KR20180031728A

KR20180031728A - 다가 및 다중특이적 gitr 결합 융합 단백질

Info

Publication number: KR20180031728A
Application number: KR1020187004964A
Authority: KR
Inventors: 존 씨. 티머; 카일 에스. 존스; 아미르 에스. 라자이; 아브라힘 후세인; 케이틀린 엠. 윌리스; 퀸 데브루; 브렌단 피. 에켈만
Original assignee: 인히브릭스 엘피
Priority date: 2015-07-23
Filing date: 2016-07-22
Publication date: 2018-03-28
Also published as: BR112018001161A2; TW201718630A; CN108650886A; AU2016297249B2; JP2018523493A; RU2018106452A3; JP6913682B2; AU2016297249A1; IL257030B2; TWI745296B; CA2992298A1; AR105767A1; US20190100594A1; WO2017015623A2; IL257030B; EP3325512A4; EP3325512B1; SG10201913807QA; MX2018000948A; IL257030A

Abstract

본 개시내용은 일반적으로 TNF 수용체 수퍼패밀리(TNFRSF)의 구성원인 글루코코르티코이드 유도된 TNFR 관련 단백질(GITR)과 특이적으로 결합하는 분자를 제공한다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 적어도 GITR에 결합하는 다가 및/또는 다중특이적 분자에 관한 것이다.

Description

다가 및 다중특이적 GITR 결합 융합 단백질

관련 출원

본 출원은 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 가출원 제62/195,822(2015년 7월 23일 출원)의 이익을 주장한다.

서열 목록의 포함

2016년 7월 22일에 생성되고 크기가 209 KB인, "INHI022001WO_ST25.txt"로 명명된 텍스트 파일의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

발명의 분야

종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리는 구조적으로 관련된 여러 세포 표면 수용체로 이루어진다. 다량체 리간드에 의한 활성화는 이들 수용체 중 많은 수용체의 공통적인 특징이다. TNFRSF의 많은 구성원은 적절하게 활성화되면, 많은 병상에서 치료 효용을 갖는다. 중요한 것은, 이 수용체 패밀리를 적절하게 효능화(agonizing)하는 것은 종종 고차원 클러스터링(clustering)을 필요로 하고, 통상적인 2가 항체는 이를 위해 이상적이지 않다는 것이다. 따라서, TNFRSF의 보다 효과적인 효능제(agonist) 분자에 대한 치료를 위한 필요성이 존재한다.

발명의 요약

본 개시내용은 적어도 글루코코르티코이드 유도된 TNFR 관련 단백질(GITR, 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 18(TNFRSF18) 및/또는 활성화 유도성 TNFR 패밀리 수용체(AITR)로도 알려짐)에 결합하는 다가 TNF 수용체 수퍼패밀리(TNFRSF) 결합 융합 폴리펩티드를 제공한다. 적어도 GITR에 결합하는 이들 분자는 본원에서 "GITR 표적화 분자" 또는 "GITR 표적화 융합체" 또는 "GITR 표적화 단백질" 또는 "GITR 표적화 융합 폴리펩티드" 또는 "GITR 표적화 융합 단백질"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, GITR 표적화 분자는 다가 분자, 예를 들어 다가 GITR 표적화 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, GITR 표적화 분자는 다중특이적 분자, 예를 들어 다중특이적 GITR 표적화 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, GITR 표적화 분자는 다가 및 다중특이적 분자, 예를 들어 다가 및 다중특이적 GITR 표적화 융합 단백질이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "융합 단백질" 또는 "융합 폴리펩티드" 또는 "GITR 표적화 융합 단백질" 또는 "GITR 표적화 융합 폴리펩티드"는 달리 구체적으로 표시되지 않는 한, 다가 융합 단백질, 다중특이적 융합 단백질, 또는 다가 및 다중특이적 융합 단백질을 포함하고 이로 제한되지 않는, 본 개시내용의 임의의 융합 단백질 실시양태를 지칭한다.

이들 GITR 표적화 분자는 본원에서 "GITR 결합 도메인"(GITR-BD)으로 지칭되는, GITR에 결합하는 적어도 하나의 도메인을 포함한다. 이들 GITR-BD는 GITR에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, GITR-BD는 항체 또는 예를 들어 scFv, Fab, 단일 도메인 항체(sdAb), V_NAR, 또는 VHH를 포함하는 항체 단편이거나 이로부터 유래된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, GITR-BD는 인간 또는 인간화된 sdAb를 포함한다.

본 개시내용의 GITR 표적화 분자는 GITR을 포함하는 TNF 수용체 수퍼패밀리(TNFRSF)의 구성원을 표적으로 하는 통상적인 항체로부터의 문제점 및 한계를 극복한다. TNFRSF의 구성원을 표적으로 하는 통상적인 항체는 DR4, DR5, GITR 및 OX40에 대한 활성 항체에서 Fc-감마 수용체 (FcγR)에 대한 필요성에 의해 입증된 바와 같이, 충분한 효능제 활성을 달성하기 위해서는 외인성 가교결합을 필요로 하는 것으로 밝혀졌다([Ichikawa et al 2001 al Nat. Med. 7, 954-960], [Li et al 2008 Drug Dev. Res. 69, 69-82]; [Pukac et al 2005 Br. J. Cancer 92, 1430-1441]; [Yanda et al 2008 Ann. Oncol. 19, 1060-1067]; [Yang et al 2007 Cancer Lett. 251:146-157]; [Bulliard et al 2013 JEM 210(9): 1685]; [Bulliard et al 2014 Immunol and Cell Biol 92: 475-480]). FcγR을 통한 가교결합 이외에, 올리고머 리간드 또는 항체 결합체(예를 들어, 단백질 A 및 2차 항체)의 첨가를 비롯한 다른 외인성 작용제(agent)가 항-TNFRSF 항체 클러스터링 및 하류 신호전달을 향상시키는 것으로 입증되었다. 예를 들어, DR5 리간드 TRAIL의 첨가는 항-DR5 항체의 세포자멸(apoptosis) 유발 능력을 향상시켰다 (Graves et al 2014 Cancer Cell 26: 177-189). 이러한 발견은 이량체를 넘어서는 TNFRSF의 클러스터링의 필요성을 시사한다.

본 개시내용은 GITR에 특이적으로 결합하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 항체 또는 예를 들어 scFv, Fab, 단일 도메인 항체(sdAb), V_NAR, 또는 VHH를 포함하는 항체 단편으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 인간 또는 인간화된 sdAb이다. sdAb 단편은 VHH, V_NAR, 조작된 VH 또는 VK 도메인으로부터 유래될 수 있다. VHH는 낙타류(camelid) 중쇄 단독 항체로부터 생성될 수 있다. V_NAR은 연골 어류 중쇄 단독 항체로부터 생성될 수 있다. 계면 공학 및 특정 생식계열 패밀리의 선택을 비롯하여, 종래의 이종이량체 VH 및 VK 도메인으로부터 단량체 sdAb를 생성하기 위한 다양한 방법이 수행되었다. 다른 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 비항체 스캐폴드 단백질, 비제한적인 예를 들어 설계된 안키린 반복 단백질(다르핀(darpin)), 아비머, 안티칼린/리포칼린, 센티린 및 피노머로부터 유래된다.

일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함한다.

본 개시내용은 또한 2개 이상의 TNFRSF 결합 도메인(TBD)을 포함하는 다가 TNFRSF 결합 융합 단백질을 제공하며, 여기서 적어도 하나의 TBD는 GITR에 결합하고, 이것은 본원에서 GITR 결합 도메인(GITR-BD)으로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 신생물 치료에서 유용성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 종양 세포 상에 발현된 TNFRSF 구성원, 예를 들어, 적어도 GITR에 결합한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 GITR-BD는 항체 또는 scFv, Fab, 단일 도메인 항체(sdAb), V_NAR, 또는 VHH를 포함하는 항체 단편으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, GITR-BD는 인간 또는 인간화된 sdAb이다. sdAb 단편은 VHH, V_NAR, 조작된 VH 또는 VK 도메인으로부터 유래될 수 있다. VHH는 낙타류 중쇄 단독 항체로부터 생성될 수 있다. V_NAR은 연골 어류 중쇄 단독 항체로부터 생성될 수 있다. 계면 공학 및 특정 생식계열 패밀리의 선택을 비롯하여, 종래의 이종이량체 VH 및 VK 도메인으로부터 단량체 sdAb를 생성하기 위한 다양한 방법이 수행되었다. 다른 실시양태에서, GITR-BD는 비항체 스캐폴드 단백질, 비제한적인 예를 들어 설계된 안키린 반복 단백질(다르핀), 아비머, 안티칼린/리포칼린, 센티린 및 피노머로부터 유래된다.

일반적으로, 본 개시내용의 다가 융합 단백질은 링커 폴리펩티드를 통해 작동 가능하게 연결된 적어도 2개 이상의 GITR-BD를 포함한다. 본 개시내용의 다가 융합 단백질 내의 특정 GITR-BD 서열로서 sdAb 단편의 이용은 많은 이중/다중특이적 항체 방법에 공통적인 중쇄:경쇄 미스페어링(mispairing) 문제를 피할 수 있는 이점을 갖는다. 또한, 본 개시내용의 다가 융합 단백질은 많은 이중특이적 항체가 필요로 하는 긴 링커의 사용을 회피한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 2개 이상의 상이한 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 3개 이상의 상이한 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 4개 이상의 상이한 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 5개 이상의 상이한 GITR-BD를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 6개 이상의 상이한 GITR-BD를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 GITR-BD의 다중 카피를 함유한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 GITR-BD의 적어도 2개의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 GITR-BD의 적어도 3개의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 GITR-BD의 적어도 4개의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 GITR-BD의 적어도 5개의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 GITR-BD의 적어도 6개의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 GITR-BD의 6개 이상의 카피를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피 및 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피 및 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피 및 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피 및 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피 및 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피 및 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피 및 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피 및 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피 및 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피 및 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 GITR-BD의 2개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 GITR-BD의 3개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 GITR-BD의 4개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 GITR-BD의 5개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 GITR-BD의 6개 이상의 카피 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 81-105로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 81-93으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 94-105로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 번호 81-105로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 번호 81-93으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 번호 94-105로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질 단백질은 서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 98의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 99의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 101의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 103의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 104의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 다가 GITR 표적화 융합 단백질은 4가이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 4가 GITR 표적화 분자는 2개의 GITR-BD를 포함하는 GITR 표적화 융합 단백질의 2개의 카피를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 4가 GITR 표적화 분자는 다음 구조를 갖는 GITR 표적화 융합 단백질의 2개의 카피를 포함한다: (GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-힌지-Fc. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 4가 GITR 표적화 분자는 다음 구조를 갖는 GITR 결합 융합 단백질의 2개의 카피를 포함한다: (GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-힌지-Fc (여기서 GITR-BD는 GITR에 결합하는 단리된 폴리펩티드 서열이다). 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 4가 GITR 표적화 분자는 다음 구조를 갖는 GITR 결합 융합 단백질의 2개의 카피를 포함한다: (GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-힌지-Fc (여기서 GITR-BD는 GITR에 결합하는 sdAb 서열이다). 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 4가 GITR 표적화 분자는 다음 구조를 갖는 GITR 결합 융합 단백질의 2개의 카피를 포함한다: (GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-힌지-Fc (여기서 GITR-BD는 GITR에 결합하는 인간화된 또는 완전 인간 sdAb 서열이다). 일부 실시양태에서, GITR-BD는 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4가 GITR 표적화 분자는 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 4가 GITR 표적화 분자는 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 4가 GITR 표적화 분자는 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 4가 GITR 표적화 분자는 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 4가 GITR 표적화 분자는 서열 번호 81-93으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 2개의 카피를 포함한다.

일부 실시양태에서, 다가 GITR 표적화 융합 단백질은 6가이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 6가 GITR 표적화 분자는 3개의 GITR-BD를 포함하는 GITR 표적화 융합 단백질의 2개의 카피를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 6가 GITR 표적화 분자는 다음 구조를 갖는 GITR 표적화 융합 단백질의 2개의 카피를 포함한다: (GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-힌지-Fc. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 6가 GITR 표적화 분자는 다음 구조를 갖는 GITR 표적화 융합 단백질의 2개의 카피를 포함한다: (GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-힌지-Fc (여기서 GITR-BD는 GITR에 결합하는 단리된 폴리펩티드 서열이다). 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 6가 GITR 표적화 분자는 다음 구조를 갖는 GITR 표적화 융합 단백질의 2개의 카피를 포함한다: (GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-힌지-Fc (여기서 GITR-BD는 GITR에 결합하는 sdAb 서열이다). 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 6가 GITR 표적화 분자는 다음 구조를 갖는 GITR 표적화 융합 단백질의 2개의 카피를 포함한다: (GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-힌지-Fc (여기서 GITR-BD는 인간화된 또는 완전 인간 sdAb 서열이다). 일부 실시양태에서, 4가 GITR 표적화 분자는 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 4가 GITR 표적화 분자는 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 4가 GITR 표적화 분자는 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 4가 GITR 표적화 분자는 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 4가 GITR 표적화 분자는 서열 번호 94-105로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

본 개시내용의 다가 융합 단백질은 비가교결합된 2가 항체에 비해 TNFRSF 구성원의 클러스터링을 향상시킬 수 있다. 본 개시내용의 다가 융합 단백질에 의해 매개되는 TNFRSF 구성원의 향상된 클러스터링은 비가교결합된 2가 항체에 비해 향상된 TNFRSF 의존성 신호전달을 유도한다. 대부분의 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 2개 초과의 GITR-BD, 예를 들어 3개, 4개, 5개 또는 6개를 포함할 것이다. 이들 실시양태에서, 비-TNFRSF 항원의 상호작용은 추가의 가교결합 기능을 제공할 수 있고, TNFRSF 활성화는 단지 1개 또는 2개의 TBD로 달성된다.

일부 실시양태에서, 다가 융합 단백질은 또한 하나 이상의 GITR-BD 및 GITR 이외의 다른 표적에 결합하는 하나 이상의 추가의 결합 도메인(들)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가의 다중특이적 융합 단백질은 또한 하나 이상의 GITR-BD 및 비-TNFRSF 구성원 항원에 대한 하나 이상의 추가의 결합 도메인(들)을 포함한다. 이들 중 임의의 실시양태에서, 다가의 다중특이적 융합 단백질은 또한 본원에서 TNFRSF-결합 도메인(TBD)으로 지칭되는 TNFRSF 구성원에 대한 하나 이상의 추가의 결합 도메인(들)을 포함할 수 있다. 이들 중 임의의 실시양태에서, 비-TNFRSF 항원의 상호작용은 추가의 가교결합 기능을 제공할 수 있고, TNFRSF 활성화는 단지 1 또는 2개의 GITR-BD 또는 단지 1 또는 2개의 GITR-BD 및 TBD만으로 달성된다.

일부 실시양태에서, 다가의 다중특이적 융합 단백질은 또한 본원에서 TNFRSF- 결합 도메인(TBD)으로 지칭되는, TNFRSF 구성원에 대한 하나 이상의 추가의 결합 도메인(들)을 포함한다. 이들 실시양태에서, 다가의 다중특이적 융합 단백질은 적어도 2개의 별개의 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 다가의 다중특이적 융합 단백질의 모든 TBD는 주어진 TNFRSF 구성원 상의 동일한 에피토프를 인식한다. 예를 들어, 본 개시내용의 다가의 다중특이적 융합 단백질은 주어진 TNFRSF 구성원에 대해 동일한 특이성을 갖는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 TBD를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 다가의 다중특이적 융합 단백질은 주어진 TNFRSF 구성원 상의 별개의 에피토프를 인식하는 TBD를 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 다가의 다중특이적 융합 단백질은 GITR, CD40 또는 CD137 상의 다양한 에피토프에 대해 별개의 인식 특이성을 갖는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 TBD를 포함할 수 있다. 이들 실시양태에서, 본 개시내용의 다가의 다중특이적 융합 단백질은 특정 TNFRSF 구성원의 별개의 영역을 표적으로 하는 다수의 TBD를 함유한다. 일부 실시양태에서, TBD는 동일한 TNFRSF 구성원 상의 상이한 에피토프를 인식할 수 있거나 또는 별개의 TNFRSF 구성원 상의 에피토프를 인식할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용은 GITR 및 OX40에 결합하는 TBD를 포함하는 다가의 다중특이적 융합 단백질을 제공한다.

다른 실시양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 GITR 및 비제한적인 예로서 OX40, CD27, HVEM, CD40, 림프독소 베타 수용체(LTBR), 엑토디스플라신(ectodysplasin) A2 수용체(ED2R), 엑토디스플라신 A 수용체(EDAR), TweakR, BCMA, BAFFR, DR3, DR6 또는 CD137과 같은 비종양 세포 상에 발현된 제2 TNFRSF 구성원에 결합하는 다중특이적 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질은 또한 다가이다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질은 이중특이적이다. 이들 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이적 융합 단백질은 면역 세포를 조절하여 종양 파괴를 향상시킨다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이적 융합 단백질은 염증성 병태를 치료하는데 유용하다. 이들 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이적 융합 단백질은 면역 세포를 조절하여 염증성 손상(inflammatory insult)을 약화한다. 예를 들어, TNFR2를 특이적으로 효능화하면, Treg의 증식을 향상시켜 면역 억제를 유도할 수 있다.

일부 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질은 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질은 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질은 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질은 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질은 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD 및 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 함유한다.

본 개시내용의 다중특이적 융합 단백질은 비가교결합된 2가 항체에 비해 TNFRSF 구성원의 클러스터링을 향상시킬 수 있다. 본 개시내용의 다중특이적 융합 단백질에 의해 매개되는 TNFRSF 구성원의 향상된 클러스터링은 비가교결합된 2가 항체에 비해 향상된 TNFRSF 의존성 신호전달을 유도한다. 대부분의 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질은 2개 초과의 TBD, 예를 들어 3개, 4개, 5개 또는 6개를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질은 TBD 및 비-TNFRSF 구성원 항원에 대한 결합 도메인을 포함할 것이다. 이들 실시양태에서, 비-TNFRSF 항원의 상호작용은 추가의 가교결합 기능을 제공할 수 있고, TNFRSF 활성화는 단지 1개 또는 2개의 TBD로 달성된다. 이들 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질은 다중특이적이고, 2개의 별개의 항원에 결합한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 TBD는 항체 또는 scFv, Fab, 단일 도메인 항체(sdAb), V_NAR, 또는 VHH를 포함하는 항체 단편으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, TBD는 인간 또는 인간화된 sdAb이다. sdAb 단편은 VHH, V_NAR, 조작된 VH 또는 VK 도메인으로부터 유래될 수 있다. VHH는 낙타류 중쇄 단독 항체로부터 생성될 수 있다. V_NAR은 연골 어류 중쇄 단독 항체로부터 생성될 수 있다. 계면 공학 및 특정 생식계열 패밀리의 선택을 비롯하여, 종래의 이종이량체 VH 및 VK 도메인으로부터 단량체 sdAb를 생성하기 위한 다양한 방법이 수행되었다. 다른 실시양태에서, TBD는 비항체 스캐폴드 단백질, 비제한적인 예를 들어 설계된 안키린 반복 단백질(다르핀), 아비머, 안티칼린/리포칼린, 센티린 및 피노머로부터 유래된다.

일반적으로, 본 개시내용의 다중특이적 융합 단백질은 링커 폴리펩티드를 통해 작동 가능하게 연결된 적어도 2개의 TBD로 이루어진다. 본 개시내용의 다중특이적 융합체 내의 특정 TBD로서 sdAb 단편의 이용은 많은 이중/다중특이적 항체 방법에 공통적인 중쇄:경쇄 미스페어링 문제를 피할 수 있는 이점을 갖는다. 또한, 본 개시내용의 다중특이적 융합 단백질은 많은 이중특이적 항체가 필요로 하는 긴 링커의 사용을 회피한다.

일부 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질의 모든 TBD는 주어진 TNFRSF 구성원 상의 동일한 에피토프를 인식한다. 예를 들어, 본 개시내용의 다중특이적 융합 단백질은 GITR에 대한 동일한 특이성을 갖는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 TBD를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 다중특이적 융합 단백질은 주어진 TNFRSF 구성원 상의 별개의 에피토프를 인식하는 TBD를 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 다중특이적 융합 단백질은 GITR, CD40 또는 CD137 상의 다양한 에피토프에 대해 별개의 인식 특이성을 갖는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 TBD를 포함할 수 있다. 이들 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이적 융합 단백질은 특정 TNFRSF 구성원의 별개의 영역을 표적으로 하는 다수의 TBD를 함유한다. 일부 실시양태에서, TBD는 동일한 TNFRSF 구성원 상의 상이한 에피토프를 인식할 수 있거나 또는 별개의 TNFRSF 구성원 상의 에피토프를 인식할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용은 GITR 및 OX40에 결합하는 TBD를 포함하는 다중특이적 융합 단백질을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질, 예를 들어 다가 및/또는 다중특이적 융합 단백질은 단일 폴리펩티드로 이루어진다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 하나 초과의 폴리펩티드로 이루어진다. 예를 들어, 이종이량체 도메인은 구축물이 비대칭 융합 단백질이 되도록 융합 단백질 내에 포함된다. 예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역이 융합 단백질에 포함되면, CH3 도메인은 동종이량체화 도메인으로 사용될 수 있거나, CH3 이량체 계면 영역이 이종이량체화를 가능하게 하도록 돌연변이될 수 있다.

일부 실시양태에서, 융합 단백질은 TBD 및/또는 GITR-BD를 융합 단백질의 대향 말단에 함유한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, TBD 및/또는 GITR-BD는 융합 단백질의 아미노 말단(N 말단) 부분 및 융합 단백질의 카르복시 말단(C 말단) 부분 둘 모두에 위치한다. 다른 실시양태에서, 모든 TBD 및/또는 GITR-BD는 융합 단백질의 동일한 말단에 존재한다. 예를 들어, TBD 및/또는 GITR-BD는 융합 단백질의 아미노 또는 카르복실 말단 부분에 존재한다.

일부 실시양태에서, 융합 단백질은 면역글로불린 Fc 영역을 함유한다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG1 이소형, IgG2 이소형, IgG3 이소형 및 IgG4 서브클래스로 이루어진 군으로부터 선택된 IgG 이소형이다.

일부 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 영역 또는 그의 면역학적 활성 단편은 IgG 이소형이다. 예를 들어, 융합 단백질의 면역글로불린 Fc 영역은 다음 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG1 이소형의 것이다:

일부 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 영역 또는 그의 면역학적 활성 단편은 서열 번호 1의 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인간 IgG1 폴리펩티드 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 인간 IgG1 Fc 영역은 융합 단백질의 글리코실화를 방지하기 위해 아미노산 Asn297(Boxed, 카바트 넘버링(Kabat Numbering))에서 변형된다(예를 들어, Asn297Ala(N297A) 또는 Asn297Asp(N297D)). 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 Fc 영역은 Fc 수용체 상호작용을 변경하기 위해 아미노산 Leu235(Boxed, 카바트 넘버링)에서 변형된다(예를 들어, Leu235Glu(L235E) 또는 Leu235Ala(L235A)). 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 Fc 영역은 Fc 수용체 상호작용을 변경하기 위해 아미노산 Leu234(Boxed, 카바트 넘버링)에서 변형된다(예를 들어, Leu234Ala(L234A)). 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 Fc 영역은 Fc 수용체 상호작용을 변경하기 위해 아미노산 Leu234(Boxed, 카바트 넘버링)에서 변형된다(예를 들어, Leu235Glu(L235E)). 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 Fc 영역은 아미노산 234 및 235에서 변경된다(예를 들어, Leu234Ala 및 Leu235Ala(L234A/L235A) 또는 Leu234Val 및 Leu235Ala(L234V/L235A)). 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 Fc 영역은 Fc 수용체 결합을 감소시키기 위해 Gly235에서 변경된다. 예를 들어, Gly235는 융합 단백질로부터 결손된다. 일부 실시양태에서, 인간 IgG1 Fc 영역은 CD32A와의 상호작용을 향상시키기 위해 아미노산 Gly236에서 변형된다(예를 들어, Gly236Ala(G236A)). 일부 실시양태에서, 인간 IgG1 Fc 영역에는 Lys447(문헌 [Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest]의 EU 인덱스)이 결여되어 있다.

일부 실시양태에서, 융합 단백질의 Fc 영역은 Fc 수용체 결합을 감소시키기 위해 다음 위치 중 하나 이상에서 변경된다: Leu234(L234), Leu235(L235), Asp265(D265), Asp270(D270), Ser298(S298), Asn297(N297), Asn325(N325) 또는 Ala327(A327)이다. 예를 들어, Leu234Ala(L234A), Leu235Ala(L235A), Asp265Asn(D265N), Asp270Asn(D270N), Ser298Asn(S298N), Asn297Ala(N297A), Asn325Glu(N325E) 또는 Ala327Ser(A327S). 바람직한 실시양태에서, Fc 영역 내의 변형은 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합에 대한 영향을 최소화하면서 Fc-수용체-감마 수용체에 대한 결합을 감소시킨다.

일부 실시양태에서, 융합 단백질의 Fc 영역은 Fc 수용체 결합을 감소시키기 위해 다음 위치 중 하나 이상에서 아미노산이 결여된다: Glu233(E233), Leu234(L234) 또는 Leu235(L235). 이들 실시양태에서, 이들 3개의 아미노산의 Fc 결손은 보체 단백질 C1q 결합을 감소시킨다. 이러한 변형된 Fc 영역 폴리펩티드는 본원에서 "Fc 결손" 폴리펩티드로 지칭된다.

일부 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 영역 또는 그의 면역학적 활성 단편은 서열 번호 2의 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인간 IgG1 폴리펩티드 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 융합 단백질의 면역글로불린 Fc 영역 또는 면역학적 활성 단편은 다음 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG2 이소형의 것이다:

일부 실시양태에서, 융합체 또는 그의 면역학적 활성 단편은 서열 번호 3의 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인간 IgG1 폴리펩티드 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 인간 IgG2 Fc 영역은 항체의 글리코실화를 방지하기 위해 아미노산 Asn297(Boxed)에서 변형된다(예를 들어, Asn297Ala(N297A) 또는 Asn297Asp(N297D)). 일부 실시양태에서, 인간 IgG2 Fc 영역에는 Lys447(문헌 [Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest]의 EU 인덱스)이 결여되어 있다.

일부 실시양태에서, 융합 단백질의 면역글로불린 Fc 영역 또는 면역학적 활성 단편은 다음 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG3 이소형의 것이다:

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 면역학적 활성 단편은 서열 번호 4의 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인간 IgG3 폴리펩티드 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 인간 IgG3 Fc 영역은 항체의 글리코실화를 방지하기 위해 아미노산 Asn297(Boxed, 카바트 넘버링)에서 변형된다(예를 들어, Asn297Ala(N297A) 또는 Asn297Asp(N297D)). 일부 실시양태에서, 인간 IgG3 Fc 영역은 반감기를 연장하기 위해 아미노산 435에서 변형된다(예를 들어, Arg435His(R435H)). 일부 실시양태에서, 인간 IgG3 Fc 영역에는 Lys447(문헌 [Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest]의 EU 인덱스)이 결여되어 있다.

일부 실시양태에서, 융합 단백질의 면역글로불린 Fc 영역 또는 면역학적 활성 단편은 다음 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG4 이소형의 것이다:

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 면역학적 활성 단편은 서열 번호 5의 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인간 IgG4 폴리펩티드 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 면역학적 활성 단편은 서열 번호 6의 아미노산 서열에 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인간 IgG4 폴리펩티드 서열을 포함한다.

다른 실시양태에서, 인간 IgG4 Fc 영역은 Fc 수용체 상호작용을 변경하기 위해 아미노산 235에서 변형된다(예를 들어, Leu235Glu(L235E)). 일부 실시양태에서, 인간 IgG4 Fc 영역은 항체의 글리코실화를 방지하기 위해 아미노산 Asn297(카바트 넘버링)에서 변형된다(예를 들어, Asn297Ala(N297A) 또는 Asn297Asp(N297D)). 일부 실시양태에서, 인간 IgG4 Fc 영역에는 Lys447(문헌 [Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest]의 EU 인덱스)이 결여되어 있다.

일부 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 FcRn 결합을 향상시키기 위해 변형된다. FcRn에 대한 결합을 향상시키는 Fc 돌연변이의 예는 Met252Tyr, Ser254Thr, Thr256Glu(각각 M252Y, S254T, T256E)(카바트 넘버링, [Dall' Acqua et al. 2006, J. Biol Chem Vol. 281(33) 23514-23524]), Met428Leu 및 Asn434Ser(M428L, N434S)(Zalevsky et al. 2010 Nature Biotech, Vol.28(2) 157-159), 또는 Met252Ile, Thr256Asp, Met428Leu(각각 M252I, T256D, M428L)(문헌 [Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest]의 EU 인덱스)이다.

본 개시내용의 융합 단백질이 Fc 폴리펩티드를 포함하는 일부 실시양태에서, Fc 폴리펩티드는 돌연변이되거나 변형된다. 이러한 실시양태에서, 돌연변이된 또는는 변형된 Fc 폴리펩티드는 카바트 넘버링 시스템을 사용하여 Met252Tyr 및 Met428Leu(M252Y, M428L)와 같은 돌연변이를 포함한다.

일부 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 변경하기 위해 변형된다(예를 들어, 문헌 [Natsume et al., 2008 Cancer Res, 68(10): 3863-72]; [Idusogie et al., 2001 J Immunol, 166(4): 2571-5]; [Moore et al., 2010 mAbs, 2(2): 181-189]; [Lazar et al., 2006 PNAS, 103(11): 4005-4010], [Shields et al., 2001 JBC, 276(9): 6591-6604]; [Stavenhagen et al., 2007 Cancer Res, 67(18): 8882-8890]; [Stavenhagen et al., 2008 Advan. Enzyme Regul, 48: 152-164]; [Alegre et al., 1992 J Immunol, 148: 3461-3468]에 기재되고, [Kaneko and Niwa, 2011 Biodrugs, 25(1):1-11]에서 검토된 아미노산 변형). ADCC를 향상시키는 돌연변이의 예는 Ser239 및 Ile332에서의 변형, 예를 들어 Ser239Asp 및 Ile332Glu(S239D, I332E)를 포함한다. CDC를 향상시키는 돌연변이의 예는 Lys326 및 Glu333에서의 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 카바트 넘버링 시스템을 사용하여 이들 위치 중 하나 또는 둘 모두에서 변형된다(예를 들어 Lys326Ala 및/또는 Glu333Ala(K326A 및 E333A)).

일부 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 이종이량체화를 유도하기 위해 변형된다. 예를 들어, 부피가 보다 큰 아미노산, 예를 들어 Try으로 교체되어 Thr366에서 CH3 도메인 내에 아미노산 변형(T366W)을 갖는 것은 위치 Thr366, Leu368 및 Tyr407에서 부피가 덜 큰 아미노산, 예를 들어 각각 Ser, Ala 및 Val으로의 아미노산 변형(T366S/L368A/Y407V)을 갖는 제2 CH3 도메인과 우선적으로 페어링할 수 있다. CH3 변형을 통한 이종이량체화는 예를 들어 대향 CH3 도메인 상의 Ser354를 Cys(S354C)으로, Y349를 Cys(Y349C)으로 변화시킴으로써 디술피드 결합을 도입하여 더욱 안정화될 수 있다(문헌 [Carter, 2001 Journal of Immunological Methods, 248: 7-15]에서 검토됨).

일부 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 이량체화를 방지하기 위해 변형된다. 이들 실시양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 단량체이다. 예를 들어, 잔기 Thr366에서 하전된 잔기로의 변형, 예를 들어 Thr366Lys, Thr366Arg, Thr366Asp, 또는 Thr366Glu(각각 T366K, T366R, T366D 또는 T366E)는 CH3-CH3 이량체화를 방지한다.

일부 실시양태에서, 융합 단백질의 Fc 영역은 Fc 수용체 결합을 감소시키기 위해 다음 위치 중 하나 이상에서 변경된다: Leu234(L234), Leu235(L235), Asp265(D265), Asp270(D270), Ser298(S298), Asn297(297), Asn325(N325) 또는 Ala327(A327). 예를 들어, Leu234Ala(L234A), Leu235Ala(L235A), Asp265Asn(D265N), Asp270Asn(D270N), Ser298Asn(S298N), Asn297Ala(N297A), Asn325Glu(N325E) 또는 Ala327Ser(A327S). 바람직한 실시양태에서, Fc 영역 내의 변형은 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합에 대한 영향을 최소화하면서 Fc-수용체-감마 수용체에 대한 결합을 감소시킨다.

일부 실시양태에서, 융합 단백질은 면역글로불린 힌지 영역으로부터 유래된 폴리펩티드를 함유한다. 힌지 영역은 임의의 인간 IgG 서브클래스로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 EPKSSDKTHTCPPC(서열 번호 7)의 서열을 갖는 변형된 IgG1 힌지를 함유할 수 있고, 여기서 경쇄의 C-말단 시스테인과 함께 디술피드를 형성하는 Cys220은 세린으로 돌연변이된다(예를 들어, Cys220Ser(C220S)). 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 서열 DKTHTCPPC(서열 번호 8)를 갖는 절두된 힌지를 함유한다.

일부 실시양태에서, 융합 단백질은 서열 ESKYGPPCPPC(서열 번호 9)를 갖는, 가닥 교환을 방지하거나 감소시키기 위해 변형된, IgG4로부터의 변형된 힌지, 예를 들어 Ser228Pro(S228P)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 링커 폴리펩티드를 함유한다. 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 링커 및 힌지 폴리펩티드를 함유한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 N297에 N-연결된 글리칸 사슬에 부착된 푸코스를 갖지 않거나 감소된 푸코스를 보유한다. FUT8 결핍 세포주에서의 생산; 포유동물 세포 배양 배지에 대한 억제제, 예를 들면 카스타노스페르민의 첨가; 생산 세포주의 대사 조작을 포함하고 이로 제한되지 않는, 푸코실화를 방지하기 위한 많은 방법이 있다.

일부 실시양태에서, TBD는 인간에서 발견된 기존재하는 항체에 의한 인식을 제거하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단일 도메인 항체는 위치 Leu11의 돌연변이, 예를 들어 Leu11Glu(L11E) 또는 Leu11Lys(L11K)에 의해 변형된다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 단일 도메인 항체는 카르복시 말단 영역의 변화에 의해 변형되고, 예를 들어 말단 서열은 GQGTLVTVKPGG(서열 번호 10) 또는 GQGTLVTVEPGG(서열 번호 11) 또는 그의 변형으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단일 도메인 항체는 위치 11의 돌연변이 및 카르복시 말단 영역의 변화에 의해 변형된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질의 TBD 및/또는 GITR-BD는 아미노산 링커를 통해 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 이들 링커는 본원에서 GS-링커로 표시되는 바와 같이 아미노산 글리신 및 세린으로 주로 구성된다. 본 개시내용의 융합 단백질의 GS-링커는 다양한 길이, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개의 아미노산 길이일 수 있다.

일부 실시양태에서, GS-링커는 GGSGGS, 즉 (GGS)₂(서열 번호 12); GGSGGSGGS, 즉 (GGS)₃(서열 번호 13); GGSGGSGGSGGS, 즉 (GGS)₄(서열 번호 14); 및 GGSGGSGGSGGSGGS, 즉 (GGS)₅(서열 번호 15)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 링커는 글리신 잔기, 예를 들어 비제한적인 예로서 GG, GGG, GGGG(서열 번호 16), GGGGG(서열 번호 17), 및 GGGGGG(서열 번호 18)를 포함하는 가요성 링커이다.

일부 실시양태에서, GITR 표적화 융합 단백질은 GS-링커 및 글리신 링커의 조합물을 포함한다.

도 1a는 본 개시내용의 예시적인 다가 융합 단백질의 개략도이다.
도 2a, 도 2b 및 도 2c는 유동 세포 계측에 의해 평가된, CHO 세포에서 발현된 GITR에 대한 GITR 표적화 융합 단백질의 결합을 보여주는 일련의 그래프이다. GITR 항체인 TRX-518을 이 연구의 대조군으로 사용하였다.
도 3a, 도 3b 및 도 3c는 GITRL과 GITR 사이의 상호작용을 차단하는 GITR 표적화 융합 단백질의 능력을 보여주는 일련의 그래프이다. 여기서, GITR 발현 CHO 세포 및 재조합 GITRL을 사용하는 유동 세포 계측 검정을 사용하여 차단 능력을 평가하였다. GITR 항체인 TRX-518을 이 연구의 대조군으로 사용하였다.
도 4a, 도 4b, 도 4c, 도 4d 및 도 4e는 유동 세포 계측에 의해 측정된, CHO 세포의 표면 상에 발현된 인간 GITR 및 시노몰거스 GITR("cyno GITR")에 대한, hzC06v1.1, hzC06v1.2, hzC06v1.3, hzC06v1.4, hzC06v2.1, hzC06v2.2, hzC06v2.3, hzC06v2.4, hzC06v3, hzC06v3.1, hzC06v3.2, hzC06v3.3, hzC06v3.4, hzC06v3.5, hzC06v3.6, hzC06v3.7, hzC06v3.8, hzC06v3.9, hzC06v3.10, hzC06v3.11, 및 hzC06v3.12로 언급된 본 개시내용의 GITR 표적화 분자의 결합을 나타내는 일련의 그래프이다.
도 5a, 도 5b, 도 5c, 도 5d 및 도 5e는 유동 세포 계측에 의해 측정된, CHO 세포의 표면 상에 발현된 인간 GITR 및 시노몰거스 GITR("cyno GITR")에 대한, hzC04v4.1, hzC04v4.1.2, hzC04v4.2, hzC04v4.2.2, hzC04v5, hzC04v1.2.1, hzC04v5.1, hzC04v5.2, hzC04v5.3, hzC04v5.4, hzC04v5.5, hzC04v5.6, hzC04v5.7, hzC04v5.8, hzC04v5.9, hzC04v5.10, hzC04v5.11, 및 hzC04v5.12로 언급된 본 개시내용의 GITR 표적화 분자의 결합을 나타내는 일련의 그래프이다.
도 6은 인간 IgG1 Fc 도메인에 융합된 단일 도메인 가변 영역(sdAb)의 2개의 직렬 카피(tandem copy)로 구축된 본 개시내용의 4가 항-GITR 분자의 개략도이다. 대리(surrogate) 분자는 마우스 IgG2a로부터 유래된 Fc 도메인으로 구축된다.
도 7은 본원에서 4가 hzC06-hIgG1로 언급된 본 개시내용의 항-GITR 분자의 1차 인간 T 세포에 대한 결합을 나타내는 그래프이다. 4가 hzC06-hIgG1은 서열 번호 93의 GITR 결합 분자의 2개의 카피로 구축되고, 상기 결합 분자는 다시 서열 번호 1의 인간 IgG1 Fc 도메인에 융합된 서열 번호 59의 단일 도메인 가변 영역(sdAb)의 2개의 직렬 카피로 구축된다.
도 8a 및 8b는 GITR을 발현하는 리포터 세포주에서 NF-kB 신호전달을 활성화하는 본 개시내용의 4가 GITR 표적화 분자의 능력을 나타내는 일련의 그래프이다.
도 9a, 9b 및 9c는 본 개시내용의 4가 GITR 표적화 분자를 사용한 처리가 투여일과 무관하게 CT26 종양 성장을 상당히 감소시켰음을 나타내는 일련의 그래프이다.
도 10은 본 개시내용의 4가 GITR 표적화 분자에 의한 CT26 종양 성장의 용량 의존성 억제를 나타내는 일련의 그래프이다.
도 11은 본 개시내용의 4가 GITR 표적화 분자에 의한 MC38 종양 성장의 용량 의존성 억제를 나타내는 일련의 그래프이다.
도 12a, 12b 및 12c는 CT26 종양 성장의 억제에 대한 Fc 기능의 영향을 나타내는 일련의 그래프이다.
도 13a, 13b 및 13c는 4가 GITR 표적화 분자를 사용한 처리가 CT26 종양 재-시험접종(re-challenge)에 대한 하위서열 내성을 갖는다는 것을 나타내는 일련의 그래프이다.
도 14a, 14b 및 14c는 본 개시내용의 4가 GITR 표적화 분자를 사용한 처리가 T_reg 빈도를 유의하게 감소시키고 종양 미세 환경 내의 T_reg 대 T_이펙터 세포의 비를 변경한다는 것을 나타내는 일련의 그래프이다.
도 15a 및 15b는 본 개시내용의 4가 GITR 표적화 분자를 사용한 처리가 CD8 T 세포 활성화 및 증식을 유의하게 유도한다는 것을 나타내는 일련의 그래프이다.

상세한 설명

본원은 TNF 수용체 수퍼패밀리(TNFRSF)의 구성원인 글루코코르티코이드 유도된 TNFR 관련 단백질(GITR)에 특이적으로 결합하는 분자를 제공한다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 적어도 GITR에 결합하는 다가 분자에 관한 것이다. 이러한 다가 TNFRSF 결합 융합 단백질은 2개 이상의 TNFRSF 결합 도메인(TBD)을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 TBD는 GITR에 결합하고, 이것은 본원에서 GITR 결합 도메인(GITR-BD)으로 지칭된다.

GITR은 TNFRSF의 구성원이고, 종양에서 CD4+/CD25+/Foxop3+ 조절 T 세포(Treg) 상에 구성적으로 발현되고, 활성화 후 다른 T 세포 집단에서 상향조절된다. 그것은 Treg 매개 면역학적 자체 내성(self-tolerance)을 가지고 있으며 우세한 역할을 수행한다고 가정된다. GITR 효능제는 Treg의 억제 활성을 약화하고, 마우스 모델에서는 종양의 이펙터 T 세포 사멸을 증가시키는 것으로 나타났다. 따라서, 기능성 GITR 효능제는 큰 잠재적인 종양 면역 치료 효과를 갖는다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 적어도 하나의 GITR-BD를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 다가 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 GITR 및 제2 항원, 예를 들어 임의의 다른 TNFRSF 구성원과 결합하는 다중특이적 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 다중특이적 및 다가 융합 단백질이다.

일부 실시양태에서, GITR-BD는 인간 및 시노몰거스 원숭이 GITR에 결합한다. 일부 실시양태에서, GITR-BD는 GITR 및 그의 리간드 GITR-리간드(GITR-L)의 상호작용을 차단하거나, 억제하거나, 달리 조절한다. 다른 실시양태에서, GITR-BD는 GITR 및 GITR-L의 상호작용을 차단하거나, 억제하거나, 달리 조절하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 동일한 GITR-BD의 다중 카피를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 GITR 상의 동일한 에피토프를 인식하는 다수의 GITR-BD를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 GITR 상의 별개의 에피토프를 인식하는 다수의 GITR-BD를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 다수의 GITR-BD를 포함하고, 여기서 일부의 GITR-BD는 GITR-GITR-L 상호작용을 차단하고, 다른 GITR-BD는 GITR-GITR-L 상호작용을 차단하지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용의 GITR 표적화 융합 단백질은 종양 세포의 직접적인 세포 사멸을 유도한다.

일부 실시양태에서, GITR 표적화 분자는 GITR에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체(sdAb) 서열의 적어도 하나의 카피를 포함한다. 일부 실시양태에서, GITR 표적화 분자는 GITR에 특이적으로 결합하는 sdAb의 2개 이상의 카피, 예를 들어 GITR에 특이적으로 결합하는 sdAb의 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 카피를 포함한다.

단일 도메인 항체(sdAb)는 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있는 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 이루어진 항체 단편이다. 분자량이 12-15 kDa에 불과한 단일 도메인 항체는 2개의 중쇄 단백질 및 2개의 경쇄로 이루어진 일반적인 항체(150-160 kDa)보다 훨씬 더 작고, 심지어 Fab 단편(~50 kDa, 하나의 경쇄 및 중쇄의 절반) 및 단일쇄 가변 단편(~25 kDa, 2개의 가변 도메인(하나는 경쇄로부터, 하나는 중쇄로부터 유래됨)보다 더 작다.

단일 도메인 항체는 그의 상보성 결정 영역이 단일 도메인 폴리펩티드의 일부인 항체이다. 그 예는 중쇄 항체, 천연적으로 경쇄가 결여된 항체, 통상적인 4개 사슬 항체로부터 유래된 단일 도메인 항체, 조작된 항체 및 항체로부터 유래된 것 이외의 다른 단일 도메인 스캐폴드를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 단일 도메인 항체는 마우스, 인간, 낙타, 야마, 염소, 토끼 및/또는 소를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 사용되는 단일 도메인 항체는 경쇄가 결여된 중쇄 항체로 알려진 천연 생성 단일 도메인 항체이다. 명확성을 위해, 천연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 항체로부터 유래된 상기 가변 도메인은 4개 사슬 면역글로불린의 통상적인 VH와 구별하기 위해 본원에서 VHH로 제시된다. 이러한 VHH 분자는 낙타, 야마, 단봉낙타, 알파카 및 구아나코와 같은 낙타과(Camelidae) 종에서 생성된 항체로부터 유래될 수 있다. 낙타과 이외의 다른 종은 천연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 항체를 생산할 수 있고, 상기 VHH는 본 발명의 범위 내에 포함된다.

GITR VHH(야마-유래) 및 인간화된 서열을 아래에 나타내고, CDR 서열을 아래에 제시된 서열 내에 나타낸다. 일부 실시양태에서, GITR 결합 sdAb는 IgG Fc 영역에 융합되고, 이들 실시양태에서 융합 단백질은 분자당 2개의 GITR 결합 도메인을 갖는 2가이다. 일부 실시양태에서, 2개의 GITR 결합 sdAb(2x)는 IgG Fc 영역에 융합되고, 이러한 실시양태에서, 융합 단백질은 분자당 4개의 GITR 결합 도메인을 갖는 4가이다. 일부 실시양태에서, 3개의 GITR 결합 sdAb(3x)는 IgG Fc 영역에 융합되고, 이들 실시양태에서, 융합 단백질은 분자당 6개의 GITR 결합 도메인을 갖는 6가이다.

예시적인 GITR 결합 sdAb

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 GITR을 표적으로 하는 융합 단백질은 아미노산 링커를 통해 작동 가능하게 연결된 2개 이상의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 링커는 본원에서 GS-링커로 표시되는 바와 같이 아미노산 글리신 및 세린으로 주로 구성된다. 본 개시내용의 융합 단백질의 GS-링커는 다양한 길이, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개의 아미노산 길이일 수 있다.

일부 실시양태에서, GITR 결합 융합 단백질은 GS-링커 및 글리신 링커의 조합물을 포함한다.

일부 실시양태에서, 다가 GITR 표적화 융합 단백질은 4가이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 4가 GITR 표적화 분자는 다음 구조를 갖는 GITR 표적화 융합 단백질의 2개의 카피를 포함한다: (GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-힌지-Fc. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 4가 GITR 표적화 분자는 다음 구조를 갖는 GITR 결합 융합 단백질의 2개의 카피를 포함한다: (GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-힌지-Fc (여기서 GITR-BD는 GITR에 결합하는 단리된 폴리펩티드 서열이다). 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 4가 GITR 표적화 분자는 다음 구조를 갖는 GITR 결합 융합 단백질의 2개의 카피를 포함한다: (GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-힌지-Fc (여기서 GITR-BD는 GITR에 결합하는 sdAb 서열이다). 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 4가 GITR 표적화 분자는 다음 구조를 갖는 GITR 결합 융합 단백질의 2개의 카피를 포함한다: (GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-힌지-Fc (여기서 GITR-BD는 GITR에 결합하는 인간화된 또는 완전 인간 sdAb 서열이다). 일부 실시양태에서, 4가 GITR 표적화 분자는 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4가 GITR 표적화 분자는 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 4가 GITR 표적화 분자는 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 4가 GITR 표적화 분자는 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 4가 GITR 표적화 분자는 서열 번호 81-93으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 다가 GITR 표적화 융합 단백질은 6가이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 6가 GITR 표적화 분자는 다음 구조를 갖는 GITR 표적화 융합 단백질의 2개의 카피를 포함한다: (GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-힌지-Fc. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 6가 GITR 표적화 분자는 다음 구조를 갖는 GITR 표적화 융합 단백질의 2개의 카피를 포함한다: (GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-힌지-Fc (여기서 GITR-BD는 GITR에 결합하는 인간화된 또는 단리된 폴리펩티드 서열이다). 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 6가 GITR 표적화 분자는 다음 구조를 갖는 GITR 표적화 융합 단백질의 2개의 카피를 포함한다: (GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-힌지-Fc (여기서 GITR-BD는 GITR에 결합하는 sdAb 서열이다). 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 6가 GITR 표적화 분자는 다음 구조를 갖는 GITR 표적화 융합 단백질의 2개의 카피를 포함한다: (GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-힌지-Fc (여기서 GITR-BD는 GITR에 결합하는 인간화된 또는 완전 인간 sdAb 서열이다). 일부 실시양태에서, 6가 GITR 표적화 분자는 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 6가 GITR 표적화 분자는 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 6가 GITR 표적화 분자는 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 6가 GITR 표적화 분자는 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 GITR-BD를 함유한다. 일부 실시양태에서, 6가 GITR 표적화 분자는 서열 번호 94-105로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

본원에서 설명되는 GITR 표적화 단백질은 다양한 치료, 진단 및 예방 요법에서 유용하다. 예를 들어, GITR 표적화 단백질은 대상체의 다양한 질환 및 장애를 치료하는데 유용하다. 일부 실시양태에서, GITR 표적화 단백질은 염증성 질환 또는 장애를 앓고 있거나 또는 염증성 질환 또는 장애의 위험이 있는 것으로 확인된 대상체에서 질환 또는 장애의 증상을 완화하고/하거나, 그 진행을 개선 및/또는 지연하는데 유용하다. 일부 실시양태에서, GITR 표적화 단백질은 암 또는 다른 신생물 병태를 치료하고/하거나, 그 증상을 완화하고/하거나, 그 진행을 개선 및/또는 지연하는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 암은 방광암, 유방암, 자궁/자궁경부암, 난소암, 전립선암, 고환암, 식도암, 위장암, 췌장암, 결장직장암, 결장암, 신장암, 두경부암, 폐암, 위암, 생식세포암, 골암, 간암, 갑상선암, 피부암, 중추 신경계의 신생물, 림프종, 백혈병, 골수종, 육종 및 바이러스 관련 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 전이성 암, 불응성 암 또는 재발성 암이다. 일부 실시양태에서, GITR 표적화 단백질은 그를 필요로 하는 대상체의 종양에서 T 조절 세포의 수를 감소시키거나 고갈시키는데 유용하다. 일부 실시양태에서, GITR 표적화 단백질은 대상체에서 면역 반응을 자극하는데 유용하다. 일부 실시양태에서, GITR 표적화 단백질은 자가면역 질환 또는 장애를 치료하고/하거나, 그 증상을 완화하고/하거나, 그 진행을 개선 및/또는 지연하는데 유용하다. 일부 실시양태에서, GITR 표적화 단백질은 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염을 치료하고/하거나, 그 증상을 완화하고/하거나, 그 진행을 개선 및/또는 지연하는데 유용하다.

본 개시내용의 GITR 표적화 분자를 포함하는 본 개시내용의 치료 제제는 대상체에서 GITR의 비정상적인 활성 및/또는 발현과 관련된 질병 또는 장애와 관련된 증상을 치료하거나 완화하는 데 사용된다. 치료 요법은 임의의 다양한 임상 및/또는 실험 절차를 포함하는 표준 방법을 사용하여 GITR의 비정상적인 활성 및/또는 발현과 관련된 질병 또는 장애를 앓고 있는(또는 이들이 발생할 위험이 있는) 대상체, 예를 들어 인간 환자를 확인함으로써 수행된다. 환자라는 용어에는 사람 및 수의 대상체가 포함된다. 이 용어에는 인간 및 다른 포유동물이 포함된다.

치료 효능은 GITR의 비정상적인 활성 및/또는 발현과 관련된 특정 질환 또는 장애를 진단 또는 치료하기 위한 임의의 공지된 방법과 관련하여 결정된다. GITR의 비정상적인 활성 및/또는 발현과 관련된 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 완화는 GITR 표적화 분자가 임상적 이점을 부여한다는 것을 나타낸다.

본 개시내용의 GITR 표적화 분자의 치료적 용도는 또한 하나 이상의 추가의 작용제의 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 작용제는 항-GITR 항체 또는 융합 단백질, 항-PD1 항체 또는 융합 단백질, LAG-3 항체 또는 융합 단백질, CTLA-4 항체 또는 융합 단백질, 및/또는 PD-L1 항체 또는 융합 단백질이다.

본 발명의 GITR 표적화 분자는 단독으로 또는 다른 치료 방식과 함께 투여될 수 있다. 이 분자는 다른 치료 방식, 예를 들어 수술, 화학요법, 방사선 요법, 또는 또 다른 치료용 폴리펩티드/항체와 같은 생물제제의 실시/투여 전에, 이와 실질적으로 동시에, 또는 그 후에 제시될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 GITR 표적화 분자는 화학요법제와 조합하여 사용될 수 있다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시톡산(Cytoxan)^® 사이클로포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄토테신(합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴; 항생제, 예컨대 에네다인 항생제(예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1(예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem Intl . Ed. Engl ., 33: 183-186 (1994)] 참조); 다이네미신 A를 포함하는 다이네미신; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소 단백질 에네다인 항생제 발색단), 아클라시노미신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신^® 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세클라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK^® 다당류 복합체(JHS Natural Products, 미국 오레곤주 유진 소재); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄, 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 탁솔(Taxol)^® 파클리탁셀(Bristol-Myers Squibb Oncology, 미국 뉴저지주 프린스턴 소재), 아브락산(Abraxane)^® 크레모포르-프리(Cremophor-free), 파클리탁셀의 알부민 조작된 나노입자 제제(American Pharmaceutical Partners, 미국 일리노이주 샤움버그 소재), 및 탁소테레(Taxotere)® 독세탁셀(Rhone-Poulenc Rorer, 프랑스 안토니 소재); 클로란부실; 겜자르(Gemzar)^® 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 나벨빈(Navelbine)^® 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(Camptosar, CPT-11)(5-FU 및 류코보린과 함께 사용되는 이리노테칸의 치료 요법 포함); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린(LV); 옥살리플라틴 치료 요법(FOLFOX)을 포함한 옥살리플라틴; 세포 증식을 감소시키는 PKC-알파, Raf, H-RAS, EGFR(예를 들어, 에를로니팁(Tarceva^®) 및 VEGF-A의 억제제, 및 상기 임의의 화합물의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

추가의 비제한적인 예시적인 화학요법제는 암에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예컨대 예를 들어 타목시펜(놀바덱스(Nolvadex)^® 타목시펜 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018,오나프리스톤 및 파레스톤(Fareston)^® 토레미펜을 포함하는 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM); 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예컨대 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가제(Megase)^® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(Aromasin)^® 엑세메스탄, 포르메스타니에, 파드로졸, 리비소르(Rivisor)^® 보로졸, 페마라(Femara)A^® 레트로졸, 및 아리미덱스(Arimidex)^® 아나스트로졸; 및 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 트록사시타빈(1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예컨대 PKC-알파, Raf 및 H-Ras; 리보자임, 예컨대 VEGF 발현 억제제(예를 들어, 안지오자임(Angiozyme)^® 리보자임) 및 HER2 발현 억제제; 유전자 요법 백신과 같은 백신, 예를 들어 알보벡틴(Allovectin)^® 백신; 류벡틴(Leuvectin)^® 백신, 및 박시드(Vaxid)^® 백신; 프로류킨(Proleukin)^® rIL-2; 루르토테칸(Lurtotecan)^® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(Abarelix)^® rmRH; 및 상기 임의의 화합물의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 GITR 표적화 분자는 항혈관신생제와 함께 사용될 수 있다. 혈관신생제는 혈관신생, 혈관형성 또는 바람직하지 않은 혈관 투과성을 직접 또는 간접적으로 억제하는 저분자량 물질, 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 억제 RNA(RNAi 또는 siRNA) 포함), 폴리펩티드, 단리된 단백질, 재조합 단백질, 항체 또는 이들의 접합체 또는 융합 단백질을 지칭한다. 항혈관신생제는 혈관신생 인자 또는 그의 수용체에 결합하여 혈관신생 활성을 차단하는 작용제를 포함하는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 항혈관신생제는 혈관신생제에 대한 항체 또는 다른 길항제, 예를 들어 VEGF-A(예를 들어, 베바시주맙(Avastin^®) 또는 VEGF-A 수용체(예를 들어, KDR 수용체 또는 Flt-1 수용체)에 대한 항체, 항-PDGFR 억제제, 예컨대 글리벡(Gleevec)^®(이마티닙 메실레이트), VEGF 수용체 신호전달을 차단하는 소분자(예를 들어, PTK787/ZK2284, SU6668, Sutent^®/SU11248(수니티닙 멜레이트), AMG706 또는 국제 특허 출원 공개 WO 2004/113304에 기재된 것)이다. 항혈관신생는 또한 천연 혈관신생 억제제, 예컨대 안지오스타틴, 엔도스타틴 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol . 53:217-39]; [Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179(예를 들어, 악성 흑색종에서 항혈관신생 요법을 제시하고 있는 표 3)]; [Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364]; [Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556(예를 들어, 공지된 항혈관신생 인자를 제시하고 있는 표 2)]; 및 [Sato (2003) Int . J. Clin . Oncol. 8:200-206(예를 들어, 임상 시험에서 사용된 항혈관신생제를 제시하고 있는 표 1)]을 참조한다.

일부 실시양태에서, GITR 표적화 분자는 항-HER-2 항체, 항-CD20 항체, 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 길항제(예를 들어, 티로신 키나제 억제제), HER1/EGFR 억제제(예를 들어, 에를로니팁(Tarceva^®)), 혈소판 유도 성장 인자 억제제(예를 들어, 글리벡^®(이마티닙 메실레이트), COX-2 억제제(예를 들어, 셀레콕시브), 인터페론, CTLA4 억제제(예를 들어, 항-CTLA4 항체 이필리무맙(YERVOY)^®), PD-1 억제제(예를 들어, 항-PD1 항체, BMS-936558), PDL1 억제제(예를 들어, 항-PDL1 항체, MPDL3280A), PDL2 억제제(예를 들어, 항-PDL2 항체), 사이토카인, 표적 ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA, PD-1, PDL1, PDL2, CTLA4 또는 VEGF 수용체(들), TRAIL/Apo2 중 하나 이상에 결합하는 길항제(예를 들어, 중화 항체) 및 기타 생체 활성 및 유기 화학적 작용제 등과 조합하여 사용된다.

일부 실시양태에서, GITR 표적화 분자는 하나 이상의 추가의 작용제와 조합하여 치료 동안 및/또는 치료 후에 투여된다. 일부 실시양태에서, GITR 표적화 분자 및 추가의 작용제는 단일 치료 조성물로 제제화되고, GITR 표적화 분자 및 추가의 작용제는 동시에 투여된다. 대안적으로, GITR 표적화 분자 및 추가의 제제는 서로 분리되고, 예를 들어, 각각 별도의 치료 조성물로 제제화되고, GITR 표적화 분자 및 추가의 작용제는 동시에 투여되거나, 또는 GITR 표적화 분자 및 추가의 작용제는 치료 요법 동안 상이한 시간에 투여된다. 예를 들어, GITR 표적화 분자는 추가의 작용제의 투여 전에 투여되거나, GITR 표적화 분자는 추가의 작용제의 투여 후에 투여되거나, 또는 GITR 표적화 분자 및 추가의 작용제는 번갈아 투여된다. 본원에서 설명되는 바와 같이, GITR 표적화 분자 및 추가의 작용제는 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여된다.

일부 실시양태에서, GITR 표적화 분자 및 추가의 작용제(들)는 동시에 투여된다. 예를 들어, GITR 표적화 분자 및 추가의 작용제(들)는 단일 조성물로 제제화되거나, 2 이상의 별도의 조성물로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, GITR 표적화 분자 및 추가의 작용제(들)는 순차적으로 투여되거나, 또는 GITR 표적화 분자 및 추가의 작용제는 치료 요법 동안 상이한 시간에 투여된다.

원하는 특이성을 갖는 GITR 표적화 분자의 스크리닝 방법은 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA), 효소 검정, 유동 세포 계측 및 관련 기술 분야에 알려진 다른 면역 매개 기술을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

본 개시내용은 핵산 서열 및 특히 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 제공한다. 바람직하게는, DNA 서열은 파지, 바이러스, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, YAC 또는 에피솜과 같은 염색체외 복제에 적합한 벡터에 의해 운반된다. 특히, 목적하는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 벡터는 본원에서 설명되는 GITR 표적화 분자를 제조하고 상당량의 융합 단백질을 수득하는 방법을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. DNA 서열은 적절한 발현 벡터, 즉 삽입된 단백질 코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소를 함유하는 벡터에 삽입될 수 있다. 다양한 숙주-벡터 시스템을 이용하여 단백질 코딩 서열을 발현시킬 수 있다. 바이러스(예를 들어, 우두 바이러스, 아데노바이러스 등)에 감염된 포유동물 세포 시스템; 바이러스(예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 효모 벡터를 함유하는 효모와 같은 미생물, 또는 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아를 포함한다. 이용된 숙주-벡터 시스템에 따라, 다수의 적합한 전사 및 번역 요소 중 임의의 하나가 사용될 수 있다.

본 개시내용은 또한 본원에서 설명되는 GITR 표적화 분자를 코딩하는 단리된 핵산 분자 및/또는 이러한 단리된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 세포를 폴리펩티드의 발현을 유도하는 조건 하에 배양함으로써 GITR 표적화 분자를 생산하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 본원에서 설명되는 GITR 표적화 분자를 코딩하는 단리된 핵산 분자 및/또는 이러한 단리된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 세포를 GITR 표적화 분자의 발현을 유도하는 조건 하에 배양함으로써 GITR 표적화 분자를 생산하는 방법을 제공한다.

본 개시내용의 융합 단백질(본원에서 "활성 화합물"로도 언급됨), 및 그의 유도체, 단편, 유사체 및 상동체는 투여에 적합한 약학 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 조성물은 전형적으로 융합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용되는 담체"라는 용어는 약학적 투여와 상용성일 수 있는 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅, 항박테리아 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 적합한 담체는 이 분야의 표준 참고 문헌인 [Remington's Pharmaceutical Sciences]의 최신판에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다. 상기 담체 또는 희석제의 적합한 예는 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 용액 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 리포솜 및 비수성 비히클, 예컨대 고정유가 또한 사용될 수 있다. 약학 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 물질의 사용은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 물질이 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고, 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 포함될 수 있다.

본 개시내용의 약학 조성물은 그의 의도된 투여 경로와 상용성이도록 제제화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어 정맥내, 피내, 피하, 종양내, 구강(예를 들어, 흡입), 경피(즉, 국소), 경점막 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이팅제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 장성 조절제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조절할 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰풀, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 넣을 수 있다.

주사 가능한 사용에 적합한 약학 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사 가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리학적 염수, 정균수, 크레모포르 EL™(BASF, 미국 뉴저지주 파시파니 소재) 또는 포스페이트 완충 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고, 주사가 용이하도록 하는 정도로 유동성이어야 한다. 그것은 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들면 당, 폴리알콜, 예컨대, 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 장기 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아르산알루미늄 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.

멸균 주사 가능 용액은 필요에 따라 적절한 용매 내의 필요한 양의 활성 화합물을 상기 열거된 성분들 중의 하나 또는 이들의 조합물과 혼합한 후, 멸균 여과함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본적인 분산매 및 상기 열거된 성분으로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 포함시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 활성 성분의 분말 + 이전에 멸균 여과된 그의 용액으로부터의 임의의 추가의 원하는 성분을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다.

경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐에 넣거나, 압축하여 정제로 만들 수 있다. 경구 치료 투여를 위해, 활성 화합물은 부형제와 혼합되고, 정제, 트로키제 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강 세정제로서 사용하기 위해 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있으며, 여기서 유체 담체 내의 화합물은 입에 넣고 헹구고(swishing) 뱉거나 삼키게 된다. 약학적으로 상용성인 결합제 및/또는 보조제 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐, 트로키제 등은 하기 성분 또는 유사한 성질의 화합물 중 임의의 것을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대 미정질 셀룰로스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제, 예컨대 알긴산, 프리모겔(Primogel) 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 스테로테스(Sterotes); 활주제, 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료.

흡입에 의한 투여를 위해, 화합물은 적절한 추진제, 예를 들어 이산화탄소와 같은 가스 가압 용기 또는 분배기(dispenser), 또는 분무기로부터의 에어로졸 분무 형태로 전달된다.

전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의해 수행될 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 침투되는 장벽에 적합한 침투제가 제제에 사용된다. 이러한 침투제는 관련 기술 분야에 일반적으로 알려져 있으며, 예를 들어, 점막 투여를 위해 세제, 담즙염 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제의 사용을 통해 수행될 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 일반적으로 관련 기술 분야에 알려진 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제제화된다.

화합물은 또한 직장 전달을 위한 좌제(예를 들어, 통상적인 좌제 기제, 예컨대 코코아 버터 및 기타 글리세리드) 또는 정체 관장제의 형태로 제조될 수 있다.

한 실시양태에서, 활성 화합물은 임플란트 및 미세캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제제와 같이 신체로부터의 신속한 제거로부터 화합물을 보호하는 담체와 함께 제조된다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안히드라이드(polyanhydride), 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 상기 물질은 또한 알자 코퍼레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼스, 인크.(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 리포솜 현탁액이 또한 약학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 방법, 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

투여 용이성 및 투여량 균일성을 위해 단위 투여 형태로 경구 또는 비경구 조성물을 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 단위 투여 형태는 치료되는 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 의미하고; 각각의 단위는 필요한 약학 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 개시내용의 단위 투여 형태에 대한 상세한 내역은 활성 화합물의 특유한 특성 및 달성되는 특정 치료 효과, 및 개체의 치료를 위해 활성 화합물을 배합하는 관련 기술 분야에 내재된 한계에 의해 좌우되고 이에 직접적으로 의존한다.

약학 조성물은 사용 설명서와 함께 키트, 용기, 팩 또는 분배기에 포함될 수 있다. 이러한 약학 조성물은 사용 설명서가 포함된 진단 키트에 포함될 수 있다.

약학 조성물은 특정 적응증의 치료 또는 예방에 효과적인 양으로 투여된다. 치료 유효량은 전형적으로 치료되는 대상체의 체중, 그의 신체 또는 건강 상태, 치료되는 병태의 정도 또는 치료되는 대상체의 연령에 따라 결정된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 투여당 약 50 ㎍/kg(체중) 내지 약 50 mg/kg(체중)의 양으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 투여당 약 100 ㎍/kg(체중) 내지 약 50 mg/kg(체중)의 양으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 투여당 약 100 ㎍/kg(체중) 내지 약 20 mg/kg(체중)의 양으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 투여당 약 0.5 mg/kg(체중) 내지 약 20 mg/kg(체중)의 양으로 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 10 mg 내지 약 1,000 mg/투여의 양으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 20 mg 내지 약 500 mg/투여의 양으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 20 mg 내지 약 300 mg/투여의 양으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약 20 mg 내지 약 200 mg/투여의 양으로 투여될 수 있다.

약학 조성물은 필요에 따라 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물의 유효 용량은 1회 이상 대상체에게 투여된다. 다양한 실시양태에서, 약학 조성물의 유효 용량은 1개월에 1회, 1개월에 1회 미만, 예를 들어 2개월마다, 3개월마다 또는 6개월마다 대상체에게 투여된다. 다른 실시양태에서, 약학 조성물의 유효 용량은 1개월에 1회 초과, 예를 들어 2주마다, 매주, 주 2회, 주 3회, 매일 또는 1일당 다수회 투여된다. 약학 조성물의 유효 용량은 대상체에게 적어도 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물의 유효 용량은 적어도 1개월, 적어도 6개월 또는 적어도 1년의 기간 동안을 포함하여 다수회 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 병태의 하나 이상의 증상을 완화하기 위해 필요에 따라 대상체에게 투여된다.

달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 일반적으로, 본원에서 설명되는 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 혼성화와 관련하여 이용되는 명명법은 관련 기술 분야에서 공지되고 일반적으로 사용되는 명명법이다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성 및 조직 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천공, 리포펙션)을 위해 표준 기술이 사용된다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조자의 지침에 따라 또는 관련 기술 분야에서 통상적으로 수행되거나 본원에서 설명되는 바와 같이 수행된다. 상기한 기술 및 절차는 일반적으로 관련 기술 분야에 공지된 통상적인 방법에 따라 및 본원 명세서 전반에 걸쳐 언급되고 논의되는 다양한 일반적인 및 보다 구체적인 참고 문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))]을 참고한다. 본원에서 설명되는 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의약 및 약학 화학과 관련하여 사용되는 명명법 및 그에 대한 실험 절차 및 기술은 관련 기술 분야에 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 약학 제제, 제제화 및 전달, 및 환자의 치료를 위해 표준 기술이 사용된다. 용어 환자는 인간 및 수의학적 대상체를 포함한다.

본 개시내용에 따라 이용되는 바와 같이, 달리 지시되지 않는 한, 아래 용어는아래에 제시된 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다:

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표적화 융합 단백질" 및 "항체"는 동의어일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린(Ig) 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 항원에 특이적으로 결합하는(항원과 면역반응하는) 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 의미한다. "특이적으로 결합하다" 또는 "면역반응하다" 또는 "에 대해 작용하는"은 항체가 원하는 항원의 하나 이상의 항원 결정자와 반응하고 다른 폴리펩티드와 반응하지 않거나 훨씬 더 낮은 친화도(K_d>10^- ⁶)로 결합한다는 것을 의미한다. 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, dAb(도메인 항체), 단일쇄, Fab, Fab' 및 F(ab')₂ 단편, F_v, scFv, Fab 발현 라이브러리 및 단일 도메인 항체(sdAb) 단편, 예를 들어 V_HH, V_NAR, 조작된 V_H 또는 V_K를 포함하고 이로 제한되지 않는다.

기본 항체 구조 단위는 사량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각각의 사량체는 폴리펩티드 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 이루어지고, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70 kDa)을 갖는다. 각각의 사슬의 아미노 말단 부분은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 사슬의 카르복시 말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 규정한다. 일반적으로, 인간으로부터 수득된 항체 분자는 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 클래스 중 임의의 것들과 관련되며, 이들은 분자 내에 존재하는 중쇄의 특성에 의해 서로 상이하다. 특정 클래스에는 IgG₁, IgG₂ 등과 같은 하위클래스(이소형으로도 알려짐)가 있다. 또한, 인간에서 경쇄는 카파 사슬 또는 람다 사슬일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체"(mAb) 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 특유한 경쇄 유전자 산물 및 특유한 중쇄 유전자 산물로 이루어진 항체 분자의 단지 하나의 분자 종을 함유하는 항체 분자의 집단을 지칭한다. 특히, 모노클로날 항체의 상보성 결정 영역(CDR)은 집단의 모든 분자에서 동일하다. MAb는 그에 대한 특유한 결합 친화도를 특징으로 하는 항원의 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 항원 결합 부위를 함유한다.

"항원 결합 부위" 또는 "결합 부분"이라는 용어는 항원 결합에 참여하는 면역글로불린 분자의 부분을 의미한다. 항원 결합 부위는 중쇄("H") 및 경쇄("L")의 N 말단 가변 영역("V")의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. "초가변 영역"으로 언급되는 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내의 3개의 고도로 분기하는 스트레치(divergent stretch)는 프레임워크 영역 또는 "FR"로 알려진 보다 보존된 측면에 인접하는(flanking) 스트레치 사이에 끼워진다. 따라서, 용어 "FR"은 면역글로불린에서 초가변 영역 사이에서 및 초가변 영역에 인접하여 천연적으로 발견되는 아미노산 서열을 의미한다. 항체 분자에서, 경쇄의 3개의 초가변 영역 및 중쇄의 3개의 초가변 영역은 3차원 공간에서 서로에 대해 배치되어 항원 결합 표면을 형성한다. 항원 결합 표면은 결합된 항원의 3차원 표면에 상보성이고, 중쇄 및 경쇄 각각의 3개의 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로 지칭된다. 아미노산을 각각의 도메인에 대해 지정하는 것은 문헌 [Kabat Sequences of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1987 and 1991))] 또는 [Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)], [Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)]의 정의에 따른다.

본 개시내용의 융합 단백질의 단일 도메인 항체(sdAb) 단편 부분은 본원에서 표적화 폴리펩티드와 교환 가능하게 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 그의 단편, 또는 T 세포 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정자를 포함한다. "에피토프"라는 용어는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체와의 특이적 결합이 가능한 임의의 단백질 결정자를 포함한다. 에피토프 결정자는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 군으로 이루어지며, 일반적으로 특이적 전하 특성뿐만 아니라 특이적인 3차원 구조적 특징을 갖는다. 항체는 해리 상수가 ≤ 1 μM, 예를 들어 ≤ 100 nM, 바람직하게는 ≤ 10 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 1 nM인 경우에 항원에 특이적으로 결합한다고 언급된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역학적 결합" 및 "면역학적 결합 특성" 및 "특이적 결합"은 면역글로불린 분자와 면역글로불린이 특이적인 항원 사이에서 발생하는 유형의 비공유 상호작용을 나타낸다. 면역학적 결합 상호작용의 강도 또는 친화도는 상호작용의 해리 상수(K_d)의 측면에서 표현될 수 있으며, 여기서 보다 작은 K_d는 보다 큰 친화도를 나타낸다. 선택된 폴리펩티드의 면역학적 결합 특성은 관련 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 정량될 수 있다. 그러한 방법 중 하나는 항원 결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리의 속도를 측정하는 것을 수반하며, 여기서 이들 속도는 복합체 파트너의 농도, 상호작용의 친화도, 및 양쪽 방향의 속도에 동등하게 영향을 미치는 기하학적 파라미터에 의존한다. 따라서, "온 속도(on rate) 상수"(k_on) 및 "오프 속도(off rate) 상수"(k_off)는 농도 및 실제 회합 및 해리 속도의 계산에 의해 결정될 수 있다(문헌 [Nature 361:186-87 (1993)] 참조). k_off/k_on의 비율은 친화도와 관련이 없는 모든 파라미터의 취소를 가능하게 하며, 해리 상수 K_d와 같다(일반적으로, 문헌 [Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473] 참조). 본 개시내용의 항체는 방사성 리간드 결합 검정, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 유동 세포 계측 결합 검정 또는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 유사한 검정과 같은 검정에 의해 측정될 때, 평형 결합 상수(K_d)가 ≤1 μM, 바람직하게는 ≤ 100 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 10 nM, 가장 바람직하게는 ≤ 100 pM 내지 약 1 pM 일 때 항원에 특이적으로 결합한다고 언급된다.

바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다.

보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 교환 가능성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소 류신이고; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 세린 및 트레오닌이고; 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 적절한 보존적 아미노산 치환기는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌 발린, 글루탐산-아스파르트산 및 아스파라긴-글루타민이다.

본원에서 논의된 바와 같이, 항체 또는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열의 작은 변화는 본 개시내용에 포함되는 것으로 고려되고, 여기서 아미노산 서열의 변이는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 95%, 가장 바람직하게는 99%를 유지한다. 특히, 보존적 아미노산 교체가 고려된다. 보존적 교체는 그 측쇄와 관련된 아미노산의 패밀리 내에서 일어나는 것이다. 유전적으로 코딩되는 아미노산은 일반적으로 다음과 같은 패밀리로 분류된다: (1) 산성 아미노산은 아스파르테이트, 글루타메이트이고, (2) 염기성 아미노산은 라이신, 아르기닌, 히스티딘이고; (3) 비극성 아미노산은 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판이고, (4) 비하전 극성 아미노산은 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신이다. 친수성 아미노산은 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르테이트, 글루타민, 글루타메이트, 히스티딘, 라이신, 세린 및 트레오닌을 포함한다. 소수성 아미노산은 알라닌, 시스테인, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신 및 발린을 포함한다. 아미노산의 다른 패밀리는 (i) 지방족-히드록시 패밀리인 세린 및 트레오닌; (ii) 아미드 함유 패밀리인 아스파라긴 및 글루타민; (iii) 지방족 패밀리인 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 및 (iv) 방향족 패밀리인 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다. 예를 들어, 류신을 이소류신 또는 발린으로, 아스파르테이트를 글루타메이트로, 트레오닌을 세린으로 교체하는 것, 또는 아미노산을 구조적으로 관련이 있는 아미노산으로 유사하게 교체하는 것은 특히 교체가 프레임워크 부위 내의 아미노산을 포함하지 않는 경우, 생성되는 분자의 결합 또는 특성에 주요한 영향을 미치지 않을 것이다. 아미노산 변화가 기능성 펩티드를 생성하는지의 여부는 폴리펩티드 유도체의 특이적 활성을 검정함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 검정은 본원에서 상세히 설명된다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 단편 또는 유사체의 적합한 아미노 및 카르복시 말단은 기능성 도메인의 경계 부근에서 발생한다. 구조적 및 기능적 도메인은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이터를 공공 또는 독점적(proprietary) 서열 데이터베이스와 비교함으로써 확인될 수 있다. 바람직하게는, 컴퓨터에 의한 비교 방법은 공지된 구조 및/또는 기능을 갖는 다른 단백질에서 발생하는 서열 모티프 또는 예측된 단백질 입체형태 도메인을 확인하기 위해 사용된다. 공지된 3차원 구조로 접힌 단백질 서열을 확인하는 방법은 알려져 있다(Bowie et al. Science 253:164 (1991)]에 기재되어 있다. 따라서, 상기 실시예는 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 본 개시내용에 따라 구조적 및 기능적 도메인을 규정하기 위해 사용될 수 있는 서열 모티프 및 구조적 입체형태를 인식할 수 있음을 보여준다.

바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백질 분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화 감수성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체 형성에 대한 결합 친화도를 변경하고, (4) 결합 친화도를 변경하고, (4) 그러한 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 변형할 수 있다. 유사체는 천연 생성 펩티드 서열 이외의 다른 서열의 다양한 뮤테인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다중 아미노산 치환(바람직하게는 보존적 아미노산 치환)은 천연 생성 서열에서, 바람직하게는 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드의 부분에서 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변경하지 않는다(예를 들어, 교체 아미노산은 모 서열에서 발생하는 나선을 파괴하거나, 모 서열을 특징짓는 다른 유형의 2차 구조를 붕괴시키지 않아야 한다). 관련 기술 분야에서 인정되는 2차 및 3차 구조의 예는 문헌 [Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1984))]; [Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))]; 및 [Thornton et al. Nature 354:105 (1991)]에 기재되어 있다.

본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드 단편"은 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단 결손을 갖지만 나머지 아미노산 서열은 예를 들어 전장 cDNA 서열로부터 유추된 천연 생성 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 지칭한다. 단편은 전형적으로 적어도 5, 6, 8 또는 10개의 아미노산 길이, 바람직하게는 적어도 14개의 아미노산 길이, 보다 바람직하게는 적어도 20개의 아미노산 길이, 대체로 적어도 50개의 아미노산 길이, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 70개의 아미노산 길이이다. 본원에서 사용되는 용어 "유사체"는 유추된 아미노산 서열의 일부에 대한 실질적인 동일성을 갖고 적절한 결합 조건 하에 GITR에 대한 특이적인 결합을 갖는 적어도 25개 아미노산의 세그먼트로 이루어진 폴리펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 폴리펩티드 유사체는 천연 생성 서열에 대하여 보존적 아미노산 치환(또는 부가 또는 결손)을 포함한다. 유사체는 전형적으로 적어도 20개 아미노산 길이, 바람직하게는 적어도 50개 아미노산 길이 또는 그 초과의 길이이며, 종종 천연 생성 전장 폴리펩티드 길이만큼 길 수 있다.

펩티드 유사체는 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 갖는 비펩티드 약물로서 약학 산업에서 통상적으로 사용된다. 이러한 유형의 비펩티드 화합물은 "펩티드 모방체" 또는 "펩티도미메틱(peptidomimetic)"으로 지칭된다([Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986)], [Veber and Freidinger TINS p.392 (1985)]; 및 [Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987)]). 이러한 화합물은 종종 컴퓨터에 의한 분자 모델링의 도움으로 개발된다. 치료상 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체는 동등한 치료 또는 예방 효과를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩티도미메틱은 인간 항체와 같은 전형적인 폴리펩티드(즉, 생화학적 특성 또는 약리학적 활성을 갖는 폴리펩티드)와 구조적으로 유사하지만, 관련 기술 분야에 공지된 방법에 의해, --CH₂NH--, --CH₂S-, --CH₂-CH₂--, --CH=CH--(시스 및 트랜스), --COCH₂--, CH(OH)CH₂--, 및 -CH₂SO--로 이루어진 군으로부터 선택되는 연결에 의해 선택적으로 교체된 하나 이상의 펩티드 연결을 갖는다. 동일한 유형의 D-아미노산(예를 들어, L-라이신 대신에 D-라이신)으로 컨센서스 서열의 하나 이상의 아미노산을 체계적으로 치환함으로써 보다 안정한 펩티드를 생성할 수 있다. 또한, 컨센서스 서열 또는 실질적으로 동일한 컨센서스 서열 변이를 포함하는 구속된(constrained) 펩티드는 관련 기술 분야에 알려진 방법(Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992))에 의해, 예를 들어, 펩티드를 고리화하는 분자내 디술피드 다리를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 부가함으로써 생성될 수 있다.

용어 "작용제(agent)"는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자 및/또는 생물학적 물질로 제조된 추출물을 나타내기 위해 본원에서 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표지" 또는 "표지된"은 방사성 표지된 아미노산의 혼입 또는 표시된 아비딘(예를 들어, 광학적 또는 열량 측정 방법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 모이어티의 폴리펩티드에 대한 부착을 지칭한다. 특정 상황에서, 표지 또는 마커는 또한 치료 활성일 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지하는 다양한 방법이 관련 기술 분야에 알려져 있고, 사용될 수 있다. 폴리펩티드에 대한 표지의 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예를 들어, ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹TC, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I), 형광 표지(예를 들어, FITC, 로다민, 란타나이드 인광체), 효소 표지(예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광, 비오티닐기, 2차 리포터(예를 들어, 류신 지퍼쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프. 일부 실시양태에서, 표지는 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암(arm)에 의해 부착된다. 본원에서 사용되는 용어 "약제 또는 약물"은 환자에게 적절하게 투여될 때 원하는 치료 효과를 유도할 수 있는 화합물 또는 조성물을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "치료하다", "치료하는", "치료" 등의 용어는 장애 및/또는 이와 관련된 증상의 감소 및/또는 개선을 나타낸다. "완화하다" 및/또는 "완화하는"은 예를 들어 암과 같은 질환의 발달 또는 진행을 감소, 억제, 약화, 축소, 정지 및/또는 안정시키는 것을 의미한다. 배제되지는 않지만, 장애 또는 병태의 치료는 장애, 병태 또는 이와 관련된 증상이 완전히 제거될 것을 필요로 하지는 않음이 이해될 것이다.

본 개시내용에서, "포함하다", "포함하는", "함유하는", "갖는" 등은 미국 특허법에서 그들에게 부여된 의미를 가질 수 있으며, "포괄하다", "포괄하는" 등을 의미할 수 있고; 용어 "본질적으로 이루어지는" 또는 "본질적으로 이루어지다"는 미국 특허법에서 부여된 의미를 가지며, 이들 용어는 제한이 없는 것으로서, 언급된 것의 기본적인 또는 신규한 특징이 언급된 것을 초과한 것의 존재에 의해 변경되지 않지만 선행 기술의 실시양태를 배제하는 한, 언급된 것을 초과한 것의 존재를 허용한다.

"유효량"은 치료되지 않은 환자에 비해 질환의 증상을 개선하기 위해 필요한 양을 의미한다. 질환의 치료 처치를 위해 본 개시내용을 실시하는데 사용되는 활성 화합물(들)의 유효량은 투여 방식, 대상체의 연령, 체중 및 일반적인 건강 상태에 따라 달라진다. 궁극적으로, 치료 의사 또는 수의사는 적절한 양 및 투여 요법을 결정할 것이다. 이러한 양은 "유효량"으로 언급된다.

"대상체"는 소, 말, 개, 설치류, 양, 영장류, 낙타류 또는 고양이와 같은 인간 또는 비인간 포유동물을 포함하고 이로 제한되지 않는 포유동물을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "투여"는 치료제로 치료할 필요가 있는 대상체에게 상기 치료제를 운반, 전달, 도입 또는 수송하는 임의의 방식을 의미한다. 이러한 방식은 경구, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 피내, 비내 및 피하 투여를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

"단편"은 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 일부를 의미한다. 이 부분은 바람직하게는 참조 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 전체 길이의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 함유한다. 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 함유할 수 있다.

본원에서 제공되는 범위는 그 범위 내의 모든 값에 대해 단축형인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50으로 이루어진 군으로부터의 임의의 수, 수의 조합 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 구체적으로 언급되거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 용어 "a", "an" 및 "the"는 단수 또는 복수로 이해된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 구체적으로 언급되거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 구체적으로 언급되거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 용어 "약"은 관련 기술 분야에서 통상의 허용 범위 내, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 내로서 이해된다. 약은 언급된 값의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 내로서 이해될 수 있다. 문맥으로부터 명백하게 그렇지 않는 한, 본원에서 제공되는 모든 수치는 용어 "약"에 의해 수식된다.

본 개시내용은 청구범위에 기재된 개시내용의 범위를 제한하지 않는 다음의 실시예에서 추가로 설명될 것이다.

실시예

실시예 1. GITR 표적화 분자는 GITR에 결합한다.

도 2a, 2b 및 2c에 나타낸 바와 같이, 본 개시내용의 다양한 GITR 표적화 융합 단백질은 유동 세포 계측에 의해 평가된 바와 같이 CHO 세포 상에 발현된 GITR에 결합한다. GITR 항체인 TRX-518을 이 연구의 대조군으로 사용하였다.

CHO 세포의 표면 상에 발현된 인간 및 시노몰거스 GITR에 대한, hzC06v1.1(서열 번호　42), hzC06v1.2(서열 번호　43), hzC06v1.3(서열 번호　44), hzC06v1.4(서열 번호 45), hzC06v2.1(서열 번호　46), hzC06v2.2(서열 번호　47), hzC06v2.3(서열 번호　48), hzC06v2.4(서열 번호　49), hzC06v3(서열 번호　50), hzC06v3.1(서열 번호　51), hzC06v3.2(서열 번호　52), hzC06v3.3(서열 번호　53), hzC06v3.4(서열 번호　54), hzC06v3.5(서열 번호　55), hzC06v3.6(서열 번호　56), hzC06v3.7(서열 번호　57), hzC06v3.8(서열 번호　58), hzC06v3.9(서열 번호　59), hzC06v3.10(서열 번호　60), hzC06v3.11(서열 번호　61), hzC06v3.12(서열 번호　62), hzC04v4.1(서열 번호　63), hzC04v4.1.2(서열 번호　64), hzC04v4.2(서열 번호　65), hzC04v4.2.2(서열 번호　66), hzC04v5(서열 번호　67), hzC04v1.2.1(서열 번호　68), hzC04v5.1(서열 번호　69), hzC04v5.2(서열 번호　70), hzC04v5.3(서열 번호　71), hzC04v5.4(서열 번호　72), hzC04v5.5(서열 번호　73), hzC04v5.6(서열 번호　74), hzC04v5.7(서열 번호　75), hzC04v5.8(서열 번호　76), hzC04v5.9(서열 번호　77), hzC04v5.10(서열 번호　78), hzC04v5.11(서열 번호　79), 및 hzC04v5.12(서열 번호　80)로 본원에서 언급되는 GITR 표적화 분자의 결합 친화도는 유동 세포 계측으로 결정하였다. 그 결과는 도 4a-4e 및 도 5a-5e에 제시된다.

실시예 2. GITR 표적화 분자는 GITR과 GITR-L 사이의 상호작용을 차단한다.

도 3a, 3b 및 3c에 나타낸 바와 같이, 본 개시내용의 다양한 GITR 표적화 융합 단백질은 GITRL과 GITR 사이의 상호작용을 차단할 수 있었다. 간단히 설명하면, 이들 연구에서, GITR 발현 CHO 세포 및 재조합 GITRL을 사용하는 유동 세포 계측 검정을 사용하여 차단 능력을 평가하였다. GITR 항체인 TRX-518을 이 연구에 대한 대조군으로 사용하였다.

실시예 3. 인간 및 시노몰거스 GITR에 대한 GITR 표적화 분자의 결합 친화도

인간 및 시노몰거스 GITR 세포외 도메인 인간 IgG1 융합 단백질(GITR-Fc)에 대한 2가 hzC06v3.9-hIgG1 또는 2xhzC06v3.9-IgG1 Fc(서열 번호 93)로 본원에서 언급되는 GITR 표적화 분자의 결합 친화도는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정되었다. 간단히 설명하면, 비오티닐화된 인간 및 시노몰거스 GITR-Fc를 칩 표면 상에 포획한 다음, 2가 hzC06v3.9-hIgG1을 120초 동안 40 ㎕/min에서 10 농도(0 nM 내지 600 nM)로 주입하였다. 240초 동안 해리되도록 하였다. ka1, kd1 및 KD1을 하기 표에 보고하였다.

실시예 4. 1차 인간 T 세포에 대한 GITR 표적화 분자의 결합

1차 인간 T 세포에 대한, 본원에서 4가 hzC06-hIgG1로 언급되는 본 개시내용의 항-GITR 분자의 능력을 본 실시예에서 평가하였다. 4가 hzC06-hIgG1은 서열 번호 93의 GITR 결합 분자의 2개의 카피로 구축되고, 상기 결합 분자는 다시 서열 번호 1의 인간 IgG1 Fc 도메인에 융합된 서열 번호 59의 단일 도메인 가변 영역(sdAb)의 2개의 직렬 카피로 구축된다.

형광 활성화된 세포 분류에 의해 단리된 총 PBMC 또는 정제된 Treg를 건강한 인간 공여자로부터 제조하였다. 세포를 재조합 인간 IL2로 보충된 항-CD3 및 항-CD28로 시험관 내에서 활성화하였다. 세포를 다양한 농도의 4가 hzC06-hIgG1 및 표면 표현형 결정 항체 칵테일(surface phenotyping antibody cocktail)과 함께 인큐베이팅하였다. 이어서, 샘플을 세척하고, 형광 표지된 항-hIg 2차 항체로 염색한 후, 유동 세포 계측으로 평가하였다. 활성화된 CD4 T 세포는 CD3, CD4 및 CD25로 염색됨으로써 확인되었다. 이들 연구의 결과는 3명의 공여자로부터의 활성화된 CD4 T 세포(닫힌 기호, 실선) 및 2명의 공여자로부터의 활성화된 Treg(열린 기호, 점선)에 대해 도 7에 도시된다.

실시예 5. GITR 표적화 분자는 NF-kB 신호전달을 활성화한다.

4가 항-GLTR-표적화 분자는 GITR을 발현하는 리포터 세포주에서 NF-kB 신호전달을 활성화하였다. 본 실시예에서 설명되는 연구는 본 개시내용의 2개의 4가 GITR 표적화 분자를 사용하였다. 제1의 4가 GITR 표적화 분자는 hzC06v3.9 GITR-BD(서열 번호 59) 및 서열 번호 1의 IgG1 Fc 폴리펩티드의 2개의 카피를 포함하는, 본원에서 2x hzC06v3.9 IgG1-Fc(서열 번호 93)로 언급되는 GITR 결합 융합 단백질의 2개의 카피를 포함한다. 제2의 4가 GITR 표적화 분자는 C06 GITR-BD(서열 번호 22) 및 서열 번호 1의 IgG1 Fc 폴리펩티드의 2개의 카피를 포함하는, 본원에서 2x C06 IgG1-Fc로 언급되는 GITR 결합 융합 단백질의 2개의 카피를 포함한다.

NF-kB 유도 분비형 알칼리성 포스파타제(SEAP) 리포터 유전자를 함유하는 HEK293 세포주를 인간 GITR(도 8a) 또는 시노몰거스 원숭이 GITR(도 8b)로 안정하게 형질감염시켰다. 세포주를 적정 용량의 4가 GITR 항체와 함께 37℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. SEAP 리포터 유전자 발현은 650 nM에서 광학 밀도에 의해 측정된 기질의 가수분해에 의해 정량되었다.

실시예 6. 종양 모델에서의 GITR 표적화 분자

도 9a-9c에 나타낸 바와 같이, 본 개시내용의 GITR 표적화 분자를 사용한 처리는 투여일과 무관하게 CT26 종양 성장을 유의하게 감소시켰다. BALB/c 마우스에게 CT26 결직장 암종 세포를 피하 접종하고, 서열 번호 22의 GITR-BD 및 서열 번호 1의 인간 IgG1 Fc 폴리펩티드 서열의 2개의 카피를 포함하는, 본원에서 2x C06-IgG1 Fc로 언급되는 GITR 결합 융합 단백질의 2개의 카피를 포함하는 4가 C06-hIgG1 또는 대조군으로서의 인간 IgG1-Fc를 제7일(도 9a), 제9일(도 9b), 또는 제11일(도 9c)에 투여하였고, 이 시점에서 평균 종양 부피는 125, 230 또는 310 mm³이었다. 4가 C06-IgG1 Fc 처리는 처리일과 무관하게 투여 6-8일 후에 시작되는 인간 Fc와 비교하여 종양 성장을 유의하게 감소시켰다(p < 0.05, 양측 비대응(two-tailed, unpaired) t-시험을 통해 결정됨).

도 10에 나타낸 바와 같이, 본 개시내용의 GITR 표적화 분자를 사용한 처리는 CT26 종양 성장의 용량 의존성 억제를 생성하였다. BALB/c 마우스에게 CT26 결직장 암종 세포를 피하 접종하고, 서열 번호 22의 GITR-BD 및 뮤린 IgG2a 서열의 2개의 카피를 포함하는, 본원에서 2x C06-mIgG1 2a Fc로 언급되는 GITR 결합 융합 단백질의 2개의 카피를 포함하는 4가 C06-mIgG2a 또는 대조군으로서의 비특이적 mIgG2a를 제9일(대략 종양 부피 260 mm³)에 투여하였다. 4가 C06-mIgG2a 처리는 2.5, 0.25, 0.08 또는 0.025 mg/kg으로 투여했을 때 대조군에 비해 종양 부피를 유의하게 감소시켰다(p < 0.05). 0.008 mg/kg으로 투여된 4가 C06-mIgG2a는 CT26 종양 성장을 유의하게 억제하지 않았다. 통계적 유의성은 mIgG2a에 대한 4가 C06-mIgG2a 군의 다중 비교에서 일원(one-way) ANOVA를 통해 결정되었다.

도 11a-11b에 나타낸 바와 같이, 본 개시내용의 GITR 표적화 분자를 사용한 처리는 MC38 종양 성장의 용량 의존성 억제를 생성하였다. C57BL/6 마우스에게 MC38 결직장 암종 세포를 피하 접종하고, 4가 C06-mIgG2a 또는 대조군으로서의 비특이적 mIgG2a를 제7일(평균 종양 부피 110-115 mm³)에 투여하였다. 0.08 이상의 용량에서 4가 C06-mIgG2a를 투여하면, 제14일에 시작되는 mIgG2a 대조군에 비해 현저한 종양 성장 감소가 나타났다(p < 0.05)(도 11a). 0.025에서의 4가 C06-mIgG2a 처리는 제18일에 시작되는mIgG2a 대조군에 비해 종양 성장을 유의하게 감소시켰다(p < 0.05). 0.008 mg/kg으로 투여된 4가 C06-mIgG2a는 MC38 종양 성장을 유의하게 억제하지 않았다. 통계적 유의성은 IgG2a에 대한 C06 군의 다중 비교에서 일원 ANOVA를 통해 결정되었다. MC38 접종 후 제20일의 개별 종양 부피를 도 11b에 나타내었다. 2.5, 0.25 및 0.08 mg/kg 처리군에서 상기 시점에서 종양 성장의 유사한 감소가 존재한다.

실시예 7. CT26 종양 성장의 억제에 대한 Fc 기능의 영향

BALB/c 마우스에게 CT26 결직장 암종 세포를 피하 접종하고, 제9일(평균 종양 부피 260 mm³)에 야생형 Fc를 갖는 4가 C06-mIgG2a 또는 Fc 수용체에 대한 결합을 차단하기 위한 N297G 돌연변이를 갖는 4가 C06-mIgG2a(mAb1-mIgG2a-사일런트(silent))를 투여하였다. 비특이적 mIgG2a, 항-GITR mAb1-mIgG2a 및 항-GITR 대조군 mAb1-mIgG2a-사일런트를 대조군으로 사용하였다. 도 12a에 도시된 바와 같이, 4가 C06은 야생형 Fc에서 가장 강력했지만, 야생형 및 사일런트 형태 둘 모두 대조군에 비해 종양 성장을 유의하게 감소시켰다(p < 0.05). 야생형 Fc 형태로 투여될 때 mAb1만이 CT26의 성장을 억제하였다. 통계적 유의성은 mIgG2a에 대한 처리군의 다중 비교에서 일원 ANOVA를 통해 결정되었다. CT26 접종 후 제22일의 개별 종양 부피를 도 12b에 나타내었다. 4가 C06의 Fc 야생형 및 사일런트 형태 사이의 종양 성장의 차이는 유의하지 않았지만, 형태는 mAb1이 종양 성장을 억제하는 능력에 대해 유의하였다. 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석은 야생형 Fc를 사용한 4가 C06 처리가 CT26을 갖는 마우스의 생존을 유의하게 향상시킬 수 있음을 보여준다(도 12c). 제10일의 4가 C06-mIgG2a의 단일 투여는 mIgG2a 대조군의 20일에 비해 중앙 생존을 66일까지 연장한다.

실시예 8. GITR 표적화 분자를 사용한 처리는 재- 시험접종에 대한 내성을 유도한다 .

4가 C06-mIgG2a-유도된 CT26 거부 반응을 보인 마우스는 재-시험접종에 내성이었다. 4가 C06-mIgG2a를 사용한 처리시에 CT26 종양을 거부한 BALB/c 마우스에게 CT26, 렌카(Renca) 또는 EMT6 뮤린 종양 세포주를 재접종하였다. 도 13a에 도시된 바와 같이, 이전에 CT26을 거부한 마우스는 이 모델의 후속 재접종시에 종양 성장에 대해 완전히 내성이었다. 중요한 사실은, 연령이 일치된 나이브(naive) 마우스가 CT26 종양의 성장을 나타냈다는 것이다. 도 13b에 도시된 바와 같이, 렌카 종양은 CT26을 이전에 거부 한 마우스에서 잘 성장하지 않았다. 실제로, 4마리의 마우스 중 2마리는 완전히 내성이 있었고, 1마리의 마우스는 연령이 일치된 나이브 대조군에 비해 렌카 성장의 현저한 감소를 보였다. 렌카는 T 세포 에피토프를 CT26과 공유하고, 이것은 T 세포 매개 면역이 유도됨을 시사한다. 도 13c에서 볼 수 있는 바와 같이, EMT6 종양은 C06 처리시에 CT26을 이전에 제거했는지 아니면 나이브했는지에 관계없이, BALB/c 마우스에서 잘 성장한다. EMT6는 T 세포 에피토프를 CT26과 공유하지 않는다.

실시예 9. T 세포에 대한 GITR 표적화 분자의 처리 효과

처리는 T_reg 빈도를 유의하게 감소시키고, 종양 미세 환경 내의 T_이펙터 세포에 대한 비를 변경하였다. BALB/c 마우스에게 CT26 결직장 암종 세포를 피하 접종하고, 제9일에 야생형 Fc를 갖는 4가 C06-mIgG2a 또는 Fc 수용체에 대한 결합을 차단하기 위한 N297G 돌연변이를 갖는 4가 C06-mIgG2a(mIgG2a-사일런트)를 2.5 mg/kg으로 투여하였다. 비특이적 mIgG2a를 대조군으로 사용하였다. 처리 3일 후에 말초 혈액 및 종양을 수집하고, 유동 세포 계측에 의해 분석하였다. 도 14a에 도시된 바와 같이, 4가 C06-mIgG2a를 사용한 처리는 순환하는 T_reg, 통상적인 CD4 T 세포(4Tcon) 및 CD8 T 세포(8T)의 빈도를 유의하게 감소시켰다(p < 0.05). mIgG2a-사일런트 형태에서는 어떠한 효과도 관찰되지 않았다. 도 14b에 나타낸 바와 같이, 4가 C06-mIgG2a를 사용한 처리는 종양 내 T_reg 및 통상적인 CD4 T 세포의 빈도를 유의하게 감소시켰지만(p < 0.001), CD8 T 세포는 변경되지 않았다. mIgG2a-사일런트 형태에서는 어떠한 효과도 관찰되지 않았다. 도 14c에 도시된 바와 같이, 4가 C06-mIgG2a에 의한 T_reg의 강력한 감소의 결과로서, 이펙터 T 세포 대 T_reg의 비율은 종양에서 유의하게 증가하였다(p < 0.05). 통계적 유의성은 양측 비대응 t-시험을 통해 결정되었다.

실시예 10. GITR 표적화 분자의 T 세포 활성화 및 증식에 대한 효과

처리는 CD8 T 세포 활성화 및 증식을 유의하게 유도하였다. BALB/c 마우스에게 CT26 결직장 암종 세포를 피하 접종하고, 제9일에 야생형 Fc를 갖는 4가 C06-mIgG2a 또는 Fc 수용체에 대한 결합을 차단하기 위한 N297G 돌연변이를 갖는 4가 C06-mIgG2a(mIgG2a-사일런트)를 2.5 mg/kg으로 투여하였다. 비특이적 mIgG2a를 대조군으로 사용하였다. 말초 혈액은 처리 12일 후에 유동 세포 계측에 의해 분석되었다. 도 15a에 도시된 바와 같이, 4가 C06-mIgG2a를 사용한 처리는 순환 CD8 T 세포의 빈포를 유의하게 유도하지만(p < 0.005), T_reg 및 통상적인 CD4 T 세포는 변경되지 않았다. 이 효과는 mIgG2a-사일런트 형태에서는 관찰되지 않았다. 도 15b에 도시된 바와 같이, CD8 T 세포는 또한 4가 C06-mIgG2a를 사용한 처리 후에 활성화된 증식 표현형(CD62L^- Ki67⁺)을 나타내었다. 통계적 유의성은 양측 비대응 t-시험을 통해 결정되었다.

SEQUENCE LISTING <110> INHIBRX LP Timmer, John C. Jones, Kyle S. Razai, Amir S. Hussain, Abrahim Willis, Katelyn M. Deveraux, Quinn Eckelman, Brendan P. <120> MULTIVALENT AND MULTISPECIFIC GITR-BINDING FUSION PROTEINS <130> INHI-022/001WO <150> US 62/195,822 <151> 2015-07-23 <160> 150 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 1 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 115 120 125 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 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Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu 180 185 190 Val Cys Leu Ile Thr Gly Gly Arg Thr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val 195 200 205 Lys Gly Arg Phe Thr Cys Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 210 215 220 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Asn Ala Val Val Ser Thr Gly Trp Gly Arg Asn Ala Asp Asp Tyr Trp 245 250 255 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser 260 265 270 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly 275 280 285 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Ser Ile Asp 290 295 300 Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 305 310 315 320 Cys Leu Ile Thr Gly Gly Arg Thr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys 325 330 335 Gly Arg Phe Thr Cys Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 340 345 350 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 355 360 365 Ala Val Val Ser Thr Gly Trp Gly Arg Asn Ala Asp Asp Tyr Trp Gly 370 375 380 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys 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Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 131 Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asp Asp Met 1 5 10 <210> 132 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 132 Val His Ser Gly Ser Ser Thr Asn 1 5 <210> 133 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 133 Tyr Ala Ala Ile Ser Ser Gly Trp Gly Arg Asp Ala Glu Asp Tyr Trp 1 5 10 15 <210> 134 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 134 Ile Thr Gly Gly Arg Thr Thr Thr 1 5 <210> 135 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 135 Asn Ala Ala Val Ser Thr Gly Trp Gly Arg Ser Ala Asp Asp Tyr Trp 1 5 10 15 <210> 136 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 136 Ile Thr Gly Gly Arg Thr Thr Tyr 1 5 <210> 137 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 137 Ala Ile Thr Gly Gly Arg Thr Thr Tyr 1 5 <210> 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Claims

적어도 글루코코르티코이드 유도된 TNFR 관련 단백질(GITR)에 결합하고, 다수의 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리(TNFRSF) 결합 도메인(TBD)을 포함하는 단리된 폴리펩티드로서, 적어도 제1 TBD(TBD1)가 GITR에 특이적으로 결합하는 GITR 결합 도메인(GITR-BD)을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 다수의 TBD에서 각각의 TBD가 GITR-BD를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제2항에 있어서, 다수의 TBD가 GITR 상의 동일한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 GITR-BD를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제2항에 있어서, 적어도 2개의 GITR-BD가 GITR 상의 상이한 에피토프에 결합하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 폴리펩티드가 동일한 GITR-BD의 적어도 2개의 카피를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 폴리펩티드가 동일한 GITR-BD의 적어도 3개의 카피를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 각각의 GITR-BD가 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 각각의 GITR-BD가 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 각각의 GITR-BD가 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 다수의 TBD에서 각각의 TBD가 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 다수의 TBD에서 각각의 TBD가 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 다수의 TBD에서 각각의 TBD가 서열 번호 42-62로 이루어진 군으로부터 선택된 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 다수의 TBD에서 각각의 TBD가 서열 번호 63-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GITR-BD를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 다수의 GITR-BD에서 적어도 하나의 GITR-BD가 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 다수의 GITR-BD에서 각각의 GITR-BD가 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 다수의 GITR-BD에서 각각의 GITR-BD가 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 다수의 TBD에서 각각의 TBD가 링커 폴리펩티드를 통해 작동 가능하게 연결되는 것인 단리된 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 단리된 폴리펩티드가 이종이량체화 도메인을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 단리된 폴리펩티드가 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제19항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역 폴리펩티드가 서열 번호 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, GITR-BD가 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 TBD에서 각각의 TBD가 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제21항 또는 제22항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 scFv, Fab, 단일 도메인 항체(sdAb), V_NAR 또는 VHH인 단리된 폴리펩티드.
제21항 또는 제22항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 sdAb인 단리된 폴리펩티드.
제24항에 있어서, sdAb가 인간 또는 인간화된 sdAb인 단리된 폴리펩티드.
제24항에 있어서, sdAb가 VHH, V_NAR, 조작된 VH 도메인 또는 조작된 VK 도메인인 단리된 폴리펩티드.
제23항에 있어서, sdAb가 연골 어류 중쇄 단독 항체로부터 생성되는 것인 단리된 폴리펩티드.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 TBD가 비항체 스캐폴드 단백질을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제28항에 있어서, 비항체 스캐폴드 단백질이 안키린 반복 단백질, 다르핀(darpin), 아비머, 안티칼린/리포칼린, 센티린 또는 피노머인 단리된 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 폴리펩티드가 4가인 단리된 폴리펩티드.
제30항에 있어서, 폴리펩티드가 (GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-힌지-Fc의 구조를 포함하는 융합 단백질의 2개의 카피를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제31항에 있어서, GITR-BD가 sdAb 서열인 단리된 폴리펩티드.
제31항에 있어서, GITR-BD가 인간화된 또는 완전 인간 sdAb 서열인 단리된 폴리펩티드.
제31항에 있어서, 각각의 GITR-BD가 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제31항에 있어서, 각각의 GITR-BD가 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 폴리펩티드가 6가인 단리된 폴리펩티드.
제36항에 있어서, 폴리펩티드가 (GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-힌지-Fc의 구조를 포함하는 융합 단백질의 2개의 카피를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제36항에 있어서, GITR-BD가 sdAb 서열인 단리된 폴리펩티드.
제36항에 있어서, GITR-BD가 인간화된 또는 완전 인간 sdAb 서열인 단리된 폴리펩티드.
제36항에 있어서, 각각의 GITR-BD가 서열 번호 19-80으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제36항에 있어서, 각각의 GITR-BD가 서열 번호 106, 109, 112, 117, 120, 125, 131, 138, 143, 148 및 149로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호 107, 110, 113, 115, 118, 121, 123, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 139, 141, 144 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 서열 번호 108, 111, 114, 116, 119, 122, 124, 126, 127, 129, 133, 135, 140, 142, 145, 146 및 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 단리된 폴리펩티드가 서열 번호 81-105로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
서열 번호 81-105로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
서열 번호 81-105로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
제44항에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 81-105로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제44항의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
제46항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
제44항의 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물.
암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 치료 유효량의 제48항의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
암이 존재하는 대상체의 생존을 증가시키는 방법으로서, 상기 대상체에게 치료 유효량의 제1항 또는 제43항 또는 제44항의 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.
제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 방광암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 고환암, 식도암, 위장암, 췌장암, 결장직장암, 결장암, 신장암, 두경부암, 폐암, 위암, 생식세포암, 골암, 간암, 갑상선암, 피부암, 중추 신경계의 신생물, 림프종, 백혈병, 골수종, 육종 및 바이러스 관련 암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제52항에 있어서, 암이 전이성 암, 불응성 암 또는 재발성 암인 방법.
종양 성장의 억제를 필요로 하는 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법으로서, 상기 대상체에게 치료 유효량의 제43항 또는 제44항의 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
대상체에게 제43항 또는 제44항의 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 종양내 조절 T 세포(T_reg)의 빈도를 감소시키거나, CD8+ T 세포의 활성화 및 증식을 유도하거나, 또는 T_reg 세포의 빈도를 감소시키고 CD8+ T 세포의 활성화 및 증식을 유도하는 방법.
제55항에 있어서, 상기 대상체가 CT26 마우스인 방법.
신생물 치료를 위한, 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 용도.
면역 세포를 조절하여 종양 파괴를 향상시키기 위한, 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 용도.