JP6401704B2 - Ｔ細胞を修飾する化合物およびその使用 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／７１２，０２８号の優先権の利益を請求し、その開示は、その全体が本明細書によって参照により組み込まれる。
本開示は、ゲノム編集および治療薬の分野におけるものである。

標的ＤＮＡ部位に特異的に結合するように設計されたジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびホーミングエンドヌクレアーゼを含む、操作されたヌクレアーゼは、ゲノム工学において有用である。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ヌクレアーゼドメインに融合された、操作された部位特異的なジンクフィンガーを含むタンパク質である。そのようなＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、様々な異なる種におけるゲノム修飾の使用に成功してきた。例えば、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号明細書；米国特許出願公開第２００５０２０８４８９号明細書；米国特許出願公開第２００５００２６１５７号明細書；米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書；米国特許出願公開第２００６０１８８９８７号明細書；米国特許出願公開第２００６００６３２３１号明細書；米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書；米国特許出願公開第２０１３０１７７９８３号明細書；米国特許出願公開第２０１３０１７７９６０号明細書；米国仮特許出願第６１／８２３，６８９号明細書、および国際公開第０７／０１４２７５号パンフレットを参照されたい。これらの開示は、すべての目的に対して、それらの全体が参照によって組み込まれる。これらの操作されたヌクレアーゼは、特定のヌクレオチド配列で二本鎖切断（ＤＳＢ）を作ることができ、これは、１０００倍超まで、標的遺伝子座での相同組換えの頻度を増加させる。したがって、操作されたヌクレアーゼは、相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）（ＨＤＲ）系を活用し、細胞のゲノムの中への導入遺伝子の標的組み込みを容易にするために使用することができる。そのうえ、非相同的末端結合（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ）（ＮＨＥＪ）による部位特異的ＤＳＢの不正確な修復はまた、遺伝子破壊をもたらし得る。

プログラム死受容体（ＰＤ１またはＰＤ−１、ＰＤＣＤ１としても知られている）は、慢性抗原に応じてＴ細胞活性化およびＴ細胞寛容の間のバランスを調節することに関与することが示され、免疫学的チェックポイント遺伝子として公知の遺伝子のグループのうちの１つによってコードされる。これらの遺伝子によってコードされるタンパク質は、免疫応答の大きさの調節に関与する。Ｔ細胞活性化に際して、ＰＤ１発現は、Ｔ細胞において誘導される。ＰＤ１受容体に対するリガンドは、ＰＤ１リガンド（Ｂ７−Ｈ１およびＣＤ２７２としても知られているＰＤＬ１）ならびにＰＤＬ２（Ｂ７−ＤＣおよびＣＤ２７３としても知られている）であり、通常、抗原提示細胞において発現される。ＰＤ１−ＰＤＬ（ＰＤ１リガンド）カップリングは、Ｔ細胞の非活性化を引き起こし、Ｔ細胞寛容の誘導に関与する（Ｐａｒｄｏｌｌ（２０１２）Ｎａｔ Ｒｅｖ １２：２５２を参照されたい）。ＨＩＶ１感染症の間に、ＰＤ１の発現は、ＣＤ４＋Ｔ細胞において増加すれることが分かっており、ＰＤＬ１発現はＡＰＣにおいて増加し、Ｔ細胞阻害およびＴ細胞刺激の間のバランスをＴ細胞阻害の方へ傾ける（Ｆｒｅｅｍａｎら（２００６）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０３（１０）：２２２３−２２２７を参照されたい）。ＨＩＶ感染症における場合のようにＴ細胞機能不全が慢性抗原曝露の存在下において観察される場合、ＰＤ１アップレギュレーションはＴ細胞枯渇（鍵となるエフェクター機能の進行性の損失として定義される）になんらかの形で結び付けられると考えられる。ＰＤ１アップレギュレーションはまた、慢性ウイルス感染症の間にこれらの同じ一連の細胞におけるアポトーシスの増加にも関連し得る（Ｐｅｔｒｏｖａｓら（２００９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８３（２）：１１２０−３２を参照されたい）。ＰＤ１はまた、免疫監視からの腫瘍特異的な回避においても役割を果たし得る。ＰＤ１は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の両方において腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）において高度に発現されることが実証された。ＰＤ１はまた、黒色腫浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ）においてもアップレギュレートされる（Ｄｏｔｔｉ（２００９）Ｂｌｏｏｄ １１４（８）：１４５７−５８を参照されたい）。腫瘍は、ＰＤ１リガンドＰＤ−Ｌ１またはよりまれにではあるがＰＤ１リガンドＰＤＬ２を発現することが分かっており、これは、ＣＴＬにおけるＰＤ１のアップレギュレーションと組み合わせられる場合、Ｔ細胞機能性における損失およびＣＴＬが有効な抗腫瘍応答を媒介することができないことの要因となり得る。研究者らは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）に慢性的に感染したマウスにおいて、抗ＰＤ１抗体の投与がＰＤ１−ＰＤＬ相互作用を遮断し、いくらかのＴ細胞機能性（増殖およびサイトカイン分泌）を回復させることができ、ウイルスの負荷の減少に至ったことを示した（Ｂａｒｂｅｒら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４３９（９）：６８２−６８７）。そのうえ、完全ヒトＰＤ−１特異的ＩｇＧ４モノクローナル抗体は、様々な疾患のバックグラウンド（進行型黒色腫、腎細胞癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、または前立腺癌）を有する患者に対して、がん医療（ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｓｅｔｔｉｎｇ）における臨床において試験された。臨床活性は、黒色腫、腎細胞癌および非小細胞肺癌の患者において観察され、予備データは、処置前の腫瘍によるＰＤ１リガンド発現の検出が臨床の転帰と相関することを示唆した（Ｗｏｌｆｅ（２０１２）Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｒｅｖｉｅｗ、７月；およびＰａｒｄｏｌｌ、同書を参照されたい）。

Ｔ細胞活性の他の調節因子は、ＣＴＬＡ−４受容体であり、それもまた、免疫学的チェックポイント遺伝子と考えられる。Ｔ細胞受容体共刺激分子ＣＤ２８と同様に、ＣＴＬＡ−４は、抗原提示細胞上のＣＤ８０リガンドおよびＣＤ８６リガンドと相互作用する。しかし、ＣＤ２８とのこれらの抗原の相互作用はＴ細胞の活性化を引き起こすが、ＣＤ８０またはＣＤ８６のＣＴＬＡ−４との相互作用は、ＩＬ−２分泌およびＩＬ−２受容体発現を妨げることによって、および重要な細胞周期構成成分の発現を阻害することによって、Ｔ細胞活性化をアンタゴナイズする。ＣＴＬＡ−４は、ほとんどの休止Ｔ細胞の表面上に見られないが、Ｔ細胞活性化の後に一時的にアップレギュレートされる。したがって、ＣＴＬＡ−４もまた、Ｔ細胞活性の活性化および阻害のバランスに関与する（Ａｔｔｉａら（２００５）Ｊ ＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．２３（２５）：６０４３−６０５３を参照されたい）。転移性黒色腫を有する対象におけるＣＴＬＡ ４抗体の使用を伴う最初の臨床研究は、疾患の後退を発見したが（Ａｔｔｉａ、同書）、後の研究で、抗体により処置された対象が、自己寛容の中断に関係するように思われる、治療の副作用（免疫関連性の有害事象：発疹、大腸炎、肝炎など）を示すことが分かった。このデータの分析は、抗ＣＴＬＡ４抗体の結果としてのより大きな腫瘍後退が、免疫関連性の有害事象のより重大な重症度と直接相関することを示唆した（Ｗｅｂｅｒ（２００７）Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ １２（７）：８６４−８７２）。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞表面上に発現される特異的な分子標的を免疫細胞が標的にするように設計された分子である。それらの最も基本的な形態において、それらは、特異性ドメインがその標的と相互作用する場合に、細胞が活性化されるように、細胞の外側に発現された特異性ドメインを細胞の内部のシグナル伝達経路に関連する、細胞に導入された受容体である。多くの場合、ＣＡＲは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の変異体から作製され、ｓｃＦｖまたはいくつかのタイプの受容体などのような特異性ドメインは、ＴＣＲのシグナル伝達ドメインに融合される。これらの構築物は、次いで、Ｔ細胞の中に導入され、標的抗原を発現する細胞の存在下においてＴ細胞が活性化されるようになるのを可能にし、非ＭＨＣ依存性の形で、活性化されたＴ細胞による標的細胞に対する攻撃をもたらす（Ｃｈｉｃａｙｂａｍら（２０１１）Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０：２９４−３１１を参照されたい）。現在、様々な腫瘍抗原を標的にする腫瘍特異的なＣＡＲは、様々な異なる癌の処置のために臨床において試験されている。標的にされているこれらの癌およびそれらの抗原の例は、濾胞性リンパ腫（ＣＤ２０またはＧＤ２）、神経芽細胞腫（ＣＤ１７１）、非ホジキンリンパ腫（ＣＤ２０）、リンパ腫（ＣＤ１９）、膠芽腫（ＩＬ１３Ｒα２）、慢性リンパ性白血病またはＣＬＬ、および急性リンパ性白血病またはＡＬＬ（両方ともＣＤ１９）を含む。ウイルス特異的なＣＡＲもまた、ＨＩＶなどのようなウイルスを持つ細胞を攻撃するために開発されてきた。例えば、ＨＩＶの処置のためにＧｐ１００に対して特異的なＣＡＲを使用する臨床試験が開始された（Ｃｈｉｃａｙｂａｍ、同書）。
養子細胞治療（ＡＣＴ）は、送達された細胞が患者の癌を攻撃し、取り除くために、患者に腫瘍特異的な免疫細胞を送達することに基づく、癌治療の開発中の形態である。ＡＣＴは、多くの場合、患者自身の腫瘍の塊から単離され、患者の中に再注入して戻すためにエクスビボにおいて増やされたＴ細胞である腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の使用を伴う。このアプローチは、転移性黒色腫の処置において有望とされてきており、ある研究において、＞５０％の長期応答率が観察された（例えばＲｏｓｅｎｂｅｒｇら（２０１１）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ １７（１３）：４５５０を参照されたい）。ＴＩＬは、それらが、腫瘍上に存在する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する患者自身の混合された一連の細胞であるので、細胞の有望な供給源となる（Ｗｕら（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ Ｊ １８（２）：１６０）。しかしながら、上記に述べられるように、ＴＩＬは、おそらく腫瘍におけるＰＤＬ発現のために、多くの場合、ＰＤ１発現についてアップレギュレートされ、特異的な癌細胞を標的にし、腫瘍に浸潤することができるが、一方では、がん細胞を死滅させることができない細胞の集団をもたらす。インビトロ研究は、抗ＰＤ１抗体の非存在下における刺激と比較して、抗ＰＤ１抗体の存在下においてそれらの同種の腫瘍抗原に応じてＴＩＬ増殖の著しい増加を示した（Ｗｕら、同書）。

米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号明細書 米国特許出願公開第２００５０２０８４８９号明細書 米国特許出願公開第２００５００２６１５７号明細書 米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書 米国特許出願公開第２００６０１８８９８７号明細書 米国特許出願公開第２００６００６３２３１号明細書 米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書 米国特許出願公開第２０１３０１７７９８３号明細書 米国特許出願公開第２０１３０１７７９６０号明細書 国際公開第０７／０１４２７５号

Ｐｅｔｒｏｖａｓら（２００９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８３（２）：１１２０−３２ Ｄｏｔｔｉ（２００９）Ｂｌｏｏｄ １１４（８）：１４５７−５８ Ｂａｒｂｅｒら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４３９（９）：６８２−６８７ Ｗｏｌｆｅ（２０１２）Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｒｅｖｉｅｗ、７月 Ａｔｔｉａら（２００５）Ｊ ＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．２３（２５）：６０４３−６０５３ Ｗｅｂｅｒ（２００７）Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ １２（７）：８６４−８７２ Ｃｈｉｃａｙｂａｍら（２０１１）Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０：２９４−３１１ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（２０１１）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ １７（１３）：４５５０ Ｗｕら（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ Ｊ １８（２）：１６０

Ｔ細胞に、癌細胞などのような特異的な細胞に対してその注意を再度向けさせるであろう技術を開発するのは有用であるが、これらの標的細胞が多くの場合ＰＤ−１リガンドを発現するという問題が残る。そのため、ＰＤ１−ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２相互作用は、Ｔ細胞を不活性化し、アポトーシスおよび細胞枯渇を増加させることによって、腫瘍が、ＣＡＲ標的Ｔ細胞による作用を回避するのを可能にする。そのうえ、ＰＤ１−ＰＤＬ相互作用はまた、ＨＩＶに対するＴ細胞応答の抑制にも関与し、ＰＤ１およびＰＤＬの両方の発現の増加により、Ｔ細胞枯渇に至る。活性化されたＴ細胞上のＣＴＬＡ−４発現の誘導もまた、免疫応答を減退させることに対する第１のステップのうちの１つであり、したがって、ＣＡＲを持つＴ細胞は、Ｔ細胞阻害とＴ細胞活性化とのバランスを保つように設計されたこの系の関与のために、不活性になり得る。

したがって、研究および治療上の適用において使用することができるＰＤ１標的および／またはＣＴＬＡ−４調節因子、例えばＰＤ１および／またはＣＴＬＡ−４−標的ヌクレアーゼまたは転写抑制因子の必要性が残っている。

本開示は、Ｔ細胞阻害を予防するまたは低下させるための、必要に応じて、操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と組み合わせた、ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ−４の不活性化のための免疫学的チェックポイント標的ヌクレアーゼ、例えば、操作されたメガヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、およびＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の開発に関する。本開示はまた、Ｔ細胞阻害を予防するまたは低下させるための、必要に応じて、操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と組み合わせた、ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ−４の不活性化のための転写抑制因子、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの融合タンパク質、ジンクフィンガーベースの融合タンパク質、およびＴＡＬＥベースの融合タンパク質の開発にも関する。

本開示は、ヒトおよびげっ歯動物ＰＤ１に対して特異的なジンクフィンガータンパク質ならびにこれらのＰＤ１特異的ジンクフィンガータンパク質を含むジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ−ＴＦ）またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む融合タンパク質を提供する。本開示はまた、ヒトＣＴＬＡ−４に対して特異的なジンクフィンガータンパク質およびこれらのＣＴＬＡ−４特異的ジンクフィンガータンパク質を含むジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む融合タンパク質をも提供する。本開示はまた、ヒトＰＤ１に対して特異的な活性ＴＡＬＥタンパク質、およびこれらのＰＤ１特異的ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む融合タンパク質をも提供する。ある実施形態では、ジンクフィンガータンパク質が、Ｎ−末端からＣ−末端にＦ１からＦ５に並べられた５つのジンクフィンガー認識領域を含み、認識領域は、表２ａまたは表２ｃの一行に示される下記のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＴＡＬ−エフェクタードメイン（ＴＡＬＥ）が、複数のＴＡＬＥ反復単位を含み、それぞれの反復単位が、標的配列中の核酸に結合する反復可変二残基（Ｒｅｐｅａｔ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）（ＲＶＤ）領域を含み、ＴＡＬＥは、示される配列番号：２９〜３４（表５に示される）のような標的配列に結合する。

本発明のＰＤ１および／もしくはＣＴＬＡ−４特異的ジンクフィンガー、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、またはＴＡＬＥタンパク質を含むタンパク質は、ＰＤ１が発現され（例えば過剰発現され）、標的細胞によるＰＤＬの過剰発現のために、活性化されたＴ細胞の不活性化もしくは枯渇をもたらす、任意の疾患もしくは障害、および／またはＣＴＬＡ−４の関与の予防が有益になるであろう疾患もしくは障害の処置を含む、研究および治療目的に使用されてもよい。例えば、Ｔ細胞におけるＰＤ１遺伝子座のジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼターゲティングは、慢性感染症および悪性腫瘍の両方におけるＰＤ１依存性免疫抑制を遮断するために使用することができる。同様に、Ｔ細胞におけるジンクフィンガー、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＴＡＬＥヌクレアーゼ、および／またはＣＴＬＡ−４のターゲティングは、例えば癌の処置において、ＣＴＬＡ−４媒介性のＴ細胞阻害を予防するために使用することができる。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびメガヌクレアーゼの結合から誘導された融合タンパク質もまた、類似する遺伝子ノックダウンまたはノックアウトのためにＰＤ１および／またはＣＴＬＡ−４に指向させることができる。転写抑制因子ドメインに融合された操作されたジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ由来の転写抑制因子タンパク質はまた、ＰＤ１またはＣＴＬＡ−４媒介性のＴ細胞阻害を予防するために使用することができる。

本発明の他の態様では、融合タンパク質が、ヒトＰＤ１またはＣＴＬＡ−４遺伝子に対して特異的であるジンクフィンガー（ＺＦＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、またはＴＡＬＥ（ＴＡＬＥＮ）ヌクレアーゼを含む。ある実施形態では、ＰＤ−１に対して特異的なヌクレアーゼ融合タンパク質のジンクフィンガードメインが、天然に存在しない認識ヘリックスを含み、および／または米国特許出願公開第２０１１０１３６８９５号明細書において開示される標的部位に結合し（表２ａおよび２ｂを参照されたい）、ＴＡＬＥタンパク質が、表５ａおよび５ｂにおいて示されるＰＤ１における標的部位に結合する。他の実施形態では、ＣＴＬＡ−４に対して特異的な融合タンパク質のジンクフィンガードメインが、表２ｃにおいて示される天然に存在しない認識ヘリックスを含む、および／または表３において示される標的部位に結合する。

他の態様では、ゲノム中のＰＤ１またはＣＴＬＡ−４遺伝子における目的の領域における標的部位に結合するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、本明細書において記載され、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓヌクレアーゼおよび操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（または単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ））を含む。米国仮特許出願第６１／８２３，６８９号明細書もまた参照されたい。

他の態様では、本明細書において記載されるヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、例えば、１つまたは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、１つまたは複数のＴＡＬＥＮ、１つまたは複数のメガヌクレアーゼ、および／または１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、提供される。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその組み合わせを含むことができる。ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、プラスミドを含む。他の実施形態では、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡを含む。

一態様では、本発明の方法および組成物が、操作された（遺伝子修飾された）Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（例えばＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（例えばＣＤ８＋）、記憶Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ、ＣＤ３＋）などを含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、Ｔ細胞が、ＰＤ−１特異的ヌクレアーゼ（例えば細胞におけるＰＤ１の不活性化のための）を含み、他方で、さらなる実施形態では、Ｔ細胞が、ＰＤ−１特異的ヌクレアーゼおよび少なくとも１つの導入遺伝子ドナーを含む。ある実施形態では、Ｔ細胞が、ＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼ（例えば細胞におけるＣＴＬＡ−４の不活性化のための）を含み、他方で、さらなる実施形態では、Ｔ細胞が、ＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼおよび少なくとも１つの導入遺伝子ドナーを含む。他の実施形態では、遺伝子修飾されたＴ細胞が、内因性ＰＤ１遺伝子および内因性ＣＴＬＡ−４遺伝子の両方でヌクレアーゼによって修飾される。さらなる実施形態では、遺伝子修飾されたＴ細胞が、内因性ＴＣＲならびに内因性ＰＤ１およびＣＴＬＡ−４遺伝子で少なくとも１つのヌクレアーゼによって修飾される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの導入遺伝子ドナーが、キメラ抗体受容体（ＣＡＲ）をコードする。ある実施形態では、ＣＡＲドナーが、内因性ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ−４遺伝子の中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲドナーが、セーフハーバー位置（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ）の中への標的組込みによって組み込まれる。他の実施形態では、ＣＡＲをコードする外因性配列が、レンチウイルス送達系を使用して、ランダムな組み込みによって導入される。他の実施形態では、ＣＡＲドナーが、トランスポゾンベースの送達系を使用して、ランダムな組み込みによって導入される。

他の実施形態では、Ｔ細胞が、少なくとも２つの導入遺伝子ドナーを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの導入遺伝子ドナーが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えばＴＲＡＣおよびＴＲＢＣのサブユニットをコードする（参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１０１５８９５７号明細書を参照されたい）。いくつかの例では、ＴＣＲサブユニットは、ドナーから発現された場合に、ＴＡＡに対する特異性を有するＴＣＲを含む。いくつかの実施形態は、内因性ＴＣＲとの関連を最小限にするように設計された、操作されたＴＣＲ鎖を含む。他の実施形態では、内因性ＴＣＲが、操作されたヌクレアーゼ媒介性の遺伝子破壊によって非機能的にされる。

いくつかの実施形態では、導入遺伝子ドナーは、導入遺伝子が発現され、ＰＤ１またはＣＴＬＡ ４発現が破壊されるようにＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４遺伝子座の中に挿入される。他の実施形態では、操作されたＴ細胞は、標的組み込みによってセーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）の遺伝子座（例えばＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、またはＨＰＲＴ）の中に導入遺伝子が挿入されるように、ＰＤ１またはＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼ、セーフハーバーに対して特異的な第２のヌクレアーゼ、および導入遺伝子を含む。例えば米国特許第７，９５１，９２５号明細書ならびに米国特許出願公開第２００８０１５９９９６号明細書；米国特許出願公開第２０１０００２１８２６４号明細書；米国特許出願公開第２０１３０１７７９８３号明細書；米国特許出願公開第２０１３０１７７９６０号明細書；米国特許出願公開第２０１３０１３７１０４号明細書；および米国特許出願公開第２０１３０１２２５９１号明細書を参照されたい。他の実施形態では、Ｔ細胞が、ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼ、ＣＡＲをコードする導入遺伝子、ならびに他のオープンリーディングフレームをコードする第２の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第２の導入遺伝子が、自殺遺伝子をコードする。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞が、ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼ、ＣＡＲをコードする導入遺伝子、およびＴＡＡ特異的ＴＣＲをコードする一連の導入遺伝子を含む。他の態様では、ヌクレアーゼが組み込まれる前に、ドナー導入遺伝子が、Ｔ細胞の中に組み込まれ、他方で、いくつかの態様では、ドナー導入遺伝子およびヌクレアーゼの両方が、Ｔ細胞の中に一緒に導入される。

他の態様では、Ｔ細胞を修飾する方法が、本明細書において記載される。ある実施形態では、Ｔ細胞におけるＰＤ１および／またはＣＴＬＡ−４発現が、例えば、ジンクフィンガーもしくはＴＡＬＥ転写因子、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよび／もしくはＴＡＬＥＮ、ならびに／またはＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系を使用して低下させられるまたは不活性化される。ある実施形態では、方法が、本明細書において記載されるＰＤ１修飾細胞および／またはＣＴＬＡ−４修飾細胞のいずれかの中に１つまたは複数の外因性配列（例えば導入遺伝子）、例えば、ＣＡＲをコードする導入遺伝子および／またはＴＡＡ特異的ＴＣＲをコードする一連の導入遺伝子を導入するステップをさらに含む。ある実施形態では、Ｔ細胞が、例えば、米国特許出願公開第２００８０３１１０９５号明細書において記載されるビーズ活性化により活性化される。他の実施形態では、Ｔ細胞が、休止している。いくつかの態様では、Ｔ細胞が、ＴＩＬである。他の態様では、Ｔ細胞が、ＴＩＬに由来するＴ細胞系統を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬが、そのＨＬＡサブタイプについて特徴付けられ、他の実施形態では、ＴＩＬが、特異的に操作されたＨＬＡノックアウトおよび／またはノックインを持つ（本明細書において参照によって組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２００６０２３０号明細書を参照されたい）。

他の態様では、本発明の方法が、治療上の処置の必要がある対象の治療上の処置のための組成物を含む。いくつかの実施形態では、組成物が、ＰＤ１またはＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼ、セーフハーバー特異的ヌクレアーゼ、ＣＡＲをコードする少なくとも１つの導入遺伝子ドナー、第２の導入遺伝子ドナー、ならびにそのヌクレアーゼおよびドナーの任意の組み合わせを含む、操作されたＴ細胞またはＴＩＬを含む。いくつかの態様では、導入遺伝子ドナーが、ＴＡＡ特異的ＴＣＲをコードする。他の実施形態では、組成物が、ＰＤ１またはＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼおよびＣＡＲをコードする導入遺伝子ドナーを含む、操作されたＴ細胞またはＴＩＬを含む。

他の態様では、ＰＤ１またはＣＴＬＡ−４遺伝子の調節のための方法および組成物が、本明細書において提供される。ある実施形態では、方法が、ＰＤ１またはＣＴＬＡ−４の遺伝子に結合し、修飾するヌクレアーゼ（例えばＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥメガヌクレアーゼ融合物など）を導入するステップを含む。ある実施形態では、ヌクレアーゼが、疾患または障害を予防するまたは処置するための、疾患または障害を有する対象由来の細胞の中への、ＰＤ１またはＣＴＬＡ−４遺伝子座の標的部位に結合するように操作されたジンクフィンガーもしくはＴＡＬＥ融合タンパク質を含む融合タンパク質（または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）である。いくつかの実施形態では、方法が、ＰＤ１またはＣＴＬＡ−４遺伝子に結合し、その発現を抑制する、転写調節因子（例えばＺＦＰ−ＴＦ、ＴＡＬＥ−ＴＦ、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ−ＴＦなど）を細胞の中に導入するステップを含む。いくつかの実施形態では、疾患または障害が、癌または悪性腫瘍であり、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ融合タンパク質が、ヌクレアーゼまたは転写抑制ドメインを含む融合タンパク質である。他の実施形態では、ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を含む。処置するおよび／または予防することができる癌の非限定的な例は、肺癌、膵癌、肝臓癌、黒色腫、骨肉腫、乳癌、結腸直腸癌、白血病、卵巣癌、リンパ腫、脳癌などを含む。

本発明のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系を含むキットもまた、提供される。キットは、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸（例えば、適した発現ベクター中に含有されるＲＮＡ分子またはＺＦＰ、ＴＡＬＥＮ、もしくはＣａｓ９コード遺伝子）および必要であれば操作されたｓｇ ＲＮＡまたは一定分量のヌクレアーゼタンパク質、ドナー分子、適した宿主細胞系統、本発明の方法を実行するための説明書などを含んでいてもよい。

図１は、Ｃｅｌ−Ｉアッセイ（本文中に記載）を使用する、Ｋ５６２細胞におけるＰＤ１特異的ＴＡＬＥＮの活性（インデル検出％によって測定）を示すゲルを示すグラフである。レーン名称は本文中のとおりであり、検出されたインデル％は、それぞれのレーンの下に示す。

図２は、示されるヌクレアーゼおよび条件を使用して、Ｃｅｌ−１アッセイによって決定された非相同的末端結合事象（ＮＨＥＪ）パーセントを示す図ある。「Ｒ５」は、ＣＣＲ５特異的ＺＦＮ ｍＲＮＡによりエレクトロポレーションされた細胞を指す（例えば米国特許第７，９５１，９２５号明細書を参照されたい）。「ＰＤ１」は、ＰＤ１特異的ＺＦＮ ｍＲＮＡによりエレクトロポレーションされた細胞を指す（例えば米国特許出願公開第２０１１０１３６８９５号明細書を参照されたい）。「Ｃ１」および「Ｃ３」は、エレクトロポレーション条件を指す。それぞれの対の左の棒は、ｍＲＮＡエレクトロポレーションの３日後（ＥＰＤ３）の、示される条件でのＮＨＥＪ ％を示し、右の棒は、ｍＲＮＡエレクトロポレーションの５日後（ＥＰＤ５）の、示される条件でのＮＨＥＪ ％を示す。

（詳細な説明）
ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ−４の調節のための組成物および方法が、本明細書において記載される。これらの組成物および方法は、研究および治療上の適用に有用であり、ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ−４遺伝子を破壊するための、操作されたヌクレアーゼを介してのゲノム編集の使用を伴う。本発明の方法はまた、ＰＤ１またはＣＴＬＡ−４遺伝子の発現を予防するために、転写抑制因子に融合されたＰＤ１もしくはＣＴＬＡ−４特異的ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。含まれる方法および組成物はまた、ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ−４破壊と共に、Ｔ細胞における特異的な細胞標的に対するＴ細胞の活性化のためのキメラ抗原受容体の使用を示す。

Ｔ細胞上に発現されるＰＤ１の、ＰＤ１リガンドとの相互作用は、Ｔ細胞の非活性化を引き起こし得る。いくつかの癌細胞は、ＰＤ１リガンドを発現し、このようにして、免疫監視を回避することができ、ＰＤ−１リガンドの非存在下においてその癌細胞を破壊することができるＴ細胞が存在するにもかかわらず増殖することができる。さらに、たとえＴ細胞が、そのＴ細胞を活性化し、かつ特定のマーカーを持つ細胞に再度指向させるＣＡＲを発現するように、Ｔ細胞が修飾されていたとしても、その標的細胞によるＰＤ１リガンドの発現は、活性化されたＴ細胞の脱感作を引き起こし得、次いで、脱感作されたＴ細胞は、もはや標的細胞に作用しないであろう。

ＣＴＬＡ−４発現は、活性化されたＴ細胞上でＴ細胞活性化に際して誘導され、抗原提示細胞活性化抗原ＣＤ８０およびＣＤ８６と結合について競合する。ＣＤ８０またはＣＤ８６とのＣＴＬＡ−４の相互作用は、Ｔ細胞阻害を引き起こし、免疫応答のバランスを維持する役割を果たす。しかしながら、ＣＤ８０またはＣＤ８６とのＣＴＬＡ−４相互作用の阻害は、Ｔ細胞活性化を延長し、したがって、癌抗原に対する免疫応答のレベルを増加させ得る。本発明は、ジンクフィンガーもしくはＴＡＬＥ−転写因子融合物による、または遺伝子をノックアウトするためのＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼによるＴ細胞の処理を介しての、ＣＴＡＬ−４の発現の遮断を介したＣＴＡＬ−４相互作用の阻害を記載する。

ＣＡＲ技術は、特異的な細胞を攻撃するデザイナーＴ細胞（ｄｅｓｉｇｎｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ）の可能性を提示し、それらのＴ細胞の標的は、研究者によって選ばれる。医学研究者たちは、長い間、Ｔ細胞は、当然のことながら悪性細胞または異常な細胞を定期的に除去するが、おそらく、ＰＤ−１リガンドにより駆動される免疫応答の減退の使用を通して回避することができるいくつかの癌があることを示唆してきた。したがって、ＣＡＲの使用は有望であるように思われるが、それらの同じ細胞におけるＰＤ１またはＣＴＬＡ−４発現を抑制するまたはノックアウトするための転写因子および／またはヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの）と組み合わせた、ＣＡＲ（Ｔ細胞が特定の腫瘍細胞を標的にするようにする）を発現するように操作されたＴ細胞の組み合わせは、様々な疾患ならびに障害を研究し、処置するための新規な細胞および動物モデルならびに方法を提供する。

概説
本明細書において開示される方法の実施ならびに組成物の調製および使用は、別段の指示がない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、ならびに当技術分野の範囲内にある関連する分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献において十分に説明される。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９および第３版、２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９８７および定期的改訂版；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ；Ｗｏｌｆｆｅ、ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，第３０４巻、“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ． ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ． Ｐ． Ｗｏｌｆｆｅ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、１９９９；およびＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、第１１９巻、“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ． Ｂｅｃｋｅｒ編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、トトワ、１９９９を参照されたい。

定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、直鎖または環状コンホメーションで、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的について、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定するものとして解釈されないものとする。これらの用語は、天然のヌクレオチドの公知の類似体ならびに塩基、糖、および／またはリン酸部分（例えばホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドを包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成の特異性を有する、つまり、Ａの類似体はＴと塩基対形成するであろう。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用される。これらの用語はまた、１つまたは複数のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

「結合（する）」は、高分子間の（例えばタンパク質および核酸の間の）配列特異的な非共有結合による相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用のすべての構成要素が配列特異的である必要があるわけではない（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と接触する）。そのような相互作用は、１０^−６Ｍ^−１以下の解離定数（Ｋ_ｄ）によって一般に特徴付けられる。「親和性」は、結合の強度を指し、結合親和性の増加は、より低いＫ_ｄと相関する。

「結合タンパク質」は、他の分子に非共有結合で結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えばＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合には、それはそれ自体に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）、および／またはそれは異なるタンパク質（複数可）の１つまたは複数の分子に結合することができる。結合タンパク質は、１つを超えるタイプの結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、およびタンパク質結合活性を有する。

「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、構造が亜鉛イオンの配位を通して安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１つまたは複数のジンクフィンガーを通して配列特異的な形でＤＮＡに結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。

「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたは複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、その同種の標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。単一の「反復単位」（「リピート」とも呼ばれる）は、典型的に、３３〜３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。それぞれのＴＡＬＥ反復単位は、典型的にリピートの１２位および／または１３位に反復可変二残基（ＲＶＤ）を構成する、１つまたは２つのＤＮＡ結合残基を含む。これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識のための天然の（標準）コードは、１２位および１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡに、ＮＮがＧまたはＡに結合し、ＮＧがＴに結合するように決定され、そして、非標準（非定型的）ＲＶＤもまた、知られている。その全体が本明細書において参照によって組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい。

「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ」または「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系」は、ＤＮＡに結合する非コードＲＮＡ分子（ガイド）ＲＮＡおよびヌクレアーゼの機能性（例えば２つのヌクレアーゼドメイン）を有するＣａｓタンパク質（Ｃａｓ９）を含む。例えば米国特許仮出願第６１／８２３，６８９号明細書を参照されたい。

本明細書において記載される方法のいずれかにおいて、ジンクフィンガータンパク質および／またはＴＡＬＥＮタンパク質のさらなるペアは、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断に使用することができる。そのうえ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、単独でまたはさらなる二本鎖切断を誘導するためにＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮと組み合わせて使用されてもよい。

ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１つまたは複数のアミノ酸の改変）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作する」ことができる。そのため、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が主に合理的な判定基準から結果として生じる、天然に存在しないタンパク質である。設計の合理的な判定基準は、置換規則ならびに既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計および結合データの情報を保存しているデータベースにおける情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用を含む。例えば米国特許第６，１４０，０８１号明細書；米国特許第６，４５３，２４２号明細書；および米国特許第６，５３４，２６１号明細書を参照されたい；国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；国際公開第９８／５３０５９号パンフレット；国際公開第９８／５３０６０号パンフレット；国際公開第０２／０１６５３６号パンフレット、および国際公開第０３／０１６４９６号パンフレットならびに米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３明細書もまた参照されたい。

「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、産生が、主として、ファージディスプレー、相互作用トラップ（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｔｒａｐ）、またはハイブリッド選択などの経験的なプロセスから結果として生じる、天然に見られないタンパク質である。例えば米国特許第５，７８９，５３８号明細書；米国特許第５，９２５，５２３号明細書；米国特許第６，００７，９８８号明細書；米国特許第６，０１３，４５３号明細書；米国特許第６，２００，７５９号明細書；国際公開第９５／１９４３１号パンフレット；国際公開第９６／０６１６６号パンフレット；国際公開第９８／５３０５７号パンフレット；国際公開第９８／５４３１１号パンフレット；国際公開第００／２７８７８号パンフレット；国際公開第０１／６０９７０号パンフレット、国際公開第０１／８８１９７号パンフレット；国際公開第０２／０９９０８４号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい。

「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合の骨格の破損を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない様々な方法によって開始することができる。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は２つの別個の一本鎖切断事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生をもたらすことができる。ある実施形態では、融合ポリペプチドが、標的二本鎖ＤＮＡ切断に使用される。

「切断ハーフドメイン（ｃｌｅａｖａｇｅ ｈａｌｆ−ｄｏｍａｉｎ）」は、第２のポリペプチド（同一かまたは異なるかのいずれか）と共に、切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第１および第２の切断ハーフドメイン」；「＋および−切断ハーフドメイン」、ならびに「右および左切断ハーフドメイン」は、交換可能に使用され、二量体化する切断ハーフドメインのペアを指す。「操作された切断ハーフドメイン」は、他の切断ハーフドメイン（例えば他の操作された切断ハーフドメイン）と偏性ヘテロ二量体を形成するように修飾された切断ハーフドメインである。それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書、米国特許出願公開第２００７０２１８５２８号明細書、米国特許出願公開第２００８０１３１９６２号明細書、および米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号明細書もまた参照されたい。

用語「配列」は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、これは、ＤＮＡまたはＲＮＡとすることができ、直鎖、環状、または分岐とすることができ、一本鎖または二本鎖のいずれかとすることができる。用語「ドナー配列」は、ゲノムの中に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば２〜１０，０００ヌクレオチド長（またはその間のもしくはそれを超える任意の整数値）、好ましくは約１００〜１，０００ヌクレオチド長（またはその間の任意の整数）、より好ましくは約２００〜５００ヌクレオチド長とすることができる。「クロマチン」は、細胞のゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞のクロマチンは、核酸、主としてＤＮＡならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。大多数の真核生物の細胞のクロマチンは、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、それぞれ２つのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４を含む八量体と関連するおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含み、リンカーＤＮＡ（生物に依存する可変長の）は、ヌクレオソームコア間にわたる。ヒストンＨ１の分子は、一般に、リンカーＤＮＡに関連する。本開示の目的について、用語「クロマチン」は、原核生物および真核生物の両方のすべてのタイプの細胞の核タンパク質を包含することを意味する。細胞のクロマチンは、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方を含む。

「染色体」は、細胞のゲノムのすべてまたは一部分を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、その核型によって特徴付けられ、これは、細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合体である。細胞のゲノムは、１つまたは複数の染色体を含むことができる。

「エピソーム」は、細胞の染色体の核型の一部でない核酸を含む、複製する核酸、核タンパク質複合体、または他の構造である。エピソームの例は、プラスミドおよび特定のウイルスゲノムを含む。

「標的部位」または「標的配列」は、結合分子が結合するであろう核酸の一部分を規定する核酸配列であるが、ただし、結合のための十分な条件が存在することを条件とする。例えば、配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’は、Ｅｃｏ ＲＩ制限エンドヌクレアーゼについての標的部位である。

「慢性感染症」は、感染症が持続している、感染病原体によって引き起こされる疾患である。そのような疾患は、肝炎（Ａ、Ｂ、またはＣ）、ヘルペスウイルス（例えばＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ、ＣＭＶ、およびＥＢＶ）、ならびにＨＩＶ／ＡＩＤＳを含み得る。非ウイルスの例は、アスペルギルス症、カンジダ症、コクシジオイデス症、ならびにクリプトコックスおよびヒストプラズマ症に関連する疾患などのような慢性真菌性疾患を含んでいてもよい。慢性細菌感染病原体の非限定的な例は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓであってもよい。

用語「自己免疫性疾患」は、対象が自身の組織に対して破壊性免疫応答を開始する、任意の疾患または障害を指す。自己免疫性障害は、対象（例えばヒト）におけるほとんどすべての臓器系に影響を与え得、神経系、胃腸系、および内分泌系ならびに皮膚および他の結合組織、眼、血液、ならびに血管の疾患を含むが、これらに限定されない。自己免疫性疾患の例は、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、グレーブス病、強皮症、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、および糖尿病を含むが、これらに限定されない。

本明細書において使用される用語「癌」は、特有の特徴−正常な制御の喪失−が、無秩序な増殖、分化の欠如、局所的な組織侵潤、および転移をもたらす細胞の過剰増殖として定義される。本発明の方法に関して、癌は、急性リンパ性癌（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱癌、骨肉腫、脳癌、乳癌、肛門、肛門管、または肛門直腸の癌、眼の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、頸部、胆嚢、または胸膜の癌、鼻、鼻腔、または中耳の癌、口腔癌、外陰部の癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性癌（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、白血病、液性腫瘍、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵癌、腹膜、網、および腸間膜の癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、固形腫瘍、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、ならびに膀胱癌のいずれかを含む、任意の癌とすることができる。本明細書において使用されるように、用語「腫瘍」は、別段の具体的な指示がない限り、悪性タイプの細胞または組織の異常な増殖を指し、良性タイプの組織を含まない。本明細書において使用される用語「阻害する」または「阻害すること」は、増殖／複製を低下させることを意味する。

用語「免疫学的チェックポイント遺伝子」は、免疫応答の大きさを調節するように作用する阻害性プロセス（例えばフィードバックループ）、例えば有害な免疫応答の制御されていない伝播を緩和する免疫阻害性フィードバックループに関与する任意の遺伝子を指す。これらの応答は、感染症に対する免疫応答の間に起こり得る付随的な組織損傷から保護する分子シールドおよび／または周辺の自己寛容の維持に寄与することを含む。免疫学的チェックポイント遺伝子の非限定的な例は、広範囲のＣＤ２８ファミリーの受容体のメンバーおよびそれらのリガンドならびに共阻害性（ｃｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）経路（例えばＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１）に関与する遺伝子を含む。

「外因性の」分子は、細胞中に通常存在しないが、１つまたは複数の遺伝的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞の中に導入することができる分子である。「細胞における通常の存在」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成人の筋細胞に関して外因性の分子となる。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に関して外因性の分子となる。外因性の分子は、例えば、機能障害内因性分子の機能的バージョンまたは通常機能する内因性の分子の機能障害的バージョンを含むことができる。

外因性の分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されるような小分子、もしくはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖などの高分子、上記の分子の任意の修飾された誘導体、または１つまたは複数の上記の分子を含む任意の複合体であり得る。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖とすることができ、直鎖、分岐、または環状とすることができ、任意の長さとすることができる。核酸は、二本鎖を形成することができるものおよび三重鎖形成核酸を含む。例えば米国特許第５，１７６，９９６号明細書および米国特許第５，４２２，２５１号明細書を参照されたい。タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、レコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼを含むが、これらに限定されない。

外因性の分子は、内因性の分子と同じタイプの分子、例えば外因性のタンパク質または核酸とすることができる。例えば、外因性の核酸は、感染しているウイルスゲノム、細胞の中に導入されたプラスミドもしくはエピソーム、または細胞中に通常存在しない染色体を含むことができる。細胞の中への外因性の分子の導入のための方法は、当業者らに公知であり、脂質媒介性の移入（つまり中性脂質およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接的な注射、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性の移入、ならびにウイルスベクター媒介性の移入を含むが、これらに限定されない。

対照的に、「内因性の」分子は、特定の環境条件下で特定の発生段階で特定の細胞中に通常存在する分子である。例えば、内因性の核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体、もしくは他の細胞小器官のゲノムまたは天然に存在するエピソーム核酸を含むことができる。さらなる内因性の分子は、タンパク質、例えば転写因子および酵素を含むことができる。

「融合」分子は、好ましくは共有結合で２つ以上のサブユニット分子が連結されている分子である。サブユニット分子は、同じ化学的タイプの分子とすることができ、または異なる化学的タイプの分子とすることができる。第１のタイプの融合分子の例は、融合タンパク質（例えばＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインの間の融合物）；融合核酸（例えば上に記載される融合タンパク質をコードする核酸）、ならびに核酸およびタンパク質の間の融合物（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系）を含むが、これらに限定されない。第２のタイプの融合分子の例は、三重鎖形成核酸およびポリペプチドの間の融合物ならびにマイナーグルーブバインダー（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）および核酸の間の融合物を含むが、これらに限定されない。

細胞における融合分子の発現は、融合分子の細胞への送達から結果として生じ得、例えば、融合タンパク質については、融合タンパク質の細胞への送達によるものである、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達によるものであり、ポリヌクレオチドは転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質が生成される。トランススプライシング、ポリペプチド切断、およびポリペプチドライゲーションもまた、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド送達のための方法は、本開示において別記される。

本開示の目的のための「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（以下を参照されたい）ならびに遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域を含み、これは、そのような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているかどうかにかかわらない。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネータ、リボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位などのような翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製開始点、マトリックス付着部位、ならびに遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない。

「遺伝子発現」は、遺伝子産物への、遺伝子中に含有される情報の変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、もしくは任意の他のタイプのＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって生成されるタンパク質とすることができる。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのようなプロセスによって修飾されるＲＮＡならびに例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）、およびグリコシル化によって修飾されるタンパク質を含む。

遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の発現レベルにおける変化を指す。発現の調節は、遺伝子活性化および遺伝子抑制を含むことができるが、これらに限定されない。調節はまた、完全であってもよい、すなわち、遺伝子発現は完全に不活性化される、もしくは野生型レベル以上まで活性化される、またはそれは部分的であってもよく、遺伝子発現は部分的に低下させられる、もしくは一部の野生型レベルまで部分的に活性化される。「真核生物」細胞は、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、およびヒト細胞（例えばＴ細胞）を含むが、これらに限定されない。

用語「動作可能な連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｌｉｎｋａｇｅ）」および「動作可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」（または「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」）は、２つ以上の構成成分（配列エレメントなど）の並列に関して交換可能に使用され、構成成分は、両方の構成成分が正常に機能し、少なくとも１つの構成成分が、少なくとも１つの他の構成成分に発揮される機能を媒介することができることを可能にするように配置されている。例として、プロモーターなどの転写調節配列は、転写調節配列が、１つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応じてコード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に動作可能に連結されている。転写調節配列は、一般に、コード配列とシスで動作可能に連結されるが、それに直接隣接している必要はない。例えば、たとえエンハンサーおよびコード配列が連続していなくても、エンハンサーは、コード配列に動作可能に連結されている転写調節配列である。

融合ポリペプチドに関して、用語「動作可能に連結された」は、構成成分のそれぞれが、別の構成成分と連結して、それがそのように連結されていなかった場合に発揮すると思われる機能と同じ機能を発揮するという事実を指すことができる。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、またはＣａｓ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、他方で、切断ドメインが標的部位の近くでＤＮＡを切断することができる場合、ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは、動作可能に連結されている。同様に、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、またはＣａｓ ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインまたは抑制ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、他方で、活性化ドメインが遺伝子発現をアップレギュレートすることができる、または抑制ドメインが遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる場合、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインまたは抑制ドメインは、動作可能に連結されている。遺伝子発現を調節することができるドメインに融合されたＺＦＰは、「ＺＦＰ−ＴＦ」または「ジンクフィンガー転写因子」と総称して呼ばれるが、遺伝子発現を調節することができるドメインに融合されたＴＡＬＥは、「ＴＡＬＥ−ＴＦ」または「ＴＡＬＥ転写因子」と総称して呼ばれ、遺伝子発現を調節することができるドメインに連結されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＴＦ」と総称して呼ばれる。

タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的断片」は、その配列が全長タンパク質、全長ポリペプチド、または全長核酸と同一ではないが、全長タンパク質、全長ポリペプチド、または全長核酸と同じ機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子よりも多い、少ない、もしくはそれと同じ数の残基を持つことができ、および／または１つまたは複数のアミノ酸置換もしくはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えばコーディング機能、他の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当技術分野において周知である。同様に、タンパク質の機能を決定するための方法は、周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる。Ａｕｓｕｂｅｌら、前掲を参照されたい。タンパク質が他のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または遺伝的および生化学的両方の相補性によって決定することができる。例えばＦｉｅｌｄｓら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４０：２４５−２４６；米国特許第５，５８５，２４５号明細書および国際公開第９８／４４３５０号パンフレットを参照されたい。

「ベクター」は、標的細胞に遺伝子配列を移入することができる。典型的に、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指向させることができ、標的細胞に遺伝子配列を移入することができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクルならびに組み込みベクターを含む。

「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」は、好ましくは必ずというわけではないが常用的なアッセイにおいて、容易に測定されるタンパク質産物を生成する任意の配列を指す。適したレポーター遺伝子は、抗生物質耐性（例えばアンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、プロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色タンパク質または蛍光タンパク質または発光性タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）ならびに細胞増殖の増強および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列を含むが、これらに限定されない。エピトープタグは、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡ、または任意の検出可能なアミノ酸配列の１つまたは複数のコピーを含む。「発現タグ」は、目的の遺伝子の発現をモニターするために所望の遺伝子配列に作動可能に連結されてもよいレポーターをコードする配列を含む。

「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）は、リンパ球においてシグナル伝達を担う免疫受容体に連結された特異性ドメインまたは認識（すなわち結合）ドメインを含む、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである。最も一般的には、結合ドメインは、特異性ドメイン内の抗体鎖間の可動性リンカーの導入を介して単鎖ｓｃＦｖに作りあげられたＦａｂ抗体断片に由来する。他の可能な特異性ドメインは、ホルモン分子またはサイトカイン分子のシグナル伝達部分、受容体の細胞外ドメイン、およびライブラリー（例えばファージ）スクリーニングによって単離されたペプチドリガンドまたはペプチドを含むことができる（ＲａｍｏｓおよびＤｏｔｔｉ、（２０１１）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏ Ｔｈｅｒ １１（７）：８５５を参照されたい）。ＣＡＲのシグナル伝達部分および結合部分の間の可動性は、標的ドメインおよび結合ドメインの間のより最適な相互作用を可能にするのに望ましい特質であり得、そのため、多くの場合、ヒンジ領域が含まれる。使用することができる構造の１つの例は、ＩｇＧ分子などの免疫グロブリン由来のＣＨ２−ＣＨ３領域である。典型的なＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ゼータ鎖などのＴＣＲ−ＣＤ３複合体の細胞内ドメインを含む。あるいは、Ｆｃ受容体のγ鎖が、使用されてもよい。典型的なＣＡＲの膜貫通部分は、ＣＤ４、ＣＤ８、またはＣＤ２８などのタンパク質の膜貫通部分を含むことができる（ＲａｍｏｓおよびＤｏｔｔｉ、同書）。いくつかのＣＡＲの特質は、非ＭＨＣ拘束性の形で、選択される標的にＴ細胞特異性およびＴ細胞反応性を再度指向させるそれらの能力を含む。非ＭＨＣ拘束性標的認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシング、したがって、腫瘍回避の主なメカニズムの迂回と無関係に標的を認識する能力を与える。

いわゆる「第一世代」ＣＡＲは、多くの場合、ＣＤ３ゼータ鎖などの単一の内部シグナル伝達ドメインを含み、おそらく不完全な活性化のために、臨床においていくぶん効果のないものと考えられる。これらのＣＡＲを持つＴ細胞の性能を増加させるために、第２世代ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、Ｌｃｋ、ＩＣＯＳ、およびＤＡＰ１０などの他の受容体の細胞間ドメインに多くの場合由来する他の刺激ドメインを含むことによって、Ｔ細胞のさらなる活性化シグナルを証明する能力により、生成された。そのうえ、ＣＡＲが３つ以上の刺激ドメインを含有する第３世代ＣＡＲもまた、開発された（ＲａｍｏｓおよびＤｏｔｔｉ、同書）。

いくつかの例において、ＣＡＲは、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに必要に応じて、ＣＤ８を含む細胞内ヒンジドメイン、ならびにＣＤ２８、４−１ＢＢ、およびＣＤ３．ゼータを含む細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインを含むことができる。ＣＤ２８は、Ｔ細胞共刺激において重要なＴ細胞マーカーである。ＣＤ８もまた、Ｔ細胞マーカーである。４−１ＢＢは、Ｔ細胞に強力な共刺激シグナルを伝え、分化を促進し、Ｔリンパ球の長期生存を増強する。ＣＤ３．ゼータは、ＴＣＲに会合してシグナルを産生し、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。他の例において、ＣＡＲは、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ２８およびＣＤ３．ゼータを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含むことができる。さらなる例において、ＣＡＲは、細胞外ヒンジドメインならびにＣＤ８を含む膜貫通ドメインならびにＣＤ２８およびＣＤ３．ゼータを含む細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインを含むことができる。

概観
ＤＮＡ結合分子（例えば、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ）および／またはＰＤ１遺伝子および／またはＣＴＬＡ−４遺伝子を標的にする転写因子ならびに疾患もしくは障害、特に、ＰＤ１もしくはＰＤ１リガンドが免疫系の細胞上に望ましくなく発現される障害、癌および／もしくは自己免疫性疾患、ならびに／またはＣＴＬＡ−４発現の抑制が有益であると思われる疾患もしくは障害の処置のための、これらのヌクレアーゼおよび人工転写因子を含む組成物ならびにそれらを使用するための方法が、本明細書において記載される。ＰＤ１／ＰＤ１リガンド相互作用またはＣＴＬＡ−４媒介性のＴ細胞阻害の調節によって改善される疾患または障害を有する対象の処置のために、本明細書において記載されるヌクレアーゼは、インビボまたはエクスビボにて細胞（例えば、そのような疾患に罹患した対象から単離されたＴ細胞などの初代細胞）の中に導入して、処理された細胞上のＰＤ１またはＣＴＬＡ−４の発現を予防することができる。ヌクレアーゼ処理後に、ＰＤ１またはＣＴＬＡ−４ノックアウトＴ細胞は、慢性感染症もしくは癌の処置における医薬として使用するために、対象の中に再導入されてもよく、または再導入の前に増やされてもよい。あるいは、ＰＤ１またはＣＴＬＡ−４の遺伝子座の調節は、対象の中への必要なヌクレアーゼまたは操作された転写因子の導入を通してインビボで行われてもよい。同様に、ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼ（例えばＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系、および／またはＴＡＬＥＮ）により処理された幹細胞が、使用されてもよい。これらの細胞は、そのような医学的状態の処置のために、罹患している対象の中に注入することができる。

いくつかの例において、ＰＤ１またはＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼまたは転写因子は、キメラ抗原受容体と共に使用されてもよい。したがって、本発明は、例えば、タンパク質腫瘍抗原または非タンパク質腫瘍抗原を特異的に標的にするＣＡＲをＴ細胞の中に導入し、その結果、そのようなＣＡＲを持つＴ細胞が抗原の存在下において活性化されるようになる方法を企図する。ＰＤ１またはＣＴＬＡ−４遺伝子（複数可）がノックアウトされている、または別の方法で同様に調節されている、ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼまたは転写因子によって処理された、または処理されるであろう細胞におけるＣＡＲの使用は、癌細胞によって生成されるＰＤ１リガンドに対して抵抗性であり、したがって、ＰＤ−１媒介性のＴ細胞枯渇にさらされない、および／またはＣＴＬＡ−４媒介性のＴ細胞阻害に対して抵抗性である、目的のＣＡＲを発現するＴ細胞をもたらす。

多数の癌抗原は、当技術分野において公知であり、特異的なＣＡＲによって標的にされ得る。非限定的な例として、ＣＡＲによって標的にされ得る腫瘍関連抗原について表１を参照されたい（ＲａｍｏｓおよびＤｏｔｔｉ、同書およびＯｒｅｎｔａｓら（２０１２）、Ｆｒｏｎｔ ｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２：１を参照されたい）。

さらに、組換え発現ベクター、例えば自殺遺伝子を含むベクター、またはそのような遺伝子は、別々に導入されてもよい。本明細書において使用されるように、用語「自殺遺伝子」は、自殺遺伝子を発現する細胞を死滅させる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、その遺伝子が発現される細胞に作用する薬剤、例えば薬物に感受性を与え、細胞がその薬剤と接触した、またはその薬剤に曝露された場合に、細胞を死滅させる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当技術分野において公知であり（例えばＳｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｃａｒｏｌｉｎｅ Ｊ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｔ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、サットン、サリー、イギリス国）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００４を参照されたい）、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、およびニトロレダクターゼを含む。

ＤＮＡ結合ドメイン
ＰＤ１遺伝子座またはＣＴＬＡ−４遺伝子座における標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む組成物が本明細書において記載される。ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＤＮＡ結合ヌクレアーゼ系、またはメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインを含むが、これらに限定されない任意のＤＮＡ結合ドメインが、本明細書において開示される組成物および方法において使用することができる。

ある実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合タンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、それが選択された標的部位に結合するように操作されるという点で、天然には存在しない。例えば、すべてそれらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏら（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌら（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏら（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６；米国特許第６，４５３，２４２号明細書；米国特許第６，５３４，２６１号明細書；米国特許第６，５９９，６９２号明細書；米国特許第６，５０３，７１７号明細書；米国特許第６，６８９，５５８号明細書；米国特許第７，０３０，２１５号明細書；米国特許第６，７９４，１３６号明細書；米国特許第７，０６７，３１７号明細書；米国特許第７，２６２，０５４号明細書；米国特許第７，０７０，９３４号明細書；米国特許第７，３６１，６３５号明細書；米国特許第７，２５３，２７３号明細書；および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書；米国特許出願公開第２００７／０２１８５２８号明細書；米国特許出願公開第２００５／０２６７０６１号明細書を参照されたい。他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む（本明細書においてその全体が参照によって組み込まれる、共有に係る米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい）。

操作されたジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質と比較して、新規な結合特異性を有することができる。操作方法は、合理的な設計および様々なタイプの選択を含むが、これらに限定されない。合理的な設計は、例えば、それぞれの三つ組または四つ組ヌクレオチド配列が、特定の三つ組または四つ組配列に結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列に関連している、三つ組（または四つ組）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含む。例えば、それらの全体が本明細書において参照によって組み込まれる、共有に係る米国特許第６，４５３，２４２号明細書および米国特許第６，５３４，２６１号明細書を参照されたい。

ファージディスプレーおよびツーハイブリッド系を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号明細書；米国特許第５，９２５，５２３号明細書；米国特許第６，００７，９８８号明細書；米国特許第６，０１３，４５３号明細書；米国特許第６，４１０，２４８号明細書；米国特許第６，１４０，４６６号明細書；米国特許第６，２００，７５９号明細書；および米国特許第６，２４２，５６８号明細書；ならびに国際公開第９８／３７１８６号パンフレット；国際公開第９８／５３０５７号パンフレット；国際公開第００／２７８７８号パンフレット；国際公開第０１／８８１９７号パンフレット、および英国特許第２，３３８，２３７号明細書において開示される。そのうえ、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共有に係る国際公開第０２／０７７２２７号パンフレットにおいて記載されている。

そのうえ、これらのおよび他の参考文献において開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガー型（ｍｕｌｔｉ−ｆｉｎｇｅｒｅｄ）ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、例えば５以上のアミノ酸長のリンカーを含む任意の適したリンカー配列を使用してともに連結されてもよい。例示的な６以上のアミノ酸長のリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号明細書；米国特許第６，９０３，１８５号明細書；および米国特許第７，１５３，９４９号明細書もまた参照されたい。本明細書において記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適したリンカーの任意の組み合わせを含んでいてもよい。そのうえ、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共有に係る国際公開第０２／０７７２２７号パンフレットにおいて記載されている。

標的部位の選択；ＺＦＰまたはＴＡＬＥならびに融合タンパク質（および融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者らに公知であり、米国特許第６，１４０，０８１５号明細書；米国特許第７８９，５３８号明細書；米国特許第６，４５３，２４２号明細書；米国特許第６，５３４，２６１号明細書；米国特許第５，９２５，５２３号明細書；米国特許第６，００７，９８８号明細書；米国特許第６，０１３，４５３号明細書；米国特許第６，２００，７５９号明細書；国際公開第９５／１９４３１号パンフレット；国際公開第９６／０６１６６号パンフレット；国際公開第９８／５３０５７号パンフレット；国際公開第９８／５４３１１号パンフレット；国際公開第００／２７８７８号パンフレット；国際公開第０１／６０９７０号パンフレット、国際公開第０１／８８１９７号パンフレット；国際公開第０２／０９９０８４号パンフレット；国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；国際公開第９８／５３０５９号パンフレット；国際公開第９８／５３０６０号パンフレット；国際公開第０２／０１６５３６号パンフレット、および国際公開第０３／０１６４９６号パンフレットにおいて詳細に記載される。

そのうえ、これらのおよび他の参考文献において開示されるように、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば５以上のアミノ酸長のリンカーを含む任意の適したリンカー配列を使用してともに連結されてもよい。例示的な６以上のアミノ酸長のリンカー配列については米国特許第６，４７９，６２６号明細書；米国特許第６，９０３，１８５号明細書；および米国特許第７，１５３，９４９号明細書もまた参照されたい。本明細書において記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のＤＮＡ結合ドメイン間に適したリンカーの任意の組み合わせを含んでいてもよい。

あるいは、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来してもよい。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が公知である。米国特許第５，４２０，０３２号明細書；米国特許第６，８３３，２５２号明細書；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８；Ｄｕｊｏｎら（１９８９）Ｇｅｎｅ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，１１２５−１１２７；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔら（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３、およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのカタログもまた参照されたい。そのうえ、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位に結合するように操作することができる。例えばＣｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ１０：８９５−９０５；Ｅｐｉｎａｔら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３１：２９５２−２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ４４１：６５６−６５９；Ｐａｑｕｅｓら（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ７：４９−６６；米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号明細書を参照されたい。

他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインが、例えばＲＮＡ分子によってガイドされるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系におけるものである。

ある実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインが、ＰＤ１またはＣＴＬＡ−４遺伝子座における標的部位に結合し（配列特異的な形で）、ＰＤ１またはＣＴＬＡ−４の発現を調節する、操作されたジンクフィンガータンパク質である。ＰＤ１およびＣＴＬＡ−４標的部位は、典型的に、少なくとも１つのジンクフィンガーを含むが、複数のジンクフィンガー（例えば２、３、４、５、６、またはそれ以上のフィンガー）を含むことができる。通常、ＺＦＰは、少なくとも３つのフィンガーを含む。特定のＺＦＰは、４、５、または６つのフィンガーを含む。３つのフィンガーを含むＺＦＰは、典型的に、９または１０ヌクレオチドを含む標的部位を認識し、４つのフィンガーを含むＺＦＰは、典型的に、１２〜１４ヌクレオチドを含む標的部位を認識し、他方で、６つのフィンガーを有するＺＦＰは、１８〜２１ヌクレオチドを含む標的部位を認識することができる。ＺＦＰはまた、１つまたは複数の調節ドメインを含む融合タンパク質とすることもでき、これらの調節ドメインは、転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインとすることができる。

他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインが、天然に存在する、または操作された（天然に存在しない）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、本明細書においてその全体が参照によって組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい。キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の植物病原細菌は、重要な作物において多くの疾患を引き起こすことが知られている。キサントモナスの病原性は、植物細胞の中に２５を超える異なるエフェクタータンパク質を注入する、保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されるタンパク質の中には、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームをあやつる転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）がある（Ｋａｙら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４８−６５１を参照されたい）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬＥのうちの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ由来のＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓら（１９８９）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１８：１２７−１３６および国際公開第２０１００７９４３０号パンフレットを参照されたい）。ＴＡＬＥは、タンデムリピートの集中型ドメインを含有し、それぞれのリピートは、およそ３４のアミノ酸を含有し、これらは、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性の鍵となる。そのうえ、それらは、核局在配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説については、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ Ｓら（２００６）Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６３（３）：２５６−２７２を参照されたい）。そのうえ、植物病原性細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍにおいて、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ次亜種１株ＧＭＩ１０００および次亜種４株ＲＳ１０００において、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であるｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と称される２つの遺伝子が発見された（Ｈｅｕｅｒら（２００７）Ａｐｐｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ Ｍｉｃｒｏ ７３（１３）：４３７９−４３８４を参照されたい）。これらの遺伝子は、互いにヌクレオチド配列において９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７のリピートドメインにおける１，５７５ｂｐの欠失によって異なる。しかしながら、両方の遺伝子産物は、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性しか有していない。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系
真核生物のＲＮＡｉ経路に平行すると仮定されてきた古細菌および多くの細菌におけるＲＮＡ媒介性のゲノム防御経路の存在について説得力のある証拠が最近明らかになった（概説については、ＧｏｄｄｅおよびＢｉｃｋｅｒｔｏｎ、２００６．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．６２：７１８−７２９；Ｌｉｌｌｅｓｔｏｌら、２００６．Ａｒｃｈａｅａ ２：５９−７２；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６．Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ １：７．；Ｓｏｒｅｋら、２００８．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：１８１−１８６を参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系または原核生物ＲＮＡｉ（ｐＲＮＡｉ）として知られているように、この経路は、２つの進化的におよび多くの場合、物理的に連結した遺伝子座；その系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座から生じることが提唱されている（Ｊａｎｓｅｎら、２００２．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１５６５−１５７５；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００２．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：４８２−４９６；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６．Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ １：７；Ｈａｆｔら、２００５．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１：ｅ６０）。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子およびＣＲＩＳＰＲ媒介性の核酸切断の特異性をプログラムすることができる非コードＲＮＡエレメントの組み合わせを含有する。個々のＣａｓタンパク質は、真核生物ＲＮＡｉ機構のタンパク質構成成分と有意な配列類似性を共有しないが、類似する予測される機能（例えばＲＮＡ結合、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼなど）を有する（Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６．Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ １：７）。ＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子は、多くの場合、ＣＲＩＳＰＲリピート−スペーサーアレイに関連する。４０を超える様々なＣａｓタンパク質ファミリーが記載されてきた。これらのタンパク質ファミリーのうち、Ｃａｓ１は、様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の中に広範に分布しているように思われる。ｃａｓ遺伝子およびリピート構造の特定の組み合わせは、８つのＣＲＩＳＰＲサブタイプ（Ｅｃｏｌｉ、Ｙｐｅｓｔ、Ｎｍｅｎｉ、Ｄｖｕｌｇ、Ｔｎｅａｐ、Ｈｍａｒｉ、Ａｐｅｒｎ、およびＭｔｕｂｅ）を規定するために使用され、これらのうちのいくつかは、リピート関連ミステリアスタンパク質（ｒｅｐｅａｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｙｓｔｅｒｉｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＲＡＭＰ）をコードするさらなる遺伝子モジュールに関連する。１つを超えるＣＲＩＳＰＲサブタイプが単一のゲノム中に生じてもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓサブタイプの散在性の分布は、その系が微生物の進化の間に遺伝子水平伝播を受けやすいことを示唆する。

３つの型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系があり、これらはすべて、ＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を組み込む。Ｉ型およびＩＩＩ型は両方とも、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡをプロセシングするＣａｓエンドヌクレアーゼを有し、これは、ｃｒＲＮＡに完全にプロセシングされた場合、ｃｒＲＮＡに相補的な核酸を切断することができるマルチＣａｓタンパク質複合体を構築する。

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ（Ｃａｓ９によって例証される）は、最もよく特徴付けられている系のうちの１つであり、４つの連続的なステップにおいて標的ＤＮＡ二本鎖切断を実行する。第１に、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、標的認識のためのさらなる必要条件であるプロトスペーサー（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ）隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の、標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン−クリック塩基対形成を介して、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに指向させる。最後に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を作る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップから構成される：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおける、今後の攻撃を予防するためのＣＲＩＳＰＲアレイ中への異質ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連するタンパク質の発現ならびにアレイの発現およびプロセシング、その後に続く（ｉｉｉ）異質核酸へのＲＮＡ媒介性の干渉。したがって、細菌細胞において、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能と関わりがある。

ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の主要な産物は、インベーダー標的配列（ｉｎｖａｄｅｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含有し、経路におけるそれらの仮定される役割に基づいてガイドＲＮＡまたは原核生物サイレンシングＲＮＡ（ｐｓｉＲＮＡ）と称される、短いＲＮＡであるように思われる（Ｍａｋａｒｏｖａら（２００６）Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ １：７；Ｈａｌｅら（２００８）ＲＮＡ１４：２５７２−２５７９）。ＲＮＡ分析は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座転写物が、反復配列内で切断されて、個々のインベーダー標的配列およびフランキングリピート断片を含有する約６０〜７０ｎｔのＲＮＡ中間体を放出することを示す（Ｔａｎｇら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：７５３６−７５４１；Ｔａｎｇら（２００５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：４６９−４８１；Ｌｉｌｌｅｓｔｏｌら、（２００６）Ａｒｃｈａｅａ ２：５９−７２；Ｂｒｏｕｎｓら（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９６０−９６４；Ｈａｌｅら（２００８）ＲＮＡ１４：２５７２−２５７９）。古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓにおいて、これらの中間体ＲＮＡは、大量の安定した約３５〜４５ｎｔ成熟ｐｓｉＲＮＡにさらにプロセシングされる（Ｈａｌｅら（２００８）ＲＮＡ１４：２５７２−２５７９）。

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において、ｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ中のリピート配列に相補的なトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）が、Ｃａｓ９タンパク質の存在下において二本鎖特異的ＲＮアーゼＩＩＩによるプロセシングを作動させる、種々のメカニズムを使用して産生される。Ｃａｓ９は、次いで、成熟ｃｒＲＮＡに相補的な標的ＤＮＡを切断することができるが、Ｃａｓ９による切断は、ｃｒＲＮＡおよび標的ＤＮＡの間の塩基対形成ならびにＰＡＭ配列（プロトスペーサー隣接モチーフ）と呼ばれる、ｃｒＲＮＡ中の短いモチーフの存在の両方に依存する（Ｑｉら（２０１３）Ｃｅｌｌ １５２：１１７３を参照されたい）。そのうえ、ｔｒａｃｒＲＮＡはまた、その３’末端でｃｒＲＮＡと塩基対形成するように存在していなければならず、この関連によりＣａｓ９活性を作動させる。

ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の必要条件は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのアニーリングによって通常形成されるヘアピンを含む操作された「単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の使用によって回避することができる（Ｊｉｎｅｋら（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６およびＣｏｎｇら（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３１１４３を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓにおいて、操作されたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合物またはｓｇＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体がＣａｓ関連ＲＮＡおよび標的ＤＮＡの間で形成された場合、標的ＤＮＡを切断するようにＣａｓ９をガイドする。Ｃａｓ９タンパク質およびＰＡＭ配列を含有する操作されたｓｇＲＮＡを含むこの系は、ＲＮＡガイドゲノム編集に使用されてきており（Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ、同書を参照されたい）、インビボでのゼブラフィッシュ胚ゲノム編集に有用であり（Ｈｗａｎｇら（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１（３）：２２７を参照されたい）、編集効率はＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様であった。

Ｃａｓタンパク質
Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを有する：一方のヌクレアーゼドメインはＨＮＨエンドヌクレアーゼに類似し、他方はＲｕｖエンドヌクレアーゼドメインに似ている。ＨＮＨ型ドメインは、ｃｒＲＮＡに相補的であるＤＮＡ鎖の切断を担うように思われ、他方でＲｕｖドメインは非相補性鎖を切断する。

ある実施形態では、Ｃａｓタンパク質が、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であってもよい。天然配列のポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列のポリペプチドと共通した質的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」は、天然配列の断片ならびに天然配列のポリペプチドの誘導体およびその断片を含むが、これらに限定されず、ただし、それらが、対応する天然配列ポリペプチドと共通した生物学的活性を有することを条件とする。本明細書において企図される生物学的活性は、機能的誘導体がＤＮＡ基質を断片に加水分解する能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチド、共有結合修飾体の両方のアミノ酸配列変異体、およびその融合物を包含する。

「Ｃａｓポリペプチド」は、全長Ｃａｓポリペプチド、Ｃａｓポリペプチドの酵素的に活性な断片、およびＣａｓポリペプチドの酵素的に活性な誘導体またはその断片を包含する。Ｃａｓポリペプチドの適した誘導体またはその断片は、Ｃａｓタンパク質の突然変異体、融合物、共有結合修飾体、またはその断片を含むが、これらに限定されない。

Ｃａｓタンパク質およびＣａｓポリペプチドは、細胞から入手可能であるか、または化学的に合成されてもよく、またはこれらの２つの手順の組み合わせによるものであってもよい。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、より高い発現レベルで内因性のＣａｓタンパク質を産生するように、または核酸が内因性のＣａｓと同じもしくは異なるＣａｓをコードする外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であってもよい。ある場合では、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生せず、Ｃａｓタンパク質を生成するように遺伝子操作される。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系はまた、遺伝子発現を阻害するために使用することもできる。Ｌｅｉら（２０１３）Ｃｅｌｌ １５２（５）：１１７３−１１８３）は、エンドヌクレアーゼ活性を欠く触媒として作用しないＣａｓ９が、ガイドＲＮＡと同時発現された場合に、転写伸長、ＲＮＡポリメラーゼ結合、または転写因子結合に特異的に干渉することができるＤＮＡ認識複合体を生成することを示した。ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）と呼ばれるこの系は、標的遺伝子の発現を効率的に抑制することができる。

そのうえ、Ｃａｓタンパク質の切断ドメインにおいて、それらをＤＳＢを誘導ができないようにし、代わりに標的ＤＮＡ中にニックを導入する突然変異を含むＣａｓタンパク質が、開発された（「Ｃａｓ９ニッキング酵素」、Ｃｏｎｇら、同書を参照されたい）。特に、Ｃａｓヌクレアーゼは、それぞれ、標的ＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖を切断するための２つのヌクレアーゼドメイン、ＨＮＨおよびＲｕｖＣ様を含む。Ｃａｓヌクレアーゼは、したがって、ヌクレアーゼドメインのうちの一方のみが機能的となり、したがってＣａｓニッカーゼを作るように、操作することができる。例えばＪｉｎｅｋら、同書およびＣｏｎｇら、同書を参照されたい。

本発明のＣａｓタンパク質は、機能性を改変するために突然変異させてもよい。ファージディスプレーおよびツーハイブリッド系を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号明細書；米国特許第５，９２５，５２３号明細書；米国特許第６，００７，９８８号明細書；米国特許第６，０１３，４５３号明細書；米国特許第６，４１０，２４８号明細書；米国特許第６，１４０，４６６号明細書；米国特許第６，２００，７５９号明細書；および米国特許第６，２４２，５６８号明細書；ならびに国際公開第９８／３７１８６号パンフレット；国際公開第９８／５３０５７号パンフレット；国際公開第００／２７８７８号パンフレット；国際公開第０１／８８１９７号パンフレット、および英国特許第２，３３８，２３７号明細書において開示されている。

ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓのＲＮＡ構成成分
Ｃａｓ９関連ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、２つのＲＮＡ非コード構成成分：ｔｒａｃｒＲＮＡおよび同一の直列リピート（ＤＲ）で間を置かれたヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含有するｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してゲノム工学を達成するために、これらのＲＮＡの両方の機能は存在しなければならない（Ｃｏｎｇら（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ １／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ １２３１１４３を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｃｒＲＮＡが、個別の発現構築物を介してまたは個別のＲＮＡとして供給される。他の実施形態では、キメラＲＮＡが構築され、キメラｃｒ−ＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（単鎖ガイドＲＮＡとも称される）を作るために、操作された成熟ｃｒＲＮＡ（標的特異性を与える）がｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用をもたらす）に融合される（Ｊｉｎｅｋ、同書およびＣｏｎｇ、同書を参照されたい）。

キメラＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、任意の所望の標的に相補的な配列を含むように操作することができる。ＲＮＡは、標的に相補性で、形態Ｇ［ｎ１９］、その後に続く、形態ＮＧＧのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の２２塩基を含む。したがって、ある方法において、ｓｇＲＮＡは、目的の遺伝子における公知のＺＦＮ標的の利用によって、（ｉ）関連するゲノム（ヒト、マウス、または特定の植物種のもの）の参照配列とＺＦＮヘテロ二量体の認識配列をアライメントし、（ｉｉ）ＺＦＮハーフ部位の間のスペーサー領域を同定し、（ｉｉｉ）スペーサー領域に最も近いモチーフＧ［Ｎ２０］ＧＧの位置を同定し（１つを超えるそのようなモチーフがスペーサーとオーバーラップする場合、スペーサーに関して中心にあるモチーフが選ばれる）、（ｉｖ）ｓｇＲＮＡのコアとしてそのモチーフを使用することによって、設計することができる。この方法は、有利には、証明されているヌクレアーゼ標的に依存する。あるいは、ｓｇＲＮＡは、単純に、Ｇ［ｎ２０］ＧＧ式に一致する、適した標的配列を同定することによって、目的の任意の領域を標的にするように設計することができる。

標的部位
上記に詳細に記載されるように、ＤＮＡドメイン（ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、メガヌクレアーゼ）は、遺伝子座における選択された任意の配列に結合するように操作することができる。操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するＤＮＡ結合ドメインと比較して、新規な結合特異性を有することができる。操作方法は、合理的な設計および様々なタイプの選択を含むが、これらに限定されない。合理的な設計は、例えば、それぞれの三つ組または四つ組ヌクレオチド配列が、特定の三つ組または四つ組配列に結合するＤＮＡ結合ドメインの１つまたは複数のアミノ酸配列に関連している、三つ組（または四つ組）ヌクレオチド配列および個々の（例えばジンクフィンガー）アミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含む。例えば、それらの全体が本明細書において参照によって組み込まれる、共有に係る米国特許第６，４５３，２４２号明細書および米国特許第６，５３４，２６１号明細書を参照されたい。ＴＡＬ−エフェクタードメインの合理的な設計もまた、実行することができる。例えば米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい。

ファージディスプレーおよびツーハイブリッド系を含む、ＤＮＡ結合ドメインに適用可能な例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号明細書；米国特許第５，９２５，５２３号明細書；米国特許第６，００７，９８８号明細書；米国特許第６，０１３，４５３号明細書；米国特許第６，４１０，２４８号明細書；米国特許第６，１４０，４６６号明細書；米国特許第６，２００，７５９号明細書；および米国特許第６，２４２，５６８号明細書；ならびに国際公開第９８／３７１８６号パンフレット；国際公開第９８／５３０５７号パンフレット；国際公開第００／２７８７８号パンフレット；国際公開第０１／８８１９７号パンフレット、および英国特許第２，３３８，２３７号明細書において開示される。

標的部位の選択；ヌクレアーゼならびに融合タンパク質（および融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の設計ならびに構築のための方法は、当業者らに公知であり、本明細書においてそれらの全体が参照によって組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書および米国特許出願公開第２００６０１８８９８７号明細書において詳細に記載される。

そのうえ、これらのおよび他の参考文献において開示されるように、ＤＮＡ結合ドメイン（例えばマルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質）は、例えば５以上のアミノ酸のリンカーを含む任意の適したリンカー配列を使用して互いに連結されてもよい。例示的な６以上のアミノ酸長のリンカー配列については、例えば米国特許第６，４７９，６２６号明細書；米国特許第６，９０３，１８５号明細書；および米国特許第７，１５３，９４９号明細書を参照されたい。本明細書において記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のＤＮＡ結合ドメイン間に任意の組み合わせの適したリンカーを含んでいてもよい。米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書もまた参照されたい。

ドナー
上記に言及されるように、外因性の配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも呼ばれる）の挿入は、例えば、ポリペプチドの発現、突然変異体遺伝子の修正または野生型遺伝子の発現の増加のためのものである。ドナー配列は、それが配置されるゲノム配列と典型的には同一ではないことは容易に明らかであろう。ドナー配列は、目的の位置で効率的なＨＤＲを可能にするために相同性の２つの領域が隣接する非相同的配列を含有することができる。そのうえ、ドナー配列は、細胞のクロマチンにおける目的の領域に相同でない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞のクロマチンに対して相同性のいくつかの非連続的な領域を含有することができる。例えば、目的の領域中に通常存在しない配列の標的挿入については、前記配列は、ドナー核酸分子中に存在し、目的の領域における配列に相同性の領域が隣接することができる。

ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡとすることができ、直鎖または環状の形態で細胞の中に導入することができる。例えば米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号明細書；米国特許出願公開第２０１１０２８１３６１号明細書；米国特許出願公開第２０１１０２０７２２１号明細書、および米国特許出願第１３／８８９，１６２号明細書を参照されたい。ドナー配列（複数可）は、ＤＮＡ ＭＣ内に含有され得、これは、環状または直鎖の形態で細胞の中に導入されてもよい。直鎖の形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者らに公知の方法によって保護することができる（例えばエキソヌクレアーゼ分解から）。例えば、１つまたは複数のジデオキシヌクレオチド残基が、直鎖分子の３’末端に付加される、および／または自己相補的なオリゴヌクレオチドが、一方もしくは両方の末端にライゲーションされる。例えばＣｈａｎｇら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：４９５９−４９６３；Ｎｅｈｌｓら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２：８８６−８８９を参照されたい。分解から外因性のポリヌクレオチドを保護するためのさらなる方法は、末端アミノ基（複数可）の付加ならびに例えばホスホロチオエート、ホスホロアミデート、およびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間結合の使用を含むが、これらに限定されない。

ポリヌクレオチドは、例えば複製開始点、プロモーター、および抗生物質耐性をコードする遺伝子などのさらなる配列を有するベクター分子の一部として細胞の中に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、ネイキッド核酸として、リポソームもしくはポロキサマーなどの作用物質と複合体を形成させた核酸として、導入することができ、またはウイルス（例えばアデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、およびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達することができる。

ドナーは、一般に、その発現が組み込み部位で内因性のプロモーター、すなわち、ドナーが挿入される内因性の遺伝子（例えばＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴなど）の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように挿入される（共有に係る米国特許である米国特許第８，１１０，３７９号明細書および米国特許第７、９５１９、２５号明細書ならびに米国特許出願公開第２０１３０１３７１０４号明細書および米国特許出願公開第２０１３０１２２５９１号明細書を参照されたい）。しかしながら、ドナーが、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば構成的プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含んでもよいことは明らかであろう。

非コード核酸配列の標的挿入もまた、実現され得る。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列もまた、標的挿入に使用されてもよい。

ドナー分子は、内因性の遺伝子のすべて、いくつかが発現されるか、またはどれも発現されないように、内因性の遺伝子の中に挿入されてもよい。例えば、本明細書において記載される導入遺伝子は、例えば導入遺伝子との融合物として、内因性の配列のうちのいくつか（導入遺伝子に対してＮ−末端および／またはＣ−末端）が発現されるか、またはどれも発現されないように、内因性の遺伝子座の中に挿入されてもよい。他の実施形態では、導入遺伝子（例えば内因性の遺伝子についてなどのさらなるコード配列を有するか、または有していない）は、任意の内因性の遺伝子座、例えばセーフハーバー遺伝子座の中に組み込まれる。例えば、米国特許出願公開第２００８０２９９５８０号明細書；米国特許出願公開第２００８０１５９９９６号明細書、および米国特許出願公開第２０１０００２１８２６４号明細書を参照されたい。

内因性の配列（内因性または導入遺伝子の一部）が導入遺伝子と共に発現される場合、内因性の配列は、全長配列（野生型もしくは突然変異体）または部分的な配列であってもよい。好ましくは、内因性の配列は、機能的である。これらの全長または部分的な配列の機能の非限定的な例は、導入遺伝子（例えば治療用遺伝子）によって発現される、および／または担体として作用するポリペプチドの血清半減期の増加を含む。

さらに、発現に必要とされないが、外因性の配列はまた、転写調節配列または翻訳調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列、および／またはポリアデニル化シグナルを含んでいてもよい。

ある実施形態では、外因性の配列（ドナー）が、目的のタンパク質、およびその融合パートナーとして、細胞の表面に融合タンパク質を配置させる、膜タンパク質の細胞外ドメインの融合物を含む。いくつかの例では、ドナーがＣＡＲをコードし、ＣＡＲコード配列は、ＣＡＲが発現されるように、セーフハーバーの中に挿入される。いくつかの例では、ＣＡＲコード配列が、ＰＤ１遺伝子座および／またはＣＴＬＡ−４遺伝子座の中に挿入される。他の場合では、ＣＡＲが、ランダム挿入のためにレンチウイルスにおいて細胞に送達され、他方で、ＰＤ１特異的ヌクレアーゼまたはＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡとして供給される。いくつかの例では、ＣＡＲが、セーフハーバー（例えばＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、アルブミン、またはＨＰＲＴ）に対して特異的なヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと共に、ＡＡＶまたはアデノウイルスなどのウイルスベクター系を介して送達される。米国特許出願公開第２００８０２９９５８０号明細書；米国特許出願公開第２００８０１５９９９６号明細書；米国特許出願公開第２０１０００２１８２６４号明細書；米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書；米国特許出願公開第２０１３０１７７９８３号明細書、および米国特許出願公開第２０１３０１７７９６０号明細書ならびに米国仮特許出願第６１／８２３，６８９号明細書を参照されたい。細胞はまた、ＰＤ１特異的ヌクレアーゼおよび／またはＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡにより処理することもできる。ある実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドが、ＨＰＲＴ特異的ヌクレアーゼおよびＰＤ１特異的ヌクレアーゼまたはＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと一緒にウイルス送達系を介して供給される。ＨＰＲＴ遺伝子座に組み込まれたＣＡＲコードヌクレオチドを含む細胞は、インタクトなＨＰＲＴ遺伝子を有する細胞において細胞停止をもたらす、および／またはアポトーシスを開始することができる、グアニンアナログである６−チオグアニンを使用して選択することができる。本発明の方法および組成物と共に使用することができるＣＡＲは、第１世代、第２世代、および第３世代の設計を含むすべてのタイプのこれらのキメラタンパク質を含む。受容体、リガンド、および操作されたポリペプチドに由来する特異性ドメインもまた本発明によって想定されるが、抗体に由来する特異性ドメインを含むＣＡＲは、特に有用である。細胞間シグナル伝達ドメインは、ゼータなどのＴＣＲ鎖ならびにγ鎖およびε鎖などのＣＤ３複合体の他のメンバーに由来するものとすることができる。ある場合には、ＣＡＲが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢとしても知られている）、またはＣＤ１３４由来の細胞間ドメインなどのさらなる共刺激ドメインを含んでいてもよい。さらなる場合では、２つのタイプの共刺激因子ドメインが、同時に使用されてもよい（すなわちＣＤ３ゼータがＣＤ２８＋ＣＤ１３７と共に使用される）。

融合タンパク質
本明細書において記載されるＤＮＡ結合タンパク質（例えばＺＦＰまたはＴＡＬＥ）および異種調節（機能的）ドメイン（またはその機能的断片）を含む融合タンパク質もまた、提供される。一般的なドメインは、例えば転写因子ドメイン（活性化因子、抑制因子、共活性化因子、共抑制因子）、サイレンサー、癌遺伝子（例えばｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）；ＤＮＡ修復酵素ならびにそれらの関連因子および修飾因子；ＤＮＡ再編成酵素ならびにそれらの関連因子および修飾因子；クロマチン関連タンパク質ならびにそれらの修飾因子（例えばキナーゼ、アセチラーゼ、およびデアセチラーゼ）；ならびにＤＮＡ修飾酵素（例えばメチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）ならびにそれらの関連因子および修飾因子を含む。ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインの融合に関する詳細については、本明細書においてそれらの全体が参照によって組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書；米国特許出願公開第２００６０１８８９８７号明細書、および米国特許出願公開第２００７／０２１８５２８号明細書。

活性化の実現に適したドメインは、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン（例えばＨａｇｍａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，５９５２−５９６２（１９９７）を参照されたい）、核内ホルモン受容体（例えばＴｏｒｃｈｉａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３−３８３（１９９８）を参照されたい）；核内因子カッパＢのｐ６５サブユニット（ＢｉｔｋｏおよびＢａｒｉｋ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０−５６１８（１９９８）およびＤｏｙｌｅおよびＨｕｎｔ、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ８：２９３７−２９４２（１９９７））；Ｌｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：３−２８（１９９８））、またはＶＰ６４などの人工キメラ機能的ドメイン（Ｂｅｅｒｌｉら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４６２３−３３）およびデグロン（Ｍｏｌｉｎａｒｉら（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊ．１８，６４３９−６４４７）を含む。さらなる例示的な活性化ドメインは、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ−２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ−２、およびＣＴＦ１（Ｓｅｉｐｅｌら、ＥＭＢＯ Ｊ．１１，４９６１−４９６８（１９９２）ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２ＡおよびＥＲＦ−２を含む。例えばＲｏｂｙｒら（２０００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：３２９−３４７；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２３：２５５−２７５；Ｌｅｏら（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：１−１１；Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ−Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ（１９９９）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．４６：７７−８９；ＭｃＫｅｎｎａら（１９９９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：３−１２；Ｍａｌｉｋら（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７−２８３；およびＬｅｍｏｎら（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９−５０４を参照されたい。さらなる例示的な活性化ドメインは、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、ＡＲＦ−６、ＡＲＦ−７、およびＡＲＦ−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ、ならびにＴＲＡＢ１を含むが、これらに限定されない。例えばＯｇａｗａら（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：２１−２９；Ｏｋａｎａｍｉら（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：８７−９９；Ｇｏｆｆら（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：２９８−３０９；Ｃｈｏら（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：４１９−４２９；Ｕｌｍａｓｏｎら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：５８４４−５８４９；Ｓｐｒｅｎｇｅｒ−Ｈａｕｓｓｅｌｓら（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１−８；Ｇｏｎｇら（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３３−４４；およびＨｏｂｏら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１５，３４８−１５，３５３を参照されたい。

ＤＮＡ結合ドメインおよび機能的ドメインの間の融合タンパク質（または融合タンパク質をコードする核酸）の形成において、活性化ドメインまたは活性化ドメインと相互作用する分子のいずれかが機能的ドメインとして適していることは、当業者らに明らかであろう。本質的に、標的遺伝子に活性化複合体を動員するおよび／またはそれに対する活性を活性化する（例えばヒストンアセチル化など）ことができる任意の分子は、融合タンパク質の活性化ドメインとして有用である。融合分子において機能的ドメインとして使用するのに適しているインスレータードメイン、局在化ドメイン、ならびにＩＳＷＩ含有ドメインおよび／またはメチル結合ドメインタンパク質などのクロマチンリモデリングタンパク質は、例えば共有に係る米国特許出願第２００２／０１１５２１５号明細書および米国特許出願第２００３／００８２５５２号明細書ならびに共有に係る国際公開第０２／４４３７６号パンフレットにおいて記載されている。

例示的な抑制ドメインは、ＫＲＡＢ Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ−ベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ−ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えばＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２を含むが、これらに限定されない。例えばＢｉｒｄら（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４５１−４５４；Ｔｙｌｅｒら（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４３−４４６；Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒら（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４７−４５０；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２５：３３８−３４２を参照されたい。さらなる例示的な抑制ドメインは、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａを含むが、これらに限定されない。例えばＣｈｅｍら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：３０５−３２１；およびＷｕら（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１９−２７を参照されたい。

融合分子の機能的構成成分／ドメインは、一旦、融合分子がそのＤＮＡ結合ドメインを介して標的配列に結合したら、遺伝子の転写に影響を及ぼすことができる様々な異なる構成成分のいずれかから選択することができる。よって、機能的構成成分は、活性化因子、抑制因子、共活性化因子、共抑制因子、およびサイレンサーなどの、様々な転写因子ドメインを含むことができるが、これらに限定されない。

さらなる例示的な機能的ドメインは、例えば、共有に係る米国特許第６，５３４，２６１号明細書および米国特許出願公開第２００２／０１６０９４０号明細書において開示されている。

外因性の小分子またはリガンドによって調節される機能的ドメインもまた、選択されてもよい。例えば、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）技術が、用いられてもよく、機能的ドメインは、外部のＲｈｅｏＣｈｅｍ（商標）リガンドの存在下においてのみその活性なコンホメーションを呈する（例えば米国特許出願公開第２００９０１３６４６５号明細書を参照されたい）。したがって、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣａｓは、調節可能な機能的ドメインに作動可能に連結されてもよく、ＺＦＰ−ＴＦ、ＴＡＬＥ−ＴＦ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＴＦの結果として生ずる活性は、外部のリガンドによって制御される。

ヌクレアーゼ
ある実施形態では、融合タンパク質が、ＤＮＡ結合性結合ドメインおよび切断（ヌクレアーゼ）ドメインを含む。そのため、遺伝子修飾は、ヌクレアーゼ、例えば操作されたヌクレアーゼを使用して実現することができる。操作されたヌクレアーゼの技術は、天然に存在するＤＮＡ結合タンパク質の操作に基づく。本明細書において記載される方法および組成物は、広く適用可能で、目的の任意のヌクレアーゼを含んでいてもよい。ヌクレアーゼの非限定的な例は、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を含む。ヌクレアーゼは、異種ＤＮＡ結合ドメインおよび異種切断ドメイン（例えば異種切断ドメインを有するジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含んでいてもよく、あるいは、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択される標的部位に結合するように改変されてもよい（例えば、同種の結合部位と異なる部位に結合するように操作されたメガヌクレアーゼ）。例えば、ある目的に合うように作ったＤＮＡ結合特異性を有するホーミングエンドヌクレアーゼの操作が記載されており、Ｃｈａｍｅｓら（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３（２０）：ｅ１７８；Ａｒｎｏｕｌｄら（２００６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３−４５８およびＧｒｉｚｏｔら（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、７月７日ｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎを参照されたい。そのうえ、ＺＦＰの操作もまた、記載されている。例えば米国特許第６，５３４，２６１号明細書；米国特許第６，６０７，８８２号明細書；米国特許第６，８２４，９７８号明細書；米国特許第６，９７９，５３９号明細書；米国特許第６，９３３，１１３号明細書；米国特許第７，１６３，８２４号明細書；および米国特許第７，０１３，２１９号明細書を参照されたい。ヌクレアーゼは、核酸およびタンパク質の組み合わせを含んでいてもよい（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）。

ある実施形態では、ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）である。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対の切断部位を認識し、一般に、４つのファミリーにグループ化される：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリー。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩを含む。それらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号明細書；米国特許第６，８３３，２５２号明細書；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８；Ｄｕｊｏｎら（１９８９）Ｇｅｎｅ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，１１２５−１１２７；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔら（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３、およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのカタログもまた参照されたい。

主としてＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー由来の天然に存在するメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインは、植物、酵母、ショウジョウバエ、哺乳動物細胞、およびマウスにおける部位特異的なゲノム修飾を促進するために使用されてきたが、このアプローチは、メガヌクレアーゼ認識配列を保存する相同遺伝子（Ｍｏｎｅｔら（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｏｎ．２５５：８８−９３）または認識配列が導入されたあらかじめ操作されたゲノムのいずれかの修飾に限られてきた（Ｒｏｕｔｅら（１９９４）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：８０９６−１０６；Ｃｈｉｌｔｏｎら（２００３）、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１３３：９５６−６５；Ｐｕｃｈｔａら（１９９６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５０５５−６０；Ｒｏｎｇら（２００２）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：１５６８−８１；Ｇｏｕｂｌｅら（２００６）、Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．８（５）：６１６−６２２）。したがって、医学的にまたはバイオテクノロジーに関連する部位で新規な結合特異性を示すようにメガヌクレアーゼを操作するための試みがなされてきた（Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７−７３；Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１−４１；Ｅｐｉｎａｔら（２００３）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２−６２；Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５−９０５；Ｅｐｉｎａｔら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ４４１：６５６−６５９；Ｐａｑｕｅｓら（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９−６６；米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号明細書；米国特許出願公開第２００６０２０６９４９号明細書；米国特許出願公開第２００６０１５３８２６号明細書；米国特許出願公開第２００６００７８５５２号明細書；および米国特許出願公開第２００４０００２０９２号明細書）。そのうえ、メガヌクレアーゼ由来の天然に存在する、または操作されたＤＮＡ結合ドメインは、異種ヌクレアーゼ（例えばＦｏｋＩ）由来の切断ドメインと作動可能に連結されてきた。

他の実施形態では、ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。ＺＦＮは、選択された遺伝子における標的部位に結合するように操作されたジンクフィンガータンパク質および切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。

上記に言及されるように、ジンクフィンガー結合ドメインは、選択された配列に結合するように操作することができる。例えばＢｅｅｒｌｉら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏら（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌら（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏら（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規な結合特異性を有することができる。操作方法は、合理的な設計および様々なタイプの選択を含むが、これらに限定されない。合理的な設計は、例えば、それぞれの三つ組または四つ組ヌクレオチド配列が、特定の三つ組または四つ組配列に結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列に関連している、三つ組（または四つ組）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含む。例えば、それらの全体が本明細書において参照によって組み込まれる、共有に係る米国特許第６，４５３，２４２号明細書および米国特許第６，５３４，２６１号明細書を参照されたい。

ファージディスプレーおよびツーハイブリッド系を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号明細書；米国特許第５，９２５，５２３号明細書；米国特許第６，００７，９８８号明細書；米国特許第６，０１３，４５３号明細書；米国特許第６，４１０，２４８号明細書；米国特許第６，１４０，４６６号明細書；米国特許第６，２００，７５９号明細書；および米国特許第６，２４２，５６８号明細書；ならびに国際公開第９８／３７１８６号パンフレット；国際公開第９８／５３０５７号パンフレット；国際公開第００／２７８７８号パンフレット；国際公開第０１／８８１９７号パンフレット、および英国特許第２，３３８，２３７号明細書において開示されている。そのうえ、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共有に係る国際公開第０２／０７７２２７号パンフレットにおいて記載されている。

標的部位の選択；ＺＦＮならびに融合タンパク質（および融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者らに公知であり、本明細書においてそれらの全体が参照によって組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書および米国特許出願公開第２００６０１８８９８７号明細書において詳細に記載されている。

そのうえ、これらのおよび他の参考文献において開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質は、例えば５以上のアミノ酸長のリンカーを含む任意の適したリンカー配列を使用して互いに連結されてもよい。例示的な６以上のアミノ酸長のリンカー配列については例えば米国特許第６，４７９，６２６号明細書；米国特許第６，９０３，１８５号明細書；および米国特許第７，１５３，９４９号明細書を参照されたい。本明細書において記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適したリンカーの任意の組み合わせを含んでいてもよい。

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、操作されたＴＡＬＥＮである。ユーザーが選ぶ標的配列との強い部位特異的な相互作用のためにこれらのタンパク質を操作するための方法および組成物が公開されている（共有に係る米国特許出願第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい）。

他の実施形態では、ヌクレアーゼは、本明細書において記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系である。

ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／またはメガヌクレアーゼなどのヌクレアーゼはまた、ヌクレアーゼ（切断ドメイン、切断ハーフドメイン）をも含む。上記に言及されるように、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインと同種であってもよいまたは異種であってもよい。例えば、切断ドメインは、Ｃａｓヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系中の）またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインを有するメガヌクレアーゼ切断ドメインを含むことができる。あるいは、異種切断ドメインは、ジンクフィンガーもしくはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとヌクレアーゼ由来の切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインと異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメインを含む融合物タンパク質を含む。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含むが、これらに限定されない。例えば２００２−２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ビバリー、マサチューセッツ；およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素は、公知である（例えばＳ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮアーゼＩ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎら（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３もまた参照されたい）。１つまたは複数のこれらの酵素（またはその機能的断片）は、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として使用することができる。

同様に、切断ハーフドメインは、切断活性のために二量化を必要とする、上記に示される任意のヌクレアーゼまたはその一部分に由来することができる。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が切断に必要とされる。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能的断片）に由来することができ、またはそれぞれの切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能的断片）に由来することができる。そのうえ、２つの融合タンパク質に対する標的部位は、好ましくは、切断ハーフドメインが例えば二量体化により機能的な切断ドメインを形成するのを可能にする、互いに対して空間的な配向で、２つの融合タンパク質のそれぞれの標的部位への結合が切断ハーフドメインを配置するように、互いに対して並べられる。したがって、ある実施形態では、標的部位の近傍の端が、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド隔てられる。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位の間に介在することができる（例えば２〜５０ヌクレオチド対またはそれ以上）。一般に、切断の部位は、標的部位の間にある。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに配列特異的な結合をし（認識部位で）、結合の部位またはその近くでＤＮＡを切断することができる。特定の制限酵素（例えばＩＩＳ型）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素Ｆｏｋ Ｉは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチドおよび他方の上のその認識部位から１３ヌクレオチドのところでＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば米国特許第５，３５６，８０２号明細書；米国特許第５，４３６，１５０号明細書、および米国特許第５，４８７，９９４号明細書；ならびにＬｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４２７５−４２７９；Ｌｉら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２７６４−２７６８；Ｋｉｍら（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：８８３−８８７；Ｋｉｍら（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−９８２を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質が、操作されてもよく、または操作されなくてもよい、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素および１つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメイン由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）を含む。

切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、Ｆｏｋ Ｉである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示の目的のために、開示される融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の一部分は、切断ハーフドメインと考えられる。したがって、ジンクフィンガー−Ｆｏｋ Ｉ融合物またはＴＡＬＥ−ＦｏｋＩ融合物を使用する細胞の配列の標的二本鎖切断および／または標的置換については、それぞれＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を、触媒活性切断ドメインを再構成するために使用することができる。あるいは、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび２つのＦｏｋ Ｉ切断ハーフドメインを含有する単一のポリペプチド分子もまた、使用することができる。ジンクフィンガー−Ｆｏｋ Ｉ融合物またはＴＡＬＥ−Ｆｏｋ Ｉ融合物を使用する標的切断および標的配列改変のためのパラメーターは、本開示において別記されている。

切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持するか、または機能的な切断ドメインを形成するように多量体を形成する（例えば二量体化する）能力を保持するタンパク質の任意の部分とすることができる。

例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書において組み込まれる、国際公開第０７／０１４２７５号パンフレットにおいて記載される。さらなる制限酵素はまた、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを含有し、これらは本開示によって企図される。例えばＲｏｂｅｒｔｓら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照されたい。

ある実施形態では、切断ドメインが、例えば、すべての開示について本明細書においてそれらの全体が参照によって組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書；米国特許出願公開第２００６０１８８９８７号明細書、および米国特許出願公開第２００８０１３１９６２号明細書において記載されるように、ホモ二量体化を最小限にするかまたは予防する、１つまたは複数の操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン突然変異体とも呼ばれる）を含む。ＦｏｋＩの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位、および５３８位のアミノ酸残基はすべて、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を及ぼす標的である。

偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な操作された切断ハーフドメインは、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０位および５３８位のアミノ酸残基で突然変異を含み、第２の切断ハーフドメインがアミノ酸残基４８６および４９９で突然変異を含むペアを含む。

したがって、一実施形態では、４９０での突然変異が、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し、５３８での突然変異が、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し、４８６での突然変異が、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置換し、４９９位での突然変異が、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換する。詳細には、本明細書において記載される操作された切断ハーフドメインは、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と称される、操作された切断ハーフドメインを産生するために、一方の切断ハーフドメインにおいて４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を突然変異させることによって、ならびに「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と称される、操作された切断ハーフドメインを産生するために、他の切断ハーフドメインにおいて、４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を突然変異させることによって、調製された。本明細書において記載される操作された切断ハーフドメインは、異常な切断が最小限にされるまたは排除される偏性ヘテロ二量体突然変異体である。例えば、その開示がすべの目的についてそれらの全体が参照によって組み込まれる、共有に係る米国特許出願公開第２００８０１３１９６２号明細書の実施例１および発行された米国特許第７，９１４，７９６号明細書を参照されたい。

ある実施形態では、操作された切断ハーフドメインが、４８６位、４９９位、および４９６位（野生型ＦｏｋＩに関連してナンバリング）に突然変異、例えば４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で、および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置換する突然変異（それぞれ「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインが、４９０位、５３８位、および５３７位（野生型ＦｏｋＩに関連してナンバリング）に突然変異、例えば４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置換する突然変異（それぞれ「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインが、４９０位および５３７位（野生型ＦｏｋＩに関連してナンバリング）に突然変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基とおよび５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基と交換する突然変異（それぞれ「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。（米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号明細書を参照されたい）。本明細書において記載される操作された切断ハーフドメインは、例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書；米国特許出願公開第２００８０１３１９６２号明細書；および米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号明細書において記載されるように、野生型切断ハーフドメイン（Ｆｏｋ Ｉ）の部位特異的突然変異誘発によって、任意の適した方法を使用して調製することができる。

あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素（ｓｐｌｉｔ−ｅｎｚｙｍｅ）」技術を使用して、核酸標的部位でインビボで組み立てられてもよい（例えば米国特許出願公開第２００９００６８１６４号明細書を参照されたい）。そのようなスプリット酵素の構成成分は、個別の発現構築物上で発現されてもよく、または個々の構成成分が例えば自己切断２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって隔てられている１つのオープンリーディングフレーム中で連結することができる。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであってもよい。

本明細書において記載される操作された切断ハーフドメインは、例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書；米国特許出願公開第２００７／０３０５３４６号明細書；米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号明細書；および米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号明細書における野生型切断ハーフドメイン（Ｆｏｋ Ｉ）の部位特異的突然変異誘発によって、任意の適した方法を使用して調製することができる。

ヌクレアーゼ発現構築物は、当技術分野において公知の方法を使用して容易に設計することができる。例えば、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号明細書；米国特許出願公開第２００５０２０８４８９号明細書；米国特許出願公開第２００５００２６１５７号明細書；米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書；米国特許出願公開第２００６０１８８９８７号明細書；米国特許出願公開第２００６００６３２３１号明細書；および国際公開第０７／０１４２７５号パンフレットを参照されたい。ある実施形態では、ヌクレアーゼの発現が、誘導性プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下において活性化され（抑制解除され）、グルコースの存在下において抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にある。特に、ガラクトキナーゼプロモーターが誘導され、誘導性であり、ヌクレアーゼ（複数可）は、炭素供給源における連続の変化（例えばグルコースからラフィノース〜ガラクトースへ）に際して発現される。誘導性プロモーターの他の非限定的な例は、ＣＵＰ１、ＭＥＴ１５、ＰＨＯ５、およびｔｅｔ−反応性プロモーターを含む。

一本鎖切断を生成するヌクレアーゼもまた、使用することができる。ある実施形態では、触媒不活性ヌクレアーゼが、一本鎖切断を生成するため触媒活性ヌクレアーゼ（「ニッカーゼ」とも呼ばれる）と組み合わせて使用される。そのようなニッカーゼは、例えば米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号明細書；Ｊｉｎｅｋら、同書；Ｃｏｎｇら、同書において記載されている。ニッカーゼは、酵素の触媒ドメイン中のアミノ酸の特定の突然変異またはドメインの一部もしくはすべてのトランケーションによって、それがもはや機能的ではなくなるように生成することができる。したがって、２つのヌクレアーゼ（切断）ドメイン（例えばＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系）を含むヌクレアーゼでは、このアプローチは、どちらかのドメインに対して行われてもよい。さらに、二本鎖切断は、２つのそのような一本鎖ニッカーゼの使用によって標的ＤＮＡにおいて実現することができる。それぞれのニッカーゼは、ＤＮＡの一方の鎖を切断し、２つ以上のニッカーゼの使用は、標的二本鎖配列において二本鎖切断（例えばねじれ型二本鎖切断（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｂｒｅａｋ））を引き起こすことができる。

送達
ヌクレアーゼおよび転写因子、ヌクレアーゼおよび転写因子をコードするポリヌクレオチド、ならびに／または任意のドナーポリヌクレオチドならびに本明細書において記載されるタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の適した手段によって標的細胞に送達されてもよい。

適した細胞は、真核生物細胞および原核生物細胞および／または細胞系統を含むが、これらに限定されない。そのような細胞またはそのような細胞から生成された細胞系統の非限定的な例は、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えばＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えばＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、またはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、およびシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などのような真菌細胞を含む。ある実施形態では、細胞系統は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞系統、ＭＤＣＫ細胞系統、またはＨＥＫ２９３細胞系統である。適した初代細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびこれらに限定されないが、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）、または任意の他のタイプのＴ細胞などの任意のＴ−細胞などの他の血液細胞サブセットを含む。適した細胞はまた、例として、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、および間葉系幹細胞などの幹細胞をも含む。

本明細書において記載される転写因子およびヌクレアーゼを送達するための方法は、例えば、そのすべての開示はそれらの全体が本明細書において参照によって組み込まれる、米国特許第６，４５３，２４２号明細書；米国特許第６，５０３，７１７号明細書；米国特許第６，５３４，２６１号明細書；米国特許第６，５９９，６９２号明細書；米国特許第６，６０７，８８２号明細書；米国特許第６，６８９，５５８号明細書；米国特許第６，８２４，９７８号明細書；米国特許第６，９３３，１１３号明細書；米国特許第６，９７９，５３９号明細書；米国特許第７，０１３，２１９号明細書；および米国特許第７，１６３，８２４号明細書において記載される。

本明細書において記載される転写因子およびヌクレアーゼはまた、例えば１つまたは複数のタンパク質をコードする配列を含有するベクターを使用して送達されてもよい。ポリヌクレオチドをコードするドナーは、同様に送達されてもよい。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない任意のベクター系が、使用されてもよい。それらの全体が本明細書において参照によって組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号明細書；米国特許第６，６０７，８８２号明細書；米国特許第６，８２４，９７８号明細書；米国特許第６，９３３，１１３号明細書；米国特許第６，９７９，５３９号明細書；米国特許第７，０１３，２１９号明細書；および米国特許第７，１６３，８２４号明細書もまた、参照されたい。さらに、これらのベクターのいずれかが１つまたは複数の転写因子および／またはヌクレアーゼを含んでいてもよいことは明らかであろう。したがって、１つまたは複数のＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、および／またはドナーが細胞の中に導入される場合、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、および／またはドナーは、同じベクター上でまたは異なるベクター上で運ばれてもよい。複数のベクターが使用される場合、それぞれのベクターは、１つまたは複数のＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、および／またはドナーをコードする配列を含んでいてもよい。

従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入方法は、操作されたＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、ＴＡＬＥ、および／またはドナーをコードする核酸を細胞（例えば哺乳動物細胞）および標的組織に導入するために使用することができる。そのような方法はまた、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、および／またはドナーをコードする核酸をインビトロで細胞に投与するために使用することができる。ある実施形態では、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、および／またはドナーをコードする核酸が、インビボまたはエクスビボ遺伝子治療の使用のために投与される。非ウイルスベクター送達系は、リポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体を形成したＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、および核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスを含み、これらは、細胞への送達の後にエピソームゲノムまたは組込みゲノムのいずれかを有する。遺伝子治療手順の概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）；ＮａｂｅｌおよびＦｅｌｇｎｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７（１９９３）；ＭｉｔａｎｉおよびＣａｓｋｅｙ、ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ、ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ、Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６（１９９５）；ＫｒｅｍｅｒおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａら、ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｈｍ（編）（１９９５）；およびＹｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６（１９９４）を参照されたい。

核酸の非ウイルス送達の方法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの取込みが増強された作用物質を含む。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００系（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーションもまた、核酸の送達に使用することができる。

さらなる例示的な核酸送達系は、Ａｍａｘａ（登録商標）Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ケルン、ドイツ国）、Ｍａｘｃｙｔｅ， Ｉｎｃ．（ロックビル、メリーランド）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ホリストン、マサチューセッツ）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃによって提供されるものを含む（例えば米国特許第６００８３３６号明細書を参照されたい）。リポフェクションは、例えば米国特許第５，０４９，３８６号明細書、米国特許第４，９４６，７８７号明細書；および米国特許第４，８９７，３５５号明細書において記載され、リポフェクション試薬は、市販されている（例えばＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性脂質および中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号パンフレット、国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものを含む。送達は、細胞（エクスビボ投与）または標的組織（インビボ投与）へのものとすることができる。

免疫脂質（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｉｄ）複合体などの標的リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えばＣｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号明細書、米国特許第４，２１７，３４４号明細書、米国特許第４，２３５，８７１号明細書、米国特許第４，２６１，９７５号明細書、米国特許第４，４８５，０５４号明細書、米国特許第４，５０１，７２８号明細書、米国特許第４，７７４，０８５号明細書、米国特許第４，８３７，０２８号明細書、および米国特許第４，９４６，７８７号明細書を参照されたい）。

送達のさらなる方法は、ＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）中へ送達される核酸のパッケージングの使用を含む。これらのＥＤＶは、二重特異性抗体を使用して、標的組織に特異的に送達され、抗体の一方のアームは標的組織に対する特異性を有し、他方はＥＤＶに対する特異性を有する。抗体は、標的細胞表面にＥＤＶを運び、次いで、ＥＤＶは、エンドサイトーシスによって細胞の中に運ばれる。一旦、細胞中に入ったら、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（７）ｐ．６４３を参照されたい）。

操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、および／またはドナーをコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、身体における特異的な細胞をウイルスが標的とする、および核にウイルス搭載物（ｐａｙｌｏａｄ）を輸送するための非常に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与することができる（インビボ）またはそれらは、インビトロで細胞を処置するために使用することができ、修飾された細胞は、患者に投与される（エクスビボ）。送達のための従来のウイルスベースの系は、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、ワクシニア、および単純ヘルペスウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。宿主ゲノムにおける組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子導入方法により可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。そのうえ、高い形質導入効率は、多くの異なる細胞型および標的組織において観察されてきた。

レトロウイルスのトロピズムは、外来性エンベロープタンパク質を組み込み、標的細胞の潜在的な標的集団を増やすことによって、改変することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染することができ、典型的に、高ウイルス力価をもたらすことができるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの外来性配列をパッケージする能力を有するシス作用性長末端リピートから構成される。最小限のシス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージに十分であり、これらは、次いで、持続性の導入遺伝子発現をもたらすために標的細胞の中に治療用遺伝子を組み込むために使用される。広く使用されるレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびその組み合わせに基づくものを含む（例えばＢｕｃｈｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。

一過性の発現が好まれる適用では、アデノウイルスベースの系を使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターにより、高力価および高レベルの発現が得られてきた。このベクターは、比較的単純なシステムで多量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターはまた、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、細胞に標的核酸を形質導入するため、ならびにインビボおよびエクスビボでの遺伝子治療手順のために使用される（例えばＷｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号明細書；国際公開第９３／２４６４１号パンフレット；Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照されたい）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号明細書；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含む、多くの刊行物において記載されている。

少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが、臨床試験における遺伝子導入のために現在利用可能であり、これは、形質導入剤を生成するためにヘルパー細胞系統の中に挿入された遺伝子による欠損ベクターの補完を含むアプローチを利用する。

ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験において使用されたレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８−３０５（１９９５）；Ｋｏｈｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）；Ｍａｌｅｃｈら、ＰＮＡＳ ９４：２２ １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療の治験において使用された最初の治療用ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０（１９９５））。５０％以上の形質導入効率は、ＭＦＧ−Ｓパッケージベクターについて観察された。（Ｅｌｌｅｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）；Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。

組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損非病原性パルボウイルスアデノ随伴型ウイルスに基づく有望な代替的遺伝子送達系である。ベクターは、導入遺伝子発現カセットの隣接するＡＡＶ １４５ｂｐの逆方向末端リピートのみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノムの中への組み込みによる、効率的な遺伝子導入および安定した導入遺伝子送達は、このベクター系についての重要な特徴である。（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２−３（１９９８）、Ｋｅａｒｎｓら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６およびＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ならびにＡＡＶｒｈ１０ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、およびＡＡＶ２／６などのシュードタイプＡＡＶを含む他のＡＡＶ血清型もまた、本発明に従って使用することができる。

複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生され、多くの異なる細胞型に容易に感染することができる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置換するように操作され、続いて、複製欠損ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増殖される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓および筋肉において見られるものなどの非分裂分化細胞を含む、インビボでの複数タイプの組織について形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな運搬能を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド治療を含んだ（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例は、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：１ ５−１０（１９９６）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７ １０８３−１０８９（１９９８）；Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）；Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）；Ｔｏｐｆら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）を含む。

パッケージ細胞は、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するために使用される。そのような細胞は、アデノウイルス、ＡＡＶをパッケージする２９３細胞およびレトロウイルスをパッケージするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞を含む。遺伝子治療において使用されるウイルスベクターは、ウイルス粒子の中に核酸ベクターをパッケージする産生細胞系統によって通常生成される。ベクターは、典型的に、パッケージおよび宿主（適用可能な場合）の中への続く組み込みに必要な最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置換される。失われたウイルス機能は、パッケージ細胞系統によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療において使用されるＡＡＶベクターは、典型的に、パッケージおよび宿主ゲノムの中への組み込みに必要とされる、ＡＡＶゲノム由来の逆方向末端リピート（ＩＴＲ）配列のみを持つ。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞系統中にパッケージされる。細胞系統はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染させられる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミド由来のＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して大量にはパッケージされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である熱処理によって低下させることができる。そのうえ、ＡＡＶは、バキュロウイルス系を使用して、臨床規模で産生することができる（米国特許第７，４７９，５５４号明細書を参照されたい）。

多くの遺伝子治療の適用では、特定の組織型に高度の特異性で遺伝子治療ベクターが送達されることは望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外側表面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、所定の細胞型に対して特異性を有するように修飾することができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが知られている受容体に対する親和性を有するように選ばれる。例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、モロニーマウス白血病ウイルスが、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するように修飾することができ、組換えウイルスが、ヒト上皮増殖因子受容体を発現する特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス−標的細胞ペアに広げることができる。例えば、繊維状ファージは、事実上任意の選ばれた細胞受容体に対して特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えばＦＡＢまたはＦｖ）をディスプレーするように操作することができる。上記の記載は主としてウイルスベクターに適用されるが、同じ原理は非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取込みに好都合である特定の取込み配列を含有するように操作することができる。

遺伝子治療ベクターは、下記に記載されるように、典型的に、全身投与（例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所適用によって、個々の患者への投与によってインビボで送達することができる。あるいは、ベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えばリンパ球、骨髄穿刺液、組織生検材料）または万能ドナー造血幹細胞などの、エクスビボで細胞に送達することができ、その後、通常ベクターを組み込んだ細胞の選択の後に患者の中に細胞が再移植される。

診断、研究、または遺伝子治療のためのエクスビボ細胞トランスフェクション（例えば、トランスフェクトされた細胞の、宿主生物中への再注入を介して）は、当業者らに周知である。好ましい実施形態では、細胞が、対象生物から単離され、ＺＦＰ核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）によりトランスフェクトされ、対象生物（例えば患者）の中に再注入され戻される。エクスビボでのトランスフェクションに適した様々な細胞型は、当業者らに周知である（患者から細胞を単離し、培養する方法の議論について、例えばＦｒｅｓｈｎｅｙら、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第３版、１９９４）およびそこに挙げられる参考文献を参照されたい）。

適した細胞は、真核生物細胞および原核生物細胞ならびに／または細胞系統を含むが、これらに限定されない。そのような細胞またはそのような細胞から生成された細胞系統の非限定的な例は、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えばＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えばＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、またはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、およびシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの真菌細胞を含む。ある実施形態では、細胞系統が、ＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫ、またはＨＥＫ２９３細胞系統である。そのうえ、初代細胞は、単離され、本明細書において記載される転写因子および／またはヌクレアーゼによる処理後に、処置される対象の中への再導入のためにエクスビボで使用されてもよい。適した初代細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、および限定されないが、腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴ細胞などの他の血液細胞サブセットを含む。適した細胞はまた、例として、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、および間葉系幹細胞などの幹細胞を含む。

一実施形態では、幹細胞が、細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のためにエクスビボ手順において使用される。幹細胞の使用の利点は、それらがインビトロで他の細胞型に分化することができる、またはそれらが骨髄において生着するであろう哺乳動物（細胞のドナーなど）の中に導入することができるということである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのサイトカインを使用して臨床的に重要な免疫細胞型にインビトロでＣＤ３４＋細胞を分化させる方法が公知である（Ｉｎａｂａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）を参照されたい）。

幹細胞は、公知の方法を使用して、形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、およびＩａｄ（分化抗原提示細胞）などの望まれない細胞に結合する抗体により骨髄細胞をパニングする（ｐａｎｎｉｎｇ）ことによって、骨髄細胞から単離される。（Ｉｎａｂａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）を参照されたい）。

修飾された幹細胞もまた、いくつかの実施形態で使用されてもよい。例えば、アポトーシスに対して抵抗性にされた幹細胞は、治療用組成物として使用されてもよく、幹細胞はまた、本発明のＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、および／またはドナーを含有する。アポトーシスに対する抵抗性は、例えば、幹細胞、またはさらに例えばカスパーゼ−６特異的ＺＦＮを使用してカスパーゼが破壊された細胞において、ＢＡＸ特異的ＺＦＮまたはＢＡＫ特異的ＺＦＮを使用して、ＢＡＸおよび／またはＢＡＫをノックアウトすることによって生じてもよい（米国特許出願第１２／４５６，０４３号明細書を参照されたい）。

治療用ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、および／またはドナー核酸を含有するベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）もまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することができる。あるいは、ネイキッドＤＮＡまたはｍＲＮＡを投与することができる。投与は、分子を導入するために通常使用される経路のいずれかにより、最終的に血液または組織細胞と接触し、これは、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない。そのような核酸を投与するための適した方法は、利用可能であり、当業者らに周知であり、特定の組成物を投与するために複数の経路を使用することができるが、特定の経路は、多くの場合、他の経路よりも即時的かつ有効な反応をもたらすことができる。

造血幹細胞の中へのＤＮＡの導入のための方法は、例えば米国特許第５，９２８，６３８号明細書において開示される。造血幹細胞、例えばＣＤ３４^＋細胞の中への導入遺伝子の導入に有用なベクターは、アデノウイルス３５型を含む。

免疫細胞（例えばＴ細胞）の中への導入遺伝子の導入に適したベクターは、非組み込みレンチウイルスベクターを含む。例えばＯｒｙら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３８２−１１３８８；Ｄｕｌｌら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１；Ｚｕｆｆｅｒｙら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０；Ｆｏｌｌｅｎｚｉら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：２１７−２２２を参照されたい。

薬学的に許容され得る担体は、投与されている特定の組成物および組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。したがって、下記に記載されるように、利用可能な医薬組成物の多種多様の適した製剤がある（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８９を参照されたい）。

適用
開示される組成物および方法は、ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４の発現を調節することが所望される、任意の適用に使用することができる。特に、これらの方法および組成物は、ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４の調節が所望される場合に、使用することができ、治療上および研究の適用を含むが、これらに限定されない。本発明はまた、ＣＡＲおよび／または操作されたＴＣＲをコードするＤＮＡ配列の、ＰＤ−１調節細胞および／またはＣＴＬＡ−４調節細胞（例えば、ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ−４発現が、操作された転写因子を介して修飾されているか、または操作されたヌクレアーゼを使用してノックアウトされている細胞）のゲノムの中への挿入をも企図する。いくつかの例では、細胞は、ＴＩＬまたはＴＩＬから増やされた細胞である。本方法および組成物は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳおよびＨＣＶなどの慢性感染症ならびに／または癌（例えば黒色腫、卵巣癌、結腸直腸／結腸癌、腎細胞癌、形質細胞腫／骨髄腫、乳癌、および肺癌）を含む様々な疾患ならびに障害を処置するために使用されてもよい。

これらのおよび他の疾患もまた、ＣＡＲと組み合わせて、ＰＤ１標的ヌクレアーゼまたはＣＴＬＡ−４標的ヌクレアーゼまたは転写因子により処置されてもよく、ＣＡＲが、ウイルス送達系を介して細胞の中に導入される。ある場合には、操作されたＴＣＲもまた、細胞の中に導入されるか、またはＣＡＲの代わりに細胞の中に導入されてもよい。操作されたＴＣＲの作用を容易にするために、内因性のＴＣＲはまた、破壊されてもよい。

ＰＤ１特異的ヌクレアーゼまたはＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼまたは転写因子を含む方法および組成物はまた、慢性感染症または癌を処置するように設計された他の治療薬と共に使用されてもよい。本明細書において記載されるヌクレアーゼ（例えばＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系もしくはこれらの分子をコードするポリヌクレオチド）または転写因子（もしくはそれらをコードするポリヌクレオチド）は、同時に（例えば同じ医薬組成物中で）投与されてもよく、または任意の順で、順次投与されてもよい。肺癌、膵癌、肝臓癌、骨肉腫、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、白血病、黒色腫、リンパ腫、脳癌などを含むが、これらに限定されない任意のタイプの癌を処置することができる。

ＰＤ１特異的ヌクレアーゼおよび／またはＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼまたは転写因子は、ＣＡＲ Ｔ細胞標的系と共に使用されてもよい。ＣＡＲは、腫瘍抗原に対して特異性を有していてもよく、ＣＡＲ特異性ドメインはｓｃＦｖである。あるいは、ＣＡＲは、腫瘍抗原に対して特異的であってもよく、ＣＡＲ特異性ドメインはリガンドまたはポリペプチドを含む。非限定的な例示的ＣＡＲは、ＣＤ３３（Ｄｕｔｏｕｒら（２０１２）Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１２；２０１２：６８３０６５を参照されたい）、ＧＤ２（Ｌｏｕｉｓら（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１８（２３）：６５０−６）、ＣＤ１９（Ｓａｖｏｌｄｏら（２０１１）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２１（５）：１８２２およびＴｏｒｉｋａｉら（２０１２）Ｂｌｏｏｄ １１９（２４）：５６９７）、ＩＬ−１１Ｒα（Ｈｕａｎｇら（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７２（１）：２７１−８１）、ＣＤ２０（Ｔｉｌｌら（２０１２）Ｂｌｏｏｄ １１９（１７）：３９４０−５０）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（Ｓｃｈｕｂｅｒｔｈら（２０１２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ２０１２．４８）、ＥｒｂＢ２（Ｚｈａｏら（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １８３（９）：５５６３−７４）、ＣＤ７０（Ｓｈａｆｆｅｒら（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１６（１６）：４３０４−４３１４）、ＣＤ３８（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒａｙｙａら（２０１２）Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃ Ｊ ２（６）ｐ．ｅ７５）、ＣＤ２２（Ｈａｓｏら（２０１２）Ｃａｎｃ Ｒｅｓ ７２（８）Ｓ１，ｄｏｉ：１１５８／１１５８−７４４５ ＡＭ２０１２−３５０４）、ＣＤ７４（Ｓｔｅｉｎら（２００４）Ｂｌｏｏｄ １０４：３７０５−３７１１）、ＣＡＩＸ（Ｌａｍｅｒｓら（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１７（１）：７２−８２）、ＳＴＥＡＰ１（標的の概説についてはＫｉｅｓｓｌｉｎｇら（２０１２）Ｃａｎｃｅｒｓ ４：１９３−２１７を参照されたい）、ＶＥＧＦ−Ｒ２（米国特許出願公開第２０１２０２１３７８３Ａ１号明細書）、葉酸受容体（ＰＣＴ特許公開国際公開第２０１２０９９９７３号パンフレット）、ならびにＩＬ−１３ Ｒα（米国特許第７５１４５３７号明細書）を標的にするものを含む。ある場合には、ＣＡＲは、二重特異性であってもよい（米国特許出願公開第２００１０１２９６７号明細書を参照されたい）。ある場合には、Ｔ細胞は、ＴＩＬである。そのうえ、ＰＤ１特異的ヌクレアーゼおよび／またはＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼまたは転写因子は、操作されたＴＣＲを含むＴ細胞またはＴＩＬと共に使用されてもよい。

本発明の方法および組成物はまた、インビトロおよびインビボモデル、例えば慢性感染症、癌、または自己免疫の動物モデルの設計および実現に有用であり、これにより、これらの障害の研究および有用な治療薬のさらなる発見を可能にする。ある場合には、本発明の方法は、操作されたＴ細胞を必要とする患者において使用されてもよい、操作されたＴ細胞を産生するのに有用である。いくつかの処置のために、患者は、Ｔ細胞の注入の前に部分的なまたは完全な骨髄破壊のための作用物質によりあらかじめ処置される。

下記の実施例は、ヌクレアーゼがＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを含む本開示の例示的な実施形態に関する。これは例証のみの目的のためのものであり、他のヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系、操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、および／または天然に存在する操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインおよび異種切断ドメインの融合物を使用することができることが十分に理解されるであろう。

実施例１：持続的に生物学的に活性なＰＤ１特異的ＺＦＮまたはＣＴＬＡ−４特異的ＺＦＮの同定
ＺＦＮは、Ｍｉｌｌｅｒら（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：７７８−７８５ならびに米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書および国際特許公開第２００５／０１４７９１号パンフレットにおいて記載されるように、ヒトＰＤ１またはＣＴＬＡ−４遺伝子に対して組み立てられ、ＥＬＩＳＡおよびＣＥＬ１アッセイによって試験された。

ＰＤ１標的ＺＦＰの特定の例は、米国特許出願公開第２０１１０１３６８９５号明細書において開示され、表２ａおよび２ｂにおいて示され、ＣＴＬＡ−４標的ＺＦＰ設計を、表２ｃにおいて示す。この表における第１列は、ＺＦＰについての内部参照名（番号）である。「Ｆ」はフィンガーを指し、「Ｆ」に続く番号は、どのジンクフィンガーかを指す（例えば「Ｆ１」はフィンガー１を指す）。これらのＣＴＬＡ−４特異的ＺＦＮについての標的部位を、表３に示す。

最初のインビトロ活性アッセイは、上記に記載されるように、ヌクレオフェクトした（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔ）細胞サンプルに対して実行した。手短に言えば、ＺＦＰ−ＦｏｋＩ融合物をコードするプラスミドを、メーカーによって指定されるように、Ａｍａｘａ（商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎキットを使用するトランスフェクションによって、Ｋ５６２細胞の中に導入した。トランスフェクションのために、２００万のＫ５６２細胞を、様々な量の各ジンクフィンガーヌクレアーゼ発現プラスミドおよび１００μＬ Ａｍａｘａ（商標）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｖと混合した。細胞を、プログラムＴ−１６を使用し、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ（商標）においてトランスフェクトした。トランスフェクションの直後に、細胞を２つの異なるフラスコの中に分割し、４日間、３０℃または３７℃のいずれかで５％ＣＯ_２中、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させた。

そのうえ、ＰＭＢＣもまた抗ＣＤ２３／ＣＤ８ビーズにより活性化した（例えば米国特許出願公開第２００８０３１１０９５号明細書を参照されたい）。活性化の３日（ＥＰＤ３）または５日（ＥＰＤ５）後のいずれかで、細胞を、２つの異なるＭＡＸＣＹＴＥ（商標）条件（Ｃ１およびＣ３）を使用して、ＰＤ１特異的ＺＦＮ ｍＲＮＡ（ＰＤ１、特にＺＦＮ １２９４２および２５０２９）またはＣＣＲ５（Ｒ５、米国特許第７，９５１，９２５号明細書を参照されたい）を用いてエレクトロポレーションした。次いで、細胞を、下記に記載されるＣＥＬ−１アッセイを使用して、標的遺伝子座の遺伝子修飾について分析した。図２において示されるように、高レベルの遺伝子修飾が見られた。

ＣＴＬＡ−４遺伝子座でのＺＦＮ活性を決定するために、Ｃｅｌ−１ベースのＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）ヌクレアーゼアッセイを、基本的にメーカーの指示（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標））に従って、および米国特許出願公開第２０１１０１３６８９５号明細書においてＰＤ１について記載されるように、実行した。手短に言えば、細胞を回収し、染色体ＤＮＡを、メーカーの説明書（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標））に従ってＱｕｉｃｋｅｘｔｒａｃｔ（商標）キットを使用して調製した。ＰＤ１遺伝子座の適切な領域は、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ（商標）Ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応は９４℃まで加熱し、室温まで徐々に冷却した。およそ２００ｎｇのアニールしたＤＮＡを、０．３３μＬ Ｃｅｌ−Ｉ酵素と混合し、４２℃で２０分間インキュベートした。反応産物を、１×トリス−硼酸−ＥＤＴＡバッファー中でポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。

細胞は、ウイルスへの曝露の３日または１０日後に回収し、遺伝子修飾効率は、国際特許公開第０７／０１４２７５号パンフレットにおいて記載されるように実行したＣｅｌ−ＩベースのＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）ヌクレアーゼアッセイを使用して決定した。Ｏｌｅｙｋｏｗｓｋｉら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：４５９７−４６０２；Ｑｕｉら（２００４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３６：７０２−７０７；Ｙｅｕｎｇら（２００５）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３８：７４９−７５８もまた参照されたい。

実施例２：ＰＤ１特異的ＴＡＬＥＮおよびＣＴＬＡ−４特異的ＴＡＬＥＮ
ＰＤ１特異的ＴＡＬＥＮは、以前に記載したように開発され、組み立てられた（米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい）。塩基認識は、標準ＲＶＤ塩基対応を使用して実現した（「ＴＡＬＥコード」：ＡについてＮＩ、ＣについてＨＤ、ＧについてＮＮ（ハーフリピート（ｈａｌｆ ｒｅｐｅａｔ）中ＮＫ）、ＴについてＮＧ）。ＴＡＬＥＮは、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書において記載されるように「＋６３」ＴＡＬＥＮ骨格で構築された。標的および試験したＴＡＬＥＮについての数値の識別子を、下記表５ａおよび５ｂにおいて示す。

次いで、ＴＡＬＥＮを、内因性のＰＤ１染色体標的で修飾を誘導する能力についてＫ５６２細胞においてペアで試験し、結果は、ほぼすべてのタンパク質のペアが活性であることを示した。下記表６において示される１２９４２／２５０２９ ＺＦＮペアとの活性の対照比較は（米国特許出願公開第２０１１−１３６８９５号明細書を参照されたい）、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮが同じ近似範囲にある活性を有することを示した。表６において示されるレーン番号が図１において示されるレーンに対応することに注意されたい。

ＣＴＬＡ−４特異的ＴＡＬＥＮは、上記に記載されるように設計され、組み立てられる。内因性のＣＴＬＡ−４染色体標的に対する活性についての試験は、ＴＡＬＥＮが活性であることを明らかにする。

実施例３：ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ−４もまた欠く、ＣＡＲを含むＴ細胞の生成
ＣＡＲを発現し、ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ−４がノックアウトされているＴ細胞集団を生成するために、ＣＡＲ含有Ｔ細胞を生成する。細胞（例えばＰＢＭＣ、ＴＩＬ、ＣＤ４＋、またはＣＤ８＋細胞などのＴ細胞）を天然の供給源、例えば転移性の黒色腫患者から精製し、標準的な手順に従って培養する、および／または増やす。細胞は、例えば、米国特許出願公開第２００８０３１１０９５号明細書において記載されるように刺激されてもよい。細胞にＣＡＲ、例えばＥｒｂＢ２特異的ｓｃＦｖまたはＶＥＧＦＲ２特異的ｓｃＦｖのいずれかを含むＣＡＲを形質導入する。ｓｃＦｖをコードする核酸は、ＰＣＲアプローチを介して最初に構築され、配列を検証する。それらをＣＤ２８およびＣＤ３ゼータシグナル伝達部分に連結し、細胞の中に導入する（例えばレトロウイルスまたはレンチウイルスあるいは他の標的／送達メカニズムを介して）。

次いで、細胞を、ＰＤ１特異的ヌクレアーゼおよび／またはＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡにより処理し、集団を、ＰＤ１またはＣＴＬＡ−４破壊およびＣＡＲ挿入について検証するために、Ｃｅｌ−Ｉアッセイによって分析する。次いで、操作されたＴ細胞を、ＥｒｂＢ２またはＶＥＧＦ２Ｒのいずれかを発現する腫瘍細胞系統に対して試験し、これらの標的細胞系統を特異的に溶解することが示される。

実施例４：ＰＤ１特異的ＺＦＰ ＴＦ
ＰＤ１特異的ＺＦＰ ＴＦは、ＰＤ１発現の発現を抑制するように設計された。これらのタンパク質を下記表７ａおよび７ｂにおいて示す。

次いで、表７ａにおいて示されるＰＤ１特異的ＤＮＡ結合ドメインを、ヒトＫＯＸ１遺伝子由来のＫＲＡＢ抑制ドメインに融合した。ＰＤ１抑制ＺＦＰ ＴＦの活性を試験するために、ＺＦＰ ＴＦをヒト細胞の中にトランスフェクトし、ＰＤ１の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用してモニターした。具体的には、Ｊｕｒｋａｔ細胞を１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で培養し、１ｅ^５細胞を、メーカーの指示に従って、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）によって、示されるＺＦＰ−ＫＯＸ融合物をコードする１μｇのプラスミドＤＮＡによりトランスフェクトする。

トランスフェクトした細胞を２日間インキュベートし、内因性のヒトＰＤ１および標準化コントロール１８Ｓのレベルを正規化プロトコールに従ってリアルタイムＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析した。ＰＤ１レベルは、偽トランスフェクトサンプル（１に設定）に対して正規化したＰＤ１／１８Ｓ比として表現した。

ＰＤ１標的ＺＦＰはＰＤ１発現を抑制した。

ウエスタンブロット分析は、ＰＤ１タンパク質レベルの低下を確認するために標準的なプロトコールを使用して行う。

本明細書において挙げられる特許、特許出願、および刊行物はすべて、それらの全体が参照によって本明細書により組み込まれる。

本開示は、理解の明瞭さの目的のために例証および実施例として詳細に提供されたが、様々な変化および修飾が本開示の精神または範囲から逸脱することなく実行することができることは当業者らに明らかであろう。したがって、前述の説明および実施例は、限定として解釈されるべきではない。

Claims (21)

1. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子修飾Ｔ細胞であって、ＣＡＲをコードする外因性の配列が、１つまたは複数のヌクレアーゼを使用して、該Ｔ細胞のゲノムの中に組み込まれ、さらに、少なくとも１つの内因性の免疫学的チェックポイント遺伝子の発現が、該Ｔ細胞において該免疫学的チェックポイント遺伝子を遺伝子修飾することによって抑制され、該免疫学的チェックポイント遺伝子がプログラム死受容体ＰＤＣＤ１（ＰＤ１）遺伝子またはＣＴＬＡ−４遺伝子であり、該免疫学的チェックポイント遺伝子が、配列番号２１〜３３または１１６〜１２０のいずれかに示される標的部位に結合するヌクレアーゼを使用して修飾される、遺伝子修飾Ｔ細胞。
2. 前記免疫学的チェックポイント遺伝子が、ＣＴＬＡ−４遺伝子である、請求項１に記載のＴ細胞。
3. 前記免疫学的チェックポイント遺伝子が、ＰＤ１遺伝子である、請求項１に記載のＴ細胞。
4. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、および腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）からなる群から選択される、請求項１に記載のＴ細胞。
5. 前記ＣＡＲをコードする外因性の配列が、セーフハーバー遺伝子座でＴ細胞ゲノムの中に組み込まれる、請求項１に記載のＴ細胞。
6. 前記ＣＡＲをコードする外因性の配列が、Ｔ細胞ゲノムの中にランダムに組み込まれる、請求項１に記載のＴ細胞。
7. 前記ＣＡＲが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のシグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載のＴ細胞。
8. 前記ＣＡＲが、ｓｃＦｖ特異性ドメインを含む、請求項７に記載のＴ細胞。
9. 前記Ｔ細胞が、刺激される、請求項１に記載のＴ細胞。
10. 前記Ｔ細胞が、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにより刺激される、請求項９に記載のＴ細胞。
11. 少なくとも１つのさらなる導入遺伝子をさらに含む、請求項１に記載のＴ細胞。
12. 前記少なくとも１つのさらなる導入遺伝子が、ＴＡＡ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする、請求項１１に記載のＴ細胞。
13. 請求項５および７〜１０のいずれか一項に記載のＴ細胞を作製する方法であって、前記ＣＡＲをコードする外因性の配列が前記セーフハーバー遺伝子の中に組み込まれるように、少なくとも１つのヌクレアーゼを使用して、前記Ｔ細胞におけるセーフハーバー遺伝子を切断するステップを含む、方法。
14. 前記セーフハーバー遺伝子が、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴおよびＲｏｓａからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ＣＡＲをコードする外因性の配列が、プラスミドベクターまたはウイルスベクターによって運ばれる、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
16. 前記少なくとも１つのヌクレアーゼが、ｍＲＮＡとして前記細胞の中に導入される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記Ｔ細胞を刺激するステップをさらに含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記Ｔ細胞が、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにより刺激される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記Ｔ細胞ゲノムの中に少なくともさらなる導入遺伝子を組み込むステップをさらに含む、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記少なくとも１つのさらなる導入遺伝子が、ＴＡＡ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする、請求項１９に記載の方法。
21. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子修飾Ｔ細胞を含む医薬組成物。