KR20190098747A - 입양 세포 치료법을 위한 조작된 세포의 제조방법 - Google Patents

입양 세포 치료법을 위한 조작된 세포의 제조방법 Download PDF

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KR20190098747A
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cell
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recombinant
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KR1020197019497A
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파스칼 뷰체즈니
세미 유. 타린
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주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드
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Abstract

본 발명에 따라 유전자 조작시 사용되기 위한 세포를 포함하여, 세포를 유전자 조작하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터 입자와 세포를 함께 인큐베이션함으로써 세포를 형질도입시키는 것을 포함하되, 인큐베이션에 앞서, 세포들은 활성화제나 자극 제제와 인큐베이션되지 않고, 예컨대 항-CD3/항-CD28 항체 및/또는 하나 이상의 재조합 사이토카인과 함께 인큐베이션되지 않는다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 세포를 유전자 조작하기 위한 공정을 단축 또는 개선시키는 것과 관련된 특정을 초래한다. 또한 본 발명에 따라 키메라 항원 수용체와 같은 키메라 수용체 또는 트랜스제닉 T 세포 유전자와 같은 다른 재조합 항원 수용체를 인코딩하는 것과 같은, 재조합 또는 이종 유전자 또는 이들의 조합에 의해 형질도입된, 결과적인 세포도 제공된다.

Description

입양 세포 치료를 위한 조작된 세포의 제조방법
관련 출원의 상호참조
[0001] 이 출원은 "입양 세포 치료를 위한 조작된 세포들의 제조방법"이라는 제목으로 2016년 12월 5일 출원된 미국 가특허출원 No. 62/430,349에 기초한 우선권 주장 출원으로서, 상기 출원의 내용은 그 전체가 본원에 참고 통합된다.
서열목록의 참조 통합
[0002] ASCII 텍스트 파일로 제출된 하기 제출 내용은 참조를 위해 그 내용 전체가 서열 목록의 컴퓨터 판독가능한 형태(CRF)로서 본원에 통합되었다 (파일명:　735042005040SeqList.txt, 생성일 2017년 11월 28일, 크기; 50,233 바이트)
분야
[0003] 본원은 입양 세포 치료와 관련하여 사용되기 위한 세포를 비롯한 세포의 유전자 조작을 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 레트로바이러스 벡터 입자, 예컨대 렌티바이러스 벡터와의 인큐베이션에 의한 세포의 형질도입을 포함하며, 여기서 인큐베이션 전에 상기 세포들은 항-CD3/항-CD28 항체 및/또는 하나 이상의 재조합 사이토카인과 함께 인큐베이션되지 않는 것처럼, 활성화제 또는 자극 제제와 함께 인큐베이션되지 않은 것들이다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 세포를 유전자 조작하기 위한 프로세스를 단축 또는 개선시키는 것과 관련된 특징을 가져온다. 또한 키메라 항원 수용체와 같은 키메라 수용체, 또는 트랜스제닉 T 세포 수용체와 같은 다른 재조합 항원 수용체를 인코딩하는 재조합 또는 이종 유전자에 의해 형질도입된, 결과적인 세포들 및 그의 조성물도 제공된다. 일부 구현예에서, 제공된 세포들 및 조성물은 입양 면역요법에 사용될 수 있다.
배경
[0004] Various 입양 세포 면역 치료 또는 암 치료에 사용하기 위해 시험관내 항원-특이적 T 세포를 형질도입하는 것을 포함하여, 시험관내에서 T 세포 집단을 형질도입하기 위한 다양한 전략이 이용 가능하다. 연구, 진단 및 치료 목적을 포함하여 시험관내에서 세포 집단을 형질도입하기 위한 개선된 전략이 필요한다. 이러한 요구를 충족시키는 시약, 방법, 제조 물품 및 키트가 제공된다.
발명의 개요
[0005] 본 발명은 재조합 핵산을 함유하는 바이러스 벡터 입자 및 대상체로부터 유도된 세포들을 함유하는 샘플로부터 수득된 복수의 T 세포를 함유하는 인풋 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하는, T 세포의 형질도입을 위한 방법을 제공하며, 여기서, 상기 인큐베이션은 대상체로부터 샘플을 수득한 후 24 시간 이내; 및/또는 인큐베이션 전에 개시되며; 및/또는 인큐베이션 전에, 상기 T 세포는 대상체로부터 샘플을 수득한 후 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 또는 24시간 초과의 기간 동안, 약 15℃, 약 18℃, 약 22℃ 또는 약 25℃ 보다 높은 온도로 처리되지 않은 것이며 (번역자주: 본 명세서에서 "약"이라는 용어는 그 다음에 나오는 수치 및 단위를 포함하는 것으로 한다, 예를 들어 "약 15℃"라는 표현은 "15℃" 자체도 포함하는 것으로 한다); 및/또는 인큐베이션 전에, T 세포는 대상체로부터 샘플을 수득한 후 15분, 30분, 1시간 또는 2시간 초과의 기간 동안 약 37℃±2.0℃ 이상의 온도로 처리되지 않은 것이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 대상체로부터 샘플을 수득한 후 약 1 시간, 3 시간, 6 시간, 12 시간 또는 18 시간 이하에서 개시된다.
[0006] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 인큐베이션에 앞서, 상기 방법은 세포 활성화를 촉진시키는 조건 하에서 T 세포를 자극하는 것을 포함하지 않는다. 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 상기 인큐베이션에 앞서, 인풋 조성물은 약 37℃ ± 2.0℃ 이상의 온도에서의 인큐베이션 및/또는 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 활성화시킬 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에서의 인큐베이션, TCR 복합체를 통한 신호를 유도할 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에서의 인큐베이션,및/또는 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에서의 인큐베이션과 같은 생체외(ex vivo) 자극; CD3-결합 분자; CD28-결합 분자; 재조합 IL-2; 재조합 IL-15; 및 재조합 IL-7 처리를 거치지 않은 것이다.
[0007] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 상기 인큐베이션에 앞서 T 세포의 5% 이하, 10% 이하, 20% 이하, 30% 이하 또는 40% 이하가 활성화된 세포이고, HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L 및 4-1BB로 이루어진 군으로부터 선택된 표면 마커를 발현하며; IL-2, IFN-감마, TNF-알파로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포내 발현을 포함하고, 세포 주기의 G1 또는 그 후의 단계에 있으며 및/또는 증식할 수 있다.
[0008] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 상기 방법은 재조합 핵산을 함유하는 바이러스 벡터 입자 및 T 세포를 함유하는 인풋 조성물을 인큐베이션 처리하는 것을 포함하며, 상기 T 세포는 대상체로부터의 샘플로부터 수득된 것이고, 여기서 상기 인큐베이션에 앞서, T 세포 또는 인풋 조성물은 약 37℃ ± 2.0℃ 이상의 온도에서의 인큐베이션 및/또는 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 활성화시킬 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에서의 인큐베이션, TCR 복합체를 통한 신호를 유도할 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에서의 인큐베이션,및/또는 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에서의 인큐베이션과 같은 생체외(ex vivo) 자극; CD3-결합 분자; CD28-결합 분자; 재조합 IL-2; 재조합 IL-15; 및 재조합 IL-7 처리를 거치지 않은 것이다.
[0009] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 하나 이상의 제제들은 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체를 함유한다.
[0010] 또한 재조합 핵산을 함유하는 바이러스 벡터 입자 및 T 세포를 함유하는 인풋 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하는, T 세포를 형질도입시키는 방법이 제공되며, 상기 T 세포는 대상체로부터의 샘플에서 수득된 것이고, 여기서 인큐베이션 전에 T 세포의 5% 이하, 10% 이하, 20% 이하, 30% 이하 또는 40% 이하가 활성화된 세포이고, HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L 및 4-1BB로 이루어진 군으로부터 선택된 표면 마커를 발현하며; IL-2, IFN-감마, TNF-알파로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포내 발현을 포함하고, 및/또는 세포 주기의 G1 또는 그 후의 단계에 있는 것이다.
[0011] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서 인풋 조성물 중의 T 세포의 10% 이하는 인큐베이션 직전에, HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L 및 4-1BB로 이루어진 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커를 함유한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 상기 인큐베이션 처리에 앞서, T 세포의 5%, 10%, 20%, 30% 또는 40% 초과는 저밀도 지질 수용체 (LDL-R)를 발현한다.
[0012] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 대상체는 인간이다.
[0013] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, T 세포는 인큐베이션 전 48 시간 이상 동안 2℃ 내지 8℃의 온도로 유지된 바 없거나 및/또는 유지되지 않는다.
[0014] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 샘플은 혈액 샘플이다. 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 샘플은 백혈구성분채집(leukapheresis) 샘플이다.
[0015] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, T 세포는 비분획화 T 세포이고, 농축(enriched) 또는 단리된 CD3+ T 세포이며, 농축 또는 단리된 CD4+ T 세포이거나, 농축 또는 단리된 CD8+ T 세포이다. 이러한 임의의 구현예 중 일부에서, T 세포는 일부 측면에서 농축 조성물을 생산하거나 및/또는 인풋 조성물을 생산하는, 대상체로부터의 샘플로부터 선택되거나 또는 농축된 것이다.
[0016] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 본원 방법은 인큐베이션하기 전에 대상체로부터 샘플을 얻고, 선택적으로, 일부 측면에서 농축 조성물을 생산하거나 및/또는 인풋 조성물을 생산하는, 샘플로부터 T 세포를 선택 또는 농축한다. 일부 경우에서, 인풋 조성물 중의 T 세포의 백분율은 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% T 세포를 초과한다.
[0017] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD4+ 및 CD8+ 세포를 함유한다. 일부 경우에서, CD4+ 세포 대 CD8+ 세포의 비율은 약 1:1, 1:2, 2:1, 1:3 또는 3:1이다.
[0018] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 샘플은 혈청 또는 혈장을 적어도 또는 적어도 약 10% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 15% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 20% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 25% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 30% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 33% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 35% (v/v), 또는 적어도 또는 적어도 약 40% (v/v)의 농도로 함유하며; 및/또는 인큐베이션에 앞서, 샘플은 적어도 또는 적어도 약 10% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 15% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 20% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 25% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 30% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 33% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 35% (v/v), 또는 적어도 또는 적어도 약 40% (v/v)의 농도로 혈청 또는 혈장과 세포외 접촉되었다.
[0019] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 샘플은 적어도 또는 적어도 약 30% (v/v)의 농도로 혈청 또는 혈장을 함유하며; 및/또는 인큐베이션에 앞서, 샘플을 적어도 또는 적어도 약 30% (v/v)의 농도로 혈청 또는 혈장과 생체외에서 접촉시켰다. 일부 측면에서, 혈청 또는 혈장은 인간이다. 일부 경우에서, 혈청 또는 혈장은 대상체에 있어 자가(autologous)의 혈청 또는 혈장이다.
[0020] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 샘플은 항응고제를 함유하고 및/또는 항응고제는 인큐베이션 처리 전에 샘플에 첨가된다. 일부 사례에서, 항응고제는 유리 시트르산 이온을 함유한다.
[0021] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 인큐베이션에 앞서, 본원 방법은 동결 방지제의 존재하에 T 세포, 선택적으로는 상기 샘플 또는 상기 농축된 조성물의 T 세포를 동결보존하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 인큐베이션에 앞서, 상기 방법은 동결보존된 조성물을, 동결방지제를 저감 또는 제거하는 조건 및/또는 인풋 조성물을 생성하는 조건 하에서 세척하는 단계를 포함한다.
[0022] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 인풋 조성물은 N-아세틸시스테인 (NAC); 혈청, 선택적으로 인간 혈청; 재조합 인터류킨-2 (IL-2), 재조합 인터류킨-15 (IL-15), 및/또는 재조합 인터류킨-7 (IL-7)을 포함한다.
[0023] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 인풋 조성물은 N-아세틸시스테인을 약 0.4 mg/mL 내지 4 mg/mL, 0.8 mg/mL 내지 3.6 mg/mL 또는 1.6 mg/mL 내지 2.4 mg/mL의 농도로 포함하거나; 또는 인풋 조성물은 N-아세틸시스테인을 적어도 또는 적어도 약 또는 약 0.4 mg/mL, 0.8 mg/mL, 1.2 mg/mL, 1.6 mg/mL, 2.0 mg/mL, 2.4 mg/mL, 2.8 mg/mL, 3.2 mg/mL, 3.6 mg/mL 또는 4.0 mg/mL의 농도로 함유한다. (번역자주: 본 명세서에서 "내지"라는 표현이 사용된 경우 내지 전후의 수치도 포함된다. 예를 들어, 5 내지 10시간 이라 함은 5시간과 10시간 사이의 기간은 물론 5시간과 10시간도 포함하는 것으로 한다) 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 인풋 조성물은 혈청, 선택적으로 인간 혈청을, 약 0.5% 내지 25% (v/v), 1.0% 내지 10% (v/v) 또는 2.5% 내지 5.0% (v/v)의 농도로 함유하거나; 또는 인풋 조성물은 혈청, 선택적으로 인간 혈청을, 적어도 또는 적어도 약 또는 약 0.5%, 1.%, 2.5%, 5% (v/v) 또는 10%의 농도로 함유한다.
[0024] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 인풋 조성물은 재조합 IL-2, 선택적으로 재조합 인간 IL-2을, 약 10 IU/mL 내지 500 IU/mL, 50 IU/mL 내지 250 IU/mL 또는 100 IU/mL 내지 200 IU/mL의 농도로 함유하거나; 또는 적어도 또는 적어도 약 10 IU/mL, 50 IU/mL, 100 IU/mL, 200 IU/mL, 300 IU/mL, 400 IU/mL 또는 500 IU/mL의 농도로 함유하며; 및/또는 인풋 조성물은 재조합 IL-15, 선택적으로 재조합 인간 IL-15을, 약 1 IU/mL 내지 100 IU/mL, 2 IU/mL 내지 50 IU/mL 또는 5 IU/mL 내지 10 IU/mL의 농도로 함유하거나; 또는 적어도 또는 적어도 약 1 IU/mL, 2 IU/mL, 5 IU/mL, 10 IU/mL, 25 IU/mL 또는 50 IU/mL의 농도로 함유하고; 및/또는 인풋 조성물은 재조합 IL-7, 선택적으로 재조합 인간 IL-7을, 약 50 IU/mL 내지 1500 IU/mL, 100 IU/mL 내지 1000 IU/mL 내지 200 IU/mL 내지 600 IU/mL의 농도로 함유하거나; 또는 적어도 또는 적어도 약 50 IU/mL, 100 IU/mL, 200 IU/mL, 300 IU/mL, 400 IU/mL, 500 IU/mL, 600 IU/mL, 700 IU/mL, 800 IU/mL, 900 IU/mL 또는 1000 IU/mL의 농도로 함유한다.
[0025] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 인큐베이션 처리는 바이러스 벡터 입자를 인풋 조성물에 회전접종(spinoculating)하는 단계를 포함한다. 일부 사례에서, 회전접종은 원심 챔버의 내부 공동(cavity)에서 바이러스 벡터 입자 및 인풋 조성물을 회전시키는 단계를 포함하되, 여기서 회전은 공동의 측벽의 내부 표면에서, 약 500 g 내지 2500 g, 500 g 내지 2000 g, 500 g 내지 1600 g, 500 g 내지 1000 g, 600 g 내지 1600 g, 600 g 내지 1000 g, 1000 g 내지 2000 g 또는 1000 g 내지 1600 g의 상대 원심력; 또는 적어도 또는 적어도 약 600 g, 800 g, 1000 g, 1200 g, 1600 g, 또는 2000 g의 상대 원심력으로 수행된다.
[0026] 일부 구현예에서, 회전접종은 약 5분 이상, 또는 약 10분 이상, 또는 약 15분 이상, 또는 약 20분 이상, 또는 약 30분 이상, 또는 약 45분 이상, 또는 약 60분 이상, 또는 약 90분 또는 약 120분 이상의 기간 동안; 또는 between 또는 between 약 5분 내지 60분, 10분 내지 60분, 15분 내지 60분, 15분 내지 45분, 30분 내지 60분 또는 45분 내지 60분의 기간 동안 수행된다.
[0027] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 본원 방법은 인풋 조성물 및/또는 바이러스 벡터 입자를 형질도입 아쥬반트와 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 일부 경우에, 접촉은 바이러스 벡터 입자를 인풋 조성물에 회전접종하기 전, 회전접종과 동시, 또는 회전접종 후에 수행된다.
[0028] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 약 37℃±2℃에서 수행된다. 일부 측면에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 회전접종 후에 수행된다. 일부 경우에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 약 2시간, 약 4시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 60시간 또는 약 72시간 이하의 기간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 약 24시간 동안 수행된다. 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 인큐베이션의 총 기간은 12시간, 24시간, 36시간, 48시간 또는 72시간 이하이다.
[0029] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 바이러스 벡터 입자는 렌티바이러스 벡터 입자이다. 일부 경우에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 HIV-1로부터 유래된다. 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 바이러스 벡터 입자는 바이러스 엔벨롭 당단백질로 슈도타입화된다(pseudotyped). 일부 경우에서, 바이러스 엔벨롭 당단백질은 VSV-G이다.
[0030] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 바이러스 벡터 입자는 SAMHD1-억제 활성을 나타내는 렌티바이러스 단백질을 함유하며, 상기 단백질은 바이러스 입자 내에 패키징된된다. 일부 사례에서, SAMHD1-억제 단백질은 야생형 Vpx 단백질, 야생형 Vpr 단백질이거나 또는 SAMHD1-억제 활성을 나타내는 야생형 Vpx 또는 Vpr 단백질의 변이체 또는 일부이다. 일부 경우에서, SAMHD1-억제 단백질은 레트로바이러스 벡터 입자에 대해 이종이다. 일부 구현예에서, SAMHD1-억제 단백질은 야생형 Vpx 단백질이거나 SAMHD1-억제 활성을 나타내는 야생형 Vpx 단백질의 변이체 또는 일부이다.
[0031] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 바이러스 벡터 입자는 약 20.0 미만 또는 약 10.0 미만의 감염 다중도(multiplicity of infection)로 인큐베이션 처리된다. 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 바이러스 벡터 입자는 약 1.0 IU/세포내지 10 IU/세포 또는 2.0 U/세포내지 5.0 IU/세포의 감염 다중도로 인큐베이션되거나; 또는 바이러스 벡터 입자는 적어도 또는 적어도 약 1.6 IU/세포, 1.8 IU/세포, 2.0 IU/세포, 2.4 IU/세포, 2.8 IU/세포, 3.2 IU/세포 또는 3.6 IU/세포, 4.0 IU/세포, 5.0 IU/세포, 6.0 IU/세포, 7.0 IU/세포, 8.0 IU/세포, 9.0 IU/세포 또는 10.0 IU/세포의 감염 다중도로 인큐베이션된다.
[0032] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 인풋 조성물은 적어도 또는 약 적어도 또는 약 50 x 106 세포들, 100 x 106 세포들, 또는 200 x 106 세포들을 함유한다.
[0033] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 재조합 핵산은 항원 수용체를 인코딩한다. 일부 경우에서, 항원 수용체는 트랜스제닉 T 세포 수용체 (TCR)이다. 일부 구현예에서, 항원 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 일부 사례에서, 키메라 항원 수용체 (CAR)는 ITAM을 함유하는 세포내 신호전달 도메인 및 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타 (CD3ζ) 사슬의 세포내 도메인을 함유한다. 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, CAR은 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인을 연결하는 막관통 도메인을 더 함유한다. 일부 경우에서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 함유한다.
[0034] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 공동자극 분자의 세포내 신호전달 도메인을 추가로 함유한다. 일부 사례에서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 및 41BB로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0035] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 항원 수용체는 질환 또는 병태(condition)와 관련된 항원에 특이적으로 결합하거나 유니버설 태그에 특이적으로 결합한다. 일부 경우, 질환 또는 병태는 암 및 자가면역 질환 또는 장애, 또는 감염성 질환이다.
[0036] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 상기 방법은 재조합 핵산으로 형질도입된 T 세포를 함유하는 아웃풋 조성물을 생산한다. 일부 경우, 아웃풋 조성물 중의 T 세포의 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 또는 적어도 80%는 재조합 핵산으로 형질도입된다. 일부 측면에서, 상기 방법은 상기 방법에 의해 생산된 형질도입된 T 세포를 상기 아웃풋 조성물로부터 회수하거나 단리하는 단계를 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 방법은 아웃풋 조성물의 세포 또는 상기 방법에 의해 형질도입된 세포를 활성화 또는 확장(expansion)시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 사례에서, 활성화 및/또는 확장은 생체외(ex vivo)에서 수행된다.
[0037] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 인큐베이션 후, 아웃풋 조성물 중의 세포를, T 세포를 활성화할 수 있고, TCR 복합체를 통해 신호를 유도할 수 있으며 및/또는 T 세포의 증식을 유도할 수 있는 하나 이상의 자극 제제의 존재 하에 추가로 인큐베이션 처리한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 자극 제제는 CD3-결합 분자; CD28-결합 분자; 재조합 IL-2; 재조합 IL-15; 및 재조합 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 자극 제제는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체를 함유한다.
[0038] 일부 경우에서, 활성화 및/또는 확장은 생체내(in vivo)에서 수행된다. 일부 구현예에서, 활성화 및/또는 확장은 항원 수용체에 의해 특이적으로 결합되는 항원 존재 하에서 일어나며 및/또는 도입유전자-특이적이다.
[0039] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 배양 후, 아웃풋 조성물 중의 세포는 선택적으로 CD3-결합 분자; CD28-결합 분자; 재조합 IL-2; 재조합 IL-15; 및 재조합 IL-7로 이루어진 하나 이상의 자극 제제의 존재하에 생체외에서 추가로 배양되지 않으며, 및/또는 아웃풋 조성물 내의 세포들은 30℃ 보다 높은 온도에서 24시간 이상 추가로 인큐베이션되지 않는다.
[0040] 또한, 본원에 기술된 임의의 방법에 의해 제조된 유전적으로 조작된 T 세포가 제공된다. 또한, 본원에 기재된 유전적으로 조작된 T 세포 및 약학 적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 조성물도 제공된다.
[0041] 또한, 상기한 바와 같은 조성물을 질병 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 제공된다. 일부 경우에서, 조성물은 대상체에게 투여되거나 투여될 준비가 되어 있고, 및/또는 대상체로부터 샘플을 얻은 후 9일 이내, 8일 이내, 7일 이내, 6일 이내 또는 5일 이내에 시험을 위해 방출된다. 일부 사례에서, 조성물은 대상체에게 투여되거나 투여 될 준비가 되어 있고 및/또는 대상체로부터 샘플을 얻은 후 1 일, 2 일, 3 일 또는 4 일 이내에 시험을 위해 방출된다. 일부 경우, 조성물은 대상체로부터 샘플을 얻은 후 21일 이내, 20일 이내, 19일 이내, 15일 이내, 14일 이내, 13일 이내, 12일 이내, 10일 이내, 9일 이내, 8일 이내, 7일 이내, 6일 이내 또는 5일 이내에 투여될 준비가 되어 있다.
[0042] 또한, 질환 또는 병태를 갖는 대상으로부터 수득된 샘플로부터 T 세포를 농축 또는 단리하는 단계; 상기 기술된 임의 방법에 의해 농축 또는 단리된 T 세포를 함유하는 인풋 조성물을 바이러스 벡터 입자로 형질도입시켜 형질도입된 세포를 함유하는 아웃풋 조성물을 생산하는 단계로서, 상기 바이러스 벡터 입자는 질환 또는 장애와 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 항원 수용체를 인코딩하는 재조합 핵산을 함유하는 것인 단계; 및 형질도입된 세포를 함유하는 아웃풋 조성물을 질병 또는 병태를 치료하기 위해 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 입양 세포 요법을 위한 방법도 제공된다.
[0043] 또한 질환 또는 병태를 치료하기 위해 재조합 핵산으로 형질도입된 T 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 아웃풋 조성물은 세포를 형질도입시키는 임의의 방법에 의해 생산되는 것인 단게를 포함하는 치료 방법도 제공된다.
[0044] 이러한 임의의 방법의 구현예에서, 조성물은 대상체에게 투여되거나 투여 될 준비가 되거나, 또는 대상체로부터 샘플을 얻은 후 11일 이내, 9일 이내, 8일 이내, 7일 이내 6일 이내 또는 5일 이내에 시험을 위해 방출된다. 일부 구현예에서, 조성물은 대상체로부터 샘플을 얻은 후 1 일, 2 일, 3 일, 4 일 또는 5 일 이내에 투여되거나 투여될 준비가된다. 일부 경우, 조성물을 투여하기 전에, 형질도입된 세포 또는 아웃풋 조성물의 세포를 약학 적으로 허용가능한 완충액 중에 제형 화한다.
[0045] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 형질도입된 세포를 함유하는 아웃풋 조성물을 투여하기 전에, 세포를 생체외에서 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 또는 10일 동안 배양하되, 상기 배양은 30℃를 초과하는 온도에서 일어난다. 일부 구현예에서, 형질도입 후, 형질도입된 세포를 함유하는 아웃풋 조성물 또는 세포를, T 세포를 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 자극 제제의 존재하에 배양하고, TCR 복합체를 통해 신호를 유도하고 및/또는 T 세포의 증식을 유도함으로써 형질도입된 세포를 함유하는 조성물을 제조한다.
[0046] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 형질도입된 세포를 투여하기 전에, 형질도입된 세포를 함유하는 아웃풋 조성물 또는 세포는 하나 이상의 자극 제제의 존재하에 생체외에서 추가로 인큐베이션되지 않고, 및/또는 30℃가 넘는 온도에서 24 시간 이상 추가로 인큐베이션 처리되지 않는다.
[0047] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 하나 이상의 자극 제제는 CD3 결합 분자; CD28-결합 분자; 재조합 IL-2; 재조합 IL-15; 및 재조합 IL-7, 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 항원을 포함하는 백신 및 항원 수용체에 특이 적으로 결합하는 항-이디오타입 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0048] 일부 경우에서, 하나 이상의 자극 제제는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체를 함유한다. 일부 구현예에서, 아웃풋 조성물의 세포 또는 형질도입된 세포들은 준최적 투여량(sub-optimal dose)으로 투여된다.
[0049] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 본원 방법은 생체내에서 형질도입된 T 세포의 자극 및/또는 확장을 유도 또는 증진시키는 하나 이상의 제제를 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 제제는 도입유전자-특이적이며 및/또는 선택적으로 항원 수용체이거나 또는 이를 함유하는, 발현된 도입유전자를 통해 세포를 자극하거나 활성화시킨다. 일부 측면에서, 하나 이상의 제제는 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 항원을 함유하는 백신, 항원 수용체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 항원 수용체의 이량화를 화학적으로 유도할 수 있는 제제 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 면역조절 제제; 면역 체크포인트 억제제; 세포외 아데노신 또는 아데노신 수용체, 선택적으로 A2aR 수용체의 억제제; 키누레닌 경로 조절제, 및 신호전달 경로의 조절제, 예컨대, 키나아제 억제제이다.
[0050] 또한 표적 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 TCR을 발현하도록 유전자 조작된 1차 인간 T 세포 집단을 함유하는 조성물도 제공되며, 여기서 상기 집단은 다수의 휴지(resting) T 세포를 함유하되; 상기 다수의 휴지 T 세포는 상기 조성물에서 유전자 조작된 세포의 적어도 7.5%를 함유한다. 일부 사례에서, 유전자 조작된 휴지 T 세포는 조성물 내 유전자 조작된 세포의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%를 함유한다.
[0051] 일부 구현예에서, 휴지 T 세포는 HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L (CD154) 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 음성이고; IL-2, IFN-감마 및 TNF-알파로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포내 발현이 결여되어 있으며; 세포주기의 G0 또는 G0G1a 단계에 있고; 및/또는 활성 SAMHD1을 포함한다. 일부 사례에서, 휴지 T 세포는 CD25 및 CD69에 대해 표면 음성이다(CD25-/CD69-). 일부 측면에서, 휴지 T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 함유한다.
[0052] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 표적 항원은 질환 또는 장애와 관련된다. 일부 경우에서, 질환 또는 장애는 감염성 질환 또는 병태, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 암이다.
[0053] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 표적 항원은 RORl, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, Lewis Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아종양(oncofetal) 항원, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원 (CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 윌름 종양 1 (WT-1) 및 사이클린 A1 (CCNA1)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본원에 설명된 조성물의 일부 구현예에서, 일차 인간 T 세포는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인 및 ITAM을 함유하는 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 CAR을 발현하도록 유전자 조작된다. 일부 경우에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 도메인을 함유한다. 일부 경우, CAR은 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인을 연결하는 막관통 도메인을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 함유한다.
[0054] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 공동자극 분자의 세포내 신호전달 도메인을 더 함유한다. 일부 경우에서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 및 41BB으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0055] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 함유한다.
[0056] 도 1A-1B는 도입유전자를 발현하는 렌티바이러스 벡터 입자에 의한 형질도입 전, 활성화 여부에 관계없이, 도입유전자 발현의 지표인, T 세포의 측면 발산 (SSC; y축) 및 EGFRt 표면 마커 발현 (x축)에 대한 도트 플롯을 나타낸다. 도 1A는 형질도입 전에 항-CD3/항-CD28 비드 시약 1 또는 항-CD3/항-CD28 비드 시약 2로 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 렌티바이러스 벡터 입자로 형질도입시킨 후의 EGFRt 발현의 도트 플롯을 나타낸다. 도 1B는 형질도입 전에 활성화되지 않은 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 다양한 농도의 바이러스 (초기 농도로부터 2배 연속 희석)에서 렌티바이러스 벡터 입자로 형질도입된 후의 EGFRt 발현의 도트 플롯을 나타낸다. EGFRt+ 였던 세포들의 백분율도 박스 내에 표시되어 있다.
[0057] 도 2는 다양한 조건 하에서의 형질도입 및 처리 후, 선택 후 표시된 날에서의 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 대리 마커 표면 발현 빈도(형질도입 빈도를 나타낸다)를 나타낸다.
상세한 설명
I. 개요
[0058] Provided 면역계와 같은 세포의 형질도입을 수반하는 바이러스 벡터의 세포 (예를 들어, T 세포) 로의 전달 방법이 제공된다.
예컨대 T 세포와 같은 면역 세포 등의 세포들을, 상기 세포들의 사전 활성화 없이 형질도입하거나 및/또는 대상체로부터 세포들을 수득한 후 24시간 이내에 개시되는 기간 내에 형질도입하거나 및/또는 형질도입 전 및 대상체로부터 세포들을 수득한 후 수 시간 이상 (및 24 시간 이하) 동안 15℃ 내지 25℃ 보다 높은 온도 예컨대 37℃± 2.0℃를 초과하는 온도로 세포를 처리함이 없이, 형질도입하는 것을 포함하는, 세포들(예컨대 T 세포) 내로 바이러스 벡터를 전달하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 먼저 T 세포를 생체외 자극 시약(예컨대 항-CD3/항-CD28 시약)으로 활성화 및/또는 자극함이 없이, 바이러스 입자와 세포를 접촉 또는 인큐베이션하기 전 및/또는 이와 연계하여, 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터 입자를 예컨대 T 세포와 같은 면역 세포 등의 세포 집단과 함께 인큐베이션 및/또는 접촉시키는 것을 포함한다.
[0059] 일부 구현예에서, 제공된 방법은 그러한 세포들을 재조합 수용체, 예를 들어 항원 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 T 세포 수용체(TCR)와 같은 재조합 수용체 등의 이종 분자로 유전자 조작하는데 이용된다. 유전자 조작된 세포는 입양 면역요법에 사용할 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 제공된 방법은 T 세포를 활성화 및/또는 자극하는 단계를 포함하지 않는 입양 치료를 위한 T 세포 등의 면역 세포를 제조하는데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 세포를 활성화 시키거나 자극할 필요성을 제거함으로써, 제공된 방법은 입양 세포 치료를 위한 세포를 조작 및/또는 제조하는 공정을 단축시킨다.
[0060] 일반적으로, 레트로바이러스-기반 벡터는 관심 대상 유전자를 세포에 안정하게 통합시키는데 사용될 수 있다. 비록 수포 구내염 바이러스 G 단백질 (VSV-g) 슈도타입 렌티바이러스 벡터가 비-분열 세포들을 형질도입 할 수는 있지만, 휴지 T 세포의 경우에는 형질도입이 잘 이루어지지 않는다고 보고되었다. 그러므로, 기존의 레트로바이러스 벡터로는, 비-사이클링 골수 세포 또는 휴지 T 세포와 같은 휴면 및/또는 휴지 세포를, 예컨대 세포 치료에 사용하기 위한 다운스트림 용도를 위해 충분한 양으로, 효과적으로 안정하게 유전자 조작하는 것이 항상 가능하지만은 않을 수 있다. 일부 경우 T 세포에서 형질도입이 일어나기 위해서는, T 세포 수용체 (TCR)의 작용 또는 사이토카인 자극에 의한 T 세포의 활성화가 요구될 수 있다. 일부 경우에서, VSV-G의 결합 파트너인 LDL 수용체의 저수준 발현이 휴지 T 세포에서 일어나는 것으로 관찰되었다. 활성화는 어떤 경우에는 LDL 수용체 발현을 증가시켜 렌티바이러스 벡터의 흡수를 증가시키는 것으로 나타났다. 전형적으로, T 세포가 입양 T 세포 치료법에 사용되기 위해서는, 적어도 1일 (때로는 최대 3일 이상) 활성화된다. 예를 들어, T 세포에 대한 렌티바이러스 형질도입 프로토콜은 전형적으로 형질도입 24 시간 이전에 활성화를 필요로 한다 (Amirache et al. (2014) Blood, 123:1422-1424).
[0061] 일부 사례에서, 입양 면역요법을 위한 유전자 조작된 T 세포를 제조하는데 이용가능한 절차는 선택, 활성화, 형질도입 및 확장의 순차적인 생체외 단계들을 요구할 수 있다. 그러나 T 세포와 같은 면역 세포의 생체외 자극 또는 활성화는 특정 입양 면역 요법을 위한 세포를 준비하는 데 있어 항상 바람직한 것은 아니다. 예를 들어, 예를 들어, 형질도입 전의 활성화 및/또는 자극 단계의 포함은 입양 세포 치료를 위한 세포를 제조하는데있어 시간, 비용, 시약 및/또는 사용자 취급을 증가시킬 수 있다. 이러한 결과는 다른 프로세스 및/또는 다른 대상체로부터의 세포와의 가변성의 위험을 증가시킬 수 있다.
[0062] 또한, 일부 맥락에서, 입양 T 세포 치료 후 T 세포 지속성 및/또는 소진(exhaustion)은 투여 전, 예를 들어 유전자 조작 전(예컨대, 항원 수용체, 예를 들어 CAR과 같은 수용체 등 유전자 조작된 분자를 인코딩하는 핵산의 도입) T 세포의 자극 및/또는 활성화와 관련이 있을 수 있다. 예를 들어, 형질도입을 촉진하기 위한 T 세포의 활성화는 T 세포의 분화 또는 활성화 상태를 변화시킬 수 있고, 이는 유전자 조작된 세포가 대상체에게 투여될 때 감소된 생체내 지속성을 유발 및/또는 초래할 수 있다. 일어날 수 있는 분화 상태의 변화로는, 일부 경우에서, 나이브 표현형의 상실, 기억 T 세포 표현형의 상실 및/또는 소진된 T 세포 표현형을 갖는 이펙터 세포의 생성을 들 수 있다. T 세포의 소진은 T 세포 기능의 급진적인 손실 및/또는 세포의 고갈을 초래할 수 있다(Yi et al. (2010) Immunology, 129:474-481).
[0063] 제공된 방법은, 대상체로부터 세포들을 선택 및/또는 농축한 직후, T 세포 집단과 같은 세포 집단을, 렌티바이러스 벡터 입자와 같은 레트로바이러스 벡터 입자와 인큐베이션 및/또는 접촉시킴으로써, 대상체로부터 수득된 일차 세포의 충분한 형질도입을 달성할 수 있다는 관찰에 기반한다. 일부 구현예에서, 제공된 방법에 따른 형질도입 프로세스는 CD3 및/또는 CD28 단백질의 결합 및/또는 LDL 수용체의 상향 조절을 통해 세포에 자극을 제공하거나 및/또는 세포를 먼저 활성화시킴으로써 LDL-수용체를 상향조절할 필요성에 의해 제한되지 않는 것으로 나타났다. 특정 이론에 구애되기를 원치는 않으나, 본 발명에 따라, 성분채집술을 비롯하여, 선택 및/또는 농축된 세포들의 업스트림 프로세싱과 T 세포 선택 및/또는 농축 프로세스는, 이미 LDL-수용체 발현을 상향조절하고 및/또는 T 세포를 바이러스 진입에 민감하게 만들 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 적어도 24 시간 동안 세포를 활성화시킬 필요없이 선택 직후 T 세포를 형질도입할 수 있음으로 해서, 공정을 단축시키는 것이 가능한 것으로 밝혀졌다. 제공된 방법의 일부 경우에, 농축 및/또는 선택된 세포들의 동결보존은 인큐베이션 및/또는 접촉에 앞서 상기 농축 및/또는 선택된 세포들이 자극 제제에 의해 생체외 자극되지 않는 한, 형질도입에 선행할 수 있다.
[0064] 일부 구현예에서, 제공된 방법은, 형질도입하고자 하는 세포들을 함유하는 인풋 조성물을 인큐베이션 및/또는 접촉시키는 것을 포함하되, 인큐베이션에 앞서, 인풋 조성물의 세포들은, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포와 같은 T 세포에서 TCR/CD3 세포내 신호전달 캐스케이드를 켜거나 개시시키는 제제와의 인큐베이션을 비롯한 생체외 자극 처리되지 않은 것이다. 이러한 제제로는 결합 분자 또는 항체, 예를 들어 비드와 같은 고체 지지체에 결합된, 예컨대, 항-CD3, 항-CD28와 같은 TCR 성분 및/또는 공동자극 수용체에 특이적인 것들, 및/또는 하나 이상의 사이토카인, 예컨대 재조합 사이토카인, 예컨대 IL-2 및/또는 IL-15 및/또는 IL-7을 들 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 레트로바이러스 벡터를 도입하기 전에, 제공된 방법은 T 세포를 함유하는 세포 집단을 항-CD3 항체, 항-CD28 항체 및/또는 재조합 IL-2, IL-15 또는 IL-7 사이토카인 중 하나 이상으로 활성화 및/또는 자극하는 것을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 재조합이라 함은 대상체로부터 수득된 샘플에서는 일반적으로 수득되지 않으나, 그 대신 세포내로 인공적 또는 외인적으로 도입된 단백질을 인코딩하는 유전자 서열로 DNA를 세포에서 발현시키는 것을 수반하는 것과 같은, 재조합 DNA 기술을 이용하여 생산되는 사이토카인을 가리킨다. 따라서, 재조합 사이토카인이라 함은 대상체로부터의 샘플, 예컨대 성분채집 샘플에 존재할 수 있거나 및/또는 그러한 대상체로부터 수득된 혈청에 존재하는 사이토카인은 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 인풋 조성물은 대상체로부터의 샘플로부터 수득되거나 및/또는 에컨대 T 세포와 같은 특정 세포의 서브셋으로 농축된 일차 세포들의 집단을 포함한다.
[0065] 일부 구현예에서, 세포 집단, 예를 들어 인풋 조성물은 이전에 동결보존 대상이었던 세포 집단일 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 세포의 동결보존에 앞서, 세포 집단은 세포 활성화 또는 자극을 촉진하는 임의의 조건, 예를 들어 T 세포의 세포 활성화 또는 자극과 같은 조건 하에 처리 및/또는 노출 및/또는 인큐베이션 처리된 바 없는 것이다. 일부 구현예에서, 세포의 동결보존 전에, 세포 집단은 TCR 복합체의 세포내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 제제, 예컨대 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체 및/또는 예컨대 IL-2 및/또는 IL-15 및/또는 IL-7 등의 하나 이상의 사이토카인의 존재하에 처리 및/또는 노출 및/또는 인큐베이션된 바 없는 것이다.
[0066] 일부 구현예에서, 세포 집단, 예를 들면, 제공되는 레트로바이러스 벡터와 함께 인큐베이션 처리되는 인풋 조성물은 레트로바이러스 벡터 입자와 함께 인큐베이션 처리되기 전에, 0℃ 초과, 예컨대 4℃, 15℃, 20℃ 또는 25℃ 초과의 온도에서 약 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 또는 72시간 이상 노출 및/또는 처리된 바 없는 것이다.
[0067] 일부 구현예에서, 인큐베이션 및/또는 접촉은 대상체로부터 일차 세포를 함유하는 샘플, 예컨대 성분채집 샘플을 수득한 후 약 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 18시간 또는 24시간 이내에 개시된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 처리 전에 T 세포는 대상체로부터 샘플 수득 후로부터 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 또는 24시간 초과의 기간 동안 약 15℃, 18℃, 22℃ 또는 25℃ 초과의 온도로 처리되지 않으며, 예컨대 대상체로부터 샘플 수득 후 15분, 30분, 1시간 또는 2시간 초과의 기간 동안 약 37℃± 2.0℃를 초과하는 온도로 처리된 바 없는 것이다.
[0068] 일부 구현예에서, 제공된 방법은 세포의 그러한 활성화가 형질도입에 선행하지 않은 형질도입된 세포들을 함유하는 아웃풋 조성물을 생산한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 집단 내의 T 세포 중 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상이, 표면 마커 또는 세포내 사이토카인 또는 기타 마커 등 T 세포 활성화 마커를 결여하는 T 세포와 같은 휴지 T 세포이거나 및/또는 세포 주기의 G0 또는 G0G1a 단계에 있는 T 세포인, T 세포 집단을 형질도입하는데 사용될 수 있다.
[0069] 일부 구현예에서, 상기 방법은 아웃풋 조성물 내 총 세포(또는 T 세포와 같은 특정 표적 세포 유형)의 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%가, 상기 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 것이거나 및/또는 그에 의해 인코딩된 재조합 유전자 산물을 발현하는 것인 아웃풋 조성물을 생산한다.
[0070] 일부 구현예에서, 제공된 방법은 비-사이클링 및/또는 휴지 세포들, 예컨대 비-활성화 또는 비-자극된 면역 세포들, 예를 들어 휴지 T 세포와 같은 면역 세포의 상대적으로 높은 형질도입 효율을 결과시킨다. 일부 구현예에서, 세포 집단, 예컨대 아웃풋 조성물 내 휴지 T 세포와 같은 비-사이클링 또는 휴지 세포의 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%는, 제공된 방법에 따라 레트로바이러스 벡터 입자에 의해 형질도입된다.
[0071] 일부 구현예에서, 인풋 조성물 및/또는 아웃풋 조성물 중의 T 세포의 5%, 10%, 20%, 30%, 또는 40% 이하는 활성화된 세포들이고, HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L 및 4-1BB로 이루어진 군으로부터 선택된 표면 마커를 발현하며; IL-2, IFN-감마, TNF-알파로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포내 발현을 포함하고, 세포 주기의 G1 또는 그 후의 단계에 있거나 및/또는 증식가능하다. 예를 들어,일부 측면에서, 인풋 조성물 및/또는 아웃풋 조성물의 세포 집단은, 그의 적어도 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%가 CD25 및/또는 CD69, 예컨대 CD25-및 CD69-에 대해 표면 음성인 것이다.
[0072] 휴지 T 세포와 같은 세포의 사이클링 상태를 평가 및/또는 평가하기 위한 방법 및 기술은 공지되어있다 (Tumeh et al. (2010) J Immunother., 33:759-768). 일부 구현예에서, 휴지 T 세포는 활성화된 T 세포와 같은 증식 T 세포보다 작은 크기를 나타낸다. 따라서, 일부 측면에서, 트리판 블루와 같은 생존 성 염료를 사용하거나 사용하지 않는 자동 세포 계수기를 사용하여 측정된 것과 같은 세포 크기가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 집단 내 대다수의 세포 및/또는 실질적으로 모든 T 세포는 4 ㎛ 미만, 예를 들어 일반적으로 3 ㎛ 미만, 예를 들어 약 1 ㎛ 내지 약 3 ㎛, 일반적으로 약 또는 대략 2 ㎛의 직경을 갖는 세포들이다. 일부 구현예에서, 대사 기질의 흡수는 각기 활성화 또는 자극된 세포들에 의해 흡수되는 마커들인, 예를 들어 삼중수소(3H)-표지된 2'-데옥시-D-글루코스 ([3H]-2'DDG), 3H-표지된 3'-데옥시-3'-플루오로티미딘 ([3H]-3'FLT) 및/또는 3H-표지된-2'-데옥시-2'-플루오로아라비노플루라노실시토신 ([3H]-FAC)을 이용하여 평가가능하다. 일부 구현예에서, 집단 내 대다수의 세포 및/또는 실질적으로 모든 T 세포는 대사 기질의 마커를 흡수 및/또는 축적하지 못한다. 일부 구현예에서, 세포주기는 예를 들어, 프로피듐 요오다이드(PI), 7-아미노액티노마이신-D (7-AAD), Hoechst 33342, 33258 및 S769121, TO-PRO-3, 4'6'-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI), DRAQ5™ 또는 DRAQ7™을 사용하여 DNA 함량을 정량함으로써 직접 평가하거나 모니터링할 수 있다.
[0073] T 세포 활성화 마커의 발현 및/또는 수준을 평가하는 방법 및 기술은 당업계에 공지되어있다. 이러한 마커를 검출하기 위한 항체 및 시약은 당업계에 잘 알려져 있으며 쉽게 입수할 수 있다. 이러한 마커를 검출하기 위한 분석법 및 방법의 비제한적인 예로는 유세포 계측법, 예컨대 세포내 유세포 계측법, ELISA, ELISPOT, 사이토메트릭 비드 어레이 또는 다른 멀티플렉스 방법, 웨스턴 블랏 및 기타 면역친화성-기반 방법을 들 수 있다.
[0074] 일부 구현예에서, 상기 방법은 특정 조건 하에서 적어도 특정 형질도입 효율을 달성할 수 있다. 예를 들어, 인풋 조성물이 세포 중 하나 당 약 1 감염 유닛 (IU) 내지 세포 중 하나 당 10 IU의 비율, 예컨대 세포들 중 하나 당 적어도 또는 약 1 감염 유닛 (IU), 또는 세포들 중 하나 당 적어도 또는 약 2 IU, 세포들 중 하나 당 적어도 또는 약 5 IU, 또는 세포들 중 하나 당 적어도 또는 약 10 IU로 바이러스 및 세포를 포함하는 일부 구현예에서, 상기 방법은 그 방법에 의해 생성된 조성물 내 세포의 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%가, 예컨대 재조합 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 것인 아웃풋 조성물을 생산할 수 있다.
[0075] 일부 이러한 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 입자에 의한 세포의 형질도입 효율은 세포, 예컨대 비-사이클링 숙주 세포, 예컨대 휴지 T 세포 또는 그의 세포 집단으로의 벡터의 형질도입 또는 다른 형태의 전달 후, 레트로바이러스 벡터의 게놈에 함유된 핵산에 의해 인코딩된 이종 분자 또는 단백질과 같은 재조합 분자 또는 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 모니터링 및/또는 관찰가능하다. 친 화성-기반 방법, 예를 들어, 유동 친화도 측정법과 같은 세포 표면 단백질과 관련한 면역친화성-기반 방법에 의한 검출과 같은 재조합 분자의 발현 수준을 평가하기 위한 다수의 널리 공지된 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현은 형질도입 마커 및/또는 리포터 구조물의 검출에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 절단된(truncated) 표면 단백질을 인코딩하는 핵산은 벡터 내에 포함되어 그의 발현 및/또는 증진의 마커로서 사용된다.
[0076] 일부 구현예에서, 제공된 방법은 인큐베이션, 예컨대 바이러스 입자에 의한 세포의 형질도입 전 또는 후에 동결보존 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 단계는 재료의 선적, 재료의 샘플링 또는 환자의 현 치료 상태의 '유지(hold)'를 허용하는 공정의 중단 단계를 제공할 수 있다.
[0077] 제공되는 방법은 일부 측면에서 세포의 사전 활성화 및/또는 자극을 위한 단계를 포함하지 않지만, 이 방법은 형질도입과 동시에 및/또는 형질도입 후에 세포의 활성화 또는 자극을 포함할 수 있다. 활성화 또는 자극은 생체외 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 후, 예를 들어. 바이러스 입자에 의한 세포의 형질도입 후, 생체내 활성화 및 확장을 위해 세포를 환자에게 주입할 수 있다.
[0078] 일부 구현예에서, 인큐베이션 도중 또는 그 후에, 제공된 방법은 세포의 증식 및/또는 활성화를 유도하는 것과 같은 예컨대 세포의 자극을 위한 조건하에서, 인풋 조성물, 아웃풋 조성물 및/또는 형질도입된 세포들을 생체외 배양하는 것을 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 배양은 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일을 초과하는 기간 동안, 30℃ 초과 온도, 예컨대 약 32℃, 35℃ 또는 37℃ 초과 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 자극은 하나 이상의 자극 제제의 존재하에 수행된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 자극 제제는 CD3-결합 분자, CD28-결합 분자이거나, 또는 재조합 IL-2, 재조합 IL-15 또는 재조합 IL-7과 같은 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체와 같은 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 추가의 배양은 세포의 확장을 초래하는 조건 하에서, 예를 들어 입양 세포 치료에 의해 대상체에게 투여하기 위한 치료적 유효량의 세포를 생산하도록 수행된다.
[0079] 일부 구현예에서, 아웃풋 조성물 또는 형질도입된 세포들은 30℃ 초과의 온도에서 생체외에서 추가 배양되지 않으며 및/또는 하나 이상의 자극 제제의 존재 하에서 추가 배양되지 않는다.
[0080] 일부 구현예에서, 제공된 방법은 CAR과 같은 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산으로 T 세포를 도입, 전달 및/또는 형질도입하는 과정에서 T 세포의 생체외 분화 상태에 대한 변화를 실질적으로 회피하거나 및/또는 최소화한다. 일부 구현예에서, 제공된 방법에 따라 제조된 투여된 세포들은 덜 소진된 표현형을 나타낸다.
[0081] 일부 구현예에서, 예컨대 T 세포를 포함하는 인풋 조성물 및/또는 아웃풋 조성물은, 인풋 조성물의 세포들이 적어도 또는 적어도 약 24 시간 동안 항-CD3/항-CD28 항체에 의해 활성화 및/또는 자극되는 것과 같이, 인큐베이션에 앞서 활성화 및/또는 자극된 조성물 내 세포들보다, 소진된 T 세포 표현형을 갖는 이펙터 세포와 같은 이펙터 세포의 비율 또는 백분율이 더 낮다. 일부 구현예에서, 인풋 조성물 및/또는 아웃풋 조성물 내의 T 세포는 인풋 조성물의 세포들이 적어도 또는 약 적어도 24 시간 동안 항-CD3/항-CD28 항체에 의해 활성화 및/또는 자극되는 것과 같이, 인큐베이션에 앞서 활성화 및/또는 자극된 조성물 보다, 더 낮은 비율 또는 백분율로 T 이펙터 기억 (TEM) 또는 T 이펙터 세포들(TEFF) 세포들, 예컨대 CD45RO+CD62L-CCR7-세포들을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 비율 또는 백분율은 적어도 또는 약 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 5배 더 낮다.
[0082] 일부 구현예에서, 예컨대 T 세포를 포함하는 인풋 조성물 및/또는 아웃풋 조성물은, 인풋 조성물의 세포들이 적어도 또는 적어도 약 24 시간 동안 항-CD3/항-CD28 항체에 의해 활성화 및/또는 자극되는 것과 같이, 인큐베이션에 앞서 활성화 및/또는 자극된 조성물 내 세포들보다 기억 T 세포 표현형을 갖는 T 세포를 더 높은 비율 또는 백분율로 나타낸다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 기억 T 세포는 T 중심 세포 기억 (TCM) 표현형을 갖는 세포, 예컨대 CD45RO+CCR7+CD62L+ T 세포 및/또는 CD45RO+CCR7+CD27+CD28+CD62L+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 비율 또는 백분율은 적어도 또는 적어도 약 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 5배 더 낮다.
[0083] 일부 구현예에서, 제공된 방법은 예컨대 입양 세포 치료에서와 같은 임상적 사용을 위한 세포의 제조시 하나 이상 또는 모든 단계들이, 비-살균 조건에 세포를 노출시키지 않고, 무균실 또는 무균 캐비닛을 사용할 필요 없이 수행되도록 수행된다. 이러한 공정의 일부 구현예에서, 세포는 폐쇄 시스템 내에서 단리, 분리 또는 선택, 형질도입, 세척되며, 선택적으로 활성화 또는 자극 및 제형화된다. 일부 구현예에서, 폐쇄 시스템은 원심 챔버를 포함하는 장치이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 자동화 방식으로 수행된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단계는 예컨대 원심 챔버 시스템과는 별도로, 폐쇄 시스템 또는 장치와 별도로 수행된다.
[0084] 일부 구현예에서, 제공된 방법은 세포들이 보다 짧은 기간 동안 생체외에서 가공됨으로 해서 시간을 절약하고 비용 감소를 가능하게하는 최적화된 또는 개선된 공정을 제공한다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 또한 이펙터 기억 세포에 비해 중심 기억 세포는 더 많고 및/또는 소진된 세포는 더 적은 것과 같은, 더 바람직하거나 더 우수한 표현형을 갖는, 환자에게 투여하기 위한 형질도입된 세포들을 생산하는 것을 가능케할 수 있다.
[0085] 일부 구현예에서, 상기 방법에 의해 생산된 세포들, 또는 그러한 세포를 포함하는 조성물이, 질환 또는 병태의 치료를 위해 대상체에게 투여된다.
[0086] 일부 구현예에서, 제공된 방법은 대상체에게 준-최적 투여량의 세포를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 투여량은 질환 또는 병태를 치료하기 위한 세포의 치료 유효량보다 약 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배 또는 10 배 미만이다. 이러한 예에서, 세포의 치료적 유효량을 생성하기 위한 세포의 확장은 세포를 대상체에 투여시 생체내에서 발생할 수 있다.
[0087] 일부 구현예에서, 제공된 방법은 세포의 생체내 확장을 포함한다. 일부 측면에서, 세포의 생체내 확장은 투여된 세포의 도입유전자-특이적 활성화 또는 자극에 의해 생체내에서 발생할 수 있다. 일부 구현예에서 항원 수용체 (예: CAR)는 항원 인식시에 활성화되거나 확장되는 것과 같이 자극된다. 일부 구현예에서, 대상체에서 생체내 세포의 자극, 활성화 또는 확장을 부스트, 고양 또는 증가시키기 위해 하나 이상의 제제가 환자에게 투여된다.
[0088] 일부 구현예에서, 제공된 방법은 대상체에 투여시, 증가된 지속성 및/또는 감소된 T 세포 소진을 나타내는 유전자 조작된 T 세포를 생산한다. 일부 구현예에서, 증가된 지속성 및/또는 감소된 소진을 갖는 유전자 조작된 세포는 그것이 투여되는 대상체에서 더 우수한 효능을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제공된 레트로바이러스 벡터 입자 및 방법은 예를 들어, 대상체에게 투여하기 전에 T 세포의 생체외 조작을 최소화 및/또는 감소시킴으로써 입양 면역치료 방법에서 치료 결과의 가변성을 감소시킨다. 일부 구현예에서, T-세포의 생체외 활성화를 제거하는 것은 생체외 조작에 필요한 시간 및 시약을 감소시킴으로써 입양 면역요법을 위한 유전자 조작된 T-세포를 생산 또는 제조하는 공정을 개선시킨다.
[0089] 일부 구현예에서, 형질도입된 또는 조작된 세포에 대한 선택은 유전 공학에 따라 수행된다. 일부 구현예에서, 휴지 T 세포와 같은 휴지 또는 휴면 세포 및/또는 조작된 비-사이클링 세포는 입양 면역요법에서 사용하기 위해 농축될 수 있다.
[0090] 제공된 구현예 중에는 또한, CAR 및/또는 다른 재조합 수용체와 같은 재조합 항원 수용체 등의 유전자 조작된 수용체를 발현하는 세포와 같은 유 전자 조작된 세포, 및 그러한 유전자 조작된 세포의 입양 면역요법을 위한 방법 및 용도에 관한 것도 있다.
II. 형질도입의 방법
[0091] 본원에 따라 인풋 조성물의 세포를 레트로바이러스 벡터 입자, 예컨대 렌티바이러스 벡터 입자와 함께 접촉하거나 인큐베이션시키는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 인풋 조성물은 일부 경우에 세포의 하위집단 또는 서브세트가 선택 및/또는 농축된바 있는, 대상체로부터 수득된 일차 세포의 조성물이다. 인풋 조성물의 특징이 제공된다.
[0092] 일부 구현예에서, 세포들은 제공된 방법에 따라 유전자 조작을 통해 도입된 하나 이상의 핵산을 포함하고 이에 따라 이러한 핵산의 재조합 산물 또는 유전자 조작 산물을 발현한다. 일부 구현예에서, 핵산은 이종성이며, 즉 통상적으로 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플에 존재하지 않고, 다른 유기체 또는 세포로부터 수득된 것이며, 예를 들어, 조작된 세포 및/또는 그러한 세포가 유래된 유기체에서 통상적으로 발견되지 않는 것이다. 일부 구현예에서, 핵산은 예컨대 복수의 상이한 세포 유형으로부터의 다양한 도메인을 인코딩하는 핵산들의 키메라 조합을 포함하는 것을 비롯하여, 자연에서 발견되지 않는 핵산과 같이, 자연발생적인 것이 아니다.
[0093] 방법의 처리 단계는 다수의 세포 처리 단계 중 임의의 하나 이상을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 처리 단계는 세포에서의 발현을 위한 재조합 산물을 인코딩하는 것과 같은 레트로바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 벡터 입자로 세포를 형질도입하는 것을 포함한다. 상기 방법은 세포의 단리, 분리, 선택, 세척, 현탁, 희석, 농축 및/또는 제형화를 위한 단계와 같은 다른 처리 단계를 추가로 및/또는 택일적으로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 방법은 또한 배양을 위한 생체외 단계를 포함할 수도 있다 (예를 들어, 세포의 증식 및/또는 활성화를 위해 세포를 자극하는 단계). 다른 경우에, 세포를 자극하거나 활성화시키는 단계는 항원의 인식에 의해, 대상체에게 세포 투여시 및/또는 대상체에서 세포의 확장, 활성화 및/또는 증식을 부스트 또는 고양시키기 위해 하나 이상의 제제를 투여한 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체로부터 세포를 단리하고, 이들을 제조, 가공, 배양 및/또는 조작하고 동결보존 전 또는 후에 동일 대상으로 재도입하는 것을 포함한다.
[0094] 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포, 예를 들어 1차 세포가 생물학적 샘플로부터 선택되거나 분리되는 것과 같이 먼저 분리되는 단계; 선택된 세포를 형질도입을 위해 바이러스 벡터 입자와 함께 배양하는 단계; 및 형질도입된 세포를 조성물로 제형화하는 단계의 순서로 수행된다. 일부 경우에 있어서, 형질도입된 세포는 자극 시약의 존재하에 자극에 의해 생체외에서 활성화, 확대 또는 전파된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포를 세척, 현탁, 희석 및/또는 농축하는 하나 이상의 처리 단계들을 포함할 수 있고 이러한 처리 단계는 단리 예컨대 분리 또는 선택, 형질도입, 자극, 및/또는 제형화 단계들 중 하나 이상을 수행하기 전, 동안 또는 후에 일어날 수 있다.
[0095] 일부 구현예에서, 하나 이상 또는 모든 처리 공정, 예컨대 형질도입 및 조작, 및 제형화 단계와 관련한, 단리, 선택 및/또는 농축, 처리, 인큐베이션은 시스템, 장치 또는 방법을 사용하여 수행된다 자동화된 또는 프로그램 가능한 방식으로, 또는 일체형 또는 자가-포함 시스템, 및/또는 자동화 또는 프로그램가능한 방식의 시스템, 디바이스 또는 장치를 이용하여 수행된다. 일부 측면에서, 시스템 또는 장치는 사용자가 처리, 격리, 조작 및 제형화 단계의 다양한 측면을 프로그램, 제어, 결과 평가하고 및/또는 그의 다양한 측면을 조정할 수 있게 해주는, 시스템 및/또는 장치와 통신하는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함한다. 일례에서, 시스템은국제특허출원, 공개번호 WO2009/072003, 또는 US 20110003380 A1에 설명된 시스템이다. 일레에서, 시스템은 국제공개번호 WO2016/073602에 설명된 시스템이다.
[0096] 일부 구현예에서, 제공된 형질도입 방법과 관련하여 세포를 제조, 처리 및/또는 인큐베이션하는 것과 관련된 하나 이상의 세포 처리 단계는 일반적으로 원통형이고 회전축 주위로 회전가능한 실질적으로 강성인 챔버와 같은 원심분리 챔버의 내부 공동에서 수행될 수 있고, 이것은 이용 가능한 다른 방법에 비해 소정의 이점을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 모든 처리 단계는 동일한 원심분리 챔버에서 수행된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 처리 단계는 서로 다른 원심분리 챔버, 예컨대 동일 유형의 복수개의 원심분리 챔버에서 수행된다. 이러한 방법은 국제특허공개 WO2016/073602에 설명된 임의의 방법을 포함한다.
[0097] 예시적인 원심 분리 챔버는 A-200/F 및 A-200 원심분리 챔버 및 이러한 시스템과 함께 사용하기 위한 다양한 키트를 포함하여 Sepax® 및 Sepax® 2 시스템과 함께 사용되기 위한 것을 포함하여 Biosafe SA사가 제조 및 판매하는 것을 포함한다. 예시적인 챔버, 시스템 및 처리 기기 및 캐비넷은 예컨대 미국특허 No. 6,123,655, 미국특허 No. 6,733,433 및 미국특허출원공개 No.: US 2008/0171951, 및 국제출원공개 WO 00/38762에 설명되어 있고, 이들 문헌의 내용은 그 전체가 본 발명에 참조 병합된다. 특정 처리 (예컨대 희석, 세척, 형질도입, 제형화)에 따라, 해당 처리에 적합한 특정 키트를 선택하는 것은 당업자의 재량이다. 이러한 시스템과 함께 사용하기 위한 예시적인 키트는 BioSafe SA사가 CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 또는 CS-900.2라는 제품명으로 판매하는 일회용 키트를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
[0098] 일부 구현예에서, 시스템은 시스템에서 수행되는 다양한 처리 단계의 양태를 조작, 자동화, 제어 및/또는 모니터링하기 위한 장비를 포함한 다른 장비에 함께 포함되거나 및/또는 관련될 수 있다. 일부 구현예에서 이러한 장비는 캐비넷 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 장비는 제어 회로, 원심 분리기, 커버, 모터, 펌프, 센서, 디스플레이 및 사용자 인터페이스를 포함하는 하우징을 포함하는 캐비닛을 포함한다. 예시적인 기기는 미국특허 No. 6,123,655, 미국특허 No. 6,733,433, 및 미국특허출원 2008/0171951에 개시되어있다.
[0099] 일부 구현예에서, 시스템은 일련의 용기, 예를 들어, 백, 튜빙, 스톱 코크, 클램프, 커넥터 및 원심분리 챔버를 포함한다. 일부 구현예에서, 백과 같은 용기는 형질도입될 세포 및 바이러스 벡터 입자를 동일한 용기 별도의 용기 예컨대 동일한 백 또는 별도의 백과 같은 하나 이상의 용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 시스템은 챔버 및/또는 다른 구성 요소로 인출되어 방법이 수행되는 동안 성분 및/또는 조성물을 희석, 재순환 및/또는 세척하는 희석액 및/또는 세척액과 같은 매질을 함유하는 하나 이상의 용기 예컨대 백을 더 포함한다. 용기는 인풋 라인, 희석 라인, 세척 라인, 폐기물 라인 및/또는 아웃풋 라인에 대응하는 위치와 같이 시스템 내 하나 이상의 위치에 연결될 수 있다.
[0100] 일부 구현예에서, 폐쇄형 시스템과 같은 시스템은 무균이다. 일부 구현예에서, 예컨대 커넥터를 통한 튜빙 라인과 용기 사이와 같은, 시스템의 구성 요소들 간의 모든 연결은 무균 조건 하에서 이루어진다. 일부 구현예에서, 연결은 라미나 흐름 하에서 이루어진다. 일부 구현예에서, 연결은 튜빙과 용기 사이에서 무균 용접과 같은 무균 연결을 생성하는 무균 연결 장치를 사용하여 이루어진다. 일부 구현예에서, 무균 연결 장치는 적어도 200℃ 또는 260℃ 또는 300℃와 같은 무균성을 유지하기에 충분히 높은 가열 조건 하에서 연결을 수행한다.
[0101] 일부 구현예에서, 시스템은 일회용 키트와 같은 일회용일 수 있다. 일부 구현예에서, 일회용 키트는 예를 들어, 연속 또는 반-연속 방식으로 일어나는 공정에서 적어도 2, 3, 4, 5회 또는 그 이상과 같은 공정 또는 공정의 복수의 사이클에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 일회용 키트와 같은 시스템은 단일 환자로부터의 세포의 처리에 사용된다.
[0102] 원심 챔버는 일반적으로 회전축 둘레로 회전 가능하고, 공동은 전형적으로 챔버와 동축이다. 일부 구현예에서, 원심 챔버는 공동의 체적을 변화시키기 위해 일반적으로 챔버 내에서 이동 (예를 들어, 축 방향 이동)할 수 있는 피스톤과 같은 이동 가능한 부재를 더 포함한다. 따라서, 특정 구현예에서, 내부 공동* 챔버의 측벽과 단부벽과 가동 부재에 의해 구속되며, 가동 부재를 이동시킴으로써 조정될 수 있는 가변 체적을 갖는다. 가동 부재는 강성의, 실질적으로 또는 전체적으로 경질의 가요성 재료, 또는 이들의 조합으로 제조될 수 있다.
[0103] 챔버는 일반적으로 액체 및/또는 기체의 흡입 및 발현을 허용할 수 있는 하나 이상의 입구, 하나 이상의 출구 및/또는 하나 이상의 입구/출구와 같은 하나 이상의 개구(들)를 포함한다. 공동 및 공동으로부터. 어떤 경우, 개구는 액체 및/또는 기체의 흡입 및 발현이 일어나는 입구/출구 일 수 있다. 어떤 경우에는 하나 이상의 입구가 하나 이상의 출구와 분리되거나 다를 수 있다. 개구 또는 개구들은 단부 벽 중 하나에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 공동의 체적을 증가 및/또는 감소시키기 위해 가동 부재의 이동에 의해 액체 및/또는 기체가 공동으로 흡입 및/또는 발현된다. 다른 구현예에서, 액체 및/또는 기체는 예컨대
자동화 방식으로 제어될 수 있는 펌프, 시린지 또는 기타 기계 장치의 제어와 관련하여 튜브 라인 또는 채널을 위치시킴으로써 개구에 있거나 또는 개구와 관련하여 위치하는 튜브 라인 또는 다른 채널을 통해 공동으로 취입 및/또는 그로부터 발현될 수 있다.
[0104] 일부 구현예에서, 챔버는 튜브 라인 및 커넥터 및 캡과 같은 다양한 추가 구성 요소를 갖는 멸균 시스템과 같은 폐쇄 시스템의 일부분이며, 그 내부에서 처리 단계가 발생한다. 따라서, 일부 구현예에서, 제공된 방법 및/또는 그의 단계는 완전 폐쇄형 또는 반(semi)-폐쇄형 환경, 예를 들어 폐쇄형 또는 반-폐쇄형 멸균 시스템에서 수행되어, 바이오 안전성 캐비닛이나 룸과 같은 별도의 무균 환경을 필요로 함이 없이, 치료를 위해 대상체에게 투여하기 위한 세포 생산을 용이하게 할 수 있다. 일부 구현예에서 이 방법은 자동화 또는 부분 자동화 방식으로 수행된다.
[0105] 일부 구현예에서, 챔버는 그 회전축 주위와 같이 챔버의 회전을 수행 할 수 있는 원심분리기와 연계된다. 회전은 하나 이상의 공정 단계에서 인큐베이션 전, 도중 및/또는 후에 발생할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 다양한 처리 단계 중 하나 이상이 예를 들어 소정의 힘으로 회전하에 수행된다. 챔버는 원심분리 중에 챔버가 수직으로 위치하도록 전형적으로 수직 또는 일반적으로 수직 회전할 수 있고, 측벽과 축들은 수평 또는 일반적으로 수평이 되도록 단부 벽(들)에 대해 수직 또는 일반적으로 수직이다.
[0106] 이러한 방법의 측면에서, 상기 공정은 동일한 원심분리 챔버와 같은 동일한 폐쇄 시스템에서 수행될 필요는 없지만 상이한 원심분리 챔버와 같은 상이한 폐쇄 시스템 하에서 수행될 수 있다; 일부 구현예에서, 이러한 상이한 원심 챔버는 동일한 원심분리기와 관련하여 배치되는 것과 같이 동일한 시스템과 관련하여 배치되는 방법에서 각각의 지점에 위치한다. 일부 구현예에서, 모든 처리 단계는 각각의 하나 이상의 처리 단계의 전부 또는 일부가 동일하거나 상이한 원심 챔버에서 수행되는 폐쇄 시스템에서 수행된다.
A. 샘플 및 세포 준비
[0107] 세포는 일반적으로 진핵 세포, 예를 들면 포유동물 세포이고, 전형적으로 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 혈액, 골수, 림프 또는 림프 기관으로부터 유래되며, 면역계의 세포, 예를 들면 선천 또는 후천 면역 세포, 예컨대, 골수 또는 림프 세포이고, 여기에는 림프구, 일반적으로 T 세포 및/또는 NK 세포가 포함된다. 그 밖의 예시적인 세포에는 줄기세포, 예를 들면 다능성(multipotent) 및 전능성(pluripotent) 세포, 유도된 다능성(iPSCs)가 포함된다.
[0108] 세포는 일반적으로 일차 세포, 예를 들면 대상체로부터 직접 분리되거나 및/또는 대상체로부터 분리되어 동결된 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포 또는 기타 세포 유형의 1 이상의 서브세트, 예를 들면 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포, 및 예를 들면 기능, 활성 상태, 성숙도, 분화 잠재능, 확장, 재순환, 국소화 및/또는 지속능, 항원-특이성, 항원 수용체의 종류, 특정 장기 또는 분획 내의 존재여부, 마커 또는 시토카인 분비 프로파일, 및/또는 분화도에 의해 정의되는 바와 탁은 그의 서브집단을 포함한다. 치료될 대상체와 관련하여, 세포는 동종이계(allogeneic) 및/또는 자가(autologous)일 수 있다. 방법에는 기성의 상용(off-the-shelf) 방법이 포함된다. 일부 측면에서, 예를 들면 기성의 상용 기술에서, 세포는 전능성 및/또는 다능성, 예를 들면 줄기 세포, 예를 들면 유도된 전능성 줄기 세포 (iPSCs)이다. 일부 구현예에서, 이 방법은 대상체로부터 세포를 분리, 이를 준비, 가공, 배양 및/또는 조작하고, 동결보전 전 또는 후에 이를 동일 대상체에게 재도입하는 것을 포함한다.
[0109] T 세포 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 서브타입 및 서브집단에는 나이브 T (TN) 세포, 이펙터 T 세포 (TEFF), 기억 T 세포 및 이의 서브타입들, 예를 들면 줄기세포 기억 T (TSCM), 중심 기억 T (TCM), 이펙터 기억 T (TEM), 또는 말단 분화된 이펙터 기억 T 세포, 종양-주입 림프구 (TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 점막-관련 불변 T (MAIT) 세포, 자연발생 및 적응 조절 T (Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예를 들면 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 소포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포, 및 델타/감마 T 세포를 들 수 있다.
[0110] 일부 구현예에서, 세포는 자연 살해(NK) 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 단핵구 또는 과립구, 예컨대, 골수 세포, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구, 및/또는 호염기구이다.
[0111] 일부 구현예에서, 세포들은 세포주, 예컨대, T 세포주로부터 유래한다. 일부 구현예에서 세포들은 마우스, 래트, 비인간 영장류 및 돼지와 같은 이종 기원(xenogeneic source)으로부터 수득된다.
[0112] 일부 구현예에서, 세포는 예컨대 대상체로부터 수득 또는 유래된 샘플로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포가 분리되는 대상체는 세포 요법을 필요로 하는 질병 또는 병태에 걸린 대상체 또는 세포 요법이 투여될 대상체이다. 일부 구현예에서 대상체는 특정한 치료적 개재, 예를 들면 세포가 분리, 가공 및/또는 조작될 입양 세포 치료법을 필요로 하는 인간이다.
[0113] 따라서, 일부 구현예에서 세포는 일차 세포, 예컨대 일차 인간 세포이다. 샘플에는 대상체로부터 직접 채취된 조직, 유액(fluid), 및 기타 세포 뿐만 아니라 분리, 원심분리, 유전자 조작 (예컨대 바이러스 벡터를 이용한 형질도입), 세척, 및/또는 인큐베이션과 같은 한 가지 이상의 프로세싱 단계의 결과 얻어지는 샘플이 포함된다. 생물학적 샘플은 프로세싱되는 샘플 또는 생물학적 공급원으로부터 직접 얻어지는 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플의 비제한적인 예로는 체액, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 뇨 및 땀, 조직 및 장기 샘플 및 이들로부터 유래된 프로세싱된 샘플을 들 수 있다.
[0114] 일부 측면에서, 세포가 유래 또는 단리되는 샘플은 혈액 또는 혈액-유래된 샘플이거나 또는 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 생성물로부터 유래된 것이다. 예시적인 샘플로는 전혈, 말초혈액단핵 세포(PBMCs), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장연관 림프조직, 점막연관 림프조직, 비장, 기타 림프조직, 간, 폐, 위, 소장, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁경부, 고환, 난소, 편도, 또는 기타 장기, 및/또는 이들로부터 유래된 세포를 들 수 있다. 예컨대, 입양세포 치료와 같은 세포 치료 맥락에서 샘플에는 예컨대 자가 공급원 및 동종이계 공급원으로부터의 샘플이 포함된다.
[0115] 일부 예에서, 대상체의 순환 혈액으로부터의 세포는 예컨대 성분채집술 또는 백혈구성분채집술에 의해 수득된다. 일부 측면에서 샘플은, T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포들, 기타 유핵 백혈구 세포들, 적혈구 세포들, 및/또는 혈소판을 비롯한 림프구를 포함하며 일부 측면에서 적혈구 세포와 혈소판이 아닌 세포들을 함유한다.
[0116] 일부 구현예에서, 대상체로부터 수집된 혈액 세포들을 세척하여 예컨대 혈장 분획을 제거하고 후속 프로세싱 단계를 위하여 세포를 적절한 완충액 또는 배지에 넣는다. 일부 구현예에서, 세포들을 인산완충염수(PBS)로 세척한다. 일부 구현예에서, 세척용액은 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 다수의 또는 모든 2가 양이온을 결여한다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조사 설명서에 따라 반자동화식 "병류(flow-through)" 원심분리 (예컨대, Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter)에 의해 달성된다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조사 설명서에 따라 탄젠트 유동 여과(tangential flow filtration: TFF)에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 세포는 예컨대 Ca++/Mg++가 없는 PBS와 같은 다양한 생체적합성 완충액에 재현탁된다. 특정 구현예에서, 혈액세포 샘플 성분들을 제거하고 세포들을 배양 배지에 직접 현탁시킨다.
[0117] 일부 구현예에서, 세포를 농축 및/또는 선택하기 전에, 샘플은 인간 혈청 또는 혈장과 같은 혈청 또는 혈장과 접촉되거나 및/또는 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 혈청 또는 혈장은 세포가 얻어진 대상체에게 자가(autologous)이다. 일부 구현예에서, 혈청 또는 혈장은 샘플에 적어도 또는 적어도 약 10% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 15% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 20% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 25% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 30% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 35% (v/v), 또는 적어도 또는 적어도 약 40% (v/v)의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 세포의 선택 및/또는 형질도입 전에, 일차 세포는 함유하는 샘플을 항응고제와 접촉되거나 또는 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 항응고제는 유리 시트르산 이온, 예를 들어, 항응고제 구연산 덱스트로스 용액인, Solution A (ACD-A)이다.
[0118] 일부 구현예에서, 세포를 농축 및/또는 선택하기 전에, 샘플로부터의 세포를 무혈청 배지로 옮기거나 여기에 현탁시킨다. 일부 구현예에서, 무 혈청 배지는 정의되고 및/또는 잘 정의된 세포 배양 배지이다. 특정 구현예에서, 무혈청 배지는 억제제 및/또는 성장 인자를 제거하기 위해 처리, 예를 들어, 여과된 제어된 배양 배지이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 단백질을 함유한다. 특정 구현예에서, 무혈청 배지는 혈청 알부민, 가수분해물, 성장 인자, 호르몬, 담체 단백질 및/또는 부착 인자를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 무 혈청 배지는 단백질, 예를 들어 소 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민 및/또는 재조합 알부민과 같은 알부민을 함유한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 아미노산, 비타민, 무기 염, 완충액, 항산화제 및 에너지원을 함유하는 기저 배지(basal media), 예를 들어 DMEM 또는 RPMI 1640을 함유한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 비제한적인 예로서 알부민, 화학적으로 규정된 지질, 성장 인자, 인슐린, 사이토카인 및/또는 항산화제로 보강된다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 면역 세포, T 세포 및/또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포와 같은 특정 세포 유형의 세포의 성장, 증식, 건강, 항상성을 지지하도록 제형화된다.
[0119] 일부 구현예에서, 세포의 선택 및/또는 농축 전에, 샘플 또는 샘플 내의 세포는 추가 공정 단계 전에 안착되거나 유지될 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 약 2℃ 내지 8℃의 온도에서, 최대 12 시간, 24 시간 또는 36 시간 동안과 같이 최대 48 시간 동안 유지된다.
[0120] 일부 구현예에서, 제조 방법은 형질도입 및 조작을 위한 단리, 선택 및/또는 농축 및/또는 인큐베이션 전 또는 후에 세포를 동결, 예컨대 동결보존하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동 및 후속적인 해동 단계는 세포 집단 내의 과립구 및, 어느 정도로 단핵구를 제거한다. 일부 구현예에서는 예컨대 혈장 및 혈소판 제거를 위해 세척 단계 후에 냉동 용액에 세포들을 현탁시킨다. 일부 측면에서 공지의 다양한 여하한 냉동 용액 및 파라미터가 모두 사용가능하다. 그 한 가지 예는 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민 (HSA)를 함유하는 PBS 또는 그 밖의 적절한 세포 동결 배지의 사용을 포함한다. 이어서 배지로 1:1 희석하여 DMSO 및 HSA의 최종 농도가 각각 10% 및 4%가 되도록 한다. 이어서 세포를 일반적으로 분 당 1℃의 속도로-80℃까지 냉동시키고 액체질소 저장 탱크의 증기상에 보관한다.
[0121] 일부 구현예에서, 세포의 단리는 하나 이상의 제조 및/또는 비-친화성 기반 세포 단리 단계를 포함한다. 몇 가지 예에서, 세포들은 예컨대 원치 않는 성분들을 제거하고, 원하는 성분들을 농축시키거나, 특정 시약에 민감한 세포들을 용해 또는 제거하기 위한 1종 이상의 시약의 존재 하에, 세척, 원심분리, 및/또는 인큐베이션된다. 몇 가지 예에서, 세포들은 밀도, 흡착 특성, 크기, 민감성 및/또는 특정 성분에 대한 내성과 같은 하나 이상의 성질에 기반하여 분리된다.
[0122] 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 적혈구 세포의 용해 및 Percoll 또는 Ficoll 구배를 통한 원심분리에 의해 말초혈액으로부터 백혈구 세포를 준비하는 것과 같은, 밀도-기반 세포 단리방법을 포함한다.
[0123] 일부 구현예에서, 일부 구현예에서, 단리 방법은 세포내 하나 이상의 특이 분자, 예컨대 표면 마커, 예컨대 표면 단백질, 세포내 마커 또는 핵산의 발현 또는 존재여부에 기초하여 상이한 세포 유형을 분리하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 마커에 기반한 공지의 분리 방법들이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 분리는 친화성-또는 면역친화성-기반 분리이다. 예컨대, 일부 측면에서 단리는 세포 발현 또는 전형적으로 세포 표면 마커와 같은 하나 이상의 마커의 발현 수준에 기초하여 세포 및 세포 집단을 분리하는 것을 포함하며, 예컨대 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와 함께 인큐베이션한 다음, 일반적으로 세척 단계 및, 항체 또는 결합 파트너와 결합된 세포를 항체 또는 결합 파트너와 결합하지 않은 세포들로부터 분리함으로써 달성된다
[0124] 이러한 분리 단계는 시약과 결합한 세포가 추가 사용을 위해 유지되는 양성 선택 및/또는 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포들이 유지되는 음성 선택에 기초할 수 있다. 몇 가지 예에서, 두 가지 분획 모두 추가 사용을 위해 유지된다. 일부 측면에서, 음성 선택은 소망되는 집단 이외의 세포에 의해 발현되는 마커에 기초하여 분리가 최선으로 수행되는 것인, 이종 집단 내의 세포 유형을 특이적으로 동정할 수 있는 항체가 없을 경우 특히 유용할 수 있다.
[0125] 분리에 의해 특정 마커를 발현하는 세포 특정 세포 집단 또는 세포가 반드시 100% 농축되거나 제거되는 것은 아니다. 예컨대, 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포에 대한 농축 또는 양성 선택은 그러한 세포의 갯수 또는 밸분율을 증가시키는 것을 가리키는 것이지 그 마커를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재를 반드시 결과시키는 것은 아니다. 마찬가지로, 예컨대 마커를 발현하는 것처럼 어떤 특정한 유형의 세포의 음성 선택, 제거 또는 고갈은 이러한 세포의 갯수 또는 백분율을 감소시키는 것을 가리키는 것일 뿐 이러한 모든 세포의 완전한 제거를 반드시 결과시키는 것은 아니다.
[0126] 몇 가지 예에서, 분리 단계를 복수 라운드로 수행하는데, 이 경우 어떤 한 단계로부터 양성 또는 음성 선택된 분획을 후속적인 양성 또는 음성 선택과 같은 또 다른 분리 단계로 처리한다. 몇 가지 예에서, 음성 선택에 표적화된 마커에 대해 각각 특이적인 복수개의 항체 또는 결합 하트너와 세포를 함께 인큐베이션시킴으로써, 단일 분리 단계에 의해 복수개의 마커를 동시에 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있다. 마찬가지로, 다양한 세포 종류에서 발현되는 복수개의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 함께 인큐베이션시킴으로써 복수개의 세포 종류들을 동시에 양성 선택할 수 있다.
[0127] 예컨대, 일부 측면에서, 예컨대, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ T 세포와 같은, 하나 이상의 표면 마커를 높은 수준으로 발현하거나 이에 대해 양성인 세포와 같은 T 세포의 특별한 하위집단이 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리된다.
[0128] 예컨대, CD3+, CD28+ T 세포는 CD3/CD28 컨쥬게이트된 자기 비드 (예컨대, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)를 이용하여 양성 선택될 수 있다.
[0129] 일부 구현예에서, 단리는 양성 선택에 의한 특정 세포 집단에 대한 농축 또는 음성 선택에 의한 특정 세포 집단의 고갈에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 양성 또는 음성 선택은 각각 양성 또는 음성 선택된 세포 상에서 비교적 고수준 (마커하이)으로 또는 발현되는 (마커+) 하나 이상의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 항체 또는 기타 결합제와 세포를 함께 인큐베이션함으로써 달성된다.
[0130] 일부 구현예에서, T 세포는 비-T 세포, 예컨대 B 세포, 단핵구 또는 기타 백혈구 세포, 예컨대 CD14 상에서 발현되는 마커들의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 측면에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계를 이용하여 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포독성 T 세포를 분리한다. 이러한 CD4+ 및 CD8+ 집단은 나이브, 기억, 및/또는 이펙터 T 세포 하위집단 중 하나 이상을 비교적 고도로 발현하는 마커의 양성 또는 음성 선택에 의해 하위집단으로 더 분류될 수 있다.
[0131] 일부 구현예에서, CD8+ 세포를 나이브 중심 기억, 이펙터 기억, 및/또는 중심 기억 줄기 세포에 대해, 예컨대 이들 각각의 하위집단과 연계된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해, 추가로 농축 또는 고갈시킨다. 일부 구현예에서, 효능 증가를 위해, 예컨대 투여 후 장기간 생존, 증식 및/또는 이식을 위해 중심 기억 T (TCM) 세포에 대한 농축이 수행되는데, 이는 일부 측면에서 이러한 하위집단들에서 특히 원기왕성하다. 참조 [Terakura등 (2012) Blood.1:72-82; Wang 등 (2012) J Immunother. 35(9):689-701]. 일부 구현예에서, TCM-농축된 CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포의 조합에 의해 효능이 추가로 향상된다.
[0132] 일부 구현예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L-서브세트 양쪽 모두에 존재한다. PBMC는 예컨대 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 이용함으로써, CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+ 분획을 농축 또는 고갈시킬 수 있다.
[0133] 일부 구현예에서, 중심 기억 T (TCM) 세포의 농축은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD27 및/또는 CD 127의 양성 또는 높은 표면 발현에 기초한다; 일부 측면에서, 이것은 CD45RA 및/또는 그랜자임(granzyme) B를 발현 또는 고도로 발현하는 세포에 대한 음성 선택에 기반한다. 일부 측면에서, TCM 세포가 농축된 CD8+ 집단의 단리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈 및 CD62L를 발현하는 세포의 양성 선택 또는 농축에 의해 수행된다. 일 측면에서, 중심 기억 T (TCM) 세포에 대한 농축은 CD14 및 CD45RA의 발현에 기초한 음성 선택 및 CD62L에 기초한 양성 선택 처리되는 CD4 발현에 기초하여 선택된 세포들의 음성 분획으로부터 출발하여 수행된다. 일부 측면에서 이러한 선택은 동시적으로 수행되며 또 다른 측면에서는 순서와 상관없이 순차적으로 수행된다. 일부 측면에서, CD8+ 세포 집단 또는 하위집단을 준비하는데 사용된 것과 동일한 CD4 발현-기반 선택 단계를, CD4+ 세포 집단 또는 하위집단을 생성하는데도 이용함으로써, CD4-기반 분리로부터의 양성 및 음성 분획 양방 모두를 유지하여 후속 단계에서 이용할 수 있으며, 한 가지 이상의 추가적인 양성 또는 음성 선택 단계를 임의로 더 실시할 수 있다.
[0134] 특정 예에서, PBMCs 샘플 또는 기타 백혈구 세포 샘플을 CD4+ 세포 선택 처리하여, 음성 분획과 양성 분획 양자 모두를 유지시킨다. 이어서 음성 분획을 CD14 및 CD45RA 또는 CD19의 발현에 기반하여 음성 선택하고, 중심 기억 T 세포, 예컨대 CD62L 또는 CCR7에 특징적인 마커에 기초하여 양성 선택하되, 이 때 양성 선택과 음성 선택을 순서와 관계없이 수행한다.
[0135] CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단의 동정에 의해, 나이브, 중심 기억, 및 이펙터 세포로 분류된다. CD4+ 림프구들은 표준 방법에 의해 수득가능하다. 일부 구현예에서, 나이브 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 중심 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 일부 구현예에서, 이펙터 CD4+ 세포는 CD62L-및 CD45RO-이다.
[0136] 일 실시예에서, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농축하기 위해, 모노클로날 항체 칵돌기은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 양성 및/또는 음성 선택을 위해 세포를 분리할 수 있도록 고체 지지체 또는 매트릭스, 예컨대 자성 비드 또는 상자성 비드에 결합된다. 예컨대, 일부 구현예에서, 세포 및 세포 집단은 면역자성(또는 친화자성) 분리 기술에 의해 분리 또는 단리된다 (문헌 Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks 및 U. Schumacher " Humana Press Inc., Totowa, NJ에서 검토됨).
[0137] 일부 측면에서, 분리하고자 하는 세포의 샘플 또는 조성물은 자성 반응성 입자 또는 마이크로입자, 예컨대 상자성 비드(예컨대, (예컨대, 예컨대 Dynalbeads 또는 MACS 비드)와 같이 자화가능하거나 또는 자성적으로 반응성인 소형 물질과 함께 인큐베이션된다. 자성적으로 반응성인 물질, 예컨대, 입자는 일반적으로 분리하고자 하는, 예컨대 양성 또는 음성 선택이 요구되는 세포 또는 세포 집단 상에 존재하는 예컨대 표면 마커와 같은 분자에 특이적으로 결합하는 항체와 같은 결합 파트너에 일반적으로 직접 또는 간접적으로 결합된다.
[0138] 일부 구현예에서, 자성 입자 또는 비드는 항체 또는 기타 결합 파트너와 같은 특이적인 결합 멤버에 결합된 자성적으로 반응성인 물질을 포함한다. 이 분야에는 자성 분리방법에 사용되는 자성적으로 반응성인 많은 물질들이 알려져 있다. 적절한 자성 입자에는 Molday의 미국특허 No. 4,452,773, 및 유럽 특허 명세서 EP 452342 B에 설명된 것들이 포함되며, 이들 문한은 본 발명에 참조 통합되었다. 그 밖의 예로는 예컨대 Owen의 미국특허 No. 4,795,698, 및 Liberti 등의 미국특허 No. 5,200,084에 설명된 콜로이드 크기의 입자를 들 수 있다.
[0139] 인큐베이션은 일반적으로 항체 또는 결합 파트너 또는 분자, 이러한 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하고 자성 입자 또는 비드에 결합된 예컨대 2차 항체 또는 기타 시약이 샘플 내 세포 상에 존재할 경우 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 그러한 조건 하에서 수행된다.
[0140] 일부 측면에서, 샘플은 자기장에 놓이며, 자성적으로 반응성인 세포 또는 그에 결합된 자화가능한 입자들이 자석에 이끌려 비표지 세포로부터 분리된다. 양성 선택의 경우, 자석에 유인되는 세포들이 유지된다; 음성 선택의 경우, 유인되지 않는 세포(비표지 세포)가 유지된다. 일부 측면에서, 동일한 선택 단계 동안 양성 및 음성 선택의 조합을 수행하여, 양성 및 음성 분획을 유지하여 추가 분리 단계로 처리하거나 또는 추가 프로세싱한다.
[0141] 특정 구현예에서, 자성적으로 반응성인 입자들은 일차 항체 또는 기타 결합 파트너, 이차 항체, 렉틴, 효소, 또는 스트렙트아비딘에서 코팅된다. 특정 구현예에서, 자성 입자들은 하나 이상의 마커에 특이적인 일차 항체의 코팅을 통해 세포에 결합된다. 특정 구현예에서는 비드가 아닌 세포가 일차 항체 또는 결합 파트너로 표지된 다음, 세포-유형 특이적인 이차 항체-또는 기타 결합 파트너(예컨대, 스트렙트아비딘)-코팅된 자성 입자가 첨가된다. 특정 구현예에서, 스트렙트아비딘-코팅된 자성 입자들은 바이오티닐화된 일차 또는 이차 항체와 연계적으로 사용된다.
[0142] 일부 구현예에서, 자성적으로 반응성인 입자들은 후속적으로 인큐베이션, 배양 및/또는 조작될 세포에 부착된 채로 방치된다; 일부 측면에서, 이들 입자들은 환자에 대한 투여를 위해 세포에 부착된 채로 방치된다. 일부 구현예에서, 자화가능한 또는 자성적으로 반응성인 입자들이 세포로부터 제거된다. 세포로부터 자화가능한 입자를 제거하는 방법은 공지이며 여기에는 예컨대 경쟁적 비-표지 항체의 사용, 자화가능한 입자 또는 절단가능한 링커에 컨쥬게이션된 항체의 사용, 등이 포함된다. 일부 구현예에서, 자화가능한 입자들은 생분해성이다.
[0143] 일부 구현예에서, 친화성-기반 선택은 자기-활성화 세포 소팅(MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA)을 경유한다. 자기 활성화 세포 소팅(MACS) 시스템은 그에 결합된 자화된 입자들을 갖는 세포의 고순도 선택이 가능하다. 특정 구현예에서, MACS은 비표적 종 또는 표적 종이 외부 자기장 인가 후에 순차적으로 용리되는 방식으로 작동한다. 즉, 자화된 입자에 부착된 세포들은 그 자리에 유지되는 반면 부착되지 않은 종들은 용리된다. 이어서, 이 1차 용리 단계가 종결된 후, 자기장에 포획된 종들 및 용리되지 않은 종들이 용리 및 회수가능한 일부 방식으로 방출된다. 특정 구현예에서, 비-표적 세포가 표지되어 이질적인 세포 집단으로부터 고갈된다.
[0144] 특정 구현예에서, 본 발명 방법의 단리 또는 분리는 단리, 세포 준비, 분리, 가공, 인큐베이션, 배양 및/또는 제형화 단계 중 하나 이상을 수행하는 시스템, 기기 또는 장치를 이용하여 수행된다. 일부 측면에서, 예컨대 실수, 사용자 핸들링 및/또는 오염을 최소화하기 위해, 밀폐 또는 멸균 환경에서 이들 단계들을 각각 수행하기 위한 시스템이 이용된다. 일례에서, 시스템은 국제특허출원, 공개번호 WO2009/072003, 또는 US 20110003380 A1에 설명된 시스템이다. 일례에서, 시스템은 국제공개번호 WO2016/073602에 설명된 시스템이다.
[0145] 일부 구현예에서, 상기 방법은 예컨대 원심 회전 하에 원심 챔버의 내부 공동에서 선택 단계의 전부 또는 일부를 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 예컨대 면역친화성-기반 선택 시약과 같은 선택 시약과 함께 세포를 인큐베이션하는 것은 원심 챔버에서 수행된다.
[0146] 예를 들어, 면역친화성-기반 선택은 분리되는 세포와 상기 세포 상의 마커에 특이적으로 결합하는 분자, 예컨대 항체 또는 입자와 같은 고체 표면 상의 결합 파트너 간의 호의적인(favorable) 에너지발생 상호반응에 의존할 수 있다. 비드와 같은 입자들을 이용하는 친화성-기반 분리에 이용가능한 어떤 방법들에서, 입자와 세포는 튜브 또는 백과 같은 컨테이너에서 인큐베이션되며, 이 동안 에너지 발생에 유리한 상호반응을 촉진을 돕는 일정한 세포 밀도-대 입자(예컨대 비드)의 비율로 혼합 또는 진탕이 이루어진다. 이러한 접근법은 대규모 생산에 사용되기에 이상적인데, 이는 이들이 목적하는 세포 갯수를 유지하면서 최적의 또는 목적하는 세포-대-입자 비율을 유지하기 위해 큰 부피의 사용을 필요로 할 수 있기 때문이다. 따라서, 이러한 접근법은 증가된 시간, 단계수 및 조작횟수를 필요로 하고, 경비 및 사용차의 실수 위험성 역시 증가시킬 수 있는 뱃치 방식 또는 포맷으로 프로세싱할 것을 요구하는 것일 수 있다.
[0147] 일부 구현예에서, 원심 챔버의 공동 내에서 이러한 선택 단계 또는 그의 일부(예컨대 자성 비드와 같은 항체-코팅된 입자와 함께 인큐베이션하는 것)를 수행함으로써, 사용자는 다양한 용액의 부피, 프로세싱 동안 용액의 첨가 및 그에 소요되는 시간 등 기존의 다른 방법에 비해 장점을 제공하는 것을 수 있는 특정 변수들을 제어할 수 있다. 예컨대, 인큐베이션 동안 공동 내 액체 부피를 감소시킬 수 있는 능력은 션별에 이용되는 입자(예컨대 비드 시약)의 농도를 증가시킬 수 있고, 따라서, 공동 내 세포의 총 갯수에 영향을 미침이 없이 용액의 화학적 강도를 증가시킬 수 있다. 이것은 다시 프로세싱되는 세포와 선택에 이용되느 입자 사이의 쌍을 이루는 상호반응을 향상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 예컨대 전술한 시스템, 전기회로망 및 제어기술이 연계된 챔버 내에서 인큐베이션 단계를 수행함으로써, 사용자는 인큐베이션 동안 목적하는 기간(들) 동안 용액을 교반할 수 있고, 이에 의해 상호반응 역시도 향상될 수 있다.
[0148] 일부 구현예에서, 선택 단계의 적어도 일부는 원심 챔버 내에서 수행되며, 이것은 세포를 선택 시약과 함께 인큐베이션하는 것을 포함한다. 이러한 프로세스의 일부 측면에서는, 일정 부피의 세포를, 제조자 지침에 따라 동일한 세포 갯수 및/또는 세포 부피를 선택하기 위한 튜브나 컨테이너에서 유사한 선택단계를 수행할 때 일반적으로 사용되는 것보다 훨씬 적은 양의, 목적하는 친화성-기반 선택 시약과 혼합한다. 일부 구현예에서, 선택 시약 또는 시약들은, 튜브 또는 컨테이너-기반 인큐베이션시 제조자 지침에 따라 동일한 세포 갯수 및/또는 세포 부피를 선택하는데 사용되는 것과 동일한 선택 시약(들)의 양의 5% 이하, 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 50% 이하, 60% 이하, 70% 이하 또는 80% 이하의 양으로 사용된다.
[0149] 예컨대 챔버 공동에서 수행될 수 있는 선택 방법의 일부로서 선택 시약 또는 시약들과 인큐베이션하는 것은, 하나 이상의 특정 분자, 예컨대 표면 마커, 예컨대 표면 단백질, 세포내 마커 또는 핵산이 세포내 또는 세포 상에서 발현 또는 존재하는 것에 기초하여 하나 이상의 상이한 세포 종류를 선택하기 위하여 1종 이상의 선택 시약을 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 마커에 기반한 분리를 위한 선택 시약 또는 시약들을 이용하는 공지 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 시약 또는 시약들은 친화성-또는 면역친화성-기반 분리인 분리를 일으킨다. 예컨대, 일부 측면에서 선택은 하나 이상의 마커, 전형적으로 세포 표면 마커의 세포 발현 또는 발현 수준에 기초하여, 그러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와 인큐베이션한 다음, 일반적으로 상기 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포들로부터, 항체 또는 결합 파트너에 결합된 세포를 세척 및 분리함으로써, 세포 또는 세포 집단의 분리를 위한 시약 또는 시약과 함께 인큐베이션하는 것을 포함한다.
[0150] 일부 구현예에서, 선택을 위해, 예컨대, 세포의 면역친화성-기반 선택을 위해, 농축 및/또는 고갈시키고자 하는 세포 상의 표면 마커에 특이적으로 결합하지만, 예컨대 스캐폴드 예컨대 폴리머 또는 표면 예컨대 비드 예컨대 자성 비드 예컨대 CD4 및 CD8에 특이적인 모노클로날 항체에 커플링된 자성 비드와 같은, 조성물 내 다른 세포 상의 마커에는 특이적으로 결합하지 않는 분자와 같은 선택 시약과 함께 선택 완충액 역시도 함유하는 조성물에서 챔버의 공동에서 세포를 인큐베이션한다.　 전술한 바와 같은 일부 구현예에서, 선택 시약은 챔버의 공동 내의 세포에, 진탕 또는 회전하면서 튜브 내 선택을 수행하는 경우 동일한 세포 갯수 또는 동일한 세포 부피를 선택하데 드는 것과 동일 또는 유사한 효율을 달성하는데 일반적으로 이용되거나 필요한, 선택 시약의 양보다 실질적으로 더 적은 양 (예컨대 그 양의 5% 이하, 10% 이하, 20% 이하, 30% 이하, 40% 이하, 50% 이하, 60% 이하, 70% 이하 또는 80% 이하의 양)으로 챔버의 공동 내의 세포에, 첨가된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 예컨대 적어도 또는 약 적어도 또는 약 또는 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 150 mL 또는 200 mL의 양의 표적 부피량의 시약을 달성하기 위해 세포에 선택 완충액 및 선택 시약을 첨가하는 것에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 완충액 및 선택 시약은 세포에 첨가되기 전에 예비-혼합된다. 일부 구현예에서, 선택 완충액 및 선택 시약은 세포에 별도로 첨가된다. 일부 구현예에서, 선택 인큐베이션은 주기적으로 약하게 혼합하는 조건과 함께 수행되는데, 이러한 조건은 에너지발생에 유리한 상호반응을 촉진할 수 있으므로 고선택 효율을 달성하면서도, 전체적인 선택 시약의 양을 덜 사용할 수 있게 해준다.
[0151] 일부 구현예에서, 선택 시약과의 총 인큐베이션 기간은 약 5분 내지 6시간, 예컨대 30분 내지 3시간, 예컨대, 적어도 또는 약 적어도 30분, 60분, 120분 또는 180분이다.
[0152] 일부 구현예에서, 인큐베이션은 일반적으로 혼합 조건 하에, 예컨대 약 600 rpm 내지 1700 rpm (예컨대 적어도 600 rpm, 1000 rpm, 또는 1500 rpm 또는 1700 rpm), 예컨대 샘플 또는 챔버 벽 또는 기타 컨테이너 벽에서의 RCF가 약 80g 내지 100g (예컨대 약 또는 적어도 80 g, 85 g, 90 g, 95 g, 또는 100 g)인 조건과 같이, 세포 펠렛에 사용되는 것보다 낮은 속도와 같은 상대적으로 낮은 힘 또는 속도에서 이루어지는 스피닝 존재 하에, 수행된다. 일부 구현예에서, 스핀은 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 초 동안 스핀 및/또는 휴지를 수행하는 것, 예컨대 약 1초 또는 2초간 스핀한 다음 약 5, 6, 7, 또는 8초 동안 휴지하는 방식으로, 저속 스핀 후 휴지 기간의 반복 실시 간격을 이용하여 수행된다.
[0153] 일부 구현예에서, 이러한 프로세스는 챔버가 불가분하게 통합된 전체적으로 밀폐된 시스템 내에서 수행된다. 일부 구현예에서, 이 프로세스 (및 면면 측면에서 성분채집술 샘플과 같은 세포를 함유하는 샘플을 세척하는 이전의 세척 단계와 같은 하나 이상의 부가적인 단계를 포함)는 자동화 방식으로 수행되며, 이에 따라 세포, 시약 및 기타 성분들이 적절한 시간 및 원심분리 하에 챔버 내로 견인 및 유출되어, 자동화 프로그램을 이용하여 단일의 밀폐 시스템에서 세척과 결합 단계를 완결지을 수 있다.
[0154] 일부 구현예에서, 인큐베이션 및/또는 세포와 선택 시약 및/또는 시약들의 혼합 후, 인큐베이션된 세포들을 특정 시약 또는 시약들의 존재 또는 부재에 기초하여 세포를 선택하기 위한 분리 단계를 거치게 한다. 일부 구현예에서, 추가 선택은 원심 챔버 외부에서 수행된다. 일부 구현예에서, 분리는 원심 챔버가 존재하고 세포와 선택 시약과의 인큐베이션이 수행되었던 것과 동일한 밀폐 시스템에서 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 시약과의 인큐베이션 후, 선택 시약과 결합된 세포를 비롯한 인큐베이션된 세포들은 원심 챔버로부터 표출, 예컨대 원심 챔버로부터 세포의 면역친화성-기반 분리를 위한 시스템 내로 전달된다. 일부 구현예에서, 면역친화성-기반 분리를 위한 시스템은 자성 분리 컬럼이거나 또는 이것을 포함한다. 일부 구현예에서, 분리에 앞서, 세척과 같은 하나 이상의 프로세싱 단계를 챔버 내에서 수행할 수 있다.
[0155] 예컨대 밀폐 및 멸균 시스템에서 임상-규모 수준으로 세포를 자동화 분리하기 위해, 일부 측면에서, 분리 및/또는 기타 단계들은 CliniMACS 시스템(Miltenyi Biotic)을 이용하여 수행된다. 부품으로는 일체형 마이크로컴퓨터, 자성 분리 유닛, 연동 펌프, 다양한 핀치 밸브를 들 수 있다. 일부 측면에서 일체형 컴퓨터는 장비의 모든 부품들을 제어하여 시스템으로 하여금 표준화된 시퀀스로 공정을 반복 수행하게 할 수 있다. 일부 측면에서 자성 분리 유닛은 이동가능한 영구자석 및 선택 컬럼용 홀더를 포함한다. 연동 펌프는 튜빙 세트를 통해 유속을 조절하고 핀치 밸브와 함께 시스템을 통한 완충액의 흐름과 세포의 지속적인 현탁을 통제한다.
[0156] 일부 구현예에서, 자동화 분리, 예컨대 일부 측면에서 CliniMACS 시스템을 이용한 분리는 멸균된 비발열성 용액에 공급되는 항체-커플링된 자화가능한 입자를 이용한다. 일부 구현예에서, 세포를 자성 입자로 표지한 후 세포들을 세척하여 과량의 입자를 제거한다. 이어서 세포 제조 백을 튜빙 세트에 연결한 다음 이것을 완충액을 함유하는 백과 세포 수집 백에 연결한다. 튜빙 세트는 예비-컬럼 및 분리 컬럼을 비롯하여, 미리-조립된 멸균 튜빙으로 구성되며, 1회 사용만을 염두에 둔 것이다. 분리 프로그램 개시 후, 시스템은 세포 샘플을 분리 컬럼에 자동적으로 적용한다. 표지된 세포들은 컬럼 내에 유지되는 한편, 비표지 세포들은 일련의 세척 단계로부터 제거된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용되기 위한 세포 집단은 표지되지 않으며 컬럼에 유지되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용되기 위한 세포 집단은 표지되며 컬럼 내에 유지된다. 일부 구현예에서, 본 발명에 설명된 방법에 사용되기 위한 세포 집단은 자기장 제거 후 컬럼으로부터 용리되어, 세포 수집 백에 수집된다.
[0157] 특정 구현예에서, 분리 및/또는 기타 단계들은 CliniMACS Prodigy 시스템 (Miltenyi Biotec)을 이용하여 수행된다. CliniMACS Prodigy 시스템에는 일부 측면에서 자동화 세척 및 원심분리에 의한 세포의 분획화를 가능케 해주는 세포 가공 유닛이 구비되어 있다. CliniMACS Prodigy 시스템은 또한 소스 세포 산물의 현거시적인 층을 알아차림으로써 최적 분획화 종말점을 탐지하는 온보드 카메라 및 이미지 인식 소프트웨어를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 말초 혈액을 적혈구, 백혈구 및 혈장 층 내로 자동 분리한다. CliniMACS Prodigy 시스템은 또한 예컨대 세포 분화 및 성장, 항원 로딩 및 장기간 세포 배양 등의 세포 배양 프로토콜을 달성하는 일체형 세포 배양 챔버를 포함할 수도 있다. 인풋 포트는 배지의 멸균 제거 및 재보충을 가능케하며 일체형 현미경을 이용하여 세포를 모니터링할 수 있다. 예컨대, Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) 혈액.1:72-82, 및 Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701 참조.
[0158] 일부 구현예에서, 복수개의 세포 표면 마커에 대해 염색된 세포를 유동 스트림에서 처리하는, 유세포분석법을 통해 본 발명에서 설명된 세포 집단을 수집 및 농축 (또는 고갈)시킨다. 일부 구현예에서, 예비 스케일 (FACS)-소팅을 경유하여 본 발명에 설명된 세포 집단을 수집 및 농축한다. 특정 구현예에서는 FACS-기반 검출 시스템과 조합된 마이크로전기기계 시스템(MEMS)를 이용함으로써 본 발명에 설명된 세포 집단을 수집 및 농축시킨다 (참조: 예컨대, WO 2010/033140, Cho 외 (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; 및 Godin (2008) J Biophoton. 1(5):355-376). 양자 모두에 있어서, 세포를 복수개의 마커로 표지할 수 있으므로, 잘-장의된 T 세포 서브세트를 고순도로 단리해낼 수 있다.
[0159] 일부 구현예에서는, 양성 및/또는 음성 선택을 위한 분리를 용이화하기 위해 항체 또는 결합 파트너를 하나 이상의 검출 가능한 마커로 표지한다. 예컨대, 분리는 형광 표지된 항체에 대한 결합에 기초할 수 있다. 몇 가지 예에서, 1개 이상의 세포 표면 마커에 특이적인 항체 또는 기타 결합 파트너의 결합에 기초한 세포 분리를 유체 스트림에서, 예컨대, 예비 규모(FACS) 및/또는 미세전자기계 시스템(MEM) 칩을 비롯한, 형광-활성화 세포 소팅(FACS)에 의해, 유세포 검출 시스템과 조합하여 수행한다. 이러한 방법에 의해 복수 마커에 기초하여 양성 및 음성 선택을 동시에 수행할 수 있다.
[0160] 일부 구현예에서, 제공된 레트로바이러스 벡터 입자에 의한 형질도입 세포는 예를 들어, 단핵구, 단핵구-유래 대식세포, 단핵구-유래 수지상 세포 또는 휴지 T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 제공된 레트로바이러스 입자는 휴지 T 세포를 형질도입할 수 있다. 일부 구현예에서, 인풋 조성물은 비-사이클링 및/또는 휴면 및/또는 휴지 상태이거나 및/또는 그렇게 형질도입된 집단 내 대다수의 세포들, 예컨대 50%, 60%, 70%, 80%, 80% 이상의 세포들이 비-사이클링 및/또는 휴면 및/또는 휴지 상태인, 예컨대 T 세포 등 면역 세포와 같은 다수의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 인풋 조성물은 집단 내의 T 세포 중 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상이, 표면 마커 또는 세포내 사이토카인 또는 기타 마커 등 T 세포 활성화 마커를 결여하는 T 세포와 같은 휴지 T 세포이거나 및/또는 세포 주기의 G0 또는 G0G1a 단계에 있는 T 세포인, T 세포 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 비인산화(unphosphorylated) SAMHD1과 같은 활성 SAMHD1을 함유한다. 일부 구현예에서, 세포는 세포주기의 G0, G0/G1a 또는 G1 단계에 있다.
[0161] 일부 구현예에서, 상기 방법은 T 세포의 5%, 10%, 20%, 30% 또는 40% 이하가 T 세포 활성화 마커를 발현하는 T 세포의 형질도입을 수반한다. 일부 구현예에서, T 세포의 5%, 10%, 20%, 30% 또는 40%만이 하나 이상의 T 세포 활성화 마커 HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L (CD154) 및/또는 4-1BB (CD137)에 대해 표면 양성이다. 일부 구현예에서, 5%, 10%, 20%, 30% 또는 40% 이하의 T 세포가 IL-2, IFN-γ 및/또는 TNF-α 인 사이토카인의 세포내 발현을 갖는다.
B. 바이러스 벡터 입자
[0162] 일부 구현예에서, 바이러스 벡터 입자는 바이러스 벡터 게놈 내에 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 기타 항원 수용체 등의 재조합 및/또는 이종 수용체와 같은, 재조합 및/또는 이종 분자, 예컨대, 재조합 또는 이종 단백질을 인코딩하는 핵산을 함유하는, 렌티바이러스 입자와 같은 레트로바이러스 벡터 입자이다. 바이러스 벡터 입자의 게놈은 전형적으로 재조합 분자를 인코딩하는 핵산 이외의 서열을 포함한다. 이러한 서열은 게놈이 바이러스 입자 내로 패키징되도록 하는 서열 및/또는 CAR과 같은 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산의 발현을 촉진하는 서열을 포함할 수 있다.
1. 바이러스 벡터
[0163] 일부 구현예에서, 바이러스 벡터 입자는 렌티바이러스 게놈 기반 벡터로부터 유래된 것과 같은 레트로바이러스 게놈 기반 벡터로부터 유래된 게놈을 함유한다. 제공된 바이러스 벡터의 일부 측면에서, CAR과 같은 항원 수용체와 같은 재조합 수용체를 인코딩하는 이종 핵산은 벡터 게놈의 5'LTR 및 3'LTR 서열 사이에 포함되거나 및/또는 위치한다.
[0164] 일부 구현예에서, 바이러스 벡터 게놈은 HIV-1 게놈 또는 SIV 게놈과 같은 렌티바이러스 게놈이다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 여러 병독성 유전자들을 약화시킴으로서 제조되며, 예를 들어 env, vif, vpu 및 nef 유전자는 삭제 될 수 있으므로 벡터가 치료목적으로 보다 안전해진다. 렌티바이러스 벡터는 공지되어 있다. Naldini et al., (1996 and 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, 미국특허미국특허 제 6,013,516 호; 및 5,994,136). 일부 구현예에서, 이들 바이러스 벡터들은 플라스미드 또는 바이러스에 기반하고, 외래 핵산의 통합, 선택, 및 숙주 세포로의 핵산의 전달을 위한 필수 서열을 전달하도록 구성된다. 공지된 렌티바이러스는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 ("ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209)과 같은 기탁기관으로부터 쉽게 얻을 수 있으며 도는 상업적으로 구득가능한 기술에 의해 공지 공급원으로부터 분리될 수도 있다.
[0165] 렌티바이러스 벡터의 비제한적 예시는 렌티바이러스, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스 1 (HIV-1), HIV-2, 유인원 면역결핍 바이러스 (SIV), 인간 T-림프구 바이러스 1 (HTLV-1), HTLV-2 또는 말 감염 빈혈 바이러스 (E1AV)로부터 유래된 것들을 들 수 있다. 예컨대, 렌티바이러스 벡터는 HIV 독성 유전자 약독화를 반복함으로써 생성되었는데, 예컨대 유전자 env, vif, vpr, vpu 및 nef는 결실되어 상기 벡터를 치료 목적으로 더 안전하게 만든다. 렌티바이러스 벡터는 이 기술 분야에 알려져 있다 (Naldini et al., (1996 및 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, 미국특허 Nos. 6,013,516; 및 5,994,136 참조). 몇 가지 구현예에 있어서, 이들 바이러스 벡터는 플라스미드계 또는 바이러스계이고, 외래 핵산 혼입을 위하여, 선택을 위하여 및 핵산의 숙주 세포로의 전달을 위하여 필수적인 서열을 갖게끔 형성된다. 공지된 렌티바이러스는 American Type Culture Collection ("ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209)와 같은 기탁소 또는 컬렉션으로부터 쉽게 얻을 수 있거나, 통상 이용 가능한 기법을 이용하여 알려진 원으로부터 단리될 수 있다.
[0166] 일부 구현예에서, 바이러스 게놈 벡터는 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스의 5' 및 3' LTR 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 바이러스 게놈 구조물은 렌티바이러스의 5 '및 3' LTR로부터의 서열 및 렌티바이러스로부터의 불활성화된(inactivated) 또는 자체-불활성화(self-inactivating) 3' LTR 서열을 함유할 수 있다. LTR 서열은 임의의 종으로부터 임의의 렌티바이러스로부터의 LTR 서열일 수 있다. 예를 들어 이들은 HIV, SIV, FIV 또는 BIV의 LTR 서열일 수 있다. 일반적으로, LTR 서열은 HIV LTR 서열이다.
[0167] 일부 구현예에서, HIV 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터의 핵산은 추가적인 전사 단위를 결여한다. 벡터 게놈은 불활성화된(inactivated) 또는 자체-불활성화(self-inactivating) 3' LTR을 포함할 수 있다 (Zufferey t l.J Virol　72: 9873, 1998; Miyoshi et al.,　J Virol　72:8150, 1998). 예를 들어, 바이러스 벡터 RNA를 생성하는데 사용된 핵산의 3'LTR의 U3 영역에서의 결실은 자체-불활성화 (SIN) 벡터를 생성하는데 사용될 수 있다. 이 결실은 역전사 과정에서 프로바이러스 DNA의 5'LTR로 전달될 수 있다. 자체-불활성화 벡터는 일반적으로 벡터 통합 동안 5 'LTR로 카피되는 3' 긴 말단 반복체 (LTR:long terminal repeat)로부터의 인핸서 및 프로모터 서열의 결실을 갖는다. 일부 구현예에서, LTR의 전사 활성을 소멸시키기 위한 TATA 박스의 제거를 포함하는 충분한 서열이 제거될 수 있다. 이것은 형질도입된 세포에서 전장 벡터 RNA의 생산을 막을 수 있다. 일부 측면에서, 3'LTR의 U3 요소는 그의 인핸서 서열, TATA 박스, Sp1 및 NF-κB 부위의 결실을 함유한다. 자체-불활성화 3'LTR의 결과로서, 진입 및 역전사 후에 생성된 프로 바이러스는 불활성화된 5'LTR을 함유한다. 이것은 벡터 게놈의 동원 위험과 근처 세포 프로모터에 대한 LTR의 영향을 줄임으로써 안전성을 향상시킬 수 있다. 자체-불활성화 3'LTR은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 이것은 벡터 역가 또는 벡터의 시험관내 또는 생체내 특성에 영향을 미치지 않는다.
[0168] 선택적으로, 렌티바이러스 5'LTR로부터의 U3 서열은 이종 프로모터 서열과 같은 바이러스 구조물 내의 프로모터 서열로 대체될 수 있다. 이것은 패키징 세포주에서 회수된 바이러스의 역가를 증가시킬 수 있다. 인핸서 서열 역시도 포함될 수 있다. 패키징 세포주에서 바이러스 RNA 게놈의 발현을 증가시키는 임의의 인핸서/프로모터 조합이 사용될 수 있다. 일례로, CMV 인핸서/프로모터 서열이 사용된다 (미국특허 제 5,385,839호 및 미국특허 제5,168,062호).
[0169] 특정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 게놈과 같은 레트로바이러스 벡터 게놈을 통합 결함되게 구성함으로써 삽입 돌연변이 유발의 위험이 최소화될 수 있다. 비-통합성 벡터 게놈을 생산하기 위해 다양한 접근법을 추구할 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이(들)는 비활성 유전자를 갖는 단백질을 인코딩하도록 pol 유전자의 인테그라 아제 효소 성분으로 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터 게놈 그 자체는 예를 들어, 부착 부위 중 하나 또는 둘 모두를 돌연변이 시키거나 결실시키거나 또는 결실 또는 변형을 통해 3'LTR-근위 폴리펩틴 트랙트 (PPT)을 비 기능성으로 만드는 것에 의해 통합을 방지하도록 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 비-유전적 접근법이 이용가능하다; 이들은 인테그라제의 하나 이상의 기능을 억제하는 약리학적 제제를 포함한다. 접근법은 상호배타적이지 않다: 즉, 한 번에 두 가지 이상을 사용할 수 있다. 예를 들어 인테그라제와 부착 부위는 두 가지 모두 비-기능성일 수 있고, 또는 인터그라제와 PPT 부위는 비-기능성이거나 또는 부착 부위와 PPT 부위가 비-기능성일 수 있고, 또는 이들 모두가 비-기능성일 수 있다. 이러한 방법 및 바이러스 벡터 게놈은 공지되어 있고 입수가능하다 (참조: Philpott 및 Thrasher,　Human Gene Therapy　18:483, 2007; Engelman et al. J Virol 69:2729, 1995; Brown et al　J Virol　73:9011 (1999); WO 2009/076524; McWilliams et al.,　J Virol　77:11150, 2003; Powell 및 Levin　J Virol　70:5288, 1996).
[0170] 일부 구현예에서, 벡터는 원핵 숙주 세포와 같은 숙주 세포에서의 증식을 위한 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 핵산은 박테리아 세포와 같은 원핵 세포에서의 증식을위한 하나 이상의 복제 기점을 함유한다. 일부 구현예에서, 원핵 생물 복제 원점을 포함하는 벡터는 또한 그의 발현이 약물 내성과 같은 검출 가능하거나 선택 가능한 마커를 부여하는 유전자를 함유할 수 있다.
2. SAMHD1-억제 액세서리 단백질
[0171] 제공되는 구현예 중에는 그의 비리온에 캡슐화된 SAMHD1-억제 액세서리 단백질을 함유하는 레트로바이러스 벡터 입자가 있다. 일부 측면에서, 이러한 입자는 비-사이클링 면역 세포, 예를 들어 휴지 T 세포와 같은 비-사이클링 세포의 효율적인 형질도입을 가능하게 한다. 일부 측면에서, 이러한 입자는 단핵구, 단핵구-유래된 대식세포 또는 단핵구-유래된 수지상 세포의 효율적인 형질도입을 가능하게 한다. 일부 측면에서, 제공된 레트로바이러스 벡터 입자는 세포의 활성화 및/또는 자극을 위한 것과 같은, 형질도입을 위한 세포의 생체외 조작에 대한 요구를 최소화 및/또는 감소시킨다.
[0172] SAMHD1은 dGTP-의존성 데옥시뉴클레오타이드 트리포스포하이드롤라제 활성을 가지며 세포성 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 (dNTPs)를 탈인산화시킬 수 있는 비-사이클링 및/또는 휴면 면역 세포에 존재하는 단백질이다. 인산화되지 않은 SAMHD1과 같은 항바이러스 활성을 갖는 세포에서 활성 SAMHD1의 존재는 뉴클레오타이드 풀을 감소시킬 수 있다. 이러한 감소는 바이러스 벡터가, 예컨대 바이러스 게놈과 같은 바이로스 RNA의 충분한 역전사를 용이하게 하는데 충분한 수의 뉴클레오타이드와 만나는 것을 방지함으로 해서, 그에 따라 레트로바이러스 형질도임을 제한할 수 있다. 어떤 경우에는 활성화된 또는 증식 T 세포와 같은 사이클링 세포가 SAMHD1을 발현할 수 있지만 SAMHD1의 항 바이러스 활성은 SAMHD1의 세포주기 의존성 인산화에 의해 규제되는 경우도있다 (Cribier et al. (2013) Cell Reports, 3 : 1036-1043). 예를 들어, 사이클링 세포에서, SAMHD1은 일반적으로 세포주기 관련 단백질과 상호 작용하고, 일부 측면에서는 사이클린 의존성 키나제1 (CDK1)에 의해 인산화된다. 인간 SAMHD1의 예시적인 서열은 SEQ ID NO: 19에 기재되어있다 (예를 들어, UniProt No. Q9Y3Z3 참조). 예를 들어, 일부 구현예에서, SAMHD1은 SEQ ID NO:19에 제시된 SAMHD1의 예시적인 서열의 T592 위치에 상응하는 위치에서 인산화될 수 있다. 인산화된 SAMHD1은 감소된 활성 및/또는 최소 활성을 가지므로, 사이클링 T 세포에서의 형질도입에 대한 바이러스 제한의 결핍을 설명한다.
[0173] 제공된 벡터 입자 및 방법의 일부 구현예에서, SAMHD1-억제 액세서리 단백질을 비리온에 혼입시킴으로써 SAMHD1은 제공된 레트로바이러스 벡터 입자에 의해 도입된 세포에서 분해되는 것과 같이 저해된다. 이것은 뉴클레오티드 풀을 증가시키고, 따라서 SAMHD1을 발현하는 휴면 및/또는 비-사이클링 세포에서 형질도입이 일어날 수 있게한다. 일부 구현예에서, 제공된 레트로바이러스 입자는 SAMHD1-억제 단백질을 함유하고, 비인산화 SAMHD1 단백질과 같은 활성 SAMHD1을 함유하는 세포를 형질도입할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 레트로바이러스 벡터 입자에 의한 형질도입은 SAMHD1이 SEQ ID NO: 19에 제시된 SAMHD1의 예시적인 서열에서 T592 위치에 상응하는 위치에서 인산화되지 않는 세포에서 발생한다. SAMHD1의 발현 및/또는 인산화를 평가하는 방법은 공지된 기술을 이용하여 평가될 수 있으며, 이러한 공지 기술의 예로는 포스-태그(Phos-tag) 아크릴아미드 기술 또는 다른 유사한 방법을 이용하는 SDS-PAGE 및/또는 포스페이트 친화성 SDS-PAGE의 SAMHD1-특이적 항체를 사용하는 웨스턴 블롯을 들 수 있다 (예 : Cribier et al. 참조).
[0174] 특정 구현예에서 그의 비리온에서 SAMHD1-억제 액세서리 단백질을 함유하도록 변형된 제공된 레트로바이러스 벡터 입자는 형질도입을 위한 숙주 뉴클레오타이드에 의존하는 임의의 바이러스 벡터이다. 그러한 바이러스 벡터 입자는 바이러스 역전사 효소에 의해 바이러스 RNA로부터 바이러스 cDNA를 합성하기 위해 세포 dNTP를 이용하는 레트로바이러스 벡터 입자, 예를 들어 렌티바이러스 또는 감마레트로바이러스 벡터 입자를 포함할 수 있다.
[0175] 일부 구현예에서, SAMHD1-억제 단백질은 SAMHD1-억제 활성을 나타내는 바이러스성 숙주 세포 단백질이다. 일부 구현예에서, SAMHD1-억제 단백질은 렌티바이러스 Vpx 또는 Vpr 단백질 또는 SAMHD1-억제 활성을 나타내는 그의 변이체 또는 일부와 같은 렌티바이러스 단백질이다. 서로 다른 렌티바이러스에서 발현되는 Vpx와 Vpr은 서열 및 구조적 상동성을 공유하며, 조립시 비리온 내로 패키징되는 비리온 관련 단백질이다. 세포에 도입되면, Vpx 및 일부 측면에서 Vpr은 CUL4A-DDB1-DCAF1 숙주 세포 단백질로부터 형성된 세포의 유비퀴틴 리가제 복합체에 의한 SAMHD1의 유비퀴틴화를 방해할 수 있고, 이에 따라 SAMHD1을 프로테오좀 분해를 목표로 한다 (Schwefel et al. (2014) Nature 505 : 234-238). 일부 구현예에서, Vpr 또는 Vpx 단백질에 의한 SAMHD1의 분해와 같은 억제는 유비퀴틴 리가제 복합체에서 SAMHD1 및/또는 DDB1 또는 DCAF1에 대한 Vpx 또는 Vpr 렌티바이러스 단백질의 결합에 의해 매개된다.
[0176] 일부 구현예에서, SAMHD1-억제 단백질은 SAMHD1에 특이적으로 결합하거나 및/또는 억제하는 항체 또는 그의 단편이다.
[0177] 일부 구현예에서, 제공된 레트로바이러스 벡터 입자는 바이러스 벡터 입자가 도입된 휴지 T 세포와 같은 숙주 세포에서 SAMHD1을 분해시키는 활성을 나타낸다. 일부 측면에서, SAMHD1은 레트로바이러스 벡터 입자가 도입되지 않은 동일한 세포에서의 SAMHD1의 발현 또는 수준에 비해 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 150배, 200배 또는 그 이상 분해될 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, SAMHD1의 분해는 SAMHD1-억제 단백질을 함유하는 제공된 레트로바이러스 벡터 입자를 휴지 T 세포와 같은 비-사이클링 숙주 세포내로 형질도입 또는 다른 형태로 전달한 후에 모니터링되거나 관찰될 수 있다. 분해는 레트로바이러스 벡터 입자가 도입되지 않은 동일한 세포에서 SAMHD1의 발현과 비교된, SAMHD1 발현의 상대적인 정도를 탐지함으로써 측정될 수 있다. 단백질의 발현 수준을 평가하기 위한 다수의 잘 알려진 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, SAMHD1은 SAMHD1-특이 항체를 사용하는 면역 블롯에 의해, 예를 들어 용균된 세포로부터의 샘플에서 검출될 수 있다. 발현의 범위 또는 수준은 또한 농도계와 같은 표준 절차에 의해 정량화(quantified) 및/또는 정량화(quantitated)될 수 있다. 일부 구현예에서, SAMHD1 수준 및/또는 발현은 경시적으로 모니터링될 수 있고 및/또는 바이러스 인풋을 변화시킴으로써 모니터링될 수 있다.
[0178] 일부 측면에서, Vpx 또는 Vpr 단백질과 같은 SAMHD1-억제 단백질을 함유하는 제공된 레트로바이러스 벡터 입자는 비-사이클링 및/또는 휴면 또는 휴지 면역 세포를, 그 벡터에 의해 인코딩된 유전자 조작된 분자, 예컨대 CAR과 같은 재조합 항원 수용체 및/또는 다른 재조합 수용체 예컨대 세포외 리간드-결합 또는 인식 도메인 및 ITAM 함유 및/또는 T 세포 공동 자극 도메인과 같은 T 세포에 대한 자극 신호를 강화시킬 수 있는 세포내 신호전달 도메인 또는 도메인들의 형질도입 및 도입에 대해 보다 민감하게 만든다. 일부 구현예에서, CAR과 같은 재조합 항원 수용체 및/또는 다른 재조합 수용체와 같은 유전자 조작된 수용체를 단핵구-유래된 대식세포, 단핵구-유래된 수지상 세포 또는 휴지 T 세포로 형질도입 및/또는 도입하기 위해, Vpx 단백질 또는 Vpr 단백질과 같은 SAMHD1-억제 단백질을 함유하는 제공된 레트로바이러스 벡터 입자를 사용하는 방법이 제공된다.
[0179] 일부 구현예에서, SAMHD1 억제제는 Vpx 단백질, Vpr 단백질 또는 SAMHD1-억제 활성을 나타내는 Vpx 또는 Vpr 단백질의 기능적 변이체 또는 일부분이다. 일부 실시 형태에 있어서, Vpx는 영장류 렌티바이러스에서 발견되는 112 아미노산 (aa), 18 kDa 단백질이다. SIV와 HIV-2의 Vpx는 아미노산 수준에서 83% 동일하며 (Goujon et al., J Virol, 82 : 12335-12345 (2008)), SAMHD1에 결합 및 분해되는 활성을 나타낸다 (Laguette et al., Nature, 474 : 654-657 (2011). Vpx는 일부 렌티바이러스에만 존재하며; HIV-1에서는 발견되지 않는다. Vpx와 높은 수준의 구조적 및 서열 상동성을 공유하는 밀접한 관련 유전자 Vpr은 모든 영장류 렌티바이러스에 의해 인코딩되며, 일부 경우에는, SAMHD1 활성도 나타내도록 진화했다. Vpx와 Vpr은 양자 모두 p55gag 전구체의 p6 영역과의 상호 작용을 통해 비리온에 패키징된다.
[0180] 제공된 입자, 조성물 및 방법에서, SAMHD1-억제 활성을 나타내는 임의의 적합한 Vpx 및/또는 Vpr 단백질을 사용할 수 있다. 어떤 단백질이 세포에서 SAMHD1을 분해하는 것과 같이 억제할 수 있으면 그 단백질은 SAMHD1-억제 활성을 나타내는 것이다. 일부 경우, 기술분야에 공지 또는 설명된 방법을 이용하는 등, 그러한 단백질을 함유하지 않는 바이러스 벡터와 비교하여 그러한 단백질을 함유하는 바이러스 벡터 입자의 도입 후, 휴지 T 세포와 같은 비-사이클링 세포에서의 SAMHD1 분해를 평가함으로써 억제를 모니터할 수 있다. 일부 구현예에서, Vpx, Vpr 및 이의 변이체는 하나 이상의 다양한 공지 방법에 따라 SAMHD1의 활성을 저해하는 능력에 대해 시험한다. Lim et al., Cell Host & Microbe, 11, 194-204 (2012) 및 Lahouassa et al., Nature Immunol, 13 : 3, 223-229 (2012) 참조. 일부 경우에서, 당업계에 공지된 방법 또는 기술된 방법을 이용하여, 필적가능하거나 동일하지만 Vpx 또는 Vpr 단백질을 함유하지 않는 바이러스 벡터와 비교하여, 그러한 단백질을 함유하는 바이러스 벡터 입자를 도입한 후, 휴지 T 세포와 같은 비-사이클링 세포에서의 형질도입 효율을 평가함으로써 억제를 모니터 할 수 있다.
[0181] 일부 구현예에서, Vpx 및/또는 Vpr 또는 변이체 또는 부분이 비리온으로의 패키징 및 혼입을 위해 제공된다. 일부 구현예에서, Vpx 단백질, Vpr 단백질 또는 Vpx 또는 Vpr 단백질의 변이체 또는 부분을 인코딩하는 유전자는 렌티바이러스 게놈 상에 포함되며, 바이러스 입자가 표적 세포를 감염시킬 때 발현된다.
[0182] 일부 구현예에서, SAMHD1-억제 단백질은 야생형 렌티바이러스, 예를 들어 야생형 영장류 렌티바이러스에 의해 인코딩되거나 또는 SAMHD1-억제 활성을 나타내는 그의 변이체 또는 일부인 Vpx 단백질이다 (참조: 예컨대 Fregoso (2013) PLoS Pathogens, 9:e1003496). Vpx를 인코딩하는 영장류 렌티바이러스로는 HIV-2/SIVsmc-관련 및 SIVrcm/SIVmnd2-관련 계통 바이러스 (Lim et al. (2012) 세포 숙주 & Microbe, 11:194-204), 예컨대 HIV-2, SIV 수티 망가베이 원숭이 (SIVsm), SIV 붉은 모자 망가베이 원숭이 (SIVrcm), 및 SIV 마카크 원숭이 (SIVmac), SIV 맨드릴 원숭이 (SIVmnd2), SIV 드릴 원숭이 (SIVdrl), SIV 돼지꼬리 마카크 원숭이 (SIVmne)을 들 수 있다.
[0183] 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자와 같은 레트로바이러스 벡터 입자는 HIV-2, SIVsm, SIVrcm, SIVmac, SIVmnd2, SIVdrl, SIVmne에 의해 인코딩되는 야생형 Vpx 단백질을 함유하거나, SAMHD1-억제 활성을 나타내는 변이체 또는 그의 일부이다. 일부 실시 형태에서, Vpx 단백질은 SEQ ID NO: 1(SIVmac Vpx)과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 그러한 단백질의 기능적 단편 또는 일부이다. 일부 구현예에서, Vpx 단백질은 SEQ ID NO: 2 (SIVsm Vpx)과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 그러한 단백질의 기능적 단편 또는 일부이다. 일부 구현예에서, Vpx 단백질은 SEQ ID NO: 3 (SIVrcm Vpx)과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 그러한 단백질의 기능적 단편 또는 일부이다. 일부 구현예에서, Vpx 단백질은 SEQ ID NO: 4 (HIV-2)와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 그러한 단백질의 기능적 단편 또는 일부이다. 일부 구현예에서, Vpx 단백질은 SEQ ID NO: 16 (SIVmnd2)과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 그러한 단백질의 기능적 단편 또는 일부이다. 일부 구현예에서, Vpx 단백질은 SEQ ID NO: 17 (SIVdrl)과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 그러한 단백질의 기능적 단편 또는 일부이다. 일부 구현예에서, Vpx 단백질은 SEQ ID NO: 18 (SIVmne)과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 그러한 단백질의 기능적 단편 또는 일부이다.
[0184] 일부 구현예에서, SAMHD1-억제 단백질은 SAMHD1-억제 활성을 나타내는 Vpr 단백질이다. Vpr은 일반적으로 천연 렌티바이러스에 의해 인코딩된다. 모든 Vpr 단백질이 SAMHD1 저해 활성을 나타내는 것은 아니다. 예를 들어, SIVdeb, SIVmus, SIVagm, SIVden, SIVtal, SIVgsn, SIVmon 및 SIVsyk로부터의 Vpr은 SAMHD1-억제 활성을 나타내는 것으로 보고되었다 (Lim 등 (2012) Cell Host & Microbe, 11:194-204).
[0185] 일부 구현예에서, SAMHD1-억제 단백질은 SIVdeb Vpr, SIVmus Vpr, SIVagm Vpr, SIVden Vpr, SIVtal Vpr, SIVgsn Vpr, SIVmon Vpr 또는 SIVsyk Vpr이거나, 또는 SAMHD1-억제 활성을 나타내는 그의 변이체 또는 일부분이다. 일부 구현예에서, Vpr 단백질은 SEQ ID NO: 5 (SIVdeb)와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 그의 기능적 단편 또는 그 일부이다. 일부 구현예에서, Vpr 단백질은 SEQ ID NO: 6 (SIVmus)과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 그의 기능적 단편 또는 그 일부이다. 일부 구현예에서, Vpr 단백질은 SEQ ID NO: 7 (SIVagm Vpr)과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 그의 기능적 단편 또는 그 일부이다. 일부 구현예에서, Vpr 단백질은 SEQ ID NO: 8 (SIVagm Vpr)과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 그의 기능적 단편 또는 그 일부이다. 일부 구현예에서, Vpr 단백질은 SEQ ID NO: 9 (SIVdeb Vpr)와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 그의 기능적 단편 또는 그 일부이다. 일부 구현예에서, Vpr 단백질은 SEQ ID NO: 10 (SIVden Vpr)과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 그의 기능적 단편 또는 그 일부이다. 일부 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO: 11 (SIVtal Vpr)과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 그의 기능적 단편 또는 그 일부이다. 일부 구현예에서, Vpr 단백질은 SEQ ID NO: 12 (SIVgsn Vpr)와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 그의 기능적 단편 또는 그 일부이다. 일부 구현예에서, Vpr 단백질은 SEQ ID NO: 13 (SIVgsn Vpr)과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 그의 기능적 단편 또는 그 일부이다. 일부 구현예에서, Vpr 단백질은 SEQ ID NO: 14 (SIVmon Vpr)와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 그의 기능적 단편 또는 그 일부이다. 일부 구현예에서, Vpr 단백질은 SEQ ID NO: 15 (SIVsyk Vpr)와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 그의 기능적 단편 또는 그 일부이다.
[0186] 일부 구현예에서, Vpx 또는 Vpr 단백질과 같은 SAMHD1-억제 단백질은 바이러스에 이종이다. 문맥 상 이종(herologous)이라 함은, 그 단백질이 혼입되는 바이러스 패밀리, 클래스 또는 종과는 다른 바이러스 패밀리, 클래스 또는 종으로부터 그 단백질이 유래됨을 의미한다. 예를 들어, 일부 측면에서, SIVmac로부터의 Vpx 단백질은 HIV-1 벡터 입자 내로 혼입 될 수 있다. 다른 측면에서, 예컨대 SIVmac와 같은 임의의 렌티바이러스로부터의 Vpx 단백질은 MLV와 같은 감마레트로바이러스에 혼입될 수 있다.
[0187] 일부 구현예에서, Vpx 또는 Vpr 단백질과 같은 SAMHD1-억제 단백질은 예컨대 SEQ ID NO:19에 제시된, 인간 SAMHD1을 저해, 예를 들어, 분해한다 (Lim et al. (2012) Cell Host & Microbe, 11:194-204). 일부 구현예에서, 인간 SAMHD1을 분해하는 Vpx 단백질은 HIV-2 또는 SIVmac에 의해 인코딩되거나 또는 인간 SAMHD1을 분해하는 그의 변이체 또는 기능적 단편 또는 그 일부이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, Vpx 단백질은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO:4와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 인간 SAMHD1을 분해하는 그의 기능적 단편 또는 일부분이다. 일부 구현예에서, 인간 SAMHD1를 분해하는 Vpr 단백질은 SIVdeb 또는 SIVmus에 의해 인코딩될 수 있거나 또는 인간 SAMHD1를 분해하는 그의 변이체 또는 기능적 단편 또는 일부분이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, Vpr 단백질은 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO:6와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 인간 SAMHD1을 분해하는 그의 기능적 단편 또는 일부분이다.
[0188] 일부 구현예에서, 변이체는 야생형 또는 레퍼런스 Vpx 또는 Vpr 단백질의 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 결실, 삽입 및/또는 치환을 함유하는 단백질을 포함한다. 일부 경우에서, 변이체는 비보존적 또는 보존적 치환을 포함한다. 일부 경우에서, Vpx 단백질 및/또는 Vpr 단백질의 서열 정렬로부터 얻은 정보는 Vpx 또는 Vpr의 기능적 변이체 및 기능적 단편 변이체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 치환이 Vpx 또는 Vpr 단백질을 인코딩하는 바이러스들 간의 상이한 위치에 도입될 수 있다.
[0189] 예를 들어, 일부 구현예에서, SIV 및 HIV-2에 의해 인코딩되는 Vpx 단백질들 간에 동일성을 공유하는 잔기들은 본원에서 제공된 Vpx 단백질의 변이체에서 변동 또는 변화되지 않는다. 예를 들어, 다음 돌연변이들은 Vpx 활성을 감소 또는 소멸시키는 것으로 나타났다: 프롤린이 풍부한 C-말단 11 잔기, Ser13Ala, Lys84Ala/Lys85Ala, Thr17Ala, Thr28Ala, Gly86Ala/Cys87Ala, Ser13Ala/Thr17Ala/Thr28Ala, His39Ala, Tyr66Ala/Tyr69Ala/Tyr71Ala, Trp49Ala/Trp53Ala/Trp56Ala, Lys68Ala/Lys77Ala, Gln76Ala, Pro9Gly, Asn12Ala, Glu15Ala, Glu16Ala, Phe80Ala의 결실, 이들 각각에 대해 SEQ ID NO: 1에 제시된 잔기를 참조. (참조: Goujon et al., Gramberg et al. (2010) Journal of Virology, 84:1387-1396., Laguette et al. (2011)). 따라서, 일부 구현예에서, Vpx 단백질의 변이체는 활성을 필요로하는 것으로 나타난 SEQ ID NO: 1의 상기 잔기 중 임의의 것에 상응하는 잔기에서 치환을 함유하지 않는다. 일부 실시 형태에있어서, Vpx 단백질의 변이체는 SEQ ID NO: 1의 상기 잔기 중 임의의 것에 상응하는 잔기에서 보존적 치환을 포함하나 비보존적 치환은 포함하지 않는다.
[0190] 일부 구현예에서, Vpx 또는 Vpr 단백질의 변이체는 SAMHD1-억제 활성에 영향을 주지 않는 것으로 알려진 돌연변이를 포함할 수 있다 (Goujon 등, J Virol, 82 : 12335-12345 (2008) 참조). 예를 들어, 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 1의 Asn26Ala, Ser52Ala, 및 Ser63Ala/Ser65Ala 돌연변이 중 하나 이상에 상응하는 아미노산 치환과 같은 돌연변이는 Vpx 기능에 영향을 미치지 않는다.
[0191] 일부 구현예에서, SAMHD1의 억제 및/또는 분해는 Vpx 단백질, Vpr 단백질 또는 그의 변이체 또는 일부분과 같은 SAMHD1-억제 단백질의 핵 편재를 필요로 한다. Vpx는 SAMHD1과 Vpx 양자 모두가 핵에 국한되도록, 핵에서 SAMHD1 유비퀴틴화 및 분해를 유도한다. 따라서, 일부 구현예에서, Vpx 단백질, Vpr 단백질 또는 그의 변이체 또는 일부분은 핵 편재(localization) 신호를 함유한다. 일부 실시 형태에 있어서, Vpx 단백질 또는 그의 변이체 또는 그 일부분은 SEQ ID NO:4를 참조로 잔기 62-80 또는 65-72에 상응하는 핵 편재 신호를 함유한다.
[0192] 일부 구현예에서, SAMHD1의 억제 및/또는 분해는 DCAF와의 결합 및/또는 상호작용을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, Vpx 단백질, Vpr 단백질 또는 그의 변이체 또는 일부는 DCAF에 결합한다. 일부 구현예에서, Vpx 단백질, Vpr 단백질 또는 그의 변이체 또는 일부분은 Wx4Φx2Φx3AΦxH 모티프 (SEQ ID NO: 26에 제시됨; Wei et al. (2012) Cell Microbiol., 14:1745-56)를 함유한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, Vpx 단백질, Vpr 단백질 또는 그의 변이체 또는 일부분은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 4를 참조로 잔기 24-39에 상응하는 잔기에서 Wx4Φx2Φx3AΦxH 모티프를 함유한다. 일부 구현예에서, Vpx 단백질, Vpr 단백질 또는 이의 변이체 또는 일부분은 SEQ ID NO: 1의 위치 76에 상응하는 위치에 Gln(Q)을 함유한다.
[0193] 일부 구현예에서, Vpx 단백질, Vpr 단백질 또는 그의 변이체 또는 일부분은 단백질의 N-말단 부분, 헬릭스 1, 헬릭스 2 및/또는 헬릭스 3의 잔기에 상응하는 잔기를 함유한다 (Gramberg et al. (2010) Journal of Virology, 84:1387-1396). 예를 들어, 일부 구현예에서 Vpx 단백질, Vpr 단백질 또는 그의 변이체 또는 일부분은 SEQ ID NO:1에 제시된 아미노산 서열의 잔기 1-86에 상응하는 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 1의 잔기 1 내지 86과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 나타내고 SAMHD1-억제 활성을 나타내는, 그의 아미노산 치환된 변이체를 함유한다.
[0194] 일부 구현예에서, Vpx 또는 Vpr 단백질, 또는 그의 기능적 부분 또는 변이체는, 비리온으로 패키징되는데 이는, 상기 단백질로 하여금 프로바이러스 통합 전에 숙주 세포의 감염시 SAMHD1를 억제, 예컨대 분해하는 것을 허용한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 입자는 SAMHD1-억제 렌티바이러스 단백질의 레트로바이러스 벡터로의 패키징을 촉진시키는 Gag 단백질의 p6 도메인을 함유한다. Vpx 및 Vpr은 Gag 전구체 폴리 펩타이드 (p6gag)의 p6 영역의 아미노산 패키징 모티프와의 상호 작용을 통해 패키징된다. 일부 구현예에서, 내인성 바이러스 p6 Gag으로 충분한 혼입이 달성된다. 일부 구현예에서, 혼입은 패키징을 촉진하는 패키징 모티브를 함유하는 키메라 p6 Gag을 사용함으로써 발효되고 및/또는 증가된다.
[0195] 일부 구현예에서, 패키징 모티프는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 잔기 17 내지 23에 상응하는 아미노산을 포함하는 P6의 N 말단 영역의 모티프에 상응한다 (Accola et al. (1999) J. Virol ., 73 : 9992-9). 예를 들어, 일부 구현예에서 패키징 모티프는 류신-함유 모티프 DXAXXLL (SEQ ID NO: 22)을 포함한다.
[0196] 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 입자는 비리온 내로 Vpx 또는 Vpr 패키징을 매개 및/또는 촉진시키는 패키징 모티프의 도입에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 패키징 모티브는 내인성 바이러스 p6 영역의 상응하는 위치에 삽입된다. 일부 구현예에서, 패키징 모티프는 SEQ ID NO:21에 제시된 SIVmac p6의 아미노산 17 내지 23 또는 아미노산 17 내지 26에 각각 상응하는, 아미노산 서열 DPAVDLL (SEQ ID NO:23) 또는 DPAVDLLKNY (SEQ ID NO:24)을 포함한다. 일부 구현예에서, 패키징 모티프는 미국특허출원 공개 No. US2013/0183334에 설명된 임의의 패키징 모티프이다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 20에 제시된 HIV-1 p6의 상응하는 위치로의 모티프의 전사는 Vpx를 패키징하는 HIV-1 비리온을 초래한다..
[0197] 일부 구현예에서, Vpx 또는 Vpr 단백질 또는 그의 변이체 또는 일부는 Gag 단백질의 p6 영역의 변형 없이 패키징된다. 일부 이러한 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 HIV-1으로부터 유래되고, HIV-1 p6 Gag를 사용하여 충분한 혼입이 달성된다. 이러한 일부 구현예에서, SAMHD1-억제 단백질은 SIVmac Vpx이거나 SAMHD1-억제 활성을 나타내는 그의 변이체 또는 그 일부이다.
[0198] 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 HIV-1으로부터 유래하며, SIVmac p6 패키징 모티프가 삽입된 HIV-1 p6을 포함하는 키메라 또는 하이브리드 p6 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 연속적인 순서로, SEQ ID NO: 20에 제시된 HIV-P6의 아미노산 1 내지 14에 상응하는 아미노산 잔기, SEQ ID NO: 20의 잔기 17 내지 26으로서 제시된 SIVmac 패키징 모티프에 상응하는 아미노산, 및 SEQ ID NO:20의 아미노산 잔기 21 내지 52에 상응하는 HIV-1 p6의 C-말단 부분을 포함하는 키메라 또는 하이브리드 p6 도메인을 포함한다.(SIV 17-23b라 표시됨; US2013/0183334; Sunseri et al. (2011) J. Virol., 85:6263-6274 참조). 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 하이브리드 또는 키메라 p6 도메인은 SEQ ID NO:25에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
3. 이종 단백질을 인코딩하는 핵산
[0199] 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 이종 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산을 함유한다. 일부 구현예에서, 이종 재조합 분자는 재조합 수용체, 예를 들어, 항원 수용체, SB-트랜스포존, 예컨대 유전자 침묵, 캡시드에 봉입된 트랜스포존, 예컨대 게놈 재조합을 위한 상동성 이중 가닥 핵산, 또는 리포터 유전자 (예컨대 형광 단백질, 예컨대 GFP) 또는 루시페라제)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 이종 수용체 단백질과 같은 재조합 수용체 및/또는 키메라 수용체를 인코딩하는 핵산을 함유한다.
[0200] 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 이종 수용체 단백질과 같은 재조합 수용체 및/또는 키메라 수용체를 인코딩하는 핵산을 함유한다. 이종 수용체와 같은 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 비롯한 기능적 비-TCR 항원 수용체 및 트랜스 제닉 T 세포 수용체 (TCR)와 같은 다른 항원-결합 수용체와 같은 항원 수용체를 포함할 수 있다. 수용체는 또한 특정 리간드에 결합하고 CAR에 존재하는 것과 유사한 막관통 및/또는 세포내 신호전달 도메인을 갖는 수용체와 같은 다른 키메라 수용체와 같은 다른 수용체도 포함할 수 있다.
[0201] 그러한 예들 중 임의의 예에서, 핵산은 바이러스 벡터의 영역, 예를 들어 일반적으로 바이러스 게놈의 비필수 영역에 삽입되거나 위치한다. 일부 구현예에서, 핵산은 특정 바이러스 서열 대신에 바이러스 게놈에 삽입되어 복제 결함이있는 바이러스를 생산한다.
[0202] 일부 구현예에서, 인코딩된 재조합 항원 수용체, 예를 들어, CAR은 암, 감염성 질환, 염증성 또는자가면역 질환 또는 제공된 방법 및 조성물에 의해 표적화되는 본원에 설명된 것들을 비롯한 다른 질환 또는 병태와 같이 표적화될 질환 또는 세포 상의 하나 이상의 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 것이다.
[0203] 특정 구현예에서, 예시적인 항원은 αvβ6 인테그린 (avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원 (BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 무수화 효소 9 (CA9, 또한 CAIX 또는 G250으로도 알려짐), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B (CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 알려짐), 배암종 항원 (CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, 표피 성장 인자 단백질 (EGFR), 절단형 표피 성장 인자 단백질 (tEGFR), III 형 상피 성장 인자 수용체 돌연변이 (EGFR vIII), 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2 (EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5 (FCRL5, Fc 수용체 상동체 5 또는 FCRH5로도 알려짐), 태아 아세틸콜린 수용체 (태아 AchR), 엽산 결합 단백질 (FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸 화 GD2 (OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100 (gp100), G 단백질 결합 수용체 5D (GPCR5D), Her2/neu (수용체 티로신 키나아제 erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원 (HMW-MAA), 헤파티티스 B 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1 (HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2), IL-22 수용체 알파 (IL-22Ra), IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Ra2), 키나아제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자 (L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 리피트 함유 8 패밀리 멤버 A (LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종-관련 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 메소텔린, c-Met, 쥐과 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뮤신 1 (MUC1), MUC16, 자연 킬러 그룹 2 멤버 D (NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 접착 분자 (NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원 (PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이 항원, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이 막 항원 (PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1 (ROR1), 서바이빈 (survivin), 영양막 당단백질 (TPBG, 5T4로도 알려짐), 종양-관련 당단백질 72 (TAG72), 혈관 내피 장 인자 수용체 (VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2), 윌름 종양 1 (WT-1), 병원체-특이적 항원, 또는 보편적 태그 관련 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 B 세포 악성종양과 관련된 항원을 포함하는데, 예컨대 다수의 공지된 B 세포 마커 중 어느 하나이다. 일부 구현예에 있어서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 이를 포함한다.
[0204] 일부 구현예에서, 예시적인 항원은 희귀 티로신 키나아제 수용체 (또는phan tyrosine kinase receptor) ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 헤파티티스 B 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체 (fetal acethycholine receptor), GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1 세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아성 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암 배아 항원 (CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, 및 MAGE A3, CE7, 윌름 종양 1 (윌름 종양 1, WT-1), 사이클린, 예컨대 사이클린 A1 (CCNA1), 및/또는 비오티닐화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV, HPV, 또는 기타 병원체 및/또는 그의 발암 버젼에 특이적이거나 특징적인 및/또는 이에 의해 발현되는 분자이다.
[0205] 일부 구현예에서, 항원은 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 바이러스 항원 (예컨대 HIV, HCV, HBV, 등으로부터의 바이러스 항원), 박테리아 항원, 및/또는 기생충 항원이다.
[0206] CAR 및 재조합 TCR을 비롯한 항원 수용체 및 이의 제조 및 도입은 예를 들어 일부 구현예에서, 예를 들어, 국제특허출원 공개번호 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061 미국특허출원 공개번호 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국특허번호: 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353, 및 8,479,118, 및 유럽 특허출원번호 EP2537416, 및/또는 문헌 Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75에 설명된 것들을 포함한다.
a. 키메라 항원 수용체
[0207] 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 게놈에 함유된 핵산은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩한다. CAR은 일반적으로 하나 이상의 세포내 신호전달 성분에 연결된 항체 또는 그의 단편을 함유하는 세포외 부분과 같은 세포외 리간드 결합 도메인을 갖는 유전적으로 조작된 수용체이다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인을 연결하는 막관통 도메인 및/또는 세포내 도메인을 포함한다. 이러한 분자는 전형적으로 공동자극 수용체와 조합하여 그러한 수용체를 통한 신호 및/또는 천연 항원 수용체를 통한 신호를 모방하거나 근사한다.
[0208] 일부 구현예에서, CAR은 예를 들어 암 마커 및/또는 설명된 항원과 같은 입양 치료에 의해 표적화될 특정 세포 유형에서 발현된 마커와 같은 특정 마커에 대해 특이성을 갖도록 구성된다. 따라서, CAR은 전형적으로 항체의 하나 이상의 항원-결합 단편, 도메인 또는 일부, 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인 및/또는 항체 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 항체 분자의 항원-결합 부분 또는 부분들, 예컨대, 가변 중쇄 (VH) 또는 그의 항원-결합 부분, 또는 모노클로날 항체(mAb)의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)로부터 유래된 단일-사슬 항체 단편 (scFv)을 포함한다.
[0209] 일부 구현예에서, 특정 세포 유형의 표면에 발현되는 항원과 같은 특정 항원 (또는 마커 또는 리간드)에 대한 특이성을 갖는 CAR을 발현하는 T 세포와 같은 조작된 세포들이 제공된다. 일부 구현예에서, 항원은 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 이것은 탄수화물 또는 기타 분자이다. 일부 구현예에서, 항원은 정상 세포 또는 비-표적화 세포 또는 조직에 비해, 질환 또는 병태의 세포, 예를 들어, 종양 또는 병원성 세포에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포 상에 발현되고 및/또는 조작된 세포 상에 발현된다.
[0210] 특정 구현예에서, 키메라 수용체와 같은 재조합 수용체는 세포질 신호전달 영역을 포함하는데, 이것은 T 세포에서 일차 활성화 신호를 유도할 수 있는 세포질(세포내) 영역과 같은 세포질 신호전달 도메인 또는 영역(세포내 신호전달 도메인 또는 영역이라고도 호환적으로 칭해짐), 예를 들어, T 세포 수용체(TCR) 성분의 세포질 신호전달 도메인 또는 영역 (예컨대 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 제타 사슬의 세포질 신호전달 도메인 또는 그의 기능적 변이체 또는 신호전달 부분) 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 것을 포함한다.
[0211] 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 리간드(예컨대 항원) 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 리간드-결합 도메인을 추가로 함유한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인을 함유하는 CAR이다. 일부 구현예에서, 항원과 같은 리간드는, 세포 표면에서 발현되는 단백질이다. 일부 구현예에서, CAR은 TCR-유사 CAR이고 항원은 처리된 펩타이드 항원, 예를 들어 TCR과 같이 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자 관점에서 세포 표면에서 인식되는 세포내 단백질의 펩타이드 항원이다.
[0212] CAR을 포함하는 예시적인 항원 수용체 및 이러한 수용체를 조작하고 세포내로 도입시키는 방법은, 예를 들어 국제 특허출원 공개번호 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, 미국특허출원 공개번호 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국특허 번호: 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592,, 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353, 및 8,479,118, 및 유럽 특허출원 번호 EP2537416에 개시된 것들 및/또는 [Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398]; [Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338]; [Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39]; [Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75]에 개시된 것들을 포함한다. 일부 측면에서, 항원 수용체는 미국특허 7,446,190에 기재된 바와 같은 CAR 및 국제 특허출원 공개 WO/2014055668 A1에 기재된 것들을 포함한다. CAR의 예는 전술한 간행물, 예컨대 WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국특허 7,446,190, US 특허 8,389,282, [Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013)]; [Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701]; 및 [Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)] 중 어느 하나에 개시된 CAR을 포함한다. 또한, WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국특허 7,446,190, 및 US 특허 8,389,282 참조.
[0213] 일부 구현예에서, CAR은 특정 항원 (또는 마커 또는 리간드)에 대한 특이성을 가지고 구성되는데, 예컨대 입양 요법에 의하여 표적화되는 특정 세포 유형에서 발현되는 항원, 예컨대 암 마커 및/또는 완충 반응 (dampening response)을 유도하려는 목적의 항원, 예컨대 정상 세포 또는 비-질환 세포 유형 상에서 발현되는 항원이다. 따라서, CAR은 전형적으로 그의 세포외 부분에 하나 이상의 항원 결합 분자, 예컨대 하나 이상의 항원-결합 단편, 도메인 또는 일부분, 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인 및/또는 항체 분자를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, CAR은 항체 분자의 항원-결합 부분 또는 부분들을 포함하는데, 예컨대 모노클로날 항체 (mAb)의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL)로부터 유래되는 단일-쇄 항원 단편 (scFv)이다.
[0214] 일부 구현예에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항원 수용체와 같은 재조합 수용체의 일부로서 세포 상에서 발현된다. 항원 수용체 중에는 키메라 항원 수용체 (CAR)와 같은 기능성 비-TCR 항원 수용체가 있다. 일반적으로, 펩타이드-MHC 복합체에 대한 TCR-유사 특이성을 나타내는 항체 또는 항원 결합 단편을 함유하는 CAR은 또한 TCR-유사 CAR로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, TCR-유사 CAR의 MHC-펩타이드 복합체에 특이적인 세포외 항원 결합 도메인은 하나 이상의 세포내 신호전달 요소와 연결되는데, 일부 측면에서 링커 및/또는 막관통 도메인(들)을 통해서이다. 일부 구현예에 있어서, 이러한 분자는 전형적으로 TCR과 같은 천연 항원 수용체를 통한 신호, 및 임의로, 공동자극 수용체와 조합되는 이러한 수용체를 통한 신호를 모방하거나 이와 비슷할 수 있다.
[0215] 일부 구현예에 있어서, 재조합 수용체, 예컨대 키메라 수용체 (예컨대, CAR)는 항원 (또는 리간드)에 결합, 예컨대 특이적으로 결합하는 리간드-결합 도메인을 포함한다. 키메라 수용체에 의해 표적화되는 항원들 중에는, 입양 세포 요법을 통해 표적화될 질환, 병태 또는 세포 유형의 관점에서 발현되는 것들이 있다. 질환 및 병태 중에는, 증식성, 신생물성 및 악성 질환 및 장애가 있는데, 예컨대 암 및 종양, 예컨대 혈액학적 암, 면역계 암, 예컨대 림프종, 백혈병 및/또는 골수종, 예컨대 B, T 및 골수 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종이다.
[0216] 일부 구현예에 있어서, 항원 (또는 리간드)은 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에 있어서, 이는 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에 있어서, 항원 (또는 리간드)는 정상 또는 비-표적화된 세포 또는 조직과 비교하여 질환 또는 병태의 세포, 예를 들어, 종양 또는 병원성 세포에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포에서 발현되거나 및/또는 조작된 세포에서 발현된다.
[0217] 일부 구현예에 있어서, CAR은 세포의 표면 상에서 발현되는 항원, 예를 들어, 온전한 (intact) 항원을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv)을 함유한다.
[0218] 일부 구현예에서, 항원 (또는 리간드)은 종양 항원 또는 암 마커이다. 일부 구현예에서, 항원 (또는 리간드)은 αvβ6 인테그린 (avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원 (BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 무수화 효소 9 (CA9, 또한 CAIX 또는 G250으로도 알려짐), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B (CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 알려짐), 배암종 항원 (CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, 표피 성장 인자 단백질 (EGFR), 절단형 표피 성장 인자 단백질 (tEGFR), III 형 상피 성장 인자 수용체 돌연변이 (EGFR vIII), 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2 (EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5 (FCRL5, Fc 수용체 상동체 5 또는 FCRH5로도 알려짐), 태아 아세틸콜린 수용체 (태아 AchR), 엽산 결합 단백질 (FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸 화 GD2 (OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100 (gp100), G 단백질 결합 수용체 5D (GPCR5D), Her2/neu (수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원 (HMW-MAA), 헤파티티스 B 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1 (HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2), IL-22 수용체 알파 (IL-22Ra), IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Ra2), 키나아제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자 (L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 리피트 함유 8 패밀리 멤버 A (LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종-관련 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 메소텔린, c-Met, 쥐과 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뮤신 1 (MUC1), MUC16, 자연 킬러 그룹 2 멤버 D (NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 접착 분자 (NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원 (PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이 항원, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이 막 항원 (PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1 (ROR1), 서바이빈 (survivin), 영양막 당단백질 (TPBG, 5T4로도 알려짐), 종양-관련 당단백질 72 (TAG72), 혈관 내피 장 인자 수용체 (VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2), 윌름 종양 1 (WT-1), 병원체-특이적 항원, 또는 보편적 태그 관련 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 B 세포 악성종양과 관련된 항원을 포함하는데, 예컨대 다수의 공지된 B 세포 마커 중 어느 하나이다. 일부 구현예에 있어서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 이를 포함한다.
[0219] 일부 구현예에서, 항원은 병원체-특이적이거나 또는 병원체-발현된 항원이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 바이러스 항원 (예컨대 HIV, HCV, HBV, 등으로부터의 바이러스 항원), 박테리아 항원, 및/또는 기생충 항원이다. 일부 구현예에서, CAR은 TCR-유사 항체를 함유하는데, 예컨대 MHC-펩타이드 복합체로서 세포 표면상에 제시되는 종양-관련 항원과 같은 세포내 항원을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv)이다. 일부 구현예에 있어서, MHC-펩타이드 복합체를 인식하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항원 수용체와 같은 재조합 수용체의 일부로서 세포 상에서 발현될 수 있다. 항원 수용체 중에는, 키메라 항원 수용체 (CAR)와 같은 기능성 비-TCR 항원 수용체가있다. 일반적으로, 펩타이드-MHC 복합체에 대한 TCR-유사 특이성을 나타내는 항체 또는 항원-결합 단편을 함유하는 CAR은 또한 TCR-유사 CAR로 지칭될 수 있다.
[0220] "주조직 적합성 복합체 (major histocompatibility complex)" (MHC)에 대한 언급은, 일부 경우에 폴리펩타이드의 펩타이드 항원, 예컨대 세포의 기계적 장치에 의하여 가공되는 펩타이드 항원과 복합체화할 수 있는 다형성 펩타이드 결합 위치 또는 결합 홈을 함유하는 단백질, 일반적으로 당단백질을 말한다. 일부 경우, MHC 분자는 T 세포상의 항원 수용체, 예컨대 TCR 또는 TCR-유사 항체에 의하여 인식 가능한 형태로 항원을 제시하기 위해, 예컨대 펩타이드와의 복합체로서, 즉 MHC-펩타이드 복합체로서 세포 표면상에 표시되거나 발현될 수 있다. 일반적으로, MHC 클래스 I 분자는 일부 경우 3 개의 α 도메인을 갖는 막에 존재하는 알파쇄 및 비-공유적으로 결합되는 β2 마이크로글로불린을 갖는 이종이량체이다. 일반적으로, MHC 클래스 II 분자는 통상 양자 모두 막에 존재하는 2 개의 막관통 당단백질인 α 및 β로 구성된다. MHC 분자는 항원 결합 위치 또는 펩타이드를 결합하기 위한 위치 및 적절한 항원 수용체에 의한 인식에 필요한 서열을 함유하는 MHC의 유효 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, MHC 클래스 I 분자는 세포질에서 기원하는 펩타이드를, MHC-펩타이드 복합체가 T 세포에 의하여 인식되는, 예컨대 일반적으로 CD8+ T 세포에 의하여, 그러나 어떤 경우 CD4+ T 세포에 의해 인식되는 세포 표면으로 전달한다. 일부 구현예에 있어서, MHC 클래스 II 분자는 소포 시스템에서 기원하는 펩타이드를, 이들이 통상 CD4+ T 세포에 의해 인식되는 세포 표면으로 전달한다. 일반적으로, MHC 분자는 마우스에서 H-2으로 그리고 인간에서는 인간 백혈구 항원 (HLA)으로 총칭되는, 연결된 좌위 그룹에 의해 인코딩된다. 따라서, 통상 인간 MHC는 또한 인간 백혈구 항원 (HLA)으로 지칭될 수 있다.
[0221] 용어 "MHC-펩타이드 복합체" 또는 "펩타이드-MHC 복합체" 또는 이들의 변형은 예를 들어, 일반적으로 MHC 분자의 결합 홈 또는 틈에서 펩타이드의 비-공유 상호 작용에 의한, 펩타이드 항원과 MHC 분자의 복합체 또는 결합을 말한다. 일부 구현예에 있어서, MHC-펩타이드 복합체는 세포 표면상에 존재하거나 표시된다. 일부 구현예에 있어서, MHC-펩타이드 복합체는 항원 수용체, 예컨대 TCR, TCR-유사 CAR 또는 이의 항원-결합 부분에 의해 특이적으로 인식될 수 있다.
[0222] 일부 구현예에 있어서, 폴리펩타이드의 펩타이드, 예컨대 펩타이드 항원 또는 에피토프는, 예컨대 항원 수용체에 의한 인식을 위하여, MHC 분자와 결합할 수 있다. 일반적으로, 펩타이드는 폴리펩타이드 또는 단백질과 같은 보다 긴 생물학적 분자의 단편으로부터 유래되거나 이에 기초한다. 일부 구현예에 있어서, 펩타이드는 전형적으로 약 8 내지 약 24 개의 길이이다. 일부 구현예에 있어서, 펩타이드는 MHC 클래스 II 복합체에서의 인식을 위해 9 내지 22 개의 아미노산 또는 약 그 정도의 길이를 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 펩타이드는 MHC 클래스 I 복합체에서의 인식을 위해 8 내지 13 개의 아미노산 또는 약 그 정도의 길이를 갖는다. 일부 구현예에 있어서, MHC-펩타이드 복합체와 같은 MHC 분자의 관점에서 펩타이드의 인식에 따라, TCR 또는 TCR-유사 CAR과 같은 항원 수용체는 T 세포 반응, 예컨대 T 세포 증식, 사이토카인 생산, 세포독성 T 세포 반응 또는 다른 반응을 유도하는 T 세포에 대한 활성화 신호를 생성 또는 촉발한다.
[0223] 일부 구현예에 있어서, TCR-유사 항체 또는 항원-결합 부분은 공지되어 있거나 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 공개 출원 US 2002/0150914; US 2003/0223994; US 2004/0191260; US 2006/0034850; US 2007/00992530; US20090226474; US20090304679; 및 국제 PCT 공개 WO 03/068201 참조).
[0224] 일부 구현예에 있어서, MHC-펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 특정 MHC-펩타이드 복합체를 함유하는 유효량의 면역원으로 숙주를 면역화함으로써 제조될 수 있다. 일부 경우, MHC-펩타이드 복합체의 펩타이드는 MHC에 결합할 수 있는 항원의 에피토프, 예를 들어, 종양 항원, 예를 들어 범용 종양 항원, 골수종 항원 또는 하기에 기술되는 다른 항원의 에피토프이다. 일부 구현예에 있어서, 면역 반응을 이끌어 내기 위해 그 후 유효량의 면역원을 숙주에게 투여하는데, 여기서 면역원은 MHC 분자의 결합 홈에서 펩타이드의 3-차원적 제시에 대한 면역 반응을 이끌어 내기에 충분한 시간 동안 그들의 3-차원적 형태를 보유한다. 그 후, 숙주로부터 수집된 혈청을 분석하여 MHC 분자의 결합 홈에서 상기 펩타이드의 3-차원적 제시를 인식하는 원하는 항체가 생성되는지를 결정한다. 일부 구현예에 있어서, 생성된 항체는 그 항체가 MHC 분자 단독, 관심 대상 펩타이드 단독 및 무관한 펩타이드와 MHC와의 복합체로부터 대상 MHC-펩타이드 복합체를 구별할 수 있음을 확인하기 위해 평가될 수 있다. 그 후, 원하는 항체는분리될 수 있다.
[0225] 일부 구현예에 있어서, MHC-펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 파지 항체 라이브러리와 같은 항체 라이브러리 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 돌연변이 Fab, scFv 또는 다른 항체 형태의 파지 디스플레이 라이브러리가 생성될 수 있으며, 여기서, 예를 들어 라이브러리 구성원은 CDR 또는 CDR들의 하나 이상의 잔기에서 돌연변이된다. 예컨대, 미국 공개 출원 US20020150914, US2014/0294841; 및 [Cohen CJ. et al. (2003) J Mol. Recogn. 16:324-332] 참조.
[0226] 본 발명에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 포함하고, 예컨대 온전한 항체 및 기능적 (항원-결합) 항체 단편, 예컨대 항원 결합 단편 (Fab), F(ab')2 Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG (rIgG) 단편, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 가변 중쇄 (VH) 영역, 단일쇄 항체 단편, 예컨대 단일쇄 가변 단편 (scFv) 및 단일 도메인 항체 (예컨대, sdAb, sdFv, 나노바디) 단편이다. 상기 용어는 유전적으로 조작된 및/또는 달린 변형된 형태의 면역글로불린들, 예컨대 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체, 완전 인간 항체, 인간화 항체, 및 헤테로 컨쥬게이트 항체, 다중 특이적, 예컨대, 이중 특이적 항체, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디, 탠덤 디-scFv, 탠덤 트리-scFv이다. 달리 언급하지 않는 한, 용어 "항체"는 그의 기능적 항체 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 용어는 또한 온전한 또는 전장 항체를 포함하는데, 예컨대 IgG 및 그 서브 클래스, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 임의의 부류 또는 하위-부류의 항체이다.
[0227] 일부 구현예에 있어서, 항원-결합 단백질, 항체 및 그의 항원 결합 단편은 전장 항체의 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에 있어서, 항체의 중쇄 및 경쇄는 전장일 수 있거나 항원-결합 부분 (Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv 단편 (scFv))일 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 항체 중쇄 불변 영역은 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE로부터 선택되고, 특히 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로부터 선택되며, 더욱 특히 IgG1 (예컨대, 인간 IgG1)이다. 또 다른 구현예에 있어서, 항체 경쇄 불변 영역은 예를 들어 카파 또는 람다로부터 선택되고, 특히 카파이다.
[0228] 제공되는 항체 중에는 항체 단편이 있다. "항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 말한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 가변 중쇄 (VH) 영역, 단일-쇄 항체 분자, 예컨대 scFv 및 단일 도메인 VH 단일 항체; 및 항체 단편으로부터 형성되는 다중 특이적 항체를 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 항체는 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역, 예컨대 scFv을 포함하는 단일-쇄 항체 단편이다.
[0229] 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체와 항원의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4 개의 보존된 구조 영역 (FR) 및 3 개의 CDR을 포함한다. 예컨대, [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는, 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예컨대, [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)]; [Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 참조.
[0230] 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부분 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부분을 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에 있어서, 단일-도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다. 일부 구현예에 있어서, CAR은 항원에, 예를 들어 종양 세포 또는 암세포와 같은 표적화되는 질환의 세포의 암 마커 또는 표면 항원, 예를 들어 본 발명에서 기술되거나 공지된 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 중쇄 도메인을 포함한다.
[0231] 항체 단편은 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 예컨대 온전한 항체의 단백질 분해성 소화 및 재조합 숙주 세포에 의한 생산이 포함되지만 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에 있어서, 항체는 재조합적으로-생산된 단편인데, 예를 들어 자연적으로 존재하지 않는 배열을 포함하는 단편, 예컨대 펩타이드 링커와 같은 합성 링커에 의해 결합되는 2 개 이상의 항체 영역 또는 사슬을 갖는 것들, 및/또는 자연적으로-존재하는 온전한 항체의 효소 소화에 의해 생성될 수 없는 것들이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 항체 단편은 scFv이다.
[0232] "인간화된" 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 아미노산 잔기가 비-인간 CDR로부터 유래된 것이며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 아미노산 잔기가 인간 FR로부터 유래된 항체이다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 모태 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서 통상 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화를 거친 비-인간 항체의 변이체를 말한다. 일부 구현예에 있어서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 회복 또는 개선시키기 위하여 비-인간 항체 (예를 들어, 그로부터 CDR 잔기가 유도된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
[0233] 따라서, 일부 구현예에 있어서, TCR-유사 CAR을 포함하는 키메라 항원 수용체는 항체 또는 항체 단편을 함유하는 세포외 부분을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 단편은 scFv를 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 단편 및 세포내 신호전달 영역을 함유하는 세포외 부분을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 세포내 신호전달 영역은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호전달 도메인, T 세포 수용체 (TCR) 요소의 신호전달 도메인 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인이거나 이를 포함한다.
[0234] 일부 구현예에서, 그의 항체 부분과 같은 CAR의 세포외 부분은 항원-인식 성분, 예를 들어 항원-인식 성분, 예컨대 scFv와 막관통 도메인 사이에 스페이서 영역과 같은 스페이서를 추가로 포함한다. 스페이서는 힌지 영역, 예를 들어 IgG4 힌지 영역 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역과 같은 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 변이체 또는 변형된 버전의 적어도 일부이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 스페이서 및/또는 힌지 영역을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgG4 또는 IgG1과 같은 인간 IgG이다. 일부 측면에서, 불변 영역의 일부분은 항원-인식 성분, 예를 들어 scFv와 막관통 도메인 사이의 스페이서 영역으로서 작용한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID NO: 27에 기재된 서열을 갖고, SEQ ID NO: 28에 제시된 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID NO: 29에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID NO: 30에 제시된 서열을 갖는다.
[0235] 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgD이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID NO : 31에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID NOS: 27, 29, 30 및 31 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는다.
[0236] 일부 구현예에서, 스페이서는 힌지 영역, 예를 들어 IgG4 힌지 영역 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역과 같은 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 변이체 또는 변형된 버전의 적어도 일부일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 스페이서 및/또는 힌지 영역을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 일부분은 IgG4 또는 IgG1과 같은 인간 IgG이다. 일부 측면에서, 불변 영역의 일부분은 항원-인식 성분, 예를 들어 scFv와 막관통 도메인 사이에서 스페이서 영역으로서 작용한다. 스페이서는 스페이서가 부재할 경우에 비해, 항원 결합에 이어 세포의 증가된 응답성을 제공하는 길이일 수 있다. 몇 가지 예에서, 스페이서의 길이는 12 또는 약 12 아미노산 또는 12개 이하의 아미노산일 수 있다. 예시적인 스페이서는 적어도 약 10 내지 229 아미노산, 약 10 내지 200 아미노산, 약 10 내지 175 아미노산, 약 10 내지 150 아미노산, 약 10 내지 125 아미노산, 약 10 내지 100 아미노산, 약 10 내지 75 아미노산, 약 10 내지 50 아미노산, 약 10 내지 40 아미노산, 약 10 내지 30 아미노산, 약 10 내지 20 아미노산, 또는 약 10 내지 15 아미노산, 및 상기 나열된 범위들의 양 종점의 숫자들 사이의 여하한 정수의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 약 12개 이하의 아미노산 또는, 약 119개 이하의 아미노산 또는 약 229개 이하의 아미노산을 갖는다. 예시적인 스페이서는 IgG4 힌지 단독, CH2 및 CH3 도메인에 링크된 IgG4 힌지, 또는 CH3 도메인에 링크된 IgG4 힌지를 포함한다. 예시적인 스페이서의 비제한적인 예로는, 문헌 Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19 : 3153 또는 국제특허출원 공개번호 WO2014/031687에 기재된 것들을 들 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID NO: 27에 기재된 서열을 갖고, SEQ ID NO: 28에 제시된 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID NO: 29에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID NO : 30에 제시된 서열을 갖는다.
[0237] 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgD의 것이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID NO: 31에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID NOS: 27, 29, 30 및 31 중 어느 하나와 적어도 또는 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는다.
[0238] 세포외 리간드 결합, 예컨대 항원 인식 도메인은 하나 이상의 세포내 신호전달 요소와 연결되는데, CAR의 경우에, 예컨대 TCR 복합체와 같은 항원 수용체 복합체를 통하여 활성화를 모방하고 및/또는 다른 세포 표면 수용체를 통하여 신호를 전달하는 신호전달 요소이다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 세포외 리간드 결합과 세포내 신호전달 도메인을 연결한다. 일부 구현예에 있어서, 항원-결합 성분 (예를 들어, 항체)은 하나 이상의 막관통 및 세포내 신호전달 도메인 또는 영역에 연결된다. 일부 구현예에 있어서, CAR은 세포외 도메인에 융합된 막관통 도메인을 포함한다. 일 구현예에 있어서, 수용체, 예를 들어 CAR의 도메인들 중 하나와 자연적으로 결합된 막관통 도메인이 사용된다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호 작용을 최소화하기 위해, 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 이러한 도메인이 결합하는 것을 회피하도록 선택되거나, 아미노산 치환에 의하여 변형된다.
[0239] 일부 구현예에서 막관통 도메인은 천연원 또는 합성원으로부터 유도된다. 상기 유도원이 천연인 경우, 일부 측면에 있어서 상기 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유도된다. 막관통 영역은 T 세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 또는 CD154의 알파, 베타 또는 제타 사슬로부터 유래된 것들을 포함한다 (즉, 적어도 그의 막관통 영역을 포함). 또는, 일부 구현예에서 막관통 도메인은 합성인 것이다. 일부 측면에서, 합성 막관통 도메인은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 일부 측면에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체가 합성 막횐단 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 일부 구현예에 있어서, 결합은 링커, 스페이서 및/또는 막관통 도메인(들)에 의한다.
[0240] 일부 구현예에서, 일부 구현예에 있어서, 짧은 올리고-또는 폴리펩타이드 링커, 예를 들어 길이가 2 내지 10 개 사이의 아미노산인 링커, 예컨대 글리신 및 세린을 함유하는 것, 예컨대 글리신-세린 이중체를 함유하는 링커가 존재하며, 막관통 도메인과 CAR의 세포질 신호전달 도메인과의 연결을 형성한다.
[0241] 재조합 수용체, 예를 들어, CAR은 일반적으로 적어도 하나의 세포내 신호전달 요소 또는 요소들을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 수용체는 T-세포 활성화 및 세포 독성을 매개하는 TCR CD3 사슬와 같은 TCR 복합체의 세포내 요소, 예컨대 CD3 제타 사슬을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 항원-결합 부분은 하나 이상의 세포 신호전달 모듈에 연결된다. 일부 구현예에 있어서, 세포 신호전달 모듈은 CD3 막관통 도메인, CD3 세포내 신호전달 도메인 및/또는 다른 CD 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 수용체, 예를 들어, CAR은 Fc 수용체 γ, CD8, CD4, CD25 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가 분자의 일부분을 더 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, CAR 또는 다른 키메라 수용체는, CD3-제타 (CD3-ζ) 또는 Fc 수용체 γ와, CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이의 키메라 분자를 포함한다.
[0242] 일부 구현예에서, CAR 또는 다른 키메라 수용체의 연결 (ligation)에 따라, 수용체의 세포질 도메인 및/또는 영역 또는 세포내 신호전달 도메인 및/또는 영역은 면역 세포, 예컨대 CAR를 발현하도록 조작된 T 세포의 정상적인 이펙터 기능 또는 반응 중 적어도 하나를 활성화시킨다. 예를 들어, 일부 관점에서는, CAR은 T 세포의 기능, 예컨대 세포 용해 활성 또는 T-헬퍼 활성, 예컨대 사이토카인 또는 다른 인자의 분비를 유도한다. 일부 구현예에 있어서, 항원 수용체 성분 또는 공동자극 분자의 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부분 또는 영역은 온전한 면역자극 쇄를 대신하여 사용되는데, 예컨대 그것이 이펙터 기능 신호를 전달하는 경우에 그러하다. 일부 구현예에 있어서, 세포내 신호전달 영역, 세포내 도메인 또는 도메인들을 함유하는 영역은 T 세포 수용체 (TCR)의 세포질 서열을 포함하고, 일부 측면에서는 천연의 상황에서 항원 수용체 결합 다음에 그러한 수용체와 협력하여 작용하고 신호전달을 개시하는 공-수용체의 서열을 포함하며, 및/또는 이러한 분자의 임의의 유도체 또는 변이체 및/또는 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다.
[0243] 천연 TCR의 관점에서, 완전한 활성화는 일반적으로 TCR을 통한 신호전달뿐만 아니라 공동자극 신호를 요구한다. 따라서, 일부 구현예에 있어서, 완전한 활성화를 촉진시키기 위해, 2차 또는 공-자극 신호를 발생시키는 위한 요소가 또한 CAR에 포함된다. 다른 구현예에 있어서, CAR은 공동자극 신호를 생성하기 위한 요소를 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 추가적인 CAR은 동일한 세포에서 발현되며, 2차 또는 공동자극 신호를 생성하기 위한 요소를 제공한다.
[0244] 일부 측면에서, T 세포 활성화는 적어도 2 부류의 세포질 신호전달 서열에 의하여 매개되는 것으로 기술된다: TCR을 통해 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 것들 (1차 세포질 신호전달 서열), 및 항원-비의존성 방식으로 작용하여 2차 또또는 공-자극 신호를 제공하는 것들 (2차 세포질 신호전달 서열). 일부 측면에서, CAR은 그러한 신호전달 요소들 중 하나 또는 양자 모두를 포함한다.
[0245] 일부 측면에서, CAR은 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호전달 서열을 포함한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD8, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래되는 것들을 포함한다. 특정 구현예에서, ITAM 함유 일차 세포질 신호전달 서열은 TCR 또는 CD3 제타, FcR 감마, 또는 FcR 베타로부터 유래된 것들을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, CAR의 세포질 신호전달 분자(들)은 세포질 신호전달 도메인 또는 영역, 그들의 일부분, 또는 CD3 제타로부터 유래되는 서열을 함유한다.
[0246] 일부 구현예에서, CAR은 공동자극 수용체의 신호전달 도메인 또는 영역 및/또는 막관통 일부분, 예컨대 CD28, 4-1BB, OX40, CD27, DAP10 및 ICOS를 포함한다. 일부 측면에서, 동일한 CAR은 활성화 또는 신호전달 및 공동자극 요소 양자 모두를 포함한다.
[0247] 일부 구현예에 있어서, 활성화 도메인은 하나의 CAR 내에 포함되는 반면, 공동자극 요소는 또 다른 항원을 인식하는 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 구현예에 있어서, CAR은, 양자가 동일한 세포 상에서 발현되는, 활성화 또는 자극 CAR, 및 공동자극 CAR을 포함한다 (WO2014/055668 참조). 일부 측면에서, CAR은 공동자극 또는 활성화 CAR을 포함한다; 또 다른 측면에서, 이것은 공동자극 CAR이다. 일부 구현예에 있어서, 세포는 다른 항원을 인식하는 CAR과 같은 억제 CAR (iCARs, Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5 (215) (2013 년 12 월) 참조)를 더 포함하며, 이에 의해, 제1 항원을 인식하는 CAR을 통해 전달된 활성화 신호는, 예를 들어 오프-타겟 효과를 감소시키기 위해 억제성 CAR이 그의 리간드에 결합함으로써 감소되거나 저해된다.
[0248] 특정 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 세포내 도메인에 연결된 CD28 막관통 및 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 세포내 도메인에 연결된 CD137 공동-자극 도메인 및 키메라 CD28을 포함한다.
[0249] 일부 구현예에서, CD8+ 세포독성 T 세포의 세포내 신호전달 도메인은 CD4+ 헬퍼 T 세포의 세포내 신호전달 도메인과 동일하다. 일부 구현예에서, CD8+ 세포독성 T 세포의 세포내 신호전달 도메인은 CD4+ 헬퍼 T 세포의 세포내 신호전달 도메인과 상이하다.
[0250] 일부 구현예에서, CAR은 세포질 부분에서, 하나 이상의, 예컨대, 두 개 이상의, 공동자극 도메인 및 활성화 도메인, 예컨대, 일차 활성화 도메인을 포함한다. 예시적인 CARs은 CD3-제타, CD28, 및 4-1BB의 세포내 성분들을 포함한다.
[0251] 일부 구현예에서, 재조합 수용체(들), 예를 들어, 제공된 바이러스 벡터 내 핵산(들)에 의해 인코딩된 CAR은, 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 분자(들)을 발현하는 세포의 선택 및/또는 표적화 및/또는 수용체를 발현하는 세포의 형질도입 또는 조작을 확인할 목적으로, 하나 이상의 마커를 더 포함한다. 일부 측면에서, 그러한 마커는 예컨대 동일한 벡터나 동일 유형의 벡터를 통하는 것과 같이, 예컨대 전형적으로 본원의 임의의 방법에 의한 형질도입과 같은 동일한 방법을 통해, 유전자 조작 과정 중에 도입될 수도 있는, 상이한 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드에 의해 안코딩될 수 있다.
[0252] 일부 측면에서, 마커, 예를 들어, 형질도입 마커는 단백질이고 및/또는 세포 표면 분자이다. 예시적인 마커는 자연-발생 세포 표면 분자와 같은 자연 발생적인, 예컨대 내인성 마커의 절단된(truncated) 변이체이다. 일부 측면에서, 변이체는 천연 또는 내인성 세포 표면 분자와 비교하여 감소된 면역원성, 감소된 트래피킹 기능 및/또는 감소된 신호전달 기능을 갖는다. 일부 구현예에서, 마커는 절단된 EGFR (tEGFR)과 같은 세포 표면 수용체의 절단된 형태이다. 일부 측면에서, 마커는 CD34, NGFR 또는 표피 성장 인자 수용체 (예를 들어, tEGFR)의 전부 또는 일부 (예를 들어, 절단된 형태)를 포함한다. 일부 구현예에서, 마커를 인코딩하는 핵산은 절단가능한 링커 서열, 예컨대 T2A P2A, E2A 및/또는 F2A와 같은 링커 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, WO2014/031687 참조.
[0253] 일부 구현예에서, 마커는 T 세포에서 자연적으로 발견되지 않거나, T 세포 표면 또는 그의 일부에서 자연적으로 발견되지 않는, 예컨대, 세포 표면 단백질과 같은 분자이다.
[0254] 일부 구현예에서, 일부 구현예에 있어서, 마커는, T 세포 상에서 자연적으로 발견되지 않거나 또는 T 세포의 표면 상에서 자연적으로 발견되지 않는 분자, 예를 들어 세포 표면 단백질 또는 그의 일부분이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 분자는 비-자기 분자 (non-self molecule), 예를 들어 비-자기 단백질로서, 즉 그 세포가 입양되어 전이될 숙주의 면역계에 의해 "자기"로 인식되지 않는 것이다.
[0255] 일부 구현예에 있어서, 마커는, 어떠한 치료적 기능을 제공하지 않으며 및/또는 예를 들어, 조작된 세포를 성공적으로 선택하기 위한 유전자 조작의 마커로서 사용되는 것 외의 어떠한 효과를 발생시키지 않는다. 다른 구현예에 있어서, 마커는, 입양 전이 및 리간드와 접하였을 때 세포의 반응을 강화 및/또는 완충시키기 위한 공동자극 또는 면역 체크 포인트 분자와 같이, 치료적 분자 또는 어떤 원하는 효과를 달리 작용하는 분자, 예컨대 생체내에서 마주치게 될 세포에 대한 리간드일 수 있다.
[0256] 일부 경우, CAR은 제1, 제2 및/또는 제3 세대 CAR로 지칭된다. 일부 측면에서, 제1 세대 CAR은 항원 결합시 CD3-쇄 유도 신호를 단독으로 제공하는 것이고; 일부 측면에서, 제2-세대 CAR은 그러한 신호 및 공동자극 신호를 제공하는 것으로서, 예컨대 CD28 또는 CD137과 같은 하나의 공동자극 수용체로부터의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것이고; 일부 측면에서, 제3 세대 CAR은 일부 측면에서 상이한 공동자극 수용체들의 복수의 공동자극 도메인을 포함하는 것이다.
[0257] 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 세포외 리간드-결합 부분, 예컨대 항원-결합 부분, 예컨대 그의 항체 또는 단편을 세포내 도메인에 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv 또는 단일-도메인 VH 항체를 포함하고 세포내 도메인은 ITAM을 함유한다. 일부 측면에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타 (CD3ζ) 쇄의 제타 쇄의 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 키메라 항원 수용체는 세포 도메인과 세포내 신호전달 영역 또는 도메인을 연결하거나 및/또는 그 사이에 배치된 막관통 도메인을 포함한다.
[0258] 일부 측면에서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 포함한다. 세포외 도메인과 막관통 도메인은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인과 막관통은 스페이서, 본 발명에 설명된 스페이서에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공동자극 분자의 세포내 도메인을 막관통 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 함유한다. 일부 측면에서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 또는 41BB이다.
[0259] 일부 구현예에서, CAR은 항체, 예컨대, 항체 단편, CD28 또는 그의 기능성 변이체의 막관통 부분이거나 상기 부분을 포함하는 막관통 도메인, 및 CD28 또는 그의 기능성 변이체의 신호전달 부분 및 CD3 제타 또는 그의 기능성 변이체의 신호전달 부분을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 항체, 예컨대, 항체 단편, 4-1BB 또는 그의 기능성 변이체의 막관통 부분이거나 상기 부분을 포함하는 막관통 도메인, 및 4-1BB 또는 그의 기능성 변이체의 신호전달 부분 및 CD3 제타 또는 그의 기능성 변이체의 신호전달 부분을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 이러한 몇 가지 구현예에서, 수용체는 추가로 Ig 분자, 예를 들면 인간 Ig 분자의 일부를 함유하는 스페이서, 예를 들면 Ig 힌지, 예컨대 IgG4 힌지, 예를 들면 힌지-온리(only) 스페이서를 추가로 포함한다.
[0260] 일부 구현예에서, 수용체, 예를 들어, CAR의 막관통 도메인은 인간 CD28 또는 그의 변이체의 막관통 도메인, 예를 들어, 인간 CD28의 27-아미노산 막관통 도메인(수탁번호: P10747.1)이거나, 또는 SEQ ID NO: 34에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 34에 대해 적어도 또는 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 막관통 도메인이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 막관통-도메인 함유 부분은 SEQ ID NO: 35에 제시된 아미노산 서열 그에 대해 적어도 또는 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
[0261] 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공동자극 분자의 세포내 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 또는 4-1BB이다.
[0262] 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 인간 CD28의 세포내 공동자극 신호전달 도메인 또는 그의 기능적 변이체 또는 부분, 예컨대 그의 41 아미노산 도메인 및/또는 천연 CD28 단백질의 186-187 위치에서 LL이 GG로 치환된 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 영역 및/또는 도메인은 SEQ ID NO: 36 또는 37에 제시된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 36 또는 37에 대해 적어도 또는 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 영역 및/또는 도메인은 4-1BB의 세포내 공동자극 신호전달 도메인 또는 그의 기능적 변이체, 예컨대 인간 4-1BB(수탁번호 Q07011.1)의 42-아미노산 세포질 도메인, 또는 그의 기능적 변이체 또는 부분, 예컨대 SEQ ID NO: 38에 제시된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 38에 대해 적어도 또는 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
[0263] 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 영역 및/또는 도메인은 인간 CD3 사슬, 선택적으로 CD3 제타 자극성 신호전달 도메인 또는 그의 기능적 변이체, 예컨대 인간 CD3ζ(수탁번호: P20963.2)의 이소폼 3의 112 AA 세포질 도메인 또는 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하며 이는 미국특허 No.: 7,446,190 또는 미국특허 No. 8,911,993에 설명되어 있다.　일부 구현예에서, 세포내 신호전달 영역은 SEQ ID NO: 39, 40, 또는 41에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 39, 40, 또는 41에 대해 적어도 또는 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
[0264] 일부 측면에서, 스페이서는 IgG의 힌지 영역만을 포함하며, 예를 들어 SEQ ID NO: 27에 기재된 힌지 온리 스페이서와 같은 IgG4 또는 IgG1의 힌지만을 함유한다. 다른 구현예에서, 스페이서는 Ig 힌지, 예를 들어, CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 예컨대 SEQ ID NO: 29에 기재된 바와 같이, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지, 예컨대, IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 예컨대 SEQ ID NO: 30에 기재된 바와 같이, CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지, 예컨대, IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 글리신-세린이 풍부한 서열 또는 공지의 가요성 링커와 같은 다른 가요성 링커이거나 또는 이를 포함한다.
[0265] 예를 들어, 일부 구현예에서, CAR은 다음을 포함한다: 예컨대 본원에 설명된 바와 같은 항원에 특이적으로 결합하는, 예컨대 sdAbs 및 scFvs을 비롯한 그의 항체 또는 단편과 같은 항원-결합 부분과 같은 세포외 리간드-결합 부분; 임의의 Ig-힌지 함유 스페이서와 같은 스페이서; CD28의 일부인 막관통 도메인 또는 그의 변이체; CD28의 신호전달 부분을 함유하는 세포내 신호전달 도메인 또는 그의 기능적 변이체; 및 CD3 제타 신호전달 도메인의 신호전달 부분 또는 그의 기능적 변이체.　일부 구현예에서, 이러한 CAR 구조물은 예컨대 CAR의 하류에, T2A 리보좀 스킵(ribosomal skip) 요소 및/또는 tEGFR 서열을 더 포함한다.
b. T 세포 수용체(TCR)
[0266] 일부 구현예에서, 핵산(들)에 의해 인코딩된 재조합 분자(들)는 재조합 T 세포 수용체 (TCR)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 TCR은 항원, 표적 세포에 존재하는 항원, 예컨대 종양-특이 항원, 자가면역 또는 염증 질환과 관련된 특정 세포 유형에서 발현되는 항원 또는 바이러스성 병원체 또는 박테리아 병원체로부터 유래된 항원에 대해 특이적이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리펩타이드, 예컨대 종양, 바이러스 또는 자가면역 단백질의 항원의 펩타이드 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 인식하는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 그의 항원-결합 일부분을 발현하는, T 세포와 같은 조작된 세포가 제공된다.
[0267] 일부 구현예에서, "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 가변 α 및 β 쇄 (각각 TCRα 및 TCRβ로도 알려짐) 또는 가변 γ 및 δ 쇄 (또한 TCRα 및 TCRβ로도 알려짐), 또는 이들의 항원-결합 부분을 함유하고, MHC 분자에 결합된 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 분자이다. 일부 구현예에 있어서, TCR은 αβ 형태이다. 통상, αβ와 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 이들을 발현하는 T 세포는 별개의 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포 표면상에서 또는 가용성 형태로 발견된다. 일반적으로, TCR은, 일반적으로 주조직 적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 역할을 하는 T 세포 (또는 T 림프구)의 표면에서 발견된다.
[0268] 달리 언급하지 않는 한, 용어 "TCR"은 완전 TCR 뿐만 아니라 그의 항원-결합 부분 또는 항원-결합 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에 있어서, TCR은 온전한 또는 전장 TCR이고, 예컨대 αβ 형태 또는 γδ 형태의 TCR이다. 일부 구현예에 있어서, TCR은 전장 TCR 보다 짧지만 MHC 분자에서 결합된 특정 펩타이드에 결합하는 항원-결합 부분이고, 예컨대 MHC-펩타이드 복합체에 결합한다. 일부 경우, TCR의 항원-결합 부분 또는 단편은 전장 또는 온전한 TCR의 구조적 도메인의 일부분만을 함유하지만, 여전히 상기 전장 TCR이 결합하는 MHC-펩타이드 복합체와 같은 펩타이드 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 경우, 항원-결합 부분은 특정 MHC-펩타이드 복합체에 결합하기 위한 결합 위치를 형성하기에 충분한, TCR의 가변 도메인, 예컨대 가변 α 쇄 및 가변 β 쇄를 함유한다. 일반적으로, TCR의 가변 쇄들은 펩타이드, MHC 및/또는 MHC-펩타이드 복합체의 인식에 관여하는 상보성 결정 영역을 함유한다.
[0269] 일부 구현예에 있어서, TCR의 가변 도메인은 초가변 루프 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유하는데, 이것이 일반적으로 항원 인식 및 결합 능력 및 특이성에 주로 기여한다. 일부 구현예에 있어서, TCR의 CDR 또는 그들의 조합은 주어진 TCR 분자의 항원-결합 위치의 전부 또는 실질적으로 전부를 형성한다. TCR 쇄의 가변 영역 내 다양한 CDR은 일반적으로 구조 영역 (FR)에 의해 분리되는데, 이는 CDR과 비교하여 TCR 분자 중에서 일반적으로 가변성이 덜 나타난다 (예를 들어, [Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 미국A. 87:9138, 1990]; [Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988] 참조; 또한 [Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003] 참조). 일부 구현예에 있어서, CDR3이 항원 결합 또는 특이성을 책임지는 주 CDR이거나, 또는 항원 인식을 위해 및/또는 펩타이드-MHC 복합체의 가공된 펩타이드 부분과 상호 작용하기 위하여 주어진 TCR 가변 영역상의 3 개의 CDR 중에서 가장 중요하다. 일부 상황에서, 알파 사슬의 CDR1은 특정 항원 펩타이드의 N-말단 부분과 상호 작용할 수 있다. 일부 상황에서, 베타 쇄의 CDR1은 펩타이드의 C-말단 부분과 상호 작용할 수 있다. 일부 상황에서, CDR2는 MHC-펩타이드 복합체의 MHC 부분과의 상호 작용 또는 그의 인식을 책임지는 주 CDR에 가장 크게 기여하거나 그러한 CDR이다. 일부 구현예에 있어서, β-쇄의 가변 영역은 추가적인 초변이 영역을 함유할 수 있는데 (CDR4 또는 HVR4), 이는 일반적으로 항원 인식이 아닌 초항원 (superantigen) 결합과 관련된다 (Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).
[0270] 일부 구현예에 있어서, TCR은 또한 불변 도메인, 막관통 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 함유 할 수 있다 (예컨대, [Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997] 참조). 일부 측면에서, TCR의 각 쇄는 하나의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 막관통 영역 및 C-말단에서 짧은 세포질 꼬리를 가질 수 있다. 일부 구현예에 있어서, TCR은 신호전달을 매개하는 것과 관련된 CD3 복합체의 불변 단백질들과 관련된다.
[0271] 일부 구현예에 있어서, TCR 쇄는 하나 이상의 불변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 주어진 TCR 쇄 (예컨대, α-쇄 또는 β-쇄)의 세포외 부분은 세포 막에 인접하여 2 개의 면역글로불린-유사 도메인을 함유할 수 있는데, 예컨대 가변 도메인 (예컨대, Vα 또는 Vβ; 통상 카밧 (Kabat) 번호매김에 기초하여 아미노산 1 내지 116, [Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.]) 및 불변 도메인 (예컨대, α-쇄 불변 도메인 또는 Cα, 통상 카밧 번호매김에 기초하여 쇄 중 117 내지 259 위치 또는 β 쇄 불변 도메인 또는 Cβ, 통상 카밧에 기초하여 쇄 중 117 내지 295 위치)이다. 예를 들어, 일부 경우, 2 개의 쇄에 의해 형성된 TCR의 세포외 부분은 2 개의 막-근위 불변 도메인 및 2 개의 막-말단 가변 도메인을 포함하는데, 가변 도메인 각각은 CDR을 함유한다. TCR의 불변 도메인은, 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하여 그에 의해 TCR의 두 쇄를 연결하는 짧은 연결 서열을 함유할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, TCR은 α 및 β 쇄 각각에 추가의 시스테인 잔기를 가질 수 있어서, TCR은 불변 도메인에서 2 개의 이황화 결합을 함유한다.
[0272] 일부 구현예에 있어서, TCR 쇄는 막관통 도메인을 함유한다. 일부 구현예에 있어서 막관통 도메인은 양전하를 띤다. 일부 경우에는, TCR 쇄는 세포질 꼬리를 함유한다. 일부 경우, 상기 구조는 TCR이 CD3 및 그의 서브 유닛과 같은 다른 분자와 결합하는 것을 허용한다. 예를 들어, 막관통 영역을 갖는 불변 도메인을 함유하는 TCR은 세포막 내의 단백질을 고정시키고 CD3 신호전달 장치 또는 복합체의 불변 서브 유닛과 결합 할 수 있다. CD3 신호전달 서브 유닛 (예를 들어, CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ 쇄)의 세포내 꼬리는 TCR 복합체의 신호전달 능력에 관계된 하나 이상의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM을 함유한다.
[0273] 일부 구현예에 있어서, TCR은 2 개의 쇄 α 및 β (또는 필요에 따라, γ 및 δ)의 이종이량체이거나 단일 쇄 TCR 컨스트럭트일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, TCR은 이황화 결합 또는 이황화 결합들에 의해 연결된 2 개의 분리된 쇄 (α 및 β 쇄 또는 γ 및 δ 쇄)를 함유하는 이종이량체이다.
[0274] 일부 구현예에 있어서, TCR은 Vα, β 쇄의 서열과 같은 공지된 TCR 서열(들)로부터 생성될 수 있는데, 이들에 대하여 실질적으로 전장 인코딩 서열이 용이하게 이용 가능하다. 세포 공급원으로부터 V 쇄 서열을 포함하는 전장 TCR 서열을 얻는 방법은 잘 알려져 있다. 일부 구현예에 있어서, TCR을 인코딩하는 핵산은 다양한 원으로부터 얻어질 수 있는데, 예컨대 주어진 세포 또는 세포들 내에서 또는 그로부터 분리된 TCR-인코딩 핵산의 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 의하여 또는 공개적으로 입수 가능한 TCR DAN 서열을 합성함에 의하여 얻어질 수 있다.
[0275] 일부 구현예에 있어서, TCR은 생물학적 원으로부터 얻어지는데, 예컨대 세포로부터, 예컨대 T 세포 (예를 들어, 세포 독성 T 세포), T 세포 하이브리도마 또는 다른 공개적으로 입수 가능한 원으로부터 얻어진다. 일부 구현예에 있어서, T 세포는 생체내 분리된 세포로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, TCR은 흉선학적으로 (thymically) 선택된 TCR이다. 일부 구현예에 있어서, TCR은 신에피토프-제한 (neoepitope-restricted) TCR이다. 일부 구현예에 있어서, T-세포는 배양된 T-세포 하이브리도마 또는 클론일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, TCR 또는 그의 항원-결합 부분 또는 그의 항원-결합 단편은 TCR의 서열 지식으로부터 합성 생성될 수 있다.
[0276] 일부 구현예에 있어서, TCR은 표적 폴리펩타이드 항원 또는 그의 표적 T 세포 에피토프에 대한 후보 TCR 라이브러리의 스크리닝하는 것으로부터 선택되거나 또는 동정된 TCR로부터 생성된다. TCR 라이브러리는 PBMCs, 비장 또는 다른 림프 기관에 존재하는 세포를 포함하여 대상체로부터 분리된 T 세포로부터 Vα 및 Vβ 레파토리를 증폭함으로써 생성될 수 있다. 일부 경우에, T 세포는 종양-침윤 림프구 (TIL)로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, TCR 라이브러리는 CD4+ 또는 CD8+ 세포로부터 생성될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, TCR은 건강한 대상체의 정상 T 세포원, 즉 정상 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, TCR은 질환이 있는 대상체의 T 세포원, 즉 질환이 있는 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 축퇴 (degenerate) 프라이머는 인간으로부터 수득된 T 세포와 같은 샘플에서 예컨대 RT-PCR에 의하여 Vα 및 Vβ의 유전자 레퍼토리를 증폭시키는데 사용된다. 일부 구현예에 있어서, scTv 라이브러리는 증폭된 산물이 클로닝되거나 어셈블리 되어 링커에 의해 분리되는 나이브 Vα 및 Vβ 라이브러리로부터 어셈블리 될 수 있다. 대상체 및 세포의 공급원에 따라 라이브러리는 HLA 대립형질-특이적일 수 있다. 또는, 일부 구현예에 있어서, TCR 라이브러리는 모체 또는 스캐폴드 TCR 분자의 돌연변이화 또는 다양화에 의해 생성될 수 있다. 일부 측면에서, TCR은 예를 들어 α 또는 β 쇄의 돌연변이화에 의하여 지시된 진화 (directed evolution)의 대상이된다. 일부 구현예에 있어서, TCR의 CDR 내의 특정 잔기가 변경된다. 일부 구현예에 있어서, 선택된 TCR은 친화적 성숙에 의해 변형될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 항원 특이적 T 세포는, 예컨대 펩타이드에 대한 CTL 활성을 평가하기 위한 스크리닝에 의하여 선택될 수 있다. 일부 측면에서, TCR, 예를 들어 항원-특이적 T 세포 상에서 존재하는 TCR은, 예컨대 결합 활성에 의하여, 예컨대 상기 항원에 대한 특정 친화도 또는 결합력 (avidity)에 의하여 선택될 수 있다.
[0277] 일부 구현예에서, 유전적으로 조작된 항원 수용체는 재조합 T 세포 수용체 (TCR) 및/또는 자연적으로 존재하는 T 세포로부터 클로닝된 TCR을 포함한다. 일부 구현예에서, TCR은 자연발생적인 T 세포로부터 클론된 것이다. 일부 구현예에 있어서, 표적 항원 (예를 들어, 암 항원)에 대한 고-친화성 T 세포 클론은 동정되고, 환자로부터 분리되며, 세포내로 도입된다. 일부 구현예에 있어서, 표적 항원에 대한 TCR 클론은 인간 면역계 유전자 (예를 들어, 인간 백혈구 항원 시스템, 또는 HLA)로 조작된 트랜스제닉 마우스에서 생성되었다. 예컨대, 종양 항원 (예컨대, [Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180] 및 [Cohen et al. (2005) J Immunol. 175:5799-5808] 참조). 일부 구현예에 있어서, 파지 디스플레이가 표적 항원에 대한 TCR을 분리하는데 사용된다 (예컨대, [Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med. 14:1390-1395] 및 [Li (2005) Nat Biotechnol. 23:349-354] 참조). 일부 구현예에 있어서, TCR 또는 그의 항원-결합 부분은 변형되거나 조작된 것이다. 일부 구현예에 있어서, 지시된 진화 방법이 이용되어, 특정 MHC-펩타이드 복합체에 대한 보다 높은 친화성을 갖는 것과 같은 변화된 특성을 갖는 TCR을 생성시킨다. 일부 구현예에 있어서, 지시된 진화는 디스플레이 방법, 예컨대 비한정적인 예로서 효모 디스플레이 (Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92), 파지 디스플레이 (Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54) 또는 T 세포 디스플레이 (Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84)에 의하여 달성된다. 일부 구현예에 있어서, 디스플레이 접근법은 공지된, 모체 또는 레퍼런스 TCR을 조작하는것 또는 변형하는 것을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, 야생형 TCR은, 그 TCR에서 CDR의 하나 이상의 잔기가 돌연변이되는 돌연변이화된 TCR을 생성하기 위한 주형으로서 사용될 수 있고, 원하는 변경된 성질을 갖는 돌연변이체, 예를 들어 원하는 표적 항원에 대한 더 높은 친화도의 돌연변이체가 선택된다.
[0278] 일부 구현예에서, 대상 TCR을 생산하거나 생성시키는 데 사용하기 위한 표적 폴리펩타이드의 펩타이드는 공지되어 있거나 당업자에 의하여 쉽게 확인될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, TCR 또는 항원-결합 부분을 생성시키는 데 사용하기에 적합한 펩타이드는 대상 표적 폴리펩타이드, 예를 들어 하기 기술되는 표적 폴리펩타이드에서 HLA-제한 모티프의 존재에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 펩타이드는 입수가능한 컴퓨터 예측 모델을 사용하여 확인된다. 일부 구현예에 있어서, MHC 클래스 I 결합 위치를 예측하기 위한 모델로서, ProPred1 (Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237), 및 SYFPEITHI ([Schuler et al. (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007] 참조)이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에 있어서, MHC-제한된 에피토프는 HLA-A0201인데, 이는 전체 코카시언의 대략 39-46%에서 발현되며, 따라서 TCR 또는 기타 MHC-펩타이드 결합 분자를 제조하는데 사용하기 위한 MHC 항원의 적절한 선택을 대표한다.
[0279] 컴퓨터 예측 모델을 이용하여 HLA-A0201-결합 모티프 및 프로테아좀 및 면역-프로테아좀의 절단 위치는 공지되어 있다. MHC 클래스 I 결합 위치를 예측하기 위한 그러한 모델은 ProPred1 ([Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001]에 보다 자세히 기술됨), 및 SYFPEITHI ([Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93 2007] 참조)를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
[0280] 일부 구현예에 있어서, TCR 또는 그의 항원 결합 부분은 결합 특성과 같은 하나 이상의 특성이 변경된, 재조합적으로 생산된 천연 단백질 또는 그들의 돌연변이된 형태일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, TCR은 인간, 마우스, 래트 또는 다른 포유 동물과 같은 다양한 동물 종 중 하나로부터 유래될 수 있다. TCR은 세포-결합된 것 또는 가용성 형태일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 제공되는 방법의 목적상, TCR은 세포 표면 상에 발현된 세포-결합된 형태이다.
[0281] 일부 구현예에 있어서, TCR은 전장 TCR이다. 일부 구현예에 있어서, TCR은 항원-결합 부분이다. 일부 구현예에 있어서, TCR은 이량체 TCR (dTCR)이다. 일부 구현예에 있어서, TCR은 단일-쇄 TCR (sc-TCR)이다. 일부 구현예에 있어서, dTCR 또는 scTCR은 WO 03/020763, WO 04/033685, WO2011/044186에 기재된 바와 같은 구조를 갖는다.
[0282] 일부 구현예에 있어서, TCR은 막관통 서열에 상응하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에 있어서, TCR은 세포질 서열에 상응하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에 있어서, TCR은 CD3과 함께 TCR 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, dTCR 또는 scTCR을 포함하는 임의의 TCR은 T 세포의 표면 상에 활성 TCR을 생성하는 신호전달 도메인에 연결될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, TCR은 세포 표면에서 발현된다.
[0283] 일부 구현예에 있어서, dTCR은, TCR α 쇄 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR α 쇄 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 서열의 N 말단에 융합된 제1 폴리펩타이드, 및 TCR β 쇄 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR β 쇄 분변 영역 세포외 서열에 상응하는 서열의 N 말단에 융합된 제2 폴리펩타이드를 함유하는데, 상기 제1 및 제2 폴리펩타이드는 이황화 결합에 의해 연결된다. 일부 구현예에 있어서, 상기 결합은 본래의 이량체 αβ TCR에 존재하는 본래의 내부-쇄 이황화 결합에 해당할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 쇄간 이황화 결합은 천연 TCR에는 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, dTCR 폴리펩타이드 쌍의 불변 영역 세포외 서열에 하나 이상의 시스테인이 혼입될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비-천연 이황화 결합이 바람직할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, TCR은 막에 결착하기 위해 막관통 서열을 함유한다.
[0284] 일부 구현예에 있어서, dTCR은, 가변 α 도메인, 불변 α 도메인 및 상기 불변 α 도메인의 C-말단에 부착된 제1 이합체화 모티프를 함유하는 TCR α 쇄, 및 가변 β 도메인, 불변 β 도메인 및 상기 불변 β 도메인의 C-말단에 부착된 제2 이합체화 모티프를 포함하는 TCR β 쇄를 함유하고, 상기 제1 및 제2 이합체화 모티프는 쉽게 상호 작용하여 상기 제1 이합체화 모티프의 아미노산과 상기 제2 이합체화 모티프의 아미노산 간 공유 결합을 형성하여, TCR α 쇄와 TCR β 쇄를 함께 연결한다.
[0285] 일부 구현예에 있어서, TCR은 scTCR이다. 통상, scTCR은 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다 (예를 들어, [Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (USA) 89, 4759 (1992)]; [Wulfing, C. and Pluckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994)]; [Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993)]; 국제 공개 PCT Nos. WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO2011/044186; 및 [Schlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996)] 참조). 일부 구현예에 있어서, scTCR은 도입된 비-천연 (non-naive) 이황화 쇄간 결합을 함유하여 TCR 쇄들의 결합을 촉진시킨다 (예를 들어, 국제 공개 PCT WO 03/020763 참조). 일부 구현예에 있어서, scTCR은, 그의 C-말단에 융합된 이종의 류신 지퍼가 쇄 결합을 용이하게 하는 비-이황화 결합된 절단된 TCR이다 (예를 들어, 국제 공개 PCT WO 99/60120 참조). 일부 구현예에 있어서, scTCR은 펩타이드 링커를 통해 TCRβ 가변 도메인에 공유 결합된 TCRα 가변 도메인을 함유한다 (국제 공개 PCT No. WO99/18129 참조).
[0286] 일부 구현예에 있어서, scTCR은, TCR α 쇄 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열로 구성되는 제1 분절, TCR β 쇄 불변 도메인 세포외 서열에 상응하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된 TCR β 쇄 가변 영역 서열에 상응하는 아미노산 서열로 구성되는 제2 분절, 및 상기 제1 분절의 C 말단을 상기 제2 분절의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 함유한다.
[0287] 일부 구현예에 있어서, scTCR은, α 쇄 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 α 쇄 가변 영역 서열로 구성되는 제1 분절, 및 β 쇄 세포외 불변 서열의 N 말단에 융합된 β 쇄 가변 영역 서열 및 막관통 서열로 구성되는 제2 분절, 및, 필요에 따라 상기 제1 분절의 C 말단을 상기 제2 분절의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 함유한다.
[0288] 일부 구현예에 있어서, scTCR은, β 쇄 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 TCR β 쇄 가변 영역 서열로 구성되는 제1 분절, 및 α 쇄 세포외 불변 서열의 N 말단에 융합된 α 쇄 가변 영역 서열 및 막관통 서열로 구성되는 제2 분절, 및, 필요에 따라 상기 제1 분절의 C 말단을 상기 제2 분절의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 함유한다.
[0289] 일부 구현예에 있어서, 제1 및 제2 TCR 분절을 연결시키는 scTCR의 링커는 TCR 결합 특이성을 유지하면서 단일 폴리펩타이드 가닥을 형성할 수 있는 임의의 링커일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 링커 서열은 예를 들어 식-P-AA-P-를 가질 수 있는데, 여기서 P는 프롤린이고 AA는 그 아미노산이 글리신 및 세린 인 아미노산 서열을 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 상기 제1 및 제2 분절은 그들의 가변 영역 서열이 그러한 결합을 위해 배향되도록 쌍을 이룬다. 따라서 일부 경우에, 상기 링커는 상기 제1 분절의 C 말단과 상기 제2 분절의 N 말단 간의 거리를 아우르는 충분한 길이를 가지거나 그 역도 마찬가지이지만, scTCR의 그 표적 리간드로의 결합을 차단하거나 감소시킬 만큼 너무 길지는 않다. 일부 구현예에 있어서,상기 링커는 10 내지 45 개 아미노산, 예컨대 10 내지 30 개 아미노산, 또는 26 내지 41 개 아미노산 잔기, 예컨대 29, 30, 31 또는 32 개의 아미노산, 또는 약 그 정도의 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 상기 링커는 식-PGGG-(SGGGG)5-P-를 갖는데, 여기서 P는 프롤린, G는 글리신 및 S는 세린이다 (SEQ ID NO: 48). 일부 구현예에 있어서, 상기 링커는 서열 GSADDAKKDAAKKDGKS (SEQ ID NO: 49)을 갖는다.
[0290] 일부 구현예에 있어서, scTCR은 α 쇄의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기를, β 쇄의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기에 연결하는 공유 이황화 결합을 함유한다. 일부 구현예에 있어서, 천연 TCR에서 쇄간 (interchain) 이황화 결합은 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, scTCR 폴리펩타이드의 제1 및 제2 분절의 불변 영역 세포외 서열 내로 하나 이상의 시스테인이 혼입될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비-천연 이황화 결합 양자 모두가 바람직할 수 있다.
[0291] 도입된 쇄간 이황화 결합을 함유하는 dTCR 또는 scTCR의 일부 구현예에 있어서, 천연의 이황화 결합은 존재하지 않는다. 일부 구현예에 있어서, 천연의 쇄간 이황화 결합을 형성하는 하나 이상의 천연 시스테인은 세린 또는 알라닌과 같은 다른 잔기로 치환된다. 일부 구현예에 있어서, 도입된 이황화 결합은 상기 제1 및 제2 분절 상의 비-시스테인 잔기를 시스테인으로 돌연변이 시킴으로써 형성될 수 있다. TCR의 예시적인 비-천연 이황화 결합은 국제 공개 PCT 번호 WO2006/000830에 기술되어 있다.
[0292] 일부 구현예에 있어서, TCR 또는 이의 항원-결합 단편은, 10-5 내지 10-12 M과 그 안의 모든 개별 값 및 범위 또는 약 그 정도의 표적 항원에 대한 평형 결합 상수를 갖는 친화도를 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 표적 항원은 MHC-펩타이드 복합체 또는 리간드이다.
[0293] 일부 구현예에 있어서, α 쇄 및 β 쇄와 같은 TCR을 인코딩하는 핵산 또는 핵산들은 PCR, 클로닝 또는 다른 적절한 수단에 의해 증폭될 수 있고, 적합한 발현 벡터 또는 벡터들 내에 클로닝 될 수 있다. 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있으며, 임의의 적합한 숙주를 형질 전환 또는 형질 감염 시키는데 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 전파 및 증식을 위해 또는 발현을 위해, 또는 양자 모두를 위해 설계된 것들을 포함하며, 예컨대 플라스미드 및 바이러스이다.
[0294] 일부 구현예에서, 벡터는 pUC 시리즈 (Fermentas Life Sciences), pBluescript 시리즈 (Stratagene, 미국 캘리포니아주 라호야 소재), pET 시리즈 (Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨 소재), pGEX 시리즈 (Pharmacia Biotech, 스웨덴 웁살라 소재), 또는 pEX 시리즈 (Clontech, 미국 캘리포니아주 팔로앨토 소재)의 벡터일 수 있다. 일부 경우에서, 박테리오파지 벡터, 예컨대 λG10, λGT11, λZapII (Stratagene), λEMBL4, 및 λNM1149가 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 식물 발현 벡터가 사용될 수 있으며, 이는 pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19 (Clontech)를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물 발현 벡터는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo (Clontech)를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터가 사용된다.
[0295] 일부 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는, 벡터가 DNA-또는 RNA-기반인지를 고려하여, 적절한 경우, 벡터가 도입될 숙주의 유형 (예를 들어, 박테리아, 균류, 식물 또는 동물)에 특이적인 조절 서열, 예컨대 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 TCR 또는 항원-결합 부분 (또는 기타 MHC-펩타이드 결합 분자)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 비천연 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 비-바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 및 뮤린 줄기세포 바이러스의 긴 말단 반복부에서 발견되는 프로모터일 수 있다. 공지된 다른 프로모터가 또한 고려된다.
[0296] 일부 구현예에 있어서, T-세포 클론이 수득된 후, TCR 알파 및 베타 쇄가 단리되고 유전자 발현 벡터 내로 클로닝된다. 일부 구현예에 있어서, TCR 알파 및 베타 유전자는 피코르나바이러스 2A 리보좀 스킵 펩타이드를 통해 연결되어, 두 쇄가 동시에 발현된다. 일부 구현예에서, TCR을 인코딩하는 핵산은 수용체를 발현시키기 위한 세포의 형질도입 또는 조작을 확인하기 위한 마커를 더 포함한다. 일부 구현예에 있어서, TCR의 유전자 전달은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 통해 또는 트랜스포존을 통해 수행된다 (예컨대, [Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063]; [Frecha et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:1748-1757]; 및 [Hackett et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:674-683] 참조).
[0297] 일부 구현예에 있어서, TCR을 인코딩하는 벡터를 생성하기 위해, 대상 TCR을 발현하는 T 세포 클론으로부터 단리된 총 cDNA로부터 α 및 β 쇄를 PCR 증폭하고 발현 벡터에 클로닝한다. 일부 구현예에 있어서, α 및 β 쇄는 동일한 벡터 내로 클로닝된다. 일부 구현예에 있어서, α 및 β 쇄는 상이한 벡터로 클로닝된다. 일부 구현예에 있어서, 생성된 α 및 β 쇄는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터 내로 혼입된다.
c. 키메라 자가-항체 수용체 (CAAR)
[0298] 일부 구현예에 있어서, 재조합 수용체는 키메라 자가항체 수용체 (CAAR)이다. 일부 구현예에 있어서, CAAR은 자가항체에 특이적이다. 일부 구현예에 있어서, CAAR를 발현하는 세포, 예컨대 CARR을 발현하도록 조작된 T 세포는 자가항체-발현 세포에 특이적으로 결합하고 이를 죽이는 데 사용될 수 있지만, 정상 항체 발현 세포에는 그러하지 아니하다. 일부 구현예에 있어서, CAAR-발현 세포는 자가면역 질환과 같은 자기-항원의 발현과 관련된 자가면역 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, CAAR-발현 세포는 궁극적으로 자가항체를 생산하고 그의 세포 표면 상에 자가항체를 표시하는 B 세포를 표적화 할 수 있고, 이들 B 세포를 치료적 개입을 위한 질환-특이적 표적으로 표시할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, CAAR-발현 세포는 항원-특이적 키메라 자가항체 수용체를 사용하여 질환-유발 B 세포를 표적화함으로써 자가면역 질환에서 병원성 B 세포를 효율적으로 표적화하고 사멸시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 재조합 수용체는 CAAR, 예컨대 미국특허출원 공개 No. 2017/0051035에 개시된 임의의 것이다.
[0299] 일부 구현예에 있어서, CAAR은 자가항체 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 영역을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 세포내 신호전달 영역은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 세포내 신호전달 영역은 1차 신호전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호전달 도메인, T 세포 수용체 (TCR) 요소의 신호전달 도메인 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 세포내 신호전달 영역은 2차 또는 공동자극 신호전달 영역 (2차 세포내 신호전달 영역)을 포함한다.
[0300] 일부 구현예에 있어서, 자가항체 결합 도메인은 자가항원또는 그의 단편을 포함한다. 자가항원의 선택은 표적화 될 자가항체의 유형에 달려 있다. 예를 들어, 자가항원은, 그것이 특정 병태, 예컨대 자기면역 질환, 예컨대 자가항체-매개 자가면역 질환과 관련된, B 세포와 같은 표적 세포상의 자가항체를 인식하기 때문에 선택될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 자가면역 질환은 심상성 천포창 (pemphigus vulgaris, PV)을 포함한다. 예시적인 자가항원은 데스모글레인 1 (Dsg1) 및 Dsg3을 포함한다.
d. 다중-표적화
[0301] c. 일부 구현예에 있어서, 세포 및 방법은 다중-표적화 전략을 포함하는데, 예컨대 세포 상에 2 종 이상의 유전적으로 조작된 수용체의 발현으로서, 각각 동일하거나 상이한 항원을 인식하고, 통상 각각은 상이한 세포내 신호전달 요소를 포함한다. 이러한 다중-표적화 전략은 예를 들어 국제 특허출원 공개 WO 2014055668 A1 (활성화 및 공동자극 CAR의 조합을 기재하는데, 이는 예를 들어, 오프-표적, 예컨대 정상 세포 상에 개별적으로 존재하는 2 가지 상이한 항원을 표적으로 하지만 치료될 질환 또는 병태의 세포 상에만 같이 존재함) 및 [Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013)](활성화 및 억제성 CAR을 발현하는 세포를 기재함, 예컨대 상기 활성화 CAR이 정상 세포나 비-질환 세포 및 치료될 질환 또는 병태의 세포 양자 모두에서 발현되는 하나의 항원에 결합하고, 억제성 CAR은 정상 세포나 치료되기를 원치 않는 세포에서만 발현되는 다른 항원에 결합하는 것임)에 개시되어 있다.
[0302] 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, 세포는 일반적으로 제1 수용체에 의하여 인식되는 항원, 예컨대 제1 항원에 특이적 결합시, 상기 세포에 대한 활성화 또는 자극 신호를 유도할 수 있는 유전적으로 조작된 제1 항원 수용체 (예컨대 CAR 또는 TCR)을 발현하는 수용체를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 세포는 일반적으로 제2 수용체에 의하여 인식되는 제2 항원에 특이적 결합시, 면역 세포에 대한 공동자극 신호를 유도할 수 있는, 유전적으로 조작된 제2 항원 수용체 (예컨대 CAR 또는 TCR), 예컨대 키메라 공동자극 수용체를 더 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 제1 항원 및 제2 항원은 동일하다. 일부 구현예에 있어서, 상기 제1 항원 및 제2 항원은 상이하다.
[0303] 일부 구현예에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2의 유전적으로 조작된 항원 수용체 (예를 들어, CAR 또는 TCR)은 세포에 활성화 또는 자극 신호를 유도할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 함유하는 세포내 신호전달 요소를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 제1 수용체에 의해 유도된 활성화는 신호전달 또는 세포에서 단백질 발현의 변화를 수반하는데, 그 결과 면역 반응의 개시, 예컨대 ITAM 인산화 및/또는 ITAM-매개 신호전달 캐스케이드의 개시, 면역학적 시냅스의 형성 및/또는 결합된 수용체 근처에서 분자들의 클러스터링 (예컨대, CD4 또는 CD8 등), 하나 이상의 전사 인자의 활성화, 예컨대 NF-κB 및/또는 AP-1, 및/또는 예컨대 사이토카인과 같은 인자들의 유전자 발현, 증식, 및/또는 생존의 유도가 일어난다.
[0304] 일부 구현예에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 수용체는 CD28, CD137 (4-1BB), OX40 및/또는 ICOS와 같은 공동자극 수용체의 세포내 신호전달 도메인 또는 영역을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 제1 및 제2 수용체는 상이한 공동자극 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 하나의 구현예에 있어서, 상기 제1 수용체는 CD28 공동자극 신호전달 영역을 함유하고, 제2 수용체는 4-1BB 공-자극 신호전달 영역을 함유하며, 또는 그 역도 마찬가지이다.
[0305] 일부 구현예에 있어서, 제1 및/또는 제2 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 함유하는 세포내 신호전달 도메인 및 공동자극 수용체의 세포내 신호전달 도메인 양자를 모두 포함한다.
[0306] 일부 구현예에 있어서, 제1 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 함유하는 세포내 신호전달 도메인을 함유하고, 제2 수용체는 공동자극 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 함유한다. 동일한 세포에서 유도된 활성화 신호와 조합된 공동자극 신호는 면역 반응을 결과하는 것이고, 예컨대 견고하고 지속적인 면역 반응, 예컨대 유전자 발현 증가, 사이토카인 및 다른 인자의 분비, 및 T 세포 매개된 이펙터 기능, 예컨대 세포 살상이다.
[0307] 일부 구현예에 있어서, 제1 수용체만의 결합 또는 제2 수용체만의 결합은 강력한 면역 반응을 유도하지 않는다. 일부 측면에서, 단지 하나의 수용체가 결합된다면, 세포는 내성이 되거나 항원에 반응하지 않거나, 억제되거나, 및/또는 인자들을 증식하거나 분비하도록 유도되지 않거나 이펙터 기능을 수행하지 않는다그러나, 일부 이러한 구현예에 있어서, 제1 및 제2 항원을 발현하는 세포와 맞닥뜨리는 것과 같이 복수 개의 수용체가 결합될 때, 원하는 반응은 달성되는데, 예를 들어, 하나 이상의 사이토카인의 분비에 의하여 표시되는 바와 같은 완전한 면역 활성화 또는 자극, 표적 세포의 세포독성 살해와 같은 면역 이펙터 기능의 증식, 지속 및/또는 수행이다.
[0308] 일부 구현예에 있어서, 두 수용체는 각각 세포에 활성화 및 억제성 신호를 유도하고, 그로써 상기 수용체 중 하나에 의한 그의 항원에 대한 결합은 상기 세포를 활성화시키거나 반응을 유도하지만, 상기 제2 억제성 수용체의 그의 항원에 대한 결합은 그 반응을 억제하거나 완충하는 신호를 유도한다. 예시로는 활성화 CAR 및 억제 CAR나 iCAR의 조합이 있다. 예를 들어, 활성화 CAR이 질환 또는 병태에서 발현되지만 정상 세포 상에서도 발현되는 항원에 결합하고, 억제성 수용체가 정상 세포에서 발현되지만 질환이나 병태의 세포에서는 발현되지 않는 별개의 항원에 결합하는, 그러한 전략이 이용될 수 있다.
[0309] 일부 구현예에 있어서, 다중-표적화 전략은 특정 질환 또는 병태와 관련된 항원이 일시적으로 (예를 들어, 유전자 조작 관련 자극시) 또는 영구적으로 비-질환 세포 상에서 발현 및/또는 조작된 세포 자체 상에서 발현되는 경우에 이용된다. 이러한 경우에, 2 개의 독립적이고 각각 특이적인 항원 수용체의 결합을 요구함으로써, 특이성, 선택성 및/또는 효능이 개선될 수 있다.
[0310] 일부 구현예에 있어서, 복수 개의 항원, 예를 들어, 제1 및 제2 항원은 표적화될 세포, 조직 또는 질환 또는 병태에서 발현되는데, 예컨대 암 세포 상에서이다. 일부 측면에서, 상기 세포, 조직, 질환 또는 병태는 다발성 골수종 또는 다발성 골수종 세포이다. 일부 구현예에 있어서, 복수 개의 항원 중 하나 이상은 또한 일반적으로 세포 요법으로 표적화되기를 원치 않는 세포, 예컨대 정상 또는 비-질환 세포나 조직, 및/또는 조작된 세포 그 자체 상에서 발현된다. 이러한 구현예에 있어서, 세포의 반응을 달성하기 위하여 다수의 수용체의 결합을 요구함으로써, 특이성 및/또는 효능이 달성된다.
e. 다른 조절 요소들
[0311] 본원에서 제공된 방법 및 조성물의 일부 구현예에서, 항원 수용체, 예를 들어 CAR과 같은 재조합 수용체를 인코딩하는 바이러스 벡터 게놈에 함유된 핵산 서열은 다른 기능적 관계 면에서 다른 유전 요소들, 예컨대 프로모터 또는 인핸서를 비롯한 전사 조절 서열과 작동 가능하게 연결되어, 특정 방식으로 관심 서열의 발현을 조절한다. 특정 예에서, 그러한 전사 조절 서열은 활성과 관련하여 시간적으로 및/또는 공간적으로 조절되는 서열이다. 성분의 발현 조절에 사용될 수 있는 발현 조절 요소는 공지되어 있고 그의 비제한적인 예로서 유도성 프로모터, 구성적 프로모터, 분비 신호, 인핸서 및 기타 조절 요소를 들 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터 게놈에 함유된 핵산 서열은 인코딩된 상이한 성분들, 예컨대 상이한 수용체 성분 및/또는 신호전달 성분들을 제어하는 복수개의 발현 조절 요소들을 함유하여, 재조합 수용체 및/또는 조작된 세포, 예컨대 조작된 수용체를 발현하는 세포의 발현, 기능 및/또는 활성을 조절, 예컨대 유도, 억제, 제어할 수 있거나 및/또는 사용자가 조절할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 벡터는 예컨대 재조합 수용체 또는 조작된 세포와 같은 인코딩된 성분의 발현, 활성 및/또는 기능을 핵산 서열들이 함께 제어할 수 있도록, 하나 이상의 발현 조절 요소 및/또는 하나 이상의 인코딩된 성분을 함유하는 하나 이상의 핵산 서열을 함유할 수 있다.
[0312] 일부 구현예에서, CAR과 같은 항원 수용체 등, CAR과 같은 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 서열은 내부 프로모터/인핸서 조절 서열과 작동 가능하게 연결된다. 사용된 프로모터는 도입된 DNA 절편의 높은 수준의 발현을 지시하는 적절한 조건 하에서 구성적, 조직-특이적, 유도가능하거나 및/또는 유용할 수 있다. 프로모터는 이종 또는 내인성일 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터 및/또는 인핸서는 합성적으로 생성된다. 일부 구현예에서, 프로모터 및/또는 인핸서는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생산된다.
[0313] 일부 경우에서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 서열은 신호 펩타이드를 인코딩하는 신호 서열을 함유한다. 일부 측면에서, 신호 서열은 천연 폴리펩타이드로부터 유래된 신호 펩타이드를 인코딩할 수 있다. 다른 측면에서, 신호 서열은 SEQ ID NO: 50에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되고 SEQ ID NO: 51에 제시된 GMCSFR 알파 사슬의 예시적인 신호 펩타이드와 같은 이종성 또는 비-고유 신호 펩타이드를 인코딩할 수 있다. 일부 경우에, 재조합 수용체, 예를 들어, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 핵산 서열은 신호 펩타이드를 인코딩하는 신호 서열을 함유한다. 신호 펩타이드의 비제한적인 예로는, 예를 들어 SEQ ID NO: 51에 제시되고 SEQ ID NO: 50에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 GMCSFR 알파 사슬 신호 펩타이드, 또는 SEQ ID NO: 52에 제시된 CD8 알파 신호 펩타이드를 들 수 있다.
[0314] 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 재조합 수용체의 발현을 조절하기 위해 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터를 함유한다. 일부 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 재조합 수용체의 발현을 조절하기 위해 작동 가능하게 연결된 2 개, 3 개 또는 그 이상의 프로모터를 함유한다.
[0315] 핵산 분자가 2 개 이상의 상이한 폴리 펩타이드 사슬, 예를 들어, 재조합 수용체 및 마커를 인코딩하는 특정 경우에, 폴리펩타이드 사슬의 각각은 별도의 핵산 분자에 의해 인코딩될 수 있다. 예를 들어, 2 개의 분리된 핵산이 제공되고, 각각은 세포내에서 발현을 위해 세포내로 개별적으로 전달되거나 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 및 마커를 인코딩하는 핵산은 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 내부 리보솜 진입 부위 (internal ribosome entry site; IRES) 또는 자가 절단 펩타이드 또는 선택적으로 T2A, P2A, E2A 또는 F2A인 리보좀 스킵핑을 일으키는 펩타이드를 인코딩하는 핵산에 의해 선택적으로 분리된다. 일부 구현예에서, 마커를 인코딩하는 핵산 및 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산은 두 개의 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 마커를 인코딩하는 핵산 및 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산은 세포의 게놈 내의 상이한 위치에 존재하거나 삽입된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 레트로바이러스 형질도입, 형질감염(transfection) 또는 형질전환에 의해 배양된 세포를 함유하는 조성물로 도입된다.
[0316] 폴리뉴클레오타이드가 제1 및 제2 핵산 서열을 함유하는 일부 구현예에서, 상이한 폴리펩타이드 사슬 각각을 인코딩하는 코딩 서열들은 동일하거나 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 2 이상의 상이한 폴리펩타이드 사슬의 발현을 유도하는 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 핵산 분자는 멀티시스트론 (바이시스트론 또는 트리시스트론, 예를 들어, 미국특허 제 6,060,273 호 참조)일 수 있다. 일부 구현예에서, 전사 단위는 단일 프로모터로부터의 메시지에 의해 유전자 산물 (예를 들어, 마커를 인코딩하고 재조합 수용체를 인코딩하는 것)의 동시 발현을 허용하는, IRES (내부 리보솜 진입 부위)를 함유하는 바이시스트론 유닛으로서 조작될 수 있다. 별법으로, 일부 경우에서, 단일 프로모터는 자가-절단 펩타이드(예컨대, 2A 서열들) 또는 프로테아제 인식 부위(예컨대, 퓨린)을 인코딩하는 서열에 의해 서로 분리된 2 또는 3개의 유전자들(예컨대 마커 인코딩 및 재조합 수용체 인코딩)을 하나의 오픈 리딩 프레임(ORF)에 함유하는, RNA의 발현을 지시할 수 있다. ORF는 따라서 번역 도중(2A의 경우) 또는 번역 후에 개별적인 단백질로 가공되는, 단일 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 경우에서, T2A와 같은 펩타이드는, 리보좀으로 하여금 2A 요소의 C-말단에서 펩타이드 결합 합성을 생략하도록(리보좀 스키핑) 할 수 있는데 이에 의해, 2A 서열의 말단과 다음 펩타이드의 하류 사이가 분리된다 (예를 들어, 참조: de Felipe, Genetic Vaccines 및 Ther. 2:13 (2004) 및 de Felipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)). 다양한 2A 요소가 알려져 있다. 본원에 개시된 방법 및 시스템에 사용가능한 2A 서열의 비제한적인 예로는, 구제역 바이러스 (F2A, 예컨대, SEQ ID NO: 47), 말의 A형 비염 바이러스 (E2A, 예를 들어, SEQ ID NO: 46), Thosea asigna 바이러스(T2A, 예컨대, SEQ ID NO: 32 또는 43), 및 돼지의 테스코바이러스-1(P2A, 예컨대, SEQ ID NO: 44 또는 45)을 들 수 있으며 이에 관해서는 미국특허 공개번호 20070116690에 기재되어 있다.
[0317] 본원에 기재된 임의의 재조합 수용체는 임의의 조합 또는 배열로 재조합 수용체를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩될 수 있다. 예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 폴리뉴클레오타이드는 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 상이한 폴리펩타이드, 예를 들어 재조합 수용체를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나의 벡터 또는 구조물은 마커를 코딩하는 핵산 서열을 함유하고, 별도의 벡터 또는 구조물은 재조합 수용체, 예를 들어 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 마커를 인코딩하는 핵산 및 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산은 두 개의 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산은 마커를 인코딩하는 핵산의 하류에 존재한다.
[0318] 일부 구현예에서, 벡터 골격은 하나 이상의 마커(들)를 인코딩하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 마커(들)는 형질도입 마커, 대리 마커 및/또는 선택 마커이다.
[0319] 일부 구현예에서, 마커는 형질도입 마커 또는 대리 마커이다. 형질도입 마커 또는 대리 마커는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 재조합 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포를 검출하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 형질도입 마커는 세포의 변형을 나타낼 수 있거나 또는 세포의 변형을 확인할 수 있다. 일부 구현예에서, 대리 마커는 세포 표면에서 재조합 수용체, 예를 들어 CAR과 세포 표면에서 동시 발현되도록 만들어진 단백질이다. 특정 구현예에서 그러한 대리 마커는 거의 또는 전혀 활성을 갖지 않도록 변형된 표면 단백질이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산 서열은 마커를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고, T2A, P2A, E2A 또는 F2A와 같은 2A 서열과 같은 리보좀 스킵을 야기하는 펩타이드 또는 자가-절단 펩타이드를 인코딩하는 핵산 또는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)에 의해 선택적으로 분리된다. 외래 마커 유전자는 어떤 경우에는 조작된 세포와 관련하여 세포의 검출 또는 선택을 가능하게하고 경우에 따라 세포 자살을 촉진시킬 수 있다.
[0320] 예시적인 대리 마커는 절단된 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (tHER2), 절단된 표피 성장 인자 수용체 (EGFRt, SEQ ID NO: 33 또는 42에 기재된 예시적인 EGFRt 서열), 절단된 표피 성장 인자 수용체 2 또는 전립선 특이 막 항원 (PSMA) 또는 이의 변형된 형태를 포함할 수 있다. EGFRt는 항체 세툭시맙 (Erbitux®) 또는 기타 치료용 항-EGFL 항체 또는 결합 분자에 의해 인식되는 에피토프를 포함할 수 있으며, 이는 키메라 항원 수용체 (CAR)와 같은 재조합 수용체 및 EGFRt 구조물에 의해 조작된 세포를 동정 또는 선택하거나 및/또는 상기 수용체를 발현하는 세포들을 제거 또는 분리하는데 이용될 수 있다. 참조: 미국특허 No. 8,802,374 및 Liu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434).　일부 측면에서, 예컨대 대리 마커와 같은 마커는, CD34, NGFR 또는 표피 성장 인자 수용체 (예를 들어, tEGFR)의 전부 또는 일부 (예를 들어, 절단된 형태)를 포함한다. 일부 구현예에서, 마커를 인코딩하는 핵산은 절단 가능한 링커 서열, 예를 들어 T2A와 같은 링커 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 마커, 및 선택적으로 링커 서열은 문헌 PCT Pub. WO2014031687에 개시되어 있는 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 마커는 T2A 절단가능한 링커 서열과 같은 링커 서열에 선택적으로 연결된 절단된 EGFR (tEGFR)일 수 있다. 절단된 EGFR (예를 들어, tEGFR)에 대한 예시적인 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 33 또는 42에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 33 또는 42에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
[0321] 일부 구현예에서, 마커는 녹색 형광 단백질 (GFP), 증강된 녹색 형광 단백질 (EGFP), 예컨대 수퍼-폴드 GFP, 적색 형광 단백질 (RFP)과 같은 형광 단백질, 예컨대 tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed 또는 DsRed2, 시안 형광 단백질 (CFP), 청색 녹색 형광 단백질 (BFP), 증강된 청색 형광 단백질 (EBFP), 및 황색 형광 단백질 (YFP)과 같은 형광 단백질 및 상기 형광 단백질의 종 변이체, 단량체 변이체, 및 코돈-최적화되거나 및/또는 증강된 변이체를 비롯한, 변이체들이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 마커는 루시퍼라제, 대장균 유래의 lacZ 유전자, 알칼라인 포스파타제, 분비된 배아 알칼리성 포스파타제 (SEAP), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (CAT)이거나 이를 포함한다. 예시적인 발광 리포터 유전자에는 루시퍼라제(luc), β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT), β-글루쿠로니다제(GUS) 또는 그의 변이체가 포함된다.
[0322] 일부 구현예에서, 마커는 선택 마커이다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 외인성 제제 또는 약물에 내성을 부여하는 폴리펩타이드이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 항생제 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 항생제 내성 유전자로서 포유동물 세포에 대해 항생제 내성을 부여한다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 푸로마이신 내성 유전자, 하이그로 마이신 내성 유전자, 블라스티시딘 (Blasticidin) 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 제네티신 내성 유전자 또는 제오신 내성 유전자 또는 이의 변형된 형태이거나 또는 이를 포함한다.
[0323] 부가적인 핵산들 중에서도, 예컨대, 도입을 위한 유전자로는 예컨대 전달된 세포의 생존능 및/또는 기능을 촉진함으로써 치료 효능을 향상시키는 것들; 예컨대 생체내 생존 또는 국소화를 위해, 세포의 선택 및/또는 평가를 위한 유전 a자마커를 제공하기 위한 유전자; 예컨대 우세한(dominant) 양성 선택가능한 마커와 음성 선택가능한 마커를 융합시켜 유도된 이중기능성 선택가능한 융합 유전자의 사용에 관하여 설명된 문헌 [Lupton S. D. 등, Mol. 및 Cell Biol., 11:6 (1991); 및 Riddell 등, Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); PCT/US91/08442 및 PCT/US94/05601, Lupton 등 참조]에 설명된 바와 같이 생체내 음성 선택에 민감한 세포를 만들어냄으로써, 안정성을 향상시키는 유전자를 들 수 있다. 예컨대, Riddell 등, US 특허 No. 6,040,177, 컬럼 14-17 참조.
[0324] 일부 구현예에서, 프로모터 및/또는 인핸서는 코딩 절편 및/또는 엑손의 상류에 위치하는 5' 비-코딩 서열을 단리함으로써 수득될 수 있는 바와 같이, 핵산 서열과 자연적으로 결합된 것일 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 코딩 핵산 절편은 자연 환경에서는 코딩 핵산 서열과 보통 연계되지 않는 재조합 및/또는 이종 프로모터 및/또는 인핸서의 제어하에 위치할 수 있다. 재조합 DNA 구축에 사용되는 예시적 프로모터의 비제한적인 예로는 β-락타마아제 (페니실리나아제), 락토오스, 트립토판 (trp), RNA 폴리머라아제 (pol) III 프로모터, 예컨대 인간 및 쥐과 U6 pol III 프로모터 뿐 아니라 인간 및 쥐과 H1 RNA pol III 프로모터; RNA 폴리머라아제 (pol) II 프로모터; 사이토메갈로바이러스 극초기 프로모터 (pCMV), 신장 인자-1 알파 (EF-1 알파), 및 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복 (long terminal repeat promotor)(pRSV) 프로모터 시스템을 들 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두(fowlpox) 바이러스, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로 바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 시미안 바이러스 40(SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득 될 수 있다. 프로모터는 또한, 그러한 프로모터가 표적 세포와 양립할 수 있음을 전제로, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터, 열-충격 프로모터, 또는 천연 서열과 통상적으로 관련된 프로모터일 수 있다. 일 구현예에서, 프로모터는 바이러스 발현 시스템에서 자연 발생 바이러스 프로모터이다.
[0325] 일부 구현예에서, 프로모터는 구성적으로 활성일 수 있다. 사용될 수 있는 구성 프로모터의 비제한적인 예로는 유비퀴틴 (미국특허 제 5,510,474 호; WO 98/32869 호), CMV (Thomsen 등, PNAS 81 : 659, 1984; 미국특허 제 5,168,062 호), 베타-액틴 (Gunning et al., 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 4831-4835) 및 pgk (예를 들어, Adra 등 1987 Gene 60 : 65-74; Singer-Sam et al., 1984 Gene 32 : 409-417, 및 Dobson et al., 1982 Nucleic Acids Res., 10 : 2635-2637)를 들 수 있다.
[0326] 일부 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터 및/또는 표적 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 관심 서열의 유도 가능한 발현을 허용하도록 선택될 수 있다. 유도가능한 발현을 위한 다수의 시스템이 알려져 있으며, 여기에는 테트라사이클린 반응 시스템, lac 오퍼레이터-리프레서 시스템뿐만 아니라 열 충격, 메탈로티오네인 프로모터와 같은 금속 이온, 인터페론, 저산소증(hypoxia), 스테로이드, 예컨대 프로게스테론 또는 글루코코르티코이드 수용체 프로모터, 조사, 예컨대 VEGF 프로모터를 비롯한 다양한 환경적 또는 생리적 변화에 반응하는 프로모터가 포함된다. 일부 구현예에서, tet 오퍼레이터 서열 (TECO)상의 대장균의 tet 억제(tetr: tet repression)의 억제 작용에 기초하는 테트라사이클린-(tet)-조절가능한 시스템은 포유동물 시스템에서 사용하기 위해 변형될 수 있고, 발현 카세트의 조절 요소로서 사용된다. 이들 시스템은 잘 알려져 있다(참조: Goshen 및 Badgered, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-51 (1992), Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6522-26 (1996), Lindemann et al., Mol. Med. 3:466-76 (1997)).
[0327] 또한, 관심 유전자의 목적하는 발현을 수득하기 위해 프로모터들의 조합을 사용할 수도 있다. 통상의 숙련된 기술자는 생물체 또는 관심 대상 표적 세포에서 유전자의 원하는 발현 패턴에 기초하여 프로모터를 선택할 수 있을 것이다.
[0328] 일부 구현예에서, 관심 유전자의 발현을 증가시키기 위해 바이러스 구조물 내에 인핸서가 또한 존재할 수 있다. 인핸서는 전형적으로 길이가 약 10 내지 300 인 시스형 (cis-acting) 핵산 요소이며, 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 작용한다. HIV 또는 CMV와 같은 바이러스 게놈의 많은 인핸서가 알려져 있다. 예를 들어 CMV 인핸서 (Boshart et al., Cell, 41 : 521, 1985)를 사용할 수 있다. 또 다른 예로는, 복제 기원 (bp 100-270)의 후기 측의 SV40 인핸서, 사이토메갈로 바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후기 측의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 들 수 있다. 일부 경우, 인핸서는 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-태아단백질 또는 인슐린의 인핸서와 같은 포유동물 유전자로부터 유래된다. 인핸서는 이종 프로모터와 함께 사용될 수 있다. 인핸서는 관심 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 5 '또는 3'위치에서 벡터로 스플라이싱될 수 있지만, 일반적으로 프로모터로부터 5 '위치에 위치한다. 당업자는 원하는 발현 패턴에 기초하여 적절한 인핸서를 선택할 수 있을 것이다.
[0329] 바이러스 벡터 게놈은 또한 추가의 유전 요소를 포함할 수 있다. 구조물에 포함될 수 있는 요소의 유형은 어떠한 방식으로도 제한되지 않으며 당업자가 선택할 수 있다.
[0330] 예를 들어, 표적 세포에서 바이러스 게놈의 핵 진입을 용이하게하는 신호가 포함될 수 있다. 그러한 신호의 예는 HIV-1 플랩 신호 (때로는 플랩 서열이라고도 함)이다. 또한, 벡터 게놈은 관심 유전자의 발현을 증강시키도록 고안된 하나 이상의 유전 요소를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 게놈은 전사후 활성을 나타내는 전사후 조절 요소 (post-transcriptional regulatory element, PRE) 또는 이의 변형된 형태를 함유한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 우드척 간염 바이러스 전사후 반응 요소 (post-transcriptional responsive element) (WPRE)가 구조물에 삽입될 수 있다 (Zufferey et al., 1999; J. Virol.74 : 3668-3681; Deglon et al. Gene Ther., 11 : 179-190). 일부 구현예에서, 벡터 게놈은 플랩 서열이 없거나 및/또는 WPRE가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 벡터 게놈은 돌연변이되거나 결함이있는 플랩 서열 및/또는 WPRE를 함유한다.
[0331] 일부 사례에서, 별개의 이종 단백질을 인코딩하는 두 개 이상의 오픈 리딩 프레임이 포함될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 리포터 및/또는 검출가능한 및/또는 선택가능한 유전자가 발현 구조물에 포함되는 경우, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 서열이 포함될 수 있다. 전형적으로, 추가적인 유전 요소는 프로모터/인핸서에 의해 작동 가능하게 연결되어 프로모터/인핸서와 독립적으로 제어된다. 추가적인 유전 요소는 리포터 유전자, 선택 마커 또는 다른 원하는 유전자 일 수 있다.
[0332] 일부 구현예에서, 다른 다양한 조절 요소는 전사 개시 영역 및/또는 종결 영역을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 또한 전사의 종결 및 mRNA 안정화를위한 서열을 함유할 수 있다. 그러한 서열은 공지되어 있으며 종종 진핵 세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역에 자연적으로 존재한다. 전사 종결 영역의 비제한적인 예로는 폴리아데닐화 신호 서열을 들 수 있다. 폴리아데닐화 신호 서열의 예로는 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리(A), SV40 후기 폴리 (A), 토끼 베타-글로빈 (RBG) 폴리 (A), 티미딘 키나아제 (TK) 폴리 (A) 서열 및 이의 임의의 변이체를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
[0333] 일부 구현예에서, 조절 요소는 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 조절 가능한 발현 및/또는 활성을 허용하는 조절 요소 및/또는 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조절 가능한 발현 및/또는 활성은 재조합 수용체가 특정 조절 요소 및/또는 시스템을 함유하거나 또는 조절되도록 구성함으로써 달성된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 수용체가 발현 조절 시스템에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 조절 시스템은 재조합 수용체의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 특정 리간드에의 노출 또는 결합을 필요로하는 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 조절된 발현은 조절된 전사 인자 방출 시스템, 예를 들어 변형된 Notch 신호전달 시스템에 의해 달성된다 (참조: 예컨대, Roybal et al., 세포 (2016) 164:770-779; Morsut et al., 세포 (2016) 164:780-791). 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 활성 조절은 폴리펩타이드, 예를 들어 재조합 수용체의 구조 변화 및/또는 다량화를 유도할 수 있는 부가적인 제제의 투여에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 화학적 유도제이다 (참조, 예컨대, 미국특허 공개번호. 2016/0046700, Clackson et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U S A. 95(18):10437-42; Spencer et al. (1993) Science 262(5136):1019-24; Farrar et al. (1996) Nature 383 (6596):178-81; Miyamoto et al. (2012) Nature Chemical Biology 8(5): 465-70; Erhart et al. (2013) Chemistry 및 Biology 20(4): 549-57).
4. 바이러스 벡터 입자의 제조
[0334] 바이러스 벡터 게놈은 전형적으로 패키징 또는 생산자 세포주에 형질 감염될 수 있는 플라스미드 형태로 구축된다. 게놈이 바이러스 벡터 게놈의 RNA 카피를 함유하는 레트로바이러스 입자를 생산하기 위해 임의의 다양한 공지된 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스-기반 유전자 전달 시스템을 만드는데는 적어도 2 가지 성분, 즉: 첫째로, 바이러스 벡터 입자를 생성시키는데 필요한 효소뿐만 아니라 구조 단백질을 포함하는 패키징 플라스미드 및 둘째로, 바이러스 벡터 자체, 즉 전달하고자 하는 유전 물질이 관여한다. 바이오안전성 안전장치는 이들 성분 중 어느 하나 또는 양자 모두의 설계시 도입될 수 있다.
[0335] 일부 구현예에서, 패키징 플라스미드는 HIV-1과 같은 모든 레트로바이러스, 엔벨롭 단백질 이외의 단백질을 함유할 수 있다(Naldini et al., 1998). 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 바이러스 독성(virulence)과 관련된 것들과 같은, 부가적인 바이러스 유전자, 예컨대 vpr, vif, vpu 및 nef 및/또는 Tat, HIV의 주요 트랜스액티베이터를 결여할 수 있다. 일부 구현예에서, HIV-기반 렌티바이러스 벡터와 같은 렌티바이러스 벡터는 재조합을 통해 야생형 바이러스의 재구성 가능성을 감소 시키거나 제거하는 gag, pol 및 rev와 같은 부모 바이러스의 단지 3 개의 유전자 만을 포함한다.
[0336] 일부 구현예에서, 바이러스 벡터 게놈은 바이러스 벡터 게놈으로부터 전사된 바이러스 게놈 RNA를 바이러스 입자로 패키징하는데 필요한 모든 성분을 함유하는 패키징 세포주에 도입된다. 또는, 바이러스 벡터 게놈은 관심있는 하나 이상의 서열, 예를 들어 재조합 핵산에 부가하여 바이러스 성분을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 그러나, 일부 측면에서, 표적 세포에서 게놈의 복제를 방지하기 위해, 복제에 필요한 내인성 바이러스 유전자를 제거하고 패키징 세포주에 별도로 제공한다.
[0337] 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 입자를 생성시키는데 필요한 성분을 함유하는 하나 이상의 플라스미드 벡터로 형질감염된다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 LTR, 시스-작용 패키징 서열 및 관심 서열, 즉 CAR과 같은 항원 수용체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터 게놈을 함유하는 플라스미드; 및 Gag, pol 및/또는 rev와 같은 바이러스 효소 및/또는 구조 성분을 인코딩하는 하나 이상의 헬퍼 플라스미드에 의해 형질감염된다. 일부 구현예에서, 다수의 벡터가 레트로바이러스 벡터 입자를 생성시키는 다양한 유전 성분을 분리하는데 이용된다. 일부 이러한 구현예에서, 개별적인 벡터를 패키징 세포에 제공하는 것은 그렇지 않으면 복제능 바이러스를 생성하는 재조합 이벤트의 기회를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 모든 레트로바이러스 성분을 갖는 단일 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다.
[0338] 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자와 같은 레트로바이러스 벡터 입자는 숙주 세포의 형질도입 효율을 증가시키기 위해 슈도타입화된다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터 입자와 같은 레트로바이러스 벡터 입자는 일부 구현예에서, 형질도입될 수 있는 세포 유형을 확장시키는 넓은 세포 숙주 범위를 제공하는 VSV-G 당단백질로 슈도타입화된다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 비-천연 엔벨롭 당단백질, 예컨대, 제노트로픽, 폴리트로픽 또는 암포트로픽 엔벨롭, 예컨대 신드비스 바이러스 엔벨롭, GALV 또는 VSV-G를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 플라스미드에 의해 형질감염된다.
[0339] 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 바이러스 게놈 RNA를 렌티바이러스 벡터 입자로 패키징하기 위해 트랜스에서 요구되는 바이러스 조절 및 구조 단백질을 포함하는 성분을 제공한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 렌티바이러스 단백질을 발현하고 기능성 렌티바이러스 벡터 입자를 생성할 수 있는 임의의 세포주 일 수 있다. 일부 측면에서, 적합한 패키징 세포주로는 293 (ATCC CCL X), 293T, HeLA (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) 및 Cf2Th (ATCC CRL 1430) 세포를 들 수 있다.
[0340] 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 바이러스 단백질(들)을 안정하게 발현한다. 예를 들어, 일부 측면에서, gag, pol, rev 및/또는 다른 구조 유전자를 함유하지만 LTR 및 패키징 성분이 없는 패키징 세포주를 구축할 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 이종 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 및/또는 엔벨롭 당단백질을 코딩하는 핵산을 함유하는 바이러스 벡터 게놈과 함께 하나 이상의 바이러스 단백질을 인코딩하는 핵산 분자로 일시적으로 형질감염될 수 있다.
[0341] 일부 구현예에서, 바이러스 벡터 및 패키징 및/또는 헬퍼 플라스미드는 형질전환 또는 감염을 통해 패키징 세포주에 도입된다. 패키징 세포주는 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 바이러스 벡터 입자를 생성한다. 형질감염 또는 감염에 대한 방법은 잘 알려져있다. 비제한적인 예로는 인산 칼슘, DEAE-덱스트란 및 리포펙션 방법, 전기천공 및 미세 주입을 들 수 있다.
[0342] 재조합 플라스미드 및 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열이 (예를 들어, 칼슘 포스페이트 침전에 의해) 특정 세포주에 도입될 때, 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자 내로 패키징되도록 허용할 수 있고, 이어서 이것은 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 일부 구현예에서 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고, 선택적으로 농축시키고, 유전자 전달에 사용한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 패키징 플라스미드 및 전달 벡터의 패키징 세포주로의 동시형질전환(cotransfection) 후에, 바이러스 벡터 입자를 배양 배지로부터 회수하고 당업자가 사용하는 표준 방법으로 역가를 측정한다.
[0343] 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 입자의 생성을 허용하기 위한 플라스미드의 도입에 의해 예시적인 HEK 293T 세포주와 같은 패키징 세포주에서 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포는 형질감염되어 및/또는 gag 및 pol을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 항원 수용체, 예를 들어 CAR과 같은 재조합 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 rev 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 선택적으로 및/또는 추가로 형질 감염되고 및/또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 함유한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 VSV-G와 같은 비-천연 엔벨롭 당단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 선택적으로 및/또는 추가로 형질감염되고 및/또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 함유한다. 이러한 일부 구현예에서, 예를 들어, HEK 293T 세포와 같은 세포를 형질감염한지 약 2일 후, 세포 상등액은 재조합 렌티바이러스 벡터를 포함하며, 회수하여 적정할 수 있다.
[0344] 회수 및/또는 생산된 레트로바이러스 벡터 입자는 기재된 방법을 사용하여 표적 세포를 형질도입하는데 사용될 수 있다. 일단 표적 세포에서, 바이러스 RNA는 역전사되고, 핵으로 유입되며, 숙주 게놈에 안정적으로 통합된다. 바이러스 RNA의 통합 후 1일 또는 2일 후에, 재조합 단백질, 예컨대 CAR과 같은 항원 수용체가 검출될 수 있다.
C. 인큐베이션
[0345] 일부 구현예에서, 제공된 방법은 복수의 세포를 포함하는 세포 조성물 (이하, "인풋 조성물"이라고도 함)을 (1) 바이러스 입자와 접촉, 예컨대 인큐베이션시킴으로써 세포를 형질도입하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 인풋 조성물은 대상체로부터 농축되거나 및/또는 대상체로부터 선택된 세포와 같이, 대상체로부터 수득된 일차 세포들이거나 또는 이를 포함한다.
[0346] 일부 구현예에서, 상기 인풋 조성물은 대상체로부터 수득한 일차 세포를 포함한다. 일부 측면에서, 샘플은 전혈 샘플, 백혈구 연층(buffy coat) 샘플, 말초혈액 단핵구 세포들(PBMC) 샘플, 비분획 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집술 생성물 또는 백혈구성분채집 생성물이다.
[0347] 일부 구현예에서, 세포의 선택 및/또는 형질도입 전에, 일차 세포를 함유하는 샘플은 적어도 또는 적어도 약 10% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 15% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 20% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 25% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 30% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 35% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 40% (v/v), 또는 적어도 또는 적어도 약 50%의 농도로 혈청 또는 혈장과 생체외에서 접촉되거나 또는 이들을 함유한다. 일부 구현예에서, 샘플은 약 또는 혈청 또는 혈장을, 약 또는 적어도 약 25%,26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 또는 35% (v/v)의 농도로 함유한다. 일부 구현예에서, 혈청 또는 혈장은 인간이다. 일부 구현예에서, 혈청 또는 혈장은 환자에게 자가(autologous)이다. 일부 구현예에서, 세포의 선택 및/또는 형질도입에 앞서, 일차 세포를 함유하는 샘플은 항응고제와 접촉되거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 항응고제는 유리 시트르산 이온, 예를 들어, 항응고제 시트레이트 덱스트로스 용액, 용액 A (ACD-A)이거나 또는 이를 함유한다.
[0348] 일부 구현예에서, 세포의 선택 및/또는 형질도입 전에, 샘플은 최대 48시간, 예컨대 최대 12시간, 24시간 또는 36시간 동안 약 2℃ 내지 8℃의 온도로 유지된다.
[0349] 일부 구현예에서, 인풋 조성물은 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 T 세포를 포함하거나 및/또는 이것으로 농축된다. 일부 측면에서, 농축은 1차 세포를 1차 또는 2차 선별 배양, 또는 1차 세포의 하위집단에서 발현된 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 선택 또는 친화성 시약과 일차 세포를 인큐베이션하고, 이에 의해 선택 시약에 대한 결합에 기반하여 일차 세포들을 농축함으로써 친화성-기반 선택에 의해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 농축은 세포를 항체-코팅 입자, 예를 들어, 자성 비드와 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다.
[0350] 일부 구현예에서, 상기 인풋 조성물은 대상체의 샘플로부터 수득된 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 T 세포를 포함한다. 일부 측면에서, 인큐베이션 전, 인풋 조성물의 T 세포의 5%, 10%, 20%, 30% 또는 40% 이하가 활성화된 세포이고, HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L 및 4-1BB로 이루어진 군으로부터 선택된 표면 마커를 발현하며; IL-2, IFN-감마, TNF-알파로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포내 발현을 포함하고, 세포 주기의 G1 또는 그 후의 단계에 있고 및/또는 증식할 수 있다.
[0351] 일부 구현예에서, 그러한 세포, 예를 들면, 인큐베이션 및/또는 접촉 전에 자극 제제 또는 1 종 이상의 제제로 생체외 자극을 가하지 않은 세포를 함유하는 인풋 조성물은, 그 세포의 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 초과가 저밀도 지질 수용체 (LDL-R)를 발현하는 조성물이다. 일부 구현 양태에서, 인풋 조성물은 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포와 같은 T 세포가 풍부하고(농축되어 있고), 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%를 초과하는 T 세포가 저밀도 지질 수용체 (LDL-R)를 발현한다.
[0352] 일부 구현예에서, 인큐베이션 및/또는 접촉 동안 또는 적어도 일부 동안, 인풋 조성물은 하나 이상의 사이토카인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-2, IL-7 또는 IL-15로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 인풋 조성물 중의 사이토 카인의 농도는 독립적으로 약 1 IU/mL 내지 1500 IU/mL, 예컨대 약 1 IU/mL 내지 100 IU/mL, 2 IU/mL 내지 50 IU/mL, 5 IU/mL 내지 10 IU/mL, 10 IU/mL 내지 500 IU/mL, 50 IU/mL 내지 250 IU/mL 또는 100 IU/mL 내지 200 IU/mL, 50 IU/mL 내지 1500 IU/mL, 100 IU/mL 내지 1000 IU/mL 또는 200 IU/mL 내지 600 IU/mL이다. 일부 구현예에서, 인풋 조성물 내 사이토카인의 농도는, 독립적으로 적어도 또는 적어도 약 1 IU/mL, 5 IU/mL, 10 IU/mL, 50 IU/mL, 100 IU/mL, 200 IU/mL, 500 IU/mL, 1000 IU/mL 또는 1500 IU/mL이다. 특정 측면에서, 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체와 같이, TCR 복합체의 세포내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 제제 역시도 인큐베이션 동안 또는 인큐베이션의 적어도 일부 동안 또는 인큐베이션 후에 포함될 수 있다.
[0353] 일부 구현예에서, 배양 및/또는 접촉 동안 또는 적어도 일부 동안, 인풋 조성물은 혈청을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 혈청은 태아 소 혈청이다. 일부 구현예에서, 혈청은 인간 혈청이다. 일부 구현예에서, 혈청은 약 약 0.5% 내지 25% (v/v), 1.0% 내지 10% (v/v) 또는 2.5% 내지 5.0% (v/v)의 농도로 인풋 조성물 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 혈청은 적어도 또는 적어도 약 0.5% (v/v), 1.0% (v/v), 2.5% (v/v), 5% (v/v) 또는 10% (v/v)의 농도로 인풋 조성물 내에 존재한다.
[0354] 일부 구현예에서, 인큐베이션 및/또는 접족 동안 또는 적어도 일부 동안, 인풋 조성물은 혈청을 함유하지 않거나 및/또는 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 및/또는 접족 동안 또는 적어도 일부 동안, 인풋 조성물은 혈청 부재 하에서 인큐베이션 및/또는 접촉된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 및/또는 접족 동안 또는 적어도 일부 동안, 인풋 조성물을 무혈청 배지에서 인큐베이션 및/또는 접촉된다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 정의된 및/또는 잘 정의된 세포 배양 배지이다. 특정 구현예에서, 무혈청 배지는 억제제 및/또는 성장 인자를 제거하기 위해 처리, 예를 들어, 여과된 조절 배양 배지이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 단백질을 함유한다. 특정 구현예에서, 무혈청 배지는 혈청 알부민, 가수분해물, 성장 인자, 호르몬, 담체 단백질 및/또는 부착 인자를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 단백질, 예를 들어 소 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민 및/또는 재조합 알부민과 같은 알부민을 함유한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 아미노산, 비타민, 무기 염, 완충액, 항산화제 및 에너지 공급원을 함유하는 기저 배지, 예를 들어 DMEM 또는 RPMI 1640을 함유한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지에는 비제한적인 예로서 알부민, 화학적으로 한정된 지질, 성장 인자, 인슐린, 사이토카인 및/또는 항산화제가 보충된다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 면역 세포, T 세포 및/또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포와 같은 특정 세포 유형의 세포의 성장, 증식, 건강, 항상성을 지지하도록 제형화된다.
[0355] 일부 구현예에서, 인큐베이션 및/또는 접족 동안 또는 적어도 일부 동안, 인풋 조성물은 N-아세틸시스테인을 포함한다. 일부 구현예에서, 인풋 조성물 중의 N-아세틸시스테인 농도는 약 0.4 mg/mL 내지 4 mg/mL, 0.8 mg/mL 내지 3.6 mg/mL 또는 1.6 mg/mL 내지 2.4 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 인풋 조성물 중의 N-아세틸시스테인 농도는 적어도 또는 적어도 약 또는 약 0.4 mg/mL, 0.8 mg/mL, 1.2 mg/mL, 1.6 mg/mL, 2.0 mg/mL, 2.4 mg/mL, 2.8 mg/mL, 3.2 mg/mL, 3.6 mg/mL 또는 4.0 mg/mL이다.
[0356] 일부 구현예에서, 인풋 조성물의 세포 농도는 약 1.0 x 105 세포/mL 내지 1.0 x 108 세포/mL, 예컨대 적어도 또는 약 적어도 또는 약 1.0 x 105 세포/mL, 5 x 105 세포/mL, 1 x 106 세포/mL, 5 x 106 세포/mL, 1 x 107 세포/mL, 5 x 107 세포/mL 또는 1 x 108 세포/mL이다.
[0357] 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 인풋 조성물 중의 총 세포 수 또는 형질도입될 총 세포 수에 대한 특정 비율의 바이러스 벡터 입자 또는 그의 감염 유닛(IU), 즉 (IU/세포)의 단위로 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 접촉 동안 세포 하나 당 약 또는 적어도 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 또는 60 IU의 바이러스 벡터 입자의 농도로 존재한다.
[0358] 일부 구현예에서, 바이러스 벡터 입자의 역가는 약 1 x 106 IU/mL 내지 1 x 108 IU/mL, 예컨대 약 5 x 10 6 IU/mL 내지 5 x 107 IU/mL, 예컨대 적어도 6 x 106 IU/mL, 7 x 106 IU/mL, 8 x 106 IU/mL, 9 x 106 IU/mL, 1 x 107 IU/mL, 2 x 107 IU/mL, 3 x 107 IU/mL, 4 x 107 IU/mL, 또는 5 x107 IU/mL이다.
[0359] 일부 구현예에서, 형질도입은 100 미만, 예컨대 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 미만의 감염 다중도 (MOI)로 달성된다.
[0360] 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포를 바이러스 입자와 접촉 시키거나 인큐베이션, 예컨대 혼합하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 접촉은 30분 내지 72시간, 예컨대 30분 내지 48시간, 30분 내지 24시간 또는 1시간 to 24시간, 예컨대 적어도 또는 약 적어도 30분, 1시간, 2시간, 6시간, 12시간, 24시간, 36시간 이상 수행된다.
[0361] 일부 구현예에서, 접촉은 용액 중에서 수행된다. 일부 구현예에서, 세포 및 바이러스 입자는 약 0.5 mL 내지 500 mL, 또는 약 0.5 mL 내지 200 mL, 0.5 mL 내지 100 mL, 0.5 mL 내지 50 mL, 0.5 0.5 mL 내지 5 mL, 5 mL 내지 500 mL, 5 mL 내지 200 mL, 5 mL 내지 100 mL, 5 mL 내지 50 mL, 5 mL 내지 10 mL, 10 mL 내지 500 mL, 10 mL 내지 10 mL 200 mL, 10 mL 내지 100 mL, 10 mL 내지 50 mL, 50 mL 내지 500 mL, 50 mL 내지 200 mL, 50 mL 내지 100 mL, 100 mL 내지 500 mL, 100 mL 내지 200 mL 또는 200 mL 내지 500 mL의 부피로 접촉된다.
[0362] 일부 구현예에서, 접촉은 회전접종(예컨대 원심분리 접종)과 같이, 원심분리에 의해 수행가능하다. 일부 구현예에서, 세포, 바이러스 입자 및 시약을 함유하는 조성물은 일반적으로 저속, 예컨대 세포들을 펠렛화시키는데 사용되는 속도보다 낮은 속도, 예컨대 약 600 rpm 내지 1700 rpm (예컨대 약 또는 적어도 600 rpm, 1000 rpm, 또는 1500 rpm 또는 1700 rpm)의 속도로 회전시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 회전은 예를 들어 챔버 또는 챔버 또는 공동의 내벽 또는 외벽에서 측정시, 약 100 g 내지 3200 g (예컨대 약 또는 적어도 약 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g 또는 3200 g)의 상대 원심력의 힘으로 수행된다. "상대 원심력(relative centrifugal force)"또는 RCF라는 용어는 일반적으로 회전축과 비교하여 공간내 특정 지점에서의 지구 중력에 상대적인, 물체 또는 물질 (예컨대 세포, 샘플 또는 펠렛 및/또는 챔버 또는 다른 용기 내의 회전하는 지점)에 부여되는 유효한 힘으로 이해된다. 이 값은 중력, 회전 속도 및 회전 반경 (회전축으로부터 RCF가 측정되는 대상, 물질 또는 입자 사이의 거리)을 고려하여 잘 알려진 공식을 사용하여 결정될 수 있다.
[0363] 일부 구현예에서, 바이러스 벡터 입자와 세포의 인큐베이션 처리는 바이러스 벡터 입자로 형질도입된 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 초래하거나 생산한다.
D. 기타 처리 단계
[0364] 일부 구현예에서, 세포 조작과 관련한 것과 같은 형질도입을 위한 공정 단계는 세포의 배양(culture), 배양(cultivation), 자극, 활성화, 증식 및/또는 제형화를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아웃풋 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극 제제의 존재 하에서 인큐베이션된다. 그러한 조건은 집단에서 세포의 증식, 확장, 활성화 및/또는 생존을 유도하고 및/또는 항원 노출을 모방하도록 고안된 조건을 포함한다. 자극은 대상체에 대한 투여 후 생체외 또는 생체내에서 수행될 수 있다.
1. 세포의 형질도입 후 활성화(post-translation activation) 및/또는 확장
[0365] 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어. 아웃풋 조성물은 유전 공학과 관련하여 추가 인큐베이션 및/또는 추가 배양된다. 인큐베이션 단계는 배양, 배양, 자극, 활성화 및/또는 확장을 포함할 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 추가 인큐베이션은 하나 이상의 세포의 숙주 게놈 내로 바이러스 벡터를 통합시키는 조건 하에서 수행된다. 인큐베이션 및/또는 엔지니어링은 배양 용기, 예컨대 세포 배양을 위한 유닛, 챔버, 웰, 컬럼, 튜브, 튜빙 세트, 밸브, 바이알, 배양 접시, 백 또는 기타 용기에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극 제제의 존재하에 인큐베이션된다. 그러한 조건은 집단 내에서 세포의 증식, 확장, 활성화 및/또는 생존을 유도하고, 항원 노출을 모방하고, 및/또는 재조합 항원 수용체의 도입과 같은 유전자 조작을 위해 세포를 준비하는 것을 포함한다.
[0366] 일부 구현예에서, 추가 인큐베이션은 약 32℃, 35℃ 또는 37℃초과 온도와 같이, 실온보다 높은 온도, 예컨대 약 25℃보다 높은 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 추가 인큐베이션은 약 37℃와 같이, 약 37℃±2℃에서 수행된다.
[0367] 일부 구현예에서, 추가 인큐베이션은 세포의 자극 및/또는 활성화 조건 하에서 수행되며, 이 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제, 예를 들어 영양성분, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체 및 세포를 활성화 시키도록 고안된 임의의 다른 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
[0368] 일부 구현예에서, 자극 조건 또는 자극 제제는 TCR 복합체의 세포내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 제제 (예컨대 자극 제제 및/또는 액세서리 제제), 예를 들어 리간드를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 제제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포내 신호전달 캐스케이드를 켜거나 개시하는 것과 같이, 예컨대 TCR 성분에 특이적인 것들과 같은, ITAM-유도된 신호의 활성화를 개시하기 위한 것과 같이, 일차 신호를 전달하는데 적절한 제제, 및/또는 예컨대 T 세포 공동자극 수용체에 특이적인 것, 예를 들어, 비드와 같은 고체 지지체에 선택적으로 결합된 항-CD3, 항-CD28, 또는 항-41-BB 및/또는 하나 이상의 사이토카인과 같이, 공동자극 신호를 촉진하는 제제이다. 자극 제제로는 항-CD3/항-CD28 비드 (예컨대, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T 세포 확장제 및/또는 ExpACT® 비드)를 들 수 있다. 선택적으로, 확장 방법은 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 배양 배지에 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 제제는 IL-2 및/또는 IL-15, 예를 들어, IL-2를 적어도 약 10 유닛/mL의 농도로 포함한다.
[0369] 일부 구현예에서, 자극 조건 또는 자극 제제는 TCR 복합체의 세포내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 제제, 예를 들어 리간드를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 제제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포내 신호전달 캐스케이드를 켜거나 개시시킨다. 이러한 제제에는 TCR 성분 및/또는 공동자극 수용체에 특이적인 것과 같은 항체, 예를 들어 비드와 같은 고체 지지체에 결합된 항-CD3, 항-CD28 및/또는 하나 이상의 사이토카인이 포함될 수 있다. 선택적으로, 확장 방법은 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 배양 배지에 (예를 들어, 적어도 약 0.5 ng/ml의 농도로) 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 제제는 IL-2 및/또는 IL-15, 예를 들어, IL-2를 적어도 약 10 유닛/mL, 적어도 약 50 유닛/mL, 적어도 약 100 유닛/mL 또는 적어도 약 200 유닛/mL의 농도로 포함한다.
[0370] 상기 조건은 하나 이상의 특정 매질, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제, 예컨대 영양 성분, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예를 들어 사이토카인, 케모카인. 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 용해성 수용체, 및 세포를 활성화 시키도록 고안된 임의의 다른 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
[0371] 일부 측면에서, 인큐베이션은 문헌 [예컨대 Riddell 등의 미국특허번호 6,040,177, Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, 및/또는 Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701]에 설명된 바에 따라 수행된다.
[0372] 일부 구현예에서, 추가 인큐베이션은 접촉이 발생한 동일한 용기 또는 장치에서 수행된다. 일부 구현예에서, 추가 인큐베이션은 일반적으로 예컨대 원심분리 또는 회전접종과 같이, 회전 하에서 수행되는 인큐베이션의 적어도 일부 후에 수행되는, 회전이나 원심분리 없이 수행된다. 일부 구현예에서, 추가 인큐베이션은 크로마토그래피 매트릭스의 외부와 같은 고정상 외부, 예를 들어 용액 중에서 수행된다.
[0373] 일부 구현예에서, 추가 인큐베이션은 바이러스 입자와 시약의 접촉 후 조성물을 예컨대 자동 이동에 의해 상이한 용기 또는 장치로 이동시킴으로써, 접촉이 일어난 것과는 다른 용기 또는 장치에서 수행된다.
[0374] 일부 구현예에서, T 세포는 예컨대 비-분열성 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 같은 배양-개시 조성물 피더 세포를 첨가함하고 (예컨대 결과적인 세포 집단이 증식시키고자 하는 초기 집단 중의 각각의 T 림프구에 대해 PBMC 피더 세포를 적어도 5, 10, 20, 또는 40배 또는 그 이상 함유하도록); 배양체를 인큐베이션 (예컨대 일부 T 세포들이 증식하는데 충분한 기간 동안) 함으로써 증식된다. 일부 측면에서, 비분열 피더 세포들은 감마선이 조사된 PBMC 피더 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 분열을 방지하기 위해 약 3000 내지 3600 rads 범위로 PBMC에 감마선을 조사한다. 일부 측면에서, T 세포 집단을 첨가하기에 앞서서, 배양 배지에 피더 세포를 첨가한다.
[0375] 일부 구현예에서, 자극 조건은 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도예컨대, 적어도 약 25℃, 일반적으로 적어도 약 30도, 및 일반적으로 약 37℃를 포함한다. 필요에 따라, 인큐베이션은 피더 세포로서 비분열 EBV 바이러스-형질전환된 림프구 세포 (LCL)를 첨가하는 것을 더 포함할 수 있으며, 예를 들어, 바이러스는 EBV, CMV 또는 인플루엔자 및 선택적으로 MHC의 맥락에서 그의 표면에 바이러스-유래 항원 존재하는 형질전환된 LCL일 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 바이러스 항원을 인식하는 TCR을 발현한다. 일부 구현예에서, 바이러스 항원은 EBV, CMV 또는 인플루엔자 유래 수 있다. LCL에 약 6000 내지 10,000 rads 범위의 감마선을 조사할 수 있다. 일부 측면에서 LCL 피더 세포가 적절한 양, 예컨대 적어도 약 10:1의 초기 T 림프구에 대한 LCL 피더 세포 비율로서 제공된다.
[0376] 일부 구현예에서, 예를 들어, 생체외 확장을 용이하게 하기 위한 추가 배양 또는 인큐베이션은, 약 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일을 초과한 기간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 추가 배양 또는 인큐베이션은 6 일 이하, 5 일 이하, 4 일 이하, 3 일 이하, 2 일 이하 또는 24 시간 이하 동안 수행된다.
[0377] 일부 구현예에서, 예컨대 자극 제제와의 인큐베이션의 총 지속 기간은, 약 1시간 내지 96시간, 1시간 내지 72시간, 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간 또는 12시간 내지 24시간, 예컨대 적어도 또는 약 적어도 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간 또는 72시간이다. 일부 구현예에서, 추가 인큐베이션은 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간 또는 12시간 내지 24시간 동안 수행된다.
[0378] 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 방법은 추가의 배양 또는 인큐베이션을 포함하지 않으며, 예컨대, 생체외 확장 단계를 포함하지 않으며 또는, 실질적으로 보다 짧은 생체외 확장 단계를 포함한다.
[0379] 일부 구현예에서, 세포를 조작하는 전체 프로세스, 예를 들어, 선택 및/또는 농축, 형질도입과 관련한 인큐베이션 및/또는 추가의 배양(culturing) 또는 배양(cultivation)은 대상체로부터 샘플 수득 후 9일 초과, 8일 이내, 7일 이내, 6일 이내, 5일 이내, 4일 이내, 3일 이내, 2일 이내 또는 1일 이내 동안 수행된다. 이러한 타이밍은 세포가 동결보존을 받는 기간은 포함하지 않는 것으로 이해된다.
[0380] 본원에 제공된 방법의 일부 구현예에서, 조작된 세포, 예를 들어, 아웃풋 조성물 또는 제형화된 조성물은 유의적인 생체외 확장없이, 형질도입 직후 또는 바로 후에 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 형질도입 단계 직후에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 형질도입 단계 직후에, 예컨대 생체외 확장 없이 투여되거나 또는 상당한 시험관내 활성화, 확장 및/또는 농축을 필요로하는 종래 방법에 비해 실질적으로 더 짧은 기간 동안만 확장을 수행한 후 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공된 방법의 일부 구현예에서, 조작된 세포는 형질도입 후 3 일, 2 일 또는 1 일 이내에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 형질도입 단계로부터 48, 36, 24, 20, 16, 12, 8, 4, 2, 1시간 이내 또는 그 보다 더 짧은 시간 이내에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 예컨대, for 48, 36, 24, 20, 16, 12, 8, 4, 2, 1시간 또는 더 짧은 시간과 같이, 통상적인 방법보다 더 짧은 시험관내 확장 처리를 받는다
[0381] 상기한 임의의 구현예에서, 세포의 확장 및/또는 활성화는 항원에 노출된 후 일어날 수 있다. 예컨대 세포 투여 후 대상체의 체내에서 조작된 세포의 확장. 일부 구현예에서, 생체내 확장의 범위, 정도 또는 크기는 예를 들어, 투여된 세포, 예컨대 재조합 수용체 발현 세포의 확장, 증식, 생존 및/또는 효율을 조절, 예컨대 증가시킬 수 있는 다양한 방법에 의해 추가로 증강, 부스팅 또는 증진될 수 있다.
[0382] 일부 구현예에서, 그러한 방법은 분자의 발현 또는 활성을 변경(예컨대 증가 또는 감소)시키기 위해, 예컨대 핵산과 같은 제제에 의해 추가 변형된 조작된 세포의 투여를 포함하는 것을 들 수 있으며, 여기서, 이러한 변경된 발현 또는 활성은 투여된 세포의 확장, 증식, 생존 및/또는 효능을 증가, 부스팅 또는 증진하는 것이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 핵산과 같은 제제의 발현은 인듀서 또는 기타 조절 분자의 투여에 의해, 유도, 억제, 조절 가능하거나 및/또는 사용자에 의해 제어가능하다.
[0383] 일부 구현예에서, 이러한 방법은 투여된 세포, 예컨대 재조합 수용체 발현 세포의 확장, 증식, 생존 및/또는 효능을 증가, 부스팅 또는 증진할 수 있는 약물 또는 제제와의 동시 또는 순차 투여와 같은 조합 투여를 포함하는 방법을 포함한다. 이러한 약물 및 제제의 예시는 섹션 III에 기재되어있다.
2. 제형화(Formulating)
[0384] 일부 구현예에서, 추가 인큐베이션 후, 세포를 제조하는 방법은 세포를 세척 또는 제형화하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 처리 단계 중에 이러한 조성물을 제형화하는 것을 포함할 수 있다.
[0385] 또한, 이러한 방법에 사용하기 위한 의약 조성물 또는 제형도 제공되며, 이들은 일부 구현에에서 제공된 처리 방법과 연계하여, 예를 들어 자동화 또는 부분 자동화 방식에서 처럼, 다른 처리 단계가 수행되는 밀폐 시스템과 같은 시스템에서 제형화된다.
[0386] 일부 구현예에서, 세포 및 조성물은 세포 또는 세포 집단 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물과 같은 의약 조성물 또는 제형의 형태로 대상체에게 투여된다.
[0387] "의약 제형(pharmaceutical formulation)"이라는 용어는 그러한 형태에서, 그에 함유된 활성 성분의 생물확적 활성이 유효하게끔 허용해주는 제제로서, 상기 제형이 투여될 대상체에게 허용불가능하게 독성인 부가적인 성분들을 전혀 함유하지 않는 제제를 가리킨다.
[0388] 일부 구현예에서, 의약 조성물은 다른 약학적 활성물질 또는 약물, 예컨대 화학요법제, 예컨대 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 히드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등을 부가적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 염, 예컨대 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 투여된다. 약학적으로 허용가능한 적절한 산 부가염에는 무기산, 예컨대 염산, 히드로브롬산, 인산, 메타인산, 질산 및 황산, 그리고 유기산, 에컨대 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산, 벤조산, 글리콜산, 글루콘산, 숙신산 및 아릴설폰산, 예컨대 p-톨루엔설폰산이 포함된다.
[0389] "약학적으로 허용가능한 담체"라 함은 의약 조성물 내에서 활성 성분이 아니면서 대상체에게 비독성인 성분을 가리킨다. 약학적으로 허용가능한 담체의 비제한적인 예로는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 들 수 있다.
[0390] 일부 측면에서, 담체의 선택은 부분적으로 특정한 세포, 및/또는 투여 방법에 따라 결정된다. 따라서, 적절한 제형이 다양하게 존재한다. 예를 들어, 의약 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적절한 보존제로는 예컨대 메틸파라벤, 프로필파라벤, 소듐 벤조에이트, 및 염화 벤잘코늄을 들 수 있다. 일부 측면에서, 2종 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 그의 혼합물은 일반적으로 총 조성물 중 약 0.0001% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 담체는 예컨대 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 설명되어 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며: 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제(예를 들면 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드); 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예를 들면 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 예를 들면 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예를 들면 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제 예를 들면 EDTA; 당 예를 들면 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온 예를 들면 소듐; 금속 복합체(예컨대 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함할 수 있으며 이들로 한정되지 않는다.
[0391] 완충제는 일부 측면에서 조성물에 포함된다. 적절한 완충제의 예로는 시트르산, 소듐 시트레이트, 인산, 포타슘 포스페이트, 및 그 밖에 다양한 및 염을 들 수 있다. 일부 측면에서, 2종 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 그의 혼합물은 총 조성물에 대해 일반적으로 약 0.001% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투약가능한 의약 조성물의 제조 방법은 공지이다. 예시적인 방법은 예를 들면 문헌 [Remington: The Science 및 Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)]에 보다 자세히 설명되어 있다.
[0392] 제형(formulation)은 수용액을 포함할 수 있다. 제형 또는 조성물은 또한 세포로 치료되는 특정 징후, 질환 또는 상태에 유용한 하나 이상의 활성 성분, 바람직하게는 각각의 활성이 서로 역효과를 미치지 않는, 세포에 상보적인 활성을 갖는 활성 성분을 두 가지 이상 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 적절하게 의도된 목적에 유효한 양으로 조합하여 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 의약 조성물은 화학요법제, 예컨대 아스파라기나제, 부술판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 히드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 및/또는 빈크리스틴와 같은 다른 약학적 활성 제제 또는 약물을 더 포함한다.
[0393] 일부 구현예에서 의약 조성물은 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하기에 유효한 양, 예를 들어 치료 유효량 또는 예방적 유효량으로 세포를 함유한다. 일부 구현예에서 치료적 또는 예방적 효능은 치료된 대상체의 주기적 평가에 의해 모니터링된다. 원하는 투약량은 세포의 단일 볼루스 투여, 세포의 다량 투여에 의해, 또는 세포의 연속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
[0394] 제형은 경구, 정맥 내, 복강 내, 피하, 폐, 경피, 근육 내, 비강 내, 협측, 설하 또는 좌약 투여용 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 비경구로 투여된다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 정맥 내, 근육 내, 피하, 직장, 질 및 복강 내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 정맥 내, 복강 내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 사용하여 대상체에게 투여된다.
[0395] 일부 구현예에서, 조성물은 멸균 액상 제제, 예컨대 등장성 수용액, 현탁액, 에멀젼, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공되며, 이들은 일부 측면에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액상 제제는 보통 겔, 기타 점성 조성물 및 고체 조성물에 비해 제조하기가 더 쉽다. 이에 더해, 액상 조성물은 특히 주사에 의해, 투여하기가 다소 더 간편하다. 다른 한편으로, 점성 조성물은 특정 조직과의 보다 장기간 접촉을 제공하기 위해 적절한 점도 범위를 갖도록 제제화될 수 있다. 액상 및 점성 조성물은 예컨대 물, 염수, 인산염 완충 염수, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적절한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
[0396] 예컨대 적절한 담체, 희석제 또는 부형제, 예컨대 멸균수, 생리식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과 혼합된 용매에 세포를 혼입시킴으로써 주사가능한 멸균 용액을 제조할 수 있다. 투여 경로 및 소망되는 제제에 따라 조성물은 보조 제제, 예컨대 습윤제, 분산제 또는 유화제(예컨대 메틸셀룰로스), pH 완충제, 겔화제 또는 점도증강 첨가제, 방부제, 풍미제, 및/또는 색소를 함유할 수 있다. 일부 측면에서 적절한 제제를 제조하기 위해, 표준 텍스트를 참조할 수 있다.
[0397] 항미생물 보존제, 항산화제, 킬레이팅제 및 완충제를 비롯하여, 조성물의 안정성과 멸균성을 향상시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 다양한 항균제 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 및/또는 소르브산에 의하여 미생물의 작용을 방지할 수 있다. 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수지연제를 이용함으로써 주사가능한 의약 형태를 장기간 흡수시킬 수 있다.
[0398] 생체내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예컨대 멸균 여과막을 통해 여과함으로써 쉽게 달성가능하다.
III. 투여를 위한 치료 방법 및 조성물
[0399] 일부 측면에서, 상기 방법의 생성물은 치료 방법, 예를 들어, 세포 또는 조성물을 입양 세포 요법에서 대상체에게 투여하는 것과 같은 치료 방법에 사용된다. 또한, 상기 방법에 의해 가공되고 생산된 세포의 그러한 방법 및 용도, 및 그에 사용하기 위한 의약 조성물 및 제제도 제공된다. 제공된 방법은 일반적으로 세포 또는 조성물, 예를 들어, 아웃풋 조성물 및/또는 제형화된 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
[0400] 일부 구현예에서, 세포는 CAR과 같은 재조합 수용체 또는 트랜스제닉 TCR과 같은 다른 항원 수용체, 예를 들어 본원에서 제공된 형질도입 방법으로 전달된 것 등을 발현한다. 이러한 세포는 일반적으로 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 리간드와 관련된 질환 또는 상태를 갖는 대상체에게 투여된다. 한 구현예에서, 세포는 상기 질환 또는 상태와 관련된 리간드에 특이적으로 결합하거나 또는 그의 세포 또는 조직에 의해 발현되는 리간드에 특이적으로 결합하는, 재조합 수용체 또는 키메라 수용체, 예컨대 CAR 또는 TCR과 같은 항원 수용체를 발현한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 수용체는 항원 수용체이고, 리간드는 질병 또는 상태에 특이적인 또는/관련된 항원이다. 투여는 일반적으로 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상의 개선을 초래하고 및/또는 질환 또는 병태 또는 그의 증상을 치료 또는 예방한다.
[0401] 상기 질환, 질태 및 장애 중에는, 종양, 예컨대 고형 종양, 혈액학적 악성종양, 및 흑색종이 있고, 국소화된 및 전이성 종양, 감염성 질환, 예컨대 바이러스 또는 기타 병원체로의 감염, 예컨대 HIV, HCV, HBV, CMV 감염, 및 기생충 질환, 및 자가면역 및 염증성 질환이 있다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 종양, 암, 악성종양, 신생물, 또는 다른 증식성 질병 또는 장애이다. 이러한 질병은 백혈병, 림프종, 예를 들어 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 림프모구 백혈병 (ALL), 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 난치성 여포성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 지연성 B 세포 림프종, B 세포 악성종양, 결장암, 폐암, 간암, 유방암, 전립선암, 난소암, 피부암, 흑색종, 골암 및 뇌암, 난소암, 상피암, 신장 세포 암종, 췌장 선암종, 호지킨 림프종, 자궁 경부암, 결장직장암, 교모세포종, 신경아세포종, 유잉 육종 (Ewing sarcoma), 수모세포종, 골육종, 활액 육종 및/또는 중피종을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.
[0402] 일부 구현예에서, 이러한 질환의 비제한적인 예로는 백혈병, 림프종, 예컨대 급성 골수성 (또는 골수성) 백혈병 (AML), 만성 골수성 (또는 골수성) 백혈병 (CML), 급성 림프성 (또는 림프 모구성), 만성 림프성 백혈병 (CLL), 털세포 백혈병 (HCL), 소형 림프구성 림프종 (SLL), 맨틀 세포 림프종 (MCL), 한계 부위 림프종, 버킷 림프종, 호지킨 림프종 (HL), 비호지킨 림프종(NHL), 미분화대형세포 림프종(ALCL), 여포성 림프종, 난치성 여포성 림프종, 미만성 대형 만성 B세포 림프종 (DLBCL) 및 다발성 골수종 (MM)을 들 수 있다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 급성 림프 구성 백혈병 (ALL), 성인 ALL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 비호지킨 림프종 (NHL) 및 미만성 대형 B세포 림프종 (DLBCL) 중에서 선택된 B 세포 악성 종양이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 NHL이고 NHL은 공격성 NHL, 미만성 대형 B세포 림프종 (DLBCL), NOS (드 노보 및 무통성으로부터 전환), 원발성 종격동 대형 B세포 림프종 (PMBCL), T 세포/조직구 풍부 대형 B 세포 림프종 (TCHRBCL), 버킷 림프종, 맨틀 세포 림프종 (MCL) 및/또는 여포성 림프종 (FL), 선택적으로 여포성 림프종 등급 3B (FL3B)이다.
[0403] 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 감염성 질환 또는 병태, 예컨대, 바이러스, 레트로바이러스, 박테리아, 및 원충 감염, 면역결핍, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 엡스타인-바르 바이러스 (Epstein-Barr virus)(EBV), 아데노바이러스, BK 폴리오마바이러스 (polyomavirus)이나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 자가면역 또는 염증성 질환 또는 병태, 예컨대 관절염, 예를 들어 류머티즘성 관절염 (RA), I형 당뇨병, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 염증성 장 질병, 건선, 경피증, 자가면역 갑상선 질병, 그레이브스병 (Grave's disease), 크론병 (Crohn's disease) 다발성 경화증, 천식, 및/또는 이식 관련 질환 또는 병태이다.
[0404] 일부 구현예에서, 상기 질환 또는 장애와 관련된 항원은 αvβ6 인테그린 (avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원 (BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 무수화 효소 9 (CA9, 또한 CAIX 또는 G250으로도 알려짐), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B (CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 알려짐), 배암종 항원 (CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, 표피 성장 인자 단백질 (EGFR), 절단형 표피 성장 인자 단백질 (tEGFR), III 형 상피 성장 인자 수용체 돌연변이 (EGFR vIII), 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2 (EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5 (FCRL5, Fc 수용체 상동체 5 또는 FCRH5로도 알려짐), 태아 아세틸콜린 수용체 (태아 AchR), 엽산 결합 단백질 (FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸 화 GD2 (OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100 (gp100), G 단백질 결합 수용체 5D (GPCR5D), Her2/neu (수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원 (HMW-MAA), 헤파티티스 B 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1 (HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2), IL-22 수용체 알파 (IL-22Ra), IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Ra2), 키나아제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자 (L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 리피트 함유 8 패밀리 멤버 A (LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종-관련 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 메소텔린, c-Met, 쥐과 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뮤신 1 (MUC1), MUC16, 자연 킬러 그룹 2 멤버 D (NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 접착 분자 (NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원 (PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이 항원, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이 막 항원 (PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1 (ROR1), 서바이빈 (survivin), 영양막 당단백질 (TPBG, 5T4로도 알려짐), 종양-관련 당단백질 72 (TAG72), 혈관 내피 장 인자 수용체 (VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2), 윌름 종양 1 (WT-1), 병원체-특이적 항원, 또는 보편적 태그 관련 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자 중에서 선택되는 항원이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화된 항원으로는 임의의 수의 공지의 B 세포 마커와 같은, B 세포 악성 종양과 연계된 항원을 들 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 또는 이를 포함한다.
[0405] 일부 구현예에서, 세포 또는 조성물에 의해 표적화된 질환 또는 장애와 관련된 항원은 희귀 티로신 키나아제 수용체 ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, Lewis Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아종양 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원 (CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, 및 MAGE A3, CE7, 윌름 종양 1 (WT-1), 사이클린, 예컨대 사이클린 A1 (CCNA1), 및/또는 바이오티닐화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 기타 병원체에 의해 발현된 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0406] 일부 구현예에서, 항원은 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 바이러스 항원 (예컨대 HIV, HCV, HBV 등으로부터의 바이러스 항원), 박테리아 항원s, 및/또는 기생충 항원이다.
[0407] 본 발명에서 사용되는 바, "치료" (및 그 문법적 변형, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는")은 질환 또는 병태 또는 장애 또는 그와 관련된 증상, 부작용 또는 결과, 또는 표현형의 완전한 또는 부분적 개선 또는 감소를 말한다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행률 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이 용어는 질환의 완전한 치유 또는 임의의 증상에 대한 완전한 제거 또는 모든 증상 또는 결과에 대한 효과(들)을 의미하지는 않는다.
[0408] 본 발명에서 사용되는 바, "질환 발생을 지연"시킨다 함은 질환 (예컨대, 암)의 발생을 연기, 방해, 지연, 늦춤, 안정화, 억제 및/또는 연기하는 것을 의미한다. 이러한 지체는 질환 이력 및/또는 치료 대상인 개체에 따라 다양한 시간 길이일 수 있다. 당업자에게 명백할 바와 같이, 충분한 또는 상당한 지체는, 개체가 질환을 발생시키지 않는다는 점에서, 사실상 예방을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전이 발생과 같은 말기 단계 암이 지체될 수 있다.
[0409] 본 발명에서 사용되는 바, "방지"는 질환에 걸리기 쉽지만 아직 그 질환으로 진단되지 않은 대상체에서 질환의 발생 또는 재발에 관한 예방을 제공하는 것을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 제공되는 세포 및 조성물은 질환의 발생을 지체시키거나 질환의 진행을 지연시키는데 사용된다.
[0410] 본 발명에서 사용되는 바, 기능 또는 활성을 "억제"시킨다는 것은, 대상 조건 또는 파라미터를 제외하고 다른 것은 동일한 조건과 비교하였을 때, 또는 다른 조건과 비교하여 상기 기능 또는 활성을 감소시키는 것이다. 예를 들어, 종양 성장을 억제하는 세포는, 상기 세포의 부재시 종양의 성장 속도와 비교하여 상기 종양의 성장 속도를 감소시킨다.
[0411] 입양 세포 치료를 위한 세포의 투여 방법은 공지되어 있으며, 제공되는 방법 및 조성물과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 입양 T 세포 치료 방법은, 예를 들어 Gruenberg 등의 미국특허출원 공개 2003/0170238; Rosenberg 등의 미국특허 4,690,915; 문헌 [Rosenberg(2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)]에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Themeli et al.(2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933]; [Tsukahara et al.(2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9]; [Davila et al.(2013) PLoS ONE 8(4): e61338]을 참조한다.
[0412] 치료되는 질환 또는 병태는, 항원의 발현이 질환, 병태 또는 장애의 병인학과 관련되고 및/또는 수반되는, 예컨대, 이러한 질환, 병태 또는 장애의 원인이 되거나, 이를 악화시키거나 또는 달리 이와 관련된 임의의 것일 수 있다. 예시적인 질환 및 병태는, 세포의 악성 또는 형질 전환 (예를 들어, 암), 자가면역 또는 염증성 질환, 또는 예컨대 박테리아, 바이러스 또는 기타 병원체에 의하여 야기되는 감염성 질환과 관련되는 질환 또는 병태를 포함할 수 있다. 치료될 수 있는 다양한 질환 및 병태와 관련된 항원을 포함하는, 예시적인 항원은 상기 기재되어 있다. 특정 구현예에 있어서, 키메라 항원 수용체 또는 트랜스제닉 TCR은 상기 질환 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합한다.
[0413] 세포 및 조성물은 표준 투여 기술, 제제 및/또는 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 세포의 투여는 자가 또는 이종 (異種)일 수 있다. 예를 들어, 면역반응성 세포 또는 전구 세포는 한 대상체로부터 얻을 수 있으며 동일한 대상 또는 다른 호환가능한 대상체에 투여할 수 있다. 말초 혈액 유래된 면역 반응 세포 또는 그 자손 (예를 들어, 생체내, 생체외 또는 시험관내 유래)은 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥 내 주사 또는 비경 구 투여를 포함하는 국소 주사를 통해 투여 될 수 있다. 치료 조성물(예컨대 유전자 변형된 면역반응 세포를 함유하는 의약 조성물) 투여시, 이것은 일반적으로 단위 투여형 주사가능한 형태(용액, 현탁액, 에멀젼)으로 제형화될 것이다.
[0414] 일부 구현예에서, 세포 요법, 예를 들어, 입양 세포 요법, 예를 들어, 입양 T 세포 요법은 자가조직 전달 (autologous transfer)에 의하여 수행되는데, 자가조직 전달에서 세포는 상기 세포 요법을 받는 대상체로부터 또는 그러한 대상체로부터 유래한 샘플로부터 단리 및/또는 달리는 제조된다. 따라서, 일부 측면에서, 세포는 대상체, 예컨대 치료를 필요로 하는 환자로부터 유래하고, 상기 세포는, 단리 및 가공 다음에 동일한 대상체에게 투여된다.
[0415] 일부 구현예에서, 세포 요법, 예를 들어, 입양 세포 요법, 예를 들어, 입양 T 세포 요법은 동종이계 전달 (allogeneic transfer)에 의해 수행되는데, 동종이계 전달에서 세포는 상기 세포 요법을 받거나 궁극적으로 받는 대상체, 예컨대 제1 대상체 이외의 대상체로부터 단리 및/또는 달리는 제조된다. 그러한 구현예에 있어서, 세포는 그 후 동일한 종의 상이한 대상체, 예를 들어, 제2 대상체에 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 동일하다. 일부 구현예에 있어서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 구현예에 있어서, 제2 대상체는 제1 대상체와 동일한 HLA 클래스 또는 수퍼타입을 발현한다.
[0416] 예를 들어, 볼루스 주입, 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사, 안내 주사, 눈 주위 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 경 중격 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 전방내 주사, 결막하 주사 (subconjectval injection), 결막하 주사 (subconjuntival injection), 안각건하 주사, 안구후 주사, 안구 주위 주사 또는 후방 공막 부근 전달에 의한 임의의 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 이들은 비경구, 폐내 및 비내, 및 국소 치료가 요망되는 경우, 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 소정의 투여량이 세포의 단일 볼루스 투여에 의해, 예를 들어 3 일 이하의 기간에 걸쳐, 세포의 다회의 볼루스 투여 또는 세포의 연속 주입 투여에 의해 투여된다.
A. 투여량 및 투여
[0417] 세포 또는 조성물은 질환 또는 병태를 치료하기 위한 생체내에서 재조합 수용체 (예컨대 CAR)-발현 세포의 치료학적 유효량을 생성하는 투여량으로 투여된다. 질병의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 치료될 질환 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 유형, 세포 확장을 부스팅, 증가 또는 증진시키는 것과 같은 다른 약물 또는 제제와의 조합 투여, 질병의 중증도 및 경과, 세포가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 치료, 대상체의 임상 경력 및 세포 반응 및 주치의의 재량에 따라 달라질 수 있다. 조성물 및 세포는 일부 구현예에서 한 번에 또는 일련의 치료를 통해 대상체에게 적절하게 투여된다.
[0418] 투여의 맥락에서 제제, 예컨대 약학적 제형, 세포 또는 조성물의 "유효량"은 원하는 결과, 예컨대 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위하여 필요한 투여량/양으로 및 그러한 시간 동안 효과적인 양을 말한다.
[0419] 제제, 예컨대 약학적 제형 또는 세포의 "치료적으로 유효한 양"은 원하는 치료적 결과를 달성하기 위하여, 예컨대 질환, 병태 또는 장애의 치료, 및/또는 치료의 약물 동태학적 또는 약물 동력학적 효과를 달성하기 위하여 필요한 투여량으로 및 그러한 시간 동안 효과적인 양을 말한다. 치료적으로 유효한 양은 대상체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 투여되는 세포 집단 및 예컨대 동시적으로 조합 투여되는 다른 약물 또는 제제에 따라 달라질 수 있다.
[0420] "예방적으로 유효한 양"은 원하는 예방적 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량으로 및 그러한 시간 동안 효과적인 양을 말한다. 반드시 그러한 것은 아니지만 통상, 예방적 투여량은 질환 발생 전 또는 초기 단계에서 대상체에게 사용되기 때문에, 상기 예방적으로 유효한 양은 치료적으로 유효한 양보다 적을 것이다.
[0421] 일부 구현예에서, 세포 또는 조성물은 치료 유효량 또는 예방 유효량과 같은 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하는데 효과적인 양으로 투여된다. 따라서, 일부 구현예에서, 투여 방법은 세포 및 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서 치료적 또는 예방적 효능은 치료된 대상체의 주기적 평가에 의해 모니터링된다. 병태에 따라 며칠 또는 그 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 치료를 반복한다. 그러나, 다른 용량 요법이 유용할 수 있고 결정될 수 있다.
[0422] 일부 구현예에서, 치료적 유효량의 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 세포의 생체내 확장을 위한 조건하에 세포를 투여하는 경우와 같이, 대상체에게 준-최적 투여량의 세포가 투여된다.
[0423] 특정 구현예에서, 세포, 또는 세포의 각 서브-유형 집단은 대상체에게 약 10만 내지 약 1000억 개의 세포 수준으로 및/또는 대상체의 체중 킬로그램당 그러한 양의 세포로 투여될 수 있는데, 예컨대 대상체의 체중 킬로그램당 10만 내지 약 500억 세포 (예컨대, 50만 미만 세포, 100만 미만 세포, 약 10만 세포, 약 20만 세포, 약 30만 세포, 약 40만 세포, 약 50만 세포, 약 100만 세포, 약 500만 세포, 약 2500만 세포, 약 5억 세포, 약 10억 세포, 약 50억 세포, 약 200억 세포, 약 300억 세포, 약 400억 세포 또는 상기 수치들 중 임의의 2 가지에 의하여 구획되는 범위), 100만 내지 약 500억 세포 (예컨대, 약 500만 세포, 약 2500만 세포, 약 5억 세포, 약 10억 세포, 약 50억 세포, 약 200억 세포, 약 300억 세포, 약 400억 세포 또는 상기 수치들 중 임의의 2 가지에 의하여 구획되는 범위), 예컨대 약 1000만 내지 약 1000억 세포 (예컨대, 약 2000만 세포, 약 3000만 세포, 약 4000만 세포, 약 6000만 세포, 약 7000만 세포, 약 8000만 세포, 약 9000만 세포, 약 100억 세포, 약 250억 세포, 약 500억 세포, 약 750억 세포, 약 900억 세포, 또는 상기 수치들 중 임의의 2 가지에 의하여 구획되는 범위), 및 일부 경우 약 1억 세포내지 약 500억 세포 (예컨대 약 1억2천만 세포, 약 2억5천만 세포, 약 3억5천만 세포, 약 4억5천만 세포, 약 6억5천만 세포, 약 8억 세포, 약 9억 세포, 약 30억 세포, 약 300억 세포, 약 450억 세포) 또는 이들 범위들 사이의 임의의 수치이다. 투여량은 질환 또는 장애 및/또는 환자 및/또는 다른 치료에 대한 특별한 속성에 따라 다를 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 이러한 값은 재조합 수용체-발현 세포의 수를 말하며; 다른 구현예에 있어서, 이들은 투여되는 T 세포 또는 PBMC 또는 총 세포의 수를 말한다.
[0424] 일부 구현예에 있어서, 상기 세포 요법은 0.1 x 106 세포/대상체의 체중 kg, 0.2 x 106 세포/kg, 0.3 x 106 세포/kg, 0.4 x 106 세포/kg, 0.5 x 106 세포/kg, 1 x 106 세포/kg, 2.0 x 106 세포/kg, 3 x 106 세포/kg 또는 5 x 106 세포/kg 이상 또는 약 그 이상, 또는 0.1 x 106 세포/대상체의 체중 kg, 0.2 x 106 세포/kg, 0.3 x 106 세포/kg, 0.4 x 106 세포/kg, 0.5 x 106 세포/kg, 1 x 106 세포/kg, 2.0 x 106 세포/kg, 3 x 106 세포/kg 또는 5 x 106 세포/kg이거나 약 그 정도인 세포 수를 포함하는 투여량의 투여를 포함한다.
[0425] 일부 구현예에 있어서, 상기 세포 요법은 각각 포함하기로, (약) 0.1 x 106 세포/대상체의 체중 kg 내지 1.0 x 107 세포/kg, (약) 0.5 x 106 세포/kg 내지 5 x 106 세포/kg, (약) 0.5 x 106 세포/kg 내지 3 x 106 세포/kg, (약) 0.5 x 106 세포/kg 내지 2 x 106 세포/kg, (약) 0.5 x 106 세포/kg 내지 1 x 106 세포/kg, (약) 1.0 x 106 세포/대상체의 체중 kg 내지 5 x 106 세포/kg, (약) 1.0 x 106 세포/kg 내지 3 x 106 세포/kg, (약) 1.0 x 106 세포/kg 내지 2 x 106 세포/kg, (약) 2.0 x 106 세포/대상체의 체중 kg 내지 5 x 106 세포/kg, (약) 2.0 x 106 세포/kg 내지 3 x 106 세포/kg, 또는 (약) 3.0 x 106 세포/대상체의 체중 kg 내지 5 x 106 세포/kg인 세포 수를 포함하는 투여량의 투여를 포함한다.
[0426] 일부 구현예에 있어서, 상기 세포 투여량은 (약) 2 x 105 세포/kg 내지 (약) 2 x 106 세포/kg, 예컨대 (약) 4 x 105 세포/kg 내지 (약) 1 x 106 세포/kg 또는 (약) 6 x 105 세포/kg 내지 (약) 8 x 105 세포/kg를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 세포 투여량은 대상체의 체중 킬로그램당 2 x 105 개 이하의 세포 (예컨대, 항원-발현, 예컨대 CAR-발현 세포)를 포함하는데 (세포/kg), 예컨대 (약) 3 x 105 세포/kg 이하의, (약) 4 x 105 세포/kg 이하의, (약) 5 x 105 세포/kg 이하의, (약) 6 x 105 세포/kg 이하의, (약) 7 x 105 세포/kg 이하의, (약) 8 x 105 세포/kg 이하의, (약) 9 x 105 세포/kg 이하의, (약) 1 x 106 세포/kg 이하의, 또는 (약) 2 x 106 세포/kg 이하이다.
[0427] 일부 구현예에 있어서, 상기 세포 투여량은 대상체의 체중 킬로그램당 (약) 2 x 105 개 이상 또는 (약) 2 x 105 개의 세포 (예컨대, 항원-발현, 예컨대 CAR-발현 세포)를 포함하는데 (세포/kg), 예컨대 (약) 3 x 105 세포/kg 이상 또는 (약) 3 x 105 세포/kg, (약) 4 x 105 세포/kg 이상 또는 (약) 4 x 105 세포/kg, (약) 5 x 105 세포/kg 이상 또는 (약) 5 x 105 세포/kg, (약) 6 x 105 세포/kg 이상 또는 (약) 6 x 105 세포/kg, (약) 7 x 105 세포/kg 이상 또는 (약) 7 x 105 세포/kg, (약) 8 x 105 세포/kg 이상 또는 (약) 8 x 105 세포/kg, (약) 9 x 105 세포/kg 이상 또는 (약) 9 x 105 세포/kg, (약) 1 x 106 세포/kg 이상 또는 (약) 1 x 106 세포/kg, 또는 (약) 2 x 106 세포/kg 이상 또는 (약) 2 x 106 세포/kg이다.
[0428] 일부 구현예에서, 세포 투여량은 투여량이 대상체의 체표면적 또는 체중에 구애되지 않거나 그에 기반하지 않도록 플랫 투여량 또는 고정 투여량이다.
[0429] 특정 구현예에서, 특정 구현예에 있어서, 세포, 또는 세포의 각 서브-유형 집단은 대상체에게 약 100만 내지 약 1000억 개의 세포 수준으로 및/또는 대상체의 체중 킬로그램당 그러한 양의 세포로 투여될 수 있는데, 예컨대 대상체의 체중 킬로그램당 100만 내지 약 500억 세포 (예컨대, 약 500만 세포, 약 2500만 세포, 약 5억 세포, 약 10억 세포, 약 50억 세포, 약 200억 세포, 약 300억 세포, 약 400억 세포 또는 상기 수치들 중 임의의 2 가지에 의하여 구획되는 범위), 예컨대 약 1000만 내지 약 1000억 세포 (예컨대, 약 2000만 세포, 약 3000만 세포, 약 4000만 세포, 약 6000만 세포, 약 7000만 세포, 약 8000만 세포, 약 9000만 세포, 약 100억 세포, 약 250억 세포, 약 500억 세포, 약 750억 세포, 약 900억 세포, 또는 상기 수치들 중 임의의 2 가지에 의하여 구획되는 범위), 및 일부 경우 약 1억 세포내지 약 500억 세포 (예컨대 약 1억2천만 세포, 약 2억5천만 세포, 약 3억5천만 세포, 약 4억5천만 세포, 약 6억5천만 세포, 약 8억 세포, 약 9억 세포, 약 30억 세포, 약 300억 세포, 약 450억 세포) 또는 이들 범위들 사이의 임의의 수치이다. 투여량은 질환 또는 장애 및/또는 환자 및/또는 다른 치료에 대한 특별한 속성에 따라 다를 수 있다.
[0430] 일부 구현예에 있어서, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우, 상기 투여량은 약 5 x 108 개의 총 재조합 수용체 (예컨대, CAR)-발현 세포, T 세포, 또는 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMCs)보다 더 적은 수의 세포를 포함하는데, 예컨대 약 1 x 106 내지 5 x 108 개의 이러한 세포, 예컨대 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 또는 5 x 108 개의 이러한 총 세포 범위의 또는 상기 수치들 중 임의의 2 수치 사이의 범위이다.
[0431] 일부 구현예에서, 세포 요법은 각각 포함하기로, (약) 1 x 105 내지 5 x 108 개의 총 재조합 수용체-발현 세포, 총 T 세포, 또는 총 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMCs) 수, (약) 5 x 105 내지 1 x 107 개의 총 재조합 수용체-발현 세포, 총 T 세포, 또는 총 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMCs) 수, 또는 (약) 1 x 106 내지 1 x 107 개의 총 재조합 수용체-발현 세포, 총 T 세포, 또는 총 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMCs) 수를 포함하는 투여량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 세포 요법은 적어도 (약) 1 x 105 개의 총 재조합 수용체-발현 세포, 총 T 세포, 또는 총 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMCs) 수를 포함하는 세포 투여량의 투여를 포함하는데, 예컨대 적어도 (약) 1 x 106 개, 적어도 (약) 1 x 107 개, 적어도 (약) 1 x 108 개의 그러한 세포를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 수는 CD3+ 또는 CD8+의 총 수에 관한 것이며, 일부 경우, 재조합 수용체-발현 (예컨대, CAR+) 세포에 관한 것이다. 일부 구현예에 있어서, 상기 세포 요법은 각각 포함하기로, (약) 1 x 105 내지 5 x 108 개의 CD3+ 또는 CD8+ 총 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포, (약) 5 x 105 내지 1 x 107 개의 CD3+ 또는 CD8+ 총 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포, 또는 (약) 1 x 106 내지 1 x 107 개의 CD3+ 또는 CD8+ 총 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포 수를 포함하는 투여량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 세포 요법은 각각 포함하기로, (약) 1 x 105 내지 5 x 108 개의 총 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포, (약) 5 x 105 내지 1 x 107 개의 총 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포, 또는 (약) 1 x 106 내지 1 x 107 개의 총 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포 수를 포함하는 투여량의 투여를 포함한다.
[0432] 일부 구현예에 있어서, 상기 투여량 중 T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함한다.
[0433] 일부 구현예에 있어서, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우, 예컨대 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 투여량에서, 상기 투여량 중의 CD8+ T 세포는 약 1 x 106 내지 5 x 108 개의 총 재조합 수용체 (예컨대, CAR)-발현 CD8+ 세포를 포함하는데, 예컨대 약 5 x 106 내지 1 x 108 개의 그러한 세포, 예컨대 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 7.5 x 107, 1 x 108, 또는 5 x 108 개의 총 그러한 세포, 또는 전술한 수치들 중 임의의 2 수치 사이의 개수이다. 일부 구현예에 있어서, 환자는 다회 투여량을 투여받고, 투여량 각각 또는 총 투여량은 전술한 수치들 중 어느 하나 이내일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 상기 세포 투여량은 각각 포함하기로, (약) 1 x 107 내지 0.75 x 108 개의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포, 1 x 107 내지 2.5 x 107 개의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포, (약) 1 x 107 내지 0.75 x 108 개의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 투여를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 세포 투여량은 약 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107 7.5 x 107, 1 x 108, 또는 5 x 108 개의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 투여를 포함한다.
[0434] 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 재조합 수용체-발현 T 세포의 투여량은 단일 투여로 대상체에게 투여되거나 2 주, 1 개월, 3 개월, 6 개월, 1 년 이상의 기간 동안 단지 1 회 투여된다.
[0435] 입양 세포 요법과 관련하여, 주어진 "투여량"의 세포의 투여는 단일 조성물로서의 주어진 양 또는 수의 세포의 투여 및/또는 단일의 중단되지 않은 투여, 예를 들어 단회 주사 또는 연속 주입을 포함하며, 또한, 주어진 양 또는 개수의 세포를 분할 투여량으로서 또는 복수 조성물로서, 3일 이하와 같은 특정 기간 동안 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 일부 상황에서, 투여량은 단일 시점에서 주어지거나 개시되는 특정 세포 수의 단일 또는 연속 투여이다. 그러나 어떤 경우에는 투여량을 3일 이내의 기간 동안 복수회 주사 또는 주입하여 투여하며, 예컨대 3일 동안 또는 2일 동안 하루 1회 투여하거나 또는 1일의 기간 동안 복수회 주입한다.
[0436] 따라서, 일부 측면에서, 투여량의 세포는 단일 의약조성물로서 투여된다. 일부 구현예에서, 투여량의 세포는 투여량의 세포를 집합적으로 함유하는 복수의 조성물을 통해 투여된다.
[0437] "분할 투여량(split dose)"이란 용어는 분할되어 하루 이상에 걸쳐 투여되는 투여량을 말한다. 이러한 유형의 투여는 본 발명의 방법에 포함되며 단일 투여량으로 간주된다. 일부 구현예에서, 분할 투여량의 세포는 투여량의 세포를 집합적으로 함유하는 복수의 조성물을 통해 3일 이하의 기간 동안 투여된다.
[0438] 따라서, 세포의 투여량은 분할 투여량으로서, 예컨대 경시적으로 분할 투여량으로서 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, 투여량은 2 일 또는 3 일에 걸쳐 대상체에게 투여될 수 있다. 투여량을 분할하는 예시적인 방법은 제1 일에 투여량의 25%를 투여하고 제2 일에 투여량의 나머지 75%를 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에 있어서, 제1 투여량의 33%는 제1 일에 투여되고 나머지 67%는 제2 일에 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 투여량의 10%는 제1 일에 투여되고, 투여량의 30%는 제2 일에 투여되고, 투여량의 60%는 제3 일에 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 분할 투여량은 3 일을 초과하여 이루어지지는 않는다.
[0439] 일부 구현예에 있어서, 투여량의 세포는 각각 투여량 중 일부의 세포를 함유하는 복수 개의 조성물 또는 용액의 투여에 의하여 투여될 수 있는데, 예컨대 제1 및 제2 조성물 또는 용액, 필요에 따라 더 다수의 조성물 또는 용액의 투여에 의하는 것이다. 일부 측면에서, 각각 상이한 세포 집단 및/또는 서브-유형을 함유하는 복수 개의 조성물은, 필요에 따라 특정 기간 내에 개별적이거나 독립적으로 투여된다. 예를 들어, 세포의 집단 또는 서브-유형은, 각각 CD8+ 및 CD4+ T 세포 및/또는 각각 CD8+-농축된 및 CD4+-농축된 집단, 예를 들어 각각 재조합 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 세포들을 각기 포함하는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 투여량의 투여는 CD8+ T 세포의 투여량 또는 CD4+ T 세포의 투여량을 포함하는 제1 조성물의 투여, 및 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 다른 투여량을 포함하는 제2 조성물의 투여를 포함한다.
[0440] 일부 구현예에서, 조성물 또는 투여량의 투여, 예를 들어, 복수 개의 세포 조성물의 투여는 세포 조성물을 개별적으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 개별적인 투여는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로, 수행된다. 일부 구현예에 있어서, 투여량은 제1 조성물 및 제2 조성물을 포함하고, 제1 조성물 및 제2 조성물은 0 내지 12 시간 간격으로, 0 내지 6 시간 간격으로 또는 0 내지 2 시간 간격으로 투여된다. 일부 구현예에 있어서, 제1 조성물의 투여 개시 및 제2 조성물의 투여 개시는 2 시간 이하의 간격으로, 1 시간 이하의 또는 30 분 이하의, 15 분 이하의, 10 분 이하의 또는 5 분 이하의 간격으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 제1 조성물의 투여 개시 및/또는 완료 및 제2 조성물의 투여의 완료 및/또는 개시는 2 시간 이하, 1 시간 이하, 또는 30 분 이하, 15 분 이하, 10 분 이하 또는 5 분 이하의 간격으로 수행된다.
[0441] 일부 조성물에서, 제1 조성물, 예를 들어 투여량 중 제1 조성물은 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 조성물에서, 제1 조성물, 예를 들어 투여량 중 제1 조성물은 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 제1 조성물은 제2 조성물 이전에 투여된다.
[0442] 일부 구현예에 있어서, 세포의 투여량 또는 조성물은 정의된 비 또는 표적 비의 재조합 수용체를 발현하는 CD8+ 세포에 대한 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ 세포, 및/또는 CD8+ 세포에 대한 CD4+ 세포를 포함하는데, 여기의 비는 임의로 대략 1:1 또는 대략 1:3 내지 대략 3:1 사이로, 예컨대 대략 1:1이다. 일부 측면에서, 표적 비 또는 원하는 비의 상이한 세포 집단 (예컨대 CD4+:CD8+ 비 또는 CAR+CD4+:CAR+CD8+ 비, 예컨대 1:1)을 갖는 조성물 또는 투여량의 투여는 상기 집단 중 하나를 함유하는 세포 조성물을 투여한 후 상기 집단 중 다른 것을 포함하는 개별적인 세포 조성물을 투여하는 것을 포함하는데, 여기서 투여는 상기 표적 비 또는 원하는 비로 또는 대략 그러한 비로 이루어진다. 일부 측면에서, 소정 비율로 세포 조성물 또는 투여량을 투여하면 T 세포 요법의 개선된 확장, 지속성 및/또는 항종양 활성이 유도된다.
[0443] 일부 구현예에서, 대상체는 세포의 다중 투여량, 예를 들어, 2회 이상의 투여량 또는 다수회의 연속 투여량을 투여 받는다. 일부 구현예에서, 2 회 투여량이 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 연속 투여량을 투여받으며, 예컨대, 제1 투여량 투여로부터 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일 후에 제2 투여량이 투여된다. 일부 구현예에서, 연속 투여량의 투여 후에 추가 투여량이 투여되도록 제1 투여량 투여 후에 다수회의 연속 투여량이 투여된다. 일부 측면에서, 추가 투여량으로 대상체에게 투여된 세포의 수는 제1 투여량 및/또는 연속 투여량과 동일하거나 유사하다. 일부 구현예에서, 추가 투여량은 이전 투여량보다 크다.
[0444] 일부 측면에서, 제1 및/또는 연속 투여량의 크기는 투여량의 크기는 하나 이상의 기준에 기초하여 결정되는데, 예컨대 화학요법과 같은 이전 치료에 대한 환자의 반응, 대상체의 질환 부담, 예컨대 종양 부하, 벌크, 크기 또는 정도, 세기, 또는 전이 유형, 단계 및/또는 독성 결과, 예컨대 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경독성, 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응를 발병할 가능성 또는 이환률에 기초한다.
[0445] 일부 측면에서, 제1 투여량의 투여와 연속 투여량 사이의 시간은 약 9 내지 약 35 일, 약 14 내지 약 28 일 또는 15 내지 27 일이다. 일부 구현예에서, 연속 투여량의 투여는 제1 투여량 투여 후 약 14 일 초과와 약 28 일 미만사이의 시점에서 이루어진다. 일부 측면에서, 제1 투여량의 투여와 연속 투여량의 투여 사이의 시간은 약 21 일이다. 일부 구현예에서, 추가 투여량 또는 투여량들, 예컨대 연속 투여량들은 연속 투여량의 투여 후에 투여된다. 일부 측면에서, 추가적인 연속 투여량 또는 투여량들은 이전 투여량의 투여 후 적어도 약 14 일 및 약 28 일 미만에 투여된다. 일부 구현예에서, 추가 투여량은 이전 투여 후 약 14 일 미만에, 예를 들어 이전 투여량 투여 후 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13 일 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 이전 투여량 투여로부터 약 14일 미만에는 투여가 이루어지지 않고 및/또는 이전 투여량으로부터 약 28일 초과 후에도 투여가 이루어지지 않는다.
[0446] 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 재조합 수용체-발현 세포의 투여량은 T 세포의 제1 투여량 및 T 세포의 연속 투여량을 포함하는, 2 회 투여량 (예를 들어, 2배 투여량(double dose))을 포함하며, 여기서, 제1 투여량과 제2 투여량 중 일방 또는 양방 모두는 T 세포를 분할 투여량으로 투여하는 것을 포함한다.
[0447] 일부 구현예에서, 세포의 투여량은 일반적으로 질환 부담을 감소시키는데 효과적 일만큼 충분히 크다.
[0448] 일부 구현예에서, 세포는 원하는 투여량으로 투여되는데, 이는 일부 측면에 있어서 원하는 투여량 또는 세포 수 또는 세포 유형(들) 및/또는 원하는 세포 유형의 비를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에 있어서, 상기 세포의 투여량은 총 세포 수 (또는 체중 kg당 세포 수) 및 개개의 서브-유형 집단의 원하는 비, 예컨대 CD4+ 대 CD8+ 비에 기초한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 세포의 투여량은 개개 집단에서 세포의, 또는 개개의 세포 유형의 원하는 총 세포 수 (또는 체중 kg당 세포 수)에 기초한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 투여량은 이러한 특징의 조합에 기초하는데, 예컨대 원하는 총 세포 수, 원하는 비, 및 개개 집단에서 원하는 총 세포 수와 같은 특징이다.
[0449] 일부 구현예에 있어서, 세포 집단 또는 서브-유형, 예컨대 CD8+ 및 CD4+ T 세포는 원하는 총 세포의 투여량, 예컨대 원하는 T 세포의 투여량의 용인되는 차이로, 또는 그 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 투여량은 원하는 세포의 수 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중 단위당 원하는 세포의 수로서, 예컨대 세포/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 투여량은 최소한의 세포 수 또는 체중 단위당 최소한의 세포 수이거나, 또는 그보다 많다. 일부 측면에서, 원하는 투여량으로 투여된 총 세포 중에서, 각 집단 또는 서브-유형은 원하는 결과 비로 (예컨대 CD4+ 대 CD8+ 비), 또는 그 근처에 존재하는데, 예컨대 그러한 비의 특정 용인 차이 내이거나 오류 내이다.
[0450] 일부 구현예에 있어서, 세포는 하나 이상의 각 세포 집단 또는 서브-유형의 원하는 투여량, 예컨대 CD4+ 세포의 원하는 투여량 및/또는 CD8+ 세포의 원하는 투여량의 용인되는 차이로 또는 그 이내로 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 투여량은 상기 서브-유형 또는 집단의 원하는 세포 수, 또는 상기 세포가 투여되는 대상체의 체중 단위당 원하는 그러한 세포의 수, 예컨대 세포/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 투여량은 최소한의 세포 수 또는 체중 단위당 최소한의 세포 수이거나, 또는 그보다 많다.
[0451] 따라서, 일부 구현예에 있어서, 투여량은 총 세포의 원하는 고정 투여량 및 원하는 비에 기초하고, 및/또는 하나 이상의, 예를 들어 각각 개별적인 서브-유형 또는 서브-집단의 원하는 고정 투여량에 기초한다. 따라서, 일부 구현예에 있어서, 투여량은 T 세포의 원하는 고정 또는 최소 투여량 및 원하는 CD4+ 대 CD8+ 세포의 비에 기초하고 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포의 원하는 고정 또는 최소 투여량에 기초한다.
[0452] 일부 구현예에 있어서, 세포는 다수의 세포 집단 또는 서브-유형, 예컨대 CD4+ 및 CD8+ 세포 또는 서브 유형의 원하는 결과 비의 용인 범위에서 또는 그 이내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 비는 특정 비일 수 있고 또는 비의 범위일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, 원하는 비 (예컨대 CD4+ 대 CD8+ 세포의 비)는 (약) 1:5 내지 (약) 5:1 (또는 약 1:5보다 크고, 약 5:1보다 작음), 또는 (약) 1:3 내지 (약) 3:1 (또는 약 1:3보다 크고, 약 3:1보다 작음), 예컨대 (약) 2:1 내지 (약) 1:5 (또는 약 1:5보다 크고, 약 2:1보다 작음)이고, 예컨대 (약) 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 또는 1:5이다. 일부 측면에서, 상기 용인되는 차이는 상기 원하는 비의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4% 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 및 이들 범위 사이의 임의의 수치를 포함하여 그 이내이다.
[0453] 특정 구현예에 있어서, 세포의 수 및/또는 농도는 재조합 수용체 (예를 들어, CAR)-발현 세포의 수를 지칭한다. 다른 구현예에 있어서, 상기 세포의 수 및/또는 농도는 투여된 모든 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵구 (PBMC)의 수 또는 농도를 말한다.
[0454] 일부 측면에서, 투여량의 크기는 하나 이상의 기준에 기초하여 결정되는데, 예컨대 화학요법과 같은 이전 치료에 대한 환자의 반응, 대상체의 질환 부담, 예컨대 종양 부하, 벌크, 크기 또는 정도, 세기, 또는 전이 유형, 단계 및/또는 독성 결과, 예컨대 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경독성, 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응를 발병할 가능성 또는 이환률에 기초한다.
[0455] 일부 구현예에서, 상기 방법은 또한 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 세포의 하나 이상의 추가 투여량을 투여하는 것 및/또는 임파 결핍 치료를 포함하고, 및/또는 상기 방법 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 투여량은 초기 투여량과 동일하다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 투여량은 초기 투여량과 다르며, 예를 들어, 초기 투여량보다 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 또는 그 이상 더 높거나, 초기 투여량보다 예컨대, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 또는 그 이상 더 낮을 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 투여량의 투여는 초기 치료 또는 임의의 이전 치료에 대한 환자의 반응, 대상체의 질환 부담, 예컨대 종양 부하, 벌크, 크기 또는 정도, 세기, 또는 전이 유형, 단계 및/또는 독성 결과, 예컨대 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경독성, 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응를 발병할 가능성 또는 이환률에 기초하여 결정된다.
[0456] 일부 구현예에서, 세포의 비교적 낮은 투여량, 예컨대 세포의 준-최적 투여량 또는 치료적 유효량보다 더 낮은 세포의 투여량을 투여할 수 있는데, 이러한 투여량은 생체내 자극(예컨대 내인성 항원 또는 외인성 제제에 의해)시, 대상체에 존재하는 조작된 세포의 수를 부스트, 예컨대 증가 또는 확장시킬 수 있다. 그러한 임의의 구현예에서, 세포의 확장 및/또는 활성화는 예컨대 세포 투여 후 대상체의 체내에서 조작된 세포의 확장과 같이, 생체내에서 항원에 노출된 후에 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 생체내 확장의 범위, 정도 또는 크기는 예를 들어, 투여된 세포, 예컨대 재조합 수용체 발현 세포의 확장, 증식, 생존 및/또는 효능을 조절, 예컨대 증가시킬 수 있는 다양한 방법에 의해 추가로 증가, 부스팅 또는 증진될 수 있다.
[0457] 일단 세포가 대상체 (예컨대 인간)에 투여되면, 일부 측면에서의 세포 집단의 생물학적 활성을 다수의 공지된 방법 중 임의의 방법에 의해 측정한다. 평가할 파라미터는 예를 들어 이미징에 의해, 또는 ELISA 또는 유동 세포 측정법에 의해 생체내에서 항원에 세포의 특이적 결합을 평가하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 표적 세포를 파괴시키는 세포의 능력은 예를 들어 문헌 [Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), 및 Herman et al. J. Immunological 방법, 285(1): 25-40 (2004)]에 기재된 세포독성 검정과 같은 당업계에 공된 임의의 적합한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포의 생물학적 활성은 또한 CD107a, IFNγ, IL-2 및 TNF와 같은 특정 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 분석함으로써 측정될 수 있다. 일부 측면에서, 생물학적 활성은 종양 부하 또는 부하의 감소와 같은 임상적 결과를 평가함으로써 측정된다. 일부 측면에서, 독성 결과, 세포의 지속성 및/또는 확장, 및/또는 숙주 면역 반응의 존재 또는 부재가 평가된다.
B. 조성물 및 제형
[0458] 일부 구현예에서, 재조합 항원 수용체, 예컨대 CAR 또는 TCR에 의해 조작된 세포를 포함하는 세포의 투여량이 의약 조성물 또는 제형과 같은 조성물 또는 제형으로서 제공된다. 이러한 조성물은 예컨대 질환, 병태 및 장애의 예방 또는 치료, 또는 검출, 진단 및 예후 방법에서와 같이, 제겅된 방법 및/또는 제공된 제조 물품 또는 조성물과 함께 사용될 수 있다.
[0459] 용어 "약학적 제형"은, 내부에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 이러한 형태 내에서 유효하도록 하고, 제형이 투여되는 대상체에 허용 가능하지 않을 정도로 유독한 추가의 성분을 함유하지 않은 제제를 지칭한다.
[0460] "약학적으로 허용 가능한 담체"는, 대상체에 유독하지 않은, 활성 성분 이외의 약학적 제형 중 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 완충액, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
[0461] 일부 구현예에 있어서, 담체의 선택은 부분적으로는, 특정 세포 또는 제제 및/또는 투여 방법에 의해 결정된다. 따라서, 다양한 적합한 제형이 존재한다. 예를 들어, 약학적 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적합한 보존제는, 예를 들어 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산나트륨 및 염화벤잘코늄을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 2종 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 그의 혼합물은 통상적으로 총 조성물 중 약 0.0001 중량% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 담체는, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로, 사용되는 투여량 및 농도에서 수용체에 유독하지 않은 것이며, 인산염, 시트르산염 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제 (예컨대, 염화옥타데실디메틸벤질 암모늄; 염화헥사메토늄, 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 소수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염-형성 반대-이온; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
[0462] 일부 측면에서, 조성물 중에 완충제가 포함된다. 적합한 완충제는, 예를 들어 시트르산, 시트르산나트륨, 인산, 인산칼륨 및 다양한 다른 산 및 염을 포함한다. 일부 측면에서, 2종 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 그의 혼합물은 통상적으로 총 조성물 중 약 0.001 중량% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약학적 조성물의 제조 방법이 공지되어 있다. 예시적인 방법이, 예를 들어, 문헌 [Remington: Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed.(May 1, 2005)]에 더욱 상세히 기재되어 있다.
[0463] 제형 또는 조성물은 또한, 세포 또는 제제에 의해 예방되거나 치료되는 특정 지표, 질환 또는 병태에 유용한 1종 이상의 활성 성분을 함유할 수 있는데, 여기서 상기 각 활성은 서로 유해한 영향을 주지 않는 것인 하나 이상의 활성 성분이다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합물 중에 적절히 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 화학치료제, 예를 들어 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등과 같은 다른 약학적 활성 제제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제제 또는 세포는 염의 형태로, 예를 들어 약제학적으로 허용되는 염으로 투여된다. 제약학적으로 허용되는 적절한 산 부가염에는 염산, 브롬산, 인산, 메타인산, 질산 및 황산과 같은 무기산, 및 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산, 벤조산, 글리콜산, 글루콘산, 숙신산 및 아릴설폰산, 예를 들어 p-톨루엔설폰산과 같은 유기산이 포함된다.
[0464] 약학적 조성물은 일부 구현예에서, 질환 또는 병태의 치료 또는 예방에 유효한 양, 예컨대 치료적 유효량 또는 예방법적 유효량의 제제 또는 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 치료 대상체의 주기적 평가에 의해, 치료 또는 예방법적 효능을 모니터링한다. 수일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여에 대하여, 병태에 따라, 치료는 원하는 질환 징후에 대한 억제가 나타날 때까지 반복된다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있고 결정될 수 있다. 요망되는 투여량은 조성물의 단일 볼루스 투여, 조성물의 다회 볼루스 투여 또는 조성물의 연속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
[0465] 제제 또는 세포는 예를 들어, 볼루스 주입, 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사, 안내 주사, 눈 주위 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 경 중격 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 전방내 주사, 결막하 주사 (subconjectval injection), 결막하 주사 (subconjuntival injection), 안각건하 주사, 안구후 주사, 안구 주위 주사 또는 후방 공막 부근 전달에 의한 임의의 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 이들은 비경구, 폐내 및 비내, 및 국소 치료가 요망되는 경우, 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 소정의 투여량이 세포 또는 제제의 단일 볼루스 투여에 의해, 예를 들어 3 일 이하의 기간에 걸쳐, 제제 또는 세포의 다회의 볼루스 투여 또는 세포의 연속 주입 투여에 의해 투여된다.
[0466] 질환의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 치료될 질환의 유형, 제제 또는 제제들의 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 제제 또는 세포가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 치료, 대상체의 임상 기록 및 제제 또는 세포에 대한 반응, 주치의의 재량에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 조성물 및 세포는 한 번에 또는 일련의 치료를 통해 적절하게 대상체에게 투여된다.
[0467] 세포 또는 제제는 표준 기술, 제형 및/또는 장치를 이용하여 투여된다. 조성물의 보관 및 투여를 위한 제형 및 장치, 예컨대 시린지 및 바이알이 제공된다. 세포와 관련하여 투여는 동종 또는 이종일 수 있다. 예컨대, 한 대상체로부터 면역응답 세포 또는 전구세포(progenitors)를 수득하여 이를 동일 또는 상이한, 호환가능한 대상체에게 투여할 수 있다. 말초혈액에서 유래하는 면역응답 세포 또는 그의 자손(예컨대 생체내, 생체외 또는 시험관내 유래됨)은 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥 주사 또는 비경구 투여를 비롯한 국소화된 주사를 통해 투여될 수 있다. 치료 조성물(예컨대 유전자 변형된 면역응답 세포를 함유하는 의약 조성물 또는 신경독성 증상을 치료 또는 완화하는 제제)을 투여하는 경우, 일반적으로 주사가능한 단위 투여 제형(용액, 현탁액, 에멀젼)으로서 제제화된다.
[0468] 일부 구현예에서 세포 집단 및 조성물은 표준 투여 기술, 예컨대 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 협강내(buccal), 설하 또는 좌제 투여 경로로 투여된다. 일부 구현예에서, 제제 또는 세포 집단은 비경구 투여된다. 본 발명에서 "비경구"라는 용어는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질내 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제 또는 세포 집단은 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 이용하여 대상체에게 투여된다.
[0469] 일부 구현예에서, 조성물이 멸균 액상 제제, 예컨대 등장성 수용액, 현탁액, 에멀젼, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공되며, 이들은 일부 측면에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액상 제제는 보통 겔, 기타 점성 조성물 및 고체 조성물에 비해 제조하기가 더 쉽다. 이에 더해, 액상 조성물은 특히 주사에 의해, 투여하기가 다소 더 간편하다. 다른 한편으로, 점성 조성물은 특정 조직과의 보다 장기간 접촉을 제공하기 위해 적절한 점도 범위를 갖도록 제제화될 수 있다. 액상 및 점성 조성물은 예컨대 물, 염수, 인산염 완충 염수, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적절한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
[0470] 예컨대 적절한 담체, 희석제 또는 부형제, 예컨대 멸균수, 생리식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과 혼합된 용매에 세포 또는 제제를 혼입시킴으로써 주사가능한 멸균 용액을 제조할 수 있다.
[0471] 생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이다. 예컨대 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 멸균을 쉽게 달성할 수 있다.
C. 복합 요법, 예컨대 세포 확장 및 활성을 조절하기 위한 제제들
[0472] 일부 구현예에서, 세포는 복합 치료의 일부로서, 예컨대 다른 제제, 예컨대 치료적 제제 에컨대 약물과 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 다른 제제, 예컨대 약물은 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 제제, 예컨대 세포 독성 또는 치료제와 같이 치료적 개재일 수 있다. 일부 구현예에서, 다른 제제, 예를 들어 약물은 세포의 확장, 증식, 생존 및/또는 효능을 향상, 증가 또는 부스팅하는 제제 일 수 있다. 일부 상황에서, 세포 집단이 하나 이상의 추가의 치료제의 효과를 증진시키도록 또는 그 역이 되도록, 세포를 다른 치료법과 충분히 근접한 시간 내에 공동-투여한다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가의 치료제 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가의 치료제 후에 투여된다.
[0473] 일부 구현예에서, 상기 방법은 예컨대 투여된 세포, 예를 들어 재조합 수용체 발현 세포의 확장, 증식, 생존 및/또는 효능을 증가, 증강 또는 강화시킬 수 있는 약물 또는 제제와 동시 또는 순차 투여하는 것과 같은 조합 투여를 포함하는 방법을 포괄한다. 일부 구현예에서, 이러한 제제는 약물과 같은 다른 제제와 임의의 순서로 순차적으로 또는 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 제제는 세포, 예컨대 CAR과 같은 재조합 수용체 발현 세포의 투여 전, 투여 중, 투여 후 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 제제는 도입유전자, 예를 들어 재조합 수용체를 인코딩하는 도입유전자를 특이적으로 조절함으로써 조작된 세포의 확장, 증식, 생존 및/또는 효능을 특이적으로 증가, 부스팅 또는 증진시키는 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 제제는 투여된 세포, 예를 들어 T 세포와 같은 면역 세포의 세포 확장 및/또는 활성을 조절하는 제제를 포함한다.
[0474] 일부 구현예에서, 투여된 세포, 예를 들어, 재조합 수용체를 발현하도록 조작된 세포는 투여된 세포의 확장, 증식, 생존 및/또는 효능을 증가, 부스팅 또는 증진시키기 위해 변형된다. 일부 구현예에서, 투여된 세포, 예를 들어, 재조합 수용체를 발현하도록 조작된 세포는, 예컨대 제제의 투여에 의해 조작된 세포의 확장, 증식, 생존 및/또는 효능이 조절 및/또는 제어되도록 변형된다.
[0475] 일부 구현예에서, 상기 방법은 생체내에서 조작된 세포의 증식, 확장 및/또는 생존을 억제하는 억제 인자의 효과를 감소, 억제 및/또는 최소화하기위한 생체내 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 생체내에서 조작된 세포의 증식, 확장 및/또는 생존을 촉진, 지지 및/또는 증진시키는 생체내 단계를 포함한다.
[0476] 일부 구현예에서, 추가적인 제제는 소분자, 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 항체 모방물, 앱타머 또는 핵산 분자 (예컨대 siRNA), 지질, 다당류 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 특정 인자, 분자, 수용체, 기능 및/또는 효소의 억제제 또는 활성화제이다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 특정 인자, 분자, 수용체, 기능 및/또는 효소의 작용제 또는 길항제이다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 하나 이상의 인자 및/또는 대사 물질의 유사체 또는 유도체이다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 세포, 예를 들어 조작된 세포이다.
1. 도입유전자에 특이적인 확장을 위한 제제
[0477] 일부 구현예에서, 상기 방법은 투여된 세포에 더해서 제제, 예를 들어, 조합 요법에서와 같이 재조합 수용체를 발현하도록 조작된 세포를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 도입유전자, 예컨대 재조합 수용체를 인코딩하는 도입유전자를 특이적으로 조절함으로써, 조작된 세포의 확장, 증식, 생존 및/또는 효능을 특이적으로 증가, 부스팅 또는 증진시키는 제제. 일부 구현예에서, 제제는 도입유전자, 예를 들어 재조합 수용체를 특이적으로 표적으로 한다. 일부 구현예에서, 제제는 재조합 수용체의 활성 및/또는 도입유전자에 의해 인코딩되는 재조합 분자의 전부 또는 일부의 다른 기능에 특이적으로 결합, 활성화 및/또는 강화시킨다. 일부 구현예에서, 재조합 세포와 제제를 조합 투여함으로써 투여된 세포의 증식, 확장 및/또는 생존을 증진, 부스팅 또는 증가시킬 수 있으며, 예를 들어, 세포의 생체내 확장을 향상시킬 수 있다.
[0478] 일부 구현예에서, 도입유전자-특이적 확장을 위한 예시적 방법 또는 제제는 내인성 항원 노출, 백신 접종, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및/또는 조절가능한 재조합 수용체를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 도입유전자-특이적 확장은 백신 접종 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 펩타이드 백신 또는 세포-기반 백신, 예를 들어 세포 독성 백신, 예컨대 재조합 수용체에 의해 인식되는 특정 항원을 발현하도록 조작된 세포이다 (참조: 예컨대, WO 2016/069647, WO 2011/066048, US 2016/0304624, US Pat. No. 9,476,028 및 Hailemichael 및 Overwijk, Int J Biochem 세포 Biol. (2014) 53: 46-50). 일부 구현예에서, 도입 유전자-특이적 확장을 위한 방법은 항-이디오타입 항체를 투여하는 것을 포함한다. 그의 항원-결합 단편을 포함하는 항-이디오타입 항체는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예컨대, 키메라 항원 수용체 (CAR)와 같은 재조합 수용체의 항원-결합 도메인의 이디오토프를 특이적으로 인식하거나, 이에 특이적으로 표적화되거나 및/또는 이에 특이적으로 결합한다. 이디오토프는 항체의 가변 부분 내의 임의의 단일 항원 결정기 또는 에피토프이다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입항체 또는 그의 항원-결합 단편은 작용제이거나 및/또는 특정 항체 또는 그 특정 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하는 컨쥬게이트 또는 재조합 수용체를 발현하는 세포를 자극하기 위한 특이적인 활성을 나타낸다 (예컨대 참조: 미국특허공개번호. US 2016/0096902; US 2016/0068601; US 2014/0322183; US 2015/0175711; US 2015/283178; 미국특허 No. 9,102,760; Jena et al. PloS one (2013) 8(3):e57838; Long et al., Nature Medicine (2015) 21(6):581-590; Lee et al., The Lancet (2015) 385(9967):517-528; Zhao et al., PloS One (2014) 9(5):e96697; Leung et al., MAbs. (2015) 7(1):66-76).
2. 세포 확장 또는 활성을 조절하기 위한 제제
[0479] 일부 구현예에서, 상기 방법은 투여되는 조작된 세포를 포함하여 일반적으로 면역 세포 또는 면역 기능의 확장, 증식, 생존 및/또는 활성의 조절을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 생체내 투여된 세포를 포함하는 면역 세포의 확장, 증식, 생존 및/또는 활성을 일반적으로 면역 자극하는 단계 또는 일반적으로 촉진, 증강, 증가 및/또는 부스팅시키는 단계를 포함하거나 또는 일반적으로 면역자극적인 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 면역 세포, 예를 들어 투여된 세포의 생체내에서의 증식, 확장 및/또는 생존을 억제하는 억제 인자의 효과를 감소, 억제 및/또는 최소화할 수 있다.
a. 음성 조절제의 억제
[0480] 일부 구현예에서, 상기 방법은 투여된 세포, 예컨대 조작된 면역 세포의 증식, 확장 및/또는 활성화의 음성 조절제를 억제함으로써, 조작된 세포의 확장을 조절하는 것을 포함한다. 대상체 체내의 특정 환경에서, 재조합 수용체를 발현하는 투여된 세포는, 세포의 성장, 증식, 확장 및/또는 생존을 억제 또는 억압하는 환경, 예컨대 면역억제 환경(immunosuppressive environments)에 직면할 수 있다. 예를 들어, 면역억제 환경에는 면역억제성 사이토카인, 조절적 조절제 및 공동-억제 수용체가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제를 사용하여 투여된 세포의 확장을 조절할 수 있으며, 예를 들어 억제 환경을 극복할 수 있다.
[0481] 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 면역조절 제제, 면역 체크포인트 억제제, 대사 경로의 조절제, 아데노신 경로 또는 아데노신 수용체 길항제 또는 작용제 및 신호전달 경로의 조절제, 예컨대 키나아제 억제제를 포함한다.
[0482] 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 면역 체크포인트 억제제와 같은 면역조절 제제이다. 일부 사례에서, 부가적인 제제는 투여된 세포의 확장 및/또는 증식을 증가, 증진 또는 증대시킴으로써 면역 체크포인트 단백질 (즉, 면역 체크포인트 억제제)을 차단함에 따라 면역 반응을 증가, 증진 또는 증가시킨다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 조작된 세포, 예를 들어, 재조합 수용체-발현 세포의 활성을 증가시키는 제제이며, 면역 억제 분자 또는 면역 체크포인트 분자를 억제하는 분자이다. 면역억제 분자의 예로는 PD-1, PD-L1, CTLA4, TEVI3, CEACAM (예컨대, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR β를 들 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 면역 체크포인트 단백질에 지향된 항체, 예컨대 세포 독성 T-림프구 항원 4 (CTLA4 또는 CD152), 프로그램된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1), 또는 프로그램된 세포 사멸 단백질 1 리간드 1(PD-L1)에 지향된 항체일 수 있다 (예컨대 참조: Pardoll, Nat Rev Cancer. 2012 Mar. 22; 12(4):252-264).
[0483] 일부 구현예에서, 상기 방법은 재조합 수용체를 발현하는 세포를 억제성 세포 표면 수용체, 예를 들어, 형질전환 성장 인자 베타 수용체 (TGFβR)를 억제하는 제제와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여된 세포, 예를 들어, 재조합 수용체 발현 세포는 그의 이펙터 기능을 억제할 수 있는 면역억제 성 사이토카인의 효과에 저항하도록 조작될 수 있다(예컨대, 참조: Foster et al., J Immunother. (2008) 31:500-505; Bollard et al., Molecular Therapy. (2012) 20:S22; Bendle et al., J. Immunol. (2013) 191(6):3232-3239). 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 항-TGFβ 항체 또는 항-TGFβR 항체이다 (예컨대, WO 2011/109789 참조).
[0484] 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 면역억제 인자, 예를 들어 아데노신의 대사, 신호전달 및/또는 수송을 조절한다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 세포외 아데노신 또는 아데노신 수용체의 억제제이거나, 또는 세포외 아데노신 수준의 저감 또는 감소를 유발하는 제제, 예를 들어 세포외 아데노신의 형성을 방지, 분해, 불활성화 및/또는 감소시키는 제제이다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 A2a, A2b 및/또는 A3 수용체와 같은 아데노신 수용체 길항제이다.
[0485] 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 아데노신 수준 및/또는 아데노신 경로 성분의 조절제이다. 아데노신은 체내에서 면역조절제로서 기능할 수 있다. 예를 들어, 아데노신 및 아데노신 수용체 아형을 비선택적으로 활성화시키는 일부 아데노신 유사체는 염증성 산화 생성물의 호중구 생성을 감소시킨다 (Cronstein et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 451:291, 1985; Roberts et al., Biochem. J., 227:669, 1985; Schrier et al., J. Immunol. 137:3284, 1986; Cronstein et al., Clinical Immunol. Immunopath. 42:76, 1987). 일부 경우에서, 세포외 아데노신 또는 아데노신 유사체의 농도는 특정 환경, 예를 들어, 종양미세환경 (TME)에서 증가 할 수 있다. 일부 경우, 아데노신 또는 아데노신 유사체 신호전달은 저산소증 또는 저산소증 관련 인자 또는 그 조절에 관련된 인자, 예를 들어 저산소증 유도성 인자 (HIF)에 의존한다. 일부 구현예에서, 아데노신 신호전달의 증가는 전염증성 사이토 카인 생산의 억제를 초래하는 세포내 cAMP 및 cAMP-의존성 단백질 키나아제를 증가시켜, 면역억제 분자의 합성 및 Tregs의 발달을 유도할 수 있다 (Sitkovsky et al., Cancer Immunol Res (2014) 2(7):598-605). 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 아데노신, 아데노신 유사체 및/또는 아데노신 신호전달의 면역억제 효과를 감소시키거나 역전시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 저산소증에 의해 유발된 A2-아데노신성 T 세포 면역 제를 감소시키거나 역전시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 아데노신 수용체의 길항제, 세포외 아데노신-분해 제제, CD39/CD73 외효소(ectoenzymes)에 의한 아데노신 생성 억제제 및 저산소-HIF-1α 신호전달 억제제 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 아데노신 수용체 길항제 또는 작용제이다.
[0486] 세포외 아데노신 억제제 (세포외 아데노신의 형성을 방지하고, 세포외 아데노신을 분해, 불활성화, 및/또는 감소시키는 제제) 및/또는 아데노신 수용체 억제제(예컨대 아데노신 수용체 길항제)에 의한 세포외 아데노신 또는 아데노신 수용체의 억제 또는 감소는, 대식세포, 호중구, 과립구, 수지상 세포, T-및/또는 B 세포 매개 반응과 같은 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 또한, Gs 단백질 매개된 cAMP 의존성 세포내 경로의 억제제 및 아데노신 수용체-유발된 Gi 단백질 매개된 세포내 경로의 억제제 역시도 급성 및 만성 염증을 증가시킬 수 있다.
[0487] 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 아데노신 수용체 길항제 또는 작용제, 예를 들어 아데노신 수용체 A2a, A2b, A1 및 A3 중 하나 이상의 길항제 또는 작용제이다. 아데닐레이트 사이클라제 활성을 A1 및 A3은 억제하고, A2a 및 A2b는자극한다. A2a, A2b 및 A3과 같은 특정 아데노신 수용체는 염증 동안 면역 반응을 억제 또는 감소시킬 수 있다. 따라서, 면역억제성 아데노신 수용체의 길항 작용은 면역 반응, 예를 들어, 투여된 세포, 예를 들어, CAR-발현 T 세포로부터의 면역 반응을 증가, 부스팅 또는 증강시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 아데노신 수용체를 통한 세포외 아데노신 및 아데노신-유발 신호전달의 생성을 억제한다. 예를 들어, 면역 반응, 국소 조직 염증 및 표적화된 조직 파괴의 증진은, 아데노신-생성 국소 조직 저산소증의 억제 또는 감소; 누적된 세포외 아데노신의 분해 (또는 비활성화시킴); 면역 세포상에서의 아데노신 수용체의 발현의 예방 또는 감소; 및/또는 아데노신 수용체를 통한 아데노신 리간드에 의한 신호전달의 억제/길항에 의해 증강될 수 있다.
[0488] 길항제는 생물학적 반응을 유도하지 않으면서, 세포 수용체에 결합하는 제제로서, 다른 것의 작용을 무력하게하는 경향이있는 임의의 물질이다. 일부 구현예에서, 길항제는 A2a, A2b 또는 A3 수용체와 같은 아데노신 수용체에 대한 길항제인 화학적 화합물이다. 일부 구현예에서, 길항제는 아데노신 수용체와 결합하지만 G1 단백질 의존성 세포내 경로를 유발하지 않는 펩타이드 또는 펩타이드모방체(pepidomimetic)이다. 예시적인 아데노신 수용체 길항제는 미국특허 Nos. 5,565,566; 5,545,627, 5,981,524; 5,861,405; 6,066,642; 6,326,390; 5,670,501; 6,117,998; 6,232,297; 5,786,360; 5,424,297; 6,313,131, 5,504,090; 및 6,322,771; 및 Jacobson 및 Gao, Nat Rev Drug Discov. (2006) 5(3): 247-264에 설명되어 있다.
b. 면역자극의 촉진
[0489] 일부 구현예에서, 상기 방법은 면역자극 제제인 부가적인 제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 일반적으로 면역 세포의 증식, 확장, 생존 및/또는 효능을 촉진시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 투여된 세포, 예를 들어, 재조합 수용체-발현 세포를 특이적으로 촉진시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 리간드이다.
[0490] 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 면역자극 리간드, 예를 들어, CD40L이다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-3, IL-6, IL-11, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 알파, 베타 또는 감마 인터페론 (IFN) 및 에리트로포이에틴 (EPO)이다.
3. 림프구고갈 요법(Lymphodepleting Therapies)
[0491] 일부 측면에서, 제공된 방법은 세포, 예를 들어, 재조합 수용체-발현 세포의 투여 개시 전 또는 투여 개시와 동시에, 하나 이상의 림프구고갈 치료를 수행하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 림프구고갈 치료는 사이클로포스파미드와 같은 포스파미드의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 림프구고갈 치료는 플루다라빈의 투여를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 플루다 라빈은 림프구고갈 요법에서 제외된다. 일부 구현예에서, 림프구고갈 치료는 수행되지 않는다.
[0492] 면역고갈 (예컨대 림프구고갈) 요법을 받는 사전 컨디셔닝(preconditioning) 대상체는 입양 세포 요법 (ACT)의 효과를 향상시킬 수 있다. 사이클로스포린과 플루다라빈과의 조합을 비롯한, 림프구고갈 제제를 이용한 사전 컨디셔닝은, 전달된 세포의 반응 및/또는 지속성을 향상시키는 것을 포함하여, 세포 치료에서 전달된 종양 침윤 림프구 (TIL) 세포의 효능을 향상 시키는데 효과적이었다. 예컨대 참조: Dudley et al., Science, 298, 850-54 (2002); Rosenberg et al., Clin Cancer Res, 17(13):4550-4557 (2011).　 마찬가지로, CAR+ T 세포의 맥락에서, 일부 연구에서는 림프구고갈 제제, 가장 일반적으로 사이클로포스파미드, 플루다라빈, 벤다무스틴 또는 이들의 조합을 통합시켰으며, 때때로 저선량 방사선 조사를 동반시켰다. 참조; Han et al. Journal of Hematology & Oncology, 6:47 (2013); Kochenderfer et al., Blood, 119: 2709-2720 (2012); Kalos et al., Sci Transl Med, 3(95):95ra73 (2011); Clinical Trial Study Record Nos.: NCT02315612; NCT01822652.　
[0493] 이러한 사전 컨디셔닝은 치료의 효능을 약화시킬 수 있는 하나 이상의 다양한 결과의 위험을 감소시키는 것을 목표로 수행될 수 있다. 여기에는 T 세포, B 세포, NK 세포가 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15와 같은 사이토카인의 활성화 또는 항상성을 위해 TIL과 경쟁하는 "사이토카인 싱크(cytokine sink)"라고 알려진 현상; 조절 T 세포, NK 세포 또는 면역계의 다른 세포에 의한 TIL 억제; 종양 미세환경에서 음성 조절제의 영향이 포함된다. Muranski 등, Nat Clin Pract Oncol. 12 월; 3 (12) : 668-681 (2006)].
[0494] 그러므로 일부 구현예에서, 제공된 방법은 대상체에게 림프구고갈 치료를 실시하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 투여량 투여 전에 대상체에게 림프구고갈 요법을 실시하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 림프구고갈 치료는 플루다라빈 및/또는 사이클로포스파미드와 같은 화학요법제를 함유한다. 일부 구현예에서, 세포의 투여 및/또는 림프구갈 치료는 외래 환자 전달을 통해 수행된다.
[0495] 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 투여량 투여 전에 대상체에게 사이클로포스파미드, 플루다라빈 또는 그의 조합과 같은 림프구고갈 제제 또는 화학요법제와 같은 사전 컨디셔닝 제제를 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 대상체는 첫번째 또는 후속 투여량 투여로부터 적어도 2 일 전에, 예를 들어 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7 일 전에 사전 컨디셔닝 제제를 투여받을 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 세포 투여량 투여 전 7 일 이내, 예를 들어 6, 5, 4, 3 또는 2 일 이내에 사전 컨디셔닝 제를 투여받는다.
[0496] 일부 구현예에서, 대상체는 약 20 mg/kg 내지 100 mg/kg, 예컨대 약 40 mg/kg 내지 80 mg/kg의 투여량의 사이클로포스파미드로 사전 컨디셔닝된다. 일부 측면에서, 대상체는 약 60 mg/kg의 사이클로포스파미드로 사전 컨디셔닝된다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파미드는 단일 투여로 투여되거나 또는 다회 투여, 예컨대 매일, 격일, 또는 매 3일마다 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파미드는 1 일 또는 2일 동안 1일 1회 투여된다. 림프구고갈 제제가 사이클로포스파미드를 포함하는 일부 구현예에서, 대상체는 사이클로포스파미드를 약 100 mg/m2 내지 500 mg/m2, 예컨대 약 200 mg/m2 내지 400 mg/m2, 또는 250 mg/m2 내지 350 mg/m2의 투여량으로 투여받는다. 일부 사례에서, 상기 대상체는 약 300 mg/m2의 사이클로포스파미드를 투여 받는다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파미드는 단일 투여로 투여되거나 또는 매일, 격일로, 또는 매 3일마다 투여되는 것과 같이 복수회 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파미드는 1-5일 동안, 예를 들어, 3 내지 5일 동안 매일 투여된다. 일부 사례에서, 대상체는 약 300 mg/m2의 사이클로포스파미드를 세포 요법 개시 전에, 3일 동안 매일 투여받는다.
[0497] 일부 구현예에서, 플루다라빈은 단일 투여량으로 투여되거나 또는 매일, 격일로, 또는 매 3일마다 제공되는 것과 같이 복수 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 1 일 내지 5 일 동안, 예를 들어 3 일 내지 5 일 동안 매일 투여된다. 경우에 따라, 대상체는 세포 요법의 개시에 앞서, 약 30 mg/m2의 플루다라빈을 3 일 동안 매일 투여받는다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파미드는 1 일 또는 2 일 동안 1 일 1 회 투여된다.
[0498] 일부 구현예에서, 림프구고갈 제제가 플루다라빈을 포함하는 경우, 대상체는 플루다라빈을 약 1 mg/m2 내지 100 mg/m2, 예컨대 약 10 mg/m2 내지 75 mg/m2, 15 mg/m2 내지 50 mg/m2, 20 mg/m2 내지 30 mg/m2, 또는 24 mg/m2 내지 26 mg/m2의 투여량으로 투여받는다. 일부 경우, 대상체는 25 mg/m2의 플루다라빈을 투여받는다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 단일 용량으로 투여되거나 또는 매일, 격일 또는 매 3일마다 제공되는 것과 같은 복수 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 1 일 내지 5 일 동안, 예를 들어 3 일 내지 5 일 동안 매일 투여된다.
[0499] 일부 구현예에서, 림프구고갈 제제는 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 조합과 같은 제제의 조합을 포함한다. 따라서, 이러한 제제의 조합은 사이클로포스파미드를 전술한 것과 같은 임의의 투여량 또는 투여 스케쥴로, 그리고 플루다라빈을 전술한 것과 같은 임의의 투여량 또는 투여 스케쥴로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 대상체는 세포 투여 전에, 60 mg/kg (~2 g/m2)의 사이클로포스파미드 및 3 내지 5 투여량의 25 mg/m2 플루다라빈을 투여받는다.
[0500] 예시적인 한 가지 투여 요법으로서, 1차 투여량 투여에 앞서, 대상체는 사이클로포스파미드 및 플루다라빈 (cy/flu)의 림프구고갈 사전 컨디셔닝 화학요법을, CAR-발현 세포의 1차 투여로부터 적어도 2일 전에, 일반적으로 상기 세포 투여 전 7일 이내에 투여받는다. 사전 컨디셔닝 처리 후, 대상체에게 전술한 바와 같은 CAR-발현 T 세포의 투여량을 투여한다.
[0501] 일부 구현예에서, 세포 투여량의 주입 전에 사전 컨디셔닝 제제의 투여는 치료 결과를 개선시킨다. 예를 들어, 일부 측면에서, 사전 컨디셔닝은 그 투여량으로 치료 효능을 향상시키거나, 대상체에서 재조합 수용체-발현 세포 (예를 들어, CAR-발현 세포, 예컨대 CAR-발현 T 세포)의 지속성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 사전 컨디셔닝 처리는 세포 투여 후, 주어진 기간 후에 최소한도의 잔여 또는 분자 검출가능한 질환도 나타내지 않으면서 대상체가 살아있는 무병 생존을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 무병 생존 중앙값까지의 시간이 증가된다.
[0502] 일단 세포가 대상체 (예컨대 사람)에 투여되면, 일부 측면에서 조작된 세포 집단의 생물학적 활성은 다수의 공지된 방법 중 임의의 방법에 의해 측정된다. 평가할 파라미터는 생체내에서 예를 들어, 이미징 또는 생체외에서, 예를 들어 ELISA 또는 유세포 계측법에 의한, 조작된 또는 천연의 T 세포 또는 다른 면역 세포의 항원에 대한 특이적 결합을 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 세포가 표적 세포를 파괴하는 능력은 예를 들어 문헌 [Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), 및 Herman et al. J. Immunological 방법, 285(1): 25-40 (2004)]에 설명된 세포독성 분석과 같은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포의 생물학적 활성은 또한 CD107a, IFNγ, IL-2 및 TNF와 같은 특정 사이토 인의 발현 및/또는 분비를 분석함으로써 측정될 수 있다. 일부 측면에서, 생물학적 활성은 종양 부담 또는 부하의 감소와 같은 임상적 결과를 평가함으로써 측정된다. 일부 측면에서, 독성 결과, 세포의 지속성 및/또는 확장, 및/또는 숙주 면역 반응의 존재 또는 부재가 평가된다.
[0503] 일부 구현예에서, 세포 투여량의 주입 전에 사전 컨디셔닝 제제의 투여는 투여량으로 치료 효과를 개선하거나 또는 재조합 수용체-발현 세포(예를 들어, CAR-발현 T 세포와 같은 CAR-발현 세포)의 지속성을 증가시킴으로써 치료 결과를 향상시킨다 를 투여 할 수 있다.
D. 세포의 변형
[0504] 특정 구현예에서, 세포는 그의 치료적 또는 예방적 효능이 증가되고 및/또는 확장, 증식, 생존 및/또는 효능이 조절될 수 있도록 임의의 수의 방식으로 변형된다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체에 투여 후, 생체내에서 확장, 증식, 생존 및/또는 효능이 조절, 예를 들어 증강, 부스팅 및/또는 증가될 수 있도록 변형된다. 일부 구현예에서, 세포는 도입유전자 및/또는 면역조절 인자의 발현이 조절 및/또는 제어될 수 있도록 변형된다. 일부 구현예에서, 세포는 재조합 수용체의 특정 성분의 발현 및/또는 활성을 조절하도록 변형된다. 일부 구현예에서, 세포는 제제, 예컨대 억제성 핵산과 같은 핵산의 발현을 증가 또는 감소 시키도록 변형된다. 일부 구현예에서, 세포는 제제를 발현 및/또는 분비하도록 변형된다.
[0505] 일부 구현예에서, 조작된 재조합 수용체, 예를 들어, 조작된 세포에 의해 발현된 CAR은 링커를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 표적 모이어티에 컨쥬게이트될 수 있다. 재조합 수용체와 같은 화합물을 표적 모이어티에 컨쥬게이트시키는 관행은 당업계에 공지되어있다. 예를 들어, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995), 및 미국특허 5,087,616 참조.
1. 억제성 핵산 및 유전자 변형
[0506] 일부 구현예에서, 상기 방법은 투여될 세포를, 예컨대 재조합 수용체를 발현하는 조작된 T 세포와 같은 투여된 세포의 음성 조절자(negative regulators)의 발현을 감소시키거나 감소를 일으킬 수 있는 제제와 접촉시킴으로써, 투여될 세포를 변형시키는 것을 포함한다. 세포의 음성 조절자는 면역 체크포인트 억제제, 억제성 수용체 및/또는 아데노신 조절제와 같은 본원에 기술된 임의의 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 음성 조절자의 발현을 감소시키거나 감소를 일으킬 수 있는 제제에는 그 음성 조절자를 인코딩하는 유전자 또는 핵산에 상보적이거나, 이를 표적으로 하거나, 억제하거나 및/또는 이와 결합하는 것과 같은, 억제성 핵산 분자이거나 이를 포함하는 제제가 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 Cas9, 예컨대 일부 경우에서 불활성 Cas9 및 음성 조절자를 인코딩하는 유전자를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체를 포함하는 복합체이거나 또는 이를 포함하는 것이다.
[0507] 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 억제성 핵산 분자는 RNA 간섭 제제를 포함한다. 이러한 임의의 구현예들 중 일부에서, 억제성 핵산은 작은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA-적합 shRNA, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 헤어핀 siRNA, 전구체 마이크로RNA (pre-miRNA) 또는 마이크로RNA (miRNA)이거나 또는 이를 포함하거나 또는 이를 인코딩한다. 억제성 핵산을 설계하고 세포를 변형시켜 억제성 핵산을 발현하는 방법은 당업계에 공지되어있다 (예를 들어, WO 2004/0455543 및 WO 2004/048566 참조).
[0508] 일부 구현예에서, 조작된 세포는 면역 세포의 면역조절, 음성 조절 및/또는 면역억제에 관련된 유전자를 인코딩하는 유전자좌를 표적으로 하는 유전자 변형 또는 유전자 편집의 대상이된다. 일부 구현예에서, 유전자 편집은 표적 부위에서의 삽입 또는 결실, 또는 표적 부위의 "녹아웃 (knock-out)" 및 인코딩된 단백질의 발현 제거를 초래한다. 일부 구현예에서, 유전자 편집은 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하는 비상동성 말단 결합 (NHEJ)에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 Cas9 뉴클레아제, Cas9 니카아제, 효소적으로 불활성인 Cas9 또는 그의 변이체, 또는 조작된 징크 핑거 또는 TALE 시스템과 함께 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA) 분자를 사용할 수 있다. 유전자 변형의 방법은 당업계에 공지되어있다 (예컨대, WO 2015/161276; 미국특허 Nos. 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536, WO 03/016496 및 미국 공개번호. 2011/0301073 참조).
2. 부가적인 제제를 발현시키기 위한 변형
[0509] 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 재조합 수용체-발현 세포는 투여된 세포의 증식, 확장, 생존 및/또는 효능을 촉진, 증진, 부스팅 및/또는 증가시키는 부가적인 제제를 발현 및/또는 분비하도록 추가로 변형된다. 예를 들어, CAR-발현 세포와 같은 재조합 수용체-발현 세포는 T 세포 및 재조합 수용체의 확장 및/또는 기능을 증진시키거나 및/또는 면역억제 효과를 극복하는 부가적인 제제를 발현 및/또는 분비하도록 추가로 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 투여된 세포의 확장을 촉진시키는 사이토카인을 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 부가적인 제제는 유도성 발현 시스템, 예를 들어 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
[0510] 일부 구현예에서, 투여된 세포는 본원에 설명된 바와 같은, 면역억제 인자를 억제하거나 및/또는 면역자극 인자를 자극하는 제제를 발현 및/또는 분비하도록 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여된 세포에 의해 발현되는 부가적인 제제는 종양 미세환경에서 상기 세포의 면역억제를 감소시키거나 방지한다 (예를 들어, 미국특허 Pub. No. US 2016/0045551 참조). 일부 구현예에서, 투여된 세포에 의해 인코딩 및/또는 분비되는 부가적인 제제는 본원에 기재된 임의의 부가적인 제제를 포함할 수 있다.
[0511] 일부 구현예에서, 투여된 세포에 의해 인코딩되는 부가적인 제제는 가용성이며 분비된다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 가용성 scFv이다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 사이토카인이다.
3. 재조합 수용체의 발현 및/또는 활성의 조절
[0512] 일부 구현예에서, 상기 방법은 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 조절 가능한 발현 및/또는 활성을 허용하도록 세포를 변형시켜 재조합 수용체를 통해 신호를 조절하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 조절 가능한 발현 및/또는 활성은 재조합 수용체가 본원에 기술된 바와 같은 특정 조절 요소 및/또는 시스템을 함유하거나 또는 포함되도록 구성함으로써 달성된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포를 환자의 신체에 투여하거나 및/또는 특정 리간드에 노출시키는 것은 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 발현 및/또는 활성의 조절은 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 발현을 조절할 수 있는 부가적인 제제의 투여에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 조절된 발현은 조절 가능한 전사 인자 방출 시스템에 의해, 또는 폴리펩타이드, 예를 들어 재조합 수용체의 구조 변화 및/또는 멀티머화를 유도할 수 있는 부가적인 제제의 투여에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 부가적인 제제는 화학적 인듀서이다.
IV. 정의
[0513] 달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용되는 분야의 모든 용어, 표기 및 다른 기술적 및 과학적 용어 또는 전문용어는 청구 대상이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에서, 일반적으로 이해되는 의미의 용어는 본 명세서에서 명확성 및/또는 용이한 참조를 위해 정의되며, 본 명세서에 이러한 정의가 포함된 경우에는 반드시, 당업계에서 일반적으로 이해되는 것 이상의 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 아니된다.
[0514] 본 발명에서, 단수 형태인 "a," "an," 및 "the"는 문맥상 달리 명시되지 않는 한 복수 개념을 포함한다. 예컨대, "a" 또는 "an"은 "적어도 1개" 또는 "1개 이상"을 의미한다.
[0515] 본 명세서 전반에 걸쳐, 청구 대상 발명의 다양한 측면이 범위 포맷으로서 표현되었다. 이러한 범위 포맷의 설명은 단지 편의성 및 간결성을 위한 것일 뿐 청구대상 발명의 범위를 경직적으로 한정하려는 것은 아니다. 따라서, 범위 설명은 가능한 모든 하위 범위 뿐만 아니라 그 범위 내에 속하는 개별적인 수치 값도 구체적으로 기재한 것으로 이해되어야 한다. 예컨대, 어떤 값의 범위가 제공된 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이에 개재된 각각의 값들 및 명시된 범위 내의 달리 명시 또는 개재된 모든 값들 역시 청구대상발명에 포괄되는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 보다 작은 범위의 상한 및 하한은 그 작은 범위에 독립적으로 포함되는 것일 수 있고, 또한 청구대상발명의 범위 내에 포괄되는 것이다. 명시된 범위가 이러한 한계의 일방 또는 양방 모두를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계의 일방 또는 양방 모두를 제외한 범위 역시도 본 발명에 포괄된다. 이것은 범위의 폭과 무관하게 적용된다.
[0516] 본 명세서에서 "약"이라는 용어는 이 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려진 각각의 값에 대한 일반적인 오차 범위를 가리키는 것이다. 어떤 값 또는 파라미터에 대해 "약"이라는 표현이 사용될 경우 바로 그 값 또는 파라미터 자체에 지향된 구현예 역시도 포함(및 설명)하는 것이다.
[0517] 본 발명에서, 대상체는 살아있는 생명체, 이를테면 인간 및 기타 포유동물을 포함한다. 포유동물의 비제한적인 예로는 인간, 및 비인간 동물, 예컨대 농장동물, 스포츠 동물, 설치류 및 애완동물을 들 수 있다.
[0518] 본원에서, 하나 이상의 특정 세포 유형 또는 세포 집단과 관련하여 "고갈(depleting)"이라는 용어는 그 세포 유형 또는 세포 집단의 수 또는 백분율이, 예를 들어, 조성물 내 총 세포수 또는 조성물 부피에 비해, 또는 다른 세포 유형에 상대적으로, 예컨대 그 집단 또는 세포에 의해 발현된 마커에 기반한 음성 선택, 또는 고갈시키고자 하는 그 집단 또는 세포에 존재하지 않는 마커에 기반한 양성 선택에 의해, 감소되는 것을 의미한다. 이 용어는 조성물로부터 세포, 세포 유형 또는 집단이 완전히 제거될 것을 요구하는 것은 아니다.
[0519] 본원에서, 하나 이상의 특정 세포 유형 또는 세포 집단과 관련하여 "농축시키다 또는 풍부하게 하다(enriching)"라는 용어는, 그 세포 유형 또는 세포 집단의 수 또는 백분율이, 예를 들어, 조성물 내 총 세포수 또는 조성물 부피에 비해, 또는 다른 세포 유형에 상대적으로, 예컨대 그 집단 또는 세포에 의해 발현된 마커에 기반한 양성 선택, 또는 고갈시키고자 하는 그 집단 또는 세포에 존재하지 않는 마커에 기반한 음성 선택에 의해, 증가되는 것을 의미한다. 이 용어는 조성물로부터 다른 세포, 세포 유형 또는 집단이 완전히 제거될 것을 요구하는 것이 아니며, 그렇게 농축된 세포가 농축된 조성물 중에 100% 또는 그에 가깝게 존재할 것을 요구하지 않는다.
[0520] 본 발명에서, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "양성"이라 함은 특정 마커 일반적으로 표면 마커가 그 세포내 또는 세포 상에 검출가능하게 존재함을 가리키는 것이다. 표면 마커라 함은, 예를 들어 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하여 상기 항체를 검색함으로써, 유세포 계측에 의해 검출시 일부 구현예에서 표면 발현 존재를 가리키는 것으로, 여기서 염색은 이소타입-맷치된 대조군을 이용하여 동일 공정을 수행하여 검출되는 염색보다 실질적으로 높은 수준에서 및/또는 그 마커에 대해 양성으로 알려진 세포의 그것과 실질적으로 유사한 수준에서 및/또는 그 마커에 대해 음성으로 알려진 세포의 그것보다 실질적으로 더 높은 수준에서 유세포 계측법으로 검출가능한 것이다.
[0521] 본 발명에서, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "음성"이라 함은 특정 마커 일반적으로 표면 마커가 그 세포내 또는 세포 상에 검출가능할 정도로 존재하지 않음을 가리키는 것이다. 표면 마커라 함은, 예를 들어 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하여 상기 항체를 검색함으로써, 유세포 계측에 의해 검출시 일부 구현예에서 표면 발현의 부재를 가리키는 것으로, 여기서 염색은 이소타입-맷치된 대조군을 이용하여 동일 공정을 수행하여 검출되는 염색보다 실질적으로 높은 수준에서 및/또는 그 마커에 대해 양성으로 알려진 세포의 그것과 실질적으로 더 낮은 수준에서 및/또는 그 마커에 대해 음성으로 알려진 세포의 그것과 실질적으로 유사한 수준에서 유세포 계측법으로 검출가능한 것이다.
[0522] 본 발명에서, 아미노산 서열 (레퍼런스 폴리펩타이드 서열)과 관련하여 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성" 및 "퍼센트 동일성"이라 함은, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 그리고 서열 동일성의 일부로서 여하한 보존적 치환은 고려함이 없이, 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입한 후, 레퍼런스 폴리펩타이드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열(예컨대, Vpx 또는 Vpr 단백질) 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정할 목적의 정렬은 당업자에게 공지인 다양한 방법, 예를 들면 공중 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 통상의 기술자라면 비교된 서열 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 여하한 알고리듬을 포함하여, 서열 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있을 것이다.
[0523] 아미노산 치환은 폴리펩타이드 내 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 아미노산은 일반적으로 다음의 공통적인 측쇄 특성에 따라 그룹지을 수 있다:
[0524] (1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
[0525] (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
[0526] (3) 산성: Asp, Glu;
[0527] (4) 염기성: His, Lys, Arg;
[0528] (5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
[0529] (6) 방향성: Trp, Tyr, Phe.
[0530] 비보존적 아미노산 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류의 구성원과 교환하는 것을 포함할 것이다.
[0531] 본원에서, "에 상응하는 위치" 또는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치가 본원 서열 목록에 기재된 바와 같은 개시된 서열의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치에 "상응하다"라는 표현은, GAP 알고리즘과 같은 표준 정렬 알고리즘을 사용하여 개시된 서열과의 동일성을 최대화하기 위해 정렬시 확인된 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치를 가리킨다. 일부 구현예에서, Vpx 또는 Vpr 단백질의 예시적인 상응하는 잔기는, 서열을 SEQ ID NO: 1에 기재된 예시적인 Vpx 서열 또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 Vpx 또는 Vpr 서열과 정렬시킴으로써 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, SAMHD1의 예시적인 상응하는 잔기는 SEQ ID NO: 19에 제시된 예시적인 SAMHD1 서열과 서열정렬시킴으로써 동정될 수 있다. 서열을 정렬시킴으로써, 당업자는 예를 들어, 보존된 아미노산 잔기 및 동일한 아미노산 잔기를 가이드로서 사용하여 상응하는 잔기들을 동정할 수 있다. 일반적으로, 상응하는 위치를 동정하기 위해 가장 높은 차수의 일치(match)가 얻어지도록 아미노산 서열들을 정렬시킨다 (참조, 예컨대: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics 및 게놈 Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., 및 Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073).
[0532] 본 발명에 사용되는 "벡터"라는 용어는 그것이 연결된 다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 상기 용어는 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈에 혼입된 벡터뿐만 아니라 자기 복제 핵산 구조로서의 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그들이 작동적으로 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 본 발명에서는 "발현 벡터"라 지칭한다. 벡터에는 그의 증식을 위해 숙주 게놈 내로 삽입가능하고 다른 핵산을 지니는 게놈을 갖는, 예를 들어 레트로바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 또는 감마레트로바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터가 포함된다
[0533] 본 발명에서, 조성물은 세포를 비롯하여 생성물, 물질 또는 화합물의 2 이상의 혼합물을 가리킨다. 이것은 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 이들의 조합일 수 있다.
[0534] 본 발명에서, "치료", "치료하다" 및 "치료하는" 이라는 용어는 질병이나 병태 또는 장애 또는 그와 관련된 증상, 유해 효과 또는 결과 또는 표현형의 완전한 또는 부분적 경감 또는 감소를 가리킨다. 특정 구현예에서, 그 효과는 치료적이며 이에 따라 질병이나 병태 또는 그에 기인한 유해 증상이 부분적으로 또는 완전히 치유된다.
[0535] 본 발명에서, 어떤 화합물 또는 조성물 또는 조합의 "치료적 유효량"이라 함은 이를테면 질병, 병태, 또는 장애의 치료와 같은 소망되는 치료적 결과를 달성하거나 및/또는 치료의 약동학적 또는 약력학적 효과를 달성하는 것을 가리키는데 효과적인 양을 가리킨다. 치료적 유효량은 대상체의 병태, 연령, 성별 및 체중, 그리고 투여되는 세포 집단들에 따라 달라질 수 있다.
[0536] 본원에 언급된 특허 문헌, 과학 기사 및 데이터베이스를 비롯한 모든 간행물은 각각의 간행물이 개별적으로 참고 문헌으로 인용된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참고 문헌으로 인용된다. 본원에 제시된 정의가 본원에서 참고 문헌으로 인용된 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 공보에 기재된 정의와 상반되거나 달리 불일치하는 경우, 본원에 기재된 정의가 본원에 참고로 인용된 정의에 우선한다.
[0537] 본 명세서에 사용된 섹션 표제는 단지 조직적인 목적을 위한 것이며 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
V. 예시적인 구현예들
[0538] 제시된 구현예들로는 다음을 들 수 있다:
1. T 세포의 형질도입 방법으로서, 상기 방법은 재조합 핵산을 포함하는 바이러스 벡터 입자와 복수의 T 세포를 포함하는 인풋 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하되, 상기 복수의 T 세포는 대상체로부터 수득된 것이고, 여기서:
상기 인큐베이션은 대상체로부터 샘플을 수득한 후 24 시간 이내에 개시되고; 및/또는
인큐베이션 전에, T 세포는 대상체로부터 샘플을 수득한 후 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 또는 24시간 초과의 기간 동안, 약 15℃, 약 18℃, 약 22℃ 또는 약 25℃ 보다 높은 온도로 처리되지 않은 것이며; 및/또는
인큐베이션 전에, T 세포는 대상체로부터 샘플을 수득한 후 15분, 30분, 1시간 또는 2시간 초과의 기간 동안 약 37℃±2.0℃를 초과하는 온도로 처리되지 않은 것인, T 세포의 형질도입 방법.
2. 구현예 1에 있어서, 인큐베이션은 대상체로부터 샘플을 수득한 후 약 1시간, 3시간, 6시간, 12시간 또는 18시간 이내에 개시되는 것인 방법.
3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 상기 인큐베이션 전에, 상기 방법은 세포 활성화를 촉진하는 조건 하에서 T 세포를 자극하는 것을 포함하지 않는 것인 방법.
4. 구현예 1-3 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 상기 인큐베이션 전에, 인풋 조성물은, 약 37℃±2.0℃를 초과하는 온도에서의 인큐베이션, 및/또는 T 세포, CD4+ T 세포, 및/또는 CD8+ T 세포를 활성화시킬 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에서의 인큐베이션, TCR 복합체를 통해 신호를 유도할 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에서의 인큐베이션 및/또는 T 세포, CD4+ T 세포, 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에서의 인큐베이션; CD3-결합 분자; CD28-결합 분자; 재조합 IL-2; 재조합 IL-15; 및 재조합 IL-7을 포함하는 생체외 자극으로 처리되지 않은 것인 방법.
5. 구현예 1-4 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 상기 인큐베이션 전에, T 세포의 5%, 10%, 20%, 30%, 또는 40% 이하는 활성화된 세포들이고, HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L 및 4-1BB로 이루어진 군으로부터 선택된 표면 마커를 발현하며; IL-2, IFN-감마, TNF-알파로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포내 발현을 포함하고, 세포 주기의 G1 또는 그 후의 단계에 있거나 및/또는 증식가능한 것인 방법.
6. T 세포의 형질도입 방법으로서, 상기 방법은 재조합 핵산을 포함하는 바이러스 벡터 입자와 T 세포를 포함하는 인풋 조성물을 인큐베이션시키는 것을 포함하되, 상기 T 세포는 대상체로부터의 샘플로부터 수득된 것이고, 여기서, 상기 인큐베이션 전에 T 세포 또는 인풋 조성물은, 약 37℃±2.0℃를 초과하는 온도에서의 인큐베이션, 및/또는 T 세포, CD4+ T 세포, 및/또는 CD8+ T 세포를 활성화시킬 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에서의 인큐베이션, TCR 복합체를 통해 신호를 유도할 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에서의 인큐베이션 및/또는 T 세포, CD4+ T 세포, 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에서의 인큐베이션; CD3-결합 분자; CD28-결합 분자; 재조합 IL-2; 재조합 IL-15; 및 재조합 IL-7을 포함하는 생체외 자극으로 처리되지 않은 것인 방법.
7. 구현예 4 또는 구현예 6에 있어서, 하나 이상의 제제는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체를 포함하는 것인 방법.
8. T 세포의 형질도입 방법으로서, 상기 방법은 재조합 핵산을 포함하는 바이러스 벡터 입자와 T 세포를 포함하는 인풋 조성물을 인큐베이션시키는 것을 포함하되, 상기 T 세포는 대상체로부터의 샘플로부터 수득된 것이고, 여기서, 인큐베이션 전에, T 세포의 5%, 10%, 20%, 30%, 또는 40% 이하는 활성화된 세포들이고, HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L 및 4-1BB로 이루어진 군으로부터 선택된 표면 마커를 발현하며; IL-2, IFN-감마, TNF-알파로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포내 발현을 포함하고, 세포 주기의 G1 또는 그 후의 단계에 있는 것인 방법.
9. 구현예 5 또는 구현예 8에 있어서, 인풋 조성물 내 T 세포의 10% 이하는 인큐베이션 직전에 HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L, 및 4-1BB로 이루어진 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커를 포함하는 것인 방법.
10. 구현예 1-9 중 어느 하나의 구현예에 있어서에 있어서, 상기 인큐베이션 전에, T 세포의 5%, 10%, 20%, 30%, 또는 40% 초과는 저밀도 지질 수용체 (LDL-R)를 발현하는 것인 방법.
11. 구현예 1-9 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 대상체는 인간인 것인 방법.
12. 구현예 1-8 중 어느 하나의 구현예에 있어서, T 세포는 인큐베이션 전에 2℃ 내지 8℃의 온도로 48 시간을 초과하는 기간 동안 유지된 바 없고 및/또는 유지되지 않는 것인 방법.
13. 구현예 1-12 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 샘플은 혈액 샘플인 것인 방법.
14. 구현예 1-12 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 샘플은 백혈구성분채집 샘플인 방법.
15. 구현예 1-14 중 어느 하나의 구현예에 있어서, T 세포는 비분획화 T 세포이고, 농축(enriched) 또는 단리된 CD3+ T 세포이며, 농축 또는 단리된 CD4+ T 세포이거나, 농축 또는 단리된 CD8+ T 세포인 것인 방법.
16. 구현예 1-15 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 대상체로부터의 샘플로부터 선택되거나 또는 농축된 것인 방법.
17. 구현예 1-16 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 인큐베이션 전에, 대상체로부터 샘플을 수득하고, 선택적으로 농축된 조성물이거나 및/또는 인풋 조성물을 생산하는 것인 샘플로부터 선택적으로 T 세포를 선택 또는 농축하는 단계를 더 포함하는 방법.
18. 구현예 1-17 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 인풋 조성물 내 T 세포의 백분율은 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% T 세포인 것인 방법.
19. 구현예 3-18 중 어느 하나의 구현예에 있어서, T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ 세포들을 포함하는 것인 방법.
20. 구현예 3-18 중 어느 하나의 구현예에 있어서, T 세포는 CD4+ 및 CD8+ 세포들을 포함하는 것인 방법.
21. 구현예 20에 있어서, CD4+ 세포 대 CD8+ 세포의 비는 약 1:1, 1:2, 2:1, 1:3 또는 3:1인 것인 방법.
22. 구현예 1-21 중 어느 하나의 구현예에 있어서:
샘플은 혈청 또는 혈장을 적어도 또는 적어도 약 10% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 15% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 20% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 25% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 30% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 33% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 35% (v/v), 또는 적어도 또는 적어도 약 40% (v/v)의 농도로 포함하고; 및/또는
인큐베이션 전에, 샘플은 적어도 또는 적어도 약 10% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 15% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 20% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 25% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 30% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 33% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 35% (v/v), 또는 적어도 또는 적어도 약 40% (v/v)의 농도의 혈청 또는 혈장과 생체외 접촉된 것인 방법.
23. 구현예 1-22 중 어느 하나의 구현예에 있어서:
샘플은 혈청 또는 혈장을 적어도 또는 적어도 약 30% (v/v)의 농도로 함유하고; 및/또는
인큐베이션 전에, 샘플은 적어도 또는 적어도 약 30% (v/v) 농도의 혈청 또는 혈장과 생체외 접촉된 것인 방법.
24. 구현예 22 또는 구현예 23에 있어서, 혈청 또는 혈장은 인간 유래인 것인 방법.
25. 구현예 22-24 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 혈청 또는 혈장은 대상체에 대새 자가(autologous)인 것인 방법.
26. 구현예 1-22 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 샘플은 항응집제를 포함하는 것인 방법.
27. 구현예 26에 있어서, 항응집제는 시트레이트 이온을 포함하지 않는 것인 방법.
28. 구현예 1-27 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 인큐베이션 전에, 상기 방법은 동결보존제의 존재 하에, T 세포를 선택적으로 샘플 또는 농축된 조성물에서 동결건조시키는 것을 포함하여, 동결보존된 조성물을 생산하는 것인 방법.
29. 구현예 28에 있어서, 인큐베이션 전에, 동결보존제를 감소 또는 제거하거나 및/또는 인풋 조성물을 생성하는 조건 하에서 동결보존된 조성물을 세척하는 것인 방법.
30. 구현예 1-29 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 인풋 조성물은 N-아세틸시스테인 (NAC); 혈청, 선택적으로 인간 혈청; 재조합 인터류킨-2 (IL-2), 재조합 인터류킨-15 (IL-15), 및/또는 재조합 인터류킨-7 (IL-7)을 포함하는 것인 방법.
31. 구현예 1-30 중 어느 하나의 구현예에 있어서:
인풋 조성물은 N-아세틸시스테인을 약 0.4 mg/mL 내지 4 mg/mL, 0.8 mg/mL 내지 3.6 mg/mL 또는 1.6 mg/mL 내지 2.4 mg/mL의 농도로 포함하거나; 또는
인풋 조성물은 N-아세틸시스테인을 적어도 또는 적어도 약 또는 약 0.4 mg/mL, 0.8 mg/mL, 1.2 mg/mL, 1.6 mg/mL, 2.0 mg/mL, 2.4 mg/mL, 2.8 mg/mL, 3.2 mg/mL, 3.6 mg/mL 또는 4.0 mg/mL의 농도로 포함하는 것인 방법.
32. 구현예 1-31 중 어느 하나의 구현예에 있어서:
인풋 조성물은 혈청, 선택적으로 인간 혈청을 약 0.5% 내지 25% (v/v), 1.0% 내지 10% (v/v) 또는 2.5% 내지 5.0% (v/v)의 농도로 포함하거나; 또는
인풋 조성물은 혈청, 선택적으로 인간 혈청을 적어도 또는 적어도 약 또는 약 0.5%, 1.%, 2.5%, 5% (v/v) 또는 10%의 농도로 포함하는 것인 방법.
33. 구현예 1-32 중 어느 하나의 구현예에 있어서:
인풋 조성물은 재조합 IL-2, 선택적으로 재조합 인간 IL-2를, 약 10 IU/mL 내지 500 IU/mL, 50 IU/mL 내지 250 IU/mL 또는 100 IU/mL 내지 200 IU/mL의 농도; 또는 적어도 또는 적어도 약 10 IU/mL, 50 IU/mL, 100 IU/mL, 200 IU/mL, 300 IU/mL, 400 IU/mL 또는 500 IU/mL의 농도로 포함하거나; 및/또는
인풋 조성물은 재조합 IL-15, 선택적으로 재조합 인간 IL-15를, 약 1 IU/mL 내지 100 IU/mL, 2 IU/mL 내지 50 IU/mL 또는 5 IU/mL 내지 10 IU/mL의 농도; 또는 적어도 또는 적어도 약 1 IU/mL, 2 IU/mL, 5 IU/mL, 10 IU/mL, 25 IU/mL 또는 50 IU/mL의 농도로 포함하거나; 및/또는
인풋 조성물은 재조합 IL-7, 선택적으로 재조합 인간 IL-7을 약 50 IU/mL 내지 1500 IU/mL, 100 IU/mL 내지 1000 IU/mL 내지 200 IU/mL 내지 600 IU/mL의 농도; 또는 적어도 또는 적어도 약 50 IU/mL, 100 IU/mL, 200 IU/mL, 300 IU/mL, 400 IU/mL, 500 IU/mL, 600 IU/mL, 700 IU/mL, 800 IU/mL, 900 IU/mL 또는 1000 IU/mL의 농도로 포함하는 것인 방법.
34. 구현예 1-33 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 인큐베이션은 바이러스 벡터 입자를 인풋 조성물로 회전접종(spinoculating)하는 단계를 포함하는 것인 방법.
35. 구현예 34에 있어서, 회전접종은 원심 챔버의 내부 공동에서, 바이러스 벡터 입자와 및 인풋 조성물을 회전시키는 것을 포함하며, 상기 회전은 공동 측벽의 내부 표면에서:
약 500 g 내지 2500 g, 500 g 내지 2000 g, 500 g 내지 1600 g, 500 g 내지 1000 g, 600 g 내지 1600 g, 600 g 내지 1000 g, 1000 g 내지 2000 g 또는 1000 g 내지 1600 g의 상대 원심력; 및/또는
적어도 또는 적어도 약 600 g, 800 g, 1000 g, 1200 g, 1600 g, 또는 2000 g의 상대 원심력으로 수행되는 것인 방법.
36. 구현예 34 또는 구현예 35에 있어서, 회전접종은:
약 5분 이상, 또는 약 10분 이상, 또는 약 15분 이상, 또는 약 20분 이상, 또는 약 30분 이상, 또는 약 45분 이상, 또는 약 60분 이상, 또는 약 90분 이상 또는 약 120분 이상 수행되거나; 또는
약 5분 내지 60분, 10분 내지 60분, 15분 내지 60분, 15분 내지 45분, 30분 내지 60분 또는 45분 내지 60분 동안 수행되는 것인 방법.
37. 구현예 1-36 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 인풋 조성물 및/또는 바이러스 벡터 입자를 형질도입 아쥬반트(adjuvant)와 접촉시키는 것을 더 포함하는 방법.
38. 구현예 37에 있어서, 접촉은 바이러스 벡터 입자를 인풋 조성물로 회전접종시키기 전, 회전접종과 동시 또는 회전접종 후에 수행되는 것인 방법.
39. 구현예 1-38 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 인큐베이션의 적어도 일부는 약 37℃±2℃에서 수행되는 것인 방법.
40. 구현예 34-39 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 인큐베이션의 적어도 일부는 회전접종 후에 수행되는 것인 방법.
41. 구현예 39 또는 구현예 40에 있어서, 인큐베이션의 적어도 일부는 약 2시간, 4시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 48시간, 60시간 또는 72시간 이하 동안 수행되는 것인 방법.
42. 구현예 39-41 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 인큐베이션의 적어도 일부는 약 24시간 동안 수행되는 것인 방법.
43. 구현예 1-42 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 인큐베이션의 총 기간은 12시간 이하, 24시간 이하, 36시간 이하, 48시간 이하 또는 72시간 이하인 것인 방법.
44. 구현예 1-43 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 바이러스 벡터 입자는 렌티바이러스 벡터 입자인 것인 방법.
45. 구현예 44에 있어서, 렌티바이러스 벡터 입자는 HIV-1로부터 유래된 것인 방법.
46. 구현예 1-45 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 바이러스 벡터 입자는 바이러스 엔벨롭 당단백질로 슈도타입화되는 것인 방법.
47. 구현예 46 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 바이러스 엔벨롭 당단백질은 VSV-G인 것인 방법.
48. 구현예 1-47 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 바이러스 벡터 입자는 SAMHD1-억제 활성을 나타내는 렌티바이러스 단백질을 포함하고, 상기 단백질은 상기 바이러스 입자 내에 패키징되는 것인 방법.
49. 구현예 48에 있어서, SAMHD1-억제 단백질은 야생형 Vpx 단백질, 야생형 Vpr 단백질이거나, 또는 SAMHD1-억제 활성을 나타내는 야생형 Vpx 또는 Vpr 단백질의 변이체 또는 일부인 것인 방법.
50. 구현예 48 또는 구현예 49에 있어서, SAMHD1-억제 단백질은 레트로바이러스 벡터 입자에 대해 이종(heterologous)인 것인 방법.
51. 구현예 48-50 중 어느 하나의 구현예에 있어서, SAMHD1-억제 단백질은 야생형 Vpx 단백질이거나 또는 SAMHD1-억제 활성을 나타내는 야생형 Vpx 단백질의 변이체 또는 일부인 것인 방법.
52. 구현예 1-51 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 바이러스 벡터 입자는 약 20.0 미만 또는 약 10.0의 감염 다중도로 인큐베이션되는 것인 방법.
53. 구현예 1-52 중 어느 하나의 구현예에 있어서:
바이러스 벡터 입자는 약 1.0 IU/세포내지 10 IU/세포 또는 2.0 U/세포내지 5.0 IU/세포의 감염 다중도로 인큐베이션되거나; 또는
바이러스 벡터 입자는 적어도 또는 적어도 약 1.6 IU/세포, 1.8 IU/세포, 2.0 IU/세포, 2.4 IU/세포, 2.8 IU/세포, 3.2 IU/세포 또는 3.6 IU/세포, 4.0 IU/세포, 5.0 IU/세포, 6.0 IU/세포, 7.0 IU/세포, 8.0 IU/세포, 9.0 IU/세포 또는 10.0 IU/세포의 감염 다중도로 인큐베이션되는 것인 방법.
54. 구현예 1-53 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 인풋 조성물은 적어도 또는 약 적어도 또는 약 50 x 106 세포들, 100 x 106 세포들, 또는 200 x 106 세포들을 포함하는 것인 방법.
55. 구현예 1-54 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 재조합 핵산은 항원 수용체를 인코딩하는 것인 방법.
56. 구현예 55에 있어서, 항원 수용체는트랜스제닉 T 세포 수용체 (TCR)인 것인 방법.
57. 구현예 55 또는 구현예 56에 있어서, 항원 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 방법.
58. 구현예 57에 있어서, 키메라 항원 수용체 (CAR)는 ITAM을 함유하는 세포내 신호전달 도메인 및 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인을 포함하는 것인 방법.
59. 구현예 58에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타 (CD3ζ) 사슬의 세포내 도메인을 포함하는 것인 방법.
60. 구현예 58 또는 구현예 59에 있어서, 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인을 연결하는 막관통 도메인을 더 포함하는 것인 방법.
61. 구현예 60에 있어서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 포함하는 것인 방법.
62. 구현예 58-61 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 공동자극 분자의 세포내 신호전달 도메인을 더 포함하는 것인 방법.
63. 구현예 62에 있어서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 및 41BB로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
64. 구현예 55-63 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 항원 수용체는 질환 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합하거나 또는 유니버설 태그에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
65. 구현예 64에 있어서, 질환 또는 병태는 암, 및 자가면역 질환 또는 장애, 또는 감염성 질환인 것인 방법.
66. 구현예 1-65 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 상기 방법은 재조합 핵산으로 형질도입된 T 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 생산하는 것인 방법.
67. 구현예 66에 있어서, 아웃풋 조성물 내 T 세포의 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 또는 적어도 80%는 재조합 핵산으로 형질도입되는 것인 방법.
68. 구현예 66 또는 구현예 67에 있어서, 상기 방법에 의해 생산된 형질도입된 T 세포를 아웃풋 조성물로부터 회수 또는 단리하는 것을 더 포함하는 방법.
69. 구현예 66 또는 구현예 68에 있어서, 아웃풋 조성물의 세포 또는 상기 방법에 의해 형질도입된 세포들을 활성화 또는 확장시키는 것을 더 포함하는 방법.
70. 구현예 69에 있어서, 활성화 및/또는 확장은 생체외에서 수행되는 것인 방법.
71. 구현예 69 또는 구현예 70에 있어서, 인큐베이션 후에, 아웃풋 조성물 내의 세포들은, T 세포를 활성화시킬 수 있고, TCR 복합체를 통해 신호를 유도할 수 있으며 및/또는 T 세포의 증식을 유도할 수 있는 하나 이상의 자극 제제의 존재 하에 추가로 인큐베이션되는 것인 방법.
72. 구현예 71에 있어서, 하나 이상의 자극 제제는 CD3-결합 분자; CD28-결합 분자; 재조합 IL-2; 재조합 IL-15; 및 재조합 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
73. 구현예 71 또는 구현예 72에 있어서, 하나 이상의 자극 제제는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체를 포함하는 것인 방법.
74. 구현예 69에 있어서, 활성화 및/또는 확장은 생체내에서 수행되는 것인 방법.
75. 구현예 69 또는 구현예 74에 있어서, 활성화 및/또는 확장은 항원 수용체에 특이적으로 결합된 항원의 존재 하에 일어나거나 및/또는 도입유전자-특이적인 것인 방법.
76. 구현예 72 또는 구현예 75에 있어서, 인큐베이선 후에, 아웃풋 조성물 내의 세포들은 선택적으로 CD3-결합 분자; CD28-결합 분자; 재조합 IL-2; 재조합 IL-15; 및 재조합 IL-7로 이루어진 하나 이상의 자극 제제의 존재 하에 추가로 생체외 인큐베이션되지 않거나, 및/또는 아웃풋 조성물 내의 세포들은 30℃를 초과하는 온도에서 24 시간을 초과하여 추가 인큐베이션되지 않는 것인 방법.
77. 구현예 1-76 중 어느 하나의 구현예의 방법에 의해 제조된 유전자 조작된 T 세포.
78. 구현예 77의 유전자 조작된 T 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
79. 구현예 78의 조성물을 질환 또는 병태를 갖는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 치료 방법
80. 구현예 79에 있어서, 조성물은 대상체로부터 샘플을 수득한 후 5일 이내에 대상체에 투여되는 것인 방법.
81 구현예 80에 있어서, 조성물은 대상체로부터 샘플을 수득한 후 1일, 2일, 3일 또는 4일 이내에 대상체에 투여되는 것인 방법.
82. 입양 세포 치료를 위한 방법으로서:
(a) 질환 또는 병태를 갖는 대상체로부터 수득된 샘플로부터 T 세포를 농축 또는 분리하는 단계;
(b) T 세포를 포함하는 인풋 조성물을, 구현예 1-71 중 어느 하나의 구현예의 방법에 의해, 바이러스 벡터 입자로 형질도입시킴으로써, 형질도입된 세포들을 포함하는 아웃풋 조성물을 생성하되, 여기서 상기 바이러스 벡터 입자는 질환 또는 장애와 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 항원 수용체를 인코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 것인 단계;
(c) 질환 또는 병태를 치료하기 위해 형질도입된 세포들을 포함하는 아웃풋 조성물을 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 아웃풋 조성물은, 대상체로부터 샘플이 수득된 지 9일 이내에 대상체에 투여되는 것인 단계
를 포함하는, 입양 세포 치료를 위한 방법.
83. 입양 세포 치료를 위한 방법으로서, 재조합 핵산으로 형질도입된 T 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 질환 또는 병태를 치료하기 위해 대상체에 투여하는 것을 포함하되, 여기서 상기 아웃풋 조성물은 구현예 1-71 중 어느 하나의 구현예의 방법에 의해 제조된 것인, 입양 세포 치료를 위한 방법.
84. 구현예 82 또는 구현예 83에 있어서, 아웃풋 조성물은 대상체로부터 샘플 수득 후 1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일 이내에 대상체에 투여되는 것인 방법.
85. 구현예 82-84 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 조성물 투여 전에, 아웃풋 조성물의 세포 또는 형질도입된 세포를 약학적으로 허용가능한 완충액 중에 제형화시키는 방법.
86. 구현예 82-85 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 형질도입된 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 투여하기 전에, 세포들을 형질도입 후, 최대 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일 또는 9일 동안 30℃를 초과하는 온도에서 생체외 배양하는 방법.
87. 구현예 82-86 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 형질도입 후, 형질도입된 세포를 포함하는 세포 또는 아웃풋 조성물을 T 세포를 활성화시킬 수 있고, TCR 복합체를 통해 신호를 유도할 수 있으며 및/또는 T 세포의 증식을 유도할 수 있는 하나 이상의 자극 제제의 존재 하에 배양시킴으로써, 형질도입된 세포를 포함하는 조성물을 생산하는 방법.
88. 구현예 82-85 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 형질도입된 세포를 투여하기 전에, 형질도입된 세포를 포함하는 세포 또는 아웃풋 조성물은 하나 이상의 자극 제제의 존재 하에 추가로 생체외 인큐베이션되지 않거나 및/또는 30℃보다 높은 온도에서 24 시간을 초과하여 추가 인큐베이션되지 않는 것인 방법.
89. 구현예 87 또는 구현예 88에 있어서, 하나 이상의 자극 제제는 CD3-결합 분자; CD28-결합 분자; 재조합 IL-2; 재조합 IL-15; 및 재조합 IL-7, 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 항원, 및 항원 수용체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 포함하는 백신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
90. 구현예 89에 있어서, 하나 이상의 자극 제제는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체를 포함하는 것인 방법.
91. 구현예 82-90 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 아웃풋 조성물의 세포 또는 형질도입된 세포는 준-최적 투여량(sub-optimal dose)로 투여되는 것인 방법.
92. 구현예 82-91 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 생체내에서 형질도입된 T 세포의 자극 및/또는 확장을 유도 또는 증강시키기 위한 하나 이상의 제제를 대상체에 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
93. 구현예 92에 있어서, 하나 이상의 제제는 도입유전자-특이적이거나 및/또는 선택적으로 항원 수용체이거나 또는 이를 포함하는, 발현된 도입유전자를 통해 세포를 자극 또는 활성화시키는 것인 방법.
94. 구현예 92 또는 구현예 93에 있어서, 하나 이상의 제제는 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 항원, 항원 수용체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 포함하는 백신 또는 항원 수용체의 이량화를 화학적으로 유도할 수 있는 제제로부터 선택되는 것인 방법.
95. 구현예 92에 있어서, 하나 이상의 제제는 면역조절 제제; 면역 체크포인트 억제제; 세포외 아데노신 또는 아데노신 수용체, 선택적으로 A2aR 수용체의 억제제; 키누레닌 경로 조절제, 및 신호전달 경로의 조절제, 예컨대, 키나아제 억제제인 것인 방법.
96. 표적 항원에 특이적으로 결합하는 트랜스제닉 TCR 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)을 발현하도록 유전자 조작된 일차 인간 T 세포의 집단을 포함하는 조성물로서:
상기 집단은 복수의 휴지(resting) T 세포를 포함하고; 및
상기 복수의 휴지 T 세포는 조성물 내 유전자 조작된 세포를 적어도 7.5% 포함하는 것인 조성물.
97. 구현예 96에 있어서, 유전자 조작된 휴지 T 세포는 조성물 내 유전자 조작된 세포를 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 포함하는 것인 조성물.
98. 구현예 96 또는 구현예 97에 있어서, 휴지 T 세포는 HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L (CD154) 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 음성이고; IL-2, IFN-감마 및 TNF-알파로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포내 발현을 결여하며; 세포 주기의 G0 또는 G0G1a 단계에 있거나; 및/또는 활성 SAMHD1을 포함하는 것인 조성물.
99. 구현예 98에 있어서, 휴지 T 세포는 CD25 및 CD69에 대해 표면 음성 (CD25-/CD69-)인 것인 조성물.
100. 구현예 96-99 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 휴지 T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 조성물.
101. 구현예 96-100 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 표적 항원은 질환 또는 장애와 관련된 것인 조성물.
102. 구현예 100에 있어서, 질환 또는 장애는 감염성 질환 또는 병태, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 암인 것인 조성물.
103. 구현예 96-102 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 표적 항원은 B 세포 성숙 항원 (BCMA), 탄산 무수화 효소 9 (CAIX), tEGFR, Her2/neu (수용체 티로신 키나아제 erbB2), CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 이량체 EGFR vIII, 엽산 결합 단백질 (FBP), FCRL5, FCRH5, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, 키나아제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, Lewis Y, L1-세포 부착 분자 (L1-CAM), 흑색종-관련 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 흑색종 우선 발현 항원 (PRAME), 서바이빈, TAG72, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2, PSCA, 엽산 수용체-알파, CD44v6, CD44v7/8, avb6 인테그린, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, 태아 AchR, NKG2D 리간드, CD44v6, 이중 항원, 고환암(cancer-testes) 항원, 메소텔린, 쥐의 CMV, 뮤신 1 (MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아종양 항원, G 단백질 결합 수용체 5D (GPCR5D), ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원 (CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, c-Met, GD-2, O-아세틸화된 GD2 (OGD2), CE7, 윌름 종양 1 (WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, CCL-1, CD138, 병원체-특이적 항원 및 유니버설 태그에 결합된 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
104. 구현예 96-103 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 일차 인간 T 세포는 ITAM을 포함하는 세포내 신호전달 도메인 및 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인을 포함하는, CAR을 발현하도록 유전자 조작되는 것인 조성물.
105. 구현예 104에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타 (CD3ζ) 사슬의 세포내 도메인을 포함하는 것인 조성물.
106. 구현예 104 또는 구현예 105에 있어서, CAR은 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인을 연결하는 막관통 도메인을 더 포함하는 것인 조성물.
107. 구현예 106에 있어서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 포함하는 것인 조성물.
108. 구현예 104-107 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 공동자극 분자의 세포내 신호전달 도메인을 더 포함하는 것인 조성물.
109. 구현예 108에 있어서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 및 41BB로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
110. 구현예 96-108 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것인 조성물.
VI. 실시예
[0539] 다음의 실시예들은 어디까지나 설명 목적으로 포함된 것일 뿐 본 발명의 범위를 이에 한정하려는 의도로 포함된 것이 아니다.
실시예 1: 사전 세포 활성화가 없는 일차 인간 T 세포의 렌티바이러스 형질도입의 평가
[0540] 렌티바이러스 형질도입 샘플로부터 농축된 1차 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 렌티바이러스 형질도입은, 먼저 세포를 형질도입 전 생체외 T 세포 활성화 단계에 적용하지 않고 수행하였다.
[0541] 단핵 세포가 풍부한 인간 백혈구성분채집 샘플을 백혈구성분채집 시스템을 이용하여 대상체의 전혈 샘플로부터 수득하였다. 단핵 세포, 자가 혈장 및 항응고제인 ACD-A (항응고제 구연산염 덱스트로스 A)를 함유하는 백혈구성분채집 샘플을 얻기 위해 혈액을 처리하였다.
[0542] 백혈구성분채집 샘플의 세포를 세척하고, 인산염 완충 생리 식염수 (PBS), EDTA 및 인간 혈청 알부민을 함유하는 완충액을 사용하여 친화성-기반 선택에 사용하기 위해 완충액에 재현탁시켰다. T 세포의 면역친화성-기반 선택을 위해, 선택용 모노클로날 항체에 결합된 자성 비드를 실온에서 30분 동안 인큐베이션 처리하고, 마그네틱 컬럼을 사용하여 선별하였다. 농축된 T 세포를 동결보존 배지에 재현탁하고, 세포들을 동결보존시켜 세포를 추가 사용할 때까지 액체 질소에 보관하였다. 동결보존된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 해동, 세척하고, 형질도입을위한 배지에 재현탁시켰다.
[0543] 이어서, T 세포를 T 세포 활성화제와 함께 인큐베이션시키지 않고, 예컨대 상기 세포를 항-CD3 및 항-CD28 시약과 인큐베이션시키지 않고, 렌티바이러스 벡터 입자와 접촉시켰다. 형질도입을 위해, T 세포를 200 ㎕ 부피의 24-웰 플레이트의 개별 웰에 첨가하였다. 다가양이온 형질도입 아쥬반트와 예비혼합된 도입유전자를 인코딩하는 핵산(이 경우, 형질도입 마커로서 사용하기 위한 예시적인 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 절단된 EGFR, EGFRt 서열을 인코딩하고, 자가 절단 T2A 서열에 의해 CAR 서열로부터 분리됨)을 함유하는 렌티바이러스 벡터 입자를 2배 연속 희석하여 웰에 첨가 하였다. 웰 당 최종 부피를 1.1 mL로 조정하였다. 조성물들을 약 1 시간 동안 원심분리 시키고 이어서 37℃에서 24 시간 인큐베이션시켰다.
[0544] 대조군으로서, 형질도입에 앞서, T 세포를 항-CD3 및 항-CD28 항체 단편으로 코팅된 자성 비드를 각각 함유하는 두 가지 상이한 활성화 시약 (시약 1 또는 시약 2라 칭함) 중 하나와 함께 37℃에서 약 24 시간 배양시킴으로써 T 세포를 활성화시킨 것을 제외하고, 동결보존된 조성물로부터 해동된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 사용하여 전술한 바와 같이 형질도입을 수행하였다.
[0545] 전술한 각 조건에서 형질도입 후, 각 조성물의 세포들을 배지 및 IL-2의 존재 하에 37℃에서 48시간 배양시켰다.
[0546] 형질도입 효율의 척도로서, 유세포 계측법에 기초한 분석법을 사용하여 CAR의 표면 발현에 대해 양성인 세포의 백분율을 구하였다 (이 경우, 대리 마커 EGFRt를 인식하는 항-EGFL 항체를 사용하여 검출됨). 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 이 연구에서 활성화되지 않은 경우의 형질도입 효율(EGFRt 표면 발현에 의해 반영된 바와 같은)은 형질도입 전에 항-CD3/항-CD28 시약으로 활성화된 세포에서의 형질도입 효율과 필적할만 하였다. 이러한 결과는 T 세포의 생체외 활성화를 위한 제제와 함RP 사전 인큐베이션시키지 않고도 렌티바이러스 벡터를 사용하여 T 세포의 동등한 형질도입이 달성될 수 있음을 보여주었다.
실시예 2: 사전 세포 활성화 없는 일차 인간 T 세포의 렌티바이러스 형질도입을위한 대규모 처리
[0547] 이 실시예는 다양한 조건 하에서 세포가 수득되고, 친화도-선별되고, 형질도입되고(사전 활성화되거나 되지 않음), 배양되거나, 인큐베이션된, 대규모 공정을 통한 건강한 도너의 성분채집술을 통해 얻어진 CD4+ 및 CD8+ 선택된 T 세포의 형질도입에 대해 설명한다. 세척, 친화도-기반 선택 및 형질도입을, 예를 들어 국제공개번호 WO2016/073602에 설명된 바와 같이 실직적으로 수직인 원심 처리 챔버에서 수행하였다.
1. 샘플 수집 및 백혈구성분채집(leukapheresis)
[0548] 백혈구성분채집 수집 시스템을 사용하여 환자로부터 자가 말초혈액 단핵구 세포들(PBMCs)을 수집하였다. 혈액을 처리하여 단핵 세포 및 약 1/3 부피의자가 혈장 및 항응고제인 ACD-A (항응고제 시트레이트 덱스트로스 A)를 함유하는 샘플을 얻었다. 백혈구성분채집 샘플을 2-8℃에서 약 24시간 동안 밀봉 보관하였다.
2. 백혈구성분채집 세척
[0549] 백혈구성분채집 샘플을 무균적으로 전달 팩(transfer pack)에 옮겼다. 백혈구성분채집 샘플의 세포들을 세척하고, PBS, EDTA, 및 인간 혈청 알부민을 함유하는 선택 완충액에 친화성-기반 선택을 위해 재현탁시켰다. 세척은 원심처리 챔버(A-200F)를 포함한, 재생 의료 분야에서 사용되는 Biosafe SA 사가 판매하는 멸균, 1회용 키트에서 수행하였다. 세포를 함유하는 상기 전달 팩과 완충액을 함유하는 백을, Sepax® 2 처리 유닛과 연계하여 배치된 키트에 무균적으로 연결시켰다. 2회의 세척 사이클을 수행하였으며, 상기 각 세척 사이클은 공동 내벽에서 180 초 동안 약 200 g RCF로 수행되었고, 이어서 20 mL에서 세포를 최종 재현탁시켰다. 프로토콜 말미에 친화성-기반 선택을 위한 시약들과의 후속 인큐베이션을 위해, 세포들을 원심분리 챔버의 처리 공동(cavity)에서 유지시켰다.
3. 친화성-기반 선택
[0550] 원신분리 챔버에서 세척된 백혈구성분채집에 첨가된, 모노클로날 항체에 커플링된 자성 비드를 이용하여 면역친화성-기반 선택에 의해 CD4 및 CD8 T 세포를 농축시켰다. 전술한 선택 완충액에서 비드를 혼합한 다음, 장치에 무균적으로 연결하였다. Sepax® 2 유닛에서 프로그램을 실행하여 비드 혼합물과 선택 완충액을 세척된 세포가 있는 챔버로 가져오고, 챔버의 내용물을 30분 동안 혼합하였다.
[0551] 프로그램 종료시, Sepax® 2 유닛은 세포의 펠렛화 및 과량의 완충액/비드의 방출, 펠렛화된 세포의 세척 및 선택 완충액에서의 재현탁을 일으켰다. 이 프로그램에 의해 세척된 세포들이 전달 팩으로 모여졌다.
[0552] 이어서, 세포들을 표준 방법을 사용하여 자기장의 존재하에, 전달 팩으로부터 튜브 라인 및 분리 컬럼의 밀폐된 멸균 시스템을 통과시켜, CD4-특이적 및/또는 CD8-특이적 시약에 결합된 세포들을 분리시켰다. 그런 다음 자기적으로 표지된 세포들을 추가 처리를 위해 전달 팩에서 수집하였다.
4. 형질도입
[0553] Sepax® 처리 유닛과 연계 배치된 키트에 통합된 원심분리 챔버에서 렌티바이러스 벡터에 의한 형질도입을 실시하였다. 선택된 세포는 형질도입 (t=0에서 형질도입)되거나 또는 항-CD3/CD28 시약을 사용하여 활성화되었다 (t=0에서 활성화되고 t=24에서 형질도입됨).
[0554] 최초로 활성화된 세포들의 경우, 선택된 세포들을 세척하고 Sepax® 2 시스템을 사용하여 완전 배지에 재현탁시킨 다음, 실온에서 챔버의 공동에서 항-CD3/28 시약(들)과 조합시켰다. 인큐베이션 후 인큐베이션된 물질을 Sepax® 2 장치를 통해 세포 배양 백으로 옮기고 37℃에서 24 시간 동안 인큐베이션시켰다.
[0555] 형질도입을 개시하기 위해, 다음 단계들을 실시하였다.
[0556] 완전배지 (5% (v/v) 인간 혈청, 1.6 mg/mL N-아세틸시스테인 (NAC) 및 100 IU/mL IL-2를 함유하는 X-VIVO-15) 및 형질도입 개시 동안 10 ㎍/mL의 최종 농도에 충분한 양의 다가양이온, 바이러스 벡터 입자 (약 3.2 IU/세포), 및 적용가능한 경우, 공기를 함유하는 형질도입 시약 용액을 제조하였다. 형질도입 시약 용액을 원심분리 백에 무균적으로 옮겼다.
[0557] 대략 200x106개의 선택된 세포들 또는 200x106개의 활성화된 세포들과 함께 조성물을 함유하는 생성물 백을, Sepax® 2 처리 유닛과 연계하여 배치된 1회용 키트에 무균적으로 연결시켰다. Sepax® 2에서 자동화 사이클을 수행하여, 세포들을 함유하는 조성물을 챔버의 공동 내로 용이하게 이동시키고, 조성물을 Sepax® 상에서 회전시켜 세포를 펠렛화시키고, 목적하는 부피, 예컨대 10 mL를 달성하는데 필요한 적절한 액체 부피를 제거하였다. 이어서 형질도입 시약 용액의 내용물을 세포와 함께 챔버의 공동 내로 유도하였다. 이어서 결과적인 200 mL 부피(세포 및 바이러스를 포함)를 원심분리 백에 옮겼다.
[0558] 형질도입을 개시하기 위해, 바이러스와 세포들을 함유하는 원심분리 백을 제거하고 키트의 인풋 위치에서 무균적으로 연결한 다음 챔버의 공동으로 옮겼다. 바이러스 및 세포들을 공동의 내벽에서 약 1600 g의 RCF로 챔버의 공동에서 회전시켰다. 회전은 지시된 속도로 1 시간 수행하였다. 이어서 형질도입된 물질을 아웃풋 백으로 옮겼다. 완전 배지를 챔버에 옮기고, 60초간 혼합한 다음, 처리 공동으로부터 아웃풋 백에 옮겨서 형질도입된 물질을 함유하는 아웃풋 백 중에 총 200 mL의 부피를 생성하였다.
[0559] 사전 활성화 단계 없이, 선택 후(post-selection) 형질도입된 세포들을, 이어서 (1) FBS, 100 IU/mL IL-2 및 10 IU/mL IL-15가 보강된 배양 배지에서 항-CD3/항-CD28 시약으로 즉시 활성화시켜 제9일에 수확하고; (2) 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 배양 배지에서 항-CD3/항-CD28로 활성화시키고 제9일에 수확하고; (3) 활성화 없이 37℃, 5% CO2에서 3일간 배양시킴으로써 유지하고; (4) 37℃, 5% CO2에서 24 시간 동안 인큐베이션, 동결보존, 해동시키고 배양 배지에서 항-CD3/항-CD28 시약에 의해 활성화시키고 제14일에 수확하였다. 형질도입에 앞서 활성화된 다음 24 시간 후에 형질도입된 대조군 세포들의 경우, 이들 세포들을 배양 배지(활성화되지 않음)의 존재 하에 확장시켜 제9일에 수확하였다. 각 조건에서, 세포들을 37℃, 5% CO2에서에서 배양하였다.
[0560] 표 1에 시험군 및 형질도입 후 인큐베이션 조건에 대해 요약하였다.
Figure pct00001
[0561] 백혈구성분채집술에 의해 수득되 세포의 선택 후 다양한 경과일에서의 형질도입 빈도를 1에 기재된 바와 같이 측정 하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, T 세포가 먼저 형질도입된 직후에 활성화된 경우의 형질도입 빈도(표면 마커 발현에 의해 측정됨)는 형질도입 전 24 시간 동안 먼저 활성화된 T 세포의 경우에 필적하였다(선택 후 9일에 수확된 동결보존 생성물에서 각각 63% 대 68%). 이 결과는 형질도입 전에 T 세포를 활성화시키지 않고도 비교적 높은 형질도입 효율을 얻을 수 있음을 입증하는 것이다.
[0562] 사전 T 세포 활성화가 형질도입 (유전자 통합)에 요구되지는 않았으나, 이 연구의 시험 결과는, 활성화 시약과 세포들을 함께 인큐베이션하는 것이,재조합 단백질의 지속적인 표면 발현에 중요한 것으로 관찰되었음을 시사하였다. 활성화되지 않은 세포의 경우, 표면 EGFRt 발현 (CAR 발현을 위한 표면 대리 마커)은 일시적이었다; 검출된 EGFRt의 표면 발현 빈도 (형질도입의 지표)는 형질도입 후 24 시간에 29%로 최고조에 달했고 형질도입 후 3 일째에는 < 1%로 급락하였다.
[0563] 또한, 도 2는 활성화 시약과의 인큐베이션 처리가 24 시간 지연된 경우에 조차 (형질도입 전 활성화된 세포와 비교) 43%라는 충분히 높은 마커 빈도(형질도입 빈도의 척도임)를 결과시켰음을 보여주었다. 형질도입 직후 활성화 시약 (항 CD3/CD28이 부착된 자성 비드)과 인큐베이션시키자, 활성화가 24 시간 지연된 경우보다, 형질도입 마커의 표면 발현을 나타내는 세포 빈도가 더 높았다(선택 후 제9일에 수확된 동결보존된 생성물에서 측정된 빈도가 각각 63% 대 43%임). 후속적인 해동 및 활성화 시약과의 인큐베이션에 앞서 형질도입된 세포들을 동결보존(형질도입 후 24 시간)시킨 경우, 동결보존 없이 형질도입 및 활성화 시약과 인큐베이션된 세포들에 비해 형질도입 마커 빈도의 감소가 야기되었다 (동결보존 산물에서 측정된 각각의 형질도입 빈도가 각각 16% 대 43% 임).
[0564] 본 발명은 예를 들어 본 발명의 다양한 양태를 설명하기 위해 제공되는 특정의 개시된 실시예로 그 범위가 제한되지 않는다. 설명된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 본원의 설명 및 교시로부터 명백해질 것이다. 이러한 변형은 본원 개시 내용의 진정한 범위 및 사상을 벗어남이 없이 실시될 수 있으며 본원 개시 내용의 범위에 포함되도록 의도된다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
[0565] 본 발명은 예를 들어 본 발명의 다양한 양태를 설명하기 위해 제공되는 특정의 개시된 실시예로 그 범위가 제한되지 않는다. 설명된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 본원의 설명 및 교시로부터 명백해질 것이다. 이러한 변형은 본원 개시 내용의 진정한 범위 및 사상을 벗어남이 없이 실시될 수 있으며 본원 개시 내용의 범위에 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Juno Therapeutics, Inc. Tareen, Semih U Beaushesne, Pascal <120> PRODUCTION OF ENGINEERED CELLS FOR ADOPTIVE CELL THERAPY <130> 735042005040 <150> US 62/430,349 <151> 2016-12-05 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 1 Met Ser Asp Pro Arg Glu Arg Ile Pro Pro Gly Asn Ser Gly Glu Glu 1 5 10 15 Thr Ile Gly Glu Ala Phe Glu Trp Leu Asn Arg Thr Val Glu Glu Ile 20 25 30 Asn Arg Glu Ala Val Asn His Leu Pro Arg Glu Leu Ile Phe Gln Val 35 40 45 Trp Gln Arg Ser Trp Glu Tyr Trp His Asp Glu Gln Gly Met Ser Gln 50 55 60 Ser Tyr Val Lys Tyr Arg Tyr Leu Cys Leu Met Gln Lys Ala Leu Phe 65 70 75 80 Met His Cys Lys Lys Gly Cys Arg Cys Leu Gly Glu Gly His Gly Ala 85 90 95 Gly Gly Trp Arg Pro Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Leu Ala 100 105 110 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 2 Met Thr Asp Pro Arg Glu Arg Ile Pro Pro Gly Asn Ser Gly Glu Glu 1 5 10 15 Thr Ile Gly Glu Ala Phe Glu Trp Leu His Asn Thr Val Glu Ala Leu 20 25 30 Asn Gln Thr Ala Val Gln His Leu Pro Arg Glu Leu Ile Phe Gln Val 35 40 45 Trp Arg Arg Cys Trp Glu Tyr Trp Val Asp Glu Gln Gly Tyr Ser Pro 50 55 60 Ser Tyr Ala Lys Tyr Arg Tyr Val Gln Leu Met Gln Lys Ala Met Phe 65 70 75 80 Gln His Phe Arg Lys Gly Cys Thr Cys Arg Gly Glu Gly His Ser Gln 85 90 95 Gly Gly Trp Arg Thr Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Leu Ala 100 105 110 <210> 3 <211> 112 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 3 Met Ser Asp Pro Arg Glu Arg Ile Pro Pro Gly Asn Ser Gly Glu Glu 1 5 10 15 Thr Ile Gly Glu Ala Phe Asp Trp Leu Asp Arg Thr Val Glu Glu Ile 20 25 30 Asn Arg Ala Ala Val Asn His Leu Pro Arg Glu Leu Ile Phe Gln Val 35 40 45 Trp Arg Arg Ser Trp Glu Tyr Trp His Asp Glu Met Gly Met Ser Val 50 55 60 Ser Tyr Thr Lys Tyr Arg Tyr Leu Cys Leu Ile Gln Lys Ala Met Phe 65 70 75 80 Met His Cys Lys Lys Gly Cys Arg Cys Leu Gly Gly Glu His Gly Ala 85 90 95 Gly Gly Trp Arg Pro Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Leu Ala 100 105 110 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 4 Met Ala Asp Pro Arg Glu Arg Val Pro Pro Gly Asn Ser Gly Glu Glu 1 5 10 15 Thr Ile Gly Glu Ala Phe Glu Trp Leu Asp Arg Thr Ile Glu Ala Leu 20 25 30 Asn Arg Glu Ala Val Asn His Leu Pro Arg Glu Leu Ile Phe Gln Val 35 40 45 Trp Gln Arg Ser Trp Ala Tyr Trp His Asp Glu Gln Gly Met Ser Thr 50 55 60 Ser Tyr Thr Lys Tyr Arg Tyr Leu Cys Ile Met Gln Lys Ala Val Tyr 65 70 75 80 Ile His Phe Lys Lys Gly Cys Thr Cys Leu Gly Arg Gly His Gly Pro 85 90 95 Gly Gly Trp Arg Pro Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Leu Val 100 105 110 <210> 5 <211> 117 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 5 Met Glu Arg Tyr Pro Pro Ser His Pro Pro His Phe Thr Ser Arg Thr 1 5 10 15 Val Pro Met Thr Arg Leu Ala Leu Gln Gln Ala Met Gln Asp Leu Asn 20 25 30 Glu Glu Ala Leu Lys His Phe Thr Arg Glu Glu Leu Trp Gly Val Trp 35 40 45 Asn His Cys Val Asp Leu Pro Ala Gln Pro Asp Trp Thr Gly Glu Gln 50 55 60 Ala Trp Ala Ala Ser Val Ile Asp Tyr Ile Lys Ile Val Gln Arg Met 65 70 75 80 Leu Trp Leu His Leu Arg Glu Ala Cys Phe His Arg Glu Arg Glu Ala 85 90 95 Thr Arg Arg Tyr Pro Asn Ile Arg Pro Leu Thr Gly Arg Asn Arg Glu 100 105 110 Val Arg Asp Gly Glu 115 <210> 6 <211> 135 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 6 Met Glu Arg Val Pro Pro Ser His Arg Pro Pro Trp His Ser Arg Val 1 5 10 15 Val Pro Thr Thr Met Gln Gln Ala Gln Gln Ala Met Trp Asp Leu Asn 20 25 30 Glu Glu Ala Glu Lys His Phe Ser Arg Glu Glu Leu Arg Gly Ile Trp 35 40 45 Asn Asp Val Thr Glu Leu Pro Ala Asp Pro Asn Trp Thr Val Asp Gln 50 55 60 Ala Ala Ile Ala Cys Ala Ile Asp Tyr Ile Arg Arg Thr Gln Thr Leu 65 70 75 80 Leu Phe Arg His Tyr Arg Glu Gly Cys Tyr His Arg Tyr Ser Asn Thr 85 90 95 Ile Arg Arg Tyr Pro Asn Ile Arg Pro Leu Arg Gly Thr Gln Ala Pro 100 105 110 Pro Ser Asn Ser Met Pro Asn Ala Asp Pro Thr Pro Pro Leu Arg Pro 115 120 125 Ser Arg Tyr Arg Met Asp Glu 130 135 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 7 Met Ala Ser Gly Arg Asp Pro Arg Glu Glu Arg Pro Gly Glu Leu Glu 1 5 10 15 Ile Trp Asp Leu Ser Arg Glu Pro Trp Asp Glu Trp Leu Arg Asp Met 20 25 30 Leu Thr Glu Leu Asn Gln Glu Ala Gln Arg His Phe Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Leu Phe Gln Val Trp Asn Tyr Cys Gln Glu Glu Gly Glu Arg Gln Asn 50 55 60 Val Pro Met Gln Glu Arg Ala Tyr Lys Tyr Tyr Lys Leu Val Gln Arg 65 70 75 80 Ala Leu Phe Val His Phe Arg Cys Gly Cys Arg Arg Arg Gln Pro Phe 85 90 95 Glu Pro Tyr Glu Glu Arg Arg Asn Gly Gln Gly Gly Gly Arg Ala Gly 100 105 110 Arg Val Pro Pro Gly Leu Asp 115 <210> 8 <211> 119 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 8 Met Ala Ser Gly Arg Asp Pro Arg Glu Glu Arg Pro Gly Glu Val Glu 1 5 10 15 Ile Trp Asp Leu Ser Arg Glu Pro Trp Asp Glu Trp Leu Arg Asp Met 20 25 30 Leu Ala Glu Leu Asn Arg Glu Ala Gln Arg His Phe Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Leu Phe Gln Val Trp Asn Tyr Cys Gln Glu Glu Gly Glu Arg Gln Asn 50 55 60 Ile Pro Met Gln Glu Arg Ala Tyr Lys Tyr Tyr Arg Leu Val Gln Lys 65 70 75 80 Ala Leu Phe Val His Ile Arg Cys Gly Cys Arg Arg Arg Gln Pro Phe 85 90 95 Glu Pro Tyr Glu Glu Arg Arg Asn Gly Gln Gly Gly Gly Arg Ala Glu 100 105 110 Arg Val Pro Pro Gly Leu Asp 115 <210> 9 <211> 117 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 9 Met Glu Arg Tyr Pro Pro Ser His Pro Pro His Phe Thr Ser Arg Thr 1 5 10 15 Val Pro Met Thr Arg Leu Ala Leu Gln Gln Ala Met Gln Asp Leu Asn 20 25 30 Glu Glu Ala Leu Lys His Phe Thr Arg Glu Glu Leu Trp Gly Val Trp 35 40 45 Asn His Cys Val Asp Leu Pro Ala Gln Pro Asp Trp Thr Gly Glu Gln 50 55 60 Ala Trp Ala Ala Ser Val Ile Asp Tyr Ile Lys Ile Val Gln Arg Met 65 70 75 80 Leu Trp Leu His Leu Arg Glu Ala Cys Phe His Arg Glu Arg Glu Ala 85 90 95 Thr Arg Arg Tyr Pro Asn Ile Arg Pro Leu Thr Gly Arg Asn Arg Glu 100 105 110 Val Arg Asp Gly Glu 115 <210> 10 <211> 113 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 10 Met Glu Arg Leu Pro Pro Ser His Pro Pro Ala Leu Val Ser Arg Met 1 5 10 15 Ala Glu Thr Thr Gln Arg Gln Leu Gln Glu Ala Val Trp Asp Ile Thr 20 25 30 Glu Glu Ala Arg Lys His Phe Ser Lys Glu Glu Ile Thr Gly Ile Trp 35 40 45 Asp His Cys Trp Ser Leu Pro Ala Leu Pro His Trp Thr Glu Gly Gln 50 55 60 Val Met Ala Ala Ala Val Ile Asp Phe Ile Arg Ile Met Gln Lys Glu 65 70 75 80 Ile Trp Lys His Tyr Arg Val Gly Cys Phe His Arg Glu Ala Glu Arg 85 90 95 Val Arg His Tyr Pro Asn Ile Arg Pro Leu Arg Pro Arg Arg Glu Glu 100 105 110 Pro <210> 11 <211> 115 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 11 Met Glu Arg Leu Pro Pro Ser His Pro Leu Pro Leu Thr Ser Arg Leu 1 5 10 15 Ile Pro Thr Pro Arg Pro Gln Leu Glu Arg Leu Met Arg Glu Val Arg 20 25 30 Asp Glu Met Leu Ile His Phe Thr Arg Asp Glu Val Ile Gly Val Trp 35 40 45 Asn His Cys Val Glu Leu Pro Ala Asp Pro Asp Trp Thr Gly Glu Gln 50 55 60 Ala Trp Ala Ala Ser Val Ile Asp Phe Ala Arg Lys Gly Asn Gln Met 65 70 75 80 Leu Leu Leu His Phe Gln Gln Gly Cys Tyr His Glu Gln Gln Arg Arg 85 90 95 Thr Pro His Tyr Pro Asn Ile Arg Pro Leu Ser Gly Arg Gly Glu Arg 100 105 110 Thr Met Gln 115 <210> 12 <211> 133 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 12 Met Glu Arg Ile Pro Pro Ser His Pro Met Pro Trp Leu Ser Arg Arg 1 5 10 15 Val Pro Thr Thr Met Ala Ile Ala Gln Asn Ala Leu Trp Glu Ile Asn 20 25 30 Glu Glu Ala Glu Lys His Phe Ser Arg Asp Glu Leu Arg Gly Ile Trp 35 40 45 His Asp Val Thr Glu Leu Pro Ala Asp Pro Asp Trp Thr Val Asp Gln 50 55 60 Ala Ala Ile Ala Cys Ala Ile Asp Tyr Ile Arg Val Gln Thr Leu Leu 65 70 75 80 Phe Arg His Phe Lys Asp Gly Cys Phe His Arg Val Asn Leu Ser Gly 85 90 95 Arg Tyr Pro Ala Ile Arg Pro Ser Arg Gly Thr Ala Pro Pro Asp Ser 100 105 110 Asn Ser Val Ser His Ala Asp Pro Glu Gln Pro Arg Arg Pro Ser Arg 115 120 125 Tyr Arg Met Asp Glu 130 <210> 13 <211> 135 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 13 Met Glu Arg Thr Pro Pro Ser His Pro Leu Pro Trp Ile Ser Arg Arg 1 5 10 15 Val Pro Thr Thr Met Ala Val Ala Gln Ser Ala Met Trp Glu Ile Asn 20 25 30 Glu Glu Ala Glu Lys His Phe Ser Arg Glu Glu Leu Arg Gly Ile Trp 35 40 45 His Asp Val Thr Glu Leu Pro Ala Asp Pro Asp Trp Thr Val Asp Gln 50 55 60 Ala Ala Ile Ala Cys Ala Ile Asp Tyr Val Arg Arg Val Gln Thr Leu 65 70 75 80 Leu Phe Arg His Phe Arg Asp Gly Cys Phe His Arg Tyr Asn Arg Ile 85 90 95 Val Arg Arg Tyr Pro Val Ile Arg Pro Leu Arg Gly Thr Ala Pro Pro 100 105 110 Asp Ser Asn Ser Val Pro His Ala Asp Pro Glu Gln Pro Arg Arg Pro 115 120 125 Ser Arg Tyr Arg Met Asp Glu 130 135 <210> 14 <211> 135 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 14 Met Glu Gln Pro Pro Gln Ser His Pro Leu His Trp Thr Ser Arg Met 1 5 10 15 Val Pro Ile Glu Arg Gln Ala Leu Gln Ala Ala Ile Trp Glu Leu Asn 20 25 30 Glu Glu Ala Leu Lys His Phe Ser Arg Glu Glu Leu Arg Gly Ile Trp 35 40 45 Glu Gln Val Thr Glu Leu Pro Ala Asp Pro Ala Trp Asn Ala Asp Gln 50 55 60 Ala Trp Ala Ala Cys Ala Ile Asp Tyr Thr Arg Trp Val Gln Thr Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Arg His Tyr Arg Glu Gly Cys Tyr His Arg Tyr Ala Glu Gln 85 90 95 Ile Arg Arg Tyr Pro Val Leu Arg Pro Met Arg Gly Thr Ala Pro Gly 100 105 110 Pro Thr Ser Ser Val Pro Gln Ala Asp Pro Asp Asn Pro Arg Arg Pro 115 120 125 Ser Arg Tyr Arg Met Asp Glu 130 135 <210> 15 <211> 113 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 15 Met Ala Glu Ala Phe Phe Asn Pro Ser Gln His Val Gln Gly Thr Pro 1 5 10 15 Trp Phe Phe Ile Pro Arg Asn Val Glu Leu Thr Pro Asn Val Ile Asn 20 25 30 Val Thr Val Lys Ala Glu Leu Val Val Thr Glu Ala Ser Lys His Phe 35 40 45 Thr Pro Gln Glu Ile Tyr Gly Val Trp Asn Gln Ser Leu Asn Glu Glu 50 55 60 Ala Gly Thr Asp Ser Pro Thr Met Ala Trp Glu Arg Thr Met Leu Asp 65 70 75 80 Met Val Arg Ala Leu Asn Leu Met Leu Phe Glu His Phe Ala Ala Gly 85 90 95 Cys Pro Gln Arg Thr Arg Tyr Ala Arg His Arg Gly Tyr Pro His Pro 100 105 110 Ser <210> 16 <211> 99 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 16 Met Ala Glu Arg Ala Pro Glu Ala Pro Glu Gly Ala Gly Glu Val Gly 1 5 10 15 Leu Glu Gln Trp Leu Glu Thr Ser Leu Glu Arg Ile Asn Arg Glu Ala 20 25 30 Arg Leu His Phe His Pro Glu Phe Leu Phe Arg Leu Trp Asn Thr Cys 35 40 45 Val Glu His Trp His Asp Arg His Gln Arg Ser Leu Asp Tyr Ala Lys 50 55 60 Tyr Arg Tyr Leu Leu Leu Met His Lys Ala Met Tyr Thr His Met Gln 65 70 75 80 Gln Gly Cys Pro Cys Arg Asn Gly Arg Pro Arg Gly Pro Pro Pro Pro 85 90 95 Gly Met Ala <210> 17 <211> 113 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 17 Met Ala Glu Arg Gln Ser Val Glu Arg Ala Pro Ala Glu Pro Met Gly 1 5 10 15 Ala Gly Glu Val Glu Leu Glu Glu Trp Leu Gln Arg Ser Leu Leu Arg 20 25 30 Ile Asn Gln Glu Ala Arg Leu His Phe His Pro Glu Phe Leu Phe Arg 35 40 45 Leu Trp Asn Thr Cys Met Glu His Tyr His Asp Ala Leu Gln Leu Ser 50 55 60 Phe Thr Tyr Ser Lys Tyr Arg Tyr Leu Leu Leu Leu Gln Lys Ala Met 65 70 75 80 Phe Met His Phe Gln Gln Gly Cys Ser Cys Leu Gln Gly Arg His Pro 85 90 95 Pro Pro Leu Arg Pro Ala Gly Asp Arg Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro 100 105 110 Pro <210> 18 <211> 112 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 18 Met Ser Asp Pro Arg Glu Arg Ile Pro Pro Gly Asn Ser Gly Glu Glu 1 5 10 15 Thr Ile Gly Glu Ala Phe Glu Trp Leu Asn Arg Thr Val Glu Glu Ile 20 25 30 Asn Arg Glu Ala Val Asn His Leu Pro Arg Glu Leu Ile Phe Gln Val 35 40 45 Trp Gln Arg Ser Trp Glu Tyr Trp His Asp Glu Gln Gly Met Ser Pro 50 55 60 Ser Tyr Val Lys Tyr Arg Tyr Leu Cys Leu Ile Gln Lys Ala Leu Phe 65 70 75 80 Met His Cys Lys Lys Gly Cys Arg Cys Leu Gly Glu Gly His Gly Ala 85 90 95 Gly Gly Trp Arg Pro Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Leu Ala 100 105 110 <210> 19 <211> 626 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Human SAMHD1 <300> <308> UniProt:Q9Y3Z3 <309> 1999-11-01 <400> 19 Met Gln Arg Ala Asp Ser Glu Gln Pro Ser Lys Arg Pro Arg Cys Asp 1 5 10 15 Asp Ser Pro Arg Thr Pro Ser Asn Thr Pro Ser Ala Glu Ala Asp Trp 20 25 30 Ser Pro Gly Leu Glu Leu His Pro Asp Tyr Lys Thr Trp Gly Pro Glu 35 40 45 Gln Val Cys Ser Phe Leu Arg Arg Gly Gly Phe Glu Glu Pro Val Leu 50 55 60 Leu Lys Asn Ile Arg Glu Asn Glu Ile Thr Gly Ala Leu Leu Pro Cys 65 70 75 80 Leu Asp Glu Ser Arg Phe Glu Asn Leu Gly Val Ser Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Arg Lys Lys Leu Leu Ser Tyr Ile Gln Arg Leu Val Gln Ile His Val 100 105 110 Asp Thr Met Lys Val Ile Asn Asp Pro Ile His Gly His Ile Glu Leu 115 120 125 His Pro Leu Leu Val Arg Ile Ile Asp Thr Pro Gln Phe Gln Arg Leu 130 135 140 Arg Tyr Ile Lys Gln Leu Gly Gly Gly Tyr Tyr Val Phe Pro Gly Ala 145 150 155 160 Ser His Asn Arg Phe Glu His Ser Leu Gly Val Gly Tyr Leu Ala Gly 165 170 175 Cys Leu Val His Ala Leu Gly Glu Lys Gln Pro Glu Leu Gln Ile Ser 180 185 190 Glu Arg Asp Val Leu Cys Val Gln Ile Ala Gly Leu Cys His Asp Leu 195 200 205 Gly His Gly Pro Phe Ser His Met Phe Asp Gly Arg Phe Ile Pro Leu 210 215 220 Ala Arg Pro Glu Val Lys Trp Thr His Glu Gln Gly Ser Val Met Met 225 230 235 240 Phe Glu His Leu Ile Asn Ser Asn Gly Ile Lys Pro Val Met Glu Gln 245 250 255 Tyr Gly Leu Ile Pro Glu Glu Asp Ile Cys Phe Ile Lys Glu Gln Ile 260 265 270 Val Gly Pro Leu Glu Ser Pro Val Glu Asp Ser Leu Trp Pro Tyr Lys 275 280 285 Gly Arg Pro Glu Asn Lys Ser Phe Leu Tyr Glu Ile Val Ser Asn Lys 290 295 300 Arg Asn Gly Ile Asp Val Asp Lys Trp Asp Tyr Phe Ala Arg Asp Cys 305 310 315 320 His His Leu Gly Ile Gln Asn Asn Phe Asp Tyr Lys Arg Phe Ile Lys 325 330 335 Phe Ala Arg Val Cys Glu Val Asp Asn Glu Leu Arg Ile Cys Ala Arg 340 345 350 Asp Lys Glu Val Gly Asn Leu Tyr Asp Met Phe His Thr Arg Asn Ser 355 360 365 Leu His Arg Arg Ala Tyr Gln His Lys Val Gly Asn Ile Ile Asp Thr 370 375 380 Met Ile Thr Asp Ala Phe Leu Lys Ala Asp Asp Tyr Ile Glu Ile Thr 385 390 395 400 Gly Ala Gly Gly Lys Lys Tyr Arg Ile Ser Thr Ala Ile Asp Asp Met 405 410 415 Glu Ala Tyr Thr Lys Leu Thr Asp Asn Ile Phe Leu Glu Ile Leu Tyr 420 425 430 Ser Thr Asp Pro Lys Leu Lys Asp Ala Arg Glu Ile Leu Lys Gln Ile 435 440 445 Glu Tyr Arg Asn Leu Phe Lys Tyr Val Gly Glu Thr Gln Pro Thr Gly 450 455 460 Gln Ile Lys Ile Lys Arg Glu Asp Tyr Glu Ser Leu Pro Lys Glu Val 465 470 475 480 Ala Ser Ala Lys Pro Lys Val Leu Leu Asp Val Lys Leu Lys Ala Glu 485 490 495 Asp Phe Ile Val Asp Val Ile Asn Met Asp Tyr Gly Met Gln Glu Lys 500 505 510 Asn Pro Ile Asp His Val Ser Phe Tyr Cys Lys Thr Ala Pro Asn Arg 515 520 525 Ala Ile Arg Ile Thr Lys Asn Gln Val Ser Gln Leu Leu Pro Glu Lys 530 535 540 Phe Ala Glu Gln Leu Ile Arg Val Tyr Cys Lys Lys Val Asp Arg Lys 545 550 555 560 Ser Leu Tyr Ala Ala Arg Gln Tyr Phe Val Gln Trp Cys Ala Asp Arg 565 570 575 Asn Phe Thr Lys Pro Gln Asp Gly Asp Val Ile Ala Pro Leu Ile Thr 580 585 590 Pro Gln Lys Lys Glu Trp Asn Asp Ser Thr Ser Val Gln Asn Pro Thr 595 600 605 Arg Leu Arg Glu Ala Ser Lys Ser Arg Val Gln Leu Phe Lys Asp Asp 610 615 620 Pro Met 625 <210> 20 <211> 52 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> MISC_FEATURE <223> HIV-1 P6 <400> 20 Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro Glu Glu Ser Phe Arg 1 5 10 15 Phe Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Pro Gln Lys Gln Glu Pro Ile Asp 20 25 30 Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Thr Ser Leu Arg Ser Leu Phe Gly Asn Asp 35 40 45 Pro Ser Ser Gln 50 <210> 21 <211> 63 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SIVmac P6 <400> 21 Pro Met Ala Gln Val His Gln Gly Leu Met Pro Thr Ala Pro Pro Glu 1 5 10 15 Asp Pro Ala Val Asp Leu Leu Lys Asn Tyr Met Gln Leu Gly Lys Gln 20 25 30 Gln Arg Glu Lys Gln Arg Glu Ser Arg Glu Lys Pro Tyr Lys Glu Val 35 40 45 Thr Glu Asp Leu Leu His Leu Asn Ser Leu Phe Gly Gly Asp Gln 50 55 60 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> SIVmac P6 <220> <221> VARIANT <222> 2, 4, 5 <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 22 Asp Xaa Ala Xaa Xaa Leu Leu 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> packaging motif <400> 23 Asp Pro Ala Val Asp Leu Leu 1 5 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> packaging motif <400> 24 Asp Pro Ala Val Asp Leu Leu Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construc <220> <221> MISC_FEATURE <223> Hybrid P6 domain <400> 25 Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro Glu Glu Ser Asp Pro 1 5 10 15 Ala Val Asp Leu Leu Thr Thr Pro Pro Gln Lys Gln Glu Pro Ile Asp 20 25 30 Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Thr Ser Leu Arg Ser Leu Phe Gly Asn Asp 35 40 45 Pro Ser Ser Gln 50 <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> Binding motif <220> <221> VARIANT <222> 6, 9, 14 <223> Xaa can be Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr or Met <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 12, 15 <223> Xaa can be any amino acid <400> 26 Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa His 1 5 10 15 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer (IgG4hinge) (aa) <400> 27 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 28 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer (IgG4hinge) (nt) <400> 28 Gly Ala Ala Thr Cys Thr Ala Ala Gly Thr Ala Cys Gly Gly Ala Cys 1 5 10 15 Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Cys Cys Thr Thr Gly 20 25 30 Cys Cys Cys Thr 35 <210> 29 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge-CH3 spacer <400> 29 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg 1 5 10 15 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 20 25 30 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 35 40 45 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 50 55 60 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 65 70 75 80 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 85 90 95 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 100 105 110 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 115 <210> 30 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge-CH2-CH3 spacer <400> 30 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 31 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgD-hinge-Fc <400> 31 Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala 1 5 10 15 Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala 20 25 30 Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys 35 40 45 Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro 50 55 60 Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln 65 70 75 80 Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly 85 90 95 Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val 100 105 110 Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly 115 120 125 Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn 130 135 140 Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro 145 150 155 160 Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys 165 170 175 Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser 180 185 190 Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu 195 200 205 Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro 210 215 220 Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser 225 230 235 240 Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr 245 250 255 Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg 260 265 270 Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His 275 280 <210> 32 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A <400> 32 Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp 1 5 10 15 Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg 20 <210> 33 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tEGFR <400> 33 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly 20 25 30 Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe 35 40 45 Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala 50 55 60 Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu 65 70 75 80 Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile 85 90 95 Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu 100 105 110 Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala 115 120 125 Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu 130 135 140 Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr 145 150 155 160 Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys 165 170 175 Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly 180 185 190 Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu 195 200 205 Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys 210 215 220 Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu 225 230 235 240 Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met 245 250 255 Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala 260 265 270 His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val 275 280 285 Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His 290 295 300 Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro 305 310 315 320 Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala 325 330 335 Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly 340 345 350 Ile Gly Leu Phe Met 355 <210> 34 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CD28 (amino acids 153-179 of Accession No. P10747) <400> 34 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 35 <211> 66 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CD28 (amino acids 114-179 of Accession No. P10747) <400> 35 Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn 1 5 10 15 Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu 20 25 30 Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly 35 40 45 Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe 50 55 60 Trp Val 65 <210> 36 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CD28 (amino acids 180-220 of P10747) <400> 36 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 37 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CD28 (LL to GG) <400> 37 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 38 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> 4-1BB (amino acids 214-255 of Q07011.1) <400> 38 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 39 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CD3 zeta <400> 39 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 40 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CD3 zeta <400> 40 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 41 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CD3 zeta <400> 41 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 42 <211> 335 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tEGFR <400> 42 Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile 20 25 30 Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe 35 40 45 Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr 50 55 60 Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn 65 70 75 80 Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg 85 90 95 Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile 100 105 110 Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val 115 120 125 Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp 130 135 140 Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn 145 150 155 160 Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu 165 170 175 Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser 180 185 190 Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu 195 200 205 Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln 210 215 220 Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly 225 230 235 240 Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro 245 250 255 His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr 260 265 270 Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His 275 280 285 Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro 290 295 300 Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala 305 310 315 320 Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met 325 330 335 <210> 43 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A <400> 43 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 44 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A <400> 44 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 45 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A <400> 45 Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 46 <211> 20 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sequence <400> 51 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro 20 <210> 52 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 alpha signal peptide <400> 52 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala

Claims (110)

  1. T 세포의 형질도입 방법으로서, 상기 방법은 재조합 핵산을 포함하는 바이러스 벡터 입자와 복수의 T 세포를 포함하는 인풋 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하되, 상기 복수의 T 세포는 대상체로부터 수득된 것이고, 여기서:
    상기 인큐베이션은 대상체로부터 샘플을 수득한 후 24 시간 이내에 개시되고; 및/또는
    인큐베이션 전에, T 세포는 대상체로부터 샘플을 수득한 후 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 또는 24시간 초과의 기간 동안, 약 15℃, 약 18℃, 약 22℃ 또는 약 25℃ 보다 높은 온도로 처리되지 않은 것이며; 및/또는
    인큐베이션 전에, T 세포는 대상체로부터 샘플을 수득한 후 15분, 30분, 1시간 또는 2시간 초과의 기간 동안 약 37℃±2.0℃를 초과하는 온도로 처리되지 않은 것인, T 세포의 형질도입 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 인큐베이션은 대상체로부터 샘플을 수득한 후 약 1시간, 3시간, 6시간, 12시간 또는 18시간 이내에 개시되는 것인 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 인큐베이션 전에, 상기 방법은 세포 활성화를 촉진하는 조건 하에서 T 세포를 자극하는 것을 포함하지 않는 것인 방법.
  4. 청구항 1-3 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 상기 인큐베이션 전에, 인풋 조성물은, 약 37℃±2.0℃를 초과하는 온도에서의 인큐베이션, 및/또는 T 세포, CD4+ T 세포, 및/또는 CD8+ T 세포를 활성화시킬 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에서의 인큐베이션, TCR 복합체를 통해 신호를 유도할 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에서의 인큐베이션 및/또는 T 세포, CD4+ T 세포, 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에서의 인큐베이션; CD3-결합 분자; CD28-결합 분자; 재조합 IL-2; 재조합 IL-15; 및 재조합 IL-7을 포함하는 생체외 자극으로 처리되지 않은 것인 방법.
  5. 청구항 1-4 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 상기 인큐베이션 전에, T 세포의 5%, 10%, 20%, 30%, 또는 40% 이하는 활성화된 세포들이고, HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L 및 4-1BB로 이루어진 군으로부터 선택된 표면 마커를 발현하며; IL-2, IFN-감마, TNF-알파로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포내 발현을 포함하고, 세포 주기의 G1 또는 그 후의 단계에 있거나 및/또는 증식가능한 것인 방법.
  6. T 세포의 형질도입 방법으로서, 상기 방법은 재조합 핵산을 포함하는 바이러스 벡터 입자와 T 세포를 포함하는 인풋 조성물을 인큐베이션시키는 것을 포함하되, 상기 T 세포는 대상체로부터의 샘플로부터 수득된 것이고, 여기서, 상기 인큐베이션 전에 T 세포 또는 인풋 조성물은, 약 37℃±2.0℃를 초과하는 온도에서의 인큐베이션, 및/또는 T 세포, CD4+ T 세포, 및/또는 CD8+ T 세포를 활성화시킬 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에서의 인큐베이션, TCR 복합체를 통해 신호를 유도할 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에서의 인큐베이션 및/또는 T 세포, CD4+ T 세포, 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에서의 인큐베이션; CD3-결합 분자; CD28-결합 분자; 재조합 IL-2; 재조합 IL-15; 및 재조합 IL-7을 포함하는 생체외 자극으로 처리되지 않은 것인 방법.
  7. 청구항 4 또는 청구항 6에 있어서, 하나 이상의 제제는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체를 포함하는 것인 방법.
  8. T 세포의 형질도입 방법으로서, 상기 방법은 재조합 핵산을 포함하는 바이러스 벡터 입자와 T 세포를 포함하는 인풋 조성물을 인큐베이션시키는 것을 포함하되, 상기 T 세포는 대상체로부터의 샘플로부터 수득된 것이고, 여기서, 인큐베이션 전에, T 세포의 5%, 10%, 20%, 30%, 또는 40% 이하는 활성화된 세포들이고, HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L 및 4-1BB로 이루어진 군으로부터 선택된 표면 마커를 발현하며; IL-2, IFN-감마, TNF-알파로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포내 발현을 포함하고, 세포 주기의 G1 또는 그 후의 단계에 있는 것인 방법.
  9. 청구항 5 또는 청구항 8에 있어서, 인풋 조성물 내 T 세포의 10% 이하는 인큐베이션 직전에 HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L, 및 4-1BB로 이루어진 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커를 포함하는 것인 방법.
  10. 청구항 1-9 중 어느 하나의 청구항에 있어서에 있어서, 상기 인큐베이션 전에, T 세포의 5%, 10%, 20%, 30%, 또는 40% 초과는 저밀도 지질 수용체 (LDL-R)를 발현하는 것인 방법.
  11. 청구항 1-9 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 대상체는 인간인 것인 방법.
  12. 청구항 1-8 중 어느 하나의 청구항에 있어서, T 세포는 인큐베이션 전에 2℃ 내지 8℃의 온도로 48 시간을 초과하는 기간 동안 유지된 바 없고 및/또는 유지되지 않는 것인 방법.
  13. 청구항 1-12 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 샘플은 혈액 샘플인 것인 방법.
  14. 청구항 1-12 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 샘플은 백혈구성분채집 샘플인 방법.
  15. 청구항 1-14 중 어느 하나의 청구항에 있어서, T 세포는 비분획화 T 세포이고, 농축(enriched) 또는 단리된 CD3+ T 세포이며, 농축 또는 단리된 CD4+ T 세포이거나, 농축 또는 단리된 CD8+ T 세포인 것인 방법.
  16. 청구항 1-15 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 대상체로부터의 샘플로부터 선택되거나 또는 농축된 것인 방법.
  17. 청구항 1-16 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 인큐베이션 전에, 대상체로부터 샘플을 수득하고, 선택적으로 농축된 조성물이거나 및/또는 인풋 조성물을 생산하는 것인 샘플로부터 선택적으로 T 세포를 선택 또는 농축하는 단계를 더 포함하는 방법.
  18. 청구항 1-17 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 인풋 조성물 내 T 세포의 백분율은 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% T 세포인 것인 방법.
  19. 청구항 3-18 중 어느 하나의 청구항에 있어서, T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ 세포들을 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 3-18 중 어느 하나의 청구항에 있어서, T 세포는 CD4+ 및 CD8+ 세포들을 포함하는 것인 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, CD4+ 세포 대 CD8+ 세포의 비는 약 1:1, 1:2, 2:1, 1:3 또는 3:1인 것인 방법.
  22. 청구항 1-21 중 어느 하나의 청구항에 있어서:
    샘플은 혈청 또는 혈장을 적어도 또는 적어도 약 10% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 15% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 20% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 25% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 30% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 33% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 35% (v/v), 또는 적어도 또는 적어도 약 40% (v/v)의 농도로 포함하고; 및/또는
    인큐베이션 전에, 샘플은 적어도 또는 적어도 약 10% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 15% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 20% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 25% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 30% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 33% (v/v), 적어도 또는 적어도 약 35% (v/v), 또는 적어도 또는 적어도 약 40% (v/v)의 농도의 혈청 또는 혈장과 생체외 접촉된 것인 방법.
  23. 청구항 1-22 중 어느 하나의 청구항에 있어서:
    샘플은 혈청 또는 혈장을 적어도 또는 적어도 약 30% (v/v)의 농도로 함유하고; 및/또는
    인큐베이션 전에, 샘플은 적어도 또는 적어도 약 30% (v/v) 농도의 혈청 또는 혈장과 생체외 접촉된 것인 방법.
  24. 청구항 22 또는 청구항 23에 있어서, 혈청 또는 혈장은 인간 유래인 것인 방법.
  25. 청구항 22-24 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 혈청 또는 혈장은 대상체에 대새 자가(autologous)인 것인 방법.
  26. 청구항 1-22 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 샘플은 항응집제를 포함하는 것인 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 항응집제는 시트레이트 이온을 포함하지 않는 것인 방법.
  28. 청구항 1-27 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 인큐베이션 전에, 상기 방법은 동결보존제의 존재 하에, T 세포를 선택적으로 샘플 또는 농축된 조성물에서 동결건조시키는 것을 포함하여, 동결보존된 조성물을 생산하는 것인 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 인큐베이션 전에, 동결보존제를 감소 또는 제거하거나 및/또는 인풋 조성물을 생성하는 조건 하에서 동결보존된 조성물을 세척하는 것인 방법.
  30. 청구항 1-29 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 인풋 조성물은 N-아세틸시스테인 (NAC); 혈청, 선택적으로 인간 혈청; 재조합 인터류킨-2 (IL-2), 재조합 인터류킨-15 (IL-15), 및/또는 재조합 인터류킨-7 (IL-7)을 포함하는 것인 방법.
  31. 청구항 1-30 중 어느 하나의 청구항에 있어서:
    인풋 조성물은 N-아세틸시스테인을 약 0.4 mg/mL 내지 4 mg/mL, 0.8 mg/mL 내지 3.6 mg/mL 또는 1.6 mg/mL 내지 2.4 mg/mL의 농도로 포함하거나; 또는
    인풋 조성물은 N-아세틸시스테인을 적어도 또는 적어도 약 또는 약 0.4 mg/mL, 0.8 mg/mL, 1.2 mg/mL, 1.6 mg/mL, 2.0 mg/mL, 2.4 mg/mL, 2.8 mg/mL, 3.2 mg/mL, 3.6 mg/mL 또는 4.0 mg/mL의 농도로 포함하는 것인 방법.
  32. 청구항 1-31 중 어느 하나의 청구항에 있어서:
    인풋 조성물은 혈청, 선택적으로 인간 혈청을 약 0.5% 내지 25% (v/v), 1.0% 내지 10% (v/v) 또는 2.5% 내지 5.0% (v/v)의 농도로 포함하거나; 또는
    인풋 조성물은 혈청, 선택적으로 인간 혈청을 적어도 또는 적어도 약 또는 약 0.5%, 1.%, 2.5%, 5% (v/v) 또는 10%의 농도로 포함하는 것인 방법.
  33. 청구항 1-32 중 어느 하나의 청구항에 있어서:
    인풋 조성물은 재조합 IL-2, 선택적으로 재조합 인간 IL-2를, 약 10 IU/mL 내지 500 IU/mL, 50 IU/mL 내지 250 IU/mL 또는 100 IU/mL 내지 200 IU/mL의 농도; 또는 적어도 또는 적어도 약 10 IU/mL, 50 IU/mL, 100 IU/mL, 200 IU/mL, 300 IU/mL, 400 IU/mL 또는 500 IU/mL의 농도로 포함하거나; 및/또는
    인풋 조성물은 재조합 IL-15, 선택적으로 재조합 인간 IL-15를, 약 1 IU/mL 내지 100 IU/mL, 2 IU/mL 내지 50 IU/mL 또는 5 IU/mL 내지 10 IU/mL의 농도; 또는 적어도 또는 적어도 약 1 IU/mL, 2 IU/mL, 5 IU/mL, 10 IU/mL, 25 IU/mL 또는 50 IU/mL의 농도로 포함하거나; 및/또는
    인풋 조성물은 재조합 IL-7, 선택적으로 재조합 인간 IL-7을 약 50 IU/mL 내지 1500 IU/mL, 100 IU/mL 내지 1000 IU/mL 내지 200 IU/mL 내지 600 IU/mL의 농도; 또는 적어도 또는 적어도 약 50 IU/mL, 100 IU/mL, 200 IU/mL, 300 IU/mL, 400 IU/mL, 500 IU/mL, 600 IU/mL, 700 IU/mL, 800 IU/mL, 900 IU/mL 또는 1000 IU/mL의 농도로 포함하는 것인 방법.
  34. 청구항 1-33 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 인큐베이션은 바이러스 벡터 입자를 인풋 조성물로 회전접종(spinoculating)하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  35. 청구항 34에 있어서, 회전접종은 원심 챔버의 내부 공동에서, 바이러스 벡터 입자와 및 인풋 조성물을 회전시키는 것을 포함하며, 상기 회전은 공동 측벽의 내부 표면에서:
    약 500 g 내지 2500 g, 500 g 내지 2000 g, 500 g 내지 1600 g, 500 g 내지 1000 g, 600 g 내지 1600 g, 600 g 내지 1000 g, 1000 g 내지 2000 g 또는 1000 g 내지 1600 g의 상대 원심력; 및/또는
    적어도 또는 적어도 약 600 g, 800 g, 1000 g, 1200 g, 1600 g, 또는 2000 g의 상대 원심력으로 수행되는 것인 방법.
  36. 청구항 34 또는 청구항 35에 있어서, 회전접종은:
    약 5분 이상, 또는 약 10분 이상, 또는 약 15분 이상, 또는 약 20분 이상, 또는 약 30분 이상, 또는 약 45분 이상, 또는 약 60분 이상, 또는 약 90분 이상 또는 약 120분 이상 수행되거나; 또는
    약 5분 내지 60분, 10분 내지 60분, 15분 내지 60분, 15분 내지 45분, 30분 내지 60분 또는 45분 내지 60분 동안 수행되는 것인 방법.
  37. 청구항 1-36 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 인풋 조성물 및/또는 바이러스 벡터 입자를 형질도입 아쥬반트(adjuvant)와 접촉시키는 것을 더 포함하는 방법.
  38. 청구항 37에 있어서, 접촉은 바이러스 벡터 입자를 인풋 조성물로 회전접종시키기 전, 회전접종과 동시 또는 회전접종 후에 수행되는 것인 방법.
  39. 청구항 1-38 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 인큐베이션의 적어도 일부는 약 37℃±2℃에서 수행되는 것인 방법.
  40. 청구항 34-39 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 인큐베이션의 적어도 일부는 회전접종 후에 수행되는 것인 방법.
  41. 청구항 39 또는 청구항 40에 있어서, 인큐베이션의 적어도 일부는 약 2시간, 4시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 48시간, 60시간 또는 72시간 이하 동안 수행되는 것인 방법.
  42. 청구항 39-41 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 인큐베이션의 적어도 일부는 약 24시간 동안 수행되는 것인 방법.
  43. 청구항 1-42 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 인큐베이션의 총 기간은 12시간 이하, 24시간 이하, 36시간 이하, 48시간 이하 또는 72시간 이하인 것인 방법.
  44. 청구항 1-43 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 바이러스 벡터 입자는 렌티바이러스 벡터 입자인 것인 방법.
  45. 청구항 44에 있어서, 렌티바이러스 벡터 입자는 HIV-1로부터 유래된 것인 방법.
  46. 청구항 1-45 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 바이러스 벡터 입자는 바이러스 엔벨롭 당단백질로 슈도타입화되는 것인 방법.
  47. 청구항 46 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 바이러스 엔벨롭 당단백질은 VSV-G인 것인 방법.
  48. 청구항 1-47 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 바이러스 벡터 입자는 SAMHD1-억제 활성을 나타내는 렌티바이러스 단백질을 포함하고, 상기 단백질은 상기 바이러스 입자 내에 패키징되는 것인 방법.
  49. 청구항 48에 있어서, SAMHD1-억제 단백질은 야생형 Vpx 단백질, 야생형 Vpr 단백질이거나, 또는 SAMHD1-억제 활성을 나타내는 야생형 Vpx 또는 Vpr 단백질의 변이체 또는 일부인 것인 방법.
  50. 청구항 48 또는 청구항 49에 있어서, SAMHD1-억제 단백질은 레트로바이러스 벡터 입자에 대해 이종(heterologous)인 것인 방법.
  51. 청구항 48-50 중 어느 하나의 청구항에 있어서, SAMHD1-억제 단백질은 야생형 Vpx 단백질이거나 또는 SAMHD1-억제 활성을 나타내는 야생형 Vpx 단백질의 변이체 또는 일부인 것인 방법.
  52. 청구항 1-51 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 바이러스 벡터 입자는 약 20.0 미만 또는 약 10.0의 감염 다중도로 인큐베이션되는 것인 방법.
  53. 청구항 1-52 중 어느 하나의 청구항에 있어서:
    바이러스 벡터 입자는 약 1.0 IU/세포내지 10 IU/세포 또는 2.0 U/세포내지 5.0 IU/세포의 감염 다중도로 인큐베이션되거나; 또는
    바이러스 벡터 입자는 적어도 또는 적어도 약 1.6 IU/세포, 1.8 IU/세포, 2.0 IU/세포, 2.4 IU/세포, 2.8 IU/세포, 3.2 IU/세포 또는 3.6 IU/세포, 4.0 IU/세포, 5.0 IU/세포, 6.0 IU/세포, 7.0 IU/세포, 8.0 IU/세포, 9.0 IU/세포 또는 10.0 IU/세포의 감염 다중도로 인큐베이션되는 것인 방법.
  54. 청구항 1-53 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 인풋 조성물은 적어도 또는 약 적어도 또는 약 50 x 106 세포들, 100 x 106 세포들, 또는 200 x 106 세포들을 포함하는 것인 방법.
  55. 청구항 1-54 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 재조합 핵산은 항원 수용체를 인코딩하는 것인 방법.
  56. 청구항 55에 있어서, 항원 수용체는트랜스제닉 T 세포 수용체 (TCR)인 것인 방법.
  57. 청구항 55 또는 청구항 56에 있어서, 항원 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 방법.
  58. 청구항 57에 있어서, 키메라 항원 수용체 (CAR)는 ITAM을 함유하는 세포내 신호전달 도메인 및 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인을 포함하는 것인 방법.
  59. 청구항 58에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타 (CD3ζ) 사슬의 세포내 도메인을 포함하는 것인 방법.
  60. 청구항 58 또는 청구항 59에 있어서, 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인을 연결하는 막관통 도메인을 더 포함하는 것인 방법.
  61. 청구항 60에 있어서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 포함하는 것인 방법.
  62. 청구항 58-61 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 공동자극 분자의 세포내 신호전달 도메인을 더 포함하는 것인 방법.
  63. 청구항 62에 있어서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 및 41BB로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  64. 청구항 55-63 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 항원 수용체는 질환 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합하거나 또는 유니버설 태그에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  65. 청구항 64에 있어서, 질환 또는 병태는 암, 및 자가면역 질환 또는 장애, 또는 감염성 질환인 것인 방법.
  66. 청구항 1-65 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 상기 방법은 재조합 핵산으로 형질도입된 T 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 생산하는 것인 방법.
  67. 청구항 66에 있어서, 아웃풋 조성물 내 T 세포의 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 또는 적어도 80%는 재조합 핵산으로 형질도입되는 것인 방법.
  68. 청구항 66 또는 청구항 67에 있어서, 상기 방법에 의해 생산된 형질도입된 T 세포를 아웃풋 조성물로부터 회수 또는 단리하는 것을 더 포함하는 방법.
  69. 청구항 66 또는 청구항 68에 있어서, 아웃풋 조성물의 세포 또는 상기 방법에 의해 형질도입된 세포들을 활성화 또는 확장시키는 것을 더 포함하는 방법.
  70. 청구항 69에 있어서, 활성화 및/또는 확장은 생체외에서 수행되는 것인 방법.
  71. 청구항 69 또는 청구항 70에 있어서, 인큐베이션 후에, 아웃풋 조성물 내의 세포들은, T 세포를 활성화시킬 수 있고, TCR 복합체를 통해 신호를 유도할 수 있으며 및/또는 T 세포의 증식을 유도할 수 있는 하나 이상의 자극 제제의 존재 하에 추가로 인큐베이션되는 것인 방법.
  72. 청구항 71에 있어서, 하나 이상의 자극 제제는 CD3-결합 분자; CD28-결합 분자; 재조합 IL-2; 재조합 IL-15; 및 재조합 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  73. 청구항 71 또는 청구항 72에 있어서, 하나 이상의 자극 제제는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체를 포함하는 것인 방법.
  74. 청구항 69에 있어서, 활성화 및/또는 확장은 생체내에서 수행되는 것인 방법.
  75. 청구항 69 또는 청구항 74에 있어서, 활성화 및/또는 확장은 항원 수용체에 특이적으로 결합된 항원의 존재 하에 일어나거나 및/또는 도입유전자-특이적인 것인 방법.
  76. 청구항 72 또는 청구항 75에 있어서, 인큐베이선 후에, 아웃풋 조성물 내의 세포들은 선택적으로 CD3-결합 분자; CD28-결합 분자; 재조합 IL-2; 재조합 IL-15; 및 재조합 IL-7로 이루어진 하나 이상의 자극 제제의 존재 하에 추가로 생체외 인큐베이션되지 않거나, 및/또는 아웃풋 조성물 내의 세포들은 30℃를 초과하는 온도에서 24 시간을 초과하여 추가 인큐베이션되지 않는 것인 방법.
  77. 청구항 1-76 중 어느 하나의 청구항의 방법에 의해 제조된 유전자 조작된 T 세포.
  78. 청구항 77의 유전자 조작된 T 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  79. 청구항 78의 조성물을 질환 또는 병태를 갖는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 치료 방법
  80. 청구항 79에 있어서, 조성물은 대상체로부터 샘플을 수득한 후 5일 이내에 대상체에 투여되는 것인 방법.
  81. 청구항 80에 있어서, 조성물은 대상체로부터 샘플을 수득한 후 1일, 2일, 3일 또는 4일 이내에 대상체에 투여되는 것인 방법.
  82. 입양 세포 치료를 위한 방법으로서:
    (a) 질환 또는 병태를 갖는 대상체로부터 수득된 샘플로부터 T 세포를 농축 또는 분리하는 단계;
    (b) T 세포를 포함하는 인풋 조성물을, 청구항 1-71 중 어느 하나의 청구항의 방법에 의해, 바이러스 벡터 입자로 형질도입시킴으로써, 형질도입된 세포들을 포함하는 아웃풋 조성물을 생성하되, 여기서 상기 바이러스 벡터 입자는 질환 또는 장애와 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 항원 수용체를 인코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 것인 단계;
    (c) 질환 또는 병태를 치료하기 위해 형질도입된 세포들을 포함하는 아웃풋 조성물을 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 아웃풋 조성물은, 대상체로부터 샘플이 수득된 지 9일 이내에 대상체에 투여되는 것인 단계
    를 포함하는, 입양 세포 치료를 위한 방법.
  83. 입양 세포 치료를 위한 방법으로서, 재조합 핵산으로 형질도입된 T 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 질환 또는 병태를 치료하기 위해 대상체에 투여하는 것을 포함하되, 여기서 상기 아웃풋 조성물은 청구항 1-71 중 어느 하나의 청구항의 방법에 의해 제조된 것인, 입양 세포 치료를 위한 방법.
  84. 청구항 82 또는 청구항 83에 있어서, 아웃풋 조성물은 대상체로부터 샘플 수득 후 1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일 이내에 대상체에 투여되는 것인 방법.
  85. 청구항 82-84 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 조성물 투여 전에, 아웃풋 조성물의 세포 또는 형질도입된 세포를 약학적으로 허용가능한 완충액 중에 제형화시키는 방법.
  86. 청구항 82-85 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 형질도입된 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 투여하기 전에, 세포들을 형질도입 후, 최대 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일 또는 9일 동안 30℃를 초과하는 온도에서 생체외 배양하는 방법.
  87. 청구항 82-86 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 형질도입 후, 형질도입된 세포를 포함하는 세포 또는 아웃풋 조성물을 T 세포를 활성화시킬 수 있고, TCR 복합체를 통해 신호를 유도할 수 있으며 및/또는 T 세포의 증식을 유도할 수 있는 하나 이상의 자극 제제의 존재 하에 배양시킴으로써, 형질도입된 세포를 포함*는 조성물을 생산하는 방법.
  88. 청구항 82-85 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 형질도입된 세포를 투여하기 전에, 형질도입된 세포를 포함하는 세포 또는 아웃풋 조성물은 하나 이상의 자극 제제의 존재 하에 추가로 생체외 인큐베이션되지 않거나 및/또는 30℃보다 높은 온도에서 24 시간을 초과하여 추가 인큐베이션되지 않는 것인 방법.
  89. 청구항 87 또는 청구항 88에 있어서, 하나 이상의 자극 제제는 CD3-결합 분자; CD28-결합 분자; 재조합 IL-2; 재조합 IL-15; 및 재조합 IL-7, 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 항원, 및 항원 수용체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 포함하는 백신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  90. 청구항 89에 있어서, 하나 이상의 자극 제제는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체를 포함하는 것인 방법.
  91. 청구항 82-90 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 아웃풋 조성물의 세포 또는 형질도입된 세포는 준-최적 투여량(sub-optimal dose)로 투여되는 것인 방법.
  92. 청구항 82-91 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 생체내에서 형질도입된 T 세포의 자극 및/또는 확장을 유도 또는 증강시키기 위한 하나 이상의 제제를 대상체에 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
  93. 청구항 92에 있어서, 하나 이상의 제제는 도입유전자-특이적이거나 및/또는 선택적으로 항원 수용체이거나 또는 이를 포함하는, 발현된 도입유전자를 통해 세포를 자극 또는 활성화시키는 것인 방법.
  94. 청구항 92 또는 청구항 93에 있어서, 하나 이상의 제제는 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 항원, 항원 수용체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 포함하는 백신 또는 항원 수용체의 이량화를 화학적으로 유도할 수 있는 제제로부터 선택되는 것인 방법.
  95. 청구항 92에 있어서, 하나 이상의 제제는 면역조절 제제; 면역 체크포인트 억제제; 세포외 아데노신 또는 아데노신 수용체, 선택적으로 A2aR 수용체의 억제제; 키누레닌 경로 조절제, 및 신호전달 경로의 조절제, 예컨대, 키나아제 억제제인 것인 방법.
  96. 표적 항원에 특이적으로 결합하는 트랜스제닉 TCR 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)을 발현하도록 유전자 조작된 일차 인간 T 세포의 집단을 포함하는 조성물로서:
    상기 집단은 복수의 휴지(resting) T 세포를 포함하고; 및
    상기 복수의 휴지 T 세포는 조성물 내 유전자 조작된 세포를 적어도 7.5% 포함하는 것인 조성물.
  97. 청구항 96에 있어서, 유전자 조작된 휴지 T 세포는 조성물 내 유전자 조작된 세포를 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 포함하는 것인 조성물.
  98. 청구항 96 또는 청구항 97에 있어서, 휴지 T 세포는 HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L (CD154) 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 음성이고; IL-2, IFN-감마 및 TNF-알파로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포내 발현을 결여하며; 세포 주기의 G0 또는 G0G1a 단계에 있거나; 및/또는 활성 SAMHD1을 포함하는 것인 조성물.
  99. 청구항 98에 있어서, 휴지 T 세포는 CD25 및 CD69에 대해 표면 음성 (CD25-/CD69-)인 것인 조성물.
  100. 청구항 96-99 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 휴지 T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 조성물.
  101. 청구항 96-100 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 표적 항원은 질환 또는 장애와 관련된 것인 조성물.
  102. 청구항 100에 있어서, 질환 또는 장애는 감염성 질환 또는 병태, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 암인 것인 조성물.
  103. 청구항 96-102 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 표적 항원은 B 세포 성숙 항원 (BCMA), 탄산 무수화 효소 9 (CAIX), tEGFR, Her2/neu (수용체 티로신 키나아제 erbB2), CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 이량체 EGFR vIII, 엽산 결합 단백질 (FBP), FCRL5, FCRH5, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, 키나아제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, Lewis Y, L1-세포 부착 분자 (L1-CAM), 흑색종-관련 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 흑색종 우선 발현 항원 (PRAME), 서바이빈, TAG72, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2, PSCA, 엽산 수용체-알파, CD44v6, CD44v7/8, avb6 인테그린, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, 태아 AchR, NKG2D 리간드, CD44v6, 이중 항원, 고환암(cancer-testes) 항원, 메소텔린, 쥐의 CMV, 뮤신 1 (MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아종양 항원, G 단백질 결합 수용체 5D (GPCR5D), ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원 (CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, c-Met, GD-2, O-아세틸화된 GD2 (OGD2), CE7, 윌름 종양 1 (WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, CCL-1, CD138, 병원체-특이적 항원 및 유니버설 태그에 결합된 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  104. 청구항 96-103 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 일차 인간 T 세포는 ITAM을 포함하는 세포내 신호전달 도메인 및 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인을 포함하는, CAR을 발현하도록 유전자 조작되는 것인 조성물.
  105. 청구항 104에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타 (CD3ζ) 사슬의 세포내 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  106. 청구항 104 또는 청구항 105에 있어서, CAR은 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인을 연결하는 막관통 도메인을 더 포함하는 것인 조성물.
  107. 청구항 106에 있어서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 포함하는 것인 조성물.
  108. 청구항 104-107 중 어느 하나의 청구항에 있어서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 공동자극 분자의 세포내 신호전달 도메인을 더 포함하는 것인 조성물.
  109. 청구항 108에 있어서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 및 41BB로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  110. 청구항 96-108 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것인 조성물.
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