KR102523934B1 - Bcma 키메릭 항원 수용체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 B 세포 관련 병증의 입양 T 세포 요법을 위한 개선된 조성물을 제공한다.

Description

BCMA 키메릭 항원 수용체 {BCMA CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS}
관련 출원의 상호참조
본 출원은 35 U.S.C.§119(e) 하에 2014년 7월 24일자로 출원된 미국 가 출원 제 62/028,664 호, 2014년 8월 29일자로 출원된 미국 가 출원 제 62/044,103 호, 및 2015년 4월 24일자로 출원된 미국 가 출원 제 62/152,575 호의 이점을 청구하며, 이들은 각각 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
서열목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열 목록이 종이 사본 대신에 텍스트 포맷으로 제공되며, 본 명세서에 참고로 인용된다. 상기 서열 목록을 함유하는 텍스트 포맷의 명칭은 BLBD_037_03WO_ST25.txt이다. 상기 텍스트 파일은 124 KB이며, 2015년 7월 23일자로 생성되었고, 본 명세서의 출원과 동시에, EFS-Web을 통해 전자 제출 중에 있다.
기술 분야
본 발명은 B 세포 관련 병증의 치료를 위한 개선된 조성물 및 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 인간화된 항-BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 개선된 키메릭 항원 수용체(CAR), 상기 CAR을 발현하도록 유전자 변형된(genetically modified) 면역 효과기 세포, 및 B 세포 관련 병증을 유효하게 치료하기 위한 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.
다수의 중요 질병들이 B 림프구, 즉 B 세포를 수반한다. 이상 B 세포 생리학은 또한, 비제한적으로 전신 홍반성 루프스(SLE)를 포함한 자가면역 질병이 발병되게 할 수 있다. B 세포의 악성 변환은, 비제한적으로 림프종, 예를 들어 다발성 골수종 및 비-호지킨 림프종을 포함한 암에 이르게 한다.
비-호지킨 림프종(NHL) 및 다발성 골수종(MM)을 포함한 B 세포암(B cell malignancy)을 갖는 환자의 대다수는 암 사망자수의 중요 기여인자이다. 다양한 형태의 치료에 대한 B 세포암의 반응은 혼합되어 있다. 화학요법 및 방사선요법을 포함한, B 세포암의 전통적인 치료 방법들은 독성 부작용으로 인해 제한된 유용성을 갖는다. 항-CD19, 항-CD20, 항-CD22, 항-CD23, 항-CD52, 항-CD80, 및 항-HLA-DR 치료항체들에 의한 면역요법은 부분적으로, 불량한 약동학적 프로파일, 혈청 프로테아제 및 사구체에서의 여과에 의한 항체의 빠른 제거, 및 종양 부위로의 제한된 침투 및 암세포상의 표적 항원의 발현 수준으로 인해, 제한된 성공을 제공하였다. 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하는 유전자 변형 세포를 사용하고자 하는 시도들도 또한, CAR T 세포의 불충분한 생체내 확대, 주입 후 상기 세포의 빠른 소실, 및 실망스러운 임상 활성으로 인해 제한된 성공으로 만족되었다.
본 발명은 일반적으로 T 세포 요법의 생성을 위한 개선된 벡터 및 그의 사용 방법을 제공한다. 보다 특히, 본 발명은 인간화된 항-BCMA CAR 분자, 및 B 세포 관련 병증의 치료, 예방 또는 개선에서 그의 용도를 제공한다.
임의의 특정 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 발명자들은 몇몇 인간화된 항-BCMA CAR이, 인간화된 항-BCMA CAR을 T 세포 요법에 사용하기에 부적합하게 하는 특성인 항원 독립적인("지속적인(tonic)") 사이토킨 방출을 유도함을 발견하였다. 놀랍게도, 발명자들은 몇몇 인간화된 항-BCMA CAR T 세포에 의한 지속적인 사이토킨 방출이, 적어도 상기 인간화된 항-BCMA CAR의 막관통 도메인의 하나 이상의 특성을 변경시킴으로써 항원 의존성으로 만들 수 있음을 발견하였다.
다양한 실시태양에서, 인간 BCMA 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 인간화된 항-BCMA(B 세포 성숙화 항원) 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 세포외 도메인; 막관통 도메인, 하나 이상의 세포내 공-자극 신호전달 도메인, 및 주요 신호전달 도메인(primary signaling domain)을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 제공한다.
특정한 실시태양에서, 상기 인간 BCMA 폴리펩티드에 결합하는 인간화된 항-BCMA 항체 또는 항원 결합 단편은 카멜(Camel) Ig, Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단쇄 Fv 항체("scFv"), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 디설파이드 안정화된 Fv 단백질("dsFv"), 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
추가적인 실시태양에서, 상기 인간 BCMA 폴리펩티드에 결합하는 인간화된 항-BCMA 항체 또는 항원 결합 단편은 scFv이다.
일부 실시태양에서, 상기 인간화된 항-BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 CDR을 포함한다.
특정한 실시태양에서, 상기 인간화된 항-BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 CDR을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 상기 인간화된 항-BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 7 내지 9 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열을 포함한다.
특정한 실시태양에서, 상기 가변 경쇄 서열은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CDR 서열을 포함한다.
다른 실시태양에서, 상기 인간화된 항-BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 10 내지 14 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열을 포함한다.
추가적인 실시태양에서, 상기 가변 중쇄 서열은 서열번호 4 내지 6에 제시된 CDR 서열을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 상기 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154, 및 PD1로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 폴리펩티드로부터의 것이다.
일부 실시태양에서, 상기 막관통 도메인은 CD8α; CD4, CD45, PD1, 및 CD152로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 폴리펩티드로부터의 것이다.
일부 실시태양에서, 상기 막관통 도메인은 PD1로부터의 것이다.
일부 실시태양에서, 상기 막관통 도메인은 CD152로부터의 것이다.
몇몇 실시태양에서, 상기 막관통 도메인은 CD8α로부터의 것이다.
특정한 실시태양에서, 상기 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM, 및 ZAP70으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 공-자극 분자로부터의 것이다.
특정한 실시태양에서, 상기 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CD28, CD134 및 CD137로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 공-자극 분자로부터의 것이다.
추가적인 실시태양에서, 상기 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CD28, CD134 및 CD137로 이루어진 그룹 중에서 선택된 공-자극 분자로부터의 것이다.
추가적인 실시태양에서, 상기 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CD28로부터의 것이다.
특정한 실시태양에서, 상기 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CD134로부터의 것이다.
다른 실시태양에서, 상기 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CD137로부터의 것이다.
몇몇 실시태양에서, CAR은 힌지 영역 폴리펩티드를 포함한다.
추가의 실시태양에서, 상기 힌지 영역은 CD8α, PD1 및 CD152로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 폴리펩티드로부터의 것이다.
추가의 실시태양에서, 상기 힌지 영역 폴리펩티드는 PD1의 힌지 영역을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 상기 힌지 영역 폴리펩티드는 CD152의 힌지 영역을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 상기 힌지 영역 폴리펩티드는 CD8α의 힌지 영역을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 상기 CAR은 PD1로부터의 힌지 영역 폴리펩티드 및 막관통 도메인을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 상기 CAR은 CD152로부터의 힌지 영역 폴리펩티드 및 막관통 도메인을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 상기 CAR은 CD8α로부터의 힌지 영역 폴리펩티드 및 막관통 도메인을 포함한다.
일부 실시태양에서, CAR은 스페이서 영역(spacer region)을 포함한다.
추가적인 실시태양에서, 상기 스페이서 영역 폴리펩티드는 IgG1 또는 IgG4의 CH2 및 CH3 영역을 포함한다.
특정한 실시태양에서, CAR은 신호 펩티드를 포함한다.
추가의 실시태양에서, 상기 신호 펩티드는 IgG1 중쇄 신호 폴리펩티드, CD8α 신호 폴리펩티드, 또는 인간 GM-CSF 수용체 알파 신호 펩티드를 포함한다.
하나의 실시태양에서, CAR은 서열번호 15-29, 71 및 73 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, CAR은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 실시태양에서, CAR은 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, CAR은 서열번호 17에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
추가적인 실시태양에서, CAR은 서열번호 18에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 실시태양에서, CAR은 서열번호 19에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 특정한 실시태양에서, CAR은 서열번호 20에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, CAR은 서열번호 21에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, CAR은 서열번호 22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
더욱 또 다른 실시태양에서, CAR은 서열번호 23에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
여전히 더욱 또 다른 실시태양에서, CAR은 서열번호 24에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 특정한 실시태양에서, CAR은 서열번호 25에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 어떤 실시태양에서, CAR은 서열번호 26에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 추가적인 실시태양에서, CAR은 서열번호 27에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 추가의 실시태양에서, CAR은 서열번호 28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, CAR은 서열번호 29에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, CAR은 서열번호 71에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, CAR은 서열번호 73에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다양한 특정 실시태양에서, CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기에서 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 30-44, 70 및 72 중 어느 하나에 제시된다.
다양한 몇몇 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되거나 또는 서열번호 30-44, 70 및 72 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
몇몇 실시태양에서, 상기 벡터는 발현 벡터이다.
추가적인 실시태양에서, 상기 벡터는 에피솜 벡터이다.
특정한 실시태양에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터이다.
추가의 실시태양에서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터이다.
다른 실시태양에서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
추가적인 실시태양에서, 상기 렌티바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1); 인간 면역결핍 바이러스 2(HIV-2), 비스나-메디 바이러스(VMV) 바이러스; 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV); 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역 결핍 바이러스(BIV); 및 유인원(simian) 면역결핍 바이러스(SIV)로 필수적으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
특정한 실시태양에서, 벡터는 좌측(5') 레트로바이러스 LTR, 프사이(ψ) 패키징 신호, 중심 폴리퓨린 트랙/DNA 플랩(cPPT/FLAP), 레트로바이러스 외수송 요소(export element); 본 명세서에서 고려되는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터; 및 우측(3') 레트로바이러스 LTR을 포함한다.
다른 실시태양에서, CAR은 이종 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, CAR은 B형 간염 바이러스 전사후 조절 요소(HPRE) 또는 우드척 전사후 조절 요소(WPRE)를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 상기 5' LTR의 프로모터를 이종 프로모터로 치환시킨다.
추가의 실시태양에서, 상기 이종 프로모터는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 또는 유인원 바이러스 40(SV40) 프로모터이다.
특정한 실시태양에서, 상기 5' LTR 또는 3' LTR은 렌티바이러스 LTR이다.
특정한 실시태양에서, 상기 3' LTR은 하나 이상의 변형을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 3' LTR은 하나 이상의 결실을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 상기 3' LTR은 자기-불활성화(SIN) LTR이다.
일부 실시태양에서, 상기 폴리아데닐화 서열은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 또는 신호 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 서열이다.
추가적인 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 최적화된 코작(Kozak) 서열을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터는 거대세포바이러스 전초기 유전자 프로모터(CMV), 신장 인자 1 알파 프로모터(EF1-α), 포스포글리세레이트 키나제-1 프로모터(PGK), 유비퀴틴-C 프로모터(UBQ-C), 거대세포바이러스 인헨서/치킨 베타-액틴 프로모터(CAG), 폴리오마 인헨서/헤르페스 단순 티미딘 키나제 프로모터(MC1), 베타 액틴 프로모터(β-ACT), 유인원 바이러스 40 프로모터(SV40), 및 골수증식성 육종 바이러스 인헨서, 음성 조절 영역 결실된, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) 프로모터로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
다양한 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 벡터를 포함하는 면역 효과기 세포를 제공한다.
추가의 실시태양에서, 상기 면역 효과기 세포는 T 림프구 및 천연 살해(NK) 세포로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
다양한 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 면역 효과기 세포 및 생리학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
다양한 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR을 포함하는 면역 효과기 세포의 생성 방법을 제공하며, 상기 방법은 면역 효과기 세포에 상기 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 도입시킴을 포함한다.
추가적인 실시태양에서, 상기 방법은 상기 면역 효과기 세포를 자극하고, 상기 세포를 CD3에 결합하는 항체 및 CD28에 결합하는 항체와 접촉시킴으로써 증식을 유도하여; 면역 효과기 세포의 집단을 생성시킴을 추가로 포함한다.
특정한 실시태양에서, 상기 면역 효과기 세포를 상기 벡터의 도입 전에 자극하고 증식하도록 유도한다.
몇몇 실시태양에서, 상기 면역 효과기 세포는 T 림프구를 포함한다.
특정한 실시태양에서, 상기 면역 효과기 세포는 NK 세포를 포함한다.
다양한 실시태양에서, B 세포 관련 병증의 치료가 필요한 피실험자에서 상기 병증을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 피실험자에게 치료 유효량의, 본 명세서에서 고려되는 항-BCMA CAR T 세포, 및 임의로 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물을 투여함을 포함한다.
다른 실시태양에서, 상기 B 세포 관련 병증은 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 불확실한 악성 잠재성의 B 세포 증식, 림프종 모양 육아종증, 이식-후 림프증식성 질환, 면역조절 질환, 류머티스성 관절염, 중증 근무력증, 특발성 혈소판감소성 자반, 항-인지질 증후군, 샤가스병, 그레이브스병, 베게너 육아종증, 결절성 다발동맥염, 쇼그렌 증후군, 심상성 천포창, 피부경화증, 다발성 경화증, 항-인지질 증후군, ANCA 관련 혈관염, 굿파스쳐 증후군, 카와사키병, 자가면역 용혈성 빈혈, 및 빠르게 진행하는 사구체신염, 중쇄병, 원발성 또는 면역세포-관련 아밀로이드증, 또는 미확정 단클론 감마병증이다.
추가의 실시태양에서, 상기 B 세포 관련 병증은 B 세포암이다.
몇몇 실시태양에서, 상기 B 세포암은 다발성 골수종(MM) 또는 비-호지킨 림프종(NHL)이다.
몇몇 실시태양에서, 상기 MM은 현성 다발성 골수종(overt multiple myeloma), 무증후성 다발성 골수종(smoldering multiple myeloma), 형질세포 백혈병, 비-분비성 골수종, IgD 골수종, 골경화성 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 및 골수외 형질세포종으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 실시태양에서, 상기 NHL은 버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병/소 림프구성 림프종(CLL/SLL), 미만성 대 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 면역모구성 대세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종 및 외투세포 림프종으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
특정한 실시태양에서, 상기 B 세포 관련 병증은 형질세포암이다.
추가의 실시태양에서, 상기 B 세포 관련 병증은 자가면역 질병이다.
추가의 실시태양에서, 상기 자가면역 질병은 전신 홍반성 루프스이다.
몇몇 실시태양에서, 상기 B 세포 관련 병증은 류머티스성 관절염이다.
특정한 실시태양에서, 상기 B 세포 관련 병증은 특발성 혈소판감소성 자반, 또는 중증 근무력증, 또는 자가면역 용혈성 빈혈이다.
도 1은 인간화된 항-B 세포 성숙화 항원(항-BCMA) CAR 구조물의 도해를 도시한다.
도 2는 항-BCMA CAR T 세포를, BCMA를 발현하는 K562 세포와 24시간 동안 공-배양한 후 상기 세포로부터 방출되는 IFNγ의 양을 도시한다.
도 3은 BCMA를 발현하는 K564-세포와 4시간 동안 공-배양된 항-BCMA CAR T 세포의 세포 용해 활성을 도시한다.
도 4는 마우스(항-BCMA-02) 또는 인간화된(항-BCMA항-BCMA-10, 항-항-BCMA-11, 항-항-BCMA-31) CAR 서열로 형질도입된 T 세포에서의 항-BCMA CAR 발현을 도시한다.
도 5는 항-BCMA CAR T 세포를, 소량 또는 다량의 BCMA를 발현하는 K562 BCMA 세포, 다발성 골수종 세포주(RPMI-8226, NCI-H929) 또는 BCMA-음성 세포주(K562, HDLM-2)와 24시간 동안 공-배양한 후 상기 세포로부터 방출되는 IFNγ의 양을 도시한다.
도 6은 K564-BCMA 세포와 4시간 동안 공-배양된 항-BCMA CAR을 발현하는 T 세포의 세포 용해 활성을 도시한다.
도 7은 인간 혈청은 함유하지만 BCMA는 결여된 배지에서 배양된 인간화된 항-BCMA-10 CAR 구조물을 발현하는 T 세포에 의한 항원 독립적인 사이토킨 방출을 도시한다.
도 8은 인간 혈청은 함유하지만 BCMA는 결여된 배지에서 배양된 인간화된 항-BCMA-10 CAR 구조물을 발현하는 T 세포에 의한 항원 독립적인 사이토킨 방출을 도시한다.
도 9는 항-BCMA-02, 항-BCMA-10, 항-BCMA-10.2 및 항-BCMA-10.5 CAR 구조물의 도해를 도시한다.
도 10은 항-BCMA-10, 항-BCMA-10.2, 또는 항-BCMA-10.5 CAR T 세포를 BCMA를 발현하는 K562 세포와 24시간 동안 공-배양한 후 상기 세포들로부터 방출되는 IFNγ의 양을 도시한다.
도 11은 마우스 항-BCMA-02 CAR을 발현하거나, 또는 인간화된 항-BCMA-10, 항-BCMA-10.2 또는 항-BCMA-10.5 CAR을 발현하는 T 세포들의 24시간 배양 후 상기 세포들로부터의 지속적인 IFNγ 방출량의 비교를 도시한다.
서열 식별자의 간단한 설명
서열번호 1-3은 본 명세서에서 고려되는 항-BCMA CAR의 예시적인 경쇄 CDR 서열의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 4-6은 본 명세서에서 고려되는 항-BCMA CAR의 예시적인 중쇄 CDR 서열의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 7-9는 본 명세서에서 고려되는 항-BCMA CAR의 예시적인 경쇄 서열의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 10-14는 본 명세서에서 고려되는 항-BCMA CAR의 예시적인 중쇄 서열의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 15-29, 71 및 73은 본 명세서에서 고려되는 예시적인 항-BCMA CAR의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 30-44, 70 및 72는 본 명세서에서 고려되는 예시적인 항-BCMA CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열번호 45는 인간 BCMA의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 46-56은 다양한 링커의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 57-69는 프로테아제 절단 부위 및 자기-절단 폴리펩티드 절단 부위의 아미노산 서열을 제시한다.
A. 개요
본 발명은 일반적으로 B 세포 관련 병증의 치료를 위한 개선된 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "B 세포 관련 병증"란 용어는 부적합한 B 세포 활성을 수반하는 병증 및 B 세포암에 관한 것이다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 유전자 변형 면역 효과기 세포를 사용하는 B 세포 관련 병증의 개선된 입양 세포 요법(adoptive cell therapy)에 관한 것이다. 유전학적 접근법은 암세포의 면역 인식 및 제거를 증대시키는 잠재적인 수단을 제공한다. 한 가지 유망한 전략은 세포독성을 암세포로 재지시하는(redirect) 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 면역 효과기 세포를 유전학적으로 조작하는 것이다. 그러나, B 세포 질환을 치료하기 위한 기존의 입양세포 면역요법들은, 상기 세포가 모든 또는 대부분의 B 세포상에 발현된 항원들을 표적화하기 때문에, 체액 면역(humoral immunity)을 손상시킬 심각한 위험성을 나타낸다. 상응하게, 상기와 같은 요법들은 임상적으로 바람직하지 않으며, 따라서 당해 분야에서는 체액 면역이 부족한 B 세포 관련 병증에 보다 효율적인 요법이 여전히 필요하다.
본 명세서에 개시된 입양세포 요법의 개선된 조성물 및 방법은, 쉽게 확대될 수 있고, 생체내에서 장기간 지속성을 나타낼 수 있으며, B 세포 발현 B 세포 성숙화 항원(BCMA, 또한 CD269 또는 종양 괴사 인자 수용체 상과, 구성원 17; TNFRSF17로서 공지됨)을 표적화함으로써 체액 면역의 손상을 감소시킬 수 있는 유전자 변형된 면역 효과기 세포를 제공한다.
BCMA는 상기 종양 괴사 인자 수용체 상과의 일원이다(예를 들어 문헌[Thompson et al ., J. Exp . Medicine, 192(1): 129-135, 2000], 및 문헌[Mackay et al ., Annu . Rev . Immunol, 21: 231-264, 2003]을 참조하시오). BCMA는 B-세포 활성화 인자(BAFF) 및 증식 유도성 리간드(APRIL)에 결합한다(예를 들어 문헌[Mackay et al ., 2003] 및 문헌[Kalled et al ., Immunological Reviews, 204: 43-54, 2005]을 참조하시오). 비암성 세포들 중에서, BCMA는 대개 형질세포 및 성숙한 B-세포의 부분집합들에서 발현되는 것으로 보고되었다(예를 들어 문헌[Laabi et al ., EMBO J., 77(1 ): 3897-3904, 1992]; 문헌[Laabi et al ., Nucleic Acids Res ., 22(7): 1147-1154, 1994]; 문헌[Kalled et al ., 2005; O'Connor et al ., J. Exp . Medicine, 199(1): 91-97, 2004]; 및 문헌[Ng et al ., J. Immunol., 73(2): 807-817, 2004]을 참조하시오). BCMA 결함 마우스는 건강하며 정상적인 수의 B 세포를 가지나, 장수한 형질세포의 생존은 손상된다(예를 들어 문헌[O'Connor et al., 2004]; 문헌[Xu et al ., Mol . Cell . Biol , 21(12): 4067-4074, 2001]; 및 문헌[Schiemann et al ., Science , 293(5537): 2 111-21 14, 2001]을 참조하시오). BCMA RNA는 보편적으로 다발성 골수종 세포 및 다른 림프종에서 검출되었으며, BCMA 단백질은 여러 연구자들에 의해 다발성 골수종 환자로부터의 형질세포의 표면상에서 검출되었다(예를 들어 문헌[Novak et al ., Blood, 103(2): 689-694, 2004]; 문헌[Neri et al., Clinical Cancer Research, 73(19): 5903-5909, 2007]; 문헌[Bellucci et al., Blood, 105(10): 3945-3950, 2005]; 및 문헌[Moreaux et al ., Blood, 703(8): 3148-3157, 2004]을 참조하시오).
다양한 실시태양에서, 인간화된 항-BCMA 항체 서열을 포함하는 CAR은 마우스 항체 서열을 포함하는 항-BCMA CAR에 비해 매우 효능이 있으며; 확고한 생체내 확대를 겪고; BCMA를 발현하는 인간 B 세포를 인식하며 상기 BCMA 발현 B 세포에 대해 세포독성 활성을 나타낸다. 본 발명자들은 뜻밖에도, 실질적으로 구조 및 부수적인 항원 인식 도메인을 포함한, 상기 마우스 항-인간 BCMA 항체 서열의 변형 부분이 인간화된 항-BCMA CAR T 세포의 기능을 실질적으로 변경시키지 않으며, 상기 인간화된 항-BCMA CAR의 적어도 막관통 도메인을 변경시킴으로써 상기 인간화된 항-BCMA CAR T 세포의 사이토킨 방출 성질을, 참조용 인간화된 항-BCMA CAR을 발현하는 T 세포에 비해 증가시키거나 감소시킬 수 있음을 발견하였다.
특정한 실시태양에서, 인간화된 항-BCMA CAR은 놀랍게도 높은 항원 독립적인 또는 지속적인 사이토킨 방출을 유도한다. 특정한 실시태양에서, 항원 독립적인 사이토킨 방출을 발생시키는 인간화된 항-BCMA CAR의 막관통 도메인을, 상기 변경된 인간화된 항-BCMA CAR T 세포의 신호전달 성질(예를 들어 사이토킨 방출)이, 변경되지 않은 인간화된 항-BCMA CAR을 발현하는 T 세포에 비해 실질적으로 항원 의존적으로 되도록 변경시킨다.
몇몇 실시태양에서, 항원 독립적인 사이토킨 방출을 발생시키는 인간화된 항-BCMA CAR의 막관통 도메인을, 상기 변경된 인간화된 항-BCMA CAR T 세포가, 변경되지 않은 인간화된 항-BCMA CAR을 발현하는 T 세포에 비해 항원의 부재하에서 실질적으로 항원 의존적으로 되거나 사이토킨을 실질적으로 적게 방출하도록 변경시킨다.
하나의 실시태양에서, 인간화된 항-BCMA 항체 또는 항원 결합 단편, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR을 발현하도록 유전자 변형시킨 면역 효과기 세포를 제공한다. CAR을 발현하는 T 세포를 본 명세서에서 CAR T 세포 또는 CAR 변형된 T 세포라 칭한다.
다양한 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 유전자 변형된 면역 효과기 세포를, B 세포 관련 병증, 예를 들어 B 세포와 관련된 자가면역 질병 또는 B 세포암이 있는 환자에게 투여한다.
본 발명의 실시는, 달리 구체적으로 지시되지 않는 한, 당해 분야의 기술내에 있는 통상적인 화학, 생화학, 유기화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기법, 유전학, 면역학, 및 세포 생물학의 방법들을 사용할 것이며, 이들 중 다수는 하기에 예시를 목적으로 기재된다. 상기와 같은 기법들은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어 하기의 문헌들을 참조하시오: Sambrook, et al ., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Sambrook, et al ., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al ., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (1982); Ausubel et al ., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, updated July 2008); Short Protocols in Molecular Biology : A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning : A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology; 뿐만 아니라 문헌[Advances in Immunology]와 같은 학술지의 논문들.
B. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가들에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 바와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질들을 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 조성물, 방법 및 물질의 바람직한 실시태양들을 본 명세서에 기재한다. 본 발명의 목적을 위해서, 하기의 용어들을 하기에 정의한다.
관사 "하나의" 및 "상기"는 본 명세서에서 상기 관사의 문법적 목적어 중 하나 또는 하나 초과(즉 적어도 하나 또는 하나 이상)를 지칭한다. 예로서, "하나의 요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
양자택일(예를 들어 "또는")의 사용은 상기 양자택일 중 하나, 둘 다, 또는 그의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해해야 한다.
"및/또는"이란 용어는 상기 양자택일 중 하나 또는 둘 다를 의미하는 것으로 이해해야 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약" 또는 "대략적으로"란 용어는 참조 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼 까지 변하는 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, "약" 또는 "대략적으로"란 용어는 참조 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 관하여 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이 ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2%, 또는 ± 1%의 범위를 지칭한다.
본 명세서 전체를 통해서, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, "포함하다", 및 "함하는"이란 단어는 진술된 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 그룹을 포함하나 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 그룹은 포함하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다. "로 이루어지는"은 "로 이루어지는"이란 어구에 이어지는 것은 무엇이든 포함하며 이들로 제한됨을 의미한다. 따라서, 상기 "로 이루어지는"이란 어구는 나열된 요소들이 필요하거나 필수적이며 다른 요소들은 존재할 수 없음을 가리킨다. "로 필수적으로 이루어지는"은 상기 어구 뒤에 나열된 임의의 요소들을 포함하며, 상기 나열된 요소들의 명세에 명시된 활성 또는 작용을 방해하지 않거나 상기 작용에 기여하지 않는 다른 요소들로 제한됨을 의미한다. 따라서, "로 필수적으로 이루어지는"이란 어구는 상기 나열된 요소들이 필요하거나 필수적이지만, 상기 나열된 요소들의 활성 또는 작용에 실질적으로 영향을 미치는 다른 요소들은 존재하지 않음을 가리킨다.
본 명세서 전체를 통해 "하나의 실시태양", "특정한 실시태양", "관련된 실시태양", "몇몇 실시태양", "추가적인 실시태양", 또는 "추가의 실시태양" 또는 이들의 조합에 대한 언급은, 상기 실시태양과 관련하여 기재된 특정한 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시태양에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체를 통해 다양한 부분들에서 상기 어구들의 출현은 반드시 모두 동일한 실시태양들을 언급하는 것은 아니다. 더욱 또한, 상기 특정한 특징, 구조 또는 특성을 하나 이상의 실시태양에서 임의의 적합한 방식으로 조합할 수 있다. 또한, 하나의 실시태양에서 하나의 특징의 긍정적인 인용은 특정한 실시태양에서 상기 특징을 제외하는 근거로서 작용하는 것으로 이해된다.
C. 키메릭 항원 수용체
다양한 실시태양에서, 면역 효과기 세포의 세포독성을 B 세포를 향해 재지시하는 유전자 조작된(genetically engineered) 수용체를 제공한다. 상기 유전자 조작된 수용체는 본 명세서에서 키메릭 항원 수용체(CAR)라 지칭된다. CAR은, 목적하는 항원(예를 들어 BCMA)에 대한 항체-기반 특이성을 T 세포 수용체-활성화 세포내 도메인과 조합하여 특이적인 항-BCMA 세포 면역 활성을 나타내는 키메릭 단백질을 생성시키는 분자이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "키메릭"이란 용어는 상이한 기원으로부터의 상이한 단백질 또는 DNA의 부분들로 구성됨을 기술한다.
본 명세서에서 고려되는 CAR은 BCMA에 결합하는 세포외 도메인(또한 결합 도메인 또는 항원-특이성 결합 도메인이라 지칭됨), 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 상기 CAR의 항-BCMA 항원 결합 도메인과 표적 세포의 표면상의 BCMA와의 맞물림은 상기 CAR의 클러스터를 생성시키며 CAR-함유 세포로 활성화 자극을 전달한다. CAR의 주 특성은 면역 효과기 세포 특이성을 재지시하는 능력이며, 이에 의해 주 조직적합성(MHC) 독립적인 방식으로 증식, 사이토킨 생성, 식작용, 또는 표적 항원 발현 세포의 세포사를 매개 할 수 있는 분자의 생성을 촉발하고, 단클론 항체, 용해성 리간드 또는 세포 특이성 공-수용체의 세포 특이성 표적화 능력을 활용한다.
다양한 실시태양에서, CAR은 인간화된 BCMA-특이성 결합 도메인을 포함하는 세포외 결합 도메인; 막관통 도메인; 하나 이상의 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
특정한 실시태양에서, CAR은 인간화된 항-BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 세포외 결합 도메인; 하나 이상의 힌지 도메인 또는 스페이서 도메인; 막관통 도메인; 하나 이상의 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
1. 결합 도메인
특정한 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR은 B 세포상에서 발현된 인간 BCMA 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 인간화된 항-BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 세포외 결합 도메인을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "결합 도메인", "세포외 도메인", "세포외 결합 도메인", "항원-특이성 결합 도메인", 및 "세포외 항원 특이성 결합 도메인"이란 용어들은 호환가능하게 사용되며, CAR에 관심 표적 항원, 예를 들어 BCMA에 특이적으로 결합하는 능력을 제공한다. 상기 결합 도메인은 천연, 합성, 반-합성, 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "특이적 결합 친화성" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합된" 또는 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 표적화하는"이란 용어들은 배경 결합보다 더 큰 결합 친화성으로 BCMA에 대한 항-BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편(또는 이를 포함하는 CAR)의 결합을 기술한다. 결합 도메인(또는 결합 도메인을 포함하는 CAR 또는 결합 도메인을 함유하는 융합 단백질)은 상기 도메인이 예를 들어 약 105 M-1 이상의 친화성 또는 Ka(즉 1/M의 단위를 갖는 특정한 결합 상호작용의 평형 결합 상수)로 BCMA에 결합하거나 또는 상기와 회합하는 경우 BCMA에 "특이적으로 결합한다". 몇몇 실시태양에서, 결합 도메인(또는 그의 융합 단백질)은 약 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1, 또는 1013 M-1 이상의 Ka로 표적에 결합한다. "고 친화성" 결합 도메인(또는 그의 단쇄 융합 단백질)은 적어도 107 M-1, 적어도 108 M-1, 적어도 109 M-1, 적어도 1010 M-1, 적어도 1011 M-1, 적어도 1012 M-1, 적어도 1013 M-1 이상의 Ka를 갖는 상기 결합 도메인들을 지칭한다.
한편으로, 친화성은 M의 단위(예를 들어 10-5 M 내지 10-13 M, 또는 그 이하)를 갖는 특정한 결합 상호작용의 평형 해리 상수(Kd)로서 정의될 수도 있다. 본 명세에 따른 결합 도메인 폴리펩티드 및 CAR 단백질의 친화성을 통상적인 기법들을 사용하여, 예를 들어 경쟁 ELISA(효소-결합된 면역흡수 분석)에 의해서, 또는 결합 회합, 또는 표지된 리간드를 사용하거나 또는 표면-플라스몬 공명 장치, 예를 들어 비아코어(Biacore) T100(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 비아코어 인코포레이티드로부터 입수할 수 있다)을 사용하는 치환 분석(displacement assay), 또는 광학 바이오센서 기술, 예를 들어 EPIC 시스템 또는 엔스파이어(EnSpire)(각각 코닝(Corning) 및 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)로부터 입수할 수 있다)에 의해 쉽게 측정할 수 있다(또한 예를 들어 문헌[Scatchard et al . (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660]; 및 미국특허 제 5,283,173 호; 미국특허 제 5,468,614 호 등을 참조하시오).
하나의 실시태양에서, 상기 특이적 결합의 친화성은 배경 결합보다 약 2배 더 크거나, 배경 결합보다 약 5배 더 크거나, 배경 결합보다 약 10배 더 크거나, 배경 결합보다 약 20배 더 크거나, 배경 결합보다 약 50배 더 크거나, 배경 결합보다 약 100배 더 크거나, 또는 배경 결합보다 약 1000배 더 크거나, 또는 그 이상이다.
특정한 실시태양에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. "항체"는 항원의 에피토프, 예를 들어 항원 결정인자, 예를 들어 면역 세포에 의해 인식되는 것들을 함유하는 펩티드, 지질, 폴리사카라이드, 또는 핵산을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 적어도 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드인 결합제를 지칭한다.
"항원(Ag)"은 동물에서 항체의 생산 또는 T 세포 반응을 자극할 수 있는 화합물, 조성물, 또는 물질, 예를 들어 동물에게 주사되거나 흡수되는 조성물, 예를 들어 암-특이성 단백질을 포함하는 조성물을 포함한다. 항원은 특이적인 체액 또는 세포 면역의 산물, 예를 들어 이종 항원, 예를 들어 상기 개시된 항원들에 의해 유도되는 것들과 반응한다. 특정한 실시태양에서, 상기 표적 항원은 BCMA 폴리펩티드의 에피토프이다.
"에피토프" 또는 "항원 결정인자"는 결합제가 결합하는 항원의 영역을 지칭한다. 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병렬되는 연속적인 아미노산 또는 불연속적인 아미노산 모두로부터 형성될 수 있다. 연속적인 아미노산으로부터 형성되는 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출시 유지되는 반면 3차 폴딩에 의해 형성되는 에피토프는 전형적으로 변성 용매 처리시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간 입체구조 중에 적어도 3개, 및 보다 대개는 적어도 5개, 약 9개, 또는 약 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다.
항체는 그의 항원 결합 단편, 예를 들어 카멜 Ig, Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단쇄 Fv 단백질("scFv"), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 디설파이드 안정화된 Fv 단백질("dsFv"), 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디) 및 항원 결합을 담당하는 전장 항체의 부분들을 포함한다. 상기 용어는 또한 유전자 조작된 형태, 예를 들어 키메릭 항체(예를 들어 인간화된 쥐 항체), 이종접합 항체(예를 들어 이중특이성 항체) 및 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 또한 문헌[Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)]; 문헌[Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997]을 참조하시오.
숙련가에 의해 이해되고 본 명세서의 어딘가에 기재된 바와 같이, 완전 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 가변 영역 및 제1, 제2 및 제3 불변 영역으로 이루어지는 반면, 각각의 경쇄는 가변 영역 및 불변 영역으로 이루어진다. 포유동물 중쇄는 α, δ, ε, γ 및 μ로서 분류된다. 포유동물 경쇄는 λ 또는 κ로서 분류된다. 상기 α, δ, ε, γ 및 μ 중쇄를 포함하는 면역글로불린은 면역글로불린 (Ig)A, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로서 분류된다. 상기 완전 항체는 "Y" 모양을 형성한다. 상기 Y의 줄기는 함께 결합된 2개의 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역(및 IgE 및 IgM의 경우, 제4 불변 영역)으로 이루어지며, 디설파이드 결합(쇄-간)이 힌지에 형성된다. 중쇄 γ, α 및 δ는 3개의 직렬(한 줄로) Ig 도메인으로 구성된 불변 영역, 및 유연성을 더하기 위한 힌지 영역을 가지며; 중쇄 μ 및 ε는 4개의 면역글로불린 도메인으로 구성된 불변 영역을 갖는다. 상기 제2 및 제3 불변 영역을 각각 "CH2 도메인" 및 "CH3 도메인"이라 칭한다. 상기 Y의 각 아암(arm)은 단일 경쇄의 가변 및 불변 영역에 결합된 단일 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역을 포함한다. 상기 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원 결합을 담당한다.
경쇄 및 중쇄 가변 영역은 3개의 고가변 영역, 소위 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"에 의해 중단된 "프레임워크" 영역을 함유한다. 상기 CDR을 통상적인 방법에 의해, 예를 들어 카밧 등(문헌[Wu, TT and Kabat, E. A., J Exp Med. 132(2):211-50, (1970)]; 문헌[Borden, P. and Kabat E. A., PNAS, 84: 2440-2443 (1987)])에 따른 서열에 의해; (본 명세서에 참고로 인용된 문헌[Kabat et al ., Sequences of Proteins of Immunological Interest , U.S. Department of Health and Human Services, 1991]을 참조하시오), 또는 코티아 등(문헌[Chothia, C. and Lesk, A.M., J Mol . Biol., 196(4): 901-917 (1987)], 문헌[Chothia, C. et al, Nature, 342: 877 - 883 (1989)])에 따른 구조에 의해 한정하거나 식별할 수 있다.
상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열들은 하나의 종, 예를 들어 인간 내에서 비교적 보존된다. 항체의 프레임워크 영역, 즉 구성 경쇄 및 중쇄의 결합된 프레임워크 영역은 상기 CDR을 3차원 공간에 위치 및 정렬시키는 작용을 한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합을 담당한다. 각 쇄의 CDR을 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3이라 칭하며, N-말단으로부터 출발하여 연속해서 번호를 매기고, 또한 전형적으로 특정 CDR이 위치한 쇄에 의해 식별한다. 따라서, 항체의 중쇄의 가변 도메인에 위치한 CDR들을 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이라 칭하는 반면, 항체의 경쇄의 가변 도메인에 위치한 CDR들은 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이라 칭한다. 상이한 특이성(즉 상이한 항원들에 대한 상이한 결합 부위)을 갖는 항체는 상이한 CDR을 갖는다. CDR은 항체마다 다르지만, 상기 CDR내 오직 제한된 수의 아미노산 위치만이 항원 결합에 직접적으로 관련된다. 상기 CDR내의 상기 위치들을 특이성 결정 잔기(SDR)라 칭한다. 본 명세서에서 고려되는 인간화된 항-BCMA CAR의 구성에 적합한 경쇄 CDR의 예시적인 예는 비제한적으로 서열번호 1-3에 제시된 CDR 서열들을 포함한다. 본 명세서에서 고려되는 인간화된 항-BCMA CAR의 구성에 적합한 중쇄 CDR의 예시적인 예는 비제한적으로 서열번호 4-6에 제시된 CDR 서열들을 포함한다.
"VH" 또는 "VH"에 대한 언급은 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 지칭하며, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체, Fv, scFv, dsFv, Fab 또는 다른 항체 단편의 경우를 포함한다. "VL" 또는 "VL"에 대한 언급은 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 지칭하며, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체, Fv, scFv, dsFv, Fab 또는 다른 항체 단편의 경우를 포함한다.
"단클론 항체"는 B 림프구의 단일 클론에 의해 또는 단일 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자로 감염된 세포에 의해 생산된 항체이다. 단클론 항체는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어 골수종 세포와 면역 비장 세포와의 융합으로부터 하이브리드 항체-형성 세포를 제조함으로써 생성된다. 단클론 항체는 인간화된 단클론 항체를 포함한다.
"키메릭 항체"는 하나의 종, 예를 들어 인간으로부터의 프레임워크 잔기, 및 또 다른 종, 예를 들어 마우스로부터의 CDR(일반적으로 항원 결합을 부여한다)을 갖는다. 특히 바람직한 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR은 키메릭 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 항원-특이성 결합 도메인을 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 상기 항체는 인간 BCMA 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체(예를 들어 인간화된 단클론 항체) 또는 그의 단편이다. "인간화된" 항체는 인간 프레임워크 영역 및 비-인간(예를 들어 마우스, 래트 또는 합성) 면역글로불린으로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린이다. 상기 CDR을 제공하는 비-인간 면역글로불린을 "공여체"라 칭하며, 상기 프레임워크를 제공하는 인간 면역글로불린을 "수용체"라 칭한다. 하나의 실시태양에서, 상기 CDR은 모두 인간화된 면역글로불린 중의 공여체 면역글로불린으로부터의 것이다. 불변 영역은 존재할 필요가 없지만, 존재하는 경우, 인간 면역글로불린 불변 영역과 실질적으로 일치해야 한다, 즉 적어도 약 85 내지 90%, 예를 들어 약 95% 이상 일치해야 한다. 따라서, 가능하게는 CDR을 제외하고, 인간화된 면역글로불린의 모든 부분이 천연 인간 면역글로불린 서열의 상응하는 부분과 실질적으로 일치한다. 인간화된 또는 다른 단클론 항체는 추가의 보존적인 아미노산 치환을 가질 수 있으며, 상기 치환은 항원 결합 또는 다른 면역글로불린 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는다. 인간화된 항체를 유전자 조작에 의해 구성할 수 있다(예를 들어 미국특허 제 5,585,089 호를 참조하시오).
특정한 실시태양에서, 인간화된 항-BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 비제한적으로 카멜 Ig(카멜리드 항체(VHH)), Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단쇄 Fv 항체("scFv"), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 디설파이드 안정화된 Fv 단백질("dsFv"), 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디)를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "카멜 Ig" 또는 "카멜리드 VHH"는 중쇄 항체의 최소의 공지된 항원-결합 단위를 지칭한다(Koch-Nolte, et al, FASEB J., 21: 3490-3498 (2007)). "중쇄 항체" 또는 "카멜리드 항체"는 2개의 VH 도메인을 함유하고 경쇄는 없는 항체를 지칭한다(Riechmann L. et al, J. Immunol. Methods 231:25-38 (1999); WO94/04678; WO94/25591; 미국특허 제 6,005,079 호).
"면역글로불린 신규 항원 수용체"의 "IgNAR"은 하나의 가변 신규 항원 수용체(VNAR) 도메인 및 5개의 불변 신규 항원 수용체(CNAR) 도메인의 동종이량체로 이루어지는 상어 면역 레퍼토리로부터의 항체 부류를 지칭한다. IgNAR은 상기 최소의 공지된 면역글로불린-계 단백질 스캐폴드 중 일부를 나타내고 매우 안정성이며 효율적인 결합 특성을 갖는다. 상기 본래의 안정성은 (i) 쥐 항체에서 발견되는 통상적인 항체 VH 및 VL 도메인에 비해 상당한 수의 하전되고 친수성인 표면 노출된 잔기를 나타내는 근원적인 Ig 스캐폴드; 및 (ii) 고리-간 디설파이드 가교 및 고리-내 수소 결합의 패턴을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 고리에서 구조적 특징의 안정화 모두에 기여할 수 있다.
항체의 파파인 절단은 소위 "Fab" 단편이라 칭하는 2개의 동일한 항원-결합 단편(각각 단일 항원-결합 부위를 갖는다), 및 잔류 "Fc" 단편(그의 명칭은 쉽게 결정화하는 그의 능력을 반영한다)을 생성시킨다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 가지며 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성시킨다.
"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 하나의 실시태양에서, 2-쇄 Fv 종은 빈틈없이 비-공유 회합된 하나의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 단쇄 Fv(scFv) 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인을, 상기 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서의 경우와 유사한 "이량체성" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 결합시킬 수 있다. 상기 배열에서, 각 가변 도메인의 3개의 고가변 영역(HVR)은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면상에 항원-결합 부위를 한정한다. 집합적으로, 상기 6개의 HVR은 상기 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이성인 단지 3개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)조차, 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화성이기는 하지만, 항원을 인식하고 상기 항원에 결합하는 능력을 갖는다.
상기 Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하며 상기 경쇄의 불변 도메인 및 상기 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 또한 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 새로운 잔기의 추가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본 명세서에서 상기 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 표시(designation)이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 힌지 시스테인이 사이에 있는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
"디아바디"란 용어는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭하며, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 쇄상의 2개의 도메인간에 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인들을 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 강제로 짝을 이루게 하여 2개의 항원-결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 2가이거나 이중특이성일 수 있다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al ., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]; 및 문헌[Hollinger et al ., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 충분히 기재되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디가 또한 문헌[Hudson et al ., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
"단일 도메인 항체" 또는 "sdAb" 또는 "나노바디"는 항체 중쇄의 가변 영역(VH 도메인) 또는 항체 경쇄의 가변 영역(VL 도메인)으로 이루어지는 항체 단편을 지칭한다(Holt, L., et al, Trends in Biotechnology, 21(11): 484-490).
"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기에서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 및 어느 한 배향으로(예를 들어 VL-VH 또는 VH-VL) 존재한다. 일반적으로, 상기 scFv 폴리펩티드는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하며, 이는 상기 scFv가 항원 결합에 목적하는 구조를 형성할 수 있게 한다. scFv에 대한 재고찰을 위해서, 예를 들어 문헌[Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315]을 참조하시오.
바람직한 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR은, scFv이고 쥐, 인간 또는 인간화된 scFv일 수 있는 항원-특이성 결합 도메인을 포함한다. 단쇄 항체를 목적하는 표적에 특이성인 하이브리도마의 V 영역 유전자로부터 클로닝할 수 있다. 상기와 같은 하이브리도마의 생성은 통상적이게 된다. 가변 영역 중쇄(VH) 및 가변 영역 경쇄(VL)를 클로닝하는데 사용될 수 있는 기법은 예를 들어 문헌[Orlandi et al ., PNAS, 1989; 86: 3833-3837]에 기재되었다.
특정한 실시태양에서, 항원-특이성 결합 도메인은 인간 BCMA 폴리펩티드에 결합하는 인간화된 scFv이다. 본 명세서에서 고려되는 항-BCMA CAR의 구성에 적합한 가변 중쇄의 예시적인 예는 비제한적으로 서열번호 10-14에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서에서 고려되는 항-BCMA CAR의 구성에 적합한 가변 경쇄의 예시적인 예는 비제한적으로 서열번호 7-9에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
예시적인 인간화된 항-BCMA-특이성 결합 도메인은 적어도 하나의 인간 프레임워크 영역을 포함하는 BCMA에 특이적인 면역글로불린 가변 영역이다. "인간 프레임워크 영역"은 인간 면역글로불린 가변 영역의 야생형(즉 천연) 프레임워크 영역, 하나의 태양에서, 면역원성이 감소되도록, 상기 영역 중 아미노산의 약 50% 미만(예를 들어 바람직하게는 약 45%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 1% 미만)이 결실 또는 치환된(예를 들어 상응하는 위치에서 비인간 면역글로불린 프레임워크 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해) 인간 면역글로불린 가변 영역의 변경된 프레임워크 영역, 또는 상기 영역 중 아미노산의 약 50% 미만(예를 들어 약 45%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만)이 결실 또는 치환된(예를 들어 노출된 잔기들의 위치에서 및/또는 상응하는 위치에서 인간 면역글로불린 프레임워크의 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해) 비인간 면역글로불린 가변 영역의 변경된 프레임워크 영역을 지칭한다.
몇몇 실시태양에서, 인간 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 가변 영역의 야생형 프레임워크 영역이다. 몇몇 다른 실시태양에서, 인간 프레임워크 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 위치에서 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 인간 면역글로불린 가변 영역의 변경된 프레임워크 영역이다. 다른 실시태양에서, 인간 프레임워크 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 위치에서 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 비-인간 면역글로불린 가변 영역의 변경된 프레임워크 영역이다.
특정한 실시태양에서, BCMA-특이성 결합 도메인은 인간 경쇄 FR1, 인간 중쇄 FR1, 인간 경쇄 FR2, 인간 중쇄 FR2, 인간 경쇄 FR3, 인간 중쇄 FR3, 인간 경쇄 FR4 및 인간 중쇄 FR4 중에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 인간 프레임워크 영역(FR)을 포함한다.
BCMA-특이성 결합 도메인 중에 존재할 수 있는 인간 FR은 또한 본 명세서에 제공된 예시적인 FR의 변이체들(여기에서 상기 예시적인 FR 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산이 치환되거나 결실되었다)을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 인간화된 항-BCMA-특이성 결합 도메인은 (a) 인간 경쇄 FR1, 인간 경쇄 FR2, 인간 경쇄 FR3 및 인간 경쇄 FR4를 포함하는 인간화된 경쇄 가변 영역, 및 (b) 인간 중쇄 FR1, 인간 중쇄 FR2, 인간 중쇄 FR3 및 인간 중쇄 FR4를 포함하는 인간화된 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 명세서에 제공된 BCMA-특이성 결합 도메인은 또한 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다. 상기와 같은 CDR은 경쇄의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 및 중쇄의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 중에서 선택된 비인간 CDR 또는 변경된 비인간 CDR일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, BCMA-특이성 결합 도메인은 (a) 경쇄 CDRL1, 경쇄 CDRL2 및 경쇄 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 중쇄 CDRH1, 중쇄 CDRH2 및 중쇄 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
2. 링커
몇몇 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR은, 예를 들어 상기 분자의 적합한 이격 및 배치를 위해 첨가된, 상기 다양한 도메인들 사이의 링커 잔기를 포함할 수 있다. 특정한 실시태양에서 상기 링커는 가변 영역 연결 서열이다. "가변 영역 연결 서열"은, 상기 VH 및 VL 도메인을 연결하고, 생성되는 폴리펩티드가 동일한 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체로서 동일한 표적 분자에 대해 특이적인 결합 친화성을 유지하도록 2개의 하위-결합 도메인의 상호작용에 적합한 스페이서 기능을 제공하는 아미노산 서열이다. 본 명세서에서 고려되는 CAR은 1, 2, 3, 4 또는 5개 또는 그 이상의 링커를 포함할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 링커의 길이는 약 1 내지 약 25 아미노산, 약 5 내지 약 20 아미노산, 또는 약 10 내지 약 20 아미노산, 또는 임의의 사이 길이의 아미노산일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 그 이상의 아미노산 길이이다.
링커의 예시적인 예는 글리신 중합체 (G)n; 글리신-세린 중합체 (G1- 5S1 - 5)n(여기에서 n은 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5의 정수이다); 글리신-알라닌 중합체; 알라닌-세린 중합체; 및 당해 분야에 공지된 다른 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 비교적 조직화되지 않으며, 따라서 본 명세서에 기재된 CAR과 같은 융합 단백질의 도메인들간의 중립 밧줄(neutral tether)로서 작용할 수 있다. 글리신은 심지어 알라닌보다 현저하게 더 파이-프사이 공간에 접근하며 보다 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한된다(문헌[Scheraga, Rev . Computational Chem. 11173-142 (1992)]을 참조하시오). 통상적인 숙련가는 특정한 실시태양에서 CAR의 디자인이 전부 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있으며, 따라서 상기 링커가 가요성 링커뿐만 아니라 목적하는 CAR 구조를 제공하도록 덜 가요성인 구조를 부여하는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있음을 알 것이다.
다른 예시적인 링커는 비제한적으로 하기의 아미노산 서열들을 포함한다: GGG; DGGGS (서열번호 46); TGEKP (서열번호 47) (예를 들어 문헌[Liu et al ., PNAS 5525-5530 (1997)]을 참조하시오); GGRR (서열번호 48) (상기 문헌[Pomerantz et al . 1995]); (GGGGS)n (여기에서 = 1, 2, 3, 4 또는 5이다) (서열번호 49) (Kim et al ., PNAS 93, 1156-1160 (1996.); EGKSSGSGSESKVD (서열번호 50) (Chaudhary et al ., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1066-1070); KESGSVSSEQLAQFRSLD (서열번호 51) (Bird et al ., 1988, Science 242:423-426), GGRRGGGS (서열번호 52); LRQRDGERP (서열번호 53); LRQKDGGGSERP (서열번호 54); LRQKd(GGGS)2 ERP (서열번호 55). 한편으로, 가요성 링커를 DNA-결합 부위 및 펩티드 자체 모두를 모델링할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 사용하여(Desjarlais & Berg, PNAS 90:2256-2260 (1993), PNAS 91:11099-11103 (1994)) 또는 파지 디스플레이 방법에 의해 합리적으로 디자인 할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 링커는 하기의 아미노산 서열을 포함한다: GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열번호 56) (Cooper et al ., Blood, 101(4): 1637-1644 (2003)).
3. 스페이서 도메인
특정 실시태양에서, 상기 CAR의 결합 도메인에 이어서 하나 이상의 "스페이서 도메인"(항원 결합 도메인을 효과기 세포 표면으로부터 이동시켜 적합한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하는 영역을 지칭한다)이 있다(Patel et al ., Gene Therapy, 1999; 6: 412-419). 상기 힌지 도메인은 천연, 합성, 반-합성, 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 스페이서 도메인은 비제한적으로 하나 이상의 중쇄 불변 영역, 예를 들어 CH2 및 CH3을 포함하는 면역글로불린의 일부이다. 상기 스페이서 도메인은 천연 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 면역글로불린 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 스페이서 도메인은 IgG1 또는 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
4. 힌지 도메인
상기 CAR의 결합 도메인에 이어서 일반적으로 하나 이상의 "힌지 도메인"(항원 결합 도메인을 효과기 세포 표면으로부터 떨어져 위치시켜 적합한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하는데 한 역할을 한다)이 있다. CAR은 일반적으로 상기 결합 도메인과 막관통 도메인(TM) 사이에 하나 이상의 힌지 도메인을 포함한다. 상기 힌지 도메인은 천연, 합성, 반-합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 상기 힌지 도메인은 천연 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 면역글로불린 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
"변경된 힌지 영역"은 (a) 30% 이하의 아미노산 변화(예를 들어 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 이하의 아미노산 치환 또는 결실)를 갖는 천연 힌지 영역, (b) 30% 이하의 아미노산 변화(예를 들어 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 이하의 아미노산 치환 또는 결실)를 갖는, 적어도 10 아미노산(예를 들어 적어도 12, 13, 14 또는 15 아미노산) 길이인 천연 힌지 영역의 일부, 또는 (c) 코어 힌지 영역(4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 또는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 아미노산 길이일 수 있는)을 포함하는 천연 힌지 영역의 일부를 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 천연 면역글로불린 힌지 영역 중 하나 이상의 시스테인 잔기를 하나 이상의 다른 아미노산 잔기(예를 들어 하나 이상의 세린 잔기)에 의해 치환시킬 수 있다. 변경된 면역글로불린 힌지 영역은 한편으로 또는 추가로 또 다른 아미노산 잔기(예를 들어 세린 잔기)에 의해 치환된 야생형 면역글로불린 힌지 영역의 프롤린 잔기를 가질 수 있다.
본 명세서에 기재된 CAR에 사용하기에 적합한 다른 예시적인 힌지 도메인은 1형 막 단백질의 세포외 영역으로부터 유래된 힌지 영역, 예를 들어 CD8α, CD4, CD28, PD1, CD152 및 CD7을 포함하며, 이들은 상기 분자로부터의 야생형 힌지 영역이거나 변경될 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 힌지 도메인은 PD1, CD152 또는 CD8α 힌지 영역을 포함한다.
5. 막관통(TM) 도메인
"막관통 도메인"은, 세포외 결합 부분과 세포내 신호전달 도메인을 융합하며 CAR을 면역 효과기 세포의 원형질막에 고정시키는 상기 CAR의 부분이다. 상기 TM 도메인은 천연, 합성, 반-합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 상기 TM 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154, 및 PD1로부터 유래될 수 있다(즉 적어도 이들의 막관통 영역(들)을 포함할 수 있다). 특정한 실시태양에서, 상기 TM 도메인은 합성적이며 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 우세하게 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR은 PD1, CD152 또는 CD8α로부터 유래된 TM 도메인을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR은 PD1, CD152 또는 CD8α로부터 유래된 TM 도메인, 및 상기 TM 도메인 및 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인을 연결하는, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커를 포함한다. 글리신-세린계 링커는 특히 적합한 링커를 제공한다.
6. 세포내 신호전달 도메인
특정한 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. "세포내 신호전달 도메인"은 인간 BCMA 폴리펩티드에 대한 유효한 항-BCMA CAR 결합의 메세지를 면역 효과기 세포의 내부로 전달하여 효과기 세포 기능, 예를 들어 상기 CAR-결합된 표적 세포로의 세포독성 인자의 방출 또는 상기 세포외 CAR 도메인에 대한 항원 결합으로 유도된 다른 세포 반응을 포함한 활성화, 사이토킨 생성, 증식 및 세포독성 활성을 유도하는데 관여하는 상기 CAR의 부분을 지칭한다.
"효과기 기능"이란 용어는 면역 효과기 세포의 전문화된 기능을 지칭한다. 상기 T 세포의 효과기 기능은 예를 들어 사이토킨의 분비를 포함한 세포용해 활성이거나 또는 상기 활성을 도울 수 있다. 따라서, "세포내 신호전달 도메인"이란 용어는 상기 효과기 기능 신호를 전달하고 상기 세포가 전문화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질 부분을 지칭한다. 대개는 전체 세포내 신호전달 도메인을 사용할 수 있지만, 다수의 경우에 상기 전체 도메인을 사용하는 것은 필요하지 않다. 세포내 신호전달 도메인의 절두된(truncated) 부분의 사용에 관하여, 상기와 같은 절두된 부분을, 상기 부분이 효과기 기능 신호를 전달하는 한, 상기 전체 도메인 대신에 사용할 수 있다. 상기 세포내 신호전달 도메인이라는 용어는 효과기 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절두된 부분을 포함함을 의미한다.
상기 TCR만을 통해 생성된 신호는 상기 T 세포의 완전한 활성화에 불충분하며 2차적인 또는 공-자극 신호가 또한 필요한 것으로 공지되어 있다. 따라서, T 세포 활성화는 2개의 독특한 부류의 세포내 신호전달 도메인, 즉 TCR(예를 들어 TCR/CD3 복합체)을 통해 항원-의존성 1차 활성화를 개시시키는 주요 신호전달 도메인 및 항원-독립적인 방식으로 2차적인 또는 공-자극 신호를 제공하는 작용을 하는 공-자극 신호전달 도메인에 의해 매개된다고 할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR은 하나 이상의 "공-자극 신호전달 도메인" 및 "주요 신호전달 도메인"을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
주요 신호전달 도메인은 상기 TCR 복합체의 1차 활성화를 자극 방식으로 또는 억제 방식으로 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 주요 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-계 활성화 동기 또는 ITAM으로서 공지된 신호전달 동기들을 함유할 수 있다.
본 발명에 특히 유용한 주요 신호전달 도메인을 함유하는 ITAM의 예시적인 예는 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것들을 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에서, CAR은 CD3ζ 주요 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 상기 세포내 주요 신호전달 및 공-자극 신호전달 도메인들을 임의의 순서로 직렬로(in tandem) 막관통 도메인의 카복실 말단에 연결시킬 수 있다.
본 명세서에서 고려되는 CAR은 CAR 수용체를 발현하는 T 세포의 효능 및 확대를 증대시키기 위해 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "공-자극 신호전달 도메인" 또는 "공-자극 도메인"이란 용어는 공-자극 분자의 세포내 신호전달 도메인을 지칭한다. 공-자극 분자는 항원에 결합시 T 림프구의 효율적인 활성화 및 기능에 필요한 2차 신호를 제공하는 항원 수용체 또는 Fc 수용체 이외의 세포 표면 분자이다. 상기와 같은 공-자극 분자의 예시적인 예는 CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM, 및 ZAP70을 포함한다. 하나의 실시태양에서, CAR은 CD28, CD137 및 CD134, 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, CAR은 CD28 및 CD137 공-자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
더욱 또 다른 실시태양에서, CAR은 CD28 및 CD134 공-자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
하나의 실시태양에서, CAR은 CD137 및 CD134 공-자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
하나의 실시태양에서, CAR은 CD137 공-자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
하나의 실시태양에서, CAR은 CD134 공-자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
하나의 실시태양에서, CAR은 CD28 공-자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
특정한 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR은 B 세포상에서 발현된 BCMA 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 인간화된 항-BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다.
하나의 실시태양에서, CAR은 BCMA 폴리펩티드에 결합하는 인간화된 항-BCMA scFv; T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154, 및 PD1로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 폴리펩티드로부터 유래된 막관통 도메인; 및 CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM, 및 ZAP70으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 공-자극 분자로부터의 하나 이상의 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터의 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
하나의 실시태양에서, CAR은 BCMA 폴리펩티드에 결합하는 인간화된 항-BCMA scFv; IgG1 힌지/CH2/CH3, IgG4 힌지/CH2/CH3, PD1 힌지, CD152 힌지, 및 CD8α 힌지로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 힌지 도메인; T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154, 및 PD1로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 폴리펩티드로부터 유래된 막관통 도메인; 및 CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM, 및 ZAP70으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 공-자극 분자로부터의 하나 이상의 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터의 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
하나의 실시태양에서, CAR은 BCMA 폴리펩티드에 결합하는 인간화된 항-BCMA scFv; IgG1 힌지/CH2/CH3, IgG4 힌지/CH2/CH3, PD1 힌지, CD152 힌지, 및 CD8α 힌지로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 힌지 도메인; T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154, 및 PD1로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 폴리펩티드로부터 유래된 막관통 도메인; TM 도메인을 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인에 연결하는, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커; 및 CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM, 및 ZAP70으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 공-자극 분자로부터의 하나 이상의 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터의 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
특정한 실시태양에서, CAR은 BCMA 폴리펩티드에 결합하는 인간화된 항-BCMA scFv; IgG1 힌지/CH2/CH3 폴리펩티드 및 CD8α 폴리펩티드를 포함하는 힌지 도메인; 약 3 내지 약 10 아미노산의 폴리펩티드 링커를 포함하는 CD8α 막관통 도메인; CD137 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
특정한 실시태양에서, CAR은 BCMA 폴리펩티드에 결합하는 인간화된 항-BCMA scFv; CD8α 폴리펩티드를 포함하는 힌지 도메인; 약 3 내지 약 10 아미노산의 폴리펩티드 링커를 포함하는 CD8α 막관통 도메인; CD134 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
특정한 실시태양에서, CAR은 BCMA 폴리펩티드에 결합하는 인간화된 항-BCMA scFv; CD8α 폴리펩티드를 포함하는 힌지 도메인; 약 3 내지 약 10 아미노산의 폴리펩티드 링커를 포함하는 CD8α 막관통 도메인; CD28 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
특정한 실시태양에서, CAR은 BCMA 폴리펩티드에 결합하는 인간화된 항-BCMA scFv; PD1 힌지, 폴리펩티드를 포함하는 힌지 도메인; 약 3 내지 약 10 아미노산의 폴리펩티드 링커를 포함하는 PD1 또는 CD152 막관통 도메인; CD137 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
특정한 실시태양에서, CAR은 BCMA 폴리펩티드에 결합하는 인간화된 항-BCMA scFv; PD1 힌지, 폴리펩티드를 포함하는 힌지 도메인; 약 3 내지 약 10 아미노산의 폴리펩티드 링커를 포함하는 PD1 또는 CD152 막관통 도메인; CD134 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
특정한 실시태양에서, CAR은 BCMA 폴리펩티드에 결합하는 인간화된 항-BCMA scFv; PD1 힌지, 폴리펩티드를 포함하는 힌지 도메인; 약 3 내지 약 10 아미노산의 폴리펩티드 링커를 포함하는 PD1 또는 CD152 막관통 도메인; CD28 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
특정한 실시태양에서, CAR은 BCMA 폴리펩티드에 결합하는 인간화된 항-BCMA scFv; CD152 힌지, 폴리펩티드를 포함하는 힌지 도메인; 약 3 내지 약 10 아미노산의 폴리펩티드 링커를 포함하는 PD1 또는 CD152 막관통 도메인; CD137 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
특정한 실시태양에서, CAR은 BCMA 폴리펩티드에 결합하는 인간화된 항-BCMA scFv; CD152 힌지, 폴리펩티드를 포함하는 힌지 도메인; 약 3 내지 약 10 아미노산의 폴리펩티드 링커를 포함하는 PD1 또는 CD152 막관통 도메인; CD134 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
특정한 실시태양에서, CAR은 BCMA 폴리펩티드에 결합하는 인간화된 항-BCMA scFv; CD152 힌지, 폴리펩티드를 포함하는 힌지 도메인; 약 3 내지 약 10 아미노산의 폴리펩티드 링커를 포함하는 PD1 또는 CD152 막관통 도메인; CD28 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
더욱이, 본 명세서에서 고려되는 CAR의 디자인은, 변형되지 않은 T 세포 또는 다른 CAR을 발현하도록 변형된 T 세포에 비해 상기 CAR을 발현하는 T 세포에서 개선된 확대, 장기간 지속, 및 세포독성 성질을 가능하게 한다.
D. 폴리펩티드
본 발명은 부분적으로 CAR 폴리펩티드 및 그의 단편, 이를 포함하는 세포 및 조성물, 및 폴리펩티드를 발현하는 벡터를 고려한다. 바람직한 실시태양에서, 서열번호 15-29, 71 및 73 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 CAR을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
"폴리펩티드", "폴리펩티드 단편", "펩티드" 및 "단백질"은 달리 명시되지 않는 한 호환가능하며, 통상적인 의미, 즉 아미노산의 서열로서 통상적인 의미에 따른다. 폴리펩티드는 특정 길이로 제한되지 않는다, 예를 들어 폴리펩티드는 전장 단백질 서열 또는 전장 단백질의 단편을 포함할 수 있으며, 상기 폴리펩티드의 번역-후 변형, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 다른 변형들(천연 및 비-천연 모두)을 포함할 수 있다. 다양한 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR 폴리펩티드는 상기 단백질의 전달을 번역과 동시에 또는 번역-후에 지시하는, 상기 단백질의 N-말단 단부의 신호(또는 리더) 서열을 포함한다. 본 명세서에 개시된 CAR에 유용한 적합한 신호 서열의 예시적인 예는 비제한적으로 IgG1 중쇄 신호 폴리펩티드, CD8α 신호 폴리펩티드, 또는 인간 GM-CSF 수용체 알파 신호 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드를 다양한 주지된 재조합 및/또는 합성 기법 중 어느 하나를 사용하여 제조할 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 폴리펩티드는 본 명세의 CAR, 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 CAR의 하나 이상의 아미노산으로부터의 결실, 상기 아미노산에의 부가, 및/또는 상기 아미노산의 치환을 갖는 서열을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "단리된 펩티드" 또는 "단리된 폴리펩티드" 등은 세포 환경으로부터, 및 상기 세포의 다른 성분과의 결합으로부터 펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 시험관내 단리 및/또는 정제를 지칭한다, 즉 상기는 생체내 물질과 그다지 결합되지 않는다. 유사하게, "단리된 세포"는 생체내 조직 또는 기관으로부터 수득되었고 세포외 기질이 실질적으로 없는 세포를 지칭한다.
폴리펩티드는 "폴리펩티드 변이체"를 포함한다. 폴리펩티드 변이체는 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 있어서 천연 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 상기와 같은 변이체는 천연이거나, 또는 예를 들어 상기 폴리펩티드 서열 중 하나 이상의 변형에 의해 합성적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 특정한 실시태양에서, 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 CAR 폴리펩티드의 결합 도메인, 힌지, TM 도메인, 공-자극 신호전달 도메인 또는 주요 신호전달 도메인에 도입시킴으로써 상기 CAR의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질들을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드에 적어도 약 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 아미노산 일치성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
폴리펩티드는 "폴리펩티드 단편"을 포함한다. 폴리펩티드 단편은 천연 또는 재조합-생성된 폴리펩티드의 아미노-말단 결실, 카복실-말단 결실 및/또는 내부 결실 또는 치환을 갖는, 단량체성이거나 다량체성일 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 폴리펩티드 단편은 적어도 5 내지 약 500 아미노산 길이의 아미노산 쇄를 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 단편은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 450 아미노산 길이임을 알 것이다. 특히 유용한 폴리펩티드 단편은 항체의 항원-결합 도메인 또는 단편을 포함한 기능성 도메인을 포함한다. 인간화된 항-BCMA 항체의 경우에, 유용한 단편은 비제한적으로 CDR 영역, 중쇄 또는 경쇄의 CDR3 영역; 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역; 2개의 CDR을 포함하는 항체 쇄 또는 가변 영역의 일부; 등을 포함한다.
상기 폴리펩티드를 또한 상기 폴리펩티드의 합성, 정제 또는 식별의 용이성을 위해서(예를 들어 폴리-His) 또는 상기 폴리펩티드의 고체 지지체에의 결합을 증대시키기 위해서 링커 또는 다른 서열에 인-프레임 융합시키거나 또는 접합시킬 수 있다.
상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 아미노산 치환, 결실, 절두 및 삽입을 포함한 다양한 방식으로 변경시킬 수 있다. 상기와 같은 조작 방법은 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 참조 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체를 DNA 중의 돌연변이에 의해 제조할 수 있다. 돌연변이유발(mutagenesis) 및 뉴클레오티드 서열 변경에 대한 방법들이 당해 분야에 주지되어 있다. 예를 들어 문헌[Kunkel (1985, Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 82: 488-492)], 문헌[Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382)], 미국특허 제 4,873,192 호, 문헌[Watson, J. D. et al ., (Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987)] 및 이 중에 인용된 참고문헌들을 참조하시오. 관심 단백질의 생물 활성에 영향을 미치지 않는 적합한 아미노산 치환에 관한 지침을 문헌[Dayhoff et al ., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.]의 모델에서 찾을 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 변이체는 보존적 치환을 함유할 것이다. "보존적 치환"은 아미노산이 유사한 성질을 갖는 또 다른 아미노산에 대해 치환되는 것이며, 따라서 펩티드 화학 분야의 숙련가는 상기 폴리펩티드의 2차 구조 및 수치료 성질(hydropathic nature)이 실질적으로 변하지 않을 것을 예상할 수 있다. 변형을 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 구조 중에서 수행할 수 있으며 바람직한 특성을 갖는 변이체 또는 유도체 폴리펩티드를 암호화하는 기능성 분자를 여전히 수득할 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경시켜 본 발명의 동등한, 또는 심지어 개선된 변형 폴리펩티드를 생성시키고자 하는 경우, 당해 분야의 숙련가는 예를 들어 표 1에 따른 암호화 DNA 서열의 코돈들 중 하나 이상을 변화시킬 수 있다.
아미노산 코돈
아미노산 1문자 암호 3문자 암호 코돈
알라닌 A Ala GCA GCC GCG GCU
시스테인 C Cys UGC UGU
아스파트산 D Asp GAC GAU
글루탐산 E Glu GAA GAG
페닐알라닌 F Phe UUC UUU
글리신 G Gly GGA GGC GGG GGU
히스티딘 H His CAC CAU
이소류신 I Iso AUA AUC AUU
리신 K Lys AAA AAG
류신 L Leu UUA UUG CUA CUC CUG CUU
메티오닌 M Met AUG
아스파라진 N Asn AAC AAU
프롤린 P Pro CCA CCC CCG CCU
글루타민 Q Gln CAA CAG
아르기닌 R Arg AGA AGG CGA CGC CGG CGU
세린 S Ser AGC AGU UCA UCC UCG UCU
트레오닌 T Thr ACA ACC ACG ACU
발린 V Val GUA GUC GUG GUU
트립토판 W Trp UGG
티로신 Y Tyr UAC UAU
생물 활성을 없애지 않으면서 치환, 삽입 또는 결실시킬 수 있는 아미노산 잔기를 결정하는 지침은 당해 분야에 주지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 DNASTAR™ 소프트웨어를 사용하여 찾을 수 있다. 바람직하게, 본 명세서에 개시된 단백질 변이체 중 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉 유사하게 하전되거나 하전되지 않은 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 측쇄와 관련된 아미노산과 중 하나의 치환을 수반한다. 천연 아미노산은 일반적으로 4개의 과로 분류된다: 산성(아스파테이트, 글루타메이트), 염기성(리신, 아르기닌, 히스티딘), 비-극성(알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 및 하전되지 않은 극성(글리신, 아스파라진, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신) 아미노산. 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로서 공동으로 분류된다. 펩티드 또는 단백질에서, 아미노산의 적합한 보존적 치환은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있으며 일반적으로, 생성되는 분자의 생물 활성의 변경 없이 이루어질 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 일반적으로 폴리펩티드의 불필수 영역 중 단일 아미노산 치환이 생물 활성을 실질적으로 변경시키지 않음을 인식한다(예를 들어 문헌[Watson et al . Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224]을 참조하시오). 예시적인 보존적 치환은 미국 가 특허 출원 제 61/241,647 호에 기재되어 있으며, 그의 내용은 본 명세서에 참고로 인용된다.
상기와 같은 변화의 생성에서, 아미노산의 수치료 지수를 고려할 수 있다. 단백질에 대한 상호작용성 생물학적 기능의 부여에 있어서 아미노산 수치료 지수의 중요성은 당해 분야에서 일반적으로 이해되고 있다(본 명세서에 참고로 인용된 문헌[Kyte and Doolittle, 1982]). 각각의 아미노산은 그의 소수성 및 전하 특성을 기준으로 수치료 지수가 할당되었다(Kyte and Doolittle, 1982). 상기 값은 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스테인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라진(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5)이다.
몇몇 아미노산을 유사한 수치료 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환시킬 수 있고 여전히 유사한 생물 활성을 갖는 단백질이 생성될 수 있음, 즉 여전히 생물학적 기능이 동등한 단백질을 수득할 수 있음이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기와 같은 변화의 생성에서, 수치료 지수가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, ±1 이내의 경우가 특히 바람직하고, ±0.5 이내의 경우가 훨씬 더 특히 바람직하다. 유사한 아미노산들의 치환이 친수성을 근거로 유효하게 이루어질 수 있음이 또한 당해 분야에서 이해된다.
미국특허 제 4,554,101 호에 상세히 기재된 바와 같이, 하기의 친수성 값이 아미노산 잔기들에 할당되었다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라진(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산을 유사한 친수성 값을 갖는 또 다른 것으로 치환시킬 수 있으며 여전히 생물학적으로 동등한, 및 특히 면역학적으로 동등한 단백질을 수득할 수 있는 것으로 이해된다. 상기와 같은 변화에서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, ±1 이내의 경우가 특히 바람직하고, ±0.5 이내의 경우가 훨씬 더 특히 바람직하다.
상기에 개략된 바와 같이, 아미노산 치환은 상기 아미노산 측쇄 치환체의 상대적인 유사성, 예를 들어 그들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초할 수 있다.
폴리펩티드 변이체는 글리코실화된 형태, 다른 분자와의 집합적인 접합체, 및 관련되지 않은 화학적 모이어티(예를 들어 peg화된 분자)와의 공유 접합체를 추가로 포함한다. 공유 변이체는 당해 분야에 공지된 바와 같이, 아미노산 쇄 중에서 또는 N- 또는 C-말단 잔기에서 발견되는 기들에 작용기를 결합시킴으로써 제조될 수 있다. 변이체는 또한 대립유전자 변이체, 종 변이체, 및 뮤테인을 포함한다. 단백질의 기능 활성에 영향을 미치지 않는 영역의 절두 또는 결실이 또한 변이체이다.
하나의 실시태양에서, 2개 이상의 폴리펩티드의 발현을 원하는 경우, 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 본 명세서의 다른 어딘가에서 논의된 바와 같은 IRES 서열에 의해 분리시킬 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 2개 이상의 폴리펩티드를 하나 이상의 자기-절단성 폴리펩티드 서열을 포함하는 융합 단백질로서 발현시킬 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 융합 폴리펩티드 및 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 CAR을 제공한다. 융합 폴리펩티드 및 융합 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 이상의 폴리펩티드 분절(segment)을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 융합 폴리펩티드는 전형적으로 C-말단이 N-말단에 결합되지만, 또한 C-말단이 C-말단에, N-말단이 N-말단에, 또는 N-말단이 C-말단에 결합될 수도 있다. 상기 융합 단백질의 폴리펩티드는 임의의 순서 또는 명시된 순서로 존재할 수 있다. 융합 폴리펩티드 또는 융합 단백질은 또한 상기 융합 폴리펩티드의 목적하는 전사 활성이 보존되는 한, 보존적으로 변형된 변이체, 다형성 변이체, 대립유전자, 돌연변이체, 하위서열, 및 종간 상동체를 포함할 수 있다. 융합 폴리펩티드를 화학적 합성 방법에 의해서 또는 2개의 모이어티간의 화학적 결합에 의해서 생성시키거나 또는 일반적으로 다른 표준 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 상기 융합 폴리펩티드를 포함하는 결찰된(ligated) DNA 서열들을 본 명세서의 다른 어딘가에 논의된 바와 같은 적합한 전사 또는 번역 조절 요소들에 작동적으로 연결시킨다.
하나의 실시태양에서, 융합 짝은 단백질이 고유 재조합 단백질보다 더 높은 수준으로 발현되는 것을 돕는 서열(발현 인헨서)을 포함한다. 다른 융합 짝들은 상기 단백질의 용해도를 증가시키거나 또는 상기 단백질이 목적하는 세포내 구획에 표적화될 수 있게 하거나 또는 세포막을 통한 상기 융합 단백질의 수송을 촉진하도록 선택될 수 있다.
융합 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 각각의 폴리펩티드 도메인들 사이에 폴리펩티드 절단 신호를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 폴리펩티드 부위를 임의의 링커 펩티드 서열내에 넣을 수 있다. 예시적인 폴리펩티드 절단 신호는 폴리펩티드 절단 인식 부위, 예를 들어 프로테아제 절단 부위, 뉴클레아제 절단 부위(예를 들어 드문 제한 효소 인식 부위, 자기-절단 리보자임 인식 부위), 및 자기-절단 바이러스 올리고펩티드(문헌[deFelipe and Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26]을 참조하시오)를 포함한다.
적합한 프로테아제 절단 부위 및 자기-절단 펩티드는 숙련가에게 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Ryan et al ., 1997. J. Gener . Virol . 78, 699-722]; 문헌[Scymczak et al. (2004) Nature Biotech. 5, 589-594]을 참조하시오). 예시적인 프로테아제 절단 부위는 비제한적으로 포티바이러스 NIa 프로테아제(예를 들어 담배 식각(tobacco etch) 바이러스 프로테아제), 포티바이러스 HC 프로테아제, 포티바이러스 P1(P35) 프로테아제, 비요바이러스(byovirus) NIa 프로테아제, 비요바이러스 RNA-2-암호화된 프로테아제, 앱토바이러스(aphthovirus) L 프로테아제, 엔테로바이러스 2A 프로테아제, 리노바이러스 2A 프로테아제, 피코르나 3C 프로테아제, 코모바이러스 24K 프로테아제, 네포바이러스(nepovirus) 24K 프로테아제, RTSV(벼 해충 구상 바이러스(rice tungro spherical virus)) 3C-형 프로테아제, PYVF(파스닙 황색 얼룩 바이러스) 3C-형 프로테아제, 헤파린, 트롬빈, 인자 Xa 및 엔테로키나제의 절단 부위를 포함한다. 하나의 실시태양에서 TEV(담배 식각 바이러스) 프로테아제 절단 부위가 그의 높은 절단 엄격성으로 인해 바람직하다, 예를 들어 EXXYXQ(G/S) (서열번호 57), 예를 들어 ENLYFQG (서열번호 58) 및 ENLYFQS (서열번호 59), 여기에서 X는 임의의 아미노산을 나타낸다(Q와 G 또는 Q와 S 사이에서 TEV에 의한 절단이 발생한다).
특정한 실시태양에서, 자기-절단 펩티드는 포티바이러스 및 카디오바이러스 2A 펩티드, FMDV(구제역 바이러스), 말 A형 비염 바이러스, 해충 고착(Thosea asigna) 바이러스 및 돼지 테스코바이러스로부터 획득된 폴리펩티드 서열들을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 상기 자기-절단 폴리펩티드 부위는 2A 또는 2A-유사 부위, 서열 또는 도메인을 포함한다(Donnelly et al ., 2001. J. Gen . Virol. 82:1027-1041).
예시적인 2A 부위는 하기의 서열들을 포함한다:
서열번호 60 LLNFDLLKLAGDVESNPGP
서열번호 61 TLNFDLLKLAGDVESNPGP
서열번호 62 LLKLAGDVESNPGP
서열번호 63 NFDLLKLAGDVESNPGP
서열번호 64 QLLNFDLLKLAGDVESNPGP
서열번호 65 APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
서열번호 66 VTELLYRMKRAETYCPRPLLAIHPTEARHKQKIVAPVKQT
서열번호 67 LNFDLLKLAGDVESNPGP
서열번호 68 LLAIHPTEARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
서열번호 69 EARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
바람직한 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 폴리펩티드는 CAR 폴리펩티드를 포함한다.
E. 폴리뉴클레오티드
바람직한 실시태양에서, 하나 이상의 CAR 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 서열번호 30-44, 70 및 72를 제공한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"이란 용어는 전령 RNA(mRNA), RNA, 게놈 RNA(gRNA), 플러스 가닥 RNA(RNA(+)), 마이너스 가닥 RNA(RNA(-)), 게놈 DNA(gDNA), 상보성 DNA(cDNA) 또는 재조합 DNA를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 단일 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 명세서(예를 들어 서열 목록을 참조하시오)에 기재된 참조 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 변이체를 포함하며, 전형적으로 이때 상기 변이체는 상기 참조 서열의 적어도 하나의 생물 활성을 유지한다. 다양한 예시적인 실시태양에서, 본 발명은, 부분적으로, 발현 벡터, 바이러스 벡터, 및 전달 플라스미드를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기를 포함하는 조성물 및 세포를 고려한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 적어도 약 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 1000, 1250, 1500, 1750, 또는 2000 또는 그 이상의 연속적인 아미노산 잔기뿐만 아니라 모든 중간 길이의 아미노산 잔기들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이와 관련하여 "중간 길이"는 상기 인용된 값들 사이의 임의의 길이, 예를 들어 6, 7, 8, 9 등, 101, 102, 103 등; 151, 152, 153 등; 201, 202, 203 등을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "폴리뉴클레오티드 변이체" 및 "변이체" 등의 용어는 참조 폴리뉴클레오티드 서열과 실질적인 서열 일치성을 나타내는 폴리뉴클레오티드 또는 본 명세서에서 이후에 정의되는 엄격성 조건하에서 참조 서열과 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이들 용어는 하나 이상의 뉴클레오티드가 참조 폴리뉴클레오티드에 비해 부가 또는 결실되었거나 또는 상이한 뉴클레오티드로 치환된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이에 관하여, 돌연변이, 부가, 결실 및 치환을 포함한 몇몇 변경들을 참조 폴리뉴클레오티드에 대해 수행할 수 있으며, 이때 상기 변경된 폴리뉴클레오티드가 상기 참조 폴리뉴클레오티드의 생물 기능 또는 활성을 유지함은 당해 분야에서 충분히 이해된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "서열 일치성" 또는 예를 들어 "에 50% 일치하는 서열"을 포함하는 인용은 서열들이 비교창에 걸쳐 뉴클레오티드 하나하나 또는 아미노산 하나하나에 일치하는 정도를 지칭한다. 따라서, "서열 일치성 비율"을, 2개의 최적으로 정렬된 서열들을 비교창에 걸쳐 비교하고, 일치하는 핵산 염기(예를 들어 A, T, C, G, I) 또는 일치하는 아미노산 잔기(예를 들어 Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 상기 두 서열 모두에 존재하는 위치들의 수를 측정하여 매치된(matched) 위치의 수를 제공하고, 상기 매치된 위치의 수를 비교창 중의 전체 위치의 수(즉 창 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 일치성의 비율을 제공함으로써 계산할 수 있다. 본 명세서에 기재된 참조 서열 중 어느 하나에 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하며, 전형적으로 상기 폴리펩티드 변이체는 상기 참조 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물 활성을 유지한다.
2개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드간의 서열 관계를 기술하는데 사용되는 용어는 "참조 서열", "비교창", "서열 일치성", "서열 일치성의 비율" 및 "실질적인 일치성"을 포함한다. "참조 서열"은 적어도 12, 그러나 흔히는 15 내지 18 및 종종 적어도 25개의, 뉴클레오티드 및 아미노산 잔기를 포함한 단량체 단위의 길이이다. 2개의 폴리뉴클레오티드는 각각 (1) 상기 두 폴리뉴클레오티드간에 유사한 서열(즉 완전한 폴리뉴클레오티드 서열의 단지 일부), 및 (2) 상기 두 폴리뉴클레오티드간에 상이한 서열을 포함할 수 있기 때문에, 상기 두(또는 그 이상) 폴리뉴클레오티드간의 서열 비교를 전형적으로는 상기 두 폴리뉴클레오티드의 서열들을 "비교창"에 걸쳐 비교하여 서열 유사성의 국소 영역을 식별하고 비교함으로써 수행한다. "비교창"은 적어도 6개의 연속적인 위치, 대개는 약 50 내지 약 100개, 보다 대개는 약 100 내지 약 150개 위치의 개념상 분절을 지칭하며 여기에서 두 서열을 최적으로 정렬시킨 후에 하나의 서열을 동일한 수의 연속적인 위치의 참조 서열과 비교한다. 상기 비교창은 상기 두 서열의 최적의 정렬을 위해서 참조 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않는다)에 비해 약 20% 이하의 부가 또는 결실(즉 갭)을 포함할 수 있다. 비교창의 정렬을 위한 서열들의 최적의 정렬을, 컴퓨터화된 연산의 실행[위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 릴리스 7.0(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0)(제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 사이언스 드라이브 매디슨 575 소재)에서 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA]에 의해서, 또는 선택된 다양한 방법들 중 어느 하나에 의해 발생한 검사 및 최선의 정렬(즉 상기 비교창에 걸쳐 가장 높은 상동성 비율을 생성시키는)에 의해서 수행할 수 있다. 또한 예를 들어 문헌[Altschul et al ., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389]에 개시된 바와 같은 프로그램들의 BLAST과를 참조할 수 있다. 서열 분석에 대한 상세한 논의를 문헌[Unit 19.3 of Ausubel et al ., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15]에서 찾을 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단리된 폴리뉴클레오티드"는 천연 상태에서 인접한 서열들로부터 정제된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 통상적으로 인접된 서열로부터 제거된 DNA 단편을 지칭한다. "단리된 폴리뉴클레오티드"는 또한, 자연에서 존재하지 않고 인공으로 제조된 상보성 DNA(cDNA), 재조합 DNA 또는 다른 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
폴리뉴클레오티드의 배향을 기술하는 용어들은 5'(통상적으로 유리 포스페이트기를 갖는 폴리뉴클레오티드의 단부) 및 3'(통상적으로 유리 하이드록실(OH)기를 갖는 폴리뉴클레오티드의 단부)를 포함하다. 폴리뉴클레오티드 서열을 5'에서 3' 배향 또는 3'에서 5' 배향으로 어노테이션할 수 있다. DNA 및 mRNA의 경우, 상기 5'에서 3' 가닥은 그의 서열이 전전령(premRNA)[RNA에서 우라실(U) 제외, DNA에서 티민(T) 대신]의 서열에 일치하기 때문에 "센스", "플러스", 또는 "암호화" 가닥으로 표시된다. DNA 및 mRNA의 경우, RNA 폴리머라제에 의해 전사되는 가닥인 상보성 3'에서 5' 가닥은 "주형", "안티센스", "마이너스" 또는 "비-암호화" 가닥으로서 표시된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "역 배향"이란 용어는 3'에서 5' 배향으로 작성된 5'에서 3' 서열 또는 5'에서 3' 배향으로 작성된 3'에서 5' 서열을 지칭한다.
"상보적인" 및 "상보성"이란 용어는 염기-쌍 규칙과 관련된 폴리뉴클레오티드(즉 뉴클레오티드의 서열)를 지칭한다. 예를 들어 DNA 서열 5' A G T C A T G 3'의 상보성 가닥은 3' T C A G T A C 5'이다. 나중의 서열은 종종 좌측에 5' 단부 및 우측에 3' 단부를 갖는 역 보체, 5' C A T G A C T 3'로서 작성된다. 역 보체와 동등한 서열을 회문성 서열이라고 한다. 상보성은 "부분적"일 수 있으며, 여기에서 핵산 염기의 단지 일부만이 염기쌍 규칙에 따라 매치된다. 또는, 핵산들간에 "완전한" 또는 "전체" 상보성이 존재할 수 있다.
더욱이, 당해 분야의 통상적인 숙련가들은, 유전자 암호 축퇴성의 결과로서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 단편을 암호화하는 다수의 뉴클레오티드 서열이 존재함을 알 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드 중 일부는 임의의 고유 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대해 최소의 상동성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용의 차이로 인해 변하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 인간 및/또는 영장류 코돈 선택에 최적화된 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 의해 구체적으로 고려된다. 더욱이, 본 명세서에 제공된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자를 또한 사용할 수 있다. 대립유전자는 뉴클레오티드의 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 결실, 부가 및/또는 치환의 결과로서 변경되는 내인성 유전자이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "핵산 카세트"란 용어는 RNA, 및 후속으로 단백질을 발현할 수 있는 벡터내의 유전자 서열을 지칭한다. 상기 핵산 카세트는 관심 유전자, 예를 들어 CAR을 함유한다. 상기 핵산 카세트는 상기 벡터내에, 상기 카세트 중의 핵산이 RNA로 전사될 수 있고, 필요한 경우 단백질 또는 폴리펩티드로 번역되며, 형질전환된 세포에서 활성에 필요한 적합한 번역-후 변형을 겪고, 적합한 세포내 구획에의 표적화 또는 세포외 구획내로의 분비에 의해 생물 활성에 적합한 구획으로 전좌될 수 있도록 위치적으로 및 서열에 의해 배향된다. 바람직하게, 상기 카세트는 벡터에 바로 삽입되기에 적합한 3' 및 5' 단부를 갖는다. 예를 들어 상기는 각 단부에 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 핵산 카세트는 B 세포암의 치료에 사용되는 키메릭 항원 수용체의 서열을 함유한다. 상기 카세트를 제거하여 단일 유닛으로서 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 삽입할 수 있다.
특정한 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "관심 폴리뉴클레오티드"란 용어는 발현시키고자 하는 발현 벡터내로 삽입된, 폴리펩티드(즉 관심 폴리펩티드)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 벡터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 관심 폴리뉴클레오티드는 질병 또는 질환의 치료 또는 예방에 치료 효과를 제공하는 폴리펩티드를 암호화한다. 관심 폴리뉴클레오티드, 및 그로부터 암호화된 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 그의 기능상 변이체 및 단편을 모두 포함한다. 특정한 실시태양에서, 기능상 변이체는 상응하는 야생형 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 일치성을 갖는다. 몇몇 실시태양에서, 기능상 변이체 또는 단편은 상응하는 야생형 폴리펩티드의 생물 활성의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%를 갖는다.
하나의 실시태양에서, 상기 관심 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 암호화하지 않고 miRNA, siRNA, 또는 shRNA, 리보자임, 또는 다른 억제성 RNA를 전사하는 주형으로서 작용한다. 다양한 다른 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 CAR을 암호화하는 관심 폴리뉴클레오티드 및 비제한적으로 억제성 핵산 서열, 예를 들어 비제한적으로 siRNA, miRNA, shRNA 및 리보자임을 포함한 하나 이상의 추가적인 관심 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "siRNA" 또는 "짧은 간섭 RNA"란 용어는 동물에서 서열-특이성 전사-후 유전자 침묵화, 번역 억제, 전사 억제 또는 후성적 RNAi의 과정을 매개하는 짧은 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다(Zamore et al ., 2000, Cell, 101, 25-33; Fire et al ., 1998, Nature, 391, 806; Hamilton et al ., 1999, Science, 286, 950-951; Lin et al ., 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes & Dev., 13, 139-141; 및 Strauss, 1999, Science, 286, 886). 몇몇 실시태양에서, siRNA는 동일한 수의 뉴클레오시드를 갖는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하나; 상기 제1 및 제2 가닥은 상기 제1 및 제2 가닥상의 2개의 말단 뉴클레오시드가 상보성 가닥상의 잔기와 짝을 이루지 않도록 상쇄된다. 몇몇 경우에, 상기 짝을 이루지 않는 2개의 뉴클레오시드는 티미딘 잔기이다. 상기 siRNA는 상기 siRNA 또는 그의 단편이 표적 유전자의 하향 조절을 매개할 수 있도록, 표적 유전자에 충분한 상동성을 갖는 영역을 포함하고 뉴클레오티드에 관하여 충분한 길이를 가져야 한다. 따라서, siRNA는 표적 RNA에 적어도 부분적으로 상보성인 영역을 포함한다. 상기 siRNA와 표적간에 완벽한 상보성이 존재할 필요는 없지만, 상기 siRNA 또는 그의 절단 산물이 서열 특이성 침묵화를, 예를 들어 상기 표적 RNA의 RNAi 절단에 의해 지시할 수 있기에 충분한 상응성이 존재해야 한다. 표적 가닥과의 상보성, 또는 상기 가닥과의 상동성 정도가 안티센스 가닥에서 가장 중요하다. 특히 안티센스 가닥에서 완벽한 상보성이 종종 요구되지만, 일부 실시태양은 상기 표적 RNA에 관하여 하나 이상, 바람직하게는 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 또는 더 적은 미스매치(mismatch)를 포함한다. 상기 미스매치는 말단 영역에서 가장 허용되며, 존재하는 경우 바람직하게는 말단 영역 또는 영역들, 예를 들어 5' 및/또는 3' 말단의 6, 5, 4 또는 3개 뉴클레오티드내에서 허용된다. 센스 가닥은 단지 안티센스 가닥과, 상기 분자의 전체적인 이중-가닥 특성을 유지시키기에 충분한 상보성만이 필요할 뿐이다.
또한, siRNA는 변형되거나 또는 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. siRNA의 단일가닥 영역은 변형되거나 또는 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다, 예를 들어 헤어핀 구조의 짝없는 영역 또는 영역들, 예를 들어 2개의 상보성 영역들을 결합시키는 영역이 변형 또는 뉴클레오시드 유사체를 가질 수 있다. siRNA의 하나 이상의 3'- 또는 5'-말단을, 예를 들어 엑소뉴클레아제에 대해 안정화시키는, 또는 안티센스 siRNA제가 RISC내로 진입하는 것을 촉진시키는 변형이 또한 유용하다. 변형은 C3(또는 C6, C7, C12) 아미노 링커, 티올 링커, 카복실 링커, 비-뉴클레오티드 스페이서(C3, C6, C9, C12, 무염기성, 트리에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜), 포스포아미다이트이고 또 다른 DMT-보호된 하이드록실기를 갖는 특수 비오틴 또는 플루오레세인 시약을 포함하여, RNA 합성 동안 다수의 커플링을 허용할 수 있다. siRNA의 각 가닥은 30, 25, 24, 23, 22, 21 또는 20 뉴클레오티드 이하 길이일 수 있다. 상기 가닥은 바람직하게는 적어도 19 뉴클레오티드 길이이다. 예를 들어, 각각의 가닥은 21 내지 25 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 바람직한 siRNA는 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오티드 쌍의 듀플렉스 영역, 및 2 내지 3 뉴클레오티드의 하나 이상의 오버행, 바람직하게는 2 내지 3 뉴클레오티드의 하나 또는 2개의 3' 오버행을 갖는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "miRNA" 또는 "마이크로RNA"란 용어는 전형적으로, 프리-miRNA로서 공지된 ∼70 뉴클레오티드 폴드백(foldback) RNA 전구체 구조로부터 절제된, 20 내지 22 뉴클레오티드의 작은 비-암호화 RNA를 지칭한다. miRNA는 그의 표적들을 상기 miRNA와 상기 표적간의 상보성 정도에 따라 2가지 방식 중 하나로 음으로 조절한다. 먼저, 단백질-암호화 mRNA 서열에 완벽한 또는 거의 완벽한 상보성으로 결합하는 miRNA는 RNA-매개된 간섭(RNAi) 경로를 유도한다. mRNA 표적의 3' 번역되지 않은 영역(UTR)내 불완전한 상보성 부위에 결합함으로써 조절 효과를 발휘하는 miRNA는 표적-유전자 발현을 전사-후에, 명백하게 번역 수준에서, RNAi 경로에 사용되는 것과 유사하거나 또는 어쩌면 동일한 RISC 복합체를 통해 억제한다. 번역 조절과 일관되게, 상기 기전을 사용하는 miRNA는 그의 표적 유전자의 단백질 수준을 감소시키나, 상기 유전자의 mRNA 수준은 단지 최소로 영향을 받을 뿐이다. miRNA는 천연 miRNA뿐만 아니라 임의의 mRNA 서열을 특이적으로 표적화할 수 있는 인공적으로 디자인된 miRNA 모두를 포함한다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서, 숙련가는 인간 miRNA(예를 들어 miR-30 또는 miR-21) 주 전사물로서 발현된 짧은 헤어핀 RNA 구조를 디자인할 수 있다. 상기 디자인은 상기 헤어핀 구조물에 드로샤(Drosha) 가공 부위를 더하며 이는 녹다운 효율을 크기 증가시키는 것으로 나타났다(Pusch et al., 2004). 상기 헤어핀 줄기는 22-nt의 dsRNA(예를 들어 안티센스는 목적하는 표적에 완벽한 상보성을 갖는다) 및 인간 miR로부터의 15 내지 19-nt 고리로 이루어진다. 상기 miR 고리 및 miR30 인접 서열을 상기 헤어핀의 어느 한쪽 또는 양쪽 모두에 가하여, 마이크로RNA가 없는 통상적인 shRNA 디자인에 비해 상기 발현된 헤어핀의 드로샤 및 다이서(Dicer) 가공을 10배 넘게 증가시킨다. 증가된 드로샤 및 다이서 가공은 보다 큰 siRNA/miRNA 생성 및 발현된 헤어핀에 대한 보다 큰 효능으로 번역된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "shRNA" 또는 "짧은 헤어핀 RNA"란 용어는 단일의 자기-상보성 RNA 가닥에 의해 형성되는 이중-가닥 구조를 지칭한다. 표적 유전자의 암호화 또는 비-암호화 서열 중 어느 하나의 일부에 일치하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 shRNA 구조물이 억제에 바람직하다. 상기 표적 서열에 비해 삽입, 결실 및 단일 점 돌연변이를 갖는 RNA 서열이 또한 억제에 유효한 것으로 밝혀졌다. 상기 표적 유전자의 일부와 억제성 RNA간에 90% 초과의 서열 일치성, 또는 심지어 100% 서열 일치성이 바람직하다. 몇몇 바람직한 실시태양에서, shRNA의 듀플렉스-형성 부분의 길이는 적어도 20, 21 또는 22 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 다이서-의존성 절단에 의해 생성된 RNA 산물에 상응하는 크기이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 shRNA 구조물은 적어도 25, 50, 100, 200, 300 또는 400 염기 길이이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 shRNA 구조물은 400 내지 800 염기 길이이다. shRNA 구조물은 고리 서열 및 고리 크기의 변화에 매우 허용성이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "리보자임"이란 용어는 표적 mRNA의 부위-특이성 절단이 가능한 촉매 활성 RNA 분자를 지칭한다. 다수의 하위유형, 예를 들어 해머헤드 및 헤어핀 리보자임이 개시되었다. 리보자임 촉매 활성 및 안정성을, 비촉매 염기에서 데옥시리보뉴클레오티드를 리보뉴클레오티드 대신 치환시킴으로써 개선시킬 수 있다. 부위-특이성 인식 서열에서 mRNA를 절단하는 리보자임을 사용하여 특정한 mRNA를 파괴할 수 있지만, 해머헤드 리보자임의 사용이 바람직하다. 해머헤드 리보자임은 mRNA를, 표적 mRNA와 상보성 염기쌍을 형성하는 영역들과의 인접에 의해 지시된 위치에서 절단한다. 유일한 요건은 상기 표적 mRNA가 하기 2개 염기의 서열: 5'-UG-3'을 갖는 것이다. 해머헤드 리보자임의 구성 및 생성은 당해 분야에 주지되어 있다.
siRNA, miRNA, shRNA, 또는 리보자임을 포함하는 관심 폴리뉴클레오티드의 바람직한 전달 방법은 본 명세서에서 다른 어딘가에 기재된 바와 같은, 하나 이상의 조절 서열, 예를 들어 강한 구성(constitutive) pol III, 예를 들어 인간 U6 snRNA 프로모터, 마우스 U6 snRNA 프로모터, 인간 및 마우스 H1 RNA 프로모터 및 인간 tRNA-val 프로모터, 또는 강한 구성 pol II 프로모터를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 암호화 서열 자체의 길이와 상관 없이, 본 명세서에서 다른 어딘가에 개시되거나 당해 분야에 공지된 바와 같은, 다른 DNA 서열, 예를 들어 프로모터 및/또는 인헨서, 번역되지 않은 영역(UTR), 신호 서열, 코작 서열, 폴리아데닐화 신호, 추가적인 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 리콤비나제 인식 부위(예를 들어 LoxP, FRT, 및 Att 부위), 종결 코돈, 전사 종결 신호, 및 자기-절단 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 에피토프 태그와 결합될 수 있으며, 따라서 이들의 전체 길이는 상당히 다양할 수 있다. 따라서, 거의 모든 길이의 폴리뉴클레오티드 단편이 사용될 수 있으며, 이때 전체 길이는 바람직하게는 제조의 용이성 및 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 용도에 의해 제한되는 것으로 생각된다.
폴리뉴클레오티드를 당해 분야에 공지되고 입수 가능한 충분히 확립된 다양한 기법들 중 어느 하나를 사용하여 제조, 조작 및/또는 발현시킬 수 있다. 목적하는 폴리펩티드를 발현시키기 위해서, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 적합한 벡터에 삽입할 수 있다. 벡터의 예는 플라스미드, 자율 복제 서열, 및 전이요소이다. 추가의 예시적인 벡터는 비제한적으로 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 예를 들어 효모 인공 염색체(YAC), 세균 인공 염색체(BAC), 또는 P1-유래된 인공 염색체(PAC), 박테리오파지, 예를 들어 람다 파지 또는 M13 파지, 및 동물 바이러스를 포함한다. 벡터로서 유용한 동물 바이러스의 범주의 예는 비제한적으로 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어 헤르페스 단순 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 파필로마바이러스, 및 파포바이러스(예를 들어 SV40)를 포함한다. 발현 벡터의 예는 포유동물 세포에서의 발현을 위한 pClneo 벡터(프로메가(Promega)); 포유동물에서 렌티바이러스-매개된 유전자 전달 및 발현을 위한 pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™, 및 pLenti6.2/V5-GW/lacZ(인비트로젠(Invitrogen))이다. 특정한 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 키메릭 단백질의 암호화 서열을, 포유동물 세포에서 상기 키메릭 단백질의 발현을 위해 상기와 같은 발현 벡터에 결찰시킬 수 있다.
특정한 실시태양에서, 상기 벡터는 에피솜 벡터 또는 염색체외에서 유지되는 벡터이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "에피솜"이란 용어는 숙주의 염색체 DNA내로의 통합 없이 및 분열하는 숙주 세포로부터의 점진적인 손실 없이 복제할 수 있는 벡터를 지칭하며, 이는 또한 상기 벡터가 염색체외에서 또는 에피솜에서 복제함을 의미한다. 상기 벡터를, DNA 복제 기원을 암호화하는 서열 또는 림프친화성(lymphotrophic) 헤르페스 바이러스 또는 감마 헤르페스바이러스, 아데노바이러스, SV40, 소 유두종 바이러스, 또는 효모로부터의 "ori", 구체적으로 EBV의 oriP에 상응하는 림프친화성 헤르페스 바이러스 또는 감마 헤르페스바이러스의 복제 기원을 갖도록 조작한다. 특정한 태양에서, 상기 림프친화성 헤르페스 바이러스는 엡스타인 바 바이러스(EBV), 카포시 육종 헤르페스 바이러스(KSHV), 헤르페스 바이러스 다람쥐원숭이(HS), 또는 마렉병 바이러스(MDV)일 수 있다. 엡스타인 바 바이러스(EBV) 및 카포시 육종 헤르페스 바이러스(KSHV)가 또한 감마 헤르페스바이러스의 예이다. 전형적으로, 상기 숙주 세포는 상기 복제를 활성화하는 바이러스 복제 트랜스활성제 단백질을 포함한다.
발현 벡터 중에 존재하는 "통제 요소" 또는 "조절 서열"은 상기 벡터의 번역되지 않은 영역 - 복제 기원, 선택 카세트, 프로모터, 인헨서, 번역 개시 신호(샤인 달가르노 서열 또는 코작 서열) 인트론, 폴리아데닐화 서열, 5' 및 3' 번역되지 않은 영역(이들은 숙주 세포 단백질과 상호작용하여 전사 및 번역을 수행한다)이다. 상기와 같은 요소들은 그들의 강도 및 특이성이 다양할 수 있다. 상기 사용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라, 편재하는 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함한 임의의 수의 적합한 전사 및 번역 요소들이 사용될 수 있다.
특정한 실시태양에서, 비제한적으로 발현 벡터 및 바이러스 벡터를 포함한 본 발명의 실시에 사용하기 위한 벡터는 외인성, 내인성 또는 이종 조절 서열, 예를 들어 프로모터 및/또는 인헨서를 포함할 것이다. "내인성" 조절 서열은 게놈 중 주어진 유전자와 자연적으로 결합되는 것이다. "외인성" 조절 서열은 유전자의 전사가 결합된 인헨서/프로모터에 의해 지시되도록 유전자 조작(즉 분자 생물학적 기법)에 의해 상기 유전자에 나란히 놓인 것이다. "이종" 대조용 서열은 유전자 조작되는 세포와 상이한 종으로부터의 외인성 서열이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "프로모터"란 용어는 RNA 폴리머라제가 결합하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)의 인식 부위를 지칭한다. RNA 폴리머라제는 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드를 개시시키고 전사한다. 특정한 실시태양에서, 포유동물 세포에서 작동성인 프로모터는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역 및/또는 전사의 출발로부터 70 내지 80 염기 상류에서 발견되는 또 다른 서열, CNCAAT 영역(여기에서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다)을 포함한다.
"인헨서"란 용어는 증대된 전사를 제공할 수 있는 서열을 함유하고 일부의 경우에 또 다른 조절 서열에 비해 배향 독립적으로 기능할 수 있는 DNA의 분절을 지칭한다. 인헨서는 프로모터 및/또는 다른 인헨서 요소와 협동적으로 또는 부가적으로 기능할 수 있다. "프로모터/인헨서"란 용어는 프로모터와 인헨서 기능을 모두 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA의 분절을 지칭한다.
"작동적으로 연결된"이란 용어는 기재된 성분들이 그들을 그들이 의도하는 방식으로 기능하게 하는 관계에 있는 병렬 배치를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 상기 용어는 핵산 발현 조절 서열(예를 들어 프로모터, 및/또는 인헨서)과 제2 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어 관심 폴리뉴클레오티드간의 기능성 결합을 지칭하며, 여기에서 상기 발현 조절 서열은 상기 핵산의 전사를 상기 제2 서열에 상응하게 지시한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "구성적(constitutive) 발현 조절 서열"이란 용어는 작동적으로 연결된 서열의 전사를 연속적으로 또는 연속해서 허용하는 프로모터, 엔헨서, 또는 프로모터/인헨서를 지칭한다. 구성적 발현 조절 서열은 각각, 광범위하게 다양한 세포 및 조직 유형에서 발현을 허용하는 "편재하는(ubiquitous)" 프로모터, 인헨서 또는 프로모터/인헨서, 또는 제한된 다양한 세포 및 조직 유형에서 발현을 허용하는 "세포 특이성", "세포유형 특이성", "세포 계통 특이성" 또는 "조직 특이성" 프로모터, 인헨서 또는 프로모터/인헨서일 수 있다.
본 발명의 특정한 실시태양에 사용하기에 적합한 예시적인 편재하는 발현 조절 서열은 비제한적으로 거대세포바이러스(CMV) 전초기 프로모터, 바이러스 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들어 초기 또는 말기), 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR, 헤르페스 단순 바이러스(HSV)(티미딘 키나제) 프로모터, H5, P7.5, 및 우두 바이러스로부터 P11 프로모터, 신장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 초기 성장 반응 1((EGR1), 페리틴 H(FerH), 페리틴 L(FerL), 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH), 진핵생물 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1), 열 충격 70kDa 단백질 5(HSPA5), 열 충격 단백질 90kDa 베타, 구성원 1(HSP90B1), 열 충격 단백질 70kDa(HSP70), β-키네신(β-KIN), 인간 ROSA 26 유전자좌(Irions et al ., Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)), 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 거대세포바이러스 인헨서/치킨 β-액틴(CAG) 프로모터, β-액틴 프로모터 및 골수증식성 육종 바이러스 인헨서, 음성 조절 영역 결실된, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) 프로모터(Challita et al ., J Virol. 69(2):748-55 (1995))를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 MND 프로모터를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 인간 EF1a 유전자의 제1 인트론을 포함하는 EF1a 프로모터를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 인간 EF1a 유전자의 제1 인트론이 없는 EF1a 프로모터를 포함한다.
특정한 실시태양에서, T 세포 특이성 프로모터로부터 CAR을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 것이 바람직할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "조건적 발현"은 임의의 유형의 조건적 발현, 예를 들어 비제한적으로 유도성 발현; 억제성 발현; 특정한 생리학적, 생물학적 또는 질병 상태 등을 갖는 세포 또는 조직에서의 발현을 지칭할 수 있다. 이러한 정의는 세포 유형 또는 조직 특이성 발현을 제외하고자 하는 것은 아니다. 본 발명의 몇몇 실시태양은 관심 폴리뉴클레오티드의 조건적 발현을 제공한다, 예를 들어 세포, 조직, 유기체 등에, 상기 폴리뉴클레오티드가 발현되게 하거나 또는 상기 관심 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리뉴클레오티드의 발현의 증가 또는 감소를 야기하는 처리 또는 조건을 가함으로써 발현을 조절한다.
유도성 프로모터/시스템의 예시적인 예는 비제한적으로 스테로이드-유도성 프로모터, 예를 들어 글루코코르티코이드 또는 에스트로젠 수용체를 암호화하는 유전자에 대한 프로모터(상응하는 호르몬에 의한 처리에 의해 유도가능하다), 메탈로티오닌 프로모터(다양한 중금속에 의한 처리에 의해 유도가능하다), MX-1 프로모터(인터페론에 의해 유도가능하다), "유전자변환" 미페프리스톤-조절성 시스템(Sirin et al ., 2003, Gene, 323:67), 큐메이트 유도성 유전자 변환(WO 2002/088346), 테트라사이클린-의존성 조절 시스템 등을 포함한다.
조건적 발현을 또한 부위 특이성 DNA 리콤비나제를 사용하여 성취할 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시태양에 따라 상기 벡터는 부위 특이성 리콤비나제에 의해 매개되는 재조합을 위한 적어도 하나(전형적으로 2개)의 부위(들)를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "리콤비나제" 또는 "부위 특이성 리콤비나제"란 용어는 하나 이상의 재조합 부위(예를 들어 2, 3, 4, 5, 7, 10, 12, 15, 20, 30, 50개 등)를 수반하는 재조합 반응에 관련된 삭제성 또는 통합성 단백질, 효소, 보조-인자 또는 관련 단백질을 포함하며, 이들은 야생형 단백질(문헌[Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)]을 참조하시오), 또는 그의 돌연변이체, 유도체(예를 들어 상기 재조합 단백질 서열 또는 그의 단편을 함유하는 융합 단백질), 단편 및 변이체일 수 있다. 본 발명의 특정한 실시태양에 사용하기에 적합한 리콤비나제의 예시적인 예는 비제한적으로 Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, φC31, Cin, Tn3 리졸베이스, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1, 및 ParA를 포함한다.
상기 벡터는 광범위하게 다양한 부위 특이성 리콤비나제 중 어느 하나에 대한 하나 이상의 재조합 부위를 포함할 수 있다. 부위 특이성 리콤비나제에 대한 표적 부위는 또한 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터의 통합에 필요한 임의의 부위(들)에 대한 것임을 알아야 한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "재조합 서열", "재조합 부위" 또는 "부위 특이성 재조합 부위"란 용어는 리콤비나제가 인식하고 결합하는 특정 핵산 서열을 지칭한다.
예를 들어, Cre 리콤비나제에 대한 하나의 재조합 부위는 loxP이며, 이는 8 염기쌍 코어 서열의 측면에 인접한 2개의 13 염기쌍 역전된 반복부(상기 리콤비나제 결합 부위로서 작용함)를 포함하는 34 염기쌍 서열이다(문헌[Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527 (1994)]의 도 1을 참조하시오). 다른 예시적인 loxP 부위는 비제한적으로 lox511 (Hoess et al ., 1996; Bethke and Sauer, 1997), lox5171 (Lee and Saito, 1998), lox2272 (Lee and Saito, 1998), m2 (Langer et al ., 2002), lox71 (Albert et al ., 1995), 및 lox66 (Albert et al., 1995)을 포함한다.
FLP 리콤비나제에 적합한 인식 부위는 비제한적으로 FRT (McLeod, et al ., 1996), F1, F2, F3 (Schlake and Bode, 1994), F4, F5 (Schlake and Bode, 1994), FRT(LE) (Senecoff et al ., 1988), FRT(RE) (Senecoff et al., 1988)를 포함한다.
인식 서열의 다른 예는 attB, attP, attL 및 attR 서열이며, 이들은 리콤비나제 효소 λ 인테그라제, 예를 들어 파이-c31에 의해 인식된다. 상기 φC31 SSR은 이종형 부위 attB(34 bp 길이)와 attP(39 bp 길이) 사이에서만 재조합을 매개한다(Groth et al., 2000). 각각 세균 및 파지 게놈상의 파지 인테그라제에 대한 부착 부위들을 명명하는 attB 및 attP는 모두 φC31 동종이량체에 의해 결합되는 듯한 불완전한 역전된 반복부를 함유한다(Groth et al., 2000). 상기 생성물 부위, attL 및 attR은 추가의 φC31-매개된 재조합에 대해 유효하게 불활성이며(Belteki et al., 2003), 이는 상기 반응을 비가역적으로 만든다. 삽입을 촉매화하기 위해서, attB-함유 DNA를 게놈 attP 부위에 삽입하는 것이 attP 부위를 게놈 attB 부위에 삽입하는 것보다 더 쉬운 것으로 밝혀졌다(Thyagarajan et al., 2001; Belteki et al., 2003). 따라서, 전형적인 전략은 동종 재조합에 의해 attP-함유 "도킹 부위"를 한정된 유전자좌내로 위치시키고, 이어서 상기는 삽입을 위해 attB-함유 유입 서열과 짝을 이룬다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "내부 리보솜 진입 부위" 또는 "IRES"는 내부 리보솜의 시스트론(단백질 암호화 영역)의 개시 코돈, 예를 들어 ATG내로의 직접적인 진입을 촉진하고, 이에 의해 상기 유전자의 캡-독립적인 번역을 유도하는 요소이다. 예를 들어 문헌[Jackson et al ., 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83)] 및 문헌[Jackson and Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000]을 참조하시오. 특정한 실시태양에서, 본 발명에 의해 고려되는 벡터는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 다수의 폴리펩티드 각각의 효율적인 번역을 성취하기 위해서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 하나 이상의 IRES 서열 또는 자기-절제성 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 분리시킬 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "코작 서열"이란 용어는 mRNA의 상기 리보솜의 작은 서브유닛에의 초기 결합을 크게 촉진하고 번역을 증가시키는 짧은 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 공통(consensus) 코작 서열은 (GCC)RCCATGG이고, 여기에서 R은 퓨린(A 또는 G)이다(Kozak, 1986. Cell. 44(2):283-92, 및 Kozak, 1987. Nucleic Acids Res. 15(20):8125-48). 특정한 실시태양에서, 본 발명에 의해 고려되는 벡터는 공통 코작 서열을 갖고 목적하는 폴리펩티드, 예를 들어 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 갖는 세포는 직접적인 독성 및/또는 조절되지 않는 증식의 위험성을 감소시키기 위한 유도성 자살 유전자를 포함한, 자살 유전자를 사용한다. 특정한 태양에서, 상기 자살 유전자는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 세포를 갖는 숙주에 대해 면역원성이 아니다. 사용될 수 있는 자살 유전자의 몇몇 예는 카스파제-9 또는 카스파제-8 또는 시토신 데아미나제이다. 카스파제-9를 이량체화의 특이적인 화학적 유도인자(CID)를 사용하여 활성화시킬 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 벡터는 본 발명의 면역 효과기 세포, 예를 들어 T 세포가 생체내에서 음성 선택에 민감해지게 하는 유전자 분절을 포함한다. "음성 선택"은 주입된 세포가 개인의 생체내 조건의 변화의 결과로서 제거될 수 있음을 의미한다. 상기 음성 선택성 표현형은 투여된 작용제, 예를 들어 화합물에 민감성을 부여하는 유전자의 삽입으로부터 생성될 수 있다. 음성 선택성 유전자는 당해 분야에 공지되어 있으며, 특히 하기를 포함한다: 강시클로비어 민감성을 부여하는 헤르페스 단순 바이러스 I형 티미딘 키나제(HSV-I TK) 유전자(Wigler et al ., Cell 11:223, 1977); 세포성 하이포잔틴 포스프리보실트랜스퍼라제(HPRT) 유전자, 세포성 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(APRT) 유전자, 및 세균성 시토신 데아미나제(Mullen et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)).
일부 실시태양에서, 유전자 변형된 면역 효과기 세포, 예를 들어 T 세포는 시험관내에서 상기 음성 선택성 표현형의 세포를 선택할 수 있게 하는 양성 마커를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 양성 선택성 마커는, 숙주 세포내에 도입시 유전자를 운반하는 세포의 양성 선택을 허용하는 우성 표현형을 발현하는 유전자일 수 있다. 이러한 유형의 유전자는 당해 분야에 공지되어 있으며, 특히 하이그로마이신 B에 대한 내성을 부여하는 하이그로마이신-B 포스포트랜스퍼라제 유전자(hph), 항생제 G418에 대한 내성을 암호화하는 Tn5로부터의 아미노 글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자(neo 또는 aph), 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자, 아데노신 데아미나제 유전자(ADA), 및 다중-약물 내성(MDR) 유전자를 포함한다.
바람직하게, 상기 양성 선택성 마커 및 음성 선택성 요소는 상기 음성 선택성 요소의 상실이 또한 반드시 상기 양성 선택성 마커의 상실에 의해 동반되도록 연결된다. 훨씬 더 바람직하게, 상기 양성 및 음성 선택성 마커는 하나의 상실이 필수적으로 다른 것의 상실을 유도하도록 융합된다. 발현 산물로서 상술한 목적하는 양성 및 음성 선택성 특징을 모두 부여하는 폴리펩티드를 제공하는 융합된 폴리뉴클레오티드의 일례는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 티미딘 키나제 융합 유전자(HyTK)이다. 상기 유전자의 발현은 시험관내에서 양성 선택을 위한 하이그로마이신 B 내성, 및 생체내에서 음성 선택을 위한 강시클로비어 민감성을 부여하는 폴리펩티드를 제공한다. 문헌[Lupton S. D., et al, Mol. and Cell. Biology 1 1:3374- 3378, 1991]을 참조하시오. 또한, 바람직한 실시태양에서, 키메릭 수용체를 암호화하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 융합된 유전자, 특히 시험관내에서 양성 선택을 위한 하이그로마이신 B 내성, 및 생체내에서 음성 선택을 위한 강시클로비어 민감성을 부여하는 것들을 함유하는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 상기 문헌[Lupton, S.D. et al.(1991)]에 기재된 HyTK 레트로바이러스 벡터 중에 있다. 또한 우성 양성 선택성 마커와 음성 선택성 마커와의 융합으로부터 유도된 이기능성 선택성 융합 유전자의 용도를 기재하는, 에스 디 럽톤(S.D. Lupton)의 PCT US91/08442 및 PCT/US94/05601의 공보를 참조하시오.
바람직한 양성 선택성 마커는 hph, nco 및 gpt로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 유전자들로부터 유래되며, 바람직한 음성 선택성 마커는 시토신 데아미나제, HSV-I TK, VZV TK, HPRT, APRT 및 gpt로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 유전자로부터 유래된다. 특히 바람직한 마커는 양성 선택성 마커가 hph 또는 neo로 부터 유래되고 음성 선택성 마커는 시토신 데아미나제 또는 TK 유전자 또는 선택성 마커로부터 유래되는 이기능성 선택성 융합 유전자이다. 유도성 자살 유전자
F. 바이러스 벡터
특정한 실시태양에서, 세포(예를 들어 면역 효과기 세포)를 CAR을 암호화하는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터로 형질도입시킨다. 예를 들어, 면역 효과기 세포를, CD3ζ, CD28, 4-1BB, Ox40, 또는 이들의 임의의 조합의 세포내 신호전달 도메인과 함께, BCMA 폴리펩티드와 결합하는 인간화된 항-BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 암호화하는 벡터로 형질도입시킨다. 따라서, 이들 형질도입된 세포는 CAR-매개된 세포독성 반응을 이끌어낼 수 있다.
레트로바이러스는 유전자 전달을 위한 통상적인 도구이다(Miller, 2000, Nature. 357: 455-460). 특정한 실시태양에서, 레트로바이러스를 사용하여 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 전달한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "레트로바이러스"란 용어는 게놈 RNA를 선형 이중-가닥 DNA 사본으로 역전사하고 후속으로 그의 게놈 DNA를 숙주 게놈내로 공유적으로 통합시키는 RNA 바이러스를 지칭한다. 일단 상기 바이러스가 숙주 게놈내에 통합되면, 이를 "프로바이러스"라 칭한다. 상기 프로바이러스는 RNA 폴리머라제 II에 대한 주형으로서 작용하며 새로운 바이러스 입자를 생산하는데 필요한 구조 단백질 및 효소를 암호화하는 RNA 분자의 발현을 지시한다.
특정한 실시태양에 사용하기에 적합한 예시적인 레트로바이러스는 비제한적으로 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(M-MuLV), 몰로니 쥐 육종 바이러스(MoMSV), 하비 쥐 육종 바이러스(HaMuSV), 쥐 유방종양 바이러스(MuMTV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 고양이 백혈병 바이러스(FLV), 스푸마바이러스, 프리엔드 쥐 백혈병 바이러스, 쥐 줄기세포 바이러스(MSCV) 및 라우스 육종 바이러스(RSV)) 및 렌티바이러스를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "렌티바이러스"란 용어는 복합 레트로바이러스의 그룹(또는 속)을 지칭한다. 예시적인 렌티바이러스는 비제한적으로 HIV(인간 면역결핍 바이러스; HIV 1형 및 HIV 2형 포함); 비스나-메디 바이러스(VMV) 바이러스; 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV); 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역 결핍 바이러스(BIV); 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함한다. 하나의 실시태양에서, HIV계 벡터 주쇄(즉 HIV 시스-작용 서열 요소)가 바람직하다. 특정한 실시태양에서, 렌티바이러스를 사용하여 CAR을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 전달한다.
레트로바이러스 벡터 및 보다 특히 렌티바이러스 벡터를 본 발명의 특정한 실시태양의 실시에 사용할 수 있다. 상응하게, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "레트로바이러스" 또는 "레트로바이러스 벡터"는 각각 "렌티바이러스" 및 "렌티바이러스 벡터"를 포함함을 의미한다.
"벡터"는 본 명세서에서 또 다른 핵산 분자를 전달하거나 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는데 사용된다. 상기 전달된 핵산은 일반적으로 상기 벡터 핵산 분자에 연결된다, 예를 들어 상기 분자내로 삽입된다. 벡터는 세포에서 자율적인 복제를 지시하는 서열을 포함하거나, 또는 숙주 세포 DNA내로의 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 유용한 벡터는 예를 들어 플라스미드(예를 들어 DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포손, 코스미드, 세균 인공 염색체, 및 바이러스 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 예를 들어 복제 결함 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함한다.
당해 분야의 숙련가에게 자명한 바와 같이, "바이러스 벡터"란 용어는 전형적으로 핵산 분자(예를 들어 전달 플라스미드)의 세포 게놈내로의 전달 또는 통합을 촉진하는 바이러스-유래된 핵산 요소를 포함하는 상기 핵산 분자, 또는 핵산 전달을 매개하는 바이러스 입자를 지칭하는데 광범위하게 사용된다. 바이러스 입자는 전형적으로 다양한 바이러스 성분 및 때때로 또한 핵산(들) 이외의 숙주 세포 성분을 포함할 것이다.
바이러스 벡터란 용어는 핵산을 세포내로 전달할 수 있는 바이러스 또는 바이러스 입자 또는 상기 전달된 핵산 자체를 지칭할 수 있다. 바이러스 벡터 및 전달 플라스미드는 주로 바이러스로부터 유래된 구조적 및/또는 기능성 유전 요소를 함유한다. "레트로바이러스 벡터"란 용어는 주로 레트로바이러스로부터 유래된 구조적 및 기능성 유전 요소를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드 또는 그의 부분들을 지칭한다. "렌티바이러스 벡터"란 용어는 주로 렌티바이러스로부터 유래된 LTR을 포함한 구조적 및 기능성 유전 요소를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드, 또는 그의 부분들을 지칭한다. "하이브리드 벡터"란 용어는 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스 서열 및 비-렌티바이러스 바이러스 서열을 모두 함유하는 벡터, LTR 또는 다른 핵산을 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 하이브리드 벡터는 역전사, 복제, 통합 및/또는 패키징을 위한 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스 서열을 포함하는 벡터 또는 전달 플라스미드를 지칭한다.
특정한 실시태양에서, "렌티바이러스 벡터", "렌티바이러스 발현 벡터"란 용어는 렌티바이러스 전달 플라스미드 및/또는 감염성 렌티바이러스 입자를 지칭하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 클로닝 부위, 프로모터, 조절 요소, 이종 핵산 등을 지칭하는 경우, 이들 요소의 서열은 RNA 형태로 본 발명의 렌티바이러스 입자 중에 존재하고 본 발명의 DNA 플라스미드 중에 DNA 형태로 존재하는 것으로 생각된다.
상기 프로바이러스의 각 단부에 "긴 말단 반복부" 또는 "LTR"이라 칭하는 구조가 존재한다. "긴 말단 반복부(LTR)"란 용어는 레트로바이러스 DNA의 단부에 위치하는 염기쌍의 도메인을 지칭하며, 그의 천연 서열과 관련하여 직접적인 반복부이고 U3, R 및 U5 영역을 함유한다. LTR은 일반적으로 레트로바이러스 유전자의 발현(예를 들어 유전자 전사물의 촉진, 개시 및 폴리아데닐화) 및 바이러스 복제에 근본적인 기능들을 제공한다. 상기 LTR은 전사 조절 요소, 폴리아데닐화 신호 및 바이러스 게놈의 복제 및 통합에 필요한 서열을 포함한 다수의 조절 신호들을 함유한다. 상기 바이러스 LTR은 U3, R 및 U5라 칭하는 3개의 영역으로 분류된다. 상기 U3 영역은 인헨서 및 프로모터 요소를 함유한다. 상기 U5 영역은 프라이머 결합 부위와 R 영역 사이의 서열이고 폴리아데닐화 서열을 함유한다. 상기 R(반복) 영역은 U3 및 U5 영역에 인접해 있다. 상기 LTR은 U3, R 및 U5 영역으로 구성되며 바이러스 게놈의 5' 및 3' 단부 모두에 존재한다. 상기 5' LTR에 인접하여 게놈의 역전사(tRNA 프라이머 결합 부위) 및 입자내로의 바이러스 RNA의 효율적인 패키징(프사이 부위)에 필요한 서열들이 존재한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "패키징 신호" 또는 "패키징 서열"이란 용어는 바이러스 RNA의 바이러스 캡시드 또는 입자내로의 삽입에 필요한 레트로바이러스 게놈내에 위치한 서열들을 지칭한다. 예를 들어 문헌[Clever et al ., 1995. J. of Virology, Vol. 69, No. 4; pp. 2101-2109]을 참조하시오. 다수의 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 캡슐화에 필요한 최소 패키징 신호(또한 프사이[ψ] 서열이라 칭한다)를 사용한다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "패키징 서열", "패키징 신호", "프사이" 및 기호 "ψ"는 바이러스 입자 형성 중에 레트로바이러스 RNA 가닥의 캡슐화에 필요한 비-암호화 서열에 관하여 사용된다.
다양한 실시태양들에서, 벡터는 변형된 5' LTR 및/또는 3' LTR을 포함한다. 상기 LTR 중 하나 또는 둘 다 하나 이상의 변형, 예를 들어 비제한적으로 하나 이상의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 3' LTR의 변형은 종종 바이러스를 복제-결함으로 만듦으로써 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 시스템의 안전성을 개선시키기 위해 이루어진다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "복제-결함"이란 용어는 감염성 비리온이 생성되지 않도록(예를 들어 복제-결함 렌티바이러스 자손) 완전한, 유효한 복제가 가능하지 않은 바이러스를 지칭한다. "복제-가능(replication-competent)"이란 용어는 바이러스의 바이러스 복제가 감염성 비리온을 생성시킬 수 있도록(예를 들어 복제-가능 렌티바이러스 자손) 복제가 가능한 야생형 바이러스 또는 돌연변이 바이러스를 지칭한다.
"자기-불활성화"(SIN) 벡터는 우측(3') LTR 인헨서-프로모터 영역(U3 영역으로서 공지됨)이 첫 번째 바이러스 복제 라운드를 벗어난 바이러스 전사를 방지하도록 변형된(예를 들어 결실 또는 치환에 의해) 복제-결함 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 지칭한다. 이는 상기 우측(3') LTR U3 영역이 바이러스 복제 동안 좌측(5') LTR U3 영역에 대한 주형으로서 사용되고 따라서 바이러스 전사가 상기 U3 인헨서-프로모터 없이 이루어질 수 없기 때문이다. 본 발명의 추가의 실시태양에서, 상기 3' LTR은 상기 U5 영역이 예를 들어 이상적인 폴리(A) 서열로 치환되도록 변형된다. 상기 LTR에 대한 변형, 예를 들어 3' LTR, 5' LTR 또는 3' 및 5' LTR 모두에 대한 변형이 또한 본 발명에 포함됨에 유의해야 한다.
추가적인 안전성 증대는 상기 5' LTR의 U3 영역을 이종 프로모터로 치환시켜 바이러스 입자의 생성 동안 바이러스 게놈의 전사를 구동함으로써 제공된다. 사용될 수 있는 이종 프로모터의 예는 예를 들어 바이러스 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들어 초기 또는 말기), 거대세포바이러스(CMV)(예를 들어 전초기), 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MoMLV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 및 헤르페스 단순 바이러스(HSV)(티미딘 키나제) 프로모터를 포함한다. 전형적인 프로모터는 Tat-독립적인 방식으로 높은 수준의 전사를 구동할 수 있다. 이러한 치환은 상기 바이러스 생성 시스템에서 완전한 U3 서열이 존재하지 않기 때문에 복제-가능 바이러스를 생성시키는 재조합 가능성을 감소시킨다. 몇몇 실시태양에서, 상기 이종 프로모터는 바이러스 게놈이 전사되는 방식을 조절함에 있어서 추가적인 이점을 갖는다. 예를 들어, 상기 이종 프로모터는 유도성일 수 있으며, 따라서 바이러스 게놈의 일부 또는 전부의 전사는 오직 상기 유도 인자가 존재하는 경우에만 발생할 것이다. 유도인자는 비제한적으로 하나 이상의 화학 화합물 또는 생리학적 조건, 예를 들어 숙주 세포가 배양되는 온도 또는 pH를 포함한다.
일부 실시태양에서, 바이러스 벡터는 TAR 요소를 포함한다. "TAR"이란 용어는 렌티바이러스(예를 들어 HIV) LTR의 R 영역 중에 위치한 "트랜스-활성화 반응" 유전 요소를 지칭한다. 상기 요소는 상기 렌티바이러스 트랜스-활성제(tat) 유전 요소와 상호작용하여 바이러스 복제를 증대시킨다. 그러나, 상기 요소는 5' LTR의 U3 영역이 이종 프로모터에 의해 치환되는 실시태양에는 필요하지 않다.
상기 "R 영역"은, 캡핑 그룹의 출발(즉 전사의 출발)시 시작하고 폴리 A 트랙의 출발 직전에 종료되는 레트로바이러스 LTR내의 영역을 지칭한다. 상기 R 영역은 또한 상기 U3 및 U5 영역에 의해 인접되는 것으로서 정의된다. 상기 R 영역은 역전사 중에 게놈의 한쪽 단부에서 다른 쪽으로 발생기 DNA의 전달을 허용하는데 한 역할을 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "FLAP 요소"란 용어는 레트로바이러스, 예를 들어 HIV-1 또는 HIV-2의 중심 폴리퓨린 트랙 및 중심 종결 서열(cPPT 및 CTS)을 포함하는 서열을 갖는 핵산을 지칭한다. 적합한 FLAP 요소는 미국특허 제 6,682,907 호 및 문헌[Zennou, et al., 2000, Cell, 101:173]에 기재되어 있다. HIV-1 역 전사 중에, 중심 폴리퓨린 트랙(cPPT)에서의 플러스-가닥 DNA의 중심 개시 및 중심 종결 서열(CTS)에서의 중심 종결은 3-가닥 DNA 구조: HIV-1 중심 DNA 플랩의 형성을 유도한다. 임의의 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 DNA 플랩은 렌티바이러스 게놈 핵 내수송(import)의 시스-활성 결정인자로서 작용하고/하거나 상기 바이러스의 역가를 증가시킬 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 주쇄는 상기 벡터 중의 관심 이종 유전자의 상류 또는 하류에 하나 이상의 FLAP 요소를 포함한다. 예를 들어, 특정한 실시태양에서, 전달 플라스미드는 FLAP 요소를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 HIV-1으로부터 단리된 FLAP 요소를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 전달 벡터는 하나 이상의 외수송 요소를 포함한다. "외수송 요소"란 용어는 세포의 핵에서 세포질로의 RNA 전사물의 수송을 조절하는 시스-작용 전사-후 조절 요소를 지칭한다. RNA 외수송 요소의 예는 비제한적으로 인간 면역결핍 바이러스(HIV) rev 반응 요소(RRE)(예를 들어 문헌[Cullen et al., 1991. J. Virol. 65: 1053]; 및 문헌[Cullen et al., 1991. Cell 58: 423]을 참조하시오), 및 B형 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(HPRE)를 포함한다. 일반적으로, 상기 RNA 외수송 요소는 유전자의 3' UTR내에 위치하며 하나 또는 다수의 사본으로서 삽입될 수 있다.
특정한 실시태양에서, 바이러스 벡터 중 이종 서열의 발현은 전사후 조절 요소, 효율적인 폴리아데닐화 부위, 및 임의로 전사 종결 신호의 상기 벡터내로의 통합에 의해 증가된다. 다양한 전사후 조절 요소, 예를 들어 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE; Zufferey et al ., 1999, J. Virol., 73:2886); B형 간염 바이러스 중에 존재하는 전사후 조절 요소(HPRE)(Huang et al ., Mol . Cell . Biol., 5:3864); 등(Liu et al ., 1995, Genes Dev., 9:1766)이 단백질에서 이종 핵산의 발현을 증가시킬 수 있다. 특정한 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE 또는 HPRE를 포함한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE 또는 HPRE가 없거나 또는 포함하지 않는데, 그 이유는 일부 예에서 이들 요소가 세포 형질전환의 위험성을 증가시키고/증가시키거나 mRNA 전사물의 양 또는 mRNA 안정성을 그다지 증가시키지 않기 때문이다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 가중된 안전성 수단으로서 WPRE 또는 HPRE가 없거나 또는 이들을 포함하지 않는다.
이종 핵산 전사물의 효율적인 종결 및 폴리아데닐화를 지시하는 요소는 이종 유전자 발현을 증가시킨다. 전사 종결 신호는 일반적으로 상기 폴리아데닐화 신호의 하류에서 발견된다. 특정한 실시태양에서, 벡터는 발현시키려는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 폴리아데닐화 서열 3'을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "폴리A 부위" 또는 "폴리A 서열"이란 용어는 RNA 폴리머라제 II에 의한 발생기(nascent) RNA 전사물의 종결 및 폴리아데닐화 모두를 지시하는 DNA 서열을 나타낸다. 폴리아데닐화 서열은 상기 암호화 서열의 3' 단부에 폴리A 꼬리를 부가함으로써 mRNA 안정성을 촉진시킬 수 있고, 따라서 증가된 번역 효율에 기여할 수 있다. 상기 재조합 전사물의 효율적인 폴리아데닐화는, 폴리 A 꼬리가 없는 전사물은 불안정하고 급속히 분해되므로, 바람직할 수 있다. 본 발명의 벡터에 사용될 수 있는 폴리 A 신호의 예시적인 예는 이상적인 폴리A 서열(예를 들어 AATAAA, ATTAAA, AGTAAA), 소 성장 호르몬 폴리A 서열(BGHpA), 토끼 β-글로빈 폴리A 서열(rβgpA), 또는 당해 분야에 공지된 또 다른 적합한 이종 또는 내인성 폴리A 서열을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터는 하나 이상의 절연체(insulator) 요소를 추가로 포함한다. 격리제 요소는 렌티바이러스-발현된 서열, 예를 들어 치료학적 폴리펩티드를 통합 부위 효과(이는 게놈 DNA 중에 존재하는 시스-작용 요소들에 의해 매개되고 전달된 서열의 조절해제된 발현을 유도할 수 있다)(즉, 위치 효과; 예를 들어 문헌[Burgess-Beusse et al ., 2002, Proc . Natl . Acad . Sci ., USA, 99:16433]; 및 문헌[Zhan et al ., 2001, Hum . Genet., 109:471]을 참조하시오)로부터 보호하는데 기여할 수 있다. 일부 실시태양에서, 전달 벡터는 하나 이상의 격리제 요소 3' LTR을 포함하며, 프로바이러스의 숙주 게놈내로의 통합시 상기 프로바이러스는 5' LTR 또는 3' LTR 모두에, 상기 3' LTR의 복제에 의해 하나 이상의 격리제를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 격리제는 비제한적으로 치킨 β-글로빈 격리제를 포함한다(문헌[Chung et al., 1993. Cell 74:505]; 문헌[Chung et al., 1997. PNAS 94:575]; 및 문헌[ Bell et al ., 1999. Cell 98:387](이들은 본 명세서에 참고로 인용된다)을 참조하시오). 격리제 요소의 예는 비제한적으로 β-글로빈 유전자좌로부터의 격리제, 예를 들어 치킨 HS4를 포함한다.
본 발명의 몇몇 특정한 실시태양에 따르면, 바이러스 벡터 주쇄 서열의 대부분 또는 전부는 렌티바이러스, 예를 들어 HIV-1으로부터 유래된다. 그러나, 레트로바이러스 및/또는 렌티바이러스 서열의 다수의 상이한 공급원들이 사용될 수 있거나, 또는 상기 렌티바이러스 서열 중 일부에서 조합된 다수의 치환 및 변경이 본 명세서에 기재된 기능들을 수행하는 전달 벡터의 능력을 손상시키지 않으면서 수용될 수 있음을 알아야 한다. 더욱이, 다양한 렌티바이러스 벡터들이 당해 분야에 공지되어 있다. 문헌[Naldini et al., (1996a, 1996b, and 1998)]; 문헌[Zufferey et al ., (1997)]; 문헌[Dull et al ., 1998], 미국특허 제 6,013,516 호; 및 미국특허 제 5,994,136 호(이들 중 다수는 본 발명의 바이러스 벡터 또는 전달 플라스미드의 생성에 적합할 수 있다)을 참조하시오.
다양한 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 CAR 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함한다. 상기 벡터는 하나 이상의 LTR을 가질 수 있으며, 여기에서 LTR은 하나 이상의 변형, 예를 들어 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 상기 벡터는 형질도입 효율(예를 들어 cPPT/FLAP), 바이러스 패키징(예를 들어 프사이(ψ) 패키징 신호, RRE)을 증가시키기 위한 하나 이상의 보조 요소, 및/또는 치료학적 유전자 발현을 증가시키는 다른 요소(예를 들어 폴리(A) 서열)를 추가로 포함할 수 있으며 WPRE 또는 HPRE를 임의로 포함할 수 있다.
특정한 실시태양에서, 본 발명의 전달 벡터는 좌측(5') 레트로바이러스 LTR; 중심 폴리퓨린 트랙/DNA 플랩(cPPT/FLAP); 레트로바이러스 외수송 요소; 본 명세서에서 고려되는 CAR 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된, T 세포에서 활성인 프로모터; 및 우측(3') 레트로바이러스 LTR; 및 임의로 WPRE 또는 HPRE를 포함한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명의 전달 벡터는 좌측(5') 레트로바이러스 LTR; 레트로바이러스 외수송 요소; 본 명세서에서 고려되는 CAR 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된, T 세포에서 활성인 프로모터; 우측(3') 레트로바이러스 LTR; 및 폴리(A) 서열; 및 임의로 WPRE 또는 HPRE를 포함한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 좌측(5') LTR; cPPT/FLAP; RRE; 본 명세서에서 고려되는 CAR 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된, T 세포에서 활성인 프로모터; 우측(3') LTR; 및 폴리아데닐화 서열; 및 임의로 WPRE 또는 HPRE를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제공한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 좌측(5') HIV-1 LTR; 프사이(ψ) 패키징 신호; cPPT/FLAP; RRE; 본 명세서에서 고려되는 CAR 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된, T 세포에서 활성인 프로모터; 우측(3') 자기-불활성화(SIN) HIV-1 LTR; 및 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 서열; 및 임의로 WPRE 또는 HPRE를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 LTR; 중심 폴리퓨린 트랙/DNA 플랩(cPPT/FLAP); 레트로바이러스 외수송 요소; 및 본 명세서에서 고려되는 CAR 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된, T 세포에서 활성인 프로모터; 및 임의로 WPRE 또는 HPRE를 포함하는 벡터를 제공한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 LTR; cPPT/FLAP; RRE; 본 명세서에서 고려되는 CAR 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된, T 세포에서 활성인 프로모터; 및 폴리아데닐화 서열; 및 임의로 WPRE 또는 HPRE를 포함하는 벡터를 제공한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 SIN HIV-1 LTR; 프사이(ψ) 패키징 신호; cPPT/FLAP; RRE; 본 명세서에서 고려되는 CAR 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된, T 세포에서 활성인 프로모터; 및 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 서열; 및 임의로 WPRE 또는 HPRE를 제공한다.
"숙주 세포"는 본 발명의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 생체내, 생체외, 또는 시험관내에서 일렉트로포레이션되거나, 형질감염되거나, 감염되거나 또는 형질도입된 세포를 포함한다. 숙주 세포는 패키징 세포, 생산자 세포, 및 바이러스 벡터로 감염된 세포를 포함할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 본 발명의 바이러스 벡터로 감염된 숙주 세포를 치료가 필요한 피실험자에게 투여한다. 몇몇 실시태양에서, "표적 세포"란 용어는 숙주 세포와 호환적으로 사용되며, 목적하는 세포 유형의 형질감염되거나, 감염되거나 또는 형질도입된 세포를 지칭한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 표적 세포는 T 세포이다.
대규모 바이러스 입자 생성은 종종 타당한 바이러스 역가를 성취하기 위해 필요하다. 바이러스 입자는 전달 벡터를 바이러스 구조 및/또는 보조 유전자, 예를 들어 gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx, 또는 nef 유전자 또는 다른 레트로바이러스 유전자를 포함하는 패키징 세포주에 형질감염시킴으로써 생성된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "패키징 벡터"란 용어는, 패키징 신호가 없고 1, 2, 3, 4개 이상의 바이러스 구조 및/또는 보조 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 또는 바이러스 벡터를 지칭한다. 전형적으로, 상기 패키징 벡터는 패키징 세포 중에 포함되며 형질감염, 형질도입 또는 감염을 통해 상기 세포내로 도입된다. 형질감염, 형질도입 또는 감염 방법은 당해 분야의 숙련가들에게 주지되어 있다. 본 발명의 레트로바이러스/렌티바이러스 전달 벡터를 형질감염, 형질도입 또는 감염을 통해 패키징 세포주내로 도입시켜 생산자 세포 또는 세포주를 생성시킬 수 있다. 본 발명의 패키징 벡터를 예를 들어 칼슘 포스페이트 형질감염, 리포펙션 또는 일렉트로포레이션을 포함한 표준 방법에 의해 인간 세포 또는 세포주에 도입시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 패키징 벡터를 우성 선택성 마커, 예를 들어 네오마이신, 하이그로마이신, 퓨로마이신, 블라스토시딘, 제오신, 티미딘 키나제, DHFR, Gln 신시타제 또는 ADA와 함께 세포에 도입시킨 다음, 적합한 약물의 존재하에서 선택하고 클론을 단리한다. 선택성 마커 유전자를 패키징 벡터에 의해, 예를 들어 IRES 또는 자기 절단 바이러스 펩티드에 의해 유전자 암호화에 물리적으로 연결시킬 수 있다.
바이러스 외막 단백질(env)은 세포주로부터 생성된 재조합 레트로바이러스에 의해 최종적으로 감염 및 형질전환될 수 있는 숙주 세포의 범위를 결정한다. 렌티바이러스, 예를 들어 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV 및 EIV의 경우에, 상기 env 단백질은 gp41 및 gp120을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 패키징 세포에 의해 발현된 바이러스 env 단백질은 앞서 기재된 바와 같이, 바이러스 gag 및 pol 유전자로부터의 별도의 벡터상에서 암호화된다.
본 발명에 사용될 수 있는 레트로바이러스-유래된 env 유전자의 예시적인 예는 비제한적으로 MLV 외막, 10A1 외막, BAEV, FeLV-B, RD114, SSAV, 에볼라, 센다이, FPV(조류 역병 바이러스), 및 인플루엔자 바이러스 외막을 포함한다. 유사하게, RNA 바이러스(예를 들어 피코르나비리다에, 칼시비리다에, 아스트로비리다에, 토가비리다에, 플라비비리다에, 코로나비리다에, 파라믹소비리다에, 라브도비리다에, 필로비리다에, 오쏘믹소비리다에, 분야비리다에, 아레나비리다에, 레오비리다에, 비르나비리다에, 레트로비리다에의 RNA 바이러스과) 뿐만 아니라 DNA 바이러스(헤파드나비리다에, 시르코비리다에, 파르보비리다에, 파포바비리다에, 아데노비리다에, 헤르페스비리다에, 폭시리다에, 및 이리도비리다에의 과)로부터의 외막을 암호화하는 유전자가 사용될 수 있다. 전형적인 예는 FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, 광견병, ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CT10, 및 EIAV를 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 바이러스를 의사분류(pseudotyping)하기 위한 외막 단백질은 비제한적으로 하기의 바이러스 중 어느 하나를 포함한다: 인플루엔자 A, 예를 들어 H1N1, H1N2, H3N2 및 H5N1(조류독감), 인플루엔자 B, 인플루엔자 C 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 로타바이러스, 노로 바이러스 그룹의 임의의 바이러스, 장 아데노바이러스, 파르보바이러스, 뎅기열 바이러스, 원숭이 두창, 모노네가바이러스, 리사바이러스, 예를 들어 광견병 바이러스, 라고스 박쥐 바이러스, 모콜라 바이러스, 듀벤헤이즈 바이러스, 유럽 박쥐 바이러스 1 & 2 및 호주 박쥐 바이러스, 에페메로바이러스, 수포성 바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 헤르페스바이러스, 예를 들어 헤르페스 단순 바이러스 1형 및 2형, 수두 대상포진, 거대세포바이러스, 엡스타인-바 바이러스(EBV), 인간 헤르페스바이러스(HHV), 인간 헤르페스바이러스 6형 및 8형, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 유두종 바이러스, 쥐 감마헤르페스바이러스, 아레나바이러스, 예를 들어 아르헨티나 출혈열 바이러스, 볼리비아 출혈열 바이러스, 사비아-관련 출혈열 바이러스, 베네수엘라 출혈열 바이러스, 라싸열 바이러스, 마추포바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV), 분야비리다에, 예를 들어 크리미안-콩고 출혈열 바이러스, 한타바이러스, 신장 증후군 유발 바이러스에 의한 출혈열, 리프트밸리열 바이러스, 에볼라 출혈열 및 마르부르크 출혈열을 포함한 필로비리다에(필로바이러스), 카이사누르 포레스트병 바이러스를 포함한 플라비비리다에, Omsk 출혈열 바이러스, 진드기-매개 뇌염 유발 바이러스 및 파라믹소비리다에, 예를 들어 헨드라 바이러스 및 니파 바이러스, 대두창 및 소두창(천연두), 알파바이러스, 예를 들어 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스, SARS-관련 코로나바이러스(SARS-CoV), 서나일 바이러스(West Nile virus), 임의의 뇌염 유발 바이러스.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 VSV-G 당단백질에 의해 의사분류된 재조합 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스를 생산하는 패키징 세포를 제공한다.
본 명세서에 사용되는 "의사형(pseudotype)" 또는 "의사분류"란 용어는 바람직한 특성을 갖는 또 다른 바이러스의 외막 단백질로 치환된 바이러스 외막 단백질을 갖는 바이러스를 지칭한다. 예를 들어, HIV는, HIV 외막 단백질(env 유전자에 의해 암호화됨)이 통상적으로 상기 바이러스를 CD4+ 제시 세포에 표적화하기 때문에, HIV가 광범위한 세포를 감염시키게 하는 수포성 구내염바이러스 G-단백질(VSV-G) 외막 단백질로 의사분류될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 렌티바이러스 외막 단백질은 VSV-G로 의사분류된다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 상기 VSV-G 외막 당단백질로 의사분류된 재조합 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스를 생산하는 패키징 세포를 제공한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "패키징 세포주"란 용어는, 패키징 신호를 함유하지 않지만 바이러스 입자의 정확한 패키징에 필요한 바이러스 구조 단백질 및 복제 효소(예를 들어 gag, pol 및 env)를 안정하게 또는 일시적으로 발현시키는 세포주와 관련하여 사용된다. 임의의 적합한 세포주를 사용하여 본 발명의 패키징 세포를 제조할 수 있다. 일반적으로, 상기 세포는 포유동물 세포이다. 특정한 실시태양에서, 상기 패키징 세포주의 생성에 사용되는 세포는 인간 세포이다. 사용될 수 있는 적합한 세포주는 예를 들어 CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, C3H 10T1/2 세포, FLY 세포, 프사이-2 세포, BOSC 23 세포, PA317 세포, WEHI 세포, COS 세포, BSC 1 세포, BSC 40 세포, BMT 10 세포, VERO 세포, W138 세포, MRC5 세포, A549 세포, HT1080 세포, 293 세포, 293T 세포, B-50 세포, 3T3 세포, NIH3T3 세포, HepG2 세포, Saos-2 세포, Huh7 세포, HeLa 세포, W163 세포, 211 세포, 및 211A 세포이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 패키징 세포는 293 세포, 293T 세포 또는 A549 세포이다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 세포는 A549 세포이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "생산자 세포주"란 용어는 재조합 레트로바이러스 입자를 생산할 수 있는 세포주를 지칭하며, 패키징 세포주 및 패키징 신호를 포함하는 전달 벡터 구조물을 포함한다. 감염성 바이러스 입자 및 바이러스 모액의 제조를 통상적인 기법을 사용하여 수행할 수 있다. 바이러스 모액의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 예를 들어 문헌[Y. Soneoka et al . (1995) Nucl . Acids Res. 23:628-633], 및 문헌[N. R. Landau et al . (1992) J. Virol. 66:5110-5113]에 예시된다. 감염성 바이러스 입자를 통상적인 기법을 사용하여 상기 패키징 세포로부터 수집할 수 있다. 예를 들어, 상기 감염성 입자를 당해 분야에 공지된 바와 같이 세포 용해, 또는 세포 배양물의 상등액의 수집에 의해 수집할 수 있다. 임의로, 상기 수집된 바이러스 입자를 경우에 따라 정제할 수 있다. 적합한 정제 기법들은 당해 분야의 숙련가들에게 주지되어 있다.
형질감염에 의해서라기보다는 바이러스 감염에 의해서 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 유전자(들) 또는 다른 폴리뉴클레오티드 서열을 전달하는 것을 "형질도입"이라 칭한다. 하나의 실시태양에서, 레트로바이러스 벡터를 감염 및 프로바이러스 통합을 통해 세포내에 형질도입시킨다. 몇몇 실시태양에서, 표적 세포, 예를 들어 T 세포는, 상기가 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 사용하는 감염에 의해 세포로 전달된 유전자 또는 다른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, "형질도입된다". 특정한 실시태양에서, 형질도입된 세포는 그의 세포 게놈 중에 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터에 의해 전달된 하나 이상의 유전자 또는 다른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정한 실시태양에서, 하나 이상의 폴리펩티드를 발현하는 본 발명의 바이러스 벡터로 형질도입된 숙주 세포를, B 세포암의 치료 및/또는 예방을 위해 피실험자에게 투여한다. 본 발명의 몇몇 실시태양에 따라 사용될 수 있는 유전자 요법에서의 바이러스 벡터의 용도와 관련된 다른 방법들을 예를 들어 하기의 문헌들에서 찾을 수 있다: Kay, M. A. (1997) Chest 111(6 Supp.):138S-142S; Ferry, N. and Heard, J. M. (1998) Hum . Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory, Y. et al . (1999) Liver 19:265-74; Oka, K. et al . (2000) Curr . Opin . Lipidol. 11:179-86; Thule, P. M. and Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52; Yang, N. S. (1992) Crit . Rev . Biotechnol. 12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58; Brody, S. L. and Crystal, R. G. (1994) Ann . N.Y . Acad . Sci. 716:90-101; Strayer, D. S. (1999) Expert Opin . Investig . Drugs 8:2159-2172; Smith-Arica, J. R. and Bartlett, J. S. (2001) Curr . Cardiol . Rep. 3:43-49; 및 Lee, H. C. et al . (2000) Nature 408:483-8.
G. 유전자 변형된 세포
본 발명은 특정한 실시태양에서, B 세포 관련 병증의 치료에 사용하기 위한, 본 명세서에서 고려되는 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 세포를 고려한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유전자 조작된" 또는 "유전자 변형된"이란 용어는 여분의 유전 물질을 DNA 또는 RNA의 형태로 세포 중의 전체 유전 물질에 부가함을 지칭한다. "유전자 변형된 세포", "변형된 세포" 및 "재지시된 세포"란 용어들은 호환적으로 사용된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유전자 요법"이란 용어는 여분의 유전 물질을 DNA 또는 RNA의 형태로, 유전자의 발현을 복원, 보정 또는 변형시키거나 또는 치료학적 폴리펩티드, 예를 들어 CAR을 발현시키기 위해 세포 중의 전체 유전 물질에 도입시킴을 지칭한다.
특정한 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR을, 관심 표적 항원, 예를 들어 BCMA 폴리펩티드에 대한 그의 특이성을 재지시하기 위해서 면역 효과기 세포에 도입시키고 발현시킨다. "면역 효과기 세포"는 하나 이상의 효과기 기능(예를 들어 세포독성 세포 살해 활성, 사이토킨의 분비, ADCC 및/또는 CDC의 유도)을 갖는 면역계의 임의의 세포이다.
본 발명의 면역 효과기 세포는 자가조직/자생("자기") 또는 비-자가조직("비-자기", 예를 들어 동종이계, 동계 또는 이종)일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "자가조직"은 동일한 피실험자로부터의 세포를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "동종이계"는 비교 세포와 유전학적으로 상이한 동일한 종의 세포를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "동계"는 비교 세포와 유전학적으로 일치하는 상이한 피실험자의 세포를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "이종"은 비교 세포와 상이한 종의 세포를 지칭한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 세포는 동종이계이다.
본 명세서에서 고려되는 CAR과 함께 사용되는 예시적인 면역 효과기 세포는 T 림프구를 포함한다. "T 세포" 또는 "T 림프구"란 용어는 당해 분야에 인지되어 있으며 흉선세포, 미숙한 T 림프구, 성숙한 T 림프구, 휴지 T 림프구, 또는 활성화된 T 림프구를 포함함을 의미한다. T 세포는 T 헬퍼(Th) 세포, 예를 들어 T 헬퍼 1 (Th1) 또는 T 헬퍼 2 (Th2) 세포일 수 있다. T 세포는 헬퍼 T 세포 (HTL; CD4+ T 세포) CD4+ T 세포, 세포독성 T 세포 (CTL; CD8+ T 세포), CD4+CD8+ T 세포, CD4-CD8- T 세포, 또는 T 세포들의 임의의 다른 부분집합일 수 있다. 특정한 실시태양에 사용하기에 적합한 T 세포의 다른 예시적인 집단은 나이브 T 세포 및 기억 T 세포를 포함한다.
숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 다른 세포를 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR을 갖는 면역 효과기 세포로서 사용할 수 있다. 특히, 면역 효과기 세포는 NK 세포, NKT 세포, 호중구, 및 대식세포를 또한 포함한다. 면역 효과기 세포는 효과기 세포의 전구세포들을 또한 포함하며, 여기에서 상기와 같은 선조 세포는 생체내 또는 시험관내에서 면역 효과기 세포로 분화되도록 유도될 수 있다. 따라서, 특정한 실시태양에서, 면역 효과기 세포는 면역 효과기 세포의 선조들, 예를 들어 피실험자에 투여시 성숙한 면역 효과기 세포로 분화하거나 또는 시험관내에서 성숙한 면역 효과기 세포로 분화하도록 유도될 수 있는 제대혈, 골수 또는 동원된 말초 혈액으로부터 유래된 세포의 CD34+ 집단내에 함유된 조혈모세포(HSC)를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, BCMA-특이성 CAR을 함유하도록 유전자 조작된 면역 효과기 세포를 "BCMA-특이성 재지시된 면역 효과기 세포"라 칭할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "CD34+ 세포"란 용어는 표면상에 CD34 단백질을 발현하는 세포를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "CD34"는 종종 세포-세포 부착 인자로서 작용하고 림프절내로의 T 세포 진입에 관련된 세포 표면 당단백질(예를 들어 시알로뮤신 단백질)을 지칭한다. 상기 CD34+ 세포 집단은 조혈모세포(HSC)를 함유하며, 상기 세포는 환자에게 투여시 분화하고 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 호중구 및 단핵구/대식세포 계통의 세포를 포함한 모든 조혈 계통에 기여한다.
본 발명은 본 명세서에서 고려되는 CAR을 발현하는 면역 효과기 세포의 제조 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 방법은 상기 면역 효과기 세포가 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CAR을 발현하도록 개인으로부터 단리된 상기 면역 효과기 세포를 형질감염시키거나 형질도입시킴을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 면역 효과기 세포를 개인으로부터 단리하고 시험관내에서 추가의 조작 없이 유전자 변형시킨다. 이어서 상기와 같은 세포를 직접 상기 개인에게 다시-투여할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 상기 면역 효과기 세포를, CAR을 발현하도록 유전자 변형시키기 전에 먼저 활성화시키고 시험관내에서 증식하도록 자극한다. 이에 관하여, 상기 면역 효과기 세포를 유전자 변형(즉 본 명세서에서 고려되는 CAR을 발현하도록 형질도입 또는 형질감염)시키기 전 및/또는 후에 배양할 수 있다.
특정한 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 면역 효과기 세포의 시험관내 조작 또는 유전자 변형 전에, 세포의 공급원을 피실험자로부터 수득한다. 특정한 실시태양에서, 상기 CAR-변형된 면역 효과기 세포는 T 세포를 포함한다. T 세포를 다수의 공급원, 예를 들어 비제한적으로 말초 혈액 단핵세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉수, 비장 조직 및 종양으로부터 수득할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, T 세포를 숙련가에게 공지된 임의의 수의 기법, 예를 들어 침강, 예를 들어 FICOLL™ 분리를 사용하여 피실험자로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 개인의 순환 혈액으로부터의 세포를 성분채집술(apheresis)에 의해 수득한다. 상기 성분채집 생성물은 전형적으로 T 세포를 포함한 림프구, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 함유한다. 하나의 실시태양에서, 상기 성분채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고 상기 세포를 후속의 가공을 위해 적합한 완충제 또는 매질 중에 놓을 수 있다. 상기 세포를 PBS, 또는 칼슘, 마그네슘 및 대부분(전부는 아니더라도)의 2가 양이온이 없는 또 다른 적합한 용액으로 세척할 수 있다. 당해 분야의 통상적인 숙련가들에 의해 인식되는 바와 같이, 세척 단계를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어 반자동 통과식 원심분리기를 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어 코브(Cobe) 2991 세포 가공기, 박스터 사이토메이트(Baxter CytoMate) 등. 세척 후에, 상기 세포를 다양한 생체적합성 완충제 또는 완충제가 있거나 없는 다른 염수 용액에 재현탁시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 성분채집 샘플의 바람직하지 못한 성분들을 배양 배지에 직접 재현탁된 세포에서 제거할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, T 세포를, 적혈구를 용해시키고 단핵세포를 고갈시킴으로써, 예를 들어 PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵세포(PBMC)로부터 단리시킨다. 하기의 마커 중 하나 이상을 발현하는 T 세포의 특정한 하위집단: CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA 및 CD45RO를 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA 및 CD45RO를 발현하는, T 세포의 특정한 하위집단을 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리시킨다. 예를 들어 음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농축을 상기 음성적으로 선택된 세포 특유의 표면 마커에 대한 항체들의 조합에 의해 수행할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 한 가지 방법은 상기 음성적으로 선택된 세포상에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 단클론 항체들의 칵테일을 사용하는 유식 세포측정 또는 음성 자기 면역부착을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농축시키기 위해서, 단클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 유식 세포측정 및 세포 분류를 또한 사용하여 본 발명에 사용하기 위한 관심 세포 집단을 단리시킬 수 있다.
PBMC를 본 명세서에서 고려되는 방법들을 사용하여 CAR을 발현하도록 직접 유전자 변형시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, PBMC의 단리 후에, T 림프구를 추가로 단리시키고 몇몇 실시태양에서, 세포독성 및 헬퍼 T 림프구를 모두, 유전자 변형 및/또는 확대 전 또는 후에 나이브, 기억 및 효과기 T 세포 하위집단으로 분류할 수 있다.
CD8+ 세포를 표준 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 일부 실시태양에서, CD8+ 세포를, CD8+ 세포의 각각의 유형들과 관련된 세포 표면 항원을 식별함으로써 나이브, 중심 기억, 및 효과기 세포로 추가로 분류할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 나이브 CD8+ T 림프구는 CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127 및 CD45RA를 포함한 나이브 T 세포의 표현형 마커의 발현을 특징으로 한다.
특정한 실시태양에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 부분집합 모두에 존재한다. PBMC는 항-CD8 및 항-CD62L 항체로 염색 후 CD62L-CD8+ 및 CD62L+CD8+ 분획으로 분류된다. 일부 실시태양에서, 중심 기억 T 세포의 표현형 마커의 발현은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 및 CD127을 포함하며 그랜자임 B에 대해 음성이다. 일부 실시태양에서, 중심 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD8+ T 세포이다.
일부 실시태양에서, 효과기 T 세포는 CD62L, CCR7, CD28 및 CD127에 대해 음성이고, 그랜자임 B 및 퍼포린에 대해 양성이다.
몇몇 실시태양에서, CD4+ T 세포를 하위집단으로 추가 분류한다. 예를 들어, CD4+ T 헬퍼 세포를 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단들을 식별함으로써 나이브, 중심 기억 및 효과기 세포로 분류할 수 있다. CD4+ 림프구를 표준 방법에 의해 수득할 수 있다. 일부 실시태양에서, 나이브 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ CD4+ T 세포이다. 일부 실시태양에서, 중심 기억 CD4+ 세포는 CD62L 양성 및 CD45RO 양성이다. 일부 실시태양에서, 효과기 CD4+ 세포는 CD62L 및 CD45RO 음성이다.
상기 면역 효과기 세포, 예를 들어 T 세포를 공지된 방법을 사용하여 단리시킨 후에 유전자 변형시키거나, 또는 상기 면역 효과기 세포를 유전자 변형시키기 전에 시험관내에서 활성화 및 확대시킬 수 있다(또는 전구세포의 경우 분화시킬 수 있다). 특정한 실시태양에서, 상기 면역 효과기 세포, 예를 들어 T 세포를 본 명세서에서 고려되는 키메릭 항원 수용체로 유전자 변형시키고(예를 들어 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입시키고) 이어서 시험관내에서 활성화 및 확대시킨다. 다양한 실시태양에서, T 세포를 예를 들어 미국특허 제 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041 호; 및 미국특허 출원 공보 제 20060121005 호에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여, CAR을 발현시키기 위한 유전자 변형 전 또는 후에 활성화 및 확대시킬 수 있다.
일반적으로, 상기 T 세포를 CD3 TCR 복합체 결합된 신호를 자극하는 작용제 및 상기 T 세포의 표면상의 공-자극 분자를 자극하는 리간드를 상기 세포에 부착된 표면과 접촉시킴으로써 확대시킨다. T 세포 집단을 항-CD3 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 표면상에 고정화된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어(ionophore)와 함께 단백질 키나제 C 활성제(예를 들어 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 자극할 수 있다. T 세포 표면상의 보조 분자의 공-자극이 또한 고려된다.
특정한 실시태양에서, PBMC 또는 단리된 T 세포를, 적합한 사이토킨, 예를 들어 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15가 있는 배양 배지에서 비드 또는 다른 표면에 일반적으로 부착된 자극제 및 공자극제, 예를 들어 항-CD3 및 항-CD28 항체와 접촉시킨다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28(디아시온(Diacione), 프랑스 브장송 소재)을 포함하며 당해 분야에 통상적으로 공지된 다른 방법들과 같이 사용할 수 있다(Berg et al ., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al ., J. Exp. Med. 190(9): 13191328, 1999; Garland et al ., J. Immunol Meth. 227( 1 -2):53-63, 1999). 동일한 비드에 부착된 항-CD3 및 항-CD28 항체는 "대용(surrogate)" 항원 제시 세포(APC)로서 작용한다. 다른 실시태양에서, 상기 T 세포를 US6040177; US5827642; 및 WO2012129514에 기재된 바와 같은 방법들을 사용하여 배양보조 세포 및 적합한 항체 및 사이토킨과 함께 증식을 위해 활성화시키고 자극할 수 있다.
다른 실시태양에서, 인공 APC(aAPC)를, K562, U937, 721.221, T2 및 C1R 세포를 다양한 공-자극 분자 및 사이토킨의 안정한 발현 및 분비를 지시하도록 조작함으로써 제조하였다. 특정한 실시태양에서 K32 또는 U32 aAPC를 사용하여 상기 AAPC 세포 표면상의 하나 이상의 항체-계 자극 분자의 디스플레이를 지시한다. aAPC상의 유전자의 다양한 조합들의 발현은, aAPC가 특정한 성장 요건 및 별개의 기능을 갖는 T-세포 부분집합의 최적의 증식에 맞출 수 있도록 인간 T-세포 활성화 요건의 정확한 측정을 가능하게 한다. 상기 aAPC는 기능성 인간 CD8 T 세포의 생체외 성장 및 장기간 확대를, 천연 APC의 사용과 대조적으로, 외인성 사이토킨을 첨가할 필요 없이 지지한다. T 세포의 집단을 다양한 공자극 분자, 예를 들어 비제한적으로 CD137L(4-1BBL), CD134L(OX40L) 및/또는 CD80 또는 CD86을 발현하는 aAPC에 의해 확대시킬 수 있다. 최종적으로, 상기 aAPC는 유전자 변형된 T 세포를 확대시키고 CD8 T 세포상에서 CD28 발현을 유지시키기에 효율적인 플랫폼을 제공한다. WO03/057171 및 US2003/0147869에 제공된 aAPC는 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다.
하나의 실시태양에서, CD34+ 세포를 본 발명에 따라 핵산 구조물로 형질도입시킨다. 몇몇 실시태양에서, 상기 형질도입된 CD34+ 세포는 피실험자내로의 투여에 이어서 생체내에서 성숙한 면역 효과기 세포로 분화하며, 일반적으로 상기 피실험자로부터 상기 세포가 최초로 단리되었다. 또 다른 실시태양에서, CD34+ 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR에 노출 전 또는 상기 CAR로 유전자 변형 후에, 앞서 기재된 방법들(Asheuer et al., 2004; Imren, et al., 2004)에 따라 하기의 사이토킨 중 하나 이상으로 자극할 수 있다: Flt-3 리간드(FLT3), 줄기세포 인자(SCF), 거핵세포(megakaryocyte) 성장 및 분화 인자(TPO), IL-3 및 IL-6.
본 발명은 암의 치료를 위한 변형된 면역 효과기 세포의 집단을 제공하며, 상기 변형된 면역 효과기 세포는 본 명세서에 개시된 바와 같은 CAR을 포함한다. 예를 들어, 변형된 면역 효과기 세포의 집단을 본 명세서에 기재된 B 세포암이 있는 것으로 진단된 환자(자가조직 공여체)로부터 수득된 말초 혈액 단핵세포(PBMC)로부터 제조한다. 상기 PBMC는 CD4+, CD8+, 또는 CD4+ 및 CD8+일 수 있는 T 림프구의 이종 집단을 형성한다.
상기 PBMC는 또한 NK 세포 또는 NKT 세포와 같은 다른 세포독성 림프구를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 CAR의 암호화 서열을 운반하는 발현 벡터를 인간 공여체 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포의 집단내로 도입시킬 수 있다. 상기 발현 벡터를 운반하는 성공적으로 형질도입된 T 세포를 유식 세포측정을 사용하여 분류하여 CD3 양성 T 세포를 단리시키고 이어서 추가로 증식시켜, 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체 및 IL-2를 사용하거나 또는 본 명세서의 다른 어딘가에 기재된 바와 같은 당해 분야에 공지된 임의의 다른 방법을 사용하여, 세포 활성화 외에 상기 CAR 단백질 발현 T 세포의 수를 증가시킬 수 있다. 인간 피실험자에 사용하기 위한 보관 및/또는 제조를 위해 상기 CAR 단백질 T 세포를 발현하는 T 세포의 저온보존에 표준 과정을 사용한다. 하나의 실시태양에서, 상기 T 세포의 시험관내 형질도입, 배양 및/또는 확대를 비-인간 동물 유래된 생성물, 예를 들어 송아지 태아 혈청 및 소 태아 혈청의 부재하에서 수행한다. PBMC의 이종 집단을 유전자 변형시키기 때문에, 상기 생성되는 형질도입된 세포는 본 명세서에서 고려되는 바와 같은 BCMA 표적화 CAR을 포함하는 변형된 세포의 이종 집단이다.
추가의 실시태양에서, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 상이한 발현 벡터들의 혼합물을 면역 효과기 세포의 공여체 집단의 유전자 변형에 사용할 수 있으며, 여기에서 각각의 벡터는 본 명세서에서 고려되는 바와 같은 상이한 키메릭 항원 수용체 단백질을 암호화한다. 상기 생성되는 변형된 면역 효과기 세포는 변형된 세포의 혼합된 집단을 형성하며, 상기 변형된 세포의 일부는 하나 초과의 상이한 CAR 단백질을 발현한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 BCMA 단백질을 표적화하는 유전자 변형된 쥐, 인간 또는 인간화된 CAR 단백질 발현 면역 효과기 세포의 분류 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 면역 효과기 세포를 상기 세포가 해동시 생육 가능하게 남아있도록 저온보존함을 포함한다. 상기 CAR 단백질을 발현하는 면역 효과기 세포의 분획을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 저온보존하여 B 세포 관련된 병증에 걸린 환자의 차후 치료를 위해 상기와 같은 세포의 영구적인 공급원을 제공할 수 있다. 필요한 경우, 상기 저온보존된 형질전환된 면역 효과기 세포를 보다 많은 상기와 같은 세포를 위해 해동시키고, 증식시키고, 확대시킬 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "저온보존"은 세포를 영하 온도, 예를 들어 (전형적으로) 77K 또는 -196 ℃(액체 질소의 비등점)로 냉각시킴으로써 보존함을 지칭한다. 저온보호제는 종종, 보존하려는 세포를 저온에서의 동결 또는 실온으로의 가온으로 인한 손상으로부터 방지하기 위해 영하의 온도에서 사용된다. 저온보존제 및 최적의 냉각속도는 세포 손상을 보호할 수 있다. 사용될 수 있는 저온보호제는 비제한적으로 디메틸 설폭사이드(DMSO)(Lovelock and Bishop, Nature, 1959; 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature, 1961; 190: 1204-1205), 글리세롤, 폴리비닐피롤리딘(Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576), 및 폴리에틸렌 글리콜(Sloviter and Ravdin, Nature, 1962; 196: 48)을 포함한다. 바람직한 냉각 속도는 1 내지 3 ℃/분이다. 적어도 2시간 후에, 상기 T 세포는 -80 ℃의 온도에 도달되었으며, 이를 예를 들어 장기간 저온 보관 용기에서의 영구 보관을 위해 액체 질소(-196 ℃)에 바로 넣을 수 있다.
H. 조성물 및 제형
본 명세서에서 고려되는 조성물은 본 명세서에서 고려되는 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 이들을 포함하는 벡터, 유전자 변형된 면역 효과기 세포 등을 포함할 수 있다. 조성물은 비제한적으로 약학 조성물을 포함한다. "약학 조성물"은 세포 또는 동물에게 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료 양상과 함께 투여하기 위한 약학적으로 허용 가능한 또는 생리학적으로 허용 가능한 용액 중에 제형화된 조성물을 지칭한다. 또한, 경우에 따라, 본 발명의 조성물을 또한 다른 작용제, 예를 들어 사이토킨, 성장인자, 호르몬, 소분자, 화학요법제, 전구약물, 약물, 항체 또는 다른 다양한 약학 활성제와 함께 투여할 수 있다. 상기 추가적인 작용제가 의도된 치료법을 전달하는 상기 조성물의 능력에 불리한 영향을 미치지 않는 한, 상기 조성물에 또한 포함시킬 수 있는 다른 성분들에 대한 제한은 실질적으로 없다.
"약학적으로 허용 가능한"이란 어구는 본 명세서에서 합리적인 이익/위험 비에 적합한, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 건전한 의학적 판단의 범위내에서 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여형을 지칭하는데 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제"는 비제한적으로, 미국 식품 의약품 안전청에서 인간 또는 가축에 사용하기에 허용 가능한 것으로서 승인된 임의의 보조제, 담체, 부형제, 윤활제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 풍미 증진제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정제, 등장화제, 용매, 계면활성제 또는 유화제를 포함한다. 예시적인 약학적으로 허용 가능한 담체는 비제한적으로 당, 예를 들어 락토스, 글루코스 및 슈크로스; 전분, 예를 들어 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 그의 유도체, 예를 들어 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 활석; 코코아 버터, 왁스, 동물 및 식물성 지방, 파라핀, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 산화 아연; 오일, 예를 들어 땅콩유, 면실유, 잇꽃유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예를 들어 글리세린, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예를 들어 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트; 아가; 완충제, 예를 들어 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄; 알긴산; 무-발열원 수; 등장성 염수; 링거액; 에틸 알콜; 포스페이트 완충 용액; 및 약학 제형에 사용되는 임의의 다른 적합한 물질을 포함한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 본 명세서에서 고려되는 CAR-발현 면역 효과기 세포의 양을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "양"이란 용어는 임상 결과를 포함하여 이롭거나 목적하는 예방학적 또는 치료학적 결과를 성취하기 위한 유전자 변형된 치료학적 세포, 예를 들어 T 세포의 "유효한 양" 또는 "유효량"을 지칭한다.
"예방학적 유효량"은 목적하는 예방학적 결과를 성취하기에 유효한 유전자 변형된 치료학적 세포의 양을 지칭한다. 전형적으로, 반드시는 아니지만, 예방학적 용량은 질병 전에 또는 질병의 초기 단계에 피실험자에서 사용되므로, 상기 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적다.
유전자 변형된 치료학적 세포의 "치료학적 유효량"은 개인의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 상기 개인에서 목적하는 반응을 이끌어내는 줄기 및 전구세포의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 바이러스 또는 형질도입된 치료학적 세포의 임의의 독성 또는 유해 효과가 치료학적으로 이로운 효과에 의해 보다 가치가 있는 양이다. "치료학적 유효량"이란 용어는 피실험자(예를 들어 환자)를 "치료하기"에 유효한 양을 포함한다. 치료량이 지시되는 경우, 투여되는 본 발명 조성물의 정확한 양은 상기 환자(피실험자)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도, 및 상태의 개별적인 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 본 명세서에 기재된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 102 내지 1010 세포/㎏ 체중, 바람직하게는 105 내지 106 세포/㎏ 체중의 투여량(상기 범위내의 모든 정수 값 포함)으로 투여할 수 있다. 세포의 수는 상기 조성물이 상기 중에 포함된 세포의 유형이 의도하는 바와 같은 최종 용도에 따라 변할 것이다. 본 명세서에 제공되는 용도에 대해서, 상기 세포는 일반적으로 리터 이하의 부피로 존재하며, 500 ㎖ 이하, 심지어 250 ㎖ 또는 100 ㎖ 이하일 수 있다. 따라서 목적하는 세포의 밀도는 전형적으로 106 세포/㎖ 초과 및 일반적으로 107 세포/㎖ 초과, 일반적으로 108 세포/㎖ 초과이다. 면역 세포의 임상적으로 적합한 수는 누적해서 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 또는 1012 세포 이상의 수회 주입으로 배분될 수 있다. 본 발명의 일부 태양에서, 특히 상기 주입된 세포는 모두 특정한 표적 항원으로 재지시될 것이므로, 106/킬로그램(106 내지 1011/환자) 범위의 보다 낮은 세포 수로 투여될 수 있다. CAR 발현 세포 조성물을 이들 범위내의 투여량으로 수회 투여할 수 있다. 상기 세포는 상기 치료법을 겪는 환자에게 동종이계, 동계, 이종 또는 자가조직일 수 있다. 경우에 따라, 상기 치료는 또한 상기 면역 반응의 유도를 증대시키기 위해서 본 명세서에 기재된 바와 같은 미토젠(예를 들어 PHA) 또는 림포킨, 사이토킨 및/또는 케모킨(예를 들어 IFNγ, IL-2, IL-12, TNF-알파, IL-18, 및 TNF-베타, GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, MIP1α 등)의 투여를 포함할 수 있다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같이 활성화되고 확대된 세포를 포함하는 조성물을 면역저하된(immunocompromised) 개인에서 발생하는 질병의 치료 및 예방에 사용할 수 있다. 특히, 본 명세서에서 고려되는 CAR-변형된 T 세포를 포함하는 조성물을 B 세포암의 치료에 사용한다. 본 발명의 CAR-변형된 T 세포를 단독으로 또는 담체, 희석제, 부형제, 및/또는 다른 성분들, 예를 들어 IL-2 또는 다른 사이토킨 또는 세포 집단과 함께 약학 조성물로서 투여할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 약학 조성물은 유전자 변형된 T 세포의 양을 하나 이상의 약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함한다.
CAR-발현 면역 효과기 세포 집단, 예를 들어 T 세포를 포함하는 본 발명의 약학 조성물은 완충제, 예를 들어 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수 등; 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 슈크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예를 들어 글리신; 산화방지제; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA 또는 글루타치온; 보조제(예를 들어 수산화 알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물을 바람직하게는 비경구 투여, 예를 들어 혈관내(정맥내 또는 동맥내), 복강내 또는 근육내 투여를 위해 제형화한다.
상기 액체 약학 조성물은 상기가 용액이든, 현탁액이든 또는 다른 유사한 형태든 간에, 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예를 들어 주사용수, 염수 용액, 바람직하게는 생리 식염수, 링거액, 등장성 염화 나트륨, 고정유, 예를 들어 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노 또는 디글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 항균제, 예를 들어 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 산화방지제, 예를 들어 아스코르브산 또는 나트륨 비설파이트; 킬레이트제, 예를 들어 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예를 들어 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 긴장성 조절제, 예를 들어 염화 나트륨 또는 덱스트로스. 상기 비경구 제제를 앰풀, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 수회 투여용 바이알 중에 동봉할 수 있다. 주사성 약학 조성물은 바람직하게는 멸균성이다.
특정한 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 조성물은 유효량의 CAR-발현 면역 효과기 세포를 단독으로 또는 하나 이상의 치료제와 함께 포함한다. 따라서, 상기 CAR-발현 면역 효과기 세포 조성물을 단독으로 또는 다른 공지된 암 치료, 예를 들어 방사선 요법, 화학요법, 이식, 면역요법, 호르몬요법, 광역동 요법 등과 함께 투여할 수 있다. 상기 조성물을 또한 항생제와 함께 투여할 수 있다. 상기와 같은 치료제는 당해 분야에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 특정 질병, 예를 들어 특정 암에 대한 표준 치료로서 허용될 수 있다. 고려되는 예시적인 치료제는 사이토킨, 성장인자, 스테로이드, NSAID, DMARD, 소염제, 화학요법제, 방사선 요법제, 치료 항체, 또는 다른 활성 및 보조제를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 CAR-발현 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물을 임의의 수의 화학요법제와 함께 투여할 수 있다. 화학요법제의 예시적인 예는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 사이클로포스파미드(CYTOXAN™); 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 유레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포아미드, 트리에틸렌티오포스파오라미드 및 트리메틸올롤멜라민 레주메; 질소 머스터드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라머스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 펜에스테린, 프레드니머스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스터드; 니트로스우레아, 예를 들어 카머스틴, 클로로조토신, 포테머스틴, 로머스틴, 니머스틴, 라니머스틴; 항생제, 예를 들어 아클라시노마이신, 액티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼케아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 퀘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 대사길항물질, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 폴산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카르모푸어, 시타라빈, 디데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록슈리딘, 5-FU; 안드로젠, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레뷸린산; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK®; 라족산; 시조피란; 스피로제르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노머스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 패클리탁셀(TAXOL®, 브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 미국 뉴저지주 프린스톤 소재), 및 도세탁셀(TAXOTERE®, 롱 푸랑 로리(Rhne-Poulenc Rorer), 프랑스 안토니 소재); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 국소이성화효소 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로미틴(DMFO); 레티노산 유도체, 예를 들어 타르그레틴™(벡사로텐), 판레틴™(알리트레티노인); ONTAK™(데닐류킨 디프티톡스); 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기 중 어느 하나의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한 암에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예를 들어 항-에스트로젠, 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제성 4(5)-아미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(파레스톤); 및 항-안드로젠, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 상기 중 어느 하나의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 상기 정의내에 포함된다.
다양한 다른 치료제들을 본 명세서에 기재된 조성물들과 함께 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, CAR-발현 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물을 소염제와 함께 투여한다. 소염제 또는 약물은 비제한적으로 스테로이드 및 글루코코르티코이드(베타메타손, 부데소니드, 덱사메타손, 하이드로코르티손 아세테이트, 하이드로코르티손, 하이드로코르티손, 메틸 프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 트리암시놀론 포함), 비스테로이드성 소염 약물(NSAID), 예를 들어 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 메토트렉세이트, 설파살라진, 레플루노미드, 항-TNF 약물, 사이클로포스파미드 및 마이코페놀레이트를 포함한다.
다른 예시적인 NSAID는 이부프로펜, 나프록센, 나프록센 나트륨, 콕스-2 억제제, 예를 들어 VIOXX®(로페콕시브) 및 CELEBREX®(셀레콕시브), 및 시알릴레이트로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 예시적인 진통제는 아세트아미노펜, 옥시코돈, 프로폭시펜 하이드로클로라이드의 트라마돌로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 예시적인 글루코코르티코이드는 코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론 또는 프레드니손으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 예시적인 생물학적 반응 조절제는 세포 표면 마커(예를 들어 CD4, CD5 등)에 대한 분자, 사이토킨 억제제, 예를 들어 TNF 길항물질(예를 들어 에타너셉트(ENBREL®), 아달리뮤맙(HUMIRA®) 및 인플릭시맙(REMICADE®), 케모킨 억제제 및 부착 분자 억제제를 포함한다. 상기 생물학적 반응 조절제는 단클론 항체뿐만 아니라 분자들의 재조합 형태를 포함한다. 예시적인 DMARD는 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 사이클로스포린, 메토트렉세이트, 페니실아민, 레플루노미드, 설파살라진, 하이드록시클로로퀸, 금(경구(오라노핀) 및 근육내) 및 미노사이클린을 포함한다.
본 명세서에서 고려되는 CAR 변형된 T 세포와의 조합에 적합한 치료학적 항체의 예시적인 예는 비제한적으로 바비툭시맙, 베바시주맙(아바스틴), 비바투주맙, 블리나투모맙, 코나투뮤맙, 다라투뮤맙, 둘리고튜맙, 다세투주맙, 달로투주맙, 엘로투주맙(HuLuc63), 젬투주맙, 이브리투모맙, 인다툭시맙, 이노투주맙, 로르보투주맙, 루카투뮤맙, 밀라투주맙, 목세튜모맙, 오카라투주맙, 오파투뮤맙, 리툭시맙, 실툭시맙, 테프로투뮤맙 및 유블리툭시맙을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 조성물을 사이토킨과 함께 투여한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "사이토킨"은 또 다른 세포상에서 세포간 매개체로서 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반적인 용어를 의미한다. 상기와 같은 사이토킨의 예는 림포킨, 모노킨, 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 상기 사이토킨 중에는 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예를 들어 여포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH), 및 황체 호르몬(LH); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토젠; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 뮐러관 억제 물질; 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-베타; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자(TGF), 예를 들어 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리쓰로포이에틴(EPO); 골유도성 인자; 인터페론, 예를 들어 인터페론-알파, 베타, 및 -감마; 콜로니 자극 인자(CSF), 예를 들어 대식세포-CSF(M-CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); 인터류킨(IL), 예를 들어 IL-1, IL-1알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, 종양 괴사 인자, 예를 들어 TNF-알파 또는 TNF-베타; 및 다른 폴리펩티드 인자, 예를 들어 LIF 및 키트 리간드(KL)가 포함된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 사이토킨이란 용어는 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질, 및 상기 고유 서열 사이토킨의 생물 활성 등가물을 포함한다.
I. 치료학적 방법
본 명세서에서 고려되는 유전자 변형된 면역 효과기 세포는, 비제한적으로 면역조절 병증 및 혈액암을 포함한 B 세포 관련 병증의 치료에 사용하기 위한 입양 면역요법의 개선된 방법을 제공한다.
특정한 실시태양에서, 1차 면역 효과기 세포의 특이성은 상기 1차 면역 효과기 세포를 본 명세서에서 고려되는 CAR로 유전자 변형시킴으로써 B 세포에 대해 재지시된다. 다양한 실시태양에서, 바이러스 벡터를 사용하여 면역 효과기 세포를 BCMA 폴리펩티드에 결합하는 인간화된 항-BCMA 항원 결합 도메인; 힌지 도메인; 막관통(TM) 토메인, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커(상기 TM 도메인을 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인에 연결한다); 및 하나 이상의 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 주요 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 암호화하는 특정한 폴리뉴클레오티드로 유전자 변형시킨다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 T 세포를, BCMA 발현 B 세포를 표적화하는 CAR을 발현하도록 유전자 변형시키고 상기 CAR T 세포를 치료가 필요한 수용자에게 주입하는 세포요법의 한 유형을 포함한다. 상기 주입된 세포는 상기 수용자에서 질병 유발 B 세포를 살해할 수 있다. 항체 요법과 달리, CAR T 세포는 생체내에서 복제되어 장기간 지속성을 생성시켜 지속적인 암 요법을 유도할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 CAR T 세포는 확고한 생체내 T 세포 확대를 겪을 수 있으며 연장된 시간 동안 지속될 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 CAR T 세포는 특정한 기억 T 세포로 진화하여, 임의의 추가적인 종양 형성 또는 성장을 억제하도록 재활성화될 수 있다.
특정한 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR을 포함하는 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물을 이상 B 세포 활성과 관련된 병증의 치료에 사용한다.
본 명세서에서 고려되는 CAR을 포함하는 면역 효과기 세포를 사용하여 치료, 예방 또는 개선될 수 있는 병증의 예시적인 예는 비제한적으로 전신 홍반성 루푸스, 류머티스성 관절염, 중증 근무력증, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판감소성 자반, 항-인지질 증후군, 샤가스병, 그레이브스병, 베게너 육아종증, 결절성 다발동맥염, 쇼그렌 증후군, 심상성 천포창, 피부경화증, 다발성 경화증, 항-인지질 증후군, ANCA 관련 혈관염, 굿파스쳐 증후군, 카와사키병, 및 빠르게 진행하는 사구체신염을 포함한다.
상기 변형된 면역 효과기 세포는 또한 형질세포 질환, 예를 들어 중쇄병, 원발성 또는 면역세포-관련 아밀로이드증, 또는 미확정 단클론 감마병증(MGUS)에 용도를 가질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "B 세포암"은 하기에 논의되는 바와 같은 B 세포(면역계 세포의 한 유형) 중에 형성되는 암의 한 유형을 지칭한다.
특정한 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR-변형된 T 세포를 포함하는 조성물을 혈액암, 예를 들어 비제한적으로 B 세포암, 예를 들어 다발성 골수종(MM) 또는 비-호지킨 림프종(NHL)의 치료에 사용한다.
다발성 골수종은 세포의 단일 클론의 신생물 형질전환을 특징으로 하는 성숙한 형질세포 형태의 B 세포암이다. 상기 형질세포는 BM에서 증식하며 인접한 뼈를 침범하고 때때로 혈액을 침범할 수 있다. 다발성 골수종의 변이 형태들은 현성 다발성 골수종, 무증후성 다발성 골수종, 형질세포 백혈병, 비-분비성 골수종, IgD 골수종, 골경화성 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 및 골수외 형질세포종을 포함한다(예를 들어 문헌[Braunwald, et al . (eds), Harrison's Principles of Internal Medicine, 15th Edition (McGraw-Hill 2001)]을 참조하시오).
비-호지킨 림프종은 림프구(백혈구) 암의 큰 그룹을 포함한다. 비-호지킨 림프종은 어떠한 연령에서도 발생할 수 있으며 종종 정상보다 큰 림프절, 발열 및 체중 손실을 특징으로 한다. 다수의 상이한 유형의 비-호지킨 림프종이 존재한다. 예를 들어, 비-호지킨 림프종을 공격성(빨리-성장하는) 및 지연성(느리게-성장하는) 유형으로 분류할 수 있다. 비-호지킨 림프종은 B 세포 및 T-세포로부터 유래될 수 있지만, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "비-호지킨 림프종" 및 "B 세포 비-호지킨 림프종"이란 용어는 호환적으로 사용된다. B 세포 비-호지킨 림프종(NHL)은 버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병/소 림프구성 림프종(CLL/SLL), 미만성 대 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 면역모구성 대세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종 및 외투세포 림프종을 포함한다. 골수 또는 줄기세포 이식 후 발생하는 림프종은 대개 B 세포 비-호지킨 림프종이다.
만성 림프구성 백혈병(CLL)은 B 림프구 또는 B 세포라 칭하는 미성숙 백혈구의 느린 증가를 야기하는 지연성(느리게-성장하는) 암이다. 암세포는 혈액 및 골수를 통해 확산되며, 림프절 또는 다른 기관, 예를 들어 간 및 비장을 또한 침범할 수 있다. CLL은 최종적으로 골수를 쇠약하게 한다. 때때로, 상기 질병의 말기 단계에서, 상기 질병을 소 림프구성 림프종이라 칭한다.
특정한 실시태양에서, 치료 유효량의, 본 명세서에서 고려되는 CAR-발현 면역 효과기 세포 또는 상기를 포함하는 조성물을 상기 치료가 필요한 환자에게 단독으로 또는 하나 이상의 치료제와 함께 투여함을 포함하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 세포는 이상 B 세포 활성과 관련된 병증 또는 B 세포암의 발생 위험이 있는 환자의 치료에 사용된다. 따라서, 본 발명은 이상 B 세포 활성과 관련된 병증 또는 B 세포암의 치료 또는 예방이 필요한 피실험자에게 치료 유효량의, 본 명세서에서 고려되는 CAR-변형된 세포를 투여함을 포함하는, 상기 병증 또는 암의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "개인" 및 "피실험자"란 용어는 종종 호환적으로 사용되며, 유전자 요법 벡터, 세포-계 요법, 및 본 명세서의 다른 어딘가에 개시된 방법으로 치료될 수 있는 질병, 질환 또는 병증의 증상을 나타내는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직한 실시태양에서, 피실험자는 유전자 요법 벡터, 세포-계 치료법, 및 본 명세서의 어딘가에 개시된 방법으로 치료될 수 있는 조혈계의 질병, 질환 또는 병증, 예를 들어 B 세포암의 증상을 나타내는 임의의 동물을 포함한다. 적합한 피실험자(에를 들어 환자)는 실험용 동물(예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 기니피그), 농장 동물, 및 가축 또는 애완동물(예를 들어 고양이 또는 개)을 포함한다. 비-인간 영장류 및 바람직하게는 인간 환자가 포함된다. 전형적인 피실험자는 B 세포암을 갖거나, B 세포암으로 진단되었거나, 또는 B 세포암의 위험이 있거나 상기 암을 갖는 인간 환자를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "환자"란 용어는 유전자 요법 벡터, 세포-계 치료법, 및 본 명세서의 어딘가에 개시된 방법으로 치료될 수 있는 특정 질병, 질환 또는 병증으로 진단된 피실험자를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "치료" 또는 "치료하는"은 질병 또는 병적인 상태의 증상 또는 병리에 대한 임의의 이롭거나 바람직한 효과를 포함하며, 심지어 상기 치료되는 질병 또는 병증의 하나 이상의 측정 가능한 마커의 최소의 감소를 포함할 수도 있다. 치료는 상기 질병 또는 병증의 증상의 감소 또는 개선, 또는 상기 질병 또는 병증의 진행의 지연을 임의로 수반할 수 있다. "치료"는 상기 질병 또는 병증, 또는 그의 관련 증상의 완전한 근절 또는 치유를 반드시 가리키는 것은 아니다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "예방하다" 및 유사한 단어, 예를 들어 "예방된", "예방하는" 등은 질병 또는 병증의 발생 또는 재발 가능성의 예방, 억제 또는 감소를 위한 접근법을 가리킨다. 상기는 또한 질병 또는 병증의 개시 또는 재발의 지연 또는 질병 또는 병증의 증상의 발생 또는 재발의 지연을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "예방" 및 유사한 단어들은 또한 질병 또는 병증의 개시 또는 재발 전에 상기 질병 또는 병증의 강도, 효과, 증상 및/또는 크기의 감소를 포함한다.
"증대시키다" 또는 "촉진하다" 또는 "증가시키다" 또는 "확대하다"는 일반적으로 본 명세서에서 고려되는 조성물, 예를 들어 CAR을 암호화하는 유전자 변형된 T 세포 또는 벡터가 비히클 또는 대조용 분자/조성물에 의해 야기된 반응에 비해 보다 큰 생리학적 반응(즉 하류 효과)을 생성시키거나, 유도하거나, 또는 야기하는 능력을 지칭한다. 측정 가능한 생리학적 반응은 당해 분야 및 본 명세서의 기재의 이해로부터 자명한 다른 것들 중에서 특히 T 세포 확대, 활성화, 지속, 및/또는 암 세포 살해 능력의 증가를 포함할 수 있다. "증가된" 또는 "증대된" 양은 전형적으로 "실질적으로 의미있는" 양이며, 비히클 또는 대조용 조성물에 의해 생성된 반응의 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상(예를 들어, 500, 1000 배)(상기 사이 및 1 초과의 모든 정수 및 소수점 포함, 예를 들어 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등)의 증가를 포함할 수 있다.
"감소하다" 또는 "낮추다", "축소하다" 또는 "줄이다" 또는 "내리다"는 일반적으로 본 명세서에서 고려되는 조성물이 비히클 또는 대조용 분자/조성물에 의해 야기된 반응에 비해 보다 작은 생리학적 반응(즉 하류 효과)을 생성시키거나, 유도하거나, 또는 야기하는 능력을 지칭한다. "감소하는" 또는 "감소된" 양은 전형적으로 "실질적으로 의미있는" 양이며, 비히클, 대조용 조성물에 의해 생성된 반응(참조 반응) 또는 특정 세포 계통에서의 반응의 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상(예를 들어, 500, 1000 배)(상기 사이 및 1 초과의 모든 정수 및 소수점 포함, 예를 들어 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등)의 감소를 포함할 수 있다.
"유지하다" 또는 "보존하다" 또는 "유지" 또는 "변화없이" 또는 "실질적인 변화 없이" 또는 "실질적인 감소 없이"는 일반적으로 비히클, 대조용 분자/조성물에 의해 야기되는 반응 또는 특정 세포 계통에서의 반응에 비해, 세포에서 보다 적은 생리학적 반응(즉 하류 효과)을 생성시키거나, 유도하거나 또는 야기하는 본 명세서에서 고려되는 조성물의 능력을 지칭한다. 필적하는 반응은 상기 참조 반응과 그다지 상이하지 않거나 측정 가능하게 상이하지 않은 것이다.
하나의 실시태양에서, 치료가 필요한 피실험자에서 B 세포 관련된 병증의 치료 방법은 유효량, 예를 들어 치료 유효량의, 본 명세서에서 고려되는 유전자 변형된 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물을 투여함을 포함한다. 상기 투여량 및 빈도는 환자의 상태, 및 상기 환자 질병의 유형 및 중증도와 같은 인자들에 의해 결정되지만, 적합한 투여량을 임상 시험에 의해 결정할 수도 있다.
몇몇 실시태양에서, 활성화된 면역 효과기 세포를 피실험자에게 투여하고 이어서 후속으로 혈액을 재채혈하고(또는 성분채집술을 수행하고), 본 발명에 따라 상기로부터 면역 효과기 세포를 활성화시키고, 상기 환자를 상기 활성화되고 확대된 면역 효과기 세포로 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 과정을 몇 주마다 수회 수행할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 면역 효과기 세포를 10 cc 내지 400 cc의 채혈된 혈액으로부터 활성화시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 면역 효과기 세포를 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc, 100cc, 150cc, 200cc, 250cc, 300cc, 350cc, 또는 400cc 이상의 채혈된 혈액으로부터 활성화시킨다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 다중 채혈/수회 재주입 프로토콜의 사용은 면역 효과기 세포의 특정 집단의 선택을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 고려되는 조성물의 투여를 임의의 편리한 방식으로, 예를 들어 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 주입 또는 이식에 의해 수행할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 조성물을 비경구로 투여한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된"이란 어구는 장 및 국소 투여 외의 투여 방식, 대개는 주사에 의한 투여 방식을 지칭하며, 비제한적으로 혈관내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 관절낭내, 안와내, 종양내, 심장내, 피내, 복강내, 기관지경, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 명세서에서 고려되는 조성물을 피실험자에게 직접 주사에 의해 종양, 림프절 또는 감염 부위에 투여한다.
하나의 실시태양에서, 조성물의 투여가 필요한 피실험자에게 유효량의, 상기 피실험자에서 B 세포 관련 병증에 대한 세포 면역 반응을 증가시키는 조성물을 투여한다. 상기 면역 반응은 감염된 세포를 살해할 수 있는 세포독성 T 세포, 조절성 T 세포 및 헬퍼 T 세포 반응에 의해 매개되는 세포 면역 반응을 포함할 수 있다. B 세포를 활성화할 수 있고 따라서 항체 생성을 유도할 수 있는 헬퍼 T 세포에 의해 주로 매개되는 체액 면역 반응이 또한 유도될 수 있다. 다양한 기법들을 본 발명의 조성물에 의해 유도되는 면역 반응의 유형을 분석하기 위해 사용할 수 있으며, 이는 당해 분야에, 예를 들어 문헌[Current Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & Sons, NY, N.Y]에 충분히 기재되어 있다.
T 세포-매개된 살해의 경우에, CAR-리간드 결합은 상기 T 세포로의 CAR 신호전달을 개시하여, 상기 T 세포가 다양한 기전에 의해 표적 세포 세포사멸을 유도할 수 있는 단백질을 생산하거나 방출하도록 유도하는 다양한 T 세포 신호전달 경로의 활성화를 생성시킨다. 이들 T 세포-매개된 기전은 (비제한적으로) 상기 T 세포로부터 표적 세포내로의 세포내 세포독성 과립의 전달, 표적 세포 살해를 직접적으로(또는 간접적으로 다른 킬러 효과기 세포의 모집을 통해) 유도할 수 있는 염증전 사이토킨의 T 세포 분비, 및 상기 표적 세포상의 동족 사멸 수용체(예를 들어 Fas)에의 결합에 따른 표적 세포 세포사멸을 유도하는 상기 T 세포 표면상의 사멸 수용체 리간드(예를 들어 FasL)의 상향 조절을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 BCMA-발현 B 세포 관련된 병증으로 진단된 피실험자로부터 면역 효과기 세포를 제거하고, 상기 면역 효과기 세포를 본 명세서에서 고려되는 바와 같은 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로 유전자 변형시켜, 변형된 면역 효과기 세포의 집단을 생성시키고, 상기 변형된 면역 효과기 세포의 집단을 동일한 피실험자에게 투여함을 포함하는, B 세포 관련된 병증으로 진단된 피실험자를 치료하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 면역 효과기 세포는 T 세포를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 또한 피실험자에게 CAR 분자를 암호화하는 핵산 구조물을 발현하는 면역 효과기 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 피실험자에서 표적 세포 집단에 대한 면역 효과기 세포 매개된 면역 조절인자 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 기재된 세포 조성물의 투여 방법은 피실험자에서 본 발명의 CAR을 직접 발현시키는 생체외 유전자 변형된 면역 효과기 세포의 재도입 또는 피실험자내로 도입시 상기 CAR을 발현하는 성숙한 면역 효과기 세포로 분화하는 면역 효과기 세포의 유전자 변형된 선조의 재도입을 생성시키기에 유효한 임의의 방법을 포함한다. 한 가지 방법은 생체외에서 말초 혈액 T 세포를 본 발명에 따라 핵산 구조물로 형질도입시키고 상기 형질도입된 세포를 상기 피실험자에게 반송시킴을 포함한다.
본 명세서에 인용된 모든 공보, 특허 출원 및 허여된 특허들은 각각의 개별적인 공보, 특허 출원 또는 허여된 특허가 마치 참고로 구체적이고 개별적으로 인용됨을 가리키는 바와 같이 본 명세서에 참고로 인용된다.
상기 발명을 이해의 명확성을 위해서 예시 및 실시예에 의해 일부 상세히 개시하였지만, 몇몇 변화 및 변형을 첨부되는 특허청구범위의 진의 또는 범위로부터 이탈됨 없이 본 발명에 대해 수행할 수 있음은 본 발명의 교시에 비추어 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 쉽게 자명할 것이다. 하기의 실시예들은 단지 예시로서 제공되며 제한으로서 제공되는 것은 아니다. 당해 분야의 숙련가들은 필수적으로 유사한 결과를 생성시키도록 변화 또는 변형시킬 수 있는 다양한 중요하지 않은 매개변수들을 쉽게 알 것이다.
실시예
실시예 1
항- BCMA CAR의 구성
인간화된 항-BCMA scFv 항체를 함유하는 CAR을, 항-BCMA scFv에 작동적으로 연결된 MND 프로모터, CD8α 및 CD137 공-자극 도메인으로부터의 힌지 및 막관통 도메인에 이어서 CD3ζ 쇄의 세포내 신호전달 도메인을 함유하도록 디자인하였다. 도 1. 상기 항-BCMA CAR은 면역 효과기 세포상에서의 표면 발현을 위한 CD8α 신호 펩티드(SP) 서열을 포함한다. 상기 항-BCMA CAR의 폴리뉴클레오티드 서열을 서열번호 30 내지 44, 70 및 72에 제시하며; 상기 항-BCMA CAR의 폴리펩티드 서열을 서열번호 15 내지 29, 71 및 73에 제시하고; 벡터 지도를 도 1에 도시한다. 표 3 내지 5는 다양한 예시적인 항-BCMA CAR 렌티바이러스 벡터의 다양한 뉴클레오티드 분절들에 대한 정체, 진뱅크 참조, 소스 명 및 인용문을 나타낸다.
뉴클레오티드 정체 진뱅크 참조 소스 명 인용문
1-185 pUC19 플라스미드 주쇄 수납 #L09137.2
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뉴클레오티드 정체 진뱅크 참조 소스 명 인용문
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Mol Ther 17(8):1453-64
4251-4589 CD3-ζ 신호전달 도메인 수납 # NM_000734 CD3-ζ 신호전달 도메인 Milone et al (2009)
Mol Ther 17(8):1453-64
4590-4700 U3의 HIV-1 ppt 및 부분 수납 #M19921.2
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뉴클레오티드 정체 진뱅크 참조 소스 명 인용문
1-185 pUC19 플라스미드 주쇄 수납 #L09137.2
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185-222 링커 해당 없음 합성 해당 없음1
223-800 CMV 해당 없음 pHCMV (1994) PNAS 91: 9564-68
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J Virol: 65(11):5732-43
1241-1243 제2 정지 코돈으로 변화된 HIV-1 gag 서열 해당 없음 합성 해당 없음1
1244-1595 HIV-1 gag 서열 수납 #M19921.2
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2709-3096 MND 해당 없음 pccl-c-MNDU3c-x2 Challita et al . (1995)
J.Virol. 69: 748-755
3097-3125 링커 해당 없음 합성 해당 없음1
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3936-4118 PD-1 힌지 및 TM 수납 # NM_005018 프로그램화된 세포사 1 (PDCD1)
 해당 없음1
4119-4244 CD137 (4-1BB) 신호전달 도메인 수납 # NM_001561 CD137 신호전달 도메인 Milone et al (2009)
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4245-4583 CD3-ζ 신호전달 도메인 수납 # NM_000734 CD3-ζ 신호전달 도메인 Milone et al (2009)
Mol Ther 17(8):1453-64
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실시예 2
인간화된 항- BCMA CAR의 대량 고속처리 스크리닝
항-BCMA CAR을 신속하게 스크리닝하기 위해서 미세배양 분석이 개발되었다. 상기 미세배양 분석은 15 내지 20개의 CAR 변형된 T 세포(CAR T 세포)를 비교할 수 있다. 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 IL-2(셀제닉스(CellGenix)) 및 CD3 및 CD28(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))에 특이적인 항체를 함유하는 배지 중에서 24-웰 플레이트에서 배양하여 T 세포의 성장을 개시시켰다. 확대된 T 세포는 7일의 배양 후에 >99% CD3 양성 T 세포였다.
PBMC로부터 확대된 T 세포를 렌티바이러스에 의해 변형시켜 항-BCMA CAR을 발현시켰다. 일시적인 렌티바이러스 상등액을 배양 개시 하루 후에 상기 PBMC 배양물에 1:1 비(부피:부피)로 가하였다. 배양물을, 광 도립현미경을 사용하여 광학적으로 융합성으로 된 후에 필요에 따라 IL-2를 함유하는 신선한 배지로 분할하였다. 12일의 배양 후에, CAR T 세포를 수확하고 CAR 발현 및 기능에 대해서 평가하였다.
상기 T 세포 표면상에서의 CAR의 발현을 상기 CAR의 단쇄 가변 단편 부분에 반응성인 항체(염소 항-마우스 Ig(GAM), 라이프 테크놀로지스)를 사용하여 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 3개의 별도의 정상 공여체 중 15개 CAR 각각의 평균 발현을 표 6에 나타낸다. CAR들의 발현은 필적할만하며 47% 내지 63% CAR-양성 T 세포의 범위였다. 다양한 CAR 구조물들 가운데 형질도입 효율(표 6에서 VCN으로서 나타냄)을 시험하였다. VCN은 통합된 바이러스를 증폭시키는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 분석되었다.
구조물 서열 변화 ( % ) 평균 CAR 발현 평균 VCN
항-BCMA-20 19.6 47.0 5.7
항-BCMA-10 19.15 49.1 6.6
항-BCMA-21 18.5 55.4 6.1
항-BCMA-30 18.25 48.5 6.3
항-BCMA-11 18.05 50.1 5.6
항-BCMA-22 17.25 57.6 6.7
항-BCMA-31 17.15 55.0 5.6
항-BCMA-12 16.8 53.8 5.5
항-BCMA-23 16.4 62.3 6.1
항-BCMA-24 15.95 56.1 6.6
항-BCMA-13 15.95 54.0 5.7
항-BCMA-32 15.9 59.0 7.8
항-BCMA-14 15.5 52.9 6.8
항-BCMA-33 15.05 59.2 6.2
항-BCMA-34 14.6 56.0 6.2
실시예 3
CAR T 세포의 항원 특이 반응성
항원-특이 반응성을 BCMA-양성 세포주와의 공-배양 후에 검사하였다. 항-BCMA CAR T 세포를 24시간 동안 BCMA-조작된 K562(K562-BCMA) 세포와 공-배양하였다. K562-BCMA에 대한 항-BCMA CAR T 세포의 반응성을 ELISA에 의해 상등액내로의 IFN-감마(IFNγ) 방출에 의해 분석하였다. 시험된 모든 인간화된 항-BCMA CAR T 세포는 유사한 양의 IFNγ를 방출하였으며 상기 량은 모 마우스 항-BCMA CAR에 필적하였다. 도 2. 대조적으로, IFNγ는, 형질도입되지 않았거나 CD19-특이성 CAR T 세포를 함유하는 배양물에서 검출되지 않았으며, 이는 상기 CAR T 세포의 BCMA-특이성이 K562-BCMA 세포에 대한 반응성에 필요함을 입증한다.
또 다른 실험 세트에서, 5개의 인간화된 항-BCMA CAR 중 하나를 발현하는 T 세포의 종양 세포용해 활성을 검사하였다. 항-BCMA CAR T 세포를 4시간 동안 K562-BCMA 세포와 공-배양하였다. 상기 5개의 인간화된 항-BCMA CAR T 세포는 3개의 T 세포:종양 비에 걸쳐 K562-BCMA에 대해 유사한 세포용해 활성을 나타내었다. 도 3. 놀랍게도, 시험된 모든 인간화된 항-BCMA CAR T 세포는 모 마우스 항-BCMA CAR T 세포보다 더 큰 세포용해 활성을 나타내었다.
실시예 4
인간화된 항- BCMA CAR T 세포의 표현형 및 기능
3개의 인간화된 항-BCMA 구조물(항-BCMA-10, 항-BCMA-11, 항-BCMA-31)의 표현형 및 기능을 큰 임상 제조 공정으로 직접 확장가능한(scalable) 배양 시스템에서 평가하였다. 간단히, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 IL-2(셀제닉스) 및 CD3 및 CD28에 특이성인 항체(밀테니 바이오텍)를 함유하는 배지 중에서 정적 플라스크에서 배양하였다. 배양 개시 하루 후에 항-BCMA CAR을 암호화하는 렌티바이러스의 2x108 형질도입 단위를 가하였다. 항-BCMA CAR T 세포를, 총 10일의 배양 동안 IL-2를 함유하는 신선한 배지를 가함으로써 로그-기에서 유지시켰다. 마우스 항-BCMA CAR(BCMA-02), 상기 3개의 인간화된 항-BCMA CAR, 또는 신호전달 능력이 없는 항-CD19 CAR(CAR19Δ)로 형질도입된 T 세포들을 3개의 정상 공여체(800290, 800309, 801269)로부터 확대시켰다. CAR T 세포를 배양의 끝에서 CAR 발현 및 항원 및 종양 세포 반응성에 대해 평가하였다.
상기 T 세포 표면상에서의 항-BCMA CAR의 발현을 상기 CAR의 단쇄 가변 단편 부분에 반응성인 항체(염소 항-마우스 Ig(GAM), 라이프 테크놀로지스)를 사용하여 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 도 4. 필적하는 CAR 발현이 마우스(msBCMA-02) 또는 인간화된 서열(항-BCMA-10, 항-BCMA-11, 항-BCMA-31)에 대해서 관찰되었다. 마우스 또는 인간화된 항-BCMA CAR 발현에서 상기 3개의 공여체 전부 간에 현저한 차이는 관찰되지 않았다(표 7).
CAR 발현 ( GaM )
UnTD CAR19 △ BCMA -02 BCMA -10 BCMA -11 BCMA -31
800290 2.22 19.1 60.9 85.2 64.0 68.4
800309 2.37 13.9 56.6 77.9 54.4 57.9
801269 2.16 19.1 52.2 64.1 57.2 57.6
평균
(± SE ) 		2.25
(±0.1)		 17.4
(±1.7)		 56.6
(±2.5)		 75.7
(±6.2)		 58.5
(±2.8)		 61.3
(±3.6)
상기 항-BCMA CAR T 세포들간에 형질도입 효율에서 현저한 차이는 관찰되지 않았다. 통합된 바이러스를 증폭시키는 프라이머들을 사용하여 PCR에 의해 분석된 벡터 사본수(VCN)는 모든 항-BCMA CAR T 세포에서 필적하였다(표 8).
벡터 사본수 (VCN )
UnTD CAR19D BCMA -02 BCMA -10 BCMA -11 BCMA -31
800290 0 1.4 4.3 3.9 3.1 3.6
800309 0 1.1 3.9 3.1 2.3 2.8
801269 0 1.1 3.9 2.6 2.5 2.7
평균
(± SE ) 		0 1.2 (±0.2) 4.0 (±0.2) 3.2 (±0.7) 2.6 (±0.4) 3.0 (±0.5)
BCMA 양성 세포주 및 종양에 대한 상기 항-BCMA CAR T 세포의 반응성을 평가하였다. 필적하는 IFNγ 방출이 항-BCMA CAR T 세포와 K562-BCMA(소량 또는 다량의 BCMA를 발현하는) 세포 또는 다수의 골수종 세포주(RPMI-8226, NCI-H929)와의 공-배양 후에 관찰되었으나, BCMA-음성 세포주(HDLM-2, K562)의 경우에는 관찰되지 않았다. 도 5.
항-BCMA CAR을 발현하는 T 세포의 세포용해 활성을 검사하였다. 항-BCMA CAR T 세포를 4시간 동안 K562-BCMA 세포와 공-배양하였다. 시험된 모든 항-BCMA CAR T 세포는 필적하는 K562-BCMA 세포 세포독성을 유발하였다. 도 6.
실시예 5
인간화된 항- BCMA CAR T 세포의 지속적인 사이토킨 방출
특정한 실시태양에서, 항-BCMA CAR 분자는 자극의 부재하에서 사이토킨을 방출할 수 있다. 상기 항원-독립적인("지속적인") 사이토킨 방출은, 그의 항원의 존재가 결여된 조건에서 시험관내 배양 후에 관찰될 수 있다.
인간화된 항-BCMA-10 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포로부터의 지속적인 사이토킨 방출이 관찰되었다. 상기 인간화된 항-BCMA10이 마우스 항-BCMA-02로부터 유래되어, 마우스 서열에 대해 면역 반응성이게 하는 잠재적인 면역원성을 감소시켰다. 총 20% 미만의 서열 차이가 항-BCMA-02와 항-BCMA-10 CAR 분자 사이에 존재한다. 이러한 차이에도 불구하고, CAR 발현 또는 BCMA 항원에 대한 반응성의 차이는 마우스 항-BCMA-02와 인간화된 항-BCMA-10 간에 관찰되지 않았다(도 5 및 표 7). 그러나 BCMA의 부재하에서 인간화된 항-BCMA-10 CAR T 세포는 현저하게 더 많은 염증성 사이토킨을 방출시켰다. 도 7.
마우스 항-BCMA-02 또는 인간화된 항-BCMA-10 CAR T 세포를, 인간 혈청을 함유하지만 어떠한 BCMA도 없는 배지에서 밤새 배양하였다. 상등액내로 방출된 12개 사이토킨의 수준을 다중 비드 접근법(루미넥스(Luminex) 분석)을 사용하여 측정하였다. 5x104 개의 인간화된 항-BCMA-10 CAR T 세포는 MIP1α, MIP1β, IFNγ, GMCSF, IL-8, 및 TNFα를 포함한 염증성 사이토킨을 5 ng/㎖까지 방출하였다. 동일한 양의 마우스 항-BCMA-02 CAR T 세포는 200 pg/㎖ 미만을 방출하였다. 어떠한 CAR 변형도 IL-10 및 IL-4를 포함한 소염성 사이토킨의 방출에 영향을 미치지 않았다.
지속적인 사이토킨 방출은 항-CD19 CAR T 세포로 처리된 환자에서 과도한 사이토킨 방출에 의해 야기된 공지된 독성의 우려를 제기한다. 인간화된 항-BCMA-10 CAR T 세포로부터 관찰된 높은 항원-독립적인, 지속적인 사이토킨 방출은 BCMA 항원의 부재하에서조차 환자에서 독성 수준의 사이토킨을 야기할 수 있었다. 인간화된 항-BCMA-10을 생성시키도록 마우스 항-BCMA-02에 대해 수행된 서열 변화는, 마우스 항-BCMA-02 T 세포에서 관찰되지 않은, 인간 혈청 중 단백질에 대한 발생기 반응성을 도입시킬 수 있었다. 인간 혈청 단백질에 대한 반응성은 인간화된 항-BCMA-10에서 관찰된 "지속적인" 사이토킨 방출을 설명할 수 있었다.
마우스 항-BCMA-02 및 인간화된 항-BCMA-10 CAR T 세포를 인간 혈청 대신 송아지 태아 혈청을 함유하는 배지에서 48시간 동안 휴지시켰다. 상기 CAR T 세포를 인간 혈청을 함유하는 배지로 변환시켰으며 방출된 IFNγ의 양을 송아지 태아 혈청에서 유지시킨 배양물과 비교하였다. 배양 배지는 어느 CAR T 세포로부터의 IFN-γ 방출에도 영향을 미치지 않았다. IFNγ는 마우스 항-BCMA-02 CAR T 세포의 배양의 끝에서 검출되지 않은 반면 인간화된 항-BCMA10 배양물은 배양 배지에 관계 없이 약 4 ng/㎖의 IFNγ를 함유하였다(도 8). 마우스 항-BCMA-02 CAR T 세포에서 반응성의 결여는 T 세포 기능장애에 기인하지 않았다: 항-BCMA CAR T 세포는 모두 플레이트-고정화된 BCMA에 반응하였다(데이터 도시 안 됨).
실시예 6
인간화된 항- BCMA CAR T 세포에서 사이토킨 방출 조율(tuning)
CAR 함유 마우스 서열은 바람직하지 못한 면역 반응을 유발할 잠재성을 갖는다. CAR 임상 시험에서 일화적 증거는 상기 면역 반응이 일부 환자에서 CAR T 세포의 효능을 제한할 수 있음을 암시하였다. 마우스 서열의 인간화는 마우스 서열에 대한 상기 면역 반응을 감소시키는 전략이다. 인간화된 항-BCMA-10 CAR은 지속적인 염증성 방출을 도입시켰다. 항-BCMA-10 CAR T 세포의 항원 인식 도메인을 CD8α 막관통 도메인을 사용하여 상기 T 세포 표면에 구속시킨다. 상기 막관통 도메인의 정체 및 CAR 분자의 이량체화의 그의 영향 및 항원 부재하에서의 후속적인 활성화를 검사하였다.
항-BCMA-10 CAR 분자를, 상기 CD8α 막관통 도메인을 CTLA-4(항-BCMA-10.2) 또는 PD-1(항-BCMA-10.5) 막관통 도메인으로 치환시키도록 구성하였다(도 9). 항-BCMA-10.2 및 항-BCMA-10.5의 발현을 IgG1 Fc-PE에 접합된 재조합 인간 BCMA 단백질을 염색하고 유식세포 측정을 사용하여 분석함으로써 항-BCMA-10과 비교하였다. 표 9는 3개의 CAR 분자 모두의 확고한 표면 발현이 관찰된 2개의 전형적인 정상 공여체 T 세포로부터의 결과를 도시한다.
구조물 공여체 1 공여체 2
항-BCMA-10 90.4 87.7
항-BCMA-10.2 86.2 86.7
항-BCMA-10.5 76.2 78.0
BCMA 양성 K562 세포주에 대한 항-BCMA CAR T 세포의 반응성을 평가하였다. 필적하는 IFNγ 방출이 항-BCMA-10, 항-BCMA-10.2 또는 항-BCMA-10.5와 K562-BCMA 세포의 공-배양 후에 관찰되었다(도 10). 상기 데이터는 상기 막관통 도메인을 CTLA-4 또는 PD-1으로부터의 서열로 변화시키는 것이 상기 항-BCMA-10 CAR T 세포의 반응성에 영향을 미치지 않았음을 보인다.
지속적인 사이토킨 방출을, 마우스 항-BCMA-02, 또는 인간화된 항-BCMA-10, 항-BCMA-10.2 또는 항-BCMA-10.5와의 밤새 배양물의 상등액에서 IFNγ를 측정함으로써 평가하였다. 항-BCMCA-02 배양물은 앞서 관찰된 바와 같이 소량의 IFNγ를 함유하였다. 항-BCMA-10 배양물로부터의 상등액은 보다 많은 양의 IFNγ를 함유하였다. 항-BCMA-10.2 및 항-BCMA-10.5 배양물은 항-BCMA-02에 필적하는 IFNγ 수준을 함유하였고 항-BCMA-10 CAR T 세포보다 적은 수준을 함유하였다(도 11). 이들 데이터는 상기 막관통 도메인이 CAR T 세포의 항원 반응성에 영향을 미치지 않으면서 상기 지속적인 사이토킨 방출을 감소시킬 수 있음을 암시한다.
일반적으로, 하기의 특허청구범위에서, 사용되는 용어들을 본 명세서 및 특허청구범위에 개시된 특정한 실시태양들로 상기 특허청구범위를 제한하는 것으로서 해석해서는 안 되며, 상기와 같은 특허청구범위가 권리를 부여한 균등물의 전체 범위와 함께 모든 가능한 실시태양들을 포함하는 것으로 해석해야 한다. 상응하게, 특허청구범위는 상기 명세에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> bluebird bio, Inc. <120> BCMA CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS <130> IPA170102-US <150> US 62/028,664 <151> 2014-07-24 <150> US 62/044,103 <151> 2014-08-29 <150> US 62/152,575 <151> 2015-04-24 <160> 73 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 1 Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val Ile Gly Ala His Leu Ile His 1 5 10 15 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 2 Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 3 Leu Gln Ser Arg Ile Phe Pro Arg Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 4 Asp Tyr Ser Ile Asn 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 5 Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 6 Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 7 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized anti-BCMA antibody Light Chain <400> 7 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 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ccagcggcta caccttcacc 540 gactacagca tcaactgggt gaggcaggcc cctggacagg gactggagtg gatgggctgg 600 atcaacaccg agaccaggga gcccgcctac gcctacgact tcaggggcag gttcgtgttc 660 agcctggaca ccagcgtgag caccgcctac ctgcagatca gcagcctgaa ggccgaggac 720 accgccgtgt actactgcgc cagggactac agctacgcca tggactactg gggccagggc 780 accctggtga cagtgtccag cgcggccgca accacaacac ctgctccaag gccccccaca 840 cccgctccaa ctatagccag ccaaccattg agcctcagac ctgaagcttg caggcccgca 900 gcaggaggcg ccgtccatac gcgaggcctg gacttcgcgt gtgatattta tatttgggcc 960 cctttggccg gaacatgtgg ggtgttgctt ctctcccttg tgatcactct gtattgtaag 1020 cgcgggagaa agaagctcct gtacatcttc aagcagcctt ttatgcgacc tgtgcaaacc 1080 actcaggaag aagatgggtg ttcatgccgc ttccccgagg aggaagaagg agggtgtgaa 1140 ctgagggtga aattttctag aagcgccgat gctcccgcat atcagcaggg tcagaatcag 1200 ctctacaatg aattgaatct cggcaggcga gaagagtacg atgttctgga caagagacgg 1260 ggcagggatc ccgagatggg gggaaagccc cggagaaaaa atcctcagga ggggttgtac 1320 aatgagctgc agaaggacaa gatggctgaa gcctatagcg agatcggaat 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780 accctggtga ccgtgagcag cgcggccgca accacaacac ctgctccaag gccccccaca 840 cccgctccaa ctatagccag ccaaccattg agcctcagac ctgaagcttg caggcccgca 900 gcaggaggcg ccgtccatac gcgaggcctg gacttcgcgt gtgatattta tatttgggcc 960 cctttggccg gaacatgtgg ggtgttgctt ctctcccttg tgatcactct gtattgtaag 1020 cgcgggagaa agaagctcct gtacatcttc aagcagcctt ttatgcgacc tgtgcaaacc 1080 actcaggaag aagatgggtg ttcatgccgc ttccccgagg aggaagaagg agggtgtgaa 1140 ctgagggtga aattttctag aagcgccgat gctcccgcat atcagcaggg tcagaatcag 1200 ctctacaatg aattgaatct cggcaggcga gaagagtacg atgttctgga caagagacgg 1260 ggcagggatc ccgagatggg gggaaagccc cggagaaaaa atcctcagga ggggttgtac 1320 aatgagctgc agaaggacaa gatggctgaa gcctatagcg agatcggaat gaaaggcgaa 1380 agacgcagag gcaaggggca tgacggtctg taccagggtc tctctacagc caccaaggac 1440 acttatgatg cgttgcatat gcaagccttg ccaccccgct aatga 1485 <210> 43 <211> 1485 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized anti-BCMA-33-CAR <400> 43 atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca 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gatccactgg 180 tatcagcaga agcccggcca gcctcccaag ctgctgatct acctggccag caacctggaa 240 accggcgtgc ccgccagatt tagcgggagc ggctccggca ccgacttcac actgaccatc 300 agcagggtgc aggctgagga cgccgccatc tacagctgcc tgcagagcag aatcttcccc 360 aggaccttcg gccagggcac caagctggag atcaagggca gcaccagcgg cagcggcaag 420 cccggctccg gagagggctc caccaagggc cagatccagc tggtgcagag cggcagcgag 480 ctgaagaagc ccggcgagtc cgtgaagatc agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc 540 gactacagca tcaactgggt gaagcaggcc cctggacagg gcctgaagtg gatgggctgg 600 atcaacaccg aaaccaggga gcccgcctac gcctacgact tcaggggcag gttcgtgttc 660 tccctggaca cctccgccag caccgcctac ctgcagatca gctccctgaa ggccgaggac 720 accgccgtgt acttctgcgc cctggactac agctacgcca tggactactg gggccaggga 780 accctggtga ccgtgagcag cgcggccgca accacaacac ctgctccaag gccccccaca 840 cccgctccaa ctatagccag ccaaccattg agcctcagac ctgaagcttg caggcccgca 900 gcaggaggcg ccgtccatac gcgaggcctg gacttcgcgt gtgatattta tatttgggcc 960 cctttggccg gaacatgtgg ggtgttgctt ctctcccttg tgatcactct gtattgtaag 1020 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humanized anti-BCMA-10.2-CAR <400> 70 atggccctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgccaga 60 cccgacatcg tgctgacaca gagccctgcc agcctggccg tgagcctggg agaaagggcc 120 accatcaact gcagggcctc cgaaagcgtg agcgtgatcg gcgcccacct gatccactgg 180 tatcagcaga agcccggcca gcctcccaag ctgctgatct acctggccag caacctggaa 240 accggcgtgc ctgccaggtt tagcgggagc ggcagcggca ccgatttcac cctgaccatc 300 agcagcctgc aggccgagga cgctgccatc tactactgcc tgcagtccag gatcttcccc 360 aggaccttcg gccagggcac caagctggag atcaagggca gcaccagcgg cagcggcaag 420 cccggctccg gagagggcag caccaagggc caggtgcagc tggtgcagag cggcagcgag 480 ctgaagaaac ccggcgccag cgtgaaggtg agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc 540 gactacagca tcaactgggt gaggcaggcc cctggacagg gactggagtg gatgggctgg 600 atcaacaccg agaccaggga gcccgcctac gcctacgact tcaggggcag gttcgtgttc 660 agcctggaca ccagcgtgag caccgcctac ctgcagatca gcagcctgaa ggccgaggac 720 accgccgtgt actactgcgc cagggactac agctacgcca tggactactg gggccagggc 780 accctggtga cagtgtccag cgcggccgca gacaccggcc tctatatctg caaggtggaa 840 ctgatgtatc ccccacccta ttacctgggc attggaaatg gaacacagat atatgtgatt 900 gaccctgaac cttgtcctga ctctgacttc ctgttgtgga tactcgctgc agtctccagc 960 ggtctcttct tctactcctt cctgctgact gccgtctcta aacgcggccg aaagaagctt 1020 ctgtacatct tcaagcagcc ttttatgcga cctgtgcaaa ccactcagga agaagatggg 1080 tgttcatgcc gcttccccga ggaggaagaa ggagggtgtg aactgagggt gaaattttct 1140 agaagcgccg atgctcccgc atatcagcag ggtcagaatc agctctacaa tgaattgaat 1200 ctcggcaggc gagaagagta cgatgttctg gacaagagac ggggcaggga tcccgagatg 1260 gggggaaagc cccggagaaa aaatcctcag gaggggttgt ataatgagct gcagaaggac 1320 aagatggctg aagcctatag cgagatcgga atgaaaggcg aaagacgcag aggcaagggg 1380 catgacggtc tgtaccaggg tctctctaca gccaccaagg acacttatga tgcgttgcat 1440 atgcaagcct tgccaccccg ctaatga 1467 <210> 71 <211> 487 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized anti-BCMA-10.2-CAR <400> 71 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu 35 40 45 Ser Val Ser Val Ile Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu 65 70 75 80 Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr 100 105 110 Cys Leu Gln Ser Arg Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly 130 135 140 Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu 145 150 155 160 Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 165 170 175 Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 180 185 190 Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro 195 200 205 Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr 210 215 220 Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 225 230 235 240 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 245 250 255 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Asp Thr 260 265 270 Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr 275 280 285 Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro 290 295 300 Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser 305 310 315 320 Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Lys Arg Gly 325 330 335 Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val 340 345 350 Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu 355 360 365 Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 370 375 380 Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 385 390 395 400 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 405 410 415 Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 420 425 430 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 435 440 445 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 450 455 460 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 465 470 475 480 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 72 <211> 1461 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized anti-BCMA-10.5-CAR <400> 72 atggccctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgccaga 60 cccgacatcg tgctgacaca gagccctgcc agcctggccg tgagcctggg agaaagggcc 120 accatcaact gcagggcctc cgaaagcgtg agcgtgatcg gcgcccacct gatccactgg 180 tatcagcaga agcccggcca gcctcccaag ctgctgatct acctggccag caacctggaa 240 accggcgtgc ctgccaggtt tagcgggagc ggcagcggca ccgatttcac cctgaccatc 300 agcagcctgc aggccgagga cgctgccatc tactactgcc tgcagtccag gatcttcccc 360 aggaccttcg gccagggcac caagctggag atcaagggca gcaccagcgg cagcggcaag 420 cccggctccg gagagggcag caccaagggc caggtgcagc tggtgcagag cggcagcgag 480 ctgaagaaac ccggcgccag cgtgaaggtg agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc 540 gactacagca tcaactgggt gaggcaggcc cctggacagg gactggagtg gatgggctgg 600 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cccgctaatg a 1461 <210> 73 <211> 485 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized anti-BCMA-10.5-CAR <400> 73 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu 35 40 45 Ser Val Ser Val Ile Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu 65 70 75 80 Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr 100 105 110 Cys Leu Gln Ser Arg Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly 130 135 140 Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu 145 150 155 160 Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 165 170 175 Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 180 185 190 Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro 195 200 205 Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr 210 215 220 Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 225 230 235 240 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 245 250 255 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gln Ile 260 265 270 Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu 275 280 285 Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe 290 295 300 Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser Leu Val 305 310 315 320 Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys Ser Lys Arg Gly Arg Lys 325 330 335 Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr 340 345 350 Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu 355 360 365 Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro 370 375 380 Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly 385 390 395 400 Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro 405 410 415 Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr 420 425 430 Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly 435 440 445 Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln 450 455 460 Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln 465 470 475 480 Ala Leu Pro Pro Arg 485

Claims (86)

  1. 인간 BCMA(B 세포 성숙화 항원) 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 인간화된 항-BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 키메릭 항원 수용체의 항원 독립적인 사이토킨 방출을 감소시키는, (i) CTLA-4 힌지 및 CTLA-4 막관통 도메인 및 (ii) PD-1 힌지 및 PD-1 막관통 도메인으로부터 선택되는, 힌지 및 막관통 도메인, 하나 이상의 세포내 공-자극 신호전달 도메인, 및 주요 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR).
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 인간 BCMA 폴리펩티드에 결합하는 인간화된 항-BCMA 항체 또는 항원 결합 단편이 카멜(Camel) Ig, Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단쇄 Fv 항체(scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 디설파이드 안정화된 Fv 단백질(dsFv), 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디)로 이루어지는 그룹 중에서 선택되거나;
    (b) 인간 BCMA 폴리펩티드에 결합하는 인간화된 항-BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 scFv이거나;
    (c) 인간화된 항-BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 CDR을 포함하거나;
    (d) 인간화된 항-BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 CDR을 포함하거나;
    (e) 인간화된 항-BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열번호 7 내지 9 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열을 포함하거나;
    (f) 인간화된 항-BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열번호 7 내지 9 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열을 포함하되, 가변 경쇄 서열이 서열번호 1 내지 3에 제시된 CDR 서열을 포함하거나;
    (g) 인간화된 항-BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열번호 10 내지 14 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열을 포함하거나;
    (h) 인간화된 항-BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열번호 10 내지 14 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열을 포함하되, 가변 중쇄 서열이 서열번호 4 내지 6에 제시된 CDR 서열을 포함하거나;
    (i) 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인이 CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD152(CTLA4), CD223(LAG3), CD270(HVEM), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM, 및 ZAP70으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 공-자극 분자로부터의 것이거나;
    (j) 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인이 CD28, CD134 및 CD137로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 공-자극 분자로부터의 것이거나;
    (k) 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인이 CD28, CD134 및 CD137로 이루어진 그룹 중에서 선택된 공-자극 분자로부터의 것이거나;
    (l) 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인이 CD28로부터의 것이거나;
    (m) 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인이 CD134로부터의 것이거나;
    (n) 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인이 CD137로부터의 것이거나;
    (o) CAR이 스페이서 영역을 추가로 포함하거나;
    (p) CAR이 IgG1 또는 IgG4의 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 스페이서 영역 폴리펩티드를 추가로 포함하거나;
    (q) CAR이 신호 펩티드를 추가로 포함하거나;
    (r) CAR이 IgG1 중쇄 신호 폴리펩티드, CD8α 신호 폴리펩티드, 또는 인간 GM-CSF 수용체 알파 신호 폴리펩티드를 추가로 포함하거나; 또는
    (s) CAR이 서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 71, 및 73 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
  3. 제1항의 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  4. CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 폴리뉴클레오티드 서열이 서열번호 70 및 72 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드.
  5. 제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  6. 제5항에 있어서,
    (a) 벡터가 발현 벡터이거나;
    (b) 벡터가 에피솜 벡터이거나;
    (c) 벡터가 바이러스 벡터이거나;
    (d) 벡터가 레트로바이러스 벡터이거나;
    (e) 벡터가 렌티바이러스 벡터이거나; 또는
    (f) 벡터가 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1); 인간 면역결핍 바이러스 2(HIV-2); 비스나-메디 바이러스(VMV) 바이러스; 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV); 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역 결핍 바이러스(BIV); 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)로 필수적으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 벡터가 좌측(5') 레트로바이러스 LTR, 프사이(ψ) 패키징 신호, 중심 폴리퓨린 트랙/DNA 플랩(cPPT/FLAP), 레트로바이러스 외수송 요소; 제3항 또는 제4항의 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터; 및 우측(3') 레트로바이러스 LTR을 포함하는, 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
  8. 제7항에 있어서,
    (a) 벡터가 이종 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함하거나;
    (b) 벡터가 B형 간염 바이러스 전사후 조절 요소(HPRE) 또는 우드척 전사후 조절 요소(WPRE)를 추가로 포함하거나;
    (c) 5' LTR의 프로모터가 이종 프로모터로 치환되거나;
    (d) 5' LTR의 프로모터가 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 및 유인원 바이러스 40(SV40) 프로모터로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 이종 프로모터로 치환되거나;
    (e) 5' LTR 또는 3' LTR이 렌티바이러스 LTR이거나;
    (f) 3' LTR이 하나 이상의 변형을 포함하거나;
    (g) 3' LTR이 하나 이상의 결실을 포함하거나;
    (h) 3' LTR이 자기-불활성화(SIN) LTR이거나;
    (i) 폴리아데닐화 서열이 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 또는 신호 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 서열이거나;
    (j) 폴리뉴클레오티드가 최적화된 코작(Kozak) 서열을 포함하거나; 또는
    (k) 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터가 거대세포바이러스 전초기 유전자 프로모터(CMV), 신장 인자 1 알파 프로모터(EF1-α), 포스포글리세레이트 키나제-1 프로모터(PGK), 유비퀴틴-C 프로모터(UBQ-C), 거대세포바이러스 인헨서/치킨 베타-액틴 프로모터(CAG), 폴리오마 인헨서/헤르페스 단순 티미딘 키나제 프로모터(MC1), 베타 액틴 프로모터(β-ACT), 유인원 바이러스 40 프로모터(SV40), 및 골수증식성 육종 바이러스 인헨서, 음성 조절 영역 결실된, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) 프로모터로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, 벡터.
  9. 제6항의 벡터를 포함하는 단리된 면역 효과기 세포.
  10. 제9항에 있어서, T 림프구 및 천연 살해(NK) 세포로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, 단리된 면역 효과기 세포.
  11. 제9항의 단리된 면역 효과기 세포 및 생리학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, B 세포암(B cell malignancy)의 치료를 위한 조성물.
  12. 제1항에 따른 CAR을 포함하는 단리된 면역 효과기 세포의 생성 방법으로, 제6항의 벡터를 상기 면역 효과기 세포에 도입시킴을 포함하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 치료 유효량의 면역 효과기 세포를 포함하는, 조성물.
  14. 제11항에 있어서, B 세포암이 다발성 골수종(multiple myeloma, MM), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma, NHL), 또는 불확실한 악성 잠재성의 B 세포 증식인, 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    MM이 현성 다발성 골수종, 무증후성(smoldering) 다발성 골수종, 형질세포 백혈병, 비-분비성 골수종, IgD 골수종, 골경화성 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 및 골수외 형질세포종으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고; 또는
    NHL이 버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병/소 림프구성 림프종(CLL/SLL), 미만성 대 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 면역모구성 대세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종 및 외투세포 림프종으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, 조성물.
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