CN116096862A - Zbtb32抑制剂及其用途 - Google Patents

Zbtb32抑制剂及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN116096862A
CN116096862A CN202180042407.9A CN202180042407A CN116096862A CN 116096862 A CN116096862 A CN 116096862A CN 202180042407 A CN202180042407 A CN 202180042407A CN 116096862 A CN116096862 A CN 116096862A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
zbtb32
inhibitor
cancer
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180042407.9A
Other languages
English (en)
Inventor
E·奥兰多
M·埃斯特维兹席尔瓦
Y·甘
Y·徐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
Original Assignee
Novartis AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis AG filed Critical Novartis AG
Publication of CN116096862A publication Critical patent/CN116096862A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

本披露提供了用于治疗诸如癌症等疾病的组合物和方法。本披露还涉及制备改进的CART细胞疗法的方法，例如，具有降低的ZBTB32表达和/或降低的ZBTB32生物活性。本披露进一步提供了ZBTB32抑制剂，以及单独使用或与CART细胞疗法组合使用该抑制剂的方法。

Description

ZBTB32抑制剂及其用途
相关申请
本申请要求2020年6月11日提交的美国临时申请号63/037,826的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请包含按ASCII格式以电子方式提交并特此通过引用以其全文并入的序列表。创建于2021年6月11日的所述ASCII副本名为N2067-7174WO_SL.txt且大小为1,388,334字节。
技术领域
本披露总体上涉及ZBTB32抑制剂及其治疗癌症的用途。
背景技术
使用嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞(CART)疗法的最新发展依赖于将T细胞重定向至癌细胞上的合适细胞表面分子，该最新发展在利用免疫系统治疗癌症的能力方面显示出有希望的结果(参见例如，Sadelain等人,Cancer Discovery[癌症发现]3:388-398(2013))。鉴于对针对诸如癌症等疾病的改进策略的持续需求，非常需要用于治疗癌症，包括改进CART疗法的新型组合物和方法。
发明内容
本文尤其提供了具有降低的ZBTB32表达和/或降低的ZBTB32生物活性的表达CAR的细胞，制备表达CAR的细胞的方法，以及使用表达CAR的细胞用于治疗具有本文所述疾病或障碍的受试者的方法。本文还披露了包含表达CAR的细胞的核酸、载体和组合物，这些细胞具有降低的ZBTB32表达和/或降低的ZBTB32生物活性。此外，本披露尤其提供了使用ZBTB32抑制剂治疗癌症的方法、增加其他治疗剂或方式的功效的方法以及增加免疫应答的方法。
ZBTB32减少的表达CAR的细胞及其相关方法
在一方面，本文提供表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如细胞群体)，例如免疫效应细胞，其中CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，并且其中该细胞具有降低的ZBTB32表达和/或降低的ZBTB32生物活性。
在实施例中，该细胞不具有可检测的ZBTB32表达和/或生物活性。
在实施例中，该细胞包含ZBTB32抑制剂，或者所述细胞已经接触或正在接触ZBTB32抑制剂。
在实施例中，该ZBTB32抑制剂包含小分子。
在实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含：(1)靶向ZBTB32基因的基因编辑系统或其一种或多种组分；(2)编码所述基因编辑系统的一种或多种组分的核酸；或(3)(1)和(2)的组合。在实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含：(1)靶向ZBTB32基因的基因编辑系统或其一种或多种组分。在实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含(2)编码所述基因编辑系统的一种或多种组分的核酸。在实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含(1)和(2)的组合。
在另一个方面，本文披露了一种提高表达CAR的细胞，例如如前述权利要求中任一项所述的细胞，例如表达CAR19的细胞(例如，CTL019或CTL119)的治疗效果的方法，所述方法包括：降低ZBTB32在细胞中的表达和/或生物学活性，从而增加表达CAR的细胞的治疗效果。
在又另一个方面，本文提供了一种提高表达CAR的细胞，例如如前述权利要求中任一项所述的细胞，例如表达CAR19的细胞(例如，CTL019或CTL119)的治疗效果的方法，所述方法包括：使细胞与ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂接触，从而增加表达CAR的细胞的治疗效果。
在实施例中，该抑制剂是：(a)降低ZBTB32的表达和/或生物活性的小分子；(b)靶向所述ZBTB32基因的基因编辑系统；(c)抑制ZBTB32表达的核酸(例如，siRNA、shRNA或ASO)；(d)由所述ZBTB32基因编码的(例如显性负性)蛋白质，或由所述ZBTB32基因编码的蛋白质的结合配偶体；(e)与由所述ZBTB32基因编码的蛋白质结合的抗体分子(例如单结构域抗体(sdAb)或纳米抗体)；(f)编码(b)或其组分或(c)-(d)中任一项的核酸；或(g)(a)-(f)的任意组合。
在实施例中，将所述细胞与所述ZBTB32抑制剂离体接触。
在实施例中，将所述细胞与所述ZBTB32抑制剂体内接触。
在实施例中，在将编码CAR的核酸递送至所述细胞之前将所述细胞与所述ZBTB32抑制剂体内接触。
在实施例中，在已经将所述细胞施用至有需要的受试者之后将所述细胞与所述ZBTB32抑制剂体内接触。
在实施例中，该方法进一步包括使所述细胞与Tet2抑制剂接触。
在实施例中，该方法进一步包括使所述细胞与IKZF2抑制剂接触。
在实施例中，所述细胞已经与Tet2抑制剂接触。
在实施例中，所述细胞已经与IKZF2抑制剂，例如本文所述的IKZF2抑制剂接触。
在一方面，本文提供了一种用于治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文所述的表达CAR的细胞。
在相关方面，本披露提供了本文所述的表达CAR的细胞，用于在治疗受试者的癌症中使用。
在另一个方面，本文提供了一种用于在治疗有需要的受试者中使用的表达CAR的细胞疗法，其中所述表达CAR的细胞疗法与ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂组合使用。
在实施例中，在开始所述表达CAR的细胞疗法之前，所述受试者接受所述ZBTB32抑制剂的预治疗。
在实施例中，所述受试者接受用所述ZBTB32抑制剂和所述表达CAR的细胞疗法的并行治疗。
在实施例中，所述受试者在表达CAR的细胞疗法后接受用所述ZBTB32抑制剂的治疗。
在实施例中，所述受试者患有与肿瘤抗原(例如本文所述的肿瘤抗原)的表达相关的疾病，例如增生性疾病、癌前病状、癌症、以及与所述肿瘤抗原的表达相关的非癌症相关适应症。
在实施例中，所述用途进一步包括确定所述细胞中ZBTB32的表达和/或生物活性。
在一方面，本文提供了一种治疗受试者的方法，所述方法包括：向受试者施用有效量的ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂，从而治疗受试者，其中该受试者已经接受、正在接受或将要接受包含表达CAR的细胞的疗法。
在相关方面，本披露提供了一种ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂，用于在治疗受试者中使用，其中所述受试者已经接受、正在接受或将要接受包括表达CAR的细胞的疗法。
在又另一个方面，本文提供了一种制造表达CAR的细胞的方法，所述方法包括：将编码CAR的核酸引入细胞中，使得所述核酸(或其CAR编码部分)整合到所述细胞的基因组中，从而降低所述ZBTB32的表达和/或生物活性，从而制造所述表达CAR的细胞。
在实施例中，将所述核酸整合到ZBTB32基因内(例如，整合到ZBTB32基因的内含子或外显子内)。
在实施例中，将所述核酸整合到不同于所述ZBTB32基因的基因内(例如，整合到其他基因的内含子或外显子内)。
在实施例中，根据例如如本文所述的表达CAR的细胞的制造或生产方法来制造表达CAR的细胞。
在一方面，本文提供了一种制造表达CAR的细胞的方法，所述方法包括：
使表达CAR的细胞与ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂离体接触，从而制造所述表达CAR的细胞。
在实施例中，与还未与所述ZBTB32抑制剂离体接触的相同的表达CAR的细胞相比，所述表达CAR的细胞具有改善的特性，例如，本文描述的改善的特性。
在实施例中，所述改善的特性包括体内增强的T细胞介导的抗肿瘤应答、增加的增殖和/或细胞因子产生、减少的T细胞耗竭、增强的耗竭抗性和增强的长期免疫保护，MHCII和/或MHCII反式激活因子CIITA的表达增加，体内扩增率更高，改进的免疫记忆表型，或其任何组合。
在实施例中，根据例如如本文所述的表达CAR的细胞的制造或生产方法来制造表达CAR的细胞。
在另一个方面，本披露提供了包含编码CAR的核苷酸序列和编码ZBTB32抑制剂的核苷酸序列的载体。
在实施例中，该抑制剂是：(a)靶向所述ZBTB32基因的基因编辑系统；(b)抑制ZBTB32表达的核酸(例如，siRNA、shRNA或ASO)；(c)由所述ZBTB32基因编码的(例如显性负性)蛋白质，或由所述ZBTB32基因编码的蛋白质的结合配偶体；(d)与由所述ZBTB32基因编码的蛋白质结合的抗体分子(例如单结构域抗体(sdAb)或纳米抗体)；或(e)(a)-(d)的任意组合。
在实施例中，编码所述CAR的核苷酸序列和编码所述抑制剂的核苷酸序列被2A位点分开。
在另一个方面，本文披露了一种用于离体制造表达CAR的细胞的组合物，所述组合物包含ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂。
在实施例中，该抑制剂是：(a)靶向所述ZBTB32基因的基因编辑系统；(b)抑制ZBTB32表达的核酸(例如，siRNA、shRNA或ASO)；(c)由所述ZBTB32基因编码的(例如显性负性)蛋白质，或由所述ZBTB32基因编码的蛋白质的结合配偶体；(d)与由所述ZBTB32基因编码的蛋白质结合的抗体分子(例如单结构域抗体(sdAb)或纳米抗体)；或(e)(a)-(d)的任意组合。
在实施例中，编码所述CAR的核苷酸序列和编码所述抑制剂的核苷酸序列被2A位点分开。
在一方面，本文提供了包含一种或多种本文所述的表达CAR的细胞的细胞群体，其中与参照细胞群体相比，所述细胞群体包含更高(例如高至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍)百分比的如下细胞，所述细胞具有本文所述的表型或表达本文所述的标志物(例如，与中枢记忆T(TCM)细胞或或干细胞记忆T(TSCM)细胞相关的表型或标志物)。
在又另一个方面，本文提供了包含一种或多种本文所述的表达CAR的细胞的细胞群体，其中所述群体中产生细胞因子的细胞的百分比比参照细胞群体高至少50％(例如，至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％)。
在实施例中，所述参照细胞群体是不包含一个或多个如下细胞的细胞群体，其中在所述细胞中，ZBTB32的表达和/或生物活性已被降低。
在另外的方面，本文提供了包含一种或多种本文所述的表达CAR的细胞的细胞群体，其中所述细胞群体中的至少50％(例如至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％)具有本文所述的表型或表达本文所述的标志物(例如，与中枢记忆T(TCM)细胞或或干细胞记忆T(TSCM)细胞相关的表型或标志物)。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，基因编辑系统是CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶系统、TALEN系统或大范围核酸酶系统。在实施例中，基因编辑系统与ZBTB32基因中的靶序列结合。在实施例中，所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的早期外显子或内含子中的靶序列结合。在实施例中，所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的靶序列结合，并且所述靶序列在外显子4的上游，例如在外显子1、外显子2或外显子3中。在实施例中，所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的晚期外显子或内含子中的靶序列结合。在实施例中，所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的靶序列结合，所述靶序列在倒数第四外显子的下游，例如在倒数第三外显子、倒数第二外显子或最后外显子中。在实施例中，所述基因编辑系统与包含所述ZBTB32基因的剪接连接的靶序列结合。在实施例中，所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的编码区中的靶序列结合。在实施例中，所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的非编码区中的靶序列结合。在实施例中，所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的调节元件中的靶序列结合。在实施例中，所述基因编辑系统是包含指导RNA(gRNA)分子的CRISPR/Cas系统，所述gRNA分子包含与所述ZBTB32基因的靶序列杂交的靶向序列。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含靶向所述ZBTB32基因的小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)，或编码所述siRNA或shRNA的核酸。在实施例中，所述siRNA或shRNA包含与所述ZBTB32基因的mRNA序列互补的核苷酸序列。在实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含靶向所述ZBTB32基因的反义寡核苷酸(ASO)，或编码所述ASO的核酸。在实施例中，所述ASO包含与所述ZBTB32基因的mRNA序列互补的核苷酸序列。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，ZBTB32抑制剂包含蛋白质。在实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含由所述ZBTB32基因编码的蛋白质的显性负性变体，或编码所述显性负性变体的核酸。在实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含由所述ZBTB32基因编码的蛋白质的显性负性结合配偶体，或编码所述显性负性结合配偶体的核酸。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含抗体分子，例如单结构域抗体(sdAb)或纳米抗体，其与由所述ZBTB32基因编码的蛋白质结合，或编码所述抗体分子的核酸。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含编码单结构域抗体(sdAb)或纳米抗体的核酸，所述sdAb或纳米抗体与由所述ZBTB32基因编码的蛋白质结合。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，与参照细胞相比，该细胞具有降低的ZBTB32表达，例如降低至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。在实施例中，ZBTB32蛋白的水平降低。在实施例中，所述ZBTB32蛋白稳定性降低。在实施例中，所述ZBTB32 mRNA水平降低。在实施例中，所述ZBTB32 mRNA稳定性降低。
在实施例中，所述细胞具有降低的ZBTB32转录。在实施例中，所述细胞具有降低的ZBTB32翻译。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，ZBTB32基因组基因座被改变(例如，被破坏)。在实施例中，所述ZBTB32基因包含缺失或插入，例如破坏所述ZBTB32基因组基因座中的可读框(ORF)或CLL超级增强子的缺失或插入。在实施例中，所述ZBTB32基因包含表观基因组修饰，例如降低ZBTB32表达的表观基因组修饰。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，与参照细胞相比，该细胞具有降低的ZBTB32生物活性，例如降低至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。在实施例中，ZBTB32的转录抑制功能降低。在实施例中，ZBTB32与一个或多个结合配偶体之间的相互作用减少。在实施例中，所述一个或多个结合配偶体包括范可尼贫血互补组C(FANCC)、硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)、维生素D3上调蛋白1(VDUP1)、含锌指和BTB结构域的蛋白16(Zbtb16)、锌指肘相关脯氨酸结构域蛋白2(Zpo2)、GATA结合蛋白3(Gata3)、GATA结合蛋白2(Gata2)或B细胞淋巴瘤6(Bcl-6)。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，所述细胞具有增强的T细胞介导的抗肿瘤应答。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，所述细胞具有增加的增殖和/或细胞因子产生。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，所述细胞具有改变的T细胞状态，例如功能失调的T细胞的改变状态，例如减少的T细胞耗竭。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，所述细胞具有增强的体内耗竭抗性和长期免疫保护。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，所述细胞具有增加的MHCII和/或MHCII反式激活因子CIITA表达。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，与参照细胞相比，所述细胞在体内以更高的速率扩增。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，所述细胞具有改善的免疫记忆表型，例如B细胞记忆表型。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，所述细胞是免疫效应细胞(例如免疫效应细胞群体)。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，所述免疫效应细胞是T细胞、B细胞或NK细胞。在实施例中，所述免疫效应细胞是T细胞。在实施例中，所述T细胞是αβT细胞。在实施例中，T细胞是CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或其组合。在实施例中，所述T细胞是CD8+ T细胞或调节性T细胞(Treg)，例如，肿瘤浸润性、功能失调的CD8+ T细胞或Treg。在实施例中，所述细胞是γδT细胞。在实施例中，所述细胞是B细胞。在实施例中，所述细胞是NK细胞。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，细胞是嵌合抗原受体T(CART)细胞，例如，无应答者的制造的CART细胞(non-responder’smanufactured CART cell)。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，所述细胞是人细胞。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，所述细胞还具有降低的Tet2表达和/或降低的Tet2生物活性。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，所述细胞还具有降低的IKZF2表达和/或降低的IKZF2生物活性。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，抗原结合结构域结合选自由以下组成的组的肿瘤抗原：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白(legumain)、HPV E6、HPV E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白(prostein)、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、muthsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、以及IGLL1。
在实施例中，所述肿瘤抗原是CD19、BCMA、CD20或CD22。在实施例中，肿瘤抗原是CD19。在实施例中，肿瘤抗原是BCMA。在实施例中，肿瘤抗原是CD20。在实施例中，肿瘤抗原是CD22。
在实施例中，所述抗原结合结构域是如在例如WO 2012/079000或WO 2014/153270中所述的抗体或抗体片段。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，跨膜结构域包含：具有WO 2012/079000的SEQ ID NO:12的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与WO 2012/079000的SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列；或WO 2012/079000的SEQ ID NO:12的序列。
在实施例中，所述抗原结合结构域通过铰链区与所述跨膜结构域连接，其中所述铰链区包含WO 2012/079000的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6、或其具有95％-99％同一性的序列。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域，其中该初级信号传导结构域包含选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、常见FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεR1b)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10或DAP12的蛋白质的功能性信号传导结构域。在实施例中，初级信号传导结构域包含：具有WO 2012/079000的SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与WO 2012/079000的SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列；或WO 2012/079000的SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域、或初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域，其中所述共刺激信号传导结构域包含选自下组的蛋白质的功能性信号传导结构域，该组由以下组成：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性地结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、以及NKG2D。在实施例中，所述共刺激信号传导结构域包含具有WO 2012/079000的SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与WO 2012/079000的SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。在实施例中，所述共刺激信号传导结构域包含WO 2012/079000的SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的序列。在实施例中，所述细胞内结构域包含WO 2012/079000的SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:16的序列，和WO 2012/079000的SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的序列，其中这些包含所述细胞内信号传导结构域的序列在同一框架中表达并且表达为单个多肽链。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，CAR还包含前导序列，所述前导序列包含WO 2012/079000的SEQ ID NO:2的序列。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，所述癌症是血液癌症。在实施例中，该癌症是淋巴瘤、骨髓瘤或白血病。在实施例中，该癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或白血病前期。
在实施例中，该癌症是B细胞恶性肿瘤，例如B细胞淋巴瘤或白血病。
在实施例中，该癌症是淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，例如活化的B细胞(ABC)DLBCL或生发中心B细胞(GCB)DLBCL。在实施例中，所述癌症是骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤(MM)。在实施例中，该癌症是白血病，例如急性淋巴细胞白血病(ALL)或慢性淋巴细胞白血病(CLL)。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，所述癌症是实体瘤。在实施例中，所述实体瘤与免疫细胞浸润有关。在实施例中，癌症是结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症、或上述癌症的转移性病灶。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，所述癌症表达更高水平的ZBTB32，例如，如通过本文所述的方法所确定的。
在一些实施例中，本文披露的方法或用途还包括向受试者施用第二治疗剂或方式，例如本文所述的癌症疗法。
在一些实施例中，本文披露的方法或用途还包括向受试者施用ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂。
ZBTB32抑制剂用途相关的方法
在一个方面，本披露提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用有效量的ZBTB32抑制剂和第二治疗剂或方式，从而治疗所述受试者的癌症。
在实施例中，所述ZBTB32抑制剂在施用所述第二治疗剂或方式之前、与其并行或之后施用。在实施例中，该ZBTB32抑制剂包含小分子。
在实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含：(1)靶向ZBTB32基因的基因编辑系统或其一种或多种组分；(2)编码所述基因编辑系统的一种或多种组分的核酸；或(3)(1)和(2)的组合。
在实施例中，本文提供了一种ZBTB32抑制剂，用于在治疗受试者的癌症中使用，其中所述ZBTB32抑制剂与第二治疗剂或方式组合使用。
在实施例中，所述ZBTB32抑制剂在施用所述第二治疗剂或方式之前、与其并行或之后施用。在实施例中，该ZBTB32抑制剂包含小分子。
在实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含：(1)靶向ZBTB32基因的基因编辑系统或其一种或多种组分；(2)编码所述基因编辑系统的一种或多种组分的核酸；或(3)(1)和(2)的组合。
在一方面，本文提供了一种增加治疗剂或方式的功效的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂，从而增加所述治疗剂或方式的功效。
在实施例中，受试者患有癌症(例如，本文所述的癌症)。
在实施例中，所述治疗剂或方式包括免疫疗法或细胞疗法，例如本文所述的免疫疗法或细胞疗法。
在相关方面，本文提供了一种ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂，用于在增加治疗剂或方式在受试者中的功效中使用。
在实施例中，受试者患有癌症(例如，本文所述的癌症)。
在实施例中，所述治疗剂或方式包括免疫疗法或细胞疗法，例如本文所述的免疫疗法或细胞疗法。
在一方面，本文提供了一种增加受试者中免疫应答的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂，从而增加所述受试者中的免疫应答。在实施例中，受试者患有癌症(例如，本文所述的癌症)。在实施例中，所述治疗剂或方式包括免疫疗法或细胞疗法，例如本文所述的免疫疗法或细胞疗法。
在相关方面，本披露提供了一种ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂，用于在增加受试者中的免疫应答中使用。在实施例中，受试者患有癌症(例如，本文所述的癌症)。在实施例中，所述治疗剂或方式包括免疫疗法或细胞疗法，例如本文所述的免疫疗法或细胞疗法。
在又另一个方面，本文提供了一种抑制ZBTB32的表达和/或生物活性的方法，所述方法包括：使细胞(例如免疫细胞)与ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂接触；以及任选地进一步使所述细胞与第二治疗剂或方式接触；从而治疗所述细胞。
在实施例中，使所述ZBTB32抑制剂与所述细胞体外、离体或体内接触。
在一方面，本披露提供了一种靶向如本文所述的ZBTB32基因的基因编辑系统。
在实施例中，该系统包括CRISPR/Cas基因编辑系统、锌指核酸酶系统、TALEN系统或大范围核酸酶系统。
在实施例中，该系统包括CRISPR/Cas基因编辑系统。
在实施例中，该系统包括gRNA分子，所述gRNA分子包含对所述ZBTB32基因的序列具有特异性的靶向序列，以及Cas9蛋白；gRNA分子，所述gRNA分子包含对所述ZBTB32基因的序列具有特异性的靶向序列，以及编码Cas9蛋白的核酸；编码gRNA分子的核酸，所述gRNA分子包含对所述ZBTB32基因的序列具有特异性的靶向序列，以及Cas9蛋白；或编码gRNA分子的核酸，所述gRNA分子包含对所述ZBTB32基因的序列具有特异性的靶向序列，以及编码Cas9蛋白的核酸。
在实施例中，该系统进一步包含模板DNA。在实施例中，模板DNA包含编码CAR(例如本文所述的CAR)的核酸序列。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，基因编辑系统是CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶系统、TALEN系统或大范围核酸酶系统。在实施例中，基因编辑系统与ZBTB32基因中的靶序列结合。在实施例中，所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的早期外显子或内含子中的靶序列结合。在实施例中，所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的靶序列结合，并且所述靶序列在外显子4的上游，例如在外显子1、外显子2或外显子3中。在实施例中，所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的晚期外显子或内含子中的靶序列结合。在实施例中，所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的靶序列结合，所述靶序列在倒数第四外显子的下游，例如在倒数第三外显子、倒数第二外显子或最后外显子中。在实施例中，所述基因编辑系统与包含所述ZBTB32基因的剪接连接的靶序列结合。在实施例中，所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的编码区中的靶序列结合。在实施例中，所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的非编码区中的靶序列结合。在实施例中，所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的调节元件中的靶序列结合。在实施例中，所述基因编辑系统是包含指导RNA(gRNA)分子的CRISPR/Cas系统，所述gRNA分子包含与所述ZBTB32基因的靶序列杂交的靶向序列。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含靶向所述ZBTB32基因的小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)，或编码所述siRNA或shRNA的核酸。在实施例中，所述siRNA或shRNA包含与所述ZBTB32基因的mRNA序列互补的核苷酸序列。在实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含靶向所述ZBTB32基因的反义寡核苷酸(ASO)，或编码所述ASO的核酸。在实施例中，所述ASO包含与所述ZBTB32基因的mRNA序列互补的核苷酸序列。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，ZBTB32抑制剂包含蛋白质。在实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含由所述ZBTB32基因编码的蛋白质的显性负性变体，或编码所述显性负性变体的核酸。在实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含由所述ZBTB32基因编码的蛋白质的显性负性结合配偶体，或编码所述显性负性结合配偶体的核酸。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含抗体分子，例如单结构域抗体(sdAb)或纳米抗体，其与由所述ZBTB32基因编码的蛋白质结合，或编码所述抗体分子的核酸。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述ZBTB32抑制剂包含编码单结构域抗体(sdAb)或纳米抗体的核酸，所述sdAb或纳米抗体与由所述ZBTB32基因编码的蛋白质结合。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，与参照细胞相比，该细胞具有降低的ZBTB32表达，例如降低至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。在实施例中，ZBTB32蛋白的水平降低。在实施例中，所述ZBTB32蛋白稳定性降低。在实施例中，所述ZBTB32mRNA水平降低。在实施例中，所述ZBTB32 mRNA稳定性降低。
在实施例中，所述细胞具有降低的ZBTB32转录。在实施例中，所述细胞具有降低的ZBTB32翻译。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，ZBTB32基因组基因座被改变(例如，被破坏)。在实施例中，所述ZBTB32基因包含缺失或插入，例如破坏所述ZBTB32基因组基因座中的可读框(ORF)或CLL超级增强子的缺失或插入。在实施例中，所述ZBTB32基因包含表观基因组修饰，例如降低ZBTB32表达的表观基因组修饰。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，与参照细胞相比，该细胞具有降低的ZBTB32生物活性，例如降低至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。在实施例中，ZBTB32的转录抑制功能降低。在实施例中，ZBTB32与一个或多个结合配偶体之间的相互作用减少。在实施例中，所述一个或多个结合配偶体包括范可尼贫血互补组C(FANCC)、硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)、维生素D3上调蛋白1(VDUP1)、含锌指和BTB结构域的蛋白16(Zbtb16)、锌指肘相关脯氨酸结构域蛋白2(Zpo2)、GATA结合蛋白3(Gata3)、GATA结合蛋白2(Gata2)或B细胞淋巴瘤6(Bcl-6)。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述细胞具有增强的T细胞介导的抗肿瘤应答。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述细胞具有增加的增殖和/或细胞因子产生。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述细胞具有改变的T细胞状态，例如功能失调的T细胞的改变状态，例如减少的T细胞耗竭。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述细胞具有增强的体内耗竭抗性和长期免疫保护。
在本文披露的表达CAR的细胞、方法或用途中任一项的一些实施例中，所述细胞具有增加的MHCII和/或MHCII反式激活因子CIITA表达。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述抑制剂导致更高的体内细胞扩增率。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述抑制剂改善免疫记忆表型，例如B细胞记忆表型。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述癌症是血液癌症。在实施例中，该癌症是淋巴瘤、骨髓瘤或白血病。在实施例中，该癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或白血病前期。
在实施例中，该癌症是B细胞恶性肿瘤，例如B细胞淋巴瘤或白血病。
在实施例中，该癌症是淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，例如活化的B细胞(ABC)DLBCL或生发中心B细胞(GCB)DLBCL。在实施例中，所述癌症是骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤(MM)。在实施例中，该癌症是白血病，例如急性淋巴细胞白血病(ALL)或慢性淋巴细胞白血病(CLL)。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述癌症是实体瘤。在实施例中，所述实体瘤与免疫细胞浸润有关。在实施例中，癌症是结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症、或上述癌症的转移性病灶。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述癌症表达更高水平的ZBTB32，例如，如通过本文所述的方法所确定的。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述受试者需要具有增强的免疫应答。
在一些实施例中，本文披露的方法或用途进一步包括鉴定所述受试者为需要具有增强的免疫应答。
在一些实施例中，本文披露的方法或用途进一步包括确定所述细胞中ZBTB32的表达和/或生物活性。
在一些实施例中，本文披露的方法或用途还包括确定与CART疗法应答差相关的特征。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述第二治疗剂或方式包括免疫疗法。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述第二治疗剂或方式包括免疫检查点抑制剂，例如本文所述的免疫检查点抑制剂。在实施例中，所述第二治疗剂或方式包括PD-1抑制剂、TIM-3抑制剂、LAG-3抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、GITR激动剂、PD-L1抑制剂、细胞因子、嵌合抗原受体、雌激素受体拮抗剂、CDK4/6抑制剂、CXCR2抑制剂、CSF-1/1R结合剂、A2Ar拮抗剂、IDO抑制剂、STING激动剂、半乳凝素抑制剂、MEK抑制剂、c-MET抑制剂、TGF-b抑制剂、IL-1b抑制剂或MDM2抑制剂。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述第二治疗剂或方式包括细胞疗法，例如T细胞疗法，例如本文所述的表达CAR的细胞疗法。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述第二治疗剂或方式包括靶向疗法。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述第二治疗剂或方式包括化疗。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述第二治疗剂或方式包括放射疗法。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述第二治疗剂或方式包括手术。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述第二治疗剂或方式包括激素疗法。
在本文披露的方法或用途中任一项的一些实施例中，所述第二治疗剂或方式包括血管生成抑制剂。
虽然与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本披露的实践或测试，但是以下描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考(例如，序列数据库参考号)通过引用以其全文而结合。例如，本文提及的所有GenBank、Unigene和Entrez序列(例如，在本文的任一表中)均通过引用而结合。除非另有说明，否则本文指定的序列登录号(包括本文的任何表中的)均指截至2020年6月11日的现有数据库条目。当一个基因或蛋白质参考多个序列登录号时，涵盖所有的序列变体。
此外，材料、方法和实例仅是说明性的而不旨在限制。标题、小标题或编号或字母元素，例如(a)、(b)、(i)等仅为了便于阅读而呈现。在本文件中使用标题或编号或字母元素不要求步骤或元素以字母顺序执行，或者步骤或元素必须彼此离散。根据说明书和附图并且根据权利要求书，本披露的其他特征、目标和优点将是显而易见的。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一个彩色附图。带有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本在请求并支付了必要费用后由专利局提供。
图1显示在癌细胞系百科全书数据库中的900多种癌细胞系中的ZBTB32基因表达。一条线表示每百万10个转录本(TPM)。
图2A-2C显示ZBTB32编辑和CAR19表达。图2A显示第10天时GFP和CAR19表面表达的流式细胞术分析。将PE缀合的抗CD19 CAR独特型抗体用于染色细胞表面CAR19。图2B是显示T7E1有效切割ZBTB32 gRNA6和gRNA7编辑的DNA的凝胶图像。图2C显示确认ZBTB32 gRNA6和gRNA 7编辑效率的NGS结果。“x”表示核苷酸插入。
图3A-3C显示ZBTB32KO CART细胞的抗原依赖性增殖和细胞因子表达。图3A提供％GFP+细胞的流式细胞术分析，证明wt和ZBTB32KO CART细胞的体外抗原依赖性增殖。图3B描述了显示wt和ZBTB32KO CART细胞介导的对TMD8-Luc细胞的体外杀伤的发光分析。图3C显示与TMD8-Luc细胞体外共培养时，ZBTB32 KO CART的促炎细胞因子表达水平高于wt CART细胞。
图4A-4B显示用ZBTB32 KO CART细胞或wt CART细胞处理的小鼠的肿瘤动力学：图4A显示平均肿瘤动力学以及图4B显示所有小鼠组随时间的个体肿瘤动力学。在第10天，将GFP wt(非CAR)、wt和ZBTB32 KO CART细胞以1x106个CAR+细胞/小鼠的剂量注射(用虚线表示)。
图5A-5B显示用ZBTB32 KO CART细胞或wt CART细胞处理的小鼠的肿瘤动力学。图5A显示平均肿瘤动力学以及图5B显示所有小鼠组随时间的个体肿瘤动力学。在第9天，将wt和ZBTB32 KO CART细胞以2x106个CAR+细胞/小鼠的剂量注射(用虚线表示)。PBS处理的肿瘤在第25天生长超出规定。
图6A-6B显示用ZBTB32 KO CART细胞或wt CART细胞处理的TMD8-Luc肿瘤的生物发光。图6A显示TMD8-Luc肿瘤随时间的生物发光(p/s)。在第9天，将wt和ZBTB32 KO CART细胞以2x106个CAR+细胞/小鼠的剂量注射。实心条表示每个组在每个时间点的生物发光中值。图6B显示在PBS、ZBTB32 KO CART细胞和wt CART细胞治疗小鼠中植入肿瘤后第21天捕获的图像。
图7A-7D显示用媒介物(PBS)、ZBTB32 KO CART细胞或wt CART细胞处理的小鼠的肿瘤体积和肿瘤负担。图7A将肿瘤体积显示为每个组的平均值±SEM，图7B显示个体小鼠的肿瘤体积，图7C显示每个组的中值中间生物发光(p/s)以及图7D显示个体小鼠随时间的生物发光(p/s)。在第9天，将wt和ZBTB32 KO CART细胞以0.4x106个CAR+细胞/小鼠的剂量注射(用虚线表示)。PBS处理的肿瘤在第23天生长超出规定。分图D中的箭头表示wt CART处理的小鼠中的复发肿瘤。分图D中的星号表示用ZBTB32 KO CART处理的一只小鼠，其显示稳定的生物发光信号但没有肿瘤。
图8A-8D描述了wt CART细胞和ZBTB32KO CART细胞中T细胞转录因子的表达。图8A和8B显示了血液样品中总CART和CD8 CART细胞中TCF7水平的流式细胞术分析。图8C和8D显示了血液样品中总CART和CD8 CART细胞中Eomes水平。在第10天，将WT、ZBTB32KO gRNA6和ZBTB32KO gRNA7 CART细胞以1x106个CAR+细胞/小鼠的剂量注射。在CART注射后4周和5周收集血液样品。实心条表示每个组在每个时间点的中值。*：P<0.05，***：P<0.001，****：P<0.0001，通过单因素ANOVA。
图9A-9C显示总CART细胞(图9A)，CD4+CART细胞(图9B)和CD8+CART细胞(图9C)数量/ul血液的数量的流式细胞术分析。在第10天，将WT、ZBTB32KO gRNA6和ZBTB32KO gRNA7CART细胞以1x106个CAR+细胞/小鼠的剂量注射。在CART注射后2周和3周收集血液样品。实心条表示每个组在每个时间点的中值。
图10A-10F显示细胞因子的流式细胞术分析。图10A和10D显示IL2阳性CD4和CD8CART细胞数量/ul血液。图10B和10E显示IFNg阳性CD4和CD8 CART细胞数量/ul血液。图10C和10F显示TNFa阳性CD4和CD8 CART细胞数量/ul血液。在第10天，将WT、ZBTB32KO gRNA6和ZBTB32KO gRNA7 CART细胞以1x106个CAR+细胞/小鼠的剂量注射。在CART注射后3周和5周收集血液样品。实心条表示每个组在每个时间点的中值。
图11A-11D显示血液样品中CART细胞中细胞表面PD1(图11A和11B)和TIM3(图11C和11D)水平的流式细胞术分析。在第10天，将WT、ZBTB32KO gRNA6和ZBTB32KO gRNA7 CART细胞以1x106个CAR+细胞/小鼠的剂量注射。在CART注射后3周收集血液样品。实心条表示每个组的中值水平。**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.0001，通过单因素ANOVA。MFI：中值荧光强度。
图12A-12C描述了无肿瘤小鼠脾脏中CART细胞的数量。在第10天，将WT、ZBTB32KOgRNA6和ZBTB32KO gRNA7 CART细胞以1x106个CAR+细胞/小鼠的剂量注射。在第53天，从14-15只无肿瘤小鼠的脾脏中分离出CART细胞。汇集同一组中的4-5个脾脏，计算每个脾脏的CART细胞总数。图12A显示CART细胞的总数。图12B显示CD4+CART细胞的总数。图12C显示CD8+CART细胞的总数。数据呈现为平均值±SEM。
图13A-13C显示血液样品中CART细胞中TCF7(图13A)、Eomes(图13B)和TOX(图13C)水平的流式细胞术分析。在第9天，将wt和ZBTB32KO gRNA6 CART细胞以0.4x106个CAR+细胞/小鼠的剂量注射。在CART注射后20天收集血液样品。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，通过t检验。MFI：中值荧光强度。实心条表示每个组的中值。
图14A-14F显示细胞表面PD1、TIM3和LAG3的流式细胞术分析。图14A和14D显示血液样品中CART细胞的PD1水平。图14B和14E显示血液样品中CART细胞的TIM3水平。图14C和14F显示血液样品中CART细胞的LAG 3水平。在第9天，将wt和ZBTB32KO gRNA6CART细胞以0.4x106个CAR+细胞/小鼠的剂量注射。在CART注射后20天收集血液样品。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.0001，通过t检验。MFI：中值荧光强度。实心条表示每个组的中值。
图15A-15C显示对照和ZBTB32 KO TMD8细胞的细胞生长。图15A显示对照TMD8细胞(gRNA NT)和ZBTB32 KO TMD8细胞的体外增殖。图15B-15C显示对照TMD8细胞(gRNA NT)和ZBTB32 KO TMD8细胞的体内肿瘤生长。显示了每组小鼠随时间的个体(图15B)和平均(图15C)肿瘤生长动力学。
具体实施方式
本文的披露内容至少部分基于ZBTB32抑制对免疫细胞和癌细胞的影响的发现。不希望受理论束缚，据信在一些实施例中，ZBTB32的抑制可以增强T细胞介导的抗肿瘤应答。在某些实施例中，ZBTB32的抑制增强了体内CART细胞活性，例如，细胞扩增、细胞因子产生、持久性、耗竭抗性和抗肿瘤活性。在其他实施例中，抑制ZBTB32会降低体外和体内癌细胞生长。
因此，本文的披露内容包括但不限于使用ZBTB32抑制剂提高表达CAR的细胞的治疗效果的方法，以及制造表达CAR的细胞的方法。还披露了相关的表达CAR的细胞、疗法、核酸、载体和组合物。本文的披露内容还包括但不限于使用ZBTB32抑制剂治疗癌症的方法、增加其他治疗剂或方式的功效的方法以及增加免疫应答的方法。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本披露内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
术语“一个/种(a/an)”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)该冠词的语法宾语。通过举例，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。
当指可测量的值如量、时距等时，术语“约”意在涵盖与规定值±20％或在一些情况下±10％、或在一些情况下±5％、或在一些情况下±1％、或在一些情况下±0.1％的变化，因为此类变化适于执行所披露的方法。
术语“嵌合抗原受体”或可替代地“CAR”是指重组多肽构建体，该重组多肽构建体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含源自如下定义的刺激分子的功能性信号传导结构域的胞质信号传导结构域(本文还称为“细胞内信号传导结构域”)。在一些实施例中，CAR多肽构建体中的结构域在同一多肽链中，例如，包含嵌合融合蛋白。在一些实施例中，例如，如在如本文所述的RCAR中所提供，CAR多肽构建体中的结构域彼此不连续，例如在不同的多肽链中。在一些实施例中，术语“CAR”和“CAR分子”可互换使用。
在一些实施例中，胞质信号传导结构域包含初级信号传导结构域(例如，CD3-ζ的初级信号传导结构域)。在一些实施例中，胞质信号传导结构域进一步包含源自如下定义的至少一种共刺激分子的一个或多个功能性信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激分子选自41BB(即，CD137)、CD27、ICOS和/或CD28。在一些实施例中，CAR分子包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含源自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，CAR分子包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含源自共刺激分子的功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，CAR分子包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含源自一种或多种共刺激分子的两个功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，CAR分子包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含源自一种或多种共刺激分子的至少两个功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，CAR分子包含CAR融合蛋白的氨基-末端(N-末端)处的任选前导序列。在一些实施例中，CAR分子进一步包含在细胞外抗原识别结构域的N末端的前导序列，其中前导序列任选地在细胞加工和CAR分子定位至细胞膜期间从抗原识别结构域(例如，scFv)切割。
包含靶向特定肿瘤标志物X的抗原结合结构域(例如，scFv(单结构域抗体)或TCR(例如，TCRα结合结构域或TCRβ结合结构域))的CAR分子(其中X可以是如本文所述的肿瘤标志物)也称为XCAR。例如，包含靶向CD19的抗原结合结构域的CAR分子被称为CD19CAR。CAR分子可以在任何细胞中表达，例如，如本文所述的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)。
术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能性部分，其通过在细胞内传递信息以通过产生第二信使或通过应答于此类信使而用作效应子，经由定义的信号传导途径调控细胞活性起作用。
如本文所用，术语“抗体”是指源自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列，该蛋白质或多肽序列与抗原特异性结合。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链、或完整免疫球蛋白，并且可以源自天然来源或来自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”是指完整抗体或其重组变体的至少一部分，并且是指足以赋予抗体片段识别和特异性结合靶标(如抗原)的抗原结合结构域(例如完整抗体的抗原决定可变区)。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体(如sdAb(VL或VH))、骆驼科VHH结构域和由如二价片段的抗体片段形成的多特异性分子，该二价片段包含在铰链区通过二硫桥连接的两个或更多个(例如两个)Fab片段，或所连接的抗体的两个或更多个(例如两个)分离的CDR或其他表位结合片段。抗体片段也可以掺入单结构域抗体、多抗体、微抗体、纳米抗体、细胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双scFv中(参见例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology[自然生物技术]23:1126-1136,2005)。还可以将抗体片段移植到基于多肽如纤连蛋白III型(Fn3)的支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微型抗体)。
术语“scFv”是指融合蛋白，该融合蛋白包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中该轻链和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续地连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留了衍生其的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则如本文所用，scFv可以例如相对于多肽的N末端和C末端以任何顺序具有VL和VH可变区，该scFv可以包含VL-接头-VH或者可以包含VH-接头-VL。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区内的赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸的序列。例如，一般来说，每个重链可变区中存在三个CDR(例如，HCDR1、HCDR2、和HCDR3)，并且每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、和LCDR3)。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任一种来确定，这些方案包括由以下文献描述的那些：Kabat等人(1991),"Sequences of Proteins ofImmunological Interest"[具有免疫学重要性的蛋白序列]，第5版，美国国立卫生研究院，公共卫生事业部，马里兰州贝塞斯达市(“卡巴特”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB273,927-948(“乔西亚”编号方案)、或其组合。根据Kabat编号方案，在一些实施例中，将重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)、和95-102(HCDR3)；并将轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据Chothia编号方案，在一些实施例中，将VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)、和95-102(HCDR3)；并将VL中的CDR氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)、和91-96(LCDR3)。在组合的卡巴特和乔西亚编号方案中，在一些实施例中，CDR对应于为卡巴特CDR、乔西亚CDR或两者的一部分的氨基酸残基。例如，在一些实施例中，CDR对应于VH(例如哺乳动物VH，例如人VH)中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)、和95-102(HCDR3)；和VL(例如哺乳动物VL，例如人VL)中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)、和89-97(LCDR3)。
包含抗体或其抗体片段的本披露的CAR组合物部分可以多种形式存在，例如，其中抗原结合结构域表达为多肽链的一部分，包括例如，单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)，或例如，人源化抗体(Harlow等人,1999,Using Antibodies:A Laboratory Manual[使用抗体：实验室手册]中,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约；Harlow等人,1989,Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册]中,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；Bird等人,1988,Science[科学]242:423-426)。在一些实施例中，本披露的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在一些实施例中，CAR分子包含含有scFv的抗体片段。
如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”(在本文中也称为“抗靶标结合结构域”)是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在一些实施例中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中该多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且该多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一些实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。术语“抗体重链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较大的一种，并且通常决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较小的一种。κ(kappa)和λ(lambda)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如像由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子和表达抗体蛋白的DNA分子或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中该DNA或氨基酸序列已经使用本领域可得和熟知的重组DNA或氨基酸序列技术获得。
术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。免疫应答可以涉及抗体产生或特定免疫活性细胞的活化或两者。技术人员将理解实际上包括所有蛋白质或肽的任何大分子都可以充当抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组DNA。技术人员将理解包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都因此编码“抗原”(当该术语在本文中使用时)。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本披露包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所希望的免疫应答的多肽。另外，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生或可以源自生物样品，或者可以是除多肽外的大分子。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物组分的流体。
术语“抗肿瘤作用”是指可以通过各种手段(包括但不限于例如减小肿瘤体积、减少肿瘤细胞数量、减少肿瘤转移数量、增加预期寿命、减少肿瘤细胞增殖、减少肿瘤细胞存活、或改善与癌性病症相关的各种生理症状)表现的生物学作用。“抗肿瘤作用”也可以通过本披露的肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力来表现。
术语“抗癌作用”是指可以通过各种手段显现的生物学作用，包括但不限于例如肿瘤体积减少、癌细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命延长、癌细胞增殖减少、癌细胞存活率降低、或改善与癌性病症相关的各种生理症状。“抗癌作用”还可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防癌症发生的能力来显现。术语“抗肿瘤作用”是指可以通过各种手段显现的生物学作用，包括但不限于例如肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、肿瘤细胞增殖减少、或肿瘤细胞存活率降低。术语“自体的”是指源自与后来将其重新引入个体中的同一个体的任何材料。
术语“同种异体的”是指源自与引入材料的个体相同的物种的不同动物的任何材料。当一个或多个基因座处的基因不相同时，称两个或更多个个体彼此是同种异体的。在一些实施例中，来自相同物种的个体的同种异体材料可以在遗传上充分不同以抗原性地相互作用。
术语“异种的”是指源自不同物种的动物的移植物。
如本文所用，术语“单采血(apheresis)”是指本领域公认的体外过程，通过该过程，供体或患者的血液从该供体或患者移出并穿过分离出一种或多种所选择的特定成分的装置，并返回其余部分至该供体或患者的循环(例如，通过再输送)。因此，在“单采样品”的上下文中是指使用单采获得的样品。
术语“组合”是指呈一个剂量单位形式的固定组合；或组合施用，其中本披露的化合物与组合配偶物(partner)(例如下文所解释的另一种药物，也称为“治疗剂”或“共药剂(co-agent)”)可以在同一时间独立地施用或在时间间隔内分开地施用，特别是在这些时间间隔允许组合配偶物显示协作(例如协同)效应的情况下。单个组分可以包装在一个试剂盒中或分开包装。可在施用之前将一种或两种组分(例如粉末或液体)重构或稀释至所希望的剂量。如本文所用，术语“共同施用”或“组合施用”等意在涵盖将所选择的组合配偶体施用至有需要的单个受试者(例如患者)，并且旨在包括其中药剂不一定通过相同的施用途径施用或同时施用的治疗方案。如本文所用的术语“药物组合”意指由多于一种活性成分的混合或组合所产生的产品，并且包括活性成分的固定和非固定组合两者。术语“固定组合”意指活性成分(例如本披露的化合物和组合配偶体)以单一实体或剂量的形式同时地施用给患者。术语“非固定组合”意指活性成分(例如本披露的化合物和组合配偶体)作为分开的实体同时地、并行地或顺序地施用给患者(没有特定的时间限制)，其中这种施用在患者体内提供治疗有效水平的两种化合物。后者也适用于鸡尾酒疗法，例如三种或更多种活性成分的施用。
所谓“组合”或“与……组合”并不旨在暗示疗法或治疗剂必需同时施用和/或将这些疗法或治疗剂配制用于一起递送，尽管这些递送方法也在本文所述的范围内。组合中的治疗剂可以与一种或多种其他另外的疗法或治疗剂并行、在其之前或之后施用。这些治疗剂或治疗方案可以以任何顺序施用。通常，每种药剂将以针对该药剂确定的剂量和/或时间表施用。还应理解，该组合中使用的另外的治疗剂可以在单一组合物中一起施用或在不同组合物中分开施用。通常，预期组合中使用的其他治疗剂以不超过它们单独使用时的水平使用。在一些实施例中，组合中使用的水平将低于单独使用的水平。
在实施例中，另外的治疗剂以治疗剂量或低于治疗剂量给予。在某些实施例中，当第二治疗剂与第一治疗剂组合施用时，实现抑制(例如，生长抑制)所需的第二治疗剂的浓度比单独施用第二治疗剂时低。在某些实施例中，当第一治疗剂与第二治疗剂组合施用时，实现抑制(例如，生长抑制)所需的第一治疗剂的浓度比单独施用第一治疗剂时低。在某些实施例中，在组合疗法中，实现抑制(例如，生长抑制)所需的第二治疗剂的浓度比作为单一疗法的第二治疗剂的治疗剂量低，例如低10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、或80-90％。在某些实施例中，在组合疗法中，实现抑制(例如，生长抑制)所需的第一治疗剂的浓度比作为单一疗法的第一治疗剂的治疗剂量低，例如低10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、或80-90％。
术语“抑制”、“抑制剂”或“拮抗剂”包括给定分子的某些参数(例如活性)的降低。例如，此术语包括将活性抑制至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或更多。因此，抑制不必是100％。
术语“活化”、“活化剂”或“激动剂”包括给定分子的某些参数(例如活性)的增加。例如，此术语包括将活性增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，或者至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多。
术语“癌症”是指以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。本文描述了各种癌症的实例，并且包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。通过本文所述的方法治疗的优选的癌症包括多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换地使用，例如，两个术语涵盖实体和液体，例如弥散或循环肿瘤。如本文所用，所述术语“癌症”或“肿瘤”包括恶化前以及恶性癌症和肿瘤。
“源自”(当该术语在本文中使用时)表示第一分子和第二分子之间的关系。它通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并不暗示或包括对衍生自第二分子的第一分子的过程或来源的限制。例如，在衍生自CD3ζ分子的细胞内信号传导结构域的情况下，细胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，使得其具有所需的功能，即在适当条件下产生信号的能力。它没有暗示或包括对产生细胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，它并不意指为了提供细胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列开始并删除不需要的序列，或强加突变，以到达细胞内信号传导结构域。
短语“与抗原(例如肿瘤抗原)表达相关的疾病”包括但不限于与表达抗原(例如野生型或突变型抗原)的细胞相关的疾病或与表达抗原(例如野生型或突变型抗原)的细胞相关的病症，包括例如增生性疾病(如癌症或恶性肿瘤)或癌前病症(如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期)；或与表达抗原(例如野生型或突变型抗原)的细胞相关的非癌症相关适应症。为避免疑义，与抗原表达相关的疾病可包括与目前不表达抗原(例如，因为比如由于用靶向抗原的分子进行治疗导致抗原表达已被下调)但曾经表达该抗原的细胞相关的病症。在一些实施例中，与抗原例如肿瘤抗原的表达相关的疾病是癌症(例如实体癌或血液癌症)、病毒感染(例如HIV、真菌感染，例如新型隐球菌)、自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE或狼疮)、寻常型天疱疮和干燥综合征；炎症性肠病、溃疡性结肠炎；与粘膜免疫有关的移植相关的同种异体特异性免疫障碍；以及针对生物制剂(如因子VIII)而言不需要的免疫应答(其中体液免疫很重要)。
术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入本披露的抗体或抗体片段中。保守取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本披露的CAR分子内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代，并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的CAR分子。
术语“刺激”是指通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体的结合诱导初级应答，从而介导信号转导事件，如但不限于经由TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，如TGF-β的下调、和/或细胞骨架结构的重构等。
术语“刺激分子”是指由T细胞表达的分子，其针对T细胞信号传导途径的至少一些方面提供以刺激方式调节TCR复合物的初级活化的一个或多个初级胞质信号传导序列。在一些实施例中，CAR分子内的含ITAM的结构域独立于内源性TCR复合物重现初级TCR的信号传导。在一些实施例中，初级信号通过例如TCR/CD3复合物与负载肽的MHC分子的结合而引发，并且其导致T细胞应答(包括但不限于增殖、活化、分化等)的介导。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。在本披露中特别有用的含有ITAM的初级胞质信号传导序列的实例包括但不限于源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI和CD66d、DAP10和DAP12的那些。在本披露的特定CAR分子中，本披露的任何一种或多种CAR分子中的细胞内信号传导结构域包含细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的初级信号传导序列。术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指免疫系统细胞如辅助细胞(例如，B细胞、树突细胞等)，所述免疫系统细胞在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外源抗原。T细胞可以使用它们的T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC处理抗原并将它们呈递给T细胞。
如本文所用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。在实施例中，细胞内信号结构域转导效应功能信号并指导细胞执行特化功能。虽然可以采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，可以使用这种截短部分代替完整链，只要截短部分可转导效应子功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域意指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
细胞内信号传导结构域产生促进含有CAR的细胞(例如，CART细胞)的免疫效应子功能的信号。免疫效应子功能的实例，例如，在CART细胞中，包括细胞溶解活性和辅助活性(包括分泌细胞因子)。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含初级细胞内信号传导结构域。示例性初级细胞内信号传导结构域包含源自负责初级刺激、或抗原依赖性模拟的分子的那些。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含共刺激细胞内结构域。示例性共刺激细胞内信号传导结构域包括源自负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的分子的那些。例如，在CART的情况下，初级细胞内信号传导结构域可以包括T细胞受体的胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包括来自共受体或共刺激分子的胞质序列。
初级细胞内信号传导结构域可以包含被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的实例包括但不限于源自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI、CD66d、DAP10和DAP12的那些。
术语“ζ”或可替代地“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”是指CD247。Swiss-Prot登录号P20963提供了示例性的人CD3ζ氨基酸序列。“ζ刺激结构域”或可替代地“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”是指CD3-ζ或其变体的刺激结构域(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。在一些实施例中，ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1或其变体的残基52至164(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。在一些实施例中，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是SEQ ID NO:1034或1037提供的序列或其变体(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。
术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，该同源结合配偶体与共刺激配体特异性地结合，从而介导T细胞的共刺激应答，如但不限于增殖。共刺激分子是有效免疫应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB和与CD83特异性结合的配体。
共刺激细胞内信号传导结构域是指共刺激分子的细胞内部分。
细胞内信号传导结构域可以包含其来源的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域或其功能性片段。
术语“4-1BB”是指CD137或肿瘤坏死因子受体超家族成员9。Swiss-Prot登录号P20963提供了示例性的人4-1BB氨基酸序列。“4-1BB共刺激结构域”是指4-1BB的共刺激结构域或其变体(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。在一些实施例中，“4-1BB共刺激结构域”是SEQ ID NO:1029提供的序列或其变体(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。
当所述术语在本文中使用时，“免疫效应细胞”是指参与免疫应答(例如促进免疫效应子应答)的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、和髓源性吞噬细胞。
当该术语在本文中使用时，“免疫效应子功能或免疫效应子应答”是指例如免疫效应细胞的增强或促进靶细胞的免疫攻击的功能或应答。例如，免疫效应子功能或应答是指促进靶细胞的杀伤或抑制其生长或增殖的T细胞或NK细胞的特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或应答的实例。
术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包括分泌细胞因子)。
术语“编码”是指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列用作在生物过程中用于合成具有确定核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的固有特性，以及由此产生的生物学特性。因此，如果与基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为编码蛋白质或者该基因或cDNA的其他产物。
除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包含内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可以在某些形式中含有一个或多个内含子。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指如本文描述的化合物、配制品、材料或组合物的有效于实现特定的生物学结果的量。
术语“内源的”是指来自生物体、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何材料。
术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统引入或在其外部产生的任何材料。
术语“表达”是指特定核苷酸序列的转录和/或翻译。在一些实施例中，表达包括被引入细胞的mRNA的翻译。
术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可用于向细胞内部递送该分离的核酸的物质组合物。许多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒、以及病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应当解释为进一步包括促进将核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如像聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与有待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有表达载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们可以将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法中的一种。HIV、SIV、和FIV都是慢病毒的实例。
术语“慢病毒载体”是指源自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括如下提供的自灭活慢病毒载体：Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453–1464(2009)。可以在临床中使用的慢病毒载体的其他实例包括但不限于例如来自牛津生物医药公司(OxfordBioMedica)的
Figure BDA0003991130860000391
基因递送技术、来自Lentigen公司的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可得的并且是本领域技术人员已知的。
术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合分子之间(例如，两个核酸分子(如两个DNA分子或两个RNA分子)之间、或两个多肽分子之间)的亚基序列同一性。当这两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子中的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配位置或同源位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则这两个序列是90％同源的。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体及其抗体片段是人免疫球蛋白(接受者抗体或抗体片段)，其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(如小鼠、大鼠或兔)(供体抗体)的具有所希望特异性、亲和力和能力的CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基由相应非人残基置换。此外，人源化抗体/抗体片段可以包含既不在受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。这些修饰可以进一步改进和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含基本上所有如下项：至少一个(典型地两个)可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，且FR区的所有或显著一部分是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体或抗体片段还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。有关进一步的细节，参见Jones等人,Nature[自然],321:522-525,1986；Reichmann等人,Nature[自然],332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[结构生物学现状],2:593-596,1992。
“完全人”是指如下免疫球蛋白，如抗体或抗体片段，其中整个分子是人起源或由与抗体或免疫球蛋白的人形式相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”意指从天然状态改变的或去除的。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质能以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境(例如像，宿主细胞)中。
在本披露的上下文中，使用以下对常见核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。
术语“可操作地连接”或“转录控制”是指调控序列和异源核酸序列之间的导致后者的表达的功能性连接。例如，当第一核酸序列被放置成与第二核酸序列有功能关系时，该第一核酸序列与该第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子与该编码序列可操作地连接。可操作地连接的DNA序列可以彼此邻接，并且例如在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，它们处于同一阅读框中。
术语“肠胃外”施用免疫原性组合物包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、或胸骨内注射、肿瘤内或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，这些核酸具有与参考核酸类似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸类似的方式进行代谢。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子置换，例如保守置换)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子置换(例如，保守置换)可以通过产生其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列来实现(Batzer等人,Nucleic AcidRes.[核酸研究]19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes[分子和细胞探针]8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的分子。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含由肽键彼此相连的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链，例如其在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚体；并且还是指较长的链，其在本领域中通常称为蛋白质，存在有很多类型的蛋白质。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、或其组合。
术语“启动子”是指启动多核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞合成机器或引入的合成机器所识别的DNA序列。
术语“启动子/调控序列”是指表达与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，该序列还可以包含增强子序列和表达基因产物所需的其他调节元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调控序列。
术语“组成型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大多数或全部生理条件下致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“诱导型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在对应于启动子的诱导物存在于细胞中时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“组织特异性”启动子是指当与编码或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“癌症相关抗原”或“肿瘤抗原”可互换地指在癌细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达的分子(典型地是蛋白质、碳水化合物或脂质)，并且其可用于优先将药理学药剂靶向癌细胞。在一些实施例中，肿瘤抗原是由正常细胞和癌细胞两者表达的标志物，例如谱系标志物，例如B细胞上的CD19。在一些实施例中，肿瘤抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过表达的细胞表面分子，例如，与正常细胞相比，1倍过表达、2倍过表达、3倍过表达或更多。在一些实施例中，肿瘤抗原是在癌细胞中不适当合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施例中，肿瘤抗原将仅在癌细胞的细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达，并且不在正常细胞的表面上合成或表达。在一些实施例中，本披露的CAR分子包括包含与MHC呈递的肽结合的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段)的CAR分子。通常，源自内源性蛋白质的肽填充主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的口袋，并且被CD8+ T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合物由所有有核细胞组成型表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合物代表用于免疫疗法的独特类别的细胞表面靶标。已经描述了在人白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的情况下靶向源自病毒或肿瘤抗原的肽的TCR样抗体(参见例如，Sastry等人,JVirol.[病毒学杂志]2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等人,Blood[血液],2011 117(16):4262-4272；Verma等人,J Immunol[免疫学杂志]2010 184(4):2156-2165；Willemsen等人,Gene Ther[基因疗法]2001 8(21):1601-1608；Dao等人,Sci Transl Med[科学转化医学]20135(176):176ra33；Tassev等人,Cancer Gene Ther[癌基因疗法]201219(2):84-100)。例如，可以从筛选文库(如人scFv噬菌体展示文库)鉴定TCR样抗体。
术语“支持肿瘤的抗原”或“支持癌症的抗原”可互换地指在细胞表面上表达的分子(典型地是蛋白质、碳水化合物或脂质)，所述细胞本身不是癌性的、但例如通过促进其生长或存活、例如对免疫细胞的抗性而支持癌细胞。这种类型的示例性细胞包括基质细胞和骨髓源性的抑制细胞(MDSC)。支持肿瘤的抗原本身不需要在支持肿瘤细胞中发挥作用，只要该抗原存在于支持癌细胞的细胞上。
如在scFv的语境中使用的术语“柔性多肽接头”或“接头”是指由单独或组合使用的氨基酸(如甘氨酸和/或丝氨酸)残基组成的，以将可变重链区和可变轻链区连接在一起的肽接头。在一些实施例中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头并且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝1，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5，以及n＝6，n＝7，n＝8，n＝9，以及n＝10(SEQ ID NO:1009)。在一些实施例中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4 Ser)4(SEQ ID NO:1010)或(Gly4 Ser)3(SEQ ID NO:1011)。在一些实施例中，接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)(SEQ ID NO:1012)的多个重复。描述于WO2012/138475中的接头也包括在本披露的范围内，该专利通过援引并入本文。
如本文所用，5'帽(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是在转录开始后不久添加到真核信使RNA的“前”端或5'端的经修饰的鸟嘌呤核苷酸。5'帽由与第一转录核苷酸连接的末端基团组成。它的存在对于被核糖体识别和被保护免于RNA酶至关重要。帽添加与转录偶联，并且共转录地发生，使得每个都影响另一个。在转录开始后不久，合成的mRNA的5'端被与RNA聚合酶相关的帽合成复合物结合。这种酶复合物催化mRNA加帽所需的化学反应。合成作为多步生物化学反应进行。可以修饰加帽部分以调制mRNA的功能，如其稳定性或翻译效率。
如本文所用，“体外转录的RNA”是指已在体外合成的RNA，优选mRNA。通常，体外转录的RNA由体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。
如本文所用，“聚(A)”是通过聚腺苷酸化与mRNA附接的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的一些实施例中，聚A为50个至5000个之间(SEQ ID NO:1013)、优选大于64个、更优选大于100个、最优选大于300个或400个。聚(A)序列可以被化学修饰或酶促修饰以调节mRNA功能，如定位、稳定性或翻译效率。
如本文所用，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷酰基部分或其经修饰的变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'端被聚腺苷酸化。3'聚(A)尾是通过酶(聚腺苷酸聚合酶)的作用添加到前mRNA上的腺嘌呤核苷酸(通常数百个)的长序列。在高等真核生物中，将聚(A)尾添加到含有特定序列(聚腺苷酸化信号)的转录物上。多聚(A)尾和与其结合的蛋白质有助于保护mRNA免于被外切核酸酶降解。聚腺苷酸化对于转录终止、从细胞核输出mRNA以及翻译也是重要的。聚腺苷酸化在DNA转录成RNA后立即在细胞核中发生，但另外也可稍后在胞质中发生。在转录已经终止后，通过与RNA聚合酶缔合的内切核酸酶复合物的作用切割mRNA链。切割位点通常被表征为切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。在mRNA被切割后，腺苷残基被添加到切割位点处的游离3'端上。
如本文所用，“瞬时”是指非整合转基因的持续数小时、数天或数周的表达，其中表达的时间段小于在整合到基因组中或包含在宿主细胞中的稳定质粒复制子内的情况下基因的表达的时间段。
如本文所用，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或改善增殖性障碍的进展、严重程度和/或持续时间，或者改善增生性障碍的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)，这由施用一种或多种疗法(例如一种或多种本披露的治疗剂)引起。在具体的实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指改善增生性障碍的至少一种可测量的物理参数，如肿瘤的生长，这不一定是患者可辨别的。在其他实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指通过例如稳定可辨别的症状来物理地，或通过例如稳定物理参数来生理地，或通过两者，抑制增生性障碍的进展。在其他实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或稳定肿瘤大小或癌细胞计数。
术语“信号转导途径”是指在多种信号转导分子之间的生物化学关系，这些信号转导分子在信号从细胞的一部分传递至细胞的另一部分中发挥作用。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并且传递信号跨过细胞膜的分子以及分子复合物。
术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物、人)。
术语“基本上纯化的”细胞是指本质上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其天然存在状态下正常相关的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群体是指同质的细胞群体。在其他情况下，该术语仅指已经与其天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在一些实施例中，在体外培养细胞。在其他实施例中，不在体外培养细胞。
如本文所用，术语“治疗剂”意指治疗。通过减少、抑制、缓解或根除疾病状态来获得治疗效果。
如本文所用，术语“预防”意指对疾病或疾病状态的预防或保护性治疗。
在本披露的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增生性障碍抗原”或“与过度增生性障碍相关的抗原”是指特异性过度增生性障碍常见的抗原。在某些实施例中，本披露的过度增生性障碍抗原源自癌症，包括但不限于原发性或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌(如乳腺癌、前列腺癌(例如，去势抵抗性或治疗抵抗性前列腺癌或转移性前列腺癌)、卵巢癌、胰腺癌等等)或者浆细胞增殖性障碍，例如无症状性骨髓瘤(冒烟型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意义未明的单克隆丙种球蛋白血症(MGUS)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞瘤(例如，浆细胞恶性增殖、孤立性骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤和多发性浆细胞瘤)、全身性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性、和POEMS综合征(也称为克罗-富克斯综合征、高月病和PEP综合征)。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代主体细胞及其子代。
术语“特异性结合”是指抗体或配体，其识别并结合样品中存在的同源结合配偶体(例如，存在于T细胞上的刺激和/或共刺激分子)蛋白质，但是其中抗体或配体基本上不识别或结合样品中的其他分子。
如本文所用，“可调节的嵌合抗原受体(RCAR)”是指一组多肽(在最简单的实施例中典型地为两个)，当在免疫效应细胞中时这些多肽为细胞提供针对靶细胞(典型地是癌细胞)的特异性，并且具有细胞内信号产生。在一些实施例中，RCAR至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文中也称为“细胞内信号传导结构域”)，该胞质信号传导结构域包含源自刺激分子和/或本文在CAR分子的语境中定义的共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，RCAR中的多肽组并不是相互连续的，例如在不同的多肽链中。在一些实施例中，RCAR包括二聚化开关，该二聚化开关在存在二聚化分子时可以将多肽彼此偶联，例如可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，RCAR在如本文所述的细胞(例如免疫效应细胞)，例如表达RCAR的细胞(本文还称为“RCARX细胞”)中表达。在一些实施例中，RCARX细胞是T细胞，并且被称为RCART细胞。在一些实施例中，RCARX细胞是NK细胞，并且被称为RCARN细胞。RCAR可以为表达RCAR的细胞提供对靶细胞(典型地是癌细胞)的特异性，并且具有可调节的细胞内信号产生或增殖，这可以优化表达RCAR的细胞的免疫效应特性。在实施例中，RCAR细胞至少部分地依赖于抗原结合结构域，以提供对包含由该抗原结合结构域结合的抗原的靶细胞的特异性。
当该术语在本文中使用时，“膜锚”或“膜系链结构域”是指足以将细胞外或细胞内结构域锚定到质膜的多肽或部分(例如肉豆蔻酰基)。
当该术语在本文中使用时(例如当提及RCAR时)，“开关结构域”是指实体(典型地是基于多肽的实体)，该实体在二聚化分子存在下与另一个开关结构域缔合。该缔合导致连接到(例如融合到)第一开关结构域的第一实体和连接到(例如融合到)第二开关结构域的第二实体的功能偶联。第一开关结构域和第二开关结构域统称为二聚化开关。在实施例中，第一开关结构域和第二开关结构域彼此相同，例如它们是具有相同伯氨基酸序列的多肽，并且统称为同源二聚化开关。在实施例中，第一开关结构域和第二开关结构域彼此不同，例如它们是具有不同伯氨基酸序列的多肽，并且统称为异源二聚化开关。在实施例中，该开关是细胞内的。在实施例中，该开关是细胞外的。在实施例中，开关结构域是基于多肽(例如基于FKBP或FRB)的实体，并且二聚化分子是小分子(例如雷帕霉素类似物(rapalogue))。在实施例中，开关结构域是基于多肽的实体(例如结合myc肽的scFv)，并且二聚化分子是多肽、其片段、或多肽的多聚体，例如结合一个或多个myc scFv的myc配体或myc配体的多聚体。在实施例中，开关结构域是基于多肽的实体(例如myc受体)，并且二聚化分子是抗体或其片段，例如myc抗体。
当该术语在本文中使用时(例如当提及RCAR时)，“二聚化分子”是指促进第一开关结构域与第二开关结构域缔合的分子。在实施例中，二聚化分子不在受试者中天然发生，或者不以导致显著二聚化的浓度发生。在实施例中，二聚化分子是小分子，例如雷帕霉素(Rapamycin)或雷帕霉素类似物，例如RAD001。
术语“生物等效的”是指产生与参考剂量或参考量的参考化合物(例如，RAD001)产生的效果等同的效果所需的除参考化合物(例如，RAD001)之外的药剂的量。在一些实施例中，所述效果是mTOR抑制水平，例如，如通过P70 S6激酶抑制测量的，例如，如在体内或体外测定中评估的，例如，如通过本文所述的测定(例如Boulay测定，或通过蛋白质印迹进行的磷酸化S6水平的测量)所测量的。在一些实施例中，效果是如通过细胞分选测量的PD-1阳性/PD-1阴性T细胞比率的改变。在一些实施例中，mTOR抑制剂的生物等效量或剂量是实现与参考化合物的参考剂量或参考量相同水平的P70 S6激酶抑制的量或剂量。在一些实施例中，mTOR抑制剂的生物等效量或剂量是实现与参考化合物的参考剂量或参考量相同水平的PD-1阳性/PD-1阴性T细胞比率改变的量或剂量。
当与mTOR抑制剂(例如变构mTOR抑制剂，例如RAD001或雷帕霉素，或催化性mTOR抑制剂)联合使用时，术语“低免疫增强剂量”是指mTOR抑制剂部分但不是完全抑制mTOR活性的剂量，例如，如通过P70 S6激酶活性的抑制测量的。本文讨论了用于评价mTOR活性的方法，例如通过抑制P70 S6激酶。剂量不足以导致完全免疫抑制，但足以增强免疫应答。在一些实施例中，mTOR抑制剂的低免疫增强剂量导致PD-1阳性免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)数量的减少和/或PD-1阴性免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)数量的增加，或PD-1阴性免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)/PD-1阳性免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)的比率增加。
在一些实施例中，低免疫增强剂量的mTOR抑制剂导致初始T细胞的数目增加。在一些实施例中，低免疫增强剂量的mTOR抑制剂导致以下中的一个或多个：
以下标志物中的一个或多个例如在记忆T细胞(例如，记忆T细胞前体)上的表达增加：CD62L高、CD127高、CD27+和BCL2，例如记忆T细胞(例如记忆T细胞前体)上；
KLRG1在例如记忆T细胞(例如，记忆T细胞前体)上的表达减少；以及
记忆T细胞前体，例如具有以下特征中的任一个或组合的细胞的数目增加：增加的CD62L高、增加的CD127高、增加的CD27+、降低的KLRG1以及增加的BCL2；
其中，例如，与未治疗的受试者相比，例如至少瞬时地发生上述任何变化。
如本文所用的“难治性”是指对治疗无应答的疾病，例如癌症。在实施例中，难治性癌症可以在治疗开始之前或治疗开始时对治疗具有抗性。在其他实施例中，难治性癌症可能在治疗期间变得有抗性。难治性癌症也称为抗性癌症。
如本文所用的“复发的”或“复发”是指疾病(例如癌症)或疾病的体征和症状(如改善或应答期之后，例如在疗法(例如癌症疗法)的先前治疗后的癌症)的再现。例如，应答期可能涉及癌细胞水平降低至低于某一阈值，例如低于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％。再现可能涉及癌细胞水平升高超过某一阈值，例如高于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％。
在一些实施例中，疗法的“应答者”可以是在接受所述疗法后具有完全应答、非常好的部分应答或部分应答的受试者。在一些实施例中，疗法的“无应答者”可以是在接受所述疗法后具有微小应答、疾病稳定或疾病进展的受试者。在一些实施例中，所述受试者患有多发性骨髓瘤，并且所述受试者对多发性骨髓瘤疗法的反应是基于IMWG 2016标准来确定的，例如，如Kumar等人,Lancet Oncol.[柳叶刀肿瘤学]17,e328-346(2016)中所披露的，其通过引用以其整体并入本文。
范围：贯穿本披露内容，能以范围形式呈现本披露的各个实施例。应该理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便以及简洁，不应该被理解为对本披露范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应当被认为是具有确切披露的所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围如从1至6的描述应当被认为是具有确切披露的子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的单独数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作为另一个实例，范围如95％-99％同一性包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性，并且包括如96％-99％、96％-98％、96％-97％、97％-99％、97％-98％和98％-99％同一性的子范围。无论范围的宽度如何，这都适用。
当所述术语在本文中使用时，“基因编辑系统”是指指导和影响由所述系统靶向的基因组DNA位点处或附近的一种或多种核酸的改变(例如缺失)的系统，例如一种或多种分子。基因编辑系统是本领域中已知的，并且在下文更全面地描述。
术语“同源抗原分子”是指本文所述的任何抗原。在一些实施例中，它是指被CAR多肽(例如，本文所述的任何靶CAR分子)结合(例如，识别或靶向)的抗原。在一些实施例中，它是指本文所述的与癌症相关的抗原。在一些实施例中，所述同源抗原分子是重组分子。
在本文定义的基团(group、radical)或部分中，通常在基团之前指出碳原子数目，例如(C1-C10)烷基意指具有1至10个碳原子的烷基基团。一般而言，对于包含两种或两种以上亚基团的基团，最后提及的基团为基团附接点，例如“烷基芳基”意指具有式烷基-芳基-的单价基团，而“芳基烷基”意指具有式芳基-烷基-的单价基团。此外，使用表示单价基团的术语而其中二价基团是合适的，则应理解为表示相应的二价基团，反之亦然。除非另有说明，否则假定术语对照的常规定义和常规的稳定原子的原子价，并在全部式和基团中体现。冠词“一个/种(a/an)”是指一个/种或多于一个/种(例如，至少一个/种)该冠词的语法宾语。通过举例，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。
除非另有指示，否则术语“和/或”意指“和”或者“或”。
术语“任选地取代的”意指给定的化学部分(例如，烷基基团)可以(但不是必须)与其他取代基(例如，杂原子)键合。例如，任选地取代的烷基基团可以是完全饱和的烷基链(例如，纯烃)。可替代地，相同的任选地取代的烷基基团可以具有不同于氢的取代基。例如，它可以在沿链的任何位置与卤素原子、羟基基团或本文所述的任何其他取代基结合。因此，术语“任选地取代的”意指给定的化学部分具有含有其他官能团的潜力，但不一定具有任何其他官能团。用于所述的基团的任选的取代的合适的取代基包括而不限于卤素、氧代、-OH、-CN、-COOH、-CH2CN、-O-(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、-O-(C2-C6)烯基、-O-(C2-C6)炔基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、-OH、-OP(O)(OH)2、-OC(O)(C1-C6)烷基、-C(O)(C1-C6)烷基、-OC(O)O(C1-C6)烷基、-NH2、-NH((C1-C6)烷基)、-N((C1-C6)烷基)2、-NHC(O)(C1-C6)烷基、-C(O)NH(C1-C6)烷基、-S(O)2(C1-C6)烷基、-S(O)NH(C1-C6)烷基、和S(O)N((C1-C6)烷基)2。这些取代基本身可以是任选地经取代的。如本文所使用的“任选地取代的”还是指取代的或未取代的，其含义描述于下文。
术语“经取代的”是指指定的基团或部分携带一个或多个合适的取代基，其中这些取代基可以在一个或多个位置处与所述指定的基团或部分连接。例如，被环烷基取代的芳基可指示所述环烷基通过键或通过与芳基稠合并共享两个或更多个共同原子而与所述芳基的一个原子连接。
术语“未取代的”意指特定的基团不带取代基。
除非另有明确定义，否则“芳基”意指具有1至3个芳香族环(包括单环或双环基团)的环芳香族烃基团，例如苯基、联苯基、或萘基。当含有两个芳香族环(双环等)时，芳基基团的芳香族环任选地在单个点处连接(例如，联苯基)或稠合(例如，萘基)。芳基基团在任何附接点处任选地被一个或多个取代基取代，例如1至5个取代基。示例性取代基包括但不限于：-H、-卤素、-CN、-O-(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基、-O-(C2-C6)烯基、-O-(C2-C6)炔基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、-OH、-OP(O)(OH)2、-OC(O)(C1-C6)烷基、-C(O)(C1-C6)烷基、-OC(O)O(C1-C6)烷基、NH2、NH((C1-C6)烷基)、N((C1-C6)烷基)2、-S(O)2-(C1-C6)烷基、-S(O)NH(C1-C6)烷基、和S(O)N((C1-C6)烷基)2。取代基本身是任选地取代的。此外，当含有两个稠合环时，芳基基团任选地具有与完全饱和的环稠合的不饱和的或部分饱和的环。这些芳基基团的示例性环系统包括但不限于苯基、联苯基、萘基、蒽基、非那烯基、菲基、茚满基、茚基、四氢萘基、四氢苯并轮烯基等。
除非另有明确定义，否则“杂芳基”意指5至24个环原子的单价单环芳香族基团或多环芳香族基团，其含有选自N、O、或S的一个或多个环杂原子，剩余的环原子是C。如本文所定义的杂芳基还意指双环杂芳香族基团，其中杂原子选自N、O、或S。芳香族基团任选地独立地被本文描述的一个或多个取代基取代。实例包括但不限于呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡唑基、嘧啶基、咪唑基、异噁唑基、噁唑基、噁二唑基、吡嗪基、吲哚基、噻吩-2-基、苯并吡啶基(quinolyl)、苯并吡喃基、异噻唑基、噻唑基、噻二唑、吲唑、苯并咪唑基、噻吩并[3,2-b]噻吩、三唑基、三嗪基、咪唑并[1,2-b]吡唑基、氟[2,3-c]吡啶基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、吲唑基、吡咯并[2,3-c]吡啶基、吡咯并[3,2-c]吡啶基、吡唑并[3,4-c]吡啶基、噻吩并[3,2-c]吡啶基、噻吩并[2,3-c]吡啶基、噻吩并[2,3-b]吡啶基、苯并噻唑基、吲哚基、二氢吲哚基、吲哚酮基(indolinonyl)、二氢苯并苯硫基、二氢苯并呋喃基、苯并呋喃、色满基、硫代色满基、四氢喹啉基、二氢苯并噻嗪、二氢苯噁烷基、喹啉基、异喹啉基、1,6-萘啶基、苯并[de]异喹啉基、吡啶并[4,3-b][1,6]萘啶基、噻吩并[2,3-b]吡嗪基、喹唑啉基、四唑并[1,5-a]吡啶基、[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶基、异吲哚基、吡咯并[2,3-b]吡啶基、吡咯并[3,4-b]吡啶基、吡咯并[3,2-b]吡啶基、咪唑并[5,4-b]吡啶基、吡咯并[1,2-a]嘧啶基、四氢吡咯并[1,2-a]嘧啶基、3,4-二氢-2H-1Δ2-吡咯并[2,1-b]嘧啶、二苯并[b,d]噻吩、吡啶-2-酮、氟[3,2-c]吡啶基、氟[2,3-c]吡啶基、1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噻嗪基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、氟[2,3-b]吡啶基、苯并苯硫基、1,5-萘啶基、氟[3,2-b]吡啶、[1,2,4]三唑并[l,5-a]吡啶基、苯并[1,2,3]三唑基、咪唑并[1,2-a]嘧啶基、[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪基、苯并[c][1,2,5]噻二唑基、苯并[c][1,2,5]噁二唑、1,3-二氢-2H-苯并[d]咪唑-2-酮、3,4-二氢-2H-吡唑并[1,5-b][1,2]噁嗪基、4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶基、噻唑并[5,4d]噻唑基、咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑基、噻吩并[2,3-b]吡咯基、3H-吲哚基、及其衍生物。此外，当含有两个稠合环时，本文定义的芳基基团可以具有与完全饱和的环稠合的不饱和的或部分饱和的环。这些杂芳基基团的示例性环系统包括二氢吲哚基、吲哚酮基、二氢苯并苯硫基、二氢苯并呋喃、色满基、硫代色满基、四氢喹啉基、二氢苯并噻嗪、3,4-二氢-lH-异喹啉基、2,3-二氢苯并呋喃、二氢吲哚基、吲哚基、和二氢苯噁烷基。
卤素或“卤代”意指氟、氯、溴、或碘。
“烷基”意指含有1-12个碳原子的直链或支链饱和的烃。(C1-C6)烷基基团的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、新戊基、和异己基。
“烷氧基”意指含有1-12个碳原子的直链或支链饱和的烃，其在链中含有末端“O”，例如-O(烷基)。烷氧基基团的实例包括而不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、或戊氧基基团。
“烯基”意指含有2-12个碳原子的直链或支链不饱和的烃。“烯基”基团在链中含有至少一个双键。烯基基团的双键可以是未缀合的或与另一个不饱和基团缀合的。烯基基团的实例包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基、异丁烯、戊烯基、或己烯基。烯基基团可以是未取代的或取代的，并且可以是直链或支链的。
“炔基”意指含有2-12个碳原子的直链或支链不饱和烃。“炔基”基团在链中含有至少一个三键。烯基基团的实例包括乙炔基、炔丙基、正丁炔基、异丁炔基、戊炔基、或己炔基。炔基基团可以是未经取代的或经取代的。
“亚烷基(alkylene或alkylenyl)”意指二价烷基基团。上述单价烷基基团中的任一个可以通过从该烷基中提取第二氢原子而成为亚烷基。如本文所定义，亚烷基也可以是(C1-C6)亚烷基。亚烷基可以进一步是(C1-C4)亚烷基。典型的亚烷基基团包括但不限于-CH2-、-CH(CH3)-、-C(CH3)2-、-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2C(CH3)2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH-等。
“环烷基”或“碳环基”意指含有3-18个碳原子的单环或多环饱和的或部分不饱和的碳环，并且其中在环碳之间没有共用的非定域的n电子(芳香性)。环烷基基团的实例包括而不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、降冰片烷基(norboranyl)、降冰片烯基(norborenyl)、双环[2.2.2]辛基、或双环[2.2.2]辛烯基及其衍生物。(C3-C8)环烷基是含有3至8个之间的碳原子的环烷基基团。环烷基基团可以稠合(例如，十氢化萘)或桥接(例如，降冰片烷(norbomane))。
“杂环基”或“杂环烷基”意指含有碳和至少一个选自氧、氮或硫(O、N或S)的杂原子的饱和的或部分饱和的单环或多环的环，并且其中在环碳或杂原子之间没有共用的非定域的n电子(芳香性)。杂环烷基环结构可以被一个或多个取代基取代。这些取代基本身可以是任选地经取代的。杂环基环的实例包括但不限于氧杂环丁烷基、氮杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、吡咯烷基、噁唑啉基、噁唑烷基、噻唑啉基、噻唑烷基、吡喃基、硫代吡喃基、四氢吡喃基、二噁啉基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基S-氧化物、硫代吗啉基S-二氧化物、哌嗪基、氮杂
Figure BDA0003991130860000541
基、氧杂
Figure BDA0003991130860000542
基、二氮杂
Figure BDA0003991130860000543
基、托烷基、噁唑烷酮基、1,4-二噁烷基、二氢呋喃基、1,3-二氧戊环基、咪唑烷基、咪唑啉基、二硫戊环基和同托烷基(homotropanyl)。
“羟基烷基”意指被一个或多个-OH基团取代的烷基基团。羟基烷基基团的实例包括HO-CH2-、HO-CH2CH2-和CH2-CH(OH)-。
“卤代烷基”意指被一个或多个卤素取代的烷基基团。卤代烷基基团的实例包括但不限于三氟甲基、二氟甲基、五氟乙基、三氯甲基等。
“卤代烷氧基”意指被一个或多个卤素取代的烷氧基基团。卤代烷基基团的实例包括但不限于三氟甲氧基、二氟甲氧基、五氟乙氧基、三氯甲氧基等。
“氰基”意指具有通过三键连接氮原子的碳原子的取代基，例如C≡N。
“氨基”意指含有至少一个氮原子的取代基(例如NH2)。
“烷基氨基”意指其中一个氢被烷基基团替代的氨基或NH2基团，例如，-NH(烷基)。烷基氨基基团的实例包括但不限于甲基氨基(例如-NH(CH3))、乙基氨基、丙基氨基、异丙基氨基、正丁基氨基、仲丁基氨基、叔丁基氨基等。
“二烷基氨基”意指其中两个氢均被烷基基团替代的氨基或NH2基团，例如，-N(烷基)2。氨基基团上的烷基基团是相同或不同的烷基基团。二烷基氨基基团的实例包括但不限于二甲基氨基(例如，-N(CH3)2)、二乙基氨基、二丙基氨基、二异丙基氨基、二正丁基氨基、二仲丁基氨基、二叔丁基氨基、甲基(乙基)氨基、甲基(丁基氨基)等。
“螺环烷基”或“螺环基”意指具有通过单个原子连接的两个环的碳二环的环系统。这些环的尺寸和性质可以是不同的、或者尺寸和性质是相同的。实例包括螺戊烷、螺己烷、螺庚烷、螺辛烷、螺壬烷、或螺癸烷。螺环中的一个或两个环可以与另一个环碳环、杂环、芳香族环、或杂芳香族环稠合。(C3-C12)螺环烷基是含有3至12个之间的碳原子的螺环。
“螺杂环烷基”或“螺杂环基”意指其中至少一个环是杂环(碳原子中的一个或多个可以被杂原子取代(例如，至少一个环中的碳原子中的一个或多个被杂原子取代))的螺环。螺杂环中的一个或两个环可以与另一个环碳环、杂环、芳香族环、或杂芳香族环稠合。
术语“ZBTB32”是指含锌指和BTB结构域的32，也称为Rog、FAXF、FAZF、TZFP、ZNF538、或含锌指和BTB结构域的蛋白32。GenBank登录号：NM_001316902.2、NM_001316903.2和NM_014383.3提供了示例性ZBTB32核苷酸序列。GenBank登录号：NP_055198.1、NP_001303831.1和NP_001303832.1提供了示例性ZBTB32氨基酸序列。
如本文所用的术语“IL-15受体分子”是指全长天然存在的IL-15受体α(IL-15Ra)(例如，哺乳动物IL-15Ra，例如，人IL-15Ra，例如，GenBank登录号AAI21141.1)、IL-15Ra的功能片段，或与IL-15Ra的天然存在的野生型多肽或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的活性变体。在一些实施例中，所述变体是野生型多肽或编码所述多肽的核酸的衍生物，例如，突变体。在一些实施例中，所述IL-15Ra变体，例如，IL-15Ra的活性变体，具有野生型IL-15Ra多肽的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性。在一些实施例中，所述IL-15Ra分子包含一种或多种翻译后修饰。如本文所用，术语IL-15R和IL-15Ra可互换。
如本文所用的术语“IL-15分子”是指全长天然存在的IL-15(例如，哺乳动物IL-15，例如，人IL-15，例如，GenBank登录号AAI00963.1)、IL-15的功能片段，或与IL-15的天然存在的野生型多肽或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的活性变体。在一些实施例中，所述变体是野生型多肽或编码所述多肽的核酸的衍生物，例如，突变体。在一些实施例中，所述IL-15变体，例如，IL-15的活性变体，具有野生型IL-15多肽的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性。在一些实施例中，所述IL-15分子包含一种或多种翻译后修饰。
如本文所用，细胞因子分子的“活性变体”是指具有野生型细胞因子的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性的细胞因子变体，例如，如通过本领域公认的测定所测量的。
本文的组合物和方法的各个实施例在下文进一步详细描述。另外的定义在整个申请书中陈述。
ZBTB32
含锌指和BTB结构域的蛋白质32是一种在人类中由ZBTB32基因编码的蛋白质。ZBTB32蛋白也称为范可尼贫血锌指蛋白(FAZF)、睾丸锌指蛋白(TZFP)、FANCC相互作用蛋白(FAXP)、锌指蛋白538(ZNF538)、GATA3抑制因子(ROG)和早幼粒细胞白血病锌指和zbtb16(PLZF)样锌指蛋白(PLZP)。它包含一个N末端BTB/POZ结构域(IPR000210)或一个SKP1/BTB/POZ结构域(IPR011333)以及三个C末端锌指，Znf_C2H2_sf.(IPR036236)、Znf_C2H2_型结构域(IPR013087)、Znf_RING/FYVE/PHD结构域(IPR013083)，后面是推定的UBZ4结构域(Rizzo等人(2014)Biochemistry[生物化学].53(37):5895-906)。它是痘病毒和锌指(POZ)和Krüppel(POK)蛋白家族的成员，并在涉及免疫细胞肿瘤发生或免疫细胞发育的多个筛选中被鉴定出来(Hoatlin等人(1999)Blood[血液].94(11):3737-47)。
ZBTB32蛋白可作为转录抑制因子发挥作用。例如，ZBTB32蛋白可以将组蛋白修饰酶募集到染色质以影响基因活化(Yoon等人Journal of Immunology[免疫学杂志].189(5):2393-403)。ZBTB32还可以将共抑制因子(例如核受体共抑制因子(NCoR))和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)募集到其靶基因，诱导抑制染色质状态并与其他蛋白质(例如Blimp-1)协同作用以抑制基因转录。
ZBTB32蛋白可与多个蛋白质相互作用，这些蛋白质包括例如范可尼贫血互补组C(Fancc)、硫氧还蛋白相互作用蛋白(Txnip)、维生素D3上调蛋白1(VDUP1)、含锌指和BTB结构域的蛋白16(Zbtb16)、锌指肘相关脯氨酸结构域蛋白2(Zpo2)、GATA结合蛋白2(GATA2)以及GATA3(Hoatlin等人(1999)Blood[血液].94(11):3737-47；Tsuzuki等人(2002)Blood[血液].99:3404-3410；Miaw等人(2000)Immunity[免疫力].12:323-333)。
ZBTB32基因在活化后在T细胞和B细胞中表达，但也在睾丸中高表达。ZBTB32的表达由自然杀伤细胞中的炎性细胞因子诱导(Beaulieu等人(2014).Nat Immunol.[自然免疫学]15:546-555)。ZBTB32在弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中高度表达，并且似乎结合并抑制MHC II类反式激活因子(CIITA)的表达，并因此抑制MHCII基因(Yoon等人J Immunol[免疫学杂志](2012).189:2393-2403)。Zpo2通过Zbtb32介导的GATA3抑制驱动侵袭性乳腺癌(Shahi等人(2017).Proc Natl Acad Sci U S A.[美国国家科学院院刊]114(12):3169-3174)。基于DNA甲基化相关网络中候选生物标志物的生存分析，ZBTB32也在结肠癌中得到鉴定(Zhang等人(2015).PLoS One.[公共科学图书馆·综合]10(3):e0120361)。暴露于顺铂后，Zbtb32的表达上调(Sourisseau等人(2016).Cell Cycle.[细胞周期]15(2):295-302)。
在本文披露的组合物、方法或用途中任一项的一些实施例中，ZBTB32蛋白包含与SEQ ID NO:2265、2267或2269的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，ZBTB32蛋白包含SEQ ID NO:2265、2267、或2269的氨基酸序列。
在本文披露的组合物、方法或用途中任一项的一些实施例中，ZBTB32蛋白由与SEQID NO:2266、2268或2270的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，ZBTB32蛋白由SEQ ID NO:2266、2268、或2270的核苷酸序列编码。
在一些实施例中，本文所述的免疫效应细胞(例如，表达CAR的免疫效应细胞)包含核酸序列，例如转基因，其包含SEQ ID NO:2266、2268或2270的序列。
示例性ZBTB32氨基酸和核苷酸序列
同种型1(转录变体1)
氨基酸：NP_055198.1(SEQ ID NO:2265)
Figure BDA0003991130860000591
编码序列：NM_014383.3(SEQ ID NO:2266)
Figure BDA0003991130860000592
Figure BDA0003991130860000601
同种型2(转录变体2)
氨基酸：NP_001303831.1(SEQ ID NO:2267)
Figure BDA0003991130860000602
编码序列：NM_001316902.2(SEQ ID NO:2268)
Figure BDA0003991130860000603
Figure BDA0003991130860000611
同种型3(转录变体3)
氨基酸：NP_001303832.1(SEQ ID NO:2269)
Figure BDA0003991130860000612
编码序列：NM_001316903.2(SEQ ID NO:2270)
Figure BDA0003991130860000613
Figure BDA0003991130860000621
基因编辑系统
根据本披露，基因编辑系统可以用作ZBTB32抑制剂。本披露还考虑了编码靶向ZBTB32基因的基因编辑系统的一种或多种组分的核酸的用途。
CRISPR/Cas9基因编辑系统
在大约40％的测序的真细菌基因组和90％的测序的古细菌中发现了天然存在的CRISPR/Cas系统。Grissa等人(2007)BMC Bioinformatics[BMC生物信息学]8:172。此系统是赋予对外来遗传元件(如质粒和噬菌体)的抗性并提供获得性免疫的形式的原核免疫系统。Barrangou等人(2007)Science[科学]315:1709-1712；Marragini等人(2008)Science[科学]322:1843-1845。
已经修饰CRISPR/Cas系统用于真核生物(如小鼠或灵长类动物)的基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)。Wiedenheft等人(2012)Nature[自然]482:331-8。这是通过例如向真核细胞中引入含有特异设计的CRISPR和一种或多种适当的Cas的质粒来实现的。
CRISPR序列(有时称为CRISPR基因座)包含可替代的重复序列和间隔子。在天然存在的CRISPR中，间隔子通常包含对于细菌而言外来的序列，如质粒或噬菌体序列；在靶向ZBTB32基因的示例性CRISPR/Cas系统中，间隔子源自ZBTB32基因序列或其调节元件的序列。
来自CRISPR基因座的RNA是组成型表达的并被加工成小RNA。这些包含由重复序列侧接的间隔子。RNA指导其他Cas蛋白在RNA或DNA水平沉默外源性遗传元件。Horvath等人(2010)Science[科学]327:167-170；Makarova等人(2006)Biology Direct[生物学快讯]1:7。因此，类似于siRNA，间隔子充当RNA分子的模板。Pennisi(2013)Science[科学]341:833-836。
由于这些天然存在于许多不同类型的细菌中，因此CRISPR的确切排列，和Cas基因的结构、功能和数量及其产物在物种之间略有不同。Haft等人(2005)PLoS Comput.Biol.[公共科学图书馆医学杂志第一版]1:e60；Kunin等人(2007)Genome Biol.[基因组生物学]8:R61；Mojica等人(2005)J.Mol.Evol.[分子进化杂志]60:174-182；Bolotin等人(2005)Microbiol.[微生物学]151:2551-2561；Pourcel等人(2005)Microbiol.[微生物学]151:653-663；和Stern等人(2010)Trends.Genet.[遗传学趋势]28:335-340。例如，Cse(Cas亚型，大肠杆菌)蛋白质(例如，CasA)形成功能性复合物Cascade，其将CRISPR RNA转录物处理成保留Cascade的间隔区重复单元。Brouns等人(2008)Science[科学]321:960-964。在其他原核生物中，Cas6加工CRISPR转录物。大肠杆菌中基于CRISPR的噬菌体失活需要Cascade和Cas3，但不需要Cas1或Cas2。强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)和其他原核生物中的Cmr(Cas RAMP模块)蛋白形成具有小CRISPR RNA的功能性复合物，其识别和切割互补的靶RNA。更简单的CRISPR系统依赖于蛋白质Cas9，其是具有两个活性切割位点的核酸酶，各自对应用于双螺旋的每条链。将Cas9和修饰的CRISPR基因座RNA组合可用于基因编辑系统。Pennisi(2013)Science[科学]341:833-836。
因此，CRISPR/Cas系统可用于修饰，例如，使一个或多个核酸、ZBTB32基因、或ZBTB32基因的基因调控元件缺失，或引入过早终止子，从而降低ZBTB32基因功能的表达。替代性地，可以像RNA干扰一样使用CRISPR/Cas系统，以可逆的方式关闭ZBTB32基因。例如，在哺乳动物细胞中，RNA可以将Cas蛋白引导至ZBTB32基因的启动子，空间上阻断RNA聚合酶。
用于真核细胞中的基因编辑的CRISPR/Cas系统通常涉及(1)包含靶向序列(其能够与基因组DNA靶序列杂交)的指导RNA分子(gRNA)，和能够结合Cas(例如Cas9酶)的序列，以及(2)Cas(例如，Cas9蛋白)。可以将靶向序列和能够结合Cas(例如，Cas9酶)的序列置于同一分子上或不同的分子上。如果置于不同的分子上，则每个分子包含允许这些分子例如通过杂交缔合的杂交结构域。
本披露的示例性gRNA分子包含具有以下序列的第一核酸，例如由具有以下序列的第一核酸组成(其中“n”是指靶向序列的残基(例如，如本文所述的(例如表3中所述))，并且可以由15-25个核苷酸组成，例如由20个核苷酸组成)：
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:3022)；
和具有以下序列的第二核酸序列：
AACUUACCAAGGAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC，任选地在3'端具有1、2、3、4、5、6、或7个(例如，4或7个，例如7个)另外的U核苷酸(SEQ ID NO:3024)。
第二核酸分子可以可替代地由上述序列的片段组成，其中这种片段能够与该第一核酸杂交。这种第二核酸分子的一个实例是：
AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC，任选地在3'端具有1、2、3、4、5、6、或7个(例如，4或7个，例如7个)另外的U核苷酸(SEQ IDNO:3026)。
本披露的另一个示例性gRNA分子包含具有以下序列的第一核酸，例如由具有以下序列的第一核酸组成(其中“n”是指靶向序列的残基(例如，如本文所述的(例如表3中所述))，并且可以由15-25个核苷酸组成，例如由20个核苷酸组成)：
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:3028)，任选地在3’端具有1、2、3、4、5、6或7(例如4或7(例如4))个另外的U核苷酸。可以使用本领域中已知的技术产生抑制ZBTB32基因的人工CRISPR/Cas系统，例如，描述于美国公开号20140068797、WO 2015/048577和Cong(2013)Science[科学]339:819-823中的技术。还可以产生本领域已知的其他人工CRISPR/Cas系统，其抑制ZBTB32基因，例如描述于以下：Tsai(2014)Nature Biotechnol.[自然生物技术],32:6 569-576,美国专利号：8,871,445、8,865,406、8,795,965、8,771,945、以及8,697,359，这些文献的内容特此通过引用以其全文并入。可以产生例如通过工程化CRISPR/Cas系统以包含gRNA分子来抑制ZBTB32基因的此类系统，该gRNA分子包含与靶基因(例如ZBTB32基因)的序列杂交的靶向序列。在实施例中，该gRNA包含靶向序列，该靶向序列与靶基因(例如，ZBTB32基因)的15-25个核苷酸(例如，20个核苷酸)完全互补。在实施例中，靶基因(例如ZBTB32基因)的15-25个核苷酸(例如，20个核苷酸)紧邻由CRISPR/Cas系统的Cas蛋白识别的前间区邻近基序(PAM)序列的5'布置(例如，当所述系统包含酿脓链球菌Cas9蛋白时，该PAM序列包含NGG，其中N可以是A、T、G或C中的任一者)。
在一个实施例中，可以将外源DNA与CRISPR/Cas系统(例如，编码(例如，如本文所述的)CAR的DNA)一起引入细胞中。取决于外源DNA的序列和染色体序列，此过程可用于在CRISPR/Cas系统靶向的位点处或附近整合编码(例如，如本文所述的)CAR的DNA。如本文所示，在实例中，但不受理论的束缚，这种整合可导致CAR的表达以及ZBTB32基因的破坏。这种外源DNA分子在本文中被称为“模板DNA”。在实施例中，模板DNA还包含编码一种或多种感兴趣的分子(例如，编码本文所述的CAR)的模板DNA的核酸的5'同源臂、3'同源臂、或5'和3'同源臂两者，其中所述同源臂与靶序列侧翼的基因组DNA序列互补。
在实施例中，本披露的CRISPR/Cas系统包含Cas9(例如，酿脓链球菌Cas9)和包含与ZBTB32基因的序列杂交的靶向序列的gRNA。在实施例中，CRISPR/Cas系统包含编码对ZBTB32基因具有特异性的gRNA的核酸和编码Cas蛋白(例如Cas9，例如酿脓链球菌Cas9)的核酸。在实施例中，CRISPR/Cas系统包含对ZBTB32基因具有特异性的gRNA和编码Cas蛋白(例如Cas9，例如酿脓链球菌Cas9)的核酸。
TALEN基因编辑系统
通过将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割域进行融合来人工产生TALEN。可以工程化转录活化因子样作用(TALE)以结合任何所希望的DNA序列，包括HLA或TCR基因的部分。通过将工程化的TALE与DNA切割域组合，可以产生对任何所希望的DNA序列(包括HLA或TCR序列)具有特异性的限制酶。然后可以将这些引入细胞中，其中它们可以用于基因组编辑。Boch(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:135-6；和Boch等人(2009)Science[科学]326:1509-12；Moscou等人(2009)Science[科学]326:3501。
TALE是由黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌分泌的蛋白质。DNA结合结构域含有重复的、高度保守的33-34个氨基酸序列，但第12和第13氨基酸除外。这两个位置高度变化，显示出与特定核苷酸识别的强相关性。因此，它们可以被工程化以结合所希望的DNA序列。
为了产生TALEN，将TALE蛋白与核酸酶(N)融合，该核酸酶是例如野生型或突变的FokI核酸内切酶。针对其在TALEN中的用途已经对FokI作出若干突变；这些例如，改进切割特异性或活性。Cermak等人(2011)Nucl.Acids Res.[核酸研究]39:e82；Miller等人(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:143-8；Hockemeyer等人(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:731-734；Wood等人(2011)Science[科学]333:307；Doyon等人(2010)Nature Methods[自然方法]8:74-79；Szczepek等人(2007)Nature Biotech.[自然生物技术]25:786-793；和Guo等人(2010)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]200:96。
FokI结构域作为二聚体起作用，这需要两个具有独特DNA结合结构域的构建体，用于靶基因组中具有适当方向和间距的位点。TALE DNA结合结构域与FokI切割域之间的氨基酸残基的数量和两个单独TALEN结合位点之间的碱基的数量似乎都是实现高水平活性的重要参数。Miller等人(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:143-8。
可以在细胞内使用对ZBTB32基因具有特异性的TALEN以产生双链断裂(DSB)。如果修复机制经由非同源末端连接不正确地修复断裂，则可以在断裂位点引入突变。例如，不正确的修复可以引入移码突变。可替代地，可以将外源DNA与TALEN(例如，编码(例如，如本文所述的)CAR的DNA)一起引入细胞中。取决于外源DNA的序列和染色体序列，此过程可用于在TALEN靶向的位点处或附近整合编码(例如，如本文所述的)CAR的DNA。如本文所示，在实例中，但不受理论的束缚，这种整合可导致CAR的表达以及ZBTB32基因的破坏。这种外源DNA分子在本文中被称为“模板DNA”。在实施例中，模板DNA还包含编码一种或多种感兴趣的分子(例如，编码本文所述的CAR)的模板DNA的核酸的5’同源臂、3'同源臂、或5'和3'同源臂两者，其中所述同源臂与靶序列侧翼的基因组DNA序列互补。
可以使用本领域已知的任何方法构建对ZBTB32基因中的序列具有特异性的TALEN，这些方法包括使用模块组分的各种方案。Zhang等人(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:149-53；Geibler等人(2011)PLoS ONE[公共科学图书馆综合]6:e19509；US8,420,782；US8,470,973，这些文献的内容特此通过引用以其全文并入)。
锌指核酸酶
“ZFN”或“锌指核酸酶”是指锌指核酸酶，一种可用于修饰例如，使所希望的核酸序列(例如ZBTB32基因)的一个或多个核酸缺失的人工核酸酶。
像TALEN一样，ZFN包含与DNA结合结构域融合的FokI核酸酶域(或它的衍生物)。就ZFN而言，DNA结合结构域包含一个或多个锌指。Carroll等人(2011)Genetics Society ofAmerica[美国遗传学学会]188:773-782；和Kim等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]93:1156-1160。
锌指是被一种或多种锌离子稳定的小蛋白质结构基序。锌指可包含例如Cys2His2，并且可识别大约3-bp序列。可以将已知特异性的各种锌指组合以产生识别约6、9、12、15或18-bp序列的多指多肽。各种选择和模块组装技术可用于产生识别特定序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交和双杂交系统、以及哺乳动物细胞。
像TALEN一样，ZFN必须二聚化以切割DNA。因此，需要一对ZFN来靶向非回文DNA位点。两个单独的ZFN必须与DNA的相反链结合，其中它们的核酸酶适当地间隔开。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]95:10570-5。
也像TALEN一样，ZFN可以在DNA中产生双链断裂，所述双链断裂如果不正确地修复则可以产生移码突变，从而导致细胞中ZBTB32基因的表达减少。ZFN还可以与同源重组一起使用以使ZBTB32基因突变，或者在靶向序列处或附近的位点引入编码CAR的核酸。如上所述，编码CAR的核酸可以作为模板DNA的一部分引入。在实施例中，模板DNA还包含编码一种或多种感兴趣的分子(例如，编码本文所述的CAR)的模板DNA的核酸的5'同源臂、3'同源臂、或5'和3'同源臂两者，其中所述同源臂与靶序列侧翼的基因组DNA序列互补。
可以使用本领域中已知的任何方法来构建对ZBTB32基因中的序列具有特异性的ZFN。参见例如，Provasi(2011)Nature Med.[自然医学]18:807-815；Torikai(2013)Blood[血液]122:1341-1349；Cathomen等人(2008)Mol.Ther.[分子疗法]16:1200-7；和Guo等人(2010)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]400:96；美国专利公开2011/0158957；以及美国专利公开2012/0060230，这些文献的内容特此通过引用以其全文并入。在实施例中，ZFN基因编辑系统还可包含编码ZFN基因编辑系统的一种或多种组分的核酸，例如靶向ZBTB32基因的ZFN基因编辑系统。
不受理论的束缚，据信使用靶向ZBTB32基因的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas基因编辑系统)可以允许调节(例如，抑制)ZBTB32基因的一种或多种功能，例如，通过引起导致截短的ZBTB32基因表达的编辑事件。同样，不受理论的束缚，这种截短的ZBTB32基因产物可以保留ZBTB32基因产物的一种或多种功能(例如，支架功能)，同时抑制ZBTB32基因产物的一种或多种其他功能(例如，催化功能)，因此，可能是更优选的。就此而言，靶向ZBTB32基因晚期外显子或内含子的基因编辑系统可能是特别优选的。在一方面，本披露的基因编辑系统靶向所述ZBTB32基因的晚期外显子或内含子。在一方面，本披露的基因编辑系统靶向外显子8下游的外显子或内含子。在一方面，基因编辑系统靶向ZBTB32基因的外显子8或外显子9(例如外显子9)。
不受理论束缚，在其他实施例中也可优选的是靶向ZBTB32基因的早期外显子或内含子，例如以在靶基因中引入提前终止密码子，其导致基因产物不表达或完全无功能的基因产物表达。就此而言，靶向ZBTB32基因早期外显子或内含子的基因编辑系统可能是特别优选的。在一方面，本披露的基因编辑系统靶向所述ZBTB32基因的早期外显子或内含子。在一方面，本披露的基因编辑系统靶向外显子4上游的外显子或内含子。在实施例中，基因编辑系统靶向ZBTB32基因的外显子1、外显子2或外显子3(例如外显子3)。
不受理论束缚，在其他实施例中也可优选的是靶向ZBTB32基因的序列，其对该基因的一种或多种同种型具有特异性，但不影响该基因的一种或多种其他同种型。在实施例中，可能优选的是特异性靶向包含催化结构域的ZBTB32基因的同种型。
双链RNA(例如，SiRNA或ShRNA)抑制剂
根据本披露，双链RNA(“dsRNA”)，例如siRNA或shRNA可用作ZBTB32抑制剂。本披露还考虑了编码所述dsRNA抑制剂的核酸的用途。
在实施例中，ZBTB32基因的调节剂(例如抑制剂)是核酸，例如dsRNA，例如对编码ZBTB32基因产物的核酸具有特异性的siRNA或shRNA，例如基因组DNA或编码ZBTB32基因产物的mRNA。
本披露的一个方面提供了组合物，该组合物包含dsRNA(例如siRNA或shRNA)，其包含至少15个连续核苷酸(例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸(例如21个连续核苷酸))，这些核苷酸与ZBTB32基因的序列、核酸序列(例如编码ZBTB32基因产物的基因组DNA或mRNA)互补(例如100％互补)。应当理解，一些靶序列和/或shRNA分子以DNA形式存在，但是靶向这些序列或包含这些序列的dsRNA试剂可以是RNA、或本文公开和/或本领域已知的任何核苷酸、修饰的核苷酸或替代物，条件是该分子仍可以介导RNA干扰。
在实施例中，编码抑制ZBTB32基因表达的dsRNA分子的核酸分子可操作地连接到启动子，例如H1-或U6-衍生的启动子，使得抑制ZBTB32基因表达的dsRNA分子在表达CAR的细胞内表达。参见例如，Tiscornia G.,“Development of Lentiviral VectorsExpressing siRNA[表达siRNA的慢病毒载体的发展],”第3章,Gene Transfer:Deliveryand Expression of DNA and RNA[基因转移：DNA和RNA的递送和表达](编辑：Friedmann和Rossi)。Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],美国纽约冷泉港,2007；Brummelkamp TR等人(2002)Science[科学]296:550–553；Miyagishi M等人(2002)Nat.Biotechnol.[自然生物技术]19:497–500。在实施例中，编码抑制ZBTB32基因表达的dsRNA分子的核酸分子存在于包含编码CAR组分(例如所有组分)的核酸分子的同一载体(例如慢病毒载体)上。这样的实施例中，编码抑制ZBTB32基因表达的dsRNA分子的核酸分子位于编码CAR组分(例如所有组分)的核酸5’-或3’-的载体(例如慢病毒载体)上。编码抑制ZBTB32基因表达的dsRNA分子的核酸分子可以在与编码CAR组分(例如所有组分)的核酸相同或不同的方向上转录。在实施例中，编码抑制ZBTB32基因表达的dsRNA分子的核酸分子存在于载体上，该载体不同于包含编码CAR组分(例如所有组分)的核酸分子的载体。在实施例中，编码抑制ZBTB32基因表达的dsRNA分子的核酸分子在表达CAR的细胞内瞬时表达。在实施例中，编码抑制ZBTB32基因表达的dsRNA分子的核酸分子稳定地整合到表达CAR的细胞的基因组中。
下文提供了编码shRNA序列的核酸序列的实例。靶序列是指ZBTB32基因组DNA(或周围DNA)内的序列。编码ZBTB32 shRNA的核酸编码可用于本披露的shRNA分子。在实施例中，ZBTB32抑制剂是对下面列出的靶序列具有特异性或对其mRNA互补序列具有特异性的siRNA或shRNA。
抗体分子，例如单结构域抗体
根据本披露，抗体分子可以用作ZBTB32抑制剂。本披露还考虑了编码靶向由ZBTB32基因编码的蛋白质的抗体分子的核酸的用途。
在一些实施例中，ZBTB32抑制剂是单结构域抗体(sdAb)，也称为纳米抗体。在其他实施例中，ZBTB32抑制剂是编码单结构域抗体的核酸。
单结构域抗体可包括其互补决定区是单结构域多肽的一部分的抗体。实例包括但不限于重链抗体、天然缺乏轻链的抗体、衍生自常规4-链抗体的单结构域抗体、工程抗体和除衍生自抗体的那些以外的单结构域支架。单结构域抗体可以是任何本领域的抗体，或任何未来的单结构域抗体。单结构域抗体可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。根据本披露的另一个方面，单结构域抗体是天然存在的单结构域抗体，称为不含轻链的重链抗体。例如在WO 94/04678中披露了这种单结构域抗体。出于清楚的原因，衍生自天然缺乏轻链的重链抗体的这种可变结构域在本文中称为VHH或纳米抗体，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开。这种VHH分子可以衍生自骆驼科物种，例如骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和原驼中产生的抗体。除骆驼科外的其他物种可产生天然缺乏轻链的重链抗体；此类VHH在本披露的范围内。
嵌合抗原受体(CAR)
在一些实施例中，本文披露了制备和使用免疫效应细胞(例如，免疫效应细胞群体)的方法，所述免疫效应细胞表达CAR分子(例如，如本文所述)，并且具有降低的ZBTB32表达和/或降低的ZBTB32生物活性。在一些实施例中，示例性CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)、抗原结合结构域(例如，本文所述的抗原结合结构域)、铰链(例如，本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)、和细胞内刺激结构域(例如，本文所述的细胞内刺激结构域)。在一些实施例中，示例性CAR构建体包含任选前导序列(例如本文所述的前导序列)、细胞外抗原结合结构域(例如本文所述的抗原结合结构域)、铰链(例如本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如本文所述的跨膜结构域)、细胞内共刺激信号传导结构域(例如本文所述的共刺激信号传导结构域)和/或细胞内初级信号传导结构域(例如本文所述的初级信号传导结构域)。
可以作为本文所述的CAR分子的一部分的各种组分的非限制性实例的序列在表1和表2中列出，其中“aa”代表氨基酸，“na”代表编码相应肽的核酸。
表1：CAR的各种组分的示例性序列
Figure BDA0003991130860000731
Figure BDA0003991130860000741
表2.CAR的不同组分的示例性序列(aa–氨基酸序列，na–核酸序列)。
Figure BDA0003991130860000742
Figure BDA0003991130860000751
Figure BDA0003991130860000761
Figure BDA0003991130860000771
Figure BDA0003991130860000781
Figure BDA0003991130860000791
Figure BDA0003991130860000801
CAR抗原结合结构域
在一些实施例中，包含抗原结合结构域的CAR分子的一部分包含靶向肿瘤抗原(例如，本文所述的肿瘤抗原)的抗原结合结构域。在一些实施例中，所述抗原结合结构域结合至：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1；C型凝集素样分子-1，CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3；TNF受体家族成员；B细胞成熟抗原(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚基α-2；间皮素；白细胞介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板来源的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；黏蛋白1，细胞表面相关的(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断裂点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关蛋白(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X可读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖基神经酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ替代性阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺特异性蛋白；存活蛋白；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1、T细胞1识别的黑素瘤抗原；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样，T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在蛋白1(RU1)；肾遍在蛋白2(RU2)；豆荚蛋白；人乳头状瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头状瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧酸酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；或免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
抗原结合结构域可以是与抗原结合的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、及其功能片段，包括但不限于单结构域抗体(如骆驼来源的纳米抗体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)、和可变结构域(VHH))，以及本领域已知的用作抗原结合结构域的可替代支架(如重组纤连蛋白结构域等)、T细胞受体(TCR)或其片段(例如，单链TCR)等。在一些情况下，抗原结合结构域源自其中最终将使用CAR分子的相同物种是有益的。例如，对于在人中使用，CAR分子的抗原结合结构域包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人或人源化残基可以是有益的。
在一个实施例中，CD19 CAR是描述于以下中的CD19 CAR：美国专利号8,399,645；美国专利号7,446,190；Xu等人,Leuk Lymphoma.[白血病淋巴瘤]2013 54(2):255-260(2012)；Cruz等人,Blood[血液]122(17):2965-2973(2013)；Brentjens等人,Blood[血液]118(18):4817-4828(2011)；Kochenderfer等人,Blood[血液]116(20):4099-102(2010)；Kochenderfer等人,Blood[血液]122(25):4129-39(2013)；或16th Annu Meet Am Soc GenCell Ther[第16届年会美国基因与细胞治疗学会](ASGCT)(5月15-18日，盐湖城)2013,摘要10(这些文献各自通过引用以其全文并入本文)。在一个实施例中，针对CD19的抗原结合结构域是描述于例如PCT公开WO 2012/079000(通过引用以其全文并入本文)中的CAR分子、抗体或其抗原结合片段的抗原结合部分(例如CDR)。在一个实施例中，针对CD19的抗原结合结构域是描述于例如以下中的CAR分子、抗体或其抗原结合片段的抗原结合部分(例如CDR)：PCT公开WO 2014/153270；Kochenderfer,J.N.等人,J.Immunother.[免疫疗法杂志]32(7),689-702(2009)；Kochenderfer,J.N.,等人,Blood[血液],116(20),4099-4102(2010)；PCT公开WO 2014/031687；Bejcek,Cancer Research[癌症研究],55,2346-2351,1995；或美国专利号7,446,190(这些文献各自特此通过引用以其全文并入)。
在一个实施例中，针对间皮素的抗原结合结构域是或者可以衍生自抗体的抗原结合结构域(例如CDR、scFv或VH和VL)、抗原结合片段或描述于例如PCT公开WO 2015/090230中的CAR分子(在一个实施例中，CAR分子是描述于WO 2015/090230中的CAR分子，将该公开的内容以其整体并入本文)。在一些实施例中，针对间皮素的抗原结合结构域是或者衍生自抗体的抗原结合部分(例如CDR、scFv或VH和VL)、抗原结合片段或例如在PCT公开WO 1997/025068、WO 1999/028471、WO 2005/014652、WO 2006/099141、WO 2009/045957、WO 2009/068204、WO 2013/142034、WO 2013/040557或WO 2013/063419(这些文献各自通过引用以其全文并入本文)中描述的CAR分子。
在一个实施例中，针对CD123的抗原结合结构域是或者衍生自抗体的抗原结合部分(例如CDR、scFv或VH和VL)、抗原结合片段或描述于例如PCT公开WO 2014/130635(通过引用以其全文并入本文)中的CAR分子。在一个实施例中，针对CD123的抗原结合结构域是或者衍生自抗体的抗原结合部分(例如CDR、scFv或VH和VL)、抗原结合片段或描述于例如PCT公开WO 2016/028896(通过引用以其全文并入本文)中的CAR分子。在一些实施例中，CAR分子是描述于WO2016/028896中的CAR分子。在一个实施例中，针对CD123的抗原结合结构域是或者衍生自抗体的抗原结合部分(例如CDR、scFv或VH和VL)、抗原结合片段或例如在PCT公开WO 1997/024373、WO 2008/127735(例如26292、32701、37716或32703的CD123结合结构域)、WO 2014/138805(例如CSL362的CD123结合结构域)、WO 2014/138819、WO 2013/173820、WO2014/144622、WO 2001/66139、WO 2010/126066(例如Old4、Old5、Old17、Old19、New102、或Old6中任一个的CD123结合结构域)、WO 2014/144622、或US 2009/0252742(这些文献各自通过引用以其全文并入本文)中描述的CAR分子。
在一个实施例中，针对CD22的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：Haso等人,Blood[血液],121(7):1165-1174(2013)；Wayne等人,ClinCancer Res[临床癌症研究]16(6):1894-1903(2010)；Kato等人,Leuk Res[白血病研究]37(1):83-88(2013)；Creative BioMart[创意生物公司](creativebiomart.net):MOM-18047-S(P)。
在一个实施例中，针对CS-1的抗原结合结构域是埃洛妥珠单抗(BMS)的抗原结合部分(例如CDR)，参见例如，Tai等人,2008,Blood[血液]112(4):1329-37；Tai等人,2007,Blood.[血液]110(5):1656-63。
在一个实施例中，针对CLL-1的抗原结合结构域是抗体的抗原结合部分(例如CDR或VH和VL)、抗原结合片段或描述于例如PCT公开WO 2016/014535中的CAR分子，将该公开的内容以其整体并入本文。在一个实施例中，针对CLL-1的抗原结合结构域是可从R&D公司、电子生物科学公司(ebiosciences)、艾博抗公司(Abcam)获得的抗体的抗原结合部分(例如CDR)，所述抗体为例如PE-CLL1-hu目录号353604(百进生物科技公司(BioLegend))；和PE-CLL1(CLEC12A)目录号562566(BD)。
在一个实施例中，针对CD33的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：Bross等人,Clin Cancer Res[临床癌症研究]7(6):1490-1496(2001)(吉妥珠单抗奥佐米星,hP67.6)；Caron等人,Cancer Res[癌症研究]52(24):6761-6767(1992)(林妥珠单抗，HuM195)；Lapusan等人,Invest New Drugs[新药物研究]30(3):1121-1131(2012)(AVE9633)；Aigner等人,Leukemia[白血病]27(5):1107-1115(2013)(AMG330，CD33 BiTE)；Dutour等人,Adv hematol[血液学进展]2012:683065(2012)；以及Pizzitola等人,Leukemia[白血病]doi:10.1038/Lue.2014.62(2014)。本文描述了靶向CD33的示例性CAR分子，并且在WO 2016/014576中提供，例如在WO 2016/014576(通过引用以其全文并入本文)的表2中提供。
在一个实施例中，针对GD2的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：Mujoo等人,Cancer Res[癌症研究]47(4):1098-1104(1987)；Cheung等人,Cancer Res[癌症研究]45(6):2642-2649(1985)，Cheung等人,J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]5(9):1430-1440(1987)，Cheung等人,J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]16(9):3053-3060(1998)，Handgretinger等人,Cancer Immunol Immunother[癌症免疫学和免疫疗法]35(3):199-204(1992)。在一些实施例中，针对GD2的抗原结合结构域是选自以下的抗体的抗原结合部分：mAb 14.18、14G2a、ch14.18、hu14.18、3F8、hu3F8、3G6、8B6、60C3、10B8、ME36.1、和8H9，参见例如WO 2012033885、WO 2013040371、WO 2013192294、WO 2013061273、WO 2013123061、WO 2013074916、和WO 201385552。在一些实施例中，针对GD2的抗原结合结构域是描述于以下中的抗体的抗原结合部分，美国公开号：20100150910或PCT公开号：WO2011160119。
在一个实施例中，针对BCMA的抗原结合结构域是描述于例如WO 2012163805、WO200112812、和WO 2003062401中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。在一些实施例中，使用来自PCT公开WO 2012/0163805(将其内容通过引用以其全文并入本文)的抗原结合结构域(例如CDR、scFv或VH和VL序列)产生另外的示例性BCMA CAR构建体。在一些实施例中，使用来自PCT公开WO 2016/014565(将其内容通过引用以其全文并入本文)的抗原结合结构域(例如CDR、scFv或VH和VL序列)产生另外的示例性BCMA CAR构建体。在一些实施例中，使用来自PCT公开WO 2014/122144(将其内容通过引用以其全文并入本文)的抗原结合结构域(例如CDR、scFv或VH和VL序列)产生另外的示例性BCMA CAR构建体。在一些实施例中，使用来自PCT公开WO 2016/014789(将其内容通过引用以其全文并入本文)的CAR分子和/或BCMA结合结构域(例如CDR、scFv或VH和VL序列)产生另外的示例性BCMA CAR构建体。在一些实施例中，使用来自PCT公开WO 2014/089335(将其内容通过引用以其全文并入本文)的CAR分子和/或BCMA结合结构域(例如CDR、scFv或VH和VL序列)产生另外的示例性BCMA CAR构建体。在一些实施例中，使用来自PCT公开WO 2014/140248(将其内容通过引用以其全文并入本文)的CAR分子和/或BCMA结合结构域(例如CDR、scFv或VH和VL序列)产生另外的示例性BCMACAR构建体。
在一个实施例中，针对Tn抗原的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：US 2014/0178365；US8,440,798；Brooks等人,PNAS[美国国家科学院院刊]107(22):10056-10061(2010)；以及Stone等人,OncoImmunology[肿瘤免疫学]1(6):863-873(2012)。
在一个实施例中，针对PSMA的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：Parker等人,Protein Expr Purif[蛋白表达与纯化]89(2):136-145(2013),US 20110268656(J591 ScFv)；Frigerio等人,European J Cancer[欧洲癌症杂志]49(9):2223-2232(2013)(scFvD2B)；WO 2006125481(mAbs 3/A12，3/E7和3/F11)和单链抗体片段(scFv A5和D7)。
在一个实施例中，针对ROR1的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Hudecek等人,Clin Cancer Res[临床癌症研究]19(12):3153-3164(2013)；WO 2011159847；和US 20130101607。
在一个实施例中，针对FLT3的抗原结合结构域是描述于例如WO 2011076922、US5777084、EP 0754230、US 20090297529中的抗体以及若干种商业目录抗体(R&D公司，电子生物科学公司(ebiosciences)，艾博抗公司(Abcam))的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对TAG72的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：Hombach等人,Gastroenterology[肠胃病学]113(4):1163-1170(1997)；和Abcam ab691。
在一个实施例中，针对FAP的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：描述于例如Ostermann等人,Clinical Cancer Research[临床癌症研究]14:4584-4592(2008)(FAP5)，美国专利公开号2009/0304718中的抗体；西罗珠单抗(参见例如，Hofheinz等人,Oncology Research and Treatment[肿瘤学研究和治疗]26(1),2003)；和Tran等人,J Exp Med[实验医学杂志]210(6):1125-1135(2013)。
在一个实施例中，针对CD38的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：达雷木单抗(daratumumab)(参见例如，Groen等人,Blood[血液]116(21):1261-1262(2010)；MOR202(参见例如，US 8,263,746)；或描述于US 8,362,211中的抗体。
在一个实施例中，针对CD44v6的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：Casucci等人,Blood[血液],122(20):3461-3472(2013)。
在一个实施例中，针对CEA的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：Chmielewski等人,Gastoenterology[肠胃病学]143(4):1095-1107(2012)。
在一个实施例中，针对EPCAM的抗原结合结构域是选自以下的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：MT110、EpCAM-CD3双特异性Ab(参见例如clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00635596)；依决洛单抗；3622W94；ING-1；和阿德木单抗(MT201)。
在一个实施例中，针对PRSS21的抗原结合结构域是描述于以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：美国专利号：8,080,650。
在一个实施例中，针对B7H3的抗原结合结构域是抗体MGA271(宏观基因公司(Macrogenics))的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对KIT的抗原结合结构域是描述于例如US 7915391、US20120288506中的抗体和若干种商业目录抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对IL-13Ra2的抗原结合结构域是描述于例如WO 2008/146911、WO 2004087758中的抗体、若干种商业目录抗体和WO 2004087758中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对CD30的抗原结合结构域是描述于例如US 7090843B1和EP0805871中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对GD3的抗原结合结构域是描述于例如以下的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：US 7253263、US 8,207,308、US 20120276046、EP 1013761、WO2005035577、以及US 6437098。
在一个实施例中，针对CD171的抗原结合结构域是描述于例如Hong等人,JImmunother[免疫疗法杂志]37(2):93-104(2014)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对IL-11Ra的抗原结合结构域是可从艾博抗公司(目录号ab55262)或罗福斯生物制剂公司(Novus Biologicals)(目录号EPR5446)获得的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。在另一个实施例中，针对IL-11Ra的抗原结合结构域是肽，参见例如Huang等人,Cancer Res[癌症研究]72(1):271-281(2012)。
在一个实施例中，针对PSCA的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Morgenroth等人,Prostate[前列腺]67(10):1121-1131(2007)(scFv7F5)；Nejatollahi等人,J of Oncology[肿瘤学杂志]2013(2013)，文章ID 839831(scFvC5-II)；和美国专利公开号20090311181。
在一个实施例中，针对VEGFR2的抗原结合结构域是描述于例如Chinnasamy等人,JClin Invest[临床研究杂志]120(11):3953-3968(2010)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对LewisY的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Kelly等人,Cancer Biother Radiopharm[癌症生物治疗和放射性药物]23(4):411-423(2008)(hu3S193Ab(scFv))；Dolezal等人,Protein Engineering[蛋白质工程]16(1):47-56(2003)(NC10 scFv)。
在一个实施例中，针对CD24的抗原结合结构域是描述于例如Maliar等人,Gastroenterology[肠胃病学]143(5):1375-1384(2012)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对PDGFR-β的抗原结合结构域是抗体Abcam ab32570的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对SSEA-4的抗原结合结构域是抗体MC813(Cell Signaling公司)或其他市售抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对CD20的抗原结合结构域是抗体利妥昔单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗、维妥珠单抗或GA101的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对叶酸受体α的抗原结合结构域是抗体IMGN853或描述于以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：US 20120009181；US 4851332；LK26:US 5952484。
在一个实施例中，针对ERBB2(Her2/neu)的抗原结合结构域是抗体曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对MUC1的抗原结合结构域是抗体SAR566658的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对EGFR的抗原结合结构域是抗体西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗或马妥珠单抗的抗原结合部分(例如，CDR)。在一个实施例中，针对EGFRvIII的抗原结合结构域是或者可以衍生自抗体的抗原结合结构域(例如CDR、scFv或VH和VL)、抗原结合片段或描述于例如PCT公开WO 2014/130657中的CAR分子(在一个实施例中，CAR分子是描述于WO 2014/130657中的CAR分子，将该公开的内容以其整体并入本文)。
在一个实施例中，针对NCAM的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体克隆2-2B：MAB5324(EMD密理博公司(EMD Millipore))
在一个实施例中，针对肝配蛋白B2的抗原结合结构域是描述于例如Abengozar等人,Blood[血液]119(19):4565-4576(2012)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对IGF-I受体的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：US 8344112 B2、EP 2322550A1、WO 2006/138315、或PCT/US2006/022995。
在一个实施例中，针对CAIX的抗原结合结构域是抗体克隆303123(R&D系统公司(R&D Systems))的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对LMP2的抗原结合结构域是描述于例如US 7,410,640或US20050129701中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对gp100的抗原结合结构域是抗体HMB45、NKIβB、或描述于WO2013165940或US 20130295007中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)
在一个实施例中，针对酪氨酸酶的抗原结合结构域是描述于例如以下的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：US 5843674、或US 19950504048。
在一个实施例中，针对EphA2的抗原结合结构域是描述于例如Yu等人,Mol Ther[分子疗法]22(1):102-111(2014)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对GD3的抗原结合结构域是描述于例如以下的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：US 7253263、US 8,207,308、US 20120276046、EP 1013761 A3、20120276046、WO 2005035577、或US 6437098。
在一个实施例中，针对岩藻糖基GM1的抗原结合结构域是描述于例如以下的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：US 20100297138、或WO 2007/067992。
在一个实施例中，针对sLe的抗原结合结构域是抗体G193(对于lewis Y)的抗原结合部分(例如，CDR)，参见Scott AM等人,Cancer Res[癌症研究]60:3254-61(2000)，也如Neeson等人,J Immunol[免疫学杂志]2013年5月190(会议摘要补充)177.10中所述的。
在一个实施例中，针对GM3的抗原结合结构域是抗体CA 2523449(mAb 14F7)的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对HMWMAA的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：Kmiecik等人,Oncoimmunology[肿瘤免疫学]3(1):e27185(2014)(PMID:24575382)(mAb9.2.27)；US 6528481；WO 2010033866；或US 20140004124。
在一个实施例中，针对o-乙酰基-GD2的抗原结合结构域是抗体8B6的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对TEM1/CD248的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Marty等人,Cancer Lett[癌症快报]235(2):298-308(2006)；Zhao等人,J Immunol Methods[免疫法杂志]363(2):221-232(2011)。
在一个实施例中，针对CLDN6的抗原结合结构域是抗体IMAB027(咖尼米德制药公司(Ganymed Pharmaceuticals))的抗原结合部分(例如，CDR)，参见例如clinicaltrial.gov/show/NCT02054351。
在一个实施例中，针对TSHR的抗原结合结构域是描述于例如以下的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：US 8,603,466；US 8,501,415；或US 8,309,693。
在一个实施例中，针对GPRC5D的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体FAB6300A(R&D系统公司)；或LS-A4180(莱仕邦生物科技公司(LifespanBiosciences))。
在一个实施例中，针对CD97的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如CDR)：US 6,846,911；de Groot等人,J Immunol[免疫学杂志]183(6)：4127-4134(2009)中所述的抗体；或来自R&D:MAB3734的抗体。
在一个实施例中，针对ALK的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Mino-Kenudson等人,Clin Cancer Res[临床癌症研究]16(5):1561-1571(2010)。
在一个实施例中，针对聚唾液酸的抗原结合结构域是描述于，例如，Nagae等人,JBiol Chem[生物化学杂志]288(47):33784-33796(2013)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对PLAC1的抗原结合结构域是描述于例如，Ghods等人,Biotechnol Appl Biochem[生物化学生物技术应用]2013doi:10.1002/bab.1177中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对GloboH的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分：抗体VK9；或描述于，例如，Kudryashov V等人,Glycoconj J.[糖缀合物杂志]15(3):243-9(1998)，Lou等人,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]111(7):2482-2487(2014)中的抗体；MBr1:Bremer E-G等人J Biol Chem[生物化学杂志]259:14773–14777(1984)。
在一个实施例中，针对NY-BR-1的抗原结合结构域是描述于，例如，Jager等人,Appl Immunohistochem Mol Morphol[应用免疫组织化学分子形态学]15(1):77-83(2007)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对WT-1的抗原结合结构域是描述于以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：例如，Dao等人,Sci Transl Med[科学转化医学]5(176):176ra33(2013)；或WO 2012/135854。
在一个实施例中，针对MAGE-A1的抗原结合结构域是描述于，例如，Willemsen等人,J Immunol[免疫学杂志]174(12):7853-7858(2005)(TCR样scFv)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对sperm蛋白17的抗原结合结构域是描述于，例如，以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Song等人,Target Oncol[靶标肿瘤学]2013年8月14日(PMID:23943313)；Song等人,Med Oncol[医学肿瘤学]29(4):2923-2931(2012)。
在一个实施例中，针对Tie 2的抗原结合结构域是抗体AB33(细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology))的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对MAD-CT-2的抗原结合结构域是描述于，例如，以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：PMID:2450952；US 7635753。
在一个实施例中，针对Fos相关抗原1的抗原结合结构域是抗体12F9(罗福斯生物制剂公司)的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对MelanA/MART1的抗原结合结构域是描述于例如以下的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：EP 2514766 A2或US7749719。
在一个实施例中，针对肉瘤易位断点的抗原结合结构域是描述于，例如，Luo等人,EMBO Mol.Med.[EMBO分子医学]4(6):453-461(2012)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对TRP-2的抗原结合结构域是描述于，例如，Wang等人,J ExpMed.[实验医学杂志]184(6):2207-16(1996)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对CYP1B1的抗原结合结构域是描述于，例如，Maecker等人,Blood[血液]102(9):3287-3294(2003)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对RAGE-1的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体MAB5328(EMD密理博公司(EMD Millipore))。
在一个实施例中，针对人端粒酶逆转录酶的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体目录号：LS-B95-100(莱仕邦生物科技公司)
在一个实施例中，针对肠羧基酯酶的抗原结合结构域是抗体4F12：目录号：LS-B6190-50(莱仕邦生物科技公司)的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对mut hsp70-2的抗原结合结构域是抗体莱仕邦生物科技公司：单克隆：目录号：LS-C133261-100(莱仕邦生物科技公司)的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对CD79a的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：可从艾博抗公司获得的抗体抗CD79a抗体[HM47/A9](ab3121)；可从细胞信号传导技术公司获得的抗体CD79A抗体号3351；或产生自兔的、可从西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich)获得的抗体HPA017748-抗CD79A抗体。
在一个实施例中，针对CD79b的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体维汀-珀拉妥珠单抗(polatuzumab vedotin)(抗CD79b)(描述于Dornan等人,“Therapeutic potential of an anti-CD79b antibody-drug conjugate,anti-CD79b-vc-MMAE,for the treatment of non-Hodgkin lymphoma[抗CD79b抗体-药物偶联物抗CD79b-vc-MMAE用于治疗非霍奇金淋巴瘤的治疗潜力]”Blood[血液].)2009年9月24日；114(13):2721-9.doi:10.1182/blood-2009-02-205500.Epub 2009年7月24日中)，或双特异性抗体抗CD79b/CD3(描述于“4507Pre-Clinical Characterization of T Cell-DependentBispecific Antibody Anti-CD79b/CD3As a Potential Therapy for B CellMalignancies[4507T细胞依赖性双特异性抗体抗CD79b/CD3的临床前表征作为B细胞恶性肿瘤的潜在疗法]”Abstracts of 56th ASH Annual Meeting and Exposition[第56届ASH年会和博览会摘要],加利福尼亚州旧金山2014年12月6日至9日中)。
在一个实施例中，针对CD72的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体J3-109(描述于Myers和Uckun,“An anti-CD72 immunotoxin against therapy-refractory B-lineage acute lymphoblastic leukemia[抗CD72免疫毒素抗治疗难治性B谱系急性淋巴母细胞白血病].”Leuk Lymphoma[白血病淋巴瘤].1995年6月；18(1-2):119-22中)或抗CD72(10D6.8.1，mIgG1)(描述于Polson等人,“Antibody-Drug Conjugates forthe Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma:Target and Linker-Drug Selection[用于治疗非霍奇金淋巴瘤的抗体-药物缀合物：靶标和接头-药物选择]”Cancer Res[癌症研究]2009年3月15日69；2358。
在一个实施例中，针对LAIR1的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：可从ProSpec公司获得的抗体ANT-301LAIR1抗体；或可从百进生物科技公司获得的抗人CD305(LAIR1)抗体。
在一个实施例中，针对FCAR的抗原结合结构域是可从Sino Biological公司获得的抗体CD89/FCAR抗体(目录号10414-H08H)的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对LILRA2的抗原结合结构域是可从亚诺法公司(Abnova)获得的抗体LILRA2单克隆抗体(M17)(克隆3C7)，或可从莱仕邦生物科技公司获得的小鼠抗LILRA2抗体(单克隆(2D7))的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对CD300LF的抗原结合结构域是可从百进生物科技公司获得的抗体小鼠抗CMRF35样分子1抗体(单克隆[UP-D2])；或可从R&D系统公司获得的大鼠抗CMRF35样分子1抗体(单克隆[234903])的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对CLEC12A的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体双特异性T细胞衔接器(BiTE)scFv-抗体和ADC(描述于Noordhuis等人,“Targeting of CLEC12A In Acute Myeloid Leukemia by Antibody-Drug-Conjugatesand Bispecific CLL-1xCD3 BiTE Antibody[通过抗体-药物-缀合物和双特异性CLL-1xCD3 BiTE抗体靶向急性髓系白血病中的CLEC12A]”53rd ASH Annual Meeting andExposition[第53届ASH年会和博览会],2011年12月10日至13日中)，以及MCLA-117(梅鲁斯公司(Merus))。
在一个实施例中，针对BST2(也称为CD317)的抗原结合结构域是可从抗体在线(Antibodies-Online)获得的抗体小鼠抗CD317抗体(单克隆[3H4])或可从R&D系统公司获得的小鼠抗CD317抗体(单克隆[696739])的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对EMR2(也称为CD312)的抗原结合结构域是可从莱仕邦生物科技公司获得的抗体小鼠抗CD312抗体(单克隆[LS-B8033])或可从R&D系统公司获得的小鼠抗CD312抗体(单克隆[494025])的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对LY75的抗原结合结构域是可从EMD密理博公司获得的抗体小鼠抗淋巴细胞抗原75抗体(单克隆[HD30])或可从生命科技公司(Life Technologies)获得的小鼠抗淋巴细胞抗原75抗体(单克隆[A15797])的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对GPC3的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如CDR)：抗体hGC33(描述于Nakano K,Ishiguro T,Konishi H等人.Generation of ahumanized anti-glypican 3antibody by CDR grafting and stability optimization.[通过CDR移植和稳定性优化产生人源化抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体]Anticancer Drugs.[抗癌药物]2010年11月；21(10):907–916)，或MDX-1414、HN3或YP7(这三种抗体都描述于Feng等人,“Glypican-3antibodies:a new therapeutic target for liver cancer.[磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体：肝癌的新治疗靶标]”FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]2014年1月21日；588(2):377-82)。
在一个实施例中，针对FCRL5的抗原结合结构域是描述于以下中的抗FcRL5抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Elkins等人,“FcRL5 as a target of antibody-drugconjugates for the treatment of multiple myeloma[FcRL5作为抗体-药物缀合物的靶标用于治疗多发性骨髓瘤]”Mol Cancer Ther.[分子癌症治疗学]2012年10月；11(10):2222-32。
在一个实施例中，针对IGLL1的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如CDR)：可从莱仕邦生物科技公司获得的抗体小鼠抗免疫球蛋白λ样多肽1(单克隆[AT1G4])，可从百进生物科技公司获得的小鼠抗免疫球蛋白λ样多肽1抗体(单克隆[HSL11])。
在一个实施例中，所述抗原结合结构域包含来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如，全部三个)重链CDR(HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3)，和/或来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如，全部三个)轻链CDR(LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在一个实施例中，抗原结合结构域包含上文列出抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在另一方面，抗原结合结构域包含人源化抗体或抗体片段。在一些方面，非人抗体是人源化的，其中抗体的特定序列或区域被修饰以增加与在人中天然产生的抗体或其片段的相似度。在一方面，抗原结合结构域是人源化的。
可以使用本领域已知的多种技术产生人源化抗体，包括但不限于CDR接枝(参见例如，欧洲专利号EP 239,400；国际公布号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101、和5,585,089，这些文献各自通过引用以其全文并入本文)、贴面或表面重建(参见例如，欧洲专利号EP592,106和EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology[分子免疫学],28(4/5):489-498；Studnicka等人,1994,Protein Engineering[蛋白质工程],7(6):805-814；以及Roguska等人,1994,PNAS[美国国家科学院院刊],91:969-973，将该文献每一个通过引用以其整体并入本文)、链改组(参见例如，美国专利号5,565,332，将该文献通过引用以其整体并入本文)、和公开于例如以下中的技术：美国专利申请公开号US 2005/0042664，美国专利申请公开号US 2005/0048617，美国专利号6,407,213，美国专利号5,766,886，国际公开号WO 9317105，Tan等人,J.Immunol.[免疫学杂志],169:1119-25(2002)，Caldas等人,Protein Eng.[蛋白质工程],13(5):353-60(2000)，Morea等人,Methods[方法],20(3):267-79(2000)，Baca等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],272(16):10678-84(1997)，Roguska等人,Protein Eng.[蛋白质工程],9(10):895-904(1996)，Couto等人,Cancer Res.[癌症研究],55(23增刊):5973s-5977s(1995)，Couto等人,Cancer Res.[癌症研究],55(8):1717-22(1995)，Sandhu J S,Gene[基因],150(2):409-10(1994)，以及Pedersen等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],235(3):959-73(1994)，将这些文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。通常，框架区中的框架残基将被来自CDR供者抗体的相应残基取代，以改变例如改善抗原结合。这些框架取代是通过本领域熟知的方法来鉴定，例如，通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合和序列比较而言重要的框架残基，以鉴定特定位置处的异常框架残基。(参见例如，Queen等人,美国专利号5,585,089；以及Riechmann等人,1988,Nature[自然],332:323，将这些文献通过引用以其整体并入本文。)
人源化抗体或抗体片段具有保留于其中的来自非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，这些残基典型地取自“输入”可变结构域。如本文提供的，人源化抗体或抗体片段包含来自非人免疫球蛋白分子的一个或多个CDR和框架区，其中构成框架的氨基酸残基完全或大部分衍生自人种系。用于将抗体或抗体片段人源化的多种技术在本领域中是熟知的，并且基本上可以按照Winter和同事的方法进行(Jones等人,Nature[自然],321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature[自然],332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science[科学],239:1534-1536(1988))，所述方法是通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列，即CDR移植(EP 239,400；PCT公开号WO 91/09967；以及美国专利号4,816,567、6,331,415、5,225,539、5,530,101、5,585,089、6,548,640，将这些文献的内容通过引用以其整体并入本文)。在此类人源化抗体和抗体片段中，实质上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些框架(FR)残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。抗体和抗体片段的人源化也可以通过饰面或表面重修来实现(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology[分子免疫学],28(4/5):489-498；Studnicka等人,Protein Engineering[蛋白质工程],7(6):805-814(1994)；和Roguska等人,PNAS[美国国家科学院院刊],91:969-973(1994))或链改组(美国专利号5,565,332)，将这些文献的内容通过引用以其整体并入本文。
用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链二者)的选择是降低抗原性。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。然后接受与啮齿动物的序列最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等人,J.Immunol.[免疫学杂志],151:2296(1993)；Chothia等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],196:901(1987)，将这些文献的内容通过引用以其整体并入本文)。另一种方法采用衍生自具有特定亚组轻链或重链的全部人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(参见例如Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)；Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],89:4285(1992)；Presta等人,J.Immunol.[免疫学杂志],151:2623(1993)，将这些文献的内容通过引用以其整体并入本文)。在一些实施例中，重链可变区的框架区(例如全部四个框架区)衍生自VH4_4-59种系序列。在一个实施例中，框架区可以包括一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如来自相应鼠序列处的氨基酸的取代。在一个实施例中，轻链可变区的框架区(例如全部四个框架区)衍生自VK3_1.25种系序列。在一个实施例中，框架区可以包括一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如来自相应鼠序列处的氨基酸的取代。
在一些方面，包含抗体片段的本披露CAR组合物的部分是人源化的，但保留了对靶抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。根据本披露的一个方面，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和多种概念性人源化产物的方法制备人源化抗体和抗体片段。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且是本领域技术人员所熟悉的。计算机程序可用于说明和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中的可能作用，例如，分析影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体和输入序列中选择和组合FR残基，使得实现所希望的抗体或抗体片段特征，如对靶抗原的增加的亲和力。通常，CDR残基直接且最实质地参与影响抗原结合。
人源化抗体或抗体片段可保留与原始抗体相似的抗原特异性，例如，在本披露中结合如本文描述的癌症相关抗原的能力。在一些实施例中，人源化抗体或抗体片段可具有改善的与如本文描述的人癌症相关抗原结合的亲和力和/或特异性。
在一个方面，本披露的抗原结合结构域的特征在于抗体或抗体片段的特定功能特征或特性。例如，在一方面，本披露的CAR组合物的包含抗原结合结构域的部分特异性地结合如本文所述的肿瘤抗原。
在一个方面，如本文所述的抗癌症相关抗原结合结构域是片段(例如单链可变片段(scFv))。在一个方面，如本文所述的抗癌症相关抗原结合结构域是Fv、Fab、(Fab')2或双功能(例如，双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]17,105(1987))。在一个方面，本披露的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合如本文描述的癌症相关抗原蛋白。
在一些情况下，可以根据本领域已知的方法制备scFv(参见例如，Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来产生ScFv分子。scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区折叠和相互作用的方式。事实上，如果采用短多肽接头(例如，5-10个氨基酸)，则可以防止链内折叠。还需要链间折叠以将两个可变区组合在一起以形成功能性表位结合位点。对于接头取向和大小的实例，参见例如，Hollinger等人1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]90:6444-6448，美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794，以及PCT公开号WO 2006/020258和WO2007/024715(将其通过引用并入本文)。
scFv可以在其VL与VH区之间包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施例中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施例中，接头序列包含甘氨酸和丝氨酸重复序列组，如(Gly4Ser)n，其中n为等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:3000)。在一个实施例中，接头可以是(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:3001)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:3002)。接头长度的变化可以保留或增强活性，从而在活性研究中产生优异的功效。
在另一方面，抗原结合结构域是T细胞受体(“TCR”)或其片段，例如，单链TCR(scTCR)。用于制备此类TCR的方法是本领域中已知的。参见例如Willemsen RA等人,GeneTherapy[基因疗法]7:1369–1377(2000)；Zhang T等人,Cancer Gene Ther[癌症基因疗法]11:487–496(2004)；Aggen等人,Gene Ther.[基因疗法]19(4):365-74(2012)(将参考文献以其全文并入本文)。例如，scTCR可以工程化为含有来自通过接头(例如柔性肽)连接的T细胞克隆的Vα和Vβ基因。此途径对于本身在细胞内的癌症相关靶标非常有用，然而，这种抗原(肽)的片段通过MHC呈递在癌细胞的表面上。
在一个实施例中，针对EGFRvIII的抗原结合结构域是描述于例如PCT公开WO2014/130657或US 2014/0322275A1中的CAR分子、抗体或其抗原结合片段的抗原结合部分(例如CDR)。在一个实施例中，CAR分子包含EGFRvIII CAR，或根据WO 2014/130657(通过引用并入本文)的表2或SEQ ID NO:11的抗原结合结构域，或与其基本上相同(例如，与其至少85％、90％、95％或更多相同)的序列。在WO 2014/130657中详细说明了编码EGFRvIII CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列。
在一个实施例中，针对间皮素的抗原结合结构域是描述于例如PCT公开WO 2015/090230中的抗体、抗原结合片段或CAR分子的抗原结合部分(例如CDR)。在一个实施例中，针对间皮素的抗原结合结构域是描述于例如PCT公开WO 1997/025068、WO 1999/028471、WO2005/014652、WO 2006/099141、WO 2009/045957、WO 2009/068204、WO 2013/142034、WO2013/040557、或WO 2013/063419中的抗体、抗原结合片段、或CAR分子的抗原结合部分(例如CDR)。
在实施例中，CAR分子包含本文所述的间皮素CAR，例如描述于通过引用并入本文的WO 2015/090230中的间皮素CAR。在一些实施例中，间皮素CAR包含氨基酸，或具有WO2015/090230(通过引用并入本文)中所示的核苷酸序列，或与前述序列中的任一项基本上相同(例如，与前述间皮素CAR序列中的任一项至少85％、90％、95％或更多相同)的序列。在一个实施例中，CAR分子包含间皮素CAR，或根据WO 2015/090230(通过引用并入本文)的表2-3的抗原结合结构域，或与其基本上相同(例如，与其至少85％、90％、95％或更多相同)的序列。在WO 2015/090230中详细说明了编码间皮素CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列。
CAR跨膜结构域
关于跨膜结构域，在各种实施例中，CAR分子可以设计为包含附接至CAR分子的细胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如，与跨膜来源的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如，细胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)和/或与跨膜蛋白来源的蛋白质的细胞内区域相关的一个或多个另外的氨基酸(例如，细胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10多至15个氨基酸)。在一些实施例中，跨膜结构域是与CAR分子的其他结构域之一相关的跨膜结构域。在一些情况下，可以选择或通过氨基酸置换修饰跨膜结构域，以避免此类域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如，以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。在一些实施例中，跨膜结构域能够与表达CAR的细胞的细胞表面上的另一种CAR分子同源二聚化。在一些实施例中，跨膜结构域的氨基酸序列可以被修饰或取代，以便最小化与存在于相同CART中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用。
跨膜结构域可以源自天然来源或来自重组来源。在来源是天然的情况下，结构域可以源自任何膜结合或跨膜蛋白。在一些实施例中，每当CAR分子结合靶标时，跨膜结构域能够将信号传导至一个或多个细胞内结构域。在本披露中特别使用的跨膜结构域可以至少包括例如T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的一个或多个跨膜区。在一些实施例中，跨膜结构域可至少包括例如，KIR2DS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触蛋白(Tactile))、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C的一个或多个跨膜区。
在一些情况下，跨膜结构域可以通过铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)附接到CAR分子的细胞外区域(例如，CAR分子的抗原结合结构域)。例如，在一些实施例中，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链(例如IgG4铰链)或CD8a铰链。在一些实施例中，铰链或间隔区包含SEQ ID NO:1018的氨基酸序列(例如由其组成)。在一些实施例中，跨膜结构域包含SEQ IDNO:1026的跨膜结构域(例如，由其组成)。
在一些实施例中，铰链或间隔子包含IgG4铰链。例如，在一些实施例中，铰链或间隔区包含SEQ ID NO:1020的氨基酸序列的铰链。在一些实施例中，铰链或间隔子包含由SEQID NO:1021的核苷酸序列编码的铰链。
在一些实施例中，铰链或间隔子包含IgD铰链。例如，在一些实施例中，铰链或间隔区包含SEQ ID NO:1022的氨基酸序列的铰链。在一些实施例中，铰链或间隔子包含由SEQID NO:1023的核苷酸序列编码的铰链。
在一些实施例中，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下其将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施例中，可以在重组跨膜结构域的每个末端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
任选地，长度在2与10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以在CAR分子的跨膜结构域与胞质区域之间形成键联。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别适合的接头。例如，在一些实施例中，接头包含SEQ ID NO:1024的氨基酸序列。在一些实施例中，接头由SEQ ID NO:1025的核苷酸序列编码。
在一些实施例中，铰链或间隔子包含KIR2DS2铰链。
胞质结构域
CAR分子的细胞质结构域或区包含细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域通常负责活化已引入CAR分子的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。
用于在本文所述CAR分子中使用的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的细胞质序列(它们协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导)以及这些序列的任何衍生物或变体和任何具有相同功能能力的重组序列。
已知仅通过TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且还需要次级和/或共刺激信号。因此，可认为T细胞活化是由两种不同类别的胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的那些(初级细胞内信号传导结构域)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质结构域，例如共刺激结构域)。
初级信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调控TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级细胞内信号传导结构域可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。
在本披露中特别有用的含有ITAM的初级细胞内信号传导结构域的实例包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI、DAP10、DAP12、和CD66d。在一些实施例中，本披露的CAR分子包含细胞内信号传导结构域，例如CD3-ζ(例如本文所述的CD3-ζ序列)的初级信号传导结构域。
在一些实施例中，初级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如与天然ITAM结构域相比具有改变的(例如，增加或减少的)活性的突变ITAM结构域。在一些实施例中，初级信号传导结构域包括含有修饰的ITAM的初级细胞内信号传导结构域，例如含有优化的和/或截短的ITAM的初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
共刺激信号传导结构域
CAR分子的细胞内信号传导结构域可以包含CD3-ζ信号传导结构域本身，或者它可以与在本披露的CAR分子的背景中使用的任何其他所希望的细胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的细胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指CAR分子的包含共刺激分子的细胞内结构域的部分。在一些实施例中，所述细胞内结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一些实施例中，所述细胞内结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和ICOS的信号传导结构域。
共刺激分子可以是除了抗原受体或其配体以外的细胞表面分子，包含淋巴细胞对抗原的有效应答所必需的。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性地结合CD83的配体等。例如，已证明CD27共刺激可增强体外人CART细胞的扩增、效应子功能、和存活，并增加体内人T细胞持久性和抗肿瘤活性(Song等人Blood.[血液]2012；119(3):696-706)。此类共刺激分子的其他实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触蛋白(Tactile))、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、NKG2D、NKG2C以及PAG/Cbp。
所述CAR分子的胞质部分内的细胞内信号传导序列可以按随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，例如，长度在2与10个氨基酸之间(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)可以形成细胞内信号传导序列之间的键联。在一些实施例中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作适合的接头。在一些实施例中，单个氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸)可以用作适合的接头。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域被设计成包含两个或更多个(例如，2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，两个或更多个(例如，2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域通过接头分子(例如，本文描述的接头分子)分开。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施例中，接头是丙氨酸残基。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一些实施例中，4-1BB的信号传导结构域是SEQ ID NO:1029的信号传导结构域。在一些实施例中，CD3-ζ的信号传导结构域是SEQ IDNO:1034的信号传导结构域。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在一些实施例中，CD27的信号传导结构域包含SEQ ID NO:1032的氨基酸序列。在一些实施例中，CD27的信号传导结构域由SEQ ID NO:1033的核酸序列编码。
在一些实施例中，本文描述的CAR细胞可以进一步包含第二CAR分子，例如包括不同的抗原结合结构域(例如，针对相同的靶标或不同的靶标(例如，除本文描述的癌症相关抗原或本文描述的不同癌症相关抗原的靶标，例如，CD19、CD33、CLL-1、CD34、FLT3，或叶酸受体β))的第二CAR分子。在一些实施例中，第二CAR分子包含针对在与癌症相关抗原相同的癌细胞类型上表达的靶标的抗原结合结构域。在一些实施例中，表达CAR的细胞包含第一CAR分子和第二CAR分子，该第一CAR分子靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，该第二CAR分子靶向第二不同的抗原并且包含具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。虽然不希望受理论束缚，但包含将共刺激信号传导结构域(例如，4-1BB、CD28、ICOS、CD27或OX-40)置于第一CAR分子上，并将初级信号传导结构域(例如，CD3ζ)置于第二CAR分子上可以将CAR活性限制于表达两种靶标的细胞。在一些实施例中，表达CAR的细胞包含第一癌症相关抗原CAR，第一癌症相关抗原CAR包含结合本文描述的靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域；和第二CAR分子，该第二CAR分子靶向不同靶抗原(例如，在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在一些实施例中，表达CAR的细胞包含第一CAR分子，第一CAR分子包含结合本文描述的靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域；和第二CAR分子，第二CAR分子靶向除第一靶抗原以外的抗原(例如，在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含针对抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
在一些实施例中，本披露的特征是CAR细胞(例如，CART细胞)的群体。在一些实施例中，CAR细胞群体包含表达不同CAR分子的细胞的混合物。例如，在一些实施例中，CART细胞群体可包括表达CAR分子(该CAR分子具有本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域)的第一细胞和表达具有不同抗原结合结构域(例如本文所述的不同癌症相关抗原的抗原结合结构域(例如不同于由第一细胞表达的CAR分子的抗原结合结构域所结合的癌症相关抗原的本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域))的CAR分子的第二细胞。作为另一个实例，CAR细胞群体可包括表达CAR分子(所述CAR包括本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域)的第一细胞和表达CAR分子(所述CAR分子包括不同于如本文所述的癌症相关抗原的靶标的抗原结合结构域)的第二细胞。在一些实施例中，CAR细胞群体包括，例如表达包含初级细胞内信号传导结构域的CAR分子的第一细胞，和表达包含次级信号传导结构域的CAR分子的第二细胞。
在一些实施例中，本披露的特征是细胞群体，其中所述群体中的至少一种细胞表达具有本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域的CAR分子；和表达另一种药剂(例如，增强表达CAR的细胞的活性的药剂)的第二细胞。例如，在一些实施例中，药剂可以是对抑制性分子进行抑制的药剂。在一些实施例中，抑制性分子(例如，PD-1)可降低表达CAR的细胞产生免疫效应子应答的能力。抑制性分子的实例包括PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3，和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGF(例如，TGFβ)。在一些实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂包含第一多肽(例如，抑制性分子)，该第一多肽与向细胞提供正信号的第二多肽，例如本文所述的细胞内信号传导结构域缔合。在一些实施例中，所述药剂包含例如，抑制性分子(如PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFβ、或这些中的任一者的片段)的第一多肽，和第二多肽，所述第二多肽包含本文描述的细胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB、CD27、OX40或CD28，例如，如本文描述)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一些实施例中，所述药剂包含PD-1的第一多肽或其片段和本文所述的细胞内信号传导结构域(例如本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。
CD19 CAR和CD19结合序列
在一些实施例中，本文所述的CAR或表达CAR的细胞是表达CD19CAR的细胞(例如，表达与人CD19结合的CAR分子的细胞)。
在一些实施例中，CD19 CAR的抗原结合结构域具有与描述于Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)中的FMC63 scFv片段相同或相似的结合特异性。在一些实施例中，CD19CAR的抗原结合结构域包括在Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)中描述的scFv片段。
在一些实施例中，所述CD19 CAR包含根据WO 2014/153270(通过引用并入本文)的表3的抗原结合结构域(例如，人源化抗原结合结构域)。WO2014/153270还描述了测定多种CAR构建体的结合和功效的方法。
在一些实施例中，亲本鼠scFv序列是在PCT公开WO2012/079000(通过引用并入本文)中提供的CAR19构建体。在一些实施例中，抗CD19结合结构域是WO 2012/079000中所述的scFv。
在一些实施例中，CAR分子包含在PCT公开WO 2012/079000中作为SEQ ID NO:12提供的融合多肽序列，其提供特异性结合至人CD19的鼠来源的scFv片段。
在一些实施例中，CD19 CAR包含在PCT公开WO2012/079000中作为SEQ ID NO:12提供的氨基酸序列。在一些实施例中，氨基酸序列是
(MALPVTALLLPLALLLHAARP)diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:1053)，或与其基本上同源的序列。信号肽的任选序列以大写字母和大括号示出。
在一些实施例中，氨基酸序列是：
diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:1054)、或与其基本上同源的序列。
在一些实施例中，CAR分子是人源化的CD19 CAR，其包含以下的氨基酸序列：
MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:3202)
在一些实施例中，CAR分子是人源化的CD19 CAR，其包含以下的氨基酸序列：
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:3203)
在一些实施例中，CD19 CAR具有USAN名称TISAGENLECLEUCEL-T。在实施例中，CTL019通过T细胞的基因修饰来制备，CTL019通过用在EF-1α启动子控制下含有CTL019转基因的自身失活型复制缺陷型慢病毒(LV)载体的转导进行稳定插入来介导。CTL019可以是转基因阳性和阴性T细胞的混合物，其基于转基因阳性T细胞百分比递送至受试者。
在一些实施例中，与CD19特异性结合的CAR T细胞具有INN名称Axicabtageneciloleucel。在一个实施例中，与CD19特异性结合的CAR T细胞具有USAN名称brexucabtagene autoleucel。在一些实施例中，Axicabtagene ciloleucel还称为
Figure BDA0003991130860001121
Axi-cel或KTE-C19。在一些实施例中，brexucabtagene autoleucel还称为KTE-X19或
Figure BDA0003991130860001122
Figure BDA0003991130860001123
在一个实施例中，与CD19特异性结合的CAR T细胞具有INN名称Lisocabtagenemaraleucel。在一些实施例中，Lisocabtagene maraleucel还称为JCAR017。
在其他实施例中，CD19 CAR包含根据WO 2014/153270(通过引用并入本文)的表3的抗原结合结构域(例如，人源化抗原结合结构域)。
对于临床环境，鼠CD19抗体的人源化可以是所希望的，其中小鼠特异性残基在接受CART19治疗(即，用CAR19构建体转导的T细胞治疗)的患者中可以诱导人-抗-小鼠抗原(HAMA)应答。人源化CD19CAR序列的产生、表征和功效描述于国际申请WO 2014/153270中，将其通过引用以其全文并入本文，包括实例1-5(第115-159页)。
在一些实施例中，CD19 CAR构建体描述于PCT公开WO 2012/079000中(通过引用并入本文)，并且鼠CD19 CAR和scFv构建体的氨基酸序列在下表3中示出，或者是与前述序列中的任一种基本上相同的序列(例如，与本文所述的任何序列是至少85％、90％、95％或更高地相同)。
表3.示例性CD19 CAR构建体
Figure BDA0003991130860001131
Figure BDA0003991130860001141
Figure BDA0003991130860001151
Figure BDA0003991130860001161
Figure BDA0003991130860001171
Figure BDA0003991130860001181
Figure BDA0003991130860001191
Figure BDA0003991130860001201
Figure BDA0003991130860001211
Figure BDA0003991130860001221
Figure BDA0003991130860001231
Figure BDA0003991130860001241
Figure BDA0003991130860001251
Figure BDA0003991130860001261
Figure BDA0003991130860001271
Figure BDA0003991130860001281
含有人源化抗CD19 scFv结构域的CD19 CAR构建体描述于PCT公开WO 2014/153270(通过引用并入本文)中。
抗CD19 scFv结构域的鼠和人源化CDR序列的序列对于重链可变结构域示出在表4中并且对于轻链可变结构域示出在表5中。SEQ ID NO是指表3中发现的那些。
表4.CD19抗体的示例性重链可变结构域CDR(卡巴特)SEQ ID NO
候选物 HCDR1 HCDR2 HCDR3
鼠_CART19 SEQ ID NO:1094 SEQ ID NO:1095 SEQ ID NO:1096
人源化_CART19a SEQ ID NO:1100 SEQ ID NO:1101 SEQ ID NO:1102
人源化_CART19b SEQ ID NO:1106 SEQ ID NO:1107 SEQ ID NO:1108
人源化_CART19c SEQ ID NO:1112 SEQ ID NO:1113 SEQ ID NO:1114
表5.CD19抗体的示例性轻链可变结构域CDR(卡巴特)SEQ ID NO
候选物 LCDR1 LCDR2 LCDR3
鼠_CART19 SEQ ID NO:1097 SEQ ID NO:1098 SEQ ID NO:1099
人源化_CART19a SEQ ID NO:1103 SEQ ID NO:1104 SEQ ID NO:1105
人源化_CART19b SEQ ID NO:1109 SEQ ID NO:1110 SEQ ID NO:1111
人源化_CART19c SEQ ID NO:1115 SEQ ID NO:1116 SEQ ID NO:1117
可以根据本披露使用本领域任何已知的CD19 CAR，例如任何已知的CD19 CAR的CD19抗原结合结构域。例如，LG-740；CD19 CAR描述于以下中：美国专利号8,399,645；美国专利号7,446,190；Xu等人,Leuk Lymphoma.[白血病淋巴瘤]2013 54(2):255-260(2012)；Cruz等人,Blood[血液]122(17):2965-2973(2013)；Brentjens等人,Blood[血液]118(18):4817-4828(2011)；Kochenderfer等人,Blood[血液]116(20):4099-102(2010)；Kochenderfer等人,Blood[血液]122(25):4129-39(2013)；以及16th Annu Meet Am SocGen Cell Ther(ASGCT)[美国基因与细胞治疗学会(ASGCT)第16届年度会议](5月15-18日,盐湖城)2013,文摘10。
示例性CD19 CAR包括本文(例如本文所述的一个或多个表中)所述的CD19 CAR、或描述于以下中的抗CD19 CAR：Xu等人Blood[血液]123.24(2014):3750-9；Kochenderfer等人Blood[血液],122.25(2013):4129-39；Cruz等人Blood[血液]122.17(2013):2965-73、NCT00586391、NCT01087294、NCT02456350、NCT00840853、NCT02659943、NCT02650999、NCT02640209、NCT01747486、NCT02546739、NCT02656147、NCT02772198、NCT00709033、NCT02081937、NCT00924326、NCT02735083、NCT02794246、NCT02746952、NCT01593696、NCT02134262、NCT01853631、NCT02443831、NCT02277522、NCT02348216、NCT02614066、NCT02030834、NCT02624258、NCT02625480、NCT02030847、NCT02644655、NCT02349698、NCT02813837、NCT02050347、NCT01683279、NCT02529813、NCT02537977、NCT02799550、NCT02672501、NCT02819583、NCT02028455、NCT01840566、NCT01318317、NCT01864889、NCT02706405、NCT01475058、NCT01430390、NCT02146924、NCT02051257、NCT02431988、NCT01815749、NCT02153580、NCT01865617、NCT02208362、NCT02685670、NCT02535364、NCT02631044、NCT02728882、NCT02735291、NCT01860937、NCT02822326、NCT02737085、NCT02465983、NCT02132624、NCT02782351、NCT01493453、NCT02652910、NCT02247609、NCT01029366、NCT01626495、NCT02721407、NCT01044069、NCT00422383、NCT01680991、NCT02794961或NCT02456207，这些文献各自通过引用以其全文并入本文。
BCMA CAR和BCMA结合序列
在一些实施例中，本文所述的CAR或表达CAR的细胞是表达BCMA CAR的细胞(例如，表达与人BCMA结合的CAR分子的细胞)。示例性BCMA CAR分子可包括WO 2016/014565的表1或16中披露的序列，其通过引用并入本文。BCMA CAR构建体可包括任选的前导序列；任选的铰链结构域，例如CD8铰链结构域；跨膜结构域，例如CD8跨膜结构域；细胞内结构域，例如4-1BB细胞内结构域；和功能性信号传导结构域，例如CD3-ζ结构域。在一些实施例中，这些结构域邻接并在同一阅读框中以形成单个融合蛋白。在其他实施例中，结构域在分开的多肽中，例如，在如本文描述的RCAR分子中。
表6-8中披露了示例性BCMA CAR分子的序列或其片段。在一些实施例中，所述全长BCMA CAR分子包含披露于表U、V、W和X中的BCMA-1、BCMA-2、BCMA-3、BCMA-4、BCMA-5、BCMA-6、BCMA-7、BCMA-8、BCMA-9、BCMA-10、BCMA-11、BCMA-12、BCMA-13、BCMA-14、BCMA-15、149362、149363、149364、149365、149366、149367、149368、149369、BCMA_EBB-C1978-A4、BCMA_EBB-C1978-G1、BCMA_EBB-C1979-C1、BCMA_EBB-C1978-C7、BCMA_EBB-C1978-D10、BCMA_EBB-C1979-C12、BCMA_EBB-C1980-G4、BCMA_EBB-C1980-D2、BCMA_EBB-C1978-A10、BCMA_EBB-C1978-D4、BCMA_EBB-C1980-A2、BCMA_EBB-C1981-C3、BCMA_EBB-C1978-G4、A7D12.2、C11D5.3、C12A3.2、或C13F12.1的一种或多种CDR、VH、VL、scFv、或全长序列、或基本上(例如，95％-99％)与其相同的序列。
可以用于抗BCMA CAR构建体的另外的示例性BCMA靶向序列披露于WO 2017/021450、WO 2017/011804、WO 2017/025038、WO 2016/090327、WO 2016/130598、WO 2016/210293、WO 2016/090320、WO 2016/014789、WO 2016/094304、WO 2016/154055、WO 2015/166073、WO 2015/188119、WO 2015/158671、US 9,243,058、US 8,920,776、US 9,273,141、US 7,083,785、US 9,034,324、US 2007/0049735、US 2015/0284467、US 2015/0051266、US2015/0344844、US 2016/0131655、US 2016/0297884、US 2016/0297885、US 2017/0051308、US 2017/0051252、US 2017/0051252、WO 2016/020332、WO 2016/087531、WO 2016/079177、WO 2015/172800、WO 2017/008169、US 9,340,621、US 2013/0273055、US 2016/0176973、US2015/0368351、US 2017/0051068、US 2016/0368988、和US 2015/0232557中，将其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，使用来自PCT公开WO 2012/0163805(将其内容通过引用以其全文并入本文)的VH和VL序列产生另外的示例性BCMA CAR构建体。
表6.示例性抗BCMA scFv结构域和BCMA CAR分子的氨基酸和核酸序列。还提供了每个scFv的氨基酸序列可变重链和可变轻链序列。
Figure BDA0003991130860001311
Figure BDA0003991130860001321
Figure BDA0003991130860001331
Figure BDA0003991130860001341
Figure BDA0003991130860001351
Figure BDA0003991130860001361
Figure BDA0003991130860001371
Figure BDA0003991130860001381
Figure BDA0003991130860001391
Figure BDA0003991130860001401
Figure BDA0003991130860001411
Figure BDA0003991130860001421
Figure BDA0003991130860001431
Figure BDA0003991130860001441
Figure BDA0003991130860001451
Figure BDA0003991130860001461
Figure BDA0003991130860001471
Figure BDA0003991130860001481
Figure BDA0003991130860001491
Figure BDA0003991130860001501
Figure BDA0003991130860001511
Figure BDA0003991130860001521
Figure BDA0003991130860001531
Figure BDA0003991130860001541
Figure BDA0003991130860001551
Figure BDA0003991130860001561
Figure BDA0003991130860001571
Figure BDA0003991130860001581
Figure BDA0003991130860001591
Figure BDA0003991130860001601
Figure BDA0003991130860001611
Figure BDA0003991130860001621
Figure BDA0003991130860001631
Figure BDA0003991130860001641
Figure BDA0003991130860001651
Figure BDA0003991130860001661
Figure BDA0003991130860001671
Figure BDA0003991130860001681
Figure BDA0003991130860001691
Figure BDA0003991130860001701
Figure BDA0003991130860001711
Figure BDA0003991130860001721
Figure BDA0003991130860001731
Figure BDA0003991130860001741
Figure BDA0003991130860001751
Figure BDA0003991130860001761
Figure BDA0003991130860001771
Figure BDA0003991130860001781
Figure BDA0003991130860001791
表7.根据Kabat编号方案(Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质的序列],”第5版Public HealthService[公共卫生署],National Institutes of Health[国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州)的示例性重链可变结构域CDR
Figure BDA0003991130860001792
Figure BDA0003991130860001801
Figure BDA0003991130860001811
表8.根据Kabat编号方案(Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质的序列],”第5版Public HealthService[公共卫生署],National Institutes of Health[国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州)的示例性轻链可变结构域CDR
Figure BDA0003991130860001812
Figure BDA0003991130860001821
CD20 CAR和CD20结合序列
在一些实施例中，本文所述的CAR或表达CAR的细胞是表达CD20CAR的细胞(例如，表达与人CD20结合的CAR分子的细胞)。在一些实施例中，所述表达CD20 CAR的细胞包含根据WO 2016/164731和PCT/US 2017/055627(通过引用并入本文)的抗原结合结构域。示例性CD20结合序列或CD20 CAR序列披露于例如，PCT/US 2017/055627的表1-5中。在一些实施例中，所述CD20结合序列或CD20 CAR包含在PCT/US 2017/055627或WO 2016/164731中披露的CD20 CAR的CDR、可变区、scFv或全长序列。
在一些实施例中，所述CAR分子包含特异性结合CD20的抗原结合结构域(CD20CAR)。在一些实施例中，抗原结合结构域靶向人CD20。在一些实施例中，抗原结合结构域包括如本文所述的单链Fv序列。人CD20 CAR的序列在下文提供。
表9：示例性CD20 CAR构建体
Figure BDA0003991130860001831
Figure BDA0003991130860001841
Figure BDA0003991130860001851
Figure BDA0003991130860001861
Figure BDA0003991130860001871
Figure BDA0003991130860001881
Figure BDA0003991130860001891
Figure BDA0003991130860001901
Figure BDA0003991130860001911
Figure BDA0003991130860001921
Figure BDA0003991130860001931
Figure BDA0003991130860001941
Figure BDA0003991130860001951
Figure BDA0003991130860001961
Figure BDA0003991130860001971
Figure BDA0003991130860001981
Figure BDA0003991130860001991
Figure BDA0003991130860002001
Figure BDA0003991130860002011
Figure BDA0003991130860002021
Figure BDA0003991130860002031
Figure BDA0003991130860002041
Figure BDA0003991130860002051
Figure BDA0003991130860002061
Figure BDA0003991130860002071
Figure BDA0003991130860002081
Figure BDA0003991130860002091
Figure BDA0003991130860002101
Figure BDA0003991130860002111
Figure BDA0003991130860002121
Figure BDA0003991130860002131
Figure BDA0003991130860002141
Figure BDA0003991130860002151
Figure BDA0003991130860002161
Figure BDA0003991130860002171
Figure BDA0003991130860002181
Figure BDA0003991130860002191
Figure BDA0003991130860002201
Figure BDA0003991130860002211
Figure BDA0003991130860002221
Figure BDA0003991130860002231
Figure BDA0003991130860002241
Figure BDA0003991130860002251
Figure BDA0003991130860002261
Figure BDA0003991130860002271
Figure BDA0003991130860002281
Figure BDA0003991130860002291
Figure BDA0003991130860002301
Figure BDA0003991130860002311
Figure BDA0003991130860002321
Figure BDA0003991130860002331
Figure BDA0003991130860002341
Figure BDA0003991130860002351
Figure BDA0003991130860002361
Figure BDA0003991130860002371
Figure BDA0003991130860002381
Figure BDA0003991130860002391
Figure BDA0003991130860002401
Figure BDA0003991130860002411
在一些实施例中，抗原结合结构域包含表9中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2、和HC CDR3。在实施例中，抗原结合结构域进一步包含LC CDR1、LCCDR2、和LC CDR3。在实施例中，抗原结合结构域包含表9中列出的LC CDR1、LC CDR2、和LCCDR3氨基酸序列。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含表9中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个、两个或全部，以及表9中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个、两个或全部。
在一些实施例中，根据卡巴特编号方案、乔西亚编号方案、或其组合定义CDR。
CD22 CAR和CD22结合序列
在一些实施例中，本文所述的CAR或表达CAR的细胞是表达CD22CAR的细胞(例如，表达与人CD22结合的CAR分子的细胞)。在一些实施例中，所述表达CD22 CAR的细胞包含根据WO 2016/164731和PCT/US 2017/055627(通过引用并入本文)的抗原结合结构域。示例性CD22结合序列或CD22 CAR序列披露于，例如，WO 2016/164731的表6A、6B、7A、7B、7C、8A、8B、9A、9B、10A和10B以及PCT/US 2017/055627的表6-10中。在一些实施例中，所述CD22结合序列或CD22 CAR序列包含在PCT/US 2017/055627或WO 2016/164731中披露的CD22 CAR的CDR、可变区、scFv或全长序列。
在实施例中，所述CAR分子包含特异性结合CD22的抗原结合结构域(CD22 CAR)。在一些实施例中，抗原结合结构域靶向人CD22。在一些实施例中，抗原结合结构域包括如本文所述的单链Fv序列。
示例性人CD22 CAR的序列在下文提供。在一些实施例中，人CD22CAR是CAR22-65。
示例性人CD22 CAR scFv序列
EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSMLSNSDTWNWIRQSPSRGLEWLGRTYHRSTWYD
DYASSVRGRVSINVDTSKNQYSLQLNAVTPEDTGVYYCARVRLQDGNSWSDAFDVWGQGT
MVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQ
HPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGTGTQLTVL(SEQ ID NO:2253)
示例性人CD22 CAR重链可变区
EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSMLSNSDTWNWIRQSPSRGLEWLGRTYHRSTWYD
DYASSVRGRVSINVDTSKNQYSLQLNAVTPEDTGVYYCARVRLQDGNSWSDAFDVWGQGT MVTVSS(SEQ ID NO:2254)
示例性人CD22 CAR轻链可变区
QSALTQPASASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSN RFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGTGTQLTVL(SEQ ID NO:2255)
表10.CD22 CAR的示例性重链可变结构域CDR(CAR22-65)
Figure BDA0003991130860002421
表11.CD22 CAR的示例性轻链可变结构域CDR(CAR22-65)。
该表中的LC CDR序列在卡巴特或组合定义下具有相同的序列。
Figure BDA0003991130860002431
在一些实施例中，抗原结合结构域包含表10中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2、和HC CDR3。在实施例中，抗原结合结构域进一步包含LC CDR1、LCCDR2、和LC CDR3。在实施例中，抗原结合结构域包含表11中列出的LC CDR1、LC CDR2、和LCCDR3氨基酸序列。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含表11中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个、两个或全部，以及表10中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个、两个或全部。
在一些实施例中，根据卡巴特编号方案、乔西亚编号方案、或其组合定义CDR。
VL和VH结构域在scFv中出现的顺序可以是变化的(即，VL-VH或VH-VL取向)，并且其中“G4S”(SEQ ID NO:1039)亚基(其中每个亚基包含序列GGGGS(SEQ ID NO:1039)(例如，(G4S)3(SEQ ID NO:1011)或(G4S)4(SEQ ID NO:1010))的一个、两个、三个或四个拷贝中的任一种可连接可变结构域以创建整个scFv结构域。可替代地，CAR构建体可以包含例如包含序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:2263)的接头。可替代地，CAR构建体可以包含例如包含序列LAEAAAK(SEQ ID NO:2264)的接头。在一些实施例中，CAR构建体不包括VL和VH结构域之间的接头。
这些克隆均含有源自CD3ζ链的共刺激结构域的信号结构域中的Q/K残基变化。
RNA转染
本文披露了用于产生体外转录的RNA CAR分子的方法。本披露还包括编码CAR构建体的RNA构建体，其可以直接转染到细胞中。产生用于转染的mRNA的方法可以涉及用特别设计的引物对模板进行体外转录(IVT)、然后添加聚A以产生含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸、和聚A尾的构建体，典型地长度为50-2000个碱基(SEQ ID NO:1468)。这样产生的RNA可以有效地转染不同类型的细胞。在一些实施例中，模板包含针对CAR构建体的序列。
在一些实施例中，CAR分子由信使RNA(mRNA)编码。在一些实施例中，将编码CAR分子的mRNA引入免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)以产生表达CAR的细胞(例如，CAR T细胞或表达CAR的NK细胞)。
在一些实施例中，体外转录的RNA CAR可以作为瞬时转染的形式引入到细胞。使用聚合酶链反应(PCR)产生的模板通过体外转录产生RNA。可以将来自任何来源的感兴趣的DNA直接通过PCR转化为模板，以使用适当的引物和RNA聚合酶体外合成mRNA。DNA的来源可以是例如基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他合适的DNA来源。用于体外转录的所希望模板是本披露的CAR。例如，RNA CAR的模板可以包含含有抗肿瘤抗体的单链可变结构域的细胞外区；铰链区、跨膜结构域(例如，CD8a的跨膜结构域)；以及胞质区，该胞质区包括细胞内信号传导结构域，例如包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。
在一些实施例中，待用于PCR的DNA含有可读框。DNA可以来自生物体基因组的天然存在的DNA序列。在一些实施例中，核酸可以包括5'和/或3'非翻译区(UTR)中的一些或全部。核酸可以包括外显子和内含子。在一些实施例中，用于PCR的DNA是人核酸序列。在一些实施例中，用于PCR的DNA是包括5'和3'UTR的人核酸序列。替代性地，DNA可以是通常不在天然存在的生物体中表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列是含有基因部分的序列，这些基因部分连接在一起以形成编码融合蛋白的可读框。连接在一起的DNA部分可以来自单个生物体或来自多于一个的生物体。
使用PCR以产生用于体外转录mRNA的模板，该mRNA用于转染。用于进行PCR的方法在本领域中是熟知的。用于PCR的引物被设计成具有与有待用作PCR模板的DNA区域基本上互补的区域。如本文所用，“基本上互补”是指其中引物序列中的大多数或所有碱基是互补的，或者一个或多个碱基是非互补的或错配的核苷酸序列。基本上互补的序列能够在用于PCR的退火条件下与预期的DNA靶标退火或杂交。可以将引物设计为与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，可以将引物设计为扩增通常在细胞中转录的核酸的一部分(可读框)，包括5'和3’UTR。还可以设计引物以扩增编码特定感兴趣的结构域的核酸的一部分。在一些实施例中，设计引物以扩增人cDNA的编码区，包括5'和3'UTR的全部或部分。可用于PCR的引物可以通过本领域熟知的合成方法产生。“正向引物”是含有核苷酸区域的引物，这些核苷酸与DNA模板上的位于待扩增DNA序列上游的核苷酸基本上互补。“上游”在本文中用于指相对于编码链而言待扩增的DNA序列的5'位置。“反向引物”是含有核苷酸区域的引物，所述核苷酸区域与待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补。“下游”在本文中用于指相对于编码链而言待扩增的DNA序列的3'位置。
可用于PCR的任何DNA聚合酶均可用于本文披露的方法中。试剂和聚合酶可从许多来源商购获得。
也可以使用能够促进稳定性和/或翻译效率的化学结构。RNA优选地具有5'和3'UTR。在一些实施例中，5'UTR的长度在1个与3000个核苷酸之间。待添加到编码区的5'和3'UTR序列的长度可以通过不同方法改变，这些方法包括但不限于设计与UTR的不同区退火的PCR引物。使用该途径，本领域普通技术人员可以改变所需的5'和3'UTR长度，以在经转录RNA的转染后实现最佳翻译效率。
5'和3'UTR可以是感兴趣的核酸的天然存在的内源性5'和3'UTR。替代性地，可以通过将对感兴趣的核酸不是内源的UTR序列并入到正向和反向引物中或通过模板的任何其他修饰来添加这些UTR序列。使用对感兴趣的核酸是内源的UTR序列可用于改变RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中的富含AU的元件可以降低mRNA的稳定性。因此，可以选择或设计3'UTR，以基于本领域熟知的UTR的特性来增加经转录的RNA的稳定性。
在一些实施例中，5'UTR可以含有内源性核酸的科扎克(Kozak)序列。替代性地，当如上所述通过PCR添加对感兴趣的核酸不是内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列重新设计共有科扎克序列。科扎克序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但似乎不是所有RNA实现高效翻译所需要的。对许多mRNA的科扎克序列的要求在本领域中是已知的。在其他实施例中，5'UTR可以是RNA病毒的5'UTR，所述RNA病毒的RNA基因组在细胞中是稳定的。在其他实施例中，可以在3'或5'UTR中使用各种核苷酸类似物来阻止mRNA的外切核酸酶降解。
为了在无需基因克隆的情况下实现从DNA模板合成RNA，转录启动子应附接到待转录序列上游的DNA模板上。当将发挥RNA聚合酶启动子功能的序列添加至正向引物的5'端时，该RNA聚合酶启动子将并入到PCR产物中位于待转录的可读框上游。在一些实施例中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文其他地方所述。其他可用的启动子包括但不限于T3和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在一些实施例中，mRNA具有5’端帽和3’聚(A)尾，它们决定核糖体结合、翻译起始和mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板例如质粒DNA上，RNA聚合酶产生长的多联产物，该多联产物不适于在真核细胞中表达。转录在3'UTR端线性化的质粒DNA产生正常大小的mRNA，该mRNA即使在转录后进行了多腺苷酸化，在真核转染中也是无效的。
在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以将转录物的3'末端延伸到模板的最后一个碱基之外(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.[核酸研究],13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志],270:1485-65(2003))。
将聚A/T伸展段整合到DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的聚A/T序列可导致质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞获得的质粒DNA模板经常被缺失和其他畸变高度污染的原因。这使得克隆程序不仅费力且耗时，而且通常是不可靠的。这就是为什么非常期望允许在不进行克隆的情况下构建具有聚A/T 3'伸展段的DNA模板的方法。
转录DNA模板的聚A/T区段可以在PCR期间通过使用含有聚T尾(如100T尾)(SEQ IDNO:1469)(大小可以是50-5000T(SEQ ID NO:1470))的反向引物来产生，或在PCR之后通过任何其他方法(包括但不限于DNA连接或体外重组)来产生。聚(A)尾也为RNA提供稳定性并降低其降解。通常，聚(A)尾的长度与转录的RNA的稳定性呈正相关。在一些实施例中，多聚(A)尾在100个和5000个腺苷之间(SEQ ID NO:1471)。
在使用聚(A)聚合酶(如大肠杆菌聚A聚合酶(E-PAP))进行体外转录后，可以进一步延伸RNA的聚(A)尾。在一些实施例中，将聚(A)尾的长度从100个核苷酸增加到300到400个核苷酸(SEQ ID NO:1472)，导致RNA的翻译效率增加约两倍。另外，不同化学基团与3'端的附接可以增加mRNA稳定性。这种附接可以含有经修饰的/人工的核苷酸、适配体和其他化合物。例如，可以使用聚(A)聚合酶将ATP类似物并入到聚(A)尾中。ATP类似物还可以增加RNA的稳定性。
5'帽也为RNA分子提供稳定性。在一些实施例中，通过本文披露的方法产生的RNA包括5'帽。使用本领域已知的和本文所述的技术获得5'帽(Cougot等人,Trends inBiochem.Sci.[生物化学科学趋势],29:436-444(2001)；Stepinski等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.[生物化学与生物物理学研究通讯],330:958-966(2005))。
通过本文披露的方法产生的RNA还可以含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒、染色体或人工设计的序列，该序列启动与帽无关的核糖体与mRNA的结合并促进翻译的起始。可以包括适用于细胞电穿孔的任何溶质，这些溶质可以含有促进细胞渗透性和活力的因子，如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
可以使用许多不同方法中的任一种将RNA引入到靶细胞中，这些不同方法例如可商购的方法，包括但不限于：电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(德国科隆的艾玛科萨生物系统公司(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))，(ECM 830(BTX)(马萨诸塞州波士顿的哈佛仪器公司(Harvard Instruments,Boston,Mass.))或Gene Pulser II(科罗拉多州丹佛的伯乐公司(BioRad,Denver,Colo.))，Multiporator(德国汉堡的艾本德公司(Eppendort,Hamburg Germany)))；阳离子脂质体介导的转染(使用脂质转染)；聚合物包封；肽介导的转染；或生物射弹颗粒递送系统如“基因枪”(参见，例如Nishikawa等人Hum Gene Ther.[人类基因疗法],12(8):861-70(2001))。
非病毒递送方法
在一些实施例中，可以使用非病毒方法将编码本文所述的CAR分子的核酸递送至细胞或组织或受试者中。
在一些实施例中，非病毒方法包括使用转座子(也称为转座元件)。在一些实施例中，转座子是可以将自身插入基因组中一位置的一条DNA，例如，能够自我复制并将其拷贝插入基因组的一条DNA，或者是可以从较长的核酸中剪接出并插入基因组中的另一个位置的一条DNA。例如，转座子包含由侧接基因的用于转座的反向重复序列构成的DNA序列。
使用转座子的核酸递送的示例性方法包括睡美人转座子系统(SBTS)和piggyBac(PB)转座子系统。参见例如，Aronovich等人Hum.Mol.Genet.[人类分子遗传学]20.R1(2011):R14-20；Singh等人Cancer Res.[癌症研究]15(2008):2961–2971；Huang等人Mol.Ther.[分子疗法]16(2008):580-589；Grabundzija等人Mol.Ther.[分子疗法]18(2010):1200-1209；Kebriaei等人Blood.[血液学].122.21(2013):166；Williams.Molecular Therapy[分子疗法],16.9(2008):1515–16；Bell等人Nat.Protoc.[自然实验手册]2.12(2007):3153-65；和Ding等人Cell.[细胞]122.3(2005):473-83，所有这些文献均通过引用并入本文。
SBTS包括两个组分：1)含有转基因的转座子和2)转座酶的来源。转座酶可以将转座子从载体质粒(或其他供体DNA)转移到靶标DNA，如宿主细胞染色体/基因组。例如，转座酶与载体质粒/供体DNA结合，从质粒中切出转座子(包括一个或多个转基因)，并将它插入到宿主细胞的基因组中。参见例如，Aronovich等人，同上。
示例性转座子包括基于pT2的转座子。参见例如，Grabundzija等人Nucleic AcidsRes.[核酸研究]41.3(2013):1829-47；和Singh等人Cancer Res.[癌症研究]68.8(2008):2961-2971，所有这些文献均通过引用并入本文。示例性的转座酶包括Tc1/海员型转座酶(mariner-type transposase)，例如SB10转座酶或SB11转座酶(可以例如从巨细胞病毒启动子表达的过度活跃的转座酶)。参见例如，Aronovich等人；Kebriaei等人；和Grabundzija等人，所有这些文献均通过引用并入本文。
SBTS的使用允许转基因(例如，编码本文所述CAR分子的核酸)的高效整合和表达。本文提供了产生细胞(例如，T细胞或NK细胞)的方法，该细胞例如使用转座子系统(如，SBTS)稳定地表达本文所述的CAR分子。
根据本文所述的方法，在一些实施例中，将含有SBTS组分的一种或多种核酸(例如质粒)递送至细胞(例如，T或NK细胞)。例如，通过核酸(例如，质粒DNA)递送的标准方法递送一种或多种核酸，这些标准方法例如本文所述的方法，例如电穿孔、转染或脂质转染。在一些实施例中，核酸含有包含转基因(例如，编码本文所述CAR分子的核酸)的转座子。在一些实施例中，核酸含有包含转基因(例如，编码本文所述CAR分子的核酸)以及编码转座酶的核酸序列的转座子。在其他实施例中，提供了具有两种核酸的系统，例如双质粒系统，例如，其中第一质粒含有包含转基因的转座子，而第二质粒含有编码转座酶的核酸序列。例如，将第一核酸和第二核酸共同递送至宿主细胞中。
在一些实施例中，通过使用基因插入(使用SBTS)和基因编辑(使用核酸酶(例如，锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统、或工程化大范围核酸酶重新工程化的归巢内切核酸酶))的组合产生表达本文所述CAR分子的细胞，例如T细胞或NK细胞。
在一些实施例中，使用非病毒递送方法允许细胞例如T细胞或NK细胞的重编程，并且将这些细胞直接输注到受试者体内。非病毒载体的优点包括但不限于容易且相对低成本地产生满足患者群体所需的足够量、储存期间的稳定性和缺乏免疫原性。
编码CAR分子的核酸构建体
本披露还提供了编码一种或多种本文所述CAR构建体的核酸分子。在一些实施例中，核酸分子提供为信使RNA转录物。在一些实施例中，核酸分子提供为DNA构建体。
相应地，在一些实施例中，本披露涉及编码CAR分子的分离的核酸分子，其中CAR分子包含抗原结合结构域、跨膜结构域和包含刺激结构域(例如，共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域，例如ζ链)的细胞内信号传导结构域。
编码所希望分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如通过从表达该基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中获得基因，或通过使用标准技术直接从含有该基因的细胞和组织分离。替代性地，感兴趣的基因可以合成产生，而不是克隆。
本披露还提供了其中插入本披露的DNA的载体。衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体相对于衍生自肿瘤逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有附加优点，因为它们可以转导非增殖性细胞，例如肝细胞。它们还具有低免疫原性的附加优点。逆转录病毒载体还可以是例如γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以包括例如启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如两个)长末端重复序列(LTR)和感兴趣的转基因，例如编码CAR分子的基因。γ逆转录病毒载体可能缺少病毒结构基因(如gag、pol、和env)。示例性γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、形成脾脏病灶病毒(SFFV)、和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，以及由其衍生的载体。其他γ逆转录病毒载体描述于例如Tobias Maetzig等人,“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology andApplication[γ逆转录病毒载体：生物学/技术和应用]”Viruses.[病毒]2011年6月；3(6):677-713。
在一些实施例中，包含编码本披露所希望CAR分子的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在一些实施例中，编码CAR IL-15R/IL-15的核酸的表达可以使用转座子如睡美人系统、CRISPR、CAS9和锌指核酸酶完成。参见下文June等人2009Nature ReviewsImmunology[自然免疫学综述]9.10:704-716，将其通过引用并入本文。
简而言之，CAR的天然或合成核酸的表达典型地是通过将编码CAR多肽或其部分的核酸与启动子可操作地连接、并将构建体并入到表达载体中来实现。载体可以适用于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节所希望核酸序列表达的启动子。
使用标准基因递送方案，本披露的表达构建体也可用于核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法在本领域中是已知的。参见例如美国专利No.5,399,346、5,580,859、5,589,466，这些专利通过援引以其全文并入本文。在一些实施例中，本披露提供了一种基因治疗载体。
可以将核酸克隆至许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，该载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
此外，可以将表达载体以病毒载体的形式提供至细胞。病毒载体技术在本领域中是熟知的，并且例如描述于Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL[分子克隆：实验室手册],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY[纽约冷泉港出版社]中，以及其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中具有复制功能的起点、启动子序列、便利的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择标志物(例如，WO01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入到载体中并且包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至受试者的细胞中。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施例中，使用了腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一些实施例中，使用慢病毒载体。
另外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。典型地，这些位于起始位点上游30-110bp的区中，但是已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔常常是灵活的，使得当元件彼此相对发生颠倒或移动时启动子功能可以得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加到相隔50bp。取决于启动子，显现单独的元件可以协同或独立地起作用以活化转录。
能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因的启动子的实例是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合物的α亚基的表达，该复合物负责将氨酰tRNA酶促递送至核糖体。EF1a启动子已经广泛用于哺乳动物表达质粒中，并且已经显示出有效地驱动克隆到慢病毒载体中的转基因的CAR表达。参见例如，Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453–1464(2009)。
启动子的另一个实例是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、Rous肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本披露不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本披露的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，该分子开关能够当需要该启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达时启动这种表达，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
启动子的另一个实例是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在实施例中，截短的PGK启动子(例如当与野生型PGK启动子序列相比时，具有一个或多个(例如1、2、5、10、100、200、300、或400个)核苷酸缺失的PGK启动子)可能是希望的。以下提供了示例性PGK启动子的核苷酸序列。
示例性WT PGK启动子
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT(SEQID NO:1473)
示例性截短的PGK启动子：
PGK100：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG(SEQ ID NO:1474)
PGK200：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG(SEQ ID NO:1475)
PGK300：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG(SEQ ID NO:1476)
PGK400：ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG
(SEQ ID NO:1477)
载体还可以包括例如促进分泌的信号序列、多腺苷酸化信号和转录终止子(例如来自牛生长激素(BGH)基因)、允许在原核生物中游离型复制和复制的元件(例如SV40起源和ColE1或本领域已知的其他元件)和/或允许选择的元件(例如氨苄青霉素抗性基因和/或zeocin标志物)。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入到细胞中的表达载体还可含有选择标志物基因或报告基因或两者，以便于从旨在通过病毒载体经转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其他实施例中，选择标志物可以在单独的DNA片段上携带并用于共转染程序。选择标志物和报告基因二者都可以侧接适当的调节序列以实现在宿主细胞中的表达。有用的选择标志物包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因用于鉴定可能经转染的细胞和用于评价调节序列的功能。通常，报告基因是如下基因，该基因不存在于受体生物体或组织中或由其表达并且编码多肽，该多肽的表达通过一些可易于检测的特性(例如，酶活性)表现出来。在将DNA引入到受体细胞中后的适当时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,2000FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]479:79-82)。合适的表达系统是熟知的，并且可以使用已知技术制备或商业获得。通常，显示报告基因的最高表达水平的具有最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接，并用于评价药剂调节启动子驱动的转录的能力。
在一些实施例中，载体可以进一步包含编码第二CAR分子的核酸。在一些实施例中，第二CAR分子包括针对以下靶标的抗原结合结构域：在急性髓性白血病细胞上表达的靶标，例如像CD123、CD34、CLL-1、叶酸受体β或FLT3；或在B细胞上表达的靶标，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a。在一些实施例中，该载体包含编码特异性结合第一抗原并且包括具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第一CAR分子的核酸序列，以及编码特异性结合第二不同抗原并且包括具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二CAR分子的核酸。
在一些实施例中，载体包含编码本文所述的CAR分子的核酸和编码抑制性CAR分子的核酸。在一些实施例中，抑制性CAR分子包含结合存在于正常细胞而非癌细胞上的抗原的抗原结合结构域。在一些实施例中，抑制性CAR分子包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。例如，抑制性CAR分子的细胞内结构域可以是PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ的细胞内结构域。
在实施例中，载体可包含两种或更多种编码CAR分子的核酸序列，例如，本文所述的CAR分子和第二CAR分子，例如，抑制性CAR分子或特异性结合不同抗原的CAR分子。在此类实施例中，编码CAR分子的两种或更多种核酸序列由相同框中的单个核酸分子编码并且作为单个多肽链。在一些实施例中，两种或更多种CAR分子可以例如通过一个或多个肽切割位点分开。(例如，细胞内蛋白酶的自动切割位点或底物)。肽切割位点的实例包括以下，其中GSG残基是任选的：
T2A：     (GSG)E G R G S L L T C G D V E E N P G P(SEQ ID NO:1478)
P2A：     (GSG)A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P(SEQ ID NO:1479)
E2A：     (GSG)Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO:1480)
F2A:     (GSG)V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO:1481)
将基因引入到细胞中并将其在细胞中表达的方法在本领域中是已知的。在表达载体的背景下，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入到宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物手段转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的。参见例如，Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL[分子克隆实用指南],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press[冷泉港实验出版社],纽约。将多核苷酸引入到宿主细胞中的优选方法是磷酸钙转染。
用于将感兴趣的多核苷酸引入到宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物例如人细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的化学手段包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠、和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外和体内的递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如人造膜囊泡)。可获得现有技术的靶向递送核酸(如用靶向纳米颗粒或其他合适的亚微米大小的递送系统递送多核苷酸)的其他方法。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质制剂以将核酸引入到宿主细胞(体外、离体或体内)中。在一些实施例中，核酸可以与脂质缔合。与脂质结合的核酸可以被包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，经由与脂质体和寡核苷酸二者相关的连接分子附接至脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，以悬浮液形式包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束或“塌陷”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，这些脂肪物质可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物(如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)的化合物类。
适用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma,St.Louis,MO)获得；磷酸二鲸蜡脂(“DCP”)可以从K&K实验室(K&K Laboratories)(普莱恩维尤(Plainview)，纽约)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以从阿凡提极地脂质公司(Avanti Polar Lipids,Inc.)(伯明翰(Birmingham)，阿拉巴马州)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单层和多层脂质媒介物。脂质体可以表征为具有囊泡结构，这些囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。它们是在磷脂悬浮在过量的水性溶液中时自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991Glycobiology[糖生物学]5:505-10)。然而，还涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了lipofectamine-核酸复合物。
无论用于将外源核酸引入宿主细胞或以其他方式将细胞暴露于本披露的抑制剂的方法如何，为了确认宿主细胞中存在重组DNA序列，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，如DNA和RNA印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定以鉴定落入本披露范围内的药剂。
本披露还提供了包含编码CAR分子的核酸分子的载体。在一些实施例中，CAR载体可以直接转导到细胞(例如T细胞或NK细胞)中。在一些实施例中，载体是克隆或表达载体，例如，包括但不限于以下的载体：一种或多种质粒(例如表达质粒、克隆载体、微环、微型载体、双微染色体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体。在一些实施例中，所述载体是多顺反子载体。在一些实施例中，载体能够在哺乳动物T细胞或NK细胞中表达CAR构建体。在一些实施例中，哺乳动物T细胞是人T细胞。在一些实施例中，哺乳动物NK细胞是人NK细胞。在一些实施例中，T细胞是自体的。在一些实施例中，T细胞是同种异体的。
细胞来源
在扩增和遗传修饰之前，细胞(例如，免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞))的来源从受试者获得。术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、及其转基因物种。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织、和肿瘤。
在本披露的某些实施例中，可以使用本领域可获得的任意数量的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)系。在本披露的某些实施例中，可以使用任何数量本领域技术人员已知的技术(如FicollTM分离)从自受试者收集的血液单位获得T细胞。在一些实施例中，通过单采获得来自个体的循环血液的细胞。单采产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施例中，可以洗涤通过单采收集的细胞以去除血浆部分，并且将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续加工步骤。在本披露的一些实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施例中，洗涤溶液缺少钙并且可能缺少镁，或者可能缺少许多(如果不是全部)二价阳离子。
在不存在钙的情况下的初始活化步骤可以导致放大的活化。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，如通过根据制造商的说明使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver5)。在洗涤后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，例如，像无Ca、无Mg的PBS、勃脈力A、或者含有或不含缓冲液的其他盐溶液。替代性地，可以除去单采血液成分术样品中不希望的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
应当认识到，本申请的方法可利用包含5％或更少(例如2％)的人AB血清的培养基条件，并使用已知的培养基条件和组合物，例如描述于以下的那些：Smith等人,“Ex vivoexpansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement[使用新型无Xeno CTS免疫细胞血清替代物进行过继免疫治疗的人T细胞的离体扩增]”Clinical&Translational Immunology[临床和移植免疫学](2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31。
在一些实施例中，通过裂解红细胞和耗减单核细胞(例如，通过PERCOLLTM梯度离心或通过对流离心淘洗)从外周血淋巴细胞分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，如CD3+、CD4+、CD8+、CD45RA+、和/或CD45RO+T细胞。例如，在一些实施例中，通过与抗CD3/抗CD28(例如3x28)缀合珠(如
Figure BDA0003991130860002601
M-450CD3/CD28T)孵育足以阳性选择所希望的T细胞的时间段来分离T细胞。在一些实施例中，时间段是约30分钟。在一些实施例中，时间段的范围为从30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在一些实施例中，时间段是至少1、2、3、4、5、或6小时。在一些实施例中，时间段是10至24小时。在一些实施例中，孵育时间段是24小时。与其他细胞类型相比，在存在较少T细胞的任何情况下，如从肿瘤组织或免疫受损个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可以提高CD8+ T细胞捕获的效率。因此，通过简单地缩短或延长使T细胞与CD3/CD28珠结合的时间和/或通过增加或减少珠与T细胞的比率(如本文进一步描述的)，可以在培养起始时或在该过程期间的其他时间点优先地选择或针对T细胞亚群。另外，通过增加或减少抗CD3和/或抗CD28抗体在珠或其他表面上的比率，可以在培养起始时或在其他希望的时间点优先地选择或针对T细胞亚群。本领域技术人员将认识到，在本披露的上下文中还可以使用多轮选择。在某些实施例中，可能希望执行选择程序并在活化和扩增过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可以经受进一步轮次的选择。
可以用针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成通过阴性选择富集T细胞群。一种方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，负磁性免疫吸附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物典型地包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗体。在某些实施例中，可能希望富集或阳性选择典型地表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+、和FoxP3+的调节T细胞。在某些实施例中，可能需要富集CD127低的细胞。替代性地，在某些实施例中，T调节细胞被抗C25缀合的珠或其他类似的选择方法耗减。
本文所述的方法可以包括，例如，使用例如(例如，本文所述的)阴性选择技术选择免疫效应细胞(例如，T细胞)的特定亚群，该亚群是T调节性细胞耗减的群体，CD25+耗减的细胞。优选地，T调节耗减的细胞群体含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。
在一些实施例中，使用抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体(IL-2)从群中去除调节性T细胞，例如，CD25+ T细胞。在一些实施例中，将抗CD25抗体或其片段、或CD25结合配体与底物(例如，珠)缀合、或以其他方式包被在底物(例如，珠)上。在一些实施例中，抗CD25抗体或其片段与本文所述的底物缀合。
在一些实施例中，使用来自MiltenyiTM的CD25耗减药剂从群体除去T调节性细胞(例如，CD25+ T细胞)。在一些实施例中，细胞与CD25耗减试剂的比率是1e7个细胞至20uL、或1e7个细胞至15uL、或1e7个细胞至10uL、或1e7个细胞至5uL、或1e7个细胞至2.5uL、或1e7个细胞至1.25uL。在一些实施例中，例如，对于T调节性细胞(例如，CD25+)耗减，使用大于5亿个细胞/ml。在一些实施例中，使用6亿、7亿、8亿、或9亿个细胞/ml的细胞浓度。
在一些实施例中，有待耗减的免疫效应细胞群体包括约6x109个CD25+ T细胞。在其他实施例中，待耗减的免疫效应细胞群体包括约1×109至1×1010个CD25+ T细胞，以及其间的任何整数值。在一些实施例中，所得群体T调节耗减的细胞具有2×109个T调节细胞(例如，CD25+细胞)或更少(例如，1×109个、5×108个、1×108个、5×107个、1×107个或更少的CD25+细胞)。
在一些实施例中，使用具有耗减管组(诸如像管162-01)的CliniMAC系统从群体除去T调节性细胞(例如，CD25+细胞)。在一些实施例中，将CliniMAC系统在耗减设置(诸如像DEPLETION2.1)上运行。
不希望受特定理论的束缚，在单采术之前或在制造表达CAR的细胞产物期间减少受试者中免疫细胞的阴性调节剂水平(例如，减少不需要的免疫细胞(例如，TREG细胞)的数量)可以降低受试者复发的风险。例如，耗减TREG细胞的方法是本领域已知的。减少TREG细胞的方法包括但不限于环磷酰胺、抗GITR抗体(本文所述的抗GITR抗体)、CD25耗减、及其组合。
在一些实施例中，制造方法包括在制造表达CAR的细胞之前降低(例如，耗减)TREG细胞的数量。例如，制造方法包括使样品(例如单采样品)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段、或CD25结合配体)接触，例如以在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物之前耗减TREG细胞。
在一些实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用一种或多种减少TREG细胞的疗法预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。在一些实施例中，减少TREG细胞的方法包括但不限于向受试者施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种。施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种可以在输注表达CAR的细胞产物之前、期间、或之后发生。
在一些实施例中，在收集用于表达CAR IL-15R/IL-15的细胞产物制造的细胞之前，用环磷酰胺预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR IL-15R/IL-15的细胞治疗复发的风险。在一些实施例中，在收集用于表达CAR IL-15R/IL-15的细胞产物制造的细胞之前，用抗GITR抗体预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR IL-15R/IL-15的细胞治疗复发的风险。
在一些实施例中，有待除去的细胞群体既不是调节性T细胞、或肿瘤细胞，也不是以其他方式对CAR IL-15R/IL-15T细胞的扩增和/或功能产生负面影响的细胞(例如表达CD14、CD11b、CD33、CD15、或由潜在免疫抑制细胞表达的其他标志物的细胞)。在一些实施例中，设想将此类细胞与调节性T细胞和/或肿瘤细胞并行去除，或在所述耗减之后，或以另一种顺序去除。
本文所述的方法可以包括多于一个的选择步骤，例如，多于一个的耗减步骤。可以例如用针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成通过阴性选择富集T细胞群体。一种方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，负磁性免疫吸附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗体。
本文所述的方法可进一步包括从表达肿瘤抗原(例如，不包含CD25的肿瘤抗原，例如，CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)的群体除去细胞，从而提供T调节性耗减的(例如，CD25+耗减的)和肿瘤抗原耗减的细胞群体，该细胞群体适于表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)。在一些实施例中，将表达肿瘤抗原的细胞与T调节性，例如，CD25+细胞同时除去。例如，抗CD25抗体或其片段、和抗肿瘤抗原抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞、或抗CD25抗体或其片段、或抗肿瘤抗原抗体或其片段的同一底物(例如，珠)，可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中，T调节性细胞(例如，CD25+细胞)的除去和表达肿瘤抗原的细胞的除去是连续的，并且可以，例如，以任何顺序发生。
还提供了包括以下的方法：从表达检查点抑制剂(例如，本文所述的检查点抑制剂)的群体除去细胞(例如，PD1+细胞、LAG3+细胞、和TIM3+细胞中的一种或多种)，从而提供T调节性耗减的(例如，CD25+耗减的)细胞和检查点抑制剂耗减的细胞(例如PD1+、LAG3+和/或TIM3+耗减的细胞)的群体。示例性检查点抑制剂包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ。在实施例中，检查点抑制剂是PD1或PD-L1。在一些实施例中，将表达检查点抑制剂的细胞与T调节性，例如，CD25+细胞同时除去。例如，抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞、或抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段的同一珠，可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中，T调节性细胞(例如，CD25+细胞)的除去和表达检查点抑制剂的细胞的除去是连续的，并且可以，例如，以任何顺序发生。
在一些实施例中，可以选择表达以下中的一种或多种的T细胞群体：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、颗粒酶B、和穿孔素、或其他适当的分子(例如，其他细胞因子)。筛选细胞表达的方法可以通过例如PCT公开号：WO 2013/126712中所述的方法进行确定。
为了通过阳性或阴性选择分离希望的细胞群体，可以改变细胞和表面(例如，颗粒(如珠))的浓度。在某些实施例中，可能希望显著减小其中珠和细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一些实施例中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一些实施例中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在一些实施例中，使用大于1亿个细胞/ml。在一些实施例中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万、或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一些实施例中，使用0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另外的实施例中，可以使用125或150百万个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞活化、和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)，或来自存在许多肿瘤细胞的样品(例如，白血病的血、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群体可能具有治疗价值，并且是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施例中，可能希望使用较低的细胞浓度。通过显著稀释T细胞和表面的混合物(例如颗粒(如珠))，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这选择了表达大量有待结合颗粒的所希望抗原的细胞。例如，CD4+ T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+ T细胞更有效地捕获。在一些实施例中，所使用的细胞浓度是5X10e6/ml。在其他实施例中，使用的浓度可以是约1×105/ml至1×106/ml，以及其间的任何整数值。
在其他实施例中，可以将这些细胞在旋转器上以不同的速度在2℃-10℃或室温下孵育不同的时间长度。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过在细胞群体中去除粒细胞及在一定程度上去除单核细胞提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在这种情况下将是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其他适合的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其他控制冷冻的方法以及在-20℃或液氮中立即不受控制的冷冻。
在某些实施例中，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻并洗涤，并允许在使用本披露的方法活化之前在室温下静置一小时。
在本披露的上下文中还考虑了在可能需要如本文所述的扩增细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采产物。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩增细胞的来源，并且分离和冷冻所需的细胞(如免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞)，以便稍后用于细胞疗法(例如，T细胞疗法)，用于将受益于细胞疗法(例如，T细胞疗法)的任何数量的疾病或病症，如本文所述的那些。在一些实施例中，血液样品或单采样品取自一般健康的受试者。在某些实施例中，血液样品或单采样品取自处于患上疾病风险但尚未患上疾病的一般健康的受试者，并且分离和冷冻感兴趣的细胞以备后用。在某些实施例中，可以扩增、冷冻免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，并在随后的时间里使用。在某些实施例中，在诊断如本文所述的特定疾病之后但在任何治疗之前不久从患者收集样品。在一些实施例中，在任何数量的相关治疗方式之前，从受试者的血液样品或单采分离细胞，这些相关治疗方式包括但不限于用以下进行治疗：药剂(如那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗、抗病毒剂)、化疗、放射、免疫抑制性剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、和FK506)、抗体或其他免疫清除剂(如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228)、和照射。
在本披露的一些实施例中，在使受试者离开功能性T细胞的治疗之后直接从患者获得T细胞。在这点上，已观察到在某些癌症治疗(特别是使用破坏免疫系统的药物的治疗)之后，在患者通常将从治疗恢复期间治疗后不久，所获得的T细胞的质量因其离体扩增的能力可能是最佳或改进的。同样地，在使用本文描述的方法进行离体操作之后，这些细胞可以处于优选的状态以增强植入和体内扩增。因此，在本披露的上下文中考虑了在所述恢复阶段期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞、或造血谱系的其他细胞。此外，在某些实施例中，动员(例如，用GM-CSF动员)和调整方案可以用于在受试者中产生病状，其中特定细胞类型的再增殖、再循环、再生、和/或扩增是有利的，尤其是在治疗后确定的时间窗口期间。说明性细胞类型包括免疫系统的T细胞、B细胞、树突细胞和其他细胞。
在一些实施例中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的免疫效应细胞获自已接受低免疫增强剂量的mTOR抑制剂的受试者。在一些实施例中，在足够的时间后(或在足够剂量的低免疫增强剂量的mTOR抑制剂后)收获被工程化以表达CAR分子的免疫效应细胞(例如T细胞)的群体，使得受试者中或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)的水平、或PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如T细胞)的比率已经至少是短暂的增加了。
在其他实施例中，已经被、或将被工程化以表达CAR分子的免疫效应细胞(例如T细胞)的群体可以通过接触一定量的mTOR抑制剂离体进行处理，所述mTOR抑制剂增加PD1阴性免疫效应子细胞(例如T细胞)的数量、或增加PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如T细胞)的比率。
在一些实施例中，T细胞群体是甘油二酯激酶(DGK)缺陷型。DGK缺陷型细胞包括不表达DGK RNA或蛋白质，或具有降低或抑制的DGK活性的细胞。DGK缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如，施用RNA干扰剂(例如，siRNA、shRNA、miRNA)以降低或预防DGK表达。替代性地，可以通过用本文描述的DGK抑制剂处理产生DGK缺陷型细胞。
在一些实施例中，T细胞群体是Ikaros缺陷型。Ikaros缺陷型细胞包括不表达Ikaros RNA、或蛋白质、或具有降低或抑制的Ikaros活性的细胞，Ikaros缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如施用RNA干扰剂(例如，siRNA、shRNA、miRNA)以降低或预防Ikaros表达。替代性地，可以通过用Ikaros抑制剂(例如，来那度胺(lenalidomide))处理产生Ikaros缺陷型细胞。
在实施例中，T细胞群体是DGK缺陷型且Ikaros缺陷型的，例如，不表达DGK和Ikaros，或者具有降低或抑制的DGK和Ikaros活性。可以通过本文描述的任何方法产生此类DGK和Ikaros缺陷型细胞。
在一些实施例中，从受试者获得NK细胞。在一些实施例中，NK细胞是NK细胞系，例如，NK-92细胞系(Conkwest公司)。
CAR细胞(包括同种异体CAR细胞)的修饰
在本文所述的实施例中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。例如该细胞可以是同种异体T细胞，例如缺少功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如HLA I类和/或HLA II类)和/或β-2微球蛋白(β2m)表达的同种异体T细胞。同种异体CAR的组合物及其方法已经在例如WO 2016/014565的第227-237页中进行了描述，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施例中，细胞(例如T细胞或NK细胞)经修饰以减少TCR和/或HLA和/或β2m和/或本文所述的抑制性分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I类MHC、II类MHC、GAL9、腺苷和TGFβ)的表达，例如使用本文所述方法，例如siRNA、shRNA、成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)转录激活子样效应核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)。
在一些实施例中，细胞(例如T细胞或NK细胞)经工程化以表达端粒酶亚基，例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT。在一些实施例中，这种修饰改善了患者体内细胞的持久性。
CAR制造/生产方法
本披露还提供了制备本文披露的细胞的方法，例如，将T细胞或NK细胞工程化以表达编码本文所述的CAR构建体(例如CD19 CAR构建体)的核酸分子的方法。在一些实施例中，本文提供了通过本文所述的任何制造过程制备的细胞(例如，免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞)群体。
活化过程
在一些实施例中，本文披露的方法可以在不到24小时内制造经工程化以表达CAR的免疫效应细胞。不希望受理论束缚，本文提供的方法在制造过程中保留T细胞的未分化表型，例如初始T细胞。这些具有未分化表型的表达CAR的细胞在输注后可在体内持续更长时间和/或更好地扩增。在一些实施例中，与通过传统的制造过程(例如，如使用scRNA-seq测量)产生的CART细胞相比，由本文提供的制造方法产生的CART细胞包含更高百分比的干细胞记忆T细胞。在一些实施例中，与通过传统的制造过程(例如，如使用scRNA-seq测量)产生的CART细胞相比，由本文提供的制造方法产生的CART细胞包含更高百分比的效应T细胞。在一些实施例中，与通过传统的制造过程(例如，如使用scRNA-seq测量)产生的CART细胞相比，由本文提供的制造方法产生的CART细胞更好的保留T细胞的干细胞性。在一些实施例中，与通过传统的制造过程(例如，如使用scRNA-seq测量)产生的CART细胞相比，由本文提供的制造方法产生的CART细胞显示低水平的缺氧。在一些实施例中，与通过传统的制造过程(例如，如使用scRNA-seq测量)产生的CART细胞相比，由本文提供的制造方法产生的CART细胞显示低水平的自噬。
在一些实施例中，本文披露的方法不涉及使用珠，例如
Figure BDA0003991130860002701
(例如，CD3/CD28
Figure BDA0003991130860002702
)，并且不涉及去珠步骤。在一些实施例中，通过本文披露的方法制造的CART细胞可以以最小的离体扩增施用于受试者，例如，小于1天、小于12小时、小于8小时、小于6小时、小于4小时、小于3小时、小于2小时、小于1小时、或没有离体扩张。因此，本文描述的方法提供了制备改进的表达CAR的细胞产物的快速制造过程，这些细胞产物用于治疗受试者的疾病。
在一些实施例中，本披露提供了制备表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如，T细胞)群体的方法，这些方法包括：(i)使细胞(例如，T细胞，例如，从冷冻的或新鲜的白细胞单采产物中分离的T细胞)群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激细胞表面上共刺激分子的药剂接触；(ii)使细胞(例如T细胞)群体与编码CAR的核酸分子(例如DNA或RNA分子)接触，从而提供包含该核酸分子的细胞(例如T细胞)群体，和(iii)收获该细胞(例如T细胞)群体，以用于储存(例如在冷冻保存培养基中重新配制细胞群体)或施用，其中：(a)步骤(ii)与步骤(i)一起进行，或在步骤(i)开始后不晚于20小时(例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时)进行，并且步骤(iii)在步骤(i)开始后不晚于26小时(例如在步骤(i)开始后不晚于22、23、或24小时，例如在步骤(i)开始后不晚于24小时)进行；(b)步骤(ii)与步骤(i)一起进行，或在步骤(i)开始后不晚于20小时(例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时)进行，并且步骤(iii)在步骤(ii)开始后不晚于30小时(例如在步骤(ii)开始后不晚于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时)进行；或(c)例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子是DNA分子。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子是RNA分子。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子在病毒载体(例如，选自慢病毒载体、腺病毒载体、或逆转录病毒载体的病毒载体)上。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子在非病毒载体上。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子在质粒上。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子不在任何载体上。在一些实施例中，步骤(ii)包括用一种或多种包含编码CAR的核酸分子的病毒载体转导细胞(例如，T细胞)群体。
在一些实施例中，从受试者的单采样品(例如，白细胞单采样品)收集细胞(例如，T细胞)群体。
在一些实施例中，从受试者收集的单采样品(例如，白细胞单采样品)并作为冷冻样品(例如，冷冻保存的样品)运输至细胞制造设施。然后解冻冷冻的单采样品，并从单采样品中选择T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如，
Figure BDA0003991130860002711
Figure BDA0003991130860002712
装置)。然后使用本文所述的活化过程接种所选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)用于CART制造。在一些实施例中，选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)在接种用于CART制造之前经历一轮或多轮冻融。
在一些实施例中，从受试者收集的单采样品(例如，白细胞单采样品)并作为新鲜的产品(例如，不冷冻的样品)运输至细胞制造设施。从单采样品中选择T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如，
Figure BDA0003991130860002713
装置)。然后使用本文所述的活化过程接种所选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)用于CART制造。在一些实施例中，选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)在接种用于CART制造之前经历一轮或多轮冻融。
在一些实施例中，从受试者收集单采样品(例如，白细胞单采样品)。从单采样品中选择T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如，
Figure BDA0003991130860002721
装置)。然后将选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)作为冷冻样品(例如，冷冻保存的样品)运输至细胞制造设施。随后解冻所选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)并使用本文所述的活化过程接种用于CART制造。
在一些实施例中，使细胞(例如，T细胞)与抗CD3和抗CD28抗体接触例如12小时，随后用编码CAR的载体(例如，慢病毒载体)(例如，一种或多种载体)转导。培养开始后24小时，洗涤细胞，并配制用于储存或施用。
不希望受理论束缚，简短的CD3和CD28刺激可以促进自我更新T细胞的有效转导。与传统的CART制造方法相比，本文提供的活化过程不涉及延长的离体扩增。与细胞因子过程类似，本文提供的活化过程还在CART制造期间保留未分化的T细胞。
在一些实施例中，使细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的药剂接触。
在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂是刺激CD3的药剂。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何组合的药剂。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28的药剂。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂选自抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段、或scFv)、小分子、或配体(例如天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂是抗体。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂是抗-CD3抗体。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂选自抗体(例如，单结构域抗体(例如，重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段、或scFv)、小分子、或配体(例如，天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是抗体。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是抗CD28抗体。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂或刺激共刺激分子的药剂不包含珠。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD3抗体。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD28抗体。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂和刺激共刺激分子的药剂包含T细胞TransActTM。
在一些实施例中，该基质包含聚合物或由其组成，例如，可生物降解或生物相容的惰性材料，例如，其对细胞无毒。在一些实施例中，该基质由亲水性聚合物链组成，由于链的水合作用，其在水溶液中获得最大的移动性。在一些实施例中，该移动基质可以是胶原蛋白、纯化的蛋白质、纯化的肽、多糖、糖胺聚糖或细胞外基质组合物。多糖可包括例如纤维素醚、淀粉、阿拉伯树胶、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、透明质酸、果胶、黄原胶、瓜尔胶或海藻酸盐。其他聚合物可包括聚酯、聚醚、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚胺、聚乙烯亚胺、聚季铵盐聚合物、聚磷腈、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、嵌段共聚物或聚氨酯。在一些实施例中，移动基质是葡聚糖的聚合物。
在一些实施例中，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，用编码CAR的DNA分子转导细胞群体。
在一些实施例中，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触，同时使细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、或0.5小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于20小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于19小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于18小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于17小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于16小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于15小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于14小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于14小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于13小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于12小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于11小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于10小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于9小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于8小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于7小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于6小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于5小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于4小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于3小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于2小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于1小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于30小时，使细胞群体与编码CAR的一种或多种核酸分子接触。
在一些实施例中，收获细胞群体用于储存或施用。
在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于72、60、48、36、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、或18小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于26小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于25小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于24小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于23小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于22小时，收获细胞群体用于储存或施用。
在一些实施例中，细胞群体不是离体扩增的。
在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过5％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过10％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过15％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过20％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过25％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过30％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过35％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过40％。
在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、16、20、24、36、或48小时。
在一些实施例中，该活化过程在无血清细胞培养基中进行。在一些实施例中，该活化过程在包含一种或多种选自以下的细胞因子的细胞培养基中进行：IL-2、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、或IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)。在一些实施例中，hetIL-15包含NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQG(SEQ ID NO:3003)的氨基酸序列。在一些实施例中，hetIL-15包含与SEQ ID NO:3003具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该活化过程在包含LSD1抑制剂的细胞培养基中进行。在一些实施例中，该活化过程在包含MALT1抑制剂的细胞培养基中进行。在一些实施例中，无血清细胞培养基包含血清替代物。在一些实施例中，血清替代物是CTSTM免疫细胞血清替代物(ICSR)。在一些实施例中，ICSR的水平可以是，例如，高达5％，例如，约1％、2％、3％、4％或5％。
在一些实施例中，本披露提供了制备表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如，T细胞)群体的方法，这些方法包括：(a)提供从受试者收集的单采样品(例如，新鲜或冷冻保存的白细胞单采样品)；(b)从单采样品中选择T细胞(例如，使用阴性选择、阳性选择或无珠选择)；(c)将分离的T细胞接种，例如，1x106至1x107个细胞/mL；(d)使T细胞与刺激T细胞的药剂接触，例如，刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的药剂(例如，使T细胞与抗CD3和/或抗CD28抗体接触，例如，使T细胞与TransAct接触)；(e)使T细胞与编码CAR的一种或多种核酸分子(例如，DNA或RNA分子)接触(例如，使T细胞与包含编码CAR的一种或多种核酸分子接触)例如，6-48小时，例如，20-28小时；以及(f)洗涤和收获T细胞用于储存(例如，在冷冻保存培养基中重新配制T细胞)或施用。在一些实施例中，步骤(f)在步骤(d)或(e)开始后不迟于30小时进行，例如在步骤(d)或(e)开始后不迟于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时。
在一些实施例中，本文提供的细胞群体是由本文所述的任何制造过程(例如，本文所述的活化过程)制备的细胞(例如，免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞)群体。
在一些实施例中，在制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比，与制造过程开始时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程开始时)细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相比(1)相同，(2)相差例如不超过4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、或15％，或(3)增加例如至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、或25％。在一些实施例中，与通过除持续例如，超过26小时(例如，持续超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)或涉及在体外扩增细胞群体持续，例如超过3天(例如，在体外扩增细胞群体持续3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15天)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)的细胞群体显示出更高百分比的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)(例如，至少高5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％)。
在一些实施例中，在制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比不少于20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％。
在一些实施例中，在制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)细胞群体中的中枢记忆细胞(例如，中枢记忆T细胞，例如，CD95+中枢记忆T细胞)的百分比与制造过程开始时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程开始时)细胞群体中的中枢记忆细胞(例如，中枢记忆T细胞，例如，CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相比(1)相同，(2)相差例如不超过4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、或15％，或(3)减少例如至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、或25％。在一些实施例中，与通过除持续，例如，超过26小时(例如，持续超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)或涉及在体外扩增细胞群体，例如，超过3天(例如，在体外扩增细胞群体3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15天)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)的细胞群体显示出更低百分比的中枢记忆细胞，例如，中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞(例如，至少低5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％)。
在一些实施例中，在制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如，中枢记忆T细胞，例如，CD95+中枢记忆T细胞的百分比不超过40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、或80％。
在一些实施例中，与通过除持续，例如，超过26小时(例如，持续超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)或涉及在体外扩增细胞群体，例如，超过3天(例如，在体外扩增细胞群体3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15天)外其他方面类似的方法制造的细胞相比，制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)的细胞群体在体内施用后持续更长时间或以更高水平上扩增(例如，至少高20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％)。
在一些实施例中，在制造过程开始前(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程开始前)，已经富集了用于表达IL6R的细胞(例如，IL6Rα和/或IL6Rβ阳性的细胞)的细胞群体。在一些实施例中，在制造过程开始时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程开始时)，细胞群体包括，例如，不少于30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、或80％的表达IL6R的细胞(例如，IL6Rα和/或IL6Rβ阳性的细胞)。
细胞因子过程
在一些实施例中，本披露提供了制备表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如，T细胞)群体的方法，这些方法包括：(1)使细胞群体与细胞因子(选自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-6，或其组合)接触；(2)使细胞(例如，T细胞)群体与编码CAR的一种或多种核酸分子(例如，DNA或RNA分子)接触，从而提供包含核酸分子的细胞(例如，T细胞)群体；和(3)收获细胞(例如，T细胞)群体，以用于储存(例如，在冷冻保存培养基中重新配制细胞群体)或施用，其中：(a)步骤(2)与步骤(1)一起进行，或在步骤(1)开始后不晚于5小时(例如在步骤(1)开始后不晚于1、2、3、4、或5小时)进行，并且步骤(3)在步骤(1)开始后不晚于26小时(例如在步骤(1)开始后不晚于22、23、或24小时，例如在步骤(1)开始后不晚于24小时)进行；或(b)例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％(例如，不超过10％)。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子是DNA分子。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子是RNA分子。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子在病毒载体(例如选自慢病毒载体、腺病毒载体、或逆转录病毒载体的病毒载体)上。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子在非病毒载体上。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子在质粒上。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子不在任何载体上。在一些实施例中，步骤(2)包括用包含编码CAR的一个或多个核酸分子的病毒载体转导细胞(例如T细胞)群体。
在一些实施例中，从受试者的单采样品(例如，白细胞单采样品)收集细胞(例如，T细胞)群体。
在一些实施例中，从受试者收集的单采样品(例如，白细胞单采样品)并作为冷冻样品(例如，冷冻保存的样品)运输至细胞制造设施。然后解冻冷冻的单采样品，并从单采样品中选择T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如，
Figure BDA0003991130860002821
Figure BDA0003991130860002822
装置)。然后使用本文所述的细胞因子过程接种所选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)用于CART制造。在一些实施例中，在细胞因子过程结束时，将CAR T细胞冷冻保存，然后解冻并施用受试者。在一些实施例中，选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)在接种用于CART制造之前经历一轮或多轮冻融。
在一些实施例中，从受试者收集的单采样品(例如，白细胞单采样品)并作为新鲜的产品(例如，不冷冻的样品)运输至细胞制造设施。从单采样品中选择T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如，
Figure BDA0003991130860002823
装置)。然后使用本文所述的细胞因子过程接种所选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)用于CART制造。在一些实施例中，选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)在接种用于CART制造之前经历一轮或多轮冻融。
在一些实施例中，从受试者收集单采样品(例如，白细胞单采样品)。从单采样品中选择T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如，
Figure BDA0003991130860002831
装置)。然后将选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)作为冷冻样品(例如，冷冻保存的样品)运输至细胞制造设施。随后解冻所选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)并使用本文所述的细胞因子过程接种用于CART制造。
在一些实施例中，在细胞(例如，T细胞)接种后，将一种或多种细胞因子(例如选自IL-2、IL-7、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、或IL-6(例如IL-6/sIL-6R)中的一种或多种的细胞因子)以及编码CAR的载体(例如慢病毒载体)(例如一个或多个载体)添加至细胞中。孵育20-24小时后，洗涤细胞，并配制用于储存或施用。
与传统的CART制造方法不同，本文提供的细胞因子过程不涉及CD3和/或CD28刺激或离体T细胞扩增。与抗CD3和抗CD28抗体接触并且离体广泛扩增的T细胞倾向于显示向中枢记忆表型的分化。不希望受理论束缚，本文提供的细胞因子过程在CART制造期间保留或增加T细胞的未分化表型，产生可在输注入至受试者后持续更长时间的CART产物。
在一些实施例中，使细胞群体与一种或多种细胞因子接触(例如，一种或多种选自IL-2、IL-7、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、或IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)的细胞因子)。
在一些实施例中，使细胞群体与IL-2接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-7接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-21接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-2和IL-7接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-2和IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-2和IL-21接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-2和IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-7和IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-7和IL-21接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-7和IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-21接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-21和IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-7、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、和IL-21接触。在一些实施例中，使细胞群体进一步与LSD1抑制剂接触。在一些实施例中，使细胞群体进一步与MALT1抑制剂接触。
在一些实施例中，使细胞群体与20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、或300U/ml的IL-2接触。在一些实施例中，使细胞群体与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20ng/ml的IL-7接触。在一些实施例中，使细胞群体与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20ng/ml的IL-15接触。
在一些实施例中，使细胞群体与编码CAR的核酸分子(例如一种或多种核酸分子)接触。在一些实施例中，用编码CAR的DNA分子转导细胞群体。
在一些实施例中，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触同时使细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于5小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于4小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于3小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于2小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于1小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。
在一些实施例中，收获细胞群体用于储存或施用。
在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于72、60、48、36、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、或18小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于26小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于25小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于24小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于23小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于22小时，收获细胞群体用于储存或施用。
在一些实施例中，细胞群体不是离体扩增的。
在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过5％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过10％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过15％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过20％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过25％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过30％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过35％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过40％。
在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、16、20、24、36、或48小时。
在一些实施例中，细胞群体在体外不与刺激CD3/TCR复合物的药剂(例如抗CD3抗体)和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的药剂(例如抗CD28抗体)接触，或如果进行接触，接触步骤少于1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、或5小时。
在一些实施例中，细胞群体在体外与刺激CD3/TCR复合物的药剂(例如抗CD3抗体)和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的药剂(例如抗CD28抗体)接触20、21、22、23、24、25、26、27、或28小时。
在一些实施例中，与通过除进一步包括使细胞群体与例如，结合CD3/TCR复合物的药剂(例如，抗CD3抗体)和/或结合细胞表面上的共刺激分子的药剂(例如，抗CD28抗体)接触外其他方面类似的方法制备的细胞相比，使用本文提供的细胞因子过程制造的细胞群体显示出在表达CAR的细胞中更高百分比的初始细胞(例如，至少高5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％)。
在一些实施例中，本文提供的细胞因子过程在包含不超过0％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、或8％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，本文提供的细胞因子过程在包含LSD1抑制剂、MALT1抑制剂或其组合的细胞培养基中进行。
其他示例性制造方法
在一些实施例中，将细胞(例如，T细胞或NK细胞)活化，例如，使用包被
Figure BDA0003991130860002871
的抗CD3/抗CD28抗体与编码CAR的一个或多个核酸分子接触，然后在体外扩增，例如7、8、9、10或11天。在一些实施例中，细胞(例如，T细胞或NK细胞)选自新鲜或冷冻保存的白细胞单采样品，例如，使用阳性或阴性选择。在一些实施例中，使细胞与编码CAR(例如CD19 CAR)的核酸分子接触。
淘洗
在一些实施例中，本文描述的方法的特征在于淘洗方法，其去除不需要的细胞，例如单核细胞和胚细胞，从而导致适合CAR表达的所需免疫效应细胞的富集改进。在一些实施例中，本文所述的淘洗方法针对从先前冷冻的样品(例如，解冻的样品)富集适合CAR表达的所希望的免疫效应细胞进行了优化。在一些实施例中，与从本领域已知的淘洗方案收集的细胞制剂相比，本文所述的淘洗方法提供了具有改进的纯度的细胞制剂。在一些实施例中，本文所述的淘洗方法包括使用起始样品(例如，细胞样品，例如，解冻的细胞样品)优化的粘度，通过用某些等渗溶液(例如，PBS)稀释，并使用流速的优化组合并通过淘洗装置收集的每个级分的收集体积。可应用于本披露的示例性淘洗方法描述于WO2017/117112的第48-51页，将其通过引用以其全文并入本文。
密度梯度离心
过继性细胞治疗产品的制造需要使所希望的细胞(例如，免疫效应细胞)远离外周血单采起始材料中存在的血细胞和血液成分的复杂混合物。通过Ficoll溶液使用密度梯度离心成功分离了外周血衍生的淋巴细胞样品。然而，Ficoll不是用于分离治疗用细胞的优选试剂，因为Ficoll不适合临床使用。此外，Ficoll含有乙二醇，它对细胞有潜在毒性。此外，冷冻保存后解冻的单采产物的Ficoll密度梯度离心产生次优的T细胞产物。例如，在通过Ficoll溶液的密度梯度离心分离的细胞制剂中观察到最终产物中T细胞的损失，伴随非T细胞的相对增加，尤其是不希望的B细胞、胚细胞和单核细胞。
不希望受理论束缚，据信免疫效应细胞(例如T细胞)在冷冻保存期间脱水，变得比新鲜的细胞更稠密。不希望受理论束缚，还据信免疫效应细胞(例如T细胞)比其他血细胞保持密集更久，因此与其他细胞相比，在Ficoll密度梯度分离期间更容易丢失。因此，不希望受理论束缚，与Ficoll或具有与Ficoll相同密度(例如，1.077g/mL)的其他培养基相比，认为密度大于Ficoll的培养基提供了所希望的免疫效应细胞的改进的分离。
在一些实施例中，本文所述的密度梯度离心方法包括使用包含碘克沙醇的密度梯度培养基。在一些实施例中，密度梯度培养基包含约60％的碘克沙醇于水中的溶液。
在一些实施例中，本文所述的密度梯度离心方法包括使用具有密度大于Ficoll的密度梯度培养基。在一些实施例中，本文所述的密度梯度离心方法包括使用密度梯度培养基，该密度梯度培养基具有大于1.077g/mL，例如，大于1.077g/mL、大于1.1g/mL、大于1.15g/mL、大于1.2g/mL、大于1.25g/mL、大于1.3g/mL、大于1.31g/mL的密度。在一些实施例中，该密度梯度培养基具有约1.32g/mL的密度。
密度梯度离心的另外的实施例描述于WO 2017/117112的第51-53页，将其通过引用以其全文并入本文。
通过选择富集
本文提供了选择特定细胞以改进适合CAR表达的所希望的免疫效应细胞富集的方法。在一些实施例中，选择包含阳性选择，例如，选择所需的免疫效应细胞。在一些实施例中，选择包含阴性选择，例如，选择不需要的细胞，例如，去除不需要的细胞。在实施例中，本文所述的阳性或阴性选择方法在流动条件下进行，例如，通过使用流通装置，例如本文所述的流通装置。示例性的阳性和阴性选择描述于WO 2017/117112的第53-57页，将其通过引用以其全文并入本文。选择方法可以在流动条件下进行，例如，通过使用流通装置，也称为细胞加工系统，以进一步富集所希望的免疫效应细胞(例如，适合用于CAR表达的T细胞)的细胞制剂。示例性的流通装置描述于WO 2017/117112的第57-70页，将其通过引用以其全文并入本文。示例性细胞分离和去珠方法描述于WO 2017/117112的第70-78页，将其通过引用以其全文并入本文。
选择程序不限于WO 2017/117112的第57-70页所述的程序。可以使用经由CD19、CD14和CD26 Miltenyi珠与柱技术(
Figure BDA0003991130860002891
Plus或
Figure BDA0003991130860002892
)组合去除不需要的细胞进行阴性T细胞选择，或可以使用CD4和CD8美天旎珠与柱技术的组合进行阳性T细胞选择(
Figure BDA0003991130860002893
Plus或
Figure BDA0003991130860002894
)。可替代地，可以使用具有可释放CD3珠的无柱技术(GE医疗集团(GE Healthcare))。
此外，还可以使用诸如ThermoGenesis X系列装置的无珠技术。
临床应用
本文的所有过程均可根据临床优质生产规范(cGMP)标准进行。
这些过程可用于细胞纯化、富集、收获、洗涤、浓缩或用于细胞培养基交换，特别是在制造过程开始时以及制造过程中收集原始起始原料(特别地细胞)用于选择或扩增用于细胞疗法的细胞。
这些细胞可包括任意多个细胞。这些细胞可以是相同的细胞类型，或混合的细胞类型。此外，这些细胞可以来自一个供体，例如用于细胞疗法的自体供体或单个异体供体。可以通过例如白细胞单采或单采从患者获得细胞。这些细胞可以包括T细胞，例如可以包括具有大于50％T细胞、大于60％T细胞、大于70％T细胞、大于80％T细胞、或90％T细胞的群体。
选择过程在培养和扩增前选择细胞时特别有用。例如，用抗CD3和/或抗CD28涂覆的顺磁性颗粒可用于选择T细胞用于扩增或用于引入编码嵌合抗原受体(CAR)或其他蛋白质的核酸。此类过程用于产生CTL019 T细胞用于治疗急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
本文披露的去珠过程和模块可特别用于制造用于细胞疗法的细胞，例如在培养和扩增之前或之后纯化细胞。例如，涂覆有抗CD3和/或抗CD28抗体的顺磁性颗粒可用于选择性扩增T细胞，例如通过引入编码嵌合抗原受体的核酸(CAR)或其他蛋白质被修饰的或将要被修饰的T细胞，使得CAR由T细胞表达。在制造此类T细胞期间，可以使用去珠过程或模块将T细胞与顺磁性颗粒分离。这种去珠过程或模块用于产生例如用于治疗急性淋巴细胞性白血病(ALL)的CTL019 T细胞。
在这里举例说明的一个此类过程中，经由单采(例如，白细胞单采)从供体(例如，用自体嵌合抗原受体T细胞产物治疗的患者)收集细胞(例如T细胞)。然后可以任选地纯化收集的细胞，例如，通过淘洗步骤、或经由靶细胞(例如，T细胞)的阳性或阴性选择。然后可以将顺磁性颗粒，例如抗CD3/抗CD28涂覆的顺磁颗粒添加到细胞群体中，以扩增T细胞。该过程还可包括转导步骤，其中将编码一种或多种所希望的蛋白质的核酸，例如CAR，例如靶向CD19的CAR，引入细胞中。可以将核酸引入慢病毒载体中。然后可以将细胞(例如，慢病毒转导的细胞)扩增数天，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天，例如在存在合适的培养基的情况下。在扩增之后，本文披露的去珠过程/模块可用于将所希望的T细胞与顺磁性颗粒分离。该过程可包括根据本披露的过程的一个或多个去珠步骤。然后可以配制去珠细胞用于施用给患者。CAR T细胞的实例及其制造进一步描述于例如WO 2012/079000中，其通过引用以其全文并入本文。本披露的系统和方法可以用于WO 2012/079000中描述的或与WO 2012/079000相关的任何细胞分离/纯化/去珠过程。另外的CAR T制造过程描述于例如WO2016109410和WO 2017117112中，其通过引用以其全文并入本文。
与常规系统和方法相比，本文的系统和方法可以类似地有益于其他细胞疗法产品，其浪费较少的所希望的细胞，引起较少的细胞损伤，并且更可靠地从细胞中去除磁性和任何非顺磁性颗粒，且较少的暴露于化学药剂或不暴露。
尽管上文仅具体描述了本披露的示例性实施例，但是应当理解，在不脱离本披露的精神和预期范围的情况下，这些示例的修改和变化是可能的。例如，除了所描述的那些之外，磁性模块和包含它们的系统可以以各种配制来布置和使用。此外，也可以使用非磁性模块。此外，这些系统和方法可以包括未在本文特别描述的另外的组件和步骤。例如，方法可以包括预注，其中首先将流体引入组件中以去除气泡并降低对细胞悬浮液或缓冲液移动的阻力。此外，实施例可以仅包括本文描述的系统的一部分以与本文所述的方法一起使用。例如，实施例可涉及可在非一次性设备中使用的一次性模块、软管等，以形成能够分离或去珠细胞以产生细胞产物的完整系统。
在本领域中已经描述了可以与本披露结合的另外的制造方法和过程。例如，WO2017/117112的第86-91页描述了改进的洗涤步骤和改进的制造过程。
T细胞的活化和扩增
T细胞通常可以使用例如美国专利6,352,694、6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005。
通常，本披露的T细胞可以通过与表面接触而扩增，该表面与刺激CD3/TCR复合物相关的信号的药剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体附接。特别地，可以如本文所描述刺激T细胞群体，如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段、或抗CD2抗体接触，或通过与结合有钙离子载体的蛋白激酶C活化剂(例如苔藓抑素)接触。对于T细胞表面上辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+ T细胞或CD8+ T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。可以使用抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(法国贝桑松Diaclone公司(Diaclone,
Figure BDA0003991130860002921
France))，还可以使用本领域公知的其他方法(Berg等人,Transplant Proc.[移植学会会报]30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.[免疫学杂志]227(1-2):53-63,1999)。
在某些实施例中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以由不同的方案提供。例如，提供每个信号的药剂可以在溶液中或偶联到表面。当偶联到表面时，药剂可以偶联到同一表面(即，为“顺式”形成)或偶联到分离表面(即，为“反式”形成)。替代性地，可以将一种药剂偶联到表面并且使另一种药剂在溶液中。在一些实施例中，将提供共刺激信号的药剂与细胞表面结合，并且使提供初级活化信号的药剂在溶液中或偶联到表面。在某些实施例中，两种药剂都可以在溶液中。在一些实施例中，这些药剂可以为可溶形式，并且然后交联到表面，如表达Fc受体的细胞或将与这些药剂结合的抗体或其他结合剂。在这点上，参见例如，美国专利申请公开号20040101519和20060034810的人工抗原呈递细胞(aAPC)，考虑将其用于活化和扩增本披露内容中的T细胞。
在一些实施例中，将两种药剂固定在珠上，或者在相同的珠上(即“顺式”)，或者在分离的珠上(即“反式”)。通过举例，提供初级活化信号的药剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的药剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且将两种药剂以等效分子量共固定到同一珠。在一些实施例中，使用针对CD4+ T细胞扩增和T细胞生长的与珠结合的每种抗体的1:1的比率。在本披露内容的某些方面，使用与珠结合的抗CD3:CD28抗体的比率，使得与使用1:1比率观察到的扩增相比观察到T细胞扩增的增加。在一些实施例中，与使用1:1比率观察到的扩增相比，观察到从约1倍至约3倍的增加。在一些实施例中，与珠结合的CD3:CD28抗体的比率范围为从100:1至1:100以及其间的所有整数值。在本披露的一些实施例中，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3:CD28的比率小于1。在本披露的某些实施例中，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一些实施例中，使用与珠结合的抗体的1:100CD3:CD28比率。在一些实施例中，使用与珠结合的抗体的1:75CD3:CD28比率。在一些实施例中，使用与珠结合的抗体的1:50CD3:CD28比率。在一些实施例中，使用与珠结合的抗体的1:30CD3:CD28比率。在一些实施例中，使用与珠结合的抗体的1:10CD3:CD28比率。在一些实施例中，使用与珠结合的抗体的1:3CD3:CD28比率。在又一些实施例中，使用与珠结合的抗体的3:1CD3:CD28比率。
颗粒与细胞的比率为从1:500至500:1以及其间的任何整数值可以用于刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易地理解的，颗粒与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的颗粒尺寸。例如，小尺寸的珠仅可以结合少量细胞，而较大的珠可以结合许多细胞。在某些实施例中，范围从1:100至100:1以及其间的任何整数值的细胞与颗粒的比率，以及在另外的实施例中，包括1:9至9:1的比率以及其间的任何整数值也可以用于刺激T细胞。如以上所指出，导致T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶联颗粒与T细胞的比率可以变化，然而某些优选的值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、和15:1，其中一个优选的比率是每个T细胞至少1:1个颗粒。在一些实施例中，使用1:1或更小的颗粒与细胞比率。在一些实施例中，优选的颗粒与细胞的比率为1:5。在另外的实施例中，颗粒与细胞的比率可以根据刺激日而变化。例如，在一些实施例中，颗粒与细胞的比率在第一天为从1:1至10:1，并且将另外的颗粒在之后每天或每隔一天加入到细胞中持续最长10天，最终比率为从1:1至1:10(基于添加当天的细胞计数)。在一些实施例中，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比率为1:1，并且在刺激的第三天和第五天调整为1:5。在一些实施例中，基于在第一天的最终比率为1:1并且在刺激的第三天和第五天为1:5，每天或每隔一天添加颗粒。在一些实施例中，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比率为2:1，并且在刺激的第三天和第五天调整为1:10。在一些实施例中，基于在第一天的最终比率为1:1并且在刺激的第三天和第五天为1:10，每天或每隔一天添加颗粒。本领域技术人员将理解，多种其他比率可以适用于本披露。特别地，比率将根据粒度和细胞大小和类型而变化。在一些实施例中，在第一天用于使用的最典型比率是1:1、2:1和3:1附近。
在本披露的另外的实施例中，将细胞(如T细胞)与药剂包被的珠组合，随后分离珠和细胞，并且然后培养细胞。在一些实施例中，在培养之前，不将药剂包被的珠和细胞分开而是一起培养。在一些实施例中，首先通过施加力(如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
通过举例，可以通过使抗CD3和抗CD28附着的顺磁珠(3x28珠)接触T细胞来连接细胞表面蛋白。在一些实施例中，将细胞(例如，104至109个T细胞)和珠(例如，比率为1:1的
Figure BDA0003991130860002941
M-450CD3/CD28 T顺磁珠)在缓冲液(例如PBS(不含二价阳离子(如钙和镁))中组合。同样，本领域的普通技术人员可易于理解可以使用任何细胞浓度。例如，靶标细胞在样品中可以非常稀少，仅占样品的0.01％，或者整个样品(即100％)可以包含所关注的靶标细胞。因此，任何细胞数量均在本披露的上下文中。在某些实施例中，可能希望显著减小其中颗粒和细胞混合在一起的体积(即增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一些实施例中，使用约100亿个细胞/ml、90亿个细胞/ml、80亿个细胞/ml、70亿个细胞/ml、60亿个细胞/ml、50亿个细胞/ml、或20亿个细胞/ml的浓度。在一些实施例中，使用大于1亿个细胞/ml。在一些实施例中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万、或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一些实施例中，使用0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另外的实施例中，可以使用125或150百万个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞活化、和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞。此类细胞群体可能具有治疗价值，并且在某些实施例中是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+ T细胞。
在一些实施例中，例如通过本文描述的方法扩增用编码CAR分子(例如本文描述的CAR分子)的核酸转导的细胞。在一些实施例中，使细胞在培养物中扩增数小时(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约14天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)的一段时间。在一些实施例中，使细胞扩增4至9天的一段时间。在一些实施例中，使细胞扩增8天或更少(例如，7、6或5天)的一段时间。在一些实施例中，使细胞(例如本文所述的表达CAR的细胞)在培养物中扩增5天，并且所得细胞比在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞更有效。效力可以例如通过各种T细胞功能来定义，例如增殖、靶细胞杀伤、细胞因子产生、活化、迁移、或其组合。在一些实施例中，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞(例如本文所述的表达CAR的细胞)在抗原刺激后显示细胞倍增至少增加一倍、两倍、三倍或四倍。在一些实施例中，使细胞(例如，本文所述的表达CAR分子的细胞)在培养物中扩增5天，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，所得的细胞表现出更高的促炎细胞因子产生(例如，IFN-γ和/或GM-CSF水平)。在一些实施例中，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞(例如，本文所述的表达CAR的细胞)显示出促炎细胞因子产生(例如，IFN-γ和/或GM-CSF水平)以pg/ml计增加至少一倍、二倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更多倍。
在本披露的一些实施例中，可以将混合物培养数小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。在一些实施例中，可以将混合物培养21天。在本披露的一些实施例中，将珠和T细胞一起培养约八天。在一些实施例中，将珠和T细胞一起培养2-3天。还可能希望进行几个刺激循环，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，Minimal Essential Media或RPMI Media 1640或X-vivo 15，(龙沙公司(Lonza)))，该培养基可以含有增殖和活力所必需的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ、和TNF-α或本领域技术人员已知用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白制品、和还原剂(如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇)。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、和X-Vivo20、优化剂，其中添加氨基酸、丙酮酸钠、和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素、和/或足以使T细胞生长和扩增的一定量细胞因子。抗生素(例如青霉素和链霉素)仅包含在实验培养物中，而不包含在有待注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和大气(例如空气加5％CO2)。
在一些实施例中，使细胞在包括一种或多种白介素的适当介质(例如本文描述的介质)中扩增，该白介素导致在14天的扩增期间细胞增加至少200倍(例如200倍、250倍、300倍、350倍)，例如如通过本文描述的方法(如流式细胞术)测量。在一些实施例中，细胞在IL-15和/或IL-7(例如，IL-15和IL-7)的存在下扩增。
在实施例中，本文描述的方法(例如表达CAR的细胞制造方法)包括例如使用抗CD25抗体或其片段，或CD25结合配体IL-2从细胞群体除去T调节细胞(例如CD25+ T细胞)。本文描述了从细胞群体除去T调节细胞(例如CD25+ T细胞)的方法。在实施例中，这些方法(例如制造方法)进一步包括使细胞群体(例如，其中T调节性细胞，如CD25+T细胞已经被耗减的细胞群体；或先前已接触抗CD25抗体其片段，或CD25结合配体的细胞群体)与IL-15和/或IL-7接触。例如，使细胞群体(例如先前已接触抗CD25抗体、其片段，或CD25-结合配体)在IL-15和/或IL-7存在下扩增。
在一些实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Ra)多肽，或IL-15多肽和IL-15Ra多肽(例如，hetIL-15)两者的组合的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽两者的组合的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物接触。
在一些实施例中，在离体扩增过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物接触。在一些实施例中，在离体扩增过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物接触。在一些实施例中，在离体扩增过程中，本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽两者的组合物接触。在一些实施例中，该接触导致淋巴细胞亚群(例如CD8+ T细胞)的存活和增殖。
已暴露于不同刺激时间的T细胞可以表现出不同的特征。例如，典型的血液或外周血单核细胞产物具有辅助T细胞群(TH，CD4+)，其大于细胞毒性或抑制性T细胞群。通过刺激CD3和CD28受体离体扩增T细胞产生T细胞群体，该T细胞群体在约8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约8-9天之后，该T细胞群体包含越来越多的TC细胞群体。因此，取决于治疗目的，向受试者输注主要包含TH细胞的T细胞群体可能是有利的。类似地，如果已分离了TC细胞的抗原特异性子集，则将该子集扩增到更大程度可能是有益的。
此外，在细胞扩增过程期间，除CD4和CD8标志物之外，其他表型标志物显著地，但在很大程度上，可重复地变化。因此，这种可重复性使得能够针对特定目的定制活化的T细胞产物。
一旦构建CAR分子，可以使用各种测定来评价分子活性，例如但不限于：在抗原刺激后扩增T细胞、在没有再刺激的情况下维持T细胞扩增的能力，以及在适当的体外和动物模型中的抗癌活性。评估CAR分子效果的测定法在下面进一步详细描述。
原代T细胞中CAR分子表达的蛋白质印迹分析可用于检测单体和二聚体的存在。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。非常简单地，表达CAR分子的T细胞(CD4+和CD8+ T细胞的1:1混合物)在体外扩增超过10天，随后在还原条件下进行裂解和SDS-PAGE。使用针对TCR-ζ链的抗体通过蛋白质印迹来检测含有全长TCR-ζ胞质结构域和内源性TCR-ζ链的CAR分子。相同的T细胞亚群用于在非还原条件下的SDS-PAGE分析，以允许评估共价二聚体的形成。
可以通过流式细胞术测量抗原刺激后CAR T细胞的体外扩增。例如，将CD4+和CD8+T细胞的混合物用αCD3/αCD28 aAPC刺激，随后用在待分析的启动子的控制下表达GFP的慢病毒载体转导。示例性启动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C、或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。通过流式细胞术，在培养的第6天在CD4+和/或CD8+ T细胞亚群中评估GFP荧光。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。替代性地，在第0天将CD4+和CD8+ T细胞的混合物用被αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，并在第1天用CAR转导，使用表达CAR连同eGFP(使用2A核糖体跳跃序列)的多顺反子慢病毒载体。在洗涤后，用表达抗原的细胞(如表达该抗原的多发性骨髓瘤细胞系或K562)再刺激培养物。每隔一天以100IU/ml向培养基中添加外源IL-2。使用基于珠的计数通过流式细胞术计算GFP+ T细胞。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。
还可以测量在没有再刺激的情况下持续的CAR+ T细胞扩增。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，以及在第1天用指示的CAR转导后，使用Coulter Multisizer III粒子计数器、Nexcelom Cellometer Vision或Millipore Scepter在培养的第8天测量平均T细胞体积(fl)。
动物模型也可用于测量CART活性。例如，可以使用利用人抗原特异性CAR+ T细胞来治疗免疫缺陷小鼠中的原发性人多发性骨髓瘤的异种移植模型。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在建立MM后，将小鼠随机分配至治疗组。可以将不同数量的CAR T细胞注射至携带MM的免疫缺陷小鼠中。以每周一次的间隔评估动物的疾病进展和肿瘤负荷。使用时序检验比较组的存活曲线。此外，还可以分析免疫缺陷小鼠中T细胞注射后4周的绝对外周血CD4+和CD8+ T细胞计数。给小鼠注射多发性骨髓瘤细胞，并在3周后注射经工程化以表达CAR分子的T细胞。通过在注射前与模拟转导的细胞混合将T细胞归一化为45％-50％输入的GFP+ T细胞，并通过流式细胞术确认。在1周的间隔评估动物的白血病。使用时序检验比较CAR T细胞组的存活曲线。
先前已经描述了细胞增殖和细胞因子产生的评估，例如在Milone等人,MolecularTherapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)中。简而言之，通过将洗涤的T细胞与表达抗原的K562细胞混合来在微量滴定板中进行CAR IL-15R/IL-15介导的增殖的评估，或在使用前用γ辐射照射其他表达抗原的骨髓瘤细胞。将抗CD3(克隆OKT3)和抗CD28(克隆9.3)单克隆抗体添加至具有KT32-BBL细胞的培养基以用作用于刺激T细胞增殖的阳性对照，因为这些信号支持长期CD8+ T细胞离体扩增。使用CountBrightTM荧光珠(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州(Carlsbad，CA))和流式细胞术(如由制造商描述的)在培养基中计数T细胞。使用用eGFP-2A连接的表达CAR的慢病毒载体进行工程化的T细胞，通过GFP表达来鉴定CAR T细胞。对于不表达GFP的CAR阳性T细胞，用生物素化的重组抗原蛋白和二级抗生物素蛋白-PE缀合物来检测CAR+ T细胞。还用特异性单克隆抗体(BD生物科学公司(BDBiosciences))同时检测T细胞上的CD4+和CD8+表达。根据制造商的说明书，使用人TH1/TH2细胞因子细胞计数珠阵列试剂盒(BD生物科学公司(BD Biosciences)，圣地牙哥，加利福尼亚州)对再刺激后24小时收集的上清液进行细胞因子测量。使用FACScalibur流式细胞仪评估荧光，并根据制造商的说明书分析数据。
可通过标准51Cr释放测定来评估细胞毒性。参见例如，Milone等人,MolecularTherapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在37℃下将51Cr(作为NaCrO4，马萨诸塞州波士顿的新英格兰核公司(New England Nuclear,Boston,MA))加入靶细胞(例如，表达抗原的K562细胞系和原代多发性骨髓瘤细胞)2小时，频繁搅拌，在完全RPMI中洗涤两次，并接种至微量滴定板中。将效应T细胞与完全RPMI的孔中的靶细胞以不同比率的效应细胞:靶细胞(E:T)混合。还制备了仅含有培养基(自发释放，SR)或1％triton-X 100洗涤剂溶液(总释放，TR)的另外的孔。在37℃孵育4小时后，收获来自每个孔的上清液。然后使用γ颗粒计数器(帕卡德仪器公司(Packard Instrument Co.)，沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州)测量释放的51Cr。每种条件进行至少一式三份，并且使用下式计算裂解百分比：％裂解＝(ER-SR)/(TR-SR)，其中ER代表每种实验条件释放的平均51Cr。替代性地，也可以使用Bright-GloTM萤光素酶测定法评估细胞毒性。
成像技术可用于评估荷瘤的动物模型中表达CAR细胞的特定运输和增殖。例如，Barrett等人,Human Gene Therapy[人基因疗法]22:1575-1586(2011)中已经描述了此类测定。简而言之，给NOD/SCID/γc–/–(NSG)小鼠或其他免疫缺陷小鼠静脉内注射多发性骨髓瘤细胞，7天后用CAR或CAR构建体电穿孔，4小时后注射CART细胞。将T细胞用慢病毒构建体稳定转染以表达萤火虫荧光素酶，并将小鼠针对生物发光成像。替代性地，单次注射CAR+ T细胞在多发性骨髓瘤异种移植模型中的治疗效果和特异性可以如下所述测量：给NSG小鼠注射经转导为稳定表达萤火虫荧光素酶的多发性骨髓瘤细胞，然后在几天后进行单次尾静脉注射CAR构建体电穿孔的T细胞。在注射后的不同时间点对动物成像。例如，可以产生在第5天(处理前2天)和第8天(CAR+PBL后24小时)的代表性小鼠中萤火虫萤光素酶阳性肿瘤的光子密度热图。
可替代地，或者与本文披露的方法组合的，披露了用于以下的一种或多种的方法和组合物：CAR细胞的检测和/或定量(例如，体外或体内(例如，临床监测))；免疫细胞扩增和/或活化；和/或涉及使用CAR配体的CAR特异性选择。在一些实施例中，CAR配体是结合CAR分子的抗体，例如结合CAR的细胞外抗原结合结构域(例如，结合抗原结合结构域的抗体，例如抗独特型抗体；或与细胞外结合结构域的恒定区结合的抗体)。在其他实施例中，CAR配体是CAR抗原分子(例如，如本文所述的CAR抗原分子)。
在一些实施例中，披露了用于检测和/或定量表达CAR的细胞的方法。例如，CAR配体可用于体外或体内检测和/或定量CAR细胞(例如，临床监测患者中的表达CAR的细胞，或给患者给药)。该方法包括：
提供CAR配体(任选地，标记的CAR配体，例如包含标签、珠、放射性或荧光标记的CAR配体)；
获得表达CAR的细胞(例如，获得含有CAR细胞的样品，如制造样品或临床样品)；
在发生结合的条件下使表达CAR的细胞与CAR配体接触，从而检测存在的表达CAR的细胞的水平(例如，量)。可以使用标准技术如FACS、ELISA等检测表达CAR的细胞与CAR配体的结合。
在一些实施例中，披露了扩增和/或活化细胞(例如，免疫效应细胞)的方法。该方法包括：
提供表达CAR的细胞(例如，表达第一CAR的细胞或瞬时表达CAR的细胞)；
在发生免疫细胞扩增和/或增殖的条件下，使所述表达CAR的细胞与CAR配体(例如，如本文所述的CAR配体)接触，从而产生活化的和/或扩增的细胞群。
在一些实施例中，CAR配体存在于(例如，固定或附接至)底物(例如非天然存在的底物)上。在一些实施例中，底物是非细胞底物。非细胞底物可以是选自例如板(例如微量滴定板)、膜(例如硝酸纤维素膜)、基质、芯片或珠的固体支持物。在实施例中，CAR配体存在于底物中(例如，在底物表面上)。CAR配体可以与底物共价或非共价(例如，交联)固定、附接、或缔合。在一些实施例中，CAR配体与珠附接(例如，共价附接)。在前述实施例中，免疫细胞群可以在体外或离体扩增。该方法可以进一步包括在CAR分子的配体存在下培养免疫细胞的群，例如，使用本文所述的任何方法。
在其他实施例中，扩增和/或活化细胞的方法还包括添加第二刺激分子，例如CD28。例如，CAR配体和第二刺激分子可以固定在底物(例如一个或多个珠)上，从而提供增加的细胞扩增和/或活化。
在又一些实施例中，提供了用于选择或富集表达CAR的细胞的方法。该方法包括使表达CAR的细胞与如本文所述的CAR配体接触；以及根据CAR配体的结合选择细胞。
在其他实施例中，提供了用于消耗、减少和/或杀伤表达CAR的细胞的方法。该方法包括使表达CAR的细胞与如本文所述的CAR配体接触；并且基于CAR配体的结合靶向细胞，从而减少表达CAR的细胞的数量和/或杀伤表达CAR的细胞。在一些实施例中，CAR配体与毒性剂(例如，毒素或细胞消融药物)偶联。在一些实施例中，抗独特型抗体可以引起效应细胞活性，例如ADCC或ADC活性。
可用于本文披露的方法的示例性抗CAR抗体描述于例如WO 2014/190273和Jena等人,“Chimeric Antigen Receptor(CAR)-Specific Monoclonal Antibody to DetectCD19-Specific T cells in Clinical Trials[嵌合抗原受体(CAR)特异性单克隆抗体检测临床试验中CD19特异性T细胞]”,PLOS[公共科学图书馆综合]2013年3月8:3e57838中，该文献的内容通过援引并入。在一些实施例中，抗独特型抗体分子识别抗CD19抗体分子，例如抗CD19 scFv。例如，抗独特型抗体分子可以竞争与CD19特异性CAR mAb克隆号136.20.1的结合(描述于Jena等人,PLOS[公共科学图书馆综合]2013年3月8:3e57838)；可以与CD19特异性CAR mAb克隆号136.20.1具有相同的CDR(例如，使用卡巴特定义、乔西亚定义、或卡巴特和乔西亚定义的组合，VH CDR1，VH CDR2，CH CDR3，VL CDR1，VL CDR2和VL CDR3中的一个或多个)；可以与CD19特异性CAR mAb克隆号136.20.1具有一个或多个(例如，2个)可变区，或可包含CD19特异性CAR mAb克隆号136.20.1。在一些实施例中，根据Jena等人所述的方法制备抗独特型抗体。在一些实施例中，独特型抗体分子是WO 2014/190273中所述的抗独特型抗体分子。在一些实施例中，抗独特型抗体分子与WO 2014/190273的抗体分子(如，136.20.1)具有相同的CDR(例如，VH CDR1、VH CDR2、CH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的一个或多个，例如全部)；可以具有WO 2014/190273的抗体分子的一个或多个(例如，2个)可变区，或者可以包含WO 2014/190273的抗体分子(如136.20.1)。在其他实施例中，抗CAR抗体结合例如如WO 2014/190273中描述的CAR分子的细胞外结合结构域的恒定区。在一些实施例中，抗CAR抗体结合CAR分子的细胞外结合结构域的恒定区，例如重链恒定区(例如，CH2-CH3铰链区)或轻链恒定区。例如，在一些实施例中，抗CAR抗体竞争与WO 2014/190273中描述的2D3单克隆抗体的结合，该抗CAR抗体与如WO 2014/190273中描述的2D3具有相同的CDR(例如，VH CDR1、VH CDR2、CH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的一个或多个，例如全部)，或具有2D3的一个或多个(例如，2个)可变区，或包含2D3。
在一些实施例中，本文的组合物和方法针对特定T细胞亚群进行了优化，例如，如2014年7月31日提交的美国序列号62/031,699中所述，该专利的内容通过援引以其全文并入本文。在一些实施例中，与对照T细胞(例如，表达相同构建体的不同类型的T细胞(例如，CD8+或CD4+))相比，优化的T细胞亚群显示了增强的持久性。
在一些实施例中，CD4+ T细胞包含本文所述的CAR分子，该CAR分子包含适合于(例如，优化，例如，导致增强的持久性)CD4+ T细胞(例如ICOS域)的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，CD8+ T细胞包含本文所述的CAR分子，该CAR分子包含适合于(例如，优化，例如，导致增强的持久性)CD8+ T细胞(例如，4-1BB域、CD28域，或ICOS域以外的其他共刺激结构域)的细胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，本文描述了治疗受试者的方法，例如患有癌症的受试者。该方法包括向所述受试者施用有效量的：
1)包含CAR分子的CD4+ T细胞(CARCD4+)
所述方法包括：
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；以及
细胞内信号传导结构域，例如第一共刺激结构域，例如ICOS域；以及
2)包含CAR分子的CD8+ T细胞(CARCD8+)，该CAR分子包含：
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；以及
细胞内信号传导结构域，例如第二共刺激结构域，例如4-1BB域、CD28域、或除ICOS域之外的另一种共刺激结构域；
其中CARCD4+和CARCD8+彼此不同。
任选地，该方法进一步包括施用：
3)包含CAR分子的第二CD8+ T细胞(第二CARCD8+)，该CAR分子包含：
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；以及
细胞内信号传导结构域，其中第二CARCD8+包含细胞内信号传导结构域，例如共刺激信号传导结构域，不存在于CARCD8+上，并且任选地，不包含ICOS信号传导结构域。
其他测定法(包括本领域已知的那些测定法)也可用于评估本披露的CAR分子。
与CAR细胞的组合疗法
本文所述的表达CAR的细胞可以与其他已知的药剂和疗法组合使用。如本文所用，“组合”施用意指在受试者患病期间将两种(或更多种)不同的治疗递送至受试者，例如在受试者被诊断患有障碍后并且在该障碍被治愈或清除前或者在由于其他原因终止治疗前递送两种或多种治疗。在一些实施例中，当第二治疗的递送开始时，第一治疗的递送仍在进行，所以就施用而言存在重叠。这在本文中有时被称为“同时递送”或“并行递送”。在其他实施例中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始前结束。在每一种情况的一些实施例中，由于是组合施用，该治疗更有效。例如，与不存在第一治疗的条件下施用第二治疗所观察到的结果相比，第二治疗更有效，例如使用更少的第二治疗观察到等效的作用，或者第二治疗将症状减少更大的程度，或者观察到对第一治疗而言类似的情况。在一些实施例中，与不存在另一种治疗的条件下递送一种治疗所观察到的结果相比，递送使得症状或与该障碍相关的其他参数减少更多。两种治疗的作用可以部分累加、完全累加、或大于累加。该递送可以使得当递送第二治疗时，递送的第一治疗的作用仍然是可检测的。
可以将本文所述的表达CAR的细胞和至少一种另外的治疗剂同时(以相同或分开的组合物)、或依序施用。对于依次施用，可以首先施用本文所述的表达CAR的细胞并且可以其次施用另外的药剂，或者可以颠倒施用顺序。
可以将CAR疗法和/或其他治疗剂、程序或方式在活性障碍期间，或在缓解期或活性较低的疾病期间施用。可以将CAR疗法在其他治疗之前、与治疗并行、治疗后或在障碍缓解期间施用。
当组合施用时，可以将CAR疗法和另外的药剂(例如，第二药剂或第三药剂)或全部以比单独使用(例如，作为单一疗法)的每种药剂的量或剂量更高、更低或相同的量或剂量施用。在一些实施例中，CAR疗法、另外的药剂(例如第二药剂或第三药剂)、或全部的施用量或剂量比单独使用(例如作为单一疗法)的每种药剂的量或剂量低(例如低至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％)。在其他实施例中，CAR疗法、另外的药剂(例如第二药剂或第三药剂)、或全部的导致期望效果(例如治疗癌症)的量或剂量比单独使用(例如作为单一疗法)的每种药剂实现相同治疗效果所需的量或剂量低(例如低至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％)。
在一些实施例中，本披露披露了一种组合疗法，其包括本文所述的表达CAR的细胞疗法、本文所述的RNA分子(或编码该RNA分子的核酸分子)和另外的治疗剂。
生物聚合物CAR递送方法
在一些实施例中，如本文所披露的一种或多种表达CAR的细胞可以经由生物聚合物支架(例如，生物聚合物植入物)施用或递送至受试者。生物聚合物支架可以支持或增强本文所述的表达CAR的细胞的递送、扩增和/或分散。生物聚合物支架包含可以是天然存在的或合成的生物相容的(例如，基本上不诱导炎性或免疫应答)和/或可生物降解的聚合物。
合适的生物聚合物的实例包括但不限于琼脂、琼脂糖、藻酸盐、藻酸盐/磷酸钙水泥(CPC)、β-半乳糖苷酶(β-GAL)、(1,2,3,4,6-戊乙酰基a-D-半乳糖)、纤维素、几丁质、壳聚糖、胶原蛋白、弹性蛋白、明胶、透明质酸胶原、羟基磷灰石、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基-己酸酯)(PHBHHx)、聚(丙交酯)、聚(己内酯)(PCL)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)、聚环氧丙烷(PPO)、聚乙烯醇(PVA)、丝、大豆蛋白、和大豆蛋白分离物，单独地或以任何浓度和任何比率与任何其他聚合物组合物组合。生物聚合物可以用粘附或迁移促进分子(例如，与淋巴细胞的胶原受体结合的胶原模拟肽、和/或刺激性分子)强化或修饰以增强待递送细胞的递送、扩增或功能(例如，抗癌活性)。生物聚合物支架可以是可注射的，例如凝胶或半固体、或固体组合物。
在一些实施例中，在递送至受试者之前，将本文所述的表达CAR的细胞接种到生物聚合物支架上。在实施例中，生物聚合物支架进一步包含一种或多种本文所述的另外的治疗剂(例如，另一种表达CAR的细胞、抗体、或小分子)或例如并入或缀合到支架的生物聚合物的增强表达CAR的细胞活性的药剂。在实施例中，生物聚合物支架被注射(例如，瘤内、或通过外科手术植入)到肿瘤处或足以介导抗肿瘤作用的肿瘤附近。生物聚合物组合物及其递送方法的另外的实例描述于Stephan等人,Nature Biotechnology[自然生物技术],2015,33:97-101；和WO2014/110591中。
与CAR细胞相关的药物组合物和治疗
本披露的药物组合物可以包含表达CAR的细胞(例如如本文描述的多种表达CAR的细胞)，以及一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。在一些实施例中，本披露的组合物被配制用于静脉内施用。
本披露的药物组合物能以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的总量和频率将由如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重程度等因素来确定，然而适当的剂量可以通过临床试验来确定。
在一些实施例中，药物组合物基本上不含，例如不存在可检测水平的例如选自下组的污染物，该组由以下组成：内毒素、支原体、复制型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIVgag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、合并的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一些实施例中，细菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、以及酿脓链球菌A组。
当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，医生可以考虑到年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定待施用的本披露组合物的精确量。通常可以说，可以将包含本文所述T细胞的药物组合物按以下剂量施用：104至109个细胞/kg体重，在一些情况下为105至106个细胞/kg体重，包括这些范围内的所有整数值。还可以将T细胞组合物以这些剂量多次施用。可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见例如Rosenberg等人,New Eng.J.ofMed.[新英格兰医学杂志]319:1676,1988)。
在某些实施例中，可能需要将活化的T细胞施用于受试者，然后随后重新抽取血液(或进行单采)，根据本披露活化来自血液的T细胞，并用这些活化和扩增的T细胞重新输注入患者。该过程可以每隔几周进行多次。在某些实施例中，可以将来自10cc至400cc抽血的T细胞活化。在某些实施例中，将来自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、或100cc抽血的T细胞活化。
能以任何常规方式施用主题组合物，包括通过雾化吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。可以向患者经动脉、皮下、真皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、或者腹膜内施用本文描述的组合物。在一些实施例中，通过皮内或皮下注射向患者施用本披露的T细胞组合物。在一些实施例中，本披露的表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)组合物通过静脉内注射施用。可以将表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)的组合物直接注射至肿瘤、淋巴结或感染部位。
在一些实施例中，受试者可以进行白细胞单采，其中离体收集、富集或去除白细胞以选择和/或分离感兴趣的细胞，例如免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)。这些免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)分离物可以通过本领域已知的方法来扩增，并进行处理，使得可以引入本披露的一种或多种CAR构建体，从而产生本披露的表达CAR的细胞(例如，CAR T细胞或表达CAR的NK细胞)。有需要的受试者可以随后经历使用高剂量化疗的标准治疗，随后进行外周血干细胞移植。在某些实施例中，在移植之后或与移植并行，受试者接受本披露的扩增的表达CAR的细胞(例如，CAR T细胞或NK细胞)的输注。在一些实施例中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。
在实施例中，例如在施用表达本文所述的CAR分子的一种或多种细胞之前，对受试者进行淋巴细胞耗减。在实施例中，淋巴细胞耗减包含施用美法仑、环磷氮芥、环磷酰胺和氟达拉滨中的一种或多种。
有待向患者施用的以上治疗的剂量将随着所治疗病症的确切性质和该治疗的受者而变化。可以根据本领域接受的做法来进行人类施用的剂量的缩放。例如，对于成年患者，CAMPATH的剂量通常将在1至约100mg的范围内，通常每天施用持续1至30天的时间。优选的每天剂量是每天1至10mg，但在一些情况下，可以使用每天最多40mg的较大剂量(描述于美国专利号6,120,766中)。
在一些实施例中，例如使用体外转录将CAR分子引入免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，并且受试者(例如，人)接受本披露的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的初始施用，以及本披露的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的一次或多次后续施用，其中一次或多次后续施用在前一次施用后的小于15天(例如在14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天)施用。在一些实施例中，每周将本披露的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)施用于受试者(例如，人)超过一次，例如每周施用本披露的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)2次、3次或4次。在一些实施例中，受试者(例如，人受试者)每周接受CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的超过一次施用(例如，每周2次、3次或4次施用)(本文也称为周期)，然后不施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)一周，然后给受试者施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的一次或多次另外施用(例如，每周施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)超过一次)。在一些实施例中，受试者(例如，人受试者)接受CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)超过一个周期，并且每个周期之间的时间小于10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天或3天。在一些实施例中，每隔一天施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，每周施用3次。在一些实施例中，施用本披露的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)至少两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周或更多周。
在一些实施例中，使用慢病毒病毒载体(如慢病毒)来产生表达CAR的细胞(例如，CART或表达CAR的NK细胞)。以这种方式产生的表达CAR的细胞(例如，CART或表达CAR的NK细胞)将具有稳定的CAR表达。
在一些实施例中，使用病毒载体如γ逆转录病毒载体(例如本文描述的γ逆转录病毒载体)产生表达CAR的细胞，例如CART。使用这些载体产生的CART可以具有稳定的CAR表达。
在一些实施例中，表达CAR的细胞(例如，CART或表达CAR的NK细胞)在转导后瞬时表达CAR载体4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天。CAR分子的瞬时表达可能受RNA CAR载体递送的影响。在一些实施例中，通过电穿孔将CAR RNA转导进细胞(例如，T细胞或NK细胞)。
使用瞬时表达的表达CAR的细胞(例如，CART或表达CAR的NK细胞)(特别是与携带鼠scFv的表达CAR的细胞(例如，CART或表达CAR的NK细胞)一起)治疗的患者可能产生的潜在问题是多次治疗后的过敏反应。
不受该理论的束缚，认为这种过敏应答可能是由患者发展体液抗CAR应答，即具有抗IgE同种型的抗CAR抗体引起的。认为当存在暴露于抗原的10至14天中断时，患者的抗体产生细胞经历从IgG同种型(不引起过敏反应)到IgE同种型的类别转换。
如果患者在瞬时CAR疗法过程中具有产生抗CAR抗体应答的高风险(如由RNA转导产生的那些)，则表达CAR的细胞(例如，CART或表达CAR的NK细胞)输注中断不应持续超过十至十四天。
使用生物标志物评价CAR有效性、受试者适用性或样品适合性的方法
在一些实施例中，本披露的特征在于评估或监测表达CAR的细胞疗法在受试者(例如，患有癌症的受试者)中的有效性的方法。该方法包括获取CAR疗法有效性、受试者适用性或样品适合性的值，其中所述值指示表达CAR的细胞疗法的有效性或适合性。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，在接受表达CAR的细胞疗法之前、期间或之后评估受试者。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，与无应答者相比，应答者(例如，完全应答者)具有或被鉴定为具有更高水平或活性的GZMK、PPF1BP2或初始T细胞中的一者、两者或更多者(全部)。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，与应答者相比，无应答者具有或被鉴定为具有更高水平或活性的IL22、IL-2RA、IL-21、IRF8、IL8、CCL17、CCL22、效应T细胞或调节T细胞中的一者、两者、三者、四者、五者、六者、七者或更多者(例如，全部)。
在一些实施例中，复发者是具有或被鉴定为具有与无复发者相比表达水平增加的以下基因中的一者或多者(例如，2者、3者、4者或全部)：MIR199A1、MIR1203、uc021ovp、ITM2C和HLA-DQB1和/或与无复发者相比表达水平减少的以下基因中的一者或多者(例如，2者、3者、4者、5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者或全部)：PPIAL4D、TTTY10、TXLNG2P、MIR4650-1、KDM5D、USP9Y、PRKY、RPS4Y2、RPS4Y1、NCRNA00185、SULT1E1和EIF1AY的患者。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，无应答者具有或被鉴定为具有更高的免疫细胞耗竭标志物(例如，一种、两种或更多种免疫检查点抑制剂(例如，PD-1、PD-L1、TIM-3和/或LAG-3))的百分比。在一些实施例中，与来自应答者的PD-1或LAG-3表达免疫效应细胞的百分比相比，无应答者具有或被鉴定为具有更高的PD-1、PD-L1或LAG-3表达免疫效应细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)(例如，表达CAR的CD4+细胞和/或CD8+ T细胞)的百分比。
在一些实施例中，无应答者具有或被鉴定为具有更高的具有耗竭表型的免疫细胞(例如，共表达至少两种耗竭标志物(例如，共表达PD-1、PD-L1和/或TIM-3)的免疫细胞)的百分比。在其他实施例中，无应答者具有或被鉴定为具有更高的具有耗竭表型的免疫细胞(例如，共表达至少两种耗竭标志物(例如，共表达PD-1和LAG-3)的免疫细胞)的百分比。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，在表达CAR的细胞群体中，与表达CAR的细胞疗法的应答者(例如，完全应答者)相比，无应答者具有或被鉴定为具有更高的PD-1/PD-L1+/LAG-3+细胞百分比。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，在表达CAR的细胞群体中，部分应答者具有或被鉴定为具有比应答者更高的PD-1/PD-L1+/LAG-3+细胞百分比。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，在表达CAR的细胞群体中，无应答者具有或被鉴定为具有PD1/PD-L1+CAR+的耗竭表型和LAG3的共表达。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，在表达CAR的细胞群体中，与应答者(例如，完全应答者)相比，无应答者具有或被鉴定为具有更高的PD-1/PD-L1+/TIM-3+细胞百分比。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，在表达CAR的细胞群体中，部分应答者具有或被鉴定为具有比应答者更高的PD-1/PD-L1+/TIM-3+细胞百分比。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，单采样品中CD8+CD27+CD45RO-T细胞的存在是受试者对表达CAR的细胞疗法的应答的阳性预测因子。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，单采血液成分样品中PD1+CAR+和LAG3+或TIM3+ T细胞的高百分比是受试者对表达CAR的细胞疗法的应答的不良预后预测因子。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，应答者(例如，完整或部分应答者)具有以下特征中的一者、两者、三者或更多者(或全部)：
(i)与参考值(例如，无应答者数量的CD27+免疫效应细胞)相比，具有更多数量的CD27+免疫效应细胞；
(ii)与参考值(例如，无应答者数量的CD8+ T细胞)相比，具有更多数量的CD8+ T细胞；
(iii)与参考值(例如，无应答者数量的表达一种或多种检查点抑制剂的细胞)相比，具有更少数量的表达一种或多种检查点抑制剂(例如选自PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3或KLRG-1的检查点抑制剂或组合)的免疫细胞；或
(iv)与参考值(例如，无应答者数量的静息TEFF细胞、静息TREG细胞、初始CD4细胞、未刺激的记忆细胞或早期记忆T细胞)相比，具有更多数量的静息TEFF细胞、静息TREG细胞、初始CD4细胞、未刺激的记忆细胞或早期记忆T细胞中的一者、二者、三者、四者或更多者(全部)或它们的组合。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，细胞因子水平或活性选自细胞因子CCL20/MIP3a、IL17A、IL6、GM-CSF、IFN-γ、IL10、IL13、IL2、IL21、IL4、IL5、IL9或TNFα中的一者、二者、三者、四者、五者、六者、七者、八者或更多者(或全部)或它们的组合。细胞因子可以选自IL-17a、CCL20、IL2、IL6或TNFα中的一者、二者、三者、四者或更多者(全部)。在一些实施例中，细胞因子的增加水平或活性选自IL-17a和CCL20中的一者或二者，这表明应答增加或复发减少。
在实施例中，可以根据临床标准进一步评估由本文的方法鉴定的应答者、无应答者、复发者或无复发者。例如，完全应答者具有或被鉴定为具有疾病(例如，癌症)的受试者，该受试者表现出对治疗的完全应答，例如完全缓解。如本文所述，可以例如使用NCCN
Figure BDA0003991130860003141
或Cheson等人,J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]17:1244(1999)和Cheson等人,“Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma[修订版恶性淋巴瘤治疗应答标准]”,J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]25:579-586(2007)(两者均通过援引以其全文并入本文)鉴定完全响应。部分应答者具有或被鉴定为具有疾病(例如，癌症)的受试者，该受试者表现出对治疗的部分应答，例如部分缓解。例如可以使用如本文所述的NCCN
Figure BDA0003991130860003142
或Cheson标准来鉴定部分响应。无应答者具有或被鉴定为具有疾病(例如，癌症)的受试者，该受试者未表现出对治疗的应答，例如患者病情稳定或疾病进展。例如可以使用如本文所述的NCCN
Figure BDA0003991130860003143
或Cheson标准来鉴定无应答者。
可替代地，或与本文披露的方法组合，应答于所述值，执行以下一者、二者、三者或更多者：
例如，将表达CAR的细胞疗法施用于应答者或无复发者；
施用改变剂量的表达CAR的细胞疗法；
改变表达CAR的细胞疗法的排程或时程；
例如，将另外的药剂与表达CAR的细胞疗法(例如检查点抑制剂，例如本文所述的检查点抑制剂)组合施用于无应答者或部分应答者；
在用表达CAR的细胞疗法治疗之前，将增加受试者中的较年轻的T细胞的数量的疗法施用于无应答者或部分应答者；
修改表达CAR的细胞疗法的制造方法，例如在引入编码CAR分子的核酸之前富集较年轻的T细胞，或例如针对被鉴定为无反应者或部分反应者的受试者而言，增加转导效率；
例如针对无应答者或部分应答者或复发者，施用替代疗法；或
如果受试者为或被鉴定为无应答者或复发者，则例如通过CD25耗减、施用环磷酰胺、抗GITR抗体中的一者或多者或它们的组合来减少TREG细胞群和/或TREG基因特征。
在一些实施例中，用抗GITR抗体预治疗受试者。在一些实施例中，在输注或再输注之前用抗GITR抗体治疗受试者。
使用ZBTB32抑制剂治疗癌症的方法
在一方面，本披露涉及使用单独的ZBTB32抑制剂(例如本文所述的ZBTB32抑制剂)或其与第二治疗剂或方式(例如本文所述的治疗剂或方式)的组合、或者包含本文披露的组合的组合物或配制品体内治疗受试者，使得抑制或减少癌性肿瘤的生长。
在一个实施例中，本文披露的ZBTB32抑制剂或组合适用于体内癌症的治疗。例如，该ZBTB32抑制剂或组合可用于抑制癌性肿瘤的生长。该ZBTB32抑制剂或组合还可以与以下中的一种或多种组合使用：护理标准治疗(standard of care treatment)(例如，用于癌症或感染性障碍)、疫苗(例如治疗性癌症疫苗)、细胞疗法、放射疗法、手术或任何其他治疗剂或方式，以治疗本文的障碍。例如，为了实现免疫的抗原特异性增强，可以将该组合与感兴趣的抗原一起施用。本文披露的组合可以按顺序或同时施用。
在另一个方面，提供了一种治疗受试者，例如减轻或改善受试者的过度增生性病状或病症(例如癌症)、例如实体瘤、血液癌症、软组织肿瘤或转移性病灶的方法。该方法包括向该受试者施用单独的ZBTB32抑制剂(例如本文所述的ZBTB32抑制剂)或其与第二治疗剂或方式(例如本文所述的治疗剂或方式)的组合、或者包含本文披露的组合的组合物或配制品，例如根据本文披露的剂量方案。
如本文所用，术语“癌症”意指包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而不考虑组织病理学类型或侵袭的阶段。癌性疾病的实例包括但不限于实体瘤、血液癌症、软组织肿瘤和转移性病灶。实体瘤的实例包括各种器官系统的恶性肿瘤(例如肉瘤)和癌(包括腺癌和鳞状细胞癌)，如影响肝、肺、乳腺、淋巴、胃肠(例如结肠)、泌尿生殖道(例如肾、尿路上皮、膀胱细胞)、前列腺、CNS(例如脑、神经或神经胶质细胞)、皮肤、胰腺和咽部的那些。腺癌包括诸如大多数结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌和食管癌的恶性肿瘤。鳞状细胞癌包括恶性肿瘤，例如在肺、食管、皮肤、头颈部区域、口腔、肛门和子宫颈中。还可以使用本披露的方法和组合物治疗或预防前述癌症的转移性病变。
在一些实施例中，癌症选自乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、皮肤癌、胃癌或ER+癌。在一些实施例中，皮肤癌是黑素瘤(例如难治性黑素瘤)。在一些实施例中，ER+癌是ER+乳腺癌。在一些实施例中，癌症是EB病毒(EBV)阳性癌症。
可以使用本文披露的组合抑制其生长的示例性癌症包括通常对免疫疗法有应答的癌症。用于治疗的典型的癌症的非限制性实例包括黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌(例如，非小细胞肺癌)。另外，可以使用本文描述的抗体分子来治疗难治性或复发性恶性肿瘤。
可以治疗的其他癌症的实例包括但不限于，基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和CNS癌；原发性CNS淋巴瘤；中枢神经系统(CNS)肿瘤；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌；上皮内肿瘤；肾癌；喉癌；白血病(包括急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性或急性白血病)；肝癌；肺癌(例如，小细胞和非小细胞)；淋巴瘤(包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤)；淋巴细胞性淋巴瘤；黑素瘤，例如，皮肤或眼内恶性黑素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(例如，唇、舌、嘴和咽部)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌；泌尿系统癌症、肝癌、肛区癌、输卵管癌、阴道癌、外阴癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症(包括石棉诱导的那些)、以及其他癌和肉瘤、以及所述癌症的组合。
在一些实施例中，该障碍是癌症，例如本文所述的癌症。在某些实施例中，癌症是实体瘤。在一些实施例中，癌症是脑瘤，例如胶质母细胞瘤、胶质肉瘤或复发性脑肿瘤。在一些实施例中，癌症是胰腺癌，例如晚期胰腺癌。在一些实施例中，癌症是皮肤癌，例如黑素瘤(例如II-IV期黑素瘤、HLA-A2阳性黑素瘤、无法切除的黑素瘤或转移性黑素瘤)或梅克尔细胞癌。在一些实施例中，癌症是肾癌，例如肾细胞癌(RCC)(例如转移性肾细胞癌)或未经治疗的转移性肾癌。在一些实施例中，癌症是乳腺癌，例如转移性乳腺癌或IV期乳腺癌，例如三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些实施例中，癌症是病毒相关癌症。在一些实施例中，癌症是肛管癌(例如肛管鳞状细胞癌)。在一些实施例中，癌症是宫颈癌(例如宫颈鳞状细胞癌)。在一些实施例中，癌症是胃癌(例如EB病毒(EBV)阳性胃癌，或者胃或胃食管交界处癌)。在一些实施例中，癌症是头颈癌(例如HPV阳性和阴性头颈部鳞状细胞癌(SCCHN))。在一些实施例中，癌症是鼻咽癌(NPC)。在一些实施例中，癌症是阴茎癌(例如阴茎鳞状细胞癌)。在一些实施例中，癌症是阴道或外阴癌(例如阴道或外阴鳞状细胞癌)。在一些实施例中，癌症是结直肠癌，例如复发性结直肠癌、转移性结直肠癌、例如微卫星不稳定结直肠癌、微卫星稳定结直肠癌、错配修复正常结直肠癌或错配修复缺陷结直肠癌。在一些实施例中，癌症是肺癌，例如非小细胞肺癌(NSCLC)。在某些实施例中，癌症是血液癌症。在一些实施例中，癌症是白血病。在一些实施例中，癌症是淋巴瘤，例如霍奇金淋巴瘤(HL)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)(复发或难治性HL或DLBCL)。在一些实施例中，癌症是骨髓瘤。在一些实施例中，癌症是微卫星高度不稳定(MSI-H)癌症。在一些实施例中，癌症是转移性癌症。在其他实施例中，癌症是晚期癌症。在其他实施例中，癌症是复发或难治性癌症。
在一个实施例中，所述癌症是默克尔细胞癌。在其他实施例中，所述癌症是黑素瘤。在其他实施例中，所述癌症是乳腺癌，例如三阴性乳腺癌(TNBC)或HER2阴性乳腺癌。在其他实施例中，所述癌症是肾细胞癌(例如透明细胞肾细胞癌(CCRCC)或非透明细胞肾细胞癌(nccRCC))。在其他实施例中，所述癌症是甲状腺癌，例如间变性甲状腺癌(ATC)。在其他实施例中，所述癌症是神经内分泌肿瘤(NET)，例如非典型肺类癌或胰腺、胃肠道(GI)或肺中的NET。在某些实施例中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)(例如鳞状NSCLC或非鳞状NSCLC)。在某些实施例中，癌症是输卵管癌。在某些实施例中，癌症是微卫星高度不稳定结直肠癌(MSI-高CRC)或微卫星稳定结直肠癌(MSS CRC)。
在其他实施例中，癌症是血液恶性肿瘤或癌症，包括但不限于白血病或淋巴瘤。例如，该组合可用于治疗癌症和恶性肿瘤，包括但不限于例如急性白血病，例如B细胞急性淋巴细胞白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(TALL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)；慢性白血病，例如，慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；另外的血液癌或血液病症，例如B细胞幼淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、和“白血病前期”(这是由髓系血细胞的无效产生(或发育不良)联合在一起的各种血液病症的集合)等。
如本文所用，术语“受试者”意在包括人和非人动物。在一些实施例中，受试者是人类受试者，例如患有以免疫检查点功能异常为特征的障碍或病症的人类患者。例如，受试者至少具有一些PD-1蛋白，包括由抗PD-1抗体分子结合的PD-1表位，例如足够高水平的蛋白质和表位来支持抗体与PD-1的结合。术语“非人动物”包括哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，所述受试者是需要增强免疫应答的人患者。本文所述的方法和组合物适用于治疗患有可通过调节(例如，增强或抑制)免疫应答来治疗的障碍的人患者。在某些实施例中，所述癌症是免疫应答缺陷的癌症或免疫原性癌症。
本文披露的方法和组合物可用于治疗与上述癌症相关的转移性病变。
在一些实施例中，该方法进一步包括确定肿瘤样品是否对PD-L1、CD8和IFN-γ中的一种或多种呈阳性，并且如果肿瘤样品对标志物中的一种或多种(例如两种或全部三种)呈阳性，则向患者施用治疗有效量的如本文所述的治疗剂组合。
在一些实施例中，ZBTB32抑制剂或组合用于治疗表达一种或多种本文披露的生物标志物的癌症。在某些实施例中，应答于确定本文披露的一种或多种生物标志物的存在而治疗受试者或癌症。
在其他实施例中，ZBTB32抑制剂或组合用于治疗以微卫星高度不稳定(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)为特征的癌症。可以使用例如针对MSI-H状态的聚合酶链式反应(PCR)试验或针对dMMR的免疫组织化学(IHC)试验来鉴定患者的MSI-H或dMMR肿瘤状态。例如在以下文献中描述了鉴别MSI-H或dMMR肿瘤状态的方法：Ryan等人Crit Rev Oncol Hematol.[肿瘤学/血液学评论]2017；116:38-57；Dietmaier和Hofstadter.Lab Invest[实验室调查]2001,81:1453-1456；Kawakami等人Curr Treat Options Oncol.[最新肿瘤学治疗方案]2015；16(7):30。
本文所述的组合疗法可包括与一种或多种另外的治疗剂(例如一种或多种抗癌剂、细胞毒剂或细胞抑制剂、激素治疗、疫苗和/或其他免疫疗法)共同配制和/或共同施用的本披露的组合物。在其他实施例中，进一步与其他治疗性治疗方式(包括手术、放射、冷冻手术和/或热疗)组合施用或使用所述组合。此类组合疗法可以有利地使用较低剂量的所给予的治疗剂，从而避免与各种单一疗法相关的可能的毒性或并发症。
当组合施用时，可以将治疗剂以比单独使用(例如作为单一疗法)的每种药剂的量或剂量更高、或更低或相同的量或剂量施用。在某些实施例中，所述治疗剂的施用量或剂量比单独使用(例如作为单一疗法)的每种药剂的量或剂量低(例如至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％)。在其他实施例中，导致所希望的效果(例如癌症的治疗)的治疗剂的量或剂量更低(例如低至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％)。
与ZBTB32抑制剂组合治疗
本披露的ZBTB32抑制剂可以在与一种或多种治疗剂(药物组合)或方式(例如，非药物疗法)的组合疗法中以治疗有效量施用。例如，其他癌症药剂可以发生协同效应。当本披露的ZBTB32抑制剂与其他疗法组合施用时，共同施用的ZBTB32抑制剂的剂量当然将根据所用的联合药物的类型、所用的特定药物、所治疗的病症等而变化。
ZBTB32抑制剂可以与其他药物疗法或治疗方式同时地(作为单个制剂或单独制剂)顺序地、单独地或在一段时间施用。通常，组合疗法设想在单个周期或疗程期间施用两种或更多种药物。治疗剂是例如化学化合物、肽、抗体、抗体片段或核酸，当将该治疗剂与本披露的化合物组合施用至患者时，该治疗剂具有治疗活性或增强治疗活性。
在一方面，本披露的ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体可以与其他治疗剂(例如其他抗癌剂、抗过敏剂、止吐剂(或抗呕剂)、止痛剂、细胞保护剂、及其组合)结合。
在一些实施例中，将本披露的ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体与一种或多种第二药剂组合施用以治疗疾病(例如癌症)，该第二药剂选自PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、LAG-3抑制剂、细胞因子、A2aR拮抗剂、GITR激动剂、TIM-3抑制剂、STING激动剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、嵌合抗原受体、雌激素受体拮抗剂、CDK4/6抑制剂、CXCR2抑制剂、CSF-1/1R结合剂、IDO抑制剂、半乳凝素抑制剂、MEK抑制剂、c-MET抑制剂、TGF-b抑制剂、IL-1b抑制剂、MDM2抑制剂、和TLR7激动剂。
在一些实施例中，将ZBTB32抑制剂与共刺激分子的激动剂组合使用，该共刺激分子选自OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、或CD83配体中的一个或多个。
在一些实施例中，将ZBTB32抑制剂与免疫检查点分子的抑制剂组合使用，该免疫检查点分子选自PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFβ中的一个或多个。
在另一个实施例中，将一种或多种化学治疗剂与ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体组合使用，以治疗疾病(例如癌症)，其中所述化学治疗剂包括但不限于阿那曲唑
Figure BDA0003991130860003211
比卡鲁胺
Figure BDA0003991130860003212
硫酸博来霉素
Figure BDA0003991130860003213
白消安
Figure BDA0003991130860003214
白消安注射液
Figure BDA0003991130860003215
卡培他滨
Figure BDA0003991130860003216
N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂
Figure BDA0003991130860003217
卡莫司汀
Figure BDA0003991130860003218
苯丁酸氮芥
Figure BDA0003991130860003219
顺铂
Figure BDA00039911308600032110
克拉屈滨
Figure BDA00039911308600032111
环磷酰胺(
Figure BDA00039911308600032112
或
Figure BDA00039911308600032113
)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷
Figure BDA00039911308600032114
阿糖胞苷脂质体注射液
Figure BDA00039911308600032115
达卡巴嗪
Figure BDA00039911308600032116
更生霉素(放线菌素D，Cosmegan)、盐酸柔红霉素
Figure BDA00039911308600032117
柠檬酸柔红霉素脂质体注射液
Figure BDA0003991130860003221
地塞米松、多西他赛
Figure BDA0003991130860003222
盐酸多柔比星
Figure BDA0003991130860003223
依托泊苷
Figure BDA0003991130860003224
磷酸氟达拉滨
Figure BDA0003991130860003225
5-氟尿嘧啶
Figure BDA0003991130860003226
氟他胺
Figure BDA0003991130860003227
tezacitibine、吉西他滨(二氟脱氧胞苷(difluorodeoxycitidine))、羟基脲
Figure BDA0003991130860003228
伊达比星
Figure BDA0003991130860003229
异环磷酰胺
Figure BDA00039911308600032210
伊立替康
Figure BDA00039911308600032211
L-天冬酰胺酶
Figure BDA00039911308600032212
亚叶酸钙、美法仑
Figure BDA00039911308600032213
6-巯基嘌呤
Figure BDA00039911308600032214
甲氨蝶呤
Figure BDA00039911308600032215
米托蒽醌
Figure BDA00039911308600032216
米罗他(mylotarg)、紫杉醇
Figure BDA00039911308600032217
phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他汀、聚苯丙生(polifeprosan)20与卡莫司汀的植入物
Figure BDA00039911308600032218
柠檬酸他莫昔芬
Figure BDA00039911308600032219
替尼泊苷
Figure BDA00039911308600032220
6-硫代鸟嘌呤、噻替派、替拉扎明
Figure BDA00039911308600032221
注射用盐酸拓扑替康
Figure BDA00039911308600032222
长春花碱
Figure BDA00039911308600032223
长春新碱
Figure BDA00039911308600032224
长春瑞滨
Figure BDA00039911308600032225
表柔比星
Figure BDA00039911308600032226
奥沙利铂
Figure BDA00039911308600032227
依西美坦
Figure BDA00039911308600032228
来曲唑
Figure BDA00039911308600032229
和氟维司群
Figure BDA00039911308600032230
在其他实施例中，将本披露的ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体与一种或多种其他抗HER2抗体(例如，上文所述的曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、玛格妥昔单抗(margetuximab)、或HT-19)或与其他抗HER2缀合物(例如，ado-曲妥珠单抗-美坦新偶联物(emtansine)(也称为
Figure BDA00039911308600032231
或T-DM1))组合使用。
在其他实施例中，将本披露的ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体与一种或多种酪氨酸激酶抑制剂(包括但不限于EGFR抑制剂、Her3抑制剂、IGFR抑制剂、和Met抑制剂)组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。
例如，酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于盐酸埃罗替尼(erlotinib)
Figure BDA00039911308600032232
利尼法尼(Linifanib)(N-[4-(3-氨基-1H-吲唑-4-基)苯基]-N'-(2-氟-5-甲基苯基)脲，也称为ABT 869，可购自基因泰克公司(Genentech))；苹果酸舒尼替尼
Figure BDA0003991130860003231
柏舒替尼(Bosutinib)(4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基]喹啉-3-甲腈，也称为SKI-606，并且描述于美国专利号6,780,996中)；达沙替尼
Figure BDA0003991130860003232
帕唑帕尼
Figure BDA0003991130860003233
索拉非尼
Figure BDA0003991130860003234
凡德他尼(ZD6474)；和伊马替尼或甲磺酸伊马替尼(
Figure BDA0003991130860003235
和
Figure BDA0003991130860003236
)。
表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂包括但不限于盐酸埃罗替尼(erlotinib)
Figure BDA0003991130860003237
吉非替尼
Figure BDA0003991130860003238
N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3”S”)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺，
Figure BDA0003991130860003239
)；凡德他尼(Vandetanib)
Figure BDA00039911308600032310
拉帕替尼
Figure BDA00039911308600032311
(3R,4R)-4-氨基-1-((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514)；二盐酸卡奈替尼(CI-1033)；6-[4-[(4-乙基-1-哌嗪基)甲基]苯基]-N-[(1R)-1-苯基乙基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(AEE788，CAS 497839-62-0)；木利替尼(Mubritinib)(TAK165)；培立替尼(EKB569)；阿法替尼(Afatinib)
Figure BDA00039911308600032312
来那替尼(Neratinib)(HKI-272)；N-[4-[[1-[(3-氟苯基)甲基]-1H-吲唑-5-基]氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基]-氨基甲酸，(3S)-3-吗啉基甲酯(BMS599626)；N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氢-2-甲基环戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(XL647，CAS781613-23-8)；和4-[4-[[(1R)-1-苯基乙基]氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚(PKI166，CAS187724-61-4)。
EGFR抗体包括但不限于西妥昔单抗
Figure BDA00039911308600032313
帕尼单抗
Figure BDA00039911308600032314
马妥珠单抗(EMD-72000)；尼妥珠单抗(Nimotuzumab)(hR3)；扎妥木单抗(Zalutumumab)；TheraCIM h-R3；MDX0447(CAS 339151-96-1)；和ch806(mAb-806，CAS 946414-09-1)。
其他HER2抑制剂包括但不限于来那替尼(Neratinib)(HKI-272，(2E)-N-[4-[[3-氯-4-[(吡啶-2-基)甲氧基]苯基]氨基]-3-氰基-7-乙氧基喹啉-6-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺，并且描述于PCT公开号WO 05/028443)；拉帕替尼或二甲苯磺酸拉帕替尼
Figure BDA0003991130860003241
(3R,4R)-4-氨基-1-((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514)；(2E)-N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(BIBW-2992，CAS 850140-72-6)；N-[4-[[1-[(3-氟苯基)甲基]-1H-吲唑-5-基]氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基]-氨基甲酸、(3S)-3-吗啉基甲酯(BMS 599626，CAS 714971-09-2)；二盐酸卡奈替尼(PD183805或CI-1033)；和N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氢-2-甲基环戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(XL647，CAS 781613-23-8)。
HER3抑制剂包括但不限于LJM716、MM-121、AMG-888、RG7116、REGN-1400、AV-203、MP-RM-1、MM-111、和MEHD-7945A。
MET抑制剂包括但不限于卡博替尼(Cabozantinib)(XL184，CAS 849217-68-1)；氟列替布(Foretinib)(GSK1363089，以前称为XL880，CAS 849217-64-7)；替万替尼(Tivantinib)(ARQ197，CAS 1000873-98-2)；1-(2-羟基-2-甲基丙基)-N-(5-(7-甲氧基喹啉-4-基氧基)吡啶-2-基)-5-甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1H-吡唑-4-甲酰胺(AMG458)；克唑替尼(
Figure BDA0003991130860003242
PF-02341066)；(3Z)-5-(2,3-二氢-1H-吲哚-1-基磺酰基)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亚甲基)-1,3-二氢-2H-吲哚-2-酮(SU11271)；(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亚甲基)-N-甲基-2-氧代吲哚啉-5-磺酰胺(SU11274)；(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-{[3,5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基丙基)-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-甲基-2-氧代吲哚啉-5-磺酰胺(SU11606)；6-[二氟[6-(1-甲基-1H吡唑-4-基)-1,2,4-三唑并[4,3-b]哒嗪-3-基]甲基]-喹啉(JNJ38877605，CAS 943540-75-8)；2-[4-[1-(喹啉-6-基甲基)-1H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡嗪-6-基]-1H-吡唑-1-基]乙醇(PF04217903，CAS 956905-27-4)；N-((2R)-1,4-二噁烷-2-基甲基)-N-甲基-N'-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-氧代-5H-苯并[4,5]环庚并[1,2-b]吡啶-7-基]磺酰胺(MK2461，CAS 917879-39-1)；6-[[6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1,2,4-三唑并[4,3-b]哒嗪3-基]硫代]-喹啉(SGX523，CAS 1022150-57-7)；和(3Z)-5-[[(2,6-二氯苯基)甲基]磺酰基]-3-[[3,5-二甲基-4-[[(2R)-2-(1-吡咯烷基甲基)-1-吡咯烷基]羰基]-1H-吡咯-2-基]亚甲基]-1,3-二氢-2H-吲哚-2-酮(PHA665752，CAS 477575-56-7)。
IGFR抑制剂包括但不限于BMS-754807、XL-228、OSI-906、GSK0904529A、A-928605、AXL1717、KW-2450、MK0646、AMG479、IMCA12、MEDI-573、和BI836845。参见例如，Yee,JNCI[国家癌症研究所杂志],104；975(2012)的综述。
在另一个实施例中，将本披露的ZBTB32抑制剂与一种或多种增殖信号传导途径抑制剂(包括但不限于MEK抑制剂、BRAF抑制剂、PI3K/Akt抑制剂、SHP2抑制剂、以及还有mTOR抑制剂和CDK抑制剂)组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。
例如，促分裂原活化蛋白激酶(MEK)抑制剂包括但不限于XL-518(也称为GDC-0973、CAS号1029872-29-4，可从ACC集团(ACC Corp.)获得)；2-[(2-氯-4-碘苯基)氨基]-N-(环丙基甲氧基)-3,4-二氟-苯甲酰胺(也称为CI-1040或PD184352，并描述于PCT公开号WO2000035436)；N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-苯甲酰胺(也称为PD0325901，并描述于PCT公开号WO 2002006213)；2,3-双[氨基[(2-氨基苯基)硫代]亚甲基]-丁二腈(也称为U0126，并描述于美国专利号2,779,780)；N-[3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-6-甲氧基苯基]-1-[(2R)-2,3-二羟基丙基]-环丙烷磺酰胺(也称为RDEA119或BAY869766，并描述于PCT公开号WO 2007014011)；(3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(乙基氨基)-8,9,16-三羟基-3,4-二甲基-3,4,9,19-四氢-1H-2-苯并氧杂环四癸炔-1,7(8H)-二酮](也称为E6201，并描述于PCT公开号WO 2003076424)；2'-氨基-3'-甲氧基黄酮(也称为PD98059，可从德国比亚芬股份有限公司(Biaffin GmbH&Co.,KG)获得)；(R)-3-(2,3-二羟基丙基)-6-氟-5-(2-氟-4-碘苯基氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-4,7(3H,8H)-二酮(TAK-733，CAS 1035555-63-5)；匹玛舍替(Pimasertib)(AS-703026，CAS 1204531-26-9)；和二甲亚砜曲美替尼(GSK-1120212，CAS 1204531-25-80)。
BRAF抑制剂包括但不限于维莫非尼(Vemurafenib)(或
Figure BDA0003991130860003261
PLX-4032，CAS 918504-65-1)、GDC-0879、PLX-4720(可从赛门斯公司(Symansis)获得)、达拉菲尼(或GSK2118436)、LGX 818、CEP-32496、UI-152、RAF 265、瑞戈非尼(Regorafenib)(BAY 73-4506)、CCT239065、或索拉非尼(或甲苯磺酸索拉非尼或
Figure BDA0003991130860003262
)。
磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂包括但不限于4-[2-(1H-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基]甲基]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基]吗啉(也称为GDC0941、RG7321、GNE0941、皮特里昔布(Pictrelisib)、或匹替利司(Pictilisib)；并描述于PCT公开号WO09/036082和WO 09/055730)；托扎舍替(Tozasertib)(VX680或MK-0457，CAS 639089-54-6)；(5Z)-5-[[4-(4-吡啶基)-6-喹啉基]亚甲基]-2,4-噻唑烷二酮(GSK1059615，CAS958852-01-2)；(1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(乙酰基氧基)-1-[(二-2-丙烯基氨基)亚甲基]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-八氢-11-羟基-4-(甲氧基甲基)-4a,6a-二甲基环戊[5,6]萘并[1,2-c]吡喃-2,7,10(1H)-三酮(PX866，CAS 502632-66-8)；8-苯基-2-(吗啉-4-基)-色原烯-4-酮(LY294002，CAS 154447-36-6)；(S)-N1-(4-甲基-5-(2-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)吡啶-4-基)噻唑-2-基)吡咯烷-1,2-二甲酰胺(也称为BYL719或阿培利司)；2-(4-(2-(1-异丙基-3-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基)-5,6-二氢苯并[f]咪唑并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓-9-基)-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙酰胺(也称为GDC0032、RG7604、或他塞利司(Taselisib))。
mTOR抑制剂包括但不限于坦罗莫司
Figure BDA0003991130860003263
地磷莫司(ridaforolimus)(正式地称为deferolimus，(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯，也称为AP23573和MK8669，并描述于PCT公开号WO 03/064383)；依维莫司(
Figure BDA0003991130860003271
或RAD001)；雷帕霉素(Rapamycin)(AY22989，
Figure BDA0003991130860003272
)；塞马莫德(simapimod)(CAS 164301-51-3)；(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502，CAS 1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-(SEQ ID NO:3201)，内盐(SF1126，CAS936487-67-1)。
CDK抑制剂包括但不限于帕柏西利(也称为PD-0332991，
Figure BDA0003991130860003273
6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(1-哌嗪基)-2-吡啶基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮)。
在又另一个实施例中，将本披露的ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体与一种或多种促凋亡剂(pro-apoptotics)(包括但不限于IAP抑制剂、BCL2抑制剂、MCL1抑制剂、TRAIL药剂、CHK抑制剂)组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。
例如，IAP抑制剂包括但不限于LCL161、GDC-0917、AEG-35156、AT406、和TL32711。IAP抑制剂的其他实例包括但不限于WO 04/005284、WO 04/007529、WO 05/097791、WO 05/069894、WO 05/069888、WO 05/094818、US 2006/0014700、US 2006/0025347、WO 06/069063、WO 06/010118、WO 06/017295、和WO 08/134679(所有这些文献都通过引用并入本文)中披露的那些。
BCL-2抑制剂包括但不限于4-[4-[[2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基-1-环己烯-1-基]甲基]-1-哌嗪基]-N-[[4-[[(1R)-3-(4-吗啉基)-1-[(苯硫基)甲基]丙基]氨基]-3-[(三氟甲基)磺酰基]苯基]磺酰基]苯甲酰胺(也称为ABT-263，并描述于PCT公开号WO 09/155386)；四制癌素A；抗霉素；棉酚((-)BL-193)；奥巴妥拉(Obatoclax)；乙基-2-氨基-6-环戊基-4-(1-氰基-2-乙氧基-2-氧乙基)-4H色酮-3-甲酸酯(HA14–1)；奥利默森(Oblimersen)(G3139，
Figure BDA0003991130860003281
)；Bak BH3肽；(-)-棉酚乙酸(AT-101)；4-[4-[(4'-氯[1,1'-联苯基]-2-基)甲基]-1-哌嗪基]-N-[[4-[[(1R)-3-(二甲基氨基)-1-[(苯硫基)甲基]丙基]氨基]-3-硝基苯基]磺酰基]-苯甲酰胺(ABT-737，CAS 852808-04-9)；和那维托克莱克斯(Navitoclax)(ABT-263，CAS 923564-51-6)。
促凋亡受体激动剂(PARA)包括DR4(TRAILR1)和DR5(TRAILR2)，包括但不限于杜拉乐明(Dulanermin)(AMG-951，RhApo2L/TRAIL)；玛帕妥木单抗(Mapatumumab)(HRS-ETR1，CAS 658052-09-6)；来沙木单抗(Lexatumumab)(HGS-ETR2，CAS 845816-02-6)；Apomab
Figure BDA0003991130860003282
西他土珠(Conatumumab)(AMG655，CAS 896731-82-1)；和替加妥珠单抗(Tigatuzumab)(CS1008，CAS 946415-34-5，可从第一三共株式会社(Daiichi Sankyo)获得)。
检查点激酶(CHK)抑制剂包括但不限于7-羟基星形孢菌素(UCN-01)；6-溴-3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-(3R)-3-哌啶基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺(SCH900776，CAS891494-63-6)；5-(3-氟苯基)-3-脲基噻吩-2-羧酸N-[(S)-哌啶-3-基]酰胺(AZD7762，CAS860352-01-8)；4-[((3S)-1-氮杂二环[2.2.2]辛-3-基)氨基]-3-(1H-苯并咪唑-2-基)-6-氯喹啉-2(1H)-酮(CHIR 124，CAS 405168-58-3)；7-氨基更生霉素(7-AAD)、Isogranulatimide、debromohymenialdisine；N-[5-溴-4-甲基-2-[(2S)-2-吗啉基甲氧基]-苯基]-N'-(5-甲基-2-吡嗪基)脲(LY2603618，CAS 911222-45-2)；萝卜硫素(CAS4478-93-7、4-甲基亚磺酰基丁基异硫氰酸盐)；9,10,11,12-四氢-9,12-环氧-1H-二吲哚[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]吡咯并[3,4-i][1,6]苯并二氮芳辛-1,3(2H)-二酮(SB-218078，CAS 135897-06-2)；和TAT-S216A(YGRKKRRQRRRLYRSPAMPENL(SEQ ID NO:33))、和CBP501((d-Bpa)sws(d-Phe-F5)(d-Cha)rrrqrr)。
在另外的实施例中，将本披露的ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体与一种或多种免疫调节剂(例如，共刺激分子的活化剂或免疫检查点分子的抑制剂中的一种或多种)组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。
在某些实施例中，免疫调节剂是共刺激分子的活化剂。在一个实施例中，共刺激分子的激动剂选自OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3或CD83配体的激动剂(例如，激动性抗体或其抗原结合片段、或可溶性融合物)。
GITR激动剂
在一些实施例中，将GITR激动剂与ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。在一些实施例中，GITR激动剂是GWN323(诺华股份有限公司(Novartis))、BMS-986156、MK-4166或MK-1248(默克公司(Merck))、TRX518(利普治疗公司(Leap Therapeutics))、INCAGN1876(因赛特公司/艾吉纳斯公司(Incyte/Agenus))、AMG 228(美商安进公司(Amgen))或INBRX-110(印希彼公司(Inhibrx))。
示例性GITR激动剂
在一个实施例中，GITR激动剂是抗GITR抗体分子。在一个实施例中，GITR激动剂是抗GITR抗体分子，如题为“Compositions and Methods of Use for Augmented ImmuneResponse and Cancer Therapy[用于增强免疫应答和癌症疗法的组合物和方法]”的2016年4月14日公开的WO2016/057846(将其通过引用以其全文并入)中所述的。
在一个实施例中，抗GITR抗体分子包含来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个、或六个互补决定区(CDR)(或总体上全部CDR)，该重链和轻链可变区包含表12(例如，来自表12中披露的MAB7的重链和轻链可变区序列)中所示的氨基酸序列、或由表12中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施例中，CDR根据卡巴特定义(例如，如表12中所列出的)。在一些实施例中，CDR根据乔西亚定义(例如，如表12中所列出的)。在一个实施例中，相对于表12中所示的氨基酸序列，或由表12中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR中的一种或多种(或总体上全部CDR)具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个变化，例如氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)或缺失。
在一个实施例中，抗GITR抗体分子包含：含有SEQ ID NO:9的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:11的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:13的VHCDR3氨基酸序列的重链可变区(VH)；以及含有SEQ ID NO:3016的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:16的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:18的VLCDR3氨基酸序列的轻链可变区(VL)，各自披露于表12中。
在一个实施例中，抗GITR抗体分子包含：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列、或与SEQID NO:1具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VH。在一个实施例中，抗GITR抗体分子包含：含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:2具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VL。在一个实施例中，所述抗GITR抗体分子包含：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL。
在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:5的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:5具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的VH。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:6的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:6具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的VL。在一个实施例中，抗体分子包含由SEQID NO:5的核苷酸序列编码的VH和由SEQ ID NO:6的核苷酸序列编码的VL。
在一个实施例中，抗GITR抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列、或与SEQID NO:3具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的重链。在一个实施例中，抗GITR抗体分子包含：含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:4具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的轻链。在一个实施例中，所述抗GITR抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链。
在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:7的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:7具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的重链。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:8的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:8具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的轻链。在一个实施例中，抗体分子包含由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的重链和由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码的轻链。
本文描述的抗体分子可以通过载体、宿主细胞、和在WO 2016/057846(将其通过引用以其全文并入)中描述的方法制得。
表12：示例性抗GITR抗体分子的氨基酸和核苷酸序列
Figure BDA0003991130860003311
Figure BDA0003991130860003321
Figure BDA0003991130860003331
其他示例性GITR激动剂
在一个实施例中，抗GITR抗体分子是BMS-986156(百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))，也称为BMS 986156或BMS986156。BMS-986156和其他抗GITR抗体披露在例如US 9,228,016和WO 2016/196792中，这些申请通过引用以其全文并入。在一个实施例中，抗GITR抗体分子包含以下中的一种或多种：BMS-986156的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列，例如，在表13中所披露的。
在一个实施例中，抗GITR抗体分子是MK-4166或MK-1248(默克公司)。MK-4166、MK-1248、和其他抗GITR抗体披露于例如，US 8,709,424、WO 2011/028683、WO 2015/026684、和Mahne等人,Cancer Res.[癌症研究]2017；77(5):1108-1118中，这些申请通过引用以其全文并入。在一个实施例中，抗GITR抗体分子包含以下中的一种或多种：MK-4166或MK-1248的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗GITR抗体分子是TRX518(利普治疗公司)。TRX518和其他抗GITR抗体披露在例如，US 7,812,135、US 8,388,967、US 9,028,823、WO 2006/105021、和Ponte J等人,(2010)Clinical Immunology[临床免疫学]；135:S96中，这些申请通过引用以其全文并入。在一个实施例中，抗GITR抗体分子包含以下中的一种或多种：TRX518的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗GITR抗体分子是INCAGN1876(因赛特公司/艾吉纳斯公司)。INCAGN1876和其他抗GITR抗体披露在例如US 2015/0368349和WO 2015/184099中，这些申请通过引用以其全文并入。在一个实施例中，抗GITR抗体分子包含以下中的一种或多种：INCAGN1876的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗GITR抗体分子是AMG 228(美商安进公司)。AMG 228和其他抗GITR抗体披露在例如US 9,464,139和WO 2015/031667中，这些申请通过引用以其全文并入。在一个实施例中，抗GITR抗体分子包含以下中的一种或多种：AMG 228的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗GITR抗体分子是INBRX-110(印希彼公司)。INBRX-110和其他抗GITR抗体披露在例如US 2017/0022284和WO 2017/015623中，这些申请通过引用以其全文并入。在一个实施例中，GITR激动剂包含以下中的一种或多种：INBRX-110的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，GITR激动剂(例如，融合蛋白)是MEDI 1873(英商梅迪缪思有限公司(MedImmune))，也称为MEDI1873。MEDI1873和其他GITR激动剂披露在例如，US 2017/0073386、WO 2017/025610、和Ross等人,Cancer Res[癌症研究]2016；76(14增刊):摘要nr561(将其通过引用以其全文并入)中。在一个实施例中，GITR激动剂包含MEDI 1873的IgGFc结构域、功能性多聚化结构域、和糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)的受体结合结构域中的一种或多种。
另外的已知GITR激动剂(例如，抗GITR抗体)包括例如在WO 2016/054638(将其通过引用以其全文并入)中描述的那些。
在一个实施例中，抗GITR抗体是与本文描述的抗GITR抗体之一竞争与GITR上的相同表位结合和/或结合GITR上的相同表位的抗体。
在一个实施例中，GITR激动剂是活化GITR信号传导途径的肽。在一个实施例中，GITR激动剂是与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的免疫粘附素结合片段(例如，包含GITRL的细胞外或GITR的结合部分的免疫粘附素结合片段)。
表13：其他示例性抗GITR抗体分子的氨基酸序列
Figure BDA0003991130860003351
在某些实施例中，免疫调节剂是免疫检查点分子的抑制剂。在一个实施例中，免疫调节剂是PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和/或TGFRβ的抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点分子的抑制剂抑制PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3或CTLA4、或其任何组合。术语“抑制”或“抑制剂”包括给定分子(例如免疫检查点抑制剂)的某些参数(例如活性)的降低。例如，该术语包括至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多的活性(例如PD-1或PD-L1活性)的抑制。因此，抑制不必是100％。
抑制性分子的抑制可以在DNA、RNA或蛋白水平进行。在一些实施例中，抑制性核酸(例如，dsRNA、siRNA或shRNA)可以用于对抑制性分子的表达进行抑制。在其他实施例中，抑制信号的抑制剂是多肽，例如，可溶性配体(例如，PD-1-Ig或CTLA-4Ig)或与抑制性分子结合的抗体或其抗原结合片段；例如，与PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和/或TGFRβ、或其组合结合的抗体或其片段(在本文中也称为“抗体分子”)。
在一个实施例中，抗体分子是完全抗体或其片段(例如，Fab、F(ab')2、Fv、或单链Fv片段(scFv))。在又其他实施例中，抗体分子具有重链恒定区(Fc)，该重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、和IgE的重链恒定区；特别地，选自例如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4的重链恒定区，更特别地，IgG1或IgG4(例如，人IgG1或IgG4)的重链恒定区。在一个实施例中，重链恒定区是人IgG1或人IgG4。在一个实施例中，将恒定区改变(例如突变)以修饰抗体分子的特性(例如，以增加或减少Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数目、效应细胞功能、或补体功能中的一种或多种)。
在某些实施例中，抗体分子处于双特异性或多特异性抗体分子的形式。在一个实施例中，双特异性抗体分子具有针对PD-1或PD-L1的第一结合特异性，和第二结合特异性，例如针对TIM-3、LAG-3、或PD-L2的第二结合特异性。在一个实施例中，该双特异性抗体分子与PD-1或PD-L1和TIM-3结合。在另一个实施例中，该双特异性抗体分子与PD-1或PD-L1和LAG-3结合。在另一个实施例中，该双特异性抗体分子与PD-1和PD-L1结合。在又另一个实施例中，该双特异性抗体分子与PD-1和PD-L2结合。在另一个实施例中，该双特异性抗体分子与TIM-3和LAG-3结合。上述分子的任何组合可以在多特异性抗体分子(例如，包含针对PD-1或PD-1的第一结合特异性，以及针对TIM-3、LAG-3、或PD-L2中的两种或更多种的第二和第三结合特异性的三特异性抗体)中制备。
在某些实施例中，免疫调节剂是PD-1(例如，人PD-1)的抑制剂。在另一个实施例中，免疫调节剂是PD-L1(例如，人PD-L1)的抑制剂。在一个实施例中，PD-1或PD-L1的抑制剂是PD-1或PD-L1的抗体分子。PD-1或PD-L1抑制剂可以单独施用、或与其他免疫调节剂组合施用，例如与LAG-3、TIM-3或CTLA4的抑制剂组合施用。在示例性实施例中，将PD-1或PD-L1的抑制剂(例如，抗PD-1或PD-L1抗体分子)与LAG-3抑制剂(例如，抗LAG-3抗体分子)组合施用。在另一个实施例中，将PD-1或PD-L1的抑制剂(例如，抗PD-1或PD-L1抗体分子)与TIM-3抑制剂(例如，抗TIM-3抗体分子)组合施用。在又其他实施例中，将PD-1或PD-L1的抑制剂(例如，抗PD-1抗体分子)与LAG-3抑制剂(例如，抗LAG-3抗体分子)和TIM-3抑制剂(例如，抗TIM-3抗体分子)组合施用。
免疫调节剂与PD-1抑制剂(例如，PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和/或TGFR中的一种或多种)的其他组合也包含在本披露内。本领域已知的或本文披露的任何抗体分子均可用于上述检查点分子抑制剂的组合中。
CTLA-4抑制剂
在一些实施例中，将本披露的ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体与CTLA-4抑制剂组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。在一些实施例中，PD-1抑制剂选自伊匹单抗(MDX-010、MDX-101或Yervoy，百时美施贵宝公司)、曲美木单抗(tremelilumab)(替西木单抗(ticilimumab)，辉瑞公司/阿斯利康公司(Pfizer/AstraZeneca))、AGEN1181(艾吉纳斯公司)、泽弗利单抗(Zalifrelimab)(AGEN1884，艾吉纳斯公司)、IBI310(信达生物公司(Innovent Biologics))。
PD-1抑制剂
在一些实施例中，将本披露的ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体与PD-1抑制剂组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。在一些实施例中，PD-1抑制剂选自PDR001(诺华股份有限公司)、纳武单抗(百时美施贵宝公司)、派姆单抗(默克公司)、匹地利珠单抗(治疗技术公司(CureTech))、MEDI0680(英商梅迪缪思有限公司)、西米普利单抗(REGN2810，再生元公司(Regeneron))、多塔利单抗(Dostarlimab)(TSR-042，泰萨罗公司(Tesaro))、PF-06801591(辉瑞公司)、替雷利珠单抗(BGB-A317，百济神州公司(Beigene))、BGB-108(百济神州公司)、INCSHR1210(因赛特公司)、巴替利单抗(Balstilimab(AGEN2035，艾吉纳斯公司))、信迪利单抗(信达生物公司)、特瑞普利单抗(上海君实生物公司(Shanghai Junshi Bioscience))、卡瑞利珠单抗(江苏恒瑞医药公司(Jiangsu Hengrui Medicine Co.))、或AMP-224(安普利公司(Amplimmune))。
示例性PD-1抑制剂
在一个实施例中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体分子。在一个实施例中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体分子，如题为“Antibody Molecules to PD-1and Uses Thereof[PD-1的抗体分子及其用途]”的2015年7月30日公开的US 2015/0210769(将其通过引用以其全文并入)中所述的。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个互补决定区(CDR)(或总体上全部CDR)，该重链和轻链可变区包含表14(例如，来自表14中披露的BAP049-克隆-E或BAP049-克隆-B的重链和轻链可变区序列)中所示的氨基酸序列，或由表14中所示的核苷酸序列编码。在一些实施例中，CDR根据卡巴特定义(例如，如表14中所列出的)。在一些实施例中，CDR根据乔西亚定义(例如，如表14中所列出的)。在一些实施例中，CDR根据卡巴特和乔西亚两者的组合CDR定义(例如，如表14中所列出的)。在一个实施例中，VH CDR1的卡巴特和乔西亚CDR的组合包含氨基酸序列GYTFTTYWMH(SEQ ID NO:3198)。在一个实施例中，相对于表14中所示的氨基酸序列，或由表14中所示的核苷酸序列编码的，CDR中的一个或多个(或总体上全部CDR)具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个变化，例如氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)或缺失。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:22的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:3018的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:3019的VHCDR3氨基酸序列的重链可变区(VH)；以及含有SEQ ID NO:31的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:32的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:286的VLCDR3氨基酸序列的轻链可变区(VL)，各自披露于表14中。
在一个实施例中，抗体分子包含：含有由SEQ ID NO:3031的核苷酸序列编码的VHCDR1、由SEQ ID NO:3032的核苷酸序列编码的VHCDR2、和由SEQ ID NO:3033的核苷酸序列编码的VHCDR3的VH；以及含有由SEQ ID NO:3036的核苷酸序列编码的VLCDR1、由SEQ IDNO:3037的核苷酸序列编码的VLCDR2、和由SEQ ID NO:3038的核苷酸序列编码的VLCDR3的VL，各自披露于表14中。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:27具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VH。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3024的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3024具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VL。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:37具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VL。在一个实施例中，所述抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:3024的氨基酸序列的VL。在一个实施例中，所述抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL。
在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:28的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:28具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的VH。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3027或38的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:3027或38具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的核苷酸序列编码的VL。在一个实施例中，所述抗体分子包含：由SEQ ID NO:28的核苷酸序列编码的VH和由SEQ ID NO:3027或38的核苷酸序列编码的VL。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:29具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的重链。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3029的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3029具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的轻链。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:39具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的轻链。在一个实施例中，所述抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:3029的氨基酸序列的轻链。在一个实施例中，所述抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的轻链。
在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:30的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:30具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的重链。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3030或3023的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:3030或3023具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的核苷酸序列编码的轻链。在一个实施例中，所述抗体分子包含：由SEQ ID NO:30的核苷酸序列编码的重链和由SEQ ID NO:3030或3023的核苷酸序列编码的轻链。
本文描述的抗体分子可以通过载体、宿主细胞、和在US 2015/0210769(将其通过引用以其全文并入)中描述的方法制得。
表14.示例性抗PD-1抗体分子的氨基酸和核苷酸序列
Figure BDA0003991130860003411
Figure BDA0003991130860003421
Figure BDA0003991130860003431
Figure BDA0003991130860003441
Figure BDA0003991130860003451
Figure BDA0003991130860003461
其他示例性PD-1抑制剂
在一些实施例中，抗PD-1抗体是纳武单抗(CAS登记号：946414-94-4)。纳武单抗的替代性名称包括MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538、BMS-936558或
Figure BDA0003991130860003462
纳武单抗是特异性阻断PD1的完全人IgG4单克隆抗体。纳武单抗(克隆5C4)和特异性结合PD1的其他人单克隆抗体披露于美国专利号8,008,449和PCT公开号WO2006/121168(将其通过引用以其全文并入)中。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一种或多种：纳武单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列，例如，如表15中所披露的。
在其他实施例中，该抗PD-1抗体是派姆单抗。派姆单抗(商品名KEYTRUDA，以前称为Lambrolizumab，也称为Merck 3745、MK-3475或SCH-900475)是与PD1结合的人源化IgG4单克隆抗体。派姆单抗披露于例如Hamid,O.等人(2013)New England Journal ofMedicine[新英格兰医学杂志]369(2):134–44,PCT公开号WO 2009/114335，以及美国专利号8,354,509(将其通过引用以其全文并入)中。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一种或多种：派姆单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列，例如，如表15中所披露的。
在一些实施例中，该抗PD-1抗体是匹地利珠单抗。匹地利珠单抗(CT-011；治疗科技公司(Cure Tech))是与PD1结合的人源化IgG1k单克隆抗体。匹地利珠单抗和其他人源化抗PD-1单克隆抗体披露于PCT公开号WO 2009/101611(将其通过引用以其全文并入)中。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一种或多种：匹地利珠单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列，例如，如表15中所披露的。
其他抗PD1抗体披露于美国专利号8,609,089、美国公开号2010028330、和/或美国公开号20120114649(将其通过引用以其全文并入)中。其他抗PD1抗体包括AMP 514(安普利公司)。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是MEDI0680(英商梅迪缪思有限公司)，也称为AMP-514。MEDI0680和其他抗PD-1抗体在US 9,205,148和WO 2012/145493中披露，这些文献通过引用以其全文并入。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：MEDI0680的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是西米普利单抗(再生元公司)，也称为REGN2810。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：REGN2810的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是PF-06801591(辉瑞公司)。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：PF-06801591的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是替雷利珠单抗(百济神州公司)，也称为BGB-A317或BGB-108。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：BGB-A317或BGB-108的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是INCSHR1210(因赛特公司)，也称为INCSHR01210或SHR-1210。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：INCSHR1210的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是多塔利单抗(泰萨罗公司)，也称为TSR-042，也称为ANB011。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：TSR-042的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是巴替利单抗(艾吉纳斯公司)，也称为AGEN2035。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：巴替利单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是信迪利单抗(信达生物公司)。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：信迪利单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是特瑞普利单抗(上海君实生物公司)。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：特瑞普利单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是卡瑞利珠单抗(江苏恒瑞医药公司)。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：卡瑞利珠单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
其他已知的抗PD-1抗体包括描述于例如以下中的那些：WO 2015/112800、WO2016/092419、WO 2015/085847、WO 2014/179664、WO 2014/194302、WO 2014/209804、WO2015/200119、US 8,735,553、US 7,488,802、US 8,927,697、US 8,993,731、和US 9,102,727(将其通过援引以其全文并入)。
在一个实施例中，抗PD-1抗体是与本文所述的抗PD-1抗体之一竞争PD-1上的相同表位结合和/或结合至PD-1上的相同表位的抗体。
在一个实施例中，PD-1抑制剂是抑制PD-1信号传导途径的肽，例如，如US 8,907,053(将其通过引用以其全文并入)中所述的。在一些实施例中，PD-1抑制剂是免疫粘附素(例如包含融合到恒定区(例如免疫球蛋白序列的Fc区)的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施例中，PD-1抑制剂是AMP-224(B7-DCIg(安普利公司)，例如，披露于WO 2010/027827和WO 2011/066342，将其通过引用以其全文并入)中。
表15.其他示例性抗PD-1抗体分子的氨基酸序列
Figure BDA0003991130860003491
Figure BDA0003991130860003501
PD-L1抑制剂
在一些实施例中，将本披露的ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体与PD-L1抑制剂组合使用，用于治疗疾病(例如癌症)。在一些实施例中，PD-L1抑制剂选自FAZ053(诺华股份有限公司)、阿特珠单抗(atezolizumab)(基因泰克公司/罗氏公司(Roche))、阿维鲁单抗(默克雪兰诺公司(MerckSerono)和辉瑞公司)、度伐鲁单抗(英商梅迪缪思有限公司/阿斯利康公司)或BMS-936559(百时美施贵宝公司)。
示例性PD-L1抑制剂
在一个实施例中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体分子。在一个实施例中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体分子，如题为“Antibody Molecules to PD-L1 and Uses Thereof[PD-L1的抗体分子及其用途]”的2016年4月21日公开的US 2016/0108123(将其通过引用以其全文并入)中所披露的。
在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个互补决定区(CDR)(或总体上全部CDR)，该重链和轻链可变区包含表16(例如，来自表16中披露的BAP058-克隆O或BAP058-克隆N的重链和轻链可变区序列)中所示的氨基酸序列，或由表16中所示的核苷酸序列编码。在一些实施例中，CDR根据卡巴特定义(例如，如表16中所列出的)。在一些实施例中，CDR根据乔西亚定义(例如，如表16中所列出的)。在一些实施例中，CDR根据卡巴特和乔西亚两者的组合CDR定义(例如，如表16中所列出的)。在一个实施例中，VH CDR1的卡巴特和乔西亚CDR的组合包含氨基酸序列GYTFTSYWMY(SEQ ID NO:3199)。在一个实施例中，相对于表16中所示的氨基酸序列，或由表16中所示的核苷酸序列编码的，CDR中的一个或多个(或总体上全部CDR)具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个变化，例如氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)或缺失。
在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3048的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:3049的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:3050的VHCDR3氨基酸序列的重链可变区(VH)；以及含有SEQ ID NO:3056的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:3057的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:3058的VLCDR3氨基酸序列的轻链可变区(VL)，各自披露于表16中。
在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含：含有由SEQ ID NO:3075的核苷酸序列编码的VHCDR1、由SEQ ID NO:3076的核苷酸序列编码的VHCDR2、和由SEQ ID NO:3077的核苷酸序列编码的VHCDR3的VH；以及含有由SEQ ID NO:3080的核苷酸序列编码的VLCDR1、由SEQID NO:3081的核苷酸序列编码的VLCDR2、和由SEQ ID NO:3082的核苷酸序列编码的VLCDR3的VL，各自披露于表16中。
在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3053的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3053具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VH。在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3063的氨基酸序列、或与SEQ IDNO:3063具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VL。在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3067的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3067具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VH。在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3071的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3071具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VL。在一个实施例中，所述抗PD-L1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3053的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:3063的氨基酸序列的VL。在一个实施例中，所述抗PD-L1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3067的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:3071的氨基酸序列的VL。
在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3054的核苷酸序列、或与SEQ IDNO:3054具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的VH。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3064的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:3064具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的VL。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3068的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:3068具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的VH。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ IDNO:3072的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:3072具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的VL。在一个实施例中，抗体分子包含由SEQ ID NO:3054的核苷酸序列编码的VH和由SEQ ID NO:3064的核苷酸序列编码的VL。在一个实施例中，抗体分子包含由SEQ ID NO:3068的核苷酸序列编码的VH和由SEQ ID NO:3072的核苷酸序列编码的VL。
在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3055的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3055具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的重链。在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3065的氨基酸序列、或与SEQ IDNO:3065具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的轻链。在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3069的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3069具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的重链。在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3073的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3073具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的轻链。在一个实施例中，所述抗PD-L1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3055的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:3065的氨基酸序列的轻链。在一个实施例中，所述抗PD-L1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3069的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:3073的氨基酸序列的轻链。
在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3062的核苷酸序列、或与SEQ IDNO:3062具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的重链。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3066的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:3066具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的轻链。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3070的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:3070具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的重链。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3074的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:3074具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的轻链。在一个实施例中，抗体分子包含由SEQ ID NO:3062的核苷酸序列编码的重链和由SEQ ID NO:3066的核苷酸序列编码的轻链。在一个实施例中，抗体分子包含由SEQ ID NO:3070的核苷酸序列编码的重链和由SEQ ID NO:3074的核苷酸序列编码的轻链。
本文描述的抗体分子可以通过载体、宿主细胞、和在US 2016/0108123(将其通过引用以其全文并入)中描述的方法制得。
表16.示例性抗PD-L1抗体分子的氨基酸和核苷酸序列
Figure BDA0003991130860003541
Figure BDA0003991130860003551
Figure BDA0003991130860003561
Figure BDA0003991130860003571
Figure BDA0003991130860003581
Figure BDA0003991130860003591
其他示例性PD-L1抑制剂
在一些实施例中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。在一些实施例中，抗PD-L1抑制剂选自YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、或MDX-1105MSB-0010718C(也称为A09-246-2)，披露于例如WO 2013/0179174中，并且具有本文披露的序列(或与其基本上相同或相似的序列，例如与指定序列具有至少85％、90％、95％、或更高同一性的序列)。
在一个实施例中，该PD-L1抑制剂是MDX-1105。MDX-1105(也称为BMS-936559)是抗PD-L1抗体，描述于PCT公开号WO 2007/005874中。
在一个实施例中，该PD-L1抑制剂是YW243.55.S70。YW243.55.S70抗体是抗PD-L1，描述于PCT公开号WO 2010/077634中。
在一个实施例中，PD-L1抑制剂是MDPL3280A(基因泰克公司/罗氏公司)，也称为阿特珠单抗、RG7446、RO5541267、YW243.55.S70、或TECENTRIQTM。MDPL3280A是与PD-L1结合的人Fc优化的IgG1单克隆抗体。MDPL3280A和针对PD-L1的其他人单克隆抗体披露于美国专利号：7,943,743和美国公开号：20120039906(将其通过引用以其全文并入)。在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含以下中的一种或多种：阿特珠单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列，例如，如表17中所披露的。
在其他实施例中，该PD-L2抑制剂是AMP-224。AMP-224是PD-L2Fc融合可溶性受体，其阻断PD1和B7-H1之间的相互作用(B7-DCIg；安普利公司；例如，披露于PCT公开号WO2010/027827和WO 2011/066342中)。
在一个实施例中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体分子。在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子是阿维鲁单抗(默克雪兰诺公司和辉瑞公司)，也称为MSB0010718C。阿维鲁单抗和其他抗PD-L1抗体披露在WO 2013/079174中，将其通过引用以其全文并入。在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含以下中的一种或多种：阿维鲁单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列，例如，如表17中所披露的。
在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子是度伐鲁单抗(英商梅迪缪思有限公司/阿斯利康公司)，也称为MEDI4736。度伐鲁单抗和其他抗PD-L1抗体披露在US 8,779,108中，将其通过引用以其全文并入。在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含以下中的一种或多种：度伐鲁单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列，例如，如表17中所披露的。
在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子是BMS-936559(百时美施贵宝公司)，也称为MDX-1105或12A4。BMS-936559和其他抗PD-L1抗体披露在US 7,943,743和WO 2015/081158中，这些申请通过引起以其全文并入。在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含以下中的一种或多种：BMS-936559的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列，例如，如表17中所披露的。
其他已知的抗PD-L1抗体包括描述于例如以下中的那些：WO 2015/181342、WO2014/100079、WO 2016/000619、WO 2014/022758、WO 2014/055897、WO 2015/061668、WO2013/079174、WO 2012/145493、WO 2015/112805、WO 2015/109124、WO 2015/195163、US 8,168,179、US 8,552,154、US 8,460,927、和US 9,175,082，这些文献通过引用以其全文并入。
在一个实施例中，抗PD-L1抗体是与本文描述的抗PD-L1抗体之一竞争与PD-L1上的相同表位结合和/或结合PD-L1上的相同表位的抗体。
表17.其他示例性抗PD-L1抗体分子的氨基酸序列
Figure BDA0003991130860003611
Figure BDA0003991130860003621
LAG-3抑制剂
在一些实施例中，将本披露的ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体与LAG-3抑制剂组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。在一些实施例中，LAG-3抑制剂选自LAG525(诺华股份有限公司)、BMS-986016(百时美施贵宝公司)或TSR-033(泰萨罗公司)。
示例性LAG-3抑制剂
在一个实施例中，LAG-3抑制剂是抗LAG-3抗体分子。在一个实施例中，LAG-3抑制剂是抗LAG-3抗体分子，如题为“Antibody Molecules to LAG-3and Uses Thereof[LAG-3的抗体分子及其用途]”的2015年9月17日公开的US 2015/0259420(将其通过引用以其全文并入)中所披露的。
在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个互补决定区(CDR)(或总体上全部CDR)，该重链和轻链可变区包含表18(例如，来自表18中披露的BAP050-克隆I或BAP050-克隆J的重链和轻链可变区序列)中所示的氨基酸序列，或由表18中所示的核苷酸序列编码。在一些实施例中，CDR根据卡巴特定义(例如，如表18中所列出的)。在一些实施例中，CDR根据乔西亚定义(例如，如表18中所列出的)。在一些实施例中，CDR根据卡巴特和乔西亚两者的组合CDR定义(例如，如表18中所列出的)。在一个实施例中，VH CDR1的卡巴特和乔西亚CDR的组合包含氨基酸序列GFTLTNYGMN(SEQ ID NO:3158)。在一个实施例中，相对于表18中所示的氨基酸序列，或由表18中所示的核苷酸序列编码的，CDR中的一个或多个(或总体上全部CDR)具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个变化，例如氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)或缺失。
在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3094的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:3095的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:3096的VHCDR3氨基酸序列的重链可变区(VH)；以及含有SEQ ID NO:3103的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:3104的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:3105的VLCDR3氨基酸序列的轻链可变区(VL)，各自披露于表18中。
在一个实施例中，所述抗LAG-3抗体分子包含：含有由SEQ ID NO:3129或3130的核苷酸序列编码的VHCDR1、由SEQ ID NO:3131或3132的核苷酸序列编码的VHCDR2、和由SEQID NO:3133或3134的核苷酸序列编码的VHCDR3的VH；以及含有由SEQ ID NO:3139或3140的核苷酸序列编码的VLCDR1、由SEQ ID NO:3141或3142的核苷酸序列编码的VLCDR2、和由SEQID NO:3143或3144的核苷酸序列编码的VLCDR3的VL，各自披露于表18中。在一个实施例中，所述抗LAG-3抗体分子包含：含有由SEQ ID NO:3150或3130的核苷酸序列编码的VHCDR1、由SEQ ID NO:3151或3132的核苷酸序列编码的VHCDR2、和由SEQ ID NO:3152或3134的核苷酸序列编码的VHCDR3的VH；以及含有由SEQ ID NO:3139或3140的核苷酸序列编码的VLCDR1、由SEQ ID NO:3141或3142的核苷酸序列编码的VLCDR2、和由SEQ ID NO:3143或3144的核苷酸序列编码的VLCDR3的VL，各自披露于表18中。
在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3099的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3099具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VH。在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3111的氨基酸序列、或与SEQ IDNO:3111具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VL。在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3117的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3117具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VH。在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3123的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3123具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VL。在一个实施例中，所述抗LAG-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3099的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:3111的氨基酸序列的VL。在一个实施例中，所述抗LAG-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3117的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:3123的氨基酸序列的VL。
在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3100或3101的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:3100或3101具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的核苷酸序列编码的VH。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3112或3113的核苷酸序列，或与SEQID NO:3112或3113具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的核苷酸序列编码的VL。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3118或3119的核苷酸序列，或与SEQ IDNO:3118或3119具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的核苷酸序列编码的VH。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3124或3125的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:3124或3125具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的核苷酸序列编码的VL。在一个实施例中，所述抗体分子包含：由SEQ ID NO:3100或3101的核苷酸序列编码的VH和由SEQID NO:3112或3113的核苷酸序列编码的VL。在一个实施例中，所述抗体分子包含：由SEQ IDNO:3118或3119的核苷酸序列编码的VH和由SEQ ID NO:3124或3125的核苷酸序列编码的VL。
在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3102的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3102具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的重链。在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3114的氨基酸序列、或与SEQ IDNO:3114具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的轻链。在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3120的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3120具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的重链。在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3126的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3126具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的轻链。在一个实施例中，所述抗LAG-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3102的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:3114的氨基酸序列的轻链。在一个实施例中，所述抗LAG-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3120的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:3126的氨基酸序列的轻链。
在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3109或3110的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:3109或3110具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的核苷酸序列编码的重链。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3115或3116的核苷酸序列，或与SEQID NO:3115或3116具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的核苷酸序列编码的轻链。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3121或3122的核苷酸序列，或与SEQ IDNO:3121或3122具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的核苷酸序列编码的重链。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3127或3128的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:3127或3128具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的核苷酸序列编码的轻链。在一个实施例中，所述抗体分子包含：由SEQ ID NO:3109或3110的核苷酸序列编码的重链和由SEQ ID NO:3115或3116的核苷酸序列编码的轻链。在一个实施例中，所述抗体分子包含：由SEQ ID NO:3121或3122的核苷酸序列编码的重链和由SEQ ID NO:3127或3128的核苷酸序列编码的轻链。
本文描述的抗体分子可以通过载体、宿主细胞、和在US2015/0259420(将其通过引用以其全文并入)中描述的方法制得。
表18.示例性抗LAG-3抗体分子的氨基酸和核苷酸序列
Figure BDA0003991130860003661
Figure BDA0003991130860003671
Figure BDA0003991130860003681
Figure BDA0003991130860003691
Figure BDA0003991130860003701
Figure BDA0003991130860003711
Figure BDA0003991130860003721
Figure BDA0003991130860003731
Figure BDA0003991130860003741
Figure BDA0003991130860003751
其他示例性LAG-3抑制剂
在一个实施例中，LAG-3抑制剂是抗LAG-3抗体分子。在一个实施例中，LAG-3抑制剂是BMS-986016(百时美施贵宝公司)，也称为BMS986016。BMS-986016和其他抗LAG-3抗体披露在WO 2015/116539和US 9,505,839中，这些申请通过引用以其全文并入。在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含以下中的一种或多种：BMS-986016的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列，例如，在表19中所披露的。
在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子是TSR-033(泰萨罗公司)。在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含以下中的一种或多种：TSR-033的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子是IMP731或GSK2831781(GSK公司和普瑞马生物医药公司(Prima BioMed))。IMP731和其他抗LAG-3抗体披露在WO 2008/132601和US 9,244,059中，这些文献通过引用以其全文并入。在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含以下中的一种或多种：IMP731的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列，例如，在表19中所披露的。在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含以下中的一种或多种：GSK2831781的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子是IMP761(普瑞马生物医药公司)。在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含以下中的一种或多种：IMP761的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
其他已知的抗LAG-3抗体可以在例如，WO 2008/132601、WO 2010/019570、WO2014/140180、WO 2015/116539、WO 2015/200119、WO 2016/028672、US 9,244,059、US 9,505,839中描述的那些，这些文献通过引用以其全文并入。
在一个实施例中，抗LAG-3抗体是与本文描述的抗LAG-3抗体之一竞争与LAG-3上的相同表位结合和/或结合LAG-3上的相同表位的抗体。
在一个实施例中，抗LAG-3抑制剂是可溶性LAG-3蛋白质，例如，IMP321(普瑞马生物医药公司)，例如，如披露于WO 2009/044273(将其通过引用以其全文并入)中。
表19.其他示例性抗LAG-3抗体分子的氨基酸序列
Figure BDA0003991130860003761
Figure BDA0003991130860003771
TIM-3抑制剂
在某些实施例中，免疫检查点分子的抑制剂是TIM-3的抑制剂。在一些实施例中，将本披露的ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体与TIM-3抑制剂组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。在一些实施例中，TIM-3抑制剂是MGB453(诺华股份有限公司)、LY3321367(礼来公司(Eli Lilly))、Sym023(Symphogen公司)、BGB-A425(百济神州公司)、INCAGN-2390(艾吉纳斯公司/因赛特公司)、MBS-986258(BMS公司/五柱公司(Five Prime))、RO-7121661(罗氏公司)、LY-3415244(礼来公司)、或TSR-022(泰萨罗公司)。
示例性TIM-3抑制剂
在一个实施例中，TIM-3抑制剂是抗TIM-3抗体分子。在一个实施例中，TIM-3抑制剂是抗TIM-3抗体分子，如题为“Antibody Molecules to TIM-3and Uses Thereof[TIM-3的抗体分子及其用途]”的2015年8月6日公开的US 2015/0218274(将其通过引用以其全文并入)中所披露的。
在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个互补决定区(CDR)(或总体上全部CDR)，该重链和轻链可变区包含表20(例如，来自表20中披露的ABTIM3-hum11或ABTIM3-hum03的重链和轻链可变区序列)中所示的氨基酸序列，或由表20中所示的核苷酸序列编码。在一些实施例中，CDR根据卡巴特定义(例如，如表20中所列出的)。在一些实施例中，CDR根据乔西亚定义(例如，如表20中所列出的)。在一个实施例中，相对于表20中所示的氨基酸序列，或由表20中所示的核苷酸序列编码的，CDR中的一个或多个(或总体上全部CDR)具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个变化，例如氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)或缺失。
在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3159的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:3160的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:3161的VHCDR3氨基酸序列的重链可变区(VH)；以及含有SEQ ID NO:3168的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:3169的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:3170的VLCDR3氨基酸序列的轻链可变区(VL)，各自披露于表20中。在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3159的VHCDR1氨基酸序列、SEQID NO:3178的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:3161的VHCDR3氨基酸序列的重链可变区(VH)；以及含有SEQ ID NO:3168的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:3169的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:3170的VLCDR3氨基酸序列的轻链可变区(VL)，各自披露于表20中。
在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3164的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3164具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VH。在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3174的氨基酸序列、或与SEQ IDNO:3174具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VL。在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3180的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3180具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VH。在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3184的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3184具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VL。在一个实施例中，所述抗TIM-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3164的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:3174的氨基酸序列的VL。在一个实施例中，所述抗TIM-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3180的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:3184的氨基酸序列的VL。
在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3165的核苷酸序列、或与SEQ IDNO:3165具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的VH。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3175的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:3175具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的VL。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3181的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:3181具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的VH。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ IDNO:3185的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:3185具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的VL。在一个实施例中，抗体分子包含由SEQ ID NO:3165的核苷酸序列编码的VH和由SEQ ID NO:3175的核苷酸序列编码的VL。在一个实施例中，抗体分子包含由SEQ ID NO:3181的核苷酸序列编码的VH和由SEQ ID NO:3185的核苷酸序列编码的VL。
在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3166的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3166具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的重链。在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3176的氨基酸序列、或与SEQ IDNO:3176具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的轻链。在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3182的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3182具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的重链。在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3186的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3186具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的轻链。在一个实施例中，所述抗TIM-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3166的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:3176的氨基酸序列的轻链。在一个实施例中，所述抗TIM-3抗体分子包含：含有SEQ ID NO:3182的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:3186的氨基酸序列的轻链。
在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3167的核苷酸序列、或与SEQ IDNO:3167具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的重链。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3177的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:3177具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的轻链。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3183的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:3183具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的重链。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:3187的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:3187具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的轻链。在一个实施例中，抗体分子包含由SEQ ID NO:3167的核苷酸序列编码的重链和由SEQ ID NO:3177的核苷酸序列编码的轻链。在一个实施例中，抗体分子包含由SEQ ID NO:3183的核苷酸序列编码的重链和由SEQ ID NO:3187的核苷酸序列编码的轻链。
本文描述的抗体分子可以通过载体、宿主细胞、和在US2015/0218274(将其通过引用以其全文并入)中描述的方法制得。
表20.示例性抗TIM-3抗体分子的氨基酸和核苷酸序列
Figure BDA0003991130860003801
Figure BDA0003991130860003811
Figure BDA0003991130860003821
Figure BDA0003991130860003831
Figure BDA0003991130860003841
其他示例性TIM-3抑制剂
在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子是TSR-022(安奈普泰斯生物有限公司(AnaptysBio)/泰萨罗公司)。在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含以下中的一种或多种：TSR-022的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含以下中的一种或多种：APE5137、或APE5121的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列，例如，如表21中所披露的。APE5137、APE5121和其他抗TIM-3抗体披露于WO 2016/161270(将其通过引用以其全文并入)中。
在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子是抗体克隆F38-2E2。在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含以下中的一种或多种：F38-2E2的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子是LY3321367(礼来公司)。在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含以下中的一种或多种：LY3321367的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链可变区序列和/或轻链可变区序列、或重链序列和/或轻链序列。
在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子是Sym023(Symphogen公司)。在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含以下中的一种或多种：Sym023的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链可变区序列和/或轻链可变区序列、或重链序列和/或轻链序列。
在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子是BGB-A425(百济神州公司)。在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含以下中的一种或多种：BGB-A425的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链可变区序列和/或轻链可变区序列、或重链序列和/或轻链序列。
在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子是INCAGN-2390(艾吉纳斯公司/因赛特公司)。在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含以下中的一种或多种：INCAGN-2390的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链可变区序列和/或轻链可变区序列、或重链序列和/或轻链序列。
在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子是BMS-986258(BMS公司/五柱公司)。在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含以下中的一种或多种：BMS-986258的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链可变区序列和/或轻链可变区序列、或重链序列和/或轻链序列。
在一个实施例中，抗TIM-3抗体或抑制剂分子是RO-7121661(罗氏公司)。在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含以下中的一种或多种：RO-7121661的TIM-3结合臂的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链可变区序列和/或轻链可变区序列、或重链序列和/或轻链序列。
在一个实施例中，抗TIM-3抗体或抑制剂分子是LY-3415244(礼来公司)。在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含以下中的一种或多种：LY-3415244的TIM-3结合臂的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链可变区序列和/或轻链可变区序列、或重链序列和/或轻链序列。
其他已知的抗TIM-3抗体包括例如在WO 2016/111947、WO 2016/071448、WO 2016/144803、US 8,552,156、US 8,841,418、和US 9,163,087(将其通过引用以其整体并入)中描述的那些。
在一个实施例中，抗TIM-3抗体是与本文描述的抗TIM-3抗体之一竞争与TIM-3上的相同表位结合和/或结合TIM-3上的相同表位的抗体。
表21.其他示例性抗TIM-3抗体分子的氨基酸序列
Figure BDA0003991130860003861
细胞因子
在又另一个实施例中，将本披露的ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体与一种或多种细胞因子(包括但不限于干扰素、IL-2、IL-15、IL-7、或IL21)组合使用。在某些实施例中，将ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体与IL-15/IL-15Ra复合物组合施用。在一些实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物选自NIZ985(诺华股份有限公司)、ATL-803(亚拉斯托公司(Altor))或CYP0150(赛腾制药(Cytune))。
示例性IL-15/IL-15Ra复合物
在一个实施例中，细胞因子是与可溶形式的IL-15受体α(IL-15Ra)复合的IL-15。IL-15/IL-15Ra复合物可以包含共价或非共价结合至IL-15Ra的可溶形式的IL-15。在特定实施例中，人IL-15非共价地与可溶形式的IL-15Ra结合。在特定实施例中，配制品的人IL-15包含表22中的SEQ ID NO:3192的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3192具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列，并且可溶形式的人IL-15Ra包含表22中的SEQID NO:3193的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3193具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列，如WO 2014/066527(将其通过引用以其全文并入)中所述。本文描述的分子可以通过载体、宿主细胞、和在WO 2007084342(将其通过引用以其全文并入)中所述的方法制得。
表22.示例性IL-15/IL-15Ra复合物的示例性氨基酸和核苷酸序列
Figure BDA0003991130860003871
其他示例性IL-15/IL-15Ra复合物
在一个实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物是ALT-803，IL-15/IL-15Ra Fc融合蛋白(IL-15N72D:IL-15RaSu/Fc可溶性复合物)。ALT-803描述于WO 2008/143794(将其通过引用以其全文并入)中。在一个实施例中，IL-15/IL-15Ra Fc融合蛋白包含如表23中披露的序列。
在一个实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物包含与IL-15Ra的sushi结构域融合的IL-15(CYP0150，赛腾制药)。IL-15Ra的sushi结构域是指在IL-15Ra的信号肽之后的第一半胱氨酸残基处开始并且在所述信号肽之后的第四个半胱氨酸残基处结束的结构域。与IL-15Ra的sushi结构域融合的IL-15的复合物描述于WO 2007/04606和WO 2012/175222(将其通过引用以其全文并入)中。在一个实施例中，IL-15/IL-15Ra sushi结构域融合物包含如在表23中披露的序列。
表23.其他示例性IL-15/IL-15Ra复合物的示例性氨基酸序列
Figure BDA0003991130860003881
在又另一个实施例中，将本披露的ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体与一种或多种toll样受体(TLR，例如TLR7、TLR8、TLR9)的激动剂组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。在一些实施例中，本披露的化合物可以与TLR7激动剂或TLR7激动剂缀合物组合使用。
在一些实施例中，TLR7激动剂包含国际申请公开号WO 2011/049677(将其通过引用以其全文特此并入)中所披露的化合物。在一些实施例中，TLR7激动剂包含3-(5-氨基-2-(4-(2-(3,3-二氟-3-膦酰基丙氧基)乙氧基)-2-甲基苯乙基)苯并[f][1,7]萘啶-8-基)丙酸。在一些实施例中，TLR7激动剂包含具有以下式的化合物：
Figure BDA0003991130860003891
在另一个实施例中，将本披露的ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体与一种或多种血管生成抑制剂组合使用，以治疗癌症，例如贝伐珠单抗
Figure BDA0003991130860003892
阿西替尼(axitinib)
Figure BDA0003991130860003893
丙氨酸布立尼布(Brivanib alaninate)(BMS-582664，(S)-((R)-1-(4-(4-氟-2-甲基-1H-吲哚-5-基氧基)-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基氧基)丙-2-基)2-氨基丙酸)；索拉非尼
Figure BDA0003991130860003894
帕唑帕尼
Figure BDA0003991130860003895
苹果酸舒尼替尼
Figure BDA0003991130860003896
西地尼布(Cediranib)(AZD2171，CAS 288383-20-1)；维加特(Vargatef)(BIBF1120，CAS 928326-83-4)；福瑞替尼(GSK1363089)；替拉替尼(Telatinib)(BAY57-9352，CAS 332012-40-5)；阿帕替尼(Apatinib)(YN968D1，CAS 811803-05-1)；伊马替尼
Figure BDA0003991130860003897
普纳替尼(Ponatinib)(AP24534，CAS 943319-70-8)；替沃扎尼(Tivozanib)(AV951，CAS 475108-18-0)；瑞戈非尼(BAY73-4506，CAS 755037-03-7)；伐他拉尼二盐酸盐(PTK787，CAS 212141-51-0)；布立尼布(Brivanib)(BMS-540215，CAS 649735-46-6)；凡德他尼(
Figure BDA0003991130860003898
或AZD6474)；莫特塞尼二磷酸盐(Motesanib diphosphate)(AMG706，CAS 857876-30-3，N-(2,3-二氢-3,3-二甲基-1H-吲哚-6-基)-2-[(4-吡啶基甲基)氨基]-3-吡啶甲酰胺，描述于PCT公开号WO 02/066470中)；多韦替尼二乳酸(Dovitinib dilactic acid)(TKI258，CAS852433-84-2)；林夫尼(Linfanib)(ABT869，CAS 796967-16-3)；卡博替尼(XL184，CAS849217-68-1)；来他替尼(Lestaurtinib)(CAS 111358-88-4)；N-[5-[[[5-(1,1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫代]-2-噻唑基]-4-哌啶甲酰胺(BMS38703，CAS 345627-80-7)；(3R,4R)-4-氨基-1-((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514)；N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氢-2-甲基环戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(XL647，CAS 781613-23-8)；4-甲基-3-[[1-甲基-6-(3-吡啶基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基]氨基]-N-[3-(三氟甲基)苯基]-苯甲酰胺(BHG712，CAS 940310-85-0)；或阿普西柏
Figure BDA0003991130860003901
在另一个实施例中，将本披露的ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体与一种或多种热休克蛋白抑制剂组合使用，以治疗癌症，例如坦螺旋霉素(17-烯丙氨基-17-去甲氧基格尔德霉素，也称为KOS-953和17-AAG，可从西格玛公司(SIGMA)获得，并描述于美国专利号4,261,989中)；瑞他霉素(Retaspimycin)(IPI504)、加特司匹(Ganetespib)(STA-9090)；[6-氯-9-(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基甲基)-9H-嘌呤-2-基]胺(BIIB021或-CNF2024，CAS 848695-25-0)；反式-4-[[2-(氨基羰基)-5-[4,5,6,7-四氢-6,6-二甲基-4-氧代-3-(三氟甲基)-1H-吲唑-1-基]苯基]氨基]环己基甘氨酸酯(SNX5422或PF04929113，CAS 908115-27-5)；5-[2,4-二羟基-5-(1-甲基乙基)苯基]-N-乙基-4-[4-(4-吗啉基甲基)苯基]-3-异噁唑甲酰胺(AUY922，CAS747412-49-3)；或17-二甲基氨基乙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-DMAG)。
在又另一个实施例中，将本披露的ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体与一种或多种HDAC抑制剂或其他表观修饰剂组合使用。示例性HDAC抑制剂包括但不限于伏立诺他(Voninostat)
Figure BDA0003991130860003902
洛米迪星(Romidepsin)
Figure BDA0003991130860003903
曲古抑菌素A(Treichostatin A)(TSA)；Oxamflatin；伏立诺他(Vorinostat)(
Figure BDA0003991130860003904
辛二酰苯胺异羟肟酸)；Pyroxamide(syberoyl-3-氨基吡啶酰胺异羟肟酸)；Trapoxin A(RF-1023A)；Trapoxin B(RF-10238)；环[(αS,2S)-α-氨基-η-氧代-2-环氧乙烷辛酰基-O-甲基-D-酪氨酰-L-异亮氨酰基-L-脯氨酰](Cyl-1)；环[(αS,2S)-α-氨基-η-氧代-2-环氧乙烷辛酰基-O-甲基-D-酪氨酰-L-异亮氨酰基-(2S)-2-哌啶羰基](Cyl-2)；环[L-丙氨酰-D-丙氨酰-(2S)-η-氧代-L-α-氨基环氧乙烷辛酰基-D-脯氨酰](HC-毒素)；环[(αS,2S)-α-氨基-η-氧代-2-环氧乙烷辛酰基-D-苯基丙氨酰-L-亮氨酰基-(2S)-2-哌啶羰基](WF-3161)；氯洁霉素(Chlamydocin)((S)-环(2-甲基丙氨酰-L-苯基丙氨酰-D-脯氨酰-η-氧代-L-α-氨基环氧乙烷辛酰基)；组蛋白脱乙酰酶抑制剂(Apicidin)(环(8-氧代-L-2-氨基癸酰基-1-甲氧基-L-色氨酰基-L-异亮氨酰基-D-2-哌啶羰基)；洛米迪星(
Figure BDA0003991130860003911
FR-901228)；4-苯基丁酸酯；Spiruchostatin A；Mylproin(丙戊酸)；恩诺司他(Entinostat)(MS-275，N-(2-氨基苯基)-4-[N-(吡啶-3-基-甲氧基羰基)-氨基-甲基]-苯甲酰胺)；Depudecin(4,5:8,9-双酐-1,2,6,7,11-五脱氧-D-苏式-D-ido-十一-1,6-二烯醇)；4-(乙酰基氨基)-N-(2-氨基苯基)-苯甲酰胺(也称为CI-994)；N1-(2-氨基苯基)-N8-苯基-辛二酰胺(也称为BML-210)；4-(二甲基氨基)-N-(7-(羟基氨基)-7-氧代庚基)苯甲酰胺(也称为M344)；(E)-3-(4-(((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)(2-羟基乙基)氨基)-甲基)苯基)-N-羟基丙烯酰胺；帕比司他
Figure BDA0003991130860003912
莫诺司他(Mocetinostat)和贝利司他(也称为PXD101、
Figure BDA0003991130860003913
或(2E)-N-羟基-3-[3-(苯基氨磺酰基)苯基]丙-2-烯酰胺)或西达本胺(chidamide)(也称为CS055或HBI-8000，(E)-N-(2-氨基-5-氟苯基)-4-((3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺基)甲基)苯甲酰胺)。其他表观遗传修饰剂包括但不限于EZH2的抑制剂(zeste同源物2的增强剂)、EED(胚胎外胚层发育)或LSD1(赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1A或KDM1A)。
在又另一个实施例中，将本披露的ZBTB32抑制剂或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体与一种或多种吲哚胺-吡咯2,3-双加氧酶(IDO)(例如，英多莫德(也称为NLG-8189)、α-环己基-5H-咪唑并[5,1-a]异吲哚-5-乙醇(也称为NLG919)或(4E)-4-[(3-氯-4-氟苯胺基)-亚硝基亚甲基]-1,2,5-噁二唑-3-胺(也称为INCB024360))的抑制剂组合使用，以治疗癌症。
嵌合抗原受体
本披露提供如本文所描述的ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体，用于在与过继免疫疗法方法和试剂(例如嵌合抗原受体(CAR)免疫效应细胞(例如，T细胞)、或嵌合TCR转导的免疫效应细胞(例如，T细胞))组合中使用。
雌激素受体拮抗剂
在一些实施例中，将雌激素受体(ER)拮抗剂与ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。在一些实施例中，雌激素受体拮抗剂是选择性雌激素受体降解剂(SERD)。SERD是与受体结合并导致例如受体的降解或下调的雌激素受体拮抗剂(Boer K.等人,(2017)Therapeutic Advances in Medical Oncology[肿瘤医学治疗进展]9(7):465-479)。ER是激素活化的转录因子，其对于例如人生殖系统的生长、发育和生理学是重要的。ER被例如激素雌激素(17β雌二醇)活化。ER表达和信号传导涉及癌症(例如，乳腺癌)，例如ER阳性(ER+)乳腺癌。在一些实施例中，SERD选自LSZ102、氟维司群、布利司群(brilanestrant)、或依拉司群(elacestrant)。
示例性雌激素受体拮抗剂
在一些实施例中，SERD包含国际申请公开号WO 2014/130310(将其通过引用以其全文特此并入)中所披露的化合物。在一些实施例中，SERD包含LSZ102。LSZ102具有化学名称：(E)-3-(4-((2-(2-(1,1-二氟乙基)-4-氟苯基)-6-羟基苯并[b]噻吩-3-基)氧基)苯基)丙烯酸。
其他示例性雌激素受体拮抗剂
在一些实施例中，SERD包含氟维司群(CAS登记号：129453-61-8)或国际申请公开号WO 2001/051056(将其通过引用以其全文特此并入)中所披露的化合物。氟维司群也称为ICI 182780、ZM 182780、
Figure BDA0003991130860003921
或(7α,17β)-7-{9-[(4,4,5,5,5-五氟戊基)亚磺酰基]壬基}雌-1,3,5(10)-三烯-3,17-二醇。氟维司群是具有0.29nM的IC50的高亲和力的雌激素受体拮抗剂。
在一些实施例中，SERD包含依拉司群(CAS登记号：722533-56-4)或美国专利号7,612,114(将其通过引用以其全文并入)中所披露的化合物。依拉司群也称为RAD1901、ER-306323或(6R)-6-{2-[乙基({4-[2-(乙基氨基)乙基]苯基}甲基)氨基]-4-甲氧基苯基}-5,6,7,8-四氢萘-2-醇。依拉司群是口服生物可利用的、非甾体结合选择性雌激素受体调节剂(SERM)和SERD。依拉司群还披露于例如Garner F等人,(2015)Anticancer Drugs[抗癌药物]26(9):948-56中。
在一些实施例中，SERD是布利司群(CAS登记号：1365888-06-7)或国际申请公开号WO 2015/136017(将其通过引用以其全文并入)中所披露的化合物。布利司群也称为GDC-0810、ARN810、RG-6046、RO-7056118或(2E)-3-{4-[(1E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基]苯基}丙-2-烯酸。布利司群是具有0.7nM的IC50的下一代口服生物可利用的选择性SERD。布利司群是还披露于例如Lai A.等人(2015)Journal of MedicinalChemistry[医药化学杂志]58(12):4888–4904中。
在一些实施例中，SERD选自RU 58668、GW7604、AZD9496、巴多昔芬、哌喷昔芬(pipendoxifene)、阿佐昔芬、OP-1074、或阿考比芬，例如，如McDonell等人(2015)Journalof Medicinal Chemistry[医药化学杂志]58(12)4883-4887中所披露的。其他示例性雌激素受体拮抗剂披露于例如WO 2011/156518、WO 2011/159769、WO 2012/037410、WO 2012/037411、和US 2012/0071535(所有这些文献都通过引用以其全文特此并入)中。
CDK4/6抑制剂
在一些实施例中，将细胞周期蛋白依赖性激酶4或6(CDK4/6)的抑制剂与ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。在一些实施例中，CDK4/6抑制剂选自瑞博西尼(Ribociclib)、阿贝西利(abemaciclib)(礼来公司)或帕柏西利。
示例性CDK4/6抑制剂
在一些实施例中，CDK4/6抑制剂包含瑞博西尼(CAS登记号：1211441-98-3)或美国专利号8,415,355和8,685,980(将其通过引用以其全文并入)中所披露的化合物。
在一些实施例中，CDK4/6抑制剂包含国际申请公开号WO 2010/020675，以及美国专利号8,415,355和8,685,980(将其通过引用以其全文并入)中所披露的化合物。
在一些实施例中，CDK4/6抑制剂包含瑞博西尼(CAS登记号：1211441-98-3)。瑞博西尼也称为LEE011、
Figure BDA0003991130860003941
或7-环戊基-N,N-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺。
其他示例性CDK4/6抑制剂
在一些实施例中，CDK4/6抑制剂包含阿贝西利(CAS登记号：1231929-97-7)。阿贝西利也称为LY835219或N-[5-[(4-乙基-1-哌嗪基)甲基]-2-吡啶基]-5-氟-4-[4-氟-2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-苯并咪唑-6-基]-2-嘧啶胺。阿贝西利是对CDK4和CDK6具有选择性的CDK抑制剂，并披露于例如Torres-Guzman R等人(2017)Oncotarget[肿瘤靶标]10.18632/oncotarget.17778中。
在一些实施例中，CDK4/6抑制剂包含帕柏西利(CAS登记号：571190-30-2)。帕柏西利也称为PD-0332991、
Figure BDA0003991130860003942
或6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(1-哌嗪基)-2-吡啶基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮。帕柏西利抑制CDK4(具有11nM的IC50)和抑制CDK6(具有16nM的IC50)，并披露于例如Finn等人(2009)Breast Cancer Research[乳腺癌研究]11(5):R77中。
CXCR2抑制剂
在一些实施例中，将趋化因子(C-X-C基序)受体2(CXCR2)的抑制剂与ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。在一些实施例中，CXCR2抑制剂选自6-氯-3-((3,4-二氧代-2-(戊烷-3-基氨基)环丁-1-烯-1-基)氨基)-2-羟基-N-甲氧基-N-甲基苯磺酰胺、达尼利星(danirixin)、瑞帕利星(reparixin)、或那伐利星(navarixin)。
示例性CXCR2抑制剂
在一些实施例中，CXCR2抑制剂包含美国专利号7989497、8288588、8329754、8722925、9115087，美国申请公开号US 2010/0152205、US 2011/0251205和US 2011/0251206，以及国际申请公开号WO 2008/061740、WO 2008/061741、WO 2008/062026、WO2009/106539、WO 2010/063802、WO 2012/062713、WO 2013/168108、WO 2010/015613和WO2013/030803中所披露的化合物。在一些实施例中，CXCR2抑制剂包含6-氯-3-((3,4-二氧代-2-(戊烷-3-基氨基)环丁-1-烯-1-基)氨基)-2-羟基-N-甲氧基-N-甲基苯磺酰胺或其胆碱盐。在一些实施例中，CXCR2抑制剂包含6-氯-3-((3,4-二氧代-2-(戊烷-3-基氨基)环丁-1-烯-1-基)氨基)-2-羟基-N-甲氧基-N-甲基苯磺酰胺胆碱盐。在一些实施例中，CXCR2抑制剂是2-羟基-N,N,N-三甲基乙-1-铵3-氯-6-({3,4-二氧代-2-[(戊烷-3-基)氨基]环丁-1-烯-1-基}氨基)-2-(N-甲氧基-N-甲基氨磺酰基)苯酚酯(即，6-氯-3-((3,4-二氧代-2-(戊烷-3-基氨基)环丁-1-烯-1-基)氨基)-2-羟基-N-甲氧基-N-甲基苯磺酰胺胆碱盐)并具有以下化学结构：
Figure BDA0003991130860003951
其他示例性CXCR2抑制剂
在一些实施例中，CXCR2抑制剂包含达尼利星(CAS登记号：954126-98-8)。达尼利星也称为GSK1325756或1-(4-氯-2-羟基-3-哌啶-3-基磺酰基苯基)-3-(3-氟-2-甲基苯基)脲。达尼利星披露于例如Miller等人Eur J Drug Metab Pharmacokinet[欧洲药物代谢和药代动力学杂志](2014)39:173–181；和Miller等人BMC Pharmacology and Toxicology[BMC药理学和毒理学](2015),16:18。
在一些实施例中，CXCR2抑制剂包含瑞帕利星(CAS登记号：266359-83-5)。瑞帕利星也称为repertaxin或(2R)-2-[4-(2-甲基丙基)苯基]-N-甲基磺酰基丙酰胺。瑞帕利星是CXCR1/2的非竞争性变构抑制剂。瑞帕利星披露于例如Zarbock等人Br J Pharmacol.[英国药理学杂志]2008；155(3):357-64。
在一些实施例中，CXCR2抑制剂包含那伐利星。那伐利星也称为MK-7123、SCH527123、PS291822、或2-羟基-N,N-二甲基-3-[[2-[[(1R)-1-(5-甲基呋喃-2-基)丙基]氨基]-3,4-二氧代环丁烯-1-基]氨基]苯甲酰胺。那伐利星披露于例如Ning等人Mol CancerTher.[分子癌症治疗学]2012；11(6):1353-64。
CSF-1/1R结合剂
在一些实施例中，将CSF-1/1R结合剂与ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。在一些实施例中，CSF-1/1R结合剂选自巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的抑制剂，例如，M-CSF的单克隆抗体或Fab(例如，MCS110)，CSF-1R酪氨酸激酶抑制剂(例如，4-((2-(((1R,2R)-2-羟基环己基)氨基)苯并[d]噻唑-6-基)氧基)-N-甲基吡啶酰胺或BLZ945)，受体酪氨酸激酶抑制剂(RTK)(例如，培达替尼)或靶向CSF-1R的抗体(例如，依米妥珠单抗(emactuzumab)或FPA008)。在一些实施例中，CSF-1/1R抑制剂是BLZ945。在一些实施例中，CSF-1/1R结合剂是MCS110。在其他实施例中，CSF-1/1R结合剂是培达替尼。
示例性CSF-1结合剂
在一些实施例中，CSF-1/1R结合剂包含巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的抑制剂。M-CSF有时也称为CSF-1。在某些实施例中，CSF-1/1R结合剂是CSF-1的抗体(例如，MCS110)。在其他实施例中，CSF-1/1R结合剂是CSF-1R的抑制剂(例如，BLZ945)。
在一些实施例中，CSF-1/1R结合剂包含M-CSF的单克隆抗体或Fab(例如，MCS110/H-RX1)或CSF-1的结合剂，披露于国际申请公开号WO 2004/045532和WO 2005/068503(包括H-RX1或5H4，例如，针对M-CSF的抗体分子或Fab片段)和US 9079956中，将这些申请和专利通过引用以其全文并入。
表24.示例性抗M-CSF抗体分子(MCS110)的氨基酸和核苷酸序列
Figure BDA0003991130860003971
在另一个实施例中，CSF-1/1R结合剂包含CSF-1R酪氨酸激酶抑制剂，4-((2-(((1R,2R)-2-羟基环己基)氨基)苯并[d]噻唑-6-基)氧基)-N-甲基吡啶酰胺(BLZ945)，或国际申请公开号WO 2007/121484和美国专利号7,553,854、8,173,689和8,710,048(将其通过引用以其全文并入)中所披露的化合物。
其他示例性CSF-1/1R结合剂
在一些实施例中，CSF-1/1R结合剂包含培达替尼(CAS登记号1029044-16-3)。培达替尼也称为PLX3397或5-((5-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)甲基)-N-((6-(三氟甲基)吡啶-3-基)甲基)吡啶-2-胺。培达替尼是KIT、CSF1R和FLT3的小分子受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂。FLT3、CSF1R和FLT3在许多癌细胞类型中过表达或突变，并且在肿瘤细胞增殖和转移中起主要作用。PLX3397可以结合并抑制干细胞因子受体(KIT)、集落刺激因子-1受体(CSF1R)和FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)的磷酸化，这可能导致抑制肿瘤细胞增殖和下调参与溶骨性转移性疾病的巨噬细胞、破骨细胞和肥大细胞。
在一些实施例中，CSF-1/1R结合剂是依米妥珠单抗。依米妥珠单抗也称为RG7155或RO5509554。依米妥珠单抗是人源化IgG1 mAb靶向的CSF1R。在一些实施例中，CSF-1/1R结合剂是FPA008。FPA008是抑制CSF1R的人源化mAb。
A2aR拮抗剂
在一些实施例中，将腺苷A2a受体(A2aR)拮抗剂(例如，A2aR途径的抑制剂，例如腺苷抑制剂，例如A2aR或CD-73的抑制剂)与ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。在一些实施例中，A2aR拮抗剂选自PBF509/NIR178(帕罗生物制药公司(Palobiofarma)/诺华股份有限公司)、CPI444/V81444(卡沃斯公司(Corvus)/基因泰克公司)、AZD4635/HTL-1071(阿斯利康公司/海普泰公司(Heptares))、维帕迪南(Vipadenant)(雷达思公司/朱诺公司(Redox/Juno))、GBV-2034(Globavir公司)、AB928(阿克斯生物科学公司(Arcus Biosciences))、茶碱、伊曲茶碱(协和发酵工业株式会社(Kyowa Hakko Kogyo))、托扎迪南/SYN-115(阿索尔公司(Acorda))、KW-6356(协和发酵工业株式会社)、ST-4206(理地安生物科学公司(Leadiant Biosciences))、和普瑞迪南/SCH 420814(默克公司/谢林公司(Schering))。
示例性A2aR拮抗剂
在一些实施例中，A2aR拮抗剂包含PBF509(NIR178)或美国专利号8,796,284或国际申请公开号WO 2017/025918(将其通过引用以其全文并入本文)中所披露的化合物。PBF509(NIR178)也称为NIR178。
其他示例性A2aR拮抗剂
在某些实施例中，A2aR拮抗剂包含CPI444/V81444。CPI-444和其他A2aR拮抗剂披露于国际申请公开号WO 2009/156737(将其通过引用以其全文并入本文)中。在某些实施例中，A2aR拮抗剂是(S)-7-(5-甲基呋喃-2-基)-3-((6-(((四氢呋喃-3-基)氧基)甲基)吡啶-2-基)甲基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-5-胺。在某些实施例中，A2aR拮抗剂是(R)-7-(5-甲基呋喃-2-基)-3-((6-(((四氢呋喃-3-基)氧基)甲基)吡啶-2-基)甲基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-5-胺、或其外消旋体。在某些实施例中，A2aR拮抗剂是7-(5-甲基呋喃-2-基)-3-((6-(((四氢呋喃-3-基)氧基)甲基)吡啶-2-基)甲基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-5-胺。
在某些实施例中，A2aR拮抗剂是AZD4635/HTL-1071。A2aR拮抗剂披露于国际申请公开号WO 2011/095625(将其通过引用以其全文并入本文)中。在某些实施例中，A2aR拮抗剂是6-(2-氯-6-甲基吡啶-4-基)-5-(4-氟苯基)-1,2,4-三嗪-3-胺。
在某些实施例中，A2aR拮抗剂是ST-4206(理地安生物科学公司)。在某些实施例中，A2aR拮抗剂是描述于美国专利号9,133,197(将其通过引用以其全文并入本文)中的A2aR拮抗剂。
在某些实施例中，A2aR拮抗剂是描述于美国专利号8,114,845和9,029,393、美国申请公开号2017/0015758和2016/0129108(将其通过引用以其全文并入本文)中的A2aR拮抗剂。
在一些实施例中，A2aR拮抗剂是伊曲茶碱(CAS登记号：155270-99-8)。伊曲茶碱也称为KW-6002或8-[(E)-2-(3,4-二甲氧基苯基)乙烯基]-1,3-二乙基-7-甲基-3,7-二氢-1H-嘌呤-2,6-二酮。例如，在LeWitt等人,(2008)Annals of Neurology[神经病学年鉴]63(3):295–302中披露了伊曲茶碱。
在一些实施例中，A2aR拮抗剂是托扎迪南(Biotie公司)。托扎迪南也称为SYN115或4-羟基-N-(4-甲氧基-7-吗啉-4-基-1,3-苯并噻唑-2-基)-4-甲基哌啶-1-甲酰胺。托扎迪南阻断在A2a受体上的内源性腺苷的作用，导致多巴胺对D2受体的作用增强，并抑制mGluR5受体上的谷氨酸的作用。在一些实施例中，A2aR拮抗剂是普瑞迪南(CAS登记号：377727-87-2)。普瑞迪南也称为SCH 420814或2-(2-呋喃基)-7-[2-[4-[4-(2-甲氧基乙氧基)苯基]-1-哌嗪基]乙基]7H-吡唑并[4,3-e][1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-5-胺。普瑞迪南被开发为一种药物，可作为腺苷A2A受体的有效和选择性拮抗剂。
在一些实施例中，A2aR拮抗剂是维帕迪南。维帕迪南也称为BIIB014、V2006、或3-[(4-氨基-3-甲基苯基)甲基]-7-(呋喃-2-基)三唑并[4,5-d]嘧啶-5-胺。其他示例性A2aR拮抗剂包括，例如ATL-444、MSX-3、SCH-58261、SCH-412,348、SCH-442,416、VER-6623、VER-6947、VER-7835、CGS-15943、和ZM-241,385。
在一些实施例中，A2aR拮抗剂是A2aR途径拮抗剂(例如，CD-73抑制剂，例如抗CD73抗体)是MEDI9447。MEDI9447是对CD73具有特异性的单克隆抗体。通过CD73靶向腺苷的细胞外产生可降低腺苷的免疫抑制作用。MEDI9447报道为具有一系列活性，例如，抑制CD73外核苷酸酶活性、减轻AMP介导的淋巴细胞遏制、以及抑制同基因肿瘤生长。MEDI9447可以驱动肿瘤微环境中骨髓和淋巴浸润白细胞群体两者的变化。这些变化包括例如CD8效应细胞和活化的巨噬细胞的增加，以及髓源性抑制细胞(MDSC)和调节性T淋巴细胞的比例的减少。
IDO抑制剂
在一些实施例中，将吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)和/或色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)的抑制剂与ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。在一些实施例中，该IDO抑制剂选自(4E)-4-[(3-氯-4-氟苯胺基)-亚硝基亚甲基]-1,2,5-噁二唑-3-胺(也称为依多司他(epacadostat)或INCB24360)、英多莫德()，(1-甲基-D-色氨酸)，α-环己基-5H-咪唑并[5,1-a]异吲哚-5-乙醇(也称为NLG919)、英多莫德、和BMS-986205(以前称为F001287)。
示例性IDO抑制剂
在一些实施例中，IDO/TDO抑制剂是英多莫德(纽琳基因公司(New LinkGenetics))。英多莫德，1-甲基-色氨酸的D异构体，是一种口服施用的小分子吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)途径抑制剂，该抑制剂破坏了由肿瘤逃避免疫介导的破坏的机制。
在一些实施例中，IDO/TDO抑制剂是NLG919(纽琳基因公司)。NLG919是有效的IDO(吲哚胺-(2,3)-双加氧酶)途径抑制剂，在无细胞测定中具有7nM/75nM的Ki/EC50。
在一些实施例中，IDO/TDO抑制剂是依多司他(CAS登记号：1204669-58-8)。依多司他也称为INCB24360或INCB024360(因赛特公司)。依多司他是有效的和选择性的吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO1)抑制剂，具有10nM的IC50，对其他相关酶(例如IDO2或色氨酸2,3-双加氧酶(TDO))具有高选择性。
在一些实施例中，IDO/TDO抑制剂是F001287(福克斯公司(Flexus)/BMS公司)。F001287是吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)的小分子抑制剂。
STING激动剂
在一些实施例中，将STING激动剂与ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。在一些实施例中，STING激动剂是环二核苷酸，例如包含嘌呤或嘧啶核碱基(例如，腺苷、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、或胞嘧啶核碱基)的环二核苷酸。在一些实施例中，环二核苷酸的核碱基包含相同核碱基或不同核碱基。
在一些实施例中，STING激动剂包含腺苷或鸟苷核碱基。在一些实施例中，STING激动剂包含一个腺苷核碱基和一个鸟苷核碱基。在一些实施例中，STING激动剂包含两个腺苷核碱基或两个鸟苷核碱基。
在一些实施例中，STING激动剂包含修饰的环二核苷酸，例如包含修饰的核碱基、修饰的核糖、或修饰的磷酸酯键。在一些实施例中，修饰的环二核苷酸包含修饰的磷酸酯键，例如硫代磷酸键。
在一些实施例中，STING激动剂包含具有2’,5’或3’,5’磷酸酯键的环二核苷酸(例如，修饰的环二核苷酸)。在一些实施例中，STING激动剂包含在磷酸酯键周围具有Rp或Sp立体化学的环二核苷酸(例如，修饰的环二核苷酸)。
在一些实施例中，STING激动剂是MK-1454(默克公司)。MK-1454是活化STING途径的干扰素基因(STING)激动剂的环二核苷酸刺激剂。示例性STING激动剂披露于例如PCT公开号WO 2017/027645中。
半乳凝素抑制剂
在一些实施例中，将半乳凝素(例如半乳凝素-1或半乳凝素-3)抑制剂与ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。在一些实施例中，组合包含半乳凝素-1抑制剂和半乳凝素-3抑制剂。在一些实施例中，组合包含靶向半乳凝素-1和半乳凝素-3两者的双特异性抑制剂(例如，双特异性抗体分子)。在一些实施例中，半乳凝素抑制剂选自抗半乳凝素抗体分子、GR-MD-02(半乳凝素治疗学公司(Galectin Therapeutics))、半乳凝素-3C(曼德勒医学院(Mandal Med))、Anginex、或OTX-008(翁科埃斯克斯公司(OncoEthix)，默克公司)。半乳凝素是与β-半乳糖苷酶糖结合的蛋白质家族。
蛋白质的半乳凝素家族包含至少半乳凝素-1、半乳凝素-2、半乳凝素-3、半乳凝素-4、半乳凝素-7、和半乳凝素-8。半乳凝素也称为S型凝集素，并且是具有例如细胞内和细胞外功能的可溶性蛋白质。
半乳凝素-1和半乳凝素-3在不同肿瘤类型中高度表达。半乳凝素-1和半乳凝素-3可以促进血管生成和/或将骨髓细胞重编程为前肿瘤表型，例如增强骨髓细胞的免疫遏制。可溶性半乳凝素-3也可以结合和/或灭活浸润性T细胞。
示例性半乳凝素抑制剂
在一些实施例中，半乳凝素抑制剂是抗体分子。在实施例中，抗体分子是单特异性抗体分子并结合单一表位。例如，具有多个免疫球蛋白可变结构域序列的单特异性抗体分子，每个免疫球蛋白可变结构域序列结合相同的表位。在实施例中，半乳凝素抑制剂是抗半乳凝素(例如抗半乳凝素-1或抗半乳凝素-3)抗体分子。在一些实施例中，半乳凝素抑制剂是抗半乳凝素-1抗体分子。在一些实施例中，半乳凝素抑制剂是抗半乳凝素-3抗体分子。
在实施例中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如它包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中该多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且该多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在实施例中，第一和第二表位在相同的抗原(例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基))上。在实施例中，第一表位和第二表位重叠。在实施例中，第一表位和第二表位不重叠。在实施例中，第一和第二表位在不同的抗原(例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基))上。在实施例中，多特异性抗体分子包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子、三特异性抗体分子、或四特异性抗体分子。
在实施例中，半乳凝素抑制剂是多特异性抗体分子。在实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在实施例中，第一和第二表位在相同的抗原(例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基))上。在实施例中，第一表位和第二表位重叠。在实施例中，第一表位和第二表位不重叠。在实施例中，第一和第二表位在不同的抗原(例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基))上。在实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体、或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的半抗体、或其片段。在实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv、或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的scFv、或其片段。在实施例中，半乳凝素抑制剂是双特异性抗体分子。在实施例中，第一表位位于半乳凝素-1上，并且第二表位位于半乳凝素-3上。
用于产生双特异性或异二聚体抗体分子的方案在本领域中是已知的；这些方案包括但不限于：“杵臼结构(knob in a hole)”途径，例如在US 5731168中所述；静电导向Fc配对，如例如在WO 09/089004、WO 06/106905和WO 2010/129304中所述；链交换工程化结构域(SEED)异二聚体形成，如例如在WO 07/110205中所述；Fab臂交换，如例如在WO 08/119353、WO 2011/131746和WO 2013/060867中所述；双抗体缀合物，例如使用具有胺反应性基团和巯基反应性基团的异双官能试剂，通过抗体交联以产生双特异性结构，如例如在US4433059中所述；通过对两条重链之间的二硫键进行还原和氧化的循环，通过重组来自不同抗体的半抗体(重-轻链对或Fab)产生的双特异性抗体决定簇，如例如在US 4444878中所述；三功能抗体，例如通过巯基反应性基团交联的三个Fab'片段，如例如在US 5273743中所述；生物合成结合蛋白，例如通过C-末端尾优选通过二硫键或胺反应性化学交联作用交联的scFv对，如例如在US 5534254中所述；双功能抗体，例如具有不同结合特异性的Fab片段，这些Fab片段通过已经替代恒定结构域的亮氨酸拉链(例如，c-fos和c-jun)二聚化，如例如在US 5582996中所述；如例如US 5591828中所述的双特异性和寡特异性单价和低价受体，例如通过一个抗体的CH1区与典型地具有相关轻链的另一个抗体的VH区之间的多肽间隔区连接的两个抗体(两个Fab片段)的VH-CH1区；双特异性DNA-抗体缀合物，例如抗体或Fab片段通过DNA的双链段交联，如例如在US 5635602中所述；双特异性融合蛋白，例如含有两个scFv(它们之间具有亲水性螺旋肽接头)和一个完全恒定区的表达构建体，如例如在US5637481中所述；多价和多特异性结合蛋白，例如具有Ig重链可变区结合区的第一结构域和Ig轻链可变区结合区的第二结构域的多肽二聚体，通常称为双体抗体(也披露了更高级结构，产生双特异性、三特异性或四特异性分子)，如例如在US 5837242中所述；具有连接的VL和VH链(它们进一步用肽间隔区连接至抗体铰链区和CH3区)的微型抗体构建体，其可以二聚化形成双特异性/多价分子，如例如在US 5837821所述；用短肽接头(例如5或10个氨基酸)连接的或在任一取向上完全没有接头连接的VH和VL结构域，这些VH和VL结构域可以形成二聚体以形成双特异性双体抗体；三聚体和四聚体，如例如在US 5844094中所述；VH结构域(或家族成员中的VL结构域)的串，其通过肽键与C-末端的可交联基团连接，这些可交联基团进一步与VL结构域相关以形成一系列FV(或scFv)，如例如在US 5864019中所述；以及具有经肽接头连接的VH和VL结构域两者的单链结合多肽通过非共价或化学交联组合成多价结构，以使用scFV或双体抗体类型形式形成例如同二价、异二价、三价和四价结构，如例如在US 5869620中所述。另外的示例性多特异性和双特异性分子及其制备方法发现于例如US 5910573、US 5932448、US 5959083、US 5989830、US 6005079、US 6239259、US 6294353、US 6333396、US 6476198、US 6511663、US 6670453、US 6743896、US 6809185、US 6833441、US 7129330、US 7183076、US 7521056、US 7527787、US 7534866、US 7612181、US 2002/004587 A1、US 2002/076406A1、US 2002/103345 A1、US 2003/207346 A1、US 2003/211078A1、US 2004/219643 A1、US 2004/220388 A1、US 2004/242847 A1、US 2005/003403 A1、US2005/004352 A1、US 2005/069552 A1、US 2005/079170 A1、US 2005/100543 A1、US 2005/136049 A1、US 2005/136051 A1、US 2005/163782 A1、US 2005/266425 A1、US 2006/083747 A1、US 2006/120960 A1、US 2006/204493 A1、US 2006/263367 A1、US 2007/004909 A1、US 2007/087381 A1、US 2007/128150 A1、US 2007/141049 A1、US 2007/154901 A1、US 2007/274985 A1、US 2008/050370 A1、US 2008/069820 A1、US 2008/152645 A1、US 2008/171855 A1、US 2008/241884 A1、US 2008/254512 A1、US 2008/260738 A1、US 2009/130106 A1、US 2009/148905 A1、US 2009/155275 A1、US 2009/162359 A1、US 2009/162360 A1、US 2009/175851 A1、US 2009/175867 A1、US 2009/232811 A1、US 2009/234105 A1、US 2009/263392 A1、US 2009/274649 A1、EP 346087 A2、WO 00/06605 A2、WO 02/072635 A2、WO 04/081051 A1、WO06/020258A2、WO 2007/044887A2、WO 2007/095338 A2、WO 2007/137760 A2、WO 2008/119353 A1、WO 2009/021754 A2、WO2009/068630 A1、WO 91/03493A 1、WO 93/23537 A1、WO 94/09131 A1、WO 94/12625 A2、WO95/09917 A1、WO 96/37621 A2、WO 99/64460 A1。上述申请的内容通过引用以其全文并入本文。
在其他实施例中，抗半乳凝素(例如抗半乳凝素-1或抗半乳凝素-3)抗体分子(例如，单特异性、双特异性、或多特异性抗体分子)与另一个配偶体(蛋白质，例如作为融合分子，如融合蛋白)共价地连接(例如融合)。在一个实施例中，双特异性抗体分子对第一靶标(例如，针对半乳凝素-1)具有第一结合特异性，对第二靶标(例如，半乳凝素-3)具有第二结合特异性。
本披露提供了分离的核酸分子，其编码上述抗体分子、其载体和宿主细胞。核酸分子包括但不限于RNA、基因组DNA和cDNA。
在一些实施例中，半乳凝素抑制剂是可以结合和抑制半乳凝素(例如半乳凝素-1或半乳凝素-3)功能的肽，例如蛋白质。在一些实施例中，半乳凝素抑制剂是可以结合和抑制半乳凝素-3功能的肽。在一些实施例中，半乳凝素抑制剂是肽半乳凝素-3C。在一些实施例中，半乳凝素抑制剂是美国专利6,770,622(将其通过引用以其全文特此并入)中所披露的半乳凝素-3抑制剂。
半乳凝素-3C是半乳凝素-3的N末端截短的蛋白质，并且例如作为半乳凝素-3的竞争性抑制剂起作用。半乳凝素-3C预防内源性半乳凝素-3与例如癌细胞(例如表面上的层粘连蛋白)和细胞外基质(ECM)上的其他β-半乳糖苷酶的糖缀合物结合。半乳凝素-3C和其他示例性半乳凝素抑制肽披露于美国专利6,770,622中。
在一些实施例中，半乳凝素-3C包含SEQ ID NO:279或与其基本相同(例如，90％、95％或99％同一性)的氨基酸的氨基酸序列。
GAPAGPLIVPYNLPLPGGVVPRMLITILGTVKPNANRIALDFQRGNDVAFHFNPRFNENNRRVIVCNTKLDNNWGREERQSVFPFESGKPFKIQVLVEPDHFKVAVNDAHLLQYNHRVKKLNEISKLGISGDIDITSASYTMI(SEQ ID NO:279)。
在一些实施例中，半乳凝素抑制剂是可以结合并抑制半乳凝素-1功能的肽。在一些实施例中，半乳凝素抑制剂是肽Anginex：Anginex是结合半乳凝素-1的抗血管生成肽(Salomonsson E,等人,(2011)Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志],286(16):13801-13804。Anginex与半乳凝素-1的结合可以干扰例如半乳凝素-1的促血管生成作用。
在一些实施例中，半乳凝素(例如半乳凝素-1或半乳凝素-3)抑制剂是非肽的拓扑模拟(topomimetic)分子。在一些实施例中，非肽的拓扑模拟半乳凝素抑制剂是OTX-008(OncoEthix)。在一些实施例中，非肽的拓扑模拟是披露于美国专利8,207,228(将其通过引用以其全文并入本文)中的非肽的拓扑模拟。OTX-008(也称为PTX-008或Calixarene0118)是半乳凝素-1的选择性变构抑制剂。OTX-008具有化学名称：N-[2-(二甲基氨基)乙基]-2-{[26,27,28-三({[2-(二甲基氨基)乙基]氨基甲酰基}甲氧基)五环[19.3.1.1,7.1,.15,]二十八-1(25),3(28),4,6,9(27),1012,15,17,19(26),21,23-十二烯-25-基]氧基}乙酰胺。
在一些实施例中，半乳凝素(例如半乳凝素-1或半乳凝素-3)抑制剂是基于碳水化合物的化合物。在一些实施例中，半乳凝素抑制剂是GR-MD-02(半乳凝素治疗学公司(Galectin Therapeutics))。在一些实施例中，GR-MD-02是半乳凝素-3抑制剂。GR-MD-02是半乳糖-叉状多糖，也称为例如半乳糖阿拉伯-鼠李半乳糖醛酸酯。GR-MD-02和其他半乳糖-叉状聚合物(例如，半乳糖阿拉伯-鼠李半乳糖醛酸酯)披露于美国专利8,236,780和美国申请2014/0086932(将其全部内容通过引用以其全文并入本文)中。
MEK抑制剂
在一些实施例中，将MEK抑制剂与ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。在一些实施例中，MEK抑制剂选自曲美替尼、司美替尼、AS703026、BIX 02189、BIX 02188、CI-1040、PD0325901、PD98059、U0126、XL-518、G-38963、或G02443714。在一些实施例中，MEK抑制剂是曲美替尼。
示例性MEK抑制剂
在一些实施例中，MEK抑制剂是曲美替尼。曲美替尼也称为JTP-74057、TMT212、N-(3-{3-环丙基-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-6,8-二甲基-2,4,7-三氧代-3,4,6,7-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-1(2H)-基}苯基)乙酰胺、或Mekinist(CAS号871700-17-3)。
其他示例性MEK抑制剂
在一些实施例中，MEK抑制剂包含司美替尼，其具有化学名称：(5-[(4-溴-2-氯苯基)氨基]-4-氟-N-(2-羟基乙氧基)-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-甲酰胺。司美替尼也称为AZD6244或ARRY 142886，例如，如PCT公开号WO 2003077914中所述。
在一些实施例中，MEK抑制剂包含AS703026、BIX 02189或BIX02188。
在一些实施例中，MEK抑制剂包含2-[(2-氯-4-碘苯基)氨基]-N-(环丙基甲氧基)-3,4-二氟-苯甲酰胺(也称为CI-1040或PD184352，例如，如PCT公开号WO 2000035436中所述)。
在一些实施例中，MEK抑制剂包含N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-苯甲酰胺(也称为PD0325901，例如，如PCT公开号WO 2002006213中所述)。
在一些实施例中，MEK抑制剂包含2’-氨基-3’-甲氧基黄酮(也称为PD98059)，其可从德国比亚芬股份有限公司(Biaffin GmbH&Co.,KG)获得。
在一些实施例中，MEK抑制剂包含2,3-双[氨基[(2-氨基苯基)硫代]亚甲基]-丁二腈(也称为U0126，例如，如美国专利号2,779,780中所述)。
在一些实施例中，MEK抑制剂包含XL-518(也称为GDC-0973)，其具有CAS号1029872-29-4，并且可从ACC集团(ACC Corp.)获得。
在一些实施例中，MEK抑制剂包含G-38963。
在一些实施例中，MEK抑制剂包含G02443714(也称为AS703206)。
MEK抑制剂的另外的实例披露于WO 2013/019906、WO 03/077914、WO 2005/121142、WO 2007/04415、WO 2008/024725和WO 2009/085983(将其内容通过引用以其全文并入本文)中。MEK抑制剂另外的实例包括但不限于2,3-双[氨基[(2-氨基苯基)硫代]亚甲基]-丁二腈(也称为U0126，并描述于美国专利号2,779,780中)；(3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(乙基氨基)-8,9,16-三羟基-3,4-二甲基-3,4,9,19-四氢-1H-2-苯并氧杂环四癸炔-1,7(8H)-二酮](也称为E6201，描述于PCT公开号WO 2003076424中)；维莫非尼(PLX-4032，CAS918504-65-1)；(R)-3-(2,3-二羟基丙基)-6-氟-5-(2-氟-4-碘苯基氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-4,7(3H,8H)-二酮(TAK-733，CAS 1035555-63-5)；匹玛舍替(AS-703026，CAS1204531-26-9)；2-(2-氟-4-碘苯基氨基)-N-(2-羟基乙氧基)-1,5-二甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺(AZD 8330)；和3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-N-(2-羟基乙氧基)-5-[(3-氧代-[1,2]噁嗪烷-2-基)甲基]苯甲酰胺(CH 4987655或Ro 4987655)。
c-MET抑制剂
在一些实施例中，将c-MET抑制剂与ZBTB32抑制剂或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。c-MET(在许多肿瘤细胞类型中过表达或突变的受体酪氨酸激酶)在肿瘤细胞增殖、存活、侵袭、转移和肿瘤血管生成中起关键作用。c-MET的抑制可以在过表达c-MET蛋白或表达组成型活化的c-MET蛋白的肿瘤细胞中诱导细胞死亡。
在一些实施例中，c-MET抑制剂选自卡玛替尼(INC280)、JNJ-3887605、AMG 337、LY2801653、MSC2156119J、克唑替尼(crizotinib)、替万替尼、或戈伐替尼(golvatinib)。
示例性c-MET抑制剂
在一些实施例中，c-MET抑制剂包含卡玛替尼(INC280)或描述于美国专利号7,767,675、和US 8,461,330(将其通过引用以其全文并入)中的化合物。
其他示例性c-MET抑制剂
在一些实施例中，c-MET抑制剂包含JNJ-38877605。JNJ-38877605是口服可用的c-Met的小分子抑制剂。JNJ-38877605选择性结合c-MET，从而抑制c-MET磷酸化并破坏c-Met信号转导途径。
在一些实施例中，c-Met抑制剂是AMG 208。AMG 208是c-MET的选择性小分子抑制剂。AMG 208抑制c-MET的配体依赖性和配体非依赖性活化，抑制其酪氨酸激酶活性，这可能导致过表达c-Met的肿瘤中的细胞生长抑制。
在一些实施例中，c-Met抑制剂包含AMG 337。AMG 337是c-Met的口服生物可利用的抑制剂。AMG 337选择性结合c-MET，从而破坏c-MET信号转导途径。
在一些实施例中，c-Met抑制剂包含LY2801653。LY2801653是口服可用的c-Met的小分子抑制剂。LY2801653选择性结合c-MET，从而抑制c-MET磷酸化作用并破坏c-Met信号转导途径。
在一些实施例中，c-Met抑制剂包含MSC2156119J。MSC2156119J是口服生物可利用的c-Met抑制剂。MSC2156119J选择性结合c-MET，抑制c-MET磷酸化作用并破坏c-Met介导的信号转导途径。
在一些实施例中，c-MET抑制剂是卡玛替尼。卡玛替尼也称为INCB028060。卡玛替尼是口服生物可利用的c-MET抑制剂。卡玛替尼选择性结合c-Met，从而抑制c-Met磷酸化作用并破坏c-Met信号转导途径。
在一些实施例中，c-MET抑制剂包含克唑替尼。克唑替尼也称为PF-02341066。克唑替尼是口服可用的受体酪氨酸激酶间变性淋巴瘤激酶(ALK)和c-Met/肝细胞生长因子受体(HGFR)的基于氨基吡啶的抑制剂。克唑替尼以ATP竞争方式结合并抑制ALK激酶和ALK融合蛋白。此外，克唑替尼抑制c-Met激酶，并破坏c-Met信号传导通路。总之，该药剂抑制肿瘤细胞生长。
在一些实施例中，c-MET抑制剂包含戈伐替尼。戈伐替尼是口服生物可利用的c-MET和VEGFR-2的双激酶抑制剂，该抑制剂具有潜在的抗肿瘤活性。戈伐替尼结合并抑制c-MET和VEGFR-2的活性，这可能抑制肿瘤细胞生长和过表达这些受体酪氨酸激酶的肿瘤细胞的存活。
在一些实施例中，c-MET抑制剂是替万替尼。替万替尼也称为ARQ197。替万替尼是口服生物可利用的c-MET小分子抑制剂。替万替尼结合c-MET蛋白并破坏c-Met信号转导途径，可在过表达c-MET蛋白或表达组成型活化的c-Met蛋白的肿瘤细胞中诱导细胞死亡。
TGF-β抑制剂
在一些实施例中，将转化生长因子β(也称为TGF-βTGFβ、TGFb、或TGF-β，可在本文互换地使用)抑制剂与ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。在某些实施例中，本文描述的组合包含转化生长因子β(也称为TGF-βTGFβ、TGFb、或TGF-β，可在本文互换地使用)抑制剂。
TGF-β属于结构相关的细胞因子的大家族，包括例如骨形态发生蛋白(BMP)、生长和分化因子、活化素和抑制素。在一些实施例中，本文描述的TGF-β抑制剂可以结合和/或抑制一种或多种TGF-β的同种型(例如，TGF-β1、TGF-β2、或TGF-β3中的一种、两种或全部)。
在正常条件下，TGF-β维持体内平衡并限制上皮细胞、内皮细胞、神经细胞和造血细胞谱系的生长(例如通过诱导抗增殖和凋亡应答)。典型和非典型信号传导途径参与细胞对TGF-β的应答。TGF-β/Smad典型途径的活化可介导TGF-β的抗增殖作用。非典型TGF-β途径可以活化另外的细胞内途径，例如促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B、Rho样GTP酶(Tian等人Cell Signal.[细胞信号传导]2011；23(6):951-62；Blobe等人N Engl J Med.[新英格兰医学杂志]2000；342(18):1350-8)，因此调节上皮细胞向间充质细胞转变(EMT)和/或细胞运动。
TGF-β信号传导途径的改变与人疾病(例如癌症、心血管疾病、纤维化、生殖障碍和伤口愈合)相关。不希望受理论束缚，据信在一些实施例中，TGF-β在癌症中的作用取决于疾病背景(例如，肿瘤阶段和遗传改变)和/或细胞环境。例如，在癌症的晚期阶段，TGF-β可以调节癌症相关过程，例如通过促进肿瘤生长(例如，诱导EMT)、阻断抗肿瘤免疫应答、增加肿瘤相关纤维化或增强血管生成(Wakefield和Hill Nat Rev Cancer.[癌症自然评论]2013；13(5):328-41)。在某些实施例中，包含本文描述的TGF-β抑制剂的组合用于治疗末期转移性癌症或晚期癌症。
临床前证据指示TGF-β在免疫调节中起重要作用(Wojtowicz-Praga Invest NewDrugs.[试验性新药]2003；21(1):21-32；Yang等人Trends Immunol.[趋势免疫]2010；31(6):220-7)。TGF-β可以经由若干种机制下调宿主免疫应答，例如，T辅助平衡转向Th2免疫表型；抑制抗肿瘤Th1型应答和M1型巨噬细胞；遏制细胞毒性CD8+ T淋巴细胞(CTL)、NK淋巴细胞和树突细胞功能，产生CD4+CD25+ T-调节性细胞；或促进具有促肿瘤活性(通过分泌免疫遏制性细胞因子(例如IL10或VEGF)、促炎细胞因子(例如IL6、TNFα或IL1)和产生具有遗传毒性活性的活性氧(ROS)介导)的M2型巨噬细胞(Yang等人Trends Immunol.[趋势免疫]2010；31(6):220-7；Truty和Urrutia Pancreatology.[胰腺学]2007；7(5-6):423-35；Achyut等人Gastroenterology.[肠胃病学]2011；141(4):1167-78)。
示例性TGF-β抑制剂
在一些实施例中，TGF-β抑制剂包含XOMA 089或国际申请公开号WO 2012/167143(将其通过引用以其全文并入)中所披露的化合物。
XOMA 089也称为XPA.42.089。XOMA 089是完全人单克隆抗体，该抗体特异性结合并中和TGF-β1和2配体。
XOMA 089的重链可变区具有以下氨基酸序列：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLWEVRALPSVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:284)(在WO 2012/167143中披露为SEQ ID NO:6)。XOMA 089的轻链可变区具有以下氨基酸序列：SYELTQPPSVSVAPGQTARITCGANDIGSKSVHWYQQKAGQAPVLVVSEDIIRPSGIPERISGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDRDSDQYVFGTGTKVTVLG(SEQ ID NO:285)(在WO 2012/167143中披露为SEQ ID NO:8)。
XOMA 089以高亲和力结合人TGF-β同种型。通常，XOMA 089以高亲和力结合TGF-β1和TGF-β2，并且在较小程度上结合TGF-β3。在Biacore测定中，人TGF-β上的XOMA 089的KD是14.6pM(对于TGF-β1)、67.3pM(对于TGF-β2)、和948pM(对于TGF-β3)。鉴于与所有三种TGF-β同种型的高亲和力结合，在某些实施例中，预期XOMA 089以如本文所描述的XOMA 089的剂量结合TGF-β1、2和3。XOMA 089与啮齿动物和食蟹猴TGF-β交叉反应，并在体外和体内显示出功能活性，制作啮齿动物和食蟹猴相关物种用于毒理学研究。
其他示例性TGF-β抑制剂
在一些实施例中，TGF-β抑制剂包含夫苏木单抗(CAS登记号：948564-73-6)。夫苏木单抗也称为GC1008。夫苏木单抗是结合和抑制TGF-β同种型1、2和3的人单克隆抗体。
夫苏木单抗的重链具有以下氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:280)。
夫苏木单抗的轻链具有以下氨基酸序列：
ETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:281)。
夫苏木单抗披露于例如国际申请公开号WO 2006/086469、和美国专利号8,383,780和8,591,901(将其通过引用以其全文并入)中。
IL-1β抑制剂
白介素-1(IL-1)细胞因子家族是一组分泌型多效性细胞因子，在炎症和免疫应答中起重要作用。在包括癌症的多种临床背景中观察到IL-1的增加(Apte等人(2006)CancerMetastasis Rev.[癌症和转移综述]387-408页；Dinarello(2010)Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]599-606页)。IL-1家族尤其包含IL-1β(IL-1b)和IL-1α(IL-1a)。IL-1b在肺癌、乳腺癌和结直肠癌中升高(Voronov等人(2014)Front Physiol.[生物学前沿]114页)并且与预后不良相关(Apte等人(2000)Adv.Exp.Med.Biol.[实验医学与生物学进展]277-88页)。不希望受理论束缚，据信在一些实施例中，衍生自肿瘤微环境和通过恶性细胞的分泌型IL-1b促进肿瘤细胞增殖、增加侵袭性并抑制抗肿瘤免疫应答(部分通过招募抑制性嗜中性粒细胞)(Apte等人(2006)Cancer Metastasis Rev.[癌症和转移综述]387-408页；Miller等人(2007)J.Immunol.[免疫学杂志]6933-42页)。实验数据指示IL-1b的抑制导致肿瘤负荷和转移的减少(Voronov等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]2645-50页)。
在一些实施例中，将白细胞介素-1β(IL-1β)抑制剂与ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。在一些实施例中，IL-1β抑制剂选自卡那单抗(canakinumab)、格沃吉珠单抗(gevokizumab)、阿那白滞素、或利纳西普(Rilonacept)。在一些实施例中，IL-1β抑制剂是卡那单抗。
示例性IL-1β抑制剂
在一些实施例中，IL-1β抑制剂是卡那单抗。卡那单抗也称为ACZ885或
Figure BDA0003991130860004151
卡那单抗是人单克隆IgG1/κ抗体，其中和人IL-1β的生物活性。
卡那单抗披露于例如WO 2002/16436、US 7,446,175、和EP 1313769中。卡那单抗的重链可变区具有以下氨基酸序列：MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSVYGMNWVRQAPGKGLEWVAIIWYDGDNQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNGLRAEDTAVYYCARDLRTGPFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:282)(在US 7,446,175中披露为SEQ ID NO:1)。卡那单抗的轻链可变区具有以下氨基酸序列：MLPSQLIGFLLLWVPASRGEIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAAAYYCHQSSSLPFTFGPGTKVDIK(SEQ ID NO:283)(在US7,446,175中披露为SEQ ID NO:2)。
卡那单抗已被用于例如成人和儿童中的Cryopyrin蛋白相关周期综合征(CAPS)的治疗、用于系统性幼年型特发性关节炎(SJIA)的治疗、用于成人中急性痛风性关节炎发作的对症治疗、和用于其他IL-1β驱动的炎性疾病。不希望受理论束缚，据信在一些实施例中，IL-1β抑制剂(例如，卡那单抗)可以增加抗肿瘤免疫应答，例如通过阻断IL-1b的一种或多种功能，包括例如募集免疫遏制性嗜中性粒细胞对肿瘤微环境的影响、刺激肿瘤血管生成和/或促进转移(Dinarello(2010)Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]599-606页)。
在一些实施例中，本文描述的组合包括IL-1β抑制剂、卡那单抗或WO 2002/16436中所披露的化合物、以及免疫检查点分子的抑制剂(例如，PD-1的抑制剂(例如，抗PD-1抗体分子))。IL-1是分泌型多效性细胞因子，在炎症和免疫应答中起重要作用。在包括癌症的多种临床背景中观察到IL-1的增加(Apte等人(2006)Cancer Metastasis Rev.[癌症和转移综述]387-408页；Dinarello(2010)Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]599-606页)。IL-1b在肺癌、乳腺癌和结直肠癌中升高(Voronov等人(2014)Front Physiol.[生物学前沿]114页)并且与预后不良相关(Apte等人(2000)Adv.Exp.Med.Biol.[实验医学与生物学进展]277-88页)。不希望受理论束缚，据信在一些实施例中，衍生自肿瘤微环境和通过恶性细胞的分泌型IL-1b促进肿瘤细胞增殖、增加侵袭性并抑制抗肿瘤免疫应答(部分通过招募抑制性嗜中性粒细胞)(Apte等人(2006)Cancer Metastasis Rev.[癌症和转移综述]387-408页；Miller等人(2007)J.Immunol.[免疫学杂志]6933-42页)。实验数据指示IL-1b的抑制导致肿瘤负荷和转移的减少(Voronov等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]2645-50页)。卡那单抗可以结合IL-1b并抑制IL-1介导的信号传导。因此，在某些实施例中，IL-1β抑制剂(例如，卡那单抗)增强或用于增强PD-1抑制剂(例如，抗PD-1抗体分子)的免疫介导的抗肿瘤作用。
在一些实施例中，IL-1β抑制剂、卡那单抗或WO 2002/16436中所披露的化合物、以及免疫检查点分子的抑制剂(例如，PD-1的抑制剂(例如，抗PD-1抗体分子))各自以剂量和/或时间表施用，组合以实现所希望的抗肿瘤活性。
MDM2抑制剂
在一些实施例中，将小鼠双微体2同源物(MDM2)抑制剂与ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体组合使用，以治疗疾病(例如癌症)。MDM2的人同源物也称为HDM2。在一些实施例中，本文描述的MDM2抑制剂也称为HDM2抑制剂。在一些实施例中，MDM2抑制剂选自HDM201或CGM097。
在实施例中，MDM2抑制剂包含(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-(甲基(((1r,4S)-4-(4-甲基-3-氧代哌嗪-1-基)环己基)甲基)氨基)苯基)-1,2-二氢异喹啉-3(4H)-酮(也称为CGM097)或PCT公开号WO 2011/076786中所披露的化合物，以治疗障碍，例如本文描述的障碍。在一个实施例中，将本文披露的治疗剂与CGM097组合使用。
在实施例中，MDM2抑制剂包含p53和/或p53/Mdm2相互作用的抑制剂。在实施例中，MDM2抑制剂包含(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢吡咯并[3,4-d]咪唑-4(1H)-酮(也称为HDM201)或PCT公开号WO 2013/111105中所披露的化合物，以治疗障碍，例如本文描述的障碍。在一个实施例中，将本文披露的治疗剂与HDM201组合使用。在一些实施例中，口服施用HDM201。
在一个实施例中，本文披露的组合适用于体内癌症的治疗。例如，该组合可用于抑制癌性肿瘤的生长。该组合还可以与以下中的一种或多种组合使用：护理标准治疗(standard of care treatment)(例如，用于癌症或感染性障碍)、疫苗(例如治疗性癌症疫苗)、细胞疗法、放射疗法、手术或任何其他治疗剂或方式，以治疗本文的障碍。例如，为了实现免疫的抗原特异性增强，可以将该组合与感兴趣的抗原一起施用。
多特异性结合分子
在一些实施例中，将ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体与多特异性结合分子(“MBM”)组合使用。如本文所用，术语“MBM”是指识别两个或更多个不同表位的结合分子。MBM的实例包括识别两种不同表位的双特异性结合分子(“BBM”)和识别三种不同表位的三特异性结合分子(“TBM”)。表位可以存在于相同的靶标或不同的靶标上。
适合与本披露的ZBTB32抑制剂组合使用或施用的MBM因此包含结合至不同表位的至少两个抗原结合结构域(“ABD”)。如本文所用，术语“抗原结合结构域”或“ABD”是指MBM具有非共价地、可逆地并且特异性结合至表位的能力的部分。
通常，为了治疗癌症，与本披露的ZBTB32抑制剂组合使用的MBM与至少一种肿瘤相关抗原(“TAA”)结合。如本文所用，术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”是指在癌细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达的分子(典型地是蛋白质、碳水化合物、脂质或它们的一些组合)，并且其可用于优先将药理学药剂靶向癌细胞。TAA是可由正常细胞和癌细胞两者表达的标志物，例如谱系标志物，例如B细胞上的CD19。TAA也是与正常细胞相比在癌细胞中过表达的细胞表面分子，例如，与正常细胞相比，1倍过表达、2倍过表达、3倍过表达或更多。TAA可以是在癌细胞中不适当合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。某些TAA可仅在癌细胞的细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达，并且不在正常细胞的表面上合成或表达。相应地，术语“TAA”涵盖对癌细胞具有特异性的抗原，有时在本领域中称为肿瘤特异性抗原(“TSA”)。此外，如本文所述，术语“癌症”是指以异常细胞的不受控(并且常常是迅速的)生长为特征的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。本文描述了多种癌症的实例并且这些实例包括但不限于：白血病、多发性骨髓瘤、无症状性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。在一些实施例中，TAA在癌性B细胞上表达。术语“癌性B细胞”是指正在经历或已经经历不受控增殖的B细胞。
与本披露的ZBTB32抑制剂组合使用的可以被MBM(例如，BBM或TBM)靶向的TAA的实例包括：TSHR、CD171、CS-1、CLL-1、GD3、Tn Ag、FLT3、CD38、CD44v6、B7H3、KIT、IL-13Ra2、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、MUC1、EGFR、EGFRvIII、NCAM、CAIX、LMP2、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、GD2、叶酸受体α、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TAARP、WT1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、周期蛋白B1、MYCN、RhoC、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD19、CD20、CD30、ERBB2、ROR1、FLT3、TAAG72、CD22、CD33、GD2、BCMA、gp100Tn、FAP、酪氨酸酶、EPCAM、CEA、Igf-I受体、钙粘蛋白17、CD32b、GPNMB、GPR64、HER3、LRP6、LYPD8、NKG2D、SLC34A2、SLC39A6、SLITRK6、TACSTD2、和EphB2。
在某些方面，TAA在例如癌性B细胞的癌性血细胞上表达。在癌性B细胞上表达的TAA的实例包括但不限于：CD19、CD20、CD22、CD123、BCMA、CD33、CLL1、CD138(也称为黏结蛋白聚糖(Syndecan)-1，SDC1)、CS1、CD38、CD133、FLT3、CD52、TNFRSF13C(TNF受体超家族成员13C，在本领域中也称为BAFFR：B细胞活化因子受体)、TNFRSF13B(TNF受体超家族成员13B，在本领域中也称为TACI：跨膜活化物和CAML相互作用物)、CXCR4(C-X-C基元趋化因子受体4)、PD-L1(程序性死亡配体1)、LY9(淋巴细胞抗原9，在本领域中也称为CD229)、CD200、FCGR2B(Fc片段IgG受体lib，在本领域中也称为CD32b)、CD21、CD23、CD24、CD40L、CD72、CD79a和CD79b。
除了结合TAA，与本披露的ZBTB32抑制剂组合使用的MBM可以接合免疫系统，例如T细胞或NK细胞。T细胞的接合可以通过靶向CD3或TCR复合物的其他一种或多种组分(例如TCR-α、TCR-β或TCR-α/β二聚体)来实现。识别CD3或TCR复合物的其他组分的示例性ABD描述于WO 2020/052692和WO 2019/104075(例如，参见WO 2020/052692的第7.8.1、7.8.2和7.8.3节和WO 2019/104075的第6.5节，将其通过引用并入本文)。MBM可以进一步包括结合CD2的ABD，例如在WO2019/104075中一般披露的。在一些实施例中，CD2可以通过使用其配体CD58及其CD2结合部分作为ABD来被靶向，如WO 2019/104075的第6.6.2节所述，将其通过引用并入本文。NK细胞的接合可以通过靶向CD16、NKp46、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46或其组合(例如CD16和NKp46的组合)来实现。参见例如Hu等人,2019,Front.Immunol.[免疫学前沿]10:1205,Gauthier等人,2019,Cell[细胞]177(7):1701-1713。
在一些实施例中，MBM是与B细胞成熟抗原或BCMA以及TCR复合物的组分(优选CD3)结合的BBM。在其他实施例中，MBM是与BCMA、TCR复合物的组分(优选CD3)以及与第二TAA或CD2(例如，通过基于CD58的ABD，例如含有CD58的氨基酸残基30-123的ABD)结合的TBM。BCMA的表达已与多种癌症、自身免疫性障碍和感染性疾病有关。BCMA表达增加的癌症包括一些血液癌症，例如多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、多种白血病和成胶质细胞瘤。WO 2019/229701描述了大量与人BCMA特异性结合的MBM以及可包括在与BCMA结合的MBM之内的示例性BCMA结合序列的序列(参见例如WO 2019/229701的段落[0149]和表1中披露的BCMA结合序列组，将其通过引用并入本文)。WO 2019/229701还描述了针对BCMA和CD3的BBM(参见例如PCT WO 2019/229701的第7.3.3.1节，将其通过引用并入本文)。
在其他实施例中，MBM是结合CD19和TCR复合物的组分(优选CD3)的BBM。在其他实施例中，MBM是与CD19、TCR复合物的组分(优选CD3)以及与第二TAA或CD2(例如，通过基于CD58的ABD，例如含有CD58的氨基酸残基30-123的ABD)结合的TBM。与CD19、CD3和CD2(例如，通过基于CD58的ABD，例如含有CD58的氨基酸残基30-123的ABD)结合的TBM可以具有WO2019/104075的图1D中描述的一般构象，例如其中图1D中的X是CD19 ABD、X是CD3 ABM并且Z是CD2 ABM；更特别地，具有WO2019/104075的图12A、12B和12C中所示的构象，所有这些图和所附文本通过引用并入本文。CD19在早期前B细胞发育过程中表达，并持续直到浆细胞分化。CD19在正常B细胞和其异常生长可能导致B细胞淋巴瘤的恶性B细胞两者上表达。例如，CD19在B细胞系恶性肿瘤上表达，包括但不限于非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)、慢性淋巴细胞白血病、和急性淋巴细胞白血病。
虽然正在开发用于癌症疗法的大量MBM通常包括针对TAA的一种或多种ABD和能够促进免疫细胞接合的一种或多种ABD，但与本披露的ZBTB32抑制剂组合使用的MBM不需要接合免疫细胞，例如T细胞或NK细胞。例如，MBM可用于抑制血管生成途径，例如通过靶向VEG-F和另一种抗原，如δ样配体4(DLL-4)、Notch受体或血管生成素2(ANG-2)的跨膜配体。
示例性ABD的类型包括抗原结合片段和基于免疫球蛋白的支架和基于非免疫球蛋白的支架的部分，这些支架保留了非共价地、可逆地并且特异性地结合抗原的能力。因此，如本文所用，术语“抗原结合结构域”涵盖了抗体片段，这些抗体片段保留了非共价地、可逆地并且特异性地结合抗原的能力。结合片段的实例包括但不限于单链Fv(scFv)，Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段；以及分离的互补决定区(CDR)。因此，术语“抗体片段”涵盖抗体的蛋白水解片段(例如，Fab和F(ab)2片段)和包含抗体(例如，scFv)的一个或多个部分的工程化的蛋白质。除了基于免疫球蛋白的ABD，例如Fab-、scFv-和其他基于抗体片段的ABD，例如上述那些，本披露的MBM还可以包括基于非免疫球蛋白的ABD，或基于免疫球蛋白的ABD和基于非免疫球蛋白的ABD的组合。可以使用的基于免疫球蛋白的ABD描述于WO 2019/104075和WO 2019/229701(参见例如WO 2019/229701的第7.2和7.3.1节和WO 2019/104075的第6.2.1节，将其通过引用并入本文)。WO 2019/104075和WO2019/229701中描述了基于非免疫球蛋白的ABD，其包括Kunitz结构域、Adnexin、亲和体(Affibody)、DARPin、高亲和性多聚体(Avimer)、抗运载蛋白(Anticalin)、配体结合蛋白(Lipocalin)、纤连蛋白支架、Affimer和Fynomer(参见例如WO 2019/229701的第7.4节和WO2019/104075的第6.3节以及Hober等人,2019,Methods[方法]154:143-152中的图2和表1，将其通过引用并入本文)。对于靶向CD2的MBM，合适的ABD是CD58或其片段，如WO 2019/104075的第6.6.2节所述，将其通过引用并入本文。
BBM至少包含两个ABD，但也可以包含两个以上的ABD。仅含有两个ABD并被认为是二价的BBM，并且BBM可以具有三个ABD(即三价)、四个ABD(即四价)或更多，条件是BBM具有至少一个可以结合一个表位的ABD和至少一个可以结合不同表位的ABD。示例性二价、三价和四价BBM构象描述于WO 2019/229701(例如WO 2019/229701的图1和第7.5节和WO 2019/229701的第7.5节，将其通过引用并入本文)。尽管WO 2019/229701涉及BCMA结合分子，其可适当地与本披露的ZBTB32抑制剂组合使用，但其中描述的BBM形式也适用于任何表位/抗原配对，例如任何TAA和T细胞受体组分配对或TAA和NK细胞活化受体，例如CD16、NKp46、NKG2D、NKp30、NKp44或NKp46。
相似地，TBM具有至少三个ABD(即TBM至少是三价的)，但还可以含有多于三个ABD。例如，TBM可以具有四个ABD(即四价)、五个ABD(即五价)、或六个ABD(即六价)，条件是该TBM具有至少一个可以结合一个表位的ABD、至少一个可以结合第二表位的ABD和至少一个可以结合第三表位的ABD。示例性三价、四价、五价和六价TBM构象描述于WO 2019/104075和WO2019/195535(例如WO 2019/104075的图1和第6.4节和WO 2019/195535的图1和第7.4节，将其通过引用并入本文)。尽管WO 2019/104075涉及与CD2、CD3(或另一种T细胞受体组分)和肿瘤相关抗原(TAA)结合的TBM，而WO 2019/195535涉及与CD3(或另一种T细胞受体组分)结合的TBM和两种TAA，两者都可以适当地与本披露的ZBTB32抑制剂组合使用，其中描述的TBM形式也适用于三个表位或抗原的任何组合。例如，TBM可以靶向TAA和两种NK细胞活化受体，例如CD16、NKp46、NKG2D、NKp30、NKp44或NKp46中的任何两种。在特定实施例中，与本披露的ZBTB32抑制剂组合使用的TBM可以靶向TAA、CD16和NKp46(参见例如Gauthier等人,2019,Cell[细胞]177(7):1701-1713)。
MBM的ABD(或其部分)可以相互连接，例如，通过短肽接头或通过Fc结构域相互连接。连接ABD以形成MBM的方法描述于WO 2019/104075和WO 2019/229701(参见例如WO2019/229701的第7.3.2节和WO 2019/104075的第6.2.2节，将其通过引用并入本文)。
MBM可以具有由两个Fc结构域联合形成的Fc区。Fc结构域可以是同二聚体或异二聚体。包括杵臼和极性桥形式的示例性异二聚化策略描述于WO 2019/104075的表2和第6.3.1.5节及其小节中，将其通过引用并入本文。Fc区具有改变的效应子功能。术语“效应子功能”是指抗体分子的活性，其是由通过抗体的结构域而不是抗原结合结构域的结合介导的，通常由效应分子的结合介导的。效应子功能包括补体介导的效应子功能，其是由例如该补体的C1组分与该抗体的结合介导的。补体的活化在细胞病原体的调理作用和裂解中是重要的。补体的活化还刺激炎症应答并且可参与自身免疫性超敏反应。效应子功能还包括Fc受体(FcR)介导的效应子功能，其可以由抗体的恒定结构域与Fc受体(FcR)的结合触发。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发许多重要的和多种的生物应答，包括抗体包覆的颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、杀伤细胞对抗体包覆的靶细胞的溶解(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、炎症介质的释放、胎盘转移以及免疫球蛋白产生的控制。抗体的效应子功能可以通过改变例如，增强或减少抗体对效应分子如Fc受体或补体组分的亲和力来改变。具有改变的效应子功能的Fc区描述于例如WO 2019/104075的第6.3.1.1至6.3.1.5节，将其通过引用并入本文；并且可以包括例如与野生型Fc区相比改变的与一种或多种Fc受体(例如FcRN)的结合、修饰的二硫键结构、或改变的糖基化模式。
可以与本披露的ZBTB32抑制剂组合使用的另外的MBM形式尤其披露于Suurs等人,2019,Pharmacology&Therapeutics[药理学与治疗学]201:103-119的图1；Labrijn等人,2019,Nat Rev Drug Discov.[自然评论：药物发现]18(8):585-608的图2；Krishnamurthy和Jimeno,2018,Pharmacology and Therapeutics[药理学与治疗学]185:122-134的图4；Sedykh等人,2018,Drug Design,Development and Therapy[药物设计、开发和疗法]12:195-208的图3；Spiess等人,2015,Molecular Immunology[分子免疫学]67:95-106的图1；Brinkmann和Kontermann,2017,mAbs[单克隆抗体],9:2,182-212的图2；Klein等人,2016,mAbs[单克隆抗体],8:6,1010-1020的图3；以及Klein等人,2019,Methods[方法]154:21-31的图2，所有这些图和所附文本均通过引用并入本文。
许多MBM已被开发或正在开发用于治疗各种癌症并且可以与本披露的ZBTB32抑制剂组合使用。参见例如Labrijn等人,2019,Nat Rev Drug Discov.[自然评论：药物发现]18(8):585-608的表1和2；Krishnamurthy和Jimeno,2018,Pharmacology and Therapeutics[药理学与治疗学]185:122-134的表1和2；Suurs等人,2019,Pharmacology&Therapeutics[药理学与治疗学]201:103-119的图3；Weidle等人,2014,Seminars in Oncology[肿瘤学研讨会]41:653-660的表1；Sedykh等人,2018,Drug Design,Development and Therapy[药物设计、开发和疗法]12:195-208的表I；Spiess等人,2015,Molecular Immunology[分子免疫学]67:95-106的表1；Dahlen等人,2018,Therapeutic Advances in Vaccines andImmunotherapy[疫苗和免疫疗法中的治疗进展]6(1)3-17的表1；以及Brinkmann和Kontermann,2017,mAbs[单克隆抗体],9(2):182-212的表3；所有这些图和所附文本均通过引用并入本文。可与本披露的ZBTB32抑制剂组合使用的示例性MBM在上述表格和图以及下表25中列出。
Figure BDA0003991130860004261
Figure BDA0003991130860004271
Figure BDA0003991130860004281
Figure BDA0003991130860004291
Figure BDA0003991130860004301
Figure BDA0003991130860004311
Figure BDA0003991130860004321
Figure BDA0003991130860004331
Figure BDA0003991130860004341
因此，本披露的分子可以与[表25]所述的任何MBM组合施用，例如以治疗适用于上文[表25]中的MBM的癌症。
在其他实施例中，[表25]中描述的MBM结合至BCMA，例如AMG701、AMG701、CC-93269、JNJ-64007957、PF-06863135或REGN5458。本披露的分子可以与任何前述靶向BCMA的MBM组合使用以治疗血液癌症，例如多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、各种白血病和成胶质细胞瘤。
在其他实施例中，[表25]中描述的MBM结合至CD19，例如MBM是A-319、AMG562、博纳吐单抗、MGD011或OXS-1550。本披露的分子可以与任何前述CD19靶向MBM组合使用，以治疗血液癌症，例如非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)、慢性淋巴细胞白血病和急性淋巴细胞白血病。
其他治疗剂
在另一个实施例中，将本披露的ZBTB32抑制剂、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体与表26中列出的或表26中引用的专利和专利申请中列出的治疗剂中的一种或多种组合使用，以治疗癌症。表26中列出的每个出版物通过引用以其全文并入本文，包括其中的所有结构式。
表26.其他示例性治疗剂
Figure BDA0003991130860004351
Figure BDA0003991130860004361
Figure BDA0003991130860004371
Figure BDA0003991130860004381
Figure BDA0003991130860004391
Figure BDA0003991130860004401
Figure BDA0003991130860004411
Figure BDA0003991130860004421
Figure BDA0003991130860004431
ZBTB32抑制剂的药物组合物
在另一个方面，本披露提供了组合物，例如药学上可接受的组合物，其包括ZBTB32抑制剂(例如本文所述的ZBTB32抑制剂)，该抑制剂单独或与第二治疗剂(例如本文所述的治疗剂)组合使用，与药学上可接受的载体一起配制。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。载体可适用于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、直肠、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。
本披露的组合物可以呈多种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如可注射和可输注溶液)，分散体或悬浮液，脂质体和栓剂。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。典型的组合物呈可注射或可输注溶液的形式。在某些实施例中，施用方式是肠胃外(例如静脉内、皮下、腹膜内、或肌肉内)。在实施例中，组合物通过静脉内输注或注射施用。在另一个实施例中，组合物通过肌肉内或皮下注射施用。
如本文所用的短语“肠胃外施用(parenteral administration和administeredparenterally)”意指除了肠道和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外以及胸骨内注射和输注。
治疗组合物在制造和贮藏条件下典型地应该是无菌和稳定的。所述组合物可以被配制成溶液、微乳剂、分散体、脂质体或其他适合于高抗体浓度的有序结构。可以通过以下各项来制备无菌可注射溶液：将活性化合物(即抗体或抗体部分)以所需的量，根据需要，与一种以上列举的成分或这些成分的组合并入适当的溶剂中，然后进行过滤灭菌。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物来制备分散体，该无菌媒介物含有基础分散介质以及来自以上列举的所需其他成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这些方法产生活性成分的粉末以及来自其以前的无菌过滤溶液的任何另外的所需成分。例如，可以通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散体的情况下维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持溶液的适当流动性。可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸盐和明胶)来延长可注射组合物的吸收。
在一些实施例中，可以将单独的或与第二治疗剂(例如，本文所述的治疗剂)组合的ZBTB32抑制剂(例如本文所述的ZBTB32抑制剂)配制成适合于向如本文所述的受试者施用(例如静脉内施用)的配制品(例如剂量配制品或剂型)。
治疗剂，例如抑制剂、拮抗剂或结合剂可以通过本领域已知的多种方法施用，但是对于许多治疗性应用，优选的施用途径/方式是静脉内注射或输注。如本领域技术人员将理解的，施用途经和/或方式将根据所希望的结果而变化。在某些实施例中，可以将活性化合物与将保护化合物免于快速释放的载体一起制备，例如控制释放配制品，包括植入物、经皮贴片和微胶囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类和聚乳酸。用于制备此类配制品的许多方法是获得专利权的或是本领域技术人员通常已知的。参见例如Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems[缓控释药物递送系统],J.R.Robinson编辑,Marcel Dekker,Inc.[马塞尔德克尔公司],纽约,1978。
在某些实施例中，治疗剂或化合物可以口服施用，例如与惰性稀释剂或可同化的可食用载体一起。化合物(和其他成分，如果希望的话)也可以包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，压制成片剂，或直接掺入受试者的饮食中。对于口服治疗给药，化合物可与赋形剂混合并以可摄入的片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。为了通过除肠胃外给药以外的其他方式施用本披露的化合物，可能需要用材料包被该化合物或将该化合物与材料共同施用以防止其失活。治疗组合物还可以用本领域已知的医疗装置给予。
调节剂量方案以提供最佳的希望应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用若干次分开剂量，或者可以如治疗情形的紧急情况所指示的按比例减少或增加剂量。可以特别有利地以单位剂型配制肠胃外组合物以易于施用和实现剂量均匀性。如本文所用，单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗受试者的物理上离散的单位；每个单位含有经计算产生所希望的治疗效果的预定量的活性化合物以及所需药物载体。本披露内容的单位剂型的规格是依据以下因素指定的并且直接取决于以下因素：(a)活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果，以及(b)混配这种活性化合物用于治疗个体的敏感性的技术中固有的限制。
本披露的药物组合物可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本披露的化合物。“治疗有效量”是指以必要的剂量和在必要的时间段内有效实现所希望的治疗结果的量。化合物的治疗有效量可以根据例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及化合物在个体中引起所希望的应答的能力等因素而变化。治疗有效量也是治疗有益效果超过化合物的任何毒性或有害作用的量。“治疗有效剂量”优选抑制可测量的参数，例如相对于未治疗的受试者，肿瘤生长速率抑制至少约20％，更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％，并且仍更优选至少约80％。可以在预测人肿瘤功效的动物模型系统中评估化合物抑制可测量参数(例如癌症)的能力。可替代地，组合物的这种特性可以通过检查化合物抑制的能力来评估，这种抑制在体外通过本领域技术人员已知的测定进行。
“预防有效量”是指以剂量计并且持续所希望的时间段以实现所希望的预防结果的有效的量。典型地，因为预防的剂量是在疾病之前或早期在受试者体内使用的，所以这种预防有效量将小于治疗有效量。
生物标志物
在某些实施例中，本文披露的任何方法进一步包括评估或监测本文所述疗法(例如，单一疗法或联合疗法)在受试者(例如，患有癌症的受试者，例如本文所述的癌症)中的有效性。该方法包括获得疗法有效性的值，其中所述值指示疗法的有效性。
在实施例中，对疗法具有有效性的值包括以下中的一、二、三、四、五、六、七、八、九或更多种(例如全部)的测量值：
(i)肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)表型的参数；
(ii)髓系细胞群体的参数；
(iii)表面表达标志物的参数；
(iv)免疫应答生物标志物的参数；
(v)系统性细胞因子调节的参数；
(vi)循环游离DNA(cfDNA)的参数；
(vii)系统性免疫调节的参数；
(viii)微生物组参数；
(ix)循环免疫细胞中活化标志物的参数；或
(x)循环细胞因子的参数。
在一些实施例中，TIL表型的参数包括受试者中，例如来自受试者的样品(例如肿瘤样品)中用于TIL计数的苏木精和伊红(H&E)染色、CD8、FOXP3、CD4或CD3中的一个、两个、三个、四个或更多(例如全部)的水平或活性。
在一些实施例中，髓系细胞群体的参数包括受试者中，例如来自受试者的样品(例如肿瘤样品)中CD68和CD163之一或两者的水平或活性。
在一些实施例中，表面表达标志物的参数包括受试者中，例如来自受试者的样品(例如肿瘤样品)中PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3或GITR中的一个或多个(例如两个、三个、四个或全部)的水平或活性。在某些实施例中，PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3或GITR的水平通过免疫组织化学(IHC)确定。
在一些实施例中，免疫应答生物标志物的参数包括受试者中，例如来自受试者的样品(例如肿瘤样品)中一种或多种基于核酸的标志物的水平或序列。
在一些实施例中，系统性细胞因子调节的参数包括受试者中，例如来自受试者的样品(例如血液样品，如血浆样品)中IL-18、IFN-γ、ITAC(CXCL11)、IL-6、IL-10、IL-4、IL-17、IL-15或TGF-β中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多(例如全部)的水平或活性。
在一些实施例中，cfDNA的参数包括受试者中，例如来自受试者的样品(例如血液样品，如血浆样品)中一种或多种循环肿瘤DNA(cfDNA)分子(例如肿瘤突变负荷)的序列或水平。
在一些实施例中，系统性免疫调节的参数包括受试者中，例如来自受试者的样品(例如血液样品，如PBMC样品)中活化的免疫细胞(例如表达CD3的细胞、表达CD8的细胞或两者)的表型特征。
在一些实施例中，微生物组的参数包括受试者中，例如来自受试者的样品(例如粪便样品)中微生物组中一种或多种基因的序列或表达水平。
在一些实施例中，循环免疫细胞中活化标志物的参数包括样品(例如血液样品，如血浆样品)中循环CD8+、HLA-DR+Ki67+、T细胞、IFN-γ、IL-18或表达CXCL11(IFN-γ诱导的CCK)的细胞中的一个、两个、三个、四个、五个或更多(例如全部)的水平或活性。
在一些实施例中，循环细胞因子的参数包括受试者中，例如来自受试者的样品(例如血液样品，如血浆样品)中IL-6的水平或活性。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，所述疗法包括本文所述的组合(例如包含治疗有效量的本文所述的PD-1抑制剂的组合)。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，(i)-(x)中的一项或多项的测量值从得自受试者的样品获得。在一些实施例中，样品选自肿瘤样品、血液样品(例如血浆样品或PBMC样品)或粪便样品。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，在接受疗法之前、期间或之后评估受试者。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，(i)-(x)中的一项或多项的测量值评估基因表达、流式细胞术或蛋白质表达中的一者或多者的特征。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，在受试者或样品中存在循环CD8+、HLA-DR+Ki67+、T细胞、IFN-γ、IL-18、或表达CXCL11(IFN-γ诱导的CCK)的细胞中的一者、二者、三者、四者、五者或更多者(例如全部)的水平或活性增加，和/或存在IL-6的水平或活性降低，是疗法有效性的阳性预测因子。
可替代地，或与本文披露的方法组合，应答于所述值，执行以下一者、二者、三者、四者或更多(例如全部)：
(i)对受试者施用疗法；
(ii)施用改变剂量的疗法；
(iii)改变疗法的时间表或时程；
(iv)向受试者施用另外的药剂(例如本文所述的治疗剂)与疗法的组合；或
(v)向受试者施用可替代的疗法。
ZBTB32抑制剂试剂盒
可以在试剂盒中提供本文披露的治疗剂的组合。通常在小瓶或容器中提供治疗剂。适当地，治疗剂可以处于液体或干燥(例如冻干)的形式。试剂盒可以包含本文披露的组合的治疗剂中的两种或更多种(例如三种、四种、五种、或全部)。在一些实施例中，所述试剂盒进一步含有药学上可接受的稀释剂。可以在试剂盒中以相同或分开的配制品(例如作为混合物或在分开的容器中)提供治疗剂。所述试剂盒可以含有提供一或多个剂量的治疗剂的等分试样。如果提供了用于多次施用的等分试样，则剂量可以是均匀的或变化的。适当地，各种给药方案可以递增或递减。组合中治疗剂的剂量可以独立地是均匀的或变化的。所述试剂盒可包括一种或多种其他要素，包括：使用说明书；其他试剂，例如标志物，或可用于螯合或以其他方式偶联治疗剂与标记物或治疗剂的试剂、或辐射防护组合物；用于制备用于施用的抗体的装置或其他材料；药学上可接受的载剂；和用于对受试者施用的装置或其他材料。
IKZF2抑制剂
在一些实施例中，ZBTB32抑制剂或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体或互变异构体可以与IKAROS家族锌指2(IKZF2)抑制剂组合使用，用于制备表达CAR的细胞，例如表达CAR的免疫效应细胞，或用于治疗疾病，例如癌症。
在一些实施例中，IKZF2抑制剂包含具有式(I’)的化合物
Figure BDA0003991130860004491
其中：
X1和X2各自独立地是H、(C1-C4)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C4)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、(C3-C7)环烷基、卤素、-CN、-OH、或-NH2；
Rx是H或D；
R1是
Figure BDA0003991130860004501
每个R2在每次出现时独立地是(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、-CN、-OH、或-NH2；或
两个R2与它们所附接的碳原子一起形成(C3-C7)环烷基或4元至7元杂环烷基环，该杂环烷基环包含选自O、N和S的1-3个杂原子；或当两个R2在相邻碳原子上时一起形成苯基、或5元或6元杂芳基环，该杂芳基环包含选自O、N和S的1-3个杂原子；或
R2和R6与它们所附接的碳原子和氮原子一起形成4元至6元杂环烷基环，该杂环烷基环任选地包含选自O、N和S的1-2个另外的杂原子，并且该杂环烷基环任选地被各自独立地选自以下的一至四个取代基取代：(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、卤素、-OH、-CN和-NH2；
每个R3是(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、-OH、或-NH2；
R4是-OR5或-NR6R6’；
R5是H，(C1-C6)烷基，(C1-C6)卤代烷基，(C3-C7)环烷基，包含选自O、N和S的1-3个杂原子的5元或6元杂环烷基，(C6-C10)芳基，或包含选自O、N和S的1-3个杂原子的5元或6元杂芳基，其中该烷基任选地被一至三个取代基取代，该一至三个取代基独立地选自(C6-C10)芳基，和包含选自O、N和S的1-3个杂原子的5元或6元杂芳基；
R6和R6'各自独立地是H，(C1-C6)烷基，(C1-C6)卤代烷基，(C2-C6)羟基烷基，(C3-C7)环烷基，包含选自O、N和S的1-3个杂原子的5元或6元杂环烷基，(C6-C10)芳基，或包含选自O、N和S的1-3个杂原子的5元或6元杂芳基，其中该烷基任选地被一至三个R7取代，并且其中该环烷基、杂环烷基、芳基、和杂芳基任选地被一至四个R12取代；或
R6和R6'与它们所附接的氮原子一起形成4元至8元杂环烷基环，该杂环烷基环任选地包含选自O、N和S的1-2个另外的杂原子，并且该杂环烷基环任选地被一至四个R8取代；或
R2和R6与它们所附接的碳原子和氮原子一起形成4元至6元杂环烷基环，该杂环烷基环任选地包含选自O、N和S的1-2个另外的杂原子，并且该杂环烷基环任选地被各自独立地选自以下的一至四个取代基取代：(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、卤素、-OH、-CN和-NH2；
每个R7是(C3-C7)环烷基，包含选自O、N和S的1-3个杂原子的4元至7元杂环烷基环，(C6-C10)芳基，或包含选自O、N和S的1-3个杂原子的5元或6元杂芳基，其中该环烷基、杂环烷基、芳基、和杂芳基任选地被一至四个R9取代；
每个R8在每次出现时独立地是卤素，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)卤代烷基，(C1-C6)卤代烷氧基，-CN，-OH，-NR13R14，-NH2，-O(C3-C7)环烷基，包含选自O、N和S的1-3个杂原子的-O-4元至7元杂环烷基环，-O(C6-C10)芳基，或包含选自O、N和S的1-3个杂原子的-O-5元或6元杂芳基，其中该烷氧基任选地被一至三个R10取代，并且该环烷基、杂环烷基、芳基、和杂芳基任选地被一至三个R11取代；或
两个R8与它们所附接的原子一起形成任选地被两个R15取代的(C4-C7)环烷基，或包含选自O、N和S的1-2个杂原子的4元至7元杂环烷基环；或者当两个R8在相邻原子上时与它们所附接的原子一起形成(C6-C10)芳基，或包含选自O、N和S的1-3个杂原子的5元或6元杂芳基；或者两个R8与它们所附接的相同的原子一起形成＝(O)；
每个R9在每次出现时独立地是(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、(C3-C6)环烷基、-OH、-CN、-NH2、或-NR13R14；或
两个R9与它们所附接的原子一起形成(C4-C7)环烷基或5元至7元杂环烷基环，该杂环烷基环包含选自O、N和S的1-2个杂原子，该环烷基或杂环烷基环任选地被一个或多个取代基取代，该一个或多个取代基各自独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、卤素、-OH、-CN和-NH2；或者当两个R9在相邻原子上时与它们所附接的原子一起形成(C6-C10)芳基，或包含选自O、N和S的1-3个杂原子的5元或6元杂芳基；
每个R10在每次出现时独立地选自(C3-C7)环烷基，包含选自O、N和S的1-3个杂原子的4元至7元杂环烷基环、(C6-C10)芳基，和包含选自O、N和S的1-3个杂原子的5元或6元杂芳基；
每个R11在每次出现时独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、-OH、-CN、和-NH2；
每个R12在每次出现时独立地是(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、-OH、-CN、或-NH2；
两个R12与它们所附接的原子一起形成(C4-C7)环烷基或4元至7元杂环烷基环，该杂环烷基环包含选自O、N和S的1-2个杂原子；
R13和R14各自独立地选自(C1-C6)烷基，(C1-C6)卤代烷基，C3-C7环烷基，包含选自O、N和S的1-3个杂原子的4元至7元杂环烷基环，(C6-C10)芳基，和包含选自O、N和S的1-3个杂原子的5元或6元杂芳基；
两个R15与它们所附接的原子一起形成(C4-C7)环烷基或4元至7元杂环烷基环，该杂环烷基环包含选自O、N和S的1-2个杂原子；
m和m1各自独立地是0、1或2；
n1是0、1、2、或3；以及
每个s和n独立地是1、2、或3，其中s+n≤4；
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、和互变异构体。
在一些实施例中，所述化合物具有式(I)，
Figure BDA0003991130860004531
其中：
Rx是H或D；
R1是
Figure BDA0003991130860004532
每个R2在每次出现时独立地是(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、-CN、-OH、或-NH2；或
两个R2与它们所附接的碳原子一起形成(C3-C7)环烷基或4元至7元杂环烷基环，该杂环烷基环包含选自O、N和S的1-3个杂原子；或当两个R2在相邻碳原子上时一起形成苯基、或5元或6元杂芳基环，该杂芳基环包含选自O、N和S的1-3个杂原子；或
R2和R6与它们所附接的碳原子和氮原子一起形成5元或6元杂环烷基环，该杂环烷基环任选地包含选自O、N和S的1-2个另外的杂原子，并且该杂环烷基环任选地被一至四个取代基取代，该一至四个取代基各自独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、卤素、-OH、-CN、和-NH2；
每个R3是(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、-OH、或-NH2；
R4是-OR5或-NR6R6'；
R5是H，(C1-C6)烷基，(C1-C6)卤代烷基，(C3-C7)环烷基，包含选自O、N和S的1-3个杂原子的5元或6元杂环烷基，(C6-C10)芳基，或包含选自O、N和S的1-3个杂原子的5元或6元杂芳基，其中该烷基任选地被一至三个取代基取代，该一至三个取代基独立地选自(C6-C10)芳基，和包含选自O、N和S的1-3个杂原子的5元或6元杂芳基；
R6和R6'各自独立地是H，(C1-C6)烷基，(C1-C6)卤代烷基，(C3-C7)环烷基，包含选自O、N和S的1-3个杂原子的5元或6元杂环烷基，(C6-C10)芳基，或包含选自O、N和S的1-3个杂原子的5元或6元杂芳基，其中该烷基任选地被一至三个R7取代；或
R6和R6'与它们所附接的氮原子一起形成4元至7元杂环烷基环，该杂环烷基环任选地包含选自O、N和S的1-2个另外的杂原子，并且该杂环烷基环任选地被一至四个R8取代；或
R2和R6与它们所附接的碳原子和氮原子一起形成5元或6元杂环烷基环，该杂环烷基环任选地包含选自O、N和S的1-2个另外的杂原子，并且该杂环烷基环任选地被各自独立地选自以下的一至四个取代基取代：(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、卤素、-OH、-CN和-NH2；
每个R7是(C3-C7)环烷基，包含选自O、N和S的1-3个杂原子的4元至7元杂环烷基环，(C6-C10)芳基，或包含选自O、N和S的1-3个杂原子的5元或6元杂芳基，其中该环烷基、杂环烷基、芳基、和杂芳基任选地被一至四个R9取代；
每个R8在每次出现时独立地是卤素、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、-CN、-OH、或-NH2，其中该烷氧基任选地被一至三个取代基取代，该一至三个取代基独立地选自(C3-C7)环烷基，包含选自O、N和S的1-3个杂原子的4元至7元杂环烷基环，(C6-C10)芳基，和包含选自O、N和S的1-3个杂原子的5元或6元杂芳基；或
两个R8与它们所附接的原子一起形成(C5-C7)环烷基或4元至7元杂环烷基环，该杂环烷基环包含选自O、N和S的1-2个杂原子；
每个R9在每次出现时独立地是(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、卤素、-OH、-CN、或-NH2；或
两个R9与它们所附接的原子一起形成(C5-C7)环烷基或5元至7元杂环烷基环，该杂环烷基环包含选自O、N和S的1-2个杂原子，该环烷基或杂环烷基环任选地被一个或多个取代基取代，该一个或多个取代基各自独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、卤素、-OH、-CN、和-NH2；
m和m1各自独立地是0、1、或2；
n1是0、1、2、或3；以及
每个s和n独立地是1、2、或3，其中s+n≤4；
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、和互变异构体。
在一些实例中，R1是
Figure BDA0003991130860004551
在一些实施例中，n1是0、1或2。在一些实施例中，m1是0。在一些实施例中，m1是2。
在一些实例中，R1是
Figure BDA0003991130860004552
在一些实施例中，n是2并且s是1或2。在一些实施例中，m是0或1。
在一些实施例中，该化合物具有式(Ia)或式(Ib)：
Figure BDA0003991130860004553
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、和互变异构体。
在一些实施例中，该化合物具有式(Ic)、式(Id)、式(Ie)、式(If)、式(Ig)、式(Ih)、式(Ii)、或式(Ij)：
Figure BDA0003991130860004554
Figure BDA0003991130860004561
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、和互变异构体。
在一些实施例中，该化合物具有式(Ik)、式(Il)、式(Im)、式(In)、式(Io)、或式(Ip)：
Figure BDA0003991130860004562
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、和互变异构体。
在一些实施例中，R4是-OR5。在一些实施例中，R4是-NR6R6'。
在一些实施例中，该化合物具有式(Iq)、式(Ir)、式(Is)或式(It)：
Figure BDA0003991130860004563
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、和互变异构体。
在一些实施例中，所述化合物选自：
3-(5-(((1S,2S)-2-((2,2-二氟乙基)(乙基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-((2,2-二氟乙基)(乙基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-((2,2-二氟乙基)(乙基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-((2,2-二氟乙基)(乙基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-((2,2-二氟乙基)(乙基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(苄基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(苄基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(苄基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(苄基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(苄基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((1-甲基八氢环戊[b]吡咯-6-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-甲氧基环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-甲氧基环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-甲氧基环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-甲氧基环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-甲氧基环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-羟基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-羟基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-羟基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-羟基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-羟基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-羟基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-羟基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-羟基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-羟基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-羟基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(异丁基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(异丁基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(异丁基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(异丁基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(异丁基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(4,4-二氟哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(4,4-二氟哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(4,4-二氟哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(4,4-二氟哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(4,4-二氟哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(苄氧基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(苄氧基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(苄氧基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(苄氧基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(苄氧基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(二乙基氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(二乙基氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(二乙基氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(二乙基氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(二乙基氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-(((1-(三氟甲基)环丙基)甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-(((1-(三氟甲基)环丙基)甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-(((1-(三氟甲基)环丙基)甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-(((1-(三氟甲基)环丙基)甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-(((1-(三氟甲基)环丙基)甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-氨基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-氨基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-氨基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-氨基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-氨基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(二乙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(二乙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(二乙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(二乙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(二乙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-氨基环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-氨基环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-氨基环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-氨基环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-氨基环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(8-氧杂-3-氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(8-氧杂-3-氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(8-氧杂-3-氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(8-氧杂-3-氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(8-氧杂-3-氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-苯氧基环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-苯氧基环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-苯氧基环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-苯氧基环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-苯氧基环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(苄基氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(苄基氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(苄基氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(苄基氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(苄基氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((3S,4S)-3-(苄基氨基)四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((3R,4S)-3-(苄基氨基)四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((3R,4R)-3-(苄基氨基)四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((3S,4R)-3-(苄基氨基)四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((3-(苄基氨基)四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(苄基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(苄基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(苄基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(苄基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(苄基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-(((R)-1-苯基乙基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-(((R)-1-苯基乙基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-(((R)-1-苯基乙基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-(((R)-1-苯基乙基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-(((R)-1-苯基乙基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(乙基(2-氟乙基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(乙基(2-氟乙基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(乙基(2-氟乙基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(乙基(2-氟乙基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(乙基(2-氟乙基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(乙基(异丙基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(乙基(异丙基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(乙基(异丙基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(乙基(异丙基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(乙基(异丙基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-甲氧基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-甲氧基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-甲氧基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-甲氧基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-甲氧基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-羟基环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-羟基环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-羟基环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-羟基环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-羟基环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(乙基氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(乙基氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(乙基氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(乙基氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(乙基氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(双(环丙基甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(双(环丙基甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(双(环丙基甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(双(环丙基甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(双(环丙基甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-(哌啶-1-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-(哌啶-1-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-(哌啶-1-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-(哌啶-1-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-(哌啶-1-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-吗啉代环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-吗啉代环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-吗啉代环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-吗啉代环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-吗啉代环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(二苄基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(二苄基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(二苄基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(二苄基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(二苄基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
顺式-3-(5-((2-(二乙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
反式-3-(5-((2-(二乙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(甲基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(甲基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(甲基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(甲基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(甲基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
1-((1S,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)-4-甲基哌啶-4-甲腈；
1-((1R,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)-4-甲基哌啶-4-甲腈；
1-((1R,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)-4-甲基哌啶-4-甲腈；
1-((1S,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)-4-甲基哌啶-4-甲腈；
1-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)-4-甲基哌啶-4-甲腈；
3-(5-(((1S,2S)-2-(苄基(甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(苄基(甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(苄基(甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(苄基(甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(苄基(甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((3S,4S)-3-氨基四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((3R,4S)-3-氨基四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((3R,4R)-3-氨基四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((3S,4R)-3-氨基四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((3-氨基四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((1S,2S)-2-(苄基氨基)环丁氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((1R,2R)-2-(苄基氨基)环丁氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((1S,2R)-2-(苄基氨基)环丁氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((1R,2S)-2-(苄基氨基)环丁氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(2-(苄基氨基)环丁氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((3R,4S)-4-氨基四氢呋喃-3-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((3R,4R)-4-氨基四氢呋喃-3-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((3S,4R)-4-氨基四氢呋喃-3-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((3S,4S)-4-氨基四氢呋喃-3-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((4-氨基四氢呋喃-3-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((3R,4S)-4-(二乙基氨基)四氢呋喃-3-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((3R,4R)-4-(二乙基氨基)四氢呋喃-3-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((3S,4R)-4-(二乙基氨基)四氢呋喃-3-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((3S,4S)-4-(二乙基氨基)四氢呋喃-3-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((4-(二乙基氨基)四氢呋喃-3-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(乙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(乙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(乙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(乙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(乙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
4-((((1S,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)苄腈；
4-((((1R,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)苄腈；
4-((((1R,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)苄腈；
4-((((1S,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)苄腈；
4-(((2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)苄腈；
3-(5-((1S,2S)-2-(二乙基氨基)环丁氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((1R,2S)-2-(二乙基氨基)环丁氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((1R,2R)-2-(二乙基氨基)环丁氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((1S,2R)-2-(二乙基氨基)环丁氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(2-(二乙基氨基)环丁氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(乙基((3-氟二环[1.1.1]戊-1-基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(乙基((3-氟二环[1.1.1]戊-1-基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(乙基((3-氟二环[1.1.1]戊-1-基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(乙基((3-氟二环[1.1.1]戊-1-基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(乙基((3-氟二环[1.1.1]戊-1-基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-((((1S,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)苄腈；
3-((((1R,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)苄腈；
3-((((1R,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)苄腈；
3-((((1S,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)苄腈；
3-(((2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)苄腈；
3-(5-(((1S,2S)-2-(异丙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(异丙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(异丙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(异丙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(异丙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
2-((((1S,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)苄腈；
2-((((1R,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)苄腈；
2-((((1R,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)苄腈；
2-((((1S,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)苄腈；
2-(((2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)苄腈；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((3-氟二环[1.1.1]戊-1-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((3-氟二环[1.1.1]戊-1-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((3-氟二环[1.1.1]戊-1-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((3-氟二环[1.1.1]戊-1-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((3-氟二环[1.1.1]戊-1-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(4-羟基-4-甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(4-羟基-4-甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(4-羟基-4-甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(4-羟基-4-甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(4-羟基-4-甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(4-羟基-4-(三氟甲基)哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(4-羟基-4-(三氟甲基)哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(4-羟基-4-(三氟甲基)哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(4-羟基-4-(三氟甲基)哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(4-羟基-4-(三氟甲基)哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
1-((1S,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)-4-(三氟甲基)哌啶-4-甲腈；
1-((1R,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)-4-(三氟甲基)哌啶-4-甲腈；
1-((1R,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)-4-(三氟甲基)哌啶-4-甲腈；
1-((1S,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)-4-(三氟甲基)哌啶-4-甲腈；
1-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)-4-(三氟甲基)哌啶-4-甲腈；
3-(5-(((1S,2S)-2-(2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-(3-(2,2,2-三氟乙氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-(3-(2,2,2-三氟乙氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-(3-(2,2,2-三氟乙氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-(3-(2,2,2-三氟乙氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-(3-(2,2,2-三氟乙氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-(2,2-二氟乙氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-(2,2-二氟乙氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-(2,2-二氟乙氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-(2,2-二氟乙氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-(2,2-二氟乙氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-(环丙基甲氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-(环丙基甲氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-(环丙基甲氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-(环丙基甲氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-(环丙基甲氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-(苄氧基)氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-(苄氧基)氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-(苄氧基)氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-(苄氧基)氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-(苄氧基)氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-异丙氧基氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-异丙氧基氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-异丙氧基氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-异丙氧基氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-异丙氧基氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-乙氧基氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-乙氧基氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-乙氧基氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-乙氧基氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-乙氧基氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-(苄氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-(苄氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-(苄氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-(苄氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-(苄氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-乙氧基氮杂环丁-1-基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-乙氧基氮杂环丁-1-基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-乙氧基氮杂环丁-1-基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-乙氧基氮杂环丁-1-基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-乙氧基氮杂环丁-1-基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-(3,3-二氟环丁氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-(3,3-二氟环丁氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-(3,3-二氟环丁氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-(3,3-二氟环丁氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-(3,3-二氟环丁氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(4-羟基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(4-羟基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(4-羟基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(4-羟基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(4-羟基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-(4-氧代哌啶-1-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-羟基吡咯烷-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-羟基吡咯烷-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-羟基吡咯烷-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-羟基吡咯烷-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-羟基吡咯烷-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(异丁基氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(异丁基氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(异丁基氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(异丁基氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(异丁基氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(乙基(甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(乙基(甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(乙基(甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(乙基(甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(乙基(甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-((3aR,6aS)-四氢-1H-氟[3,4-c]吡咯-5(3H)-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-((3aR,6aS)-四氢-1H-氟[3,4-c]吡咯-5(3H)-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-((3aR,6aS)-四氢-1H-氟[3,4-c]吡咯-5(3H)-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-((3aR,6aS)-四氢-1H-氟[3,4-c]吡咯-5(3H)-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-((3aR,6aS)-四氢-1H-氟[3,4-c]吡咯-5(3H)-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-(四氢-1H-氟[3,4-c]吡咯-5(3H)-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-((吡啶-2-基甲基)氨基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-((吡啶-2-基甲基)氨基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-((吡啶-2-基甲基)氨基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-((吡啶-2-基甲基)氨基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-((吡啶-2-基甲基)氨基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-(吡咯烷-1-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-(吡咯烷-1-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-(吡咯烷-1-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-(吡咯烷-1-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-(吡咯烷-1-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(双((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(双((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(双((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(双((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(双((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(4-甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(4-甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(4-甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(4-甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(4-甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-((吡啶-3-基甲基)氨基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-((吡啶-3-基甲基)氨基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-((吡啶-3-基甲基)氨基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-((吡啶-3-基甲基)氨基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-((吡啶-3-基甲基)氨基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-((吡啶-4-基甲基)氨基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-((吡啶-4-基甲基)氨基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-((吡啶-4-基甲基)氨基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-((吡啶-4-基甲基)氨基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-((吡啶-4-基甲基)氨基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(4-甲氧基-4-甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(4-甲氧基-4-甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(4-甲氧基-4-甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(4-甲氧基-4-甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(4-甲氧基-4-甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(4,4-二甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(4,4-二甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(4,4-二甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(4,4-二甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(4,4-二甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(4-甲氧基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(4-甲氧基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(4-甲氧基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(4-甲氧基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(4-甲氧基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(乙基(氧杂环丁烷-3-基甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(乙基(氧杂环丁烷-3-基甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(乙基(氧杂环丁烷-3-基甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(乙基(氧杂环丁烷-3-基甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(乙基(氧杂环丁烷-3-基甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(异吲哚啉-2-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(异吲哚啉-2-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(异吲哚啉-2-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(异吲哚啉-2-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(异吲哚啉-2-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-甲氧基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-甲氧基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-甲氧基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-甲氧基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-甲氧基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(4-乙氧基-4-甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(4-乙氧基-4-甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(4-乙氧基-4-甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(4-乙氧基-4-甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(4-乙氧基-4-甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-((((1R,4S)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-((((1R,4R)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-((((1R,4R)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-((((1R,4S)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-((((1R,4R)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
(1S,4R)-4-((((1S,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)氨基)甲基)环己烷-1-甲腈；
(1R,4r)-4-((((1R,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)氨基)甲基)环己烷-1-甲腈；
(1R,4r)-4-((((1R,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)氨基)甲基)环己烷-1-甲腈；
(1S,4r)-4-((((1S,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)氨基)甲基)环己烷-1-甲腈；
(1r,4r)-4-(((2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)氨基)甲基)环己烷-1-甲腈；
4-(((2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)氨基)甲基)环己烷-1-甲腈；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-((((1S,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)(乙基)氨基)甲基)-1-甲基环丁烷-1-甲腈；
(1S,3R)-3-((((1S,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)(乙基)氨基)甲基)-1-甲基环丁烷-1-甲腈；
(1R,3S)-3-((((1S,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)(乙基)氨基)甲基)-1-甲基环丁烷-1-甲腈；
反式-3-((((1S,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)(乙基)氨基)甲基)-1-甲基环丁烷-1-甲腈；
顺式-3-((((1S,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环戊基)(乙基)氨基)甲基)-1-甲基环丁烷-1-甲腈；
3-(5-(((1S,2S)-2-(4-氟哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(4-氟哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(4-氟哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(4-氟哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(4-氟哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(1,5-氧杂氮杂辛-5-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(1,5-氧杂氮杂辛-5-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(1,5-氧杂氮杂辛-5-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(1,5-氧杂氮杂辛-5-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(1,5-氧杂氮杂辛-5-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3,3-二甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3,3-二甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3,3-二甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3,3-二甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3,3-二甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(乙基(((1R,4S)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-((((1R,4S)-4-甲氧基环己基)甲基)(甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
反式-3-(5-((2-(二乙基氨基)-4,4-二甲基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
顺式-3-(5-((2-(二乙基氨基)-4,4-二甲基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(二乙基氨基)-4,4-二甲基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(二乙基氨基)-4,4-二甲基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(二乙基氨基)-4,4-二甲基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(二乙基氨基)-4,4-二甲基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(二乙基氨基)-4,4-二甲基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((4,4-二氟环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((4,4-二氟环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((4,4-二氟环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((4,4-二氟环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((4,4-二氟环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((1H-吲哚-5-基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((1H-吲哚-5-基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((1H-吲哚-5-基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((1H-吲哚-5-基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((1H-吲哚-5-基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(4-(叔丁氧基)哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(4-(叔丁氧基)哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(4-(叔丁氧基)哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(4-(叔丁氧基)哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(4-(叔丁氧基)哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(2-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(2-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(2-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(2-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(2-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-(2-氯苯氧基)氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-(2-氯苯氧基)氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-(2-氯苯氧基)氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-(2-氯苯氧基)氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-(2-氯苯氧基)氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-(2-甲氧基苯氧基)氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-(2-甲氧基苯氧基)氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-(2-甲氧基苯氧基)氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-(2-甲氧基苯氧基)氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-(2-甲氧基苯氧基)氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(6-氮杂螺[3.5]壬-6-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(6-氮杂螺[3.5]壬-6-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(6-氮杂螺[3.5]壬-6-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(6-氮杂螺[3.5]壬-6-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(6-氮杂螺[3.5]壬-6-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(乙基(((1S,3R)-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(乙基(((1s,3S)-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(乙基(((1s,3S)-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(乙基(((1s,3R)-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(乙基(((1s,3s)-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(二乙基氨基)-4,4-二甲基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(二乙基氨基)-4,4-二甲基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(二乙基氨基)-4,4-二甲基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(二乙基氨基)-4,4-二甲基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(二乙基氨基)-4,4-二甲基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(乙基(((1R,3S)-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(乙基(((1r,3R)-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(乙基(((1r,3R)-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(乙基(((1r,3S)-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(乙基(((1r,3r)-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-2-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-2-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-2-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-2-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-2-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-硫代吗啉代环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-硫代吗啉代环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-硫代吗啉代环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-硫代吗啉代环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-硫代吗啉代环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(4-异丙氧基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(4-异丙氧基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(4-异丙氧基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(4-异丙氧基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(4-异丙氧基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(4-(环丙基甲氧基)哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(4-(环丙基甲氧基)哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(4-(环丙基甲氧基)哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(4-(环丙基甲氧基)哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(4-(环丙基甲氧基)哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-((3aR,4R,7S,7aS)-八氢-2H-4,7-环氧异吲哚-2-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-((3aR,4R,7S,7aS)-八氢-2H-4,7-环氧异吲哚-2-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-((3aR,4R,7S,7aS)-八氢-2H-4,7-环氧异吲哚-2-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-((3aR,4R,7S,7aS)-八氢-2H-4,7-环氧异吲哚-2-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-((3aR,4R,7S,7aS)-八氢-2H-4,7-环氧异吲哚-2-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(4-乙氧基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(4-乙氧基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(4-乙氧基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(4-乙氧基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(4-乙氧基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(7,8-二氢-1,6-萘啶-6(5H)-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(7,8-二氢-1,6-萘啶-6(5H)-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(7,8-二氢-1,6-萘啶-6(5H)-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(7,8-二氢-1,6-萘啶-6(5H)-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(7,8-二氢-1,6-萘啶-6(5H)-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-((((1S,4R)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-((((1s,4S)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-((((1s,4S)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-((((1s,4R)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-((((1s,4s)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-((R)-3-甲氧基吡咯烷-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-((R)-3-甲氧基吡咯烷-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-((R)-3-甲氧基吡咯烷-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-((R)-3-甲氧基吡咯烷-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-((R)-3-甲氧基吡咯烷-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-((S)-3-甲氧基吡咯烷-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-((S)-3-甲氧基吡咯烷-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-((S)-3-甲氧基吡咯烷-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-((S)-3-甲氧基吡咯烷-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-((S)-3-甲氧基吡咯烷-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((3,3-二氟环丁基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((3,3-二氟环丁基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((3,3-二氟环丁基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((3,3-二氟环丁基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((3,3-二氟环丁基)甲基)氨基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(4-(二氟甲氧基)哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(4-(二氟甲氧基)哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(4-(二氟甲氧基)哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(4-(二氟甲氧基)哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(4-(二氟甲氧基)哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(1,3-二氢-2H-吡咯并[3,4-c]吡啶-2-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-(丙基氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-(丙基氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-(丙基氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-(丙基氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-(丙基氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(二丙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(二丙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(二丙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(二丙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(二丙基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-((吡啶-4-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-((吡啶-4-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-((吡啶-4-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-((吡啶-4-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-((吡啶-4-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-((吡啶-3-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-((吡啶-3-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-((吡啶-3-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-((吡啶-3-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-((吡啶-3-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((1-乙基-1H-吡唑-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((1-乙基-1H-吡唑-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((1-乙基-1H-吡唑-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((1-乙基-1H-吡唑-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((1-乙基-1H-吡唑-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(乙基(甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(乙基(甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(乙基(甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(乙基(甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(乙基(甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(二甲基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(二甲基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(二甲基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(二甲基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(二甲基氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-((氧杂环丁烷-3-基甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-((氧杂环丁烷-3-基甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-((氧杂环丁烷-3-基甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-((氧杂环丁烷-3-基甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-((氧杂环丁烷-3-基甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-((2-羟基乙基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-((2-羟基乙基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-((2-羟基乙基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-((2-羟基乙基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-((2-羟基乙基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-(吡咯烷-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-(吡咯烷-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-(吡咯烷-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-(吡咯烷-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-(吡咯烷-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-吗啉代环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-吗啉代环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-吗啉代环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-吗啉代环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-吗啉代环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-((吡啶-2-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-((吡啶-2-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-((吡啶-2-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-((吡啶-2-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-((吡啶-2-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-((3-羟基-3-甲基丁基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-((3-羟基-3-甲基丁基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-((3-羟基-3-甲基丁基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-((3-羟基-3-甲基丁基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-((3-羟基-3-甲基丁基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(4-甲氧基-4-甲基哌啶-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(4-甲氧基-4-甲基哌啶-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(4-甲氧基-4-甲基哌啶-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(4-甲氧基-4-甲基哌啶-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(4-甲氧基-4-甲基哌啶-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-甲氧基氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-甲氧基氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-甲氧基氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-甲氧基氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-甲氧基氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((6-甲基吡啶-2-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((6-甲基吡啶-2-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((6-甲基吡啶-2-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((6-甲基吡啶-2-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((6-甲基吡啶-2-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((5-甲氧基吡啶-2-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((5-甲氧基吡啶-2-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((5-甲氧基吡啶-2-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((5-甲氧基吡啶-2-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((5-甲氧基吡啶-2-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((6-甲氧基吡啶-3-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((6-甲氧基吡啶-3-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((6-甲氧基吡啶-3-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((6-甲氧基吡啶-3-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((6-甲氧基吡啶-3-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-((2-羟基-2-甲基丙基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-((2-羟基-2-甲基丙基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-((2-羟基-2-甲基丙基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-((2-羟基-2-甲基丙基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-((2-羟基-2-甲基丙基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-((((1S,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)-1-甲基环丁烷-1-甲腈；
3-((((1R,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)-1-甲基环丁烷-1-甲腈；
3-((((1R,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)-1-甲基环丁烷-1-甲腈；
3-((((1S,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)-1-甲基环丁烷-1-甲腈；
3-(((2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)-1-甲基环丁烷-1-甲腈；
(1S,3R)-3-((((1S,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)-1-甲基环丁烷-1-甲腈；
(1R,3R)-3-((((1R,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)-1-甲基环丁烷-1-甲腈；
(1R,3R)-3-((((1R,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)-1-甲基环丁烷-1-甲腈；
(1S,3r)-3-((((1S,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)-1-甲基环丁烷-1-甲腈；
(1r,3r)-3-(((2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)-1-甲基环丁烷-1-甲腈；
(1R,3S)-3-((((1S,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)-1-甲基环丁烷-1-甲腈；
(1S,3s)-3-((((1R,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)-1-甲基环丁烷-1-甲腈；
(1S,3s)-3-((((1R,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)-1-甲基环丁烷-1-甲腈；
(1R,3s)-3-((((1S,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)-1-甲基环丁烷-1-甲腈；
(1s,3s)-3-(((2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)-1-甲基环丁烷-1-甲腈；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-(哌啶-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-(哌啶-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-(哌啶-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-(哌啶-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-(哌啶-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-((((1S,3R)-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-((((1s,3S)-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-((((1s,3S)-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-((((1s,3R)-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-((((1s,3s)-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((顺式-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((顺式-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((顺式-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((顺式-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((顺式-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-((((1R,3S)-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-((((1s,3S)-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-((((1s,3S)-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-((((1s,3R)-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-((((1s,3s)-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((反式-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((反式-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((反式-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((反式-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((反式-3-甲氧基环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-((((1r,4S)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-((((1r,4R)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-((((1r,4R)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-((((1r,4S)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-((((1r,4r)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((4-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-((嘧啶-5-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-((嘧啶-5-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-((嘧啶-5-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-((嘧啶-5-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-((嘧啶-5-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-((2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-((2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-((2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-((2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-((2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((4-甲氧基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((4-甲氧基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((4-甲氧基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((4-甲氧基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((4-甲氧基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((2,2-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((2,2-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((2,2-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((2,2-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((2,2-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-((7-氧杂螺[3.5]壬-2-基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-((7-氧杂螺[3.5]壬-2-基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-((7-氧杂螺[3.5]壬-2-基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-((7-氧杂螺[3.5]壬-2-基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-((7-氧杂螺[3.5]壬-2-基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
1-((((1S,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)环丁烷-1-甲腈；
1-((((1R,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)环丁烷-1-甲腈；
1-((((1R,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)环丁烷-1-甲腈；
1-((((1S,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)环丁烷-1-甲腈；
1-(((2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)环丁烷-1-甲腈；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-(2-氯苯氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-(2-氯苯氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-(2-氯苯氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-(2-氯苯氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-(2-氯苯氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-(2-甲氧基苯氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-(2-甲氧基苯氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-(2-甲氧基苯氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-(2-甲氧基苯氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-(2-甲氧基苯氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-((吡唑并[1,5-a]嘧啶-6-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-((吡唑并[1,5-a]嘧啶-6-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-((吡唑并[1,5-a]嘧啶-6-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-((吡唑并[1,5-a]嘧啶-6-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-((吡唑并[1,5-a]嘧啶-6-基甲基)氨基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-((4,4-二氟环己基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-((4,4-二氟环己基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-((4,4-二氟环己基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-((4,4-二氟环己基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-((4,4-二氟环己基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-((2,4-二氟苄基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-((2,4-二氟苄基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-((2,4-二氟苄基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-((2,4-二氟苄基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-((2,4-二氟苄基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-((2-甲氧基环戊基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-((2-甲氧基环戊基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-((2-甲氧基环戊基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-((2-甲氧基环戊基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-((2-甲氧基环戊基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((1R,2R)-2-甲氧基环戊基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((1R,2R)-2-甲氧基环戊基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((1R,2R)-2-甲氧基环戊基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((1R,2R)-2-甲氧基环戊基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((1R,2R)-2-甲氧基环戊基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((1S,2S)-2-甲氧基环戊基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((1S,2S)-2-甲氧基环戊基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((1S,2S)-2-甲氧基环戊基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((1S,2S)-2-甲氧基环戊基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((1S,2S)-2-甲氧基环戊基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-((((1S,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)二环[1.1.1]戊烷-1-甲腈；
3-((((1R,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)二环[1.1.1]戊烷-1-甲腈；
3-((((1R,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)二环[1.1.1]戊烷-1-甲腈；
3-((((1S,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)二环[1.1.1]戊烷-1-甲腈；
3-(((2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)二环[1.1.1]戊烷-1-甲腈；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-(3-氟苯氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-(3-氟苯氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-(3-氟苯氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-(3-氟苯氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-(3-氟苯氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((3,3-二氟环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((3,3-二氟环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((3,3-二氟环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((3,3-二氟环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((3,3-二氟环丁基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-((((1S,4R)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-((((1s,4S)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-((((1s,4S)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-((((1s,4R)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-((((1s,4s)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((顺式-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((反式-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(双(((1R,4S)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(双(((1r,4R)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(双(((1r,4R)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(双(((1r,4S)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(双(((1r,4R)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
4-((((1S,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)苄腈；
4-((((1R,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)苄腈；
4-((((1R,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)苄腈；
4-((((1S,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)苄腈；
4-(((2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)氨基)甲基)苄腈；
4-((((1S,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)(甲基)氨基)甲基)苄腈；
4-((((1R,2S)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)(甲基)氨基)甲基)苄腈；
4-((((1R,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)(甲基)氨基)甲基)苄腈；
4-((((1S,2R)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)(甲基)氨基)甲基)苄腈；
4-(((2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)氧基)环己基)(甲基)氨基)甲基)苄腈；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((3-氟二环[1.1.1]戊-1-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((3-氟二环[1.1.1]戊-1-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((3-氟二环[1.1.1]戊-1-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((3-氟二环[1.1.1]戊-1-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((3-氟二环[1.1.1]戊-1-基)甲基)氨基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3,3-二氟吡咯烷-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3,3-二氟吡咯烷-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3,3-二氟吡咯烷-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3,3-二氟吡咯烷-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3,3-二氟吡咯烷-1-基)环己基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(乙基氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(乙基氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(乙基氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(乙基氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(乙基氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(苄基氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(苄基氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(苄基氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(苄基氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(苄基氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(二乙基氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(二乙基氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(二乙基氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(二乙基氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(二乙基氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(4-甲氧基-4-甲基哌啶-1-基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(4-甲氧基-4-甲基哌啶-1-基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(4-甲氧基-4-甲基哌啶-1-基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(4-甲氧基-4-甲基哌啶-1-基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(4-甲氧基-4-甲基哌啶-1-基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(异丁基氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(异丁基氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(异丁基氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(异丁基氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(异丁基氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-(丙基氨基)环庚基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-(丙基氨基)环庚基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-(丙基氨基)环庚基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-(丙基氨基)环庚基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-(丙基氨基)环庚基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-((((1R,4S)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-((((1r,4R)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-((((1r,4R)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-((((1r,4S)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-((((1r,4r)-4-甲氧基环己基)甲基)氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环庚基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环庚基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环庚基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环庚基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)环庚基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)甲基)氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)甲基)氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)甲基)氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)甲基)氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)甲基)氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((3-氟二环[1.1.1]戊-1-基)甲基)氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((3-氟二环[1.1.1]戊-1-基)甲基)氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((3-氟二环[1.1.1]戊-1-基)甲基)氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((3-氟二环[1.1.1]戊-1-基)甲基)氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((3-氟二环[1.1.1]戊-1-基)甲基)氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-甲氧基氮杂环丁-1-基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-甲氧基氮杂环丁-1-基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-甲氧基氮杂环丁-1-基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-甲氧基氮杂环丁-1-基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-甲氧基氮杂环丁-1-基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(((3,3-二氟环丁基)甲基)氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(((3,3-二氟环丁基)甲基)氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(((3,3-二氟环丁基)甲基)氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(((3,3-二氟环丁基)甲基)氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(((3,3-二氟环丁基)甲基)氨基)环庚基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(二乙基氨基)-3-甲基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(二乙基氨基)-3-甲基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(二乙基氨基)-3-甲基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(二乙基氨基)-3-甲基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(二乙基氨基)-3-甲基环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-(3-(哒嗪-3-基氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-(3-(哒嗪-3-基氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-(3-(哒嗪-3-基氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-(3-(哒嗪-3-基氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-(3-(哒嗪-3-基氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-异丙氧基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-异丙氧基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-异丙氧基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-异丙氧基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-异丙氧基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-(3-(2,2,2-三氟乙氧基)氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-(3-(2,2,2-三氟乙氧基)氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-(3-(2,2,2-三氟乙氧基)氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-(3-(2,2,2-三氟乙氧基)氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-(3-(2,2,2-三氟乙氧基)氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3,3-二甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3,3-二甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3,3-二甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3,3-二甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3,3-二甲基哌啶-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(3-异丙氧基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(3-异丙氧基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(3-异丙氧基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(3-异丙氧基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(3-异丙氧基氮杂环丁-1-基)环戊基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S,3S,4R)-3-(3-乙氧基氮杂环丁-1-基)二环[2.2.1]庚-2-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S,3R,4R)-3-(3-乙氧基氮杂环丁-1-基)二环[2.2.1]庚-2-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R,3R,4R)-3-(3-乙氧基氮杂环丁-1-基)二环[2.2.1]庚-2-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R,3S,4R)-3-(3-乙氧基氮杂环丁-1-基)二环[2.2.1]庚-2-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,4R)-3-(3-乙氧基氮杂环丁-1-基)二环[2.2.1]庚-2-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S,3S,4S)-3-(3-乙氧基氮杂环丁-1-基)二环[2.2.1]庚-2-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S,3R,4S)-3-(3-乙氧基氮杂环丁-1-基)二环[2.2.1]庚-2-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R,3R,4S)-3-(3-乙氧基氮杂环丁-1-基)二环[2.2.1]庚-2-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R,3S,4S)-3-(3-乙氧基氮杂环丁-1-基)二环[2.2.1]庚-2-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,4S)-3-(3-乙氧基氮杂环丁-1-基)二环[2.2.1]庚-2-基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2S)-2-(3-(吡嗪-2-基氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1S,2R)-2-(3-(吡嗪-2-基氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2R)-2-(3-(吡嗪-2-基氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(((1R,2S)-2-(3-(吡嗪-2-基氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-((2-(3-(吡嗪-2-基氧基)氮杂环丁-1-基)环己基)氧基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-氨基环戊基)氧基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-氨基环戊基)氧基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-氨基环戊基)氧基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-氨基环戊基)氧基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-氨基环戊基)氧基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(二乙基氨基)环戊基)氧基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(二乙基氨基)环戊基)氧基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(二乙基氨基)环戊基)氧基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(二乙基氨基)环戊基)氧基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-(二乙基氨基)环戊基)氧基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-氨基环戊基)氧基)-6-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-氨基环戊基)氧基)-6-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-氨基环戊基)氧基)-6-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-氨基环戊基)氧基)-6-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2-氨基环戊基)氧基)-6-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2S)-2-(二乙基氨基)环戊基)氧基)-6-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1S,2R)-2-(二乙基氨基)环戊基)氧基)-6-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2R)-2-(二乙基氨基)环戊基)氧基)-6-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(((1R,2S)-2-(二乙基氨基)环戊基)氧基)-6-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；以及
3-(5-((2-(二乙基氨基)环戊基)氧基)-6-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮，
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、和互变异构体。
在国际公开号WO 2020/012334中描述了其他IKZF2抑制剂，其通过引用以其全文并入。
在一些实施例中，IKZF2抑制剂包含具有式(I')的化合物，
Figure BDA0003991130860005271
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体，
其中：
X1是CR3；
当X1是CR3并且R3不存在时，
Figure BDA0003991130860005272
任选地是双键；
每个R1独立地是(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)羟烷基、或卤素，或
两个R1与它们所附接的碳原子一起形成5元或6元杂环烷基环，或
当在相邻原子上时，两个R1与它们所附接的原子一起形成(C6-C10)芳基环或包含1至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基环；
R2是(C1-C6)烷基、-C(O)(C1-C6)烷基、-C(O)(CH2)0-3(C6-C10)芳基、-C(O)O(CH2)0-3(C6-C10)芳基、(C6-C10)芳基、包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基、或(C3-C8)环烷基，其中所述烷基任选地被一个或多个R4取代；并且芳基、杂芳基、和环烷基任选地被一个或多个R5取代，或
当在相邻原子上时，R1和R2与它们所附接的原子一起形成5元或6元杂环烷基环；
当
Figure BDA0003991130860005281
是双键时，R3是H或R3不存在；
每个R4独立地选自-C(O)OR6，-C(O)NR6R6'，-NR6C(O)R6'，卤素，-OH，-NH2，CN，(C6-C10)芳基，包含1个至4个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基，(C3-C8)环烷基，和包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基环，其中所述芳基、杂芳基、环烷基、和杂环烷基基团任选地被一个或多个R7取代；
每个R5独立地选自(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)卤代烷基，(C1-C6)卤代烷氧基，(C1-C6)羟烷基，卤素，-OH，-NH2，CN，(C3-C7)环烷基，包含1至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基，(C6-C10)芳基，以及包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基，或
当在相邻原子上时，两个R5与它们所附接的原子一起形成(C6-C10)芳基环或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基环，其任选地被一个或多个R10取代，或
当在相邻原子上时，两个R5与它们所附接的原子一起形成(C5-C7)环烷基环或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基环，其任选地被一个或多个R10取代；
R6和R6'各自独立地是H、(C1-C6)烷基、或(C6-C10)芳基；
每个R7独立地选自(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)卤代烷基，(C1-C6)卤代烷氧基，-C(O)R8，-(CH2)0-3C(O)OR8，-C(O)NR8R9，-NR8C(O)R9，-NR8C(O)OR9，-S(O)pNR8R9，-S(O)pR12，(C1-C6)羟烷基，卤素，-OH，-O(CH2)1-3CN，-NH2，CN，-O(CH2)0-3(C6-C10)芳基，金刚烷基，包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的-O(CH2)0-3-5元或6元杂芳基，(C6-C10)芳基，包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的单环或双环5元至10元杂芳基，(C3-C7)环烷基，以及包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基，其中所述烷基任选地被一个或多个R11取代，并且所述芳基、杂芳基、和杂环烷基任选地被一个或多个各自独立地选自以下的取代基取代：卤素、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、和(C1-C6)烷氧基，或
两个R7与它们所附接的碳原子一起形成a＝(O)，或
当在相邻原子上时，两个R7与它们所附接的原子一起形成(C6-C10)芳基环或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基环，其任选地被一个或多个R10取代，或
两个R7与它们所附接的原子一起形成(C5-C7)环烷基或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基环，其任选地被一个或多个R10取代；
R8和R9各自独立地是H或(C1-C6)烷基；
每个R10独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、(C1-C6)羟烷基、卤素、-OH、-NH2、和CN，或
两个R10与它们所附接的碳原子一起形成a＝(O)；
每个R11独立地选自CN，(C1-C6)烷氧基，(C6-C10)芳基，以及包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基，其中所述芳基和杂环烷基任选地被一个或多个各自独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、(C1-C6)羟烷基、卤素、-OH、-NH2、和CN的取代基取代；
R12是(C1-C6)烷基，(C1-C6)卤代烷基，(C6-C10)芳基，或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基；
Rx是H或D；
p是0、1或2；
n是0、1、或2；
n1是1或2，其中n+n1≤3；以及
q是0、1、2、3或4。
在一些实施例中，所述化合物具有式(I)，
Figure BDA0003991130860005301
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体，
其中：
X1是CR3；
当X1是CR3并且R3不存在时，
Figure BDA0003991130860005302
任选地是双键；
每个R1独立地是(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)羟烷基、或卤素；
R2是(C1-C6)烷基，(C6-C10)芳基，包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基，或(C3-C8)环烷基，其中所述烷基任选地被一个或多个R4取代；并且芳基、杂芳基、和环烷基任选地被一个或多个R5取代；
当
Figure BDA0003991130860005303
是双键时，R3是H或R3不存在；
每个R4独立地选自-C(O)OR6，-C(O)NR6R6'，-NR6C(O)R6'，(C6-C10)芳基，包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基，(C3-C8)环烷基，以及包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基，其中所述芳基、杂芳基、环烷基、和杂环烷基基团任选地被一个或多个R7取代；
每个R5独立地选自(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)卤代烷基，(C1-C6)卤代烷氧基，(C1-C6)羟烷基，卤素，-OH，-NH2，CN，(C3-C7)环烷基，包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基，(C6-C10)芳基，以及包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基，或
当在相邻原子上时，两个R5与它们所附接的原子一起形成(C6-C10)芳基环或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基环，其任选地被一个或多个R10取代，或
当在相邻原子上时，两个R5与它们所附接的原子一起形成(C5-C7)环烷基环或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基环，其任选地被一个或多个R10取代；
R6和R6'各自独立地是H或(C1-C6)烷基；
每个R7独立地选自(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)卤代烷基，(C1-C6)卤代烷氧基，-C(O)R8，-C(O)OR8，-C(O)NR8R9，-NR8C(O)R9，(C1-C6)羟烷基，卤素，-OH，-NH2，CN，(C6-C10)芳基，包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基，(C3-C7)环烷基，以及包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基，或
当在相邻原子上时，两个R7与它们所附接的原子一起形成(C6-C10)芳基环或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基环，其任选地被一个或多个R10取代，或
当在相邻原子上时，两个R7与它们所附接的原子一起形成(C5-C7)环烷基环或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基环，其任选地被一个或多个R10取代；
R8和R9各自独立地是H或(C1-C6)烷基；
每个R10独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、(C1-C6)羟烷基、卤素、-OH、-NH2、和CN；
Rx是H或D；
n是1或2；以及
q是0、1、2、3或4。
在一些实施例中，n是1。在一些实施例中，n是2。在一些实施例中，q是0、1或2。在一些实施例中，X1是CH。在一些实施例中，Rx是H。在一些实施例中，R2是(C6-C10)芳基或(C3-C8)环烷基，其中所述芳基、杂芳基、和环烷基任选地被一个至三个R5取代。在一些实施例中，R2是(C6-C10)芳基或(C3-C8)环烷基。在一些实施例中，R2是任选地被一个至三个R4取代的(C1-C6)烷基。
在一些实施例中，该化合物具有式(Ia)、式(Ib)、式(Ic)、或式(Id)：
Figure BDA0003991130860005321
在一些实施例中，R2是(C6-C10)芳基或(C3-C8)环烷基，其中所述芳基和环烷基任选地被一个至三个R5取代。在一些实施例中，R2是(C6-C10)芳基或(C3-C8)环烷基。在一些实施例中，R2是任选地被一个至三个R4取代的(C1-C6)烷基。
在一些实施例中，所述化合物选自：
3-(5-(1-乙基哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-丙基哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(环丙基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-异丁基哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(环丁基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(噁唑-2-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(噻唑-2-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(环戊基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((5-氯噻吩-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((2-氯噻唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(环己基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-苯乙基哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-氯苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2-氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2-氯苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(2-(哌啶-1-基)乙基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((3,5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1,3-二甲基-1H-吡唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((6-甲基吡啶-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-吗啉代丙基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,6-二氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,6-二氯苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3,5-二氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3,5-二溴苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-氯-5-氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,5-二氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,5-二氯苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
4-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苄腈；
3-(5-(1-(4-(羟甲基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3,4-二氯苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-氯-2-氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2-氯-4-氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苄腈；
3-(5-(1-(2,3-二氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
2-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苄腈；
3-(5-(1-(4-甲氧基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,5-二甲基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3,4-二甲基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,4-二甲基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1H-吲唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1H-苯并[d]咪唑-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-异丙基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
5-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)呋喃-2-甲酸甲酯；
3-(5-(1-(萘-2-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(喹啉-2-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(萘-1-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(4-(三氟甲氧基)苄基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(1H-吡咯-1-基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(1H-1,2,4-三唑-1-基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(3-(三氟甲氧基)苄基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(2-(三氟甲氧基)苄基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-苄基哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(吡啶-2-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(吡啶-3-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(吡啶-4-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(嘧啶-5-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(1-苯乙基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(氟甲基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3,4-二氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
2-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)嘧啶-5-甲腈；
3-(5-(1-(4-乙基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2-甲氧基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((2-甲氧基嘧啶-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-氟-4-甲基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(二氟甲基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
4-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苯甲酰胺；
4-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苯甲酸；
3-(5-(1-(3-(二氟甲基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苯甲酸；
3-(1-氧代-5-(1-(4-丙基苄基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(4-(三氟甲基)苄基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(二氟甲氧基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-(二氟甲氧基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2-(二氟甲氧基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-环丁基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-6-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(叔丁基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-异丁基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
N-(4-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苯基)乙酰胺；
3-(5-(1-((2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]二氧杂环庚烯-7-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(4-(叔戊基)苄基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-([1,1'-联苯基]-4-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(1H-吡唑-1-基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(1H-咪唑-1-基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-(1H-吡唑-1-基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-环己基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(嘧啶-2-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-溴苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-氯苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3,5-二氯苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮
3-(5-(1-(4-氯-3-氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-氯-4-氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,4-二氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-甲氧基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(苯并[c][1,2,5]噁二唑-5-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2-环丙基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(2-(三氟甲基)苄基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-异丙氧基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(4-(噻吩-3-基)苄基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-环戊基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(4-(吡咯烷-1-基)苄基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,4-二氯苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(喹啉-8-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1-甲基-1H-吡唑-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1H-吡唑-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1H-吡咯-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1H-咪唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1-乙基-1H-吡唑-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((2-氨基嘧啶-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((6-氨基吡啶-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((5-氨基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((6-甲基咪唑并[2,1-b]噻唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-5-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(吡唑并[1,5-a]吡啶-4-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1,4-二甲基-1H-咪唑-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(苯并[d]噻唑-5-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-6-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(咪唑并[1,2-a]嘧啶-3-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(咪唑并[1,2-a]嘧啶-2-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1-环丁基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1H-吲哚-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1H-吲唑-6-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苯甲酰胺；
3-(5-(1-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-6-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]噻嗪-6-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((2-(吡咯烷-1-基)嘧啶-5-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((2-(叔丁基)噻唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((2-(噻吩-2-基)噻唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((5-环丙基-1H-吡唑-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((2-吗啉代嘧啶-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((3-苯基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((6-甲基-1H-吲哚-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
4-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯；
3-(1-氧代-5-(1-((3-(吡啶-3-基)-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((5-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3,5-二氟-4-羟基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2-甲基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-甲基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3,5-二甲基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2S)-1-苄基-2-甲基哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2R)-1-苄基-2-甲基哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-苄基-2-甲基哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-甲基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((5,6,7,8-四氢萘-1-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((R)-氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((S)-氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((1,2,3,4-四氢萘-1-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
2-(4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)乙酸甲酯；
3-(1-氧代-5-(1-苯基哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-甲基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,6-二甲基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((5,6,7,8-四氢萘-2-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
2-(4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)乙酸乙酯；
2-(4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)乙酸叔丁酯；
2-(4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)乙酸；
3-(1-氧代-5-(1-(3,3,3-三氟丙基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
2-(4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)-N-苯乙酰胺；
3-(5-(1-(3-氟丙基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
4-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苯甲酸叔丁酯；
3-(5-(1-苄基-3,3-二甲基哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-苄基-3-二甲基哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2-羟基-1-苯乙基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((S)-1-苄基氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-苄基-2,5-二氢-1H-吡咯-3-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-苄基-2-氧代哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-苄基-1,2,3,4-四氢喹啉-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1-苄基-1H-四唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((5-苯基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(苯并[d]噻唑-2-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((R)-2-羟基-1-苯乙基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1-甲基-1H-吲唑-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1,2,4-噁二唑-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-羟基-3-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
2-(4-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苯基)乙腈；
3-(5-(1-((7-羟基-2-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,2-二氟-1-苯乙基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((3-氟双环[1.1.1]戊烷-1-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2-氟-1-苯乙基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((4-氧代-3,4-二氢噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(喹啉-4-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3,5-双(三氟甲基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
6-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)氰基吡啶；
2-(4-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苯氧基)乙腈；
3-(5-(1-((1H-吲唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((7-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-甲酸苄酯；
3-(1-氧代-5-(1-(2-苯乙酰基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(2,2,2-三氟-1-苯乙基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(5-甲基苯并[d]噻唑-2-基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(异喹啉-1-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(4-甲氧基哌啶-1-基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(异丙硫基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((S)-1-苯乙基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
2-(4-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苯基)乙酸；
3-(5-(1-((7-氟喹啉-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((2-氨基-4-(三氟甲基)噻唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)-1,2,4-噁二唑-5-甲酰胺；
3-(5-(1-(3-(吗啉代磺酰基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
4-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)-N,N-二甲基苯磺酰胺；
3-(1-氧代-5-(1-(噻唑-4-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(喹喔啉-6-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(叔丁基)苯甲酰基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-((4-氟苄基)氧基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((3-甲基异噁唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(异噁唑-3-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((R)-1-苯乙基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(甲氧基甲基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((S)-2-羟基-1-苯乙基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(苯磺酰基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((5-甲基-3-苯基异噁唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-((二氟甲基)磺酰基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
2-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)噁唑-4-甲酸甲酯；
3-(1-氧代-5-(1-(4-(吡啶-2-基甲氧基)苄基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-乙酰基哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-5基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-苄基吡咯烷-3-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
(R)-3-(5-((R)-1-苄基氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
(S)-3-(5-((S)-1-苄基氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-苄基氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-甲基-2,3,6,7-四氢-1H-氮杂卓-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(8-苄基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-乙酰基-1,2,5,6-四氢吡啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
(R)-3-(5-((R)-1-乙酰基吡咯烷-3-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-乙酰基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(八氢中氮茚-7-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
(R)-3-(5-((S)-1-苄基氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((R)-1-苄基氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-乙酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-3-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-甲基环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
(S)-3-(5-((R)-1-苄基氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
(S)-3-(5-((R)-1-乙酰基吡咯烷-3-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((6-异丙氧基吡啶-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((1-苯基-1H-吡唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-乙氧基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((1-苯基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1-异丙基-1H-吡唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(异噻唑-5-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1H-吡唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((5-异丙氧基吡啶-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((1-(吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((1-(吡啶-3-基)-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
5-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)-2-氟苄腈；
3-(5-(1-((5-氟吡啶-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1-乙基-3-(吡啶-3-基)-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
反式-3-(1-氧代-5-(1-((4-(三氟甲基)环己基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
顺式-3-(1-氧代-5-(1-((4-(三氟甲基)环己基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
反式-3-(5-(1-((4-甲氧基环己基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；以及
3-(5-(1-((6-甲氧基吡啶-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体。
在美国专利号10,414,755中描述了其他IKZF2抑制剂，其通过引用以其全文并入。
在一些实施例中，IKZF2抑制剂包含具有式(Ic)的化合物：
Figure BDA0003991130860005511
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体，
其中：
每个R1独立地是(C1-C6)烷基；
R2是被一个至三个R4取代的(C1-C6)烷基；
每个R4独立地选自(C6-C10)芳基和(C3-C8)环烷基，其中所述芳基和环烷基基团任选地被一个或多个R7取代；
每个R7独立地选自(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)卤代烷基，(C1-C6)卤代烷氧基，-C(O)R8，-C(O)OR8，-C(O)NR8R9，-NR8C(O)R9，(C1-C6)羟烷基，卤素，-OH，-NH2，CN，(C6-C10)芳基，包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基，(C3-C7)环烷基，以及包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基，或
当在相邻原子上时，两个R7与它们所附接的原子一起形成(C6-C10)芳基环或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基环，其任选地被一个或多个R10取代，或
当在相邻原子上时，两个R7与它们所附接的原子一起形成(C5-C7)环烷基环或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基环，其任选地被一个或多个R10取代；
R8和R9各自独立地是H或(C1-C6)烷基；
每个R10独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、(C1-C6)羟烷基、卤素、-OH、-NH2、和CN；以及q是0。
在一些实施例中，R4是任选地被一个至三个R7取代的苯基或(C3-C8)环烷基。在一些实施例中，R4是任选地被一个至三个R7取代的苯基。在一些实施例中，R4是任选地被一个至三个R7取代的(C3-C8)环烷基。
在一些实施例中，IKZF2抑制剂包含选自以下的化合物：
Figure BDA0003991130860005521
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体。
在一些实施例中，该化合物是化合物(I-156)：
Figure BDA0003991130860005531
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体。
在一些实施例中，该化合物是化合物(I-57)：
Figure BDA0003991130860005532
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体。
在一些实施例中，该化合物是化合物(I-87)：
Figure BDA0003991130860005533
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体。
在一些实施例中，该化合物是化合物(I-88)：
Figure BDA0003991130860005541
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体。
在一些实施例中，该化合物是化合物(I-112)：
Figure BDA0003991130860005542
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体。
在一些实施例中，该化合物是化合物(I-303)：
Figure BDA0003991130860005543
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体。
在一些实施例中，该化合物是化合物(I-11)：
Figure BDA0003991130860005551
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体。
在一些实施例中，IKZF2抑制剂包含具有式(Ic)的化合物：
Figure BDA0003991130860005552
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体，
其中：
每个R1独立地是(C1-C6)烷基；
R2是被一个至三个R4取代的(C1-C6)烷基；
每个R4独立地选自苯基或包含选自O、N、和S的1个至4个杂原子的5元或6元杂芳基，其中所述苯基和杂芳基基团任选地被一个至三个R7取代；
每个R7独立地选自(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)卤代烷基，(C1-C6)卤代烷氧基，-C(O)R8，-C(O)OR8，-C(O)NR8R9，-NR8C(O)R9，(C1-C6)羟烷基，卤素，-OH，-NH2，CN，(C6-C10)芳基，包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基，(C3-C7)环烷基，以及包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基，或
当在相邻原子上时，两个R7与它们所附接的原子一起形成(C6-C10)芳基环或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基环，其任选地被一个或多个R10取代，或
当在相邻原子上时，两个R7与它们所附接的原子一起形成(C5-C7)环烷基环或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基环，其任选地被一个或多个R10取代；
R8和R9各自独立地是H或(C1-C6)烷基；
每个R10独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、(C1-C6)羟烷基、卤素、-OH、-NH2、和CN；以及q是0。
在一些实施例中，R4是被一个至三个R7取代的苯基。在一些实施例中，R4是包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元杂芳基，其任选地被一个至三个R7取代。在一些实施例中，R4是包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的6元杂芳基，其任选地被一个至三个R7取代。
在一些实施例中，所述化合物选自：
Figure BDA0003991130860005561
Figure BDA0003991130860005571
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体。
在一些实施例中，IKZF2抑制剂包含具有式(I')的化合物：
Figure BDA0003991130860005572
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体，
其中：
X1是CR3；
当X1是CR3并且R3不存在时，
Figure BDA0003991130860005573
任选地是双键；
每个R1独立地是(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)羟烷基、或卤素，或
两个R1与它们所附接的碳原子一起形成5元或6元杂环烷基环，或当在相邻原子上时，两个R1与它们所附接的原子一起形成(C6-C10)芳基环或包含1至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基环；
R2是(C1-C6)烷基，-C(O)(C1-C6)烷基，-C(O)(CH2)0-3(C6-C10)芳基，-C(O)O(CH2)0-3(C6-C10)芳基，(C6-C10)芳基，包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基，(C3-C8)环烷基，或包含1个至3个选自O、N和S的杂原子的5元至7元杂环烷基，其中所述烷基任选地被一个或多个R4取代；并且所述芳基、杂芳基、环烷基、和杂环烷基任选地被一个或多个R5取代，或
当在相邻原子上时，R1和R2与它们所附接的原子一起形成5元或6元杂环烷基环；
当
Figure BDA0003991130860005581
是双键时，R3是H或R3不存在；
每个R4独立地选自-C(O)OR6，-C(O)NR6R6'，-NR6C(O)R6'，卤素，-OH，-NH2，CN，(C6-C10)芳基，包含1个至4个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基，(C3-C8)环烷基，和包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基环，其中所述芳基、杂芳基、环烷基、和杂环烷基基团任选地被一个或多个R7取代；
每个R5独立地选自(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)卤代烷基，(C1-C6)卤代烷氧基，(C1-C6)羟烷基，卤素，-OH，-NH2，CN，(C3-C7)环烷基，包含1至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基，(C6-C10)芳基，以及包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基，或
当在相邻原子上时，两个R5与它们所附接的原子一起形成(C6-C10)芳基环或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基环，其任选地被一个或多个R10取代，或
当在相邻原子上时，两个R5与它们所附接的原子一起形成(C5-C7)环烷基环或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基环，其任选地被一个或多个R10取代；
R6和R6'各自独立地是H、(C1-C6)烷基、或(C6-C10)芳基；
每个R7独立地选自(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)卤代烷基，(C1-C6)卤代烷氧基，-C(O)R8，-(CH2)0-3C(O)OR8，-C(O)NR8R9，-NR8C(O)R9，-NR8C(O)OR9，-S(O)pNR8R9，-S(O)pR12，(C1-C6)羟烷基，卤素，-OH，-O(CH2)1-3CN，-NH2，CN，-O(CH2)0-3(C6-C10)芳基，金刚烷基，包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的-O(CH2)0-3-5元或6元杂芳基，(C6-C10)芳基，包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的单环或双环5元至10元杂芳基，(C3-C7)环烷基，以及包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基，其中所述烷基任选地被一个或多个R11取代，并且所述芳基、杂芳基、和杂环烷基任选地被一个或多个各自独立地选自以下的取代基取代：卤素、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、和(C1-C6)烷氧基，或
两个R7与它们所附接的碳原子一起形成a＝(O)，或
当在相邻原子上时，两个R7与它们所附接的原子一起形成(C6-C10)芳基环或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基环，其任选地被一个或多个R10取代，或
两个R7与它们所附接的原子一起形成(C5-C7)环烷基或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基环，其任选地被一个或多个R10取代；
R8和R9各自独立地是H或(C1-C6)烷基；
每个R10独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、(C1-C6)羟烷基、卤素、-OH、-NH2、和CN，或
两个R10与它们所附接的碳原子一起形成a＝(O)；
每个R11独立地选自CN，(C1-C6)烷氧基，(C6-C10)芳基，以及包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基，其中所述芳基和杂环烷基任选地被一个或多个各自独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、(C1-C6)羟烷基、卤素、-OH、-NH2、和CN的取代基取代；
R12是(C1-C6)烷基，(C1-C6)卤代烷基，(C6-C10)芳基，或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基；
Rx是H或D；
p是0、1或2；
n是0、1、或2；
n1是1或2，其中n+n1≤3；以及
q是0、1、2、3或4。
在一些实施例中，所述化合物具有式(I)：
Figure BDA0003991130860005601
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体，
其中：
X1是CR3；
当X1是CR3并且R3不存在时，
Figure BDA0003991130860005602
任选地是双键；
每个R1独立地是(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)羟烷基、或卤素；
R2是(C1-C6)烷基、(C6-C10)芳基、包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基、(C3-C8)环烷基、或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基，其中所述烷基任选地被一个或多个R4取代；并且所述芳基、杂芳基、环烷基、和杂环烷基任选地被一个或多个R5取代；
当
Figure BDA0003991130860005603
是双键时，R3是H或R3不存在；
每个R4独立地选自-C(O)OR6，-C(O)NR6R6'，-NR6C(O)R6'，(C6-C10)芳基，包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基，(C3-C8)环烷基，以及包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基，其中所述芳基、杂芳基、环烷基、和杂环烷基基团任选地被一个或多个R7取代；
每个R5独立地选自(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)卤代烷基，(C1-C6)卤代烷氧基，(C1-C6)羟烷基，卤素，-OH，-NH2，CN，(C3-C7)环烷基，包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基，(C6-C10)芳基，以及包含1个至3个选自O、N和S的杂原子的5元或6元杂芳基，或
当在相邻原子上时，两个R5与它们所附接的原子一起形成(C6-C10)芳基环或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基环，其任选地被一个或多个R10取代，或
当在相邻原子上时，两个R5与它们所附接的原子一起形成(C5-C7)环烷基环或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基环，其任选地被一个或多个R10取代；
R6和R6'各自独立地是H或(C1-C6)烷基；
每个R7独立地选自(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)卤代烷基，(C1-C6)卤代烷氧基，-C(O)R8，-C(O)OR8，-C(O)NR8R9，-NR8C(O)R9，(C1-C6)羟烷基，卤素，-OH，-NH2，CN，(C6-C10)芳基，包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基，(C3-C7)环烷基，以及包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基，或
当在相邻原子上时，两个R7与它们所附接的原子一起形成(C6-C10)芳基环或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元或6元杂芳基环，其任选地被一个或多个R10取代，或
当在相邻原子上时，两个R7与它们所附接的原子一起形成(C5-C7)环烷基环或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基环，其任选地被一个或多个R10取代；
R8和R9各自独立地是H或(C1-C6)烷基；
每个R10独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、(C1-C6)羟烷基、卤素、-OH、-NH2、和CN；
Rx是H或D；
n是1或2；以及
q是0、1、2、3或4。
在一些实施例中，n是1。在一些实施例中，n是2。在一些实施例中，q是0、1或2。在一些实施例中，X1是CH。在一些实施例中，Rx是H。
在一些实施例中，R2是(C6-C10)芳基，(C3-C8)环烷基，或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基，其中所述芳基、杂芳基、环烷基、和杂环烷基任选地被一个至三个R5取代。在一些实施例中，R2是(C6-C10)芳基，(C3-C8)环烷基，或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基。在一些实施例中，R2是任选地被一个至三个R4取代的(C1-C6)烷基。
在一些实施例中，该化合物具有式(Ia)、式(Ib)、式(Ic)、或式(Id)：
Figure BDA0003991130860005621
在一些实施例中，R2是(C6-C10)芳基，(C3-C8)环烷基，或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基，其中所述芳基、杂芳基、环烷基、和杂环烷基任选地被一个至三个R5取代。在一些实施例中，R2是(C6-C10)芳基，(C3-C8)环烷基，或包含1个至3个选自O、N、和S的杂原子的5元至7元杂环烷基。在一些实施例中，R2是任选地被一个至三个R4取代的(C1-C6)烷基。
在一些实施例中，所述化合物选自：
3-(5-(1-乙基哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-丙基哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(环丙基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-异丁基哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(环丁基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(噁唑-2-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(噻唑-2-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(环戊基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((5-氯噻吩-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((2-氯噻唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(环己基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-苯乙基哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-氯苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2-氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2-氯苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(2-(哌啶-1-基)乙基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((3,5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1,3-二甲基-1H-吡唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((6-甲基吡啶-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-吗啉代丙基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,6-二氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,6-二氯苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3,5-二氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3,5-二溴苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-氯-5-氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,5-二氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,5-二氯苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
4-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苄腈；
3-(5-(1-(4-(羟甲基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3,4-二氯苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-氯-2-氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2-氯-4-氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苄腈；
3-(5-(1-(2,3-二氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
2-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苄腈；
3-(5-(1-(4-甲氧基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,5-二甲基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3,4-二甲基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,4-二甲基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1H-吲唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1H-苯并[d]咪唑-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-异丙基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
5-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)呋喃-2-甲酸甲酯；
3-(5-(1-(萘-2-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(喹啉-2-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(萘-1-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(4-(三氟甲氧基)苄基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(1H-吡咯-1-基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(1H-1,2,4-三唑-1-基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(3-(三氟甲氧基)苄基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(2-(三氟甲氧基)苄基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-苄基哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(吡啶-2-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(吡啶-3-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(吡啶-4-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(嘧啶-5-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(1-苯乙基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(氟甲基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3,4-二氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
2-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)嘧啶-5-甲腈；
3-(5-(1-(4-乙基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2-甲氧基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((2-甲氧基嘧啶-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-氟-4-甲基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(二氟甲基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
4-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苯甲酰胺；
4-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苯甲酸；
3-(5-(1-(3-(二氟甲基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苯甲酸；
3-(1-氧代-5-(1-(4-丙基苄基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(4-(三氟甲基)苄基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(二氟甲氧基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-(二氟甲氧基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2-(二氟甲氧基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-环丁基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-6-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(叔丁基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-异丁基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
N-(4-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苯基)乙酰胺；
3-(5-(1-((2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]二氧杂环庚烯-7-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(4-(叔戊基)苄基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-([1,1'-联苯基]-4-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(1H-吡唑-1-基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(1H-咪唑-1-基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-(1H-吡唑-1-基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-环己基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(嘧啶-2-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-溴苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-氯苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3,5-二氯苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮
3-(5-(1-(4-氯-3-氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-氯-4-氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,4-二氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-甲氧基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(苯并[c][1,2,5]噁二唑-5-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2-环丙基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(2-(三氟甲基)苄基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-异丙氧基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(4-(噻吩-3-基)苄基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-环戊基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(4-(吡咯烷-1-基)苄基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-氟苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,4-二氯苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(喹啉-8-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1-甲基-1H-吡唑-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1H-吡唑-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1H-吡咯-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1H-咪唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1-乙基-1H-吡唑-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((2-氨基嘧啶-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((6-氨基吡啶-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((5-氨基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((6-甲基咪唑并[2,1-b]噻唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-5-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(吡唑并[1,5-a]吡啶-4-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1,4-二甲基-1H-咪唑-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(苯并[d]噻唑-5-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-6-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(咪唑并[1,2-a]嘧啶-3-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(咪唑并[1,2-a]嘧啶-2-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1-环丁基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1H-吲哚-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1H-吲唑-6-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苯甲酰胺；
3-(5-(1-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-6-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]噻嗪-6-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((2-(吡咯烷-1-基)嘧啶-5-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((2-(叔丁基)噻唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((2-(噻吩-2-基)噻唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((5-环丙基-1H-吡唑-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((2-吗啉代嘧啶-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((3-苯基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((6-甲基-1H-吲哚-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
4-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯；
3-(1-氧代-5-(1-((3-(吡啶-3-基)-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((5-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3,5-二氟-4-羟基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2-甲基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-甲基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3,5-二甲基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2S)-1-苄基-2-甲基哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((2R)-1-苄基-2-甲基哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-苄基-2-甲基哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-甲基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((5,6,7,8-四氢萘-1-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((R)-氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((S)-氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((1,2,3,4-四氢萘-1-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
2-(4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)乙酸甲酯；
3-(1-氧代-5-(1-苯基哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3-甲基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,6-二甲基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((5,6,7,8-四氢萘-2-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
2-(4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)乙酸乙酯；
2-(4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)乙酸叔丁酯；
2-(4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)乙酸；
3-(1-氧代-5-(1-(3,3,3-三氟丙基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
2-(4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)-N-苯乙酰胺；
3-(5-(1-(3-氟丙基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
4-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苯甲酸叔丁酯；
3-(5-(1-苄基-3,3-二甲基哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-苄基-3-二甲基哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2-羟基-1-苯乙基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((S)-1-苄基氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-苄基-2,5-二氢-1H-吡咯-3-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-苄基-2-氧代哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-苄基-1,2,3,4-四氢喹啉-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1-苄基-1H-四唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((5-苯基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(苯并[d]噻唑-2-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((R)-2-羟基-1-苯乙基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1-甲基-1H-吲唑-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1,2,4-噁二唑-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-羟基-3-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
2-(4-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苯基)乙腈；
3-(5-(1-((7-羟基-2-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,2-二氟-1-苯乙基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((3-氟双环[1.1.1]戊烷-1-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2-氟-1-苯乙基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((4-氧代-3,4-二氢噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(喹啉-4-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(3,5-双(三氟甲基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
6-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)氰基吡啶；
2-(4-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苯氧基)乙腈；
3-(5-(1-((1H-吲唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((7-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-甲酸苄酯；
3-(1-氧代-5-(1-(2-苯乙酰基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(2,2,2-三氟-1-苯乙基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(5-甲基苯并[d]噻唑-2-基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(异喹啉-1-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(4-甲氧基哌啶-1-基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(异丙硫基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((S)-1-苯乙基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
2-(4-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)苯基)乙酸；
3-(5-(1-((7-氟喹啉-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((2-氨基-4-(三氟甲基)噻唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)-1,2,4-噁二唑-5-甲酰胺；
3-(5-(1-(3-(吗啉代磺酰基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
4-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)-N,N-二甲基苯磺酰胺；
3-(1-氧代-5-(1-(噻唑-4-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(喹喔啉-6-基甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(叔丁基)苯甲酰基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-((4-氟苄基)氧基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((3-甲基异噁唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(异噁唑-3-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((R)-1-苯乙基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-(甲氧基甲基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((S)-2-羟基-1-苯乙基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(苯磺酰基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((5-甲基-3-苯基异噁唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-((二氟甲基)磺酰基)苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
2-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)噁唑-4-甲酸甲酯；
3-(1-氧代-5-(1-(4-(吡啶-2-基甲氧基)苄基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-乙酰基哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-5基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-苄基吡咯烷-3-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
(R)-3-(5-((R)-1-苄基氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
(S)-3-(5-((S)-1-苄基氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-苄基氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-甲基-2,3,6,7-四氢-1H-氮杂卓-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(8-苄基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-乙酰基-1,2,5,6-四氢吡啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
(R)-3-(5-((R)-1-乙酰基吡咯烷-3-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-乙酰基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(八氢中氮茚-7-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
(R)-3-(5-((S)-1-苄基氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-((R)-1-苄基氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-乙酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-3-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-甲基环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
(S)-3-(5-((R)-1-苄基氮杂环庚烷-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
(S)-3-(5-((R)-1-乙酰基吡咯烷-3-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((6-异丙氧基吡啶-3-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((1-苯基-1H-吡唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(4-乙氧基苄基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((1-苯基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1-异丙基-1H-吡唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-(异噻唑-5-基甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1H-吡唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((5-异丙氧基吡啶-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((1-(吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(1-氧代-5-(1-((1-(吡啶-3-基)-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
5-((4-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)哌啶-1-基)甲基)-2-氟苄腈；
3-(5-(1-((5-氟吡啶-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
3-(5-(1-((1-乙基-3-(吡啶-3-基)-1H-吡唑-4-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
反式-3-(1-氧代-5-(1-((4-(三氟甲基)环己基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
顺式-3-(1-氧代-5-(1-((4-(三氟甲基)环己基)甲基)哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
反式-3-(5-(1-((4-甲氧基环己基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；以及
3-(5-(1-((6-甲氧基吡啶-2-基)甲基)哌啶-4-基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮；
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、或互变异构体。
另外的示例性IKZF2抑制剂还描述于美国专利号10,414,755和10,640,489、美国申请公开号US 2019/0367483和US 2019/0359594、以及国际公开号WO 2020/012334和WO2019/038717中，将其通过引用以其全文并入。
在一些实施例中，将ZBTB32抑制剂和IKZF2抑制剂组合使用以治疗非小细胞肺癌(NSCLC)、黑素瘤、三阴性乳腺癌(TNBC)、鼻咽癌(NPC)、微卫星稳定结直肠癌(mssCRC)、胸腺瘤、类癌、或胃肠道间质瘤(GIST)。
实例
通过参考以下实验实例进一步详细描述本披露。提供这些实例仅用于说明的目的，除非另有说明，否则不应旨在是限制性的。因此，本披露决不应被解释为限于以下实例，而是应该被解释为涵盖由于本文提供的传授内容而变得明显的任何和所有变化。
无需进一步描述，相信本领域普通技术人员可以使用前述说明和以下说明性实例制备和利用本披露的组合物并实践所要求保护的方法。以下工作实例具体指出了本披露的不同实施例，并且不应被解释为以任何方式限制本披露的其余部分。
实例1：ZBTB32在癌细胞系中的表达
本实例描述ZBTB32在癌细胞系中的表达。
多种癌细胞系中的ZBTB32基因表达数据获得自癌细胞系百科全书(CCLE)数据库(Ghandi,M等人Nature[自然],2019,569:503-508)。图1显示了来自RNAseq分析的特定细胞系中的ZBTB32表达。如图1和表27所示，高水平表达ZBTB32的细胞主要来自造血和淋巴组织，并且存在于淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病谱系中。
表27.以高于每百万5个转录本(TPM)的水平表达ZBTB32的细胞系列表。
Figure BDA0003991130860005821
Figure BDA0003991130860005831
Figure BDA0003991130860005841
已经表明，与其他DLBCL类型相比，ZBTB32是活化的B细胞亚型的DLBCL(ABC-DLBCL)患者中最一致和差异表达的基因中的一种(Care等人PLoS One.[公共科学图书馆·综合]2013；8(2):e55895)。相应地，RNA测序分析显示ABC-DLBCL中的ZBTB32表达水平比生发中心B细胞DLBCL(GCB-DLBCL)细胞系高得多(表28)。
表28.ZBTB32在ABC型和GCB型DLBCL细胞系中的表达。CPM：每百万次读取计数
Figure BDA0003991130860005851
实例2：使用ZBTB32敲除增强CART活性
该实例描述了当ZBTB32在CART细胞中被敲除时，体内增强的CART细胞扩增、细胞因子产生、持久性、耗竭抗性和抗肿瘤活性。
材料与方法
CART产生
在第0天，将先前从新鲜血液中分离出来的冷冻T细胞解冻并用CD3/CD28珠子(赛默飞世尔公司(Thermofisher))以1:3的细胞与珠子比率活化。第二天，将10x106个细胞接种在5mL的T细胞培养基中的6孔板中，该培养基不含抗生素，并滴加GFP(缺少CAR编码序列)或CAR19-GFP病毒(MOI＝1)。第3天，如下进行CRISPR-Cas9电穿孔以敲除CAR19-GFP转导细胞中的ZBTB32。将trRNA和gRNA在不同的试管中加热至98℃持续2分钟，使RNA二级结构变性，然后逐渐将温度降低至38℃进行退火。在单独的管中，通过按顺序添加Cas9缓冲液、Cas9蛋白、trRNA和gRNA并在每次添加后混合均匀来创建RNP混合物。Cas9:tracerRNA:gRNA的最终比率为1:2:2。制备细胞时，将样品在37℃孵育10分钟。收集T细胞，旋转沉降，用温热的OPTI-MEM洗涤，旋转沉降，并以20x106个细胞/ml重悬于T缓冲液(Neon转染系统)中。将100uL的T细胞与50uL的RNP混合物混合，并在室温下孵育5分钟。使用Neon机器，使用1600V、10ms、3个脉冲的设置对细胞进行电穿孔，并转移到具有完全T细胞培养基的6孔板中。ZBTB32gRNA6序列：CCAGCCGATCAGAGCCATAG(SEQ ID NO:3004)。ZBTB32 gRNA7序列：GCTCTGGAGCCAGAACCAGT(SEQ ID NO:3005)。从第4天开始，通过每隔一天添加新鲜培养基来扩增细胞。当细胞大小达到400fm时，使用CS10冷冻培养基冻结细胞。
下一代测序(NGS)和T7核酸内切酶I(T7E1)测定
在冻结之前收获细胞，并使用PureLink基因组DNA迷你试剂盒(英杰公司)分离基因组DNA。通过使用Q5高保真主混合物(NEB)的PCR扩增编辑位点周围的DNA片段。ZBTB32gRNA6 NGS F：5’-CCACAGGCTTGAAATGAGATG-3’(SEQ ID NO:3006)，ZBTB32gRNA6 NGS R：5’-CATACACAAAGTTCAGGAGC-3’(SEQ ID NO:3007)，ZBTB32 gRNA7 NGS F：5’-GACAAGAAGCTGCTGCCACA-3’(SEQ ID NO:3008)，ZBTB32 gRNA7 NGS R：5’-GGAACCTGGAAGGAACAGTG-3’(SEQ ID NO:3009)。使用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化PCR产物并提交用于NGS。为了进行T7E1测定，通过使用Q5高保真主混合物(NEB)的PCR扩增编辑位点周围的DNA片段。ZBTB32 gRNA6 T7 F：5’-ATTTCCATTCTCTCGCCACC-3’(SEQ ID NO:3010)，ZBTB32 gRNA6 T7 R：5’-CTGGGCAAAGGTAGAAGGGC-3’(SEQ ID NO:3011)，ZBTB32 gRNA7T7F：5’-GGTCTAGTGCTCTGCCTCCA-3’(SEQ ID NO:3012)，ZBTB32gRNA7 T7 R：5’-GCGCCAACTCACTGTACCATT-3’(SEQ ID NO:3013)。纯化PCR产物并使用10X NEBuffer2对200ng纯化的DNA进行变性和缓慢退火。将T7核酸内切酶I(NEB)添加到退火的PCR产物中，在37℃下孵育15分钟。对于未切割的对照，不添加T7E1酶。用切割和未切割的样品运行电泳凝胶以确定是否发生编辑。
抗原依赖性增殖测定
将TMD8细胞以10,000rad照射，并将50,000个经照射的细胞接种在96孔板中的100ul的T细胞培养基中。解冻GFP(非CAR)T细胞或CART细胞，针对不同的效应细胞与靶细胞(E:T)比率(10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.625:1和0.3125:1)连续稀释，并将其接种在受照射的TMD8细胞上的100ul的T细胞培养基中。将细胞孵育3天和5天，并使用活/死细胞、CD3、CD4、CD8和GFP染色通过流式细胞术进行分析。将GFP％用于确定抗原依赖性增殖动力学。
抗原依赖性杀伤测定
将TMD8-荧光素酶细胞接种在96孔板(25,000/孔)中的100ul的T细胞培养基中。解冻CART细胞，针对不同的E:T比率(10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.625:1和0.3125:1)连续稀释，并将其接种在TMD8-荧光素酶细胞上的100ul的T细胞培养基中。将细胞孵育48和72小时。在每个时间点，根据制造商的说明收集100ul培养基用于MSD，并添加100ul的BrightGlo试剂(普洛麦格公司(Promega))并在读取发光之前在室温下孵育10分钟。将单独的TMD8-荧光素酶细胞用作0％杀伤对照。
使用TMD8模型的体内功效研究
将TMD8细胞在室内解冻并按指数培养，并在第0天收集用于植入。在收获时，将细胞洗涤并重新悬浮在1:1比率的PBS(不含CaCl2或MgCl2)和基质胶中至浓度为5x106个细胞/100μl用于植入。将细胞皮下植入免疫功能受损的NSG小鼠(杰克逊实验室(JacksonLaboratory))的右侧肋腹部。在植入时也记录了基线体重。在第9天，根据肿瘤体积对肿瘤进行测径和随机化。平均肿瘤体积为178.3mm3。在第10天进行CART输注。将GFP wt(非CAR)T细胞和CART细胞解冻并在RPMI1640+10％热灭活胎牛血清(FBS)中洗涤。将细胞在Cellometer Vision(Nexcelcom公司)上计数，并在重新悬浮于PBS中进行注射之前再次洗涤。每个样品的GFP阳性百分比，将细胞重新悬浮至终浓度为1x106个CAR+细胞/100μl的PBS。在小鼠的尾静脉中体内静脉注射。一组小鼠接受100μl PBS注射作为阴性对照。此后每周监测肿瘤体积和体重2-3次。
在CART输注后2周开始，通过侧尾静脉穿刺采血，此后一直持续到第6周。在每个时间点，将大约50μl全血收集到EDTA涂层毛细管中。将30μl血液涂板以进行流式细胞术染色，并将剩余血液以13,000rpm离心5分钟。从试管中提取血浆，铺板，并储存在-80℃下用于细胞因子评估。
使用TMD8-荧光素酶模型的体内功效研究
六周大的雌性NSG小鼠来自杰克逊实验室。在肿瘤植入前一天，将用于动物标识的电子转发器植入在左侧肋腹部。将TMD8-Luc细胞用含有10％胎牛血清和1％L-谷氨酰胺的RMPI-1640培养基培养。收获对数生长期的细胞并在冷的无菌PBS中洗涤一次。将细胞以25x106/ml的浓度按1:1比率的PBS和基质胶重悬，置于冰上，并以200ul皮下注射到小鼠的右侧肋腹部。每只小鼠的总细胞数为5x106。肿瘤植入后9天，将小鼠随机化。野生型或ZBTB32KO gRNA6 CAR T细胞解冻，用RPMI1640+10％热灭活胎牛血清(FBS)洗涤，并通过Cellometer Vision(Nexcelcom公司)计数。将CART细胞以300g离心10分钟，并以相应浓度重悬于冷PBS中，并保持在冰上直至注射。通过尾静脉向小鼠静脉内注射200μl PBS(媒介物)或含有2x106或0.4x106个野生型或ZBTB32KO gRNA6 CAR T细胞的200ul PBS。此后每周监测肿瘤和体重2-3次。TMD8-Luc细胞表达荧光素酶。为测量荧光素酶信号，以200ul的剂量向小鼠腹腔内注射15mg/ml的荧光素底物，并在10分钟后拍摄图像以进行定量。
流式细胞术分析
将血液样品转移到96孔U型底板(每个小组10-30ul血液)中，通过每孔添加150ul的ACK裂解缓冲液(Quality Biological公司，目录号118-156-721)裂解红细胞。在室温下孵育2分钟后，将100ul杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)添加到每个孔中，将细胞以1500rpm旋转沉降5分钟并用200ul DPBS洗涤。对于细胞表面和转录因子小组，将细胞直接按照下述染色程序进行处理。对于细胞因子小组，为了刺激细胞因子表达，将细胞重悬于含有PMA(西格玛公司(Sigma)，最终浓度：10ng/ml)和离子霉素(西格玛公司，最终浓度：1ug/ml)的200ul T细胞培养基(RPMI1640+10％FBS+1x丙酮酸钠+1x NEAA+1x L-谷氨酰胺+1x HEPES+1x 2-巯基乙醇+1X青霉素/链霉素)中，并在37℃培养箱中孵育3小时。将布雷菲德菌素A(百进生物科技公司，最终浓度：10ug/mL)添加到每个孔中，并将细胞在37℃培养箱中再培养1小时。将细胞以1500rpm旋转沉降5分钟并用200ul DPBS洗涤。
然后用DPBS中的100ul Zombie NIR(1:1500)重悬细胞。在黑暗中室温孵育15分钟后，将细胞以1800rpm旋转沉降3分钟并用FACS缓冲液(1000mL DPBS+40mL热灭活FBS+1mL0.5M EDTA pH8.0)洗涤。
对于细胞表面染色，使用含有小鼠Fc阻断抗体(美天旎公司，目录号130-092-575，1:25稀释)和人Fc阻断抗体(BD，目录号564220，1:10稀释)的50ul FACS缓冲液重悬细胞并在室温下避光孵育20分钟。然后添加在FACS缓冲液中的50ul 2x表面抗体混合物，混合并在室温下避光孵育30分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，并使用BD Fortessa流式细胞仪进行分析。
对于细胞内染色，用200ul 1x固定/透化缓冲液(英杰公司，目录号00-5523-00)重悬细胞，混合并在室温下避光孵育30分钟。将细胞用200ul 1x透化缓冲液洗涤两次，用100ul 1x细胞内抗体混合物重悬于1x透化缓冲液中，并在室温下避光孵育30分钟。用200ul1x透化缓冲液洗涤细胞，并在室温下用在DPBS中的200uL 0.05％多聚甲醛固定30分钟。固定后，将细胞旋转沉降以去除多聚甲醛并重悬于200uL FACS缓冲液中，以使用BD Fortessa流式细胞仪进行分析。
表29：流式抗体列表
Figure BDA0003991130860005891
Figure BDA0003991130860005901
从脾脏分离CART
在终点(第53天)，处死所有剩余的14-15只无肿瘤小鼠并收集它们的脾脏。将脾脏通过70μm过滤器粉碎到50ml锥形管中的约10ml培养基(RPMI 10％FBS)中。用培养基洗涤过滤器以确保将脾细胞收集到锥形管中。将4个或5个脾脏合并为一个。将收集管以1500rpm旋转5分钟，细胞托盘用1ml ACK裂解缓冲液(Quality Biological公司，目录号118-156-721)重悬，并在室温下孵育2分钟。用DPBS洗涤细胞，用活/死细胞染色，并使用FACSAria分选仪进行处理以分选出GFP阳性活细胞。
统计分析
使用GraphPad Prism软件进行单因素ANOVA和未配对t-检验以确定统计差异。
结果
为了研究ZBTB32在人T细胞介导的抗肿瘤免疫应答中的作用，生成了野生型(wt)和ZBTB32 KO CAR19-GFP T细胞。CAR阳性通过GFP和抗CD19 CAR独特型抗体染色流式细胞术分析确定(图2A)，基因编辑效率通过T7E1切割测定和NGS验证(图2B-2C)。如图2A所示，与没有ZBTB32破坏的野生型细胞相比，CAR19在ZBTB32敲除细胞中的表达水平相似。与wtCART细胞相比，ZBTB32 KO CART细胞也具有类似的体外抗原(CD19)依赖性增殖和癌细胞杀伤作用(图3A和3B)。当与癌细胞体外共培养时，ZBTB32 KO CART细胞产生更高水平的促炎细胞因子IFNg、IL2和TNFα(图3C)。
接下来，使用TMD8和TMD8荧光素酶肿瘤模型进行体内研究以评估wt和ZBTB32 KOCART介导的抗肿瘤免疫应答的体内功效。对于TMD8模型，每只小鼠移植1X106个CAR+细胞，对于TMD8荧光素酶肿瘤模型，每只小鼠移植0.4X106个CAR+细胞和0.4X106个CAR+细胞。这些实验的数据显示在图4-7中。
对于TMD8模型中的第一个实验，在第10天以每只小鼠1x106个CAR+细胞的剂量注射GFP wt(非CAR)、wt或ZBTB32 KO CART细胞。如图4A-4B所示，与用wt CART细胞处理的动物相比，用ZBTB32KO CART细胞(gRNA 6或gRNA 7)处理的动物在较早的时间点(时间点第25天到第39天之间)具有较小的肿瘤体积。数据证明与wt CART细胞相比，ZBTB32 KO CART细胞具有更快速的肿瘤控制。
在接下来的实验中，对于TMD8-Luc模型，在第9天以每只小鼠2x106个CAR+细胞的剂量注射wt或ZBTB32 KO CART细胞。如图5A-5B所示，与用wt CART细胞治疗的动物相比，用ZBTB32 KO CART细胞治疗的荷瘤动物具有较小的肿瘤体积。数据表明，ZBTB32 KO CART细胞比wt CART细胞更快速地控制肿瘤。用ZBTB32 KO CART细胞处理的携带TMD8-Luc肿瘤的动物的生物发光成像显示，ZBTB32 KO CART细胞比wt CART细胞更快速地控制肿瘤(图6A)并且在第21天，ZBTB32KO CART细胞处理的小鼠的生物发光显著低于wt CART细胞处理的小鼠(图6B)。类似地，当以每只小鼠0.4x106个CAR+细胞处理荷瘤小鼠时，观察到ZBTB32 KOCART细胞比wt CART细胞更快速地控制肿瘤(图7A-7D)。此外，5只wt CART细胞处理的小鼠中有3只显示肿瘤复发，而ZBTB32 KO CART细胞处理的小鼠没有显示肿瘤复发，突出表明ZBTB32 KO CART细胞具有更好的免疫保护持久性(图7A-7D)。来自这些实验的数据一致表明，与wt CART细胞相比，ZBTB32 KO CART细胞在体内更有效地杀死肿瘤细胞，更快地消除肿瘤细胞并具有更好的长期免疫保护以防止肿瘤复发(图4-7)。
T细胞状态由一组转录因子动态控制。TCF7是对干细胞记忆样T细胞(Tscm)状态至关重要的关键转录因子。已经表明，肿瘤内的TCF7+CD8+ T细胞频率可预测许多人类癌症在PD-1阻断后的应答和更好的患者存活率。转录因子Eomes表达在Tscm细胞中低，在耗竭的或终末分化的CD8+ T细胞中增加。最近的研究鉴定TOX为一种转录因子，可通过表观遗传方式重编码CD8 T细胞，从而在慢性病毒感染和癌症期间驱动T细胞耗竭。
为了研究ZBTB32与T细胞状态之间的关系，评估了ZBTB32敲除对CART细胞中T细胞转录因子表达的影响。流式细胞术分析表明，ZBTB32 KO CART细胞具有较高水平的TCF7和较低水平的Eomes(图8A-8D和图13A-13B)。ZBTB32 KO CART细胞中的TOX水平也较低(图13C)。该数据表明ZBTB32在抗肿瘤免疫应答期间体内调节T细胞状态。
与wt CART细胞相比，血液中的总ZBTB32KO CART细胞(CD4+和CD8+ T细胞)更多(图9A-9C)。在CD4+ T细胞群体(图10A-10C)和CD8+ T细胞群体(图10D-10F)中也均观察到数量更多的产生IL2、IFNg和TNFα细胞因子的ZBTB32KO CART细胞。
重要的是，与wt CART细胞相比，ZBTB32 KO CART细胞具有显著更低水平的耗竭标志物，例如PD1、TIM3和LAG3(图11A-11D和图14A-14F)。该数据表明ZBTB32 KO CART细胞更具体内耗竭抗性。此外，当肿瘤在小鼠体内被清除时，在小鼠脾脏中观察到的ZBTB32KOCART细胞数量是wt CART细胞数量的3-5倍(图12A)。还观察到小鼠脾脏中CD4+CART细胞和CD8+CART细胞的细胞总数增加(图12B-12C)。肿瘤清除后小鼠中ZBTB32KO CART细胞数量的增加表明ZBTB32KO CART细胞的体内持久性增强。
CART细胞中的ZBTB32敲除可增强体内CART细胞扩增、细胞因子产生、持久性、耗竭抗性，并最终增强更有效和更好的长期抗肿瘤活性。考虑到ZBTB32对关键T细胞转录因子、耗竭基因和T细胞状态的调节，这种对CART细胞的有益作用也可通过单独的ZBTB32抑制或其与靶向或其他IO疗法组合应用于实体瘤。
实例3：ZBTB32敲除对癌细胞的影响
该实例描述了ZBTB32敲除对癌细胞生长的影响。
TMD8-cas9稳定细胞由含有Cas9的慢病毒转导制备并用20ug/ml杀稻瘟菌素选择。然后用含有非靶向gRNA(gRNA NT，GTAGCGAACGTGTCCGGCGT(SEQ ID NO:3014))或ZBTB32gRNA6(CCAGCCGATCAGAGCCATAG(SEQ ID NO:3004))的慢病毒感染TMD8-cas9细胞，并用0.5ug/ml嘌呤霉素进行选择。
为了测量体外细胞生长动力学，将TMD8 gRNA NT或TMD8ZBTB32 gRNA6稳定细胞接种到384孔板中，并在第0、1、2、3和4天使用CellTiter-Glo发光细胞活力试剂盒测定细胞生长。如图15A所示，与对照细胞相比，TMD8细胞中ZBTB32的敲除导致体外细胞增殖减少。
为了确定体内肿瘤生长动力学，将TMD8 gRNA NT和TMD8ZBTB32 gRNA6细胞重悬在1:1比率的PBS(不含CaCl2或MgCl2)和基质胶中。收集并以1500rpm旋转5分钟后，将细胞重新悬浮至浓度为5x106个细胞/100μl用于植入。在第0天将细胞皮下植入NSG小鼠的右侧肋腹部(5x106个细胞/小鼠，每组20只小鼠)。通过卡尺测量监测肿瘤，每周2-3次。当肿瘤体积接近终点(>1000mm3)时终止小鼠。在终点(第23天)，对照组(gRNA NT)和ZBTB32 KO TMD8肿瘤组分别有7只和12只小鼠。
对照(gRNA NT)TMD8肿瘤始终比ZBTB32KO肿瘤生长略快。第23天对照组的平均肿瘤体积略有下降可归因于肿瘤接近终点(>1000mm3)几只小鼠在第21天的前一次测量中被处死。图15B-15C显示ZBTB32 KO TMD8肿瘤始终表现出随时间的体内延迟生长动力学。
等同物
本文引用的每一个专利、专利申请和出版物的披露内容据此通过引用以其全文特此并入。虽然已经参照特定实施例披露了本披露内容，但是本领域其他技术人员可以在不偏离本披露的真实精神以及范围的情况下设想本披露的其他实施例以及变化。所附权利要求旨在理解为包括所有这类实施例以及等同变化。

Claims (222)

1.一种细胞(例如细胞群体)，例如免疫效应细胞，所述细胞表达嵌合抗原受体(CAR)，
其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域，并且
其中所述细胞具有降低的ZBTB32表达和/或降低的ZBTB32生物活性。
2.如权利要求1所述的细胞，其中所述细胞不具有可检测的ZBTB32表达和/或生物活性。
3.如权利要求1或2所述的细胞，其中所述细胞包含ZBTB32抑制剂，或者所述细胞已经接触或正在接触ZBTB32抑制剂。
4.如权利要求3所述的细胞，其中所述ZBTB32抑制剂包含小分子。
5.如权利要求3所述的细胞，其中所述ZBTB32抑制剂包含：
(1)靶向ZBTB32基因的基因编辑系统或其一种或多种组分；
(2)编码所述基因编辑系统的一种或多种组分的核酸；或
(3)(1)和(2)的组合。
6.如权利要求5所述的细胞，其中所述基因编辑系统是CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶系统、TALEN系统或大范围核酸酶系统。
7.如权利要求5或6所述的细胞，其中所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因中的靶序列结合。
8.如权利要求5-7中任一项所述的细胞，其中所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的早期外显子或内含子中的靶序列结合。
9.如权利要求5-8中任一项所述的细胞，其中所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的靶序列结合，并且所述靶序列在外显子4的上游，例如在外显子1、外显子2或外显子3中。
10.如权利要求5-9中任一项所述的细胞，其中所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的晚期外显子或内含子中的靶序列结合。
11.如权利要求5-10中任一项所述的细胞，其中所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的靶序列结合，所述靶序列在倒数第四外显子的下游，例如在倒数第三外显子、倒数第二外显子或最后外显子中。
12.如权利要求5-11中任一项所述的细胞，其中所述基因编辑系统与包含所述ZBTB32基因的剪接连接的靶序列结合。
13.如权利要求5-12中任一项所述的细胞，其中所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的编码区中的靶序列结合。
14.如权利要求5-13中任一项所述的细胞，其中所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的非编码区中的靶序列结合。
15.如权利要求5-14中任一项所述的细胞，其中所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的调节元件中的靶序列结合。
16.如权利要求5-15中任一项所述的细胞，其中所述基因编辑系统是包含指导RNA(gRNA)分子的CRISPR/Cas系统，所述gRNA分子包含与所述ZBTB32基因的靶序列杂交的靶向序列。
17.如权利要求5-15中任一项所述的细胞，其中所述ZBTB32抑制剂包含靶向所述ZBTB32基因的小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)，或编码所述siRNA或shRNA的核酸。
18.如权利要求17所述的细胞，其中所述siRNA或shRNA包含与所述ZBTB32基因的mRNA序列互补的核苷酸序列。
19.如权利要求5-15中任一项所述的细胞，其中所述ZBTB32抑制剂包含靶向所述ZBTB32基因的反义寡核苷酸(ASO)，或编码所述ASO的核酸。
20.如权利要求19所述的细胞，其中所述ASO包含与所述ZBTB32基因的mRNA序列互补的核苷酸序列。
21.如权利要求5-15中任一项所述的细胞，其中所述ZBTB32抑制剂包含蛋白质。
22.如权利要求5-15中任一项所述的细胞，其中所述ZBTB32抑制剂包含由所述ZBTB32基因编码的蛋白质的显性负性变体，或编码所述显性负性变体的核酸。
23.如权利要求5-15中任一项所述的细胞，其中所述ZBTB32抑制剂包含由所述ZBTB32基因编码的蛋白质的显性负性结合配偶体，或编码所述显性负性结合配偶体的核酸。
24.如权利要求5-15中任一项所述的细胞，其中所述ZBTB32抑制剂包含抗体分子，例如单结构域抗体(sdAb)或纳米抗体，其与由所述ZBTB32基因编码的蛋白质结合，或编码所述抗体分子的核酸。
25.如权利要求5-15或24中任一项所述的细胞，其中所述ZBTB32抑制剂包含编码单结构域抗体(sdAb)或纳米抗体的核酸，所述sdAb或纳米抗体与由所述ZBTB32基因编码的蛋白质结合。
26.如权利要求1-25中任一项所述的细胞，其中与参照细胞相比，所述细胞具有降低的ZBTB32表达，例如降低至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。
27.如权利要求26所述的细胞，其中所述ZBTB32蛋白水平降低。
28.如权利要求26或27所述的细胞，其中所述ZBTB32蛋白稳定性降低。
29.如权利要求26-28中任一项所述的细胞，其中所述ZBTB32mRNA水平降低。
30.如权利要求26-29中任一项所述的细胞，其中所述ZBTB32mRNA稳定性降低。
31.如权利要求26-30中任一项所述的细胞，其中所述细胞具有降低的ZBTB32转录。
32.如权利要求26-31中任一项所述的细胞，其中所述细胞具有降低的ZBTB32翻译。
33.如权利要求26-32中任一项所述的细胞，其中所述ZBTB32基因组基因座被改变(例如，被破坏)。
34.如权利要求33所述的细胞，其中所述ZBTB32基因包含缺失或插入，例如破坏所述ZBTB32基因组基因座中的可读框(ORF)或CLL超级增强子的缺失或插入。
35.如权利要求33或34所述的细胞，其中所述ZBTB32基因包含表观基因组修饰，例如降低ZBTB32表达的表观基因组修饰。
36.如权利要求1-35中任一项所述的细胞，其中与参照细胞相比，所述细胞具有降低的ZBTB32生物活性，例如降低至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。
37.如权利要求36所述的细胞，其中ZBTB32的转录抑制功能降低。
38.如权利要求36或37所述的细胞，其中ZBTB32与一个或多个结合配偶体之间的相互作用减少。
39.如权利要求38所述的细胞，其中所述一个或多个结合配偶体包括范可尼贫血互补组C(FANCC)、硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)、维生素D3上调蛋白1(VDUP1)、含锌指和BTB结构域的蛋白16(Zbtb16)、锌指肘相关脯氨酸结构域蛋白2(Zpo2)、GATA结合蛋白3(Gata3)、GATA结合蛋白2(Gata2)或B细胞淋巴瘤6(Bcl-6)。
40.如权利要求1-39中任一项所述的细胞，其中所述细胞具有增强的T细胞介导的抗肿瘤应答。
41.如权利要求1-40中任一项所述的细胞，其中所述细胞具有增加的增殖和/或细胞因子产生。
42.如权利要求1-41中任一项所述的细胞，其中所述细胞具有改变的T细胞状态，例如功能失调的T细胞的改变状态，例如减少的T细胞耗竭。
43.如权利要求1-42中任一项所述的细胞，其中所述细胞具有体内增强的耗竭抗性和增强的长期免疫保护。
44.如权利要求1-43中任一项所述的细胞，其中所述细胞具有增加的MHCII和/或MHCII反式激活因子CIITA表达。
45.如权利要求1-44中任一项所述的细胞，其中与参照细胞相比，所述细胞在体内以更高的速率扩增。
46.如权利要求1-39中任一项所述的细胞，其中所述细胞具有改善的免疫记忆表型，例如B细胞记忆表型。
47.如权利要求1-46中任一项所述的细胞，其中所述细胞是免疫效应细胞(例如，免疫效应细胞群体)。
48.如权利要求47所述的细胞，其中所述免疫效应细胞是T细胞、B细胞或NK细胞。
49.如权利要求47或48所述的细胞，其中所述免疫效应细胞是T细胞。
50.如权利要求49所述的细胞，其中所述T细胞是αβT细胞。
51.如权利要求49或50所述的细胞，其中所述T细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合。
52.如权利要求49-51中任一项所述的细胞，其中所述T细胞是CD8+T细胞或调节性T细胞(Treg)，例如，肿瘤浸润性、功能失调的CD8+T细胞或Treg。
53.如权利要求49所述的细胞，其中所述细胞是γδT细胞。
54.如权利要求1-53中任一项所述的细胞，其中所述细胞是嵌合抗原受体T(CART)细胞，例如，无应答者的制造的CART细胞。
55.如权利要求47或48所述的细胞，其中所述细胞是B细胞。
56.如权利要求47或48所述的细胞，其中所述细胞是NK细胞。
57.如权利要求1-56中任一项所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。
58.如权利要求1-57中任一项所述的细胞，其中所述细胞还具有降低的Tet2表达和/或降低的Tet2生物活性。
59.如权利要求1-58中任一项所述的细胞，其中所述细胞还具有降低的IKZF2表达和/或降低的IKZF2生物活性。
60.如权利要求1-59中任一项所述的细胞，其中所述抗原结合结构域结合选自由以下组成的组的肿瘤抗原：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、HPV E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、以及IGLL1。
61.如权利要求1-60中任一项所述的细胞，其中所述肿瘤抗原是CD19、BCMA、CD20或CD22。
62.如权利要求1-61中任一项所述的细胞，其中所述肿瘤抗原是CD19。
63.如权利要求1-61中任一项所述的细胞，其中所述肿瘤抗原是BCMA。
64.如权利要求1-61中任一项所述的细胞，其中所述肿瘤抗原是CD20。
65.如权利要求1-61中任一项所述的细胞，其中所述肿瘤抗原是CD22。
66.如权利要求1-65中任一项所述的细胞，其中所述抗原结合结构域是如在例如WO2012/079000或WO 2014/153270中所述的抗体或抗体片段。
67.如权利要求1-66中任一项所述的细胞，其中所述跨膜结构域包含：
具有WO 2012/079000的SEQ ID NO:12的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与WO2012/079000的SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列；或WO 2012/079000的SEQ ID NO:12的序列。
68.如权利要求1-67中任一项所述的细胞，其中所述抗原结合结构域通过铰链区与所述跨膜结构域连接，其中所述铰链区包含WO2012/079000的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6、或其具有95％-99％同一性的序列。
69.如权利要求1-68中任一项所述的细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域，其中所述初级信号传导结构域包含选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、常见FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεR1b)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10或DAP12的蛋白质的功能性信号传导结构域。
70.如权利要求69所述的细胞，其中所述初级信号传导结构域包含：具有WO 2012/079000的SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与WO 2012/079000的SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列；或WO 2012/079000的SEQ IDNO:18或SEQ IDNO:20的氨基酸序列。
71.如权利要求1-70中任一项所述的细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域、或初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域，其中所述共刺激信号传导结构域包含选自下组的蛋白质的功能性信号传导结构域，该组由以下组成：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性地结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、以及NKG2D。
72.如权利要求71所述的细胞，其中所述共刺激信号传导结构域包含具有WO 2012/079000的SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与WO 2012/079000的SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。
73.如权利要求71或72所述的细胞，其中所述共刺激信号传导结构域包含WO 2012/079000的SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的序列。
74.如权利要求1-73所述的细胞，其中所述细胞内结构域包含WO2012/079000的SEQ IDNO:14或SEQ ID NO:16的序列，和WO2012/079000的SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的序列，其中这些包含所述细胞内信号传导结构域的序列在同一框架中表达并且表达为单个多肽链。
75.如权利要求1-74中任一项所述的细胞，其进一步包含前导序列，所述前导序列包含WO 2012/079000的SEQ ID NO:2的序列。
76.一种提高表达CAR的细胞，例如如前述权利要求中任一项所述的细胞，例如表达CAR19的细胞(例如，CTL019或CTL119)的治疗效果的方法，所述方法包括：
降低所述细胞中ZBTB32的表达和/或生物活性，
从而增加所述表达CAR的细胞的治疗效果。
77.一种提高表达CAR的细胞，例如如前述权利要求中任一项所述的细胞，例如表达CAR19的细胞(例如，CTL019或CTL119)的治疗效果的方法，所述方法包括：
使所述细胞与ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂接触，
从而增加所述表达CAR的细胞的治疗效果。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述抑制剂是：
(a)降低ZBTB32的表达和/或生物活性的小分子；
(b)靶向所述ZBTB32基因的基因编辑系统；
(c)抑制ZBTB32表达的核酸(例如，siRNA、shRNA或ASO)；
(d)由所述ZBTB32基因编码的(例如显性负性)蛋白质，或由所述ZBTB32基因编码的蛋白质的结合配偶体；
(e)与由所述ZBTB32基因编码的蛋白质结合的抗体分子(例如单结构域抗体(sdAb)或纳米抗体)；
(f)编码(b)或其组分或(c)-(d)中任一项的核酸；或
(g)(a)-(f)的任意组合。
79.如权利要求77或78所述的方法，其中将所述细胞与所述ZBTB32抑制剂离体接触。
80.如权利要求77或78所述的方法，其中将所述细胞与所述ZBTB32抑制剂体内接触。
81.如权利要求80所述的方法，其中在将编码CAR的核酸递送至所述细胞之前将所述细胞与所述ZBTB32抑制剂体内接触。
82.如权利要求80或81所述的方法，其中在已经将所述细胞施用至有需要的受试者之后将所述细胞与所述ZBTB32抑制剂体内接触。
83.如权利要求76-82中任一项所述的方法，所述方法进一步包括使所述细胞与Tet2抑制剂接触。
84.如权利要求76-83中任一项所述的方法，所述方法进一步包括使所述细胞与IKZF2抑制剂接触。
85.如权利要求76-84中任一项所述的方法，其中所述细胞已经与Tet2抑制剂接触。
86.如权利要求76-85中任一项所述的方法，其中所述细胞已经与IKZF2抑制剂，例如本文所述的IKZF2抑制剂接触。
87.一种用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1-75中任一项所述的细胞。
88.如权利要求1-75中任一项所述的细胞，用于在治疗受试者的癌症中使用。
89.如权利要求87所述的方法或用于如权利要求88所述使用的细胞，其中所述癌症是血液癌症，任选地其中所述癌症是淋巴瘤、骨髓瘤或白血病。
90.如权利要求87或89所述的方法或用于如权利要求88-89中任一项所述使用的细胞，其中所述癌症是B细胞恶性肿瘤，例如B细胞淋巴瘤或白血病。
91.如权利要求87或89-90中任一项所述的方法或用于如权利要求88-90中任一项所述使用的细胞，其中所述癌症是淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，例如活化的B细胞(ABC)DLBCL或生发中心B细胞(GCB)DLBCL。
92.如权利要求87或89-90中任一项所述的方法或用于如权利要求88-90中任一项所述使用的细胞，其中所述癌症是骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤(MM)。
93.如权利要求87或89-90中任一项所述的方法或用于如权利要求88-90中任一项所述使用的细胞，其中所述癌症是白血病，例如急性淋巴细胞白血病(ALL)或慢性淋巴细胞白血病(CLL)。
94.如权利要求87所述的方法或用于如权利要求88所述使用的细胞，其中所述癌症是实体瘤，任选地其中所述实体瘤与免疫细胞浸润相关。
95.如权利要求87所述的方法或用于如权利要求88所述使用的细胞，其中所述癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或白血病前期。
96.如权利要求87所述的方法或用于如权利要求88所述使用的细胞，其中所述癌症是结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症、或上述癌症的转移性病灶。
97.如权利要求87或89-96中任一项所述的方法或用于如权利要求88-96中任一项所述使用的细胞，其中所述癌症表达更高水平的ZBTB32，例如，如通过本文所述的方法所确定的。
98.如权利要求87或89-97所述的方法或用于如权利要求88-97中任一项所述使用的细胞，所述方法进一步包括向所述受试者施用第二治疗剂或方式，例如本文所述的癌症疗法。
99.如权利要求87或89-98所述的方法或用于如权利要求88-98中任一项所述使用的细胞，所述方法进一步包括向所述受试者施用ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂。
100.一种用于在治疗有需要的受试者中使用的表达CAR的细胞疗法，所述表达CAR的细胞疗法与ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂组合使用。
101.用于如权利要求100所述使用的表达CAR的细胞疗法，其中在开始所述表达CAR的细胞疗法之前，所述受试者接受所述ZBTB32抑制剂的预治疗。
102.用于如权利要求100或101所述使用的表达CAR的细胞疗法，其中所述受试者接受用所述ZBTB32抑制剂和所述表达CAR的细胞疗法的并行治疗。
103.用于如权利要求100-102中任一项所述使用的表达CAR的细胞疗法，其中所述受试者在表达CAR的细胞疗法后接受用所述ZBTB32抑制剂的治疗。
104.用于如权利要求100-103中任一项所述使用的表达CAR的细胞疗法，其中所述受试者患有与肿瘤抗原(例如本文所述的肿瘤抗原)的表达相关的疾病，例如增生性疾病、癌前病状、癌症、以及与所述肿瘤抗原的表达相关的非癌症相关适应症。
105.用于如权利要求100-104中任一项所述使用的表达CAR的细胞疗法，其中所述受试者患有血液癌症。
106.用于如权利要求100-105中任一项所述使用的表达CAR的细胞疗法，其中所述受试者患有淋巴瘤、骨髓瘤或白血病。
107.用于如权利要求100-106中任一项所述使用的表达CAR的细胞疗法，其中所述受试者患有B细胞恶性肿瘤，例如B细胞淋巴瘤或白血病。
108.用于如权利要求100-107中任一项所述使用的表达CAR的细胞疗法，其中所述受试者患有淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，例如活化的B细胞(ABC)DLBCL或生发中心B细胞(GCB)DLBCL。
109.用于如权利要求100-107中任一项所述使用的表达CAR的细胞疗法，其中所述受试者患有骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤(MM)。
110.用于如权利要求100-107中任一项所述使用的表达CAR的细胞疗法，其中所述受试者患有白血病，例如急性淋巴细胞白血病(ALL)或慢性淋巴细胞白血病(CLL)。
111.用于如权利要求100-106中任一项所述使用的表达CAR的细胞疗法，其中所述受试者患有慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或白血病前期。
112.用于如权利要求100-104中任一项所述使用的表达CAR的细胞疗法，其中所述受试者患有实体瘤。
113.用于如权利要求112所述使用的表达CAR的细胞疗法，其中所述实体瘤与免疫细胞浸润有关。
114.用于如权利要求100-104或112-113中任一项所述使用的表达CAR的细胞疗法，其中所述受试者患有结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症、或上述癌症的转移性病灶。
115.用于如权利要求100-114中任一项所述使用的表达CAR的细胞疗法，其中所述用途进一步包括确定所述细胞中ZBTB32的表达和/或生物活性。
116.一种治疗受试者的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用有效量的ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂，
从而治疗所述受试者，
其中所述受试者已经接受、正在接受或将要接受包括表达CAR的细胞的疗法。
117.一种ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂，用于在治疗受试者中使用，其中所述受试者已经接受、正在接受或将要接受包括表达CAR的细胞的疗法。
118.一种制造表达CAR的细胞的方法，所述方法包括：
将编码CAR的核酸引入细胞中，使得所述核酸(或其CAR编码部分)整合到所述细胞的基因组中，从而降低所述ZBTB32的表达和/或生物活性，
从而制造所述表达CAR的细胞。
119.如权利要求118所述的方法，其中将所述核酸整合到ZBTB32基因内(例如，整合到ZBTB32基因的内含子或外显子内)。
120.如权利要求118所述的方法，其中将所述核酸整合到不同于所述ZBTB32基因的基因内(例如，整合到其他基因的内含子或外显子内)。
121.如权利要求118-120中任一项所述的方法，其中所述表达CAR的细胞是根据本文所述的制造或生产方法制造的。
122.一种制造表达CAR的细胞的方法，所述方法包括：
使表达CAR的细胞与ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂离体接触，从而制造所述表达CAR的细胞。
123.如权利要求122所述的方法，其中与还未与所述ZBTB32抑制剂离体接触的相同的表达CAR的细胞相比，所述表达CAR的细胞具有改善的特性，例如，本文描述的改善的特性。
124.如权利要求123所述的方法，其中所述改善的特性包括体内增强的T细胞介导的抗肿瘤应答、增加的增殖和/或细胞因子产生、减少的T细胞耗竭、增强的耗竭抗性和增强的长期免疫保护，MHCII和/或MHCII反式激活因子CIITA的表达增加，体内扩增率更高，改进的免疫记忆表型，或其任何组合。
125.如权利要求118-124中任一项所述的方法，其中所述表达CAR的细胞是根据本文所述的制造或生产方法制造的。
126.一种包含编码CAR的核苷酸序列和编码ZBTB32抑制剂的核苷酸序列的载体。
127.如权利要求126所述的载体，其中所述抑制剂是：
(a)靶向所述ZBTB32基因的基因编辑系统；
(b)抑制ZBTB32表达的核酸(例如，siRNA、shRNA或ASO)；
(c)由所述ZBTB32基因编码的(例如显性负性)蛋白质，或由所述ZBTB32基因编码的蛋白质的结合配偶体；
(d)与由所述ZBTB32基因编码的蛋白质结合的抗体分子(例如单结构域抗体(sdAb)或纳米抗体)；或
(e)(a)-(d)的任意组合。
128.如权利要求126或127所述的载体，其中编码所述CAR的核苷酸序列和编码所述抑制剂的核苷酸序列被2A位点分开。
129.一种用于离体制造表达CAR的细胞的组合物，所述组合物包含ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂。
130.如权利要求129所述的组合物，其中所述抑制剂是：
(a)降低ZBTB32的表达和/或生物活性的小分子；
(b)靶向所述ZBTB32基因的基因编辑系统；
(c)抑制ZBTB32表达的核酸(例如，siRNA、shRNA或ASO)；
(d)由所述ZBTB32基因编码的(例如显性负性)蛋白质，或由所述ZBTB32基因编码的蛋白质的结合配偶体；
(e)与由所述ZBTB32基因编码的蛋白质结合的抗体分子(例如单结构域抗体(sdAb)或纳米抗体)；
(f)编码(b)或其组分或(c)-(d)中任一项的核酸；或
(g)(a)-(f)的任意组合。
131.一种细胞群体，所述细胞群体包含一种或多种如权利要求1-75中任一项所述的细胞，其中与参照细胞群体相比，所述细胞群体包含更高(例如高至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍)百分比的如下细胞，所述细胞具有本文所述的表型或表达本文所述的标志物(例如，与中枢记忆T(TCM)细胞或干细胞记忆T(TSCM)细胞相关的表型或标志物)。
132.一种细胞群体，所述细胞群体包含一种或多种如权利要求1-75中任一项所述的细胞，其中所述群体中产生细胞因子的细胞的百分比比参照细胞群体高至少50％(例如，至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％)。
133.如权利要求131或132所述的细胞群体，其中所述参照细胞群体是不包含一个或多个如下细胞的细胞群体，其中在所述细胞中，ZBTB32的表达已被降低。
134.如权利要求131-133中任一项所述的细胞群体，其中所述参照细胞群体是不包含一个或多个如下细胞的细胞群体，其中在所述细胞中，ZBTB32的生物活性已被降低。
135.一种细胞群体，所述细胞群体包含一种或多种如权利要求1-75中任一项所述的细胞，其中所述细胞群体中的至少50％(例如至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％)具有本文所述的表型或表达本文所述的标志物(例如，与中枢记忆T(TCM)细胞或干细胞记忆T(TSCM)细胞相关的表型或标志物)。
136.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用有效量的ZBTB32抑制剂和第二治疗剂或方式，
从而治疗所述受试者的癌症。
137.一种ZBTB32抑制剂，用于在治疗受试者的癌症中使用，其中所述ZBTB32抑制剂与第二治疗剂或方式组合使用。
138.如权利要求136所述的方法或用于如权利要求137所述使用的抑制剂，其中所述ZBTB32抑制剂在施用所述第二治疗剂或方式之前、与其并行或之后施用。
139.如权利要求136或138所述的方法或用于如权利要求137或138所述使用的抑制剂，其中所述ZBTB32抑制剂包含小分子。
140.如权利要求136或138所述的方法或用于如权利要求136或137所述使用的抑制剂，其中所述ZBTB32抑制剂包含：
(1)靶向ZBTB32基因的基因编辑系统或其一种或多种组分；
(2)编码所述基因编辑系统的一种或多种组分的核酸；或
(3)(1)和(2)的组合。
141.如权利要求140所述的方法或用于如权利要求140所述使用的抑制剂，其中所述基因编辑系统是CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶系统、TALEN系统或大范围核酸酶系统。
142.如权利要求140或141所述的方法或用于如权利要求140或141所述使用的抑制剂，其中所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因中的靶序列结合。
143.如权利要求140-142中任一项所述的方法或用于如权利要求140-142中任一项所述使用的抑制剂，其中所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的早期外显子或内含子中的靶序列结合。
144.如权利要求140-143中任一项所述的方法或用于如权利要求140-143中任一项所述使用的抑制剂，其中所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的靶序列结合，并且所述靶序列在外显子4的上游，例如在外显子1、外显子2或外显子3中。
145.如权利要求140-144中任一项所述的方法或用于如权利要求140-144中任一项所述使用的抑制剂，其中所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的晚期外显子或内含子中的靶序列结合。
146.如权利要求140-145中任一项所述的方法或用于如权利要求140-145中任一项所述使用的抑制剂，其中所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的靶序列结合，所述靶序列在倒数第四外显子的下游，例如在倒数第三外显子、倒数第二外显子或最后外显子中。
147.如权利要求140-146中任一项所述的方法或用于如权利要求140-146中任一项所述使用的抑制剂，其中所述基因编辑系统与包含所述ZBTB32基因的剪接连接的靶序列结合。
148.如权利要求140-147中任一项所述的方法或用于如权利要求140-147中任一项所述使用的抑制剂，其中所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的编码区中的靶序列结合。
149.如权利要求140-148中任一项所述的方法或用于如权利要求140-148中任一项所述使用的抑制剂，其中所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的非编码区中的靶序列结合。
150.如权利要求140-149中任一项所述的方法或用于如权利要求140-149中任一项所述使用的抑制剂，其中所述基因编辑系统与所述ZBTB32基因的调节元件中的靶序列结合。
151.如权利要求140-150中任一项所述的方法或用于如权利要求140-150中任一项所述使用的抑制剂，其中所述基因编辑系统是包含指导RNA(gRNA)分子的CRISPR/Cas系统，所述gRNA分子包含与所述ZBTB32基因的靶序列杂交的靶向序列。
152.如权利要求136或138所述的方法或用于如权利要求137或138所述使用的抑制剂，其中所述ZBTB32抑制剂包含靶向所述ZBTB32基因的小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)，或编码所述siRNA或shRNA的核酸。
153.如权利要求152所述的方法或用于如权利要求152所述使用的抑制剂，其中所述siRNA或shRNA包含与所述ZBTB32基因的mRNA序列互补的核苷酸序列。
154.如权利要求136或138所述的方法或用于如权利要求137或138所述使用的抑制剂，其中所述ZBTB32抑制剂包含靶向所述ZBTB32基因的反义寡核苷酸(ASO)，或编码所述ASO的核酸。
155.如权利要求154所述的方法或用于如权利要求154所述使用的抑制剂，其中所述ASO包含与所述ZBTB32基因的mRNA序列互补的核苷酸序列。
156.如权利要求136或138所述的方法或用于如权利要求137或138所述使用的抑制剂，其中所述ZBTB32抑制剂包含蛋白质。
157.如权利要求136或138所述的方法或用于如权利要求137或138所述使用的抑制剂，其中所述ZBTB32抑制剂包含由所述ZBTB32基因编码的蛋白质的显性负性变体，或编码所述显性负性变体的核酸。
158.如权利要求136或138所述的方法或用于如权利要求137或138所述使用的抑制剂，其中所述ZBTB32抑制剂包含由所述ZBTB32基因编码的蛋白质的显性负性结合配偶体，或编码所述显性负性结合配偶体的核酸。
159.如权利要求136或138所述的方法或用于如权利要求137或138所述使用的抑制剂，其中所述ZBTB32抑制剂包含抗体分子，例如单结构域抗体(sdAb)或纳米抗体，其与由所述ZBTB32基因编码的蛋白质结合，或编码所述抗体分子的核酸。
160.如权利要求136、138或159所述的方法或用于如权利要求137、138或159所述使用的抑制剂，其中所述ZBTB32抑制剂包含编码单结构域抗体(sdAb)或纳米抗体的核酸，所述sdAb或纳米抗体与由所述ZBTB32基因编码的蛋白质结合。
161.如权利要求136或138-160中任一项所述的方法或用于如权利要求137-160中任一项所述使用的抑制剂，其中与参照细胞相比，所述ZBTB32抑制剂具有降低的ZBTB32表达，例如降低至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。
162.如权利要求136或138-161中任一项所述的方法或用于如权利要求137-161中任一项所述使用的抑制剂，其中所述ZBTB32抑制剂降低ZBTB32蛋白的水平。
163.如权利要求136或138-162中任一项所述的方法或用于如权利要求137-162中任一项所述使用的抑制剂，其中所述ZBTB32抑制剂降低ZBTB32蛋白的稳定性。
164.如权利要求136或138-163中任一项所述的方法或用于如权利要求137-163中任一项所述使用的抑制剂，其中所述ZBTB32抑制剂降低ZBTB32 mRNA的水平。
165.如权利要求136或138-164中任一项所述的方法或用于如权利要求137-164中任一项所述使用的抑制剂，其中所述ZBTB32抑制剂降低ZBTB32 mRNA的稳定性。
166.如权利要求136或138-165中任一项所述的方法或用于如权利要求137-165中任一项所述使用的抑制剂，其中所述ZBTB32抑制剂降低ZBTB32转录。
167.如权利要求136或138-166中任一项所述的方法或用于如权利要求137-166中任一项所述使用的抑制剂，其中所述ZBTB32抑制剂降低ZBTB32翻译。
168.如权利要求136或138-167中任一项所述的方法或用于如权利要求137-167中任一项所述使用的抑制剂，其中所述ZBTB32抑制剂改变(例如，破坏)所述ZBTB32基因组基因座。
169.如权利要求136或138-168中任一项所述的方法或用于如权利要求137-168中任一项所述使用的抑制剂，其中所述改变包括缺失或插入，例如破坏所述ZBTB32基因组基因座中的可读框(ORF)或CLL超级增强子的缺失或插入。
170.如权利要求136或138-169中任一项所述的方法或用于如权利要求137-169中任一项所述使用的抑制剂，其中所述改变包括表观基因组修饰，例如降低ZBTB32表达的表观基因组修饰。
171.如权利要求136或138-170中任一项所述的方法或用于如权利要求137-170中任一项所述使用的抑制剂，其中与参照细胞相比，所述ZBTB32抑制剂降低ZBTB32生物活性，例如降低至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。
172.如权利要求136或138-171中任一项所述的方法或用于如权利要求137-172中任一项所述使用的抑制剂，其中所述ZBTB32抑制剂降低ZBTB32的转录抑制功能。
173.如权利要求136或138-172中任一项所述的方法或用于如权利要求137-172中任一项所述使用的抑制剂，其中所述ZBTB32抑制剂减少ZBTB32与一个或多个结合配偶体之间的相互作用。
174.如权利要求136或138-173中任一项所述的方法或用于如权利要求137-173中任一项所述使用的抑制剂，其中所述一个或多个结合配偶体包括范可尼贫血互补组C(FANCC)、硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)、维生素D3上调蛋白1(VDUP1)、含锌指和BTB结构域的蛋白16(Zbtb16)、锌指肘相关脯氨酸结构域蛋白2(Zpo2)、GATA结合蛋白3(Gata3)、GATA结合蛋白2(Gata2)或B细胞淋巴瘤6(Bcl-6)。
175.如权利要求136或138-174中任一项所述的方法或用于如权利要求137-174中任一项所述使用的抑制剂，其中抑制剂增强T细胞介导的抗肿瘤应答。
176.如权利要求136或138-175中任一项所述的方法或用于如权利要求137-175中任一项所述使用的抑制剂，其中所述抑制剂增加增殖和/或细胞因子产生。
177.如权利要求136或138-176中任一项所述的方法或用于如权利要求137-176中任一项所述使用的抑制剂，其中所述抑制剂改变T细胞状态，例如功能失调的T细胞的状态，例如减少T细胞耗竭。
178.如权利要求136或138-177中任一项所述的方法或用于如权利要求137-177中任一项所述使用的抑制剂，其中所述抑制剂增强体内耗竭抗性和长期免疫保护。
179.如权利要求136或138-178中任一项所述的方法或用于如权利要求137-178中任一项所述使用的抑制剂，其中所述抑制剂增加MHCII和/或MHCII反式激活因子CIITA表达。
180.如权利要求136或138-179中任一项所述的方法或用于如权利要求137-179中任一项所述使用的抑制剂，其中所述抑制剂导致更高的体内细胞扩增率。
181.如权利要求136或138-180中任一项所述的方法或用于如权利要求137-180中任一项所述使用的抑制剂，其中所述抑制剂改善免疫记忆表型，例如B细胞记忆表型。
182.如权利要求136或138-181中任一项所述的方法或用于如权利要求137-181中任一项所述使用的抑制剂，其中所述癌症是血液癌症。
183.如权利要求136或138-182中任一项所述的方法或用于如权利要求137-182中任一项所述使用的抑制剂，其中所述癌症是淋巴瘤、骨髓瘤或白血病。
184.如权利要求136或138-183中任一项所述的方法或用于如权利要求137-183中任一项所述使用的抑制剂，其中所述癌症是B细胞恶性肿瘤，例如B细胞淋巴瘤或白血病。
185.如权利要求136或138-184中任一项所述的方法或用于如权利要求137-184中任一项所述使用的抑制剂，其中所述癌症是淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，例如活化的B细胞(ABC)DLBCL或生发中心B细胞(GCB)DLBCL。
186.如权利要求136或138-184中任一项所述的方法或用于如权利要求137-184中任一项所述使用的抑制剂，其中所述癌症是骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤(MM)。
187.如权利要求136或138-184中任一项所述的方法或用于如权利要求137-184中任一项所述使用的抑制剂，其中所述癌症是白血病，例如急性淋巴细胞白血病(ALL)或慢性淋巴细胞白血病(CLL)。
188.如权利要求136或138-181中任一项所述的方法或用于如权利要求137-181中任一项所述使用的抑制剂，其中所述癌症是实体瘤。
189.如权利要求188所述的方法或用于如权利要求188所述使用的抑制剂，其中所述实体瘤与免疫细胞浸润有关。
190.如权利要求136或138-181中任一项所述的方法或用于如权利要求137-181中任一项所述使用的抑制剂，其中所述癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或白血病前期。
191.如权利要求136或138-181中任一项所述的方法或用于如权利要求137-181中任一项所述使用的抑制剂，其中所述癌症是结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症、或上述癌症的转移性病灶。
192.如权利要求136或138-191中任一项所述的方法或用于如权利要求137-191中任一项所述使用的抑制剂，其中所述癌症表达更高水平的ZBTB32，例如，如通过本文所述的方法所确定的。
193.如权利要求136或138-192中任一项所述的方法或用于如权利要求137-192中任一项所述使用的抑制剂，其中所述受试者需要具有增强的免疫应答。
194.如权利要求136或138-193中任一项所述的方法或用于如权利要求137-193中任一项所述使用的抑制剂，所述方法进一步包括鉴定所述受试者为需要具有增强的免疫应答。
195.如权利要求136或138-194中任一项所述的方法或用于如权利要求137-194中任一项所述使用的抑制剂，所述方法进一步包括确定所述细胞中ZBTB32的表达和/或生物活性。
196.如权利要求136或138-195中任一项所述的方法或用于如权利要求137-195中任一项所述使用的抑制剂，所述方法进一步包括确定与CART疗法应答差相关的特征。
197.如权利要求136或138-196中任一项所述的方法或用于如权利要求137-196中任一项所述使用的抑制剂，其中所述第二治疗剂或方式包括免疫疗法。
198.如权利要求136或138-197中任一项所述的方法或用于如权利要求137-197中任一项所述使用的抑制剂，其中所述第二治疗剂或方式包括免疫检查点抑制剂，例如本文所述的免疫检查点抑制剂。
199.如权利要求136或138-198中任一项所述的方法或用于如权利要求137-198中任一项所述使用的抑制剂，其中所述第二治疗剂或方式包括PD-1抑制剂、TIM-3抑制剂、LAG-3抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、GITR激动剂、PD-L1抑制剂、细胞因子、嵌合抗原受体、雌激素受体拮抗剂、CDK4/6抑制剂、CXCR2抑制剂、CSF-1/1R结合剂、A2Ar拮抗剂、IDO抑制剂、STING激动剂、半乳凝素抑制剂、MEK抑制剂、c-MET抑制剂、TGF-b抑制剂、IL-1b抑制剂或MDM2抑制剂。
200.如权利要求136或138-199中任一项所述的方法或用于如权利要求137-199中任一项所述使用的抑制剂，其中所述第二治疗剂或方式包括细胞疗法，例如T细胞疗法，例如本文所述的表达CAR的细胞疗法。
201.如权利要求136或138-200中任一项所述的方法或用于如权利要求137-200中任一项所述使用的抑制剂，其中所述第二治疗剂或方式包括靶向疗法。
202.如权利要求136或138-201中任一项所述的方法或用于如权利要求137-201中任一项所述使用的抑制剂，其中所述第二治疗剂或方式包括化疗。
203.如权利要求136或138-202中任一项所述的方法或用于如权利要求137-202中任一项所述使用的抑制剂，其中所述第二治疗剂或方式包括放射疗法。
204.如权利要求136或138-203中任一项所述的方法或用于如权利要求137-203中任一项所述使用的抑制剂，其中所述第二治疗剂或方式包括手术。
205.如权利要求136或138-204中任一项所述的方法或用于如权利要求137-204中任一项所述使用的抑制剂，其中所述第二治疗剂或方式包括激素疗法。
206.如权利要求136或138-205中任一项所述的方法或用于如权利要求137-205中任一项所述使用的抑制剂，其中所述第二治疗剂或方式包括血管生成抑制剂。
207.一种增加治疗剂或方式的功效的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用有效量的ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂，
从而增加所述治疗剂或方式的功效。
208.一种ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂，用于在增加治疗剂或方式在受试者中的功效中使用。
209.如权利要求207所述的方法或用于如权利要求208所述使用的抑制剂，其中所述受试者患有癌症，例如，本文所述的癌症。
210.如权利要求207或209所述的方法或用于如权利要求208或209所述使用的抑制剂，其中所述治疗剂或方式包括免疫疗法或细胞疗法，例如本文所述的免疫疗法或细胞疗法。
211.一种增加受试者中免疫应答的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用有效量的ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂，
从而增加所述受试者中的免疫应答。
212.一种ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂，用于在增加受试者中的免疫应答中使用。
213.如权利要求211所述的方法或用于如权利要求212所述使用的抑制剂，其中所述受试者患有癌症，例如，本文所述的癌症。
214.如权利要求211或213所述的方法或用于如权利要求212或213所述使用的抑制剂，其中所述受试者已经接受或正在接受第二治疗剂或方式，例如本文所述的第二治疗剂或方式。
215.一种抑制ZBTB32的表达和/或生物活性的方法，所述方法包括：
使细胞(例如免疫细胞)与ZBTB32抑制剂，例如本文所述的ZBTB32抑制剂接触；以及
任选地进一步使所述细胞与第二治疗剂或方式接触；
从而治疗所述细胞。
216.如权利要求213所述的方法，其中使所述ZBTB32抑制剂与所述细胞体外、离体或体内接触。
217.一种靶向如本文所述的ZBTB32基因的基因编辑系统。
218.如权利要求217所述的基因编辑系统，所述基因编辑系统是CRISPR/Cas基因编辑系统、锌指核酸酶系统、TALEN系统或大范围核酸酶系统。
219.如权利要求217或218所述的基因编辑系统，所述基因编辑系统是CRISPR/Cas基因编辑系统。
220.如权利要求217-219中任一项所述的基因编辑系统，所述基因编辑系统包含：
gRNA分子，所述gRNA分子包含对所述ZBTB32基因的序列具有特异性的靶向序列，以及Cas9蛋白；
gRNA分子，所述gRNA分子包含对所述ZBTB32基因的序列具有特异性的靶向序列，以及编码Cas9蛋白的核酸；
编码gRNA分子的核酸，所述gRNA分子包含对所述ZBTB32基因的序列具有特异性的靶向序列，以及Cas9蛋白；或
编码gRNA分子的核酸，所述gRNA分子包含对所述ZBTB32基因的序列具有特异性的靶向序列，以及编码Cas9蛋白的核酸。
221.如权利要求217-220中任一项所述的基因编辑系统，所述基因编辑系统还包含模板DNA。
222.如权利要求221所述的基因编辑系统，其中所述模板DNA包含编码CAR，例如如本文所述的CAR的核酸序列。
CN202180042407.9A 2020-06-11 2021-06-11 Zbtb32抑制剂及其用途 Pending CN116096862A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063037826P 2020-06-11 2020-06-11
US63/037,826 2020-06-11
PCT/US2021/037048 WO2021252920A1 (en) 2020-06-11 2021-06-11 Zbtb32 inhibitors and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116096862A true CN116096862A (zh) 2023-05-09

Family

ID=77071723

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180042407.9A Pending CN116096862A (zh) 2020-06-11 2021-06-11 Zbtb32抑制剂及其用途

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20230332104A1 (zh)
EP (1) EP4165169A1 (zh)
JP (1) JP2023529211A (zh)
KR (1) KR20230024967A (zh)
CN (1) CN116096862A (zh)
AU (1) AU2021288224A1 (zh)
CA (1) CA3185455A1 (zh)
IL (1) IL298473A (zh)
WO (1) WO2021252920A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112203725A (zh) 2018-06-13 2021-01-08 诺华股份有限公司 Bcma嵌合抗原受体及其用途
WO2023150518A1 (en) * 2022-02-01 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof

Family Cites Families (225)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2779780A (en) 1955-03-01 1957-01-29 Du Pont 1, 4-diamino-2, 3-dicyano-1, 4-bis (substituted mercapto) butadienes and their preparation
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4851332A (en) 1985-04-01 1989-07-25 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Choriocarcinoma monoclonal antibodies and antibody panels
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
US6407213B1 (en) 1991-06-14 2002-06-18 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
CA2078539C (en) 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
GB9125768D0 (en) 1991-12-04 1992-02-05 Hale Geoffrey Therapeutic method
CA2507749C (en) 1991-12-13 2010-08-24 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US5646253A (en) 1994-03-08 1997-07-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Recombinant human anti-LK26 antibodies
DK1589107T3 (da) 1992-08-21 2010-04-26 Univ Bruxelles Immonuglobuliner uden lette kæder
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
AU7863794A (en) 1993-11-16 1995-06-06 Pola Chemical Industries Inc. Antihuman tyrosinase monoclonal antibody
US5635388A (en) 1994-04-04 1997-06-03 Genentech, Inc. Agonist antibodies against the flk2/flt3 receptor and uses thereof
CA2188432C (en) 1994-04-22 2011-02-01 Yutaka Kawakami Melanoma antigens
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
ES2141467T5 (es) 1995-01-18 2006-07-16 Roche Diagnostics Gmbh Anticuerpos anti-cd30 que evitan la escision proteolitica y liberacion del antigeno cd30 fijado a la membrana.
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US6177078B1 (en) 1995-12-29 2001-01-23 Medvet Science Pty Limited Monoclonal antibody antagonists to IL-3
EP0871492B1 (en) 1996-01-05 2003-11-26 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Mesothelium antigen and methods and kits for targeting it
DE19608769C1 (de) 1996-03-07 1997-04-10 Univ Eberhard Karls Antikörper BV10A4H2
EP0938557B1 (en) 1996-10-25 2000-09-13 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Methods and compositions for inhibiting inflammation and angiogenesis comprising a mammalian cd97 alpha subunit
ES2301198T3 (es) 1997-06-12 2008-06-16 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Polipeptidos artificiales de anticuerpos.
DE69833459T2 (de) 1997-12-01 2006-08-17 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antikörper, sowie fv moleküle, und immunkonjugate mit hoher bindungsaffinität für mesothelin und methoden für deren verwendung
US6803448B1 (en) 1998-07-22 2004-10-12 Vanderbilt University GBS toxin receptor
EP1143957A3 (en) 1998-12-16 2002-02-27 Warner-Lambert Company Treatment of arthritis with mek inhibitors
US6528481B1 (en) 1999-02-16 2003-03-04 The Burnam Institute NG2/HM proteoglycan-binding peptides that home to angiogenic vasculature and related methods
DK1210425T4 (en) 1999-08-17 2015-08-10 Apotech R & D Sa BAFF receptor (BCMA), an immunoregulatory agent
ATE388167T1 (de) 1999-09-30 2008-03-15 Kyowa Hakko Kogyo Kk Menschlicher antikörper gegen gangliosid gd3 für die transplantationskomplementarität bestimmente regionund derivate des antikörpers gegen das gangliosid gd3
CA2386270A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
MXPA02008265A (es) 2000-02-24 2004-09-10 Xcyte Therapies Inc Concentracion y estimulacion simultanea de calulas.
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
ATE510855T1 (de) 2000-03-06 2011-06-15 Univ Kentucky Res Found Verwendung eines antikörpers oder eines immunotoxins, der bzw. das selektiv an cd123 bindet zur beeinträchtigung hämatologischer krebs-vorläuferzellen
WO2001096584A2 (en) 2000-06-12 2001-12-20 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
US6960614B2 (en) 2000-07-19 2005-11-01 Warner-Lambert Company Oxygenated esters of 4-lodo phenylamino benzhydroxamic acids
WO2004007529A2 (en) 2002-07-15 2004-01-22 The Trustees Of Princeton University Iap binding compounds
US7090843B1 (en) 2000-11-28 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
AU2002238052A1 (en) 2001-02-20 2002-09-04 Zymogenetics, Inc. Antibodies that bind both bcma and taci
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
EP2383291B1 (en) 2001-08-23 2019-04-17 Rsr Limited Epitope regions of a thyrotropin (TSH) receptor, uses thereof and antibodies thereto
JP4716350B2 (ja) 2001-12-04 2011-07-06 ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート インク． 潜伏期膜タンパク質に対する抗体およびそれらの使用
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
EP2407473A3 (en) 2002-02-01 2012-03-21 ARIAD Pharmaceuticals, Inc Method for producing phosphorus-containing compounds
AU2003224672B2 (en) 2002-03-08 2010-02-04 Eisai R&D Management Co., Ltd. Macrocyclic compounds useful as pharmaceuticals
TWI275390B (en) 2002-04-30 2007-03-11 Wyeth Corp Process for the preparation of 7-substituted-3- quinolinecarbonitriles
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
GB0215823D0 (en) 2002-07-09 2002-08-14 Astrazeneca Ab Quinazoline derivatives
US8501415B2 (en) 2002-11-26 2013-08-06 B.R.A.H.M.S. Gmbh Identification of TSH receptor autoantibodies using affinity-purified antibodies
AU2003288675B2 (en) 2002-12-23 2010-07-22 Medimmune Limited Antibodies against PD-1 and uses therefor
WO2004087758A2 (en) 2003-03-26 2004-10-14 Neopharm, Inc. Il 13 receptor alpha 2 antibody and methods of use
CA2530605A1 (en) 2003-06-27 2005-05-26 Diadexus, Inc. Pro104 antibody compositions and methods of use
EP1638510B1 (en) 2003-07-01 2015-09-02 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
JP2007525971A (ja) 2003-08-05 2007-09-13 モルフォテック、インク． 癌に関連する変異体細胞表面分子
JP4934426B2 (ja) 2003-08-18 2012-05-16 メディミューン，エルエルシー 抗体のヒト化
CA2537055A1 (en) 2003-08-22 2005-04-21 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
US7399865B2 (en) 2003-09-15 2008-07-15 Wyeth Protein tyrosine kinase enzyme inhibitors
JPWO2005035577A1 (ja) 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 ガングリオシドｇｄ３に特異的に結合する抗体組成物
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
US7932382B2 (en) 2004-01-16 2011-04-26 The Regents Of The University Of Michigan Conformationally constrained Smac mimetics and the uses thereof
CA2553871A1 (en) 2004-01-16 2005-08-04 The Regents Of The University Of Michigan Smac peptidomimetics and the uses thereof
CA2555185C (en) 2004-02-06 2020-03-24 Morphosys Ag Anti-cd38 human antibodies and uses therefor
AU2005228950B2 (en) 2004-03-23 2012-02-02 Genentech, Inc. Azabicyclo-octane inhibitors of IAP
AR048927A1 (es) 2004-04-07 2006-06-14 Novartis Ag Compuestos heterociclicos como inhibidores de proteinas de apoptosis (iap); composiciones farmaceuticas que los contienen y su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa
EP3363907A1 (en) 2004-05-27 2018-08-22 The Trustees of the University of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
RS53734B1 (en) 2004-07-02 2015-06-30 Genentech Inc. IAP INHIBITORS
US7674787B2 (en) 2004-07-09 2010-03-09 The Regents Of The University Of Michigan Conformationally constrained Smac mimetics and the uses thereof
EP1773348A4 (en) 2004-07-12 2009-05-20 Idun Pharmaceuticals Inc TETRA PEPTIDE ANALOGS
WO2006020060A2 (en) 2004-07-15 2006-02-23 Tetralogic Pharmaceuticals Corporation Iap binding compounds
WO2006020258A2 (en) 2004-07-17 2006-02-23 Imclone Systems Incorporated Novel tetravalent bispecific antibody
NZ589670A (en) 2004-12-20 2013-01-25 Genentech Inc Pyrrolidine inhibitors of iap
MY146381A (en) 2004-12-22 2012-08-15 Amgen Inc Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies
WO2006099141A2 (en) 2005-03-10 2006-09-21 Morphotek, Inc. Anti-mesothelin antibodies
EP2343320B1 (en) 2005-03-25 2017-10-25 GITR, Inc. Anti-gitr antibodies and uses thereof
CN109485727A (zh) 2005-05-09 2019-03-19 小野药品工业株式会社 程序性死亡-1(pd-1)的人单克隆抗体及使用抗pd-1抗体来治疗癌症的方法
EP1726650A1 (en) 2005-05-27 2006-11-29 Universitätsklinikum Freiburg Monoclonal antibodies and single chain antibody fragments against cell-surface prostate specific membrane antigen
CA2611149A1 (en) 2005-06-15 2006-12-28 Schering Corporation Anti-igf1r antibody formulations
PL1912636T3 (pl) 2005-07-21 2015-02-27 Ardea Biosciences Inc N-(aryloamino)sulfonamidowe inhibitory mek
EP1928506A4 (en) 2005-08-19 2009-10-21 Abbott Lab IMMUNOGLOBULIN HAVING TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF
CN101356195B (zh) 2005-12-08 2013-04-03 米德列斯公司 抗岩藻糖基-gm1的人单克隆抗体及使用抗岩藻糖基-gm1抗体的方法
EP1806365A1 (en) 2006-01-05 2007-07-11 Boehringer Ingelheim International GmbH Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them
EP1996716B1 (en) 2006-03-20 2011-05-11 The Regents of the University of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting
JP5165672B2 (ja) 2006-03-29 2013-03-21 キングス カレッジ ロンドン Ｔｓｈｒに対するアゴニスト抗体
TWI395754B (zh) 2006-04-24 2013-05-11 Amgen Inc 人類化之ｃ-ｋｉｔ抗體
WO2008040362A2 (en) 2006-10-04 2008-04-10 Københavns Universitet Generation of a cancer-specific immune response toward muc1 and cancer specific muc1 antibodies
FR2906808B1 (fr) 2006-10-10 2012-10-05 Univ Nantes Utilisation d'anticorps monoclonaux specifiques de la forme o-acetylee du ganglioside gd2 dans le traitement de certains cancers
WO2008101234A2 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Anti ganglioside gd3 antibodies and uses thereof
WO2008103645A2 (en) 2007-02-19 2008-08-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Prostate cancer and melanoma antigens
US20100158927A1 (en) 2007-03-29 2010-06-24 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibodies, methods and kits for diagnosing and treating melanoma
US8163279B2 (en) 2007-04-13 2012-04-24 Stemline Therapeutics, Inc. IL3Rα antibody conjugates and uses thereof
MX2009011783A (es) 2007-04-30 2009-12-04 Genentech Inc Inhibidores de iap.
JP2010190572A (ja) 2007-06-01 2010-09-02 Sapporo Medical Univ ＩＬ１３Ｒａ２に対する抗体およびこれを含む診断・治療薬
DK2170959T3 (da) 2007-06-18 2014-01-13 Merck Sharp & Dohme Antistoffer mod human programmeret dødsreceptor pd-1
US8344112B2 (en) 2007-07-31 2013-01-01 Merck Sharp & Dohme Limited IGF-1R specific antibodies useful in the detection and diagnosis of cellular proliferative disorders
AR068402A1 (es) 2007-09-12 2009-11-18 Genentech Inc Combinaciones de compuestos inhibidores de fosfoinositida 3-quinasa y agentes quimioterapeuticos y los metodos de uso
PL2195017T3 (pl) 2007-10-01 2015-03-31 Bristol Myers Squibb Co Ludzkie antyciała, które wiążą mezotelinę i ich zastosowania
ES2439705T3 (es) 2007-10-25 2014-01-24 Genentech, Inc. Proceso para la preparación de compuestos de tienopirimidina
US9023351B2 (en) 2007-11-26 2015-05-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Anti-mesothelin antibodies and uses thereof
ES2639857T3 (es) 2008-02-11 2017-10-30 Cure Tech Ltd. Anticuerpos monoclonales para el tratamiento del tumor
US8168757B2 (en) 2008-03-12 2012-05-01 Merck Sharp & Dohme Corp. PD-1 binding proteins
AR071891A1 (es) 2008-05-30 2010-07-21 Imclone Llc Anticuerpos humanos anti-flt3 (receptor tirosina cinasa 3 tipo fms humano)
US8168784B2 (en) 2008-06-20 2012-05-01 Abbott Laboratories Processes to make apoptosis promoters
CA2734908A1 (en) 2008-08-25 2010-03-11 Amplimmune, Inc. Compositions of pd-1 antagonists and methods of use
JP2012503203A (ja) 2008-09-19 2012-02-02 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション 基底乳癌腫の診断および処置のためのｃｓｐｇ４に対するモノクローナル抗体
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
PT2406284T (pt) 2009-03-10 2016-09-29 Biogen Ma Inc Anticorpos anti-bcma
EP2426148B1 (en) 2009-04-27 2015-08-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-il-3ra antibody for use in treatment of blood tumor
KR101790802B1 (ko) 2009-09-03 2017-10-27 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 항-ｇｉｔｒ 항체
US8956828B2 (en) 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
RU2673908C2 (ru) 2009-12-02 2018-12-03 Имэджинэб, Инк. Мини-антитела j591 и цис-диатела для направленной доставки простата-специфичного мембранного антигена (psma) человека и способы их применения
ES2573642T3 (es) 2009-12-23 2016-06-09 Synimmune Gmbh Anticuerpos anti-FLT3 y métodos de usar los mismos
KR101580713B1 (ko) 2010-02-24 2015-12-29 이뮤노젠 아이엔씨 엽산염 수용체 1 항체와 면역접합체 및 이들의 용도
WO2011159847A2 (en) 2010-06-15 2011-12-22 The Regents Of The University Of California Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ror1) single chain fv antibody fragment conjugates and methods of use thereof
AU2011268110B2 (en) 2010-06-19 2016-05-19 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Anti-GD2 antibodies
JP6050230B2 (ja) 2010-07-21 2016-12-21 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｈｌａ遺伝子座の修飾のための方法及び組成物
US9493740B2 (en) 2010-09-08 2016-11-15 Baylor College Of Medicine Immunotherapy of cancer using genetically engineered GD2-specific T cells
US20130273055A1 (en) 2010-11-16 2013-10-17 Eric Borges Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
BR122021026169B1 (pt) 2010-12-09 2023-12-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Uso de uma célula
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
KR20140033029A (ko) 2011-04-01 2014-03-17 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터 에이치엘에이 에이2에 의해 제공된 더블유티1 펩타이드에 특이적인 티 세포 수용체 유사 항체
CA2832540C (en) 2011-04-08 2020-09-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-epidermal growth factor receptor variant iii chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
RU2625034C2 (ru) 2011-04-20 2017-07-11 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи Антитела и другие молекулы, которые связывают в7-н1 и pd-1
US20130101599A1 (en) 2011-04-21 2013-04-25 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bcma-based stratification and therapy for multiple myeloma patients
AR086044A1 (es) 2011-05-12 2013-11-13 Imclone Llc Anticuerpos que se unen especificamente a un dominio extracelular de c-kit y usos de los mismos
LT3415531T (lt) 2011-05-27 2023-09-25 Glaxo Group Limited Bcma (cd269/tnfrsf17) – surišantys baltymai
UA112434C2 (uk) 2011-05-27 2016-09-12 Ґлаксо Ґруп Лімітед Антигензв'язувальний білок, який специфічно зв'язується з всма
ES2795023T3 (es) 2011-09-16 2020-11-20 Baylor College Medicine Reconocimiento específico del microambiente tumoral mediante el uso de células NKT manipuladas
AU2012308205A1 (en) 2011-09-16 2014-03-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA engineered T cells for the treatment of cancer
ITMO20110270A1 (it) 2011-10-25 2013-04-26 Sara Caldrer Una cellula effettrice modificata per il trattamento di neoplasie esprimenti il disialonganglioside gd2
WO2013063419A2 (en) 2011-10-28 2013-05-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania A fully human, anti-mesothelin specific chimeric immune receptor for redirected mesothelin-expressing cell targeting
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
US10391126B2 (en) 2011-11-18 2019-08-27 Board Of Regents, The University Of Texas System CAR+ T cells genetically modified to eliminate expression of T-cell receptor and/or HLA
US9439768B2 (en) 2011-12-08 2016-09-13 Imds Llc Glenoid vault fixation
EP2814846B1 (en) 2012-02-13 2020-01-08 Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
WO2013126712A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for generating a persisting population of t cells useful for the treatment of cancer
EP2828290B1 (en) 2012-03-23 2018-08-15 The United States of America, represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Anti-mesothelin chimeric antigen receptors
WO2013151649A1 (en) 2012-04-04 2013-10-10 Sialix Inc Glycan-interacting compounds
EP3689383A1 (en) 2012-04-11 2020-08-05 The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen
RU2673153C2 (ru) 2012-04-20 2018-11-22 АПТЕВО РИСЁРЧ ЭНД ДИВЕЛОПМЕНТ ЭлЭлСи Полипептиды, связывающиеся с cd3
KR20150006000A (ko) 2012-05-01 2015-01-15 제넨테크, 인크. 항-pmel17 항체 및 면역접합체
PT2850106T (pt) 2012-05-18 2022-07-18 Aptevo Res & Development Llc Imunofusão biespecífica (bif) de scfv de ligação a cd123 e cd3
PE20150336A1 (es) 2012-05-25 2015-03-25 Univ California Metodos y composiciones para la modificacion de adn objetivo dirigida por arn y para la modulacion de la transcripcion dirigida por arn
WO2013192294A1 (en) 2012-06-20 2013-12-27 Boston 3T Biotechnologies, Inc. Cellular therapies for treating and preventing cancers and other immune system disorders
WO2014031687A1 (en) 2012-08-20 2014-02-27 Jensen, Michael Method and compositions for cellular immunotherapy
US10189906B2 (en) 2012-11-01 2019-01-29 Max-Delrück-Centrum Für Molekulare Medizin Antibody that binds CD269 (BCMA) suitable for use in the treatment of plasma cell diseases such as multiple myeloma and autoimmune diseases
TW201425336A (zh) 2012-12-07 2014-07-01 Amgen Inc Ｂｃｍａ抗原結合蛋白質
US9243058B2 (en) 2012-12-07 2016-01-26 Amgen, Inc. BCMA antigen binding proteins
ES2786193T3 (es) 2012-12-12 2020-10-09 Broad Inst Inc Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones enzimáticas mejorados para la manipulación de secuencias
EP3252160B1 (en) 2012-12-12 2020-10-28 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
US20160008399A1 (en) 2013-01-14 2016-01-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for delivery of immune cells to treat un-resectable or non-resected tumor cells and tumor relapse
EP2953972B1 (en) 2013-02-05 2020-07-08 EngMab Sàrl Method for the selection of antibodies against bcma
RU2019137208A (ru) 2013-02-20 2020-02-19 Новартис Аг ЛЕЧЕНИЕ РАКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ХИМЕРНОГО АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКОГО РЕЦЕПТОРА НА ОСНОВЕ ГУМАНИЗИРОВАННОГО АНТИТЕЛА ПРОТИВ EGFRvIII
ES2814962T3 (es) 2013-02-20 2021-03-29 Novartis Ag Fijación eficaz como objetivo de la leucemia humana primaria utilizando células T modificadas con receptor de antígeno quimérico anti-CD123
US20160031996A1 (en) 2013-03-14 2016-02-04 Csl Limited Anti il-3r alpha agents and uses thereof
US20160046718A1 (en) 2013-03-14 2016-02-18 Csl Limited Agents that neutralize il-3 signalling and uses thereof
AR095374A1 (es) 2013-03-15 2015-10-14 Amgen Res (Munich) Gmbh Moléculas de unión para bcma y cd3
US9657105B2 (en) 2013-03-15 2017-05-23 City Of Hope CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
CA2913052A1 (en) 2013-05-24 2014-11-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptor-targeting monoclonal antibodies
AR097306A1 (es) 2013-08-20 2016-03-02 Merck Sharp & Dohme Modulación de la inmunidad tumoral
TW201605896A (zh) 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
WO2015048577A2 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions
RU2714902C2 (ru) 2013-12-19 2020-02-20 Новартис Аг Химерные рецепторы антигена против мезотелина человека и их применение
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
EP3102609A4 (en) 2014-02-04 2017-08-23 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Methods for producing autologous t cells useful to treat b cell malignancies and other cancers and compositions thereof
EP3131927B8 (en) 2014-04-14 2020-12-23 Cellectis Bcma (cd269) specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
RU2741899C2 (ru) 2014-04-25 2021-01-29 Блубёрд Био, Инк. Улучшенные способы производства средств адоптивной клеточной терапии
EP3998278A1 (en) 2014-04-25 2022-05-18 2seventy bio, Inc. Mnd promoter chimeric antigen receptors
IL248257B1 (en) 2014-04-30 2024-04-01 Max Delbruck Centrum Fur Molekulare Medizin In Der Helmholtz Gemeinschaft Human antibodies against CD269(BCMA)
US20170073415A1 (en) 2014-05-12 2017-03-16 Numab Ag Novel multispecific molecules and novel treatment methods based on such multispecific molecules
RS61678B1 (sr) 2014-05-28 2021-05-31 Agenus Inc Anti-gitr antitela i postupci za njihovu primenu
KR20230008915A (ko) 2014-06-06 2023-01-16 2세븐티 바이오, 인코포레이티드 개선된 t 세포 조성물
WO2015187835A2 (en) 2014-06-06 2015-12-10 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) and uses thereof
RU2741120C2 (ru) 2014-07-21 2021-01-22 Новартис Аг Лечение рака с использованием химерного антигенного рецептора cll-1
CN107109419B (zh) 2014-07-21 2020-12-22 诺华股份有限公司 使用cd33嵌合抗原受体治疗癌症
MX2017001011A (es) 2014-07-21 2018-05-28 Novartis Ag Tratamiento de cancer de usando un receptor quimerico de antigeno anti-bcma.
CA2956002C (en) 2014-07-24 2023-06-27 Bluebird Bio, Inc. Bcma chimeric antigen receptors
EP2982692A1 (en) 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
SG11201700770PA (en) 2014-08-19 2017-03-30 Novartis Ag Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
EP3201232A1 (en) 2014-10-03 2017-08-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) antibodies and methods of use thereof
MA41044A (fr) 2014-10-08 2017-08-15 Novartis Ag Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer
EP3023437A1 (en) 2014-11-20 2016-05-25 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
EP3029068A1 (en) 2014-12-03 2016-06-08 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA for use in the treatment of diseases
SG11201704549UA (en) 2014-12-05 2017-07-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen and uses thereof
RS61781B1 (sr) 2014-12-05 2021-06-30 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antitela koja ciljaju antigen za sazrevanje b-ćelija i postupci upotrebe
BR112017012502B1 (pt) 2014-12-12 2020-09-15 Bluebird Bio, Inc. Polinucleotídeo, polipeptídeo de car codificado pelo dito polinucleotídeo, vetor compreendendo o dito polinucleotídeo, composição compreendendo o dito vetor e método para geração de uma célula imune efetora compreendendo um car
IL303247A (en) 2014-12-29 2023-07-01 Novartis Ag Methods for preparing cells expressing a chimeric receptor antigen
WO2016130598A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. Bi-specific chimeric antigen receptor and uses thereof
JP2018510160A (ja) 2015-03-20 2018-04-12 ブルーバード バイオ， インコーポレイテッド ベクター製剤
MX2017012939A (es) 2015-04-08 2018-05-22 Novartis Ag Terapias cd20, terapias cd22 y terapias de combinacion con una celula que expresa un receptor quimerico de antigeno (car) de cd19.
EP3283520B1 (en) 2015-04-13 2020-05-06 Pfizer Inc Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen
TWI787645B (zh) 2015-04-13 2022-12-21 美商輝瑞股份有限公司 Ｃｄ３特異性抗體、治療性雙特異性抗體及其用途
CN107743586B (zh) 2015-06-03 2021-07-02 百时美施贵宝公司 用于癌症诊断的抗gitr抗体
CN115058395A (zh) 2015-06-25 2022-09-16 美商生物细胞基因治疗有限公司 嵌合抗原受体(car)、组合物及其使用方法
AU2016293942B2 (en) 2015-07-10 2022-06-16 Merus N.V. Human CD3 binding antibody
EP3322735A4 (en) 2015-07-15 2019-03-13 Zymeworks Inc. BISPECIFIC ANTIGEN-BINDING CONSTRUCTS CONJUGATED TO A MEDICINAL PRODUCT
MA42895A (fr) 2015-07-15 2018-05-23 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
KR20180031728A (ko) 2015-07-23 2018-03-28 인히브릭스 엘피 다가 및 다중특이적 gitr 결합 융합 단백질
PT3331910T (pt) 2015-08-03 2020-03-24 Engmab Sarl Anticorpos monoclonais contra o antigénio de maturação de células b (bcma) humano
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
JP2018522571A (ja) 2015-08-12 2018-08-16 メディミューン リミテッド Ｇｉｔｒｌ融合タンパク質およびその使用
MX2018002043A (es) 2015-08-17 2018-07-06 Janssen Pharmaceutica Nv ANTICUERPOS ANTI-BCMA, MOLí‰CULAS DE UNIí“N A ANTíGENOS BIESPECíFICAS QUE SE UNEN A BCMA Y CD3, Y USOS DE ESTOS.
US20190269727A1 (en) 2015-12-28 2019-09-05 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
CA3084476A1 (en) * 2017-10-19 2019-04-25 Cellectis Targeted gene integration of nk inhibitors genes for improved immune cells therapy

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021252920A1 (en) 2021-12-16
KR20230024967A (ko) 2023-02-21
AU2021288224A1 (en) 2023-01-05
EP4165169A1 (en) 2023-04-19
CA3185455A1 (en) 2021-12-16
IL298473A (en) 2023-01-01
US20230332104A1 (en) 2023-10-19
JP2023529211A (ja) 2023-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230312677A1 (en) Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
US20230139800A1 (en) Car t cell therapies with enhanced efficacy
CN110225927B (zh) 用于治疗癌症的嵌合抗原受体
AU2015292755B2 (en) Treatment of cancer using a CD33 chimeric antigen receptor
US20200048359A1 (en) Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
US20180298068A1 (en) Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
CN117959417A (zh) 嵌合抗原受体和pd-1抑制剂的组合疗法
KR20210031923A (ko) 3-(5-아미노-1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체 및 ikaros 패밀리 아연 핑거 2(ikzf2) 의존성 질환의 치료에서 이들의 용도
EP3171882A1 (en) Treatment of cancer using a cll-1 chimeric antigen receptor
KR20210129671A (ko) 3-(1-옥소-5-(피페리딘-4-일)이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체 및 이의 용도
KR20210129672A (ko) 치환된 3-(1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체 및 이의 용도
US20180092968A1 (en) Compositions to disrupt protein kinase a anchoring and uses thereof
CN116134027A (zh) 杂芳基取代的3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物及其用途
US20210179709A1 (en) Anti-car compositions and methods
TW202135858A (zh) 抗ＴＧＦβ抗體和檢查點抑制劑用於治療增殖性疾病之用途
US20230332104A1 (en) Zbtb32 inhibitors and uses thereof
US20200390811A1 (en) Compositions to disrupt protein kinase a anchoring and uses thereof
CN117098776A (zh) 抗TGFβ抗体和其他治疗剂用于治疗增殖性疾病的用途
JP2024513123A (ja) 増殖性疾患を治療するための抗ＴＧＦβ抗体及び他の治療薬の使用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination