado de uma ou mais células.
46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracteriza- do pelo fato de que a determinação da quantidade da sequência de transgene compreende avaliar a massa ou peso da sequência de transgene em micrograma, por micrograma de DNA isolado de uma ou mais células.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 44, caracterizado pelo fato de que a determinação da quanti- dade da sequência de transgene compreende avaliar a massa, peso ou número de cópias da sequência de transgene por uma ou mais cé- lulas, opcionalmente por células CD3+, CD4+ e/ou CD8+, e/ou por cé- lula que expressa a proteína recombinante.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 16 a 44, caracterizado pelo fato de que a determinação da pre- sença, ausência ou quantidade da sequência de transgene compreen- de avaliar a massa, peso ou número de cópias da sequência de trans- gene por genoma diploide ou por célula na amostra biológica.
49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracteriza- do pelo fato de que o número de cópias é uma média ou número de cópias médio por genoma diploide ou por célula entre uma ou mais células na amostra biológica.
50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 16- a 44, caracterizado pelo fato de que a determinação da quan- tidade da sequência de transgene compreende avaliar a massa, peso ou número de cópias da sequência de transgene por volume da amos- tra biológica, opcionalmente por microlitro ou por mililitro da amostra biológica.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 16 a 44, caracterizado pelo fato de que determinar a quantidade da sequência de transgene compreende avaliar a massa, peso ou nú- mero de cópias da sequência de transgene por peso corporal ou área de superfície corporal do indivíduo.
52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 48, caracterizado pelo fato de que determinar a quantidade da sequência de transgene compreende avaliar a massa, peso ou nú- mero de cópias da sequência de transgene na fração de alto peso mo- lecular e normalizar a massa, peso ou número de cópias para a mas- sa, peso ou número de cópias de um gene de referência na fração de alto peso molecular ou para uma curva padrão.
53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteriza- do pelo fato de que o gene de referência é um gene de manutenção.
54. Método, de acordo com a reivindicação 52 ou 53, carac- terizado pelo fato de que o gene de referência é um gene que codifica a albumina (ALB).
55. Método, de acordo com a reivindicação 52 ou 53, carac- terizado pelo fato de que o gene de referência é um gene que codifica a subunidade p30 da proteína P da ribonuclease (RPP30).
56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 52 a 55, caracterizado pelo fato de que o número de cópias de um gene de referência no DNA isolado é realizado por PCR usando um ou mais iniciadores que são complementares a ou são capazes de especificamente amplificar pelo menos uma porção do gene de refe- rência.
57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a sequência de transgene não codifica uma proteína gag viral completa.
58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 57, caracterizado pelo fato de que a sequência de transgene não compreende um genoma de HIV completo, um genoma viral com- petente para replicação e/ou genes acessórios, cujos genes acessó- rios são opcionalmente Nef, Vpu, Vif, Vpr e/ou Vpx.
59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 6 a 15, 24 a 29 e 31 a 57, caracterizado pelo fato de que a intro- dução do polinucleotídeo é realizada por transdução com um vetor vi- ral compreendendo o polinucleotídeo.
60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracteriza- do pelo fato de que o vetor viral é um vetor retroviral ou um vetor ga- marretroviral.
61. Método, de acordo com a reivindicação 59 ou 60, carac-
terizado pelo fato de que o vetor viral é um vetor lentiviral.
62. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracteriza- do pelo fato de que o vetor viral é um vetor AAV, opcionalmente sele- cionado entre os vetores AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 ou AAV8.
63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 6 a 15, 24 a 29 e 31 a 57, caracterizado pelo fato de que a intro- dução do polinucleotídeo é realizada por um método de liberação físi- ca, opcionalmente por eletroporação.
64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 63, caracterizado pelo fato de que a proteína recombinante é um receptor recombinante.
65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracteriza- do pelo fato de que o receptor recombinante especificamente liga-se a um antígeno associado a uma doença ou condição ou a um antígeno que é expresso em células do ambiente de uma lesão associada a uma doença ou condição.
66. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracteriza- do pelo fato de que a doença ou condição é um câncer.
67. Método, de acordo com a reivindicação 65 ou 66, carac- terizado pelo fato de que o antígeno é selecionado a partir de integrina αvβ6 (integrina avb6), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, da mesma forma conhecido n como CAIX ou G250), um antígeno de câncer-testículo, antígeno de câncer/testículo 1B (CTAG, da mesma forma conhecido como NY- ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, Ligante 1 de Quimiocina de Motivo C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, sulfato de condroitina pro- teoglicano 4 (CSPG4), proteína do fator de crescimento epidérmico
(EGFR), mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de es- trogênio, receptor Fc como 5 (FCRL5 ; da mesma forma conhecido como homólogo de receptor Fc 5 ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), uma proteína de ligação de folato (FBP), receptor de folato alfa, gangliosídeo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp 100), glipicano-3 (GPC3), receptor acopla- do à proteína G classe C grupo 5 membro D (GPRC5D), Her2/neu (re- ceptor de tirosina cinase erb-B2), Her3 (erb- B3), Her4 (erb-B4), díme- ros de erbB, antígeno associado a melanoma de alto peso molecular humano (HMW-MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno de leucócito humano A1 (HLA-A1), antígeno de leucócito humano A2 (HLA- A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22Rα), receptor alfa 2 de IL-13 (IL-13Rα2), receptor de domínio de inserção de cinase (kdr), cadeia leve capa, molécula de adesão de célula L1 (L1-CAM), epítopo de CE7 de L1-CAM, repetição rica em leucina contendo 8 membros da família A (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado a melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citome- galovírus de murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes do membro D do grupo 2 de morte natural (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão de célula neural (NCAM), antígeno oncofetal, an- tígeno preferencialmente expresso de melanoma (PRAME), receptor de progesterona, um antígeno específico da próstata, antígeno de cé- lulas tronco da próstata (PSCA), antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), Receptor Órfão do Tipo Tirosina Cinase Receptora 1 (ROR1), survivina, glicoproteína de trofoblasto (TPBG da mesma for- ma conhecida como 5T4), glicoproteína associada a tumor 72 (TAG72), proteína 1 relacionada à tirosinase (TRP1, da mesma forma conhecida como TYRP1 ou gp75), proteína relacionada à tirosinase 2
(TRP2, da mesma forma conhecida como dopacromo tautomerase, dopacromo delta-isomerase ou DCT), receptor de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor de fator de crescimento endote- lial vascular 2 (VEGFR2), Tumor de Wilms 1 (WT-1), um antígeno es- pecífico de patógeno ou expresso por patógeno, ou um antígeno asso- ciado com um marcador universal e/ou moléculas biotiniladas e/ou mo- léculas expressas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos.
68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 64 a 67, caracterizado pelo fato de que o receptor recombinante é um receptor de célula T recombinante (TCR) ou um receptor de célu- la não T funcional.
69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 64 a 68, caracterizado pelo fato de que o receptor recombinante é um receptor de antígeno quimérico (CAR).
70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracteriza- do pelo fato de que o CAR compreende um domínio de reconhecimen- to de antígeno extracelular que especificamente se liga ao antígeno e um domínio de sinalização intracelular compreendendo um ITAM.
71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracteriza- do pelo fato de que o domínio de sinalização intracelular compreen- dendo um ITAM compreende um domínio intracelular de uma cadeia CD3-zeta (CD3ζ), opcionalmente uma cadeia CD3-zeta humana.
72. Método, de acordo com a reivindicação 70 ou 71, carac- terizado pelo fato de que o domínio de sinalização intracelular com- preende ainda uma região de sinalização coestimuladora.
73. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracteriza- do pelo fato de que a região de sinalização coestimulatória compreen- de um domínio de sinalização de CD28 ou 4-1BB, opcionalmente CD28 humano ou 4-1BB humano.
74. Método para avaliar uma sequência de transgene não integrada residual, o método caracterizado pelo fato de que compre- ende: (1) realizar o método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15 e 28 a 73, para determinar a presença, ausência ou quantidade da sequência de transgene na fração de alto peso mo- lecular de DNA, desse modo avaliando a integração genômica de uma sequência de transgene; (2) determinar a presença, ausência ou quantidade da se- quência de transgene no DNA isolado sem separar a fração de alto peso molecular; (3) comparar a quantidade determinada em (1) com a quan- tidade determinada em (2), desse modo determinando a quantidade da sequência recombinante residual não integrada.
75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracteriza- do pelo fato de que a determinação da presença, ausência ou quanti- dade da sequência de transgene compreende a determinação da massa, peso ou número de cópias da sequência de transgene por ge- noma diploide ou por célula em uma ou mais células.
76. Método, de acordo com a reivindicação 74 ou 75, carac- terizado pelo fato de que uma ou mais células compreendem uma po- pulação de células em que uma pluralidade de células da população compreende, ou é suspeita de compreender, a sequência de transge- ne que codifica a proteína recombinante.
77. Método, de acordo com a reivindicação 75 ou 76, ca- racterizado pelo fato de que o número de cópias é uma média ou nú- mero de cópias médio por genoma diploide ou por célula entre a popu- lação de células.
78. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 75 a 77, caracterizado pelo fato de que comparar a quantidade compreende subtrair o número de cópias determinado em (1) do nú-
mero de cópias determinado em (2).
79. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 75 a 77, caracterizado pelo fato de que comparar a quantidade compreende determinar a relação do número de cópias determinado em (1) para o número de cópia determinado em (2).
80. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 74 a 79, caracterizado pelo fato de que a determinação da pre- sença, ausência ou quantidade em (2) é realizada por reação em ca- deia da polimerase (PCR).
81. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracteriza- do pelo fato de que a PCR é a reação em cadeia da polimerase quanti- tativa (qPCR), PCR digital ou PCR digital de gotículas.
82. Método, de acordo com a reivindicação 80 ou 81, carac- terizado pelo fato de que a PCR é a PCR digital de gotículas.
83. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 80 a 82, caracterizado pelo fato de que a PCR é realizada usan- do um ou mais iniciadores que são complementares ou são capazes de especificamente amplificar pelo menos uma porção da sequência de transgene.
84. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 74 a 83, caracterizado pelo fato de que determinar a presença, ausência ou quantidade em (2) compreende avaliar a massa, peso ou número de cópias da sequência de transgene no DNA isolado sem se- parar a fração de alto peso molecular e normalizar a massa, peso ou número de cópias para a massa, peso ou número de cópias de um gene de referência no DNA isolado sem separar a fração de alto peso molecular ou para uma curva padrão.
85. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracteriza- do pelo fato de que o gene de referência é um gene de manutenção.
86. Método, de acordo com a reivindicação 84 ou 85, carac-
terizado pelo fato de que o gene de referência é um gene que codifica a albumina (ALB).
87. Método, de acordo com a reivindicação 84 ou 85, carac- terizado pelo fato de que o gene de referência é um gene que codifica a subunidade p30 da proteína P da ribonuclease (RPP30).
88. Método, de acordo com a reivindicação 84 a 87, carac- terizado pelo fato de que a determinação da massa, peso ou número de cópias de um gene de referência no DNA isolado é realizada por PCR usando um ou mais iniciadores que são complementares ou são capazes de especificamente amplificar pelo menos uma porção do ge- ne de referência.
89. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 74 a 88, caracterizado pelo fato de que a determinação da pre- sença, ausência ou quantidade em (1) e a determinação da presença, ausência ou quantidade em (2) é realizada por reação em cadeia da polimerase (PCR) usando o mesmo iniciador ou os mesmos conjuntos de iniciadores.
90. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 74 a 89, caracterizado pelo fato de que a sequência recombinan- te não integrada residual compreende um ou mais de plasmídeos de vetor, DNA complementar linear (cDNA), autointegrantes ou círculos de repetição terminal longos (LTR).
Controle não transduzido, plasmídeo de CAR reforçado e plasmídeos de VSVg
Transgene (plasmídeo de acondicionamento) (controle genômico)
Petição 870210012580, de 05/02/2021, pág. 296/350 1/11
Transduzido Transgene (plasmídeo de acondicionamento) (controle genômico) genoma diploide genoma diploide
Conclusão genoma diploide genoma diploide
Contas células, oligômero células, oligômero Petição 870210012580, de 05/02/2021, pág. 298/350 células, oligômero células, oligômero Contas 3/11 Número de cópia de transgene/célula 3 4 5 3 4 5 5 5 3 4 5 3 4 5 5 5 ia ia ia ia ia a ia a ia ia ia a ia ia l-d -d -d d i i d di dia dia o al o- l-d l-d l-d o -d l-d o- l-d o- l-d l-d l- - sa sã s ã sa sa sa sa ã sa sã sa sa sa ão Ba u Ba lus Ba u sã Ba l us lu Ba a u s cl Ba Ba cl Ba Ba B cl on o nc o nc onc C C on C C on
C C Doador Doador
Dia
Petição 870210012580, de 05/02/2021, pág. 299/350 Dia
Dia Dia 4/11
Dia
Dia
Dia Dia Dia Dia Contas células, oligômero Dia células, oligômero
Número de cópia de transgene/célula
Amostra Fração de transgene integrado Amostra genoma diploide
Petição 870210012580, de 05/02/2021, pág. 301/350 Fração de transgene não integrado Amostra Fração de transgene não integrado genoma diploide
Amostra 6/11
Amostra célula
Petição 870210012580, de 05/02/2021, pág. 303/350 genoma diploide Fração de transgene não integrado Fração de transgene integrado Fração de transgene integrado Fração de transgene não integrado genoma diploide 8/11
Tempo (horas) pós transdução
Número de cópia de transgene/células
Não expandido Expandido células, células totais células, células totais
Petição 870210012580, de 05/02/2021, pág. 306/350 11/11
% de CD3+CAR+ de CD45+ viável % de CD3+CAR+ de CD45+ viável célula, células totais célula, células totais
Não expandido Expandido
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