BR122021009076B1

BR122021009076B1 - Vetor viral contendo molécula(s) de ácido nucleico heterólogo, composição, uso e métodos do mesmo

Info

Publication number: BR122021009076B1
Application number: BR122021009076-9A
Authority: BR
Inventors: Feng Zhang; Fei RAN; Matthias Heiden-Reich; Le Cong
Original assignee: The Broad Institute Inc.; Massachusetts Institute Of Technology; President And Fellows Of Harvard College
Priority date: 2013-06-17
Filing date: 2014-06-11
Publication date: 2024-02-15
Also published as: EP3011034B1; SG10201710487VA; AU2014281031B2; SG11201510286QA; MX2015017313A; IL243195A0; RU2716421C2; CN105793425A; WO2014204729A1; RU2016101198A3; CA2915795C; AU2014281031A1; CN105793425B; US10946108B2; BR112015031610A2; KR20160056869A; EP3597755A1; EP3011034A1; JP6702858B2; US20210361779A1

Abstract

a invenção provê a aplicação, manipulação e otimização de sistemas, métodos, e composições para manipulação de sequências e/ou atividades de sequências alvo. são providos sistemas de aplicação e tecidos ou órgãos que são visados como locais de aplicação. são também providos vetores e sistemas de vetores alguns dos quais codificam um ou mais componentes de um complexo crispr, bem como métodos para o desenho e uso desses vetores. também providos são métodos de direcionamento da formação do complexo crispr em células eucarióticas para assegurar especificidade aumentada para reconhecimento do alvo e evitar a toxicidade e para editar ou modificar um local alvo em um local genômico de interesse para alterar ou melhorar o estado de uma doença ou uma afecção.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS E INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[0001] É reivindicada prioridade em relação aos pedidos de patentes dos EUA 61/836,123, depositado a 17 de junho, 2013, 61/847,537, depositado a 17 de julho, 2013, 61/862,355, depositado a 5 de agosto, 2013, 61/871,301, depositado a 28 de agosto, 2013, 61/915,225, depositado a 12 de dezembro, 2013, 61/979,879, depositado a 15 de abril, 2014, e PCT/US2013/074667, depositado a 12 de dezembro, 2013, aos quais, para propósitos dos Estados Unidos, este pedido é também uma continuação-em-parte; e como possa ser permitido sob a lei dos EUA, o equivalente dos EUA ou Fase Nacional relacionada pode adicionalmente reivindicar e reivindicar prioridade em relação a PCT/US2013/074667 e pedidos em relação aos quais PCT/US2013/074667 reivindica prioridade.

[0002] Os pedidos anteriores, e todos os documentos neles citados ou durante a sua execução (“documentos citados apln”) e todos os documentos citados ou referenciados nos documentos citados apln, e todos os documentos aqui citados ou referidos (“documentos aqui citados”), e todos os documentos citados ou referenciados nos documentos aqui citados, em conjunto com quaisquer instruções, descrições, especificações de produto, e folhas de produtos para todos os produtos mencionados neste documento ou em qualquer documento aqui incorporado como referência, são aqui incorporadas como referência, e podem ser empregues na prática da presente invenção. Mais especificamente, todos os documentos mencionados são incorporados por referência na mesma extensão em que cada documento individual foi específica e individualmente indicado para ser incorporado como referência.

ÁREA DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção geralmente refere-se à aplicação, manipulação, otimização e aplicações terapêuticas de sistemas, métodos, e composições usados para o controle da expressão de genes envolvendo sequências alvo, tais como perturbação genômica ou edição de gene, que se relaciona com Repetições Curtas Palindrômicas Agrupadas Regularmente Interespaçadas (CRISPR) e seus componentes. Em particular, a presente invenção se relaciona com aspectos relacionados com aplicação de vetores virais, terapia de genes por aplicação de vetores virais, e entendimento da função de genes e a criação de modelos através da aplicação de vetores virais.

DECLARAÇÃO SOBRE INVESTIGAÇÃO PATROCINADA PELO GOVERNO FEDERAL

[0004] Esta invenção foi realizada com apoio do governo no âmbito do NIH Pioneer Award (1DP1MH100706) concedido pelos National Institutes of Health. O governo tem determinados direitos nesta invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0005] Avanços recentes nas técnicas de sequenciação genética e métodos de análise aceleraram significativamente a capacidade de catalogar e mapear fatores genéticos associados com uma variada gama de funções biológicas e doenças. Tecnologias de direcionamento genômico preciso são necessárias para viabilizar engenharia reversa sistemática das variações genéticas causais permitindo a perturbação seletiva de elementos genéticos individuais, assim como para fazer avançar aplicações em biologia sintética, biotecnológicas, e médicas. Embora as técnicas de edição do genoma tais como configuração de dedos de zinco, efetores do tipo ativador de transcrição (TALEs), ou meganucleases migrantes estejam disponíveis para produzir perturbações genômicas direcionadas, continua a haver uma necessidade de novas tecnologias de engenharia genômica que sejam acessíveis, fáceis de configurar, escalonáveis, e passíveis de direcionamento para várias posições dentro do genoma eucariótico.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] A invenção envolve o desenvolvimento e aplicação do sistema CRISPR/Cas9 como uma ferramenta para direcionamento de sequências, tal como perturbação do genoma ou edição de genes de genes ou genomas para atender a doenças e distúrbios usando componentes virais.

[0007] O sistema CRISPR-Cas não necessita de formação de proteínas personalizadas para atingir sequências específicas mas apenas uma única enzima Cas pode ser programada através de uma pequena molécula de RNA para reconhecer um DNA alvo específico. Adicionando o sistema CRISPR-Cas ao repertório de técnicas de sequenciação genômica e a métodos de análise pode-se simplificar significativamente a metodologia e acelerar a capacidade de catalogar e mapear fatores genéticos associados com uma variada gama de funções biológicas e doenças. Para utilizar eficientemente o sistema CRISPR-Cas para editar o genoma sem efeitos adversos, é fundamental compreender aspectos de engenharia, otimização e aplicação específica ao tipo de célula/tecido/órgão dessas ferramentas de engenharia genômica, os quais são aspectos da invenção reivindicada.

[0008] Há uma necessidade premente de sistemas e técnicas robustas e alternativas para direcionamento de sequência nucleica com um vasto conjunto de aplicações. Aspectos desta invenção atendem a essa necessidade e fornecem vantagens relacionadas. Um complexo CRISPR exemplificativo compreende uma enzima CRISPR complexada com uma sequência guia hibridada a uma sequência alvo no polinucleotídeo alvo. A sequência guia é ligada a uma sequência tracr mate, a qual por sua vez hibrida com uma sequência tracr.

[0009] Em um primeiro aspecto, a invenção provê um método de modificação de um organismo ou um organismo não humano por manipulação de uma sequência alvo em um local genômico de interesse que pode compreender aplicação de uma composição de ocorrência não natural ou manipulada que pode compreender um sistema de vetores virais que pode compreender um ou mais vetores virais codificando uma composição para sua expressão, em que a composição pode compreender: (A) uma composição de ocorrência não natural ou modificada que pode compreender um sistema de vetores que pode compreender um ou mais vetores que podem compreender I. um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de polinucleotídeos de RNA do sistema CRISPR- Cas, em que a sequência de polinucleotídeos pode compreender (A) uma sequência guia capaz de hibridar com uma sequência alvo em uma célula eucariótica, (b) uma sequência tracr mate, e (c) uma sequência tracr, e II. um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação da enzima codificando uma enzima CRISPR, que pode opcionalmente compreender pelo menos uma ou mais sequências de localização nuclear, em que (A), (b) e (c) são arranjadas em uma orientação 5’ a 3’, em que os componentes I e II são localizados no mesmo ou em diferentes vetores do sistema, em que, quando transcrita, a sequência tracr mate hibrida com a sequência tracr e a sequência guia dirige a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR à sequência alvo, e em que o complexo CRISPR compreende a enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que está hibridada com a sequência alvo, e (2) a sequência tracr mate que está hibridada com a sequência tracr ou (B) uma composição de ocorrência não natural ou modificada que pode compreender um sistema de vetores que pode compreender um ou mais vetores que podem compreender I. um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a (A) uma sequência guia capaz de hibridar com uma sequência alvo em uma célula eucariótica, e (b) pelo menos uma ou mais sequências companheiras tracr, II. um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação da enzima codificando uma enzima CRISPR, e III. um terceiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência tracr, em que os componentes I, II e III estão localizados no mesmo ou em diferentes vetores do sistema, em que, quando transcrita, a sequência tracr mate hibrida com a sequência tracr e a sequência guia dirige a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR à sequência alvo, e em que o complexo CRISPR compreende a enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que está hibridada com a sequência alvo, e (2) a sequência tracr mate que está hibridada com a sequência tracr.

[0010] Em um aspecto, a invenção fornece métodos para utilizar um ou mais elementos de um sistema CRISPR-Cas. O complexo CRISPR da invenção fornece meios eficazes para modificar um polinucleotídeo alvo. O complexo CRISPR da invenção tem uma vasta gama de aplicações incluindo modificar (por exemplo eliminar, inserir, translocar, inativar, ativar) um polinucleotídeo alvo em uma multiplicidade de tipos de células em vários tecidos e órgãos. Como tal o complexo CRISPR da invenção tem um vasto espetro de aplicações em, por exemplo, edição de gene ou de genoma, terapia de genes, descoberta de fármaco, triagem de fármacos, diagnóstico de doença, e prognóstico. São pretendidos usos in vivo, in vitro e ex vivo.

[0011] Aspectos da invenção referem-se a enzimas Cas9 tendo especificidade de direcionamento melhorada em um sistema CRISPR-Cas9 tendo RNAs guia com atividade ótima, mais pequenos em comprimento que as enzimas Cas9 do tipo selvagem e as moléculas de ácido nucleico que o codificam, e enzimas quiméricas Cas9, assim como métodos para melhorar a especificidade do alvo de uma enzima Cas9 ou de desenhar um sistema CRISPR-Cas9 que pode compreender desenho ou preparação de RNAs guia com atividade ótima e/ou selecionar ou preparar uma enzima Cas9 tendo um tamanho ou comprimento menor que a Cas9 tipo selvagem em que a embalagem de um ácido nucleico que o codifica em um vetor de aplicação é mais avançado pois há menos codificação para os mesmos no vetor de aplicação do que para uma Cas9 tipo selvagem, e/ou gerando enzimas quiméricas Cas9.

[0012] Também são proporcionadas utilizações das presentes sequências, vetores, enzimas ou sistemas, em medicina. Também são proporcionados usos dos mesmos na edição de genes ou de genoma. Isto é em relação a tecidos de células ou células pós-mitóticas, in ou ex vivo.

[0013] Em um aspecto adicional da invenção, uma enzima Cas9 pode compreender uma ou mais mutações e pode ser usada como um DNA genérico ligando a proteína com ou sem fusão a um domínio funcional. As mutações podem ser mutações introduzidas artificialmente ou mutações de ganho ou perda de função. As mutações podem incluir, mas não estão limitadas a mutações em um dos domínios catalíticos (D10 e H840) nos domínios catalíticos RuvC e HNH, respectivamente. Outras mutações foram caracterizadas. Em um aspecto da invenção, o domínio de ativação transcricional pode ser VP64. Em outro aspecto da invenção, o domínio de repressão de transcrição pode ser KRAB ou SID4X. Outros aspectos da invenção referem-se a enzima modificada Cas 9 sendo fundida com domínios que incluem mas não estão limitados a um ativador de transcrição, repressor, uma recombinase, uma transposase, um remodelador histona, uma desmetilase, uma DNA metiltransferase, um criptocromo, um domínio induzível/controlável pela luz um domínio quimicamente induzível/controlável.

[0014] Em uma forma de realização adicional, a invenção proporciona métodos para gerar tracrRNA mutante e guiar sequências de repetição ou sequências guia quiméricas mutantes que permitem um desempenho melhorado desses RNAs nas células. Aspectos da invenção também provêm na seleção das referidas sequências.

[0015] Aspectos da invenção também provêm métodos de simplificação da clonagem e aplicação de componentes do complexo CRISPR. Na forma de realização preferencial da invenção, um promotor adequado, tal como o promotor U6, é amplificado com um oligo DNA e adicionado ao RNA guia. O produto de PCR resultante pode então ser transfectado para as células para guiar a expressão do RNA guia. Aspectos da invenção referem-se também ao RNA guia que é transcrito in vitro ou encomendado a uma empresa de síntese e transfectado diretamente

[0016] Em um aspecto, a invenção proporciona métodos para melhorar a atividade, usando uma polimerase mais ativa. Em uma forma de realização preferencial, a expressão dos RNAs guia sob o controle do Promotor T7 é conduzida pela expressão da polimerase T7 na célula. Em uma forma de realização vantajosa, a célula é uma célula eucariótica. Em uma forma de realização preferencial a célula eucariótica é uma célula humana. Em uma forma de realização preferencial a célula humana é uma célula específica do paciente.

[0017] Em um aspecto, a invenção proporciona métodos de redução a toxicidade das enzimas Cas. Em certos aspectos, a enzima Cas é qualquer Cas9 conforme aqui descrito, por exemplo qualquer Cas9 bacteriana ocorrendo naturalmente assim como quaisquer quimeras, mutantes, homólogas ou ortólogas. Em uma forma de realização preferencial, a Cas9 é aplicada na célula na forma de mRNA. Isto permite a expressão transiente da enzima reduzindo desse modo a toxicidade. Em outra forma de realização preferencial, a invenção também proporciona métodos para expressar Cas9 sob o controle de um promotor induzível, e as construções aí utilizadas.

[0018] Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para melhorar a aplicação in vivo do sistema CRISPR- Cas. Na forma de realização preferencial, a enzima Cas é Cas9 tipo selvagem ou qualquer das versões modificadas aqui descritas, incluindo qualquer Cas9 bacteriana ocorrendo naturalmente assim como quaisquer quimeras, mutantes, homólogas ou ortólogas. Um aspecto vantajoso da invenção provê a seleção de homólogas de Cas9 que são facilmente empacotadas em vetores virais para a aplicação. Ortólogas Cas9 tipicamente partilham a organização geral de domínios 3-4 RuvC e um domínio HNH. O domínio RuvC mais 5' cliva a cadeia não complementar, e o domínio HNH cliva a cadeia complementar. Todas as notações são em referência à sequência guia.

[0019] O resíduo catalítico no domínio 5’ RuvC é identificado através da comparação de homologia da Cas9 de interesse com outras Cas9 ortólogas (de local de CRISPR tipo II de S. pyogenes, local 1 de CRISPR de S. thermophilus, local 3 de CRISPR de S. thermophilus, e Franciscilla novicida tipo II local de CRISPR local), e o resíduo Asp conservado (D10) é modificado para alanina para converter Cas9 em uma enzima de corte de cadeia complementar. De modo semelhante, os resíduos His e Asn conservados no domínio HNH são modificados para Alanina para converter Cas9 em uma enzima de corte não de cadeia complementar. Em algumas formas de realização, ambos os conjuntos de mutações podem ser feitos, para converter Cas9 em uma enzima não de corte.

[0020] Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é uma enzima CRISPR tipo I ou III, preferencialmente uma enzima CRISPR tipo II. Esta enzima CRISPR tipo II pode ser qualquer enzima Cas. Uma enzima preferencial Cas pode ser identificada como Cas9 dado que esta pode referir-se à classe geral de enzimas partilhando homologia com a maior das nucleases com os domínios de múltiplas nucleases a partir do sistema CRISPR de tipo II. O mais preferencialmente, a enzima Cas9 é de, ou deriva de, spCas9 ou saCas9. Por consequência, os Requerentes entendem que a enzima derivada baseia-se em grande parte, no sentido de ter um elevado grau de homologia de sequência com, uma enzima de tipo selvagem, mas que foi mutada (modificada) de alguma forma conforme aqui descrito.

[0021] Será tomado em consideração que os termos enzima Cas e CRISPR são aqui geralmente utilizados intermutavelmente, a não ser que seja evidente de outra forma. Como mencionado acima, muitas das numerações de resíduos aqui utilizados se referem a enzima Cas9 do local de CRISPR tipo II em Streptococcus pyogenes. Porém, tem que se entender que a presente invenção inclui muitas mais Cas9s de outras espécies de micróbios tais como SpCas9, SaCas9, St1Cas9 e assim sucessivamente. Outros exemplos são aqui providos. O habilitado na arte será capaz de determinar resíduos correspondentes apropriados em enzimas Cas9 outras para além de SpCas9 comparando as sequências de aminoácidos relevantes. Assim, onde uma substituição específica de aminoácido é referida para uso na numeração de SpCas9, então, a menos que o contexto o torne evidente isto não pretende referir-se a outras enzimas Cas9, a divulgação pretende abranger as modificações correspondentes em outras enzimas Cas9. SpCas9 ou SaCas9 é enzima Cas9 particularmente preferencial.

[0022] Um exemplo de uma sequência otimizada para códon, neste caso otimizada para humanos (isto é sendo otimizada para expressão em humanos) é aqui provido, ver a sequência otimizada para códon SaCas9 humana. Embora isto seja preferencial, faz-se notar que são possíveis outros exemplos e é conhecida a otimização de códon para uma espécie hospedeira.

[0023] Em formas de realização adicionais, a invenção proporciona métodos para melhorar a função de Cas9 gerando proteínas Cas9 quiméricas. Proteínas Cas9 quiméricas Cas9s quiméricas podem ser novas Cas9 contendo fragmentos de mais do que uma Cas9 de ocorrência natural. Estes métodos podem compreender a fusão de fragmentos N-terminais de uma homóloga de Cas9 com fragmentos C-terminais de outra homóloga de Cas9. Estes métodos permitem ainda a seleção de novas propriedades exibidas pelas proteínas Cas9 quiméricas.

[0024] Será tomado em consideração que, nos presentes métodos, onde o organismo é um animal ou uma planta, a modificação pode ocorrer ex vivo ou in vitro, por exemplo em uma cultura de células e em alguns casos não in vivo. Em outras formas de realização, pode ocorrer in vivo.

[0025] Em um aspecto, a invenção fornece um método de modificação de um organismo ou um organismo não humano por manipulação de uma sequência alvo em um local genômico de interesse compreendendo: aplicação de uma composição de ocorrência não natural ou manipulada compreendendo: A) - I. uma sequência de polinucleotídeos de RNA do sistema CRISPR-Cas, opcionalmente uma sequência de polinucleotídeos de RNA quimérico (chiRNA), caracterizada pelo fato de a sequência de polinucleotídeos poder compreender: (a) uma sequência guia capaz de hibridar com uma sequência alvo em uma célula eucariótica, (b) uma sequência tracr mate, e (c) uma sequência tracr, e 11. uma sequência de polinucleotídeos codificando uma enzima CRISPR compreendendo opcionalmente pelo menos uma ou duas sequências de localização nuclear, em que (a), (b) e (c) são arranjadas em uma orientação 5’ a 3’, em que quando transcrita, a sequência tracr mate hibrida com a sequência tracr e a sequência guia dirige a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo, e em que o complexo CRISPR compreende a enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que está hibridada com a sequência alvo, e (2) a sequência tracr mate que está hibridada com a sequência tracr e a sequência de polinucleotídeos codificando uma enzima CRISPR é DNA ou RNA, ou (B) I. polinucleotídeos que podem compreender: (a) uma sequência guia capaz de hibridar com uma sequência alvo em uma célula eucariótica, e (b) pelo menos uma ou mais sequências companheiras tracr, (c) uma sequência de polinucleotídeos codificando uma enzima CRISPR, e (d) . uma sequência de polinucleotídeos que pode compreender uma sequência tracr, em que quando transcrita, a sequência tracr mate hibridada com a sequência tracr e a sequência guia dirige a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo, e em que o complexo CRISPR compreende a enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que está hibridada com a sequência alvo, e (2) a sequência tracr mate que está hibridada com a sequência tracr e a sequência de polinucleotídeos codificando uma enzima CRISPR é DNA ou RNA.

[0026] Em algumas formas de realização, aplicável a qualquer um dos ou todos os aspectos providos aqui, a segunda alternativa acima (B) é preferencial. A primeira alternativa (A) é particularmente preferencial, no entanto. Isto se aplica a todos os aspectos da invenção apresentando as duas abordagens de CRISPR alternativas.

[0027] Será apreciado que o presente pedido está dirigido à aplicação de vetores virais, quer seja a um órgão per se ou um tecido dentro dele ou simplesmente uma ou mais células alvo. Células alvo são aquelas selecionadas para aplicação do sistema CRISPR-Cas. Por exemplo, no caso de aplicação ao fígado, tais células alvo podem ser hepatócitos, preferencialmente hepatócitos primários. As células alvo podem estar compreendidas dentro de um animal vertebrado, um paciente (no sentido de um animal com necessidade de terapia de genes dirigida por CRISPR) ou um organismo modelo, ou podem estar em cultura de células, um organoide ou outro tecido ex vivo, tal como “fígado em um chip” por exemplo onde hepatócitos são inoculados e cultivados em um molde. Hepatócitos colhidos de órgãos não transplantados são também uma célula alvo útil. Com o desenvolvimento de técnicas de impressão 3-D sendo aplicadas à biologia, tecidos impressos estão ao alcance e é inteiramente possível que células ou tecidos do fígado impressos deste modo para criar um organoide ou em um chip poderiam ser também visadas. A discussão aqui de hepatócitos pode ser igualmente aplicada a outras células do fígado e de fato a outros tipos de células em geral, tais como células do cérebro ou rim, exemplos dos quais são providos aqui.

[0028] Assim sendo é provido um organismo modelo que pode compreender células do fígado, tais como hepatócitos, às quais o presente sistema CRISPR-Cas foi aplicado. Similarmente é também provido uma coleção ex vivo de duas ou mais células do fígado, tais como hepatócitos, às quais o presente sistema CRISPR-Cas foi aplicado. Tais coleções podem incluir órgãos do fígado, organoides do fígado, células do fígado populando um molde (“fígado em um chip”). Novamente, claro, alternativas ao fígado tais como um cérebro ou rim são previstas, pois, embora o fígado seja preferencial, é provido aqui como um exemplo. Métodos de criação de tais modelos ou coleções são também providos.

[0029] Em particular, tais células alvo podem expressar, ou compreender polinucleotídeos capazes de expressar uma enzima Cas. Como discutido aqui, isto tem a vantagem de prover um modelo pronto para interrogação da função de genes através da perturbação de genes, incluindo silenciamento. Isto é particularmente útil no estudo de afecções do fígado, tais como amiloidose e outras listadas aqui, bem como afecções mais amplas tais como obesidade.

[0030] Métodos de interrogação da função de genes do fígado são também providos aqui. Estes compreendem tipicamente aplicação às células alvo, in ou ex vivo, do sistema CRISPR- Cas. No entanto, se as células já compreenderem Cas, quer expressas como uma proteína ou codificadas por polinucleotídeos já compreendidos dentro das células, então somente o polinucleotídeo de CRISPR necessita de ser aplicado. O método pode incluir extração do e, opcionalmente, reinserção de volta ao tecido, órgão, organoide, chip ou coleção de células alvo como discutido aqui. Por aplicação se significa aplicação de fato física dos polinucleotídeos ao núcleo das células, mas também transfecção.

[0031] São também pretendidos métodos de terapia de genes. Por exemplo é alcançável correção de um ou mais genótipos deficientes (por exemplo, mutações de local único) através do uso do presente sistema CRISPR-Cas nas células do fígado discutidas aqui (incluindo os modelos). Afecções monogênicas associadas ao fígado são particularmente preferenciais e são exemplificadas aqui, ver Exemplo 38 onde o alvo do sistema CRISPR-Cas9 foi ApoB, um gene do metabolismo de lípidos, foi eficaz na indução de uma mudança de fenótipo in vivo. São também providas composições para uso em terapia de genes.

[0032] Afecções para estudo e terapia de genes são numerosas e variadas devido à ampla aplicação da tecnologia CRISPR-Cas. Exemplos adequados são providos aqui, incluindo nas Tabelas A, B e C. Qualquer uma destas pode ser selecionada e cada um é preferencial. Algumas são particularmente preferenciais, mas exemplos não limitantes são as afecções especificamente exemplificadas aqui bem como qualquer afecção monogênica, e particularmente Fibrose Cística (CFTR).

[0033] Embora sejam pretendidas várias enzimas Cas, Cas9 é particularmente preferencial e os Requerentes mostraram eficácia particular no fígado para SaCas9. A sequência tracr de Sa é também preferencial se a enzima Cas for uma enzima Cas de Sa. Uma PAM adequada em tal circunstância é NNGRR.

[0034] Embora possa ser usada uma guia, a assim chamada multiplexação com duas, três, quatro ou mais guias, é particularmente útil na interrogação da função de genes e criação do modelo (para prover múltiplos silenciamentos de genes), mas também em terapia de genes onde múltiplos genótipos defeituoso são para serem corrigidos (ou múltiplos erros em um único gene ou, mais provavelmente, múltiplos erros espalhados ao longo de vários genes). Alternativamente, a multiplexação com duas guias é útil em um abordagem de nickase dupla para reduzir os efeitos fora do alvo ou simplesmente seleção de múltiplos alvos dentro de um gene para assegurar o recrutamento de Cas. Guias triplas e quádruplas são preferenciais. A referência a gene aqui é feita indistintamente com local genômico.

[0035] A abordagem de íntrons descrita aqui é também útil a este respeito, onde a guia está posicionada dentro do íntron de Cas.

[0036] Meios de aplicação preferenciais incluem os métodos descritos por Kanasty em baixo, tais como LNP, especialmente onde somente a guia é para ser aplicada ou é para ser aplicada sozinha. No entanto, vetores virais incluindo lentivírus e AAV são geralmente preferenciais para o fígado pois têm tido sucesso até à data. Destes, AAV é preferencial e especialmente serotipo 8, se tendo mostrado que AAV2/8 era eficaz.

[0037] Algumas afecções e genes alvo preferenciais, na medida em que estejam presentes em ou afecções do fígado ou rim, são distúrbios metabólicos, tais como qualquer um de: Neuropatia amiloide (TTR, PALB); Amiloidose (APOA1, APP, AAA, CVAP, AD1, GSN, FGA, LYZ, TTR, PALB); Cirrose (KRT18, KRT8, CIRH1A, NAIC, TEX292, KIAA1988); Fibrose cística (CFTR, ABCC7, CF, MRP7); Doenças de armazenamento do glicogênio (SLC2A2, GLUT2, G6PC, G6PT, G6PT1, GAA, LAMP2, LAMPB, AGL, GDE, GBE1, GYS2, PYGL, PFKM); Adenoma hepático, 142330 (TCF1, HNF1A, MODY3), Falha hepática, início precoce, e distúrbio neurológico (SCOD1, SCO1), Deficiência de lipase hepática (LIPC), Hepatoblastoma, câncer e carcinomas (CTNNB1, PDGFRL, PDGRL, PRLTS, AXIN1, AXIN, CTNNB1, TP53, P53, LFS1, IGF2R, MPRI, MET, CASP8, MCH5); Doença cística medular do rim (UMOD, HNFJ, FJHN, MCKD2, ADMCKD2); Fenilcetonúria (PAH, PKU1, QDPR, DHPR, PTS); Doença policística do rim e hepática (FCYT, PKHD1, ARPKD, PKD1, PKD2, PKD4, PKDTS, PRKCSH, G19P1, PCLD, SEC63). Outros alvos preferenciais incluem qualquer um ou mais de: PCSK9; Hmgcr; SERPINA1; ApoB; e/ou LDL.

[0038] Será apreciado que métodos de alteração da expressão no fígado não envolvem alteração da linha germinativa, que pode ser excluída por razões morais. De fato, embora a transfecção de células-tronco seja pretendida e certamente preferencial em algumas formas de realização, células não de tronco (i.e., células pós-mitóticas) são particularmente preferenciais, particularmente onde possam mostrar ou ser estimuladas para mostrar alguma regeneração.

[0039] CRISPRS do Tipo II são particularmente preferenciais, especialmente para uso em eucariotas, como no presente caso, onde os fígados são somente encontrados em eucariotas, particularmente animais vertebrados, em qualquer caso.

[0040] O uso dos sistemas CRISPR-Cas para invocar uma mudança fenotípica é uma vantagem particular, especialmente in vivo.

[0041] Onde são pretendidas aplicações terapêuticas, ou para outra manipulação do genoma nas células alvo, então onde é requerida uma correção, será apreciado que, após nicking ou clivagem do alvo de DNA genômico, a correção através da via HDR é preferencial. Para silenciamento de genes, NHEJ é vantajoso, no entanto, a correção através da via HDR é preferencial para terapia. Em tais circunstâncias é preferencial aplicar um molde de reparação. Este é o mais preferencialmente ssDNA embora RNA através de um vetor retroviral para prover um molde de DNA correspondente seja também possível. A pessoa perita consegue prontamente colocar a invenção em prática a partir dos ensinamentos aqui contribuindo para o conhecimento na técnica; e a este respeito é feita menção de que a pessoa perita, a partir dos ensinamentos aqui contribuindo para o conhecimento na técnica, consegue prontamente apreciar e implementar considerações no que toca ao comprimento do braço homólogo. É feita menção de pedidos de patentes e publicações incluindo o inventor Zhang aqui, incluindo aqueles citados aqui. O molde de reparação é preferencialmente coaplicado com um ou mais elementos do sistema CRISPR-Cas.

[0042] É também provido um método de alteração da expressão de pelo menos um produto de gene do fígado compreendendo introdução em uma célula eucariótica contendo e expressando uma molécula de DNA tendo uma sequência alvo da célula e codificando o produto de gene, um sistema de Cas associado a CRISPR Repetições Curtas Palindrômicas Agrupadas Regularmente Interespaçadas (CRISPR) (CRISPR-Cas) não ocorrendo naturalmente, manipulado que pode compreender um ou mais vetores que podem compreender:

[0043] a) um primeiro elemento regulador operável em uma célula eucariótica operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência de nucleotídeos codificando um RNA guia do sistema CRISPR-Cas que hibrida com a sequência alvo, e

[0044] b) um segundo elemento regulador operável em uma célula eucariótica operacionalmente ligado a pelo uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína Cas9 do Tipo II,

[0045] em que os componentes (a) e (b) estão localizados nos mesmos ou em diferentes vetores do sistema, por meio do que o RNA guia visa a sequência alvo e a proteína Cas9 cliva a molécula de DNA, por meio do que a expressão do pelo menos um produto de gene do fígado é alterada; e em que a proteína Cas9 e o RNA guia não ocorrem naturalmente em conjunto.

[0046] A referência em baixo a alvos será entendida como sendo referência a genes ou células, mas tipicamente genes, a não ser que de outro modo aparente.

[0047] O que se segue se aplica igualmente a todos os aspectos da invenção. Quando fígado possa ser mencionado aqui, isto entendido como referenciando células pós-mitóticas em geral, especialmente rim ou cérebro. A sequência alvo é o mais preferencialmente uma sequência alvo de célula pós-mitótica. A célula pós-mitótica pode estar em ou ser de (i.e., a fonte das células ou do tipo de células) qualquer um dos seguintes órgãos ou pode ser organoides ou modelos ex vivo ou coleções de células compreendendo células do:

[0048] Rim, tais como células glomerulares;

[0049] Sistema Digestivo incluindo o estômago, pâncreas, duodeno, íleo e/ou cólon;

[0050] Coração;

[0051] Pulmão;

[0052] Cérebro, em particular neurônios, e/ou CNS em geral;

[0053] Olho, incluindo tecido retinal;

[0054] Ouvido, incluindo o ouvido interno;

[0055] Pele;

[0056] Músculo;

[0057] Osso; e/ou

[0058] Fígado em geral, embora isto seja excluído em algumas formas de realização pois é também o assunto de um pedido separado.

[0059] Cérebro e Rim são particularmente preferenciais. Em algumas formas de realização, a célula é uma célula do cérebro, tal como um neurônio. Em algumas formas de realização, a célula é uma célula do rim.

[0060] Células do rim preferenciais incluem qualquer uma ou mais de: • Célula parietal glomerular do rim; • Podócito glomerular do rim; • Célula fronteira do túbulo contorcido proximal do rim; • Célula do segmento fino da alça de Henle; • Célula do ramo ascendente espesso; • Célula do túbulo distal do rim; • Célula do ducto de coleta do rim; e • Células intersticiais do rim.

[0061] Exemplos preferenciais de células alvo são providos na tabela em baixo sob a seção apropriada, por exemplo aquela intitulada “rim” ou “fígado” ou “osso” ou “ouvido”, qualquer um dos quais é preferencial, bem como na Tabela B. Qualquer um ou mais destes alvos é preferencial. Os Exemplos 1 e 18 visam também células do Rim (embora células-tronco, que não são células pós-mitóticas), mas o ensinamento de aplicação pode ser aplicável.

[0062] Em algumas formas de realização particularmente preferenciais, a manipulação provoca uma mudança fenotípica na célula.

[0063] Em algumas formas de realização, a mudança fenotípica pode ser provocada na ou mantidas na célula in vivo. Ou a célula é transfectada in vivo ou é extraída, transfectada ex vivo e depois reinserida (transplantada) de volta no mesmo ou diferente hospedeiro.

[0064] A expressão da enzima CRISPR, e opcionalmente a sequência guia, pode estar sob o controle de um promotor específico da célula, por exemplo compreendido dentro de um cassete de expressão capaz de expressar a enzima e o guia opcional na referida célula pós-mitótica. Por outras palavras, a enzima CRISPR, e opcionalmente a sequência guia, está/estão operacionalmente ligada(s) ao referido promotor específico da célula alvo.

[0065] A célula alvo pode ser uma célula pós-mitótica. Sistemas de vetores AAV são particularmente preferenciais, especialmente quando a célula pós-mitótica é um neurônio. Células somáticas são também preferenciais.

[0066] O promotor da enzima CRISPR e o promotor opcional para a sequência guia podem ser os mesmos ou diferentes.

[0067] A discussão aqui, em particular o que se segue, se aplica também a qualquer método, uso ou composição descrito aqui. O RNA do sistema CRISPR-Cas pode ser um RNA quimérico (chiRNA). O sistema CRISPR-Cas pode ser um sistema de enzima CRISPR multiplexado compreendendo adicionalmente múltiplas quimeras e/ou múltiplas sequências multiguia e uma única sequência tracr. A enzima CRISPR pode se ruma nuclease dirigindo clivagem de ambas as fitas na localização da sequência alvo. A enzima CRISPR pode compreender uma ou mais mutações. A enzima CRISPR pode compreender uma ou mais mutações D10A, E762A, H840A, N854A, N863A ou D986A. A uma ou mais mutações podem ser em um domínio RuvC1 da enzima CRISPR. A enzima CRISPR pode ser uma nickase dirigindo clivagem na localização da sequência alvo. A nickase pode ser uma nickase dupla. Pelo menos duas ou mais NLS são preferenciais.

[0068] A enzima CRISPR pode ser de tipo II, preferencialmente uma Cas e o mais preferencialmente uma Cas9. A referência a Cas ou Cas9 (por exemplo em CRISPR-Cas ou CRISPR Cas9) será entendida como sendo qualquer Cas, o mais preferencialmente Cas9 e particularmente Cas9 de Sa ou Sp (englobando todas as mutações tais como D10A para prover DSB, função de nickase ou nickase dupla).

[0069] A enzima CRISPR pode ter uma ou mais mutações em um domínio catalítico, em que, quando transcrita, a sequência tracr mate hibrida com a sequência tracr e a sequência guia dirige ligação específica da sequência de um complexo CRISPR com a sequência alvo, e em que a enzima compreende adicionalmente um domínio funcional. O domínio funcional pode ser um domínio de ativação transcricional. O domínio de ativação transcricional pode ser VP64.

[0070] Os métodos podem adicionalmente compreender minimização de modificações fora do alvo por manipulação de uma primeira e uma segunda sequência alvo em fitas opostas de um dúplex de DNA em um local genômico de interesse em uma célula compreendendo aplicação de uma composição de ocorrência não natural ou manipulada compreendendo: I. uma sequência de polinucleotídeos de RNA quimérico (chiRNA) de CRISPR-Cas, em que a sequência de polinucleotídeos compreende: (a) uma primeira sequência guia capaz de hibridar com a primeira sequência alvo, (b) uma primeira sequência tracr mate, (c) uma primeira sequência tracr (d) uma segunda sequência guia capaz de hibridar com a segunda sequência alvo, (e) uma segunda sequência tracr mate, e (f) uma segunda sequência tracr, e opcionalmente, em que uma sequência ligante está presente entre a primeira sequência tracr e a segunda sequência guia, por meio do que a primeira sequência guia e a segunda sequência guia estão em tandem; e II. uma sequência de polinucleotídeos codificando uma enzima CRISPR compreendendo pelo menos uma ou mais sequências de localização nuclear, em que (a), (b), (c), (d), (e) e (f) são arranjadas em uma orientação 5' para 3', em que a sequência de polinucleotídeos compreende uma sequência ligante entre a primeira sequência tracr e a segunda sequência guia, por meio do que a primeira sequência guia e a segunda sequência guia estão em tandem, e em que, quando transcritas, a primeira e a segunda sequências companheiras tracr hibridam com as primeira e segunda sequências, respectivamente, e a primeira e a segunda sequências guia dirigem a ligação específica à sequência de um primeiro e um segundo complexo CRISPR às primeira e segunda sequências alvo, respectivamente, ou 11. um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação da enzima codificando uma enzima CRISPR, e em que os componentes I e II estão localizados nos mesmos ou em diferentes vetores do sistema, e, quando transcrita, uma primeira sequência tracr mate hibrida com uma primeira sequência tracr e a primeira e a segunda sequências guias dirigem a ligação específica à sequência de um primeiro e um complexo CRISPR às primeira e segunda sequências alvo, respectivamente; em que o primeiro complexo CRISPR compreende a enzima CRISPR complexada com (1) a primeira sequência guia que está hibridada com a primeira sequência alvo, e (2) a primeira sequência tracr mate que está hibridada com a primeira sequência tracr, em que o segundo complexo CRISPR compreende a enzima CRISPR complexada com (1) a segunda sequência guia que está hibridada com a segunda sequência alvo, e (2) a segunda sequência tracr mate que está hibridada com a segunda sequência tracr, em que a sequência de polinucleotídeos codificando uma enzima CRISPR é DNA ou RNA, e em que a primeira sequência guia dirige a clivagem de uma fita do dúplex de DNA próximo da primeira sequência alvo e a segunda sequência guia dirige a clivagem de outra fita próximo da segunda sequência alvo induzindo um quebra de fita dupla, modificando deste modo o organismo ou o organismo não humano por minimização das modificações fora do alvo.

[0071] Em algumas formas de realização, a segunda alternativa acima (B) é preferencial. A primeira alternativa (A) é particularmente preferencial, no entanto. Isto se aplica a todos os aspectos da invenção apresentando as duas abordagens de CRISPR alternativas.

[0072] Será apreciado que o presente pedido está dirigido a células pós-mitóticas, quer seja um órgão per se ou um tecido dentro dele ou simplesmente uma ou mais células pós-mitóticas, p.ex., tais como neurônios. Neurônios e células do rim são preferenciais As células pós-mitóticas podem estar compreendidas dentro de um animal vertebrado, um paciente (no sentido de um animal com necessidade de terapia de genes dirigida por CRISPR) ou um organismo modelo, ou podem estar em cultura de células, um organoide ou outro tecido ex vivo, tal como “fígado em um chip” por exemplo onde hepatócitos são inoculados e cultivados em um molde. Hepatócitos colhidos de órgãos não transplantados são também um alvo útil. Com o desenvolvimento de técnicas de impressão 3-D sendo aplicadas à biologia, tecidos impressos estão ao alcance e é inteiramente possível que células ou tecidos do fígado impressos deste modo para criar um organoide ou em um chip poderiam ser também visadas. Alternativas sem ser fígado são também pretendidas, particularmente, para tecidos do rim ou outras células/tecidos pós-mitóticos.

[0073] Assim sendo é provido um organismo modelo compreendendo células pós-mitóticas, tais como neurônios ou células do rim, às quais o presente sistema CRISPR-Cas foi aplicado. Similarmente é também provido uma coleção ex vivo de duas ou mais células pós-mitóticas, tais como neurônios ou células do rim, às quais o presente sistema CRISPR-Cas foi aplicado. Tais coleções podem incluir órgãos pós-mitóticos, organoides, células populando um molde (“rim em um chip”). Métodos de criação de tais modelos ou coleções são também providos.

[0074] Em particular, tais células pós-mitóticas podem expressar, ou compreender, polinucleotídeos capazes de expressar uma enzima Cas. Como discutido aqui, isto tem a vantagem de prover um modelo pronto para interrogação da função de genes através da perturbação de genes, incluindo silenciamento. Isto é particularmente útil no estudo de afecções das células pós-mitóticas, tais como o rim ou cérebro, bem como afecções mais amplas tais como obesidade.

[0075] Métodos de interrogação da função de genes de células pós-mitóticas são também providos aqui. Estes compreendem tipicamente aplicação às células pós-mitóticas, in ou ex vivo, do sistema CRISPR-Cas. No entanto, se as células já compreenderem Cas, quer expressas como uma proteína ou codificadas por polinucleotídeos já compreendidos dentro das células, então somente o polinucleotídeo de CRISPR necessita de ser aplicado. O método pode incluir extração do e, opcionalmente, reinserção de volta à célula pós-mitótica. Por aplicação se significa aplicação de fato física dos polinucleotídeos ao núcleo das células, mas também transfecção. Portanto, aplicação deve ser interpretada como incluindo transfecção a não ser que de outro modo aparente.

[0076] É também provido um método de indução da perturbação de genes em uma ou mais células animais ou vegetais, compreendendo transdução de uma primeira população de células com um sistema CRISPR-Cas de acordo com a presente invenção para deste modo alterar o genoma da primeira população de células para se obter uma segunda população de células. O método pode ser ex vivo ou in vitro, por exemplo em uma cultura de células ou em um modelo ex vivo ou in vitro (tal como um organoide ou “célula animal ou vegetal em chip”). Alternativamente, o método pode ser in vivo, caso em que pode também incluir isolamento da primeira população de células do sujeito, e transplante da segunda população de células (de volta para o) no sujeito. A perturbação de genes pode ser um ou mais, ou dois ou mais, ou três ou mais, ou quatro ou mais genes. A perturbação de genes pode ser uma redução na função de genes (i.e., atividade no produto de gene codificado). Isto pode ser, por exemplo, induzido através de alteração do genoma da primeira população de células para se obter a segunda população de células, em que a segunda população de células tem um genótipo defeituoso, tal como uma afecção monogênica, que está ausente na primeira população de células. Isto pode requerer um molde de reparação correspondente, como discutido aqui, para prover a sequência defeituosa ou pode ser através de indução de uma DSB. Em particular, a perturbação de genes é um silenciamento de genes. Em algumas formas de realização, a célula animal ou vegetal é o mais preferencialmente uma célula pós-mitótica tal como célula do rim ou cérebro (neurônio) ou uma célula do fígado, tal como um hepatócito primário.

[0077] Alternativamente, a perturbação de genes pode ser um aumento na função de genes (i.e., atividade no produto de gene codificado). Isto pode ser, por exemplo, induzido através de alteração do genoma da primeira população de células para se obter a segunda população de células, em que a primeira população de células tem um genótipo defeituoso, tal como uma afecção monogênica, que está ausente da ( i.e., corrigida na) segunda população de células. Isto pode requerer um molde de reparação correspondente, como discutido aqui, para proporcionar a sequência corrigida.

[0078] Se for usada multiplexação, então uma mistura de redução de um ou mais genes e aumento de um ou mais genes é pretendida. Isto pode ser alcançado através do proporcionar de uma ou mais das guias (no multiplex) e modelos de reparação correspondentes podem ser usados para reduzir a função, enquanto uma ou mais das guias e seus modelos correspondentes podem ser usados para aumentar a função.

[0079] É também provido um método de interrogação da função de um ou mais genes em uma ou mais células animais ou vegetais, compreendendo determinação de mudanças na expressão do um ou mais genes nas primeiras populações de células animais ou vegetais, indução da referida perturbação de genes na referida primeira população para proporcionar a referida segunda população com um genoma (ou genótipo) alterado, e determinação de mudanças na expressão do um ou mais genes na segunda população de células animais ou vegetais, interrogando este modo a função do um ou mais genes. Em algumas formas de realização, a célula animal ou vegetal é o mais preferencialmente uma célula pós-mitótica tal como uma célula do rim ou cérebro (neurônio) ou uma célula do fígado, tal como um hepatócito primário.

[0080] É também provido um modelo e um método de criação do referido modelo. O modelo pode ser um animal compreendendo uma célula animal ou vegetal (um modelo in vivo) ou pode ser um modelo ex vivo ou in vitro, tal como um organoide animal ou vegetal ou “célula animal ou vegetal em um chip” ou a coleção de células animais ou vegetais, tal como um em um molde, como descrito aqui. As células animais ou vegetais de qualquer um dos modelos será preferencialmente transfectado com Cas9. Conformemente é especificamente provido um modelo compreendendo uma ou mais células animais ou vegetais compreendendo a enzima CRISPR, preferencialmente uma Cas9 tal como Sa ou SpCas9. As células do modelo podem ter sido transfectadas ou transduzidas com o segundo elemento regulador provido aqui, que é segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de enzima codificando uma enzima CRISPR compreendendo pelo menos uma ou mais sequências de localização nuclear (NLSs). O modelo pode ser, como descrito acima, um modelo in vivo ou pode ser um modelo ex vivo ou in vitro. Um tal modelo permite a rápida interrogação da função de um ou mais genes, pois somente a sequência de polinucleotídeos do sistema CRISPR-Cas (compreendendo uma ou mais sequências guia visando o referido um ou mais genes) necessita de ser aplicada para perturbar a função do referido gene. Por outras palavras, os métodos de interrogação da função de genes em tais modelos podem compreender somente aplicação da sequência de polinucleotídeos do sistema CRISPR-Cas (compreendendo a uma ou mais sequências guias), tendo a Cas (enzima CRISPR) já sido provida na(s) célula(s) do modelo. Métodos de criação de tais modelos são também providos, compreendendo transdução ou transfecção de uma ou mais células animais ou vegetais em uma primeira população de células animais ou vegetais com um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de enzima codificando uma enzima CRISPR compreendendo pelo menos uma ou mais sequências de localização nuclear (NLSs) como descrito aqui para prover deste modo uma ou mais segundas populações de células animais ou vegetais compreendendo ou expressando a enzima CRISPR. Em algumas formas de realização, a célula animal ou vegetal é o mais preferencialmente uma célula pós-mitótica tal como uma célula do rim ou cérebro (neurônio) ou uma célula do fígado, tal como um hepatócito primário.

[0081] São também providos métodos de criação de modelos com genes perturbados, em particular modelos de silenciamento de genes. Estes métodos podem tipicamente compreender indução de perturbação de genes em um ou mais genes, como descrito aqui, em uma primeira população de células para deste modo prover uma segunda população de células com um genoma (ou genótipo alterado). A segunda população de células pode ser depois inoculada em um molde ou em um chip, por exemplo, para prover deste modo um modelo ex vivo ou in vitro. Alternativamente, a segunda população de pode estar compreendida dentro de um animal in vivo.

[0082] São também pretendidos métodos de terapia de genes. Por exemplo é alcançável correção de um ou mais genótipos deficientes (por exemplo, mutações de local único) através do uso do presente sistema CRISPR-Cas nas células pós- mitóticas discutidas aqui (incluindo os modelos). Afecções monogênicas associadas ao pós-mitótico são particularmente preferenciais e são exemplificadas aqui, ver Exemplo 36 onde o alvo do sistema CRISPR-Cas9 foi ApoB, um gene do metabolismo de lípidos, foi eficaz na indução de uma mudança de fenótipo in vivo. O Exemplo 38 é também instrutivo em relação às mudanças de comportamento fenotípicas vistas in vivo no cérebro de camundongos transduzidos com o presente sistema. São também providas composições para uso em terapia de genes.

[0083] Embora sejam pretendidas várias enzimas Cas, Cas9 é particularmente preferencial e os Requerentes mostraram eficácia particular no fígado para SaCas9. A sequência tracr de Sa é também preferencial se a enzima Cas for uma enzima Cas de Sa. Uma PAM adequada em tal circunstância é NNGRR.

[0084] Embora possa ser usada uma guia, a assim chamada multiplexação com duas, três, quatro ou mais guias, é particularmente útil na interrogação da função de genes e criação do modelo (para prover múltiplos silenciamentos de genes), mas também em terapia de genes onde múltiplos genótipos defeituoso são para serem corrigidos (ou múltiplos erros em um único gene ou, mais provavelmente, múltiplos erros espalhados ao longo de vários genes). Alternativamente, a multiplexação com duas guias é útil em um abordagem de nickase dupla para reduzir os efeitos fora do alvo ou simplesmente seleção de múltiplos alvos dentro de um gene para assegurar o recrutamento de Cas. Guias triplas e quádruplas são preferenciais. A referência a gene aqui é feita indistintamente com local genômico.

[0085] A abordagem de íntrons descrita aqui é também útil a este respeito, onde a guia está posicionada dentro do íntron de Cas.

[0086] Meios de aplicação preferenciais incluem os métodos descritos por Kanasty em baixo, tais como LNP, especialmente onde somente a guia é para ser aplicada ou é para ser aplicada sozinha. No entanto, vetores virais incluindo lentivírus e AAV são geralmente preferenciais para o fígado pois têm tido sucesso até à data. Destes, AAV é preferencial e especialmente serotipo 8, se tendo mostrado que AAV2/8 era eficaz. Alguns alvos preferenciais, na medida em que estejam presentes em ou afecções do rim, são distúrbios metabólicos, tais como qualquer um de: Neuropatia amiloide (TTR, PALB); Amiloidose (APOA1, APP, AAA, CVAP, AD1, GSN, FGA, LYZ, TTR, PALB); Cirrose (KRT18, KRT8, CIRH1A, NAIC, TEX292, KIAA1988); Fibrose cística (CFTR, ABCC7, CF, MRP7); Doenças de armazenamento do glicogênio (SLC2A2, GLUT2, G6PC, G6PT, G6PT1, GAA, LAMP2, LAMPB, AGL, GDE, GBE1, GYS2, PYGL, PFKM); Adenoma hepático, 142330 (TCF1, HNF1A, MODY3), Falha hepática, início precoce, e distúrbio neurológico (SCOD1, SCO1), Deficiência de lipase hepática (LIPC), Hepatoblastoma, câncer e carcinomas (CTNNB1, PDGFRL, PDGRL, PRLTS, AXIN1, AXIN, CTNNB1, TP53, P53, LFS1, IGF2R, MPRI, MET, CASP8, MCH5); Doença cística medular do rim (UMOD, HNFJ, FJHN, MCKD2, ADMCKD2); Fenilcetonúria (PAH, PKU1, QDPR, DHPR, PTS); Doença policística do rim e hepática (FCYT, PKHD1, ARPKD, PKD1, PKD2, PKD4, PKDTS, PRKCSH, G19P1, PCLD, SEC63). Outros alvos preferenciais incluem qualquer um ou mais de: PCSK9, HMGCR, APOB, LDLR, ANGPTL3, F8, F9/FIX, AAT, FAH, HPD, TAT, ATP7B, UGT1A1, OTC, ARH.

[0087] Será apreciado que métodos de alteração da expressão na célula pós-mitótica não envolvem alteração da linha germinativa, que pode ser excluída por razões morais. De fato, embora a transfecção de células-tronco seja pretendida e certamente preferencial em algumas formas de realização, neurônios e células do rim são particularmente preferenciais, particularmente onde possam mostrar ou ser estimuladas para mostrar alguma regeneração.

[0088] CRISPRS do Tipo II são particularmente preferenciais, especialmente para uso em eucariotas, como no presente caso, onde os fígados são somente encontrados em eucariotas, particularmente animais vertebrados, em qualquer caso.

[0089] O uso dos sistemas CRISPR-Cas para invocar uma mudança fenotípica é uma vantagem particular, especialmente in vivo. Mostramos isto no presente pedido.

[0090] Onde são pretendidas aplicações terapêuticas, ou para outra manipulação do genoma nas células pós-mitóticas, então onde é requerida uma correção, será apreciado que, após nicking ou clivagem do alvo de DNA genômico, a correção através da via HDR é preferencial. Para silenciamento de genes, NHEJ é vantajoso, no entanto, a correção através da via HDR é preferencial para terapia. Em tais circunstâncias é preferencial aplicar um molde de reparação. Este é o mais preferencialmente ssDNA embora RNA através de um vetor retroviral para prover um molde de DNA correspondente seja também possível. A pessoa perita consegue prontamente colocar a invenção em prática a partir dos ensinamentos aqui contribuindo para o conhecimento na técnica; e a este respeito é feita menção de que a pessoa perita, a partir dos ensinamentos aqui contribuindo para o conhecimento na técnica, consegue prontamente apreciar e implementar considerações no que toca ao comprimento do braço homólogo. É feita menção de pedidos de patentes e publicações incluindo o inventor Zhang aqui, incluindo aqueles citados aqui. O molde de reparação é preferencialmente coaplicado com um ou mais elementos do sistema CRISPR-Cas.

[0091] É também provido um método de alteração da expressão de pelo menos um produto de gene de célula pós- mitótica compreendendo introdução em uma célula eucariótica contendo e expressando uma molécula de DNA tendo uma sequência alvo da célula e codificando o produto de gene, um sistema de Cas associado a CRISPR Repetições Curtas Palindrômicas Agrupadas Regularmente Interespaçadas (CRISPR) (CRISPR-Cas) não ocorrendo naturalmente, manipulado que pode compreender um ou mais vetores que podem compreender:

[0092] a) um primeiro elemento regulador operável em uma célula eucariótica operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência de nucleotídeos codificando um RNA guia do sistema CRISPR-Cas que hibrida com a sequência alvo, e

[0093] b) um segundo elemento regulador operável em uma célula eucariótica operacionalmente ligado a pelo uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína Cas9 do Tipo II,

[0094] em que os componentes (a) e (b) estão localizados nos mesmos ou em diferentes vetores do sistema, por meio do que o RNA guia visa a sequência alvo e a proteína Cas9 cliva a molécula de DNA, por meio do que a expressão do pelo menos um produto de gene de célula pós-mitótica é alterada; e em que a proteína Cas9 e o RNA guia não ocorrem naturalmente em conjunto. A referência em baixo a alvos será entendida como sendo alvos de células pós-mitóticas ou genes de outro modo expressos na célula pós-mitótica a não ser que de outro modo aparente.

[0095] Qualquer ou todas as sequências de polinucleotídeos codificando a enzima CRISPR, a sequência guia, a sequência tracr mate ou a sequência tracr pode ser RNA. Os polinucleotídeos codificando a sequência codificando a enzima CRISPR, a sequência guia, a sequência tracr mate ou a sequência tracr podem ser RNA e podem ser sequências de polinucleotídeos via lipossomos, nanopartículas, exossomos, microvesículas, ou uma biolística.

[0096] Será apreciado que quando é feita referência a um polinucleotídeo, que é RNA e se diz “compreender” uma característica tal como uma sequência tracr mate, a sequência de RNA inclui a característica. Se o polinucleotídeo é DNA e se diz compreender uma característica tal como uma sequência tracr mate, a sequência de DNA é ou pode ser transcrita no RNA incluindo a característica em questão. Se a característica é uma proteína, tal como a enzima CRISPR, a sequência de DNA ou RNA referida como sendo, ou podendo ser, traduzida (e no caso de DNA transcrito primeiro).

[0097] Adequadamente, em certas formas de realização a invenção fornece um método de modificação de um organismo (por exemplo, por modificação das células pós-mitóticas de um organismo), por exemplo, mamífero incluindo humanos ou um mamífero ou organismo não humano através da manipulação de uma sequência alvo em um local genômico de interesse compreendendo a aplicação de uma composição de ocorrência não natural ou manipulada compreendendo um sistema vetor viral ou de plasmídeo compreendendo um ou mais vetores virais ou de plasmídeo codificando operacionalmente uma composição para a expressão dos mesmos, em que a composição compreende: (A) uma composição de ocorrência não natural ou manipulada compreendendo um sistema vetor compreendendo um ou mais vetores compreendendo I. um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a um sistema CRISPR-Cas de sequência de polinucleotídeos de RNA quimérico (chiRNA), em que a sequência de polinucleotídeos compreende (a) uma sequência guia capaz de hibridar com uma sequência alvo em uma célula eucariótica, (b) uma sequência tracr mate, e (c) uma sequência tracr, e II. um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de enzima codificando uma enzima CRISPR compreendendo pelo menos uma ou mais sequências de localização nuclear (ou opcionalmente pelo menos uma ou mais sequências de localização nuclear dado que algumas formas de realização pode envolver nenhum NLS), em que (a), (b) e (c) são arranjados em uma orientação 5’ para 3’, em que os componentes I e II estão localizados no mesmo ou em diferentes vetores do sistema, em que quando transcrita, a sequência tracr mate hibrida com a sequência tracr e a sequência guia dirige a sequência específica ligada a um complexo CRISPR com a sequência alvo, e em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que é hibridada com a sequência alvo, e (2) a sequência tracr mate que é hibridada com a sequência tracr, ou (B) de uma composição de ocorrência não natural ou manipulada compreendendo um sistema vetor compreendendo um ou mais vetores compreendendo I. um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a (a) uma sequência guia capaz de hibridar com uma sequência alvo em uma célula eucariótica, e (b) pelo menos uma ou mais sequências companheiras tracr, II. um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de enzima codificando uma enzima CRISPR, e III. um terceiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência tracr, em que os componentes I, II e III estão localizados no mesmo ou em diferentes vetores do sistema, em que quando transcrita, a sequência tracr mate hibrida com a sequência tracr e a sequência guia dirige a sequência específica de ligação a um complexo CRISPR com a sequência alvo, e em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que é hibridada com a sequência alvo, e (2) a sequência tracr mate que é hibridada com a sequência tracr. Em algumas formas de realização, os componentes I, II e III estão localizados no mesmo vetor. Em outras formas de realização, os componentes I e II estão localizadas no mesmo vetor, enquanto o componente III está localizado em outro vetor. Em outras formas de realização, os componentes I e III estão localizadas no mesmo vetor, enquanto o componente II está localizado em outro vetor. Em outras formas de realização, os componentes II e III estão localizados no mesmo vetor, enquanto o componente I está localizado em outro vetor. Em outras formas de realização, cada um dos componentes I, II e III estão localizados em diferentes vetores. A invenção também fornece um sistema vetor viral ou de plasmídeo conforme aqui descrito.

[0098] Preferencialmente, o vetor é um vetor viral, tal como um vetor viral lenti ou báculo ou preferencialmente adenoviral/adenoassociado, mas são conhecidos outros meios de aplicação (tais como sistemas de levedura, microvesículas, genes biolísticos/meios de anexação de vetores para nanopartículas de ouro) e são fornecidos. Em algumas formas de realização, um ou mais dos vetores virais ou de plasmídeo podem ser aplicados via lipossomos, nanopartículas, exossomos, microvesículas, ou uma biolística.

[0099] Através da manipulação de uma sequência alvo, os Requerentes também entendem a manipulação epigenética de uma sequência alvo. Esta pode ser do estado de cromatina de uma sequência alvo, assim como por modificação do estado de metilação da sequência alvo (isto é adição ou remoção de padrões de metilação ou de metilação ou ilhas CpG), modificação de histona, aumentando ou reduzindo a acessibilidade à sequência alvo, ou promovendo a dobragem 3D.

[0100] Será apreciado que quando é feita referência a um método de modificação de um organismo ou mamífero incluindo humanos ou um mamífero não humano ou organismo através da manipulação de uma sequência alvo em um local genômico de interesse, este pode aplicar ao organismo (ou mamífero) como um todo ou apenas uma única célula ou população de células a partir desse organismo (se o organismo é multicelular). No caso de humanos, por exemplo, os Requerentes preveem, nomeadamente, uma única célula ou uma população de células e estas podem preferencialmente ser modificadas ex vivo e então reintroduzidas. Neste caso, uma biópsia ou outro tecido ou amostra de fluído biológico podem ser necessários. As células estaminais também são particularmente preferenciais a este respeito. Mas, evidentemente, formas de realização in vivo estão igualmente previstas.

[0101] Em certas formas de realização a invenção fornece um método para o tratamento ou a inibição de uma afecção causada por um defeito em uma sequência alvo em um local genômico de interesse em um indivíduo (por exemplo, mamífero ou humano) ou um indivíduo não humano (por exemplo, mamífero) com necessidade disso compreendendo modificar o indivíduo ou um indivíduo não humano manipulando a sequência alvo e em que a afecção é suscetível a tratamento ou inibição manipulando a sequência alvo compreendendo fornecer tratamento compreendendo: aplicação de uma composição de ocorrência não natural ou manipulada compreendendo um sistema vetor AAV ou lentivírus compreendendo um ou mais vetores de AAV ou lentivírus codificando operacionalmente uma composição para a expressão dos mesmos, em que a sequência alvo é manipulada pela composição quando expressada, em que a composição compreende: (A) uma composição de ocorrência não natural ou manipulada compreendendo um sistema vetor compreendendo um ou mais vetores compreendendo I. um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a um sistema CRISPR-Cas de sequência de polinucleotídeos de RNA quimérico (chiRNA), em que a sequência de polinucleotídeos compreende (a) uma sequência guia capaz de hibridar com uma sequência alvo em uma célula eucariótica, (b) uma sequência tracr mate, e (c) uma sequência tracr, e II. um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de enzima codificando uma enzima CRISPR compreendendo pelo menos uma ou mais sequências de localização nuclear (ou opcionalmente pelo menos uma ou mais sequências de localização nuclear dado que algumas formas de realização podem não envolver NLS), em que (a), (b) e (c) são arranjados em uma orientação 5’ para 3’, em que os componentes I e II estão localizados no mesmo ou em diferentes vetores do sistema, em que quando transcrito, a sequência tracr mate hibrida com a sequência tracr e a sequência guia dirige a sequência específica de ligação a um complexo CRISPR com a sequência alvo, e em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que é hibridada com a sequência alvo, e (2) a sequência tracr mate que é hibridada com a sequência tracr, ou (B) de uma composição de ocorrência não natural ou manipulada compreendendo um sistema vetor compreendendo um ou mais vetores compreendendo I. um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a (a) uma sequência guia capaz de hibridar com uma sequência alvo em uma célula eucariótica, e (b) pelo menos uma ou mais sequências companheiras tracr, II. um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de enzima codificando uma enzima CRISPR, e III. um terceiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência tracr, em que os componentes I, II e III estão localizados no mesmo ou em diferentes vetores do sistema, em que quando transcrita, a sequência tracr mate hibrida com a sequência tracr e a sequência guia dirige a sequência específica de ligação a um complexo CRISPR com a sequência alvo, e em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que é hibridada com a sequência alvo, e (2) a sequência tracr mate que é hibridada com a sequência tracr. Em algumas formas de realização, os componentes I, II e III estão localizados no mesmo vetor. Em outras formas de realização, os componentes I e II estão localizadas no mesmo vetor, enquanto o componente III está localizado em outro vetor. Em outras formas de realização, os componentes I e III estão localizadas no mesmo vetor, enquanto o componente II está localizado em outro vetor. Em outras formas de realização, os componentes II e III estão localizados no mesmo vetor, enquanto o componente I está localizado em outro vetor. Em outras formas de realização, cada um dos componentes I, II e III estão localizados em diferentes vetores. A invenção também fornece um sistema vetor viral (por exemplo AAV ou lentivírus) conforme aqui descrito, e pode ser parte de um sistema vetor conforme aqui descrito.

[0102] Alguns métodos da invenção podem incluir indução de expressão. Em alguns métodos da invenção, o organismo ou o indivíduo é um eucariota (incluindo mamífero incluindo humanos) ou um eucariota não humano ou um animal não humano ou um mamífero não humano. Em algumas formas de realização, o organismo ou indivíduo é um animal não humano, e pode ser um artrópode, por exemplo, um inseto, ou pode ser um nematódeo. Em alguns métodos da invenção o organismo ou indivíduo é uma planta. Em alguns métodos da invenção, o organismo ou indivíduo é um mamífero ou um mamífero não humano. Um mamífero não humano pode ser por exemplo um roedor (preferencialmente um camundongo ou uma rato), um ungulado, ou um primata. Em alguns métodos da invenção, o organismo ou indivíduo é alga, incluindo microalga, ou é um fungo. Em alguns métodos da invenção o vetor viral é um AAV ou um lentivírus, e pode ser parte de um sistema vetor conforme aqui descrito. Em alguns métodos da invenção a enzima CRISPR é uma Cas9. Em alguns métodos da invenção a expressão da sequência guia está sob o controle do promotor T7 e é conduzida pela expressão da polimerase T7.

[0103] A invenção em algumas formas de realização compreende um método para aplicar uma enzima CRISPR compreendendo a aplicação a um mRNA de célula codificando a enzima CRISPR. Em alguns desses métodos a enzima CRISPR é uma Cas9.

[0104] A invenção também fornece métodos para preparar os sistemas vetores da invenção, em particular os sistemas vetores virais conforme aqui descritos. A invenção em algumas formas de realização compreende um método para preparar AAV da invenção compreendendo plasmídeo(s) de transfecção contendo ou consistindo essencialmente de molécula de ácido(s) nucleico(s) codificando o AAV em células infetadas com AAV, e fornecendo AAV rep e/ou cap obrigatória para replicação e invólucro do AAV. Em algumas formas de realização o AAV rep e/ou cap obrigatório para replicação e invólucro do AAV são fornecidos por transfecção das células com o plasmídeo auxiliar(s) ou vírus auxiliar(es). Em algumas formas de realização o vírus auxiliar é um poxvírus, adenovírus, vírus do herpes ou baculo vírus. Em algumas formas de realização o poxvírus é um vírus de vacínia. Em algumas formas de realização as células são células de mamíferos. E em algumas formas de realização as células são células de inseto e o vírus auxiliar é brassinolídeo. Em outras formas de realização, o vírus é um lentivírus.

[0105] Em plantas, os patogênios são frequentemente específicos do hospedeiro. Por exemplo, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici causa murcha do tomate mas ataca somente tomate, e F. oxysporum f. dianthii Puccinia graminis f. sp. tritici ataca somente trigo. As plantas têm defesas existentes e induzidas para resistirem à maioria dos patogênios. Mutações e eventos de recombinação ao longo de gerações de plantas levam a variabilidade genética que origina suscetibilidade, especialmente pois os patogênios se reproduzem com mais frequência do que as plantas. Em plantas pode existir resistência não ao hospedeiro, p.ex., o hospedeiro e patogênio são incompatíveis. Pode existir também Resistência Horizontal, p.ex., resistência parcial contra todas as raças de um patogênio, tipicamente controlada por muitos genes e Resistência Vertical, p.ex., resistência completa a algumas raças de um patogênio mas não a outras raças, tipicamente controlada por alguns genes. Em um nível Gene-a-Gene, as plantas e os patogênios evoluem em conjunto, e as mudanças genéticas em um equilibram as mudanças no outro. Conformemente, usando Variabilidade Natural, os criadores combinam os genes mais úteis quanto ao Rendimento, Qualidade, Uniformidade, Robustez, Resistência. As fontes de genes de resistência incluem Variedades nativas ou estranhas, Variedades de Família, Familiares de Planta Selvagem, e Mutações Induzidas, p.ex., tratamento de material de planta com agentes mutagênicos. Usando a presente invenção, os criadores de plantas são providos com uma nova ferramenta para induzir mutações. Conformemente, um perito na técnica pode analisar o genoma de fontes de genes de resistência, e em Variedades tendo características ou traços desejados empregar a presente invenção para induzir o surgimento de genes de resistência, com mais precisão do que agentes mutagênicos prévios e consequentemente acelerar e melhorar programas de melhoramento de plantas.

[0106] A invenção compreende adicionalmente uma composição da invenção ou uma enzima CRISPR dessa (incluindo ou alternativamente codificando o mRNA da enzima CRISPR) para uso em medicina ou em terapia. Em algumas formas de realização a invenção compreende uma composição de acordo com a invenção ou uma enzima CRISPR dessa (incluindo ou alternativamente mRNA codificando a enzima CRISPR) para uso em um método de acordo com a invenção. Em algumas formas de realização a invenção fornece o uso de uma composição da invenção ou uma enzima CRISPR dessa (incluindo ou alternativamente mRNA codificando a enzima CRISPR) na edição de gene ou de genoma ex vivo. Em algumas formas de realização a invenção compreende o uso de uma composição da invenção ou uma enzima CRISPR dessa (incluindo ou alternativamente codificando mRNA da enzima CRISPR) no fabrico de um medicamento para a edição de gene ou de genoma ex vivo ou para uso em um método de acordo com a invenção. A invenção compreende em algumas formas de realização uma composição da invenção ou uma sua enzima CRISPR (incluindo ou alternativamente codificando o mRNA da enzima CRISPR), em que a sequência alvo é flanqueada na sua terminação 3’ com uma sequência PAM (motivo adjacente protoespaçador) compreendendo o motivo 5’, especialmente se a Cas9 é (ou deriva de) Cas9 de S. pyogenes ou S. aureus. Por exemplo, um PAM adequado é 5'-NRG ou 5'-NNGRR (se N é qualquer Nucleotídeo) para enzimas SpCas9 ou SaCas9 (ou enzimas derivadas), respectivamente, como mencionado a seguir.

[0107] Será tomado em consideração que SpCas9 ou SaCas9 são essas de ou derivadas de Cas9 de S. pyogenes ou S. aureus. Pode, obviamente, estar mutada ou de outro modo mudada em relação ao tipo selvagem para se adequar ao uso pretendido, como descrito aqui. O mutante ou variante D10A de nickase dual é preferencial, especialmente em combinação com duas guias sobrepostas como locais opostos em fitas diferentes do mesmo cromossomo.

[0108] Aspectos da invenção compreendem a melhoria da especificidade de uma enzima CRISPR, por exemplo a Cas9, direcionamento de genes mediados e reduzindo a probabilidade de modificação fora do alvo pela enzima CRISPR, por exemplo Cas9. A invenção em algumas formas de realização compreende um método de modificação de um organismo ou um organismo não humano minimizando a modificação fora do alvo por manipulação da primeira e segunda sequência alvo em cadeias opostas de um duplex de DNA em um local genômico de interesse em uma célula compreendendo a aplicação de uma composição de ocorrência não natural ou manipulada que pode compreender:

[0109] I. uma primeira sequência de polinucleotídeos de RNA quimérico (chiRNA) do sistema CRISPR-Cas, em que a primeira sequência de polinucleotídeos compreende: (a) uma primeira sequência guia capaz de hibridar com a primeira sequência alvo, (b) uma primeira sequência tracr mate, e (c) uma primeira sequência tracr,

[0110] II. uma segunda sequência de polinucleotídeos de chiRNA do sistema CRISPR-Cas, em que a segunda sequência de polinucleotídeos pode compreender: (a) uma segunda sequência guia capaz de hibridar com a segunda sequência alvo, (b) uma segunda sequência tracr mate, e (c) uma segunda sequência tracr, e

[0111] III. uma sequência de polinucleotídeos codificando uma enzima CRISPR que pode compreender pelo menos uma ou mais sequências de localização nuclear e compreendendo uma ou mais mutações, em que (a), (b) e (c) são arranjadas em uma orientação 5’ para 3’, em que quando transcrita, a primeira e a segunda sequências companheiras tracr hibridam com a primeira e a segunda sequência tracr respectivamente e a primeira e a segunda sequência guia dirigem a ligação específica de sequência de um primeiro e um segundo complexo CRISPR a uma primeira e segunda sequências alvo respectivamente, em que o primeiro complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com (1) a primeira sequência guia que é hibridada com a primeira sequência alvo, e (2) a primeira sequência tracr mate que é hibridada com a primeira sequência tracr, em que o segundo complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com (1) a segunda sequência guia que é hibridada com a segunda sequência alvo, e (2) a segunda sequência tracr mate que é hibridada com a segunda sequência tracr, em que a sequência de polinucleotídeos codificando uma enzima CRISPR é DNA ou RNA, e em que a primeira sequência guia direciona a clivagem da cadeia feita do Duplex de DNA perto da primeira sequência alvo e a segunda sequência guia direciona a clivagem da outra cadeia perto da segunda sequência alvo induzindo uma quebra da cadeia dupla, desse modo modificando o organismo ou o organismo não humano minimizando as modificações fora do alvo.

[0112] Em alguns métodos da invenção qualquer ou todas as sequências de polinucleotídeos codificando a enzima CRISPR, a primeira e a segunda sequência guia, a primeira e a segunda sequência tracr mate ou a primeira e a segunda sequência tracr, é/são RNA. Em formas de realização adicionais da invenção os polinucleotídeos codificando a sequência codificando a enzima CRISPR, a primeira e a segunda sequência guia, a primeira e a segunda sequência tracr mate ou a primeira e a segunda sequência tracr, é/são RNA e são distribuídas via lipossomos, nanopartículas, exossomos, microvesículas, ou uma biolística. Em certas formas de realização da invenção, a primeira e a segunda sequência tracr mate partilham 100% de identidade e/ou a primeira e a segunda sequência tracr partilham 100% de identidade. Em algumas formas de realização, os polinucleotídeos podem ser compreendidos dentro de um sistema vetor compreendendo um ou mais vetores. Em formas de realização preferenciais da invenção a enzima CRISPR é uma enzima Cas9, por exemplo SpCas9. Em um aspecto da invenção a enzima CRISPR compreende uma ou mais mutações em um domínio catalítico, em que a uma ou mais mutações são selecionadas partindo do grupo consistindo em D10A, E762A, H840A, N854A, N863A e D986A. Em uma forma de realização altamente preferencial a enzima CRISPR tem a mutação D10A. Em formas de realização preferenciais, a primeira enzima CRISPR tem uma ou mais mutações de tal modo que a enzima é uma enzima de corte de cadeia complementar, e a segunda enzima CRISPR tem uma ou mais mutações de tal modo que a enzima é uma enzima de corte de cadeia não complementar. De modo alternativo a primeira enzima pode ser uma enzima de corte de cadeia não complementar, e a segunda enzima pode ser uma enzima de corte de cadeia complementar.

[0113] Em métodos preferenciais da invenção a primeira sequência guia dirigir a clivagem feita na cadeia do duplex de DNA perto a primeira sequência alvo e a segunda sequência guia dirigem a clivagem da outra cadeia perto da segunda sequência alvo resulta em uma saliência 5’. Em formas de realização da invenção a saliência 5’ é, no máximo, 200 pares de bases, preferencialmente, no máximo, 100 pares de bases, ou mais preferencialmente no máximo, 50 pares de bases. Em formas de realização da invenção a saliência 5’ é, no máximo, 26 pares de bases, preferencialmente no máximo, 30 pares de bases, ou mais preferencialmente no máximo, 34-50 pares de bases. O mais preferencialmente, a sobreposição é entre 5 e - 1 pares de bases.

[0114] A invenção em algumas formas de realização compreende um método de modificação de um organismo ou um organismo não humano minimizando as modificações fora do alvo por manipulação da primeira e segunda sequência alvo em cadeias opostas de um duplex de DNA em um local genômico de interesse em uma célula compreendendo a aplicação de uma composição de ocorrência não natural ou manipulada compreendendo um sistema vetor compreendendo um ou mais vetores compreendendo

[0115] I. um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a (a) uma primeira sequência guia capaz de hibridar com a primeira sequência alvo, e (b) pelo menos uma ou mais sequências companheiras tracr,

[0116] II. um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a (a) uma segunda sequência guia capaz de hibridar com a segunda sequência alvo, e (b) pelo menos uma ou mais sequências companheiras tracr,

[0117] III. um terceiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação da enzima codificando a enzima CRISPR, e

[0118] IV. um quarto elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência tracr,

[0119] em que os componentes I, II, III e IV estão localizados no mesmo ou em diferentes vetores do sistema, quando transcrita, a sequência tracr mate hibrida com a sequência tracr e a primeira e a segunda sequência guia dirige a ligação específica a sequência de um primeiro e um segundo complexo CRISPR a uma primeira e segunda sequências alvo respectivamente, em que o primeiro complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com (1) a primeira sequência guia que é hibridada com a primeira sequência alvo, e (2) a sequência tracr mate que é hibridada com a sequência tracr, em que o segundo complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com (1) a segunda sequência guia que é hibridada com a segunda sequência alvo, e (2) a sequência tracr mate que é hibridada com a sequência tracr, em que a sequência de polinucleotídeos codificando uma enzima CRISPR é DNA ou RNA, e em que a primeira sequência guia direciona a clivagem da cadeia do duplex de DNA perto da primeira sequência alvo e a segunda sequência guia direciona a clivagem da outra cadeia perto da segunda sequência alvo induzindo uma quebra da cadeia dupla, desse modo modificando o organismo ou o organismo não humano minimizando as modificações fora do alvo.

[0120] A invenção também fornece um sistema vetor conforme aqui descrito. O sistema pode compreender um, dois, três ou quatro vetores diferentes. Os componentes I, II, III e IV podem assim estar localizados em um, dois, três ou quatro vetores diferentes, e todas as combinações de possíveis localizações dos componentes são aqui previstas, por exemplo: os componentes I, II, III e IV podem estar localizadas no mesmo vetor; os componentes I, II, III e IV cada podem estar localizados em diferentes vetores; os componentes I, II, III e IV podem estar localizados em um total de dois ou três vetores diferentes, com todas as combinações de localizações visadas, etc.

[0121] Em alguns métodos da invenção qualquer ou todas as sequências de polinucleotídeos codificando a enzima CRISPR, a primeira e a segunda sequência guia, a primeira e a segunda sequência tracr mate ou a primeira e a segunda sequência tracr, é/são RNA. Em certas formas de realização da invenção, a primeira e a segunda sequências companheiras tracr partilham 100% de identidade e/ou a primeira e a segunda sequências tracr partilham 100% de identidade. Em formas de realização preferenciais da invenção a enzima CRISPR é uma enzima Cas9, por exemplo SpCas9. Em um aspecto da invenção a enzima CRISPR compreende uma ou mais mutações em um domínio catalítico, em que a uma ou mais mutações são selecionadas partindo do grupo consistindo em D10A, E762A, H840A, N854A, N863A e D986A. Em uma forma de realização altamente preferencial a enzima CRISPR tem a mutação D10A. Em formas de realização preferenciais, a primeira enzima CRISPR tem uma ou mais mutações de tal modo que a enzima é uma enzima de corte de cadeia complementar, e a segunda enzima CRISPR tem uma ou mais mutações de tal modo que a enzima é uma enzima de corte de cadeia não complementar. De modo alternativo a primeira enzima pode ser uma enzima de corte de cadeia não complementar, e a segunda enzima pode ser uma enzima de corte de cadeia complementar. Em uma forma de realização da invenção, um ou mais dos vetores virais são aplicados via lipossomos, nanopartículas, exossomos, microvesículas, ou uma biolística.

[0122] Em métodos preferenciais da invenção a primeira sequência guia dirige a clivagem de uma cadeia do duplex de DNA perto a primeira sequência alvo e a segunda sequência guia dirige a clivagem da outra cadeia perto da segunda sequência alvo resulta em uma saliência 5’. Em formas de realização da invenção a saliência 5’ é, no máximo, 200 pares de bases, preferencialmente no máximo, 100 pares de bases, ou mais preferencialmente no máximo, 50 pares de bases. Em formas de realização da invenção a saliência 5’ é, no máximo, 26 pares de bases, preferencialmente no máximo, 30 pares de bases, ou mais preferencialmente no máximo, 34-50 pares de bases.

[0123] A invenção em algumas formas de realização compreende um método de modificação de um local genômico de interesse minimizando as modificações fora do alvo por introdução na célula contendo e expressando uma molécula de DNA de cadeia dupla codificando um produto de gene de interesse modificado, sistema CRISPR-Cas não ocorrendo naturalmente compreendendo uma proteína Cas tendo uma ou mais mutações e dois RNAs guia que visam uma primeira cadeia e uma segunda cadeia da molécula de DNA respectivamente, em que os RNAs guia visam a molécula de DNA codificando o produto de gene e os entalhes da proteína Cas cada de uma primeira cadeia e a segunda cadeia da molécula de DNA codificando o produto de gene, em que a expressão do produto de gene é alterada; e, em que a proteína Cas e os dois RNAs guia não ocorrem naturalmente em conjunto.

[0124] Em métodos preferenciais da invenção a proteína Cas corta cada de uma primeira cadeia e a segunda cadeia da molécula de DNA codificando o produto de gene resulta em uma saliência 5’. Em formas de realização da invenção a saliência 5’ é, no máximo, 200 pares de bases, preferencialmente no máximo, 100 pares de bases, ou mais preferencialmente no máximo, 50 pares de bases. Em formas de realização da invenção a saliência 5’ é, no máximo, 26 pares de bases, preferencialmente no máximo, 30 pares de bases, ou mais preferencialmente no máximo, 34-50 pares de bases.

[0125] Formas de realização da invenção compreendem também os RNAs guia compreendendo uma sequência guia fundida a uma sequência tracr mate e uma sequência tracr Em um aspecto da invenção a proteína Cas é otimizada em códon para expressão em uma célula eucariótica, preferencialmente uma célula de mamífero ou uma célula humana. Em formas de realização adicionais da invenção a proteína Cas é uma proteína CRISPR- Cas tipo II, por exemplo uma proteína Cas 9. Em uma forma de realização altamente preferencial a proteína Cas é uma proteína Cas9, por exemplo SpCas9. Em um aspecto da invenção a proteína Cas tem uma ou mais mutações selecionadas partindo do grupo consistindo em D10A, E762A, H840A, N854A, N863A e D986A. Em uma forma de realização altamente preferencial a proteína Cas tem a mutação D10A.

[0126] Aspectos da invenção referem-se à expressão do produto de gene que é diminuído ou um polinucleotídeo modelo que é adicionalmente introduzido na molécula de DNA codificando o produto de gene ou uma sequência interveniente a ser excisada com precisão permitindo que as duas saliências 5 ‘ se voltem a hibridar e ligar ou a atividade ou função do produto de gene sendo alterado ou a expressão do produto de gene sendo aumentado. Em uma forma de realização da invenção, o produto de gene é uma proteína.

[0127] A invenção compreende também um sistema CRISPR- Cas, manipulado, não ocorrendo naturalmente compreendendo a proteína Cas tendo uma ou mais mutações e dois RNAs guia que visam uma primeira cadeia e uma segunda cadeia respectivamente de uma molécula de DNA de cadeia dupla codificando um produto de gene em uma célula, em que os RNAs guia visam a molécula de DNA codificando o produto de gene e os entalhes da proteína Cas de uma primeira cadeia e a segunda cadeia da molécula de DNA codificando o produto de gene, em que a expressão do produto de gene é alterada; e, em que a proteína Cas e os dois RNAs guia não ocorrem naturalmente em conjunto.

[0128] Em aspectos da invenção os RNAs guia podem compreender uma sequência guia fundida a uma sequência tracr mate e uma sequência tracr. Em uma forma de realização da invenção a proteína Cas é uma proteína CRISPR-Cas tipo II. Em um aspecto da invenção a proteína Cas é otimizada em códon para expressão em uma célula eucariótica, preferencialmente uma célula de mamífero ou uma célula humana. Em formas de realização adicionais da invenção a proteína Cas é uma proteína CRISPR-Cas tipo II, por exemplo uma proteína Cas 9. Em uma forma de realização altamente preferencial a proteína Cas é uma proteína Cas9, por exemplo SpCas9. Em um aspecto da invenção a proteína Cas tem uma ou mais mutações selecionadas partindo do grupo consistindo em D10A, E762A, H840A, N854A, N863A e D986A. Em uma forma de realização altamente preferencial a proteína Cas tem a mutação D10A.

[0129] Aspectos da invenção referem-se à expressão do produto de gene que é diminuída ou um polinucleotídeo modelo que é adicionalmente introduzido na molécula de DNA codificando o produto de gene ou uma sequência interveniente a ser excisada com precisão permitindo que as duas saliências 5 ‘ se realinharem e liguem ou a atividade ou função do produto de gene serem alterados ou a expressão do produto de gene ser aumentada. Em uma forma de realização da invenção, o produto de gene é uma proteína.

[0130] A invenção também compreende um sistema vetor, manipulado, não ocorrendo naturalmente compreendendo um ou mais vetores compreendendo: (a) um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a cada um dos dois RNAs guia do sistema CRISPR-Cas visando uma primeira cadeia e uma segunda cadeia respectivamente de uma molécula de DNA de cadeia dupla codificando um produto de gene, (b) um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma proteína Cas, em que os componentes (a) e (b) estão localizados no mesmo ou em diferentes vetores do sistema, em que os RNAs guia visam a molécula de DNA codificando o produto de gene e a proteína Cas corta cada primeira cadeia e segunda cadeia da molécula de DNA codificando o produto de gene, em que a expressão do produto de gene é alterada; e, em que a proteína Cas e os dois RNAs guia não ocorrem naturalmente em conjunto.

[0131] Em aspectos da invenção os RNAs guia podem compreender uma sequência guia fundida a uma sequência tracr mate e uma sequência tracr. Em uma forma de realização da invenção a proteína Cas é uma proteína CRISPR-Cas tipo II. Em um aspecto da invenção a proteína Cas é otimizada em códon para expressão em uma célula eucariótica, preferencialmente uma célula de mamífero ou uma célula humana. Em formas de realização adicionais da invenção a proteína Cas é uma proteína CRISPR-Cas tipo II, por exemplo uma proteína Cas 9. Em uma forma de realização altamente preferencial a proteína Cas é uma proteína Cas9, por exemplo SpCas9. Em um aspecto da invenção a proteína Cas tem uma ou mais mutações selecionadas partindo do grupo consistindo em D10A, E762A, H840A, N854A, N863A e D986A. Em uma forma de realização altamente preferencial a proteína Cas tem a mutação D10A.

[0132] Aspectos da invenção referem-se à expressão do produto de gene que é diminuído ou um polinucleotídeo modelo sendo adicionalmente introduzido na molécula de DNA codificando o produto de gene ou uma sequência interveniente a ser excisada com precisão permitindo que as duas saliências 5‘ se voltem a hibridar e ligar ou a atividade ou função do produto de gene sendo alterado ou a expressão do produto de gene sendo aumentado. Em uma forma de realização da invenção, o produto de gene é uma proteína. Em formas de realização preferenciais da invenção os vetores do sistema são vetores virais. Em uma forma de realização, os vetores do sistema são aplicados via lipossomos, nanopartículas, exossomos, microvesículas, ou uma biolística.

[0133] Em um aspecto, a invenção fornece um método de modificar um polinucleotídeo alvo em uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, o método compreende a permissão de um complexo CRISPR se ligar ao polinucleotídeo alvo para efetuar a clivagem do referido polinucleotídeo alvo modificando assim o polinucleotídeo alvo, em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com uma sequência guia hibridada a uma sequência alvo dentro do referido polinucleotídeo alvo, em que a referida sequência guia é ligada a uma sequência tracr mate a qual por sua vez hibrida com uma sequência tracr. Em algumas formas de realização, a referida clivagem compreende a clivagem de uma ou duas cadeias no local da sequência alvo pela referida enzima CRISPR. Em algumas formas de realização, a referida clivagem resulta na diminuição da transcrição de um gene alvo. Em algumas formas de realização, o método compreende adicionalmente reparar o referido polinucleotídeo alvo clivado por recombinação homóloga com um modelo de polinucleotídeo exógeno, em que a referida reparação resulta em uma mutação compreendendo uma inserção, deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos do referido polinucleotídeo alvo. Em algumas formas de realização, a referida mutação resulta em uma ou mais alterações de aminoácidos em uma proteína expressada partindo de um gene compreendendo a sequência alvo. Em algumas formas de realização, o método compreende adicionalmente aplicar um ou mais vetores da referida célula eucariótica, em que o um ou mais vetores dirigem a expressão de um ou mais de: a enzima CRISPR, a sequência guia ligada a uma sequência tracr mate, e a sequência tracr. Em algumas formas de realização, os referidos vetores são aplicados à célula eucariótica em um indivíduo. Em algumas formas de realização, a referida modificação ocorre na referida célula eucariótica em uma cultura de células. Em algumas formas de realização, o método compreende adicionalmente isolar a referida célula eucariótica a partir de um indivíduo antes da referida modificação. Em algumas formas de realização, o método compreende adicionalmente retornar a referida célula eucariótica e/ou as células daí derivadas ao referido indivíduo.

[0134] Em um aspecto, a invenção fornece um método para modificar um polinucleotídeo em uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, o método compreende a permissão de um complexo CRISPR se ligar ao polinucleotídeo de modo a que a referida ligação resulte no aumento ou diminuição da expressão do referido polinucleotídeo em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com uma sequência guia hibridada a uma sequência alvo dentro do referido polinucleotídeo, em que a referida sequência guia é ligada a uma sequência tracr mate a qual por sua vez hibrida com uma sequência tracr. Em algumas formas de realização, o método compreende adicionalmente aplicar um ou mais vetores das referidas células eucarióticas, em que o um ou mais vetores dirigem a expressão de uma ou mais de: a enzima CRISPR, a sequência guia ligada a uma sequência tracr mate, e a sequência tracr.

[0135] Em um aspecto, a invenção fornece um método de gerar um modelo de célula eucariótica compreendendo um gene de doença modificado. Em algumas formas de realização, um gene de doença é qualquer gene associado com um aumento do risco de ter ou desenvolver uma doença. Em algumas formas de realização, o método compreende (a) introduzir um ou mais vetores em uma célula eucariótica, em que o um ou mais vetores dirigem a expressão de um ou mais de: uma enzima CRISPR, uma sequência guia ligada a uma sequência tracr mate, e uma sequência tracr; e (b) permitindo a um complexo CRISPR ligar- se a um polinucleotídeo alvo para efetuar a clivagem do polinucleotídeo alvo dentro do referido gene de doença, em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que é hibridada com a sequência alvo no polinucleotídeo alvo, e (2) a sequência tracr mate que é hibridada com a sequência tracr, gerando desse modo um modelo de célula eucariótica compreendendo um gene de doença modificado. Em algumas formas de realização, a referida clivagem compreende a clivagem de uma ou duas cadeias no local da sequência alvo pela referida enzima CRISPR. Em algumas formas de realização, a referida clivagem resulta na diminuição da transcrição de um gene alvo. Em algumas formas de realização, o método compreende adicionalmente reparar o referido polinucleotídeo alvo clivado por recombinação homóloga com um modelo de polinucleotídeo exógeno, em que a referida reparação resulta em uma mutação compreendendo uma inserção, deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos do referido polinucleotídeo alvo. Em algumas formas de realização, a referida mutação resulta em uma ou mais alterações de aminoácidos em uma expressão de proteína partindo de um gene compreendendo a sequência alvo.

[0136] Em um aspecto a invenção fornece um método para selecionar uma ou mais célula(s) procariótica(s) por introdução de uma ou mais mutações em um gene na uma ou mais célula(s) procariótica(s), o método compreendendo: introduzir um ou mais vetores na célula(s) procariótica(s), em que o um ou mais vetores dirigem a expressão de um ou mais de: uma enzima CRISPR, uma sequência guia ligada a uma sequência tracr mate, uma sequência tracr, e um modelo de edição; em que o modelo de edição compreende a uma ou mais mutações que anulam a clivagem da enzima CRISPR; permitindo a recombinação homóloga do modelo de edição com o polinucleotídeo alvo na(s) célula(s) a serem selecionadas; permitindo a um complexo CRISPR ligar-se a um polinucleotídeo alvo para efetuar a clivagem do polinucleotídeo alvo dentro do referido gene, em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que é hibridada com a sequência alvo no polinucleotídeo alvo, e (2) a sequência tracr mate que é hibridada com a sequência tracr, em que a ligação do complexo CRISPR ao polinucleotídeo alvo induz a morte celular, permitindo assim uma ou mais célula(s) procariótica(s) nas quais uma ou mais mutações tenham sido introduzidas ser selecionadas. Em uma forma de realização preferencial, a enzima CRISPR é Cas9. Em outro aspecto da invenção, a célula a ser selecionada pode ser uma célula eucariótica, tal como uma célula eucariótica pós-mitótica. Aspectos da invenção permitem a seleção de células específicas sem a necessidade de um marcador de seleção ou um processo de dois passos que pode incluir um sistema de contrasseleção.

[0137] Em um aspecto, a invenção fornece métodos de modificação de um polinucleotídeo alvo em uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, o método compreende a permissão de um complexo CRISPR se ligar ao polinucleotídeo alvo para efetuar a clivagem do referido polinucleotídeo alvo modificando assim o polinucleotídeo alvo, em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com uma sequência guia hibridada a uma sequência alvo dentro do referido polinucleotídeo alvo, em que a referida sequência guia é ligada a uma sequência tracr mate a qual por sua vez hibrida com uma sequência tracr.

[0138] Em outras formas de realização, a invenção fornece um método de modificação da expressão de um polinucleotídeo em uma célula eucariótica. O método compreende aumentar ou diminuir a expressão de um polinucleotídeo alvo usando um complexo CRISPR que se liga ao polinucleotídeo.

[0139] Onde desejado, para efetuar a modificação da expressão em uma célula, um ou mais vetores compreendendo uma sequência tracr, uma sequência guia ligada a uma sequência tracr mate, uma sequência codificando uma enzima CRISPR são aplicados a uma célula. Em alguns métodos, o um ou mais vetores compreendem um elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de enzima codificando a referida enzima CRISPR compreendendo uma sequência de localização nuclear; e um elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência tracr mate e um ou mais sítios de inserção para inserir uma sequência guia a montante da sequência tracr mate Quando expressa, a sequência guia dirige a sequência específica de ligação de um complexo CRISPR a uma sequência alvo em uma célula. Tipicamente o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que é hibridada à sequência alvo, e (2) a sequência tracr mate que é hibridada com a sequência tracr.

[0140] Em alguns métodos, um polinucleotídeo alvo pode ser inativado para efetuar uma modificação da expressão em uma célula. Por exemplo, após a ligação de um complexo CRISPR a uma sequência alvo em uma célula, o polinucleotídeo alvo é inativado de modo que a sequência não é transcrita, a proteína codificada não é produzida, ou a sequência não funciona como o faz a sequência tipo selvagem. Por exemplo, uma proteína ou sequência de codificação de microRNA pode ser inativada de tal modo que a proteína não é produzida.

[0141] Em certas formas de realização, a enzima CRISPR compreende uma ou mais mutações selecionadas partindo do grupo consistindo em D10A, E762A, H840A, N854A, N863A ou D986A e/ou a uma ou mais mutações é em um domínio RuvC1 ou HNH da enzima CRISPR ou é uma mutação tal como aqui discutido. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR tem uma ou mais mutações em um domínio catalítico, em que quando transcrita, a sequência tracr mate hibrida com a sequência tracr e a sequência guia dirige a sequência específica de ligação a um complexo CRISPR com a sequência alvo, e em que a enzima compreende adicionalmente um domínio funcional. Em algumas formas de realização, o domínio funcional é um domínio de ativação transcricional, preferencialmente VP64. Em algumas formas de realização, o domínio funcional é um domínio de repressão da transcrição, preferencialmente KRAB. Em algumas formas de realização, o domínio de repressão de transcrição é SID, ou concatâmeros de SID (por exemplo SID4X). Em algumas formas de realização, o domínio funcional é um domínio de modificação epigenética, de tal modo que é fornecida uma enzima modificadora epigenética. Em algumas formas de realização, o domínio funcional é um domínio de ativação, o qual pode ser o domínio de ativação P65.

[0142] Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é uma enzima CRISPR tipo I ou III, mas preferencialmente uma enzima CRISPR tipo II. Esta enzima CRISPR tipo II pode ser qualquer enzima CRISPR. Uma enzima Cas pode ser identificada como Cas9 dado que esta pode referir-se à classe geral de enzimas partilhando homologia com a maior das nucleases com os domínios de múltiplas nucleases a partir do sistema CRISPR de tipo II. O mais preferencialmente, a enzima Cas9 é de, ou é derivada de, spCas9 ou saCas9. Por derivada, os Requerentes entendem que a enzima derivada baseia-se em grande parte, no sentido de ter um elevado grau de homologia de sequência com, uma enzima de tipo selvagem, mas que foi modificada (modificada), de alguma forma conforme aqui descrito.

[0143] Será tomado em consideração que os termos Enzima Cas e CRISPR são aqui geralmente utilizados intermutavelmente, a não ser que seja evidente de outra forma. Como mencionado acima, muitas das numerações de resíduos aqui utilizadas se referem a enzima Cas9 tipo II do local de CRISPR em Streptococcus pyogenes. Porém, tem que se ter em consideração que a presente invenção inclui muitas mais Cas9s a partir de outras espécies de micróbios tais como SpCas9, SaCas9, St1Cas9 e assim sucessivamente.

[0144] Um exemplo de uma sequência otimizada para códon, neste caso otimizada para humanos (isto é sendo otimizada para expressão em humanos) é aqui provido, ver a sequência otimizada para códon SaCas9 humana. Embora isto seja preferencial, faz-se notar que são possíveis outros exemplos e é conhecida a otimização de códon para uma espécie hospedeira.

[0145] Preferencialmente, o vetor é na forma de um vetor viral o qual pode ser um vetor viral, tal como um lenti ou báculo ou preferencialmente vetores virais adenovirais/adeno associados, mas são conhecidos outros meios de aplicação (tais como sistemas de levedura, microvesículas, biolística/meios de anexação de vetores a nanopartículas de ouro) e são fornecidos. Um vetor pode significar não somente um sistema de vírus ou levedura (por exemplo, onde os ácidos nucleicos de interesse podem ser operacionalmente ligados a e sob o controle de (em termos de expressão, tal como em última análise proporcionar um RNA processado) um promotor), mas também o fornecimento direto de ácidos nucleicos dentro de uma célula hospedeira. Enquanto em métodos da presente invenção o vetor pode ser um vetor viral e este é vantajosamente um AAV, outros vetores virais como aqui discutido podem ser empregues, tais como lentivírus. Por exemplo, pode ser usado baculovírus para expressão em células de insetos. Estas células de inseto podem, por sua vez ser úteis para produzir grandes quantidades de outros vetores, tais como vetores de AAV ou lentivírus adaptados para aplicação da presente invenção. Também visado é um método de aplicação da presente enzima CRISPR compreendendo a aplicação a um mRNA de célula codificando a enzima CRISPR. Será tomado em consideração que em certas formas de realização a enzima CRISPR seja truncada, e/ou compreendida em menos de mil aminoácidos ou menos de quatro mil aminoácidos, e/ou é uma nuclease ou nickase, e/ou é códon-otimizada, e/ou compreende uma ou mais mutações, e/ou compreende uma enzima CRISPR quimérica, e/ou e outras opções como aqui discutidas. Vetores de AAV e lentivirais são preferenciais.

[0146] Em certas formas de realização, a sequência alvo é flanqueada ou seguida, na sua extremidade 3’, por um PAM adequado para a enzima CRISPR, tipicamente uma Cas e em particular uma Cas9.

[0147] Por exemplo, um PAM adequado é 5'-NRG ou 5'- NNGRR para enzimas SpCas9 ou SaCas9 (ou enzimas derivadas), respectivamente.

[0148] Será tomado em consideração que SpCas9 ou SaCas9 são essas de ou derivadas de Cas9 de S. pyogenes ou S. aureus.

[0149] Em conformidade, é um objeto da invenção para não englobar na invenção qualquer produto anteriormente conhecido, processo de fabrico do produto, ou método de uso do produto de modo a que os Requerentes reservem o direito e informamos a isenção de responsabilidade de qualquer produto, processo, ou método anteriormente conhecido. É ainda notado que a invenção não pretende englobar no escopo da invenção qualquer produto, processo, ou fabrico do produto ou método de uso do produto, que não satisfaça a descrição escrita e requisitos de capacitação do USPTO (35 U.S.C. §112, primeiro parágrafo) ou o EPO (Artigo 83 do EPC), de modo que os Requerentes reservam o direito e aqui informam da isenção de responsabilidade em qualquer produto anteriormente descrito, processo de fabrico do produto, ou método de uso do produto.

[0150] Note-se que nesta descrição e particularmente nas reivindicações e/ou parágrafos, termos tais como “compreende”, “compreendido”, “compreendendo” e semelhantes podem ter o significado que lhes é atribuído na lei da Patente U.S.; por exemplo, podem significar “inclui”, “incluído”, “incluindo”, e semelhantes; e que termos como “consistindo essencialmente de” e “consiste essencialmente de” têm o significado que lhes é atribuído na lei da Patente U.S., por exemplo, permitem que elementos não explicitamente citados, mas excluem elementos que são encontrados no estado da arte ou que afetam uma característica básica ou nova da invenção.

[0151] Estas e outras formas de realização são divulgadas ou são óbvias e abrangidas pela, seguinte Descrição Pormenorizada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0152] As características novas da invenção são apresentadas especificadamente nas reivindicações anexas. Uma melhor compreensão das características e vantagens da presente invenção será obtida com a referência à seguinte descrição pormenorizada que estabelece formas de realização ilustrativas, nas quais os princípios da invenção são utilizados, e os desenhos que a acompanham dos quais:

[0153] A Figura 1 mostra um modelo esquemático do sistema CRISPR. A nuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes (amarelo) visa o DNA genômico através de um RNA guia sintético (sgRNA) consistindo de uma sequência guia 20 nt (azul) e uma plataforma (vermelho). Os pares de base da sequência guia com o DNA alvo (azul), diretamente a montante de um motivo protoespaçador 5’-NGG adjacente necessário (PAM; magenta), e A Cas9 medeia uma quebra de cadeia dupla (DSB) ~3 pb a montante do PAM (triangulo vermelho).

[0154] A Figura 2A-F mostra um sistema CRISPR exemplificativo, um possível mecanismo de ação, um exemplo de adaptação para expressão em células eucarióticas, e os resultados de testes de avaliação de localização nuclear e atividade CRISPR.

[0155] A Figura 3A-D mostra os resultados de uma avaliação de especificidade de SpCas9 para um alvo de exemplo.

[0156] A Figura 4A-G mostra um sistema vetor exemplificativo e resultados para o seu uso para dirigir a recombinação homóloga em células eucarióticas.

[0157] A Figura 5 fornece uma tabela de sequências protoespaçadoras e resume os resultados da eficiência de modificação para alvos protoespaçadores desenhados com base nos sistemas CRISPR de S. pyogenes e S. thermophilus exemplares com os correspondentes PAMs contra locais nos genomas humanos e de camundongo. As células foram transfectadas com Cas9 e ou pré-crRNA/tracrRNA ou RNA quimérico, e analisadas 72 horas após transfecção. As indels em percentagem são calculadas com base nos resultados do ensaio de Surveyor das linhas celulares indicadas (N=3 para todos os alvos protoespaçadores, os erros são S.E.M., N.D. indicam não detectável usando o ensaio Surveyor, e N.T. indica não testado neste estudo).

[0158] A Figura 6A-C mostra uma comparação de diferentes transcritos tracrRNA para direcionamento de genes mediado por Cas9.

[0159] A Figura 7 mostra um esquema de um ensaio de nuclease de Surveyor para detecção de microinserções e deleções induzidas por quebra da cadeia dupla.

[0160] A Figura 8A-B mostra vetores de expressão bicistrônicos exemplificativos para expressão de elementos do sistema CRISPR em células eucarióticas.

[0161] A Figura 9A-C mostra histogramas de distância entre o local 1 PAM SF370 de S. pyogenes adjacente (NGG) (Figura 9A) e o local 2 PAM LMD9 de S. thermophilus (NNAGAAW) (Figura 9B) em um genoma humano; e distâncias de cada PAM por cromossomo (Chr) (Figura 9C).

[0162] A Figura 2A-F mostra um sistema CRISPR exemplificativo, um exemplo de adaptação para expressão em células eucarióticas, e os resultados de testes de avaliação de localização da atividade CRISPR.

[0163] A Figura 11A-C mostra manipulações de um sistema CRISPR exemplificativas para visar os locais genômicos em células de mamífero.

[0164] A Figura 12A-B mostra os resultados de uma análise de transferência de Northern do processamento crRNA em células de mamífero.

[0165] A Figura 13A-B mostra uma seleção de protoespaçadores exemplificativos nos locais de PVALB humano e Th de camundongo.

[0166] A Figura 14 mostra o protoespaçador exemplo e correspondentes alvos de sequência PAM do sistema CRISPR de S. thermophilus em um local EMX1 humano.

[0167] A Figura 15 fornece uma tabela de sequências para iniciadores e sondas usados para ensaios Surveyor, RFLP, sequenciação genômica, e transferência de Northern.

[0168] A Figura 16A-C mostra manipulação de um sistema CRISPR exemplificativa com RNAs quiméricos e resultados de ensaios SURVEYOR para a atividade do sistema em células eucarióticas.

[0169] A Figura 17A-B mostra uma representação gráfica dos resultados de ensaios SURVEYOR para atividade do sistema CRISPR em células eucarióticas.

[0170] A Figura 18 mostra uma visualização exemplificativa de alguns sítios alvo Cas9 de S. pyogenes em um genoma humano usando o navegador de genoma UCSC.

[0171] A Figura 19A-D mostra uma representação circular da análise filogenética revelando cinco famílias de Cas9s, incluindo três grupos de Cas9s grandes (~1400 aminoácidos) e duas de Cas9s pequenas (~1100 aminoácidos).

[0172] A Figura 20A-F mostra uma representação linear da análise filogenética revelando cinco famílias de Cas9s, incluindo três grupos de Cas9s grandes (~1400 aminoácidos) e duas de Cas9s pequenas (~1100 aminoácidos).

[0173] A Figura 21A-D mostra a edição de genoma via recombinação homóloga. (a) Esquema de nickase SpCas9, com mutação D10A no domínio catalítico RuvC I. (b) Representação esquemática da recombinação homóloga (HR) no local EMX1 humano usando ou oligonucleotídeos de cadeia simples senso ou antissenso como modelos de reparação. A seta vermelha acima indica o sítio de clivagem sgRNA; iniciadores PCR para genotipagem (Tabelas J e K) são indicados como setas no painel da direita. (c) Sequência da região modificada por ensaio de HR. d, SURVEYOR para indels mediadas por SpCas9 tipo selvagem (p) e nickase (D10A) no local alvo EMX1 (n=3). As setas indicam as posições de tamanhos de fragmentos esperados.

[0174] A Figura 22A-B mostra vetores únicos desenhados para SpCas9.

[0175] A Figura 23 mostra um gráfico representando a aplicação de comprimento de Cas9 ortólogos.

[0176] A Figura 24A-M mostra sequências onde os pontos de mutação são localizados dentro do gene SpCas9.

[0177] A Figura 25A mostra o mapa vetor de direcionamento Rosa26, Cas9 Condicional.

[0178] A Figura 25B mostra o, mapa vetor de direcionamento Rosa26, Cas9 Constitutiva.

[0179] A Figura 26 mostra um esquema dos elementos importantes nas construções Cas9 Condicional e Constitutiva.

[0180] A Figura 27 mostra dados de aplicação e expressão in vivo de Cas9 de cérebro de camundongo.

[0181] A Figura 28 mostra aplicação RNA de Cas9 e RNA quimérico em células (A) aplicação de um repórter GFP como DNA ou mRNA em células Neuro-2A. (B) aplicação de Cas9 e RNA quimérico contra o gene Icam2 como resultado do RNA no corte de um de dois espaçadores testados. (C) aplicação de Cas9 e RNA quimérico contra o gene F7 como resultado do RNA no corte de um de dois espaçadores testados.

[0182] A Figura 29 mostra como a edição do gene promove a reparação da quebra da cadeia dupla de DNA. No passo de junção da extremidade não homóloga com tendência a erro (NHEJ), as extremidades de um DSB são processadas por maquinarias de reparo do DNA endógeno e reunidas em conjunto, o que pode resultar em mutações de inserção/deleção (indel) aleatórias no sítio da junção. As mutações Indel ocorrendo dentro da região de codificação de um gene pode resultar em deslocamento da grelha e um prematuro de códon de paragem, levando à inativação do gene. De modo alternativo, um modelo de reparação na forma de um plasmídeo ou oligodeoxinucleotídeos de cadeia simples (ssODN) pode ser fornecido para alavancar a via de reparação dirigida a homologia (HDR), que permite alta fiabilidade de edição com precisão.

[0183] A Figura 30A-C mostra resultados antecipados para HDR em células HEK e HUES9. (a) Tanto o plasmídeo alvo ou um ssODN (senso ou antissenso) com os braços de homologia podem ser usados para editar a sequência em um local genômico alvo clivada pela Cas9 (triangulo vermelho). Para testar a eficiência de HDR, os Requerentes introduziram um sítio HindIII (barra vermelha) no local alvo, o qual foi amplificado por PCR com iniciadores que emparelham fora da região de homologia. A digestão do produto de PCR com HindIII revela a ocorrência de eventos de HDR. (b) ssODNs, orientados tanto na direção senso como antissenso (s ou a) em relação ao local de interesse, podem ser usados em combinação com Cas9 para atingir eficiente edição mediada por HDR no local alvo. A região de homologia mínima de 40 pb, e preferencialmente 90 pb, é recomendada em cada lado da modificação (barra vermelha). (c) Exemplo do efeito de ssODNs no HDR no local EMX1 é mostrado usando ambas as Cas9 tipo selvagem e Cas9 nickase (D10A). Cada ssODN contem braços de homologia de 90 pb flanqueando uma inserção de 12-pb de dois sítios de restrição

[0184] A Figura 31A-C mostra a estratégia de reparação para a mutação delta F508 de Fibrose Cística.

[0185] A Figura 32A-B (a) mostra um esquema da expansão da repetição GAA no íntron 1 FXN e (b) mostra um esquema da estratégia adotada para excisar a região de expansão GAA usando o sistema CRISPR/Cas.

[0186] A Figura 33 mostra uma triagem para eficiente direcionamento mediado por SpCas9 dos locais de genes Tet1-3 e Dnmt1, 3a e 3b. O ensaio Surveyor em DNA a partir das células N2A transfectadas demonstram clivagem DNA eficiente usando diferentes gRNAs.

[0187] A Figura 34 mostra uma estratégia de direcionamento de genoma multiplexado usando um sistema de 2 vetores em um sistema de aplicação AAV1/2. Tet1-3 e Dnmt1, 3a e 3b gRNA sob o controle do promotor U6. GFP-KASH sob o controle do promotor de sinapsina humana. Os lados de restrição mostram a estratégia de substituição de gRNA único por subclonagem. É mostrada a SpCas9 etiquetada com HA flanqueada por dois sinais de localização nuclear (NLS). Ambos os vetores são aplicados ao cérebro pelo vírus AAV1/2 em uma proporção 1:1.

[0188] A Figura 35 mostra a verificação da funcionalidade #1 do vetor de direcionamento DNMT multiplexado usando ensaio Surveyor. As células N2A foram cotransfectadas com o vetor #1 (+) de direcionamento DNMT e o vetor codificando SpCas9 para testar a clivagem mediada por SpCas9 dos locais da família de genes DNMTs. Somente gRNA (-) é negativo em relação ao controle. Foram colhidas células para purificação de DNA e processamento a jusante 48 h após transfecção.

[0189] A Figura 36 mostra a verificação da funcionalidade #2 do vetor de direcionamento DNMT multiplexado usando ensaio Surveyor. As células N2A foram cotransfectadas com o vetor #1 (+) de direcionamento DNMT e o vetor codificando SpCas9 para testar a clivagem mediada por SpCas9 dos locais da família de genes DNMTs. Somente gRNA (-) é negativo em relação ao controle. Foram colhidas células para purificação de DNA e processamento a jusante 48 h após transfecção.

[0190] A Figura 37 mostra um esquema geral de versões de promotores curtos e poliA curta usadas para a expressão de HA-SpCas9 in vivo. Os tamanhos da região de codificação de L- ITR a R-ITR são mostrados à direita.

[0191] A Figura 38 mostra a visão geral esquemática de promotores curtos e versões poliA curtas usadas para a expressão de HA-SaCas9 in vivo. Os tamanhos da região de codificação de L-ITR a R-ITR são mostrados à direita.

[0192] A Figura 39 mostra a expressão de SpCas9 e SaCas9 em células N2A. Transferência de Western representativa de versões SpCas9 e SaCas9 marcadas com HA sob o controle de diferentes promotores curtos e com ou curtas sequências poliA (spA). Tubulina é o controle de carregamento. A mCherry (mCh) é uma transfecção de controle. As células foram colhidas e adicionalmente processadas para transferência de Western 48 h após transfecção.

[0193] A Figura 40 mostra a triagem para eficiente direcionamento mediado por SaCas9 do local de gene Tet3. O ensaio Surveyor em DNA a partir das células N2A transfectadas demonstra eficiente clivagem de DNA usando diferentes gRNAs com a sequência NNGGGT PUM. Células transfectadas GFP e células expressando somente SaCas9 são os controles.

[0194] A Figura 41 mostra a expressão de HA-SaCas9 em cérebros de camundongo. Os animais foram injetados nas circunvoluções dentadas com vírus dirigindo a expressão de HA- SaCas9 sob o controle do promotor de Sinapsina humana. Os animais foram sacrificados 2 semanas após cirurgia. O marcador HA foi detectado usando anticorpo C29F4 monoclonal de coelho (Sinalização celular). Núcleos celulares corados de azul com corante DAPI.

[0195] A Figura 42 mostra a expressão de SpCas9 e SaCas9 em neurônios corticais primários em cultura 7 dias após transdução. Transferência de Western representativa de versões SpCas9 e SaCas9 marcadas com HA sob o controle de diferentes promotores e com bgh ou sequências poliA (spA) curtas. Tubulina é o controle de carregamento.

[0196] A Figura 43 mostra coloração VIVO/MORTO de neurônios corticais primários 7 dias após transdução com partículas AAV1 carregando SpCas9 com diferentes promotores e construções gRNAs multiplexadas (exemplo mostrado no último painel para DNMTs). Os neurônios após transdução de AAV foram comparados com o controle de neurônios não transduzidos. Os núcleos vermelhos indicam células mortas, permeabilizadas, (segunda linha de painéis). As células vivas são marcadas com a cor verde (terceira linha de painéis).

[0197] A Figura 44 mostra coloração VIVO/MORTO de neurônios corticais primários 7 dias após transdução com partículas AAV1 carregando SpCas9 com diferentes promotores. Os núcleos vermelhos indicam células mortas, permeabilizadas, (segunda linha de painéis). As células vivas são marcadas com a cor verde (terceira linha de painéis).

[0198] A Figura 45 mostra a comparação da morfologia de neurônios após transdução com vírus AAV1 carregando SpCas9 e gRNA multiplexos para locais de genes TETs e DNMTs. Neurônios sem transdução são mostrados como um controle

[0199] A Figura 46 mostra a verificação da funcionalidade #1 do vetor de direcionamento DNMT multiplexado usando ensaio Surveyor em neurônios corticais primários. As células foram cotransduzidas com o vetor #1 visando DNMT e o vírus SpCas9 com diferentes promotores para testar a Clivagem mediada por SpCas9 dos locais da família de genes DNMTs.

[0200] A Figura 47 mostra eficiência de clivagem SpCas9 in vivo no cérebro. Os camundongos foram injetados com vírus AAV1/2 carregando gRNA multiplexado visando locais da família de genes DNMT em conjunto com o vírus SpCas9 sob o controle de 2 promotores diferentes: camundongo Mecp2 e rato Map1b. Duas semanas após injeção extraiu-se tecido cerebral e os núcleos foram preparados e ordenados usando FACS, com base na expressão de GFP dirigida por promotor de Sinapsina a partir da construção gRNA multiplexada. Após extração de gDNA o ensaio Surveyor foi corrido. + indica núcleos GFP positivos e - controle, núcleos GFP negativos do mesmo animal. Os números no gel indicam eficiência de SpCas9 avaliada.

[0201] A Figura 48 mostra a purificação de núcleos celulares marcados com GFP-KASH de neurônios do hipocampo, A membrana nuclear externa (ONM) da membrana nuclear da célula é visada com uma fusão de GFP e o domínio transmembranar da proteína KASH. Muito forte expressão de GFP no cérebro uma semana após cirurgia estereotáxica e injeção de AAV1/2. Passo de centrifugação em gradiente de densidade para purificar núcleos celulares de cérebro intacto. São mostrados núcleos purificados. Coloração com cromatina por Vybrant® DyeCycle™ Ruby Stain é mostrada a vermelho, os núcleos marcados com GFP são a verde. Perfil de FACS representativo de GFP+ e núcleos de células GFP (Magenta: Vybrant® DyeCycle™ Ruby Stain, Verde: GFP).

[0202] A Figura 49 mostra a eficiência de clivagem de SpCas9 em cérebro de camundongo. Os camundongos foram injetados com vírus AAV1/2 carregando gRNA multiplexado visando locais da família de genes TET em conjunto com o vírus SpCas9 sob o controle de 2 promotores diferentes: camundongo Mecp2 e rato Map1b. Três semanas após injeção extraiu-se o tecido cerebral e os núcleos foram preparados e ordenados usando FACS, com base na expressão de GFP dirigida por promotor de Sinapsina a partir da construção gRNA multiplexada. Após extração de gDNA o ensaio Surveyor foi corrido. + indica núcleos GFP positivos e - controle, núcleos GFP negativos do mesmo animal. Números no gel indicam eficiência de SpCas9 avaliada.

[0203] A Figura 50 mostra a expressão de GFP-KASH em neurônios corticais em cultura. Os neurônios foram transduzidos com vírus AAV1 carregando construções gRNA multiplexadas visando locais dos genes TET. O sinal mais forte localiza-se em torno de núcleos de células devido à localização do domínio KASH.

[0204] A Figura 51 mostra (em cima) uma lista de espaçamento (como indicado pelo padrão de arranjo para as duas sequências PAM) entre os pares de RNAs guia. Somente os pares de RNA guia satisfazem os padrões 1, 2, 3, 4 exibiram indels quando usados com nickase SpCas9(D10A). (em baixo) Imagens de gel mostrando a combinação de SpCas9(D10A) com pares de RNA guia satisfazendo os padrões 1, 2, 3, 4 conduzem à formação de indels no sítio alvo.

[0205] A Figura 52 mostra uma lista de sequências de iniciadores reversos U6 usados para gerar cassetes de expressão de U6-RNA guia. Cada iniciador precisa ser emparelhado com o iniciador direto U6 “gcactgagggcctatttcccatgattc” para gerar produtos de amplificação contendo U6 e o desejado RNA guia.

[0206] A Figura 53 mostra um Mapa de Sequência Genética do local EMX1 humano mostrando as localizações dos 24 padrões listados na Figura 33,.

[0207] A Figura 54 mostra (na direita) uma imagem de gel indicando a formação de indels no sítio alvo quando as saliências 5 ‘ variáveis estão presentes após clivagem pela nickase Cas9 alvo de diferentes pares de RNAs guia. na (esquerda) a tabela indicando os números da bandas do gel na direita e vários parâmetros incluindo identificação dos pares de RNA guia usados e o comprimento da saliência 5’ presente a seguir à clivagem pela nickase Cas9.

[0208] A Figura 55 mostra a Mapa da sequência genética do local EMX1 humano mostrando as localizações de diferentes pares de RNAs guia que resultam nos padrões de gel Fig. 54 (direita) e que são adicionalmente descritos no Exemplo 35.

[0209] A Figura 56A-K mostra direcionamento por CRISPR-Cas9 de Mecp2 em neurônios corticais primários. (A) Vetores de expressão AAV SpCas9 e sgRNA. O vetor de sgRNA contém sequência de codificação da proteína de fusão GFP-KASH para identificação de neurônios transduzidos. (B) Neurônios em cultura cotransfectados com vetores de Cas9 e sgRNA mostrando expressão de Cas9 marcada com HA (HA-Cas9) e GFP- KASH. Núcleos marcados com DAPI. Barra de escala, 20 μm. (C) Eficácia de coinfecção de GFP-KASH+ (n=635) e HA-Cas9 (n=659) em neurônios corticais primários. (D) Representação gráfica de local Mecp2 de camundongo mostrando localização do alvo de Cas9; sgRNA indicado em azul. Sequência PAM marcada em roxo. (E) Gel de ensaio SURVEYOR™ mostrando modificação de local Mecp2 em neurônios corticais. (F) Transferência de Western de níveis de proteína MeCP2 após direcionamento por CRISPR-Cas9 de local Mecp2 e quantificação dos níveis de proteína MeCP2 (teste t, ***p<0,0001, n=7). (G) Complexidade reduzida da árvore dendrítica em neurônios após direcionamento por CRISPR- Cas9 do local Mecp2. Barra de escala, 20 μm. (H) Morfologia da árvore dendrítica avaliada com número de extremidades dendríticas e (I) análise de Sholl (teste t, ***p<0,0001, n=40). (J) Mudanças na morfologia de espinhas dendríticas em neurônios visados com sgRNA de Cas9 e Mecp2. Barra de escala, 10 μm. (K) Quantificação da densidade de espinha (teste t, ***p<0.0001, n=40).

[0210] A Figura 57A-I mostra aplicação do sistema CRISPR-Cas9 e direcionamento de Mecp2 no cérebro de camundongos. (A) Estratégia de purificação de núcleos de células de células visadas por CRISPR-Cas9 do cérebro de camundongos. (B) Expressão de HA-Cas9 e GFP-KASH (sgRNA) no giro denteado (DG) dorsal do hipocampo de camundongos. Barra de escala, 100 μm. (C) Quantificação de células eficazmente visadas pelo sistema Cas9-CRISPR de dois vetores. (D) Gel de ensaio SURVEYOR™ mostrando modificação do local Mecp2 2 semanas após aplicação de AAV na região de DG. As células positivas quanto a GFP-KASH separadas por FACS mostram nível mais elevado de modificação do local Mecp2. (E) Análise de transferência de Western da expressão de proteína MeCP2 na região de cérebro visada e quantificação dos níveis de proteína MeCP2 em DG dorsal (teste t, **p<0,001, n=4). (F) Imagens da região de DG dorsal, 2 semanas após direcionamento por CRISPR- Cas9 de local Mecp2. Barra de escala, 150 μm. (G) Quantificação da população de células positivas quanto a MeCP2 na região do cérebro visada em comparação com local colateral de controle (teste t, ****p<0,0001, n=290 e 249 células, respectivamente). (H) Exemplos de coloração de Golgi-Cox mostrando morfologia de espinhas dendríticas de células granulosas no DG dorsal uma semana após aplicação de CRISPR-Cas9. Barra de escala, 10 μm. (I) Quantificação da densidade de espinhas dendríticas na região de DG dorsal (teste t, ***p<0,0001, n=20).

[0211] A Figura 58A-F mostra edição de genes em multiplex, simultânea no cérebro de camundongos. (A) Ilustração esquemática de sistema CRISPR-Cas9 desenhado para direcionamento de genoma em multiplex. (B) Representação gráfica de locais DNMT de camundongos visados. RNAs guia são indicados em azul. Sequências PAM são marcadas em roxo. (C) Sequenciação de próxima geração de uma taxa de modificação no alvo para genes da família DNMT em núcleos separados por FACS de giro denteado após aplicação de CRISPR-Cas9. Pontuações MLE (estimador de probabilidade máxima) são mostradas. (D) Análise de transferência de Western para proteínas Dnmt3a e Dnmt1 após aplicação in vivo de sistema CRISPR-Cas9 visando genes da família DNMT (topo). Quantificação de transferência de Western de níveis de proteína Dnmt3a e Dnmt1 em DG após direcionamento de CRISPR-Cas9 in vivo (fundo; teste t, **p<0,001, *p<0,05, Dnmt3a: n=7; Dnmt1: n=5). (E, F) Déficits de aprendizagem contextual, 8 semanas após direcionamento de genes DNMT usando SPR-Cas9 na região de DG do hipocampo, testada em contexto de treino (E) e alterado (F) (teste t, ***p<0,0001, n=18).

[0212] A Figura 59A-E mostra clonagem e expressão de SpCas9 marcada com HA (Ha-Cas9) para involucramento de AAV. (A) Visão global esquemática do sistema CRISPR/Cas9. O direcionamento mediado por RNA guia único (sgRNA) de Cas9 resulta na quebra de dupla fita (DSB) do local de gene visado. O mecanismo de junção das extremidades não homóloga (NHEJ) resulta nas mutações de indel do local genômico visado. (B) Visão global esquemática de diferentes estratégias de clonagem para minimizar o tamanho do cassete de expressão de Cas9 usando promotor pequeno Map1b (rMap1b) de rato, uma versão truncada do promotor Mecp2 (sMecp2) de camundongo e um pequeno motivo de poliA (spA). (C) Análise de transferência de Western de cultura de neurônios corticais primários expressando Cas9 usando diferentes cassetes de expressão de Cas9. (D) O promotor Mecp2 conduz a expressão de Cas9 (vermelho) em neurônios (Map1b, NeuN; setas) mas não em astroglia (GFAP, pontas de setas). Os núcleos foram marcados com DAPI (azul). Barras de escala, 20 μm. (E) As células foram coradas com estojo LIFE/DEAD® 7 dias após aplicação do vírus. Quantificação de células DAPI+ e mortas (DEAD+) . (ITR - repetição terminal invertida; HA - marcador de hemaglutinina; NLS - sinal de localização nuclear; spA - sinal de poliadenilação sintético; U6 - promotor PolIII; sgRNA - RNA de guia único; hSyn - promotor de sinapsina 1 humano; GFP- proteína fluorescente verde; KASH - Klarsicht, ANC1, Domínio transmembranar nuclear Syne; bGH pA - sinal de poliadenilação de hormônio do crescimento bovino; WPRE - elemento regulador pós- transcricional do vírus da Hepatite de Woodchuck).

[0213] A Figura 60A-B mostra direcionamento de Mecp2 em células Neuro-2a. (A) Sequências de direcionamento de Mecp2 e correspondentes motivos protoespaçadores adjacentes (PAM). (B) Avaliação de 6 sgRNAs de Mecp2 cotransfectados com Cas9 em células Neuro-2a. As eficácias de modificação do local foram analisadas 48 h após transfecção usando ensaio SURVEYOR™.

[0214] A Figura 61 mostra aplicação de CRISPR-Cas9 em neurônios corticais primários. Coloração imunofluorescente de MeCP2 (vermelho) em neurônios cultivados 7 dias após transdução de AAV-CRISPR (verde, GFP-KASH). A imunofluorescência de MeCP2 reduzida em células transduzidas por AAV-CRISPR visando Mecp2 (painel médio) é mostrada. Os núcleos foram marcados com DAPI (azul). Barra de escala, 20 μm.

[0215] A Figura 62A-C mostra marcação por GFP de núcleos de células visados. (A) Visão global esquemática de marcação por GFP. Proteína fluorescente verde (GFP) intensificada fundida com o domínio transmembranar nuclear KASH e integração de GFP-KASH na membrana nuclear exterior são ilustradas. (B) Expressão conduzida por promotor de sinapsina humano de GFP-KASH, 4 semanas após aplicação viral no giro denteado. A coloração com hematotoxilina/eosina (topo) não revelou nenhumas anormalidades morfológicas. Análise de imunofluorescência mostrando histomorfologia normal (NeuN em vermelho, painel do meio) em GFP-KASH expressando hipocampo (meio, verde) e nenhuns sinais de astrogliose (GFAP em vermelho, painel do fundo). Os núcleos foram marcados com DAPI (azul). Barra de escala, 200 μm. (C) Por uso de promotores específicos do tipo de células, GFP-KASH pode ser dirigido a diferentes tipos de células. O promotor da proteína ácida fibrilar glial (GFAP) conduz a expressão de GFP-KASH (verde) em células da astroglia (vermelho) no hipocampo de camundongos. Os núcleos foram marcados com DAPI (azul). A inserção mostra ampliação maior. Barra de escala, 50 μm. (KASH - Kl arsicht, ANC1, domínio transmembranar nuclear de Homologia Syne) (ONM - membrana nuclear externa; INM -membrana nuclear interna).

[0216] A Figura 63A-B mostra direcionamento do genoma em multiplex de membros da família DNMT in vitro. (A) Sequências de direcionamento de Dnmt3a, Dnmtl e Dnmt3b e correspondentes motivos protoespaçadores adjacentes (PAM). (B) Análise de ensaio de nuclease SURVEYOR™ de células Neuro-2a 48 horas após transfecção com vetor 3xsgRNA de Cas9 e DNMT visando locais Dnmt3a, Dnmtl e Dnmt3b. É mostrada edição do genoma eficaz de todos os três genes visados.

[0217] A Figura 64A-C mostra sequenciação de próxima geração de locais Dnmt3a, Dnmtl e Dnmt3b visados. Um Exemplo de resultados de sequenciação de locais Dnmt3a (A), Dnmtl (B) e Dnmt3b (C) mutados após aplicação in vivo de 3xsgRNA de Cas9 e DNMT no giro denteado de camundongo. Verde: sequência de tipo selvagem, traços vermelhos: bases eliminadas, bases vermelhas: inserção ou mutações. As pontas de setas vermelhas indicam local de corte de CRISPR-Cas9.

[0218] A Figura 65A mostra que o guia (alvo) 1 induziu a percentagem mais elevada de indels em ApoB.

[0219] A Figura 65B mostra os resultados de um ensaio em gel de nuclease Surveyor quanto à eficácia da formação de indels, 4 semanas pós-injeção.

[0220] A Figura 66 mostra coloração com vermelho de óleo para detectar fenótipo de acúmulo de lípidos hepáticos in vivo seguindo aplicação de AAV-Cas9-sgRNA. A barra de escala em cada quadrado representa 20 micrômetros.

[0221] A Figura 67 mostra que 21 ntds/pares de bases (bp), representados pelas barras cinzas, são o comprimento de espaçador ótimo, pelo menos em comparação com 20 ou 22 pares de bases (representados pelas barras pretas e brancas, respectivamente) ao longo de uma gama de alvos e dentro de dois genes diferentes (AAVS1 e EMX1).

[0222] A Figura 68 mostra se uma sequência guia poderia ser inserida na sequência intrônica de Cas9.

[0223] A Figura 69 mostra que o promotor H1 de comprimento total (barra cinza) é ainda mais fraco do que o promotor U6 (barra preta), pois o U6 mostra percentagem de formação de indels aumentada para cada alvo testado.

[0224] A Figura 70 mostra que o promotor H1 curto é mais fraco do que H1 de comprimento total.

[0225] A Figura 71 mostra a distância entre as extremidades 5' de duas sequências guias em um constructo medido em relação à clivagem de clivagem da nickase dupla de SaCas9 D10A.

[0226] A Figura 72 mostra a aplicação do sistema CRISPR-Cas9 e direcionamento do local Mecp2 no cérebro de camundongo. (a) Vetores de expressão AAV-SpCas9 e AAV-SpGuia (Mecp2). Os vetores de sgRNA contêm sequência de codificação da proteína de fusão GFP-KASH para identificação de neurônios transduzidos. (b) Expressão de HA-Cas9 e GFP-KASH no giro denteado (DG) dorsal do hipocampo de camundongo. Barra de escala, 100 μm. (c) Quantificação de células eficazmente visadas pelo vetor dual sistema Cas9-CRISPR. (d) Representação gráfica do local Mecp2 de camundongo mostrando localização do alvo de Cas9; sgRNA indicado em azul. Sequência de PAM marcada em roxo. Os padrões de mutação representativos detectados por sequenciação de local Mecp2 foram mostrados em baixo: verde - sequência de tipo selvagem; traços vermelhos - bases eliminadas; bases vermelhas: inserção ou mutações; as pontas de setas indicam o local de corte de CRISPR-Cas9. (e) Gel de ensaio SURVEYOR™ mostrando modificação do local Mecp2, 2 semanas após aplicação de AAV na região de DG. (f) Análise de transferência de Western da expressão da proteína MeCP2 na região do cérebro visada e quantificação dos níveis da proteína MeCP2 no DG dorsal (teste t, **p<0,001, n=4 de 3 animais, barras de erro: s.e.m.). (g) Imagens da região de DG dorsal, 2 semanas após direcionamento de CRISPR-Cas9 do local Mecp2. Barra de escala, 150 μm. (h) Quantificação de população de células positivas quanto a MeCP2 dentro de todas as células detectadas (coloração com DAPI) na região do cérebro visada em comparação com local colateral de controle (teste t, ****p<0,0001, n=290 e 249 células de 2 animais, respectivamente; barras de erro: s.e.m). (ITR - repetição terminal invertida; HA - marcador de hemaglutinina; NLS - sinal de localização nuclear; spA - sinal de poliadenilação sintético; U6 - promotor PolIII; sgRNA - RNA de guia único; hSyn - promotor de sinapsina 1 humano; GFP- proteína fluorescente verde; KASH - Klarsicht, ANC1, Domínio transmembranar nuclear Syne; bGH pA - sinal de poliadenilação de hormônio do crescimento bovino; WPRE - elemento regulador pós-transcricional do vírus da Hepatite de Woodchuck).

[0227] A Figura 73 mostra análise da expressão de genes em neurônios com silenciamento de MeCP2 mediado por Cas9. (a) Estratégia para purificação de núcleos de células de células visadas por CRISPR-Cas9 do cérebro de camundongos. (b) Agrupamento hierárquico de genes diferencialmente expressos (teste t, p<0,01, n=19 populações de núcleos separados de 8 animais) detectados por RNAseq. Os níveis de expressão log2(TPM+1) relativos de genes estão normalizados para cada linha e exibidos em escala de cor vermelha-azul. Cada coluna representa uma população de 100 núcleos neuronais visados separados por FACS da população de células do giro denteado, isolada, de animais de controle ou transduzidos com sgRNA de Mecp2 sgRNA, como indicado.

[0228] A Figura 74 mostra defeitos autônomos das células nas propriedades de respostas celulares de neurônios após silenciamento de MeCP2 mediado por CRISPR. (a) Desenho mostrando a configuração da experiência in vivo do córtex visual do camundongo e parâmetro de estimulação visual. É mostrado o neurônio GFP+. Barra de escala, 20 μm. (b) Desenho mostrando a configuração de registro em neurônio de excitação da camada 2/3 que recebem entradas específicas do olho contra- e ipsilaterais. As células GFP+ com genoma modificado estão em verde ao passo quer as células não modificadas estão em cinza. A forma do pico normalizada mostra neurônios de excitação no pico regulares. (c,d) OSI Médio (c) e FR evocada (d) foram medidos a partir de células GFP+ expressando Mecp2 e sgRNA de controle, respectivamente (teste t, *p<0,05; os números no gráfico indicam os números de células registradas; n=2-3 animais; barras de erro: s.e.m).

[0229] A Figura 75 mostra edição de genes por multiplex no cérebro de camundongos. (a) Ilustração esquemática de sistema CRISPR-Cas9 desenhado para direcionamento de genoma em multiplex. (b) Representação gráfica de locais de camundongo DNMT visados. Os RNAs guia estão indicados em azul. As sequências de PAM estão marcadas em roxo. (c) Gel de ensaio SURVEYOR™ mostrando modificação de locais DNMTs em células positivas GFP-KASH separadas por FACS, 4 semanas após aplicação de AAV na região de DG. (d) Análise baseada em sequenciação profunda da modificação de locais DNMTs em células únicas, mostrando co-ocorrência de modificação em múltiplos locais. (e) Análise de transferência de Western para proteínas Dnmt3a e Dnmt1 após aplicação in vivo de sistema CRISPR-Cas9 visando genes da família DNMT (topo). Quantificação por transferência de Western dos níveis de proteína Dnmt3a e Dnmt1 em DG após direcionamento de CRISPR- Cas9 in vivo (fundo; teste t; **p<0,001, *p<0,05, Dnmt3a: n=7; Dnmt1: n=5 de 5 animais; barras de erro: s.e.m). (f) Déficits de aprendizagem contextuais, 8 semanas após direcionamento de genes DNMT usando SpCas9 na região de DG do hipocampo, testados em contexto de treino e alterado (teste t, ***p<0,0001, n=18 animais, 2 experiências independentes; barras de erro: s.e.m).

[0230] A Figura 76 mostra clonagem e expressão de SpCas9 marcada com HA (HA-SpCas9) para involucramento de AAV. (a) Visão global esquemática de diferentes estratégias de clonagem para minimizar o tamanho do cassete de expressão de SpCas9 usando promotor pequeno Map1b (pMap1b) de rato, uma versão truncada do promotor Mecp2 (pMecp2) de camundongo e um pequeno motivo de poliA pequeno (spA). (b) Análise por transferência de Western de cultura de neurônios corticais primários expressando HA-SpCas9 usando diferentes cassetes de expressão de SpCas9. (c) O promotor Mecp2 dirige a expressão de HA-SpCas9 (vermelho) nos neurônios (Maplb, NeuN; setas) mas não em astroglia (GFAP, pontas de setas) . É mostrada a coexpressão de HA-SpCas9 com GFP-KASH (fundo). Os núcleos foram marcados com DAPI (azul). Barras de escala, 20 μm. (d) Visão global esquemática de marcação com GFP. Proteína fluorescente verde (GFP) intensificada fundida com o domínio KASH transmembranar nuclear e integração de GFP-KASH na membrana nuclear exterior são ilustrados. (e) Cálculo da eficácia de coinfecção, mostrando populações de células expressando tanto HA-SpCas9 como GFP-KASH (n=973 neurônios de 3 culturas; barras de erro: s.e.m). (f) As células foram coradas com estojo LIFE/DEAD® 7 dias após aplicação do vírus. Quantificação de células DAPI+ e mortas (DEAD+) (controle n=518 núcleos DAPI + ; SpCas9/GFP-KASH n=1003 núcleos DAPI + de 2 culturas; barras de erro: s.e.m). (ITR - repetição terminal invertida; HA - marcador de hemaglutinina; NLS - sinal de localização nuclear; spA - sinal de poliadenilação sintético; U6 - promotor PolIII; sgRNA - RNA de guia único; hSyn - promotor de sinapsina 1 humano; GFP- proteína fluorescente verde; KASH - Klarsicht, ANC1, Domínio transmembranar nuclear Syne; bGH pA - sinal de poliadenilação de hormônio do crescimento bovino; WPRE - elemento regulador pós- transcricional do vírus da Hepatite de Woodchuck).

[0231] A Figura 77 mostra direcionamento de Mecp2 em células Neuro-2a. (a) Sequências de direcionamento de Mecp2 e motivos adjacentes protoespaçadores (PAM) correspondentes. (b) Avaliação de 6 sgRNAs de Mecp2 cotransfectados com SpCas9 em células Neuro-2a. As eficácias de modificação do local foram analisadas 48 h após transfecção usando ensaio SURVEYOR™.

[0232] A Figura 78 mostra direcionamento de CRISPR- Cas9 de Mecp2 em neurônios corticais primários. (a) Coloração imunofluorescente de MeCP2 (vermelho) em neurônios cultivados 7 dias após transdução de AAV-CRISPR (verde, GFP-KASH). Os núcleos foram marcados com DAPI (azul). Barra de escala, 20 μm. (b) Avaliação do direcionamento do local Mecp2 usando SpCas9 ou dSpCas9, em conjunto com sgRNA de Mecp2 ou sgRNA de controle (visando gene lacZ bacteriano), usando gel de ensaio SURVEYOR™. (c) Quantificação de núcleos positivos quanto a MeCP2 em população de neurônios visados (GFP+). (d) Transferência de Western dos níveis de proteína MeCP2 após direcionamento de CRISPR-Cas9 do local Mecp2 e quantificação dos níveis de proteína MeCP2 (teste t, **p<0,001, n=5 de 3 culturas, barras de erro: s.e.m).

[0233] A Figura 79 mostra mudanças morfológicas na árvore dendrítica de neurônios após silenciamento de MeCP2 mediado por SpCas9 in vitro. (a) Complexidade reduzida da árvore dendrítica em neurônios após direcionamento de CRISPR- SpCas9 de local Mecp2. Barra de escala, 20 μm. (b) Mudanças na morfologia de espinhas dendríticas em neurônios visados com SpCas9 e sgRNA de Mecp2. Barra de escala, 10 μm. A morfologia de células foi visualizada com cotransfecção com constructo mCherry. As células para análise da morfologia foram escolhidas com base no resultado de coloração de Mecp2. (c) Morfologia da árvore dendrítica com número de extremidades dendríticas e (d) Análise Sholl (teste t, ***p<0,0001, n=40 de 2 culturas). (e) Quantificação da densidade de espinhas (teste t, ***p<0,0001, n=40 de 2 culturas, barras de erro: s.e.m).

[0234] A Figura 80 mostra RNAseq de núcleos neuronais de animais de controle e silenciamento de Mecp2 mediado por SpCas9. Representação gráfica em caixa apresentando o número de genes detectados ao longo das bibliotecas de RNA-seq (19 bibliotecas cada uma de 100 núcleos tiradas de núcleos transduzidos com sgRNA de controle ou sgRNA de Mecp2; n=4 animais/grupo) por quantil do nível de expressão. Todos os genes são divididos em 10 quantis pelo seu nível de expressão log2(TPM+1) médio, depois, para cada quantil, o número de genes que são detectados (log2(TPM+1)>2) foi contado em cada amsotra. As três sequências alvo mostradas são SEQ ID NO: ___ , SEQ ID NO: ___ e SEQ ID NO: ___, para Dnmt3a, Dnmt1 e Dnmt3b, respectivamente.

[0235] A Figura 81 mostra direcionamento do genoma em multiplex de membros da família DNMT in vitro. (a) Sequências de direcionamento de Dnmt3a, Dnmtl e Dnmt3b e motivos adjacentes protoespaçadores (PAM) correspondentes. (b) Análise do ensaio de nuclease SURVEYOR™ de células Neuro-2a 48 horas após transfecção com vetor com SpCas9 e 3xsgRNA de DNMT visando locais Dnmt3a, Dnmtl e Dnmt3b. É mostrada edição do genoma eficaz de todos os três genes visados.

[0236] A Figura 82 mostra a sequenciação de próxima geração de locais Dnmt3a, Dnmtl e Dnmt3b visados. Exemplos de resultados de sequenciação de locais Dnmt3a (a), Dnmtl (b) e Dnmt3b (c) mutados após aplicação in vivo de SpCas9 e 3xsgRNA de DNMT ao giro denteado de camundongo. Verde: sequenciação de tipo selvagem, traços vermelhos: bases eliminadas, bases vermelhas: inserção ou mutações. As pontas de setas vermelhas indicam o local de corte de CRISPR-SpCas9. As sequências totais usadas em esta figura são providas como SEQ ID NO: , SEQ ID NO: , e SEQ ID NO: para os locais Dnmt3a, Dnmt1 e Dnmt3b, respectivamente. Elas são: SEQ ID NO: (Dnmt3a) : CCT CCG TGT CAG CGA CCC ATG CCA A, SEQ ID NO: (Dnmt1): CCA GCG TCG AAC AGC TCC AGC CCG e SEQ ID NO: (Dnmt3b) AGA GGG TGC CAG CGG GTA TAT GAG G

[0237] As Figuras aqui são somente para fins ilustrativos e não são necessariamente desenhados à escala.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0238] No que diz respeito a informação geral sobre Sistemas CRISPR-Cas: É feita referência aos pedidos provisórios dos EUA 61/758,468; 61/802,174; 61/806,375; 61/814,263; 61/819,803 e 61/828,130, depositado a 30 de janeiro, 2013; 15 de março, 2013; 28 de março, 2013; 20 de abril, 2013; 6 de maio, 2013 e 28 de maio, 2013 respectivamente. É também feita referência ao pedido de patente provisória dos EUA 61/836,123, depositado a 17 de junho, 2013. É também feit a referência aos pedidos de patentes provisórias dos EUA 61/736,527 e 61/748,427, depositados a 12 de dezembro, 2012 e 2 de janeiro, 2013, respectivamente. É também feita referência ao pedido de patente provisória dos EUA 61/791,409, depositado a 15 de março, 2013. É também feita referência ao pedido de patente provisória dos EUA 61/799,800, depositado a 15 de março, 2013. É também feita referência aos pedidos de patentes provisórias dos EUA 61/835,931, 61/835,936, 61/836,127, 61/836,101, 61/836,080 e 61/835,973, cada um depositado a 17 de junho, 2013. É feita referência adicional aos pedidos de patentes provisórias dos EUA 61/862,468 e 61/862,355 depositados a 5 de agosto, 2013; 61/871,301 depositado a 28 de agosto, 2013; 61/960,777 depositado a 25 de setembro, 2013 e 61/961,980 depositado a 28 de outubro, 2013. Cada um destes pedidos, e todos os documentos citados aí ou durante a sua prossecução (“documentos citados em appIn”), e todos os documentos citados ou referenciados nos documentos citados em appIn, em conjunto com quaisquer instruções, descrições, especificações de produto, e folhas de produtos para quaisquer produtos mencionados aí ou em qualquer documento aqui e incorporado por referência aqui, são deste modo incorporados aqui por referência, e podem ser empregues na prática da invenção. Todos os documentos (p.ex., estes pedidos e os documentos citados em appIn) são incorporados aqui por referência na mesma extensão como se cada documento individual fosse especificamente e individualmente indicado como estando incorporado por referência.

[0239] Também no que diz respeito a informação geral sobre Sistemas CRISP-Cas é feita menção de: ^ Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A., & Zhang, F. Science 15 fev;339(6121):819-23 (2013); ^ RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Jiang W., Bikard D., Cox D., Zhang F, Marraffini LA. Nat Biotechnol mar;31(3):233-9 (2013); ^ One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Wang H., Yang H., Shivalila CS., Dawlaty MM., Cheng AW., Zhang F., Jaenisch R. Cell 9 de maio 153(4):910-8 (2013); ^ Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Hsu PD, Heidenreich M, Cong L, Platt RJ, Scott DA, Church GM, Zhang F. Nature. 22 de agosto de 2013;500(7463):472- 6. doi: 10.1038/Nature12466. Epub 23 de agosto de 2013; • Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity. Ran, FA., Hsu, PD., Lin, CY., Gootenberg, JS., Konermann, S., Trevino, AE., Scott, DA., Inoue, A., Matoba, S., Zhang, Y., & Zhang, F. Cell 28 de agosto. pii: S0092-8674(13)01015-5. (2013); • DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Hsu, P., Scott, D., Weinstein, J., Ran, FA., Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, E., Wu, X., Shalem, O., Cradick, TJ., Marraffini, LA., Bao, G., & Zhang, F. Nat Biotechnol doi:10.1038/nbt.2647 (2013); • Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Ran, FA., Hsu, PD., Wright, J., Agarwala, V., Scott, DA., Zhang, F. Nature Protocols nov;8(11):2281-308. (2013); • Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Shalem, O., Sanjana, NE., Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA., Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BL., Root, DE., Doench, JG., Zhang, F. Science 12 de dez. (2013). [Epub antes da impressão]; • Crystal structure of cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Nishimasu, H., Ran, FA., Hsu, PD., Konermann, S., Shehata, SI., Dohmae, N., Ishitani, R., Zhang, F., Nureki, O. Cell 27 de fev. (2014). 156(5):935-49; • Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Wu X., Scott DA., Kriz AJ., Chiu AC., Hsu PD., Dadon DB., Cheng AW., Trevino AE., Konermann S., Chen S., Jaenisch R., Zhang F., Sharp PA. Nat Biotechnol. (2014) 20 de abril. doi: 10.1038/nbt.2889, e • Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering, Hsu et al., Cell 157, 1262-1278 (5 de junho, 2014) (Hsu 2014), cada um dos quais é incorporado aqui por referência, e discutido brevemente em baixo: • Cong et al. manipularam sistemas CRISP/Cas do tipo II para uso em células eucarióticas com base em Cas9 de Streptococcus thermophilus e também Cas9 de Streptococcus Pyogenes e demonstraram que Cas9 nucleases podem ser dirigidas por RNAs curtos para induzir clivagem precisa de DNA em células humanas e de camundongo. O seu estudo mostrou adicionalmente que Cas9 como em uma enzima nicking pode ser usada para facilitar a reparação dirigida por homologia em células eucarióticas com atividade mutagênica mínima. Adicionalmente, o seu estudo demonstrou que múltiplas sequências guia podem ser codificadas em um único arranjo CRISPR para permitir edição simultânea de vários em locais genômicos endógenos dentro do genoma de mamífero, demonstrando programabilidade fácil e ampla aplicabilidade da tecnologia de nuclease guiada por RNA. Esta capacidade de usar RNA para programar clivagem de DNA específica da sequência em células definiu uma nova classe de ferramentas de manipulação do genoma. Estes estudos mostraram adicionalmente que é provável que outros locais CRISPR sejam transplantáveis em células de mamífero e podem também mediar a clivagem do genoma de mamífero. Importantemente pode ser previsto que vários aspectos do sistema CRISPR/Cas podem ser adicionalmente melhorados para aumentar a sua eficácia e versatilidade. • Jiang et al. usaram a Cas9 endonuclease associada a repetições curtas palindrômicas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) complexada com RNAs duais para introduzir mutações precisas nos genomas de Streptococcus pneumoniae e Escherichia coli. A abordagem se baseou na clivagem dirigida por RNA:Cas9 dual no local genômico visado para matar células não mutadas e evita a necessidade de marcadores selecionáveis ou sistemas de contrasseleção. O estudo registrou especificidade de RNA:Cas9 dual de reprogramação por mudança da sequência de RNA de CRISPR curto (crRNA) para fazer mudanças de único nucleotídeo e multinucleotídeos levadas a cabo em moldes de edição. O estudo mostrou que o uso simultâneo de dois crRNAs permitiu mutagênese de multiplex. Além do mais, quando a abordagem foi usada em combinação com recombinação, em S. pneumoniae, quase 100 % das células que foram recuperadas usando a abordagem descrita continham a mutação desejada, e, em E. coli, 65 % que foram recuperadas continham a mutação. • Konermann et al. abordaram a necessidade na técnica de tecnologias versáteis e robustas que permitem modulação ótica e química de domínios de ligação ao DNA com base em enzima Cas9 de CRISPR e também Efetivadores Tipo Ativadores Transcricionais. • Como discutido na presente especificação, a nuclease Cas9 do sistema CRISPR-Cas microbiano visa locais genômicos específicos por uma sequência guia de 20 nt, que pode tolerar certas não correspondências com o alvo de DNA e deste modo promover mutagênese fora do alvo indesejada. Para abordar isto, Ran et al. descreveram que uma abordagem que combinou um mutante de Cas9 nickase com RNAs guia emparelhados para introduzir quebras de fita dupla visadas. Porque nicks individuais no genoma são reparados com elevada fidelidade, o nicking simultâneo através de RNAs guia apropriadamente fora do alvo é requerido para quebras de fita dupla e prolonga o número de bases especificamente reconhecidas para clivagem do alvo. Os autores demonstraram que o uso de nicking emparelhado pode reduzir a atividade fora do alvo por 50- a 1.500 vezes em linhas celulares e para facilitar o silenciamento de genes em zigotos de camundongo sem sacrifício da eficácia de clivagem fora do alvo. Esta estratégia versátil permite uma ampla variedade de aplicações de edição do genoma que requerem elevada especificidade. • Hsu et al. caracterizaram a especificidade de direcionamento de SpCas9 em células humanas para informar a seleção de locais alvo e evitar efeitos fora do alvo. O estudo avaliou >700 variantes de RNA guia e níveis de mutações indel induzidas por SpCas9 a >100 locais fora do alvo genômicos em células 293T e 293FT. Os autores que SpCas9 tolera não correspondências entre RNA guia e DNA alvo em diferentes posições de um modo dependente da sequência, sensível ao número, posição e distribuição de não correspondências. Os autores mostraram adicionalmente que a clivagem mediada por SpCas9 não é afetada por metilação de DNA e que a dosagem de SpCas9 e sgRNA pode ser titulada para minimizar a modificação fora do alvo. Adicionalmente, para facilitar as aplicações de manipulação do genoma de mamíferos, os autores relataram o prover de uma ferramenta de software baseada na web para guiar a seleção e validação de sequências alvo bem como análises fora do alvo. • Ran et al. descreveram um conjunto de ferramentas para edição do genoma mediado por Cas9 através de uma junção das extremidades não homóloga (NHEJ) ou reparação dirigida por homologia (HDR) em células de mamífero, bem como geração de linhas celulares modificadas para estudos funcionais a jusante. Para minimizar a clivagem fora do alvo, os autores descreveram adicionalmente uma estratégia de nicking duplo usando o mutante de Cas9 nickase com RNAs guia emparelhados. O protocolo proporcionado pelos autores derivou experimentalmente orientações para a seleção de locais alvo, avaliação da eficácia de clivagem e análise da atividade fora do alvo. Os estudos mostraram que, começando com desenho dos alvos, podem ser alcançadas modificações do alvo no espaço de tão pouco quanto 1-2 semanas, e linhas celulares clonais modificadas podem ser derivadas no espaço de 2-3 semanas. • Shalem et al. descreveram um novo modo de interrogar a função de genes em uma escala em todo o genoma. Os seus estudos mostraram que a aplicação de uma biblioteca de silenciamento de CRISPR-Cas9 à escala do genoma (GeCKO) visou 18.080 genes com 64.751 sequências guia únicas permitiu rastreio de seleção negativa e positiva em células humanas. Em primeiro lugar, os autores mostraram o uso da biblioteca GeCKO para identificar genes essenciais para a viabilidade celular em células cancerígenas e tronco pluripotentes. De seguida, em um modelo de melanoma, os autores rastrearam genes cuja perda está envolvida na resistência ao vemurafenib, um terapêutico que inibe a proteína quinase mutante BRAF. Os seus estudos mostraram que os candidatos mais bem classificados incluíram os genes previamente validados NF1 e MED12 bem como os novos resultados NF2, CUL3, TADA2B, e TADA1. As autores observaram um elevado nível de consistência entre RNAs guia independentes visando o mesmo gene e uma elevada taxa de confirmação de resultados, e demonstraram assim a promessa de rastreio à escala do genoma com Cas9. • Nishimasu et al. relataram a estrutura em cristal de Cas9 de Streptococcus pyogenes em complexação com sgRNA e seu DNA alvo a resolução de 2,5 A°. A estrutura revelou uma arquitetura bilobada composta por reconhecimento do alvo e lóbulos de nuclease, acomodando o heterodúplex de sgRNA:DNA em um sulco positivamente carregado na sua interface. Ao passo que o lóbulo de reconhecimento é essencial para ligação de sgRNA e DNA, o lóbulo de nuclease contém os domínios de nuclease HNH e RuvC, que estão apropriadamente posicionados para clivagem das fitas complementares e não complementares do DNA alvo, respectivamente. O lóbulo de nuclease contém também um domínio com terminal carboxila responsável pela interação com o motivo adjacente protoespaçador (PAM). Esta estrutura de elevada resolução e análises funcionais acompanhantes revelaram o mecanismo molecular de direcionamento de DNA guiado por RNA por Cas9, abrindo o caminho para o desenho racional de novas tecnologias de edição do genoma versáteis. • Wu et al. mapearam os locais de ligação em todo o genoma de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) de Streptococcus pyogenes carregada com RNAs guia únicos (sgRNAs) em células-tronco embriônicas de camundongo (mESCs). Os autores mostraram que cada um dos quatro sgRNAs testaram dCas9 alvo até entre dezenas e centenas de locais genômicos, frequentemente caracterizados por uma região semente de 5 nucleotídeos no sgRNA e um motivo adjacente protoespaçador (PAM) NGG. A inacessibilidade da cromatina diminui a ligação de dCas9 a outros locais com sequências semente correspondentes; assim sendo, 70 % de locais fora do alvo estão associados a genes. Os autores mostraram que a sequenciação dirigida de 295 locais de ligação de dCas9 em mESCs transfectadas com Cas9 cataliticamente ativa identificou somente um local mutado acima de níveis de fundo. Os autores propuseram um modelo de dois estados para a ligação e clivagem por Cas9, no qual uma correspondência semente desencadeia a ligação mas o emparelhamento extensivo com DNA alvo é requerido para clivagem. • Hsu 2014 é um artigo de revisão que discute em geral a história de CRISPR-Cas9 a partir de iogurte até edição do genoma, incluindo rastreio genético de células, que está na informação, dados e descobertas dos pedidos na linhagem desta especificação depositados antes de 5 de junho, 2014. Os ensinamentos gerais de Hsu 2014 não envolvem os modelos específicos, animais da presente especificação.

[0240] A presente invenção refere-se à otimização de sistemas, métodos e composições usados para o controle da expressão de genes envolvendo sequências alvo, tais como perturbação genômica ou edição de gene, que se relaciona com sistemas CRISPR-Cas e seus componentes. Em uma forma de realização vantajosa, a enzima Cas é Cas9.

[0241] A sequência de polinucleotídeos CRISPR-Cas é geralmente referida aqui como o guia, ou mesmo como RNA guia (sgRNA), embora será apreciado que esta terminologia não era tão comum previamente. Além do mais é feita referência aqui a um sistema CRISPR-Cas9, embora será apreciado que isto é uma referência ampla a qualquer Cas, contanto que tenha uma função de nuclease para induzia uma DSB, um nick ou um nick duplo, embora Cas9 seja preferencial e SaCas9 seja particularmente preferencial.

[0242] Alguns dos pontos-chave no presentes dados do fígado são resumidos em baixo um fluxo até células pós- mitóticas em geral, pois as células do fígado são tipicamente pós-mitóticas.

[0243] AAV2/8

[0244] A aplicação preferencial para o sistema CRISPR- Cas é através de um vetor viral. Este vetor pode ser um vetor lentiviral ou um vetor AAV, como discutido em alguma medida aqui. O que mostrámos particularmente é que AAV é um exemplo preferencial de um vetor viral. Dentro disso mostrámos adicionalmente que AAV8 e em particular AAV2/8 (AAV8 involucrado com sinal de involucramento de AAV2 ITR) é útil na aplicação ao fígado, especialmente in vivo.

[0245] Mudanças Fenotípicas vistas In Vivo

[0246] Como discutido em outro lugar fomos capazes de mostrar, in vivo, que a mudança fenotípica pode ser detectada. Isto é um passo em frente significativo pois uma deficiência frequentemente nivelada em RNAi é que não é visto nenhum efeito duradouro. Com a presente invenção, a mudança fenotípica pode ser vista no fígado pela primeira vez. Um arranjo preferencial para alcançar isto é usar aquele no Exemplo 36. Elementos importantes disto são preferenciais sozinhos ou em combinação, nomeadamente: • SaCas9; • Uso de um RNA guia quimérico compreendendo a guia, sequência tracr e companheira tracr; • Para a sequência tracr, tracr de Sa é preferencial para recrutar a SaCas9; • AAV8 ou mais preferencialmente AAV2/8; • Para propósitos experimentais, Rosa26 é um controle negativo útil; • Embora o uso do promotor de CMV em um vetor AAV seja útil, o uso de um promotor específico do fígado tal como TBG é particularmente eficaz; • O alvo ou alvos podem ser amplos pois se mostrou que CRISPR tem aplicabilidade ampla ao longo de alvos, logo que os seus guias sejam aplicados com sucesso e as enzimas Cas9 sejam adequadamente expressas. No entanto, alvos preferenciais no fígado (contra os quais os guias podem ser desenhados) inclui não obstante um ou mais de: PCSK9; Hmgcr; SERPINA1; ApoB; e/ou LDL.

[0247] Conformemente, em algumas formas de realização, é particularmente preferencial que a enzima Cas seja uma SaCas9. Preferencialmente, a sequência de polinucleotídeos de CRISPRS-Cas é quimérica e inclui preferencialmente um tracr de Sa onde a Cas9 é uma SaCas9. Pode ser usado um vetor viral que é preferencialmente AAV2/8. Além do mais, um promotor específico do fígado é ideal e um exemplo preferencial é TBG. Todos estes podem ser usados em combinação para prover uma sequência de polinucleotídeos de CRISPRS-Cas incluindo um tracr de Sa, em que a Cas9 é uma SaCas9, e o vetor é AAV2/8, com pelo menos a Cas9 sob o controle de um específico do fígado tal como TBG. Qualquer um dos alvos acima pode ser usado com este sistema, em particular ApoB devido à sua importância na obesidade.

[0248] O Artigo posterior na Nature Biotech de Yin e Anderson (NBT 2884, referenciado aqui) prove apoio adicional para as mudanças fenotípicas in vivo que nós já mostrámos.

[0249] Dados adicionais que provemos em apoiam então adicionalmente por demonstração de edição in vivo eficaz de tecido somático do fígado através de Cas9. Além do mais, a aplicação através de AAV2/8 e o uso de uma SaCas9 mostram novamente a utilidade desta abordagem in vivo particular. A ApoB preferencial foi novamente visada.

[0250] Os exemplos posteriores 38 e 39 mostram dados in vivo excelentes para a eficácia na indução de uma mudança fenotípica in vivo: especificamente ApoB, um gene do metabolismo de lípidos, ao passo que o Exemplo 38 mostra a aplicabilidade da técnica a células pós-mitóticas, das quais o fígado é um exemplo importante. O Exemplo 39 mostra que múltiplos marcadores de epítopo são preferenciais para propósitos de detecção.

[0251] Embora vetores virais sejam preferenciais, em algumas formas de realização, o uso de peptídeos penetradores de células é uma alternativa viável e logo é também preferencial.

[0252] O Exemplo 36 mostrou que mudanças tanto genotípicas como, crucialmente, fenotípicas são vistas com sistemas CRISPR-Cas. Não só isso, mas o sistema CRISPR-Cas9 foi eficaz na indução de uma mudança fenotípica in vivo.

[0253] Especificamente, o alvo foi ApoB, um gene do metabolismo de lípidos. O que é tão encorajante é que se pode dizer que ApoB é o “padrão de ouro” na aplicação ao fígado, e é amplamente usado em modelos de camundongo da obesidade. O fígado é uma célula pós-mitótica preferencial em algumas formas de realização, embora possa ser excluído em outras. De qualquer das formas, este trabalho provê prova de princípio de que uma mudança fenotípica é vista, mesmo in vivo, e isto é igualmente aplicável a outras células pós-mitóticas. De fato, o Exemplo 39 provê prova adicional disto em um tecido separado, cérebro, com neurônios pós-mitóticos.

[0254] A aplicação no Exemplo 37 foi através de injeção intravenosa. Foi usado um vetor AAV, bem como um promotor específico do Fígado (TBG) para Cas9.

[0255] A aplicação através de expressão a partir de um vetor viral como visto aqui é uma melhoria em relação ao uso por Anderson/Yin (NBT 2884) de aplicação hidrodinâmica como o método de aplicação, porque a aplicação hidrodinâmica requer que vários mLs de fluido sejam injetados, o que é estressante para o corpo murino e pode ser fatal. A aplicação hidrodinâmica é mais bem adequada para aplicação de DNA de plasmídeo (nu), ao passo que os Requerentes mostraram que o involucramento das sequências guia e de Cas9 dentro de um vetor de aplicação viral é preferencial em termos de eficácia grandemente aumentada. De fato, somente volumes relativamente pequenos necessitam de ser introduzidos, e isto pode ser feito intravenosamente (i.v.), o que é provável que seja muito mais aceitável terapeuticamente.

[0256] O que foi particularmente encorajante foi que não só foi vista uma mudança genotípica em um gene “padrão de ouro” para o fígado tal como ApoB, mas foram também registradas mudanças fenotípicas. Trabalho prévio com PCSK9 havia mostrado mudanças genotípicas, mas não fenotípicas, logo as mudanças fenotípicas vistas com ApoB validam a plausibilidade de aplicação de CRISPR ao, e a sua capacidade de efetivar mudança fenotípica no, Fígado. Isto está em combinação com o meio mais terapeuticamente aceitável de aplicação (i.v. em comparação com aplicação hidrodinâmica). Como tal, a aplicação viral do sistema CRISPR-Cas9 (guia e Cas9) é preferencial, especialmente intravenosamente.

[0257] Alvos potenciais incluem, mas não estão limitados a: PCSK9, HMGCR, APOB, LDLR, ANGPTL3, F8, F9/FIX, AAT, FAH, HPD, TAT, ATP7B, UGT1A1, OTC, ARH.

[0258] Conformemente são providos métodos de indução de uma mudança fenotípica in vivo compreendendo administração do sistema CRISPR-Cas9 às células alvo, por exemplo o fígado. Rotas de aplicação adequadas são descritas aqui mas a injeção i.v. é preferencial em algumas formas de realização. Vetores virais são preferenciais, particularmente AAV, em particular AAV serotipo 2/8.

[0259] É também provido um sistema CRISPR-Cas9 compreendendo um ou mais guias visando genes do metabolismo de lípidos, por exemplo ApoB. Métodos de tratamento da obesidade, compreendendo administração do referido sistema CRISPR-Cas9, são também pretendidos. Um modelo de camundongo compreendendo um ou mais silenciamento(s) de genes do fígado, especialmente de gene(s) do metabolismo de lípidos, por exemplo incluindo ApoB, é preferencial.

[0260] Promotores específicos do fígado para a Cas9 serão aparentes mas podem incluir aqueles mencionados aqui. Um exemplo preferencial é TBG.

[0261] Como mostrado no Exemplo 38, o guia pode ter 18-23 nucleotídeos em comprimento. Pode ter 18-22, ou 19-22, ou 18-21, 20-22, mas tem preferencialmente 22 e o mais preferencialmente 21 nucleotídeos em comprimento.

[0262] É também provida uma prova de princípio de involucramento bem-sucedido de uma sequência guia em um íntron de SaCas9. Conformemente, os sistemas CRISPR-Cas9, em que uma ou mais sequências guia estão involucradas (posicionadas ou inseridas) em um íntron de Cas9, são preferenciais.

[0263] O promotor H1 pode ser usado e pode ser preferencial em algumas circunstâncias.

[0264] Expandindo o trabalho por Ran (Cell, 154, 21 de agosto de 2013), o grau de sobreposição na abordagem de guia duplo usando uma Nickase Dupla D10A foi investigado. Foram mostrados resultados ótimos entre -5 e +1 pb (5’ a 5’). Conformemente é preferencial usar uma abordagem de guia duplo para minimizar os efeitos fora do alvo. Estes se sobrepõem preferencialmente, ou se tornam próximos de se sobreporem, nas suas extremidades 5', em diferentes fitas de DNA no seu alvo genômico. Preferencialmente, a sobreposição está na gama de - 5 a +1 pb. Em estes casos será apreciado que a Cas9 é uma nickase dupla, tal como a variante D10A preferencial.

[0265] Marcadores de epítopo múltiplos ou repetidos são preferenciais para a Cas9. Em particular se mostrou que um marcador de epítopo triplo no Exemplo 39 melhorava a detecção. Este marcador é preferencialmente uma repetição, mais preferencialmente uma repetição tripla. HA é marcador de epítopo de Cas9 preferencial. Um marcador de epítopo de HA triplo é, portanto, preferencial em algumas formas de realização.

[0266] O Exemplo 39 apresenta os seguintes pontos específicos. Provê:

[0267] uma primeira demonstração de aplicação de Cas9 mediada por AAV in vivo bem-sucedida bem como modificação do genoma eficaz em neurônios pós-mitóticos;

[0268] para o desenvolvimento de uma técnica de marcação nuclear que permita isolamento fácil de núcleos neuronais a partir de Cas9 e células expressando sgRNA;

[0269] uma demonstração de aplicações na direção de análise de RNAseq de transcriptoma neuronal;

[0270] como estudos eletrofisiológicos e outras técnicas podem ser integrados com perturbação do genoma mediada por Cas9 para se determinarem mudanças fenotípicas; e

[0271] uma demonstração de direcionamento de multiplex e a capacidade de estudar a função de genes em comportamento de roedores usando edição do genoma mediada por Cas9.

[0272] Com base nisto pode ser visto que o Exemplo 39 provê prova de conceito adicional em duas áreas principais: no entendimento e teste a função de genes, incluindo a criação e teste de modelos; e em terapia de genes.

[0273] Um aspecto adicional, discutido adicionalmente em baixo, é em relação a um método para Marcação Nuclear.

[0274] Será apreciado que a referência a sistemas CRISPR-Cas9 aqui é uma abreviatura para referência às enzimas Cas9 providas aqui em combinação com ou guias ou guias usados para visar uma ou mais sequências genômicas. A referência a guia(s) inclui sgRNA, bem como as sequências de polinucleotídeos quiméricas descritas aqui que compreendem as sequências guias capazes de hibridar com sequências alvo no genoma do sujeito, uma sequência tracr mate e uma sequência tracr.

[0275] Os dados mostram essencialmente mudanças fenotípicas resultando do silenciamento de genes usando dois sistemas CRISPR-Cas9 separados de acordo com a invenção (RNA guia em combinação com uma enzima Cas9), em este caso para perturbar com sucesso a função de genes. O tecido escolhido foi tecido do cérebro, mas os resultados provêm prova de princípio para uma ampla gama de tecidos pós-mitóticos. Esta é uma distinção importante, porque o trabalho prévio se tem focado em células em divisão ( i.e., pré-mitóticas).

[0276] Por outras palavras, ao passo que SpCas9 tem sido amplamente usada para manipular células em divisão, os Requerentes demonstramos que SpCas9 pode ser também usada para manipular o genoma de neurônios pós-mitóticos. Isto é feito com elevada eficácia através de geração de indel mediada por NHEJ para criar silenciamentos, mas usos terapêuticos envolvendo correção através do mecanismo HDR (após prover um molde de reparação) são também pretendidos. Ambos estão dependentes da aplicação bem-sucedida e expressão funcional da Cas9 e guia ou guias de RNA, o que é mostrado aqui.

[0277] O fato de que as mudanças genotípicas induzidas pelos sistemas CRISPR-Cas9 resultam depois em uma mudança fenotípica é também importante para ambas as áreas acima (função de genes e terapia de genes).

[0278] O primeiro sistema CRISPR-Cas9 empregou sequências guia dirigidas a (visando) Mecp2. Um sistema CRISPR-Cas9 de vetor dual, com um vetor compreendendo o guia e um compreendendo a Cas9, foi empregue com sucesso mostrando prova de princípio adicional para tais sistemas de vetor dual. O sistema CRISPR-Cas9 de vetor dual foi aplicado com sucesso, através de injeção estereotáxica, a duas localizações separadas no cérebro, especialmente o giro denteado do Hipocampo e o córtex visual. Em ambos os casos foi vista perturbação de genes do mesmo gene, Mecp2, indicando que o sistema de vetor dual foi aplicado com sucesso e atuou como esperado, com transcrição e atividade funcional na enzima Cas9 (em este caso, uma SpCas9), e recrutamento com sucesso da Cas9 para a sequência alvo genômica pelas sequências guia.

[0279] A aplicação in vivo mediada por AAV de SpCas9 e sgRNA provê uma tecnologia rápida e poderosa para alcançar perturbações genômicas precisas dentro de circuitos neuronais intactos . Como tal, o vetor usado foi um vetor AAV, adicionando evidência adicional quanto ao seu uso em geral e em sistemas CRISPR-Cas9 de vetor dual em particular, especialmente em células e tecidos pós-mitóticos, e em particular no cérebro.

[0280] Será obviamente apreciado que a escolha de promotor é importante no alcance de expressão a partir do sistema CRISPR-Cas9, em particular a Cas9 ou ambos os guia(s) e Cas9. Exemplos adequados para especificidade quanto à etapa da célula ou ciclo de vida da célula podem ser determinados a partir da literatura. Não obstante, alguns exemplos não limitantes incluem: TBG, um promotor específico do fígado e é usado aqui para conduzir a expressão de SaCas9; o promotor H1; um promotor H1 truncado; o promotor U6. Igualmente, como os guias não necessitam necessariamente de um promotor específico, um ou mais guias poderiam similarmente involucrados em um/no íntron de Cas9.

[0281] O segundo sistema CRISPR-Cas9 usado incluiu uma abordagem de multiplex. Uma vantagem-chave do sistema SpCas9 é a sua capacidade de facilitar a edição do genoma em multiplex. Este segundo sistema visou com sucesso três ou mais genes da mesma família (em este caso, Dmnt1, 3a e 3b) por inclusão de guias adequados e resultou em silenciamentos estáveis de múltiplos genes. Isto tem implicações amplas para sondagem da função de não só genes individuais, mas também famílias de genes inteiras, nos tecidos de animais vivos. Isto é particularmente importante para tecidos tais como o cérebro onde isto não foi possível antes, ou poderia ser somente alcançado através de anos longos de genética clássica. Os Requerentes mostraram que pode ocorrer perturbação de gene único ou múltiplos (mesmo silenciamento completo) em células pós-mitóticas em um animal normal. No entanto, isto poderia igualmente se aplicar a um organismo modelo (por exemplo, um já transportando um mutação ou perturbação de gene ou compreendendo expressão alterada de algum tipo) ou um organismo transgênico, constituindo uma alternativa rápida a métodos existentes de produção de organismos modelo e uso de organismos modelo para entender a função de genes. Poderiam ser empregues guias adicionais (e/ou sistemas CRISPR-Cas9 inteiros) para fazer rondas posteriores de perturbações e/ou restabelecimentos de genes (restauração da função de genes por exemplo por correção do gene perturbado através do prover, por exemplo, de um molde de reparação, tal como ssDNA adequado para HDR) dentro do mesmo organismo.

[0282] De fato, em geral, o direcionamento mediado por SpCas9 de genes únicos ou múltiplos pode recapitular fenótipos morfológicos, eletrofisiológicos, e comportamentais observados usando modelos de camundongo genéticos mais morosos, clássicos.

[0283] Alternativamente ao silenciamento de famílias de genes inteiras ou genes relacionados, os dados aqui provêm também prova de princípio de que o silenciamento simultâneo de três ou mais genes não relacionados é igualmente praticável. Isto é aplicável ao longo de todos os tecidos, mas é particularmente fortemente apresentado no que diz respeito a tecidos pós-mitóticos, especialmente o cérebro.

[0284] Outro aspecto útil do trabalho é que mostrou que uma abordagem combinada, ou integrada, poderia ser tomada para se estudar a função de genes, empregar CRISPR para efetuar uma mudança genotípica e depois usar ferramentas clássicas tais como eletrofisiologia (particularmente relevante para o cérebro e tecido do CNS), leituras bioquímicas, de sequenciação, eletrofisiológicas, e/ou comportamentais para estabelecer que, se algumas, mudanças fenotípicas resultam da mudança genotípica induzida pelo sistema CRISPR-Cas9. Por exemplo, no cérebro, isto permite-nos estudar a função de genes individuais bem como grupos de genes em processos neurais e seus papéis em distúrbios do cérebro in vivo.

[0285] A perturbação de genes bem-sucedida de genes em este trabalho é igualmente aplicável à correção ou restabelecimento da função de genes, i.e., o uso de sistemas CRISPR-Cas9 em terapia de genes. Isto é particularmente em relação ao direcionamento de células pós-mitóticas, especialmente o cérebro.

[0286] Em geral, o uso de sistemas CRISPR-Cas9 mostra melhorias em relação a técnicas existentes tais como dedos de Zn, que demoram muito a desenhar e produzir e não podem multiplexar, e shRNA, que tem demasiados efeitos fora do alvo ao passo que os efeitos fora do alvo de CRISPR podem ser minimizados pelo uso de abordagens de nickase dupla.

[0287] Direcionamento de Tecidos

[0288] O trabalho aqui apoia o uso de sistemas CRISPR- Cas9 para visar genes em células pós-mitóticas através da aplicação do sistema CRISPR-Cas9 à localização apropriada (i.e., a células dentro dos órgãos ou tecidos de interesse). Tecidos preferenciais estão dentro dos seguintes órgãos:

[0289] Rim;

[0290] Sistema Digestivo incluindo o estômago, pâncreas, duodeno, íleo e/ou cólon;

[0291] Coração;

[0292] Pulmão;

[0293] Cérebro, em particular neurônios, e/ou CNS em geral;

[0294] Olho, incluindo tecido retinal;

[0295] Ouvido, incluindo o ouvido interno;

[0296] Pele;

[0297] Músculo;

[0298] Osso; e/ou

[0299] Fígado em geral.

[0300] Será apreciado que muitos dos acima podem compreender células pré-mitóticas, mas que este aspecto da invenção está dirigido a células pós-mitóticas ou tecidos dentro desses órgãos.

[0301] Em particular, os Requerentes preferem que o órgão seja o rim ou o cérebro. Dentro do cérebro, os dados mostram especificamente aplicação ao giro denteado do Hipocampo e ao córtex visual, que são tecidos preferenciais, embora outros tecidos incluindo qualquer um ou mais dos seguintes: córtex motor primário, córtex auditivo primário, córtex somatossensorial primário, cerebelo, bulbo olfativo principal, córtex pré-frontal, núcleo endopiriforme, amígdala, substância negra, estriado, pálio, tálamo, hipotálamo, núcleo Parabranquial, complexo olivar superior, núcleo coclear, núcleo mamilar, sejam também preferenciais em algumas formas de realização.

[0302] Células do cérebro, e neurônios em particular, são especialmente preferenciais.

[0303] A escolha de promotor para conduzir a expressão do sistema CRISPR-Cas9, especialmente a Cas9, é importante, como mencionado acima. Para ser considerados quando se seleciona um promotor são a etapa de ciclo de célula (inicial/posterior) e o tipo de célula pois os promotores serão específicos para um de mais tipos de célula e etapas de ciclo de célula. Os promotores adequados podem incluir qualquer um ou mais dos seguintes, em algumas formas de realização:

[0304] O sistema CRISPR-Cas9 de vetor dual usado no direcionamento do cérebro, em particular o giro denteado do Hipocampo, involucrou os cassetes de expressão de SpCas9 e sgRNA em dois vetores virais separados. Cas9s, em particular SpCas9s, são portanto preferencialmente aplicadas por vetores adenovirais, especialmente AAV (i.e., como AAV-SpCas9). Os guias são preferencialmente aplicados como cassetes de expressão de sgRNA por vetores adenovirais, especialmente AAV (i.e., como AAV-SpGuia). Uma rota preferencial para este tecido (o giro denteado do Hipocampo) e para o cérebro em geral é injeção estereotáxica.

[0305] Entendimento e Teste Da Função de Genes, E A Criação E Uso de Modelos Para Fazer Tal

[0306] As afecções que poderiam ser investigadas incluem Huntington, mas incluem essencialmente qualquer afecção encontrada em células pós-mitóticas e especialmente aquelas que possam beneficiar de ser estudadas in vivo ou não têm um modelo útil.

[0307] Como mencionado acima podem ser usados sistemas CRISPR-Cas9 para interrogar a função de um ou mais genes em células pós-mitóticas. Isto pode ser alcançado através de aplicação e expressão do sistema CRISPR-Cas9 à célula pós- mitótica, em que o(s) guia(s) do sistema CRISPR-Cas9 é(são) desenhado(s) para recrutar(em) a Cas9 para o local ou locais genômicos de interesse. Igualmente, onde a Cas9 está já compreendida dentro da célula pós-mitótica, forma de proteína (transcrita), então a aplicação dos guias à célula pós- mitótica será suficiente. Onde a Cas9 está já compreendida dentro da célula pós-mitótica, em polinucleotídeo (não transcrito), então a aplicação dos guias à célula pós-mitótica bem como a indução da transcrição do polinucleotídeo Cas9 serão necessárias. Ter a Cas9 sob o controle de um promotor induzível ou repressível, tal como o sistema on-off tet (tetraciclina), pode ser vantajoso aqui.

[0308] Um aspecto que é particularmente promissor é a integração de técnicas CRISPR com ensaios fenotípicos para se determinarem mudanças fenotípicas, se algumas, resultando de perturbações de genes, especialmente silenciamentos. Por exemplo, o Exemplo 39 mostra o que pode ser alcançado com perturbações genômicas dirigidas acopladas com leituras quantitativas para prover conhecimentos sobre a função biológica de elementos genômicos específicos. Em particular, a edição do genoma in vivo mediada por Cas9 no cérebro pode ser também acoplada ao registro eletrofisiológico para estudar os efeitos da perturbação genômica em tipos de células ou componentes de circuito específicos. Em um sentido mais amplo, o uso dos sistemas CRISPR-Cas9 (para prover perturbações genômicas mediadas por Cas9) pode ser combinado com análise bioquímica, de sequenciação, eletrofisiológica, e comportamental para estudar a função do elemento genômico visado.

[0309] Assim sendo, em um aspecto, é provido: um método de interrogação da função de um ou mais genes em uma célula pós-mitótica, compreendendo:

[0310] indução de um genótipo deficiente ou silenciamento de gene como descrito em baixo; e

[0311] determinação de mudanças na expressão de um ou mais genes na afecção interrogando deste modo a função do um ou mais genes.

[0312] Opcionalmente, o método pode também incluir:

[0313] transplante da segunda população de células no sujeito induzindo deste modo a afecção associada ao genótipo deficiente ou silenciamento de gene. Isto pode ser antes do passo de determinação.

[0314] O que se segue se aplica amplamente a aspectos apropriados da invenção. A célula pode estar em um sujeito, tal como um humano, animal ou organismo modelo, tal que a função de genes seja interrogada in vivo. No entanto é também pretendido que a célula possa estar ex vivo, por exemplo em uma cultura de células ou em um órgão ou organoide modelo. Em algumas formas de realização, o método pode incluir isolamento de uma primeira população de células do sujeito, sua cultura opcional e sua transdução com um ou mais sistemas CRISPR-Cas9. Pode se seguir cultura opcional adicional. O transplante das células transduzidas de volta para o sujeito pode depois ocorrer.

[0315] A célula pode ser de qualquer um dos tecidos ou órgãos descritos aqui. O cérebro é um exemplo preferencial, provendo o referido método de interrogação da função de um ou mais genes, em que a célula pós-mitótica é uma célula do cérebro, por exemplo um neurônio. Particularmente in vivo, isto permite a interrogação da função de genes em relação ao comportamento animal. O animal é preferencialmente um mamífero, por exemplo um roedor. Dada a complexidade do sistema nervoso, que consiste em redes intricadas de tipos celulares heterogéneo, ser-se capaz de editar eficazmente o genoma de neurônios in vivo permite o teste direto da função de genes em tipos celulares relevantes em contextos nativos. Isto é apoiado pelos dados dos Requerentes onde camundongos nocaute mostram consolidação da memória deficiente quando testados sob condições de contexto de treino. Os resultados dos Requerentes demonstram que o silenciamento de membros da família DNMT mediado por CRISPR-Cas9 em neurônios do giro denteado é suficiente para sondar a função de genes em tarefas comportamentais.

[0316] Isto mostra a versatilidade de Cas9 na facilitação de silenciamento de genes visados no cérebro de mamífero in vivo, para estudo das funções de genes e, em particular, para dissecção de circuitos neuronais. A introdução de silenciamentos estáveis de múltiplos genes no cérebro de animais vivos terá aplicações potencialmente vastas, tais como interrogação causais de mecanismos multigênicos em afecções fisiológicas e neuropatológicas.

[0317] A especificidade deste trabalho é que os Requerentes escolheram o promotor Mecp2 de camundongo (235 pb, pMecp2)7 e um sinal de poliadenilação mínimo (48 pb, spA) com base na sua capacidade de alcançar níveis suficientes de expressão de SpCas9 em neurônios corticais de camundongo primários cultivados. O gene Mecp2 desempenha um papel principal na síndrome de Rett, um tipo de distúrbio do espectro do autismo. Para visar Mecp2, os Requerentes desenharam em primeiro lugar vários sgRNAs visando o éxon 3 do gene Mecp2 de camundongo e avaliámos a sua eficácia usando células Neuro- 2a. O sgRNA mais eficaz foi identificado usando o ensaio de nuclease SURVEYOR. A aplicação foi através de injeção estereotáxica de uma mistura (razão 1:1) de AAV-SpCas9 e AAV- SpGuia de elevado título. Os Requerentes testaram também com sucesso a possibilidade de edição do genoma em multiplex no cérebro e os Requerentes desenharam um vetor de expressão de sgRNA em multiplex consistindo em três sgRNAs em tandem, em conjunto com GFP-KASH para marcação de núcleos.

[0318] Assim sendo são também providos métodos de indução de afecções caracterizados por um ou mais silenciamentos de genes em uma célula pós-mitótica. Exemplos de tais afecções são numerosos, mas podem incluir síndrome de Rett, como exemplificado. Promotores adequados serão aparentes, e o promotor Mecp2 é ideal para a síndrome de Rett. Um modo de selecionar um promotor para conduzir a expressão do sistema CRISPR-Cas9, em particular a Cas9, é selecionar o promotor para o gene de interesse.

[0319] Assim sendo, em um aspecto, é provido: um método de indução de afecções caracterizadas por um ou mais genes (ou genótipos) deficientes ou silenciamentos de genes em uma célula pós-mitótica, que pode compreender:

[0320] transdução de uma primeira população de células com uma composição de ocorrência não natural ou manipulada compreendendo um sistema de vetores compreendendo um ou mais vetores compreendendo

[0321] um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de polinucleotídeos de RNA quimérico (chiRNA) de sistema CRISPR-Cas, em que a sequência de polinucleotídeos compreende

[0322] uma, duas, três, quatro ou mais sequências guia capazes de hibridar com três ou mais sequências alvo no genoma do sujeito,

[0323] uma sequência tracr mate, e

[0324] uma sequência tracr, e

[0325] um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de enzima codificando uma enzima CRISPR compreendendo pelo menos uma ou mais sequências de localização nuclear (NLSs), em que (a), (b) e (c) são arranjados em uma orientação 5' para 3',

[0326] em que os componentes I e II estão localizados nos mesmos ou em diferentes vetores do sistema, em que, quando transcrita, a sequência tracr mate hibrida com a sequência tracr e a sequência guia dirige a ligação específica da sequência de complexos CRISPR com a sequência alvo,

[0327] em que o complexo CRISPR compreende a enzima CRISPR complexada (1) a sequência guia que é hibridada com a sequência alvo, e (2) a sequência tracr mate que é hibridada com a sequência tracr,

[0328] em que a enzima CRISPR altera o genoma da primeira população de células para se obter uma segunda população de células transportando o um ou mais genes deficientes ou genes silenciados.

[0329] Opcionalmente, o método pode também incluir:

[0330] isolamento de uma primeira população de células do sujeito.

[0331] Opcionalmente, o método pode também incluir:

[0332] transplante da segunda população de células no sujeito induzindo deste modo a afecção proliferativa.

[0333] Isto pode envolver indução de um genótipo não funcional (que inclui particularmente não funcional) na célula alvo, para deste modo prover um modelo para estudo (incluindo restauração future do genótipo funcional).

[0334] Sistemas CRISPR-Cas9 podem ser também usados para facilitar o estudo de funções de genes em ensaios celulares permitindo silenciamento dirigido em neurônios pós- mitóticos.

[0335] Métodos para aplicação de nucleotídeos a células neuronais são bem conhecidos e revistos em The Journal of Neuroscience, por Karra e Dahm (5 de maio de 2010, 30(18): 6171-6177; doi: 10.1523/JNEUROSCI.0183-10.2010). Exemplos incluem métodos de transfecção elétrica (tais como eletroporação, nucleofecção, e eletroporação de célula única); métodos de transfecção química (tais como coprecipitação de fosfato de Ca2+ e lipofecção); aplicação viral (tal como Adenoviral, Vírus Adenoassociado (AAV), Vírus Lentiviral e Herpes); e métodos de transfecção física (tais como microinjeção e biolística (partículas de ouro revestidas com DNA)). Todos estes podem ser usados para aplicação do sistema CRISPR-Cas9, mas a lipofecção ou métodos virais são preferenciais, especialmente AAV ou Lentiviral.

[0336] Modelos

[0337] São providos modelos com genes únicos ou múltiplos silenciados. Um exemplo seria um modelo de roedor da síndrome de Rett, um silenciamento de Mecp2. Outros incluem silenciamentos da família Dmnt, especificamente silenciamentos de Dmnt1, 3a e 3b. Como tal são providos modelos estudando afecções neurológicas. Tudo o que necessita de ser feito é identificar os genes de interesse alvo, desenhar guia(s) adequado(s) e incluir estes em um sistema CRISPR-Cas9 adequado e aplicá-lo à(s) célula(s) pós-mitótica(s) in vivo ou ex vivo, como requerido. Por exemplo, os modelos podem ter morfologia da árvores dendrítica eou densidade espinal alterados são providos.

[0338] Como mencionado acima são também providos tecidos de modelos, tais como organoides ou “Fígado em um chip” ou seus equivalentes não de fígado tais como tecidos de ouvido, rim e cérebro, por exemplo em um chip ou suportado em umsuporte. Modelos animais e tecidos de modelo são preferenciais. Estes podem estar já transformados com Cas9 tal que compreendam Cas9 em forma de nucleotídeo ou proteína, como mencionado acima. Estes têm a vantagem que Cas9 não necessita de ser aplicada em conjunto com o(s) guia(s) e isto por seu turno permite um grau muito maior de multiplexação (de guia) a ser acomodado dentro dos vetores de aplicação. Novamente, o uso de sistemas induzíveis ou repressíveis tais como tet-on ou tet-off pode ser vantajoso aqui.

[0339] Todos estes modelos são obteníveis usando o sistema CRISPR-Cas9 como descrito acima. Devido à versatilidade do sistema CRISPR-Cas9, a gama de modelos possíveis, de humano, roedor, mamífero ou outro, é altamente diversa e isto pode ser estabelecido por simples seleção de guia(s) apropriados. Métodos de criação de tais modelos são também providos compreendendo

[0340] Terapia de Genes

[0341] Os dados no Exemplo 39 se focam na perturbação de genes, principalmente silenciamento. É provável que o silenciamento de genes seja somente uma pequena, se importante, parte do quórum total de aplicações possíveis de sistemas CRISPR-Cas9 à terapia de genes. Como já mostrado no artigo de Yin e Anderson (Nature Biotech 2884 publicado online 30 de março de 2014), um fenótipo funcional pode ser restaurado após correção de uma mutação deficiente na tirosinemia hereditária de tipo I (HTI), uma afecção de outro modo fatal causada por mutação da fumarilacetoacetato hidrolase (FAH) (G para A no ultimo nucleotídeo no éxon 8) que causa skipping do éxon 8 durante o processamento e resulta na formação de uma proteína FAH instável, truncada, levando ao acúmulo de metabolitos tóxicos. A correção da mutação A de volta para o genótipo G de tipo selvagem resultou em um fenótipo restaurado.

[0342] Como tal, as abordagens tomadas aqui demonstram que a presente invenção pode ser plausivelmente aplicada à terapia de genes. Em particular, a abordagem de vetor dual, a abordagem de marcação nuclear, a especificidade da aplicação ao cérebro (a forma de injeção, os promotores e/ou vetores virais usados), bem como a multiplexação (uso de múltiplos guias para múltiplos alvos dentro dos mesmos ou dentro de diferentes genes) poderiam ser igualmente aplicadas à terapia de genes corretiva (i.e., onde um genótipo deficiente é corrigido) quanto ao silenciamento de gene exemplificado. A principal diferença entre terapia de genes corretiva e silenciamento de genes é que, de modo a corrigir um genótipo deficiente, tal como uma mutação pontual (por exemplo na Fibrose Cística, ver ref Schwank et al., Cell Stem Cell 13, 653-658 5 dez 2013), é vantajoso prover um molde de reparação para estimular o mecanismo HDR e prover idealmente uma Cas9 nickase adequada também.

[0343] Conformemente, os presentes vetores visam preferencialmente células pós-mitóticas. Onde o guia ou guias visam um genótipo deficiente são preferencialmente providos com um molde de reparação, por exemplo ssDNA correspondendo à sequência corrigida (Ium genótipo provendo fenótipo funcional). Moldes de reparação são descritos aqui. A Cas9 pode ser provida no mesmo ou em um diferente vetor do guia ou guias. Os vetores são preferencialmente vetores virais, mais preferencialmente vetores adenovirais e o mais preferencialmente vetores AAV. A aplicação às células é preferencialmente por injeção intravenosa ou por injeção estereotáxica, como apropriado. A seleção do promotor pode ser também importante e exemplos vantajosos são providos aqui.

[0344] Métodos de tratamento de doenças ou afecções genéticas causadas por, ou associadas a, um genótipo deficiente em células pós-mitóticas são providos, compreendendo aplicação do sistema CRISPR-Cas9 à célula apropriada. Um genótipo deficiente pode ser o genótipo não de tipo selvagem. Em particular, mutações pontuais únicas e/ou distúrbios monogênicos são especialmente adequados para tratamento usando sistemas CRISPR-Cas9. Onde múltiplos genes requerem edição ou correção, então uma abordagem em multiplex pode ser usada para os visar a todos simultaneamente. Alternativamente, duas ou mais rondas de diferentes sistemas CRISPR-Cas9 poderiam ser previstas. Preferencialmente, o genótipo de tipo selvagem é corrigido. Não necessita necessariamente de ser o genótipo mais comum, contanto que a função seja restaurada ou melhorada no fenótipo.

[0345] Um exemplo de um fenótipo restaurado é a restauração da audição para restaurar a função de VGLUT3 e consequentemente a audição no ouvido interior de camundongos (Omar Akil, Rebecca P. Seal, Kevin Burke, Chuansong Wang, Aurash Alemi, Matthew During, Robert H. Edwards, Lawrence R. Lustig. Restoration of Hearing in the VGLUT3 Knockout Mouse Using Virally Mediated Gene Therapy. Neuron, 2012; 75 (2): 283 DOI: 10.1016/j.neuron.2012.05.019). Isto foi usando aplicação do próprio VGLUT3 mediada por AAV, mas é inteiramente plausível que o sistema CRISPR-Cas9 poderia ser também usado, preferencialmente usando também vetores AAV, para visar as células do ouvido interno e corrigir o genótipo de VGLUT3 não funcional, com consequências fenotípicas similares, nomeadamente restauração da audição. Como tal, a aplicação do sistema CRISPR-Cas9 ao ouvido interno, preferencialmente usando vetores AAV, é preferencial, tratando deste modo a perda de audição. De fato, a restauração da função de genes em órgãos sensoriais tais como o olho, incluindo a retina, nariz e ouvido (particularmente o ouvido interno) é preferencial.

[0346] Uma visão global relativamente recente, que inclui uma discussão de distúrbios em tecidos pós-mitóticos (olho, ouvido e além) é Kaufmann et al. (EMBO Mol Med (2013), 5, p1642-1661). Isto confirma a utilidade de AAV na correção de distúrbios monogênicos em tecidos pós-mitóticos. Declara que “em combinação com outras características tais como baixa atividade inflamatória mostraram ter um excelente perfil de segurança e são portanto ferramentas altamente atrativas para terapia de genes in vivo. De fato, Glybera® é um AAV recombinante para injeção intramuscular^”. O artigo, com citações, revê a terapia de genes na retina, sistema nervoso central, fígado, músculo esquelético e cardiac como tecidos alvo. E, com citações, indica que “estudos iniciais exploraram o vetor de serótipo 2 de AAV protótipo, o portfólio de vetores AAV foi recentemente expandido para incluir serótipos adicionais e mesmo capsídeos manipulados”. Kaufmann e os documentos citados em Kaufmann são deste modo incorporados aqui por referência.

[0347] Análise RNAseq do Transcriptoma

[0348] A combinação de perturbação do genoma mediada por SpCas9 e análise RNAseq do nível de população provê uma maneira de caracterizar a regulação transcricional e sugerir genes que possam ser importantes para funções ou processos de doença específicos nas células sob consideração. Em particular, as células são do cérebro, em particular nuerônios. Técnicas de atuação rápida tais como um sistema CRISPR-Cas9 são vantajosas no estudo do transcriptoma, que é, pela sua natureza, transiente. Como tal, o uso de sistemas CRISPR-Cas9 de acordo com a presente invenção na análise do transcritpma (RNAseq) é provido.

[0349] Método de Marcação Nuclear

[0350] Para facilitar a identificação por imunofluorescência de neurônios expressando SpCas9, os Requerentes marcaram SpCas9 com um marcador de epítopo de HA (derivado de hemaglutinina da gripe humana, um marcador de epítopo geral amplamente usado em vetores de expressão).

[0351] Para o vetor AAV-SpGuia, os Requerentes involucraram um cassete de expressão U6-sgRNA bem como a proteína fluorescente verde (GFP) fundida com o domínio transmembramar nuclear KASH conduzido pelo promotor de Sinapsina I humano. A proteína de fusão GFP-KASH dirige a GFP para a membrana nuclear externa e permite a identificação à base de fluorescência e purificação de núcleos neuronais intactos transduzidos por AAV-SpGuia.

[0352] Conformemente, os vetores da presente invenção são preferencialmente adaptados de um modo similar. Assim sendo, os vetores são providos em que a Cas9 está marcada com um marcador de epítopo, tal como o marcador de epítopo HA. A Cas9 pode ser qualquer uma das Cas9 descritas aqui, por exemplo Sp ou SaCas9 e pode ser qualquer variante (tal como nickase dupla D10A, etc.), contanto que esteja ou possa ser apropriadamente marcada.

[0353] Os vetores da presente invenção podem ser também adaptados tal que o RNA guia seja involucrado dentro de um cassete de expressão, que comprende:

[0354] uma proteíma repórter; e

[0355] opcionalmente, um promotor adequado para o RNA guia, tal como U6;

[0356] em que a proteína repórter está fundida com um domínio transmembranar nuclear operacionalmente ligado a um promotor adequado para ele.

[0357] A proteína repórter é preferencialmente uma proteína fluorescente, por exemplo uma de proteínas verdes, vermelhas ou amarelas (GFP, RFP, YFP) e assim por diante.

[0358] Exemplos de domínios transmembranas nucleares incluem os domínios tipo KASH, domínios Sun2, domínios LEM. Em algumas formas de realização preferenciais, o domínio transmembranar nuclear é a transmembrana nuclear KASH. Preferencialmente, o promotor para o domínio transmembranar é o promotor de Sinapsina I humano; ver também documentos citados aqui.

[0359] Esta abordagem de marcação pode ser usada dentro de sistemas de vetores únicos ou duais, mas preferencialmente dentro de sistemas de vetores duais pois o espaço é limitado em sistemas de vetores únicos e a necessidade de marcadores separados diminuída também.

[0360] Além do mais, cada aspecto desta técnica de marcação pode ser usado independentemente do outro, tal que a marcação de epítopo da Cas9 possa ser usada sozinha, ou a abordagem de cassete de proteína reporter/fluorescente possa ser usada sozinha, ou mais preferencialmente ambas possam ser usadas em conjunto.

[0361] Kanasty e Anderson (Nature Materials, Vol 12 nov 2013) é uma revisão útil, inicialmente submetida a 11 de março de 2013 e publicada online a 23 de outubro de 2013, da aplicação de RNAi. Devido às similaridades entre sequências de RNAi e guia CRISPR, o ensinamento desta e outra técnica no que diz respeito a RNAi é informativo quanto aos mecanismos de aplicação dos guias no sistema CRISPR-Cas9 dos Requerentes. Algumas das técnicas descritas podem ser também adequadas para aplicação da Cas9 também. Em algum caso pode ser útil aplicar os guias do sistema CRISPR-Cas9 dos Requerentes separadamente da Cas9.

[0362] Isto pode ser como parte de um sistema de aplicação de vetores duais, onde os vetores são considerados à luz mais ampla como simplesmente qualquer meio de aplicação, ao invés de vetores especificamente virais. É previsto que a Cas9 possa ser aplicada através de um vetor viral e que guias específicos a alvos genômicos sejam separadamente aplicados. Como discutido aqui, os guias poderiam ser aplicados através dos mesmos tipos de vetores como a Cas9, por exemplo um sistema de vetores duais onde a Cas9 é aplicada em um vetor AAV e o(s) guia(s) é(são) aplicado(s) em um vetor AAV separado. Isto pode ser feito substancialmente contemporaneamente (i.e., codistribuição), mas poderia ser também feito em momentos separados no tempo, separados mesmo por semanas ou meses. Por exemplo, se uma primeira ronda de sistemas CRISPR-Cas9 ter sido aplicada, mas for subsequentemente requerido prover guias adicionais, então a Cas9 original que é esperançosamente ainda funcional nas células alvo pode ser reusada. Se a Cas9 estiver sob o controle de um promotor induzível, então a indução da transcrição de Cas9 nova nas células alvo é preferencial. Igualmente, se um modelo expressando Cas9 provido aqui for usado, então somente é necessária aplicação de guia(s). Conformemente, onde for requerida aplicação de guia(s) separadamente de Cas9, então pode ser aplicada de modo muito similar como RNAi.

[0363] Como tal, a revisão por Kanasty é útil em assinalar um número de abordagens conhecidas que são adequadas, com foco particular no fígado, embora os meios de aplicação sejam geralmente apropriados para uma ampla gama de células. Os exemplos incluem:

[0364] “O sistema de aplicação lipossomal, bem como siRNA conjugado com moléculas lipofílicas, interajem com lipoproteínas no soro e subsequentemente ganham entrada nos hepatócitos que absorvem essas lippoproteínas”;

[0365] PEGuilação;

[0366] Conjugados tais como:

[0367] Policonjugados Dinâmicos (DPCs, nanopartículas de 10 nm), que se mostrou que aplicam RNAi para suprimir com sucesso ApoB (cruzando deste modo com o trabalho dos Requerentes no direcionamento de ApoB através de um sistema CRISPR-Cas9); e

[0368] Conjugados de GalNAc triantenários

[0369] são “ambos altamente eficazes”, especialmente GalNAc;

[0370] Outras nanopartículas incluem:

[0371] Nanopartículas de Polímero de Ciclodextrina (CDP), incluindo componentes de formulação adicionais tais como adamantina-PEG (AD-PEG) e adamantina-PEG-transferrina (AD-PEG-Tf);

[0372] Nanopartículas de Lípidos (LNP), incluindo lípidos catiônicos ou ionisáveis, lípidos de proteção, colesterol e ligados de direcionamento endógenos ou exógenos. Um exemplo de um ligando de direcionamento endógeno é proteína de Ligação ao Retinol (RBP) útil para direcionamento de células estreladas hepáticas e pancreáticas, que expressam o receptor RBP. Um exemplo de um ligando de direcionamento exógeno é GalNac, que também visa o fígado através do receptor de asialoglicoproteína em hepatócitos. Uma abordagem combinada é vista em ALN-VSP da Alnylam;

[0373] “Fenestrações no endotélio do fígado permitem que moléculas com 100-200 nm em diâmetro se difundam para fora da corrente sanguínea e ganhem acesso aos hepatócitos e outras células do fígado”;

[0374] Ligandos tais como GalNAc são adequados para aplicação a células não parênquimais do fígado expressando o receptor de manose, e a hepatócitos onde se mostrou que a conjugação de siRNA adequado a um ligando GalNAc suprimia com sucesso PCSK9; e

[0375] Nanopartículas de oligonucleotídeo (ONPs) compostas por fragmentos de DNA complementar desenhados para hibridar em uma estrutura 3D pré-definida. Usando sequências de saliência 3', 6 fitas de siRNA poderiam ser anexadas a cada particular, mesmo em uma posição especificada. O diâmetro hidrodinâmico foi cerca de 29 nm.

[0376] Estas abordagens são preferenciais em algumas formas de realização para aplicação pelo menos dos guias para um sistema CRISPR-Cas9. São especialmente preferenciais Policonjugados Dinâmicos ou o uso de um ligando de direcionamento endógeno tal como proteína de Ligação ao Retinol ou ligandos de direcionamento exogenous tais como GalNac.

[0377] Ainda em outra forma de realização pode ser usada edição do genoma mediada por CRISPR-Cas9 para corrigir uma mutação e/ou fenótipo de doença. Essa edição do genoma mediada por CRISPR-Cas9 pode ser usada para corrigir uma mutação e/ou fenótipo de doença no fígado e/ou hepatócitos é ilustrada no manuscrito intitulado “Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype” por Hao Yin et al. publicado em Nature Biotechnology publicado online 30 de março 2014; corrigido online 31 de março de 2014, disponível no website nature.com/doifinder/10.1038/nbt.2884, incorporado aqui por referência na sua totalidade. O artigo se relaciona com correção mediada por CRISPR-Cas9 de uma mutação de Fah em hepatócitos em um modelo de camundongo da doença humana tirosinemia hereditária. Foi mostrado que a aplicação de componentes do sistema CRISPR-Cas9 por injeção hidrodinâmica resultou em expressão inicial da proteína Fah de tipo selvagem em ~1/250 células do fígado. Foi adicionalmente mostrado que a expansão de hepatócitos positivos quanto a Fah resgataram o fenótipo de perda de peso corporal.

[0378] Uma vantagem dos presentes métodos é aquele em que o sistema CRISPR evita a ligação fora do alvo e seus resultantes efeitos secundários. Isto é atingido usando sistemas arranjados para terem um elevado grau de especificidade de sequência para o DNA alvo.

[0379] Cas9

[0380] A otimização de Cas9 pode ser usada para aumentar a função ou para desenvolver novas funções, podendo gerar proteínas Cas9 quiméricas. Exemplos que os Requerentes geraram são fornecidos no Exemplo 6. As proteínas Cas9 quiméricas podem ser feitas combinando fragmentos de diferentes homólogas de Cas9. Por exemplo, dois exemplos das proteínas Cas9 quiméricas das Cas9s aqui descritas. Por exemplo, os Requerentes fundiram a extremidade N-terminal de St1Cas9 (o fragmento desta proteína está a negrito) com o termo- C de SpCas9. O benefício de fazer Cas9s quimérica inclui qualquer ou todos de: toxicidade reduzida; expressão melhorada em células eucarióticas; especificidade aumentada; redução do peso molecular da proteína, por exemplo, fazer a proteína mais pequena combinando os domínios mais pequenos a partir de diferentes homólogas de Cas9; e/ou alterando o requisito da sequência PAM.

[0381] A Cas9 pode ser usada como um DNA genérico ligando a proteína. Por exemplo, e como mostrado no Exemplo 7, os Requerentes usaram a Cas9 como um DNA genérico ligando a proteína por mutação dos dois domínios catalíticos (D10 e H840) responsáveis por clivarem ambas as cadeias do DNA alvo. A fim de regular positivamente a transcrição do gene nos locais alvo os Requerentes fundiram um domínio de ativação transcricional (VP64) a Cas9. São conhecidos outros domínios de ativação de transcrição. Como mostrado no Exemplo 17, a ativação da transcrição é possível. Como mostrado também no Exemplo 17, a repressão de gene (neste caso no gene beta- catenina) é possível usando um repressor de Cas9 (domínio de ligação a DNA) que se liga à sequência de genes alvo, assim reprimindo a sua atividade.

[0382] A Cas9 e um ou mais RNA guia podem ser aplicados usando adenovírus associado (AAV), lentivírus, adenovírus ou outros tipos de vetores de plasmídeos ou virais, em particular, usando formulações e formas de dosagem, por exemplo, as Patentes E.U.A. Nos. 8,454,972 (formulações, doses para adenovírus), 8,404,658 (formulações, doses para AAV) e 5,846,946 (formulações, doses para DNA de plasmídeos) e a partir de ensaios clínicos e publicações visando os ensaios clínicos envolvendo lentivírus, AAV e adenovírus. Por exemplos, para AAV, a via de administração, formulação e dose podem ser como na Patente E.U.A. No. 8,454,972 e como nos ensaios clínicos envolvendo AAV. Para Adenovírus, a via de administração, formulação e dose podem ser como na Patente E.U.A. No. 8,404,658 e como nos ensaios clínicos envolvendo adenovírus. Para aplicação de plasmídeos, a via de administração, formulação e dose podem ser como na Patente E.U.A. No. 5,846,946 e como nos estudos clínicos envolvendo plasmídeos. As doses podem ser baseadas em ou extrapoladas para um indivíduo de 70 kg em média, e podem ser ajustadas para pacientes, indivíduos, mamíferos de diferentes pesos e espécies. A frequência de administração está dentro do âmbito do especialista médico ou veterinário (por exemplo, médico, veterinário), dependendo de fatores usuais incluindo a idade, sexo, saúde geral, outras afecções do paciente ou indivíduo e a afecção particular ou sintomas a serem abordados.

[0383] Os vetores virais podem ser injetados no tecido de interesse. Para modificação do genoma específico da célula tipo, a expressão de Cas9 pode ser dirigida pelo promotor específico da célula tipo. Por exemplo, a expressão específica para fígado deve usar o promotor Albumina e a expressão específica para neurônio deve usar o promotor Sinapsina I.

[0384] Animais e plantas transgênicas

[0385] Os animais transgênicos (modelos) também são fornecidos e o que se segue se aplica igualmente a tecidos ou coleções de tecidos de modelo ex vivo, tais como organoides, fígado em um chip e assim por diante. Exemplos preferenciais incluem animais compreendendo Cas9, em termos de polinucleotídeos codificando Cas9 ou a própria proteína. camundongos, ratos e coelhos são preferenciais. Para gerar os camundongos transgênicos com as construções, como aqui exemplificado pode injetar-se DNA linear no pronúcleo de um zigoto de uma fêmea pseudo grávida, por exemplo uma fêmea CB56. Fundadores podem então ser identificados, genotipados, e retrocruzados para os camundongos CB57. As construções podem então ser clonadas e opcionalmente verificadas, por exemplo por sequenciação de Sanger. Estão previstas inativações onde por exemplo um ou mais genes são desativados em um modelo. No entanto, são também previstas reativações (sozinhas ou em combinação). Um exemplo de camundongo Cas9 reativada foi gerado e isto é exemplificado, mas as reativações Cas9 são preferenciais. Para gerar uma Cas9 reativada em camundongos se pode ter como alvo as mesmas construções constitutivas e condicionais a um local Rosa26, conforme aqui descrito (Figs. 25A-B e 26). Métodos das Publicações das Patentes E.U.A. Nos. 20120017290 e 20110265198 atribuídas a Sangamo BioSciences, Inc. dirigido para o local alvo Rosa podem ser modificados para utilizar o sistema CRISPR-Cas da presente invenção. Em outra forma de realização, os métodos da Publicação da Patente E.U.A. No. 20130236946 atribuída a Cellectis dirigidos para o local alvo Rosa podem ser modificados para utilizar o sistema CRISPR-Cas da presente invenção.

[0386] Utilidade do camundongo Cas9 condicional: Os Requerentes mostraram em 293 células que a construção de expressão condicional Cas9 pode ser ativada por coexpressão com Cre. Os Requerentes mostraram ainda que o R1 mESCs corretamente alvejado pode ter Cas9 ativa quando se expressa Cre. Porque a Cas9 é seguida pela Sequência petídica de clivagem P2A e então Requerentes EGFP identificam a expressão bem-sucedida observando EGFP. Os Requerentes mostraram a ativação de Cas9 em mESCs. Este mesmo conceito é que torna o camundongo Cas9 condicional útil. Os Requerentes podem cruzar o seu camundongo Cas9 condicional com um camundongo que expressa ubiquamente Cre (linha ACTB-Cre) e podem chegar ao camundongo que expressa Cas9 em todas as células. Deve ter-se apenas a aplicação do RNA quimérico para induzir a edição de genoma em camundongos embrionários ou adultos. Curiosamente, se o camundongo Cas9 condicional é cruzado com um camundongo expressando Cre sob um promotor específico de tecido, deve haver apenas Cas9 nos tecidos expressando também Cre. Esta abordagem pode ser usada para editar o genoma somente em tecidos precisos aplicando RNA quimérico ao mesmo tecido.

[0387] Como mencionado acima, animais transgênicos são também providos, como o são plantas transgênicas, especialmente culturas e algas. As plantas transgênicas podem ser úteis em aplicações fora do prover de um modelo de doença. Estas podem incluir produção de alimentos ou ração através da expressão de, por exemplo, níveis de proteínas, carboidratos, nutrientes ou vitaminas mais elevados do que seria normalmente visto no tipo selvagem. A este respeito, plantas transgênicas, especialmente leguminosas e tubérculos, e animais, especialmente mamíferos tais como gado (vacas, ovelhas, cabras e porcos), mas também aves domésticas e insetos comestíveis, são preferenciais.

[0388] Algas transgênicas ou outras plantas tais como colza podem ser particularmente úteis na produção de óleos vegetais ou biocombutíveis tais como álcoois (especialmente metanol e etanol), por exemplo. Estas podem ser manipuladas para expressarem elevados níveis de óleo ou álcoois para uso na indústrias de óleos ou biocombustíveis.

[0389] Adenovirus associados (AAV)

[0390] Em termos de aplicação in vivo, AAV tem vantagens sobre outros vetores virais por um par de razões:

[0391] Baixa toxicidade (isto pode ser devido ao método de purificação não requerendo ultra centrifugação das partículas celulares que podem ativar a resposta imune).

[0392] Baixa probabilidade de causar mutagênese de inserção porque não se integra no genoma do hospedeiro.

[0393] Os AAV têm um limite para se involucrarem de 4,5 ou 4,75 Kb. Isto significa que a Cas9 assim como um promotor e terminador de transcrição têm de ser todos ajustados no mesmo vetor viral. As construções maiores que 4,5 ou 4,75 Kb vão conduzir a produção de vírus significativamente reduzida. A SpCas9 é suficientemente larga, o próprio gene é mais de 4,1 Kb, o que se torna difícil de involucrar no AAV. Portanto formas de realização da invenção incluem utilizar homólogas de Cas9 que são mais curtos. Por exemplo:

[0394] Estas espécies são portanto, em geral, espécies de Cas9 preferenciais. Os Requerentes mostraram aplicação e dados de expressão in vivo de Cas9 de cérebro de camundongo.

[0395] Duas vias para involucrar Cas9 codificando moléculas de ácido nucleico, por exemplo, DNA, em vetores virais para mediar a modificação do genoma in vivo são preferenciais:

[0396] Para atingir inativação de genes mediada por NHEJ:

[0397] Vetor de vírus único:

[0398] Vetor contendo dois ou mais cassetes de expressão:

[0399] Promotor-Molécula de ácido nucleico codificando Cas9-terminador

[0400] Promotor-gRNA1-terminador

[0401] Promotor-gRNA2-terminador

[0402] Promotor-gRNA(N)-terminador (até ao limite de tamanho de vetor)

[0403] Vetor de vírus duplo:

[0404] Vetor 1 contendo um cassete de expressão para conduzir a expressão de Cas9

[0405] Promotor Cas9 codificando molécula de ácido nucleico Cas9-terminador

[0406] Vetor 2 contendo mais um cassete de expressão para conduzir a expressão de um ou mais RNAs guia

[0407] Promotor-gRNA1-terminador

[0408] Promotor-gRNA(N)-terminador (até ao limite de tamanho de vetor)

[0409] Para mediar reparação dirigida por homologia. Para além do vetor de vírus único e duplo das abordagens acima descritas, é usado um vetor adicional para fornecer um modelo de reparação direta de homologia.

[0410] O promotor utilizado para conduzir Cas9 codificando a expressão da molécula de ácido nucleico pode incluir:

[0411] AAV ITR pode servir como um promotor: isto é vantajoso para eliminar a necessidade para um elemento promotor adicional (que pode ocupar espaço no vetor). O espaço adicional liberado pode ser usado para dirigir a expressão de elementos adicionais (gRNA, etc.). Também, a atividade ITR é relativamente mais fraca, podendo assim ser usada para reduzir a toxicidade devida à sobre expressão de Cas9.

[0412] Para a expressão ubíqua, podem utilizar-se os promotores: CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, cadeias pesadas ou leves de Ferritina, etc.

[0413] Para a expressão no cérebro, podem utilizar-se os promotores: Sinapsina I para todos os neurônios, CaMKIIalfa para os neurônios excitadores, GAD67 ou GAD65 ou VGAT para neurônios GABAérgicos, etc.

[0414] Para a expressão no fígado, pode utilizar-se o promotor Albumina:

[0415] Para a expressão no pulmão, pode usar-se SP-B.

[0416] Para as células endoteliais, pode usar-se ICAM.

[0417] Para as células hematopoiéticas pode usar-se IFNbeta ou CD45.

[0418] Para Osteoblastos pode usar-se OG-2.

[0419] O Promotor usado para dirigir RNA guia pode incluir:

[0420] Promotores Pol III tais como U6 ou H1

[0421] Uso de promotor Pol II e cassetes intrônicos para expressar gRNA

[0422] Como para AAV, o AAV pode ser AAV1, AAV2, AAV5 ou qualquer combinação dos mesmos. Pode-se selecionar o AAV do AAV em relação às células a serem visadas; por exemplo, do de AAV podem selecionar-se os serotipos 1, 2, 5 ou um híbrido ou AAV1, AAV2, AAV5 de capsídeo ou qualquer combinação dos mesmos para visar células cerebrais ou neuronais; e pode-se selecionar o AAV4 parar atingir tecido cardíaco. AAV8 é útil para aplicação ao fígado. Os promotores e vetores acima são preferenciais individualmente.

[0423] A aplicação de RNA é também um método útil para aplicação in vivo. A Figura 27 mostra dados de aplicação e expressão de Cas9 em cérebro de camundongo in vivo. É possível distribuir Cas9 e gRNA (e, por exemplo, modelo de reparação HR) em células usando lipossomos ou nanopartículas. Assim a aplicação da enzima CRISPR, tal como uma Cas9 e/ou aplicação dos RNAs da invenção podem ser na forma RNA e através de microvesículas, lipossomos ou nanopartículas. Por exemplo, Cas9 mRNA e gRNA podem ser involucrados em partículas lipossômicas para aplicação in vivo. Reagentes de transfecção lipossômica tal como lipofectamina da Life Technologies e outros reagentes do mercado pode distribuir eficientemente moléculas de RNA no fígado.

[0424] Melhorar a eficiência NHEJ ou HR é também útil para a aplicação. É preferencial que a eficiência NHEJ seja aumentada por enzimas coexpressando o processamento de terminação tal como Trex2 (Dumitrache et al. Genetics. 2011 agosto; 188(4): 787-797). É preferencial que a eficiência de HR seja aumentada transientemente por inibir maquinarias NHEJ tais como Ku70 e Ku86. A eficiência de HR pode também ser aumentada coexpressando enzimas de recombinação homóloga procarióticas ou eucariótica tal como RecBCD, RecA.

[0425] Vários meios de aplicação são aqui descritos, e discutidos adicionalmente nesta seção.

[0426] Aplicação viral: A enzima CRISPR, por exemplo a Cas9, e/ou qualquer dos presentes RNAs, por exemplo um RNA guia, podem ser aplicados usando adeno vírus associado (AAV), lentivírus, adenovírus ou outros tipos de vetores virais, ou combinações destes. Cas9 e um ou mais RNAs guia podem ser involucrados em um ou mais vetores virais. Em algumas formas de realização, o vetor viral é distribuído ao tecido de interesse através de, por exemplo, uma injeção intramuscular, enquanto outras vezes a aplicação de vírus é por via intravenosa, transdérmica, intranasal, oral, mucosa, ou outros métodos de aplicação. Essa aplicação pode ser ou por uma única dose, ou doses múltiplas. Um habilitado na arte compreende que a dosagem atual a ser distribuída aqui pode variar grandemente dependendo da variedade de fatores, tais como vetores escolhidos, a célula, organismo, ou tecido alvo, a afecção geral do indivíduo a ser tratado, o grau de transformação/modificação almejado, a via de administração, o modo de administração, o tipo de transformação/modificação almejado, etc.

[0427] Tal dosagem pode ainda conter, por exemplo, um veículo (água, solução salina, etanol, glicerol, lactose, sacarose, fosfato de cálcio, gelatina, dextrano, agar, pectina, óleo de amendoim, óleo de sésamo, etc.), um diluente, um veículo farmaceuticamente aceitável (por exemplo, salino tamponado com fosfato), um excipiente farmaceuticamente aceitável, e/ou outros compostos conhecidos na técnica. Uma tal formulação de dosagem é prontamente determinável por um habilitado na arte. A dosagem pode ainda conter um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis tais como, por exemplo, um sal de ácido mineral tal como um cloridrato, um bromidrato, um fosfato, um sulfato, etc.; e os sais de ácidos orgânicos tal como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, etc. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, substâncias de tamponamento do pH, géis ou materiais gelificantes, aromatizantes, corantes, microesferas, polímeros, agentes de suspensão, etc. podem também estar aqui presentes. Adicionalmente, um ou mais outros ingredientes farmacêuticos convencionais, tais como conservantes, umectantes, agentes de suspensão, surfatantes, antioxidantes, agentes anti aglomerantes, agentes de enchimento, agentes quelantes, agentes de revestimento, estabilizadores químicos, etc. podem estar presentes, especialmente se a forma de dosagem é uma forma reconstituível. Ingredientes exemplificativos adequados incluem celulose microcristalina, carboximetilcelulose de sódio, polissorbato 80, álcool feniletílico, clorobutanol, sorbato de potássio, ácido sórbico, dióxido de enxofre, galato de propila, os parabenos, etil vanilina, glicerina, fenol, paraclorofenol, gelatina, albumina e uma combinação dos mesmos. Uma discussão exaustiva de excipientes farmaceuticamente aceitáveis está disponível em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991) que é aqui incorporada por referência.

[0428] Em uma forma de realização aqui inserida a aplicação é via um adenovírus, que pode ser com uma dose única de reforço contendo pelo menos 1 x 105 partículas (também referidas como unidades de partículas, pu) de vetores de adenovírus. Em uma forma de realização aqui inserida, a dose preferencialmente é pelo menos cerca de 1 x 106 partículas (por exemplo, cerca de 1 x 106-1 x 1012 partículas), mais preferencialmente pelo menos cerca de 1 x 107 partículas, mais preferencialmente pelo menos cerca de 1 x 108 partículas (por exemplo, cerca de 1 x 108-1 x 1011 partículas ou cerca de 1 x 108-1 x 1012 partículas), o mais preferencialmente pelo menos cerca de 1 x 100 partículas (por exemplo, cerca de 1 x 109-1 x 1010 partículas ou cerca de 1 x 109-1 x 1012 partículas), ou mesmo pelo menos cerca de 1 x 1010 partículas (por exemplo, cerca de 1 x 1010-1 x 1012 partículas) do vetor de adenovírus. De modo alternativo, a dose compreende não mais do que cerca de 1 x 1014 partículas, preferencialmente não mais de cerca de 1 x 1013 partículas, ainda mais preferencialmente não mais de cerca de 1 x 1012 partículas, ainda mais preferencialmente não mais de cerca de 1 x 1011 partículas, e o mais preferencialmente não mais de cerca de 1 x 1010 partículas (por exemplo, não mais de cerca de 1 x 1012 partículas, ainda mais preferencialmente cerca de 1 x 109 artigos). Assim, a dose pode conter uma única dose de vetores de adenovírus com, por exemplo, cerca de 1 x 106 unidades de partícula (pu), cerca de 2 x 106 pu, cerca de 4 x 106 pu, cerca de 1 x 107 pu, cerca de 2 x 107 pu, cerca de 4 x 107 pu, cerca de 1 x 108 pu, cerca de 2 x 108 pu, cerca de 4 x 108 pu, cerca de 1 x 109 pu, cerca de 2 x 109 pu, cerca de 4 x 109 pu, cerca de 1 x 1010 pu, cerca de 2 x 1010 pu, cerca de 4 x 1010 pu, cerca de 1 x 1011 pu, cerca de 2 x 1011 pu, cerca de 4 x 1011 pu, cerca de 1 x 1012 pu, cerca de 2 x 1012 pu, ou cerca de 4 x 1012 pu de vetor de adenovírus. Ver, por exemplo, os vetores de adenovírus na Patente E.U.A. No. 8,454,972 B2 para Nabel, et. al., concedida em 4 de junho, 2013; incorporada aqui como referência, e a dosagem na col 29, linhas 36-58 desses. Em uma forma de realização aqui inserida, o adenovírus é distribuído via doses múltiplas.

[0429] Em uma forma de realização aqui, a aplicação é via de um AAV. A dosagem terapeuticamente eficaz para aplicação in vivo do AAV a um humano acredita-se que seja na gama de desde cerca de 20 até cerca de 50 mL da solução salina contendo desde cerca de 1 x 1010 até cerca de 1 x 1010 AAV/mL de solução funcional. A dosagem pode ser ajustada para equilibrar o benefício terapêutico contra quaisquer efeitos secundários. Em uma forma de realização aqui, a dose AAV é geralmente na gama de concentrações desde cerca de 1 x 105 até 1 x 1050 genomas AAV, desde cerca de 1 x 108 até 1 x 1020 genomas AAV, desde cerca de 1 x 1010 até cerca de 1 x 1016 genomas, ou cerca de 1 x 1011 até cerca de 1 x 1016 genomas AAV. Uma dosagem humana pode ser cerca de 1 x 1013 genomas AAV. Essas concentrações podem ser distribuídas em desde cerca de 0,001 mL até cerca de 100 mL, cerca de 0,05 até cerca de 50 mL, ou cerca de 10 cerca de 25 mL de uma solução de veículo. Outras dosagens eficazes podem ser prontamente estabelecidas por um comum habilitado da arte através de ensaios de rotina estabelecendo curvas de resposta à dose. Ver, por exemplo, Patente E.U.A. No. 8,404,658 B2 de Hajjar, et al., concedida em 26 de março, 2013, na col. 27, linhas 45-60.

[0430] Em uma forma de realização aqui, a aplicação é por via de um plasmídeo. Nessas composições de plasmídeo, a dosagem deve ser uma quantidade suficiente de plasmídeo para induzir uma resposta. Por exemplo, quantidades adequadas de DNA de plasmídeo em composições de plasmídeo pode ser cerca de 0,1 até cerca de 2 mg, ou desde cerca de 1 μg até cerca de 10 μg.

[0431] As doses aqui são baseadas na média de um indivíduo de 70 kg. A frequência de administração está dentro do âmbito do especialista médico ou veterinário (por exemplo, médico, veterinário), ou cientista habilitado na arte. Os camundongos usados nas experiências têm cerca de 20 g. A partir do que é administrado a um camundongo de 20 g se pode extrapolar para um indivíduo de 70 kg.

[0432] Lentivírus

[0433] Os lentivírus são retrovírus complexos que têm a capacidade de infetar e expressar os seus genes nas células mitóticas e pós-mitóticas. Os lentivírus mais comummente conhecidos são o vírus da imunodeficiência humana (VIH), o qual usa o involucro de glicoproteínas de outros vírus para atingir uma ampla gama de tipos de células.

[0434] Os lentivírus podem ser preparados como se segue. Após clonagem pCasES10 (o qual contém uma estrutura de plasmídeo de transferência de lentivírus), HEK293FT na passagem inferior (p=5) foram semeados em um frasco T-75 até 50% de confluência no dia antes da transfecção em DMEM com 10% de soro fetal de bovino e sem antibióticos. Após 20 horas, o meio foi mudado para meio OptiMEM (sem soro) e transfecção foi feita 4 horas mais tarde. As células foram transfectadas com 10 μg de plasmídeo de transferência de lentivírus (pCasESlO) e os seguintes plasmídeos de invólucro: 5 μg de pMD2.G (VSV-g pseudotipo), e 7,5 ug de psPAX2 (gag/pol/rev/tat). A transfecção foi feita em 4mL OptiMEM com um agente de aplicação de lípido catiônico (50uL de Lipofectamina 2000 e 100μl de reagente Plus). Após 6 horas, o meio foi mudado para DMEM sem antibiótico com 10% de soro fetal de bovino.

[0435] Os lentivírus podem ser purificados como se segue. Sobrenadantes virais foram colhidos após 48 horas. Os sobrenadantes foram primeiro limpos de detritos e filtrados através de um filtro de 0,45 um de fraca ligação às proteínas (PVDF). Foram então centrifugadas em uma ultracentrifuga durante para 2 horas a 24.000 rpm. O sedimento viral foi ressuspendido em 50μl de DMEM durante a noite a 4 °C. Foram então aliquotado e imediatamente congelados a -80C.

[0436] Em outra forma de realização, vetores de lentivírus mínimos não primatas baseados no vírus da anemia infecciosa dos equídeos (EIAV) são também contemplados, especialmente para terapia de genes ocular (ver, por exemplo, Balagaan, J Gene Med 2006; 8: 275 - 285, Publicado online em 21 de novembro de 2005 em Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002/jgm.845). Em outra forma de realização, RetinoStat®, um vetor de terapia do gene de lentivírus baseado no vírus da anemia infecciosa equina que expressa proteínas angiostáticas endostaina e angiostatina que são aplicadas com uma injeção subretinal para o tratamento da forma úmida de degeneração macular relacionada com a idade é também contemplado (ver, por exemplo, Binley et al., HUMAN GENE THERAPY 23:980-991 (setembro 2012)) pode ser modificado para o sistema CRISPR-Cas da presente invenção.

[0437] Em outra forma de realização, vetores de lentivírus auto inativado com um siRNA visando um éxon comum partilhado por VIH tat/rev, um engodo TAR localizando nucléolo, e um ribossomo martelo anti-CCR5-específico (ver, por exemplo, DiGiusto et al. (2010) Sci Transl Med 2:36ra43) pode ser usado e/ou adaptado ao sistema CRISPR-Cas da presente invenção. Um mínimo de 2,5 x 106 CD34+ células por quilo de peso de doente podem ser colhidas e pré-estimulada durante 16 a 20 horas em meio X-VIVO 15 (Lonza) contendo glutamina 2 mML, fator de células estaminais (100 ng/mL), ligando Flt-3 (Flt- 3L) (100 ng/mL), e trombopoietina (10 ng/mL) (CellGenix) a uma densidade de 2 x 106 células/mL. Células pré-estimuladas podem ser transduzidas com lentivírus a uma multiplicidade da infecção de 5 durante 16 a 24 horas em frascos de cultura de tecidos de 75 cm2 revestidos com fibronectina (25 mg/cm2) (RetroNectin,Takara Bio Inc.).

[0438] vetores de lentivírus foram descritos como no tratamento de Doença de Parkinson, ver, por exemplo, Publicação da Patente E.U.A. No. 20120295960 e Patente E.U.A. Nos. 7303910 e 7351585. Os vetores de lentivírus foram divulgados para o tratamento de doenças oculares, ver por exemplo, Publicação das Patentes E.U.A. Nos. 20060281180, 20090007284, E.U.A. 20110117189; E.U.A. 20090017543; E.U.A. 20070054961, E.U.A. 20100317109. Os vetores de lentivírus foram divulgados para aplicação ao cérebro, ver, por exemplo, Publicação das Patentes E.U.A. Nos. US20110293571; US20110293571, US20040013648, US20070025970, US20090111106 e Patente E.U.A. No. US7259015.

[0439] Aplicação de RNA

[0440] Aplicação de RNA: A enzima CRISPR, por exemplo a Cas9, e/ou qualquer dos presentes RNAs, por exemplo um RNA guia, podem ser também distribuídas na forma de RNA. Cas9 mRNA pode ser gerado usando transcrição in vitro. Por exemplo, Cas9 mRNA pode ser sintetizada usando um cassete de PCR contendo os seguintes elementos: Sequência T7_promotor-kozak (GCCACC)- Cas9-3’ UTR a partir de cauda da beta globina-poliA (uma fiada de 120 ou mais adeninas). O cassete pode ser usado para transcrição pela polimerase T7. RNAs guia podem ser transcritos usando transcrição in vitro de um cassete contendo a sequência de RNAT7_promotor-GG-guia.

[0441] Para aumentar a expressão e reduzir a toxicidade, a enzima CRISPR e/ou RNA guia pode ser modificada usando pseudo-U ou 5-Metil-C.

[0442] Métodos de aplicação de mRNA são especialmente promissores para aplicação ao fígado, correntemente. Em particular, para AAV8 é particularmente preferencial para aplicação ao fígado.

[0443] Nanopartículas

[0444] mRNA de enzima CRISPR e RNA guia podem ser aplicados simultaneamente usando nanopartículas ou invólucros lipídicos.

[0445] Por exemplo, Su X, Fricke J, Kavanagh DG, Irvine DJ (“In vitro and in vivo mRNA delivery using lipid-enveloped pH-responsive polymer nanoparticles” Mol Pharm. 2011 Jun 6;8(3):774-87. doi: 10.1021/mp100390w. Epub 2011 abr 1) descreve nanopartículas de estrutura núcleo-escudo biodegradáveis com um núcleo poli(β-amino éster) (PBAE) involucrado com um escudo bicamada de fosfolipídeos. Estes foram desenvolvidos para a aplicação in vivo de mRNA. O componente PBAE de resposta a pH foi escolhido para promover a destruição de endossomos, enquanto que a camada superficial de lípidos foi selecionada para minimizar a toxicidade do núcleo policátion. Esses são, por conseguinte, preferenciais para a aplicação de RNA da presente invenção.

[0446] Em uma forma de realização, as nanopartículas baseadas em auto montagem de polímeros bioadesivos são contemplados, os quais podem ser sequência de polinucleotídeos para aplicação oral de peptídeos, aplicação intravenosa de peptídeos e aplicação nasal de peptídeos, todos para o cérebro. Outras formas de realização, tais como absorção oral e aplicação ocular de medicamentos hidrofóbicos são também contemplados. A tecnologia de invólucro molecular envolve um invólucro polimérico manipulado que é protegido e distribuído ao sítio da doença (ver, por exemplo, Mazza, M. et al. ACSNano, 2013. 7(2): 1016-1026; Siew, A., et al. Mol Pharm, 2012. 9(1):14-28; Lalatsa, A., et al. J Contr Rel, 2012. 161(2):523- 36; Lalatsa, A., et al., Mol Pharm, 2012. 9(6):1665-80; Lalatsa, A., et al. Mol Pharm, 2012. 9(6):1764-74; Garrett, N.L., et al. J Biophotonics, 2012. 5(5-6):458-68; Garrett, N.L., et al. J Raman Spect, 2012. 43(5):681-688; Ahmad, S., et al. J Royal Soc Interface 2010. 7:S423-33; Uchegbu, I.F. Expert Opin Drug Deliv, 2006. 3(5):629-40; Qu, X., et al. Biomacromolecules, 2006. 7(12):3452-9 e Uchegbu, I.F., et al. Int J Pharm, 2001. 224:185-199). Doses de cerca de 5 mg/kg são contempladas, com doses únicas ou múltiplas, dependendo do tecido alvo.

[0447] Em uma forma de realização, nanopartículas que podem fornecer RNA a uma célula cancerosa para parar o crescimento do tumor, desenvolvidas pelo laboratório de Dan Anderson no MIT, podem ser usadas e/ou adaptadas ao sistema CRISPR-Cas da presente invenção. Em particular, o laboratório Anderson desenvolveu sistemas combinatórios totalmente automáticos, para a síntese, purificação, caracterização, e formulação de novos biomateriais e nanoformulações. Ver, por exemplo, Alabi et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 ago 6;110(32):12881-6; Zhang et al., Adv Mater. 2013 set 6;25(33):4641-5; Jiang et al., Nano Lett. 2013 Mar 13;13(3):1059-64; Karagiannis et al., ACS Nano. 2012 out 23;6(10):8484-7; Whitehead et al., ACS Nano. 2012 ago 28;6(8):6922-9 e Lee et al., Nat Nanotechnol. 2012 Jun 3;7(6):389-93.

[0448] O pedido da Patente E.U.A. 20110293703 refere- se a compostos lipidoides são também particularmente usados na administração de polinucleotídeos, os quais podem ser sequência de polinucleotídeos para distribuir o sistema CRISPR-Cas da presente invenção. Em um aspecto, os compostos lipidoides de aminoálcool são combinados com um agente para serem aplicados à célula ou um indivíduo para formar micropartículas, nanopartículas, lipossomos, ou micelas. O agente a ser distribuído pelas partículas, lipossomos, ou micelas pode estar na forma de um gás, líquido, ou sólido, e o agente pode ser um polinucleotídeo, proteína, péptido, ou molécula pequena. Os compostos aminoálcool lipidoides podem ser combinados com outros compostos aminoálcool lipidoides, polímeros (sintéticos ou naturais), surfatantes, colesterol, carboidratos, proteínas, lípidos, etc. para formar as partículas. Estas partículas podem então opcionalmente ser combinadas com um excipiente farmacêutico para formar a composição farmacêutica.

[0449] A Publicação da Patente E.U.A. No. 0110293703 também fornece métodos para preparar os compostos aminoálcool lipidoides. Um ou mais equivalentes de uma amina se deixam reagir com um ou mais equivalentes de um composto terminado em epóxido sob condições adequadas para formar um composto aminoálcool lipidoide da presente invenção. Em certas formas de realização, todos os grupos amino da amina são completamente reagidos com o composto terminado em epóxido para formar aminas terciárias. Em outras formas de realização, todos os grupos amino da amina não são completamente reagidos com o composto terminado em epóxido para formar aminas terciárias resultando desse modo em aminas primárias ou secundárias no composto aminoálcool lipidoide. Estas aminas primárias ou secundárias são deixadas como estão ou podem ser reagidas com outro eletrófilo tal como um diferente composto terminado em epóxido. Como será apreciado por um habilitado na arte, reagindo uma amina com menos que o excesso de composto terminado em epóxido irá resultar em vários de diferentes compostos aminoálcool lipidoides com vários números de caudas. Certas aminas podem ser totalmente funcionalizadas com duas caudas de compostos derivados de epóxido enquanto outras moléculas não serão totalmente funcionalizadas com caudas do composto derivado de epóxido. Por exemplo, a diamina ou poliamina pode incluir uma, duas, três, ou quatro caudas do composto derivado de epóxido fora das várias metades amino da molécula resultando em aminas primárias, secundárias, e terciárias. Em certas formas de realização, todos os grupos amino não são totalmente funcionalizados. Em certas formas de realização, são usados dois dos mesmos tipos de composto terminados em epóxidos. Em outras formas de realização, são usados dois ou mais diferentes composto terminado em epóxidos. A síntese dos compostos aminoálcool lipidoides é realizada com ou sem solvente, e a síntese pode ser realizada a temperaturas mais altas variando desde 30-100 °C, preferencialmente a aproximadamente 50-90 °C. Os compostos aminoálcool lipidoides preparados podem ser opcionalmente purificados. Por exemplo, a mistura de compostos aminoálcool lipidoides pode ser purificada para formar um composto aminoálcool lipidoide com um número específico de caudas do composto derivado de epóxido. Ou a mistura pode ser purificada para formar um estéreo ou regioisômero específico. Os compostos aminoálcool lipidoides podem ser alquilados usando um halogeneto de alquila (por exemplo, iodeto de metila) ou outro agente alquilante, e/ou podem ser aciladas.

[0450] A publicação da Patente E.U.A. No. 0110293703 também fornece bibliotecas de compostos aminoálcool lipidoides preparados pelos métodos da invenção. Estes compostos aminoálcool lipidoides podem ser preparados e/ou triados usando técnicas de alto rendimento envolvendo manipuladores de líquidos, robôs, placas de microtitulação, computadores, etc. Em certas formas de realização, os compostos aminoálcool lipidoides são triados quanto à sua capacidade para transfectar polinucleotídeos ou outros agentes (por exemplo, proteínas, peptídeos, pequenas moléculas) na célula.

[0451] Publicação das Patentes E.U.A. No. 20130302401 se refere à classe de poli(beta-amino alcoóis) (PBAAs) foi preparada usando polimerização combinatória. As PBAAs da invenção podem ser usadas em biotecnologia e aplicações biomédicas como revestimentos (tais como revestimentos de filmes ou filmes multi camada para dispositivos médicos ou implantes), aditivos, materiais, excipientes, agentes de não incrustação biológica, agentes de micro padronização, e agentes de encapsulação celular. Quando utilizados como revestimentos de superfície, esses PBAAs eliciaram diferentes níveis de inflamação, tanto in vitro como in vivo, dependendo das suas estruturas químicas. A grande diversidade química desta classe de materiais permitiu-nos identificar revestimentos de polímeros que inibem a ativação de macrófagos in vitro. Além disso, estes revestimentos reduzem o recrutamento de células inflamatórias, e reduz a fibrose, seguindo a implantação subcutânea de micropartículas carboxiladas do poliestireno. Estes polímeros podem ser usados para formar cápsulas de complexos polieletrólito para encapsulamento de células. A invenção pode também ter muitas outras aplicações biológicas tais como revestimentos antimicrobianos, aplicação de DNA ou siRNA, e engenharia de tecidos de células estaminais. Os ensinamentos da Publicação da Patente E.U.A. No. 20130302401 podem ser aplicados ao sistemas CRISPR Cas da presente invenção.

[0452] Em outra forma de realização, estão contempladas nanopartículas lipídicas (LNPs). Em particular, um pequeno RNA de interferência antitranstirretina encapsulado em nanopartículas lipídicas (ver, por exemplo, Coelho et al., N Engl J Med 2013;369:819-29) pode ser aplicado ao sistema CRISPR-Cas da presente invenção. Doses de cerca de 0,01 até cerca 1 mg por kg de peso corporal administradas intravenosamente são contemplados. Os medicamentos para reduzir o risco de reações relacionadas com a perfusão são contemplados, tais como dexametasona, acetampinofeno, difenidramina ou cetirizina, e ranitidina são contempladas. Múltiplas doses de cerca de 0,3 mg por quilograma todas as 4 semanas para cinco doses são também contemplados.

[0453] LNPs têm mostrado ser altamente eficazes na aplicação de siRNAs ao fígado (ver, por exemplo, Tabernero et al., Cancer Discovery, abril de 2013, Vol. 3, No. 4, páginas 363-470) e são portanto contempladas para aplicação da CRISPR Cas ao fígado. A dosagem de cerca de quatro doses de 6 mg/kg de LNP (ou RNA do sistema CRISPR-Cas) todas as duas semanas pode ser contemplada. Tabernero et al. demonstrou que a regressão do tumor foi observada após os primeiros 2 ciclos de LNPs doseados a 0,7 mg/kg, e no final de 6 ciclos o paciente atingiu uma resposta parcial com regressão completa da metástase em linfonodo e encolhimento substancial dos tumores do fígado. Foi obtida uma resposta completa após 40 doses neste paciente, que permaneceu em remissão e completou o tratamento após receber doses durante 26 meses. Dois pacientes com RCC e sítios extrahepáticos da doença incluindo rim, pulmão, e linfonodos que estavam progredindo após terapêutica prévia com VEGF os inibidores mantiveram a doença estável em todos os locais durante aproximadamente 8 a 12 meses, e um paciente com PNET e metástases no fígado continuou no estudo de extensão durante 18 meses (36 doses) com a doença estável.

[0454] Porém, a carga de LNP deve ser tida em consideração. Como lípidos catiônicos combinados com lípidos carregados negativamente para induzir estruturas não bicamada que facilitam a aplicação intracelular. Porque as LNPs carregadas são rapidamente eliminadas da circulação a seguir à injeção intravenosa, lípidos catiônicos ionizáveis com valores de pKa abaixo de 7 foram desenvolvidos (ver, por exemplo, Rosin et al., Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, páginas 1286-2200, dez. 2011). Polímeros carregados negativamente tais como oligonucleotídeos siRNA podem ser carregados nas LNPs a valores de baixo pH (por exemplo, pH 4) onde os lípidos ionizáveis exibem uma carga positiva. Porém, a valores de pH fisiológico, as LNPs exibem uma baixa carga de superfície compatível com mais longos períodos de tempo de circulação. Quatro espécies de lípidos catiônicos ionizáveis foram focadas com, nomeadamente 1,2-dilineoíl-3- dimetilamônio-propano (DLinDAP), 1,2-dilinoleiloxi-3-N,N- dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleiloxi-ceto-N,N- dimetil-3-aminopropano (DLinKDMA), e 1,2-dilinoleil-4-(2- dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolana (DLinKC2-DMA). Tem sido demonstrado que sistemas LNP siRNA contendo estes lípidos exibem notável diferença de propriedade de silenciamento de gene em hepatócitos in vivo, com potências variando de acordo com as séries DLinKC2-DMA>DLinKDMA>DLinDMA>>DLinDAP empregando um Fator VII de modelo de silenciamento de genes (ver, por exemplo, Rosin et al., Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, páginas 1286-2200, 2011). Uma dosagem de níveis 1 μg/mL pode ser contemplada, especialmente para a formulação contendo DLinKC2-DMA.

[0455] Preparação de encapsulação de LNPs e CRISPR Cas podem ser usadas e/ou adaptadas a partir de Rosin et al., Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, páginas 1286-2200, dez. 2011). Os lípidos catiónicos 1,2-dilineoíl-3-dimetilamônio- propano (DLinDAP), 1,2-dilinoleiloxi-3-N,N- dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleiloxiceto-N,N- dimetil-3-aminopropano (DLinK-DMA), 1,2-dilinoleil-4-(2- dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLinKC2-DMA), (3-o-[2"- (metoxipolietilenoglicol 2000) succinoíl]-1,2-dimiristoíl-sn- glicol (PEG-S-DMG), e R-3-[(w-metoxi-poli(etileno glicol)2000) carbamoíl]-1,2-dimiristiloxlpropil-3-amina (PEG- C-DOMG) podem ser provido pela Tekmira Pharmaceuticals (Vancouver, Canadá) ou sintetizados. O colesterol pode ser comprado na Sigma (St Louis, MO). O CRISPR Cas RNA específico pode ser encapsulado nas LNPs contendo DLinDAP, DLinDMA, DLinK-DMA, e DLinKC2-DMA (lípido catiónico:DSPC:CHOL: PEGS- DMG ou PEG-C-DOMG a razões molares de 40:10:40:10 ). Quando requerido, 0,2% SP-DiOC18 (Invitrogen, Burlington, Canadá) pode ser incorporado para avaliar a incorporação celular, aplicação intracelular, e biodistribuição. A encapsulação pode ser realizada dissolvendo misturas de lípidos compreendidos por lípido catiônico:DSPC:colesterol:PEG-c-DOMG (40:10:40:10 rácio molar) em etanol a uma concentração de lípido final de 10 mmol/l. Esta solução etanólica de lípido pode ser adicionada gota a gota a 50 mmol/l de citrato, pH 4,0 para formar vesículas multilamelares para produzir uma concentração final de 30% de etanol vol/vol. Vesículas unilamelares grandes podem ser formadas a seguir à extrusão de vesículas multilamelares através de dois filtros empilhados de policarbonato de 80 nm Nuclepore usando a Extrusora (Northern Lípidos, Vancouver, Canadá). A encapsulação pode ser atingida adicionando RNA dissolvido a 2 mg/mL em 50 mmol/l de citrato, pH 4,0 contendo 30% de etanol vol/vol gota a gota às vesículas unilamelares grandes e incubação dos extrudados préformados a 31 °C durante 30 minutos misturando continuamente a um peso final de RNA/lípido taxa de peso de 0,06/1 p/p. Remoção do etanol e neutralização do tampão de formulação foram realizados por dialise contra o salino tamponado com fosfato (PBS), pH 7,4 durante 16 horas usando membranas de diálise de celulose regeneradas Spectra/Por 2. A distribuição dos tamanhos das nanopartículas pode ser determinada por dispersão de luz dinâmica usando um calibrador de partícula NICOMP 370, os modos de vesículas/intensidade, e ajuste de Gauss (Nicomp Partícula Sizing, Santa Barbara, CA). O tamanho de partícula para todos os três sistemas LNP pode ser ~70 nm de diâmetro. A eficiência de encapsulação de siRNA pode ser determinada removendo o siRNA livre usando colunas VivaPureD MiniH (Sartorius Stedim Biotech) a partir das amostras colhidas antes e após diálise. O RNA encapsulado pode ser extraído a partir das nanopartículas eluídas e quantificadas a 260 nm. A razão de siRNA para lípido foi determinada medindo o conteúdo em colesterol de vesículas usando o ensaio enzimático Colesterol E da Wako Chemicals USA (Richmond, VA). Lipossomos (ou LNPs) PEGuilados podem ser também usados para aplicação.

[0456] A preparação de LNPs grandes pode ser usada e/ou adaptada de Rosin et al., Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, páginas 1286-2200, dez. 2011). Uma solução de pré-mistura de lípidos (20,4 mg/mL concentração de lípido total) pode ser preparado em etanol contendo DLinKC2-DMA, DSPC, e colesterol a razões molares 50:10:38,5. O acetato de sódio pode ser adicionado à pré-mistura lipídica a um rácio molar de 0,75:1 (acetato de sódio:DLinKC2-DMA). Os lípidos podem ser subsequentemente hidratados combinando a mistura com 1,85 volumes de tampão citrato (10 mmol/l, pH 3,0) com agitação vigorosa, resultando na formação espontânea de lipossomos em tampão aquoso contendo 35% de etanol. A solução de lipossomos pode ser incubada a 37 °C para permitir um aumento do tamanho de partícula dependente do tempo. Alíquotas podem ser removidas a vários tempos durante a incubação para investigar mudanças no tamanho do lipossomo por dispersão de luz dinâmica (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, Worcestershire, RU). Uma vez atingido o tamanho de partícula desejado, uma solução aquosa de lípido PEG (estoque = 10 mg/mL PEG-DMG em 35% (vol/vol) de etanol) pode ser adicionada à mistura de lipossomos para formar uma concentração molar final de PEG de 3,5% de lípido total. Após a adição de lípidos PEG, os lipossomos devem sua dimensão, eficazmente extinguindo o crescimento posterior. O RNA pode então ser adicionado aos lipossomos vazios a uma razão de siRNA para lípido total de aproximadamente 1:10 (p:p), seguido por incubação por 30 minutos a 37 °C para formar LNPs carregadas. A mistura pode ser subsequentemente dialisada durante a noite em PBS e filtrado com um filtro de seringa de 0,45 μm.

[0457] Construções de Ácido Nucleico Esférico (SNA™) e outras nanopartículas (particularmente nanopartículas de ouro) são também contempladas como um meio para distribuir o sistema CRISPR/Cas a um alvo pretendido. Dados significativos mostram que as construções de Ácido Nucleico Esférico Terapêutico AuraSense (SNA™), baseadas em nanopartículas de ouro funcionalizadas para ácido nucleico, são superiores às plataformas alternativas com base em múltiplos fatores chave de sucesso, tais como:

[0458] Alta estabilidade in vivo. Devido à sua carga densa, a maioria da carga (DNA ou siRNA) permanece ligada às construções dentro das células, conferindo estabilidade ao ácido nucleico e resistência à degradação enzimática.

[0459] Capacidade de aplicação Para todos os tipos de células estudados (por exemplo, neurônios, linhas celulares tumorais, etc.) as construções demonstram uma eficiência de transfecção de 99% sem necessidade de transportadores ou agentes de transfecção.

[0460] Alvos terapêuticos. A afinidade de ligação a um alvo único e a especificidade das construções permite especificidade excelente para sequências alvo pareadas (isto é, efeitos limitados fora do alvo).

[0461] Eficácia superior As construções superam significativamente os melhores reagentes de transfecção convencionais (Lipofectamina 2000 e Citofectina).

[0462] Baixa toxicidade. As construções podem incluir uma variedade de células cultivadas, células primárias, e tecidos com nenhuma atividade aparente.

[0463] Ausência de resposta imune significativa. As construções eliciam mudanças mínimas na expressão de gene global como medido por estudos de microarranjos de todo o genoma e ensaios de proteínas específicas de citocina.

[0464] Adaptabilidade química. Qualquer número de agentes únicos ou combinatórios (por exemplo, proteínas, peptídeos, pequenas moléculas) pode ser usado para adequar a superfície das construções.

[0465] Esta plataforma de terapêuticas à base de ácido nucleico pode ser aplicável a numerosos estados de doença, incluindo inflamação e doenças infeciosas, câncer, afecções cutâneas e doença cardiovascular.

[0466] A literatura citada inclui: Cutler et al., J. Am. Chem. Soc. 2011 133:9254-9257, Hao et al., Small. 2011 7:3158-3162, Zhang et al., ACS Nano. 2011 5:6962-6970, Cutler et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:1376-1391, Young et al., Nano Lett. 2012 12:3867-71, Zheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012 109:11975-80, Mirkin, Nanomedicine 2012 7:635638 Zhang et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:16488-1691, Weintraub, Nature 2013 495:S14-S16, Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013 110(19):7625-7630, Jensen et al., Sci. Transl. Med. 5, 209ra152 (2013) e Mirkin, et al., Small, doi.org/10.1002/smll.201302143.

[0467] A auto aglomeração de nanopartículas com siRNA pode ser construída com polietileneimina (PEI) que é PEGilada com um peptídeo ligando Arg-Gly-Asp (RGD) ligado à extremidade distal do polietilenoglicol (PEG), por exemplo, como um meio para atingir a neovasculatura do tumor expressando integrinas e usado para distribuir o siRNA inibindo o crescimento endotelial vascular fator de expressão do receptor 2 (VEGF R2) e desse modo a angiogênese tumoral (ver, por exemplo, Schiffelers et al., Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 19). Os nanoplexos podem ser preparados misturando volumes iguais de soluções aquosas de polímero catiônico e ácido nucleico para dar um excesso molar de nitrogênio líquido ionizável (polímero) para fosfato (ácido nucleico) em uma gama de 2 a 6. As interações eletrostáticas entre polímeros catiônicos e ácido nucleico resultou na formação de poliplexos com distribuição do tamanho médio de partícula de cerca de 100 nm, portanto, aqui referida como nanoplexos. Uma dosagem de cerca de 100 a 200 mg de CRISPR Cas é prevista para aplicação na auto aglomeração de nanopartículas de Schiffelers et al.

[0468] Os nanoplexos de Bartlett et al. (PNAS, 25 de setembro, 2007,vol. 104, no. 39) podem também ser aplicados à presente invenção. Os nanoplexos de Bartlett et al. são preparados misturando volumes iguais de soluções aquosas de polímero catiônico e ácido nucleico para dar um excesso molar de nitrogênio líquido ionizável (polímero) para fosfato (ácido nucleico) em uma gama de 2 a 6. As interações eletrostáticas entre polímeros catiônicos e ácido nucleico resultou na formação de poliplexos com distribuição do tamanho médio de partícula de cerca de 100 nm, portanto, aqui referida como nanoplexos. O DOTA-siRNA de Bartlett et al. foi sintetizado como a seguir: Mono(N-hidroxisuccinimida éster) do ácido 1,4,7,10-tetraazacilcododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA- NHSester) foi encomendado da Macrocyclics (Dallas, TX). A cadeia de senso RNA modificada por amina com um excesso molar 100 vezes do DOTA-NHS-éster em tampão carbonato (pH 9) foi adicionada ao tubo da microcentrífuga. Os conteúdos foram reagidos por agitação durante 4 h à temperatura ambiente. O conjugado DOTA-RNAsenso foi precipitado com etanol, resuspendido em água, e emparelhado a uma cadeia antissenso não modificada para produzir DOTA-siRNA. Todos os líquidos foram pré tratados com Chelex-100 (Bio-Rad, Hercules, CA) para remover os vestígios de metal contaminantes. Nanopartículas siRNA visadas e não visadas por Tf podem ser formadas usando policátions contendo ciclodextrina. Tipicamente, as nanopartículas foram formadas em água a uma razão de carga de 3 (+/-) e uma concentração de siRNA de 0,5 g/litro. Um por cento das moléculas de adamantano PEG na superfície das nanopartículas visadas foram modificadas com Tf (adamantano- PEG-Tf). As nanopartículas foram suspensas em uma solução de veículo de glucose a 5% (p/vol) para injeção.

[0469] Davis et al. (Nature, Vol 464, 15 de abril d 2010) conduzem um ensaio clínico siRNA que usa um sistema de aplicação direcionada de nanopartículas (número de registro de ensaios clínicos NCT00689065). Aos pacientes com cânceres sólidos refratários às terapias tradicionais de tratamento são administradas doses das nanopartículas alvo nos dias 1, 3, 8 e 10 de um ciclo de 21 dias por uma infusão intravenosa de 30 min. As nanopartículas consistem de um sistema de aplicação sintético contendo: (1) um polímero linear, à base de ciclodextrina (CDP), (2) uma proteína de transferrina humana (TF) ligando de direcionamento aplicada no exterior da nanopartícula para engajar receptores TF (TFR) na superfície das células de câncer, (3) um polímero hidrofílico (polietileno glicol (PEG) usado para promover a estabilidade de nanopartículas em fluídos biológicos), e (4) siRNA desenhado para reduzir a expressão da RRM2 (sequência usada na clínica foi previamente denotada siR2B+5). A TFR há muito se sabe estar desregulada em células malignas, e RRM2 é um alvo anticâncer estabelecido. Estas nanopartículas (versão clínica denotada como CALAA-01) demonstraram ser bem toleradas em estudos multidosagem em primatas não humanos. Apesar de a um único paciente com leucemia mieloide crônica ter sido administrada uma aplicação lipossômica de siRNA, o ensaio clínico de Davis et al. é o ensaio inicial humano para aplicação sistêmica de siRNA com um sistema de aplicação direcionado e tratar pacientes com câncer sólido. Para verificar se o sistema de aplicação direcionada pode fornecer a aplicação efetiva de siRNA funcional aos tumores humanos, Davis et al. investigaram biopsias de três pacientes de três diferentes grupos de dosagem; pacientes A, B e C, todos os quais tinham melanoma metastático e receberam CALAA-01 em doses de 18, 24 e 30 mg m-2 siRNA, respectivamente. Doses similares podem também ser contempladas para o sistema CRISPR- Cas da presente invenção. A aplicação da invenção pode ser obtida com nanopartículas contendo um polímero linear, à base de ciclodextrina (CDP), uma proteína de transferrina humana (TF) ligando alvo no exterior da nanopartícula para engajar os receptores TF (TFR) na superfície das células de câncer e/ou um polímero hidrofílico (por exemplo, polietileno glicol (PEG) usado para promover nanopartículas e estabilidade em fluídos biológicos).

[0470] Exossomos

[0471] Os exossomos são nano-vesículas endógenas que transportam RNAs e proteínas que podem aplicar (si)RNA de curta interferência ao cérebro nos camundongos. Para reduzir a imunogenicidade, Alvarez-Erviti et al. (2011, Nat Biotechnol 29: 341) usaram células dendríticas auto-derivadas para produção de exossomos. O direcionamento foi alcançado, projetando as células dendríticas para expressar Lamp2b, uma proteína de membrana de exossomo, fundida a RVG peptídeo específico de neurônio. Os exossomos purificados foram carregados com siRNA exógeno por eletroporação. Os exossomos visados por RVG injetados intravenosamente aplicaram GAPDH siRNA especialmente a neurônios, microglia, oligodendrócitos em cérebro, resultando em uma inativação de gene específica. Pré-exposição a exossomos RVG não atenuou a inativação, e não se observou a absorção não específica em outros tecidos. O potencial terapêutico da aplicação de siRNA mediada por exossomo foi demonstrado pela forte inativação de BACE1 por mRNA (60%) e proteína (62%), um alvo terapêutico em doença de Alzheimer.

[0472] Para obter um conjunto de exossomos imunologicamente inertes, Alvarez-Erviti et al. recolheram medula óssea de camundongos puros C57BL/6 com um haplótipo homogêneo do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). As células dendríticas imaturas produzem grandes quantidades de exossomos desprovidos de ativadores de células T tais como MHC-II e CD86, Alvarez-Erviti et al. selecionaram as células dendríticas com fator de estimulação de colônia de granulócito/macrófago (GM-CSF) durante 7 d. Os exossomos foram purificados a partir do sobrenadante da cultura no dia seguinte usando protocolos de ultracentrifugação bem estabelecidos. Os exossomos produzidos eram fisicamente homogêneos, com um pico de aplicação de tamanho a 80 nm de diâmetro como determinado por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e microscopia eletrônica. Alvarez-Erviti et al. obtiveram 6-12 μg de exossomos (medido com base na concentração de proteína) por 106 células.

[0473] Depois, Alvarez-Erviti et al. investigaram a possibilidade de carregar exossomos modificados com cargas exógenas usando protocolos de eletroporação adaptados para aplicações a nanoescala. Como a eletroporação para partículas de membrana em escala nanométrica não está bem caracterizado, siRNA não específico marcado com Cy5 foi usado para otimização empírica do protocolo de eletroporação. A quantidade de siRNA encapsulado foi ensaiado após ultracentrifugação e lise de exossomos. Eletroporação a 400 V e 125 μF resultou na maior retenção de siRNA e foi usada para todos os experimentos subsequentes.

[0474] Alvarez-Erviti et al. administraram 150 μg de cada BACE1 siRNA encapsulado em 150 μg de exossomos RVG a camundongos C57BL/6 normais e comparou a eficiência de inativação para quatro controles: camundongos não tratados, camundongos injetados somente com exossomos RVG, camundongos injetados com BACE1 siRNA complexado a um reagente lipossomo catiônico in vivo e camundongos injetados com BACE1 siRNA complexado a RVG-9R, o peptídeo RVG conjugado com 9 D-argininas que se ligam eletrostaticamente a siRNA. Foram analisadas amostras de tecido cortical 3 d após administração e observou- se uma inativação significativa de proteína (45%, P < 0,05, versus 62%, P < 0,01) em ambos siRNA-RVG-9R-tratados e os camundongos tratados com exossomo siRNARVG, resultaram em decréscimo significativo nos níveis de BACE1 mRNA (66% [+ ou -] 15%, P < 0,001 e 61% [+ ou -] 13% respectivamente, P < 0,01). Além disso, os Requerentes demonstraram um decréscimo significativo (55%, P < 0,05) nos níveis totais de [beta]- amiloide 1-42, um componente principal das placas amiloides em patologia de Alzheimer, nos animais tratados com exossomo RVG. O decréscimo observado foi maior do que o decréscimo de β-amiloide 1-40 em camundongos normais após injeção intraventricular dos inibidores BACE1. Alvarez-Erviti et al. realizou a amplificação rápida 5' das extremidades de cDNA (RACE) no produto de clivagem BACE1, o qual forneceu elementos de prova da inativação mediada por RNAi por um siRNA.

[0475] Finalmente, Alvarez-Erviti et al. investigaram se os exossomos siRNA-RVG induziram resposta imunes in vivo avaliando as concentrações de soro IL-6, IP-10, TNFα e IFN-α. A seguir ao tratamento do exossomo siRNA-RVG, foram registradas alterações não significativas em todas as citocinas similares a tratamento com reagentes de transfecção siRNA em contraste com siRNA-RVG-9R, os quais potencialmente estimulam a secreção IL-6, confirmando um perfil imunologicamente inerte do tratamento do exossomo. Dado que os exossomos encapsulam somente 20% de siRNA, a aplicação com exossomo RVG parece ser mais eficiente do que a aplicação de RVG-9R em comparação com inativação de mRNA comparável e maior inativação da proteína foi atingida com cinco vezes menos siRNA sem o nível correspondente da estimulação da imunidade. Este experimento demonstrou o potencial terapêutico de Tecnologia de exossomo RVG, que é potencialmente adequado para silenciamento a longo prazo de genes relacionados com doenças neurodegenerativas. O sistema de libertação do exossomo de Alvarez-Erviti et al. pode ser aplicado para distribuir o sistema CRISPR-Cas da presente invenção aos alvos terapêuticos, especialmente doenças neurodegenerativas. Uma dosagem de cerca de 100 a 1000 mg de CRISPR Cas encapsulado em cerca de 100 a 1000 mg de RVG exossomos pode ser contemplada para a presente invenção.

[0476] El-Andaloussi et al. (Nature Protocols 7,2112-2126(2012)) divulgam como exossomos derivados de células cultivadas pode ser aproveitadas para aplicação de siRNA in vitro e in vivo. Este primeiro protocolo descreve a formação de exossomos alvo através de transfecção de um vetor de expressão, compreendendo uma proteína de exossomo fundida com um peptídeo ligando. Mais, El-Andaloussi et al. explicam como purificar e caracterizar os exossomos partindo do sobrenadante de células transfectadas. Mais, El-Andaloussi et al. detalharam os passos cruciais para carregar siRNA para os exossomos. Finalmente, El-Andaloussi et al. descrevem como usar exossomos para aplicar de forma eficiente siRNA in vitro e in vivo em cérebro de camundongo. Exemplos de resultados antecipados nos quais a aplicação de siRNA mediada por exossomo é avaliada por ensaios de funcionalidade e imagiologia são também fornecidos. Todo o protocolo leva ~3 semanas. A aplicação ou administração de acordo com a invenção pode ser realizada usando exossomos produzidos das células dendríticas auto derivadas.

[0477] Em outra forma de realização, os exossomos plasmáticos de Wahlgren et al. (Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 17 e130) são contemplados. Exossomos são vesículas de tamanho nanométrico (30-90nm de tamanho) produzidos por muitos tipos de células, incluindo células dendríticas (DC), células B, células T, células de mastócitos, células epiteliais e células tumorais. Estas vesículas são formadas por brotamento para dentro dos últimos endossomos e são então libertados para o meio extracelular após fusão com a membrana plasmática. Porque os exossomos carregam naturalmente RNA entre as células, esta propriedade pode ser útil na terapia de genes.

[0478] Exossomos do plasma são preparados por centrifugação da camada leucocitária a 900g durante 20 min para isolar o plasma seguido de recolha dos sobrenadantes celulares, centrifugando a 300g durante 10 min para eliminar as células e a 16 500g durante 30 min seguida por filtração através de um filtro de 0,22 mm. Exossomos são sedimentados por ultracentrifugação a 120 000g durante 70 min. A transfecção química de siRNA em exossomos é realizada de acordo com instruções do fabricante em kit de iniciação RNAi Humano/camundongo (Quiagen, Hilden, Alemanha). O siRNA é adicionado a 100 mL PBS a uma concentração final de 2 mmol/mL. Após se adicionar reagente de transfecção HiPerFect, a mistura é incubada para 10 min à TA. A fim de remover o excesso de micelas, os exossomos são reisolados usando esferas de látex aldeído/sulfato. A transfecção química de CRISPR Cas dentro dos exossomos pode ser conduzida De modo semelhante ao siRNA. Os exossomos podem ser cocultivados com monócitos e linfócitos isolados de sangue periférico de doadores saudáveis. Portanto, pode ser contemplado que os exossomos contendo CRISPR Cas podem ser introduzidos em monócitos e linfócitos e reintroduzidos autologamente em um humano. Adequadamente, a aplicação ou administração de acordo com a invenção pode ser realizada usando exossomos plasmáticos.

[0479] Lipossomos

[0480] A aplicação ou administração de acordo com a invenção pode ser realizada com lipossomos. Os lipossomos são estruturas vesiculares esféricas compostas de uma uni- ou bicamada lipídica multilamelar circundando os compartimentos internos aquosos e uma bicamada fosfolipídica lipofílica exterior relativamente impermeável. Os lipossomos ganharam uma atenção considerável como veículos de aplicação de fármacos porque são biocompatíveis, não tóxicos, podem fornecer ambas as moléculas de fármaco hidrofílicas e lipofílicas, proteger a sua carga de degradação por enzimas plasmáticas, e transportar sua carga através de membranas biológicas e da barreira sanguínea do cérebro (BBB) (ver, por exemplo, Spuch e Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Artigo ID 469679, 12 páginas, 2011. doi:10.1155/2011/469679 para revisão).

[0481] Os lipossomos podem ser feitos partindo de vários tipos diferentes de lípidos; porém, os fosfolipídeos são os mais comummente usados para gerar lipossomos como veículos de fármaco. Apesar da formação de lipossomos ser espontânea quando um filme lipídico é misturado com uma solução aquosa, isto pode também ser acelerado aplicando força sob a forma de agitação usando um homogeneizador, sonicador, ou um aparelho de extrusão (ver, por exemplo, Spuch e Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Artigo ID 469679, 12 páginas, 2011. doi:10.1155/2011/469679 para revisão).

[0482] Vários outros aditivos podem ser adicionados aos lipossomos para modificar a sua estrutura e propriedades. Por exemplo, tanto o colesterol como a esfingomielina podem ser adicionados à mistura lipossômica para ajudar a estabilizar a estrutura lipossômica e prevenir o vazamento da carga interior lipossômica. Adicionalmente, os lipossomos são preparados a partir de fosfatidilcolina de ovo hidrogenada ou fosfatidilcolina de ovo, colesterol, e fosfato de dicetila, e os seus tamanhos médios de vesículas foram ajustados até cerca 50 e 100 nm. (ver, por exemplo, Spuch e Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Artigo ID 469679, 12 páginas, 2011. doi:10.1155/2011/469679 para revisão).

[0483] A formulação de lipossomos convencionais é principalmente compreendida por fosfolipídeos e lípidos naturais tais como 1,2-distearoril-sn-glicero-3-fosfatidil colina (DSPC), esfingomielina, fosfatidilcolinas e monosialogangliósideos. Uma vez que esta formulação é constituída somente por fosfolipídeos, as formulações lipossômicas encontraram muitos desafios, um dos muitos sendo a instabilidade em plasma. Várias tentativas para superar esses desafios têm sido feitas, especificamente na manipulação da membrana lipídica. Uma dessas tentativas é focada na manipulação de colesterol. A adição de colesterol a formulações convencionais reduz a libertação rápida do composto bioativo encapsulado no plasma ou 1,2-dioleoíl-sn- glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) aumenta a estabilidade (ver, por exemplo, Spuch e Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Artigo ID 469679, 12 páginas, 2011. doi:10.1155/2011/469679 para revisão).

[0484] Em uma forma de realização particularmente vantajosa, lipossomos Cavalo de Tróia (também conhecidos como Cavalos de Tróia moleculares) são desejáveis e o protocolo pode ser encontrado em http://cshprotocols.cshlp.org/content/2010/4/pdb.prot5407.lo ng. As partículas permitem a aplicação de um transgene a todo o cérebro após uma injeção intravascular. Sem estar ligado a limitação, acredita-se que as partículas de lípidos neutros com anticorpos específicos conjugados a superfície permitem a passagem da barreira sanguínea do cérebro via endocitose. O Requerente postula que utilizando Lipossomos Cavalo de Tróia para fornecer a família CRISPR de nucleases ao cérebro via uma injeção intravascular, poderia permitir um cérebro totalmente transgênico de animais sem a necessidade de manipulação embrionária. Cerca de 1-5 g de moléculas de ácido nucleico, p.ex., DNA ou RNA, podem ser considerados para administração in vivo em lipossomos.

[0485] Em outra forma de realização, o sistema CRISPR- Cas pode ser administrado em lipossomos, tal como uma partícula lipídica estável de ácido nucleico (SNALP) (ver, por exemplo, Morrissey et al., Nature Biotecnologia, Vol. 23, No. 8, Agosto 2005). São contempladas injeções intravenosas diárias de cerca de 1, 3 ou 5 mg/kg/dia da CRISPR Cas de um alvo específico em uma SNALP. O tratamento diário pode ser até cerca de três dias e depois semanalmente durante cerca de cinco semanas. Em outra forma de realização, uma CRISPR Cas específico encapsulado SNALP) administrada por injeção intravenosa a em doses de cerca de 1 ou 2,5 mg/kg são também contemplados (ver, por exemplo, Zimmerman et al., Nature Letters, Vol. 441, 4 de maio de 2006). A formulação SNALP pode conter os lípidos 3-N- [(wmetoxipoli(etilenoglicol)2000)carbamoíl]-1,2- dimiristiloxi-propilamina (PEG-C-DMA), 1,2-dilinoleiloxi-N,N- dimetil-3-aminopropano (DLinDMA), 1,2-distearoíl-sn-glicero- 3-fosfocolina (DSPC) e colesterol, em um rácio molar de 2:40:10:48 por cento (ver, por exemplo, Zimmerman et al., Nature Letters, Vol. 441, 4 de maio 2006).

[0486] Em outra forma de realização, partículas estáveis de ácido nucleico-lipídio (SNALPs) provaram ser moléculas eficazes de aplicação a tumores de fígado derivado de HepG2 altamente vascularizado mas não em tumores de fígado derivados de HCT-116 pobremente vascularizado (ver, por exemplo, Li, Gene Therapy (2012) 19, 775-780). Os lipossomos SNALP podem ser preparados formulando D-Lin-DMA e PEG-C-DMA com distearoílfosfatidilcolina (DSPC), Colesterol e siRNA usando uma proporção de 25:1 lípido/siRNA e um rácio molar de 48/40/10/2 de Colesterol/D-Lin-DMA/DSPC/PEG-C-DMA. Os resultantes lipossomos SNALP são de cerca de 80 -100 nm de tamanho.

[0487] Ainda em outra forma de realização, uma SNALP pode compreender colesterol sintético (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), dipalmitoílfosfatidilcolina (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA), 3-N-[(w-metoxi poli(etilenoglicol)2000)carbamoíl]-1,2- dimirestiloxipropilamina, e 1,2-dilinoleiloxi-3- N,Ndimetilaminopropano catiônico (ver, por exemplo, Geisbert et al., Lancet 2010; 375: 1896-905). Uma dosagem de cerca de 2 mg/kg de CRISPR Cas total por dose administrada como, por exemplo, uma infusão de bólus intravenosa pode ser contemplada.

[0488] Ainda em outra forma de realização, as SNALP podem compreender colesterol sintético (Sigma-Aldrich), 1,2- distearoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC; Avanti Polar Lipids Inc.), PEG-cDMA, e 1,2-dilinoleiloxi-3-(N;N- dimetil)aminopropano (DLinDMA) (ver, por exemplo, Judge, J. Clin. Invest. 119:661-673 (2009)). As formulações usadas para estudos in vivo podem compreender uma proporção final em massa de lípido/RNA de cerca de 9:1.

[0489] O perfil de segurança de nanomedicamentos RNAi foi revisto por Barros e Gollob da Alnylam Pharmaceuticals (ver, por exemplo, Advanced Drug Delivery Reviews 64 (2012) 1730-1737). A partícula lipídica de ácido nucleico estável (SNALP) é composta de quatro lípidos diferentes — um lípido ionizável (DLinDMA) que é catiônico a baixo pH, um lípido neutro auxiliar, colesterol, e um polietilenoglicol difusível (PEG)lípido. A partícula é aproximadamente de 80 nm em diâmetro e é de carga neutra a pH fisiológico. Durante a formulação, o lípido ionizável serve para condensar o lípido com o siRNA aniônico durante a formação de partícula. Quando carregado positivamente sob condições endossômicas cada vez mais ácidas, o lípido ionizável também medeia a fusão de SNALP com a membrana endossômica permitindo libertação de siRNA no citoplasma. O PEG-lípido estabiliza a partícula e reduz a agregação durante a formulação, e subsequentemente fornece um exterior hidrofílico neutro que melhora as propriedades farmacocinéticas.

[0490] Até à data, dois programas clínicos foram iniciados usando formulações de SNALPsiRNA. A Tekmira Pharmaceuticals completou recentemente a fase I do estudo de dose única de SNALP-ApoB em adultos voluntários com elevado colesterol LDL. ApoB é predominantemente expressa no fígado e em jejum e é essencial para a montagem e secreção de VLDL e LDL. ApoB é também dirigida com sucesso pelos sistemas CRISPR- Cas dos Requerentes, ver exemplos 37-38. Dezassete indivíduos receberam uma dose única de SNALP-ApoB (aumento da dose de 7 níveis de dose). Não houve evidência de toxicidade hepática (antecipado como a potencial toxicidade limitante da dose com base em estudos pré-clínicos). Um (de dois) indivíduos submetidos à dose mais elevada experienciou sintomas gripais consistentes com estimulação do sistema imunitário, e a decisão tomada foi de concluir o estudo.

[0491] A Alnylam Pharmaceuticals similarmente apresentou ALN-TTR01, que emprega a tecnologia SNALP descrita acima e que visa a produção de hepatócitos TTR mutante e tipo selvagem para tratar amiloidose de TTR (ATTR). Três síndromas ATTR têm sido descritos: polineuropatia amiloidótica familiar (FAP) e cardiomiopatia amiloidótica familiar (FAC) — ambos causados por mutações autossômicas dominantes em TTR; e amiloidose sistêmica senil (SSA) causada pela TTR tipo selvagem. Uma fase I de ensaio único de escalamento de dose controlado por placebo de ALN-TTR01 foi recentemente concluído em pacientes com ATTR. Administrou-se ALN-TTR01 como uma infusão IV de 15 minutos a 31 pacientes (23 com o fármaco de estudo e 8 com placebo) dentro de uma gama de dose de 0,01 a 1,0 mg/kg (com base no siRNA). O tratamento foi bem tolerado sem aumentos significativos nos testes da função hepática. Reações relacionadas com a perfusão foram observadas em 3 dos 23 pacientes a >0,4 mg/kg; todos responderam à desaceleração da taxa de perfusão e todos continuaram em estudo. Aumentos mínimos e transitórios de citocinas séricas IL-6, IP-10 e IL- 1ra foram observados em dois pacientes com a dose mais elevada de 1 mg/kg (como previsto a partir de estudos pré-clínicos e NHP). A redução de TTR no soro, o efeito farmacodinâmico esperado da ALN-TTR01, foi observado a 1 mg/kg.

[0492] Ainda em outra forma de realização, uma SNALP pode ser feita por solubilização de um lípido catiônico, DSPC, colesterol e PEG-lípido foram solubilizados em etanol a um rácio molar de 40:10:40:10, respectivamente (ver, Semple et al., Nature Niotechnology, Volume 28 Número 2 fevereiro de 2010, pp. 172-177). A mistura de lípidos foi adicionada a um tampão aquoso (citrato 50 mM, pH 4) com uma mistura de etanol e concentração final de lípido de 30% (vol/vol) e 6,1 mg/mL, respectivamente, e deixada equilibrar a 22 °C durante 2 min antes da extrusão. Os lípidos hidratados foram extrudados através de dois filtros empilhados de tamanho de poro-80 nm (Nuclepore) a 22 °C usando uma Extrusora Lipex (Northern Lipids) até ser obtido um diâmetro de vesícula de 70-90 nm, como determinado por análise de dispersão de luz dinâmica. Isto geralmente requer 1-3 passos. O siRNA (solubilizado em uma solução aquosa de citrato a 50 mM, pH 4 contendo 30% de etanol) foi adicionado às vesículas pré-equilibradas (35 °C) a uma taxa de ~5 mL/min com mistura. Após ser atingido um rácio de referência final siRNA/lípido de 0,06 (p/p), a mistura foi incubada durante mais 30 min a 35 °C para permitir a reorganização das vesículas e encapsulamento do siRNA. O etanol foi então removido e o tampão externo substituído com PBS (NaCl 155 mM, Na2HPO4 3 mM, KH2PO4 1 mM, pH 7,5) ou por diálise ou diafiltração de fluxo tangencial. siRNA foram encapsulados em SNALP usando um processo de método de diluição gradual controlada. Os componentes lipídicos de KC2-SNALP foram DLin-KC2-DMA (lípido catiônico), dipalmitoílfosfatidilcolina (DPPC; Avanti Polar Lipids), colesterol sintético (Sigma) e PEG-C-DMA usada a um rácio molar de 57,1:7,1:34.3:1,4. Após a formação das partículas carregadas, SNALP foram dialisados contra PBS e esterilizados por filtragem através de um filtro de 0,2 μm antes da utilização. Partículas de uma média de tamanhos de 75-85 nm e 90-95% do siRNA foram encapsuladas dentro das partículas lipídicas. O rácio final de siRNA/lípido em formulações utilizadas para os ensaios in vivo foi ~0,15 (p/p). Os sistemas LNP-siRNA contendo Fator VII siRNA foram diluídos para as concentrações apropriadas em PBS estéril imediatamente antes da utilização e as formulações foram administradas por via intravenosa através da veia lateral da cauda em um volume total de 10 mL/kg. Este método pode ser extrapolado para o Sistema CRISPR Cas da presente invenção.

[0493] Outros Lípidos

[0494] Outros lípidos catiônicos, tais como o amino lípido 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA) podem ser utilizados para encapsular CRISPR Cas de modo similar a SiRNA (ver, por exemplo, Jayaraman, Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 8529 -8533). Uma vesícula pré-moldada com a seguinte composição lipídica pode ser contemplada: amino lípido, distearoílfosfatidilcolina (DSPC), colesterol e (R)- 2,3-bis(octadeciloxi) propil-1-(metoxi poli(etilenoglicol)2000)propilcarbamato (PEG-lípido) em um rácio molar de 40/10/40/10, respectivamente, e um rácio de FVII siRNA/lípido total de aproximadamente 0,05 (p/p). Para assegurar uma aplicação de tamanho de partículas estreita na gama de 70-90 nm e um baixo índice de polidispersividade de 0,11_0,04 (n=56), as partículas podem ser extrudadas até três vezes através membranas de 80 nm antes de adicionar a CRISPR Cas RNA. Partículas contendo o amino lípido 16 altamente potente podem ser usadas, nas quais o rácio molar dos quatro componentes do lípido 16, DSPC, colesterol e PEG-lípido (50/10/38,5/1,5) as quais podem ser adicionalmente otimizadas para aumentar a atividade in vivo.

[0495] Michael S D Kormann et al. ("Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice: Nature Biotechnology, Volume:29, Páginas: 154 - 157 (2011) Publicado online a 09 de janeiro de 2011) descreve o uso de invólucros lipídicos para aplicar o RNA. Uso de invólucros lipídicos é também preferencial na presente invenção.

[0496] Em outra forma de realização, os lípidos podem ser formulados com o sistema CRISPR-Cas da presente invenção para formar nanopartículas lipídicas (LNPs). Lípidos incluem, mas não estão limitados a, DLin-KC2-DMA4, C12-200 ecolípidos disteroílfosfatidil colina, colesterol, e PEG-DMG podem ser formulados com CRISPR Cas em vez de siRNA (ver, por exemplo, Novobrantseva, Molecular Therapy-Nucleic Acids (2012) 1, e4; doi:10.1038/mtna.2011.3) usando um procedimento de formação espontânea de vesículas. O rácio molar do componente pode ser cerca de 50/10/38,5/1,5 (DLin-KC2-DMA ou C12- 200/disteroílfosfatidil colina/colesterol/PEG-DMG). O rácio final de lípidos:siRNA em peso pode ser ~12:1 e 9:1 no caso de DLin-KC2-DMA e C12-200 nanopartículas lipídicas (LNPs), respectivamente. As formulações podem ter diâmetros médios de partícula de ~80 nm com >90% de eficácia de aprisionamento. Uma dose de 3 mg/kg pode ser contemplada.

[0497] Tekmira tem um portfolio de aproximadamente 95 famílias de patentes, nos E.U.A. e no exterior, que são dirigidos a diferentes aspectos das formulações LNPS e LNP (ver, por exemplo, Pat. E.U.A. Nos. 7,982,027; 7,799,565; 8,058,069; 8,283,333; 7,901,708; 7,745,651; 7,803,397; 8,101,741; 8,188,263; 7,915,399; 8,236,943 e 7,838,658 e Pat. Europeias Nos. 1766035; 1519714; 1781593 e 1664316), todas as quais podem ser usadas e/ou adaptadas à presente invenção.

[0498] O sistema CRISPR-Cas pode ser distribuído encapsulado em PLGA Microesferas tal como aqueles adicionalmente descritos nos pedidos E.U.A. publicadas 20130252281 e 20130245107 e 20130244279 (atribuída a Moderna Therapeutics) que se referem a aspectos de formulação de composições compreendendo moléculas de ácido nucleico modificadas que podem codificar uma proteína, um precursor de proteína, ou uma forma parcial ou totalmente processada de proteína ou um precursor de proteína. A formulação pode ter um rácio molar de 50:10:38,5:1,5-3,0 (lípido catiônico:lípidos fusogênicos:colesterol:PEG lípido). Os lípidos PEG podem ser selecionados de, mas não se limitando a PEG-c-DOMG, PEG-DMG. Os lípidos fusogênicos podem ser DSPC. Ver também, Schrum et al., Delivery and Formulation of Engineered Nucleic Acids, Publicação do Pedido E.U.A. 20120251618.

[0499] A tecnologia nanomérica aborda os desafios de biodisponibilidade para uma ampla gama de agentes terapêuticos, incluindo medicamentos de baixo peso molecular hidrofóbicos, peptídeos, e terapêuticos com base em ácidos nucleicos (plasmídeo, siRNA, miRNA). Vias de administração específicas para a qual a tecnologia demonstrou vantagens claras incluem a via oral, transporte através da barreira sanguínea do cérebro, aplicação a tumores sólidos, assim como ao olho. Ver, por exemplo, Mazza et al., 2013, ACS Nano. 2013 fev 26;7(2):1016-26; Uchegbu e Siew, 2013, J Pharm Sci. 102(2):305-10 e Lalatsa et al., 2012, J Control Release. 2012 Jul 20;161(2):523-36.

[0500] O pedido da patente E.U.A. No. 20050019923 descreve dendrímeros catiônicos para aplicar moléculas bioativas, tais como moléculas de polinucleotídeos, peptídeos e polipeptídeos e/ou agentes farmacêuticos, a um corpo do mamífero. Os dendrímeros são adequados para o direcionamento da aplicação das moléculas bioativas a, por exemplo, o fígado, baço, pulmão, rim ou coração. Os dendrímeros são macromoléculas tridimensionais sintéticas que são preparadas de uma forma por passos a partir de unidades de monômeros ramificados simples, a natureza e a funcionalidade das quais pode ser facilmente controlada e diversificada. Os dendrímeros são sintetizados partindo da adição repetida de blocos de construção para um núcleo multifuncional (abordagem divergente para a síntese), ou para um núcleo multifuncional (abordagem convergente para a síntese) e cada adição de uma concha 3 dimensional de blocos de construção conduz à formação de uma maior geração de dendrímeros. Os dendrímeros de polipropilenimina tem início a partir de um núcleo diaminobutano ao qual é adicionado duas vezes o número de grupos amina por uma adição dupla de Michael de acrilonitrila às aminas primárias seguida pela hidrogenação dos nitrilos. Isso resulta em uma duplicação dos grupos amina. Os dendrímeros de polipropilenimina contêm 100% de nitrogênios protonáveis e até 64 grupos amina terminais (geração 5, DAB 64). Grupos protonáveis são geralmente grupos amina que são capazes de aceitar prótons a pH neutro. O uso de dendrímeros como agentes de distribuição de genes concentrou-se principalmente no uso de poliamidoamina. e compostos contendo fósforo com uma mistura de amina/amida ou N--P(O2)S como as unidades de conjugação respectivamente sem nenhum trabalho sendo relatado sobre a utilização dos dendrímeros de polipropilenimina menor geração da aplicação de genes. Os dendrímeros de polipropilenimina também têm sido estudados como sistemas de libertação controlada sensíveis ao pH para aplicação de fármaco e para a sua encapsulação de moléculas hóspedes quando quimicamente modificados por grupos de aminoácidos periféricos. A citotoxicidade e a interação dos dendrímeros de polipropilenimina com DNA assim como a eficácia de transfecção de DAB 64 também foi estudada.

[0501] O pedido da patente E.U.A. No. 20050019923 baseia-se na observação que, contrariamente aos relatórios anteriores, dendrímeros catiônicos, tais como os dendrímeros de polipropilenimina, exibem propriedades adequadas, tais como o direcionamento específico e baixa toxicidade, para uso no direcionamento da aplicação de moléculas bioativas, tal como material genético. Adicionalmente, os derivados de dendrímeros catiônicos também exibem propriedades adequadas para a aplicação direcionada de moléculas bioativas. Ver também, Bioactive Polímeros, Pedido E.U.A. publicado 20080267903, que divulga "Vários polímeros, incluindo polímeros de poliamina catiônicos e polímeros dendriméricos, revelaram possuir atividade antiproliferativa, e podem portanto ser útil para tratamento de afecções caracterizado por proliferação celular indesejável tal como neoplasmas e tumores, afecções respiratórias (incluindo afecções autoimunes), psoríase e aterosclerose. Os polímeros podem ser usados isoladamente como agentes ativos, ou como veículos de administração para outros agentes terapêuticos, tais como moléculas farmacológicas ou ácidos nucleicos para terapia de genes. Nesses casos, a própria atividade antitumoral intrínseca dos polímeros pode complementar a atividade dos agentes a serem aplicados."

[0502] Proteínas supercarregadas

[0503] As proteínas supercarregadas são uma classe de proteínas que ocorrem naturalmente ou modificadas com carga teórica líquida positiva ou negativa invulgarmente elevada. Ambas as proteínas carregadas supernegativamente e superpositivamente exibem uma notável capacidade para resistir a agregação induzida térmica ou quimicamente. Proteínas carregadas superpositivamente também são capazes de penetrar células de mamífero. Associando a carga com estas proteínas, esses DNA de plasmídeo, siRNA, ou outras proteínas, podem permitir que a aplicação funcional dessas macromoléculas em células de mamífero tanto in vitro como in vivo. O laboratório de David Liu relatou a criação e caracterização de proteínas supercarregadas em 2007 (Lawrence et al., 2007, Journal of the American Chemical Society 129, 10110-10112).

[0504] A aplicação não viral de siRNA e DNA de plasmídeo em células de mamífero são valiosas tanto para a investigação como para aplicações terapêuticas (Akinc et al., 2010, Nat. Biotech. 26, 561-569). A proteína purificada +36 GFP (ou outras proteínas carregadas superpositivamente) são misturadas com siRNAs em meios sem soro apropriados e deixadas a complexar antes da adição às células. A inclusão de soro, nesta fase, inibe a formação dos complexos proteína-siRNA supercarragados e reduz a eficácia de tratamento. O protocolo seguinte foi encontrado para ser eficaz em uma variedade de linhas celulares (McNaughton et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 6111-6116). Porém, experiências piloto variando a dose proteína e siRNA devem ser realizadas para otimizar o processo para linhas celulares específicas.

[0505] (1) Um dia antes do tratamento, semear 1 x 105 por poço em uma placa de 48 poços.

[0506] (2) No dia do tratamento, diluir proteína +36 GFP purificada em meio sem soro a uma concentração final de 200nM. Adicionar siRNA a uma concentração final de 50nM. Vórtex para misturar e incubação à temperatura ambiente durante 10min.

[0507] (3) Durante a incubação, aspiram-se os meios das células e lavam-se uma vez com PBS.

[0508] (4) A seguir à incubação de +36 GFP e siRNA, adicionar os complexos proteína-siRNA às células.

[0509] (5) Incubar células com complexos a 37°C durante 4h.

[0510] (6) A seguir à incubação, aspirar os meios e lavar três vezes com 20 U/mL de PBS com heparina. Incubar as células com meios contendo soro durante 48h adicionais ou mais longa dependendo do ensaio de inativação.

[0511] (7) As células de análise por imunotransferência, qPCR, ensaio fenotípico, ou outro método adequado.

[0512] Foi descoberto que +36 GFP é um reagente de aplicação eficaz de plasmídeo em uma gama de células. Dado que o DNA de plasmídeo é de uma carga maior que o siRNA, proporcionalmente mais proteína +36 GFP é requerida para complexar eficientemente plasmídeos. Para a aplicação eficiente de plasmídeo os Requerentes desenvolveram uma variante de +36 GFP carregando um peptídeo tag HA2 C-terminal, um conhecido derivado peptídeo de desregulação de endossomo a partir da proteína hemaglutinina do vírus da gripe. O protocolo seguinte tem sido eficiente em uma variedade de células, mas como acima, é aconselhável que o DNA de plasmídeo e doses de proteína supercarregadas sejam otimizadas para linhas celulares específicas e aplicações de aplicação.

[0513] (1) Um dia antes do tratamento, plaquear 1 x 105 por poço em uma placa de 48 poços.

[0514] (2) No dia do tratamento, diluir a proteína +36 GFP purificada em meio sem soro a uma concentração final de 200nM. Adicionar 1 mg de DNA de plasmídeo. Vórtex para misturar e incubação à temperatura ambiente durante 10min.

[0515] (3) Durante a incubação, aspiram-se os meios das células e lava-se uma vez com PBS.

[0516] (4) A seguir à incubação de +36 GFP e DNA de plasmídeo, adicionar cuidadosamente os complexos proteína-DNA às células.

[0517] (5) Incubar células com complexos a 37°C durante 4h

[0518] (6) A seguir à incubação, aspirar os meios e lavar com PBS. Incubar células em meios contendo soro e incubar durante mais 24-48h.

[0519] (7) Analisar aplicação de plasmídeo (por exemplo, por a expressão do gene dirigido por plasmídeo) como apropriado.

[0520] Ver também, por exemplo, McNaughton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 6111-6116 (2009); Cronican et al., ACS Chemical Biology 5, 747-752 (2010); Cronican et al., Chemistry & Biology 18, 833-838 (2011); Thompson et al., Methods in Enzymology 503, 293-319 (2012); Thompson, D.B., et al., Chemistry & Biology 19 (7), 831-843 (2012). Os métodos das proteínas supercarregadas pode ser usado e/ou adaptado para aplicação do sistema CRISPR-Cas da presente invenção.

[0521] Peptídeos penetradores de células

[0522] Ainda em outra forma de realização, peptídeos penetradores de células (CPPs) são contemplados para a aplicação do sistema CRISPR Cas. CPPs são peptídeos curtos que facilitam a captação celular de várias cargas moleculares (de partículas com nanotamanho a pequenas moléculas químicas e grandes fragmentos de DNA). O termo “carga” como usado aqui inclui mas não está limitado ao grupo consistindo em agentes terapêuticos, sondas de diagnóstico, peptídeos, ácidos nucleicos, oligonucleotídeos antissenso, plasmídeos, proteínas, nanopartículas, lipossomos, cromóforos, pequenas moléculas e materiais radioativos. Em aspectos da invenção, a carga podem também compreender qualquer componente do sistema CRISPR cas ou o sistema CRISPR Cas funcional inteiro. Aspectos da presente invenção provêm adicionalmente métodos para aplicação de uma carga desejada em um sujeito compreendendo: (a) preparação de um complexo compreendendo o peptídeo penetrador de células da presente invenção e uma carga desejada, e (b) administração oral, intra-articular, intraperitoneal, intratecal, intra-arterial, intranasal, intraparênquimal, subcutânea, intramuscular, intravenosa, dérmica, intrarretal, ou tópica do complexo a um sujeito. A carga está associada aos peptídeos através de ligação química através de ligações covalentes ou através de interações não covalentes.

[0523] A função dos CPPs é aplicar a carga às células, um processo que ocorre comummente através de endocitose com a carga aplicada aos endossomos de células de mamífero vivas. Os peptídeos penetradores de células têm diferentes tamanhos, sequências de aminoácidos, e cargas mas todos os CPPs têm uma característica distinta, que é a capacidade de translocarem a membrana e facilitarem a aplicação de várias cargas moleculares para o citoplasma ou um organelo. A translocação de CPP pode ser classificada em três mecanismos de entrada principais: penetração direta na membrana, entrada mediada por endocitose, e translocação através da formação de uma estrutura transitória. Os CPPs têm encontrado numerosas aplicações em medicina como agentes de aplicação de fármacos no tratamento de diferentes doenças incluindo inibidores do câncer e vírus, bem como agentes de contraste para marcação de células. Exemplos destes últimos incluem atuação como um transportador para GFP, agentes de contraste de MRI, ou pontos quânticos. Os CPPs têm grande potencial como vetores de aplicação in vitro e in vivo para uso em investigação e medicina. Os CPPs têm tipicamente uma composição de aminoácidos que contém um abundância relativa elevada de aminoácidos positivamente carregados tais como lisina ou arginina ou têm sequências que contêm um padrão alternativo de aminoácidos polares/carregados e aminoácidos não polares, hidrofóbicos. Estes dois tipos de estruturas são referidas como policatiônicas ou anfipáticas, respectivamente. Uma terceira classe de CPPs é os peptídeos hidrofóbicos, contendo somente resíduos apolares, com baixa carga líquida ou tendo grupos aminoácidos hidrofóbicos que são cruciais para captação celular. Um dos CPPs descobertos iniciais foi o ativador transcricional transativante (Tat) do Vírus da Imunodeficiência Humana 1 (VIH-1) que se descobriu que era eficazmente absorvido pelo meio envolvente por numerosos tipos de células em cultura. Desde aí, o número de CPPs conhecidos tem se expandido consideravelmente e análogos sintéticos de pequena molécula com propriedades de transdução de proteínas mais eficazes foram gerados. Os CPPs incluem mas não estão limitados a Penetratina, Tat (48-60), Transportan, e (R-AhX- R4) (Ahx=aminohexanoíl).

[0524] A patente dos EUA 8,372,951 provê um CPP derivado de proteína catiônica de eosinófilos (ECP) que exibe eficácia altamente penetradora de células e baixa toxicidade. Aspectos de aplicação do CPP com a sua carga a um sujeito vertebrado são também providos. Aspectos adicionais de CPPs e sua aplicação podem estar nas patentes dos EUA 8,575,305; 8;614,194 e 8,044,019.

[0525] Que os CPPs possam ser empregues para aplicar o sistema CRISPR-Cas é também provido no manuscrito “Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA”, por Suresh Ramakrishna, Abu- Bonsrah Kwaku Dad, Jagadish Beloor, et al. Genome Res. 2 de abril de 2014. [Epub antes da impressão], incorporado por referência na sua totalidade, em que é demonstrado que o tratamento com proteína Cas9 recombinante conjugada com CPP e RNAs guia complexados com CPP leva a disrupções de genes endógenos em linhas celulares humanas. No artigo, a proteína Cas9 foi conjugada com CPP através de uma ligação de tioéter, ao passo que o RNA guia foi complexado com CPP, formando nanopartículas positivamente carregadas, condensadas. Foi mostrado que o tratamento simultâneo e sequencial de células humanas, incluindo células-tronco embriônicas, fibroblastos dérmicos, células HEK293T, células HeLa, e células de carcinoma embriônico, com a Cas9 e RNA guia modificados levou a disrupções de genes eficazes com mutações fora do alvo reduzidas em relação a transfecções com plasmídeos.

[0526] Dispositivos implantáveis

[0527] Em outra forma de realização, os dispositivos implantáveis são também contemplados para aplicação do sistema CRISPR-Cas. Por exemplo, o Pedido da Patente E.U.A. 20110195123 divulga um dispositivo médico implantável o qual elui um fármaco localmente e em períodos prolongados que é provido, incluindo vários tipos desse dispositivo, os modos de tratamento de implementação e métodos de implantação. O dispositivo compreendendo o substrato polimérico, tal como uma matriz por exemplo, que é usada como o corpo do dispositivo, e fármacos, e em alguns casos materiais de plataformas adicionais, tais como metais ou polímeros adicionais, e materiais para aumentar a visibilidade e imagiologia. A seleção de fármaco é baseada nas vantagens de libertar o fármaco localmente e em um período prolongado, onde o fármaco é libertado diretamente à matriz extracelular (ECM) da área da doença tal como um tumor, inflamação, degeneração ou para objetivos sintomáticos, ou para células do músculo liso lesadas, ou para prevenção. Um tipo de fármaco é o fármaco de silenciamento de genes com base na interferência de RNA (RNAi), incluindo mas não limitado a si RNA, sh RNA, ou RNA/DNA antissenso, ribossomo e análogos de nucleosídeos. Portanto, este sistema pode ser usado e/ou adaptado para o sistema CRISPR-Cas da presente invenção. Os modos de implantação em algumas formas de realização são procedimentos de implantação existentes que são desenvolvidos e usados atualmente para outros tratamentos, incluindo braquiterapia e biópsia com agulha. Nesses casos as dimensões do novo implante descrito nesta invenção são semelhantes às do implante original. Tipicamente alguns dispositivos são implantados durante o mesmo processo de tratamento.

[0528] Como descrito no Pedido da Patente E.U.A. 20110195123, é proporcionado um sistema de aplicação de fármaco implantável ou inserível, incluindo sistemas aplicáveis a uma cavidade tal como cavidade abdominal e/ou qualquer outro tipo de administração no qual o sistema de aplicação de fármaco não é ancorado ou ligado, compreendendo um substrato polimérico bioestável e/ou degradável e/ou bioabsorvível, o qual pode por exemplo opcionalmente ser uma matriz. Deve notar-se que o termo "inserção" também inclui a implantação. O sistema de aplicação de fármaco é preferencialmente implementado como um "Loder" como descrito no Pedido da patente E.U.A. 20110195123.

[0529] O polímero ou a pluralidade de polímeros são biocompatíveis, incorporando um agente e/ou vários agentes, viabilizando a libertação de agente a uma taxa controlada, em que o volume total do substrato polimérico, tal como uma matriz por exemplo, em algumas formas de realização é opcionalmente e preferencialmente não maior que um volume máximo que permite um nível terapêutico do agente a alcançar. Como um exemplo não limitativo, um tal volume é preferencialmente dentro da gama de 0,1 m3 até 1000 mm3, conforme exigido pelo volume para a carga do agente. O Loder pode opcionalmente ser maior, por exemplo quando incorporado com um dispositivo cujo tamanho é determinado pela funcionalidade, por exemplo e sem limitação, uma articulação do joelho, um anel intrauterino ou cervical e semelhantes.

[0530] O sistema de aplicação de fármaco (para aplicar a composição) é concebido em algumas formas de realização para preferencialmente empregar polímeros degradáveis, em que o mecanismo de libertação principal é a erosão em massa; ou em algumas formas de realização, são usados polímeros não degradáveis, ou lentamente degradáveis, em que o mecanismo de libertação principal é a difusão, em vez de erosão em massa, de modo que a parte exterior funciona como membrana, e sua parte interna funciona como um reservatório de fármaco, o qual praticamente não é afetado pelo ambiente circundante durante um período extenso (por exemplo desde cerca de uma semana até cerca de alguns meses). Combinações de diferentes polímeros com diferentes mecanismos de libertação podem também opcionalmente ser usadas. O gradiente de concentração na superfície é preferencialmente mantido efetivamente constante durante um período significativo do período de liberação total do fármaco, e portanto a taxa de difusão é efetivamente constante (chamado "modo zero " de difusão). Pelo termo "constante" entende-se uma taxa de difusão é preferencialmente mantida acima do limite inferior de eficácia terapêutica, mas pode, opcionalmente, ainda apresentar um aumento repentino inicial e/ou oscilar, por exemplo aumentar e diminuir até certo grau. A taxa de difusão é preferivelmente mantida assim durante um prolongado período, podendo ser considerado constante para um determinado nível para otimizar o período terapeuticamente eficaz, por exemplo, o período de silenciamento eficaz.

[0531] O sistema de aplicação de fármaco opcionalmente e preferencialmente é concebido para proteger o agente terapêutico à base de nucleotídeo da degradação, quer de natureza química ou devido a ataque de enzimas e outros fatores no corpo do indivíduo.

[0532] O sistema de aplicação de fármaco como descrito no Pedido da Patente E.U.A. 20110195123 é opcionalmente associado com sensores e/ou aparelhos de ativação que são operados a e/ou após implantação do dispositivo, através de métodos não invasivos e/ou minimamente invasivos de ativação e/ou aceleração/desaceleração, por exemplo opcionalmente incluindo mas não limitado a métodos ou dispositivos de aquecimento e arrefecimento térmico, raios laser, e ultrassônicos, incluindo ultrassons focalizados e/ou RF (radiofrequência).

[0533] De acordo com algumas formas de realização do Pedido da Patente E.U.A. 20110195123, sítios para aplicação local podem opcionalmente incluir sítios alvo caracterizados por uma elevada proliferação anormal de células, e apoptose suprimida, incluindo tumores, inflamação e infecção ativa e ou crônica incluindo estados de doença autoimune, degeneração de tecido incluindo músculo e tecido nervoso, dor crônica, sítios degenerativos, e local de fraturas ósseas e outros locais de feridas para melhorar a regeneração do tecido, e músculo cardíaco, liso e estriado lesionado. O sítio para aplicação local também pode opcionalmente incluir sítios que permitem a realização de atividades preventivas incluindo gravidez, prevenção da infecção e envelhecimento.

[0534] O sítio de implantação da composição, ou sítio alvo, preferencialmente apresenta um raio, área e/ou volume que é suficientemente pequeno para aplicação ao local alvo. Por exemplo, o sítio alvo opcionalmente tem um diâmetro em uma gama desde cerca de 0,1 mm até cerca 5 cm.

[0535] A localização do local alvo é preferencialmente selecionado para a eficácia terapêutica máxima. Por exemplo, a composição do sistema de aplicação de fármaco (opcionalmente com um dispositivo para implantação como descrito acima) é opcionalmente e preferencialmente implantado dentro ou na proximidade de um ambiente tumoral, ou fornecimento de sangue associado do mesmo.

[0536] Por exemplo a composição (opcionalmente com o dispositivo) é opcionalmente implantado dentro ou na proximidade do pâncreas, próstata, mama, fígado, através do mamilo, dentro do sistema vascular e assim sucessivamente.

[0537] A localização alvo é opcionalmente selecionada partindo do grupo consistindo em (somente como exemplos não limitativos, como opcionalmente qualquer sítio dentro do corpo pode ser adequado para implantar um Loder): 1. cérebro em locais degenerativos como na doença de Parkinson ou Alzheimer no gânglios basais, matéria branca e cinzenta; 2. coluna, como no caso da esclerose lateral amiotrófica (ALS); 3. colo uterino para prevenir a infecção por HPV; 4. inflamações agudas e crônicas das articulações; 5. derme como no caso da psoríase; 6. sítios nervosos simpáticos e sensoriais para efeito analgésico; 7. Implantação Intraóssea; 8. sítios de infecção aguda e crônica; 9. Intravaginal; 10. ouvido interno - sistema auditivo, labirinto do ouvido interno, sistema vestibular; 11. Intratraqueal; 12. Intracardíaca; coronária, epicárdico; 13. bexiga urinária; 14. sistema biliar; 15. tecidos parenquimatosos, incluindo e não se limitando ao rim, fígado, baço; 16. nódulos linfáticos; 17. glândulas salivares; 18. gengivas dentária; 19. Intra-articular (nas articulações); 20. Intraocular; 21. tecido cerebral; 22. Ventrículos cerebrais; 23. Cavidades, incluindo cavidade abdominal (por exemplo, mas sem limitação, para câncer do ovário); 24. Intraesofágico e 25. Intrarretal.

[0538] Opcionalmente a inserção do sistema (por exemplo um dispositivo contendo a composição) está associada com injeção de material ao ECM no sítio alvo e na proximidade desse sítio para afetar o pH local e/ou temperatura e/ou outros fatores biológicos afetam a difusão do fármaco e/ou as cinéticas no ECM, dos sítios alvo e a proximidade desse sítio.

[0539] Opcionalmente, de acordo com algumas formas de realização, a libertação do referido agente poderia ser associado com sensor e/ou aparelhos de ativação que são operados antes e/ou à e/ou após inserção, por métodos não e/ou minimamente invasivos e/ou outros métodos de ativação e/ou aceleração/desaceleração, incluindo métodos de feixe de laser, radiação, aquecimento e refrigeração térmica, e ultra sônico, incluindo ultrassons focalizados e/ou RF (radiofrequência) ou dispositivos, e ativadores químicos.

[0540] De acordo com outras formas de realização do Pedido da Patentes E.U.A. 20110195123, o fármaco preferencialmente compreende um fármaco RNAi biológica silenciador de gene, por exemplo para casos de câncer localizado na mama, pâncreas, cérebro, rim, bexiga, pulmão, e próstata como descrito a seguir. Além disso, muitos fármacos outros para além de siRNA são aplicáveis a ser encapsulado em Loder, e pode ser utilizado em associação com esta invenção, contanto que esses fármacos possam ser encapsulados com o substrato Loder, tal como uma matriz por exemplo. Esses fármacos incluem fármacos aprovados que são aplicados hoje por métodos outros para além dos desta invenção, incluindo Amfotericina B para a infecção fúngica; antibióticos, tais como na osteomielite; analgésicos tais como narcóticos; anti degenerativos tais como em doença de Alzheimer ou Parkinson em um Loder implantado nas imediações da coluna vertebral, no caso de dor lombar. Um tal sistema pode ser usado e/ou adaptado para a aplicação do sistema CRISPR-Cas da presente invenção.

[0541] Por exemplo, para aplicações específicas tais como a prevenção do crescimento ou rebrote de células do músculo liso (que são lesadas durante um procedimento de colocação de stent e, como resultado tendem a proliferar), o fármaco pode opcionalmente ser siRNA que silencia as células do músculo liso, incluindo silenciamento de H19, ou um fármaco selecionado partindo do grupo consistindo em taxol, rapamicina e análogos de rapamicina. Nesses casos o Loder é preferencialmente ou um Drug Eluting Stent (DES), com libertação prolongada a uma taxa constante, ou um dispositivo ajustado que é implantado separadamente, em associação com o stent. Todos estes podem ser usados e/ou adaptados ao sistema CRISPR-Cas da presente invenção.

[0542] Como outro exemplo de uma aplicação específica, doença neuro e muscular degenerativa desenvolvida devido à expressão do gene anormal. O local de aplicação de RNAs de silenciamento pode ter propriedades terapêuticas para interferir com tal expressão do gene anormal. A aplicação local de fármacos anti apoptóticos, anti inflamatórios e anti degenerativos incluindo pequenos fármacos e macromoléculas podem também ser opcionalmente terapêuticos. Nesses casos o Loder é aplicado para libertação prolongada a uma taxa constante e/ou através de um dispositivo dedicado que é implantado separadamente. Todos estes podem ser usados e/ou adaptados ao sistema CRISPR-Cas da presente invenção.

[0543] Ainda um outro exemplo de uma aplicação específica, distúrbios psiquiátricos e cognitivos são tratados com modificadores de genes. Inativação de gene com silenciamento de RNA é uma opção de tratamento. Loders distribuindo localmente agentes com base em nucleotídeos aos locais do sistema nervoso central são opções terapêuticas para distúrbio psiquiátrico e cognitivo incluindo mas não se limitando a psicose, doença bipolar, distúrbio neurótico e doenças comportamentais. Os Loders também poderia aplicar fármacos localmente incluindo fármacos de pequenas macromoléculas após a implantação em regiões específicas do cérebro. Todos estes podem ser usados e/ou adaptados ao sistema CRISPR-Cas da presente invenção.

[0544] Como outro exemplo de uma aplicação específica, o silenciamento de mediadores imunes inatos e/ou adaptativos a sítios locais permite a prevenção de rejeição de órgãos transplantados. A aplicação local de RNAs de silenciamento e reagentes de imunomodulação com o Loder implantado no órgão transplantado e/ou o local implantado tornando a supressão imunitária ao repelir as células imunes tais como CD8 ativada contra o órgão transplantado. Todos estes podem ser usados e/ou adaptados ao sistema CRISPR-Cas da presente invenção.

[0545] Como outro exemplo de uma aplicação específica, os fatores de crescimento vascular incluindo VEGFs e angiogenina e outros são essenciais para neovascularização. A aplicação local dos fatores, peptídeos, peptidomiméticos, ou supressão dos seus repressores é uma importante forma de realização terapêutica; o silenciamento de repressores e a aplicação local dos fatores, peptídeos, macromoléculas e pequenos fármacos que estimulam a angiogênese com o Loder é terapêutico para doença periférica, sistêmica e cardiovascular.

[0546] O método de inserção, como implante, pode opcionalmente ser também utilizado para outros tipos de implante de tecidos e/ou para inserções e/ou para amostragem de tecidos, opcionalmente sem modificações, ou em alternativa opcionalmente somente com modificações não cruciais nesses métodos. Tais métodos incluem opcionalmente mas não estão limitados a métodos de braquiterapia, biopsia, endoscopia com e/ou sem ultrassons, tais como ERCP, métodos estereotáxicos no tecido cerebral, Laparoscopia, incluindo implantação nas articulações com um laparoscópio, órgãos abdominais, cavidades da parede da bexiga e do corpo.

[0547] mRNA e RNA guia de enzima CRISPR

[0548] Os mRNA e RNA guia de enzima CRISPR podem ser também aplicados separadamente. O mRNA de enzima CRISPR pode ser distribuído antes do RNA guia para dar tempo a que a enzima CRISPR seja expressada. mRNA de enzima CRISPR deve ser administrado 1-12 horas (preferencialmente cerca de 2-6 horas) antes da administração do RNA guia.

[0549] De modo alternativo, mRNA e RNA guia de enzima CRISPR podem ser administrados conjuntamente. Vantajosamente, uma segunda dose de reforço de RNA Guia pode ser administrada 1-12 horas (preferencialmente cerca de 2-6 horas) após a administração inicial de mRNA + RNA guia de enzima CRISPR.

[0550] Administrações adicionais de mRNA e/ou RNA guia de enzima CRISPR devem ser úteis para atingir os níveis mais eficientes da modificação do genoma.

[0551] Para minimizar a toxicidade e efeitos fora do alvo, será importante controlar a concentração de mRNA e RNA guia de enzima CRISPR aplicados. As concentrações ótimas de mRNA e RNA guia de enzima CRISPR podem ser determinadas testando diferentes concentrações em um modelo celular ou animal e usando sequenciação profunda da análise da extensão da modificação no potencial dos locais fora do alvo genômico. Por exemplo, para a sequência guia de direcionamento 5’- GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA-3’ no gene EMX1 do genoma humano, pode usar-se sequenciação profunda para avaliar o grau de modificação nos seguintes dois locais fora do alvo, 1: 5’- GAGTCCTAGCAGGAGAAGAA-3’ e 2: 5’-GAGTCTAAGCAGAAGAAGAA-3’. A concentração que dá o mais alto nível de modificação no alvo enquanto minimiza o nível de modificação fora de alvo devendo ser escolhida para a aplicação in vivo.

[0552] De modo alternativo, para minimizar o nível de toxicidade e efeitos fora do alvo, mRNA nickase de enzima CRISPR (por exemplo Cas9 de S. pyogenes com a mutação D10A) podem ser aplicados com um par de RNAs guia visando um sítio de interesse. Os dois RNA de orientação precisam ser espaçados como se segue. Sequências guias a vermelho (sublinhado simples) e azul (sublinhado duplo) respectivamente (estes exemplos são baseados nos requisitos PAM para Streptococcus pyogenes Cas9).

[0553] Além disso a interrogativa do sistema deu aos Requerentes evidência de uma saliência 5’ (ver, por exemplo, Ran et al., Cell. 2013 set 12;154(6):1380-9 e Série Pedido de Patente Provisório US No. 61/871,301 registado em agosto 28, 2013). Os Requerentes identificaram adicionalmente parâmetros que relacionam clivagem eficiente pelo mutante nickase Cas9 quando em combinação com dois RNAs guia e estes parâmetros incluem mas não estão limitados ao comprimento de uma saliência 5’. Em formas de realização da invenção a saliência 5’ é, no máximo, 200 pares de bases, preferencialmente no máximo, 100 pares de bases, ou mais preferencialmente no máximo, 50 pares de bases. Em formas de realização da invenção a saliência 5’ é pelo menos 26 pares de bases, preferencialmente pelo menos 30 pares de bases ou mais preferencialmente 34-50 pares de bases ou 1-34 pares de bases. Noutros métodos preferenciais da invenção a primeira sequência guia dirige a clivagem feita na cadeia do duplex de DNA perto da primeira sequência alvo e da segunda sequência guia dirigindo a clivagem de outra cadeia perto de uma segunda sequência alvo resulta em um corte brusco ou uma saliência 3 '. Em formas de realização da invenção a saliência 3' é, no máximo 150, 100 ou 25 pares de bases ou pelo menos 15, 10 ou 1 pares de bases. Em formas de realização preferenciais a saliência 3 ‘é 1-100 pares de bases.

[0554] Aspectos da invenção referem-se à expressão do produto de gene que é diminuído ou um polinucleotídeo modelo que é adicionalmente introduzido na molécula de DNA codificando o produto de gene ou uma sequência interveniente a ser excisada com precisão permitindo que as duas saliências 5 ‘ se voltem a hibridar e ligar ou a atividade ou função do produto de gene sendo alterado ou a expressão do produto de gene sendo aumentado. Em uma forma de realização da invenção, o produto de gene é uma proteína.

[0555] Somente os pares sgRNA criando saliências 5‘com menos de 8pb sobreposição entre as sequências guias (deslocamento maior do que -8 pb) foram capazes de mediar a formação de indel detectável. É importante ressaltar que cada guia utilizado nestes ensaios é capaz de induzir eficientemente indels quando combinadas com a Cas9 tipo selvagem, indicando que as posições relativas dos pares de guia são os parâmetros mais importantes na predição de dupla atividade de recorte.

[0556] Uma vez que Cas9n e Cas9H840A recortam as cadeias opostas do DNA, a substituição da Cas9n por Cas9H840A com um dado par sgRNA deve resultar na inversão da saliência tipo. Por exemplo, um par de sgRNAs que irá gerar uma saliência 5 ‘com Cas9n deverá em princípio gerar a correspondente saliência 3’. Portanto, os pares sgRNA que dirigem a formação de uma saliência 3’ com Cas9n devem ser usados com Cas9H840A para gerar a saliência 5’. Inesperadamente, os Requerentes testaram Cas9H840A com um conjunto de pares sgRNA desenhados para gerarem ambas as saliências 5’e 3’ (deslocamento na gama desde-278 até +58 pb), mas foram incapazes de observar a formação de indel. Pode ser necessário mais trabalho para identificar as regras de desenho necessárias para que os pares sgRNA permitam duplo recorte porCas9H840A.

[0557] Pro-proteína subtilisina convertase Kexin 9 (PCSK9), fígado

[0558] Os dados acima mostram conversão fenotípica.

[0559] A pró-proteína subtilisina convertase Kexin 9 (PCSK9 é um membro da família da protease serina. PCSK9 é expressa primariamente pelo fígado e é crítica para a regulação para baixo da expressão do receptor LDL do hepatócito. Os níveis de LDL-C no plasma são muitíssimo elevados em humanos com ganho de mutações de função em PCSK9, classificando-os como tendo hipercolesterolemia grave. Portanto, PCSK9 é um alvo atrativo para CRISPR. CRISPR visando PCS9K pode ser formulada em uma partícula lipídica e por exemplo administrada a cerca de 15, 45, 90, 150, 250 e 400 μg/kg por via intravenosa (ver, por exemplo, http://www.alnylam.com/capella/wp- content/uploads/2013/08/ALN-PCS02-001-Protocol-Lancet.pdf).

[0560] Bailey et al. (J Mol Med (Berl). 1999 Jan;77(1):244-9) divulgam a aplicação de insulina por terapia genética ex vivo de células somáticas envolve a remoção de células somáticas não de células B (por exemplo fibroblastos) de um paciente diabético, e alterando-as geneticamente in vitro para produzir e secretar insulina. As células podem ser cultivadas e devolvidas ao dador como uma fonte de reposição de insulina. As células modificadas desse modo poderiam ser avaliadas antes do implante, e estoques de reserva poderiam ser criopreservadas. Usando as células do próprio paciente, o procedimento deveria obviar a necessidade de imunossupressão e superar o problema do fornecimento de tecido, evitando ao mesmo tempo a repetição de destruição celular. A terapia de genes de células somáticas ex-vivo requer um tipo de células acessíveis e robustas sendo passíveis de adaptação a várias transfecções e sujeito a proliferação controlada. Problemas especiais associados com o uso de células somáticas não células B incluem o processamento a proinsulina em insulina, e a atribuição de sensibilidade à biossíntese de glicose estimulada pela proinsulina e liberação de insulina reguladamente. Estudos preliminares usando fibroblastos, células da pituitária, células do rim (COS) e células do ovário (CHO) sugerem que estes desafios podem ser atingidos, e que a terapia de genes de células somáticas ex-vivo oferece uma abordagem exequível à terapia de reposição de insulina. O sistema de Bailey et al. pode ser usado/ou adaptado ao sistema CRISPR-Cas da presente invenção para aplicação ao fígado.

[0561] Os métodos de Sato et al. (Nature Biotecnologia Volume 26 Número 4 abril 2008, Páginas 431-442) podem ser aplicados ao sistema CRISPR-Cas da presente invenção para aplicação ao fígado. Sato et al. verificaram que tratamentos com os lipossomos acoplados a vitamina A carregando siRNA quase resolvem completamente a fibrose do fígado e prolongara, a sobrevivência em ratos com cirrose letal do fígado induzida por dimetilnitrosamina em um modo dependente de dose e de duração. Lipossomos catiônicos (Lipotrust) contendo cloreto de O,O’-ditetradecanoíl-N-(a-trimetilamonioacetil) dietanolamina (DC-6-14) como lípido catiônico, colesterol e dioleoílfosfatidiletanolamina a um rácio molar de 4:3:3 (que demonstrou alta eficiência de transfecção em condições que continham soro para aplicação de gene in vitro e in vivo) foram comprados ao Hokkaido System Science. Os lipossomos foram fabricados usando um método lipossomos vazios liofilizados e preparados a uma concentração de 1 mM (DC-164) por adição de água bidestilada (DDW) à mistura de lípidos liofilizada sob vórtex antes do uso. Para preparar lipossomos, acoplados a VA, 200 nmol de vitamina A (retinol, Sigma) dissolvidos em DMSO foram misturados com as suspensões de lipossomos (100 nmol como DC-16-4) por vórtex em um tubo de 1,5 mL a 25 °C. Para preparar lipossomos, acoplados a VA carregando siRNAgp46 (VA-lip-siRNAgp46), uma solução de siRNAgp46 (580 pmol/mL em DDW) foi adicionada à solução de lipossomo acoplada a retinol com agitação a 25 C. O rácio de siRNA para DC-16-4 foi 1:11,5 (mol/mol) e o rácio de siRNA para lipossomo (p/p) foi 1:1. Qualquer vitamina A ou siRNA livre que não foi retomada por lipossomos foi separada das preparações lipossômicas usando um sistema micropartição (concentrador VIVASPIN 2 30,000 MWCO PES, VIVASCIENCE). A suspensão lipossômica foi adicionada aos filtros e centrifugada a 1.500 g durante 5 min 3 vezes a 25 °C. Se recolheram as frações e o material capturado no filtro foi reconstituído com PBS para se obter a dose desejada para uso in vitro ou in vivo. Três injeções de 0,75 mg/kg de siRNA foram dadas todos os dias aos ratos. O sistema de Sato et al. pode ser usado e/ou adaptado ao sistema CRISPR-Cas da presente invenção para aplicação ao fígado aplicando cerca de 0,5 a 1 mg/kg de CRISPR Cas RNA nos lipossomos conforme descrito por Sato et al. para humanos.

[0562] Os métodos de Rozema et al. (PNAS, agosto 7, 2007, vol. 104, no. 32) para um veículo para aplicação de siRNA aos hepatócitos tanto in vitro como in vivo, os quais Rozema et al. nomearam de siRNA Dynamic PoliConjugates podem também ser aplicados à presente invenção. As principais características da tecnologia Dynamic Poli-Conjugate inclui uma polímero ativo para membrana, a capacidade de reversibilidade mascara a atividade deste polímero até se atingir o ambiente acídico dos endossomos, e a capacidade de direcionamento deste polímero modificado e a sua carga siRNA especificamente para os hepatócitos in vivo após uma única injeção i.v. de baixa pressão. SiRNAs modificados por SATA são sintetizados por reação de siRNA5’ aminamodificados com 1 equivalente em peso (eq p) de reagente Nsuccinimidil-S- acetiltioacetato (SATA) (Pierce) e 0,36 eq em p de NaHCO3 em água a 4°C durante 16 h. Os siRNAs modificados são então precipitados pela adição de 9 vol de etanol e incubação a 80°C durante 2 h. O precipitado é ressuspendido em 1X tampão siRNA (Dharmacon) e quantificado medindo a absorbância a 260 nm de comprimento de onda. Se modificou PBAVE (30 mg/mL em 5mMTAPS, pH 9) adicionando 1,5 % em peso de SMPT (Pierce). Após a 1 h de incubação, se adicionara, 0,8 mg de SMPT-PBAVE a 400 μl de solução de glucose isotônica contendo 5 mM de TAPS (pH 9). A esta solução adicionaram-se 50 μg de SiRNA modificado por SATA. Para as experiências de dose-resposta em que [PBAVE] era constante, são adicionadas diferentes quantidades de siRNA. A mistura é então incubada durante 16 h. Se adiciona então à solução 5,6 mg de Hepes base livre seguido por uma mistura de 3,7 mg de CDM-NAG e 1,9mg de CDM-PEG. A solução é então incubada durante pelo menos 1 h à temperatura ambiente antes da injeção. CDM-PEG e CDM-NAG são sintetizados partindo de cloreto gerado pelo uso de cloreto de oxalila. Ao cloreto ácido adiciona-se 1,1 equivalentes molares éter monometílico de polietilenoglicol (peso molecular em de 450) para gerar CDM-PEG ou (aminoetoxi)etoxi-2-(acetilamino)-2-deoxi-β-D- glucopiranosídeo para gerar CDM-NAG. O produto final é purificado usando HPLC de fase reversa com um gradiente de 0,1% de TFA água/acetonitrilo. Cerca de 25 a 50 μg de siRNA foram aplicados aos camundongos. O sistema de Rozema et al. pode ser aplicado ao sistema CRISPR-Cas da presente invenção para aplicação ao fígado, por exemplo prevendo uma dosagem de cerca de 50 até cerca 200 mg de CRISPR Cas para aplicação a um humano.

[0563] Osso

[0564] Oakes e Lieberman (Clin Orthop Relat Res. 2000 out;(379 Sppl):S101-12) discutiram a aplicação de genes ao osso. Transferindo genes para as células em um sítio anatômico específico, as propriedades osteoindutivas dos fatores de crescimento podem ser usadas em doses fisiológicas durante um período sustentado para facilitar uma mais significativa resposta de cura. O sítio anatômico específico, a qualidade do osso, e o invólucro do tecido mole, influenciam a seleção das células alvo para terapia de genes em uma região. Vetores de terapia de genes aplicados no sítio de tratamento em veículos osteocondutores deram resultados promissores. Vários investigadores têm demonstrado resultados emocionantes usando terapia da região de genes ex vivo e in vivo em modelos animais. Esses sistemas podem ser usados e/ou adaptados ao sistema CRISPR-Cas para aplicação ao osso.

[0565] Cérebro

[0566] Opções de aplicação ao cérebro incluem encapsulamento de enzima CRISPR e RNA guia na forme de DNA ou RNA nos lipossomos e em conjugação aos Cavalos de Tróia moleculares para aplicação na barreira sanguínea do cérebro (BBB). Os Cavalos de Tróia moleculares mostram ser eficientes para aplicação de vetores de expressão ao cérebro de primatas não humanos. A mesma abordagem pode ser utilizada para aplicar vetores contendo enzima CRISPR e RNA guia. Por exemplo, Xia CF e Boado RJ, Pardridge WM ("Antibody-mediated targeting of siRNA via the human insulin receptor using avidin-biotin technology." Mol Pharm. 2009 Maio-Jun;6(3):747-51. doi: 10.1021/mp800194) descrevem como a aplicação de RNA de curta (interferência siRNA) às células em cultura, e in vivo, é possível com o uso combinado de um anticorpo monoclonal específico de receptor (mAb) e tecnologia avidina-biotina. A autores referem também que, a ligação entre o mAb alvo e o siRNA é estável com tecnologia avidina-biotina, e os efeitos do RNAi em sítios distantes tais como o cérebro são observados in vivo após uma administração intravenosa do siRNA alvo.

[0567] Zhang et al. (Mol Ther. 2003 Jan;7(1):11-8.)) descrevem como os plasmídeos de expressão codificando repórteres tais como luciferase foram encapsulados no interior de um "vírus artificial" compreendido em um imunolipossomo PEGilado de 85 nm, o qual foi direcionado para o cérebro de macaco rhesus in vivo com um anticorpo monoclonal (MAb) para o receptor de insulina humano (HIR). O HIRMAb permite ao lipossomo carregando o gene exógeno sofrer transcitose através da barreira sanguínea do cérebro e endocitose através da membrana plasmática neuronal na sequência da injeção intravenosa. O nível de expressão do gene da luciferase no cérebro foi 50 vezes mais elevado no macaco rhesus em comparação com a rato. A expressão neuronal generalizada do gene da beta-galactosidase em cérebro de primata foi demonstrada tanto por histoquímica como por microscopia confocal. Os autores indicam que esta abordagem torna viável adultos transgênicos reversíveis em 24 horas. Em conformidade, o uso de imunopolissomos é preferencial. Estes podem ser usados em conjunção com anticorpos para atingir tecidos específicos ou proteínas de superfície celular.

[0568] São também preferenciais outros meios de aplicação ou de RNA, tais como através de nanopartículas (Cho, S., Goldberg, M., Son, S., Xu, Q., Yang, F., Mei, Y., Bogatyrev, S., Langer, R. e Anderson, D., Lipid-like nanoparticles for small interfering RNA delivery to endothelial cells, Advanced Functional Materials, 19: 3112- 3118, 2010) ou exossomos (Schroeder, A., Levins, C., Cortez, C., Langer, R., e Anderson, D., Lipid-based nanotherapeutics for siRNA delivery, Journal of Internal Medicine, 267: 9-21, 2010, PMID: 20059641).

[0569] É evidente que, os exossomos têm mostrado ser particularmente úteis na aplicação de siRNA, um sistema com alguns paralelos com o sistema CRISPR. Por exemplo, El- Andaloussi S, et al. (“Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo.” Nat Protoc. 2012 Dez;7(12):2112-26. doi: 10.1038/nprot.2012.131. Epub 2012 Nov 15.) descreve como os exossomos são ferramentas promissoras para a aplicação de fármacos através de diferentes barreiras biológicas e podem ser aproveitados para aplicação de siRNA in vitro e in vivo. A sua abordagem é gerar exossomos direcionados por transfecção de um vetor de expressão, compreendendo uma proteína exossômica fundida com um ligando peptídeo. Os exossomos são então purificados e caracterizados a partir do sobrenadante de células transfectadas, então p siRNA é carregado para os exossomos. A aplicação ou administração de acordo com a invenção pode ser realizada com exossomos, em particular mas não limitados ao cérebro.

[0570] A Vitamina E (α-tocoferol) pode ser conjugada com CRISPR Cas e distribuída ao cérebro em conjunto com lipoproteína de alta densidade (HDL), por exemplo de um modo semelhante ao efetuado por Uno et al. (HUMAN GENE THERAPY 22:711-719 (Junho 2011)) para aplicação de RNA de curta interferência (siRNA) ao cérebro. Os camundongos receberam uma infusão através de minibombas osmóticas (modelo 1007D; Alzet, Cupertino, CA) cheias com salino tamponado com fosfato (PBS) ou TocsiBACE livre ou Toc-siBACE/HDL e conectado a um kit 3 de Infusão Cerebral Kit 3 (Alzet). Uma cânula de infusão no cérebro foi colocada cerca de 0,5mm posterior ao bregma na linha média para infusão no terceiro ventrículo dorsal. Uno et al. verificou que tão pouco como 3 nmol de Toc-siRNA com HDL podia induzir uma redução pretendida em grau comparável com o mesmo método de infusão ICV. Uma dose similar de CRISPR Cas conjugada com α-tocoferol e coadministrada com HDL dirigido ao cérebro pode ser considerada para humanos na presente invenção, por exemplo, cerca de 3 nmol até cerca 3 μmol de CRISPR Cas dirigida ao cérebro pode ser considerada.

[0571] Zou et al. ((HUMAN GENE THERAPY 22:465-475 (abril 2011)) descrevem um método de aplicação mediada por RNAs de grampo curto visando PKCY no silenciamento de genes in vivo na medula espinal de ratos. Zou et al. administraram cerca de 10 μl de um lentivírus recombinante tendo um título de 1 x 109 unidades de transdução (TU)/mL através de um cateter intratecal. Uma dose similar de CRISPR Cas expressa em uma vetores de lentivírus dirigido ao cérebro pode ser considerada para humanos na presente invenção, por exemplo, cerca de 1050 mL de CRISPR Cas visando o cérebro em um lentivírus tendo um título de 1 x 109 unidades de transdução (TU)/mL pode ser considerado.

[0572] Eliminação dirigida, aplicações terapêuticas

[0573] A deleção dirigida de genes é preferencial. Os exemplos são exemplificados no Exemplo 18. Preferenciais são, portanto, genes envolvidos na biossíntese de colesterol, biossíntese de ácidos graxos, e outras afecções metabólicas, genes codificando proteínas com erros de dobragem envolvidas na amiloide e outras doenças, oncogenes conduzindo à transformação celular, genes virais latentes, e genes direcionados a afecções negativas dominantes, entre outras afecções. Como exemplificado aqui, os Requerentes preferem aplicação de gene um sistema CRISPR-Cas com o fígado, cérebro, sistema ocular, epitelial, hematopoético, ou outro tecido de um indivíduo ou um paciente com necessidade disso, sofrendo de afecções metabólicas, amiloidose e doenças relacionadas com agregação de proteína, transformação celular resultante de mutações e translocações genéticas, efeitos dominantes negativos de mutações do gene, infecções virais latentes, e outros sintomas relacionados, usando ou sistema de aplicação viral ou de nanopartícula.

[0574] Aplicações terapêuticas do sistema CRISPR-Cas incluem Glaucoma, Amiloidose, e doença de Huntington. Estas são exemplificadas nos Exemplo 20 e as características descritas aqui são preferenciais sozinhas ou em combinação.

[0575] Outro exemplo de uma doença de expansão da poliglutamina que podem ser tratadas pela presente invenção incluem ataxia espinocerebelar tipo 1 (SCA1). Após a injeção intracerebelar, os vetores de vírus adenoassociados recombinantes (AAV) expressando RNAs de grampo curto melhorar profundamente a coordenação motora, morfologia cerebelar restaurada e inclusões de ataxina-1 característica resolvida em células Purkinje de camundongos SCA1 (ver, por exemplo, Xia et al., Nature Medicine, Vol. 10, No. 8, ago. 2004). Em particular, vetores de AAV1 e AAV5 são preferenciais e AAV titula os cerca de 1 x 1012 genomas de vetores/mL são desejáveis.

[0576] Como um exemplo, infecções crônicas por VIH-1 podem ser tratadas ou prevenidas. A fim de alcançar este, pode gerar-se CRISPR-Cas RNAs guia que visam a grande maioria do genoma do VIH-1 tendo em conta as variantes da estirpe do VIH- 1 para cobertura e eficácia máxima. Pode-se realizar a aplicação do sistema CRISPR-Cas por infecção adenovírica ou mediada por lentivírus convencional do sistema imune do hospedeiro. Dependendo da abordagem, as células hospedeiras imunes podem ser a) isoladas, transduzidas com CRISPR-Cas, selecionada, e reintroduzida no hospedeiro ou b) transduzidas in vivo por aplicação sistémica do sistema CRISPR-Cas. Uma primeira abordagem permite a formação de uma população imune resistente ao passo que a segunda é mais provável para atingir reservatórios virais latentes no interior do hospedeiro. Isto é discutido em mais pormenor na seção dos Exemplos.

[0577] Em outro exemplo, o Pedido da Patente E.U.A. No. 20130171732 atribuído a Sangamo BioSciences, Inc. refere- se à inserção de um transgene anti-VIH no genoma, os métodos que podem ser aplicados ao Sistema CRISPR Cas da presente invenção. Em outra forma de realização, o gene CXCR4 pode ser visado e o sistema TALE do Pedido da Patente E.U.A. No. 20100291048 atribuída a Sangamo BioSciences, Inc. pode ser modificado para o sistema CRISPR-Cas da presente invenção. O método do Pedido das Patentes E.U.A. Nos. 20130137104 e 20130122591 atribuído a Sangamo BioSciences, Inc. e o Pedido da Patente E.U.A. No. 20100146651 atribuído a Cellectis podem ser mais generalizadamente aplicáveis para expressão de transgenes dado que envolvem a modificação de um local hIpoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HPRT) para aumentar a frequência da modificação de genes.

[0578] É também pretendido que a presente invenção gere uma do biblioteca de células de genes inativadas. Cada célula pode ter um único gene inativado. Isto é exemplificado no Exemplo 23.

[0579] Pode fazer-se uma biblioteca de células ES em que cada célula tem um único gene inativado, e a biblioteca completa das células ES terá todos os genes únicos inativados. Esta biblioteca é útil para a triagem da função de gene em processos celulares como em doenças. Para fazer estas biblioteca de células, pode integrar-se a Cas9 dirigida por um promotor induzível (por exemplo promotor doxiciclina induzível) na célula ES. Adicionalmente, pode integrar-se um único RNA guia visando um gene específico na célula ES. Para fazer a biblioteca de células ES, pode-se simplesmente misturar células ES com uma biblioteca de genes codificando RNAs guia visando cada gene em um genoma humano. Pode-se primeiro introduzir um único sítio BxB1 attB no local AAVS1 da célula ES humana. Então pode usar-se a BxB1 integrase para facilitar a integração de genes individuais RNA guia para o sítio BxB1 attB no local AAVS1. Para facilitar a integração, cada gene RNA guia pode ser contido em um plasmídeo que transporta de um único sítio attP. Esta via BxB1 irá recombinar o sítio attB no genoma com o sítio attP no plasmídeo contendo o RNA guia. Para gerar a biblioteca de células, pode-se tomar a biblioteca de células que tem os RNAs guia únicos integrados e induz a expressão de Cas9. Após indução, a Cas9 medeia a quebra de cadeias duplas em sítios especificados pelo RNA guia.

[0580] A administração crônica de terapêuticas proteicas pode eliciar respostas imunes inaceitáveis à proteína específica. A imunogenicidade de fármacos proteicos pode ser atribuída a alguns epítopos imunodominantes do linfócito T auxiliar (HTL) Reduzindo a afinidade de ligação de MHC destes epítopos HTL contidos dentro destas proteínas pode gerar-se fármacos com baixa imunogenicidade (Tangri S, et al. (“Rationally engineered therapeutic proteins with reduced immunogenicity” J Immunol. 2005 Mar 15;174(6):3187- 96.) Na presente invenção, a imunogenicidade de uma enzima CRISPR em particular pode ser reduzida seguindo a abordagem primeiro definida em Tangri et al. em relação à eritropoietina e subsequentemente desenvolvida. Adequadamente, evolução dirigida ou conceção racional podem ser usadas para reduzir a imunogenicidade da enzima CRISPR (por exemplo a Cas9) nas espécies hospedeiras (espécies humanas ou outras).

[0581] No Exemplo 28, os Requerentes usaram 3 RNAs guia de interesse e capazes de visualizar a clivagem eficiente de DNA in vivo ocorrendo somente em um pequeno subconjunto de células. Essencialmente, o que os Requerentes aqui mostraram é clivagem in vivo direcionada. Em particular, este proporciona um conceito prodof de que o direcionamento específico de organismos superiores, tais como mamíferos pode também ser alcançado. Também destaca o aspecto multiplexado em que múltiplas sequências guias (isto é alvos separados) podem ser usados simultaneamente (no sentido de coaplicação). Por outras palavras, os Requerentes usaram uma abordagem múltipla, com várias sequências diferentes visadas ao mesmo tempo, mas independentemente.

[0582] Um exemplo adequado de um protocolo para a produção de AAV, um vetor preferencial da invenção é provido no Exemplo 34.

[0583] Distúrbios de repetição de trinucleotídeos são condições preferenciais para serem tratadas. Estas também são aqui exemplificadas.

[0584] Por exemplo, o Pedido da patente E.U.A. No. 20110016540, descreve o uso de nucleases de impressão digital de zinco a células, animais e proteínas geneticamente modificadas associadas distúrbios de expansão da repetição com trinucleotídeos. Distúrbios expansão de repetição de trinucleotídeos são afecções complexas, progressivas envolvendo neurobiologia do desenvolvimento e muitas vezes afetam o conhecimento assim como as funções sensomotoras.

[0585] Proteínas de expansão de repetição de Trinucleotídeos são um conjunto diverso de proteínas associadas com a suscetibilidade para se devolver uma afecção da expansão de repetição de trinucleotídeos, a presença de uma afecção da expansão de repetição de trinucleotídeos, a gravidade da afecção da expansão de repetição de trinucleotídeos ou qualquer combinação dos mesmos. As afecções de expansão de repetição de trinucleotídeos são divididas em duas categorias determinadas pelo tipo de repetição. A repetição mais comum é o tripleto CAG, o qual, quando presente na região de codificação de um gene, codifica os aminoácidos glutamina (Q). Portanto, estas afecções são referidas como as afecções poliglutamina (poliQ) e compreende as seguintes doenças: Doença de Huntington « (HD); Atrofia muscular espinobulbar (SBMA); Ataxias Espinobulbares (SCA tipos 1, 2, 3, 6, 7, e 17); e Atrofia Dentatorubro-Palidoluisiana (DRPLA). Os restantes distúrbios de expansão de repetição de trinucleotídeos que, seja envolvem o tripleto CAG, seja o tripleto CAG não está na região de codificação do gene e são, portanto, referidos como afecções da não poliglutamina. A afecção da não poliglutamina compreende Síndrome do X Frágil (FRAXA); Retardo Mental de XE frágil (FRAXE); Ataxia de Friedreich (FRDA); Distrofia miotônica (DM); e Ataxias espinobulbares (SCA tipos 8, e 12).

[0586] As proteínas associadas aos distúrbios de expansão de repetição de trinucleotídeos são tipicamente selecionados com base em uma associação experimental da proteína associada com a afecção da expansão de repetição de trinucleotídeos com a afecção da expansão de repetição de trinucleotídeos. Por exemplo, a taxa de produção ou concentração de circulação da proteína associada com a afecção da expansão de repetição de trinucleotídeos pode ser elevada ou diminuída em uma população tendo a afecção da expansão de repetição de trinucleotídeos em relação à população sem a afecção da expansão de repetição de trinucleotídeos. Diferenças nos níveis de proteína podem ser avalizados usando técnicas proteômicas incluindo mas não limitado a transferência de Western, a coloração imuno-histoquímica, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), e espetrometria de massa. De modo alternativo, as proteínas associadas com os distúrbios de expansão de repetição de trinucleotídeos podem ser identificadas para obter perfis de expressão de genes dos genes codificando as proteínas usando técnicas genômicas incluindo mas não limitado a análise de microarranjo de DNA, análise em série da expressão genética (SAGE), e reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (Q-PCR).

[0587] Exemplos não limitativos de proteínas associadas com distúrbios da expansão de repetição de trinucleotídeos incluem AR (receptor de andrógeno), FMR1 (retardo mental 1 do X frágil), HTT (huntingtina), DMPK (proteína quinase da distrofia miotônica), FXN (frataxina), ATXN2 (ataxina 2), ATN1 (atrofina 1), FEN1 (recorte de endonuclease específica de estrutura 1), TNRC6A (repetição de trinucleotídeo de contendo 6A), proteína de ligação PABPN1 (poli(A), nuclear 1), JPH3 (junctofilina 3), MED15 (subunidade mediadora complexa 15), ATXN1 (ataxina 1), ATXN3 (ataxina 3), TBP (proteína de ligação a TATA box), CACNA1A (canal de cálcio, dependente de voltagem, P/Q tipo, subunidade alfa 1A), ATXN80S (ATXN8 cadeia oposta (codificação não proteína)), PPP2R2B (proteína fosfatase 2, subunidade reguladora B, beta), ATXN7 (ataxina 7), TNRC6B (repetição de trinucleotídeos contendo 6B), TNRC6C (repetição de trinucleotídeos contendo 6C), CELF3 (CUGBP, membro da família do tipo Elav 3), MAB21L1 (mab-21- tipo 1 (C. elegans)), MSH2 (homólogo mutS 2, câncer do cólon, não polipose tipo 1 (E. coli)), TMEM185A (proteína de transmembrana 185A), SIX5 (SIX homeobox 5), CNPY3 (copa 3 homóloga (peixe zebra)), FRAXE (sítio frágil, tipo ácido fólico, rara, fra(X)(q28) E), GNB2 (proteína de ligação ao nucleotídeo guanina (G proteína), beta polipeptídeo 2), RPL14 (proteína ribossomal L14), ATXN8 (ataxina 8), INSR (receptor de insulina), TTR (transtiretina), EP400 (E1A proteína de ligação p400), GIGYF2 (GRB10 interação GYF proteína 2), OGG1 (8-oxoguanina DNA glicosilase), STC1 (estaniocalcina 1), CNDP1 (carnosina dipeptidase 1 (família de metalopeptidase M20)), C10orf2 (cromossomo 10 grelha de leitura aberta 2), MAML3 tipo mastermind 3 (Drosophila), DKC1 (disqueratose congênita 1, disquerina), PAXIP1 (proteína de interação PAX (com o domínio de ativação transcricional) 1), CASK (cálcio/proteína serina quinase dependente de calmodulina (família MAGUK)), MAPT (proteína associada a microtúbulos tau), SP1 (Sp1 fator de transcrição), POLG (polímeroase (dirigida a DNA), gama), família AFF2 (AF4/FMR2, membro 2), THBS1 (trombospondiana 1), TP53 (proteína de tumor p53), ESR1 (receptor de estrogêno 1), CGGBP1 (proteína 1 de ligação de repetição a tripleto CGG), ABT1 (ativador de transcrição basal 1), KLK3 (peptidases relacionada com calicreína 3), PRNP (proteína de príon), JUN (oncogene jun), KCNN3 (potássio intermediário/pequena condutância de canal ativada por cálcio, subfamília N, membro 3), BAX (proteína associada a BCL2 X), FRAXA (sítio frágil, tipo ácido fólico, raro, fra(X)(q27.3) A (macroorquidismo, retardo mental)), KBTBD10 (repetição kelch e domínio BTB (POZ) contendo 10), MBNL1 (tipo músculocego (Drosophila)), RAD51 (homólogo RAD51 (RecA homólogo, E. coli) (S. cerevisiae)), NCOA3 (coativador de receptor nuclear 3), ERDA1 (domínio de repetição ampliada, CAG/CTG 1), TSC1 (tuberous sclerosis 1), COMP (cartilagem oligomérica matriz de proteína), GCLC (glutamato-ciseína ligase, subunidade catalítica), RRAD (Relacionada com Ras associada com diabetes), MSH3 (homólogo mutS 3 (E. coli)), DRD2 (receptor de dopamina D2), CD44 (molécula CD44 (Grupo sanguíneo Índico)), CTCF (fator de ligação CCCTC (proteína de impressão digital de zinco)), CCND1 (ciclina D1), CLSPN (homólogo de claspina (Xenopus laevis)), MEF2A (fator potenciador de miócitos 2A), PTPRU (proteína tirosina fosfatase, tipo receptor, U), GAPDH (desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato), TRIM22 (tripartido contendo o motivo 22), WT1 (tumor de Wilms 1), AHR (receptor de hidrocarboneto de arila), GPX1 (glutationa peroxidase 1), TPMT (tiopurina S-metiltransferase), NDP (doença de Norrie (pseudoglioma)), ARX (homeobox relacionada a ariataless), MUS81 (endonuclease homóloga MUS81 (S. cerevisiae)), TYR (tirosinase (albinismo oculocutâneo IA)), EGR1 (resposta a crescimento precoce 1), UNG (glicosilase uracilo-DNA), NUMBL (homólogo entorpecido tipo (Drosophila)), FABP2 (proteína de ligação a ácido graxo 2, intestinal), EN2 (homeobox denteada 2), CRYGC (cristalina, gama C), SRP14 (partícula de reconhecimento de sinal de14 kDa (proteína de ligação Alu RNA homóloga)), CRYGB (cristalino, gama B), PDCD1 (morte celular programada1), HOXA1 (homeobox A1), ATXN2L (ataxina tipo 2), PMS2 (segregação aumentada PMS2 posmeiótica 2 (S. cerevisiae)), GLA (galactosidase, alfa), CBL (Cas-Br-M (murino) sequência de transformação retroviral ecotrópica), FTH1 (ferritina, polipeptídeo pesado 1), IL12RB2 (receptor de interleucina 12, beta 2), OTX2 (homeobox ortodentícula 2), HOXA5 (homeobox A5), POLG2 (polímeroase (dirigida a DNA), gama 2, subunidade acessória), DLX2 (homeobox distal-menor 2), SIRPA (proteína alfa reguladora de sinal), OTX1 (homeobox ortodentícula 1), AHRR (repressor de receptor de hidrocarboneto de arila), MANF (fator neurotrófico derivado do astrócitos mesencefálicos), TMEM158 (proteína da transmembrana 158 (gene/pseudogene)), e ENSG00000078687.

[0588] Proteínas preferenciais associadas com distúrbios da expansão de repetição de trinucleotídeos incluem HTT (Huntingtina), AR (receptor de androgênio), FXN (frataxina), Atxn3 (ataxina), Atxn1 (ataxina), Atxn2 (ataxina), Atxn7 (ataxina), Atxn10 (ataxina), DMPK (distrofia da proteína mitósica quinase), Atn1 (atrofina 1), CBP (proteína de ligação creb), VLDLR (receptor de lipoproteína de muito baixa densidade), e qualquer combinação dos mesmos.

[0589] De acordo com um outro aspecto, é fornecido um método de terapia de genes para o tratamento de um paciente portador de uma mutação no gene de CFTR e compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficiente de uma partícula de terapia de genes CRISPR-Cas, opcionalmente através de um veículo farmaceuticamente compatível, às células de um indivíduo. Preferencialmente, o DNA alvo compreende a mutação deltaF508. Em geral, é preferencial que a mutação seja reparada para o tipo selvagem. Neste caso, a mutação é uma deleção dos três nucleotídeos que compreende o códon para fenilalanina (F) a posição 508. Adequadamente, reparação neste caso requer o restabelecimento do códon ausente no mutante.

[0590] Para implementar esta Estratégia de Reparação de Gene, é preferencial que um sistema adenovírus/vetor AAV é introduzida na célula hospedeira, de células ou pacientes. Preferencialmente, o sistema compreende uma Cas9 (ou Cas9 nickase) e o RNA guia em conjunto com um sistema adenovírus/vetor AAV compreendendo o modelo de reparação de homologia contendo o resíduo F508. Isto pode ser introduzido no indivíduo através dos métodos de aplicação discutidos anteriormente. O sistema CRISPR-Cas pode ser guiado pelo RNA quimérico guia CFTRdelta 508. Ele tem como alvo um local específico do CFTR o local genômico a ser cortado ou clivado. Após clivagem, o modelo de reparação é inserido no sítio de clivagem via recombinação homóloga corrigindo a deleção que resulta em Fibrose Cística ou causa sintomas relacionados com Fibrose Cística. Esta estratégia para a aplicação direta e fornecer introdução sistêmica de sistemas CRISPR com apropriados RNAs guia podem ser empregues para atingir mutações genéticas para editar ou manipular genes que causam doenças e afecções metabólica, fígado, rim e proteína tal como os da Tabela B.

[0591] Edição de genoma

[0592] Os sistemas CRISPR/Cas9 da presente invenção pode ser usado para corrigir mutações genéticas que foram anteriormente tentadas com sucesso limitado usando TALEN e ZFN. Por exemplo, o pedido de publicação WO2013163628 A2, Correção Genética de Genes Mutantes, de Duke University descreve esforços para corrigir, por exemplo, uma mutação de deslocamento de grelha que faz com que um códon de paragem prematura um produto de gene truncado que pode ser corrigido via nuclease mediada por terminação não homóloga juntando as responsáveis para Duchenne Muscular Dystrophy, ("DMD") uma afecção recessiva, fatal, ligada a X que resulta em degeneração muscular devido a mutações no gene distrofina. A maioria das mutações de distrofina que causam DMD são deleções de éxons que interrompem a grelha de leitura e causam terminação prematura da tradução no gene da distrofina. A distrofina é uma proteína citoplásmica que fornece estabilidade estrutural ao complexo distroglicana da membrana celular que é responsável pela regulação da integridade da célula muscular e função. O gene de distrofina ou "gene DMD " como aqui utilizados indiferentemente é 2,2 megabases no local Xp21. As transcrições primárias medem cerca de 2,400 kb com o mRNA maduro sendo cerca de 14 kb. 79 éxons codificam a proteína que tem acima de 3500 aminoácidos. O éxon 51 é frequentemente adjacente a deleções perturbadoras da grelha em pacientes DMD e foi visado em ensaios clínicos para éxon saltando com base em oligonucleotídeos. Um ensaio clínico para o composto eteplirseno saltando o éxon 51 informou recentemente um benefício funcional significativo ao longo de 8 semanas, com uma média de 47% de fibras positivas para distrofina em comparação com a linha de base. Mutações em éxon 51 são idealmente adequadas para correção permanente edição de genoma baseada em NHEJ.

[0593] Os métodos do Pedido da patente E.U.A. No. 20130145487 atribuída a Cellectis, que se relaciona com variantes da meganuclease para clivar uma sequência alvo a partir de gene da distrofina humana (DMD), pode também ser modificado para o sistema CRISPR-Cas da presente invenção.

[0594] Sangue

[0595] A presente invenção também contempla a aplicação do sistema CRISPR-Cas ao sangue.

[0596] Os exossomos plasmáticos de Wahlgren et al. (Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 17 e130) foram previamente descritos e podem ser utilizados para fornecer o sistema CRISPR Cas ao sangue.

[0597] O Sistema CRISPR Cas da presente invenção é também contemplado para tratar as hemoglobinopatias, tais como talassemias e doença da célula falciformes. Ver, por exemplo, Publicação da Patente Internacional No. WO 2013/126794 para alvos potenciais que podem ser direcionados pelo sistema CRISPR-Cas da presente invenção.

[0598] Pedido das patentes E.U.A. Nos. 20110225664, 20110091441, 20100229252, 20090271881 e 20090222937 atribuído a Cellectis, relacionam-se com variantes CREI, em que pelo menos um dos dois monômeros de I-CREI possui pelo menos duas substituições, um em cada um dos dois subdomínios funcionais do domínio do núcleo LAGLIDADG situado respectivamente partindo de posições 26 a 40 e 44 a 77 de I-CreI, a referida variante de ser capaz de clivar uma sequência de DNA alvo do receptor da gene interleucina-2 da cadeia gama humana (IL2RG) também chamado genes da cadeia gama receptor de citocina ou gene C gama. As sequências alvo identificadas nas Publicações das Patentes E.U.A. Nos. 20110225664, 20110091441, 20100229252, 20090271881 e 20090222937 podem ser utilizadas para o sistema CRISPR-Cas da presente invenção.

[0599] A Deficiência Imunológica Combinada Severa (SCID) resulta de um defeito na maturação de linfócitos T, sempre associado com um defeito funcional no linfócito B (Cavazzana-Calvo et al., Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585-602; Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109). A incidência global é estimada para 1 em 75 000 nascimentos. Pacientes com SCID não tratada são submetidos a infecções múltipla de microrganismos oportunistas, e que geralmente não vivem além de um ano. A SCID pode ser tratada por transferência de células estaminais hematopoiéticas alogênicas, a partir de um dador familiar. A histocompatibilidade com o doador pode variar amplamente. No caso da deficiência em Adenosina Deaminase (ADA), uma das formas SCID, os pacientes podem ser tratados por injeção de enzima Adenosina Desaminase recombinante.

[0600] Como o gene ADA tem mostrado ser modificado em doentes de SCID (Giblett et al., Lancet, 1972, 2, 1067-1069), vários outros genes envolvidos na SCID têm sido identificados (Cavazzana-Calvo et al., Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585-602; Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109). Existem quatro causas principais para SCID: (i) A mais frequente forma de SCID, SCID-X1 (SCID ligado a X ou X-SCID), é causada por mutação no gene IL2RG, resultando na ausência de linfócitos T maduros e células NK. IL2RG codifica a proteína C gama (Noguchi, et al., Cell, 1993, 73, 147-157), um comum componente de pelo menos cinco complexos receptores de interleucina. Estes receptores ativar vários alvos através da quinase JAK3 (Macchi et al., Nature, 1995, 377, 65-68), cuja inativação resulta na mesma síndrome como inativação gama C; (ii) mutação no gene ADA resulta em um defeito no metabolismo da purina que é letal para precursores de linfócitos, os quais por sua vez resultam na quase ausência de células B, T e NK; (iii) V(D)J recombinação é um passo essencial na maturação de imunoglobulinas e receptores de linfócitos T (TCRs). As Mutações no Gene de Ativação de Recombinação 1 e 2 (RAG1 e RAG2) e Artemis, três genes envolvidos neste processo, resultam na ausência de linfócitos T e B; e (iv) Mutações em outros genes tais como CD45, envolvidos em sinalização específica da célula T foram também referidos, embora representem uma minoria dos casos (Cavazzana-Calvo et al., Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585-602; Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109).

[0601] Desde quando as suas bases genéticas foram identificadas, as diferentes formas de SCID tornaram-se um paradigma para as abordagens â terapia de genes (Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109) para duas razões principais. Em primeiro lugar, como em todas as doenças do sangue, um tratamento ex vivo pode ser previsto. Células estaminais hematopoiéticas (HSCs) podem ser recuperadas da medula óssea, e manter as suas propriedades pluripotentes. Portanto, podem ser tratados in vitro, e então reinjetadas ao paciente, onde preenchem novamente a medula óssea. Segundo, como a maturação dos linfócitos é prejudicada em pacientes SCID, as células corretas têm uma vantagem seletiva. Portanto, um pequeno número de células corretas podem restaurar um sistema funcional imune. Esta hipótese foi validada várias vezes por (i) recuperação parcial das funções imunológicas associadas com a reversão das mutações em pacientes SCID (Hirschhorn et al., Nat. Genet., 1996, 13, 290-295; Stephan et al., N. Engl. J. Med., 1996, 335, 1563-1567; Bousso et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 2000, 97, 274-278; Wada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98, 8697-8702; Nishikomori et al., Blood, 2004, 103, 4565-4572), (ii) a correção de SCID- X1 deficiências in vitro em células hematopoiéticas (Candotti et al., Blood, 1996, 87, 3097-3102; Cavazzana-Calvo et al., Blood, 1996, Blood, 88, 3901-3909; Taylor et al., Blood, 1996, 87, 3103-3107; Hacein-Bey et al., Blood, 1998, 92, 4090-4097), (iii) a correção de SCID-X1 (Soudais et al., Blood, 2000, 95, 3071-3077; Tsai et al., Blood, 2002, 100, 72-79), JAK-3 (Bunting et al., Nat. Med., 1998, 4, 58-64; Bunting et al., Hum. Gene Ther., 2000, 11, 2353-2364) e RAG2 (Yates et al., Blood, 2002, 100, 3942-3949) deficiências in vivo em modelos animais e (iv) como resultado de ensaios clínicos da terapia de genes (Cavazzana-Calvo et al., Science, 2000, 288, 669-672; Aiuti et al., Nat. Med., 2002; 8, 423-425; Gaspar et al., Lancet, 2004, 364, 2181-2187).

[0602] O Pedido da Patente E.U.A. No. 20110182867 atribuído à Children’s Medical Center Corporation e ao Presidente e bolseiros do Harvard College se refere a métodos e usos de modulação da expressão de hemoglobina fetal (HbF) em células hematopoiéticas progenitoras pelos inibidores de expressão ou atividade de BCL11A, tal como RNAi e anticorpos. Os alvos descritos no Pedido da Patente E.U.A. No. 20110182867, como BCL11A, podem ser direcionados para o Sistema CRISPR Cas da presente invenção para modulação fetal da expressão da hemoglobina. Ver também Bauer et al. (Science 11 de outubro 2013: Vol. 342 no. 6155 pp. 253-257) e Xu et al. (Science 18 de novembro 2011: Vol. 334 no. 6058 pp. 993-996) para alvos adicionais BCL11A.

[0603] Ouvidos

[0604] A presente invenção também contempla a aplicação do sistema CRISPR-Cas a uma ou a ambos os ouvidos.

[0605] Os investigadores estão analisando se a terapia de genes pode ser usada para ajudar os tratamentos anti surdez— nomeadamente os implantes cocleares. A surdez é geralmente causada por perda ou dano das células capilares que não podem retransmitir sinais para os neurônios auditivos. Nesses casos, os implantes cocleares podem ser usados para responder ao som e transmitir sinais elétricos às células do nervo. Mas estes neurônios muitas vezes degeneram e retraem-se da cóclea caso poucos fatores de crescimento sejam libertados por células capilares defeituosas.

[0606] O pedido da Patente E.U.A. 20120328580 descreve a injeção de uma composição farmacêutica no ouvido (por exemplo, administração auricular), tal como no luminae da cóclea (por exemplo, a Scala media, vestíbulo Sc, e tímpanos Sc), por exemplo, usando uma seringa, por exemplo, uma seringa de dose única. Por exemplo, um ou mais dos compostos aqui descritos podem ser administrados por injeção intratímpano (por exemplo, no ouvido médio), e/ou injeções no ouvido externo, médio, e/ou interno. Esses métodos são rotineiramente utilizados na arte, por exemplo, para a administração de esteroides e antibióticos em ouvidos humanos. A injeção pode ser, por exemplo, através da janela redonda do ouvido ou através da cápsula coclear. Outros métodos de administração do ouvido interno são conhecidos na arte (ver, por exemplo, Salt e Plontke, Drug Discovery Today, 10:1299-1306, 2005).

[0607] Em outro modo de administração, a composição farmacêutica pode ser administrada in situ, com um cateter ou bombas. Um cateter ou bomba pode, por exemplo, direcionar a composição farmacêutica no luminae coclear ou na janela redonda do ouvido e/ou o lúmen do cólon. Aparelhos de aplicação de fármaco exemplares e métodos adequados para administrar um ou mais dos compostos aqui descritos no ouvido, por exemplo, um ouvido humano, são descritos por McKenna et al., (Publicação E.U.A. No. 2006/0030837) e Jacobsen et al., (Pat. E.U.A. No. 7,206,639). Em algumas formas de realização, um cateter ou bomba pode ser posicionado, por exemplo, no ouvido (por exemplo, o ouvido externo, médio e/ou interno) de um paciente durante um procedimento cirúrgico. Em algumas formas de realização, um cateter ou bomba pode ser posicionado, por exemplo, no ouvido (por exemplo, o ouvido externo, médio e/ou interno) de um paciente sem necessidade de um procedimento cirúrgico.

[0608] De modo alternativo ou adicionalmente, um ou mais dos compostos aqui descritos pode ser administrado em combinação com um dispositivo mecânico tal como um implante coclear ou um aparelho auditivo, que é usado no ouvido externo. Um implante coclear exemplar que é adequado para utilização com a presente invenção é descrito por Edge et al., (Pedido E.U.A. No. 2007/0093878).

[0609] Em algumas formas de realização, os modos de administração descritos acima pode ser combinado em qualquer ordem e podem ser simultâneo ou intercaladas.

[0610] De modo alternativo ou adicionalmente, a presente invenção pode ser administrada de acordo com qualquer dos métodos aprovados da Food and Drug Administration, por exemplo, como descrito em CDER Data Standards Manual, verão número 004 (que está disponível na fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htm).

[0611] Em geral, os métodos de terapia celular descritos no Pedido da Patente E.U.A. 20120328580 podem ser usados para promover diferenciação completa ou parcial da célula a ou para uma célula madura tipo do ouvido interno (por exemplo, uma célula capilar) in vitro. Células resultando desses métodos podem então ser transplantadas ou implantadas em um paciente necessitando desse tratamento. Os métodos de cultura de células necessários para a prática destes métodos, incluindo métodos para a identificação e seleção de tipos de células adequados, métodos para a promoção da diferenciação completa ou parcial das células selecionadas, métodos para a identificação completa ou parcial dos tipos de células diferenciadas, e métodos para a implantação de células completa ou parcialmente diferenciadas são descritos a seguir.

[0612] Células adequadas para uso na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, células que são capazes de diferenciação completa ou parcial em uma célula madura do ouvido interno, por exemplo, uma célula capilar (por exemplo, uma célula capilar do ouvido interno e/ou externo), quando contactado, por exemplo, in vitro, com um ou mais dos compostos aqui descritos. Células exemplares que são capazes de se diferenciar em uma célula capilar incluem, mas não estão limitados a células estaminais (por exemplo, células estaminais do ouvido interno, células estaminais adultas, células estaminais derivadas de medula óssea, células estaminais embrionárias, células estaminais do mesenquima, células estaminais cutâneas, células iPS, e células estaminais derivadas de gordura), células progenitoras (por exemplo, células progenitoras do ouvido interno), células de suporte (por exemplo, células de Deiters', células pilar, células falangeais internas, células da região tectal e células de Hensen), e/ou células germinativas. O uso de células estaminais para a substituição das células sensoriais do ouvido interno é descrito em Li et al., (Pedido E.U.A. No. 2005/0287127) e Li et al., (Patente E.U.A. Ser. No. 11/953,797). O uso de células estaminais derivadas de medula óssea para a substituição de células sensoriais do ouvido interno é descrita em Edge et al., PCT/US2007/084654. As células iPS são descritas, por exemplo, em Takahashi et al., Cell, Volume 131, Capítulo 5, Páginas 861-872 (2007); Takahashi e Yamanaka, Cell 126, 663-76 (2006); Okita et al., Nature 448, 260-262 (2007); Yu, J. et al., Science 318(5858):1917-1920 (2007); Nakagawa et al. Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008); e Zaehres e Scholer, Cell 131(5):834-835 (2007).

[0613] Tais células adequadas podem ser identificadas analisando (por exemplo, qualitativamente ou quantitativamente) a presença de um ou mais genes específicos de tecido. Por exemplo, a expressão de genes pode ser detectada detectando o produto de proteína de um ou mais genes específicos de tecidos. Técnicas de deteção de proteína envolvem proteínas de coloração (por exemplo, usando extratos de células ou células completas) usando anticorpos contra o antigênio apropriado. Neste caso, o antigênio apropriado é o produto de proteína da expressão de genes específica de tecido. Apesar de, em princípio, um primeiro anticorpo (isto é, o anticorpo que liga o antigênio) pode ser marcado, é mais comum (e melhora a visualização) para uso de um segundo anticorpo direcionado contra o primeiro (por exemplo, um anti-IgG). Este segundo anticorpo é conjugado quer com fluorocromos, ou enzimas apropriadas para reações colorimétricas, ou esferas de ouro (para microscopia eletrônica), ou com o sistema biotina-avidina, de modo que a localização do anticorpo primário, e assim o antigênio, pode ser reconhecido.

[0614] As moléculas de CRISPR da presente invenção podem ser aplicadas ao ouvido por aplicação direta de composição farmacêutica ao ouvido externo, com composições modificadas a partir do pedido Publicado dos EUA, 20110142917. Em algumas formas de realização, a composição farmacêutica é aplicada ao canal do ouvido. A aplicação ao ouvido pode ser também referida como aplicação aural ou ótica.

[0615] Em algumas formas de realização as moléculas de RNA da invenção são aplicados em lipossomos ou formulações de lipofectina e semelhantes e podem ser preparadas por métodos bem conhecidos dos habilitados na arte. Esses métodos são descritos, por exemplo, na Pat. E.U.A. Nos. 5,593,972, 5,589,466, e 5,580,859, que são aqui incorporadas como referência.

[0616] Sistemas de aplicação objetivada especificamente no reforço da e aplicação melhorada de siRNA em células de mamífero foram desenvolvidos, (ver, por exemplo, Shen et al. FEBS Let. 2003, 539:111-114; Xia et al., Nat. Biotech. 2002, 20:1006-1010; Reich et al., Mol. Vision. 2003, 9: 210-216; Sorensen et al., J. Mol. Biol. 2003, 327: 761-766; Lewis et al., Nat. Gen. 2002, 32: 107-108 e Simeoni et al., NAR 2003, 31, 11: 2717-2724) e pode ser aplicado à presente invenção. siRNA Recentemente, tem sido utilizado com sucesso para a inibição da expressão de genes em primatas (ver por exemplo. Tolentino et al., Retina 24(4):660 que podem ser também aplicado da presente invenção.

[0617] Qi et al. divulgam métodos para eficiente transfecção de siRNA ao ouvido interno através da janela redonda intacta por uma nova tecnologia de aplicação proteica que pode ser aplicada para o sistema CRISPR-Cas da presente invenção (ver, por exemplo, Qi et al., Gene Therapy (2013), 1-9).e Em particular, um TAT domínios de ligação a RNA de cadeia dupla (TAT-DRBDs), que podem transfectar siRNA marcado com Cy3 em células do ouvido interno, incluindo as células capilares internas e externas, crista ampular, mácula dos utrículos e mácula sáculos, através de permeação da janela redonda intacta foi bem-sucedida para aplicação siRNAs em cadeia dupla in vivo para tratar várias enfermidades do ouvido interno e preservação da função auditiva. Cerca de 40 μl de 10mM RNA pode ser contemplado como a dosagem para administração ao ouvido.

[0618] De acordo com Rejali et al. (Hear Res. 2007 Jun;228(1-2):180-7), função de implante coclear pode ser melhorada pela boa preservação dos neurônios do gânglio espiral, que são o alvo da estimulação elétrica pelo implante e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) foi anteriormente demonstrado para aumentar a sobrevivência do gânglio espiral experimentalmente em ouvidos ensurdecidos. Rejali et al. testaram um desenho modificado do elétrodo do implante coclear que inclui um revestimento das células fibroblastos transduzidos por um vetor viral com um inserção do gene do gene BDNF. Para realizar este tipo de transferência de genes ex vivo, Rejali et al. traduziram fibroblastos de cobaias com um adenovírus com um cassete de gene BDNF inserido, e determinaram se estas células secretaram BDNF e depois ligaram as células secretando BDNF ao elétrodo do implante coclear através de gel de agarose, e implantaram o elétrodo no tímpano scala. Rejali et al. determinaram que os elétrodos expressando BDNF conseguiram preservar significativamente mais neurônios do gânglio espiral nas espiras basais da cóclea após 48 dias de implantação em comparação com os elétrodos controle e demonstraram a exequibilidade da terapia combinada de implante coclear com transferência de gene ex vivo para potenciar gânglio espiral sobrevivência de neurônios. Tal sistema pode ser aplicado ao sistema CRISPR-Cas da presente invenção para aplicação ao ouvido.

[0619] Mukherjea et al. (Antioxidantes & Redox Signaling, Volume 13, Número 5, 2010) documentam que a inativação de NOX3 usando RNA de curta(s) interferência(s) anulou os ototóxicos da cisplatina, como evidenciado por OHCs de proteção dos danos e reduzidas as variações dos limiares em respostas auditivas do tronco cerebral (ABRs). Diferentes doses de siNOX3 (0,3, 0,6, e 0.9 μg) foram administradas a ratos e expressão NOX3 foi avaliado em tempo real TA-PCR. As doses mais baixas de NOX3 siRNA usadas (0,3 μg) não mostraram qualquer inibição de NOX3 mRNA em comparação com administração transtimpânico de siRNA baralhado ou cóclea não tratada. Porém, a administração de doses mais altas de NOX3 siRNA (0,6 e 0,9 μg) reduziu a expressão de NOX3 em comparação com o controle baralhado de siRNA. Um tal sistema pode ser aplicado ao Sistema CRISPR Cas da presente invenção para administração transtimpânica com uma dosagem de cerca de 2 mg até cerca 4 mg d CRISPR Cas para administração a um humano.

[0620] Jung et al. (Molecular Therapy, vol. 21 no. 4, 834-841 abr. 2013) demonstram que os níveis de Hes5 no utrículo diminui após a aplicação de siRNA e que o número de células capilares nesses utrículos foi significativamente mais larga que o seguinte tratamento de controle. Os dados sugerem que a tecnologia siRNA pode ser útil para induzir a reparação e regeneração do ouvido interno e que a via de sinalização de Notch é um alvo potencialmente útil para a inibição da expressão de genes específicos. Jung et al. injetaram 8 μg de Hes5 siRNA em 2 μL de volume, preparado adicionando salino normal estéril ao siRNA liofilizado a um epitélio vestibular do ouvido. Um tal sistema pode ser aplicado ao sistema CRISPR- Cas da presente invenção para administração ao epitélio vestibular do ouvido com uma dosagem de cerca de 1 até cerca 30 mg de CRISPR Cas para administração a um humano.

[0621] Olhos

[0622] A presente invenção também contempla a aplicação do sistema CRISPR-Cas a um ou a ambos os olhos.

[0623] Ainda em outro aspecto da invenção, o sistema CRISPR-Cas pode ser usado para corrigir defeitos oculares que surgem a partir de várias mutações genéticas adicionalmente descritas no Genetic Diseases of the Eye, Segunda Edição, editado por Elias I. Traboulsi, Oxford University Press, 2012.

[0624] Para administração ao olho, vetores de lentivírus, em particular vírus da anemia infeciosa equina (EIAV) são particularmente preferenciais.

[0625] Em outra forma de realização, vetores de lentivírus mínimos não de primatas baseados no vírus da anemia infecciosa dos equídeos (EIAV) são também contemplados, especialmente para terapia de genes ocular (ver, por exemplo, Balagaan, J Gene Med 2006; 8: 275 - 285, Publicado online em 21 de novembro de 2005 em Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002/jgm.845). Os vetores são contemplados para terem promotor citomegalovírus (CMV) dirigindo a expressão do gene alvo. Injeções intracâmeras, subretinianas, intraoculares e intravítreas são todas contempladas (ver, por exemplo, Balagaan, J Gene Med 2006; 8: 275 - 285, Publicado online em 21 de novembro de 2005 em Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002/jgm.845). As injeções intraoculares podem ser realizadas com a ajuda de um microscópio cirúrgico. Para injeções subretinianas e intravítreas, os olhos podem ser sofrer prolapso devido à pressão digital suave e os fundos visualizados usando um sistema de lentes de contato consistindo de uma gota de uma solução de meio de acoplamento na córnea coberta com uma lâmina e lamela de vidro de microscópio. Para injeções subretinianas, a ponta de uma agulha de gauge 34 de 10 mm, acoplada a uma seringa Hamilton de 5 μL pode avançar sob visualização direta através da esclera equatorial superior tangencialmente ao pólo posterior até que a abertura da agulha seja visível no espaço subretiniano. Então, 2 μL de suspensão de vetor podem ser injetados para produzir um descolamento em bolha na retina superiormente, assim confirmando o vetor de administração subretiniana. Esta abordagem cria uma esclerotomia autovedante permitindo que a suspensão de vetor seja retida no espaço subretiniano até ser absorvido por RPE, geralmente dentro das 48 horas do procedimento. Este procedimento pode ser repetido no hemisfério inferior para produzir um descolamento de retina inferior. Esta técnica resulta na exposição de cerca de 70% da retina neurossensorial e RPE para a suspensão do vetor. Para injeções intravítreas, a ponta da agulha pode avançar através da esclera 1 mm posteriormente ao limbo corneoscleral e injetam-se 2 μL de suspensão do vetor na cavidade vítrea. Para injeções na intracâmera, a ponta da agulha pode avançar através de uma paracentese limbo corneoscleral, dirigida para o centro da córnea, e podem ser injetados 2 μL de suspensão. Para injeções na intracâmera, a ponta da agulha pode avançar através de uma paracentese limbo corneoscleral, dirigida para o centro da córnea, e podem ser injetados 2 μL de suspensão do vetor. Estes vetores podem ser injetados a títulos de 1,0-1,4 x 1010 ou 1,0-1,4 x 109 unidades de transdução (TU)/mL.

[0626] Em outra forma de realização, RetinoStat®, um vetor de terapia de genes de lentivírus baseado no vírus da anemia infecciosa equina expressando as proteínas angiostáticas endostaina e angiostatina que é aplicado por uma injeção subretiniana para o tratamento da forma úmida da degeneração macular relacionada com a idade está também contemplada (ver, por exemplo, Binley et al., HUMAN GENE THERAPY 23:980-991 (setembro 2012)). Um tal vetor pode ser modificado para o sistema CRISPR-Cas da presente invenção. Cada olho pode ser tratado ou com RetinoStat® a uma dose de 1,1 x 105 unidade de transdução por olho (TU/olho) em um volume total de 100 μL.

[0627] Em outra forma de realização, os vetores de adenovírus E1, E3 parcial, deletado em E4 podem ser contemplados para aplicação ao olho. A vinte e oito pacientes com degeneração macular relacionada com a idade neovascular avançada (AMD) foi administrada uma única injeção intravítrea de um vetor de adenovírus E1, E3 parcial, deletado no vetor E4 adenoviral expressando o fator derivado do epitélio pigmentar humano (AdPEDF.ll) (ver por exemplo, Campochiaro et al., Human Gene Therapy 17:167-176 (fevereiro 2006)). Doses variando desde 106 a 109,5 unidades de partícula (PU) foram investigadas e não houve eventos adversos graves relacionados com a AdPEDF.ll e nenhuma toxicidade limitativa de dose (ver, por exemplo, Campochiaro et al., Human Gene Therapy 17:167176 (fevereiro 2006)). Genes de transferência ocular mediada por vetores de adenovírus parecem ser uma abordagem viável para o tratamento de doenças oculares e podem ser aplicados ao sistema CRISPR-Cas.

[0628] Em outra forma de realização, o sistema sd- rxRNA® da RXi Pharmaceuticals pode ser usado e/ou adaptado para aplicar CRISPR Cas ao olho. Neste sistema, um única administração intravítrea de 3 μg de sd-rxRNA resulta na redução dos níveis de PPIB mRNA específico da sequência durante 14 dias. O sistema sd-rxRNA® pode ser aplicado ao sistema CRISPR-Cas da presente invenção, contemplando a dose de cerca de 3 a 20 mg de CRISPR administrados a um humano.

[0629] Millington-Ward et al. (Molecular Therapy, vol. 19 no. 4, 642-649 abr. 2011) descrevem vetores de vírus associados a adeno (AAV) para aplicar um supressor rodopsina de base em RNA de interferência (RNAi) e um gene de substituição de rodopsina modificado por códon resistente à supressão devida a alterações de nucleotídeos nas posições degeneradas sobre o sítio alvo do RNAi. Uma injeção de 6,0 x 108 vp ou 1,8 x 1010 vp de AAV foi injetada subretinalmente nos olhos por Millington-Ward et al. Os vetores de AAV de Millington-Ward et al. podem ser aplicados ao sistema CRISPR- Cas da presente invenção, contemplando uma dose de cerca de 2 x 1011 até cerca de 6 x 1013 vp administrada a um humano.

[0630] Dalkara et al. (Sci Transl Med 5, 189ra76 (2013)) também referem a evolução dirigida in vivo para modelar um vetor AAV que aplica versões do tipo selvagem de genes detectores através da retina após injeção não lesiva no humor vítreo dos olhos. Dalkara descreve uma biblioteca de exibição de peptídeos 7mer e uma biblioteca AAV construída por de genes cap de arranjo combinatório de DNA partindo de AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, e 9. As bibliotecas rcAAV e vetores rAAV expressando GFP sob um promotor CAG ou Rhoforam involucrados e os títulos de desoxiribonuclease genômica resistente foram obtidos por PCR quantitativo. As bibliotecas foram agrupadas, e foram realizados dois ciclos de evolução, cada consistindo de diversificação da biblioteca inicial seguida de três etapas de seleção in vivo. Em cada uma dessas etapas, P30 rho-GFP os camundongos foram injetados intravítrealmente com 2 mL de iodixanol purificado, a biblioteca dialisada com salino tamponado com fosfato (PBS) com um título genômico de cerca de 1 x 1012 vg/mL. Os vetores de AAV de Dalkara et al. podem ser aplicados ao sistema CRISPR-Cas da presente invenção, contemplando uma dose de cerca de 1 x 1015 até cerca 1 x 1016 vg/mL administrada a um humano.

[0631] Em outra forma de realização, o gene rodopsina pode ser visado para o tratamento da retinite pigmentosa (RP), em que o sistema de Pedido das Patentes E.U.A. No. 20120204282 atribuído a Sangamo BioSciences, Inc. pode ser modificado de acordo com o sistema CRISPR-Cas da presente invenção.

[0632] Em outra forma de realização, os métodos do Pedido da Patente E.U.A. No. 20130183282 atribuído a Cellectis, o qual é direcionado para métodos de clivagem de uma sequência alvo de um gene rodopsina humano, pode também ser modificado pelo Sistema CRISPR Cas da presente invenção.

[0633] O Pedido da Patentes E.U.A. No. 20130202678 atribuído a Academia Sínica relaciona-se com métodos para tratar retinopatias e doenças oculares ameaçando a visão relacionando com a aplicação do gene Puf-A (que é expressado no gânglio retinal e células pigmentadas do tecido ocular e exibe uma atividade antiapoptótica única) para o espaço subretinal ou intravítreo no olho. Em particular, os desejados zgc:193933, prdm1a, spata2, tex10, rbb4, ddx3, zp2.2, Blimp-1 e HtrA2, todos os quais podem ser dirigidos pelo sistema CRISPR-Cas da presente invenção.

[0634] Wu (Cell Stem Cell,13:659-62, 2013) definiram o RNA guia que conduziu a Cas9 a uma mutação de um único par de bases que causa cataratas nos camundongos, onde se induziu a clivagem de DNA. Depois usando ou o outro alelo tipo selvagem ou os oligos dados aos mecanismos de reparação de zigotos corrigiu-se a sequência do alelo quebrada e corrigiu-se o defeito genético causador de catarata no camundongo mutante.

[0635] O Pedido da Patentes E.U.A. No. 20120159653, descreve o uso de nucleases impressão digital de zinco às células, animais e proteínas modificados geneticamente associados com a degeneração macular (MD). A degeneração macular (MD) é a primeira causa de deficiência visual em idosos, mas também é um sintoma característico de doenças de infância tal como doença de Stargardt, fundo de Sorsby, e doenças neurodegenerativas fatais da infância, com uma idade de aparecimento tão precoce como a infância. A degeneração macular resulta na perda da visão no centro do campo visual (a mácula) devido ao dano na retina. Correntemente modelos animais existentes não recapitulam as principais características da doença como é observado em humanos. Os modelos animais disponíveis compreendendo proteínas codificando genes mutantes associados com MD também produzem fenótipos altamente variáveis, fazendo traduções para doenças humanas e desenvolvimento da terapia problemática.

[0636] Um aspecto do Pedido da Patentes E.U.A. No. 20120159653 relaciona-se com edição de quaisquer sequências cromossômica codificando proteínas associadas com MD que podem ser aplicados ao sistema CRISPR-Cas da presente invenção. As proteínas associadas com MD e tipicamente selecionado com base em uma associação experimental da proteína associada com MD a uma afecção MD. Por exemplo, a taxa de produção ou a concentração circulante de uma proteína associada com MD podem ser elevados ou deprimidos em uma população possuindo um distúrbio MD em relação a uma população sem o transtorno MD. Diferenças nos níveis de proteína podem ser medidas usando técnicas proteômicas incluindo mas não limitadas a transferência de Western, a coloração imuno-histoquímica, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), e espetrometria de massa. De modo alternativo, as proteínas associadas com MD podem ser identificadas obtendo os perfis de expressão genética dos genes codificando as proteínas usando técnicas genômicas incluindo mas não limitado a análise de microarranjo de DNA, análise em série da expressão genética (SAGE), e reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (Q-PCR).

[0637] Como exemplos não limitativos, as proteínas associadas com MD incluem mas não estão limitados às seguintes proteínas: Cassete ligando a ATP (ABCA4), subfamília A (ABC1), membro 4 ACHM1 de acromatopsia (monocromacia em haste) 1 ApoE Apolipoproteína E (ApoE) C1QTNF5 (CTRP5) C1q e proteína 5 relacionada com fator de necrose tumoral (C1QTNF5) C2 componentes de complemento 2 (C2) C3 Componentes de complemento (C3) CCL2 quimiocinacina (motivo C-C ) Ligando 2 (CCL2) CCR2 quimiocina (motivo C-C) receptor 2 (CCR2) CD36 Cluster de Diferenciação 36 CFB Fator do complemento B CFH fator do complemento CFH H CFHR1 fator do complemento relacionado com H 1 CFHR3 fator do complemento relacionado com H 3 CNGB3 canal beta fechado a nucleotídeo cíclico 3 CP ceruloplasmina (CP) CRP C proteína reativa (CRP) CST3 cistatina C ou cistatina 3 (CST3) CTSD Catepsina D (CTSD) CX3CR1 quimiocina (motivo C-X3-C) receptor 1 ELOVL4 Elongação de ácidos graxos de cadeia muito longa 4 ERCC6 reparação por excisão cruzada complementar da deficiência de reparo em roedor, grupo de completação reparação 6 FBLN5 Fibulina-5 FBLN5 Fibulina 5 FBLN6 Fibulina 6 FSCN2 fascina (FSCN2) HMCN1 Hemicentrina 1 HMCN1 hemicentina 1 HTRA1 HtrA serina peptidase 1 (HTRA1) HTRA1 HtrA serina peptidase 1 IL-6 Interleucina 6 IL-8 Interleucina 8 LOC387715 Proteína hipotética PLEKHA1 Domínio de homologia de Pleckstrina contendo membro 1 da família A (PLEKHA1) PROM1 Prominina 1(PROM1 ou CD133) PRPH2 Periferin-2 RPGR retinite pigmentosa GTPase regulator SERPING1 inhibidor daserpina peptidase, clade G, membro 1 (Inibidor C1) TCOF1 Inibidor Treacle TIMP3 Metaloproteinase 3 (TIMP3) TLR3 receptor tipo Toll 3.

[0638] A identidade da proteína associada a MD cuja sequência cromossômica é editada pode e irá variar. Em formas de realização preferenciais, as proteínas associadas a MD cuja sequência cromossômica é editada podem ser o cassete de ligação a ATP, subfamília A (ABC1) membro 4 proteína (ABCA4) codificada pelo gene ABCR, a proteína apolipoproteína E (APOE), codificada pelo gene da APOE, a quimiocina (motivo C-C) Proteína ligando 2 (CCL2) codificada pelo gene CCL2, a quimiocina (motivo C-C) do receptor de proteína 2 (CCR2) codificada pelo gene CCR2, a proteína ceruloplasmina (CP) codificada pelo gene CP, a proteína catepsina D (CTSD) codificada pelo gene CTSD, ou o inibidor da metaloproteinase da proteína 3 (TIMP3), codificada pelo gene TIMP3. Em uma forma de realização exemplar, o animal geneticamente modificado é uma rato, e a sequência cromossômica editada codificando a proteína associada a MD pode ser: Cassete ligado a ATP (ABCA4), NM_000350 subfamília A (ABC1), membro APOE 4 Apolipoproteína E NM_138828 (APOE) CCL2 Quimiocina (motivoC-C NM_031530) Ligando 2 (CCL2) CCR2 Quimiocina (motivo C-C NM_021866) receptor 2 (CCR2) ceruloplasmina CP (CP) NM_012532 CTSD Catepsina D (CTSD) NM_134334 TIMP3 Metaloproteinase NM_012886 inibidor 3 (TIMP3). O animal ou célula podem compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais sequências cromossômica interrompidas codificando a proteína associada a MD e zero, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais sequências cromossômicas integradas codificando a proteína interrompida associada a MD.

[0639] A sequência cromossômica editada ou integrada pode ser modificada para codificar uma proteína alterada associada a MD. Várias mutações em sequências cromossômicas relacionadas com MD têm sido associados a MD. Exemplos de mutações em sequências cromossômicas associadas à DM não limitativos incluem as que podem causar MD incluindo na proteína ABCR, E471K (isto é, um glutamato na posição 471 é alterado para lisina), R1129L (isto é, a posição 1129 arginina é mudada para leucina), T1428M (isto é uma posição treonina 1428 é alterada para metionina), R1517S (isto é uma posição 1517 de arginina está alterada para serina), I1562T (isto é isoleucina na posição 1562 está alterada para treonina), e G1578R (isto é glicina na posição 1578 é mudada para arginina); na proteína CCR2, V64I (isto é valina na posição 192 é mudada para isoleucina); em proteína CP, G969B (isto é glicina na posição 969 é mudada para asparagina ou aspartato); em proteína TIMP3, S156C (isto é serina na posição 156 é mudada para cisteína), G166C (isto é glicina na posição 166 é mudada para cisteína), G167C (isto é glicina na posição 167 é mudada para cisteína), Y168C (isto é tirosina na posição 168 é mudada para cisteína), S170C (isto é serina na posição 170 é mudada para cisteína), Y172C (isto é tirosina na posição 172 é mudada para cisteína) e S181C (isto é serina a posição 181 é mudada para cisteína). Outras associações de variantes genéticas em genes associados a MD e doença são conhecidos na arte.

[0640] Coração

[0641] A presente invenção também contempla aplicação do sistema CRISPR-Cas ao coração. Para o coração, um vírus associado a adeno trópico do miocárdio (AAVM) é preferencial, particularmente AAVM41 o qual mostrou transferência de genes preferencial na coração (ver, por exemplo, Lin-Yanga et al., PNAS, março 10, 2009, vol. 106, no. 10). A administração pode ser sistêmica ou local. Uma dosagem de cerca de 1-10 x 1014 genomas vetores são contemplados para administração sistêmica. Ver também, por exemplo, Eulalio et al. (2012) Nature 492: 376 e Somasuntharam et al. (2013) Biomaterials 34: 7790.

[0642] Por exemplo, o Pedido da patente E.U.A. No. 20110023139, descreve o uso de nucleases de impressão digital de zinco às células modificadas geneticamente, animais e proteínas associados com a doença cardiovascular. As doenças cardiovasculares geralmente incluem pressão arterial elevada, ataques cardíacos, falha cardíaca, e enfarto e TIA. Qualquer sequência cromossômica envolvida na doença cardiovascular ou a proteína codificada por qualquer sequência cromossômica envolvida na doença cardiovascular pode ser utilizada nos métodos descritos nesta divulgação. As proteínas relacionadas com cardiovascular são tipicamente selecionadas com base em uma associação experimental da proteína relacionada com cardiovascular para o desenvolvimento de doença cardiovascular. Por exemplo, a taxa de produção ou concentração de circulação de uma proteína relacionada com cardiovascular pode ser elevada ou deprimida em uma população tendo um distúrbio cardiovascular em relação à população sem o distúrbio cardiovascular. Diferenças nos níveis de proteína podem ser medidos usando técnicas proteômicas incluindo mas não limitado a transferência de Western, a coloração imuno- histoquímica, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), e espetrometria de massa. De modo alternativo, as proteínas relacionados com cardiovascular podem ser identificados para obter os perfis de expressão de genes codificando as proteínas usando técnicas genômicas incluindo mas não limitado a análise de microarranjo de DNA, análise em série da expressão genética(SAGE), e reação quantitativa da cadeia polimerase em tempo real (Q-PCR).

[0643] Como exemplo, as sequência cromossômicas podem compreender, mas não se limitam a, IL1B (interleucina 1, beta), XDH (xantina desidrogenase), TP53 (proteína de tumor p53), PTGIS (prostaglandina 12 (prostaciclina) sintase), MB (mioglobina), IL4 (interleucina 4), ANGPT1 (angiopoietina 1), ABCG8 (Cassete de ligação de ATP, subfamília G (WHITE), Membro 8), CTSK (cahepsina K), PTGIR (prostaglandina 12 (prostaciclina) receptor (IP)), KCNJ11 (canal de retificação de potássio interno, subfamília J, Membro 11), INS (insulina), CRP (Proteína C reativa, relacionada com pentraxina), PDGFRB (receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas, polipeptídeo beta), CCNA2 (ciclina A2), PDGFB (fator polipeptídeo beta de crescimento derivado de plaquetas (sarcoma símio viral (v-sis) de oncogene homóloga)), KCNJ5 (canal de potássio retificando interiormente, subfamília J, membro 5), KCNN3 (potássio intermediário/canal ativado por Cálcio de pequena condutância, subfamília N, membro 3), CAPN10 (calpaina 10), PTGES (prostaglandina E sintase), ADRA2B (adrenérgico, alfa-2B-, receptor), ABCG5 (Cassete de ligação de ATP, subfamília G (WHITE), membro 5), PRDX2 (peroxiredoxina 2), CAPN5 (calpaina 5), família PARP14 (poli (ADP-ribose) polimerase, membro 14), MEX3C (mex-3 homólogo C (C. elegans)), ACE angiotensina I convertendo enzima (peptidil-dipeptidase A) 1), TNF (fator de necrose tumoral (superfamília TNF, membro 2)), IL6 (interleucina 6 (interferon, beta 2)), STN (estatina), SERPINE1 (inibidor da serpina peptidase, clado E (nexina, inibidor do ativador plasminogênio tipo 1), membro 1), ALB (albumina), ADIPOQ (adiponectina, C1Q e domínio contendo colagênio), APOB (apolipoproteina B (incluindo antigênio Ag(x))), APOE (apolipoproteina E), LEP (leptina), MTHFR (5,10-metilenetetrahidrofolato redutase (NADPH)), APOA1 (apolipoproteina A-I), EDN1 (endotelina 1), NPPB (natriuretic peptídeo precursor B), NOS3 (óxido nítrico sintase 3 (células endoteliais)), PPARG (receptor gama ativado por proliferator peroxisoma ), PLAT (ativador do plasminogénio, tecido), PTGS2 (prostaglandina-endopeóxido sintase 2 (prostaglandina G/H sintase e cilcooxigenase)), CETP (proteína de transferência de éster de colesterilo, plasma), AGTR1 (receptor de angiotensina II, tipo 1), HMGCR (3-hidroxi-3-metilglutaril- Coenzima A redutase), IGF1 (fator de crescimento insulina tipo 1 (somatomedina C)), SELE (selectina E), REN (renina), PPARA (receptor alfa ativado por proliferator peroxisoma ), PON1 (paraoxonase 1), KNG1 (cininogênio 1), CCL2 (quemicina (Motivo C-C) ligando 2), LPL (lipoproteína lipase), VWF (fator von Willebrand), F2 (fator II de coagulação (trombina)), ICAM1 (molécula de adesão intercelular 1), TGFB1 (fator de crescimento transfor, beta 1), NPPA (peptídeos precursores de natriurético A), IL10 (interleucina 10), EPO (eritropoietina), SOD1 (superóxido dismutase 1, solúvel), VCAM1 (molécula de adesão celular vascular 1), IFNG (interferon, gama), LPA (lipoproteína, Lp(a)), MPO (mieloperoxidase), ESR1 (receptor de estrogêneo 1), MAPK1 (proteína quinase ativada por mitógeno 1), HP (haptoglobina), F3 (fator de coagulação III (tromboplastina, fator tecidular)), CST3 (cistatina C), COG2 (doligomérico componente do complexo de Golgi 2), MMP9 (metalopeptidase de matriz 9 (gelatinase B, gelatinase 92 kDa, colagenase tipo IV 92 kDa)), SERPINC1 (inibidor da serpina peptidase, clado C (antitrombina), membro 1), F8 (fator de coagulação VIII, componente procoagulante), HMOX1 (heme oxigenase (desciclagem) 1), APOC3 (apolipoproteína C-III), IL8 (interleucina 8), PROK1 (procineticina 1), CBS (cistationina- beta-sintase), NOS2 (óxido nítrico sintase 2, induzível), TLR4 (receptor de tipo Toll 4), SELP (selectina P (proteína da membrana do grânulo de 140 kDa, antigênio CD62)), ABCA1 (Cassete de ligação de ATP, subfamília A (ABC1), membro 1), AGT (angiotensinogeno (inibidor da serpina peptidase, clado A, membro 8)), LDLR (receptor de lipoproteína de baixa densidade), GPT (transaminase piruvato glutâmico (alanina aminotransferase)), VEGFA (fator de crescimento endotelial vascularA), NR3C2 (subfamília de receptores nucleares 3, grupo C, membro 2), IL18 (interleucina 18 (fator de indução do interferão gama)), NOS1 (óxido nítrico sintase 1 (neuronal)), NR3C1 (subfamília de receptores nucleares 3, grupo C, membro 1 (receptor de glucocorticoides)), FGB (cadeia beta fibrinogênio), HGF (fator de crescimento de hepatócitos (hepapoietina A; fator de dispersão)), IL1A (interleucina 1, alfa), RETN (resistina), AKT1 (v-akt timoma de murino viral de oncogene homóloga 1), LIPC (lipase, hepática), HSPD1 (choque térmico de proteína 1 de 60 kDa (chaperonina)), MAPK14 (proteína quinase ativada por mitógeno 14), SPP1 (fosfoproteina secretada 1), ITGB3 (integrina, beta 3 (glicoproteína plaquetária111a, antigênio CD61)), CAT (catalase), UTS2 (urotensina 2), THBD (trombomodulina), F10 (fator de coagulação X), CP (ceruloplasmina (ferroxidase)), TNFRSF11B (superfamília de fator de necrose tumoral receptor, membro 11b), EDNRA (endotelina tipo receptor A), EGFR (fator de crescimento epidérmico (leucemia viral eritroblástica (v- erb-b) oncogene homólogo, aviária)), MMP2 (metalopeptidase de matriz 2 (gelatinase A, gelatinase de 72 kDa, colagenase tipo IV 72 kDa)), PLG (plasminogênio), NPY (neuropeptídeo Y), RHOD (família de gene homólogo ras, membro D), MAPK8 (proteína quinase ativada por mitógeno 8), MYC (v-myc mielocitomstose viral de oncogene homólogo (aviária)), FN1 (fibronectina 1), CMA1 (quimase 1, mastócitos), PLAU (ativator plasminogeneo, uroquinase), GNB3 (proteína de ligação a nucleotídeo guanina (G proteína), polipeptídeo beta 3), ADRB2 (adrenérgico, beta- 2-, receptor, superfície), APOA5 (apolipoproteína A-V), SOD2 (superóxido dismutase 2, mitocondrial), F5 (fator de coagulação V (proacelerina, fator lábil)), VDR (vitamina D (1,25-dihidroxivitamina D3) receptor), ALOX5 (araquidonateo 5-lipoxigenase), HLA-DRB1 (complexo principal de histocompatibilidade, classe II, DR beta 1), PARP1 (poli (ADP- ribose) polímeroase 1), CD40LG (CD40 ligando), PON2 (paraoxonase 2), AGER (receptor específico de produtos finais de glicosilação avançada), IRS1 (substrato receptor de insulina 1), PTGS1 (endoperóxido de prostaglandina sintase 1 (prostaglandina G/H sintase e cilcooxigenase)), ECE1 (enzima conversora de endotelina1), F7 (fator de coagulação VII (acelerador de conversão de protrombina sérica)), URN (antagonista receptor de interleucina 1), EPHX2 (epóxido de hidrolase 2, citoplásmica), IGFBP1 (proteína de ligação a fator de crescimento tipo insulina 1), MAPK10 (proteína quinase ativada por mitógeno 10), FAS (Fas (superfamília de receptores TNF, membro 6)), ABCB1 (Cassete de ligação de ATP, subfamília B (MDR/TAP), membro 1), JUN (jun oncogene), IGFBP3 (proteína de ligação a fator de crescimento tipo insulina 3), CD14 (molécula CD14), PDE5A (fosfodiesterase 5A, específica de cGMP), AGTR2 (receptor de angiotensina II, tipo 2), CD40 (molécula CD40, Superfamília receptor TNF membro 5), LCAT (aciltransferase lecitina-colesterol), CCR5 (quemicina (Motivo C-C) receptor 5), MMP1 (metalopeptidase de matriz 1 (colagenase intersticial)), TIMP1 (Inibidor da metalopeptidase TIMP1), ADM (adrenomedulina), DYT10 (distonia 10), STAT3 (sinal transdutor e ativador de transcrição3 (fator de resposta de fase aguda)), MMP3 (metalopeptidase de matriz 3 (estromelisina 1, progelatinase)), ELN (elastina), USF1 (fator de transcrição a montante 1), CFH (fator de complemento H), HSPA4 (choque térmico de proteína 4 de 70 kDa), MMP12 (metalopeptidase de matriz 12 (elastase de macrófago)), MME (metalo-endopeptidase de membrana), F2R (fator II de coagulação(trombina) receptor), SELL (selectina L), CTSB (catepsina B), ANXA5 (anexina A5), ADRB1 (adrenérgico, beta- 1-, receptor), CYBA (citocromo b-245, polipeptídeo alfa), FGA (fibrinogênio de cadeia alfa), GGT1 (gama-glutamiltransferase 1), LIPG (lipase, endotelial), HIF1A (fator hipóxia induzível 1, subunidade alfa (fator de transcrição hélice-ciclo-hélice básico)), CXCR4 (quemicina (motivo C-X-C) receptor 4), PROC (proteína C (inativador de fatores de coagulação Va e VIIIa)), SCARB1 (receptor de renovação classe B, membro 1), CD79A (CD79a molécula, imunoglobulina associada alfa), PLTP (proteína de transferência de fosfolípidos), ADD1 (aducina 1 (alfa)), FGG (cadeia gama de fibrinogênio), SAA1 (soro amiloide A1), KCNH2 (canal de potássio de voltagem fechada, subfamília H (ewlacionado a eag), membro 2), DPP4 (dipeptidil-peptidase 4), G6PD (glucose-6-fosfato desidrogenase), NPR1 (receptor de peptídeos natriuréticos A/guanilato ciclase A (receptor de peptídeos atrionatriuréticos A)), VTN (vitronectina), KIAA0101 (KIAA0101), FOS (FBJ osteosarcoma de murino viral de oncogene homólogo), TLR2 (receptor tipo toll 2), PPIG (peptidilprolil isomerase G (cilcofilina G)), IL1R1 (interleucina 1 receptor, tipo I), AR (receptor de androgêneo), CYP1A1 (citocromo P450, família 1, subfamília A, polipeptídeo 1), SERPINA1 (inibidor da serpina peptidase, clado A (alfa-1 antiproteinase, antitripsina), membro 1), MTR (5-metiltetrahidrofolato- homociseína metiltransferase), RBP4 (proteína de ligação a retinol 4, plasma), APOA4 (apolipoproteína A-IV), CDKN2A (inibidor de quinase dependente de ciclina 2A (melanoma, p16, inibe CDK4)), FGF2 (fator de crescimento de fibroblastos 2 (básico)), EDNRB (receptor B tipo endotelina), ITGA2 (integrina, alfa 2 (CD49B, receptor VLA-2 de subunidade alfa 2)), CABIN1 (proteína de ligação a calcineurina 1), SHBG (globulina ligada a hormônio sexual), HMGB1 (caixa de grupo de alta mobilidade 1), HSP90B2P (proteína beta de choque térmico 90 kDa(Grp94), membro 2 (pseudogene)), CYP3A4 (citocromo P450, família 3, subfamília A, polipeptídeo 4), GJA1 (proteína de junção lacuna, alfa 1, 43 kDa), CAV1 (caveolina 1, e proteína caveola, 22 kDa), ESR2 (receptor de estrogêneo 2 (ER beta)), LTA (linfotoxina alfa (TNF superfamília, membro 1)), GDF15 (fator de diferenciação de crescimento 15), BDNF (fator neurotrófico derivado do cérebro), CYP2D6 (citocromo P450, família 2, subfamília D, polipeptídeo 6), NGF (fator de crescimento do nervo (polipeptídeo beta)), SP1 (Sp1 fator de transcrição), TGIF1 (TGFB-fator homeobox induzida homeobox 1), SRC (v-src sarcoma (Schmidt-Ruppin A-2) oncogene viral homólogo (aviário)), EGF (fator de crescimento epidérmico (beta-urogastrona)), PIK3CG (fosfoinositídeo-3-quinase, catalítica, gama polipeptídeo), HLA-A (complexo principal de histocompatibilidade, classe I, A), KCNQ1 (canal de potássio de voltagem fechada, subfamília tipo KQT, membro 1), CNR1 (receptor de canabinoide 1 (cérebro)), FBN1 (fibrilina 1), CHKA (colina quinase alfa), BEST1 (bestrofina 1), APP (amiloide beta (A4) precursor de proteína), CTNNB1 (catenina (proteína associada a caderina), beta 1, 88 kDa), IL2 (interleucina 2), CD36 (CD36 molécula (receptor de trombospondina)), PRKAB1 (proteína quinase, ativada por AMP, beta 1 não subunidade catalítica), TPO (tiroide peroxidase), ALDH7A1 (família aldeído desidrogenase 7, membro A1), CX3CR1 (quemicina (motivo C-X3-C) receptor 1), TH (tirosina hidroxilase), F9 (fator de coagulação IX), GH1 (hormônio de crescimento 1), TF (transferrina), HFE (hemocromatose), IL17A (interleucina 17A), PTEN (fosfatase e tensina homóloga), GSTM1 (glutationa S-transferase mu 1), DMD (a distrofina), GATA4 (proteína ligada a GATA 4), F13A1 (fator de coagulação XIII, polipeptídeo A1), TTR (transtiretina), FABP4 (proteína de ligação a ácido graxo 4, adipócito), PON3 (paraoxonase 3), APOC1 (apolipoproteína C-I), INSR (receptor de insulina), TNFRSF1B (superfamília de fator de necrose tumoral receptor, membro 1B), HTR2A (5-hidroxitriptamina (serotonina) receptor 2A), CSF3 (fator 3 estimulante de colônias (granulocito)), CYP2C9 (citocromo P450, família 2, subfamília C, polipeptídeo 9), TXN (tioredoxina), CYP11B2 (citocromo P450, família 11, subfamília B, polipeptídeo 2), PTH (hormônio paratiroide), CSF2 (fator 2 estimulante de colônias (granulócito macrófago)), KDR (receptor do domínio de inserção da quinase (receptor tirosina quinase tipo III)), PLA2G2A (fosfolipase A2, grupo IIA (plaquetas, fluído sinovial)), B2M (beta-2-microglobulina), THBS1 (trombospondina 1), GCG (glucagon), RHOA (família de gene homólogo ras, membro A), ALDH2 (aldeído desidrogenase 2 família (mitocondrial)), TCF7L2 (fator de transcrição 7-tipo 2 (específico de célula T, caixa HMG)), BDKRB2 (receptor de bradicinina B2), NFE2L2 (fator nuclear (derivado eritroide 2)- tipo 2), NOTCH1 (entalhe homólogo 1, associada a translocação (Drosophila)), UGT1A1 (UDP glucuronosiltransferase 1 família, polipeptídeo A1), IFNA1 (interferon, alfa 1), PPARD (receptor delta ativado por proliferador peroxisoma), SIRT1 (sirtuina (acasalamento silencioso tipo informação regulação homólogo 2) 1 (S. cerevisiae)), GNRH1 (1 hormônio libertadora de gonadotropina (hormônio liberador luteinizante)), PAPPA (plasma proteína A associada a gravidez, papalisina 1), ARR3 (arrestina 3, retinal (X-arrestina)), NPPC (precursor de peptídeos C natriuréticos), AHSP (proteína estabilizadora de hemoglobulina alfa), PTK2 (PTK2 proteína tirosina kinase 2), IL13 (interleucina 13), MTOR (mecânica alvo da rapamicina (serina/treonina quinase)), ITGB2 (integrina, beta 2 (complemente componente 3 subunidade receptora 3 e 4)), GSTT1 (glutationa S-transferase teta 1), IL6ST (interleucina 6 sinal transducer (gp130, receptor oncostatina M)), CPB2 (carboxipeptidase B2 (plasma)), CYP1A2 (citocromo P450, família 1, subfamília A, polipeptídeo 2), HNF4A (hepatocyte nuclear fator 4, alfa), SLC6A4 (família de soluto dde veículo 6 (neurotransmssor transportor, serotonina), membro 4), PLA2G6 (fosfolipase A2, grupo VI (citosólica, independente de cálcio)), TNFSF11 (fator de necrose tumoral (ligando) superfamília, membro 11), SLC8A1 (família solutos de veículos 8 (sódio/permutador de cálcio), membro 1), F2RL1 (fator II de coagulação(trombina) receptor-litipo 1), AKR1A1 (família aldoceto redutase 1, membro A1 (aldeído redutase)), ALDH9A1 (aldeído desidrogenase 9 família, membro A1), BGLAP (proteína gama-carboxiglutamato ósseaproteína), MTTP (microsomal triglyceride transfer proteína), MTRR (5- metiltetrahidrofolato-homociseína metiltransferase redutase), SULT1A3 (família sulfotransferase, citosólica, 1A, preferindo fenol, membro 3), RAGE (tumor renal antigênio), C4B (componente complemente 4B (grupo sanguíneo Chido), P2RY12 (receptor P2Y purinérgico, G-proteína acoplada, 12), RNLS (renalase, amina oxidase dependente de FAD), CREB1 (proteína de ligação a elemento responsável cAMP1), POMC (proopiomelanocortina), RAC1 (substrato de toxina botulínica C3 relacionada com ras 1 família(rho, binding proteína Rac1 ligada a pequeno GTP)), LMNA (lamina NC), CD59 (molécula CD59, proteína reguladora de complemento), SCN5A (canal de sódio, voltagem fechada, tipo V, subunidade alfa), CYP1B1 (citocromo P450, família 1, subfamília B, polipeptídeo 1), MIF (fator inibidor da migração de macrófagos (fator de inibição- glicosilação)), MMP13 (metalopeptidase de matriz 13 (colagenase 3)), TIMP2 (Inibidor da metalopeptidase TIMP2), CYP19A1 (citocromo P450, família 19, subfamília A, polipeptídeo 1), CYP21A2 (citocromo P450, família 21, subfamília A, polipeptídeo 2), PTPN22 (proteína tirosina fosfatase, tipo não receptor 22 (limfoide)), MYH14 (miosina, cadeia pesada 14, não músculo), MBL2 (lectina de ligação a manose (proteína C) 2, solúvel (defeito opsónico)), SELPLG (ligando P selectina), AOC3 (amina oxidase, contendo cobre 3 (proteína de aderência vascular 1)), CTSL1 (catepsina L1), PCNA (antigênio nuclear da célula proliferativa), IGF2 (fator de crescimento tipo insulina 2 (somatomedina A)), ITGB1 (integrina, beta 1 (receptor fibronectina, polipeptídeo beta, antigênio CD29 inclui MDF2, MSK12)), CAST (calpastatina), CXCL12 (quemicina (motivo C-X-C) ligando 12 (fator derivado dr células do estroma 1)), IGHE (epsilon constante pesado de imunoglobulina), KCNE1 (canal de potássio de voltagem fechada, família relacionada com Isk, membro 1), TFRC (receptor de transferrina (p90, CD71)), COL1A1 (colagênio, tipo I, alfa 1), COL1A2 (colagênio, tipo I, alfa 2), IL2RB (receptor interleucina 2, beta), PLA2G10 (fosfolipase A2, grupo X), ANGPT2 (angiopoietina 2), PROCR (receptor C de proteína, endotelial (EPCR)), NOX4 (NADPH oxidase 4), HAMP (peptídeos antimicrobianos de hepcidina), PTPN11 (proteína tirosina fosfatase, ipo não receptor 11), SLC2A1 (família de solução de veículo 2 (transportador de glicose facilitado), membro 1), IL2RA (interleucina 2 receptor, alfa), CCL5 (quemicina (Motivo C-C) ligando 5), IRF1 (fator regulador de interferon 1), CFLAR (regulador de apoptose tipo CASP8 e FADD), CALCA (polipeptídeo alfa relacionado com calcitonina), EIF4E (fator de iniciação de translação eucariótica 4E), GSTP1 (glutationa S-transferase pi 1), JAK2 (quinase Janus 2), CYP3A5 (citocromo P450, família 3, subfamília A, polipeptídeo 5), HSPG2 (heparan sulfato proteoglycan 2), CCL3 (quemicina (Motivo C-C) ligando 3), MYD88 (gene de resposta primária de diferenciação mieloide (88)), VIP (peptídeos intestinais vasoactivos), SOAT1 (esterol O-aciltransferase 1), ADRBK1 (adrenérgico, beta, receptor quinase 1), NR4A2 (subfamília de receptores nucleares 4, grupo A, membro 2), MMP8 (metalopeptidase de matriz 8 (colagenase neutrófila)), NPR2 (receptor peptídeos natriuréticos B/guanilato ciclase B (peptídeos atrioreceptor natriuréticos B)), GCH1 (cilcohidrolase GTP 1), EPRS (glutamil-prolil-tRNA syintetase), PPARGC1A (receptor gama ativado por proliferator peroxisoma, coativdor 1 alfa), F12 (fator de coagulação XII (fator Hageman)), PECAM1 (moléculas de adesão plaquetas/células endoteliais), CCL4 (quemicina (Motivo C-C) ligando 4), SERPINA3 (inibidor da serpina peptidase, clado A (alfa-1 antiproteinase, antitripsina), membro 3), CASR (receptor de sensoriamento de cálcio), GJA5 (proteína de junção lacuna, alfa 5, 40 kDa), FABP2 (proteína de ligação a ácido graxo 2, intestinal), TTF2 (fator terminação da transcrição, RNA polimerase II), PROS1 (proteína S (alfa)), CTF1 (cardiotrofina 1), SGCB (sarcoglicana, beta (glicoproteina associada a distrofina 43 kDa)), YME1L1 (YME1- like 1 (S. cerevisiae)), CAMP (peptídeos antimicrobianos catelicidina), ZC3H12A (impressão digital de zinco tipo CCCH contendo 12A), AKR1B1 (aldo-ceto redutase família 1, membro B1 (aldose redutase)), DES (desmina), MMP7 (metalopeptidase de matriz 7 (matrilisina, uterina)), AHR (receptor de hidrocarboneto de arila), CSF1 (fator estimulante de colônias 1 (macrófago)), HDAC9 (histona deacetilase 9), CTGF (fator crescimento do tecido conjuntivo), KCNMA1 (canal de grande condutância ativado por potássio, subfamília M, alfa membro 1), UGT1A (UDP glucuronosiltransferase 1 família, local complexo de polipeptídeo A), PRKCA (proteína quinase C, alfa), COMT (catecol-.beta.-metiltransferase), S100B (S100 proteína de ligação a cálcio B), EGR1 (resposta a crescimento precoce 1), PRL (prolactina), IL15 (interleucina 15), DRD4 (receptor de dopamina D4), CAMK2G (proteína quinase II gama dependente de cálcio/calmodulina), SLC22A2 (família de soluto dde veículo 22 (cátion transportador orgânico), membro 2), CCL11 (quemicina (Motivo C-C) ligando 11), PGF (B321 fator de crescimento placentário), THPO (trombopoietina), GP6 (glicoproteína VI (plaquetas)), TACR1 (receptor de taciquinina1), NTS (neurotensina), HNF1A (HNF1 homeobox A), SST (somatostatina), KCND1 (canal de potássio devoltagem fechada, subfamília relacionada com Shal, membro 1), LOC646627 (inibidor da fosfolipase), TBXAS1 (tromboxano A sintase 1 (plaquetas)), CYP2J2 (citocromo P450, família 2, subfamília J, polipeptídeo 2), TBXA2R (tromboxano A2 receptor), ADH1C (álcool desidrogenase 1C (classe I), polipeptídeo gama), ALOX12 (araquidonato 12-lipoxigenase), AHSG (alfa-2-HS- glicoproteína), BHMT (betaína-homociseína metiltransferase), GJA4 (proteína de junção lacuna, alfa 4, 37 kDa), SLC25A4 (família de soluto dde veículo 25 (veículo mitocondrial; translocador do nucleotídeo adenine), membro 4), ACLY (ATP citrato lyase), ALOX5AP (arachidonate 5-lipoxigenase-ativting proteína), NUMA1 (proteína aparelho mitótico nuclear 1), CYP27B1 (citocromo P450, família 27, subfamília B, polipeptídeo 1), CYSLTR2 (receptor de cisteinil leucotrieno 2), SOD3 (superóxido dismutase 3, extracelular), LTC4S (leucotrieno C4 sintase), UCN (urocortina), GHRL (prepropeptídeo grelina/obestatina), APOC2 (apolipoproteína C-II), CLEC4A (família domínio tipo C de lectina 4, membro A), KBTBD10 (repetição dde kelch e domínio BTB (POZ) contendo 10), TNC (tenascina C), TYMS (timidilato sintetase), SHCl (SHC (Src homologia 2 domain contendo) proteína transformante 1), LRP1 (receptor de lipoproteína de baixa densidade-relacionada com proteína 1), SOCS3 (supressor de sinal de citocina 3), ADH1B (álcool desidrogenase 1B (classe I), polipeptídeo beta), KLK3 (peptidase relacionada com calicreina 3), HSD11B1 (desidrogenase (11-beta) hidroxisteroide 1), VKORC1 (complexo vitamina K epóxido redutase, subunidade 1), SERPINB2 (inibidor da serpina peptidase, clado B (ovalbumina), membro 2), TNS1 (tensina 1), RNF19A (proteína dedo anelar 19A), EPOR (receptor de eritropoietina), ITGAM (integrina, alfa M (3 subunidade de receptor do componente de complemento 3)), PITX2 (homeodomínio tipo emparelhado 2), MAPK7 (proteína quinase ativada por mitógeno 7), FCGR3A (Fc fragmento de IgG, baixa afinidade 111a, receptor (CD16a)), LEPR (receptor de leptina), ENG (endoglina), GPX1 (glutationa peroxidase 1), GOT2 (glutâmico- oxaloacético transaminase 2, mitocondrial (aspartato aminotransferase 2)), HRH1 (receptor de histamina H1), NR112 (subfamília de receptores nucleares 1, grupo I, membro 2), CRH (hormônio liberador de corticotropina), HTR1A (5- hidroxitriptamina (serotonina) receptor 1A), VDAC1 (canal de ânion dependente de voltagem 1), HPSE (heparanase), SFTPD (proteína D surfactante), TAP2 (transportador 2, Cassete de ligação de ATP, subfamília B (MDR/TAP)), RNF123 (proteína do dedo anelar 123), PTK2B (PTK2B proteína tirosina quinase 2 beta), NTRK2 (tirosina quinase neurotrófica, receptor, tipo 2), IL6R (receptor de interleucina 6), ACHE (acetilcolinasterase (grupo sanguínei Yt)), GLP1R (receptores de peptídeos tipo glucagona 1), GHR (hormônio de crescimento receptor), GSR (glutationa redutase), NQO1 (NAD(P)H desidrogenase, quinona 1), NR5A1 (subfamília de receptores nucleares 5, grupo A, membro 1), GJB2 (proteína de junção lacuna, beta 2, 26 kDa), SLC9A1 (família de soluto de veículo 9 (permutadoe sódio/hidrogênei), membro 1), MAOA (monoamina oxidase A), PCSK9 (pró-proteina convertase subtilisina/kexina tipo 9), FCGR2A (Fc fragmento de IgG, baixa afinidade IIa, receptor (CD32)), SERPINF1 (inibidor da serpina peptidase, clado F (alfa-2 antiplasmina, fator derivado de epitélio pigmentar), membro 1), EDN3 (endotelina 3), DHFR (dihidrofolato redutase), GAS6 (crescimento específicos de prisão 6), SMPD1 (esfingomielina fosfodiesterase 1, ácido lisossomal), UCP2 proteína de não acoplamento 2 (mitocondrial, veículo de próton)), TFAP2A (fator de transcrição AP-2 alfa (proteína de ligação a potenciador de ativação 2 alfa)), C4BPA (componente complemente 4 ligando proteína, alfa), SERPINF2 (inibidor da serpina peptidase, clado F (alfa-2 antiplasmin, Fator derivado do epitélio pigmentar), membro 2), TYMP (timidina fosforilase), ALPP (fosfatase alcalina, placentária (isozima de Regan)), CXCR2 (quemicina (motivo C-X-C) receptor 2), SLC39A3 (família de soluto dde veículo 39 (transportador de zinco), membro 3), ABCG2 (Cassete de ligação de ATP, subfamília G (WHITE), membro 2), ADA (adenosinea deaminase), JAK3 (quinase Janus 3), HSPA1A (proteína de choque térmico 70 kDa1A), FASN (ácido graxo sintase), FGF1 (fator de crescimento de fibroblastos 1 (acídico)), F11 (fator de coagulação XI), ATP7A (ATPase, transportando Cu++, polipeptídeo alfa), CR1 (componente complemento (3b/4b) receptor 1 (grupo sanguíneo de Knops)), GFAP (proteína ácida fibrilar glial), ROCK1 (Rho- associado, bobina enrolada contendo proteína quinase 1), MECP2 (metil CpG ligando proteína 2 (síndrome de Rett)), MYLK (myosin cadeia leve quinase), BCHE (butirilcolinasterase), LIPE (lipase, sensível a hormônio), PRDX5 (peroxiredoxina 5), ADORA1 (receptor de adenosina A1), WRN (síndrome de Werner, RecQ tipo helicase), CXCR3 (quemicina (motivo C-X-C) receptor 3), CD81 (molécula CD81), SMAD7 (família SMAD membro 7), LAMC2 (laminina, gama 2), MAP3K5 (proteína quinase ativada por mitógeno quinase quinase 5), CHGA (cromogranina A (proteína secretora da paratireoide 1)), IAPP (ilhéu amiloide polipeptídeo), RHO (rodopsina), ENPP1 (ectonucleotiídeo pirofosfatase/fosfodiesterase 1), PTHLH (hormônio tipo hormônio da paratireoide), NRG1 (neuregulina 1), VEGFC (fator de crescimento endotelial vascular C), ENPEP (glutamil aminopeptidase (aminopeptidase A)), CEBPB (proteína ligando CCAAT/potenciador (C/EBP), beta), NAGLU (N- acetilglucosaminidase, alfa-), F2RL3 (fator II de coagulação (trombina) tipo receptor 3), CX3CL1 (quemicina (motivo C-X3- C) ligando 1), BDKRB1 (receptor de bradicinina B1), ADAMTS13 (ADAM metalopeptidase com trombospondina tipo 1 motivo, 13), ELANE (elastase, neutrofilo expressado), ENPP2 (ectonucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase 2), CISH (citocina induzível SH2 contendo proteína), GAST (gastrina), MYOC (miocilina, malha trabecular de resposta glucocorticoide induzível), ATP1A2 (ATPase, transportando Na+/K+, alfa 2 polipeptídeo), NF1 (neurofibromina 1), GJB1 (proteína de junção lacuna, beta 1, 32 kDa), MEF2A (fator potenciador de miocito 2A), VCL (vinculina), BMPR2 (proteína receptora morfogenética óssea, tipo II (serina/treonina quinase)), TUBB (tubulina, beta), CDC42 (ciclo de divisão celular 42 (GTP proteína de ligação, 25 kDa)), KRT18 (queratina 18), HSF1 (fator de transcrição de choque térmico 1), MYB (v-myb oncogene homólogo a mieloblastose viral (aviária)), PRKAA2 (proteína quinase, AMP-ativada, alfa 2 subunidade catalítica), ROCK2 (associado a Rho, bobina enrolada contendo proteína quinase 2), TFPI (inibidor do passo do fator tecidular (inibidor da coagulação associado a lipoproteína)), PRKG1 (proteína quinase, dependente de cGMP, tipo I), BMP2 (proteína morfogenética óssea 2), CTNND1 (catenina (proteína associada a caderina), delta 1), CTH (cistationase (cistationina gama- liase)), CTSS (catepsina S), VAV2 (vav 2 fator de permuta de nucleotídeos guanina ), NPY2R (receptor Y2 de neuropeptídeo Y), IGFBP2 (proteína de ligação a fator de crescimento tipo insulina 2, 36 kDa), CD28 (CD28 molécula), GSTA1 (glutationa S-transferase alfa 1), PPIA (peptidilprolil isomerase A (cilcofilin A)), APOH (apolipoproteína H (beta-2-glicoproteína I)), S100A8 (S100 cálcio proteína de ligação A8), IL11 (interleucina 11), ALOX15 (araquidonato 15-lipoxigenase), FBLN1 (fibulina 1), NR1H3 (subfamília de receptores nucleares 1, grupo H, membro 3), SCD (estearoíl-CoA desaturase (delta- 9-desaturase)), GIP (polipeptídeo inibidor gástrico), CHGB (cromogranina B (secretogranina 1)), PRKCB (proteína quinase C, beta), SRD5A1 (esteroide-5-alfa-redutase, polipeptídeo alfa 1 (3-oxo-5 alfa- esteroide delta 4-desidrogenase alfa 1)), HSD11B2 (hidroxi esteroide (11-beta) desidrogenase 2), CALCRL (calcitonina receptor tipo), GALNT2 (UDP-N-acetil-alfa-D- galactosamina:polipeptídeo N-acetilgalactosaminiltransferase 2 (GalNAc-T2)), ANGPTL4 (angiopoietina tipo 4), KCNN4 (potássio intermediário/canal ativado por cálcio de pequena condutância, subfamília N, membro 4), PIK3C2A (fosfoinositido- 3-quinase, classe 2, polipeptídeo alfa), HBEGF (Fator de crescimento tipo EGF de ligação a heparina), CYP7A1 (citocromo P450, família 7, subfamília A, polipeptídeo 1), HLA-DRB5 (complexo principal de histocompatibilidade, classe II, DR beta 5), BNIP3 (proteína 3 19 kDa interagindo com BCL2/adenovírus E1B), GCKR (regulador de glucoquinase (hexoquinase 4)), S100A12 (proteína A12 de ligação a cálcio S100), PADI4 (peptidil arginina deiminase, tipo IV), HSPA14 (proteína de choque térmico 70 kDa14), CXCR1 (receptor de quemicina (motivo C-X-C) 1), H19 (H19, transcrição expresso maternalmente imprimida (não codificando proteína)), KRTAP19- 3 (proteína associada a queratina 19-3), IDDM2 (diabetes mellitus dependente de insulina 2), RAC2 (substrato de toxina C3 botulina 2 rfelacionada a ras (rho família, proteína de ligação a pequeno GTP Rac2)), RYR1 (receptor de rianodina 1 (esquelético)), CLOCK (homólogo a clock (camundongo)), NGFR (receptor de fator de crescimento nervoso (TNFR superfamília, membro 16)), DBH (dopamina beta-hidroxilase (dopamina beta- monooxigenase)), CHRNA4 (receptor colinérgico, nicotínico, alfa 4), CACNA1C (canal de cálcio, dependente de voltagem, L tipo, alfa 1C subunidade), PRKAG2 (proteína quinase, ativada por AMP, gama 2 não de subunidade catalítica), CHAT (colina acetiltransferase), PTGDS (prostaglandina D2 sintase 21 kDa (cérebro)), NR1H2 (subfamília de receptores nucleares 1, grupo H, membro 2), TEK (TEK tirosina quinase, endotelial), VEGFB (fator de crescimento endotelial vascularB), MEF2C (fator poyenciador de miócitos 2C), MAPKAPK2 (proteína quinase ativada por mitógeno ativdo por proteína quinase 2), TNFRSF11A (superfamília de receptor fator de necrose tumoral, membro 11a, ativator NFKB), HSPA9 (proteína de choque térmico 70 kDa9 (mortalina)), CYSLTR1 (receptor de cisteinil leucotrieno 1), MAT1A (metionina adenosiltransferase I, alfa), OPRL1 (receptor tipo opiato 1), IMPA1 (inositol(mio)-1(ou 4)-monofosfatase 1), CLCN2 (canal de cloreto 2), DLD (dihidrolipoamida desidrogenase), PSMA6 (proteasomo (prossomo, macropaína) subunidade, alfa tipo, 6), PSMB8 (proteassomo (prossome, macropaina) subunidade, beta tipo, 8 (peptidase multifuncional larga 7)), CHI3L1 (tipo quitinase 3 1 (glicoproteína- cartilagínea 39)), ALDH1B1 (família aldeído desidrogenase 1, membro B1), PARP2 (poli (ADP ribose) polimerase 2), STAR (proteína reguladora esteroidogénico aguda), LBP (proteína de ligação a lipopolisacarídeo), ABCC6 (Cassete de ligação de ATP, subfamília C(CFTR/MRP), membro 6), RGS2 (regulador de sinal de proteína G 2, 24 kDa), EFNB2 (efrina-B2), GJB6 (proteína de junção lacuna, beta 6, 30 kDa), APOA2 (apolipoproteína A-II), AMPD1 (adenosina monofosfato desaminase 1), DYSF (disferlina, distrofia muscular da cintura do membro 2B (recessiva autossômica)), FDFT1 (farnesil- difosfato farnesiltransferase 1), EDN2 (endotelina 2), CCR6 ((Motivo C-C) receptor de químicina 6), GJB3 (proteína de junção lacuna, beta 3, 31 kDa), IL1RL1 (interleucina 1 tipo receptor 1), ENTPD1 (ectonucleosídeo trifosfate difosfohidrolase 1), BBS4 (síndrome de Bardet-Biedl 4), CELSR2 (caderina, homólogo a receptor tipo G de passagem sete EGF LAG 2 (flamingo, Drosophila)), F11R (receptor F11), RAPGEF3 (fator Rap de permuta de nucleotídeos guanina (GEF) 3), HYAL1 (hialuronoglucosaminidase 1), ZNF259 (proteína de impressão digital de zinco 259), ATOX1 (ATX1 homólogo a proteína 1 antioxidante (levedura)), ATF6 (fator de ativação de transcrição 6), KHK (cetohexoquinase (fructoquinase)), SAT1 (espermidina/espermina N1-acetiltransferase 1), GGH (gama- glutamil hidrolase (conjugase, folilpoligammaglutamil hidrolase)), TIMP4 (Inibidor da metalopeptidase TIMP4), SLC4A4 (família de soluto de veículo 4, bicarbonato de sódio cotransportador, membro 4), PDE2A (fosfodiesterase 2A, estimulada por cGMP), PDE3B (fosfodiesterase 3B, inibida por cGMP), FADS1 (ácido graxo desaturase 1), FADS2 (ácido graxo desaturase 2), TMSB4X (timosins beta 4, ligada a X), TXNIP (proteína interagindo com tioredoxina), LIMS1 (LIM e domínios de células senescentes, como antigênio 1), RHOB (família de gene homólogo ras, membro B), LY96 (antigênio limfocito 96), FOXO1 (“forkhead box” O1), PNPLA2 (domínio fosfolipase patatina tipo contendo 2), TRH (hormônio liberador de tirotropina), GJC1 (proteína de junção lacuna, gama 1, 45 kDa), SLC17A5 (família de soluto de veículo 17 (transportador ânion/açúcar), membro 5), FTO (massa gorda e obesidade associada), GJD2 (proteína de junção lacuna, delta 2, 36 kDa), PSRC1 (prolina/serina- rica em bobina enrolada 1), CASP12 (caspase 12 (gene/pseudogene)), GPBAR1 (receptor do ácido biliar acoplado a proteína G 1), PXK (domínio PX contendo serina/treonina quinase), IL33 (interleucina 33), TRIB1 (homólogo a pingos 1 (Drosophila)), PBX4 (homeobox de B- leucemia pré-celular 4), NUPR1 (proteína nuclear, regulador de transcripção, 1), 15-Set(selenoproteina), CILP2 (proteína da camada intermédia de cartilagem 2), TERC (componente RNA telomerase), GGT2 (gama-glutamiltransferase 2), MT-CO1 (oxidase citocromo de codificação mitocondrial I), e UOX (urato oxidase, pseudogene).

[0644] Em uma forma de realização adicional, a sequência cromossômica pode adicionalmente ser selecionada de Pon1 (paraoxonase 1), LDLR (receptor LDL), ApoE (Apolipoproteína E), Apo B-100 (Apolipoproteína B-100), ApoA (Apolipoproteína(a)), ApoA1 (Apolipoproteína A1), CBS (Cistationa B-sintase), Glicoproteína IIb/IIb, MTHRF (5,10- metilenetetrahidrofolato redutase (NADPH), e combinações desses. Em uma iteração, as sequências cromossômicas e as proteínas codificadas por sequências cromossômicas podem ser escolhidas de Cacna1C, Sod1, Pten, Ppar(alfa), Apo E, Leptin, e combinações dessas.

[0645] Rins

[0646] A presente invenção também contempla aplicação do sistema CRISPR-Cas ao rim. Estratégias para aplicação para se induzir a entrada do ácido nucleico terapêutico incluem força física force ou sistemas vetor tais, aplicação baseada em lípidos ou complexos virais, ou nanoveículos. A partir dos pedidos iniciais com menos relevância clínica possível, quando os ácidos nucleicos foram direcionados às células renais com injeção sistêmica com alta pressão hidrodinâmica, uma ampla variedade de transportadores de genes terapêuticos virais e não-virais tinha já sido aplicada aos eventos pós-transcrição alvo em diferentes modelos de doenças nos rins animais (Csaba Révész e Péter Hamar (2011). Delivery Methods to Target RNAs in the Kidney, Gene Therapy Applications, Prof. Chunsheng Kang (Ed.), ISBN: 978-953-307-541-9, InTech, Disponível de: http://www.intechopen.com/books/gene-therapy- applications/delivery-methods-to-target-rnas-in-the-kidney). Métodos de aplicação ao rim são sumariados como se segue:

[0647] Yuan et al. (Am J Physiol Renal Physiol 295: F605-F617, 2008) investigaram se in vivo a aplicação de RNAs de pequena interferência (siRNAs) visando o passo de 12/15- lipoxigenase (12/15-LO) do metabolismo do araquidonato ácido pode melhorar a afecção renal e a nefropatia diabética (DN) em um modelo de camundongo injetado com estreptozotocina de diabetes tipo 1. Para se alcançar maior acesso vivo e expressão de siRNA no rim, Yuan et al. usaram 12/15- oligonucleotídeos LO siRNA de cadeia dupla conjugados ah colesterol. Cerca de 400 μg de siRNA foram injetados subcutaneamente nos camundongos. O método de Yuang et al. pode ser aplicado ao sistema CRISPR-Cas da presente invenção contemplando 1-2 g em uma injeção subcutânea de CRISPR Cas conjugada com colesterol a um humano para aplicação aos rins.

[0648] Molitoris et al. (J Am Soc Nephrol 20: 1754-1764, 2009) exploraram Células dos túbulos proximais (PTCs), como o sítio de reabsorção de oligonucleotídeos dentro do rim para testar a eficiência de siRNA dirigido a p53, uma proteína crucial no passo da apoptótico, para prevenir a afecção do rim. siRNA sintético nu para p53 injetado intravenosamente 4 h após afecção isquêmica derem a proteção máxima tanto para PTCs como para a função renal. Os dados de Molitoris et al. indicam que a aplicação rápida de siRNA células de túbulos proximais a seguir à administração intravenosa. Para a análise de resposta a dose, as ratos foram injetadas com doses de siP53, 0,33; 1, 3, ou 5mg/kg, dados aos mesmos quatro pontos de tempo, resultando em doses cumulativas de 1,32; 4, 12, e 20 mg/kg, respectivamente. Todas as doses de siRNA testadas produzidas um efeito de redução de SCr rao dia um com as doses mais altas sendo eficientes ao longo de aproximadamente cinco dias em comparação com tratados ratos de controlo isquémicas tratados com PBS. As doses cumulativas de 12 e 20 mg/kg proporcionaram o melhor efeito de proteção. O método de Molitoris et al. pode ser aplicado ao sistema CRISPR-Cas da presente invenção contemplando doses cumulativas de 12 e 20 mg/kg a um humano para aplicação aos rins.

[0649] Thompson et al. (Nucleic Acid Therapeutics, Volume 22, Número 4, 2012) referem as propriedades toxicológicas e farmacocinéticas do RNA I5NP sintético de pequena interferência na sequência da administração intravenosa em roedores e primatas não humanos. O I5NP é concebido para atuar pela via de Interferência de RNA (RNAi para inibir temporariamente a expressão da proteína pro apoptótica p53 e foi desenvolvido para proteger as células das afecções de isquemia/reperfusão aguda tais como afecção aguda do rim que pode ocorrer durante cirurgia cardíaca grave e função retardada do enxerto que pode ocorrer após o transplante renal. Doses de 800mg/kg I5NP em roedores, e 1.000 mg/kg de I5NP em primatas não humanos, foram necessários para elicitar efeitos adversos, os quais nos macacos foram isolados para efeitos diretos no sangue incluindo uma ativação subclínica do complemente e um ligeiro aumento do tempo de coagulação. Na rato, não foram observados quaisquer efeitos adversos adicionais com uma rato análoga a I5NP, indicando que os efeitos representam provavelmente os efeitos classe dos RNA sintéticos duplex em vez de toxicidade relacionada com a pretendida atividade farmacológica de I5NP. Tomados em conjunto, estes dados suportam testes clínicos de administração intravenosa de I5NP para a preservação da função renal na sequência de afecção isquêmica aguda/reperfusão. O nível ao qual se não observaram efeitos adversos (NOAEL) em macacos foi 500 mg/kg. Nenhum efeito sobre os parâmetros, respiratórios, cardiovasculares e neurológicos foram observados em macacos na sequência de administração i.v. a níveis de dosagem até 25 mg/kg. Portanto, uma dosagem similar pode ser contemplada para administração intravenosa de CRISPR Cas aos rins de um humano.

[0650] Shimizu et al. (J Am Soc Nephrol 21: 622-633, 2010) desenvolveram um sistema de aplicação de siRNAs aos glomérulos via veículos à base de poli(etileno glicol)-poli(L- lisina). O complexo siRNA/nanotransportador foi aproximadamente 10 a 20 nm em diâmetro, um tamanho que deveria permitir que esse se movesse ao longo do endotélio fenestrado para acesso ao mesângio. Após injeção intraperitoneal de complexos siRNA/nanotransportador marcado com fluorescência, Shimizu et al. detectaram siRNAs na circulação sanguínea por um tempo prolongado. A administração intraperitoneal repetida da proteína quinase ativada por complexo mitógeno 1 (MAPK1) siRNA/nanotransportador suprimiu o MAPK1 mRNA glomerular e a expressão de proteína em um camundongo modelo de glomerulonefrite. Para investigação da acumulação de siRNA, siRNAs marcado com Cy5 complexado com nanotransportadores PIC (0,5 mL, 5 nmol de contente siRNA), siRNAs marcada com Cy5 nu (0,5 mL, 5 nmol), ou siRNAs marcado com Cy5 encapsulado em HVJ-E (0,5 mL, 5 nmol de siRNA conteúdo) foram administrados aos camundongos BALB-c. O método de Shimizu et al. pode ser aplicado ao sistema CRISPR-Cas da presente invenção contemplando uma dose de cerca de 10-20 μmol CRISPR Cas complexada com nanotransportadores em cerca de 1-2 litros a um humano para administração intraperitoneal e aplicação aos rins.

[0651] Pulmões

[0652] A presente invenção também contempla a aplicação do sistema CRISPR-Cas para um ou ambos os pulmões.

[0653] Embora os vetores baseados em AAV-2 tenham sido originalmente propostos para a aplicação de CFTR às vias aéreas CF, outros serotipos tais como AAV-1, AAV-5, AAV-6 e AAV-9 exibem eficiência melhorada de transferência de genes em uma variedade de modelos do epitélio do pulmão (ver, por exemplo, Li et al., Molecular Therapy, vol. 17, no.12, 2067-2077, Dez. 2009). Foi demonstrado que AAV-1 é ~100 vezes mais eficiente do que o AAV-2 e AAV-5 na transdução in vitro de células epiteliais humanas das vias aéreas, 5 embora o AAV-1 na transdução in vivo de epitélios das vias aéreas traqueais de murino com uma eficiência igual à do AAV -5. Outros estudos têm mostrado que o AAV-5 é 50 vezes mais eficiente do que o AAV-2 na aplicação in vitro do gene para o epitélio das vias respiratórias humanas (HAE) e significativamente mais eficiente no epitélio das vias respiratórias do pulmão do rato in vivo. Também tem sido demonstrado que AAV-6 é mais eficaz do que AAV-2 em células epiteliais das vias aéreas humanas in vitro e em vias de murino vivo.8 Foi mostrado que o isolado mais recente, o AAV-9, exibe uma maior eficácia de transferência de genes do que AAV-5 em epitélios alveolar e nasal de murino in vivo com a expressão do gene detectado por mais de 9 meses, sugerindo que AAV pode permitir a expressão de genes a longo prazo in vivo, uma propriedade desejável para um vetor de aplicação do gene de CFTR. Além disso, demonstrouse que o AAV-9 poderia ser re-administrado ao pulmão de murino sem perda da expressão de CFTR e consequências imunológicas mínimas. Culturas de CF e não-CF HAE podem ser inoculadas na superfície apical com 100 μL de vetores de AAV durante horas (ver, por exemplo, Li et al., Molecular Therapy, vol. 17 no. 12, 2067-2077 Dez 2009). MOI pode variar de 1 x 103 4 x 105 vetor genomas/célula, dependendo da concentração de vírus e objetivo das experiências. Os vetores acima mencionados são contemplados para a aplicação e/ou administração da invenção.

[0654] Zamora et al. (Am J Respir Crit Care Med vol 183 pp 531-538, 2011) relataram um exemplo da aplicação de um RNA de interferência terapêutico para o tratamento de doenças infecciosas no homem e também um estudo randomizado de um fármaco antiviral em receptores de transplante de pulmão infetados com vírus sincicial respiratório (RSV). Zamora et al. realizou um estudo duplo-cego, randomizado,controlado por placebo em receptores LTX com infecção do trato respiratório RSV. Os pacientes foram autorizados a receber tratamento padrão para RSV. ALN-RSV01 aerossolizado (0,6 mg/kg) ou placebo foi administrado diariamente durante 3 dias. Este estudo demonstra que um RNAi terapêutico direcionado para RSV pode ser administrado com segurança aos receptores LTX com infecção RSV. Três doses diárias de ALN-RSV01 não resultaram em qualquer exacerbação dos sintomas do trato respiratório ou comprometimento da função pulmonar e não apresentaram quaisquer efeitos pró-inflamatórios sistêmicos, tais como a indução de citocinas ou CRP. A farmacocinética mostrou apenas uma baixa exposição sistêmica transitória após a inalação, de acordo com dados pré-clínicos em animais que mostram que ALN- RSV01, administrado por via intravenosa ou por inalação, é rapidamente eliminado da circulação através da digestão mediada por exonucleases e excreção renal. O método de Zamora et al. pode ser aplicado ao sistema CRISPR Cas da presente invenção e a CRISPR Cas aerossolizada, por exemplo, com uma dose de 0,6 mg/kg, pode ser contemplada para a presente invenção.

[0655] Para um exemplo de RNA guia quimérico CFTRdelta508, ver Exemplo 22 que demonstra que a transferência de genes ou a aplicação de genes de um sistema CRISPR-Cas nas vias aéreas de um indivíduo ou paciente com essa necessidade, que sofrem de fibrose cística ou de sintomas relacionados com fibrose cística (CF), usando partículas de vírus adenoassociados (AAV). Em particular, eles exemplificam a estratégia de reparação para a mutação delta F508 de Fibrose Cística. Este tipo de estratégia deve ser aplicável em todos os organismos. Com particular referência a CF, pacientes adequados podem incluir: Humano, humano não primata, caninos, felinos, bovinos, equinos e outros animais domésticos. Neste exemplo, os Requerentes utilizaram um sistema CRISPR-Cas compreendendo uma enzima Cas9 delta para direccionar F508 ou outras mutações de indução de CFTR.

[0656] Os sujeitos tratados nesta instância recebem uma quantidade farmaceuticamente eficaz do sistema de vetor AAV aerossolizado por pulmão, endobronquialmente entregue ao respirar espontaneamente. Como tal, a aplicação aerossolizada é de preferência para aplicação de AAV em geral. Um adenovírus ou uma partícula de AAV podem ser utilizados para a aplicação. Um adenovírus ou uma partícula AAV podem ser utilizados para a aplicação. Construções de genes adequadas, cada uma ligada operativamente a uma ou mais sequências reguladoras, podem ser clonadas no vetor de aplicação. Neste exemplo, as seguintes construções são proporcionadas como exemplos: CBH ou o promotor EF1a para os promotores Cas9, U6 ou H1 RNA guia quimérico),: Um arranjo preferencial é a utilização de um guia quimérico alvo CFTRdelta508, um modelo de reparação para a mutação deltaF508 e um códon otimizado da enzima Cas9 (Cas9s preferenciais são aqueles com atividade nuclease ou nickase) com, opcionalmente, um ou mais sinais ou sequências de localização nuclear (NLS(s)), por exemplo, dois (2) NLSs. Estão também previstas construções sem NLS.

[0657] A fim de identificar o local alvo de Cas9, os Requerentes analisaram o local genômico de CFTR humano e identificaram o local alvo de Cas9. De um modo preferencial, em geral, e, neste caso de CF, uma PAM pode conter um motivo NGG ou NNAGAAW.

[0658] Por conseguinte, no caso de CF, o presente método compreende a manipulação de uma sequência alvo em um local genômico de interesse compreendendo

[0659] aplicar uma composição de ocorrência não natural ou manipulada compreendendo um sistema de vetor viral compreendendo um ou mais vetores virais codificando operacionalmente uma composição para a sua expressão, caracterizado pelo fato de a composição compreender:

[0660] uma composição de ocorrência não natural ou modificada compreendendo um sistema vetor que compreende um ou mais vetores compreendendo

[0661] I. um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de polinucleotídeos de RNA quimérico (chiRNA) do sistema CRISPR-Cas, em que a sequência de polinucleotídeos compreende

[0662] (a) uma sequência guia capaz de hibridar com a sequência alvo CF em uma célula adequada de mamífero,

[0663] (b) uma sequência tracr mate, e

[0664] (c) uma sequência tracr, e

[0665] II. um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação da enzima codificando uma enzima CRISPR compreendendo pelo menos uma ou mais sequências de localização nuclear,

[0666] em que (a), (b) e (c) são arranjados em uma orientação 5’ a 3’,

[0667] em que os componentes I e II estão localizados no mesmo ou em diferentes vetores do sistema,

[0668] em que quando transcrita, a sequência tracr mate hibridada com a sequência tracr e a sequência guia dirige a ligação específica à sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo, e

[0669] em que o complexo CRISPR compreende a enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que é hibridada com a sequência alvo, e (2) a sequência tracr mate que é hibridada com a sequência tracr. No que respeita à CF, sequências de DNA alvo preferenciais compreendem a mutação CFTRdelta508. Uma PAM preferencial é descrita acima. Uma enzima preferencial CRISPR é qualquer Cas (aqui descrita, mas particularmente descrita no Exemplo 22).

[0670] Alternativas a CF incluem qualquer doença genética e exemplos destas são bem conhecidas. Outro método preferencial ou o uso da invenção é para corrigir defeitos nos genes EMP2A e EMP2B que foram identificados como estando associados com a doença de Lafora.

[0671] Em algumas formas de realização, uma "sequência guia" pode ser distinta de "RNA guia". Uma sequência guia pode se referir a uma sequência de aprox. 20 pb, dentro de RNA guia, que especifica o local alvo.

[0672] Em algumas formas de realização, o Cas9 é (ou é derivado de) SpCas9. Em tais formas de realização, as mutações preferenciais são a qualquer ou na totalidade ou nas posições 10, 762, 840, 854, 863 e/ou 986 de SpCas9 ou posições correspondentes de outros Cas9s (que pode ser determinado por exemplo por ferramentas de comparação de sequências convencionais. Particularmente, qualquer ou todas das seguintes mutações são preferenciais em SpCas9: D10A, E762A, H840A, N854A, N863A e/ou D986A; assim como a substituição conservativa de qualquer um dos aminoácidos de substituição também é prevista. A mesma (ou substituições conservativas destas mutações) nas posições correspondentes em outra Cas9s são também preferenciais. Particularmente preferenciais são D10 e H840 em SpCas9. Porém, em outras Cas9s, os resíduos correspondentes a SpCas9 D10 e H840 são também preferenciais. Estes são vantajosos uma vez que proporcionam atividade nickase. Tais mutações podem ser aplicadas a todos os aspectos da presente invenção, não só no tratamento de CF.

[0673] Schwank et al. (Cell Stem Cell, 13:653-58, 2013) usou CRISPR/Cas9 para corrigir um defeito relacionado com fibrose cística em células estaminais humanas. A meta da equipe era o gene para um canal iônico, o receptor condutor da transmembrana da fibrose cística (CFTR). Uma deleção no gene CFTR faz com que a proteína não enrole em pacientes com fibrose cística. Usando células estaminais intestinais cultivadas desenvolvidas a partir de amostras de células de duas crianças com fibrose cística, Schwank et al. foram capazes de corrigir o defeito utilizando CRISPR juntamente com um plasmídeo dador contendo a sequência reparativa para ser inserido. Assim, os investigadores cresceram as células em "organoides", intestinais ou vísceras em miniatura, e mostraram que funcionaram normalmente. Neste caso, cerca de metade dos organoides clonais foram submetidos a correção genética adequada.

[0674] Músculos

[0675] A presente invenção também contempla a aplicação do sistema CRISPR-Cas para o(s) músculo(s).

[0676] Bortolanza et al. (Molecular Therapy vol. 19, n. 11, 2055-2064 nov 2011) mostra que a aplicação sistêmica de cassetes de expressão de RNA de interferência no rato FRG1, após o início da distrofia muscular facioescapuloumeral (FSH), conduziu a uma inativação de FRG1 dependente de dose a longo prazo, sem sinais de toxicidade. Bortolanza et al. descobriu que uma única injeção intravenosa de 5 x 1012 vg de rAAV6- sh1FRG1 resgata a histopatologia e função muscular de camundongos FRG1. Em detalhe, a 200 μL contendo 2 x 1012 ou 5 x 1012vg de vetor em solução fisiológica foram injetados na veia da cauda utilizando uma seringa Terumo de calibre 25. O método de Bortolanza et al. pode ser aplicado a um AAV expressando CRISPR Cas e injetados em seres humanos em uma dosagem de cerca de 2 x 1015 ou 2 x 1016 vg de vetor.

[0677] Dumonceaux et al. (Molecular Therapy vol. 18, no. 5, 881-887 Maio 2010) inibem a via da miostatina, utilizando a técnica de RNA de interferência dirigida contra o receptor de miostatina AcvRIIb ARNm (sh-AcvRIIb). A restauração de uma quase-distrofina foi mediada pela técnica de salto de éxon U7 vetorizada (U7-DYS). Vetores adenoassociados que transportam tanto a construção sh-AcvrIIb sozinha, a construção U7-DYS sozinha, ou uma combinação de ambas as construções, foram injetadas no músculo tibial anterior (TA) de camundongos mdx distróficos. As injeções foram realizadas com 1011 genomas virais de AAV. O método de Dumonceaux et al. pode ser aplicado a um AAV expressando CRISPR Cas e injetado em seres humanos em, por exemplo, uma dosagem de cerca de 014 ou 1015 vg de vetor.

[0678] Kinouchi et al. (Gene Therapy (2008) 15, 1126 1130) relatam a eficácia in vivo da aplicação siRNA em músculos esqueléticos de ratos normais ou doentes através da formação de nanopartículas de siRNAs quimicamente inalterado com atelocolagénio (ATCOL). A aplicação local mediada por ATCOL de siRNA direcionado para miostatina, um regulador negativo do crescimento do músculo esquelético, no músculo esquelético de camundongo ou por via intravenosa, causou um aumento acentuado na massa muscular em poucas semanas após a aplicação. Estes resultados implicam que a aplicação mediada por ATCOL de siRNAs é uma ferramenta poderosa para a futura utilização terapêutica para doenças, incluindo a atrofia muscular. Mst- siRNAs (concentração final, 10 mM) foram misturados com ATCOL (concentração final para administração local, 0,5%) (AteloGene, Kohken, Tóquio, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Após anestesia dos camundongos (20 semanas de idade C57BL/6) por Nembutal (25 mg/kg, i.p.), o complexo Mst- siRNA/ATCOL foi injetado nos músculos masséter e bíceps femorais. O método de Kinouchi et al. pode ser aplicado a CRISPR Cas e injetado em seres humanos em, por exemplo, uma dosagem de cerca de 500 a 1000 mL de uma solução de 40 μM no músculo

[0679] Hagstrom et al. (Molecular Therapy Vol. 10, No. 2, Agosto de 2004) descrevem uma metodologia intravascular não viral que permite a aplicação eficiente e reproduzível de ácidos nucleicos para as células musculares (miofibras) ao longo dos músculos dos membros de mamíferos. O procedimento envolve a injeção de DNA de plasmídeo nu ou siRNA em uma veia distal de um membro que é transitoriamente isolado por um torniquete ou manguito de pressão arterial. A aplicação de ácido nucleico para miofibras é facilitada pela sua rápida injeção em volume suficiente para permitir o extravasamento da solução de ácido nucleico no tecido muscular. Níveis elevados da expressão de transgene em músculo esquelético foram obtidos tanto em animais pequenos e grandes, com uma toxicidade mínima. Evidências da aplicação de siRNA ao músculo de membros também foram obtidas. Para injeção intravenosa de DNA de plasmídeo em um macaco rhesus, uma torneira de tripla passagem foi ligada a duas bombas de seringa (modelo PHD 2000; Harvard Instruments), cada uma carregada com uma única seringa. Cinco minutos depois de uma injeção de papaverina, pDNA (15,5-25,7 mg em 40-100 mL de solução salina) foi injetado a uma taxa de 1,7 ou 2,0 mL/s. Poderia a escala ser aumentada para o plasmídeo de DNA que expressa CRISPR Cas da presente invenção com uma injeção de cerca de 300 a 500 mg em 800-2000 mL de salino para um ser humano. Para injeções de vetores adenovirais em um rato, 2 x 109 partículas infeciosas foram injetados em 3 mL de solução salina normal (NSS). Poderia a escala ser aumentada para o vetor adenoviral expressando CRISPR Cas da presente invenção com uma injeção de cerca de 1 x 1013 partículas infeciosas foram injetadas em 10 litros de NSS para um ser humano. Para siRNA, um rato foi injetado na veia safena magna com 12,5 μg de um siRNA e um primata foi injetado na veia safena magna com 750 μg de um siRNA. Poderia a escala ser aumentada para um CRISPR Cas da presente invenção, por exemplo, com uma injeção de cerca de 15 a cerca de 50 mg para a veia safena magna de um ser humano.

[0680] Pele

[0681] A presente invenção também contempla a aplicação do sistema CRISPR-Cas para a pele.

[0682] Hickerson et al. (Molecular Therapy-Nucleic Acids (2013) 2, e129) refere-se a um dispositivo de aplicação de um arranjo de microagulhas para a aplicação de (sd)-siRNA de autoaplicação para a pele humana e de murino. O principal desafio para transpor a terapêutica de pele baseada em siRNA para a clínica é o desenvolvimento de sistemas de aplicação eficazes. Esforço substancial tem sido investido em uma variedade de tecnologias de aplicação para a pele com sucesso limitado. Em um estudo clínico em que a pele foi tratada com siRNA, a dor intensa associada com a injeção com agulha hipodérmica tem impedido a inscrição de pacientes adicionais no ensaio, destacando a necessidade de melhorar, uma abordagem de aplicação mais "amigável no paciente" (ou seja, pouca ou nenhuma dor). Microagulhas representam uma maneira eficiente para aplicar grandes cargas, incluindo siRNAs através da barreira primária, o estrato córneo, e são geralmente consideradas como menos dolorosas do que as agulhas hipodérmicas convencionais. Dispositivos de microagulhas "tipo de selo" monitorizadas, incluindo o dispositivo de arranjo de microagulhas motorizado (MMNA) usado pelo Hickerson et al., foram mostrados como sendo seguros em estudos de camundongos sem pelos e causam pouca ou nenhuma dor como evidenciado pela (i) utilização generalizada na indústria de cosméticos e (ii) testes limitados em que quase todos os voluntários consideraram o uso do dispositivo muito menos doloroso do que um flushot, sugerindo que a aplicação de siRNA através do uso deste dispositivo irá resultar em muito menos dor do que a que foi experienciada no ensaio clínico anterior, utilizando injeções com agulha hipodérmica. O dispositivo MMNA (comercializado como Triple-M ou Tri-M por Bomtech Eletronic Co, Seoul, Coreia do Sul) foi adaptado para a aplicação de siRNA para pele de rato e humana. Solução de sd-siRNA (até 300 μL de 0,1 mg/mL de RNA) foi introduzida para dentro da câmara do cartucho descartável da agulha Tri-H (Bomtech), a qual foi ajustada a uma profundidade de 0,1 mm. Para o tratamento da pele humana, pele de-identificada (obtido imediatamente após procedimentos cirúrgicos) foi esticada manualmente e presa a uma plataforma de cortiça antes do tratamento. Todas as injeções intradérmicas foram realizadas utilizando uma seringa de insulina com um calibre 28 de 0,5 polegadas da agulha. O dispositivo MMNA e método de Hickerson et al. podem ser utilizados e/ou adaptados para administrar o CRISPR Cas da presente invenção, por exemplo, a uma dosagem de até 300 μL de 0,1 mg/mL CRISPR CAS para a pele.

[0683] Leachman et al. (Molecular Therapy, vol. 18, n. 2, 442-446 fevereiro 2010) refere-se a um ensaio clínico de fase Ib para o tratamento de uma afecção paquioníquia congênita (PC) rara na pele, um síndrome autossômico dominante que inclui um queratoderma plantar incapacitante, utilizando uma terapêutica baseada em pequeno RNA de interferência (siRNA) para a pele. Este siRNA, chamado TD101, marca especificamente e de forma potente o mRNA mutante N171K da queratina 6a (K6A) sem afetar o mRNA K6a de tipo selvagem. O cronograma de escalar a dose é apresentado a seguir:

[0684] Inicialmente, 0,1 mL de uma solução de TD101 1,0 mg/mL ou apenas veículo (salino tamponado com fosfato de Dulbecco sem cálcio ou magnésio) foi administrada a calos simétricos. Seis aumentos de volume de doses foram concluídos sem uma reação adversa aos aumentos: 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 1,5, e 2,0 mL de uma solução 1,0 mg/mL de uma solução de TD101 por injeção. À medida que o maior volume planeado (2,0 mL) foi bem tolerado, a concentração de TD101 foi então aumentada semanalmente de 1 mg/mL até uma concentração final de 8,5 mg/mL. Dosagens semelhantes são contempladas para a administração de um CRISPR Cas que marca especificamente e de forma potente o mRNA mutante N171K da queratina 6a (K6A).

[0685] Zheng et al. (PNAS, 24 de julho de 2012, vol. 109, no.30, 11975-11980) mostram que conjugados de nanopartículas esféricas de ácidos nucleicos (SNA-NCS), núcleos de ouro cercados por um escudo denso altamente orientado de siRNA covalentemente imobilizado, penetram livremente quase 100% dos queratinócitos in vitro, a pele do camundongo e epiderme humana dentro de horas após a aplicação. Zheng et al. demonstraram que uma única aplicação de 25 nM de receptor do fator de crescimento epidérmico SNA-NCS (EGFR) durante 60 h demonstrou uma inativação do gene eficaz na pele humana. Uma dose similar pode ser contemplada para CRISPR Cas imobilizadas em SNA-NCS para administração na pele.

[0686] Vírus da hepatite

[0687] A presente invenção também pode ser aplicada para o tratamento de vírus da hepatite B (HBV). No entanto, o sistema CRISPR Cas deve ser adaptado a fim de evitar as deficiências do RNAi, tal como o risco de saturação excessiva das pequenas vias endógenas de RNA por, por exemplo, otimizar a dose e a sequência (ver, por exemplo, Grimm et al., Nature Vol. 441., 26 de maio de 2006). Por exemplo, doses baixas, tais como, cerca de 1-10 x 1014 partículas por humano são contempladas.

[0688] Em outra forma de realização, o sistema CRISPR Cas dirigido contra HBV pode ser administrado em lipossomos, tal como uma partícula lipídica estável de ácido nucleico (SNALP) (ver, por exemplo, Morrissey et al., Nature Biotecnologia, Vol. 23, No. 8, agosto 2005). São contempladas injeções intravenosas diárias de cerca de 1, 3 ou 5 mg/kg/dia da CRISPR de alvo específico para HBV RNA em uma SNALP. O tratamento diário pode ser até cerca de três dias e depois semanalmente durante cerca de cinco semanas.

[0689] Em outra forma de realização, o sistema de Chen et al. (Gene Therapy (2007) 14, 11-19) pode ser usado e/ou adaptado para o sistema CRISPR Cas da presente invenção. Chen et al. usam um vetor 8-pseudotipado com vírus adenoassociado de cadeia dupla (dsAAV2 / 8) para aplicar shRNA. Uma única administração do vetor dsAAV2/8 (1 x 1012 genomas de vetor por camundongo, transportando shRNA específico de HBV, eficazmente suprimiu o nível estável de proteína do HBV, mRNA e DNA replicativo em fígado de camundongos transgênicos HBV, levando a um decréscimo de até 2- 3 log10 na carga de HBV na circulação. Supressão significativa de HBV sustentada por pelo menos 120 dias após a administração do vetor. O efeito terapêutico de shRNA era dependente da sequência alvo e não envolve a ativação de interferão. Para a presente invenção, um sistema CRISPR Cas dirigido ao HBV pode ser clonado em um vetor de AAV, tal como um vetor dsAAV2/8 e administrado a um ser humano, por exemplo, a uma dosagem de cerca de 1 x 1015 genomas de vetor a cerca de 1 x 1016 genomas de vetor por humano.

[0690] Em outra forma de realização, o método de Wooddell et al. . (Molecular Therapy vol. 21 no. 5, 973-985 Maio 2013) pode ser usado e/ou adaptado ao sistema CRISPR Cas da presente invenção. Woodell et al. mostram que a simples coinjeção de um hepatócito alvo, péptido semelhante a melitina conjugado com N-acetilgalactosamina (NAG-MLP) com um siRNA conjugado com colesterol trópico para o fígado (chol-siRNA) alvo para o fator de coagulação VII (F7) resulta em eficiente inativação de F7 em camundongos e primatas não-humanos sem mudanças na química clínica ou indução de citocinas. Usando modelos de ratos transgênicos e transitórios de infecção pelo HBV, Wooddell et al. mostram que uma única coinjeção de NAG- MLP com potentes Chol-siRNAs dirigidos a sequências conservadas de HBV, resultou na repressão multilog de RNA viral, proteínas, e DNA viral com longa duração do efeito. Coinjeções intravenosas, por exemplo, de cerca de 6 mg/kg de NAG-MLP e 6 mg/kg de HBV específica de CRISPR Cas, podem ser previstas na presente invenção. Em alternativa, cerca de 3 mg/kg de NAG-MLP e 3 mg/kg de HBV especifico de CRISPR Cas podem ser aplicados no dia um, seguido por administração de cerca de 2-3 mg/kg de NAG-MLP e 2-3 mg/kg de HBV especifico de CRISPR Cas duas semanas depois.

[0691] A presente invenção também pode ser aplicada para o tratamento de vírus da hepatite C (HCV). Os métodos de Roelvinki et al. (Molecular Therapy vol. 20 no. 9, 1737-1749 Sep 2012) pode ser aplicado ao sistema CRISPR Cas. Por exemplo, um vetor AAV, tal como AAV8, pode ser um vetor contemplado e, por exemplo, uma dosagem de cerca de 1,25 x 1011-1,25 x 1013 genomas de vetor por quilograma de peso corporal (vg/kg) pode ser contemplada.

[0692] Ainda em outra forma de realização pode ser usada edição do genoma mediada por CRISPR-Cas9 para corrigir uma mutação e/ou fenótipo de doença. Essa edição do genoma mediada por CRISPR-Cas9 pode ser usada para corrigir uma mutação e/ou fenótipo de doença no fígado e ou hepatócitos é ilustrada no manuscrito intitulado “Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype” por Hao Yin et al. publicado em Nature Biotechnology publicado online 30 de março 2014; corrigido online 31 de março de 2014, disponível no website nature.com/doifinder/10.1038/nbt.2884, incorporado aqui por referência na sua totalidade. O artigo se relaciona com correção mediada por CRISPR-Cas9 de uma mutação de Fah em hepatócitos em um modelo de camundongo da doença humana tirosinemia hereditária. Foi mostrado que a aplicação de componentes do sistema CRISPR-Cas9 por injeção hidrodinâmica resultou em expressão inicial da proteína Fah de tipo selvagem em ~1/250 células do fígado. Foi adicionalmente mostrado que a expansão de hepatócitos positivos quanto a Fah resgataram o fenótipo de perda de peso corporal.

[0693] Será facilmente aparente que um hospedeiro de outras doenças pode ser tratado de forma semelhante. Alguns exemplos de doenças genéticas causadas por mutações são aqui proporcionados, mas muitos outros são conhecidos. A estratégia acima pode ser aplicada a essas doenças.

[0694] Doença de Huntington (HD)

[0695] RNA de interferência (RNAi) oferece um potencial terapêutico para esta afecção, reduzindo a expressão de HTT, o gene causador da doença de Huntington (ver, por exemplo, McBrideet al., Molecular Therapy vol. 19, no.12 de dezembro de 2011, pp. 2152-2162), portanto o Requerente postula que podem ser utilizados e/ou adaptados para o sistema CRISPR-Cas. O sistema CRISPR-Cas pode ser gerado utilizando um algoritmo para reduzir o potencial direcionamento para fora de sequências antissenso. As sequências CRISPR-Cas podem ter como alvo uma sequência no éxon 52 de rato, de rhesus ou huntingtina humana e expressos em um vetor viral, tais como AAV. Os animais, incluindo seres humanos, podem ser injetados com cerca de três microinjeções por hemisfério (total de seis injeções): a primeira 1 mm rostral à comissura anterior (12 μL) e as restantes duas injeções (12 μL e 10 μL, respectivamente), espaçados 3 e 6 mm de caudal da primeira injeção com 1 e 12 vg/mL de AAV, a uma taxa de cerca de 1 mL/minuto, e a agulha foi deixada no lugar durante mais 5 minutos para permitir que o produto de injeção se difunda a partir da ponta da agulha.

[0696] DiFiglia et al. (PNAS, 23 de outubro de 2007, vol. 104, no.43, 17204-17209) observaram que a administração única para o corpo estriado de um adulto de siRNA direcionado para Htt pode silenciar o mutante Htt, atenuar patologia neuronal, e atrasar o fenótipo comportamental anormal observado em um modelo de camundongo transgênico viral de HD de início rápido. DiFiglia injetou camundongos intrastriatal com 2 μl de Cy3 marcado com cc-siRNA-HTT ou siRNA-HTT não conjugado a 10 μM. Uma dose similar de CRISPR Cas alvo para Htt pode ser contemplado para os seres humanos, na presente invenção, por exemplo, cerca de 5-10 mL de 10 μM CRISPR Cas alvo para Htt pode ser injetado intrastriatal.

[0697] Em outro exemplo, Boudreau et al.. (Molecular Therapy vol. 17 no. 06 de junho de 2009) injeta 5 μl de sorotipo AAV recombinante 2/1 vetores que expressam vírus específico- htt RNAi (em 4 x 1012 genomas virais/mL) para a straiatum. Uma dose similar de CRISPR Cas alvo para Htt pode ser contemplado para os seres humanos, na presente invenção, por exemplo, cerca de 10-20 mL de 4 x 1012 genomas virais/mL CRISPR Cas alvo para Htt pode ser injetado intrastriatal.

[0698] Em outro exemplo, um CRISPR CAS alvo para HTT pode ser administrado continuamente (ver, por exemplo, Yu et al., Cell 150, 895-908, 31 de agosto de 2012). Yu et al. utiliza bombas de aplicação osmótica 0,25 mL/hr (Modelo 2004) para aplicar 300 mg/dia de ss-siRNA ou salino tamponado com fosfato (PBS) (Sigma Aldrich), durante 28 dias, e as bombas destinadas a aplicar 0,5 μl/hr (Modelo 2002) foram usadas para aplicar 75 mg/dia do controlo positivo MOE ASO durante 14 dias. Bombas (Durect Corporation) foram cheias com ss-siRNA ou MOE diluída em PBS estéril e depois incubadas a 37 °C durante 24 ou 48 (Modelo 2004) horas antes da implantação. Os camundongos foram anestesiados com isofluorano a 2,5%, e uma incisão na linha média foi feita na base do crânio. Usando guias estereotáxicas, uma cânula foi implantada no ventrículo lateral direito e fixado com cola Loctite. Um cateter ligado a uma minibomba osmótica de Alzet foi ligado à cânula, e a bomba foi colocada subcutaneamente na área escapular média. A incisão foi fechada com suturas de nylon 5,0. Uma dose similar de CRISPR Cas alvo para Htt pode ser contemplado para os seres humanos, na presente invenção, por exemplo, cerca de 500 a 1000 g/dia de CRISPR Cas alvo para Htt pode ser administrado.

[0699] Em outro exemplo de infusão continua, Stiles et al. (Experimental Neurology 233 (2012) 463-471) implantou um cateter intraparenquimatoso com uma ponta de agulha de titânio no putâmen direito. O cateter foi ligado a uma bomba de SynchroMed® II (Medtronic Neurological, Minneapolis, MN) implantada subcutaneamente no abdómen. Após uma infusão de 7 dias de salino tamponado com fosfato a 6 μL/dia, bombas foram re-enchidas com o artigo de teste e programadas para aplicação contínua durante 7 dias. Sobre 2,3-11,52 mg/d de siRNA foram infundidos a taxas variantes de infusão de cerca de 0,1 a 0,5 μL/min. Uma dose similar de CRISPR Cas alvo para Htt pode ser contemplado para os seres humanos, na presente invenção, por exemplo, cerca de 20 a 200 mg/dia CRISPR Cas alvo para Htt pode ser administrado.

[0700] Em outro exemplo, os métodos da Patente E.U.A. No. 20130253040 atribuída a Sangamo também podem ser adaptados de TALES para o sistema CRISPR Cas da presente invenção para o tratamento da doença de Huntington.

[0701] Ácidos nucleicos, aminoácidos e proteínas

[0702] A invenção utiliza ácidos nucleicos para ligar as sequências de ADN alvo. Isto é vantajoso pois os ácidos nucleicos são muito mais fáceis e mais baratos de produzir do que as proteínas, e a especificidade pode ser variada de acordo com o comprimento do troço em que a homologia é procurada. O complexo de posicionamento 3-D de vários dedos, por exemplo, não é necessário.

[0703] O termo "polinucleotídeo", " nucleotídeo", "sequência de nucleotídeo", "ácido nucleico" e "oligonucleotídeo" são utilizados alternadamente. Eles referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, quer ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou os seus análogos. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem desempenhar qualquer função conhecida ou desconhecida. Os seguintes são exemplos não limitativos de polinucleotídeos: regiões codificantes ou não- codificantes de um gene ou fragmento de gene, locais (local) definidas a partir de análise de ligação, éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossômico, RNA de interferência pequeno (siRNA), RNA grampo curto (shRNA), microRNA (miRNA), ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico, e iniciadores. O termo também abrange estruturas semelhantes a ácido nucleico, com as estruturas dorsais sintéticas, WO 97/03211; e WO 96/39154 Um polinucleotídeo pode compreender um ou mais nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo. Se presente, as modificações da estrutura de nucleotídeos podem ser transmitidas antes ou após montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser adicionalmente modificado após polimerização, tal como por conjugação, com um componente de marcação.

[0704] Conforme aqui utilizado, o termo "tipo selvagem" é um termo da arte compreendido pelos habilitados e significa a forma típica de um organismo, estirpe, gene ou característica tal como ocorre na natureza, distinta de formas mutantes ou variantes.

[0705] Conforme aqui utilizado, o termo "variante" deve ser utilizado para significar a exposição de qualidades que têm um padrão que se desvia do que ocorre na natureza.

[0706] Os termos "ocorrência não natural" ou "artificial" são utilizados indiferentemente e indicam o envolvimento da mão do homem. Os termos, quando se referem a moléculas de ácidos nucleicos ou polipeptídeos significam que a molécula de ácido nucleico ou do polipeptídeo é, pelo menos, substancialmente livre de, pelo menos, um outro componente com o qual eles são naturalmente associados na natureza e como encontrados na natureza.

[0707] "Complementaridade" refere-se à capacidade de um ácido nucleico para formar ligação(ções) de hidrogênio com outra sequência de ácido nucleico ou por emparelhamento de bases de Watson-Crick tradicional ou outros tipos não tradicionais. A percentagem de complementaridade indica a percentagem de resíduos de uma molécula de ácido nucleico que pode formar pontes de hidrogênio (por exemplo, emparelhamento de bases Watson-Crick) com uma segunda sequência de ácido nucleico (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dos 10 sendo de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, e 100% complementares). "Perfeitamente complementar" significa que todos os resíduos contíguos de uma sequência de ácido nucleico irá fazer ligação de hidrogênio com o mesmo número de resíduos contíguos de uma segunda sequência de ácido nucleico. "Substancialmente complementar", tal como aqui utilizado, refere-se a um grau de complementaridade, que é, pelo menos, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% em relação a uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, ou mais nucleotídeos, ou refere-se a dois ácidos nucleicos que hibridam sob condições rigorosas.

[0708] Tal como aqui utilizado, "condições rigorosas" para hibridação referem-se a condições sob as quais um ácido nucleico possuindo complementaridade com uma sequência alvo predominantemente hibrida com a sequência alvo, e substancialmente não hibridam com sequência não alvo. As condições rigorosas são geralmente dependentes da sequência, e variam dependendo de um número de fatores. Em geral, quanto mais longa a sequência, maior é a temperatura à qual a sequência hibrida especificamente com a sua sequência alvo. Exemplos não limitativos de condições rigorosas são descritos em detalhe em Tijssen (1993), Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Parte I, Capítulo II "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, NY. Sempre que se faça referência a uma sequência de polinucleotídeo, então, também estão previstas as sequências complementares ou parcialmente complementares. Estes são de preferência capazes de hibridar com a sequência de referência, em condições altamente rigorosas. Geralmente, a fim de maximizar a taxa de hibridação, condições de hibridação de baixa-restringência são selecionadas: cerca de 20 a 25 °C inferior ao ponto de fusão térmico (Tm). A Tm é a temperatura à qual 50% da sequência alvo específica hibrida com uma sonda perfeitamente complementar em solução, a uma força iônica e pH definidos. Geralmente, a fim de requerer pelo menos cerca de 85% de complementaridade de nucleotídeos de sequências hibridadas, condições de lavagem altamente rigorosas são selecionadas para ser cerca de 5 a 15 °C inferior a Tm. A fim de requerer pelo menos cerca de 70% de complementaridade de nucleotídeos de sequências, condições de lavagem moderadamente rigorosas são selecionadas para ser cerca de 15 a 30 °C inferior a Tm. Condições de lavagem altamente permissivas (rigor muito baixo) podem ser tão baixas como 50 °C abaixo da Tm, permitindo um elevado nível de erros de correspondência entre as sequências hibridadas. Os habilitados na arte reconhecerão que outros parâmetros físicos e químicos na fase de hibridação e lavagem, também podem ser alterados para afetar o resultado de um sinal de hibridação detectável a partir de um determinado nível de homologia entre as sequências alvo e sonda. Condições altamente rigorosas preferenciais compreendem a incubação em 50% de formamida, 5xSSC, e 1% de SDS a 42 °C, ou de incubação em 5xSSC e SDS a 1% a 65 °C, com lavagem em 0,2xSSC e SDS a 0,1% a 65 °C.

[0709] "Hibridação" refere-se a uma reação em que um ou mais polinucleotídeos reagem para formar um complexo que é estabilizado através de ligação de hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeos. A ligação de hidrogênio pode ocorrer por emparelhamento de bases de Watson Crick, ligação Hoogstein, ou de qualquer outra sequência específica. O complexo pode compreender duas cadeias que formam uma estrutura dupla, três ou mais cadeias que formam um complexo multi cadeia, uma cadeia única auto-hibridizante, ou qualquer combinação destes. A reação de hibridação pode constituir um passo de um processo mais vasto, tal como a iniciação da PCR, ou a clivagem de um polinucleotídeo por uma enzima. Uma sequência capaz de hibridar com uma determinada sequência é designada por "complementar" da sequência dada.

[0710] Conforme aqui utilizado, o termo "local genômico" ou "local" (plural locais) é a localização específica de uma sequência de gene ou DNA de um cromossomo. Um "gene" refere-se a segmentos de DNA ou RNA codificando um polipeptídeo ou uma cadeia de RNA que tem um papel funcional em um organismo e, portanto, é a unidade molecular de hereditariedade em organismos vivos. Para os fins da presente invenção, pode ser considerado que os genes incluem regiões que regulam a produção do produto do gene, quer ou não tais sequências reguladoras sejam adjacentes para codificar e/ou transcrever sequências. Por conseguinte, um gene inclui, mas não está necessariamente limitado a, sequências promotoras, terminadores, sequências reguladoras translacionais, tais como locais de ligação ao ribossomo e sítios de entrada de ribossomo interno, estimuladores, silenciadores, isoladores, elementos de fronteira, origens de replicação, locais de ligação à matriz e regiões de controlo lócus.

[0711] Conforme aqui utilizado, "expressão de um local genômico" ou "expressão do gene" é o processo pelo qual a informação a partir de um gene é utilizada na síntese de um produto funcional do gene. Os produtos de expressão de genes são muitas vezes proteínas, mas em genes que não codificam proteínas, tais como os genes de rRNA ou genes de tRNA, o produto é de RNA funcional. O processo da expressão do gene é usado por todos os seres vivos-eucariotas conhecidos (incluindo organismos multicelulares), procariontes (bactérias e arquéias) e vírus para gerar produtos funcionais para sobreviver. Tal como aqui utilizado "expressão" de um gene ou ácido nucleico engloba não só a expressão do gene celular, mas também a transcrição e tradução do ácido nucleico(s) em sistemas de clonagem e em qualquer outro contexto. Tal como aqui utilizado, "expressão" refere-se também ao processo pelo qual um polinucleotídeo é transcrito a partir de um modelo de DNA (tal como, em e mRNA ou outro transcrito de RNA) e/ou o processo pelo qual um mRNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos, ou proteínas. Os transcritos e polipeptídeos codificados podem ser coletivamente referidos como "produto do gene." Se o polinucleotídeo é derivado do DNA genômico, a expressão pode incluir emenda do mRNA em uma célula eucariótica.

[0712] Os termos "polipeptídeo", "péptido" e "proteína" são utilizados indiferentemente no presente documento para referir polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, que pode compreender os aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos englobam também um polímero de aminoácidos que foi modificado; por exemplo, formação de ligação dissulfureto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação, tal como, conjugação com um componente de marcação. Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido" inclui aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e ambos os isômeros óticos D ou L, e análogos de aminoácidos e peptidomiméticos.

[0713] Conforme aqui utilizado, o termo "domínio" ou "domínio de proteína" refere-se a uma parte de uma sequência proteica que pode existir e funcionar independentemente do resto da cadeia de proteína.

[0714] Conforme descrito nos aspectos da invenção, a identidade da sequência está relacionada com homologia de sequência. Comparações de homologia podem ser realizadas a olho, ou mais geralmente, com a ajuda de programas de comparação de sequências facilmente disponíveis. Estes programas de computador disponíveis comercialmente podem calcular a percentagem (%) de homologia entre duas ou mais sequências e pode também calcular a identidade de sequência partilhada por dois ou mais sequências de aminoácidos ou de ácido nucleico. Em algumas formas de realização preferenciais, a região de nivelamento das dTALEs aqui descritas têm sequências que são pelo menos 95% idênticas ou têm partes idênticos às sequências de aminoácidos da região de plafonamento aqui proporcionadas.

[0715] Homologias de sequências podem ser produzidas por qualquer programa de computador conhecidos na arte, por exemplo, BLAST ou FASTA, etc. Um programa de computador adequado para realizar esse alinhamento é o pacote de GCG Wisconsin Bestfit (Universidade de Wisconsin, EUA; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387). Os exemplos de outros softwares que podem realizar comparações de sequências incluem, mas não estão limitados a, pacote BLAST (ver Ausubel et al., 1999 ibid - Capítulo 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol, 403-410) e a GENEWORKS de ferramentas de comparação. Tanto o BLAST e FASTA estão disponíveis para pesquisa offline e online (ver Ausubel et al., 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60). No entanto, prefere-se utilizar o programa GCG Bestfit.

[0716] Percentagem (%) de homologia de sequências pode ser calculada ao longo de sequências contíguas, isto é, uma sequência é alinhada com a outra sequência e cada um dos aminoácidos ou nucleotídeos em uma sequência é diretamente comparada com o correspondente aminoácido ou nucleotídeo na sequência do outro, um resíduo de cada vez. Isso é chamado de um alinhamento "sem lacuna". Normalmente, esses alinhamentos sem lacuna são realizados apenas ao longo de um período relativamente curto número de resíduos.

[0717] Embora este seja um método muito simples e consistente, ele não tem em consideração que, por exemplo, em um par de sequências idênticas de um outro modo, uma inserção ou deleção pode provocar os seguintes resíduos de aminoácidos de serem colocados fora de alinhamento, assim potencialmente resultando em uma grande redução em % de homologia quando um alinhamento global é executado. Consequentemente, a maioria dos métodos de comparação de sequência são projetados para produzir alinhamentos ideais que levam em consideração possíveis inserções e deleções, sem penalizar indevidamente a pontuação geral de homologia ou identidade. Isto é conseguido através da inserção de "gaps" no alinhamento de sequências para tentar maximizar a homologia ou identidade local.

[0718] No entanto, estes métodos mais complexos atribuem "penalizações de lacuna" a cada lacuna que ocorre no alinhamento de modo que, para o mesmo número de aminoácidos idênticos, um alinhamento de sequências com poucas lacunas quanto possível - refletindo um parentesco superior entre duas sequências de comparação - pode alcançar uma pontuação maior do que um com muitas lacunas. "Os custos de gap de afinidade" são normalmente usados que cobrar um custo relativamente elevado para a existência de um gap e uma penalidade menor para cada resíduo subsequente no gap. Este é o sistema de pontuação lacuna mais geralmente utilizado. Elevadas penalidades de gap pode, naturalmente, produzir alinhamentos otimizados com menos gaps. A maioria dos programas de alinhamento permitem que as penalidades de gap sejam modificadas. No entanto, prefere-se utilizar os valores predefinidos quando se utiliza esse software para comparações de sequências. Por exemplo, quando se utiliza o pacote GCG Wisconsin Bestfit a penalidade de gap predefinida para sequências de aminoácidos é de -12 para um gap e -4 para cada extensão.

[0719] O cálculo da % de homologia máxima, por conseguinte, requer em primeiro lugar a produção de um alinhamento ótimo, tendo em consideração penalidades de gap. Um programa de computador adequado para realizar tal alinhamento é o pacote GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al., 1984 Nuc. Acids Research 12 p387). Os exemplos de outros softwares que podem realizar comparações de sequências incluem, mas não estão limitados a, pacote BLAST (ver Ausubel et al. , 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4° Ed. - Capítulo 18), FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403410) e a GENEWORKS de ferramentas de comparação. Tanto o BLAST e FASTA estão disponíveis para pesquisa offline e online (ver Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, páginas 7-58 a 7-60). No entanto, para algumas aplicações, prefere-se utilizar o programa GCG Bestfit. Uma nova ferramenta, chamada BLAST 2 Sequences está também disponível para comparação de sequências de proteínas e nucleotídeos (ver FEMS Microbiol Lett. 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett. 1999 177(1): 187-8 e no site do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia no site dos Institutos Nacionais de Saúde).

[0720] Embora a % de homologia final possa ser medida em termos de identidade, o próprio processo de alinhamento, tipicamente, não é baseado em uma comparação de pares de tudo- ou-nada. Em vez disso, uma matriz de pontuação de semelhança escalonada é geralmente utilizada, que atribui pontuações para cada comparação de pares baseadas na semelhança química ou distância evolutiva. Um exemplo de uma tal matriz geralmente utilizada é a matriz BLOSUM62 - é a matriz por defeito para o programa BLAST. Programas GCG Wisconsin geralmente usam os valores padrão públicos ou uma tabela de comparação de símbolo personalizado, se fornecido (consulte o manual do usuário para mais detalhes). Para algumas aplicações, prefere-se usar os valores públicos por defeito para o pacote GCG, ou no caso de outro software, a matriz por defeito, tal como BLOSUM62.

[0721] Em alternativa, percentagens de homologias podem ser calculadas utilizando a função de alinhamento múltiplo em DNASISTM (Hitachi Software), com base em um algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG & afiada PM (1988), Gene 73 (1), 237-244). Uma vez que o software produziu um alinhamento ótimo, é possível calcular a % de homologia, de preferência % de identidade de sequência. O software faz tipicamente isto, como parte da comparação de sequências e gera um resultado numérico.

[0722] As sequências podem também ter deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácidos que produzem uma alteração silenciosa e resultam em uma substância funcionalmente equivalente. Substituições deliberadas de aminoácidos podem ser feitas com base na semelhança das propriedades de aminoácidos (tais como polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfipática dos resíduos) e é portanto útil agrupar os aminoácidos em grupos funcionais. Os aminoácidos podem ser agrupados em conjunto com base nas propriedades das suas cadeias laterais sozinha. No entanto, é mais útil incluir também dados de mutação. Os conjuntos de aminoácidos derivados são, portanto, suscetíveis de serem conservados por razões estruturais. Estes conjuntos podem ser descritos na forma de um diagrama de Venn (Livingstone CD e Barton GJ (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput. Appl. Biosci. 9: 745-756) (Taylor W.R. (1986) “The classification of amino acid conservation” J. Theor. Biol. 119 205(-218). Substituições conservativas podem ser feitas, por exemplo de acordo com a tabela abaixo a qual descreve um diagrama de agrupamento de aminoácidos de Venn geralmente aceite.

[0723] Formas de realização da invenção incluem sequências (tanto de polinucleotídeo como polipeptídeo) as quais podem compreender substituição homóloga (substituição e reposição são ambas usadas neste documento para significar o intercâmbio de um resíduo de aminoácido ou nucleotídeo, com um resíduo ou nucleotídeo alternativo) que podem ocorrer isto é, substituição semelhante-por-semelhante no caso de aminoácidos como básico por básico, acídico por acídico, polar por polar, etc. A substituição não homóloga pode também ocorrer isto é, de uma classe de resíduo para outra ou alternativamente envolvendo a inclusão de aminoácidos não naturais tais como ornitina (daqui em diante referida como Z), ornitina ácido diaminobutírico (daqui em diante referido como B), ornitina norleucina (daqui em diante referido como O), piriilalanina, tienilalanina, naftilalanina e fenilglicina.

[0724] Sequências de aminoácidos variantes podem incluir grupos espaçadores adequados que podem ser inseridos entre quaisquer dois resíduos de aminoácidos da sequência incluindo grupos alquila tais como grupos metila, etila ou propila adicionalmente aos espaçadores aminoácidos como resíduos de glicina ou β-alanina. Uma forma de variação adicional, que envolve a presença de um ou mais resíduos de aminoácidos na forma peptoide, pode ser bem entendida pelos habilitados na arte. Para que não restem dúvidas, “a forma peptoide” é usada para referir os resíduos de aminoácidos variantes em que o grupo substituinte a-carbono está no átomo de nitrogénio do resíduo em vez de no a-carbono. Processos para preparar peptídeos na forma de peptoide são conhecidos na arte, em por exemplo Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 e Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132 134.

[0725] A prática da presente invenção emprega, a menos que indicado de outro modo, técnicas convencionais de imunologia, bioquímica, química, biologia molecular, microbiologia, biologia celular, DNA genômico e recombinante, os quais estão dentro do escopo da arte. Ver Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a edição (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); as séries METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames e G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow e Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, AND ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987)).

[0726] Vetores

[0727] Em um aspecto, a invenção proporciona vetores que são usadosna engenharia e otimização de sistemas CRISPR- Cas.

[0728] Como aqui utilizado, um "vetor" é uma ferramenta que permite ou facilita a transferência de uma entidade de um ambiente para outro. É um replicon, tal como um plasmídeo, fago, ou cosmídeo, em que um outro segmento de DNA pode ser inserido de modo a provocar a replicação do segmento inserido. De um modo geral, um vetor é capaz de replicação quando associado com os elementos de controlo apropriados. Em geral, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Os vetores incluem, mas não estão limitados a, moléculas de ácido nucleico que são de cadeia simples, cadeia dupla, ou parcialmente de cadeia dupla; moléculas de ácidos nucleicos que compreendem uma ou mais extremidades livres, sem extremidades livres (por exemplo circular); moléculas de ácido nucleico que compreendem DNA, RNA, ou ambas; e outras variedades de polinucleotídeos conhecidos na arte. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma ansa de DNA de cadeia dupla circular, ao qual segmentos de DNA adicionais podem ser inseridos, por exemplo, por técnicas de clonagem molecular padrão. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que as sequências de DNA ou RNA derivadas de vírus estão presentes no vetor para invólucro em um vírus (por exemplo, retrovírus, retrovírus de replicação defetiva, adenovírus, adenovírus de replicação defetiva, e vírus adenoassociados (AAV)). Os vetores virais incluem polinucleotídeos transportados por um vírus para transfecção em uma célula hospedeira. Determinados vetores são capazes de replicação autónoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores epissômicos de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores não epissômicos de mamíferos) são integrados no genoma de uma célula hospedeira aquando da introdução na célula hospedeira, e assim são replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, determinados vetores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados. Estes vetores são aqui referidos como "vetores de expressão". Os vetores de expressão mais comuns de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão muitas vezes na forma de plasmídeos.

[0729] Os vetores de expressão recombinantes podem compreender um ácido nucleico da invenção em uma forma adequada para expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira, o que significa que os vetores de expressão recombinantes incluem um ou mais elementos reguladores, que podem ser selecionados com base nas células hospedeiras a serem usadas para a expressão, que está operativamente ligado à sequência de ácido nucleico a ser expressa. Dentro de um vetor de expressão recombinante, "operativamente ligado" pretende significar que a sequência de nucleotídeos de interesse é ligada ao elemento(s) de regulação de um modo que permite a expressão da sequência de nucleotídeos (por exemplo, um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira). No que diz respeito a métodos de recombinação e clonagem, é feita menção ao pedido de Patente E.U.A. 10/815,730, publicado em 02 de setembro de 2004 como US 2004-0171156 A1, o conteúdo dos quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[0730] Alguns aspectos da invenção referem-se a vetores de RNA quimérico e Cas9. vetores de expressão bicistrônicos para RNA quimérico e Cas9 são preferenciais. Em geral, e em particular nesta forma de realização, Cas9 é de preferência dirigido pelo promotor CBh. O RNA quimérico pode ser preferivelmente conduzido por um promotor U6. Idealmente os dois são combinados. O RNA guia quimérico consiste tipicamente em uma sequência guia de 20 pb (Ns) e esta pode ser ligada à sequência tracr (compreendido entre o primeiro "U" da cadeia inferior ao fim da transcrição). A sequência tracr pode ser truncada em várias posições, tal como indicado. As sequências guia e tracr são separadas pela sequência tracr mate, que pode ser GUUUUAGAGCUA. Isto pode ser seguido pela sequência ansa GAAA como mostrado. Ambos são exemplos preferenciais. Os Requerentes demonstraram indels mediados por Cas9 no EMX1 humano e locais PVALB por ensaios SURVEYOR. ChiRNAs são indicados pela designação "+n" e crRNA refere-se a um RNA híbrido no qual as sequências guia e tracr são expressas como transcritos separados. Ao longo deste pedido, RNA quimérico também pode ser chamado de guia único, ou RNA guia sintético (sgRNA). A ansa é, de preferência GAAA, mas não está limitado a esta sequência ou mesmo para ter apenas 4bp de comprimento. De facto, as sequências formadoras de ansas preferenciais para uso em estruturas em grampo têm quatro nucleotídeos de comprimento, e mais preferivelmente têm a sequência GAAA. No entanto, podem ser utilizadas as sequências ansa mais longas ou mais curtas, como sequências alternativas. As sequências incluem, de preferência, um tripleto de nucleotídeos (por exemplo, AAA), e um nucleotídeo adicional (por exemplo, C ou G). Exemplos de sequências formadoras de ansa incluem CAAA e AAAG.

[0731] O termo "elemento regulador" destina-se a incluir promotores, intensificadores, locais internos de entrada do ribossomo (IRES), e outros elementos de controlo de expressão (por exemplo, sinais de terminação da transcrição, tais como sinais de poliadenilação e sequências de poli-U). Tais elementos reguladores encontram-se descritos, por exemplo, em Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Os elementos reguladores incluem aqueles em que a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeos, em muitos tipos de célula hospedeira e as que dirigem a expressão da sequência nucleotídica apenas em determinadas células hospedeiras (por exemplo, sequências reguladoras específicas de tecido). Um promotor específico de tecido pode dirigir a expressão, principalmente em um tecido desejado de interesse, tal como o músculo, neurônio, osso, pele, sangue, órgãos específicos (por exemplo, fígado, pâncreas), ou certos tipos de células (por exemplo linfócitos). Os elementos reguladores podem também dirigir a expressão de uma forma dependente do tempo, tal como dependente do ciclo celular ou de uma maneira dependente do estádio de desenvolvimento, o que pode ou não também ser específico de tecido ou do tipo de célula. Em algumas formas de realização, um vetor compreende um ou mais promotores de pol III (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, ou mais promotores pol III), um ou mais promotores pol II (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, ou mais promotores pol II), um ou mais promotores pol I(por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, ou mais promotores pol I), ou combinações dos mesmos. Exemplos de promotores pol III incluem, mas não estão limitados a, promotores U6 e H1. Exemplos de promotores pol II incluem, mas não estão limitados a, o promotor LTR do vírus retroviral do sarcoma Rous (RSV) (opcionalmente com o intensificador RSV), o promotor de citomegalovírus (CMV) (opcionalmente com o intensificador de CMV) [ver, por exemplo, Boshart et al. Cell, 41: 521-530 (1985)], o promotor de SV40, o promotor di-hidrofolato redutase, o promotor β-actina, o promotor de fosfoglicerol quinase (PGK) e o promotor EF1α. Também englobados pelo termo "elemento regulador" estão os elementos potenciadores, tais como WPRE; Potenciadores CMV; o segmento R-U5' em LTR de HTLV- I (Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p. 466-472, 1988); potenciador SV40; e a sequência de íntron entre os éxons 2 e 3 de β-globina de coelho (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), p. 152731, 1981). Será apreciado por habilitados na arte que a construção do vetor de expressão pode depender de tais fatores, tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, nível de expressão desejado, etc. Um vetor pode ser introduzido nas células hospedeiras para assim, produzir transcritos, proteínas ou peptídeos, incluindo proteínas de fusão ou peptídeos codificados por, ácidos nucleicos como aqui descrito (por exemplo, transcritos de repetições curtas palindrómica intercaladas agrupadas regularmente (CRISPR), proteínas, enzimas, formas mutantes das mesmos, proteínas de fusão dos mesmas, etc.). No que diz respeito a sequências de regulação, é feita menção ao pedido de Patente E.U.A. 10/491,026, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência na sua totalidade. No que diz respeito aos promotores, é feita referência à publicação PCT WO 2011/028929 e pedido US 12/511,940, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

[0732] Os vetores podem ser projetados para a expressão de transcritos de CRISPR (por exemplo, transcrições de ácidos nucleicos, proteínas ou enzimas) em células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, os transcritos CRISPR pode ser expressos em células bacterianas tais como Escherichia coli, células de inseto (usando vetores de expressão de baculovírus), células de leveduras, ou células de mamíferos. As células hospedeiras adequadas são ainda discutidas em Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo usando sequências reguladoras do promotor T7 e polimerase T7.

[0733] Os vetores podem ser introduzidos e propagados em um procariota ou uma célula procariótica. Em algumas formas de realização, um procariota é utilizado para amplificar cópias de um vetor para serem introduzidas em uma célula eucariótica, ou como um vetor intermédio na produção de um vetor para ser introduzido em uma célula eucariótica (por exemplo, amplificação de um plasmídeo como parte de um sistema do invólucro de vetor viral). Em algumas formas de realização, um procariota é utilizado para amplificar cópias de um vetor e expressar um ou mais ácidos nucleicos, de modo a proporcionar uma fonte de uma ou mais proteínas para aplicação a uma célula hospedeira ou organismo hospedeiro. A expressão de proteínas em procariotas é mais frequentemente realizada em Escherichia coli com vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis dirigindo a expressão de proteínas de fusão ou não- fusão. Os vetores de fusão adicionam um número de aminoácidos a uma proteína por eles codificados, tal como o terminal amino da proteína recombinante. Tais vetores de fusão podem servir para um ou mais fins, tais como: (i) para aumentar a expressão de proteínas recombinantes; (ii) para aumentar a solubilidade da proteína recombinante; e (iii) auxiliar na purificação da proteína recombinante atuando como um ligando na purificação por afinidade. Muitas vezes, em vetores de expressão de fusão, um local de clivagem proteolítica é introduzido na junção da porção de fusão e a proteína recombinante para permitir a separação da proteína recombinante a partir da porção de fusão subsequente à purificação da proteína de fusão. Tais enzimas, e as suas sequências de reconhecimento cognatas, incluem fator Xa, trombina e enteroquinase. Exemplos de vetores de expressão de fusão incluem pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith e Johnson, 1988. Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que funde glutationa S-transferase (GST), proteína de ligação a maltose E, ou proteína A, respectivamente, para a proteína recombinante alvo.

[0734] Exemplos de vetores de expressão de E. coli adequados, induzíveis e não-fusão incluem pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315) e pET 11d (Studier et al., TECNOLOGIA DE GENES: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89).

[0735] Em algumas formas de realização, um vetor é um vetor de expressão de levedura. Exemplos de vetores para expressão na levedura Saccharomyces cerivisae incluem pYepSec1 (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kuijan e Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), e picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.).

[0736] Em algumas formas de realização, um vetor dirige a expressão de proteína em células de inseto usando vetores de expressão de baculovírus. Vetores de baculovírus disponíveis para expressão de proteínas em cultura de células de inseto (por exemplo, células SF9) incluem a série pAc (Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) e as séries pVL (Lucklow e Summers, 1989. Virology 170: 31-39).

[0737] Em algumas formas de realização, um vetor é capaz de dirigir a expressão de uma ou mais sequências em células de mamífero usando um vetor de expressão em mamífero. Exemplos vetores de expressão em mamífero incluem pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) e pMT2PC (Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195). Quando usados em células de mamífero, as funções de controle dos vetores de expressão são tipicamente providos por um ou mais elementos reguladores. Por exemplo, os promotores comummente usados são derivados da polioma, adenovírus 2, citomegalovírus, vírus de símio 40, e outros divulgados neste documento e conhecidos na arte. Para outros sistemas de expressão adequados para as células procarióticas e eucarióticas ver, por exemplo, Capítulos16 e 17 de Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

[0738] Em algumas formas de realização, o vetor de expressão recombinante de mamífero consegue dirigir a expressão do ácido nucleico preferencialmente em um tipo de célula particular (por exemplo, elementos reguladores específicos de tecido são usados para expressar o ácido nucleico). Elementos reguladores específicos de tecido são conhecidos na arte. Exemplos não limitativos de promotores específicos de tecido adequados incluem o promotor albumina (específico para fígado; Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277), promotores específicos linfoides (Calame e Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275), em particular promotores de receptores de célula T (Winoto e Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733) e imunoglobulinas (Baneiji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen e Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748), promotores específicos de neurônio (por exemplo, o promotor de neurofilamento; Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), promotores específicos de pâncreas (Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916), e promotores específicos da glândula mamária (por exemplo, promotor de subida de leite; E.U.A. Pat. No. 4,873,316 e Publicação do Pedido Europeu No. 264,166). Promotores regulados em termos de desenvolvimento são também englobados, por exemplo, os promotores de hox de murino (Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379) e o promotor a-fetoproteína (Campes e Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546). Com vista a estes vetores procarióticas e eucariótica, é feita menção à Patente E.U.A. 6,750,059, cujos conteúdos são incorporados como referência neste documento na íntegra. Outras formas de realização da invenção podem relacionar-se com o uso de vetores virais, com vista aos quais é feita menção no Pedido de Patente E.U.A. 13/092,085, cujos conteúdos são incorporados como referência neste documento na íntegra. Elementos reguladores específicos de tecidos são conhecidos na arte e com este objetivo, são mencionados na Patente E.U.A 7,776,321, cujos conteúdos são incorporados como referência neste documento na íntegra.

[0739] Elementos de Regulação

[0740] Em algumas formas de realização, um elemento regulador está operacionalmente ligado a um ou mais elementos de genes de um sistema CRISPR de modo a guiar a expressão de um ou mais elementos de genes do sistema CRISPR. Em geral, CRISPRs (Repetições Curtas Palindrômicas Agrupadas Regularmente Interespaçadas), são conhecidas como SPIDRs (Repetições Diretas Dispersas de Espaçador), constituem uma família de locais de DNA que são usualmente específicos de uma determinada espécie bacteriana. O local CRISPR compreende uma classe distinta de repetições de sequências curtas intercaladas (SSRs) que foram reconhecidas em E. coli (Ishino et al., J. Bacteriol., 169:5429-5433 [1987]; e Nakata et al., J. Bacteriol., 171:3553-3556 [1989]), e genes associados. SSRs similares intercaladas foram identificadas em Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena, e Mycobacterium tuberculosis (Ver, Groenen et al., Mol. Microbiol., 10:1057-1065 [1993]; Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5:254-263 [1999]; Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30 [1996]; e Mojica et al., Mol. Microbiol., 17:85-93 [1995]). Os locais CRISPR tipicamente diferem de outras SSRs na estrutura das repetições, as quais foram denominadas repetições curtas regularmente espaçadas (SRSRs) (Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol., 6:23-33 [2002]; e Mojica et al., Mol. Microbiol., 36:244-246 [2000]). Em geral, as repetições são elementos curtos que ocorrem em agrupamentos que são regularmente espaçados por sequências intervenientes únicas com um comprimento substancialmente constante (Mojica et al., [2000], supra). Apesar de as sequências de repetições serem altamente conservadas entre estirpes o número repetições interespaçadas e as sequências das regiões do espaçador tipicamente diferem de estirpe para estirpe (van Embden et al., J. Bacteriol., 182:2393-2401 [2000]). Os locais CRISPR foram identificados em mais de 40 procariotas (Ver por exemplo, Jansen et al., Mol. Microbiol., 43:1565-1575 [2002]; e Mojica et al., [2005]) incluindo mas não limitado a Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema, e Thermotoga.

[0741] Em geral, “Sistema CRISPR” refere-se coletivamente a transcritos e outros elementos envolvidos na expressão de ou dirigindo a atividade de genes associados a CRISPR (“Cas”), incluindo sequências codificando um gene Cas, uma sequência tracr (CRISPR de transativação) (por exemplo tracrRNA ou uma tracrRNA parcialmente ativa), uma sequência tracr mate (englobando uma “repetição direta” e uma repetição direta parcial processada por tracrRNA no contexto de um sistema endógeno de CRISPR), uma sequência guia (também referida como um “espaçador” no contexto de um sistema endógeno de CRISPR), ou outra sequências e transcritos de um local de CRISPR. Em formas de realização da invenção os termos sequência guia e RNA guia são utilizados indiferentemente. Em algumas formas de realização, um ou mais elementos de genes de um sistema a CRISPR deriva de um sistema CRISPR tipo I, tipo II, ou tipo III. Em algumas formas de realização, um ou mais elementos de um sistema CRISPR deriva de um organismo específico compreendendo um sistema endógeno de CRISPR, tal como Streptococcus pyogenes. Em geral, um sistema CRISPR se caracteriza por elementos que promovem a formação de um complexo CRISPR no sítio de uma sequência alvo (também referido como um protoespaçador no contexto de um sistema endógeno CRISPR). No contexto da formação de um complexo CRISPR, “sequência alvo” se refere a uma sequência à qual uma sequência guia é concebida para ter complementaridade, em que a hibridação entre uma sequência alvo e uma sequência guia promove a formação de um complexo CRISPR. Uma sequência alvo pode compreender qualquer polinucleotídeo, tais como polinucleotídeos DNA ou RNA. Em algumas formas de realização, uma sequência alvo está localizada no núcleo ou no citoplasma de uma célula.

[0742] Em algumas formas de realização, as repetições diretas podem ser identificadas in silico através da procura de motivos repetitivos cumprindo qualquer um ou todos os seguintes critérios:

[0743] 1. encontrado em uma janela de 2Kb da sequência genômica flanqueando o local CRISPR tipo II;

[0744] 2. extensão desde 20 até 50 pb; e

[0745] 3. interespaçada por 20 até 50 pb.

[0746] Em algumas formas de realização, 2 desses critérios podem ser usados, por exemplo 1 e 2, 2 e 3, ou 1 e 3. Em algumas formas de realização, todos os 3 critérios podem ser usados.

[0747] Em algumas formas de realização, o tracrRNA candidato pode ser subsequentemente previsto pelas sequências cumprindo qualquer ou todos os seguintes critérios:

[0748] 1. homologia de sequência a repetições diretas (pesquisa do motivo em Geneious com até 18-pb desemparelhados);

[0749] 2. presença de um previsível terminador de transcrição independente de Rho na direção da transcrição; e

[0750] 3. estrutura secundária em grampo estável entre tracrRNA e a repetição direta.

[0751] Em algumas formas de realização, 2 desses critérios podem ser usados, por exemplo 1 e 2, 2 e 3, ou 1 e 3. Em algumas formas de realização, todos os 3 critérios podem ser usados.

[0752] Em algumas formas de realização, desenhos de RNAs guia sintético quimérico (sgRNAs) podem incorporar pelo menos 12 pb de estrutura dupla entre a repetição direta e o tracrRNA.

[0753] Em formas de realização preferenciais da invenção, o sistema CRISPR é um sistema CRISPR tipo II e a enzima Cas é Cas9, a qual catalisa a clivagem de DNA. A ação enzimática por Cas9 derivada de Streptococcus pyogenes ou qualquer Cas9 intimamente relacionada gera quebras de cadeia dupla nas sequências do sítio alvo a qual hibrida com 20 nucleotídeos de uma sequência guia e que tem uma sequência motivo adjacente protoespaçadora (PAM) (os exemplos incluem NGG/NRG ou uma PAM que pode ser determinada conforme aqui descrito) seguindo os 20 nucleotídeos da sequência alvo. A atividade CRISPR através da Cas9 para o reconhecimento e clivagem de DNA específico de sítio é definida pela sequência guia, a sequência tracr que hibrida em parte a sequência guia e a sequência PAM. Mais aspectos do sistema CRISPR são descritos em Karginov e Hannon, TThe CRISPR system: small RNA- guided defence in bacteria and archaea, Mole Cell 2010, January 15; 37(1): 7.

[0754] O local CRISPR tipo II de Streptococcus pyogenes SF370, contendo um conjunto de quatro genes Cas9, Cas1, Cas2, e Csn1, assim como dois elementos de RNA não codificantes, tracrRNA e a matriz característica de sequências repetitivas (repetições diretas) interespaçadas por trechos curtos sequências de não repetitivas (espaçadores, cerca de 30pb cada). Neste sistema, a quebra do DNA alvo de cadeia dupla (DSB) é gerada em quatro etapas sequenciais (Fig. 2A). Primeiro, dois RNAs não codificantes, a matriz pré-crRNA e tracrRNA, são transcritas a partir do local de CRISPR. Segundo, o tracrRNA hibrida com as repetições diretas de pré-crRNA, o qual é então processado em crRNAs maduras contendo sequências espaçadoras individuais. Terceiro, o crRNA:tracrRNA complexo maduro dirige Cas9 ao DNA alvo consistindo do protoespaçador e a PAM correspondente via da formação de heterodúplex entre a região espaçadora do crRNA e o DNA protoespaçador. Finalmente, a Cas9 medeia a clivagem do DNA alvo a montante de PAM para criar um DSB dentro do protoespaçador (Fig. 2A). A Fig. 2B demonstra a localização do núcleo Cas9 otimizado para códon. Para promover a iniciação da transcrição exata, selecionou-se o promotor U6 de base RNA polimerase III para conduzir a expressão de tracrRNA (Fig. 2C). De modo semelhante, a construção à base do promotor U6 foi desenvolvida para expressar um arranjo pré-crRNA consistindo de um único espaçador flanqueado por duas repetições diretas (DRs, também englobadas no termo “sequências companheiras tracr”; Fig. 2C). O espaçador inicial foi desenhado para atingir um sítio alvo de 33 pares de bases (pb) (protoespaçador de 30 pb mais uma sequência motivo 3pb CRISPR (PAM) satisfazendo o motivo de reconhecimento NGG de Cas9) em um local de EMX1 humano (Fig. 2C), um gene chave no desenvolvimento do córtex cerebral.

[0755] Tipicamente, no contexto de um sistema endógeno CRISPR, a formação de um complexo CRISPR (compreendendo uma sequência guia hibridada a uma sequência alvo e complexada com uma ou mais proteínas Cas) resulta na clivagem de um ou em ambas as cadeias dentro ou na proximidade (por exemplo dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, ou mais pares de bases de) a sequência alvo. Sem se pretender ficar limitado pela teoria, a sequência tracr, a qual pode compreender ou consistir de toda ou parte de uma sequência tracr do tipo selvagem (por exemplo cerca de ou mais de 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85, ou mais nucleotídeos da sequência do tipo selvagem tracr), pode também formar parte de um complexo CRISPR, tal como por hibridação com pelo menos uma porção de uma sequência tracr a toda ou a uma parte de uma sequência tracr mate estando operacionalmente ligado a sequência guia. Em algumas formas de realização, um ou mais vetores dirigindo a expressão de um ou mais elementos de genes de um sistema CRISPR são introduzidos dentro de uma célula hospedeira de modo a que a expressão dos elementos do sistema CRISPR dirijam a formação de um complexo CRISPR em um ou mais locais alvo. Por exemplo, uma enzima Cas, uma sequência guia ligada a uma sequência tracr mate, e uma sequência tracr podem cada uma estar operacionalmente ligadas para separar ou elementos reguladores em vetores separados. De modo alternativo, dois ou mais dos elementos expressados a partir dos mesmos ou de diferentes elementos reguladores, podem ser combinados em um único vetor, com um ou mais vetores de genes adicionais fornecendo quaisquer dos componentes do sistema CRISPR não incluídos em um primeiro vetor. Os elementos do sistema CRISPR que são combinados em um único vetor podem ser arranjados em qualquer orientação adequada, tal como um elemento localizado em 5’ em relação a (“montante” de) ou 3’ em relação a (“jusante” de) um segundo elemento. A sequência codificante de um elemento pode estar localizada na mesma ou em cadeias opostas da sequência codificante de um segundo elemento, e orientadas na mesma ou na direção oposta. Em algumas formas de realização, um único promotor dirige a expressão de um transcrito codificando uma enzima CRISPR e um ou mais da sequência guia, sequência tracr mate (opcionalmente operacionalmente ligada à sequência guia), e uma sequência tracr inserida em uma ou mais sequências de íntron (por exemplo cada uma em um íntron diferente, duas ou mais em pelo menos um íntron, ou todas em um único íntron). Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR, a sequência guia, a sequência tracr mate, e a sequência tracr estão operacionalmente ligadas a e expressadas a partir do mesmo promotor.

[0756] Em algumas formas de realização, um vetor compreende um ou mais sítios de inserção de genes, tais como uma sequência de reconhecimento de endonuclease de restrição (também referida como um “sítio de clonagem”). Em algumas formas de realização, um ou mais sítios de inserção de genes (por exemplo cerca de ou mais de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais sítios de inserção) estão localizados a montante e/ou jusante de um ou mais elementos de sequência de um ou mais vetores. Em algumas formas de realização, um vetor compreende um sítio de inserção a montante de uma sequência tracr mate, e opcionalmente a jusante de um elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência tracr mate, de modo que após a inserção de uma sequência guia no sítio de inserção e aquando da expressão da sequência guia dirige a sequência específica de ligação a um complexo CRISPR para uma sequência alvo em uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, um vetor compreende dois ou mais sítios de inserção, cada sítio de inserção estando localizado entre duas sequências companheiras tracrs de modo a permitir a inserção de uma sequência guia a cada sítio. Em cada arranjo, as duas ou mais sequências guia podem compreender duas ou mais cópias da única sequência guia, duas ou mais sequências guia diferentes, ou combinações dessas. Quando são usadas sequências guia múltiplas diferentes, uma única construção de expressão pode ser usada para direcionar a atividade CRISPR para as sequências alvo múltiplas diferentes correspondentes dentro de uma célula. Por exemplo, um vetor único pode compreender cerca de ou mais de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, ou mais sequências guia. Em algumas formas de realização, podem ser providos cerca de ou mais de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais desses vetores contendo a sequência guia, e opcionalmente aplicados à célula.

[0757] Em algumas formas de realização, um vetor compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de enzima codificando uma enzima CRISPR, tal como um proteína Cas. Exemplos não limitativos de proteínas Cas incluem Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também conhecidas como Csn1 e Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, homólogos desses, ou suas versões modificadas. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR não modificada tem atividade de clivagem de DNA, tal como a Cas9. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR dirige a clivagem de uma ou ambas as cadeias no local de uma sequência alvo, assim como dentro da sequência alvo e/ou dentro do complemento da sequência alvo. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR dirige a clivagem de uma ou de ambas as cadeias em cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, ou mais pares de bases do primeiro ou último nucleotídeo de uma sequência alvo. Em algumas formas de realização, um vetor codifica uma enzima CRISPR que é modificada em relação à correspondente enzima do tipo selvagem de modo a que a enzima CRISPR não tenha capacidade para clivar uma ou ambas as cadeias de um polinucleotídeo contendo uma sequência alvo. Por exemplo, uma substituição de aspartato por alanina (D10A) no domínio catalítico RuvC I de Cas9 de S. pyogenes converte a Cas9 de uma nuclease clivando ambas as cadeias em uma nickase (cliva uma cadeia única). Outros exemplos de mutações que tornam a Cas9 uma nickase incluem, sem limitação, H840A, N854A, e N863A. Como um exemplo adicional, dois ou mais domínios catalíticos da Cas9 (RuvC I, RuvC II, e RuvC III ou o domínio HNH) podem ser modificados para produzir uma Cas9 modificada substancialmente sem toda a atividade de clivagem de DNA. Em algumas formas de realização, a mutação D10A é combinada com uma ou mais mutações de H840A, N854A, ou N863A para produzir uma enzima Cas9 substancialmente sem qualquer atividade de clivagem de DNA. Em algumas formas de realização, uma enzima CRISPR é considerada para eliminar substancialmente toda a atividade de clivagem de DNA quando a atividade de clivagem de DNA da enzima modificada é menos de cerca de 25%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01%, ou menor em relação à sua forma não modificada. Onde a enzima não é SpCas9, as mutações podem ser feitas em qualquer ou em todos os resíduos correspondentes às posições 10, 762, 840, 854, 863 e/ou 986 da SpCas9 (a qual pode ser verificada por exemplo por ferramentas de comparação de sequência padrão. Particularmente, qualquer ou todas das seguintes mutações são preferenciais em SpCas9: D10A, E762A, H840A, N854A, N863A e/ou D986A; assim como a substituição conservativa de qualquer um dos aminoácidos de substituição também é prevista. A mesma (ou substituições conservativas destas mutações) nas posições correspondentes em outra Cas9s são também preferenciais. Particularmente preferenciais são D10 e H840 em SpCas9. Porém, em outras Cas9s, os resíduos correspondentes a SpCas9 D10 e H840 são também preferenciais.

[0758] Uma substituição de aspartato por alanina (D10A) no domínio catalítico RuvC I de SpCas9 foi manipulada para converter a nuclease em uma nickase (SpCas9n) (ver por exemplo Sapranauskas et al., 2011, Nucleic Acis Research, 39: 9275; Gasiunas et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109:E2579), de modo que o DNA genômico cortado submetido a reparação de alta fiabilidade dirigida por homologia (HDR). O ensaio de Surveyor confirmou que a SpCas9n não gera indels no protoespaçador EMX1 A coexpressão de crRNA quimérico visando EMX1 (tendo também o componente tracrRNA) com as indels SpCas9 produzidas no sítio alvo, enquanto a coexpressão com SpCas9n não (n=3). Acima de tudo, a sequenciação de 327 produtos de amplificação não detecta quaisquer indels induzidas por SpCas9n. O mesmo local foi selecionado para testar HR mediada por CRISPR cotransfectando as células HEK 293FT com o RNA quimérico visando EMX1, hSpCas9 ou hSpCas9n, assim como um modelo de HR para introduzir um par de sítios de restrição (HindIII e NheI) perto do protoespaçador.

[0759] Ortólogos preferenciais são aqui descritos. Uma enzima Cas pode ser identificada como Cas9 dado que esta pode referir-se à classe geral de enzimas partilhando homologia com a maior das nucleases com os domínios de múltiplas nucleases a partir do sistema CRISPR de tipo II. O mais preferencialmente, a Enzima Cas9 é de, ou é derivada de, spCas9 ou saCas9. Por derivada, os Requerentes entendem que a enzima derivada baseia-se em grande parte, no sentido de ter um elevado grau de homologia de sequência com, uma enzima de tipo selvagem, mas que foi modificada (modificada), de alguma forma conforme aqui descrito.

[0760] Será tomado em consideração que os termos enzima Cas e CRISPR são aqui geralmente utilizados intermutavelmente, a não ser que seja evidente de outra forma. Como mencionado acima, muitas das numerações de resíduos aqui utilizadas se referem a enzima Cas9 tipo II do local de CRISPR em Streptococcus pyogenes. Porém, tem que se ter em consideração que a presente invenção inclui muitas mais Cas9s a partir de outras espécies de micróbios tais como SpCas9, SaCas9, St1Cas9 e assim sucessivamente.

[0761] Otimização de códon

[0762] Um exemplo de uma sequência otimizada para códon, neste caso otimizada para humanos (isto é sendo otimizada para expressão em humanos) é aqui provida, ver a sequência otimizada para SaCas9 humana. Embora isto seja preferencial, faz-se notar que são possíveis outros exemplos e é conhecida a otimização de códon para uma espécie hospedeira.

[0763] Em algumas formas de realização, uma sequência de codificação de enzima codificando uma enzima CRISPR é otimizada em códon para expressão em células específicas, tais como células eucarióticas. As células eucarióticas podem ser essas de ou derivadas de um organismo específico, tal como um mamífero, incluindo mas não limitado a humanos, camundongos, ratos, coelho, cão, ou mamífero não humano ou primata. Em algumas formas de realização, processos para modificar a identidade genética germinal de seres humanos e/ou processos para modificação da identidade genética de animais que são suscetíveis de lhes causar sofrimentos sem utilidade médica substancial para o homem ou animais, e também animais resultantes desses processos, podem ser excluídos.

[0764] Em geral, a otimização para códon se refere a um processo de modificação de uma sequência de ácido nucleico para melhorar a expressão nas células hospedeiras de interesse substituindo pelo menos um códon (por exemplo cerca de ou mais de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, ou mais códons) da sequência nativa com códons que são mais frequentemente ou o mais frequentemente usadas em genes dessa célula hospedeira mantendo no entanto a sequência de aminoácidos nativa. Várias espécies exibem tendência específica para certos códons de um aminoácido específico. A tendência para códons (diferenças na utilização de códon entre organismos) frequentemente correlaciona-se com a eficiência da tradução de RNA mensageiro (mRNA), que por sua vez se crê ser dependente de, entre outras coisas, as propriedades dos códons sendo traduzidos e a disponibilidade das moléculas específicas de RNA de transferência (tRNA). A predominância de tRNAs selecionados em uma célula é geralmente um reflexo dos códons mais frequentemente usados na síntese de peptídeos. Adequadamente, os genes podem ser recortados para ótima expressão de genes em um dado organismo com base na otimização de códon. As tabelas de utilização de códon estão facilmente disponíveis, por exemplo, no “Banco de Dados de Utilização de Códon” disponível em www.kazusa.orjp/códon/ (visited Jul. 9, 2002), e essas tabelas podem ser adaptadas várias vezes. Ver Nakamura, Y., et al. “Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000” Nucl. Acids Res. 28:292 (2000). Algoritmos de computador para otimização de códon uma sequência particular para expressão em uma célula hospedeira particular estão também disponíveis, tal como Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA), estão também disponíveis. Em algumas formas de realização, um ou mais códons (por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, ou mais, ou todos os códons) em uma sequência codificando uma enzima CRISPR corresponde ao códon mais frequentemente usado para um aminoácido particular.

[0765] Localização nuclear de sequências (NLSs)

[0766] Em algumas formas de realização, um vetor encodes uma enzima CRISPR compreendendo uma ou mais sequências de localização nuclear (NLSs), tal como cerca de ou mais de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais NLSs. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR compreende cerca de ou mais de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais NLSs em ou perto da terminação amina, cerca de ou mais de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais NLSs em ou perto da terminação carboxi, ou uma combinação destas (por exemplo um ou mais NLS na terminação amina e um ou mais NLS na terminação carboxi). Quando está presente mais do que um NLS, cada um pode ser selecionado independentemente dos outros, de modo a que um único NLS possa estar presente em mais do que uma cópia e/ou em combinação com um ou mais dos outro NLSs presentes em um ou mais cópias. Em uma forma de realização preferencial da invenção, a enzima CRISPR compreende no máximo 6 NLSs. Em algumas formas de realização, um NLS é considerado perto do terminal N ou C quando o aminoácido mais próximo de NLS está dentro de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, ou mais aminoácidos da cadeia polipeptídica da terminação N ou C. Exemplos não limitativos de NLSs incluem uma sequência de NLS derivado de: o NLS do vírus SV40 vírus T-antigênio grande, tendo a sequência de aminoácidos PKKKRKV; o NLS de nucleoplasmina (por exemplo a nucleoplasmina bipartida NLS com a sequência KRPAATKKAGQAKKKK); a c-myc NLS tendo a sequência de aminoácidos PAAKRVKLD ou RQRRNELKRSP; a hRNPA1 M9 NLS tendo a sequência NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY; a sequência RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV do domínio IBB da importina-alfa; as sequências VSRKRPRP e PPKKARED de T proteína de mioma; a sequência POPKKKPL de p53 humana; a sequência SALIKKKKKMAP de camundongo c-abl IV; as sequências DRLRR e PKQKKRK do vírus NS1 de influenza; a sequência RKLKKKIKKL do antigênio delta de vírus da Hepatite; a sequência REKKKFLKRR da proteína Mx1 de camundongo; a sequência KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK da poli(ADP-ribose) polimerase humana; e a sequência RKCLQAGMNLEARKTKK dos receptores de hormônio esteroide (humana) glucocorticoides.

[0767] Em geral, o um ou mais NLSs são de força suficiente para conduzir a acumulação de uma enzima CRISPR em uma quantidade detectável no núcleo de uma célula eucariótica. Em geral, a força de localização da atividade nuclear pode derivar do número de NLSs em uma enzima CRISPR, o(s) NLS(s) particular(es) usado(s), ou uma combinação destes fatores. A detecção da acumulação no núcleo pode ser realizada por qualquer uma das técnicas adequadas. Por exemplo, um marcador detectável pode ser fundido à enzima CRISPR, de modo a que a localização dentro de uma célula possa ser visualizada, de modo a que a combinação com um meio de detecção da localização do núcleo (por exemplo uma mancha específica para o núcleo, tal como DAPI). Podem também isolar-se núcleos celulares partindo das células, o conteúdo dos quais pode então ser analisado por qualquer processo adequado para detectar proteína, tal como imunohistoquímica, transferência de Western, ou ensaio de atividade de enzima. A acumulação no núcleo pode ser também determinada indiretamente, tal como através de um ensaio do efeito de formação do complexo CRISPR (por exemplo ensaio de clivagem de DNA ou mutação na sequência alvo, ou ensaio para alterar a expressão da atividade de genes afetados pela formação do complexo CRISPR e/ou atividade de enzima CRISPR), em comparação com um controlo não exposto a uma enzima ou complexo CRISPR, ou exposto a uma enzima CRISPR sem um ou mais NLSs.

[0768] Sequência guia

[0769] Guias particularmente preferenciais estão na gama de 20-22 ntds, como descrito aqui e ver Exemplo 40.

[0770] Em geral, uma sequência guia é qualquer sequência de polinucleotídeos tendo suficiente complementaridade com uma sequência de polinucleotídeos alvo para hibridar com a sequência alvo e direcionar a ligação específica de sequência de um complexo CRISPR com a sequência alvo. Em algumas formas de realização, o grau de complementaridade entre uma sequência guia e a sua correspondente sequência alvo, quando opcionalmente alinhada usando um algoritmo de alinhamento adequado, é cerca de ou mais de cerca de 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99%, ou mais. O alinhamento ótimo pode ser determinado com o uso de qualquer algoritmo adequado para alinhar sequências, exemplo não limitante do qual se inclui o algoritmo de SmithWaterman, o algoritmo Needleman-Wunsch os algoritmos baseados no Transformador de Burrows-Wheeler (por exemplo o Alinhador de Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; disponível em www.novocraft.com), ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (disponível em soap.genomics.org.cn), e Maq (disponível em maq.sourceforge.net). Em algumas formas de realização, uma sequência guia é cerca de ou mais de cerca de 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75, ou mais nucleotídeos em comprimento. Em algumas formas de realização, uma sequência guia é menos de cerca de 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, ou menos nucleotídeos em comprimento. A capacidade de uma sequência guia para ligação direta específica a sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo pode ser avaliada por qualquer ensaio adequado. Por exemplo, os componentes de um sistema CRISPR suficiente para formar um complexo CRISPR, incluindo a sequência guia para ser testado, pode ser provido a uma célula hospedeira tendo a sequência alvo correspondente, tal como por transfecção com vetores codificando os componentes da sequência CRISPR, seguido por uma avaliação de clivagem preferencial dentro de uma sequência alvo, tal como por ensaio de Surveyor conforme aqui descrito. De modo semelhante, a clivagem de uma sequência de polinucleotídeos alvo pode ser avaliada em um tubo de teste provendo uma sequência alvo, os componentes de um complexo CRISPR, incluindo a sequência guia a ser testado e uma sequência guia controle diferente da sequência guia de teste, e comparando a ligação ou a taxa de clivagem a uma sequência alvo entre o teste e reações da sequência guia controle. Outros ensaios são possíveis, e podem ocorrer aos habilitados na arte.

[0771] Uma sequência guia pode ser selecionada para visar qualquer sequência alvo. Em algumas formas de realização, a sequência alvo é uma sequência dentro de um genoma de uma célula. Sequências alvo exemplificativas incluem esses que são únicos no genoma alvo. Por exemplo, para a Cas9 S. pyogenes, uma única sequência alvo em um genoma pode incluir um sítio Cas9 alvo da MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG onde NNNNNNNNNNNNXGG (N é A, G, T, ou C; e X pode ser qualquer) tem uma única ocorrência no genoma. Uma única sequência alvo em um genoma pode incluir um sítio Cas9 alvo de S. pyogenes da MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG onde NNNNNNNNNNNNXGG (N é A, G, T, ou C; e X pode ser qualquer) tem uma única ocorrência no genoma. Para a Cas9 CRISPR1 de S. thermophilus, uma única sequência alvo em um genoma pode incluir um sítio Cas9 alvo da forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW onde NNNNNNNNNNNNXXAGAAW (N é A, G, T, ou C; X pode ser qualquer; e W é A ou T) tem uma única ocorrência no genoma. Uma única sequência alvo em um genoma pode incluir uma CRISPR1 Cas9 alvo de S. thermophilusMMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW onde NNNNNNNNNNNXXAGAAW (N é A, G, T, ou C; e X pode ser qualquer) tem uma única ocorrência no genoma. Para a Cas9 de S. pyogenes, uma única sequência alvo em um genoma pode incluir um sítio Cas9 alvo da MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG onde NNNNNNNNNNNNXGG (N é A, G, T, ou C; e X pode ser qualquer) tem uma única ocorrência no genoma. Uma única sequência alvo em um genoma pode incluir um sítio alvo Cas9 de S. pyogenes da forma MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG onde NNNNNNNNNNNXGGXG (N é A, G, T, ou C; e X pode ser qualquer) tem uma única ocorrência no genoma. Em cada dessas sequências “M” pode ser A, G, T, ou C, e não precisam de ser consideradas na identificação de uma sequência como única.

[0772] Em algumas formas de realização, uma sequência guia é selecionada para reduzir o grau da estrutura secundária na sequência guia. Em algumas formas de realização, cerca de ou menos de cerca de 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, ou menor dos nucleotídeos da sequência guia participam no emparelhamento com base em auto complementaridade quando otimamente dobrada. A dobragem ótima pode ser determinada por qualquer algoritmo de dobragem de polinucleotídeo adequado. Alguns programas são baseados no cálculo da energia mínima livre de Gibbs. Um exemplo desse algoritmo é mFold, como descrito por Zuker e Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133 -148). Outro exemplo de algoritmo de dobragem é o servidor da web RNAfold, desenvolvido no Instituto para a Química Teórica na Universidade de Viena, usando o algoritmo de previsão de estrutura centroide (ver por exemplo A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; e PA Carr e GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62).

[0773] Sequência tracr mate

[0774] Em geral, uma sequência tracr mate inclui qualquer sequência que tem complementaridade suficiente com uma sequência tracr para promover um ou mais de: (1) excisão de uma sequência guia flanqueada pela sequência tracr mate s em uma célula contendo a correspondente sequência tracr; e (2) formação de um complexo CRISPR a uma sequência alvo, em que o complexo CRISPR compreende a sequência tracr mate hibridada com a sequência tracr. Em geral, grau de complementaridade é em relação ao alinhamento ótimo de uma sequência tracr mate e sequência tracr, ao longo do comprimento tracr ao longo do comprimento da mais curta das duas sequências. O alinhamento ótimo pode ser determinado por qualquer algoritmo de alinhamento adequado, e pode adicionalmente considerar para estruturas secundárias, tais como auto complementaridade dentro ou da sequência tracr ou da sequência tracr mate. Em algumas formas de realização, o grau de complementaridade entre a sequência tracr e a sequência tracr mate ao longo do comprimento da mais curta das duas quando otimamente alinhadas é cerca de ou mais que cerca de 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99%, ou maior. Em algumas formas de realização, a sequência tracr é cerca de ou mais do que cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, ou mais nucleotídeos em comprimento. Em algumas formas de realização, a sequência tracr e a sequência tracr mate são contidas dentro de um único transcrito, de modo a que a hibridação entre as duas produz um transcrito tendo uma estrutura secundária, tal como um grampo. Em uma forma de realização da invenção, o transcrito ou a sequência de polinucleotídeos transcrita tem pelo menos dois ou mais grampos Em formas de realização preferenciais, o transcrito tem dois, três, quatro ou cinco grampos. Em uma outra forma de realização da invenção, o transcrito tem no máximo cinco grampos. Em uma estrutura em grampo a porção da sequência 5’ do “N” final e a montante da ansa corresponde para a sequência tracr mate, e a porção da sequência 3’ da ansa corresponde à sequência tracr. Exemplos adicionais não limitativos de polinucleotídeos unitários compreendendo uma sequência guia, uma sequência tracr mate, e uma sequência tracr são como se segue (listado 5’ a 3’), onde “N” representa a base de uma sequência guia, um primeiro bloco de letras minúsculas representam a sequência tracr mate, e o segundo bloco de letras minúsculas representam a sequência tracr, e a sequência poli- T final representa o terminador de transcrição: (1) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaa gctacaaagataa ggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTT TTTT; NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataag gcttcatgccg aaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT; (3) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataag gcttcatgccg aaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTTT; (4) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtc cgttatcaactt gaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTT; (5) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagtgTTTTTTT; e (6) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtc cgttatcaTT TTTTTT. Em algumas formas de realização, as sequências (1) a (3) são úteis na combinação com Cas9 de CRISPR1 S. thermophilus. Em algumas formas de realização, as sequências (4) a (6) são usadas em combinação com Cas9 de S. pyogenes. Em algumas formas de realização, a sequência tracr é um transcrito separado de um transcrito compreendendo a sequência tracr mate.

[0775] Modelo de Recombinação

[0776] Em algumas formas de realização, é também fornecido um modelo de recombinação. Um modelo de recombinação pode ser um componente de outro vetor conforme aqui descrito, contendo um vetor separado, ou provido como um polinucleotídeo separado. Em algumas formas de realização, um modelo de recombinação é desenhado para servir de modelo na recombinação homóloga, tal como dentro ou perto de uma sequência alvo cortada ou clivada por uma enzima CRISPR como uma parte de um complexo CRISPR. Um modelo de polinucleotídeo pode ser de qualquer comprimento adequado, tal como cerca de ou mais de cerca de 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000, ou mais nucleotídeos em comprimento. Em algumas formas de realização, o modelo de polinucleotídeos é complementar a uma porção de um polinucleotídeo compreendendo uma sequência alvo. Quando alinhado opcionalmente, um polinucleotídeo modelo deve- se sobrepor com um ou mais nucleotídeos de sequências alvo (por exemplo cerca de ou mais de cerca de 1, 5, 10, 15, 20, ou mais nucleotídeos). Em algumas formas de realização, quando um modelo de sequência e um polinucleotídeo compreendendo uma sequência alvo são alinhados otimamente, o nucleotídeo mais perto do modelo de polinucleotídeo é de cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000, ou mais nucleotídeos da sequência alvo.

[0777] Proteína de fusão

[0778] Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é parte de uma proteína de fusão compreendendo um ou mais heterólogos de domínios de proteína (por exemplo cerca de ou mais de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais domínios para além da enzima CRISPR). Uma proteína de fusão enzima CRISPR pode compreender qualquer sequência proteína adicional, e opcionalmente uma sequência ligante entre qualquer dos dois domínios. Exemplos de domínios de proteína que podem ser fundidos a uma enzima CRISPR incluem, sem limitação, marcadores de epítopo, sequências de genes repórter, e domínios de proteína tendo uma ou mais das seguintes atividades: atividade metilase, atividade desmetilase, atividade de ativação de transcrição, atividade de repressão de transcrição, atividade do fator de libertação de transcrição, atividade de modificação de histona, atividade de clivagem de RNA e atividade de ligação a ácido nucleico. Exemplos não limitativos de marcadores de epítopo incluem marcadores histidina (His, marcadores V5, marcadores FLAG, marcadores de hemaglutinina de influenza (HA), marcadores Myc, marcadores VSV-G, e marcadores tioredoxina (Trx). Exemplos de genes repórter incluem, mas não estão limitados a, glutationa- S-transferase (GST), peroxidase de rábano (HRP), cloranfenicol-acetiltransferase (CAT) beta-galactosidase, beta-glucuronidase, luciferase, proteína verde fluorescente (GFP), HcRed, DsRed, proteína ciano fluorescente (CFP), proteína amarelo fluorescente (YFP), e proteínas autofluorescentes incluindo proteína azul fluorescente (BFP). Uma enzima CRISPR pode ser fundida a uma sequência de genes codificando uma proteína ou um fragmento de uma proteína que liga moléculas de DNA ou de ligação a outras moléculas celulares, incluindo mas não limitado a proteína de ligação a maltose (MBP), S-tag, fusões de domínio de ligação (DBD) a Lex A DNA, fusões de domínio de ligação a GAL4 DNA, e proteínas de fusão a vírus herpes simplex (HSV) BP16. Domínios adicionais que podem formar parte de uma proteína de fusão compreendendo uma enzima CRISPR são descritos em US20110059502, incorporado neste documento como referência. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR visada é usada para identificar a localização de uma sequência alvo.

[0779] Sistema induzível

[0780] Em algumas formas de realização, uma enzima CRISPR pode formar um componente de um sistema induzível. A natureza induzível do sistema deve permitir o controle espaciotemporal de gene editando ou a expressão de genes usando uma forma de energia. A forma de energia pode incluir mas não se limitando a radiação eletromagnética, energia sonora, energia química e energia térmica. Exemplos do sistema induzível incluem promotores induzíveis de tetraciclina (Tet- ligado ou Tet-desligado), sistemas ativações de transcrição da molécula pequena de dois híbridos (FKBP, ABA, etc.), ou sistemas induzíveis pela luz (Fitocromo, domínio LOV, ou criptocromo).Em uma forma de realização, a enzima CRISPR pode ser parte de um Efetor de Transcrição Induzível pela Luz (LITE) para dirigir alterações a atividade de transcrição em um modo específico de sequência. Os componentes de uma luz podem incluir uma enzima CRISPR, um heterodímero criptocromo responsivo à luz (por exemplo de Arabidopsis thaliana), e um domínio de ativação/repressão de transcrição. Exemplos adicionais de induzível proteínas de ligação a DNA e métodos para o seu uso são providos na E.U.A 61/736465 e E.U.A 61/721,283, que é aqui incorporada como referência na íntegra.

[0781] Aplicação

[0782] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos compreendendo a aplicação de um ou mais polinucleotídeos, tais como ou um ou mais vetores conforme aqui descritos, um ou mais transcritos desses, e/ou uma ou proteínas dali transcritas, a uma célula hospedeira. Em alguns aspectos, a invenção adicionalmente fornece células produzidas por esses métodos, e animais compreendendo ou produzidos partindo dessas células. Em algumas formas de realização, uma enzima CRISPR em combinação com (e opcionalmente complexada com) uma sequência guia é distribuída a uma célula. Métodos de transferência de genes convencionais com base viral e não viral podem ser usados para introduzir ácidos nucleicos em células de mamífero ou tecidos alvo. Esses métodos podem ser usados para administrar ácidos nucleicos codificando os componentes de um sistema CRISPR a células em cultura, ou em um organismo hospedeiro. Sistemas de aplicação de vetores não virais incluem DNA de plasmídeos, RNA (por exemplo um transcrito de um vetor aqui descrito), ácido nucleico nu, e ácido nucleico complexado com um veículo de aplicação, tal como um lipossomo. Sistemas de aplicação de vetores virais incluem vírus de RNA e DNA, que têm ambos os genomas epissômicos ou integrados após fornecimento à célula. Para uma revisão de procedimentos de terapia de genes, ver Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology e Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., em Current Topics in Microbiology and Immunologym Doerfler and Bohm (eds) (1995); e Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).

[0783] Métodos de aplicação de ácidos nucleicos não virais incluem lipofecção, microinjeção, biolísticos, virossomos, lipossomos, imunolipossomos, policátion ou lípido: conjugados de ácidos nucleicos, DNA despido, virions artificiais, e agente potenciador de captação de DNA. A lipofecção é descrita em por exemplo nas Pat E.U.A.. Nos. 5,049,386, 4,946,787; e 4,897,355) e os reagentes de lipofecção são vendidos comercialmente (por exemplo, Transfectam™ e Lipofectin™). Lípidos catiônicos e neutros que são adequados para a lipofecção eficiente do receptor de reconhecimento de polinucleotídeos incluem os de Felgner, WO 91/17424; WO 91/16024. A aplicação pode ser a células (por exemplo administração in vitro ou ex vivo) ou tecidos alvo (por exemplo administração in vivo).

[0784] A preparação de complexos lípido:ácido nucleico, incluindo lipossomos visados tais como complexos de imunolípidos, é bem conhecido de um habilitado na arte (ver, por exemplo, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); Pat E.U.A. Nos. 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, e 4,946,787).

[0785] O uso de sistemas com base em RNA ou DNA viral para a aplicação de ácidos nucleicos tira proveito dos processos altamente evoluídos para direcionar um vírus para células específicas no corpo e transferir a carga viral para o núcleo. Os vetores virais podem ser administrados diretamente aos pacientes (in vivo) ou podem ser usados para tratar as células in vitro, e as células modificadas podem opcionalmente ser administradas aos pacientes (ex vivo). Sistemas convencionais de base viral podem incluir vetores de vírus retroviral, lentivírus, adenovírus, adenoassociado e herpes simplex para a transferência de genes. A integração no genoma hospedeiro é possível com os métodos de transferência de genes virais de retrovírus, lentivírus, e adenoassociado, resultando muitas vezes na expressão a longo prazo do transgene inserido. Adicionalmente, eficiências de alta transdução se observaram em muitos diferentes tipos de células e tecidos alvo.

[0786] O tropismo de um retrovírus pode ser alterado incorporando proteínas de invólucro externo, expandindo a população alvo potencial das células alvo. Os vetores de lentivírus são vetores retrovirais que são capazes de transduzir ou infetar células não se dividindo e tipicamente produzir altos títulos virais. Seleção de um sistema de transferência de genes retrovirais deverá portanto depender do tecido alvo. Vetores retrovirais compreendem repetições terminais longas de atuação cis com capacidade de acondicionamento até 6-10 kb de sequência externa. O mínimo de LTRs com atuação cis são suficientes para replicação e acondicionamento dos vetores, os quais são então usados para integrar o gene terapêutico nas células alvo para prover permanente expressão de transgenes. O uso alargado de vetores retrovirais inclui esses baseados em vírus da leucemia murina (MuLV), vírus da leucemia do macaco gibão (GaLV), vírus da Imunodeficiência símia (SIV), vírus da imunodeficiência humana (VIH), e combinações desses (ver, por exemplo, Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700).

[0787] Em uma outra forma de realização, partículas do vetor retroviral pseudotipado no invólucro de vesiculovírus Cocal são contempladas (ver, por exemplo, Publicação da patente EUA No. 20120164118 atribuída ao Fred Hutchinson Cancer Research Center). O vírus Cocal é do género vesiculovírus, e é um agente causador de estomatite vesicular, em mamíferos. O vírus Cocal foi inicialmente isolado a partir de ácaros em Trinidad (Jonkers et al., Am. J. Vet. Res. 25: 236-242 (1964)), e as infecções foram identificadas em Trinidad, Brasil e Argentina em insetos, gado e cavalos. Muitos dos vesiculovírus que infetam mamíferos têm sido isolados de artrópodes naturalmente infetados, sugerindo que são transmitidos por vetores. Os anticorpos para vesiculovírus são comuns entre as pessoas que vivem em áreas rurais, onde os vírus são endêmicos, e adquiridos em laboratório; infecções em seres humanos geralmente resultam em sintomas semelhantes aos da gripe. A glicoproteína do envelope do vírus Cocal tem 71,5% de identidade ao nível dos aminoácidos com o VSV-G Indiana, e a comparação filogenética do gene do envelope de vesiculovírus mostra que o vírus Cocal é serologicamente distinto, mas mais proximamente relacionado, de estirpes de VSV-G Indiana entre os vesiculovírus. Jonkers et al., Am. J. Vet. Res. 25:236-242 (1964) e Travassos da Rosa et al., Am. J. Tropical Med. & Hygiene 33:999-1006 (1984). As partículas do vetor retroviral pseudotipado no envelope de vesiculovírus Cocal podem incluir, por exemplo, partículas de vetor de lentivírus, alfaretrovírus, betaretrovírus, gammaretrovírus, deltaretrovírus, e epsilonretrovírus que podem compreender Gag, Pol, e/ou uma ou mais proteínas acessórias retrovirais e uma proteína do envelope de vesiculovírus Cocal. Dentro de certos aspectos destas formas de realização, a Gag, Pol, e proteínas acessórias são lentivirais e/ou gammaretrovirais.

[0788] Em aplicações em que a expressão transiente é preferencial, podem ser utilizados sistemas baseados em adenovírus. Vetores baseados em adenovírus são capazes de uma eficiência de transdução muito elevada em muitos tipos de células e não requerem divisão celular. Com tais vetores, foram obtidos títulos e níveis de expressão elevados. Este vetor pode ser produzido em grandes quantidades em um sistema relativamente simples.

[0789] Vetores de vírus associado a adeno ("AAV") podem também ser usados para transduzir células com ácidos nucleicos alvo, por exemplo, produção in vitro de ácidos nucleicos e peptídeos, e para procedimentos de terapia de genes in vivo e ex vivo (ver, por exemplo West et al., Virology 160:38-47 (1987); U.S. Pat. No. 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). Construção de vetores de AAV recombinantes são descritos em um número de publicações incluindo a Pat. E.U.A. No. 5,173,414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:64666470 (1984); e Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989).

[0790] Células do invólucro são tipicamente utilizadas para formar partículas de vírus que são capazes de infetar uma célula hospedeira. Tais células incluem células 293, que empacotam adenovirus, e células ^2 ou células PA317, que empacotam retrovírus. Os vetores virais utilizados em terapia gênica são usualmente gerados por produção de uma linha celular que empacota um vetor de ácido nucleico para dentro de uma partícula viral. Os vetores contêm tipicamente as sequências virais mínimas necessárias para involucrar e integrar subsequente em um hospedeiro, outras sequências virais a ser substituídas por um cassete de expressão para o polinucleotídeo(s) a ser expresso. As funções virais que faltam são tipicamente fornecidas em trans pela linha celular do invólucro. Por exemplo, os vetores AAV utilizados em terapia gênica tipicamente possuem apenas sequências ITR do genoma AAV que são necessárias para invólucro e integração no genoma do hospedeiro. O DNA viral é empacotado em uma linha celular que contém um plasmídeo ajudante codificando outros genes AAV, nomeadamente rep e cap, mas que não possuem sequências ITR. A linha celular pode também ser infetada com adenovírus como um auxiliar. O vírus auxiliar promove a replicação do vetor AAV e a expressão de genes AAV do plasmídeo auxiliar. O plasmídeo auxiliar não é empacotado em quantidades significativas devido à ausência das sequências ITR. A contaminação com adenovírus pode ser reduzida por, por exemplo, tratamento térmico ao qual o adenovírus é mais sensível do que AAV.

[0791] Deste modo, o AAV é considerado um candidato ideal para utilização como um vetor de transdução. Tais vetores de transdução de AAV podem compreender funções que atuam em cis suficientes para replicar na presença de funções auxiliares de adenovírus ou herpesvírus ou poxvírus (por exemplo, vírus vacínia) fornecidas em trans. AAV recombinante (rAAV) pode ser utilizado para transportar os genes exógenos para as células de uma variedade de linhagens. Nestes vetores, os genes cap e/ou rep de AAV são eliminados a partir do genoma viral e substituídos por um segmento de DNA de escolha. Vetores de AAV atuais podem acomodar até 4.300 bases de DNA inserido.

[0792] Há um número de formas para produzir o rAAV, e a invenção proporciona rAAV e métodos para a preparação de rAAV. Por exemplo, o(s) plasmídeo(s) contendo ou consistindo essencialmente na construção viral desejada são transfectados para células infetadas por AAV. Além disso, um segundo ou adicional plasmídeo auxiliar é cotransfectados para estas células para proporcionar os genes rep e/ou cap de AAV que são obrigatórios para a replicação e invólucro da construção viral recombinante. Sob estas condições, as proteínas rep e/ou cap de AAV atuam em trans para estimular a replicação e invólucro da construção rAAV. Dois a três dias após a transfecção, rAAV é colhido. Tradicionalmente, rAAV é colhido a partir das células, juntamente com adenovírus. O adenovírus contaminante é então inativado por tratamento térmico. Na presente invenção, o rAAV é vantajosamente colhido, não a partir das próprias células, mas a partir de sobrenadante celular. Consequentemente, em um aspecto inicial a presente invenção fornece a preparação de rAAV, e para além do exposto, o rAAV pode ser preparado por um método que compreende ou consiste essencialmente de: infecção de células suscetíveis com um rAAV contendo o DNA exógeno incluindo o DNA para a expressão, e vírus auxiliar (por exemplo, adenovírus, vírus do herpes, poxvírus, tais como vírus vacínia), em que o rAAV carece do funcionamento de cap e/ou rep (e o vírus auxiliar (por exemplo, adenovírus, vírus do herpes, poxvírus tais como vírus vacínia) proporciona a função cap e/ou rev que rAAV carece); ou infecção de células suscetíveis com um rAAV contendo o DNA exógeno incluindo o DNA para a expressão, em que o recombinante carece de funcionamento cap e/ou rep e transfecção das referidas células com um plasmídeo que forneça a função cap e/ou rep que falta a rAAV; ou infetar as células suscetíveis com um rAAV contendo o DNA exógeno incluindo o DNA para a expressão, em que o recombinante carece da função cap e/ou rep, em que as referidas células fornecem a função cap e/ou rep; ou a transfecção das células suscetíveis com um AAV carecendo da função cap e/ou rep e plasmídeos para a inserção de DNA exógeno no recombinante, de modo a que o DNA exógeno é expresso pelo recombinante e para fornecimento de funções rep e/ou cap em que os resultados de transfecção em um rAAV contendo o DNA exógeno incluindo o DNA para a expressão que carece de funcionamento cap e/ou rep.

[0793] O rAAV pode ser um AAV como aqui descrito, e vantajosamente pode ser um rAAV1, rAAV2, AAV5 ou rAAV tendo híbrido capsídeo que podem compreender AAV1, AAV2, AAV5 ou qualquer combinação desses. Pode-se selecionar o AAV do AAV em relação às células a serem visadas; por exemplo, podem selecionar-se os serotipos AAV 1, 2, 5 ou um AAV1, AAV2, AAV5 híbrido ou de capsídeo ou qualquer combinação dos mesmos para visar células cerebrais ou neuronais; e pode-se selecionar o AAV4 parar atingir tecido cardíaco.

[0794] Em adição a células 293, outras células que podem ser utilizadas na prática da presente invenção e a infeciosidade relativa de certos serotipos de AAV in vitro quanto a estas células (ver Grimm, D. et al., J. Virol. 82: 5887-5911 (2008)) são como a seguir:

[0795] A invenção proporciona rAAV que contém ou é constituído essencialmente por uma molécula de ácido nucleico exógeno codificador de um sistema CRISPR (Repetições Curtas Palindrômicas Agrupadas Regularmente Interespaçadas), por exemplo, uma pluralidade de cassetes compreendendo ou consistindo em um primeiro cassete compreendendo ou consistindo essencialmente em um promotor, uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína associada a CRISPR (Cas) (proteínas nuclease ou helicase putativas), por exemplo, Cas9 e um terminador, e dois, ou mais, vantajosamente, até o limite de tamanho do invólucro do vetor, por exemplo, para um total de (incluindo o primeiro cassete) cinco, cassetes compreendendo ou consistindo essencialmente em um promotor, molécula de ácido nucleico codificando RNA guia (gRNA) e um terminador (por exemplo, cada cassete esquematicamente representada como Promotor-gRNA1-terminador, Promotor-gRNA2- terminador... Promotor-gRNA (N)-terminador (onde N é um número que pode ser inserido, que é de um limite superior ao limite de tamanho do invólucro do vetor), ou dois ou mais rAAVs individuais, cada um contendo um ou mais do que um cassete de um sistema CRISPR, por exemplo, um primeiro rAAV contendo o primeiro cassete compreendendo ou consistindo essencialmente de um promotor, uma molécula de ácido nucleico codificando Cas, por exemplo, Cas9 e um terminador, e um segundo rAAV contendo uma pluralidade, quatro, cassetes compreendendo ou consistindo essencialmente de um promotor, molécula de ácido nucleico codificando RNA guia (gRNA) e um terminador (por exemplo, cada cassete esquematicamente representada como Promotor-gRNA1-terminador, promotor-gRNA2-terminador... Promotor-gRNA (N)-terminador (onde N é um número que pode ser inserido, que é de um limite superior do limite de tamanho do invólucro do vetor). Como rAAV é um vírus de DNA, as moléculas de ácidos nucleicos da presente discussão relativas a AAV ou rAAV são vantajosamente DNA. O promotor é, em algumas formas de realização, vantajosamente o promotor humano de sinapsina I (hSyn).

[0796] Os métodos adicionais para a aplicação de ácidos nucleicos de células são conhecidos pelos habilitados na arte. Ver, por exemplo, US20030087817, aqui incorporada por referência. Ver também Kanasty, incorporada também por referência e discutida aqui.

[0797] Em algumas formas de realização, uma célula hospedeira é transfectada transitoriamente ou não transitoriamente com um ou mais dos vetores aqui descritos. Em algumas formas de realização, uma célula é transfectada tal como ocorre naturalmente em um indivíduo. Em algumas formas de realização, uma célula que é transfectada é retirada de um indivíduo. Em algumas formas de realização, a célula é derivada de células retiradas de um indivíduo, tal como uma linha celular. Uma ampla variedade de linhas celulares de cultura de tecidos são conhecidos na arte. Exemplos de linhas celulares incluem, mas não são limitadas a, C8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD- 3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panc1, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK- UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS- M6A, BS-C-1 de epitélio renal de macaco, BALB/ 3T3 fibroblastos de embrião de camundongo, 3T3 Swiss, 3T3-L1, 132-d5 fibroblastos fetais humanos; 10.1 fibroblastos de camundongo, 293-T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, BCP-1 cells, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR- L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepa1c1c7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, células JY, células K562, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF- 7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI- H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, OPCN / OPCT linhas celulares, Peer, PNT-1A / PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, células Saos-2, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, THP1 linhas celulares, U373, U87, U937, VCaP, células Vero, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR, e suas variedades transgênicas. As linhas celulares estão disponíveis de uma variedade de fontes conhecidas dos habilitados na arte (ver, por exemplo, American Type Culture Collection (ATCC) (Manassus, Va.)). Em algumas formas de realização, uma célula transfectada com um ou mais dos vetores aqui descritos é utilizada para estabelecer uma nova linha celular que compreende uma ou mais sequências derivadas de vetores. Em algumas formas de realização, uma célula transitoriamente transfectada com os componentes de um sistema CRISPR como aqui descrito (por exemplo, através de transfecção transiente de um ou mais vetores, ou transfecção com RNA), e modificada por meio da atividade de um complexo CRISPR, é usada para estabelecer uma nova linha celular compreendendo as células que contêm a modificação, mas sem qualquer outra sequência exógena. Em algumas formas de realização, as células transfectadas transitoriamente ou não- transitoriamente com um ou mais vetores aqui descritos, ou linhas celulares derivadas dessas células são usadasna avaliação de um ou mais compostos de teste.

[0798] Em algumas formas de realização, um ou mais vetores aqui descritos são usados para produzir um animal transgênico não humano ou planta transgênica. Em algumas formas de realização, o animal transgênico é um mamífero, tal como um camundongo, rato, ou coelho. Métodos para produzir animais transgênicos e plantas são conhecidos na arte, e geralmente começam com um método de transfecção de células, tal como aqui descrito.

[0799] Em uma outra forma de realização, um dispositivo de administração de fluido com uma série de agulhas (ver, por exemplo, Publicação da Patente EUA No. 20110230839 atribuída a Fred Hutchinson Cancer Research Center) pode ser contemplado para a aplicação de CRISPR Cas ao tecido sólido. Um dispositivo da Publicação da Patente EUA No. 20110230839 para a aplicação de um fluido para um tecido sólido pode compreender uma pluralidade de agulhas dispostas em uma matriz; uma pluralidade de reservatórios, cada um em comunicação de fluidos com uma respectiva da pluralidade de agulhas; e uma pluralidade de atuadores operacionalmente acoplados aos respectivos da pluralidade de reservatórios e configurado para controlar uma pressão de fluido no interior do reservatório. Em certas formas de realização cada um da pluralidade de atuadores pode compreender uma de uma pluralidade de êmbolos, uma primeira extremidade de cada uma da pluralidade de êmbolos sendo recebida em uma respectiva uma de entre a pluralidade de reservatórios, e em certas outras formas de realização os êmbolos da pluralidade de êmbolos são operativamente ligados em conjunto nas respectivas segundas extremidades, de modo a serem simultaneamente pressionáveis. Ainda certas outras formas de realização podem compreender um êmbolo condutor configurado para comprimir toda a pluralidade de êmbolos, a uma taxa seletivamente variável. Em outras formas de realização de cada pluralidade de atuadores pode compreender uma de uma pluralidade de linhas de transmissão de fluido tendo uma primeira e segunda extremidades, uma primeira extremidade de cada uma da pluralidade de linhas de transmissão de fluido a ser acoplada a uma respectiva da pluralidade de reservatórios. Noutras formas de realização, o dispositivo pode compreender uma fonte de pressão de fluido, e cada uma da pluralidade de atuadores inclui um acoplamento de fluido entre a fonte de pressão de fluido e uma respectiva da pluralidade de reservatórios. Em outras formas de realização, a fonte de pressão de fluido pode compreender, pelo menos, um de um compressor, um acumulador de vácuo, uma bomba peristáltica, um cilindro mestre, uma bomba de microfluidos, e uma válvula. em uma outra forma de realização, cada uma da pluralidade de agulhas pode compreender uma pluralidade de portas distribuídas ao longo do seu comprimento.

[0800] Modificação de um alvo

[0801] Em um aspecto, a invenção proporciona métodos para a modificação de um polinucleotídeo alvo em uma célula eucariótica, que pode ser in vivo, ex vivo ou in vitro. Em algumas formas de realização, o método compreende a amostragem ou biópsia de uma célula ou população de células a partir de um animal humano ou não humano, ou uma planta, e modificando a célula ou células. A cultura pode ocorrer em qualquer fase ex vivo. A célula ou células podem ser reintroduzidas no animal não humano. Para as células reintroduzidas é particularmente preferencial que as células sejam células estaminais.

[0802] Em algumas formas de realização, o método compreende a permissão de um complexo CRISPR se ligar ao polinucleotídeo alvo para efetuar a clivagem do referido polinucleotídeo alvo modificando assim o polinucleotídeo alvo, em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com uma sequência guia hibridada a uma sequência alvo dentro do referido polinucleotídeo alvo, em que a referida sequência guia é ligada a uma sequência tracr mate a qual por sua vez hibrida com uma sequência tracr.

[0803] Em um aspecto, a invenção fornece um método para modificar um polinucleotídeo em uma célula eucariótica. Em algumas formas de realização, o método compreende a permissão de um complexo CRISPR se ligar ao polinucleotídeo de modo a que a referida ligação resulte no aumento ou diminuição da expressão do referido polinucleotídeo em que o complexo CRISPR compreende uma enzima CRISPR complexada com uma sequência guia hibridada a uma sequência alvo dentro do referido polinucleotídeo, em que a referida sequência guia é ligada a uma sequência tracr mate a qual por sua vez hibrida com uma sequência tracr. Considerações semelhantes e condições aplicam-se como acima para os métodos de modificação de um polinucleotídeo alvo. Na realidade, estas opções de amostragem, de cultura e reintrodução aplicam-se a aspectos da presente invenção.

[0804] Com efeito, em qualquer aspecto da invenção, o complexo CRISPR pode compreender uma enzima CRISPR complexada com uma sequência guia hibridada com uma sequência alvo, em que a referida sequência guia pode estar ligada a uma sequência tracr mate, que por sua vez pode hibridar com uma sequência tracr. Considerações semelhantes e condições aplicam-se como acima para os métodos de modificação de um polinucleotídeo alvo.

[0805] Kits

[0806] Em um aspecto, a invenção proporciona kits contendo qualquer um ou mais dos elementos descritos nos métodos e composições anteriores. Os elementos podem ser fornecidos individualmente ou em combinações, e podem ser proporcionados em qualquer recipiente adequado, tal como um frasco, uma garrafa ou um tubo. Em algumas formas de realização, o kit inclui instruções em uma ou mais línguas, por exemplo em mais do que uma língua.

[0807] Em algumas formas de realização, um kit compreende um ou mais reagentes para utilização em um processo que utiliza um ou mais dos elementos descritos no presente documento. Os reagentes podem ser proporcionados em qualquer recipiente adequado. Por exemplo, um kit pode fornecer um ou mais tampões de reação ou de armazenamento. Os reagentes podem ser fornecidos em uma forma que é utilizável em um ensaio particular, ou em uma forma que requer a adição de um ou mais outros componentes antes da sua utilização (por exemplo na forma liofilizada ou concentrada). Um tampão pode ser qualquer tampão, incluindo mas não se limitando a um tampão de carbonato de sódio, um tampão de bicarbonato de sódio, um tampão de borato, um tampão Tris, um tampão de MOPS, um tampão HEPES, e suas combinações. Em algumas formas de realização, o tampão é alcalino. Em algumas formas de realização, o tampão tem um pH de cerca de 7 a cerca de 10. Em algumas formas de realização, o kit compreende um ou mais oligonucleotídeos correspondentes a uma sequência guia para inserção em um vetor, de modo a ligar operacionalmente a sequência guia e um elemento regulador. Em algumas formas de realização, o kit compreende um polinucleotídeo modelo de recombinação homóloga. Em algumas formas de realização, o kit compreende um ou mais dos vetores e/ou um ou mais dos polinucleotídeos aqui descritos. O kit pode, vantajosamente, permitir fornecer todos os elementos dos sistemas da invenção.

[0808] Complexo CRISPR

[0809] Em um aspecto, a invenção fornece métodos para utilizar um ou mais elementos de um sistema CRISPR. O complexo CRISPR da invenção fornece meios eficazes para modificar um polinucleotídeo alvo. O complexo CRISPR da invenção tem uma vasta gama de utilidades incluindo modificar (por exemplo eliminar, inserir, translocar, inativar, ativar) um polinucleotídeo alvo em uma multiplicidade de tipos de células. Como tal o complexo CRISPR da invenção tem um vasto espetro de aplicações em, por exemplo, terapia de genes, triagem de fármacos, diagnóstico de doença, e prognóstico. Um complexo CRISPR exemplificativo compreende uma enzima CRISPR complexada com uma sequência guia hibridada a uma sequência alvo no polinucleotídeo alvo. A sequência guia é ligada a uma sequência tracr mate, a qual por sua vez hibrida com uma sequência tracr.

[0810] Em uma forma de realização, esta invenção fornece um método de clivagem de um polinucleotídeo alvo. O método compreende a modificação de um polinucleotídeo alvo usando um complexo CRISPR que se liga ao polinucleotídeo alvo e tem efeito na clivagem do referido polinucleotídeo alvo. Tipicamente, o complexo CRISPR da invenção, quando introduzido em uma célula, cria uma rutura (por exemplo, uma quebra na cadeia dupla ou simples) na sequência do genoma. Por exemplo, o método pode ser utilizado para clivar um gene da doença de uma célula.

[0811] A rutura criada pelo complexo CRISPR pode ser reparada por um dos processos de reparação, tais como a via da extremidade de união (NHEJ) não homóloga propensa a erros ou a reparação dirigida por homologia de alta fiabilidade (HDR) (Fig. 29). Durante esse processo de reparação, um modelo de polinucleotídeo exógeno pode ser introduzido na sequência do genoma. Em certos métodos, o processo de HDR é usado para modificar a sequência do genoma. Por exemplo, um modelo de polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência para ser integrada flanqueada por uma sequência a montante e uma sequência a jusante é introduzido em uma célula. As sequências a montante e a jusante partilham semelhanças de sequência com ambos os lados do local de integração no cromossomo.

[0812] Onde desejado, um polinucleotídeo dador pode ser DNA, por exemplo, um plasmídeo de DNA, um cromossomo bacteriano artificial (BAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC), um vetor viral, um pedaço linear de DNA, um fragmento de PCR, um ácido nucleico nu, ou um ácido nucleico complexado com um veículo de aplicação, tal como um lipossomo ou poloxâmero.

[0813] O modelo de polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência a ser integrada (por exemplo, um gene mutado). A sequência de integração pode ser uma sequência endógena ou exógena à célula. Exemplos de uma sequência a ser integrada incluem polinucleotídeos codificando uma proteína ou um RNA não codificador (por exemplo, um microRNA). Assim, a sequência de integração pode ser operativamente ligada a uma sequência de controlo adequada ou sequências. Alternativamente, a sequência a ser integrada pode fornecer uma função de regulação.

[0814] As sequências a montante e a jusante do polinucleotídeo modelo exógeno são selecionadas para promover a recombinação entre a sequência cromossômica de interesse e o polinucleotídeo dador. A sequência a montante é uma sequência de ácido nucleico que partilha a similaridade de sequência com a sequência do genoma a montante do local alvo para a integração. Do mesmo modo, a sequência a jusante é uma sequência de ácido nucleico que partilha a similaridade de sequência com a sequência cromossômica a jusante do local alvo de integração. As sequências a montante e a jusante do polinucleotídeo modelo exógeno podem ter 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência do genoma alvo. De preferência, as sequências a montante e a jusante do polinucleotídeo modelo exógeno têm cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência do genoma alvo. Em alguns métodos, as sequências a montante e a jusante do polinucleotídeo modelo exógeno têm cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência do genoma alvo.

[0815] Uma sequência a montante ou a jusante pode compreender desde cerca de 20 pb e cerca de 2500 pb, por exemplo, cerca de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, ou 2500 pb. Em alguns métodos, a sequência a montante ou a jusante exemplificativa tem cerca de 200 pb a cerca de 2000 pb, cerca de 600 pb a cerca de 1000 pb, ou mais particularmente de cerca de 700 pb a cerca de 1000 pb.

[0816] Em alguns métodos, o modelo de polinucleotídeo exógeno pode ainda compreender um marcador. Tal marcador pode tornar mais fácil a triagem de integrações alvos. Exemplos de marcadores apropriados incluem locais de restrição, proteínas fluorescentes ou marcadores selecionáveis. O polinucleotídeo modelo exógeno da invenção pode ser construído utilizando técnicas recombinantes (ver, por exemplo, Sambrook et al., 2001 e Ausubel et al., 1996).

[0817] Em um método exemplar para modificar um polinucleotídeo alvo por meio da integração de um polinucleotídeo modelo exógeno, uma quebra na cadeia dupla é introduzida na sequência do genoma do complexo CRISPR, a quebra é reparada através de recombinação homóloga um modelo polinucleotídeo exógeno de modo a que o modelo seja integrado no genoma. A presença de uma quebra na cadeia dupla facilita a integração do modelo.

[0818] Em outras formas de realização, a invenção fornece um método de modificação da expressão de um polinucleotídeo em uma célula eucariótica. O método compreende aumentar ou diminuir a expressão de um polinucleotídeo alvo usando um complexo CRISPR que se liga ao polinucleotídeo.

[0819] Em alguns métodos, um polinucleotídeo alvo pode ser inativado para efetuar uma modificação da expressão em uma célula. Por exemplo, após a ligação de um complexo CRISPR a uma sequência alvo em uma célula, o polinucleotídeo alvo é inativado de modo a que a sequência não é transcrita, a proteína codificada não é produzida, ou a sequência não funciona como faz a sequência tipo selvagem. Por exemplo, uma proteína ou sequência de codificação de microRNA pode ser inativada de tal modo que a proteína não é produzida.

[0820] Em alguns métodos, a sequência controle pode ser inativada de modo a não voltar a funcionar como sequência controlo. Como usado neste documento, “sequência controle” se refere a qualquer sequência de ácido nucleico que efetua a transcrição, tradução, ou acessibilidade de uma sequência de ácido nucleico. Exemplos de uma sequência controle incluem, um promotor, um terminador de transcrição, e um potenciador são sequências controle.

[0821] sequência alvo inativada pode incluir uma mutação de deleção (isto é, deleção de um ou mais nucleotídeos), uma mutação de inserção (isto é, inserção de um ou mais nucleotídeos), ou uma mutação não senso (isto é, substituição de um único nucleotídeo por outro nucleotídeo de modo a ser introduzido um códon de paragem). Em alguns métodos, a inativação de uma sequência alvo resulta em “inativação” da sequência alvo.

[0822] Modelos de doenças

[0823] Um método da invenção pode ser utilizado para criar uma planta, um animal ou célula, que pode ser utilizado como um modelo de doença. Tal como aqui utilizado, "doença" refere-se a uma doença, distúrbio ou indicação em um indivíduo. Por exemplo, um método da invenção pode ser usado para criar um animal ou célula que compreende uma modificação em um ou mais sequências de ácidos nucleicos associadas com uma doença, ou uma planta, animal ou célula na qual a expressão de uma ou mais sequências de ácidos nucleicos associadas com uma doença são alteradas. Tal sequência de ácido nucleico pode codificar para uma sequência de proteína associada a doença ou pode ser uma sequência de controle da doença associada. Por conseguinte, entende-se que em formas de realização da invenção, uma planta, indivíduo, paciente, organismo ou célula podem ser um indivíduo não humano, paciente, organismo ou célula. Assim, a invenção proporciona uma planta, animal ou célula, produzido por métodos da presente invenção, ou uma sua progênie. A progênia pode ser um clone da planta ou animal produzido, ou pode resultar de reprodução sexual por cruzamento com outros indivíduos das mesmas espécies para introduzir características mais desejáveis para os seus descendentes. A célula pode ser in vivo ou ex vivo, nos casos de organismos multicelulares, particularmente animais ou plantas. No caso em que a célula é cultivada, uma linha celular pode ser estabelecida se forem satisfeitas condições de cultura apropriadas e, de preferência, se a célula é adaptada para esta finalidade (por exemplo, uma célula estaminal). Linhas celulares bacterianas produzidas pela invenção são também previstas. Assim, também estão previstas linhas celulares.

[0824] Em alguns métodos, o modelo de doença pode ser utilizado para estudar os efeitos de mutações no animal ou célula e no desenvolvimento e/ou progressão da doença usando as medidas normalmente utilizadas no estudo da doença. Alternativamente, um tal modelo de doença é útil para estudar o efeito de um composto farmaceuticamente ativo na doença.

[0825] Em alguns métodos, o modelo de doença pode ser utilizado para avaliar a eficácia de uma potencial estratégia de terapia genética. Isto é, um gene ou polinucleotídeo associado à doença pode ser modificado de tal modo que o desenvolvimento da doença e/ou progressão é inibida ou reduzida. Em particular, o método compreende a modificação de um gene ou polinucleotídeo associado à doença, de modo que uma proteína alterada é produzida e, como resultado, o animal ou célula tem uma resposta alterada. Por conseguinte, em alguns métodos, um animal geneticamente modificado pode ser comparado com um animal predisposto para o desenvolvimento da doença, de modo a que o efeito do evento de terapia genética possa ser avaliado.

[0826] Em uma outra forma de realização, esta invenção proporciona um método de desenvolvimento de um agente biologicamente ativo que modula um evento de sinalização celular associado com um gene da doença. O método compreende o contacto de um composto de teste com uma célula que compreende um ou mais vetores que dirigem a expressão de uma ou mais de uma enzima CRISPR, uma sequência guia ligada a uma sequência tracr mate, e uma sequência tracr; e detecção de uma alteração em um mostrador que é indicativo de uma redução ou um aumento de um evento de sinalização celular associado com, por exemplo, uma mutação no gene da doença contido na célula.

[0827] Um modelo de célula, incluindo um organoide ou coleção de células como descrito aqui, ou modelo animal pode ser construído em combinação com o método da invenção para o rastreio de uma alteração da função celular. Um tal modelo pode ser usado para estudar os efeitos de uma sequência de genoma modificada pelo complexo CRISPR da invenção em uma função celular de interesse. Por exemplo, um modelo de função celular pode ser utilizada para estudar o efeito de uma sequência de genoma modificada na sinalização intracelular ou sinalização extracelular. Em alternativa, um modelo de função celular pode ser usado para estudar os efeitos de uma sequência de genoma modificada na perceção sensorial. Em alguns de tais modelos, são modificadas uma ou mais sequências do genoma associadas a um processo bioquímico de sinalização no modelo.

[0828] Vários modelos da doença foram especificamente investigados. Estes incluem de novo genes de risco do autismo CHD8, KATNAL2, e SCN2A; e o gene UBE3A do autismo sindrômico (Síndrome de Angelman). Estes genes e modelos resultantes de autismo são preferenciais, mas servem para mostrar a ampla aplicabilidade da invenção através genes e modelos correspondentes.

[0829] Uma expressão alterada de uma ou mais sequências do genoma associadas a um processo bioquímico de sinalização pode ser determinada através de ensaio para uma diferença nos níveis de mRNA dos genes correspondentes entre a célula de modelo teste e uma célula de controle, quando são postos em contacto com um agente candidato. Alternativamente, a expressão diferencial das sequências associadas com um caminho bioquímico de sinalização é determinada através da detecção de uma diferença no nível do polipeptídeo codificado ou do produto do gene.

[0830] Para aferir quanto a uma alteração induzida por agente no nível de transcritos de mRNA ou polinucleotídeos correspondentes, o ácido nucleico contido em uma amostra é primeiro extraído de acordo com métodos convencionais na arte. Por exemplo, o mRNA pode ser isolado utilizando várias enzimas líticas ou soluções químicas de acordo com os procedimentos estabelecidos em Sambrook et al. (1989), ou extraído por resinas de ácidos nucleicos ligantes seguindo as instruções fornecidas pelos fabricantes. O mRNA contido na amostra de ácido nucleico extraída é então detectado através de procedimentos de amplificação ou ensaios de hibridação convencionais (por exemplo, análise de transferência de Northern) de acordo com os métodos amplamente conhecidos na arte ou baseados nos métodos aqui exemplificados.

[0831] Para efeitos da presente invenção, amplificação significa qualquer método que emprega um iniciador e uma polimerase capaz de replicar uma sequência alvo com uma fiabilidade razoável. A amplificação pode ser levada a cabo por polimerases de DNA naturais ou recombinantes, tais como TaqGold™, polimerase T7 DNA, fragmento Klenow de polimerase de DNA de E. coli, e transcriptase reversa. Um método de amplificação preferencial é PCR. Em particular, o RNA isolado pode ser submetido a um ensaio de transcrição reversa, que é acoplado com uma reação de cadeia de polimerase quantitativa (RT-PCR) para quantificar o nível de expressão de uma sequência associada com um caminho bioquímico de sinalização associado à expressão.

[0832] A detecção do nível de expressão do gene pode ser realizada em tempo real, em um ensaio de amplificação. Em um aspecto, os produtos amplificados podem ser visualizados diretamente com agentes de ligação de DNA fluorescente, incluindo mas não se limitando a intercaladores de DNA e ligantes do sulco do DNA. Uma vez que a quantidade dos intercaladores incorporados nas moléculas de DNA de cadeia dupla é tipicamente proporcional à quantidade dos produtos de DNA amplificados, pode-se convenientemente determinar a quantidade dos produtos amplificados pela quantificação da fluorescência do corante intercalado utilizando sistemas óticos convencionais na arte. O corante de ligação de DNA adequado para esta aplicação inclui verde SYBR, azul SYBR, DAPI, propídio iodado, Hoeste, ouro SYBR, brometo de etídio, acridinas, proflavina, laranja de acridina, acriflavina, fluorcoumanina, elipticina, daunomicina, cloroquina, distamicina D, cromomicina, homidium, mitramicina, rutênio polipiridilpaládio, antramicina, e semelhantes.

[0833] Em outro aspecto, outros marcadores fluorescentes, tais como sondas de sequências específicas podem ser empregues na reação de amplificação para facilitar a detecção e quantificação dos produtos amplificados. Amplificação quantitativa baseada em sondas baseia-se na detecção específica da sequência de um produto amplificado desejado. São utilizadas, sondas fluorescentes específicas para o alvo (por exemplo, sondas TaqMan®), resultando no aumento da especificidade e sensibilidade. Métodos para a realização de amplificação quantitativa à base de sondas estão bem estabelecidos na arte e são ensinados na Patente E.U.A. n° 5.210.015.

[0834] Em ainda outro aspecto, ensaios de hibridação convencionais, utilizando sondas de hibridação que partilham homologia de sequência com as sequências associadas com uma via bioquímica de sinalização, podem ser realizados. Tipicamente, é permitido que as sondas formem complexos estáveis com as sequências associadas com uma via bioquímica de sinalização contidas na amostra biológica obtida a partir do indivíduo teste em uma reação de hibridação. Será apreciado por um habilitado na arte que quando é usado antissenso como sonda de ácido nucleico, os polinucleotídeos alvo fornecidos na amostra são escolhidos para serem complementares com as sequências dos ácidos nucleicos antissenso. Por outro lado, onde a sonda de nucleotídeo é um ácido nucleico de senso, o polinucleotídeo alvo é selecionado para ser complementar às sequências do ácido nucleico senso.

[0835] A hibridação pode ser realizada sob condições de rigorosidade variada. As condições de hibridação adequadas para a prática da presente invenção são tais que a interação de reconhecimento entre a sonda e sequências associadas com uma via bioquímica de sinalização é ao mesmo tempo suficientemente específico e suficientemente estável. Condições que aumentam o rigor de uma reação de hibridação são amplamente conhecidas e publicadas na arte. Ver, por exemplo, (Sambrook, et al., (1989); Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual, Boehringer Mannheim, segunda edição). O ensaio de hibridação pode ser formado utilizando sondas imobilizadas em qualquer suporte sólido, incluindo mas não se limitado a nitrocelulose, vidro, silício, e uma variedade de matrizes de genes. Um ensaio de hibridação preferencial é conduzido em chips de genes de alta densidade tal como descrito na Patente E.U.A. No. 5.445.934.

[0836] Para uma detecção conveniente de complexos de sonda-alvo formados durante o ensaio de hibridação, as sondas de nucleotídeos são conjugados com um marcador detectável. Os marcadores detectáveis adequados para utilização na presente invenção incluem qualquer composição detectável por meios fotoquímicos, bioquímicos, espectroscópicos, imunoquímicos, eléctricos, óticos ou químicos. Uma grande variedade de marcadores detectáveis apropriados é conhecida na arte, que incluem os marcadores fluorescentes ou quimioluminescentes, marcadores isotópicos radioativos, enzimáticos ou outros ligandos. Em formas de realização preferenciais, será provável ser desejável empregar um marcador fluorescente ou uma etiqueta de enzima, tal como digoxigenina, β-galactosidase, urease, fosfatase alcalina ou peroxidase, complexo avidina/biotina.

[0837] Os métodos de detecção utilizados para detectar ou quantificar a intensidade de hibridação irá tipicamente depender da etiqueta selecionada acima. Por exemplo, marcadores radioativos podem ser detectados usando película fotográfica ou fosforoimagiologia. Os marcadores fluorescentes podem ser detectados e quantificados utilizando um fotodetector para detectar luz emitida. Marcadores enzimáticos são tipicamente detectados por fornecer a enzima com um substrato e medindo o produto de reação produzido pela ação da enzima sobre o substrato; e finalmente marcadores colorimétricos são detectados por simplesmente visualizar o marcador colorido.

[0838] Uma mudança induzida por agente na expressão de sequências associadas com uma via bioquímica de sinalização pode também ser determinada através da análise dos produtos dos genes correspondentes. A determinação do nível de proteína envolve tipicamente a) contacto da proteína contida em uma amostra biológica com um agente que se liga especificamente a uma proteína associada a uma via bioquímica de sinalização; e (b) identificar qualquer agente: complexo de proteínas assim formado. Em um aspecto desta forma de realização, o agente que se liga especificamente a uma proteína associada com uma via bioquímica de sinalização é um anticorpo, preferencialmente um anticorpo monoclonal.

[0839] A reação é realizada fazendo contactar o agente com uma amostra das proteínas associadas com uma via bioquímica de sinalização derivada a partir das amostras de teste sob condições que permitirão que um complexo se forme entre o agente e as proteínas associadas com uma via de sinalização bioquímica. A formação do complexo pode ser detectada diretamente ou indiretamente, de acordo com procedimentos padrão na arte. No método de detecção direta, os agentes são fornecidos com um marcador detectável e os agentes que não reagiram podem ser removidos a partir do complexo; a quantidade restante de marcador, assim, indica a quantidade de complexo formado. Por tal método, é preferível selecionar marcadores que permanecem aderidos aos agentes, mesmo durante condições de lavagem rigorosas. É preferível que o marcador não interfira com a reação de ligação. Em alternativa, um procedimento de detecção indireto pode usar um agente que contém um marcador introduzido quimicamente ou enzimaticamente. Um marcador desejável geralmente não interfere com a ligação ou a estabilidade do agente resultante: complexo polipeptídeo. No entanto, o marcador é tipicamente concebido para ser acessível a um anticorpo para uma ligação efetiva e, consequentemente, gerar um sinal detectável.

[0840] Uma ampla variedade de marcadores adequados para a detecção de níveis de proteína são conhecidos na técnica. Os exemplos não limitativos incluem radioisótopos, enzimas, metais coloidais, compostos fluorescentes, compostos bioluminescentes, e compostos quimioluminescentes.

[0841] A quantidade de agente: complexos de polipeptídeo formados durante a reação de ligação podem ser quantificados por ensaios quantitativos padrão. Como ilustrado acima, a formação do agente de: complexo de polipeptídeo pode ser medido diretamente com a quantidade de marcador retido no local da ligação. Em uma alternativa, a proteína associada com uma via bioquímica de sinalização é testada quanto à sua capacidade para competir com um análogo marcado para locais de ligação do agente específico. Neste ensaio competitivo, a quantidade de marcador capturado é inversamente proporcional à quantidade de sequências de proteínas associadas a uma via de sinalização bioquímica presente em uma amostra de teste.

[0842] Um número de técnicas para a análise de proteínas com base nos princípios gerais descritos acima estão disponíveis na arte. Eles incluem, mas não estão limitados a radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunossorvente ligado a enzima), imunoensaios de "sanduíche", ensaios imunorradiométricos, imunoensaios in situ (utilizando, por exemplo, ouro coloidal, marcadores enzimáticos ou radioisótopos), análise de transferência de Western, ensaios de imunoprecipitação, ensaios imunofluorescentes, e SDS-PAGE.

[0843] Os anticorpos que reconhecem especificamente ou se ligam a proteínas associadas com uma via bioquímica de sinalização são preferíveis para a realização das análises a proteínas acima mencionadas. Quando desejado, os anticorpos que reconhecem um tipo específico de modificações pós- translacionais (por exemplo, via de sinalização bioquímica de modificações induzíveis) podem ser usados. Modificações pós- translacionais incluem mas não estão limitados a glicosilação, lipidação, acetilação e fosforilação. Estes anticorpos podem ser adquiridos a partir de vendedores comerciais. Por exemplo, os anticorpos antifosfotirosina que reconhecem especificamente proteínas fosforiladas de tirosina estão disponíveis a partir de uma série de fabricantes, incluindo a Invitrogen e a Perkin Elmer. Os anticorpos antifosfotirosina são particularmente úteis na detecção de proteínas que são diferencialmente fosforiladas nos seus resíduos de tirosina em resposta a um stress de ER. Tais proteínas incluem, mas não estão limitadas a fator 2 alfa de iniciação da tradução eucariótica (eIF-2α). Alternativamente, estes anticorpos podem ser gerados utilizando tecnologias de anticorpos policlonais ou monoclonais convencionais através da imunização de um animal hospedeiro ou de uma célula produtora de anticorpos com uma proteína alvo que exibe a modificação pós-translacional desejada.

[0844] Na prática do método da presente invenção, pode ser desejável discernir o padrão da expressão de uma proteína associada com uma via bioquímica de sinalização em diferentes tecidos corporais, em diferentes tipos de células e/ou em diferentes estruturas subcelulares. Estes estudos podem ser realizados com a utilização de anticorpos específicos para cada tecido, específicos de células ou estrutura subcelular capazes de se ligarem a marcadores de proteínas que são expressos preferencialmente em determinados tecidos, tipos celulares ou estruturas subcelulares.

[0845] Uma expressão alterada de um gene associado com uma via bioquímica de sinalização pode também ser determinada por análise de uma alteração na atividade do produto do gene em relação a uma célula de controlo. O ensaio para uma mudança induzida por agente na atividade de uma proteína associada com uma via bioquímica de sinalização será dependente da atividade biológica e/ou a via de transdução de sinal que está sob investigação. Por exemplo, onde a proteína é uma quinase, uma alteração da sua capacidade para fosforilar o substrato(s) a jusante pode ser determinada por uma variedade de ensaios conhecidos na arte. Ensaios representativos incluem, mas não estão limitados a imunotransferência e imunoprecipitação com anticorpos, tais como anticorpos antifosfotirosina que reconhecem proteínas fosforiladas. Além disso, a atividade de quinase pode ser detectada por ensaios quimioluminescentes de alto rendimento tais como AlphaScreen™ (disponível na Perkin Elmer) e o ensaio eTag™ (Chan-Hui, et al. (2003) Clinical Immunology 111: 162-174).

[0846] Sempre que a proteína associada a uma sinalização de via bioquímica é parte de uma cascata de sinalização que conduz a uma condição de flutuação de pH intracelular, moléculas sensíveis ao pH, tais como corantes fluorescentes de pH podem ser usadas como as moléculas repórter. Em outro exemplo, onde a proteína associada a uma via bioquímica de sinalização é um canal de íons, as flutuações no potencial da membrana e/ou a concentração de íons intracelulares podem ser monitorizadas. Um número de kits comerciais e dispositivos de alto rendimento são particularmente adequados para uma triagem rápida e robusta para moduladores de canais de íons. Instrumentos representativos incluem FLIPRTM (Molecular Devices, Inc.) e VIPR (Aurora Biosciences). Estes instrumentos são capazes de detectar simultaneamente reações em mais de 1000 poços de amostras em uma microplaca, e proporcionando a medição em tempo real e dados funcionais dentro de um segundo ou mesmo um milissegundo.

[0847] Na prática de qualquer dos métodos aqui descritos, um vetor adequado pode ser introduzido em uma célula ou um embrião através de um ou mais métodos conhecidos na arte, incluindo, sem limitação, a microinjeção, eletroporação, sonoporação, biolística, transfecção mediada por fosfato de cálcio, transfecção catiónica, transfecção por lipossomos, transfecção por dendrímeros, transfecção por choque de calor, transfecção por nucleofecção, magnetofecção, lipofecção, impalefecção, transfecção ótica, a captação de ácidos nucleicos melhorada por agente de propriedade, e aplicação via lipossomos, imunolipossomos, virossomos, ou viriões artificiais. Em alguns métodos, o vetor é introduzido em um embrião por microinjeção. O vetor ou vetores podem ser microinjetados para dentro do núcleo ou no citoplasma do embrião. Em alguns métodos, o vetor ou vetores podem ser introduzidos em uma célula por nucleofecção.

[0848] O polinucleotídeo alvo de um complexo CRISPR pode ser qualquer polinucleotídeo endógeno ou exógeno à célula eucariótica. Por exemplo, o polinucleotídeo alvo pode ser um polinucleotídeo residindo no núcleo da célula eucariótica. O polinucleotídeo alvo pode ser uma sequência codificando um produto gênico (por exemplo, uma proteína) ou uma sequência não codificadora (por exemplo, um polinucleotídeo regulador ou um DNA lixo).

[0849] Exemplos de polinucleotídeos alvo incluem uma sequência associada a uma via bioquímica de sinalização, p.ex., gene ou polinucleotídeo associado a uma via bioquímica de sinalização. Exemplos de polinucleotídeos alvo incluem um gene ou polinucleotídeo associado a doença. Um gene ou polinucleotídeo “associado a doença” se refere a qualquer gene ou polinucleotídeo que é originando produtos de transcrição ou tradução a um nível anormal ou em uma forma anormal em células derivadas de um tecido afetado por doença em comparação com tecidos ou células de um controle sem doença. Pode ser um gene que se torna expresso a um nível anormalmente elevado; pode ser um gene que se torna expresso a um nível anormalmente baixo, onde a expressão alterada se correlaciona com a ocorrência e/ou progressão da doença. Um gene associado a doença se refere também a um gene possuindo mutação(ões) ou variação genética que são diretamente responsáveis ou estão em desequilíbrio de ligação com um gene(s) que é(são) responsável(eis) pela etiologia de uma doença. Os produtos transcritos ou traduzidos podem ser conhecidos ou desconhecidos, e podem estar a um nível normal ou anormal.

[0850] O polinucleotídeo alvo de um complexo CRISPR pode ser qualquer polinucleotídeo endógeno ou exógeno à célula eucariótica. Por exemplo, o polinucleotídeo alvo pode ser um polinucleotídeo residindo no núcleo da célula eucariótica. O polinucleotídeo alvo pode ser uma sequência codificando um produto de gene (p.ex., uma proteína) ou uma sequência não codificante (p.ex., um polinucleotídeo regulador ou um DNA lixo). Sem desejar estar limitado pela teoria se acredita que a sequência alvo deva estar associada a um PAM (motivo adjacente protoespaçador); isto é, uma curta sequência reconhecida pelo complexo CRISPR. A sequência precisa e requisites de comprimento para o PAM diferem dependendo da enzima CRISPR usada, mas os PAMs são tipicamente sequências com 2.5 pares de bases adjacentes o protoespaçador (isto é, a sequência alvo). Exemplos de sequências PAM são dadas na seção dos exemplos em baixo, e a pessoa perita será capaz de identificar sequências PAM adicionais para uso com uma dada enzima CRISPR.

[0851] O polinucleotídeo alvo de um complexo CRISPR pode incluir um número de genes e polinucleotídeos associados a doença bem como genes e polinucleotídeos associados à via bioquímica de sinalização como listados nos pedidos de patentes provisórias dos EUA 61/736,527 e 61/748,427 tendo a referência Broad BI-2011/008/WSGR No. de Registro do Procurador 44063-701.101 e BI-2011/008/WSGR No. de Registro do Procurador 44063-701.102 respectivamente, ambos intitulados SISTEMAS, MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA MANIPULAÇÃO DE SEQUÊNCIAS, depositados a 12 de dezembro, 2012 e 2 de janeiro, 2013, respectivamente, os conteúdos de todos os quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

[0852] Exemplos de polinucleotídeos alvo incluem uma sequência associada com uma via bioquímica de sinalização, por exemplo, um gene ou polinucleotídeo associado a via bioquímica de sinalização. Exemplos de polinucleotídeos alvo incluem um gene ou polinucleotídeo associados a uma doença. Um gene ou polinucleotídeo "associado à doença" refere-se a qualquer gene ou polinucleotídeo que está a produzir produtos de transcrição ou tradução a um nível anormal ou em uma forma anormal em células derivadas de um tecido afetado por doença, em comparação com os tecidos ou células de um controlo de não doença. Pode ser um gene que se expressa a um nível anormalmente elevado; pode ser um gene que se expressa a um nível anormalmente baixo, em que a expressão alterada se correlaciona com a ocorrência e/ou progressão da doença. Um gene associado à doença também refere-se a um gene possuindo a mutação(ções) ou a variação genética que é diretamente responsável ou está em desequilíbrio de ligação com um gene(s) que é responsável para a etiologia de uma doença. Os produtos transcritos ou traduzidos podem ser conhecidos ou desconhecidos, e pode ser a um nível normal ou anormal.

[0853] Exemplos de genes e polinucleotídeos associados à doença estão listados nas Tabelas A e B. A informação específica da doença está disponível em McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.) e National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.), disponíveis na World Wide Web. Exemplos de genes e polinucleotídeos associados com a via de sinalização bioquímica estão listados na Tabela C.

[0854] As mutações nestes genes e vias podem resultar na produção de proteínas de impróprias ou proteínas em quantidades inadequadas que afetam a função. Outros exemplos de genes, doenças e proteínas são aqui incorporados por referência a partir do pedido provisório US 61/736.527 apresentado a 12 de dezembro de 2012. Esses genes, proteínas e vias podem ser o polinucleotídeo alvo de um complexo CRISPR. Tabela A Tabela B: Tabela C:

[0855] As formas de realização da invenção também se relacionam com os métodos e composições relacionadas com a inativação de genes, amplificação de genes e reparação de mutações particulares associadas com a instabilidade da repetição de DNA e distúrbios neurológicos (Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, Segunda Edição, Academic Press, 13 de outubro de 2011 - Medical). Aspectos específicos das sequências de repetição em tandem foram encontrados como sendo responsáveis por mais de vinte doenças humanas (Novos conhecimentos sobre a instabilidade da repetição: papel dos híbridos RNA^DNA. McIvor EI, Polak U, Napierala M. RNA Biol. 2010 setembro- outubro; 7(5): 551-8). O sistema CRISPR-Cas pode ser aproveitado para corrigir esses defeitos de instabilidade genômica.

[0856] Outro método da invenção relaciona-se com a utilização do sistema CRISPR-Cas para corrigir defeitos nos genes EMP2A e EMP2B que foram identificados como estando associados com a doença de Lafora. Doença de Lafora é uma afecção autossômica recessiva que se caracteriza por epilepsia progressiva mioclonia que pode começar como convulsões epilépticas na adolescência. Em alguns casos a doença pode ser causada por mutações em genes ainda não identificados. A doença provoca convulsões, espasmos musculares, dificuldade para caminhar, demência e, eventualmente, a morte. Não há atualmente nenhuma terapia que tem se mostrado eficaz contra a progressão da doença. Outras anormalidades genéticas associadas à epilepsia também podem ser alvo do sistema CRISPR- Cas e a genética subjacente é descrita em Genetics of Epilepsy and Genetic Epilepsies, editado por Giuliano Avanzini, Jeffrey L. Noebels, Mariani Fundação Neurologia Pediátrica: 20; 2009).

[0857] Os métodos da Patente E.U.A. publicação No. 20110158957 atribuída a Sangamo Biosciences, Inc. envolvidos na inativação do receptor de células T (TCR) de genes podem também ser modificados para o sistema CRISPR-Cas da presente invenção. Em outro exemplo, os métodos da Patente E.U.A. publicação No. 20100311124 atribuída a Sangamo Biosciences, Inc., e Patente E.U.A. publicação No. 20110225664 atribuída a Cellectis, que estão ambos envolvidos na inativação de genes responsáveis pela expressão do gene da glutamina-sintetase também podem ser modificados para o sistema CRISPR-Cas da presente invenção.

[0858] Vários outros aspectos da invenção referem-se a corrigir defeitos associados com uma vasta gama de doenças genéticas que estão descritos no site do National Institutes of Health sob a subseção com o tópico Genetic Disorders (site em health.nih.gov/topic/GeneticDisorders). As doenças cerebrais genéticas podem incluir, mas não estão limitadas a adrenoleucodistrofia, Agenesia do Corpo Caloso, Síndrome de Aicardi, doença de Alpers, doença de Alzheimer, síndrome de Barth, Doença de Batten, CADASIL, Degeneração Cerebelar, doença de Fabry, Doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, Doença de Huntington e de outras afecções de repetições triplas, doença de Leigh, Síndrome de Lesch-Nyhan, doença de Menkes, miopatias mitocondriais e Colpocefalia NINDS. Estas doenças são ainda descritas no site do National Institutes of Health sob a subseção Genetic Brain Disorders.

[0859] Em algumas formas de realização, em que a afecção é neoplasia. Em algumas formas de realização, em que a afecção é neoplasia, os genes a serem marcados são quaisquer um dos listados na Tabela A (neste caso, PTEN e assim por diante). Em algumas formas de realização, a condição pode ser Degeneração Macular Relacionada com a Idade. Em algumas formas de realização, a condição pode ser Afecção Esquizofrênica. Em algumas formas de realização, a condição pode ser Afecção deRepetição de Trinucleotídeos. Em algumas formas de realização, a condição pode ser Síndrome do X Frágil. Em algumas formas de realização, a condição pode ser Afecção Relacionada com a Secretase. Em algumas formas de realização, a condição pode ser afecção relacionada com Prion. Em algumas formas de realização, a condição pode ser ALS. Em algumas formas de realização, a condição pode ser dependência de fármacos. Em algumas formas de realização, a condição pode ser Autismo. Em algumas formas de realização, a afecção pode ser Doença de Alzheimer. Em algumas formas de realização, a afecção pode ser Inflamação. Em algumas formas de realização, a afecção pode ser Doença de Parkinson.

[0860] Por exemplo, a Publicação da Patente dos EUA No. 20110023145, descreve a utilização de nucleases de dedos de zinco para modificar geneticamente células, animais e proteínas associadas com afecções do espectro do autismo (ASD). Afecções do espectro autista (ASDs) são um grupo de doenças caracterizadas pelo comprometimento qualitativo na interação social e comunicação, e padrões restritos de comportamento repetitivos e estereotipados, interesses e atividades. As três afecções, autismo, síndrome de Asperger (AS) e afecção invasiva do desenvolvimento não especificada (PDD-NOS) são uma continuação da mesma afecção com diferentes graus de severidade, funcionamento intelectual associado e condições médicas. ASDs são predominantemente distúrbios geneticamente determinados com uma herdabilidade de cerca de 90 %.

[0861] A patente dos EUA publicação No. 20110023145 compreende a edição de quaisquer sequências cromossômicas codificando proteínas associadas com ASD que podem ser aplicadas ao sistema CRISPR-Cas da presente invenção. As proteínas associadas com ASD são normalmente selecionadas com base em uma associação experimental da proteína associada com ASD a uma incidência ou uma indicação de uma ASD. Por exemplo, a taxa de produção ou a concentração circulante de uma proteína associada com ASD pode ser aumentada ou decrescida em uma população tendo uma ASD em relação a uma população sem ASD. Diferenças nos níveis de proteína podem ser medidas usando técnicas proteômicas incluindo mas não limitado a transferência de Western, a coloração imuno-histoquímica, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), e espetrometria de massa. Alternativamente, as proteínas associadas com ASD podem ser identificadas através da obtenção de perfis da expressão dos genes codificando as proteínas utilizando técnicas genômicas incluindo mas não se limitando a análise de microarranjo de DNA, a análise em série da expressão genética (SAGE), e reação em cadeia da polimerase quantitativo em tempo real (Q-PCR).

[0862] Exemplos não limitativos de estados de doenças ou afecções que podem ser associados com as proteínas associadas com ASD, incluem autismo, síndrome de Asperger (SA), afecção invasiva do desenvolvimento não especificada (PDD-NOS), síndrome de Rett, esclerose tuberosa, fenilcetonúria, síndrome de Smith-Lemli-Opitz e síndrome do X frágil. A título de exemplo não limitativo, proteínas associadas com ASD incluem, mas não estão limitadas às seguintes proteínas: ATP10C MET MET receptor de transporte de ATPase de tirosina quinase (ATP10C) BZRAP1 MGLUR5 (GRM5) Receptor 5 de glutamato metabotrópico (MGLUR5) CDH10 Caderina- 10 MGLUR6 (GRM6) Receptor 6 de glutamato metabotrópico (MGLUR6) CDH9 caderina-9 NLGN1 Neuroligina-1 CNTN4 Contactina- 4 NLGN2 neuroligina-2 CNTNAP2 contactina-associada SEMA5A neuroligina-3 semelhante a proteína 2 (CNTNAP2) DHCR7 7- dehidrocolesterol NLGN4X neuroligina-4 X-redutase (DHCR7) ligada DOC2A domínio semelhante Duplo C2- NLGN4Y neuroligina- 4 contendo Y- alfa proteína ligada DPP6 dipeptidil NLGN5 neuroligina-5 proteína semelhante aminopeptidase 6 EN2 2 (EN2) NRCAM molécula de adesão celular Neuronal (NRCAM) MDGA2 X frágil retardo mental NRXN1 Neurexin-1 1 (MDGA2) FMR2 (AFF2) AF4/FMR2 membro da família 2 OR4M2 receptor olfativo (AFF2) 4M2 FOXP2 receptor caixa forkhead P2 OR4N4 receptor Olfativo (FOXP2) 4N4 FXR1 receptor de oxitocina Frágil X de retardo mental OXTR, homólogo 1 autossômico (OXTR) (FXR1) FXR2 Frágil X de retardo mental fenilalanina PAH, hidroxilase autossômica (PAH ) homólogo 2 (FXR2) GABRA1 ácido gama-aminobutírico fosfatase PTEN e subunidade de receptor alfa-1 tensina homólogo (GABRA1) (PTEN) GABRA5 GABAA (gama-aminobutírico PTPRZ1 ácido tipo receptor) 5 subunidade alfa do receptor de tirosina-proteína (GABRA5 ) fosfatase zeta (PTPRZ1) GABRB1 gama-aminobutírico RELN ácido Reelin.beta.3 proteína de subunidade L10 (GABRB3) GABRG1 ácido gama-aminobutírico subunidade do receptor (GABRB1) GABRB3 GABAA (60S RPL10 gama- aminobutírico ácido ribossômico) receptor beta 3 SEMA5A Semaforina-5A subunidade do receptor gama-1 (SEMA5A) (GABRG1) HIRIP3 HIRA-interagindo proteína 3 SEZ6L2 apreensão relacionada 6 homólogo (rato)- semelhante a proteína 2Homeobox HOXA1 Hox-A1 SHANK3 SH3 e múltiplas (HOXA1) anquirina repetição domínios 3 (SHANK3) IL6 Interleucina-6 SHBZRAP1 SH3 e múltipla repetição anquirina domínios 3 (SHBZRAP1) LAMB1 Laminina subunidade beta-1 SLC6A4 serotonina (LAMB1) transportador (SERT) proteína MAPK3 Mitogen-ativado TAS2R1 Taste receptor quinase 3 Tipo 2 membros 1 TAS2R1 MAZ Mic- associado dedo zinco TSC1 esclerose tuberosa proteína proteína 1 do domínio contendo TSC2 esclerose tuberosa proteína glicosilfosfatidilinositol 2 âncora (MDGA2) MECP2 ligação (MDGA2) MECP2 Metil CpG proteína proteína ubiquitina UBE3A 2 ligação (MECP2) ligase E3A (UBE3A) MECP2 metil CpG WNT2 Wingless tipo de proteína 2 integração local família (MECP2) MMTV, membro 2 (WNT2)

[0863] A identidade da proteína associada com ASD cuja sequência cromossômica é editada pode e irá variar. Em formas de realização preferenciais, as proteínas associadas com ASD cuja sequência cromossômica é editada pode ser o receptor de benzodiazepina (periférico) proteína 1 associada (BZRAP1) codificada pelo gene BZRAP1, o membro 2 da família de proteínas AF4/FMR2 (AFF2) codificada pelo gene AFF2 (também denominado MFR2), a proteína 1 homóloga autossômica do retardo mental do X frágil (FXR1) codificada pelo gene FXR1, a proteína 2 homóloga autossômica de retardo mental do X frágil (FXR2) codificada pelo gene FXR2, o domínio de MAM contendo a proteína 2 com âncora de glicosilfosfatidilinositol (MDGA2) codificada pelo gene MDGA2, a proteína 2 de ligação CpG metila (MECP2) codificada pelo gene MECP2, o receptor 5 de glutamato metabotrico (MGLUR5) codificado pelo gene MGLUR5-1 (também denominado GRM5), a proteína 1 neurexina codificada pelo gene NRXN1, ou a proteína semaforina-5A (SEMA5A) codificada pelo gene SEMA5A. Em uma forma de realização exemplar, o animal geneticamente modificado é um rato, e a sequência cromossômica editada codificando a proteína associada com ASD é como listado abaixo: Receptor XM_002727789 de benzodiazapina BZRAP1, (periférico) associado a XM_213427, proteína 1 (BZRAP1) XM_002724533, membro 2 XM_219832 da família XM_001081125, AFF2 (FMR2) AF4/FMR2, (AFF2) XM_001054673 FXR1 retardo mental NM_001012179 do X frágil, homôlogo autossômico 1 (FXR1) FXR2 do retardo mental NM_001100647 do X frágil, domínio homôlogo autossômico 2 (FXR2) MDGA2 MAM contendo NM_199269 glicosilfosfatidilinositol de âncora 2 (MDGA2) MECP2 Metila CpG ligando NM_022673 proteína 2 (MECP2) MGLUR5 glutamato metabotrópico NM_017012 (GRM5) receptor 5 (MGLUR5) NRXN1 Neurexina-1 NM_021767 SEMA5A Semaforina-5A (SEMA5A) NM_001107659

[0864] Exemplos de animais ou células podem compreender um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou mais sequências cromossômicas inativadas codificando uma proteína associada com ASD, e zero, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou mais sequências cromossomicamente integradas codificando proteínas associadas com ASD. A sequência cromossômica editada ou integrada pode ser modificada para codificar uma proteína alterada associada com ASD. Exemplos de mutações não limitativos em proteínas associadas com ASD incluem a mutação L18Q em neurexina 1 onde a leucina na posição 18 é substituída com uma glutamina, a mutação R451C na neuroligina 3 onde a arginina na posição 451 é substituída por uma cisteína, a mutação R87W na neuroligina 4, onde a arginina na posição 87 é substituída com um triptofano, e a mutação I425V no transportador da serotonina, onde a isoleucina na posição 425 é substituída por uma valina. Um número de outras mutações e rearranjos cromossômicos em sequências cromossômicas relacionadas com ASD têm sido associados com ASD e são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Freitag et al. (2010) Eur. Child. Adolesc. Psychiatry 19:169178, e Bucan et al. (2009) PLoS Genetics 5: e1000536, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[0865] Os exemplos de proteínas associadas com a doença de Parkinson incluem, mas não estão limitados a α- sinucleína, DJ-1, LRRK2, PINK1, Parkin, UCHL1, Synphilin-1, e NURR1.

[0866] Os exemplos de proteínas relacionadas com a dependência podem incluir ABAT por exemplo.

[0867] Os exemplos de proteínas relacionadas com a inflamação podem incluir a proteína quimiotática de monócitos- 1 (MCP1) codificada pelo gene Ccr2, o receptor tipo 5 de quimiocina C-C (CCR5) codificado pelo gene CCR5, o receptor IIB de IgG (FCGR2b, também denominado CD32) codificado pelo gene Fcgr2b, ou proteína R1g (FCER1g) Fc epsilon codificada pelo gene Fcer1g, por exemplo.

[0868] Exemplos de proteínas associadas a doenças cardiovasculares podem incluir IL1B (interleucina-1, beta), XDH (xantina desidrogenase), TP53 (proteína p53 tumor), PTGIS (prostaglandina I2 (prostaciclina) sintase), MB (mioglobina), IL4 (interleucina 4), ANGPT1 (angiopoietina 1), ABCG8 (cassete de ligação ATP, subfamília G (WHITE), membro 8), ou CTSK (catepsina K), por exemplo.

[0869] Por exemplo, a Patente dos EUA Publicação No. 20110023153, descreve a utilização de nucleases de dedos de zinco para modificar geneticamente células, animais e proteínas associadas com a doença de Alzheimer. Uma vez que as células e os animais modificados podem ainda ser testados usando métodos conhecidos para estudar os efeitos das mutações direcionadas sobre o desenvolvimento e/ou a progressão da DA utilizando medidas normalmente utilizadas no estudo da AD - tais como, sem limitação, aprendizagem e memória, ansiedade, depressão, dependência e funções motoras sensoriais, bem como ensaios que medem a função comportamental, funcional, patológica, metabólica e bioquímica.

[0870] A presente divulgação compreende a edição de quaisquer sequências cromossômicas codificando proteínas associadas com a DA. As proteínas relacionadas com AD são normalmente selecionadas com base em uma associação experimental da proteína relacionada com a AD a um distúrbio AD. Por exemplo, a taxa de produção ou a concentração circulante de uma proteína associada com DA pode ser aumentada ou decrescida em uma população tendo uma doença DA em relação a uma população sem DA. Diferenças nos níveis de proteína podem ser medidos usando técnicas proteômicas incluindo mas não limitado a transferência de Western, a coloração imuno- histoquímica, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), e espetrometria de massa. Alternativamente, as proteínas associadas com DA podem ser identificadas através da obtenção de perfis da expressão dos genes codificando as proteínas utilizando técnicas genômicas incluindo mas não se limitando a análise de microarranjo de DNA, a análise em série da expressão genética (SAGE), e reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (Q-PCR).

[0871] Os exemplos de proteínas associadas a doença de Alzheimer podem incluir a proteína do receptor de lipoproteína de muito baixa densidade (VLDLR) codificada pelo gene de VLDLR, a enzima de ativação modificadora de semelhante a ubiquitina 1 (UBA1) codificada pelo gene UBA1, ou a enzima ativadora de NEDD8 proteína E1 subunidade catalítica (UBE1C) codificada pelo gene UBA3, por exemplo.

[0872] A título de exemplo não limitativo, proteínas associadas com DA incluem, mas não estão limitadas às seguintes proteínas como se segue: Proteína ALAS2 Delta-aminolevulinato sintase 2 codificada pela sequência cromossômica (ALAS2) Enzima ACE angiotensina I-conversora (ACE) ABCA1 ATP-ligante cassete transportadora APOE apolipoproteína E precursor (APOE) proteína APP precursora de amiloide (APP) AQP1 proteína aquaporina 1 (AQP1) proteína 1 BIN1 Mic interação-dependente- caixa ou proteína ponte integrador 1 (BIN1) BDNF fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) BTNL8 proteína 8 semelhante a Butirofilina (BTNL8) C1ORF49 cromossomo 1 grelha de leitura aberta 49 CDH4 Caderina-4 CHRNB2 subunidade beta-2 do receptor Neuronal acetilcolina CKLFSF2 semelhante a CKLF da proteína 2 contendo o domínio transmembranar MARVEL (CKLFSF2) CLEC4E C-tipo do domínio lectina família 4, membro e (CLEC4E) proteína clusterina CLU (também conhecida como apoplipoproteína J) receptor 1 de complemento eritrócito CR1 (CR1, também conhecido como CD35, receptor C3b/C4b e receptor de adesão imunológica) receptor 1 de complemento CR1L eritrócito (CR1L) CSF3R receptor do fator 3 estimulante de colônias de granulócitos (CSF3R) CST3 Cistatina C ou cistatina CYP2C citocromo P450 2C DAPK1 proteína quinase 1 associada à morte (DAPK1) receptor IgA do fragmento FCAR Fc receptor 1 de estrogênio ESR1 1 (FCAR, também conhecido como CD89) fragmento FCGR3B Fc de IgG, baixa afinidade IIIb, receptor (FCGR3B ou CD16b) FFA2 receptor 2 de ácidos graxos livres (FFA2) FGA fibrinogênio (Fator I) proteína 2 de ligação associada a GAB2 GRB2 (GAB2) proteína 2 de ligação associada a GAB2 GRB2 (GAB2) desidrogenase gliceraldeído-3-fosfato GAPDHS péptido semelhante a galanina GALP, espermatogênico (GAPDHS) GMPB GMBP haptoglobina HP (HP) HTR7 5-hidroxitriptamina (serotonina) do receptor 7 (adenilato ciclase-acoplado) enzima de degradação da insulina IDE IF127 IF127 IFI6 Interferão, proteína 6 alfa- indutível 6 (IFI6) IFIT2 proteína induzida por interferão com tetratricopeptídeo repetições 2 (IFIT2) Receptor antagonista de interleucina-1 IL1RN (IL-1RA) receptor Interleucina 8 IL8rA, alfa (IL8rA ou CD181) receptor Interleucina 8 IL8RB, canal beta (IL8RB) JAG1 Jagged 1 (JAG1) KCNJ15 de retificação de potássio para o interior, subfamília J, membro 15 (KCNJ15) da proteína 6 relacionada com o receptor de LRP6 lipoproteína de baixa densidade (LRP6) MAPT proteína tau associada a microtúbulos (MAPT) MAP quinase 4 de regulação de afinidade ark4/microtúbulos (MARK4) MPHOSPH1 M-fase fosfoproteína 1 MTHFR redutase 5,10-metilenotetrahidrofolato MX2 proteína de ligação GTP de ligação GTP induzida por interferão Mx2 NBN Nibrina, também conhecida como receptor 2 Niacina NBN NCSTN Nicastrina NIACR2 (NIACR2, também conhecido como GPR109B) NMNAT3 adeniltransferasa 3 nucleotídeo nicotinamida NTM neurotrimina (ou HNT) ORM1 Orosmucoide 1 (ORM1) ou de alfa-1- ácido glicoproteína 1 P2RY13 P2Y purinoceptor 13 (P2RY13) PBEF1 fosforibosiltransferase Nicotinamida NAmPRTase ou Nampt) também conhecido como fator 1 de melhoria de colônia de células pré-B (PBEF1) ou visfatina pCK1 Fosfoenolpiruvato carboxicinase PICALM proteína de montagem da clatrina de ligação a fosfatidilinositol (PICALM) PLAU ativador plasminogênio do tipo uroquinase (PLAU) PLXNC1 plexina C1 (PLXNC1) PRNP proteína presenilina 1 PSEN1 de príon (PSEN1) PSEN2 proteína presenilina 2 (PSEN2) PTPRA proteína tipo A do receptor fosfatase tirosina (PTPRA) RALGPS2 Ral GEF com o domínio PH e SH3 motivo 2 de ligação (RALGPS2) RGSL2 regulador de sinalização da proteína G semelhante 2 (RGSL2) SELENBP1 proteína 1 de ligação a selênio (SELNBP1) SLC25A37 Mitoferrina-1 SORL1 receptor L relacionado com sortilina (classe DLR) proteína contendo repetições (SORL1) TF Transferrina TFAM fator A de transcrição mitocondrial TNF fator de necrose tumoral TNFRSF10C receptor do fator de necrose tumoral da superfamília membro 10C (TNFRSF10C) TNFSF10 superfamília do receptor do fator de necrose tumoral, (TRAIL) membro 10a (TNFSF10) UBA1 enzima 1 ativadora modificadora semelhante a ubiquitina (UBA1) UBA3 subunidade proteína catalítica enzima E1 ativadora NEDD8 (UBE1C) UBB proteína ubiquitina B (UBB) UBQLN1 Ubiquitina-1 UCHL1 proteína esterase L1 terminal carboxilo ubiquitina (UCHL1) UCHL3 proteína L3 isoenzima hidrolase terminal carboxilo ubiquitina (UCHL3) VLDLR receptor de proteína lipoproteína de muito baixa baixa densidade (VLDLR)

[0873] Em formas de realização exemplificativas, as proteínas associadas a DA cuja sequência cromossômica é editada pode ser a proteína do receptora de lipoproteína de muito baixa densidade (VLDLR) codificada pelo gene de VLDLR, enzima de ativação modificadora semelhante a ubiquitina 1 (UBA1) codificada pelo gene UBA1, a subunidade da proteína catalítica E1 da enzima ativadora NEDD8 (UBE1C) codificada pelo gene UBA3, a proteína 1 aquaporina (AQP1) codificada pelo gene AQP1, a proteína L1esterase do terminal carboxilo ubiquitina (UCHL1) codificada pelo gene UCHL1, a proteína L3 da isoenzima hidrolase terminal carboxilo ubiquitina (UCHL3) codificada pelo gene UCHL3, a proteína ubiquitina B (UBB) codificada pelo gene UBB, a proteína tau associada a microtúbulos (MAPT) codificada pelo gene MAPT, a proteína tipo A do receptor tirosina-fosfatase (PTPRA) codificada pelo gene PTPRA, a proteína de montagem da clatrina ligante a fosfatidilinositol (PICALM) codificada pelo gene PICALM, a proteína clusterina (também conhecida como apoplipoproteina J) codificada pelo gene CLU, a proteína presenilina 1 codificada por o gene PSEN1, a proteína presenilina 2 codificada pelo gene PSEN2, o receptor relacionado com sortilina (classe DLR) proteína contendo repetições A (SORL1) codificada pelo gene SORL1, a proteína precursora de amiloide (APP) codificada pelo gene APP, o precursor de apolipoproteína E (APOE), codificado pelo gene ApoE, ou o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), codificado pelo gene BDNF. em uma forma de realização exemplar, o animal geneticamente modificado é um rato, e a sequência cromossômica editada codificando a proteína associada com ASD é como listada abaixo: APP proteína precursora de amiloide (APP) NM_019288 AQP1 proteína aquaporina 1 (AQP1) NM_012778 BDNF fator neurotrófico derivado do cérebro NM_012513 CLU proteína clusterina (também conhecida como NM_053021 apoplipoproteína J) MAPT NM_017212 proteína tau associada a microtúbulos (MAPT) PICALM proteína de montagem clatrina NM_053554 ligante a fosfatidilinositol (PICALM) proteína presenilina 1 PSEN1 (PSEN1) NM_019163 PSEN2 proteína presenilina 2 (PSEN2) NM_031087 PTPRA proteína tirosina fosfatase NM_012763 proteína receptor tipo A (PTPRA) SORL1 receptor L relacionado com sortilina (DLR NM_053519, classe) proteína contendo repetições A XM_001065506 (SORL1) XM_217115 UBA1 ativadora modificadora semelhante a ubiquitina NM_001014080 enzima 1 (UBA1) UBA3 enzima ativadora NEDD8 E1 NM_057205 proteína de subunidade catalítica (UBE1C) UBB proteína ubiquitina B (UBB) NM_138895 UCHL1 ubiquitina carboxi-terminal NM_017237 proteína esterase L1 (UCHL1) UCHL3 ubiquitina carboxi-terminal NM_001110165 proteína hidrolase isoenzima L3 (UCHL3) VLDLR lipoproteína de muito baixa densidade NM_013155 receptor proteína (VLDLR)

[0874] O animal ou célula pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais sequências cromossômicas disruptivas codificando uma proteína associada com a DA e zero, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais sequências cromossômicas integradas codificando uma proteína associada com DA.

[0875] A sequência cromossômica editada ou integrada pode ser modificada para codificar uma proteína alterada associada com ASD. Um número de mutações em sequências cromossômicas relacionadas com DA tem sido associado com DA. Por exemplo, a mutação sem senso V7171 (isto é, a valina na posição 717 é alterada para isoleucina) na APP causa DA familiar. Múltiplas mutações na proteína presenilina-1, tais como H163R (isto é, a histidina na posição 163 é alterada para arginina), A246E (isto é, alanina na posição 246 é alterada para glutamato), L286V (isto é, a leucina na posição 286 é alterada para valina) e C410Y (ou seja, cisteína na posição 410 é alterada para tirosina) causam Alzheimer familiar de tipo 3. As mutações na proteína presenilina-2, tais como N141 I (isto é, a asparagina na posição 141 é alterada para isoleucina), M239V (isto é, a metionina na posição 239 é alterada de valina), e D439A (isto é, o aspartato na posição 439 é alterada para alanina) causam Alzheimer familiar tipo 4. Outras associações de variantes genéticas em genes associados a DA e doença são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Waring et al. (2008) Arch. Neurol. 65:329-334, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[0876] Os exemplos de proteínas associadas à Afecção do Espectro do Autismo podem incluir a proteína associada ao receptor de benzodiazepina (periférico) (BZRAP1) codificada pelo gene BZRAP1, proteína do membro 2 da família AF4 2/FMR2 (AFF2) codificada pelo gene AFF2 (também denominado MFR2), a proteína 1 homóloga autossômica de retardo mental do X frágil (FXR1) codificada pelo gene FXR1, ou a proteína 2 homóloga autossômica de retardo mental do X frágil (FXR2) codificada pelo gene FXR2, por exemplo.

[0877] Os exemplos de proteínas associadas a Degeneração Macular podem incluir o cassete de ligação de ATP, a proteína da subfamília A (ABC1) membro 4 (ABCA4) codificada pelo gene ABCR, a proteína apolipoproteína E (APOE), codificada pelo gene da APOE, ou a proteína ligando 2 quimioquina (motivo C-C) (CCL2) codificada pelo gene CCL2, por exemplo.

[0878] Os exemplos de proteínas associadas a esquizofrenia podem incluir NRG1, ErbB4, CPLX1, TPH1, TPH2, NRXN1, GSK3A, BDNF, Disc1, GSK3B, e suas combinações.

[0879] Os exemplos de proteínas envolvidas na supressão tumoral podem incluir ATM (ataxia telangiectasia mutada), a ATR (ataxia telangiectasia e Rad3 relacionados), EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico), ERBB2 (v- erb-b2 oncogene homólogo 2 da leucemia eritroblástica viral), ERBB3 (v-erb-b2 oncogene homólogo 3 da leucemia eritroblástica viral), ERBB4 (v-erb-b2 oncogene homólogo 4 da leucemia eritroblástica viral), Notch 1, Notch2, Notch 3, ou Notch 4, por exemplo.

[0880] Os exemplos de proteínas associadas com uma afecção secretase podem incluir PSENEN (homólogo 2 intensificador presenilina (C. elegans)), CTSB (catepsina B), PSEN1 (presenilina 1), APP (proteína precursora beta amiloide (A4)), APH1B (homólogo B defeituoso faringe anterior (C. elegans)), PSEN2 (presenilina 2 (doença de Alzheimer 4)), ou BACE1 (enzima 1 de clivagem de APP de local beta), por exemplo.

[0881] Por Exemplo, O Pedido Da Patente E.U.A. No. 20110023146, Descreve O Uso De Nucleases De Impressão Digital De Zinco Às Células Modificadas Geneticamente, Animais E Proteínas Associados Com A Doença Cardiovascular. Secretases São Essenciais Para O Processamento De Pré-proteínas Nas Suas Formas Biologicamente Ativas. Defeitos Em Vários Componentes Das Vias Secretase Contribuem Para Muitas Doenças, Especialmente Aquelas Com Indicação De Amiloidogenese Ou Placas Amiloides, Tal Como A Doença De Alzheimer (Da).

[0882] Uma afecção da secretase e as proteínas associadas a estas afecções são um conjunto diverso de proteínas que têm efeito na suscetibilidade para numerosas afecções, a presença da afecção, a gravidade da afecção, ou qualquer combinação dos mesmos. A presente invenção compreende a edição de quaisquer sequências cromossômicas codificando proteínas associadas com a DA. As proteínas associadas com um distúrbio da secretase são tipicamente selecionadas com base em uma associação experimental das proteínas associadas com a secretase com o desenvolvimento do distúrbio da secretase. Por exemplo, a taxa de produção ou a concentração circulante de uma proteína associada com um distúrbio da secretase pode ser aumentada ou decrescida em uma população tendo um distúrbio da secretase em relação a uma população sem distúrbio da secretase. Diferenças nos níveis de proteína podem ser medidos usando técnicas proteômicas incluindo mas não limitado a transferência de Western, a coloração imuno-histoquímica, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), e espetrometria de massa. Alternativamente, a proteína associada com distúrbio da secretase podem ser identificadas através da obtenção de perfis da expressão dos genes que codificam as proteínas utilizando técnicas genômicas incluindo mas não se limitando a análise de microarranjo de DNA, a análise em série da expressão genética (SAGE), e reação em cadeia da polimerase quantitativo em tempo real (Q-PCR).

[0883] A título de exemplo não limitativo, proteínas associadas com um distúrbio da secretase incluem PSENEN (homólogos presenilina 2 intensificador (C. elegans)), CTSB (catepsina B), PSEN1 (presenilina 1), APP (beta amiloide (A4) proteína precursora), APH1B (homólogo B faringe anterior defeituoso 1 (C. elegans)), PSEN2 (presenilina 2 (doença de Alzheimer 4)), BACE1 (enzima 1 beta-local APP-clivagem), ITM2B (proteína 2B de membrana integral), CTSD (catepsina D), NOTCH1 (homólogo Notch 1, associado a translocação (Drosophila)), TNF (fator de necrose tumoral (TNF superfamília, membro 2)), INS (insulina), DYT10 (distonia 10), ADAM17 (domínio 17 metalopeptidase ADAM), APOE (apolipoproteína E), ACE (enzima conversora de angiotensina I (peptidil-dipeptidase A) 1), STN (estatina), TP53 (proteína p53 tumor), IL6 (interleucina 6 (interferon, beta 2)), NGFR (receptor do fator de crescimento do nervo (TNFR superfamília, membro 16)), IL1B (interleucina- 1, beta), ACHE (acetilcolinesterase (grupo Yt sangue)), CTNNB1 (catenina (proteína associada a caderina), beta 1, 88kDa), IGF1 (fator 1 de crescimento semelhante a insulina (somatomedina C)), IFNG (interferon, gama), NRG1 (neuregulina 1), CASP3 (caspase 3, peptidase de cisteína relacionada com a apoptose), MAPK1 (proteína quinase 1 ativada por mitógeno), CDH1 (1 caderina, tipo 1, a E-caderina (epitelial)), APBB1 (proteína de ligação precursora de beta amiloide (A4), família B, membro 1 (Fe65)), HMGCR (3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A redutase), CREB1 (proteína 1 de ligação cAMP elemento de resposta a), PTGS2 (sintase 2 prostaglandina-endoperóxido (prostaglandina G/H sintase e ciclooxigenase)), HES1 (potenciador da divisão 1, (Drosophila)), CAT (catalase), TGFB1 (fator de transformação crescimento, beta 1), ENO2 (enolase 2 (gama, neuronal)), ERBB4 (v-erb-a homólogo 4 oncogene leucemia eritroblástica viral (aviária)), TRAPPC10 (tráfico de partículas de proteína complexa 10), MAOB (monoamina oxidase B), (fator de crescimento do nervo (polipeptídeo beta)), MMP12 (matriz metalopeptidase 12 (elastase de macrófagos)), JAG1 (1 denteado (síndrome de Alagille)), CD40LG (ligando de CD40), PPARg (receptor gama ativado pelo proliferador de peroxissoma), FGF2 (fator de crescimento de fibroblastos 2 (básico)), IL3 (interleucina 3 (fator estimulante de colônias, múltiplos)), LRP1 (proteína relacionada com receptor de lipoproteína de baixa densidade 1), NOTCH4 (Notch homólogo 4 (Drosophila)), MAPK8 (proteína quinase 8 ativada mitógeno), PREP (prolil endopeptidase), NOTCH3 (Notch homólogo 3 (Drosophila)), RPPN (proteína prion), CTSG (catepsina G), EGF (fator de crescimento epidérmico (beta-urogastrona)), REN (renina), CD44 (molécula CD44 (grupo sangue Índia)), SELP (selectina P (proteína da membrana do grânulo de 140 kDa, antígeno CD62)), GHR (receptor da hormona de crescimento), ADCYAP1 (polipeptídeo 1 ativador adenilato ciclase (hipófise)), INSR (receptor insulina), GFAP (proteína ácida fibrilar glial), MMP3 (matriz metalopeptidase 3 (estromelisina 1, progelatinase)), MAPK10 (proteína quinase 10 ativada por mitogénio), SP1 (fator de transcrição Sp1), MYC (homólogo do oncogene mielocitomatose v-myc viral (aviária)), CTSE (catepsina E), PPARA (receptor alfa peroxissoma proliferador ativado), JUN (oncogene jun), TIMP1 (TIMP inibidor 1 metalopeptidase), IL5 (interleucina 5 (fator estimulante de colônias, eosinófilos)), IL1A (interleucina 1, alfa), MMP9 (metalopeptidase de matriz 9 (gelatinase B, gelatinase de 92 kDa, colagenase de tipo IV de 92 kDa )), HTR4 (5-hidroxitriptamina (serotonina) do receptor 4), HSPG2 (sulfato de heparano proteoglicano 2), KRAS (v-Ki-ras2 homólogo oncogene Kirsten sarcoma de rato viral), CYCS (citocromo c, somático), SMG1 (SMG1 homólogo, quinase relacionada com 3-quinase fosfatidilinositol (C. elegans)), IL1R1 (receptor interleucina 1, tipo I), PROK1 (procineticina 1), MAPK3 (proteína quinase 3 ativada por mitógeno), NTRK1 (quinase tirosina neurotrófica, receptor, tipo 1), IL13 (interleucina 13), MME (membrana metalo-endopeptidase), TKT (transcetolase), CXCR2 (quimioquina (motivo C-X-C) do receptor 2), IGF1R (receptor 1 do fator de crescimento semelhante), RARA (receptor do ácido retinóico, alfa), CREBBP (proteína de ligação a CREB), PTGS1 (prostaglandina-endoperóxido sintase 1 (prostaglandina G/H sintetase e ciclooxigenase)), GALT (galactose-1-fosfato uridililtransferase), CHRM1 (receptor colinérgico, muscarínico 1), ATXN1 (ataxina 1), PAWR (PRKC, apoptose, WT1, regulador), NOTCH2 (homólogo 2 Notch (Drosophila)), M6PR (receptor de manose-6-fosfato (dependente de cations)), CYP46A1 (citocromo P450, família 46, subfamília A, polipeptídeo 1), CSNK1 D (caseína quinase 1, delta), MAPK14 (proteína quinase 14 ativada por mitógeno), PRG2 (proteoglicano 2, medula óssea (ativador de células exterminadoras naturais, principal proteína de grânulos dos eosinófilos básica)), PRKCA (proteína quinase C, alfa), L1 CAM (L1 molécula de adesão celular), CD40 (molécula CD40, TNF receptor membro da superfamília 5), NR1I2 (subfamília 1 de receptores nucleares, grupo I, membro 2), JAG2 (irregular 2), CTNND1 (catenina (proteína associada a caderina), delta 1), CDH2 (caderina 2, tipo 1, N-caderina (neuronal)), CMA1 (quimase 1, mastócitos), SORT1 (sortilina 1), DLK1 (homólogo 1 semelhante a delta (Drosophila)), THEM4 (membro 4 da superfamília tioesterase), JUP (junção placoglobina), CD46 (molécula CD46, proteína reguladora complementar), CCL11 (quimiocina (CC motivo) ligando 11), CAV3 (caveolina 3), RNASE3 (ribonuclease, RNase A família, 3 (proteína catiônica eosinofílica)), HSPA8 (70kDa proteína 8 choque por calor), CASP9 (caspase 9, peptidase cisteína relacionada com a apoptose), CYP3A4 (citocromo P450, família 3, da subfamília A, polipeptídeo 4), CCR3 (quimiocina (motivo C-C) receptor 3), TFAP2A (fator de transcrição AP-2 alfa (proteína alfa 2 intensificadora de ativação de ligação)), SCP2 (proteína 2 ransportadora esterol), CDK4 (quinase 4 dependente de ciclina), HIF1A (fator 1 hipóxia induzível, subunidade alfa (fator de transcrição básico helix-ansa-helix)), TCF7L2 fator de transcrição 7(células T especificas, HMG-box), IL1R2 (receptor interleucina 1, tipo II), B3GALTL (beta 1,3- galactosil-transferase), MDM2 (p53 Mdm2 homólogo de proteína de ligação (camundongo)), RELA (homólogo A oncogene v-rel reticuloendoteliose viral (aviária)), CASP7 (caspase 7, peptidase de cisteína relacionadas com a apoptose), IDE (enzima degradante de insulina), FABP4 (proteína de 4 de ligação a ácidos gordos, adipócitos), CASK (cálcio/dependente de calmodulina proteína quinase serina (família MAGUK)), ADCYAP1R1 (adenilato ciclase ativando polipeptídeo 1 (hipófise) do receptor de tipo I), ATF4 (fator 4 ativador de transcrição (elemento B67 potenciador tax-responsiva)), PDGFA (polipeptídeo alfa fator de crescimento derivado de plaquetas), C21 ou f33 (grelha de leitura aberta 33 cromossomo 21), SCG5 (secretogranina V (proteína 7B2)), RNF123 (proteína anel 123), NFKB1 (fator nuclear do fator kappa leve do polipeptídeo potenciador de gene em células B ), ERBB2 (homologo 2 do oncogene v-erb-b2 eritroblástico de leucemia viral, neuro/glioblastoma derivado do oncogene homólogo (aviária)), CAV1 (caveolina 1, proteína caveolae, 22 kDa), MMP7 (matriz metalopeptidase 7 (matrilisina, uterina)), TGFA (fator de crescimento transformante, alfa), RXRA (receptor X retinoide, alfa), STX1A (sintaxina 1A (cérebro)), PSMC4 (proteassoma (prossomo, macropain) subunidade 26S, ATPase, 4), P2RY2 (receptor purinérgico de P2Y, acoplado a proteína G, 2), TNFRSF21 (superfamília do receptor do fator de necrose tumoral, membro 21), DLG1 (discos, grande homólogo 1 (Drosophila)), NUMBL (homólogo numb semelhante a (Drosophila)), SPN (sialoforina), PLSCR1 (scramblase fosfolípido 1), UBQLN2 (ubiquilina 2), UBQLN1 (ubiquilina 1), PCSK7 (convertase pró-proteína subtilisina/Kexina tipo 7), SPON1 (espondina 1, proteína de matriz extracelular), SILV (prata homólogo (rato)), QPCT (ciclotransferase glutaminila- péptido), HESS (melhorador de separação 5 ( Drosophila)), GCC1 (GRIP e domínio de hélice enrolada contendo 1), e qualquer combinação dos mesmos.

[0884] O animal geneticamente modificado ou célula pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais sequências cromossômicas disruptivas codificando uma proteína associada com a afecção da secretase e zero, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais sequências cromossômicas integradas codificando uma proteína disruptiva associada com a afecção da secretase.

[0885] Exemplos de proteínas associadas com a Esclerose Lateral Amiotrófica podem incluir SOD1 (superóxido dismutase 1), ALS2 (esclerose lateral amiotrófica 2), FUS (fundida no sarcoma), TARDBP (proteína de ligação DNA TAR), VAGFA (fator de crescimento endotelial vascular A), VAGFB (fator de crescimento endotelial vascular B), e VAGFC (fator de crescimento endotelial vascular C), e qualquer combinação dos mesmos.

[0886] Por exemplo, a Publicação da Patente dos EUA No. 20110023144 descreve a utilização de nucleases de dedos de zinco para modificar geneticamente células, animais e proteínas associadas com afecções do espectro do autismo (ALS). ALS é caracterizada pela degeneração progressiva constante de determinadas células nervosas no córtex cerebral, tronco cerebral e da medula espinal envolvido no movimento voluntário.

[0887] Afecções do neurônio motor e as proteínas associadas a estas afecções são um conjunto diverso de proteínas que têm efeito na suscetibilidade para desenvolvimento de afecções do neurônio motor, a presença da afecção do neurônio motor, a gravidade da afecção do neurônio motor, ou qualquer combinação dos mesmos. A presente invenção compreende a edição de quaisquer sequências cromossômicas codificando proteínas associadas com a doença ALS, uma afecção específica do neurônio motor. As proteínas associadas com ALS são tipicamente selecionadas com base em uma associação experimental de ALS-- proteínas relacionadas com ALS. Por exemplo, a taxa de produção ou a concentração circulante de uma proteína associada com ALS pode ser aumentada ou decrescida em uma população tendo uma ALS em relação a uma população sem ALS. Diferenças nos níveis de proteína podem ser medidos usando técnicas proteômicas incluindo mas não limitado a transferência de Western, a coloração imuno-histoquímica, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), e espetrometria de massa. Alternativamente, as proteínas associadas com ALS podem ser identificadas através da obtenção de perfis da expressão dos genes codificando as proteínas utilizando técnicas genômicas incluindo mas não se limitando a análise de microarranjo de DNA, a análise em série da expressão genética (SAGE), e reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (Q-PCR).

[0888] Como exemplos não limitativos, as proteínas associadas com ALS incluem mas não estão limitados às seguintes proteínas: SOD1 superóxido dismutase 1, ALS3 esclerose lateral amiotrófica solúvel 3 SETX senataxina ALS5 esclerose lateral amiotrófica 5 FUS fundida em sarcoma ALS7 esclerose lateral amiotrófica 7 ALS2 amiotrófica lateral, DPP6 dipeptidil- peptidase 6 esclerose 2 NEFH neurofilamento, PTGS1 polipeptídeo pesado prostaglandina endoperóxido sintase 1 SLC1A2 soluto transportador família 1 TNFRSF10B fator de necrose tumoral (superfamília de receptores de alta afinidade glial, transportador de glutamato), membro 10b membro 2 PRPH periferina proteína de choque por calor HSP90AA1 90 kDa alfa (citosólico), classe A GRIA2 receptor membro 1 glutamato, IFNG interferon, gama inotrópico, AMPA 2 S100B S100 proteína B do fator de crescimento 2 de fibroblasto FGF2 ligação cálcio AOX1 oxidase aldeído 1 CS sintase citrato TARDBP TAR DNA proteína de ligação TXN tioredoxina RAPH1 Ras associação MAP3K5 proteína ativada por mitogênio (RaIGDS/AF-6) e quinase 5 plestrina domínios de homologia 1 NBEAL1 semelhante1 neurobeaquina GPX1 de peroxidase glutationa 1 ICA1L ilhota de célula autoantigênio RAC1 relacionadas ras C3 botulinum 1,69 kDa substrato 1 de toxina MAPT associada a microtúbulos ITPR2 inositol 1,4,5- proteína tau receptor trifosfato, tipo 2 ALS2CR4 amiotrófica glutaminase GLS esclerose lateral 2 (juvenil) região cromossômica, candidato 4 ALS2CR8 esclerose lateral amiotrófica CNTFR fator neurotrófico ciliar 2 (juvenil) região cromossômica receptora, candidato 8 ALS2CR11 lateral amiotrófica FOLH1 folato hidrolase 1 esclerose 2 (juvenil) região cromossômica, candidato 11 família FAM117B com sequência P4HB prolil 4 hidroxilase, similaridade 117, membro B beta polipeptídeo CNTF fator neurotrófico ciliar SQSTM1 sequestossomo 1 STRADB relacionadas com STE20 quinase NAIP NLR família, adaptador de apoptose beta proteína inibidora YWHAQ tirosina 3- SLC33A1 família portadora de soluto 33 monooxigenase/triptofano (transportador acetil- CoA), uma 5- proteína de ativação de mono-oxigenase membro 1, proteína teta polipeptídeo TRAK2, a FIG. 4 FIG. homólogo 4, SAC1 ligação 2 quinesina domínio fosfatase 2 lipídica contendo NIF3L1 NIF3 NGG1 interagindo INA internexina neuronal fator 3 intermediário 1 proteína de filamento, alfa PARD3B par-3 particionamento COX8A citocromo c oxidase defeituosa 3 homólogo B subunidade VIIIA CDK15 quinase dependente de ciclina HECW1 HECT, C2 e WW 15 domínios contendo proteína ubiquitina ligase 1 E3 NOS1 óxido nítrico sintase 1 MET met proto-oncogene SOD2 superóxido dismutase 2, choque térmico HSPB1 27 kDa proteína mitocondrial 1 NEFL neurofilamento, CTSB leve catepsina B polipeptídeo ANG angiogenina, choque térmico HSPA8 70 kDa ribonuclease, RNase A família de proteínas 8, 5 VAPB VAMP (proteína vesicula- ESR1 receptor 1 de estrogênio associado membrana) -proteína B e C associado SNCA sinucleína, alfa HGF fator de crescimento de hepatócitos CAT catalase ACTB actina, beta NEFM neurofilamento, TH meio de tirosina- hidroxilase polipeptídeo BCL2 LLC das células-B/linfoma 2 FAS Fas (superfamília de receptores de TNF, membro 6) CASP3 caspase 3, apoptose CLU clusterina relacionada peptidase cisteína SMN1 sobrevivência do neurônio motor de G6PD glicose-6-fosfato 1, telomérica BAX desidrogenase associada à BCL2 X associada X HSF1 de choque térmico fator proteína 1 transcrição RNF19A proteína anelar 19A JUN jun oncogene ALS2CR12 choque térmico HSPA5 amiotrófica lateral 70 kDa esclerose 2 (juvenil) proteína 5 da região cromossômica, candidato 12 MAPK14 proteína IL10 ativada por mitógeno interleucina 10 quinase 14 APEX1 APEX nuclease TXNRD1 tioredoxina redutase 1 (enzima de reparação do DNA multifuncional) 1 NOS2 óxido nítrico sintase 2, TIMP1 TIMP metalopeptidase induzível inibidor 1 CASP9 caspase 9, apoptose XIAP X-ligado inibidor de apoptose peptidase GLG1 golgi fator relacionado cisteína glicoproteína eritropoietina EPO 1 VEGFA endotelial vascular ELN fator de crescimento elastina A célula glial GDNF derivada NFE2L2 fator nuclear (eritroide- fator neurotrófico derivado 2) semelhante 2 SLC6A3 família 6 portadora de soluto HSPA4 choque térmico de 70 kDa (proteína neurotransmissora 4 transportador, dopamina), membro 3 APOE apolipoproteína E PSMB8 proteassoma (prossomo, macropain) subunidade, tipo beta, 8 DCTN1 dinactina 1 TIMP3 TIMP metalopeptidase inibidor 3 KIFAP3 associada a quinesina SLC1A1 família 1 portadora soluto uma proteína 3 (neuronal/epitelial alta afinidade transportador de glutamato, sistema Xag), membro 1 SMN2 sobrevivência do neurônio motor de CCNC ciclina C 2, proteína de membrana MPP4 centromerica, STUB1 STIP1 homologia e U- palmitoílada 4 caixa contendo proteína amiloide beta ALS2 (A4) PRDX6 peroxiredoxina 6 precursor SYP proteína sinaptofisina CABIN1 ligação proteína 1 CASP1 caspase 1, apoptose GART fosforibosilglicinami relacionada com cisteína de formiltransferase, fosforibosilglicinami peptidase de sintetase, fosforibosilaminoimi CDK5 sintetase dazole 5 ATXN3 ataxina 3 RTN4 reticulon 4 C1QB componente do complemento 1, q subcomponente, cadeia B VEGFC fator de crescimento do nervo receptor HTT huntingtina doença PARK7 Parkinson 7 XDH xantina desidrogenase GFAP glial fibrilar ácida MAP2 microtúbulos associados-quinase dependente de ciclina proteína proteína 2 Cics citocromo c, somática fragmento FCGR3B Fc de IgG, baixa afinidade IIIb, CCS chaperonas de cobre para UBL5 ubiquitina- semelhante 5 superóxido família transportadora metalopeptidase matriz dismutase MMP9 SLC18A3 soluto 18 9 ((acetilcolina vesicular), 3 TRPM7 HSPB2 receptor transiente membro choque térmico 27 kDa potencial canal de cátions, proteína 2 da subfamília M, membro AKT1 7 v-akt murina timoma DERL1 Der1- como família domínio, homólogo oncogene viral 1 membro 1 CCL2 quimiocina (motivo C-C) NGRN neugrina, ligando 2 neurite associado ao crescimento GSR redutase glutationa TPPP3 tubulina polimerização-membro da família a promoção de proteínas 3 APAF1 peptidase apoptótica BTBD10 BTB (POZ) de domínio do fator ativador de 1 contendo 10 GLUD1 glutamato CXCR4 quimiocina (motivo C-X-C) desidrogenase receptor 4 SLC1A3 família portadora de soluto 1 tirosina relacionada com a FMS FLT1 (glial alta afinidade transportador de glutamato), membro 3-quinase 1 PON1 paraoxonase 1 AR fator inibidor de leucemia LIF receptor de andrógeno ErbB3 v-erb-B2 leucemia eritroblástica viral homólogo oncogene 3 lectina LGALS1, galactosido-molécula CD44 CD44 vinculativo, solúvel, um tumor TP53 receptor toll-semelhante proteína p53 TLR3 3 GRIA1 receptor de glutamato, GAPDH gliceraldeído-3- inotrópico, receptor AMPA 1 fosfato desidrogenase GRIK1 glutamato, DES desmina inotrópico, cainato 1 BATE-PAPO fms relacionadas com colina acetiltransferase FLT4 tirosina-quinase 4 CHMP2B cromatina modificadora BAG1 proteína 2B atanogene MT3 metalotioneína 3 Chrna4 receptor colinérgico, nicotínico, alfa 4 GSS glutationa-sintetase BAK1 BCL2-antagonista/assassino 1 KDR receptor do domínio de inserção da quinase de GSTP1 glutationa S-transferase (um tipo III pi 1 do receptor de tirosina-quinase) OGG1 8-associado BCL2 -oxoguanina ADN de IL6 interleucina 6 (interferão, beta glicosilase 2).

[0889] O animal ou célula pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 ou mais sequências cromossômicas disruptivas codificando uma proteína associada com a DA e zero, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais sequências cromossômicas integradas codificando uma proteína associada com DA. Proteínas preferenciais associadas com ALS incluem SOD1 (superóxido dismutase 1), ALS2 (esclerose lateral amiotrófica 2), FUS (fundida no sarcoma), TARDBP (proteína de ligação DNA TAR), VAGFA (fator de crescimento endotelial vascular A), VAGFB (fator de crescimento endotelial vascular B), e VAGFC (fator de crescimento endotelial vascular C), e qualquer combinação dos mesmos.

[0890] Exemplos De Proteínas Associadas Com Doenças De Príon Podem Incluir Sod1 (Superóxido Dismutase 1), Als2 (Esclerose Lateral Amiotrófica 2), Fus (Fundida No Sarcoma), Tardbp (Proteína De Ligação Dna Tar), Vagfa (Fator De Crescimento Endotelial Vascular A), Vagfb (Fator De Crescimento Endotelial Vascular B), E Vagfc (Fator De Crescimento Endotelial Vascular C), E Qualquer Combinação Dos Mesmos.

[0891] Exemplos de proteínas relacionadas com condições neurodegenerativas em afecções de príon podem incluir A2M (alfa-2-macroglobulina), AATF (fator de transcrição antagonizante de apoptose), ACPP (ácido fosfatase da próstata), ACTA2 (alfa 2 actina do músculo liso da aorta), ADAM22 (ADAM domínio metalopeptidase), ADORA3 (receptor A3 de adenosina), ou ADRA1D (receptor adrenérgico alfa-1D para adrenoreceptor alfa-1D), por exemplo.

[0892] Os exemplos de proteínas associadas à Imunodeficiência podem incluir A2M [alfa-2-macroglobulina]; AANAT [arilalquilamina N-acetiltransferase]; ABCA1 [cassete de ligação de ATP, subfamília A (ABC1), membro 1]; ABCA2 [cassete de ligação de ATP, subfamília A (ABC1), membro 2]; ou ABCA3 [cassete de ligação de ATP, subfamília A (ABC1), membro 3]; por exemplo.

[0893] Exemplos de proteínas associadas com afecções de repetição de trinucleotídeos incluem AR (receptor de andrógeno), FMR1 (retardo mental 1 do X frágil), HTT (huntingtina), ou DMPK (distrofia miotonica-proteína quinase), FXN (frataxina), ATXN2 (ataxina 2), por exemplo.

[0894] Exemplos de proteínas associadas com afecções da neurotransmissão incluem SST (somatostatina), NOS1 (óxido nítrico sintase 1 (neuronal)), ADRA2A (adrenérgico, alfa-2A-, receptor), ADRA2C (adrenérgico, alfa-2C-, receptor), TACR1 (receptor da taquiquinina 1), ou HTR2c (5-hidroxitriptamina (serotonina) receptor 2C), por exemplo.

[0895] Exemplos de sequências associadas ao desenvolvimento neurológico incluem A2BP1 [proteína 1 de ligação a ataxina 2], AADAT [aminotransferase aminoadipato], AANAT [arilalquilamina N-acetiltransferase], ABAT [aminotransferase 4-aminobutirato], ABCA1 [cassete de ligação de ATP, subfamília A (ABC1), membro 1], ou ABCA13 [cassete de ligação a ATP, subfamília A (ABC1), membro 13], por exemplo.

[0896] Outros exemplos de condições preferenciais que podem ser tratadas com o presente sistema podem ser selecionados a partir de: Síndrome de Aicardi-Goutieres; Doença de Alexander; Síndrome de Allan-Herndon-Dudley; Distúrbios relacionados com POLG; Alfa-manosidose (Tipo II e III); Síndrome de Alstrom; Angelman; Síndrome; Ataxia Telangiectasia; Ceroides Lipofuscinoses neuronais; Beta- talassemia; Atrofia Ótica Bilateral e (Infantil) Atrofia Ótica tipo 1; Retinoblastoma (bilateral); Doença de Canavan; Síndrome 1 cerebro-ocular-esquelético-facial [COFS1]; Cerebrotendínea Xantomatose; Síndrome de Cornelia de Lange; afecções relacionadas com MAPT; Doenças de Príon genéticas; Síndrome de Dravet; Doença de Alzheimer Precoce Familiar; Ataxia de Friedreich [FRDA]; Síndrome Fryns; Fucosidose; Distrofia Muscular Congênita Fukuyama; Galactosialidose; Doença de Gaucher; Acidemias orgânicas; Linfohistiocitose hemofagocítica; Síndrome de Progeria de Hutchinson-Gilford; Mucolipidose II; Doença do Armazenamento de Ácido Siálico livre infantil; Neurodegeneração associada a PLA2G6; Síndrome de Jervell e Lange-Nielsen; Epidermólise bolhosa juncional; Doença de Huntington; Doença de Krabbe (Infantil); Síndrome de Leigh Mitochondrial associado a DNA e NARP; Síndrome de Lesch-Nyhan; Lisencefalia Associada a LIS1; síndrome de Lowe; Doença da Urina do Xarope de Bordo; Síndrome de duplicação MECP2; afecções no transporte de cobre relacionado com ATP7A; Distrofia Muscular relacionada a LAMA2; Deficiência Arilsulfatase A; Mucopolissacaridose tipo I, II ou III; afecções de biogênese peroxisomo, Síndrome de espectro Zellweger; Neurodegeneração com distúrbios cerebrais da acumulação de ferro; Deficiência de Ácido Esfingomielinase; Doença tipo C Niemann-Pick; Encefalopatia glicina; afecções relacionadas com ARX; Distúrbios do Ciclo da Ureia; Osteogênese Imperfeita relacionada com COL1A1/2; Síndrome de deleção de DNA mitocondrial; afecções relacionadas com PLP1; Síndrome de Perry; Síndrome de Phelan-McDermid; Doença de Depósito de Glicogênio Tipo II (Doença de Pompe) (Infantil); afecções relacionadas com MAPT; Afecções relacionadas com MECP2; Condrodisplasia Punctata Rizomélica Tipo 1; Síndrome de Roberts; Doença de Sandhoff; Doença de Schindler Tipo 1; Deficiência de Adenosinadesaminase; Síndrome Smith-Lemli- Opitz; Atrofia Muscular Espinhal; Ataxia Espinocerebelar infantil; Deficiência Hexosaminidase A; Displasia Tipo 1 Tanatofórica; Doenças do relacionadas com colagênio Tipo VI; Síndrome de Usher Tipo I; distrofia muscular congênita; Síndrome de Wolf-Hirschhorn; Deficiência lipossômica ácido lipase; e xeroderma pigmentoso.

[0897] Conforme é evidente, prevê-se que o presente sistema possa ser usado para qualquer sequência de polinucleotídeos alvo de interesse. Alguns exemplos de condições ou doenças que podem ser utilmente tratadas utilizando o presente sistema estão incluídos nas tabelas anteriores e exemplos de genes atualmente associados com estas condições também são fornecidos aí. No entanto, os genes exemplificados não são exaustivas.

[0898] Por exemplo, "StCas9 tipo selvagem" refere-se a Cas9 do tipo selvagem de S thermophilus, cuja sequência da proteína é dada na base de dados SwissProt com o número de acessão G3ECR1. Da mesma forma, Cas9 de S. pyogenes está incluída no SwissProt sob o número de Q99ZW2.

[0899] A capacidade de usar sistemas CRISPR-Cas para realizar edição e manipulação de genes eficaz e rentável permitirá a seleção e comparação rápidas de manipulações genéticas únicas e multiplexadas para transformar tais genomas quanto a produção melhorada e traços intensificados. A este respeito é feita referência às patentes e publicações dos EUA: Patente dos EUA No. 6,603,061 - Método de Transformação de Plantas Mediada por Agrobacterium; Patente dos EUA No. 7,868,149 - Sequências de Genoma de Planta e Seus Usos e US 2009/0100536 - Plantas Transgênicas com Traços Agronômicos Intensificados, todos os conteúdos e divulgação de cada uma das quais são incorporados por referência na sua totalidade. Na prática da invenção, os conteúdos e divulgação de Morrell et al. “Crop genomics:advances and applications” Nat Rev Genet. 29 de dez de 2011;13(2):85-96 são também aqui incorporados por referência na sua totalidade.

EXEMPLOS

[0900] Os seguintes exemplos são dados para fins de ilustração de várias formas de realização da invenção e não pretendem limitar a presente invenção de qualquer modo. Os presentes exemplos, juntamente os métodos aqui descritos são presentemente representativos de formas de realização preferenciais, são exemplares, e não são consideradas como limitações no escopo da invenção. As alterações neste documento e outros usos que sejam abrangidos no espírito da invenção como definido pelo escopo das reivindicações ocorrerão aos habilitados na arte.

Exemplo 1: Atividade do Complexo CRISPR no Núcleo de uma célula eucariótica

[0901] Um exemplo tipo II do sistema CRISPR é o local CRISPR tipo II de Streptococcus pyogenes SF370, que contem um conjunto de quatro genes Cas9, Cas1, Cas2, e Csn1, assim como dois elementos RNA não codificante, tracrRNA e uma característica do arranjo das sequências repetitivas (repetições diretas) interespaçadas por trechos curtos de sequências não repetitivas (espaçadores, cerca de 30bp cada). Neste sistema, a quebra do DNA alvo de cadeia dupla (DSB) é gerada em quatro etapas sequenciais (Fig. 2A). Primeiro, dois RNAs não codificantes, o arranjo pré-crRNA e tracrRNA, são transcritos a partir do local de CRISPR. Segundo, o tracrRNA hibrida com as repetições diretas de pré-crRNA, que é então processado nos crRNAs maduros contendo sequências espaçadoras individuais. Terceiro, o crRNA:tracrRNA complexo maduro direciona Cas9 para o DNA alvo consistindo do protoespaçador e a PAM correspondente via da formação de heterodúplex entre a região espaçadora do crRNA e o DNA protoespaçador. Finalmente, a Cas9 medeia a clivagem do DNA alvo a montante de PAM para criar um DSB dentro do protoespaçador (Fig. 2A). Este exemplo descreve um processo exemplo para adaptar este sistema de nuclease RNA-programável para dirigir a atividade do complexo CRISPR nos núcleos das células eucarióticas.

[0902] Cultura de células e transfecção

[0903] Linha celular HEK 293FT de rim embriônico (HEK) humano (Life Technologies) foi mantido em Meio de Eagle modificado da Dulbecco (DMEM) suplementado com soro fetal de bovino a 10% (HyClone), GlutaMAX 2mM (Life Technologies), 100U/mL de penicilina, e 100μg/mL de estreptomicina a 37°C com incubação em CO2 a 5%. [00591] Linha celular Linha celular de camundongo neuro2A (N2A) (ATCC) foi mantida com DMEM suplementado com 5% de soro fetal de bovino (HyClone), GlutaMAX 2mM (Life Technologies), 100U/mL de penicilina, e 100μg/mL de estreptomicina a 37°C com 5% de CO2 a 5%.

[0904] As células HEK 293FT ou N2A foram semeadas em placas de 24 poços (Corning) um dia antes da transfecção a uma densidade de 200,000 células por poço. As células foram transfectadas usando Lipofectamina 2000 (Life Technologies) seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Para cada poço da placa de 24 poços foi usado um total de 800ng de plasmídeos.

[0905] Ensaio de Surveyor e análise de sequenciação para modificação de genoma

[0906] As células HEK 293FT ou N2A foram transfectadas com DNA de plasmídeo como descrito acima. Após transfecção, as células foram incubadas a 37°C durante 72 horas antes da extração de DNA genômico. O DNA genômico foi extraído usando o kit de extração de DNA QuickExtractt (Epicentre) seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células foram ressuspendidas em solução QuickExtract e incubadas a 65°C durante 15 minutos e 98°C durante 10 minutos. O DNA genômico extraído foi imediatamente processado ou armazenado a -20°C.

[0907] A região genômica circundando um sítio CRISPR alvo para cada gene foi amplificado por PCR, e os produtos foram purificados usando Coluna QiaQuick Spin Column (Qiagen) seguindo o protocolo do fabricante. Um total de 400ng do produto de PCRs purificado foi misturado com 2μl 10X de tampão de PCR de Taq polimerase (Enzymatics) e água ultrapura até um volume final de 20μl, e sujeito a um processo de re- emparelhamento para permitir a formação de heterodúplexes: 95°C durante 10 minutos, 95°C a 85°C em rampa - 2°C/s, 85°C e 25°C/s - 0,25°C/s, e 25°C mantidos durante 1 minuto. Após re- emparelhamento, os produtos foram tratados com nuclease Surveyor e potenciador Surveyor S (Transgenomics) seguindo o protocolo de recomendações do fabricante, e analisado em géis de poliacrilamida a 4-20% Novex TBE (Life Technologies). Os géis foram corados com corante de DNA SYBR Gold (Life Technologies) durante 30 minutos e visualizados com um sistema de imagem em gel da Gel Doc (Bio-rad). A quantificação foi baseada em intensidades de banda relativas, como uma medida da fração de DNA clivada. A Fig. 7 fornece uma ilustração esquemática do ensaio Surveyor.

[0908] Ensaio de polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição para detecção de recombinação homóloga.

[0909] As células HEK 293FT e N2A foram transfectadas com DNA de plasmídeo, e incubadas a 37°C durante 72 horas antes da extração de DNA genômico como descrito acima. A região genômica alvo foi amplificada por PCR usando iniciadores fora dos braços de homologia do modelo de recombinação homóloga (HR). Os produtos de PCR foram separados em um gel de agarose a 1% e extraídos com o kit MinElute GelExtraction (Qiagen). Os produtos purificados foram digeridos com HindIII (Fermentas) e analisados em um gel de poliacrilamida a 6% Novex TBE (Life Technologies).

[0910] Previsão E Análise Da Estrutura Secundária De Rna

[0911] A estrutura secundária de RNA prevista foi realizada usando o servidor da web RNAfold, desenvolvido no Instituto para a Química Teórica na Universidade de Viena, usando o algoritmo de previsão de estrutura centroide (ver por exemplo A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; e PA Carr e GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62).

[0912] Purificação de RNA

[0913] As células HEK 293FT foram mantidas e transfectadas como indicado acima. As células foram colhidas por tripsinização seguida por lavagem em salino tamponado com fosfato (PBS). O RNA celular total foi extraído com reagente TRI (Sigma) seguindo o protocolo do fabricante. O RNA total extraído foi quantificado usando Naonodrop (Thermo Scientific) e normalizado com a mesma concentração.

[0914] Análise de transferência de Northern de crRNA e expressão de tracrRNA em células de mamífero

[0915] Os RNAs foram misturados com iguais volumes de 2X tampão de carregamento (Ambion), aquecido a 95°C durante 5 min, arrefecida em gelo durante 1 min, e depois carregada sobre 8% de géis desnaturantes de poliacrilamida (SequaGel, National Diagnostics) após pre correr o gel durante pelo menos 30 minutos. As amostras foram sujeitas a eletroforese durante 1,5 horas a 40W limite. Em seguida, o RNA foi transferido para membrana Hybond N+ (GE Healthcare) a 300 mA em um aparelho de transferência semi a seco (Bio-rad) à temperatura ambiente durante 1,5 horas. O RNA foi reticulado à membrana usando botão de autorreticulação no Reticulador UV Stratagene o Stratareticulador (Stratagene). A membrana foi pré-hibridada em Tampão de hibridação ULTRAhyb-Oligo (Ambion) durante 30 min com rotação a 42°C, e sonda foram depois adicionadas e hibridados durante a noite. As sondas foram encomendadas da IDT e marcada com [gama-32P] ATP (Perkin Elmer) com polinucleotídeo quinase T4 (New England Biolabs). A membrana foi lavada uma vez com (42°C) 2xSSC, 0.5% SDS pré aquecido durante 1 min seguido por duas lavagens de 30 minutos a 42°C. A membrana foi exposta a uma triagem de tela de fósforo durante uma hora ou durante a noite à temperatura ambiente e então escaneada com um fosforoimagiologia (Typhoon).

[0916] Sistema de construção CRISPR bacteriana e avaliação

[0917] Elementos do local da CRISPR, incluindo tracrRNA, Cas9, e líder foram amplificados por PCR a partir de Streptococcus pyogenes SF370 o DNA genômico com braços de homologia flanqueando a Montagem Gibson. Dois sítios IIS tipo BsaI foram introduzidos entre duas repetições diretas para facilitar a inserção fácil de espaçadores (Fig. 8). Os Produtos de PCRs foram clonados em pACYC184 digerido EcoRV a jusante do promotor tet usando Montagem de Mistura Master Gibson (NEB). Outros elementos do sistema endógeno CRISPR foram omissos, com exceção do último 50pb de Csn2. Oligos (Tecnologia de DNA Integrado) codificando espaçadores com saliências complementares foram clonados no vetor digerido com BSAI pDC000 (NEB) e então ligado com ligase T7 (Enzymatics) para gerar plasmídeos pCRISPR. Plasmídeos contendo espaçadores de desafio com o PAM

[0918] Expressão em células de mamífero (construções de expressão ilustrados na Fig. 6A, com funcionalidade como determinado pelos resultados do ensaio Surveyor mostrada na Fig. 6B). Sítios de início da transcrição são marcados quanto +1, e terminador de transcrição e a sequência sondada por transferência de Northern são também indicados. A expressão de tracrRNA processada foi também confirmada por transferência de Northern. A Fig. 6C mostra os resultados de uma análise de transferência de Northern do RNA total extraído das células 293FT transfectadas com as construções de expressão U6 carregando tracrRNA longo ou curto, assim como SpCas9 e DR- EMX1(1)-DR. Painéis de direita e esquerda são de células 293FT transfectadas sem ou com SpRNase III, respectivamente. U6 indica controle de carregamento apagado com uma sonda visando snRNA U6 humano. A transfecção da construção de expressão curta tracrRNA conduz os níveis abundantes da forma processada de tracrRNA (~75pb). Quantidades muito baixas de longo tracrRNA são detectados na transferência de Northern.

[0919] Para promover a iniciação da transcrição exata, o promotor U6 de base RNA polimerase III foi selecionado para guiar a expressão de tracrRNA (Fig. 2C). De modo semelhante, a construção à base do promotor U6 foi desenvolvida para expressar um arranjo pré-crRNA consistindo de um único espaçador flanqueado por duas repetições diretas (DRs, também englobadas no termo “sequências companheiras tracr”; Fig. 2C). O espaçador inicial foi desenhado para visar um sítio alvo de 33 pares de bases (pb) (protospaçador de 30 pb mais uma sequência motivo CRISPR de 3-pb(PAM) satisfazendo o motivo de reconhecimento de Cas9) no local EMX1 humano (Fig. 2C), um gene chave no desenvolvimento do córtex cerebral.

[0920] Testar se a expressão homóloga do sistema CRISPR (SpCas9, SpRNase III, tracrRNA, e pre-crRNA) em células de mamífero pode a clivagem direcionada de cromossomos de mamífero, as células HEK 293FT foram transfectadas com combinações dos componentes de CRISPR. Uma vez que DSBs em núcleos de mamífero são parcialmente reparados pela via da extremidade de união (NHEJ) não-homóloga, a qual conduz à formação de indels, o ensaio Surveyor foi usado para detectar a atividade de clivagem no local alvo EMX1 (Fig. 7) (ver por exemplo Guschin et al., 2010, Methods Mol Biol 649: 247). A cotransfecção de todos os quatro componentes de CRISPR foram capazes de induzir até 5,0% de clivagem no protoespaçador (ver Fig. 2D). A cotransfecção de todos os componentes CRISPR menores SpRNase III também induziram até 4,7% de indel no protoespaçador, sugerindo que são capazes de assistir com a maturação de crRNA, tal como por exemplo as enzimas Dicer e Drosha relacionadas. Removendo qualquer dos restantes três componentes eliminaram a atividade de clivagem do genoma do sistema CRISPR (Fig. 2D). O sequenciamento Sanger de produtos de amplificação contendo o local alvo verificou a atividade de clivagem: em 43 clones sequenciados, foram encontrados 5 alelos modificados (11,6%). Experiências similares usando uma variedade de sequências guia produziram percentagens indel tão altas como 29% (ver Figs. 3-6, 10, e 11). Estes resultados definem um sistema de três componentes para a modificação do genoma mediado para eficiente CRISPR em células de mamífero. Para otimizar a eficiência de clivagem, os Requerentes também testaram se diferentes isoformas de tracrRNA afetaram a eficiência de clivagem e verificaram que, nestes sistema de exemplo, somente a forma de transcrito curta (89-pb) foi capaz de mediar a clivagem do local genômicoEMX1 humano (Fig. 6B).

[0921] A Figura 12 mostra uma análise adicional de transferência de Northern do processamento de crRNA em células de mamífero. A Fig. 12A ilustra um esquema mostrando o vetor de expressão para um único espaçador flanqueado por duas repetições diretas (DR-EMX1(1)-DR). O espaçador de 30pb visando o EMX1 humano local protoespaçador 1 (ver Fig. 6) e as sequências de repetição direta são mostrados na sequência abaixo Fig. 12A. A linha indica a região cuja sequência de complemento reverso foi usada para gerar sondas de transferência de Northern para detecção de EMX1(1) crRNA. A Fig. 12B mostra uma análise de transferência de Northern do RNA total extraído das células 293FT transfectadas com as construções de expressão U6 carregando DR-EMX1(1)-DR. Painéis de direita e esquerda são de células 293FT transfectadas sem ou com SpRNase III, respectivamente. DR-EMX1(1)-DR foi processado em crRNAs maduros somente na presença de SpCas9 e tracrRNA curto e não dependente da presença de SpRNase III. O crRNA maduro detectado a partir do RNA total de 293FT transfectado é ~33pb e é mais pequeno que o crRNA maduro d 39- 42pb de S. pyogenes. Estes resultados demonstram que um sistema CRISPR pode ser transplantado para células eucarióticas e reprogramado para facilitar a clivagem de polinucleotídeos alvo endógenos de mamífero.

[0922] A Fig. 2 ilustra o sistema CRISPR bacteriano descrito neste exemplo. A Fig. 2A ilustra um esquema mostrando o local 1 de CRISPR de Streptococcus pyogenes SF370 e um mecanismo proposto de clivagem de DNA mediada por CRISPR através deste sistema. CrRNA maduro processado a partir do arranjo direto do espaçador de repetição direciona Cas9 para alvos genômicos consistindo de protoespaçadores complementares e um motivo protoespaçador adjacente (PAM). Após o emparelhamento de bases alvo-espaçador, Cas9 medeia uma rutura da cadeia dupla no DNA alvo. Fig. 2B ilustra a manipulação de Cas9 de S. pyogenes (SpCas9) e RNase III (SpRNase III) com sinais de localização nuclear (NLSs) para permitir a importação para o núcleo dos mamíferos. A Fig. 2C ilustra que a expressão em mamíferos de SpCas9 e SpRNase III dirigida pelo promotor EF1a constitutivo e arranjo tracrRNA e pre-crRNA (DR- Espaçador-DR) dirigido pelo promotor U6 de RNA Pol3 para promover a transcrição precisa de iniciação e terminação. Um protoespaçador de local EMX1 humano com uma sequência PAM satisfatória é usada como o espaçador no arranjo pre-crRNA. A Fig. 2D ilustra o ensaio de nuclease surveyor para inserções e deleções menores mediadas por SpCas9. SpCas9 foi expressa com e sem SpRNase III, tracrRNA, e uma matriz pre-crRNA carregando - espaçador alvo EMX1. A Fig. 2E ilustra uma representação esquemática de emparelhamento de bases entre local alvo e crRNA visando EMX1, assim como um cromatograma exemplo mostrando uma micro deleção adjacente ao sítio de clivagem SpCas9. A Fig. 2F ilustra alelos modificados identificados partindo da análise de sequenciação de 43 produtos clonais de amplificação mostrando uma diversidade de micro inserções e deleções. As setas indicam bases eliminadas, e não alinhadas ou bases incompatíveis indicam inserções ou mutações. Barra de escala = 10μm.

[0923] Para simplificar adicionalmente o sistema de três componentes, um desenho de crRNA-tracrRNA híbrido quimérico foi adaptado, onde um crRNA maduro (compreendendo uma sequência guia) pode ser fundida a uma tracrRNA parcial via uma haste em ansa para imitar o duplex natural crRNA:tracrRNA. Para aumentar a eficiência de coaplicação, um vetor de expressão bicistrônica foi criado para dirigir a coexpressão de um RNA quimérico e SpCas9 nas células transfectadas. Paralelamente, os vetores bicistrônicos foram usados para expressar a pre-crRNA (DR-sequência guia-DR) com SpCas9, para induzir o processamento em crRNA com um tracrRNA expressado separadamente (comparar Fig. 11B em cima e em baixo). A Fig. 8 fornece ilustrações esquemáticas de vetores de expressão bistrônicos para matriz pre-crRNA (Figura 8A) ou crRNA quimérico (representado pela linha curta a jusante do sítio de inserção da sequência guia e a montante do promotor EF1α na Fig. 8B) com hSpCas9, mostrando a localização de vários elementos e o ponto de inserção da sequência guia. A sequência expandida em torno do local do sítio de inserção da sequência guia na Fig. 8B também mostra uma sequência DR parcial (GTTTAGAGCTA SEQ ID NO:__) e uma sequência parcial tracrRNA (TAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTT SEQ ID NO:__). As sequências guia podem ser inseridas entre os sítios BbsI usando oligonucleotídeos emparelhados. As sequências delineadas para os oligonucleotídeos são mostradas a seguir nas ilustrações esquemáticas na Fig. 8, com os adaptadores de ligação adequados indicados. WPRE representa o elemento regulador de pós transcrição do vírus da hepatite Woodchuck. A eficiência de clivagem mediada por RNA quimérico foi testado visando o mesmo local EMX1 descrito acima. Usando ambos os ensaios de Surveyor e sequenciação de Sanger os produtos de amplificação, os Requerentes confirmaram que o delineamento do RNA quimérico facilita a clivagem de local EMX1 humano com aproximadamente uma taxa de modificação de 4,7% (Fig. 3).

[0924] A generalização de clivagem mediada pela CRISPR em células eucarióticas foi testada por segmentação do locais genômicos adicionais em ambas as células humanas e de camundongo desenhando múltiplos sítios de direcionamento de RNA quimérico em EMX1 e PVALB humano, assim como os locais Th de camundongo. A Fig. 13 ilustra a seleção de alguns protoespaçadores adicionais direcionados em PVALB humano (Fig. 13A) e Th de camundongo (Fig. 13B). São fornecidos esquemas dos locais genéticos e de localização de três protoespaçadores dentro de cada último éxon. As sequências sublinhadas incluem 30pb da sequência protoespaçadora e 3pb na extremidade 3’ correspondente às sequências de PAM. Os protoespaçadores na cadeia de senso e antissenso são indicados em cima e em baixo das sequências de DNA, respectivamente. Obteve-se uma taxa de modificação de 6,3% e 0,75% para os locais de PVALB humana e Th de camundongo respectivamente, demonstrando a larga aplicabilidade do sistema CRISPR na modificação de diferentes locais em múltiplos organismos (Fig. 5). Enquanto a clivagem foi detectada somente com um em três espaçadores para cada local usando as construções quiméricas, todas as sequências alvo foram clivadas com eficiência na produção de indels chegando aos 27% quando se usa o arranjo de pre-crRNA coexpressado (Figs. 6 e 13).

[0925] A Fig. 11 fornece uma ilustração adicional em que a SpCas9 pode ser reprogramada para atingir múltiplos locais genômicos em células de mamífero. A Fig. 11A fornece um esquema do local EMX1 humano mostrando o local de cinco protoespaçadores, indicados pelas sequências sublinhadas. A Fig. 11B fornece uma representação esquemática do complexo pre-crRNA/trcrRNA mostrando a hibridação entre a região direta de repetição de pre-crRNA e tracrRNA (em cima), e uma representação esquemática de um desenho de RNA quimérico compreendendo uma sequência guia de 20pb, e sequências tracr e companheira tracr consistindo sequências de repetição direta parcial e tracrRNA hibridadas em uma estrutura em grampo (em baixo). Os resultados de um ensaio Surveyor comparando a eficiência de clivagem mediada por Cas9 em cinco protoespaçadores no local EMX1 humano são ilustrados na Fig. 11C. Cada protoespaçador é atingido usando o complexo pre- crRNA/tracrRNA (crRNA) processado ou o RNA quimérico (chiRNA).

[0926] Uma vez que a estrutura secundária do RNA pode ser crucial para as interações moleculares, o algoritmo de previsão de estrutura com base na energia livre mínima e na estrutura ponderada de Boltzmann conjuntas com a usada para comparar a estrutura secundária putativa de todas as sequências guia usadas na experiência de direcionamento genômico (ver por exemplo Gruber et al., 2008, Nucleic Acids Research, 36: W70). A análise revelou que em muitos casos, as sequências guia efetivas no contexto do crRNA quimérico eram substancialmente isentas dos motivos da estrutura secundária, enquanto as sequências guia não efetivas eram mais provavelmente para formar estruturas secundárias internas que pudessem impedir o emparelhamento de bases com o protoespaçador de DNA alvo. Assim, é possível que a variabilidade na estrutura secundária do espaçador possa ter impacto na eficiência de interferência mediada por CRISPR quando se utiliza um crRNA quimérico.

[0927] Mais vetores desenhados para SpCas9 são mostrados na Fig. 22, que ilustra os vetores de expressão simples, incorporando um promotor U6 ligado a um local de inserção para uma oligo guia, e um promotor CBH ligado à sequência de codificaçãoSpCas9. O vetor representado na Fig. 22b inclui uma sequência de codificação tracrRNA ligada a um promotor H1.

[0928] No ensaio bacteriano, todos os espaçadores facilitaram a interferência CRISPR eficiente (Fig. 3C). Estes resultados sugerem que podem existir fatores adicionais que afetam a eficiência da atividade CRISPR em células de mamífero.

[0929] Para investigar a especificidade da clivagem mediada por CRISPR, o efeito de mutações de nucleotídeo único na sequência guia na clivagem por protoespaçador no genoma de mamífero foi analisada utilizando uma série de EMX1visando crRNAs quiméricos com mutações em um único ponto (Fig. 3A). A Fig. 3B ilustra os resultados de um ensaio de nuclease Surveyor comparando a eficácia de clivagem da Cas9 quando combinada com diferentes RNAs mutantes quiméricos. Os emparelhamentos incorretos de uma única base até 12 pb em 5' de PAM anularam substancialmente a clivagem genômica por SpCas9, enquanto que os espaçadores com mutações nas posições mais a montante a atividade foi mantida para o alvo original protoespaçador (Fig. 3B). Além do PAM, SpCas9 tem especificidade de uma única base nos últimos 12 pb do espaçador. Além disso, CRISPR é capaz de mediar a clivagem genômica tão eficientemente quanto um par de nucleases TALE (TALEN) visando o mesmo protoespaçador EMX1. A Fig. 3C proporciona um esquema que mostra o desenho de TALENs visando EMX1, e a Fig. 3D mostra um gel Surveyor comparando a eficiência de TALEN e Cas9 (n = 3).

[0930] Tendo-se estabelecido um conjunto de componentes para atingir a edição de gene mediada por CRISPR em células de mamífero através de mecanismo NHEJ propenso a erros, foi testada a capacidade da CRISPR para estimular a recombinação homóloga (HR), uma via de reparação de genes de alta fiabilidade para fazer edições precisas no genoma. A SpCas9 do tipo selvagem foi capaz de mediar os DSBs específicos de sítio, os quais podem ser reparados através tanto de NHEJ como de HR. Adicionalmente, uma substituição de aspartato por alanina (D10A) no domínio catalítico RuvC I de SpCas9 foi manipulada para converter a nuclease em uma nickase SpCas9n; ilustrada na Fig. 4A) (ver por exemplo Sapranausaks et al., 2011, Nucleic Acids Research, 39: 9275; Gasiunas et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109:E2579), de modo que o DNA genômico cortado sofre a reparação de alta fiabilidade dirigida por homologia (HDR). O ensaio de Surveyor confirmou que a SpCas9n não gera indels no alvo protoespaçador EMX1. Como ilustrado na Fig. 4B, a coexpressão de CrRNA quimérico visando EMX1 com SpCas9 produziu indels no sítio alvo, ao passo que a coexpressão com SpCas9n não induziu (n=3). Acima de tudo, a sequenciação de 327 produtos de amplificação não detecta quaisquer indels induzidas por SpCas9n. O mesmo local foi selecionado para testar HR mediada por CRISPR cotransfectando as células HEK 293FT com o RNA quimérico visando EMX1, hSpCas9 ou hSpCas9n, assim como um modelo de HR para introduzir um par de sítios de restrição (HindIII e NheI) perto do protoespaçador. A Fig. 4C fornecem uma ilustração esquemática da estratégia HR, com posições relativas dos pontos de recombinação e sequências iniciadoras de emparelhamento (setas). De facto, SpCas9 e SpCas9n catalisaram a integração do modelo RH no local EMX1. A amplificação por PCR da região alvo seguido de digestão de restrição com HindIII revelou produtos de clivagem correspondentes aos tamanhos dos fragmentos esperados (setas na análise do gel do comprimento de fragmentos de restrição polimórficos, apresentado na Fig. 4D), com SpCas9 e SpCas9n a mediar níveis semelhantes de eficiência de HR Os Requerentes verificaram ainda HR utilizando sequenciamento Sanger dos produtos de amplificação amplicons genômicos (Fig. 4E). Estes resultados demonstram a utilidade dos CRISPR para facilitar a inserção do gene alvo no genoma de mamífero. Dada a especificidade de alvo de SpCas9 do tipo selvagem de 14 pb (12 pb a partir do espaçador e 2-pb do PAM), a disponibilidade de uma nickase pode reduzir significativamente a probabilidade de alterações fora do alvo, uma vez que ruturas dos das cadeias individuais não são substratos para a via NHEJ propensa a erros.

[0931] As construções de expressão que imitam a arquitetura natural do locais CRISPR com espaçadores dispostos (Fig. 2A) foram construídas de modo a testar a possibilidade da rotulagem da sequência multiplexada. Usando uma única matriz CRISPR codificando um par de EMX1- e espaçadores PVALB- alvo, uma segmentação eficiente em ambos os locais foi detectada (Fig. 4F, mostra tanto um desenho esquemático da matriz crRNA e uma análise de transferência de Surveyor mostrando a mediação eficiente de clivagem). A deleção dirigida de regiões genômicas maiores através DSBs simultâneos usando espaçadores contra dois alvos dentro de EMX1 espaçados por 119bp, também foi testado, e uma eficácia de deleção de 1,6% (3 de 182 produtos de amplificação; Fig. 4G) foi detectada. Isto demonstra que o sistema CRISPR pode mediar a edição multiplexada dentro de um único genoma.

Exemplo 2: Modificações do sistema CRISPR e alternativas

[0932] A capacidade de usar o RNA para programar a clivagem específica da sequência de DNA define uma nova classe de ferramentas de engenharia genômica para uma variedade de aplicações industriais e de investigação. Vários aspectos do sistema CRISPR podem ser ainda melhorados para aumentar a eficiência e versatilidade do direcionamento de CRISPR. A atividade ótima Cas9 pode depender da disponibilidade de Mg2+ livre em níveis mais elevados do que o que se encontra presente no núcleo de mamíferos (ver, por exemplo Jinek et al., 2012, Science, 337:816), e a preferência para um motivo NGG imediatamente a jusante do protoespaçador restringe a capacidade de rotular em média cada 12 pb no genoma humano (Fig. 9, avaliação de ambas as cadeias mais e menos das sequências cromossômicas humanas). Algumas destas limitações podem ser superadas explorando a diversidade dos locais CRISPR em todo o metagenoma microbiano (ver, por exemplo Makarova et al., 2011, Nat Rev Microbiol., 9: 467). Outros locais de CRISPR podem ser transplantados para o meio celular de mamífero por um processo semelhante ao descrito no Exemplo 1. Por exemplo, a Fig. 10 ilustra a adaptação do sistema CRISPR Tipo II a partir de CRISPR 1 de Streptococcus thermophilus LMD-9 para expressão heteróloga em células de mamífero para conseguir a edição do genoma mediada por CRISPR. Fig. 10A proporciona uma ilustração esquemática de CRISPR 1 de S. thermophilus LMD-9. A Figura 10B ilustra a criação de um sistema de expressão para o sistema CRISPR de S. thermophilus. hStCas9 otimizada para códons humanos é expresso usando um promotor EF1α constitutivo. Versões maduras de tracrRNA e crRNA são expressas usando o promotor U6 para promover a iniciação da transcrição exata. Sequências do crRNA e tracrRNA maduros são ilustrados. Uma única base indicada pela letra minúscula "a" na sequência crRNA é utilizada para remover a sequência polyU, que serve como um terminador de transcrição de RNA polIII. Fig. 10C proporciona um esquema mostrando as sequências guia direcionadas para o local EMX1 humano. Fig. 10D mostra os resultados da clivagem mediada por hStCas9 no local alvo, utilizando o ensaio Surveyor. Espaçadores de RNA guia 1 e 2 induziram 14% e 6,4%, respectivamente. A análise estatística da atividade de clivagem na réplica biológica nestes dois locais do protoespaçador também é fornecida na Fig. 5. A Fig. 14 providência um esquema do protoespaçador adicional e correspondentes alvos de sequência PAM do sistema CRISPR de S. thermophilus em um local EMX1 humano. Duas sequências de protoespaçadoras são destacadas e as suas sequências correspondentes PAM que satisfazem o motivo NNAGAAW estão indicadas a sublinhado 3' em relação à sequência correspondente em destaque. Ambos os protoespaçadores visam a cadeia antissenso.

Exemplo 3: Algoritmo de seleção de sequência de amostra alvo

[0933] Um programa de software é projetado para identificar sequências alvo CRISPR candidatas em ambas as cadeias, de uma sequência de DNA de entrada com base no comprimento da sequência guia desejada e uma sequência do motivo CRISPR (PAM) para uma enzima CRISPR especificada. Por exemplo, os locais alvo para Cas9 de S. pyogenes, com sequências NGG de PAM, podem ser identificados através da procura de 5'-Nx-NGG-3', tanto na sequência de entrada como no complemento reverso da entrada. Da mesma forma, os locais-alvo para Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus, com sequência NNAGAAW de PAM, podem ser identificados através da procura de 5'-Nx- NNAGAAW-3', tanto na sequência de entrada e no reverso do complemento da entrada. Da mesma forma, os locais-alvo para Cas9 de CRISPR3 de S. thermophilus, com sequência NGGNG de PAM, podem ser identificados através da procura de 5'-Nx-NGGNG- 3', tanto na sequência de entrada e no reverso do complemento da entrada. O valor "x" em Nx pode ser fixado pelo programa ou especificado pelo usuário, como 20.

[0934] Uma vez que várias ocorrências no genoma do local alvo do DNA podem conduzir a edição do genoma não específica, após a identificação de todos os locais potenciais, o programa filtra as sequências com base no número de vezes que aparecem no genoma de referência relevante. Para essas enzimas CRISPR para as quais a especificidade de sequência é determinada por uma sequência "semente", tais como o 11-12bp 5' da sequência de PAM, incluindo a própria sequência PAM, o passo de filtragem pode basear-se na sequência de semente. Assim, para evitar a edição em locais genômico adicional, os resultados são filtrados com base no número de ocorrências da semente:sequência PAM no genoma relevante. O utilizador pode ser autorizado a escolher o comprimento da sequência semente. Também é permitido o usuário especificar o número de ocorrências da semente:sequência PAM em um genoma para fins de passagem do filtro. O padrão é para rastreio de sequências únicas. O nível de filtragem é alterado mudando o comprimento da sequência de semente e o número de ocorrências da sequência no genoma. O programa pode, em adição ou em alternativa, fornecer a sequência de uma sequência guia complementar da sequência(s) alvo relatada(s) fornecendo o complemento inverso da sequência(s) alvo identificada(s). Um exemplo de visualização de alguns locais alvo no genoma humano é fornecido na Fig. 18.

[0935] Mais detalhes de métodos e algoritmos para otimizar a seleção de sequências podem ser encontrados no pedido EUA N° 61/064.798 (Registro do procurador 44790.11.2022; Referência Broad BI-2012/084); aqui incorporado por referência.

Exemplo 4: Avaliação de híbridos crRNA-tracrRNA múltiplos quiméricos

[0936] Este exemplo descreve os resultados obtidos para RNAs quiméricos (chiRNAs; que compreende uma sequência guia, uma sequência tracr mate, e uma sequência tracr em um único transcrito) tendo sequências tracr que incorporam diferentes comprimentos de sequência tracrRNA de tipo selvagem. A Fig.16a ilustra um diagrama esquemático de um vetor de expressão bicistrônico para RNA quimérico e Cas9. Cas9 é dirigido pelo promotor de CBh e o RNA quimérico é dirigido por um promotor U6. O RNA guia quimérico consiste em uma sequência guia de 20 pb (Ns) ligada à sequência tracr (compreendido entre o primeiro "U" da cadeia inferior ao fim da transcrição), a qual é truncada em várias posições como indicado. As sequências guia e tracr são separadas pela sequência tracr mate GUUUUAGAGCUA (SEQ ID NO:__) seguida da sequência em ansa GAAA. Resultados de ensaios SURVEYOR para indels mediadas por Cas9 em locais EMX1 e PVALB humano são ilustrados nas Figs. 16b e 16c, respectivamente. As setas indicam os fragmentos SURVEYOR esperados. ChiRNAs são indicadas pela designação "+n" e crRNA refere-se a um RNA híbrido no qual as sequências guia e tracr são expressas como transcritos separados. A quantificação destes resultados, realizados em triplicado, são ilustrados por histograma nas Figs. 17a e 17b, correspondentes às Figs. 16b e 16c, respectivamente ("N.D." indica que não há indels detectados). IDs protoespaçadores e seus alvos genômicos correspondentes, sequência de protoespaçadora, sequência PAM, e localização da cadeia são fornecidos na Tabela D. Sequências guias foram desenhadas para serem complementares à sequência inteira de protoespaçadores no caso de transcritos separados no sistema híbrido, ou apenas para a porção sublinhada no caso de RNAs quiméricos. Tabela D:

[0937] Estas são SEQ ID NOs: __ a __, respectivamente.

[0938] Mais detalhes para otimizar sequências guias podem ser encontrados no pedido EUA N° 61/836.127 (Registro do procurador 44790.08.2022; Referência Broad BI-2013/004G); aqui incorporado por referência.

[0939] Inicialmente, foram alvo três locais dentro do local EMX1 em células HEK 293FT humanas. A eficiência de modificação do genoma de cada chiRNA foi avaliada utilizando o ensaio de nuclease SURVEYOR, que detecta mutações resultantes da quebra de DNA de cadeia dupla (DSBs) e sua posterior reparação pela via de reparação de danos de junção das extremidades não homóloga (NHEJ). As construções designadas por chiRNA(+n) indicam que até ao nucleotídeo +n de tacrRNA tipo selvagem é incluído na construção de RNA quimérico, com valores de 48, 54, 67, 85, e usado para n. RNAs quiméricos contendo fragmentos mais longos de tracrRNA tipo selvagem (chiRNA(+67) e chiRNA(+85)) mediaram a clivagem de DNA em todos os três locais alvo EMX1, com chiRNA(+85), em especial, demonstrando níveis significativamente mais elevados de clivagem de DNA do que os híbridos crRNA/tracrRNA correspondentes que expressaram sequências guia e tracr em transcrições separadas (Fig. 16b e 17a). Dois locais no local PVALB que não renderam nenhuma clivagem detectávelusando o sistema híbrido (sequência guia e sequência tracr expressa como transcritos separados) também foram rotuladas usando chiRNAs. chiRNA(+67) e chiRNA(+85) foram capazes de mediar uma clivagem significativa nos dois protoespaçadores PVALB (Figs. 16c e 17b).

[0940] Para todos os cinco alvos no locais EMX1 e PVALB, um aumento consistente na eficiência da modificação do genoma com o aumento do comprimento da sequência tracr foi observado. Sem se pretender ficar limitado por qualquer teoria, a estrutura secundária formada pela extremidade 3' do tracrRNA pode desempenhar um papel no aumento da taxa de formação do complexo CRISPR.

Exemplo 5: Diversidade de Cas9

[0941] O sistema CRISPR-Cas é um mecanismo imune adaptativo contra a invasão de DNA exógeno de diversas espécies de bactérias e archaea. O sistema CRISPR-Cas9 tipo II consiste em um conjunto de genes codificando proteínas responsáveis pela "aquisição" de DNA estranho no local CRISPR, assim como um conjunto de genes codificando a "execução" do mecanismo de clivagem de DNA; estes incluem a nuclease de DNA (Cas9), cr- RNA de transativação não-codificante (tracrRNA), e uma matriz de espaçadores derivados de DNA estranho flanqueado por repetições diretas (crRNAs). Após a maturação por Cas9, o duplex tracRNA e crRNA guiam a nuclease Cas9 a uma sequência de DNA alvo especificado pelas sequências guia do espaçador, e medeiam as quebras de cadeia dupla no DNA perto de um curto motivo de sequência no DNA alvo que é necessário para a clivagem e específico para cada sistema CRISPR-Cas. Os sistemas CRISPR-Cas tipo II são encontrados em todo o reino bacteriano e altamente diversificado em sequência e tamanho da proteína Cas9, sequência de repetição direta tracrRNA e crRNA, organização do genoma destes elementos, bem como o motivo requerido para a clivagem alvo. Uma espécie pode ter vários sistemas CRISPR-Cas distintos.

[0942] Os Requerentes avaliaram 207 Cas9s putativas de espécies de bactérias identificadas com base em homologia de sequência com Cas9s e estruturas ortólogas para subdomínios conhecidos, incluindo o domínio HNH da endonuclease e os domínios RuvC da endonuclease [Informações de Eugene Koonin e Kira Makarova]. A análise filogenética baseada na conservação da sequência da proteína deste grupo revelou cinco famílias de Cas9s, incluindo três grupos de grande Cas9s (~1400 aminoácidos) e dois da pequena Cas9s (~1100 aminoácidos) (ver Fig. 19 e 20A-F).

[0943] Mais detalhes da Cas9s e mutações da enzima Cas9 de se converter em uma nickase ou proteína de ligação a DNA e utilização da mesma com a funcionalidade alterada podem ser encontradas no pedido EUA Série N°s 61/836.101 e 61/835.936 (Registro do Procurador 44790.09.2022 e 4790.07.2022 e Referência Broad BI-2013/004E e BI-2013/004F, respectivamente), aqui incorporado por referência.

Exemplo 6: Ortólogos de Cas9

[0944] Os Requerentes analisaramortólogas Cas9 para identificar as sequências PAM relevantes e o correspondente RNA guia quimérico. Tendo um conjunto expandido de PAMs fornece um mais amplo alvo em todo o genoma e também aumenta significativamente o número de locais alvo únicos e oferece potencial para a identificação de novas Cas9s com o aumento dos níveis de especificidade no genoma.

[0945] A especificidade de ortólogas Cas9 pode ser avaliada testando a capacidade de cada Cas9 de tolerar o desajustamento entre o RNA guia e o seu DNA alvo. Por exemplo, a especificidade de SpCas9 foi caracterizada por testar o efeito de mutações no RNA guia sobre a eficiência de clivagem. As bibliotecas de RNA guia foram feitas com desemparelhamentos únicos ou múltiplos entre a sequência guia e o DNA alvo. Com base nestas constatações, os locais-alvo para SpCas9 podem ser selecionados com base nas seguintes regras:

[0946] Para maximizara a especificidade de SpCas9 para a edição de um gene particular, deve-se escolher um local alvo dentro do local de interesse, esse potencial "fora de alvo" de sequências genômicas cumpre as seguintes quatro restrições: Em primeiro lugar, eles não devem ser seguidos por um PAM quer com sequências 5'-NGG ou NAG. Em segundo lugar, a semelhança de sequência global para a sequência alvo deve ser minimizada. Em terceiro lugar, um número máximo de desemparelhamentos deve situar-se dentro da região de PAM próxima do local fora do alvo. Finalmente, um número máximo de incompatibilidades devem ser consecutivas ou separadas por menos de quatro bases.

[0947] Métodos semelhantes podem ser utilizados para avaliar a especificidade de outras ortólogas Cas9 e para estabelecer critérios para a seleção dos locais alvo específicos dentro dos genomas de espécies alvo. Como mencionado anteriormente, a análise filogenética baseada na conservação da sequência da proteína deste grupo revelou cinco famílias de Cas9s, incluindo três grupos de grande Cas9s (~1400 aminoácidos) e dois da pequena Cas9s (~1100 aminoácidos) (ver Fig. 19 e 20A-F). Mais detalhes sobre ortólogos Cas podem ser encontrados no pedido EUA Series N°s 61/836.101 e 61/835.936 (Registro do procurador 44790.09.2022 e 4790.07.2022 e Referência Broad BI-2013/004E e BI-2013/004F respectivamente) aqui incorporados por referência.

Exemplo 7: Melhoramento metodológico para simplificar a clonagem e aplicação.

[0948] Ao invés de codificar o promotor U6 e RNA guia em um plasmídeo, os Requerentes amplificaram o promotor U6 com um oligo DNA a acrescentar sobre o RNA guia. O produto de PCR resultante pode ser transfectado para as células para guiar a expressão do RNA guia.

[0949] Exemplo de par de iniciadores que permite a geração de um produto de PCR que consiste em promotor U6:RNA guia direcionando para local EMX1 humano:

[0950] Iniciador direto: AAACTCTAGAgagggcctatttcccatgattc (SEQ ID NO:__)

[0951] Iniciador reverso (transportando o RNA guia, que está a sublinhado) acctcta gAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACT AGCCTTATTTTAACTTGCTATGCTGTTTTGTTTCCAAAACAGCATAGCTCTAAAACCCCT AGTCATTGGAGGTGACGGTGTTTCGTCCTTTCCACaag (SEQ ID NO: )

Exemplo 8: Aperfeiçoamento metodológico para melhorar a atividade:

[0952] Em vez de utilizar promotores pol3, em particular RNA polimerase III (por exemplo, promotores U6 ou H1), para expressar RNA guia em células eucarióticas, os Requerentes expressam a polimerase T7 em células eucarióticas para conduzir a expressão de RNAs guia utilizando o promotor T7.

[0953] Um exemplo deste sistema pode envolver a introdução de três fragmentos de DNA:

[0954] 1. vetor de expressão para Cas9

[0955] 2. vetor de expressão para promotor T7

[0956] 3. vetor de expressão contendo RNA guia fundido com o promotor T7

Exemplo 9: Aperfeiçoamento metodológico para reduzir a toxicidade de Cas9: aplicação de Cas9 sob a forma de mRNA.

[0957] A aplicação de Cas9 sob a forma de mRNA permite a expressão transiente em células de Cas9, para reduzir a toxicidade. Por exemplo, SpCas9 humanizada pode ser amplificada utilizando o par de iniciadores seguinte:

[0958] Iniciador direto (a acrescentar sobre o promotor T7 para transcrição in vitro): TAATACGACTCACTATAGGAAGTGCGCCACCATGGCCCCAAAGAAGAAGCGG (SEQ ID NO: )

[0959] Iniciador reverso (a acrescentar à cuada poliA): GGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTttcttaCTTTTTCTTTTTTGCCT GGCCG (SEQ ID NO:__)

[0960] Os Requerentes transfectaram o mRNA Cas9 em células, quer com RNA guia na forma de RNA ou cassetes de DNA para conduzir a expressão do RNA guia em células eucarióticas.

Exemplo 10: Aperfeiçoamento metodológico para reduzir a toxicidade de Cas9: Utilização de um promotor indutível

[0961] Os Requerentes transitoriamente ativaram a expressão de Cas9 somente quando ela é necessária para a realização de modificação do genoma. Exemplos de sistema induzíveis incluem promotores tetraciclina induzidos (Tet- ligado ou Tet-desligado), e sistemas de ativação da transcrição de moléculas pequenas de dois híbridos (FKBP, ABA, etc.), ou sistemas induzíveis de luz (Fitocromo, domínios LOV, ou criptocromo).

Exemplo 11: Melhoria do sistema de Cas9 para aplicação in vivo

[0962] Os Requerentes realizaram uma busca metagenômica para uma Cas9 com peso molecular pequeno. A maioria das homólogas de Cas9 são bastante grandes. Por exemplo, SpCas9 é de cerca de 1368aa de comprimento, a qual é demasiado grande para ser facilmente involucrada em vetores virais para a aplicação. Um gráfico que representa a distribuição do comprimento de homólogas de Cas9 é gerado a partir de sequências depositadas no GenBank (Fig. 23). Algumas das sequências podem ter sido mal anotada e, portanto, a frequência exata para cada comprimento pode não ser necessariamente precisa. No entanto, fornecem uma visão da distribuição de proteínas Cas9 e sugerem que há homólogas de Cas9 mais curtas.

[0963] Através da análise computacional, os Requerentes verificaram que, na estirpe bacteriana Campylobacter, há duas proteínas Cas9 com menos do que 1000 aminoácidos. A sequência para uma Cas9 de Campylobacter jejuni é apresentada a seguir. Neste comprimento, CjCas9 pode ser facilmente involucrada em AAV, lentivírus, adenovírus, e outros vetores virais para aplicação robusta em células primárias e em modelos animais in vivo. em uma forma de realização preferencial da invenção, a proteína Cas9 de S. aureus é utilizada.

[0964] > Cas9 de Campylobacter jejuni (CjCas9)

[0965] MARILAFDIGISSIGWAFSENDELKDCGVRIFTKVENPKTGESLAL PRRLARSARKRLARRKARLNHLKHLIANEFKLNYEDYQSFDESLAKAYKGSLISPYELRF RALNELLSKQDFARVILHIAKRRGYDDIKNSDDKEKGAILKAIKQNEEKLANYQSVGEYL YKEYFQKFKENSKEFTNVRNKKESYERCIAQSFLKDELKLIFKKQREFGFSFSKKFEEEV LSVAFYKRALKDFSHLVGNCSFFTDEKRAPKNSPLAFMFVALTRIINLLNNLKNTEGILY TKDDLNALLNEVLKNGTLTYKQTKKLLGLSDDYEFKGEKGTYFIEFKKYKEFIKALGEHN LSQDDLNEIAKDITLIKDEIKLKKALAKYDLNQNQIDSLSKLEFKDHLNISFKALKLVTP LMLEGKKYDEACNELNLKVAINEDKKDFLPAFNETYYKDEVTNPVVLRAIKEYRKVLNAL LKKYGKVHKINIELAREVGKNHSQRAKIEKEQNENYKAKKDAELECEKLGLKINSKNILK LRLFKEQKEFCAYSGEKIKISDLQDEKMLEIDHIYPYSRSFDDSYMNKVLVFTKQNQEKL NQTPFEAFGNDSAKWQKIEVLAKNLPTKKQKRILDKNYKDKEQKNFKDRNLNDTRYIARL VLNYTKDYLDFLPLSDDENTKLNDTQKGSKVHVEAKSGMLTSALRHTWGFSAKDRNNHLH HAIDAVIIAYANNSIVKAFSDFKKEQESNSAELYAKKISELDYKNKRKFFEPFSGFRQKV LDKIDEIFVSKPERKKPSGALHEETFRKEEEFYQSYGGKEGVLKALELGKIRKVNGKIVK NGDMFRVDIFKHKKTNKFYAVPIYTMDFALKVLPNKAVARSKKGEIKDWILMDENYEFCF SLYKDSLILIQTKDMQEPEFVYYNAFTSSTVSLIVSKHDNKFETLSKNQKILFKNANEKE VIAKSIGIQNLKVFEKYIVSALGEVTKAEFRQREDFKK. (SEQ ID NO:__)

[0966] O elemento tracrRNA putativo para esta CjCas9 é:

[0967] TATAATCTCATAAGAAATTTAAAAAGGGACTAAAATAAA GAGTTTGCGGGACTCTGCGGGGTTACAATCCCCTAAAACCGCTTTTAAAATT (SEQ ID NO:__)

[0968] A sequência de Repetição Direta é:

[0969] ATTTTACCATAAAGAAATTTAAAAAGGGACTAAAAC (SEQ ID NO:__)

[0970] Um exemplo de um RNA guia quimérico para CjCas9 é:

[0971] NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGUCCCGAAAGGG ACUAAAAUAAAGAGUUUGCGGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU (SEQ ID NO:__)

Exemplo 12: Otimização de Cas9

[0972] Para uma função aumentada ou para desenvolver novas funções, os Requerentes geraram proteínas Cas9 quiméricas, combinando fragmentos de diferentes homólogas de Cas9. Por exemplo, dois exemplos de proteínas quiméricas Cas9:

[0973] Por exemplo, os Requerentes fundiram o N- terminal de St1Cas9 (fragmento desta proteína está a negrito) com C-termo de SpCas9 (fragmento desta proteína está sublinhado).

[0974] >St1(N)Sp(C)Cas9

[0975] MSDLVLGLDIGIGSVGVGILNKVTGEIIHKNSRIFPAAQAENNLVR RTNRQGRRLARRKKHRRVRLNRLFEESGLITDFTKISINLNPYQLRVKGLTDELSNEELF IALKNMVKHRGISYLDDASDDGNSSVGDYAQIVKENSKQLETKTPGQIQLERYQTYGQLR GDFTVEKDGKKHRLINVFPTSAYRSEALRILQTQQEFNPQITDEFINRYLEILTGKRKYY HGPGNEKSRTDYGRYRTSGETLDNIFGILIGKCTFYPDEFRAAKASYTAQEFNLLNDLNN LTVPTETKKLSKEQKNQIINYVKNEKAMGPAKLFKYIAKLLSCDVADIKGYRIDKSGKAE IHTFEAYRKMKTLETLDIEQMDRETLDKLAYVLTLNTEREGIQEALEHEFADGSFSQKQV DELVQFRKANSSIFGKGWHNFSVKLMMELIPELYETSEEQMTILTRLGKQKTTSSSNKTK YIDEKLLTEEIYNPVVAKSVRQAIKIVNAAIKEYGDFDNIVIEMARENQTTQKGQKNSRE RMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVD HIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDN LTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLK SKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVR KMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRD FATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTV AYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLP KYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFV EQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLG APAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD (SEQ ID NO: )

[0976] >Sp(N)St1(C)Cas9

[0977] MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKN LIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFL VEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRG HFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLI AQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQY ADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEK YKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFD NGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMT RKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTK VKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDR FNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDK VMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKE DIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARE TNEDDEKKAIQKIQKANKDEKDAAMLKAANQYNGKAELPHSVFHGHKQLATKIRLWHQQG ERCLYTGKTISIHDLINNSNQFEVDHILPLSITFDDSLANKVLVYATANQEKGQRTPYQA LDSMDDAWSFRELKAFVRESKTLSNKKKEYLLTEEDISKFDVRKKFIERNLVDTRYASRV VLNALQEHFRAHKIDTKVSVVRGQFTSQLRRHWGIEKTRDTYHHHAVDALIIAASSQLNL WKKQKNTLVSYSEDQLLDIETGELISDDEYKESVFKAPYQHFVDTLKSKEFEDSILFSYQ VDSKFNRKISDATIYATRQAKVGKDKADETYVLGKIKDIYTQDGYDAFMKIYKKDKSKFL MYRHDPQTFEKVIEPILENYPNKQINEKGKEVPCNPFLKYKEEHGYIRKYSKKGNGPEIK SLKYYDSKLGNHIDITPKDSNNKVVLQSVSPWRADVYFNKTTGKYEILGLKYADLQFEKG TGTYKISQEKYNDIKKKEGVDSDSEFKFTLYKNDLLLVKDTETKEQQLFRFLSRTMPKQK HYVELKPYDKQKFEGGEALIKVLGNVANSGQCKKGLGKSNISIYKVRTDVLGNQHIIKNE GDKPKLDF (SEQ ID NO:__)

[0978] Os benefícios de gerar Cas9 quiméricas incluem:

[0979] reduzir a toxicidade

[0980] melhorar a expressão em células eucariotas

[0981] melhorar a especificidade

[0982] reduzir o peso molecular da proteína, fazer a proteína menor combinando os menores domínios de diferentes homólogos de Cas9.

[0983] Alterar o requerimento da sequência PAM

Exemplo 13: Utilização de Cas9 como uma proteína de ligação a DNA genéricos

[0984] Os Requerentes usaram a Cas9 como um DNA genérico ligando a proteína por mutação dos dois domínios catalíticos (D10 e H840) responsáveis por clivarem de ambas as cadeias do DNA alvo. A fim de regular positivamente a transcrição do gene nos locais alvo os Requerentes fundiram o domínio de ativação transcricional (VP64) a Cas9. Os Requerentes colocaram a hipótese de que seria importante para ver uma forte localização nuclear da proteína de fusão Cas9- VP64 porque a força da ativação do fator de transcrição é uma função do tempo gasto para o alvo. Por conseguinte, os Requerentes clonaram um conjunto de construções de Cas9-VP64- GFP, transfectaram em células 293 e avaliaram a sua localização sob um microscópio fluorescente 12 horas após a transfecção.

[0985] As mesmas construções foram clonadas como 2A- GFP em vez de uma fusão direta, a fim de testar a funcionalidade das construções sem a presença de GFP volumoso para interferir. Os Requerentes elegeram como alvo o local Sox2 com o transativador Cas9 porque poderia ser útil para a reprogramação celular e o local já foi validado como um alvo para a ativação da transcrição mediada por TALE-TL. Para o local Sox2, os Requerentes escolheram oito alvos perto do local de início da transcrição (TSS). Cada alvo tinha 20 pb de comprimento com um motivo adjacente vizinho protoespaçador NGG (PAM). Cada construção Cas9-VP64 foi cotransfectada com cada RNA crispr quimérico (chiRNA), gerado por PCR, em 293 células. 72 horas após a transfecção a ativação da transcrição foram avaliada por meio de RT-qPCR.

[0986] A fim de otimizar ainda mais o ativador da transcrição, os Requerentes titularam a proporção de chiRNA (Sox2.1 e Sox2.5) para Cas9 (NLS-VP64-NLS-hSpCas9-NLS-VP64- NLS), transfectado em células 293, e quantificaram utilizando RT-qPCR. Estes resultados indicam que Cas9 pode ser usado como um domínio de ligação de DNA genérico para supra-regular a transcrição de genes em um local alvo.

[0987] Os Requerentes projetaram uma segunda geração de construções. (Tabela em baixo).

[0988] Os Requerentes usaram essas construções para avaliar a ativação transcricional (construções fundidas de VP64) e repressão (apenas Cas9) por RT-qPCR. Os Requerentes avaliaram a localização celular de cada construção utilizando o anticorpo anti-His, atividade de nuclease utilizando um ensaio de nuclease Surveyor, e a afinidade de ligação do DNA utilizando um ensaio de desvio em gel. Em uma forma de realização preferencial da invenção, o ensaio de desvio em gel é um teste de desvio de gel EMSA.

Exemplo 14: Cas9 transgênica e reativação em camundongos

[0989] Para gerar um camundongo que expressa a nuclease Cas9, os Requerentes apresentaram duas estratégias gerais, transgênicos e reativação. Estas estratégias podem ser aplicadas para gerar qualquer outro modelo de organismo de interesse, por exemplo, Rato. Para cada uma das estratégias gerais, os Requerentes fizeram uma Cas9 constitutivamente ativa e uma Cas9 que é condicionalmente expressa (dependente de Cre recombinase). A nuclease Cas9 constitutivamente ativa é expressa no seguinte contexto: pCAG-NLS-Cas9-NLS-P2A-EGFP-WPRE-bGHpoliA. pCAG é o promotor, o NLS é um sinal de localização nuclear, P2A é a sequência de clivagem do péptido, EGFP é proteína verde fluorescente melhorada, WPRE é o elemento regulatório pós-transcricional do vírus da hepatite "woodchuck" e bGHpoliA é a sequência sinal poli-A da hormona de crescimento de bovino (Figs. 25A- B). A versão condicional tem um elemento de cassete de paragem adicional, loxP-SV40 poliA x3-loxP, após o promotor e antes de NLS-Cas9-NLS (isto é pCAG-loxP-SV40polyAx3-loxP-NLS-Cas9- NLS-P2A-EGFP-WPRE-bGHpoliA). Os elementos de expressão importantes podem ser visualizados como na Fig. 26. A construção constitutiva deve ser expressa em todos os tipos de células ao longo do desenvolvimento, ao passo que, a construção condicional só permite a expressão Cas9 quando a mesma célula está a expressar a recombinase Cre. Esta última versão irá permitir a expressão específica de tecido de Cas9 quando Cre está sob a expressão de um promotor específico do tecido. Além disso, a expressão Cas9 podia ser induzida em camundongos adultos colocando Cre sob a expressão de um promotor induzível tal como o TET ligado ou desligado do sistema.

[0990] Validação das construções Cas9: Cada plasmídeo foi validado funcionalmente em três maneiras: 1) transfecção transiente em células 293, seguido de confirmação da expressão de GFP; 2) transfecção transiente em células 293, seguido de imunofluorescência, utilizando um anticorpo reconhecendo a sequência P2A; e 3) a transfecção transitória seguida por ensaio de nuclease Surveyor. As células 293 podem ser células 293FT ou 293T em função das células que são de interesse. Em uma forma de realização preferencial, as células são células 293FT. Os resultados do Surveyor foram corridos para fora na linha de topo e de fundo do gel para as construções condicionais e constitutivas, respectivamente. Cada foi testado na presença e ausência de RNA quimérico direcionado para o local hEMX1 (RNA quimérico hEMX1.1). Os resultados indicam que a construção pode visar, com sucesso, o local hEMX1 apenas na presença de RNA quimérico (e Cre no caso condicional). O gel foi quantificado e os resultados são apresentados como a média da eficiência de corte e o desvio padrão para três amostras.

[0991] Camundongo transgênico Cas9: Para gerar camundongos transgênicos com construções, os Requerentes injetaram DNA puro, linear no pró-núcleo de um zigoto de uma fêmea CB56 pseudo-grávida. Fundadores são identificados, genotipados, e retrocruzados para os camundongos CB57. As construções foram, com sucesso, clonadas e verificadas por sequenciação de Sanger.

[0992] Reativação em camundongo Cas9: Para gerar uma Cas9 reativada em camundongos, os Requerentes tiveram como alvo as mesmas construções constitutivas e condicionais a um local Rosa26. Os Requerentes fizeram isso por clonagem de cada um em um vetor de direcionamento Rosa26 com os seguintes elementos: Braço de homologia curta Rosa26 - cassete de expressão Cas9 constitutiva/condicional - Braço de homologia longa pPGK-Neo-Rosa26 - pPGK-DTA. pPGK é o promotor para o marcador Neo de seleção positiva, que confere resistência à neomicina, um braço curto de 1 kb, um braço longo de 4,3 kb, e uma toxina difteria de seleção negativa (DTA) accionada por PGK.

[0993] As duas construções foram eletroporadas em R1 mESCs e deixou-se crescer durante 2 dias antes da seleção com neomicina ser aplicada. As colônias individuais que sobreviveram por 5-7 dias foram repicadas e cultivadas em poços individuais. 5-7 dias mais tarde, as colônias foram colhidas, metade foi congelada e a outra metade foi utilizada para determinação do genótipo. A genotipagem foi realizada por PCR genômico, em que um iniciador hibridado dentro do plasmídeo dador (AttpF) e o lado de fora do braço de homologia curta (Rosa26-R) das 22 colônias colhidas para o caso condicional, 7 foram positivas (Esquerda). Das 27 colônias colhidas para o caso constitutivo, zero foram positivas (Direita). É provável que Cas9 faz causa algum grau de toxicidade no mESC e por esse motivo não foram clones positivos. Para estes testar, os Requerentes introduziram um plasmídeo de expressão Cre nas células Cas9 condicionais corretamente direcionadas e verificaram uma toxicidade muito baixa depois de muitos dias em cultura. O reduzido número de cópias de Cas9 em células Cas9 condicionais corretamente direcionadas (1-2 cópias por célula) é suficiente para permitir a expressão estável e uma não citotoxicidade. Além disso, estes dados indicam que o número de cópias Cas9 determina a toxicidade. Após a eletroporação cada célula deve obter várias cópias de Cas9 e isto é provavelmente porque não foram encontradas colônias positivas no caso da construção Cas9 constitutiva. Isto proporciona uma forte evidência de que a utilização de uma estratégia dependente de Cre e condicional deve mostrar uma toxicidade reduzida. Os Requerentes injetam células corretamente direcionadas em um blastocisto e implantam em um rato fêmea. Quiméricos são identificados e retrocruzados. Fundadores são identificados e genotipados.

[0994] Utilidade do camundongo Cas9 condicional: os Requerentes mostraram em 293 células que a construção de expressão condicional Cas9 pode ser ativada por coexpressão com Cre. Os Requerentes mostraram ainda que o R1 mESCs corretamente alvejado pode ter Cas9 ativa quando se expressa Cre. Porque a Cas9 é seguida pela sequência peptídica de clivagem P2A e então EGFP, os Requerentes identificam a expressão bem-sucedida observando EGFP. Este mesmo conceito é que torna o camundongo Cas9 condicional útil. Os Requerentes podem cruzar o seu camundongo Cas9 condicional com um camundongo que expressa ubiquamente Cre (linha ACTB-Cre) e podem chegar ao camundongo que expressa Cas9 em todas as células. Deve ter-se apenas a aplicação do RNA quimérico para induzir a edição de genoma em camundongos embrionários ou adultos. Curiosamente, se o camundongo Cas9 condicional é cruzado com um camundongo expressando Cre sob um promotor específico de tecido, deve haver apenas Cas9 nos tecidos expressando também Cre. Esta abordagem pode ser usada para editar o genoma somente em tecidos precisos aplicando RNA quimérico ao mesmo tecido.

Exemplo 15: Diversidade Cas9 e RNAs quiméricos

[0995] O sistema CRISPR-Cas é um mecanismo imune adaptativo contra a invasão de DNA exógeno de diversas espécies de bactérias e archaea. O sistema CRISPR-Cas tipo II consiste em um conjunto de genes codificando proteínas responsáveispela "aquisição" de DNA estranho no local CRISPR, assim como um conjunto de genes codificando a "execução" do mecanismo de clivagem de DNA; estes incluem a nuclease de DNA (Cas9), cr- RNA de transativação não-codificante (tracrRNA), e uma matriz de espaçadores derivados de DNA estranho flanqueado por repetições diretas (crRNAs). Após a maturação por Cas9, o duplex tracrRNA e crRNA guiam a nuclease Cas9 a uma sequência de DNA alvo especificado pelas sequências guia do espaçador, e medeia as quebras de cadeia dupla no DNA perto de um curto motivo de sequência no DNA alvo que é necessário para a clivagem e específico para cada sistema CRISPR-Cas. Os sistemas CRISPR-Cas tipo II são encontrados em todo o reino bacteriano e altamente diversificado em sequência e tamanho da proteína Cas9, sequência de repetição direta tracrRNA e crRNA, organização do genoma destes elementos, bem como o motivo requerido para a clivagem alvo. Uma espécie pode ter vários sistemas CRISPR-Cas distintos.

[0996] Os Requerentes avaliaram 207 Cas9s putativas de espécies de bactérias identificadas com base em homologia de sequência com Cas9s e estruturas ortólogas para subdomínios conhecidos, incluindo o domínio HNH da endonuclease e os domínios RuvC da endonuclease [Informações de Eugene Koonin e Kira Makarova]. A análise filogenética baseada na conservação da sequência da proteína deste grupo revelou cinco famílias de Cas9s, incluindo três grupos de grande Cas9s (~1400 aminoácidos) e dois da pequena Cas9s (~1100 aminoácidos) (Fig. 19A-D e 20A-F).

[0997] Os Requerentes também otimizaram RNA guia de Cas9 usando métodos in vitro.

Exemplo 16: Mutações de Cas9

[0998] Neste exemplo, os Requerentes demonstram que as seguintes mutações podem converter SpCas9 em uma enzima de corte: D10A, E762A, H840A, N854A, N863A, D986A.

[0999] Os Requerentes providenciam sequências que mostram onde os pontos de mutação são localizados dentro do gene SpCas9 (Fig. 24A-M). Os Requerentes também demonstram que as nickases são ainda capazes de mediar a recombinação homóloga. Além disso, os Requerentes mostram que SpCas9 com estas mutações (individualmente) não induzem a rutura dupla da cadeia.

[1000] Ortólogos de Cas9 partilham todos a organização geral de domínios 3-4 RuvC e um domínio HNH. O domínio RuvC mais 5' cliva a cadeia não complementar, e o domínio HNH cliva a cadeia complementar. Todas as notações são em referência à sequência guia.

[1001] O resíduo catalítico no domínio 5’ RuvC é identificado através da comparação de homologia da Cas9 de interesse com outras Cas9 ortólogas (de local de CRISPR tipo II de S. pyogenes, local 1 de CRISPR de S. thermophilus, local 3 de CRISPR de S. thermophilus, e Franciscilla novicida tipo II local de CRISPR), e o resíduo Asp conservado (D10) é modificado para alanina para converter Cas9 em uma enzima de corte de cadeia complementar. De modo semelhante, os resíduos His e Asn conservados no domínio HNH são modificados para Alanina para converter Cas9 em uma enzima de corte não de cadeia complementar.

Exemplo 17: Ativação Transcricional de Cas9 e Repressor Cas9

[1002] Ativação Cas9 Transcriptional

[1003] Uma segunda geração de construções foi concebida e testada (Tabela 1). Essas construções são usadas para avaliar a ativação transcricional (construções fundidas de VP64) e repressão (apenas Cas9) por RT-qPCR. Os Requerentes avaliaram a localização celular de cada construção utilizando o anticorpo anti-His, atividade de nuclease utilizando um ensaio de nuclease Surveyor, e a afinidade de ligação do DNA utilizando um ensaio de desvio em gel.

[1004] Repressor de Cas

[1005] Foi demonstrado anteriormente que dCas9 pode ser usado como um domínio de ligação de DNA genérico para reprimir a expressão do gene. Os Requerentes relatam um design melhorado de dCas9, bem como fusões dCas9 aos domínios repressores KRAB e SID4x. A partir da biblioteca de plasmídeos criada para modular a transcrição usando Cas9, na Tabela 1, os seguintes plasmídeos repressores foram funcionalmente caracterizados por qPCR: pXRP27, pXRP28, pXRP29, pXRP48, pXRP49, pXRP50, pXRP51, pXRP52, pXRP53, pXRP56, pXRP58, pXRP59, pXRP61, e pXRP62.

[1006] Cada plasmídeo repressor dCas9 foi cotransfectado com dois RNAs guias direcionados para a cadeia codificante do gene da beta-catenina. O RNA foi isolado 72 horas após a transfecção e a expressão do gene foi quantificada por RT-qPCR. O controlo do gene endógeno foi GAPDH. Dois shRNAs validados foram utilizados como controlos positivos. Os controlos negativos foram determinados plasmídeos transfectados sem gRNA, estes são designados por "controle pXRP##". Os plasmídeos pXRP28, pXRP29, pXRP48, e pXRP49 podem reprimir o gene da beta-catenina quando se utiliza a estratégia de direcionamento especificada. Estes plasmídeos correspondem à dCas9 sem um domínio funcional (pXRP28 e pXRP28) e dCas9 fundido com SID4x (pXRP48 e pXRP49).

[1007] Trabalho adicional investiga: repetição da experiência acima, tendo como alvo diferentes genes, utilizando outros gRNAs para determinar a posição de direcionamento ótima, e repressão multiplexada.

[1008] Tabela 1 Exemplo 18: Eliminação dirigida dos genes envolvidos na biossíntese de colesterol, biossíntese de ácidos graxos, e outras afecções metabólicas, genes codificando proteínas com erros de dobragem envolvidas na amiloide e outras doenças, oncogenes conduzindo à transformação celular, genes virais latentes, e genes direcionados a afecções negativas dominantes, entre outras afecções.

[1009] Os Requerentes demonstraram a aplicação de genes de um sistema CRISPR-Cas com o fígado, cérebro, sistema ocular, epitelial, hematopoético, ou outro tecido de um indivíduo ou um paciente com necessidade disso, sofrendo de afecções metabólicas, amiloidose e doenças relacionadas com agregação de proteína, transformação celular resultante de mutações e translocações genéticas, efeitos dominantes negativos de mutações do gene, infecções virais latentes, e outros sintomas relacionados, usando ou sistema de aplicação viral ou de nanopartícula.

[1010] Desenho de Estudo: Indivíduos ou doentes em necessidade do mesmo que sofrem de distúrbios metabólicos, amiloidose e doenças relacionadas com a agregação de proteínas, que incluem mas não se limitam a humanos, humanos não primatas, caninos, felinos, bovinos, equinos, outros animais domésticos e mamíferos relacionados. O sistema CRISPR- Cas é guiado por um RNA guia quimérico e direciona a um sítio específico do local genômico humano para ser clivado. Após clivagem e reparação mediada por extremidades de junção e não homólogas, a mutação por deslocamento resulta na inativação de genes.

[1011] Os Requerentes selecionaram RNAs guia direcionados para genes envolvidos nos distúrbios acima mencionados para serem específicos para locais endógenos com o mínimo de atividade fora do alvo. Dois ou mais RNAs guia podem ser codificados em uma única matriz CRISPR para induzir quebras de cadeia dupla simultâneas em DNA, levando a microdeleções de genes afetados ou regiões cromossômicas.

[1012] Identificação e conceção de genes alvo

[1013] Para cada gene da doença candidato, os Requerentes selecionaram sequências de DNA de interesse que incluem éxons codificadores de proteínas, sequências que incluem e flanqueiam locais de mutação negativos dominantes conhecidos, sequências que incluem e flanqueiam sequências repetitivas patológicas. Para abordagens de inativação de genes, éxons que codificam primeiro mais próximos ao códon de iniciação oferecem melhores opções para atingir a inativação completa e minimizar a possibilidade da função de retenção parcial de produtos de proteínas truncadas.

[1014] Os Requerentes analisaram sequências de interesse para todas as possíveis sequências de 20 pb direcionáveis imediatamente em 5' para um motivo NGG (para sistema SpCas9) ou NNAGAAW (para o sistema St1Cas9). Os Requerentes escolheram sequências para reconhecimento de Cas9 guiado por RNA únicas no genoma para minimizar os efeitos fora do alvo com base em algoritmo computacional para determinar a especificidade.

[1015] Clonagem de sequências guia em um sistema de aplicação

[1016] Sequências guia são sintetizadas como oligonucleotídeos de 20-24 pb de cadeia dupla. Após o tratamento 5'-fosforilação de oligonucleotídeos e emparelhamento de modo a formar dupletes, os oligos foram ligados no vetor apropriado, dependendo do método de aplicação:

[1017] Métodos de aplicação baseadas em vírus.

[1018] Vetores baseados em AAV (PX260, 330, 334, 335) têm sido descritos em outros lugares

[1019] Vetores baseados em lentivírus usam uma estratégia de clonagem semelhante de ligação direta de sequências guia em um único vetor que transporta um suporte de RNA quimérico conduzido por um promotor U6 e um Cas9 ou Cas9 nickase conduzidos por promotor EF1a.

[1020] A produção de vírus é descrita em outros lugares.

[1021] Métodos de aplicação de RNA baseados em nanopartículas

[1022] 1. Sequências guia são sintetizadas como um oligonucleotídeo duplex que codifica o promotor T7- sequência guia-RNA quimérico. Um promotor T7 é adicionado em 5' de Cas9 pelo método de PCR.

[1023] 2. Cas9 conduzida por Cas9 e RNAs guia- quiméricos são transcritos in vitro, e a Cas9 mRNA é ainda adicionado cauda cap e poli-A, utilizando kits comerciais. Produtos de RNA foram purificados através das instruções do kit.

[1024] Métodos de aplicação hidrodinâmicos na veia da cauda (para camundongo)

[1025] Sequências guia são clonadas em plasmídeos de AAV, tal como descrito acima e noutros locais deste pedido.

[1026] Validação in vitro de linhas celulares

[1027] Transfecção

[1028] 1. Transfecção de DNA de plasmídeo

[1029] Plasmídeos contendo sequências guia são transfectados em células de rim humano embrionário (HEK293T) ou células estaminais embrionárias humanas (hES), outros tipos de células relevantes usando métodos baseados em lipídios, químicos, ou eletroporação. Para uma transfecção em 24 poços de células HEK293T (~ 260000 células), 500 ng de DNA total é transfectado para cada poço utilizando Lipofectamina 2000. Para uma transfecção em 12 poços de células hES, 1 μg de DNA total é transfectado para um único poço utilizando Fugene HD.

[1030] 2. transfecção RNA

[1031] RNA purificado como descrito acima é utilizado para a transfecção em células HEK293T. 1-2ug de RNA pode ser transfectado para ~260.000 utilizando Lipofectamina 2000 através de instruções do fabricante. A aplicação de RNA de Cas9 e RNA quimérico é mostrada na Fig. 28.

[1032] Ensaio de formação indel in vitro

[1033] As células foram colhidas 72 horas após a transfecção e ensaiados para a formação de indel como uma indicação de quebras de cadeia dupla.

[1034] Resumidamente, a região genômica em torno da sequência alvo é amplificada por PCR (~400-600 pb de tamanho de amplicon), utilizando polimerase de alta fiabilidade. Os produtos são purificados, normalizados para igual concentração, e lentamente emparelhados desde 95 °C a 4 °C para permitir a formação de heterodúplexes de DNA. Pós emparelhamento, a enzima Cel-I é utilizada para clivar heterodúplexes, e os produtos resultantes são separados em um gel de poliacrilamida e a eficiência indel é calculada.

[1035] Prova in vivo de princípio em animais

[1036] Mecanismos de aplicação

[1037] A produção de AAV e Lentivírus é descrita em outros lugares.

[1038] Formulação de nanopartículas: RNA misturado na formulação de nanopartículas

[1039] Injeções hidrodinâmicas na veia da cauda com plasmídeos de DNA em camundongos são realizadas utilizando um kit comercial

[1040] Sequências Cas9 e guia são aplicadas como vírus, nanopartículas revestidas com mistura de RNA, ou plasmídeos de DNA, e injetados em animais sujeitos. Um conjunto paralelo de animais de controle é injetado com soro fisiológico estéril, Cas9 e GFP, ou a sequência guia e GFP sozinho.

[1041] Três semanas após a injeção, os animais são testados quanto à melhoria dos sintomas e sacrificados. Sistemas dos órgãosrelevantes são analisados para a formação de indel. Ensaios fenotípicos incluem níveis sanguíneos de HDL, LDL, lipídios,

[1042] Ensaio para a formação de indel

[1043] O DNA é extraído do tecido usando kits comerciais; o ensaio de indel será realizado tal como descrito para a demonstração in vitro.

[1044] As aplicações terapêuticas do sistema CRISPR- Cas são passíveis de realização específica do tecido e eliminação sistemática temporalmente controlada de genes candidatos de doenças. Os exemplos incluem os genes envolvidos no metabolismo do colesterol e de ácidos gordos, doenças amiloides, doenças negativos dominantes, infecções virais latentes, entre outras afecções.

[1045] Exemplos de um único RNA guia para introduzir indels direcionados um local do gene Exemplos de um par de RNA guia para introduzir microdeleção cromossômica direcionada em um local do gene Exemplo 19: Integração direcionada de reparação para genes que comportam mutações causadoras de doenças; reconstituição de deficiências enzimáticas e outras doenças relacionadas.

[1046] Desenho do estudo I. Identificação e desenho de genes alvos - Descrito no Exemplo 22 II. Clonagem de sequências guia e modelos de reparação em um sistema de aplicação - Descrito acima no Exemplo 22 - Os Requerentes clonaram modelos de reparação de DNA para incluir braços de homologia com o alelo doente assim um modelo de reparação de tipo selvagem III. Validação in vitro de linhas celulares - A transfecção é descrita acima no Exemplo 22; Cas9, RNA guia e o modelo de reparação são cotransfectados em tipos de células relevantes. b. Ensaio para a reparação in vitro i. Os Requerentes colheram as células 72 horas após a transfecção e ensaio para reparação ii. Resumidamente, os Requerentes amplificaram a região genômica em torno do modelo de reparação PCR usando polimerase de alta fiabilidade. Os Requerentes sequenciaram produtos para diminuição da incidência de alelo mutante. IV. Prova in vivo de princípio em animais a. Os mecanismos de aplicação são descritos acima nos exemplos 22 e 34. b. Ensaio para a reparação in vivo Os Requerentes realizaram o ensaio de reparação, tal como descrito na demonstração in vitro. V. Aplicações Terapêuticas O sistema CRISPR-Cas é passível de realização específica do tecido e eliminação sistemática temporalmente controlada de genes candidatos de doenças. Os exemplos incluem os genes envolvidos no metabolismo do colesterol e de ácidos gordos, doenças amiloides, doenças negativos dominantes, infecções virais latentes, entre outras afecções.

[1047] Exemplo de uma única mutação sem senso com reparação do modelo: Exemplo 20: Aplicação terapêutica do sistema CRISPR-Cas em Glaucoma, Amiloidose, e doença de Huntington

[1048] Glaucoma: Os Requerentes desenharam RNAs guia visando o primeiro éxon do gene miocilina (MYOC). Os Requerentes utilizam vetores de adenovírus (Ad5) para involucrar tanto Cas9, bem como um RNA guia visando o gene MYOC. Os Requerentes injetam vetores adenovirais para a rede trabecular, onde as células têm sido implicadas na patofisiologia de glaucoma. Inicialmente, os Requerentes testaram em modelos de camundongos portadores do gene mutado MYOC para ver se eles melhoravam a acuidade visual e diminuía a pressão nos olhos. A aplicação terapêutica em seres humanos emprega uma estratégia semelhante.

[1049] Amiloidose: Os Requerentes desenharam RNAs guia para direcionar o primeiro éxon do gene transtirretina (TTR) no fígado. Os Requerentes usam AAV8 para involucrar Cas9, bem como RNA guia direcionando o primeiro éxon do gene TTR. Foi mostrado que AAV8 tem direcionamento eficaz no fígado e irá ser administrado por via intravenosa. Cas9 pode ser accionado utilizando promotores específicos de fígado tal como o promotor de albumina, ou utilizando um promotor constitutivo. Um promotor pol3 dirige o RNA guia.

[1050] Em alternativa, os Requerentes utilizam aplicação hidrodinâmica de DNA de plasmídeo para inativar o gene TTR. Os Requerentes entregaram um plasmídeo que codifica para Cas9 e o RNA guia direcionado para o éxon 1 de TTR.

[1051] Como outra alternativa, os Requerentes administraram uma combinação de RNA (mRNA para Cas9, e RNA guia). RNA pode ser empacotado usando lipossomos tais como Invivofectamina da Life Technologies e aplicados por via intravenosa. Para reduzir a imunogenicidade induzida por RNA, aumentar o nível de expressão de Cas9 e a estabilidade de RNA guia, os Requerentes modificaram o mRNA Cas9 utilizando nivelamento 5'. Os Requerentes também incorporaram nucleotídeos de RNA modificados em Cas9 mRNA e RNA guia para aumentar a sua estabilidade e reduzir a imunogenicidade (por exemplo, ativação de TLR). Para aumentar a eficiência, os Requerentes administraram doses múltiplas de vírus, DNA, ou RNA.

[1052] Doença de Huntington: Os Requerentes desenharam um RNA guia baseado em mutações específicas dos alelos do gene HTT de pacientes. Por exemplo, em um paciente que é heterozigoto para HTT com repetição CAG expandida, os Requerentes identificaram sequências de nucleotídeos únicas para o alelo mutante HTT e o usaram para desenhar RNA guia. Os Requerentes garantiram que a base mutante está localizada dentro dos últimos 9 pb do RNA guia (que os Requerentes têm verificado como tendo a capacidade de discriminar entre desemparelhamentos de bases de DNA simples entre o tamanho do alvo e o RNA guia).

[1053] Os Requerentes empacotaram o alelo mutante HTT do RNA guia específico e Cas9 em AAV9 e entregaram para o corpo estriado de pacientes de Huntington. O vírus é injetado no corpo estriado estereotaxicamente por meio de uma craniotomia. AAV9 é conhecido por transduzir eficientemente neurônios. Os Requerentes dirigiram Cas9 usando um promotor específico de neurônios, tal como humano sinapsina I. Exemplo 21: Aplicação terapêutica do sistema CRISPR-Cas em VIH

[1054] A infecção viral crônica é uma fonte de significativa morbidade e mortalidade. Apesar de existir para muitos destes vírus terapias antivirais convencionais que eficazmente têm como alvo vários aspectos da replicação viral, as formas de realização terapêuticas atuais são geralmente não-curativas na natureza devido à "latência viral". Pela sua natureza, a latência viral é caracterizada por uma fase de dormência no ciclo de vida viral, sem produção viral ativa. Durante este período, o vírus é capaz de escapar, em grande parte, à vigilância imunológica e terapêutica convencional, permitindo-se o estabelecimento por longos períodos de reservatórios virais dentro do hospedeiro a partir dos quais, a subsequente reativação pode permitir a propagação e transmissão do vírus continuada. A chave para a latência viral é a capacidade de manter de forma estável o genoma viral, se conseguindo quer por meio de latência epissômica ou proviral, que armazena o genoma viral no citoplasma ou integra no genoma do hospedeiro, respectivamente. Na ausência de vacinas eficazes, que possam impedir a infecção primária, infecções virais crônicas caracterizadas por reservatórios latentes e episódios de atividade lítica podem ter consequências significativas: vírus do papiloma humano (VPH) pode resultar em cancro do colo do útero, o vírus da hepatite C (VHC) predispõe para carcinoma hepatocelular, e vírus da imunodeficiência humana, eventualmente destrói o sistema imunológico do hospedeiro resultando na suscetibilidade a infecções oportunistas. Como tal, estas infecções requerem o uso de terapias antivirais atualmente disponíveis, ao longo da vida. Para complicar ainda mais, importa a elevada mutabilidade de muitos desses genomas virais que levam à evolução de estirpes resistentes para as quais não existe nenhuma terapia eficaz.

[1055] O sistema CRISPR-Cas é um sistema imunitário adaptativo bacteriano capaz de induzir quebras no DNA de cadeia dupla (DSB) de uma forma multiplexada, específica para sequências e foi recentemente reconstituído no âmbito dos sistemas de células de mamíferos. Demonstrou-se que o direcionamento de DNA com um ou vários RNAs guia pode resultar em ambas indels e deleções das sequências intervenientes, respectivamente. Como tal, esta nova tecnologia representa um meio pelo qual a mutagênese do DNA alvo e multiplexado pode ser realizado dentro de uma única célula com alta eficiência e especificidade. Por conseguinte, a aplicação do sistema CRISPR-Cas dirigida contra sequências de DNA viral pode permitir a rutura direcionada e eliminação de genomas virais latentes, mesmo na ausência de produção viral contínua.

[1056] A título de exemplo, a infecção crônica por VIH-1 representa um problema de saúde mundial, com 33 milhões de pessoas infetadas e uma incidência anual de 2,6 milhões de infecções. O uso da terapia antirretroviral multimodal altamente ativa (HAART), que tem como alvo simultaneamente vários alvos da replicação viral, permitiu que a infecção pelo VIH ser em grande parte gerida como uma doença crônica, não terminal. Sem tratamento, a progressão do VIH para AIDS ocorre geralmente dentro de 9-10 anos, resultando na depleção do sistema imune do hospedeiro e ocorrência de infecções oportunistas que normalmente conduzem à morte, logo em seguida. Secundária à latência viral, a interrupção da HAART, invariavelmente, leva à subida da carga viral. Além disso, mesmo interrupções temporárias na terapia pode selecionar estirpes resistentes de VIH incontroláveispelos meios disponíveis. Além disso, os custos da terapia HAART são significativos: dentro dos EUA $10,000-15,0000 por pessoa por ano. Como tal, os métodos de tratamento que visam diretamente o genoma do VIH, em vez de o processo de replicação viral representam um meio pelo qual a erradicação dos reservatórios latentes poderia permitir uma opção terapêutica curativa.

[1057] Desenvolvimento e aplicação de um sistema CRISPR-Cas direcionado para VIH-1 representa uma abordagem única diferenciável dos meios existentes de direcionamento para a mutagênese do DNA, seja, ZFN e TALENs, com inúmeras implicações terapêuticas. O direcionamento para a rutura e eliminação do genoma do VIH-1 pela DSB e indels mediados por CRISPR em conjunto com HAART pode permitir a prevenção simultânea de produção viral ativa, bem como o esgotamento dos reservatórios virais latentes dentro do hospedeiro.

[1058] Uma vez integrado dentro do sistema imunitário do hospedeiro, o sistema CRISPR-Cas permite a geração de uma subpopulação de VIH-1 resistente a qual, mesmo na ausência de erradicação viral completa, pode permitir a manutenção e a reconstituição da atividade imunológica do hospedeiro. Isto poderia potencialmente prevenir a infecção primária por disrupção do genoma viral prevenindo a produção e a integração viral, o que representa um meio de "vacinação". A natureza multiplexada do sistema CRISPR-Cas permite o direcionamento de vários aspectos do genoma simultaneamente dentro de células individuais.

[1059] Como em HAART, o escape viral por mutagênese é minimizado, exigindo a aquisição de múltiplas mutações adaptativas simultaneamente. Várias estirpes de VIH-1 podem ser alvo simultaneamente, o que minimiza a possibilidade de superinfecção e previne a subsequente criação de novas estirpes recombinantes. A especificidade de sequência mediada por nucleotídeo em vez de por proteína do sistema CRISPR-Cas permite a geração rápida de agentes terapêuticos, sem necessidade de alterar significativamente mecanismo de aplicação.

[1060] A fim de alcançar este, os Requerentes geraram RNAs guia de CRISPR-Cas visando uma grande maioria do genoma do VIH-1 tendo em conta as variantes da estirpe do VIH-1 para cobertura e eficácia máxima. A análise da sequência da conservação do genoma entre subtipos e variantes do VIH-1 deve permitir a orientação das regiões flanqueadoras conservadas do genoma com o objetivo de eliminar sequências virais intervenientes ou indução de mutações por deslocamento que perturbariam funções de genes virais.

[1061] Os Requerentes realizaram a aplicação do sistema CRISPR-Cas por infecção adenovírica ou mediada por lentivírus convencional do sistema imune do hospedeiro. Dependendo da abordagem, as células hospedeiras imunes podem ser a) isoladas, transduzidas com CRISPR-Cas, selecionada, e reintroduzida no hospedeiro ou b) transduzidas in vivo por aplicação sistêmica do sistema CRISPR-Cas. Uma primeira abordagem permite a formação de uma população imune resistente ao passo que a segunda é mais provável para atingir reservatórios virais latentes no interior do hospedeiro.

Exemplo 22: Correção direcionada de deltaF508 ou outras mutações na fibrose cística

[1062] Um aspecto da invenção proporciona uma composição farmacêutica, que pode compreender uma partícula para terapia gênica de CRISPR-Cas e um transportador farmacêutico biocompatível. De acordo com um outro aspecto, é fornecido um método de terapia gênica para o tratamento de um paciente portador de uma mutação no gene de CFTR compreende administração de uma quantidade terapeuticamente eficiente de uma partícula de terapia gênica CRISPR-Cas às células de um indivíduo.

[1063] Este exemplo demonstra que a transferência de genes ou a aplicação de genes de um sistema CRISPR-Cas nas vias aéreas de um indivíduo ou paciente com essa necessidade, que sofrem de fibrose cística ou de sintomas relacionados com fibrose cística, usando partículas de vírus adenoassociados (AAV).

[1064] Estudo do desenho: Sujeitos ou pacientes em sua necessidade: Humanos, humanos não primatas, caninos, felinos, bovinos, equinos e outros animais domésticos relacionados. Este estudo testa a eficácia da transferência gênica de um sistema CRISPR-Cas por um vetor AAV. Os Requerentes determinaram os níveis de transgene suficientes para a expressão do gene e utilizaram um sistema CRISPR-Cas compreendendo uma enzima Cas9 delta para direcionar F508 ou outras mutações de indução de CFTR.

[1065] Os sujeitos tratados receberam uma quantidade farmaceuticamente eficaz do sistema de vetor AAV aerossolizado por pulmão, endobronquialmente entregue ao respirar espontaneamente. Os indivíduos do grupo controle receberam uma quantidade equivalente de um sistema de vetor AAV pseudotipado com um gene de controle interno. O sistema vetor pode ser entregue juntamente com um veiculo farmacêutico farmaceuticamente aceitável ou biocompatível. Três semanas ou um intervalo de tempo adequado após a administração de vetor, os indivíduos tratados são testados quanto à melhoria de sintomas relacionadas com fibrose cística.

[1066] Os Requerentes utilizam um adenovírus ou uma partícula de AAV.

[1067] Os Requerentes clonaram as seguintes construções de genes, cada uma ligado operacionalmente a uma ou mais sequências reguladoras (CBH ou promotor EF1a para Cas9, promotor U6 ou H1 para RNA guia quimérico), em um ou mais vetores de adenovírus ou de AAV ou qualquer outro vetor compatível: Um RNA guia quimérico direcionado para CFTRdelta508 (fig. 31B), um modelo de reparação de mutação deltaF508 (Fig. 31C) e um códon otimizado da enzima Cas9 com, opcionalmente, um ou mais sinais de localização nuclear ou sequência(s) (NLS(s)), por exemplo, dois (2) NLSs.

[1068] Identificação do local alvo Cas9

[1069] Os Requerentes analisaram o local genômico de CFTR humana e identificaram o local alvo Cas9 (Fig. 31A). (PAM pode conter um motivo NGG ou um NNAGAAW) (SEQ ID NO:__).

[1070] Estratégia de Reparação de gene

[1071] Os Requerentes introduziram um sistema de vetor de adenovírus/AAV compreendendo uma Cas9 (ou Cas9 nickase) e o RNA guia juntamente com um sistema de vetor de adenovírus/AAV compreendendo o modelo de reparação de homologia contendo o resíduo F508 para o sujeito através de um dos métodos de aplicação discutido anteriormente. O sistema CRISPR-Cas é guiado por o RNA guia quimérico CFTRdelta 508 e direciona a um sítio específico do local genômico CFTR para ser cortado ou clivado. Após clivagem, o modelo de reparação é inserido no sítio de clivagem via recombinação homóloga corrigir a deleção que resulta em fibrose cística ou causa sintomas relacionados com fibrose cística. Esta estratégia para a aplicação direta e fornecer introdução sistêmica de sistemas CRISPR com apropriados RNAs guia podem ser empregues para atingir mutações genéticas para editar ou manipular genes que causam doenças e afecções metabólicas, fígado, rim e proteína tal como os da Tabela B.

Exemplo 23: Geração de biblioteca de células com inativação de genes

[1072] Este exemplo demonstra como gerar uma biblioteca de células em que cada célula tem um único gene inativado:

[1073] Os Requerentes realizaram uma biblioteca de células ES em que cada célula tem um único gene inativado, e a biblioteca completa das células ES terá todos os genes únicos inativados. Esta biblioteca é útil para a triagem da função de gene em processos celulares como em doenças.

[1074] Para fazer esta biblioteca de células, os Requerentes integraram a Cas9 dirigida por um promotor induzível (por exemplo promotor doxiciclina induzível) na célula ES. Adicionalmente, os Requerentes integraram um único RNA guia visando um gene específico na célula ES. Para fazer a biblioteca de células ES, os Requerentes simplesmente misturaram células ES com uma biblioteca de genes codificando RNAs guia visando cada gene em um genoma humano. Os Requerentes primeiro introduziram um único sítio BxB1 attB no local AAVS1 da célula ES humana. Então os Requerentes usaram a BxB1 integrase para facilitar a integração de genes individuais RNA guia para o sítio BxB1 attB no local AAVS1. Para facilitar a integração, cada gene RNA guia é contido em um plasmídeo que transporta de um único sítio attP. Esta via BxB1 irá recombinar o sítio attB no genoma com o sítio attP no plasmídeo contendo o RNA guia.

[1075] Para gerar a biblioteca de células, os Requerentes pegaram na biblioteca de células que tem os RNAs guia únicos integrados e induz a expressão de Cas9. Após indução, a Cas9 medeia a quebra de cadeias duplas em sítios especificados pelo RNA guia. Para verificar a diversidade desta biblioteca de células, os Requerentes realizaram o sequenciamento do exoma completo para garantir que os Requerentes são capazes de observar as mutações em cada gene alvo único. Esta biblioteca de células pode ser utilizada para uma variedade de aplicações, incluindo o rastreio inteiro à base de biblioteca, ou podem ser divididos em clones de células individuais para facilitar a produção rápida de linhas celulares clonais com genes humanos individuais inativados.

Exemplo 24: Engenharia de Microalgas usando Cas9

[1076] Métodos de aplicação de Cas9

[1077] Método 1: Os Requerentes entregaram Cas9 e RNA guia utilizando um vetor que expressa Cas9 sob o controlo de um promotor constitutivo, tal como Hsp70A-Rbc S2 ou Beta2- tubulina.

[1078] Método 2: Os Requerentes entregaram Cas9 e polimerase T7 utilizando vetores que expressam Cas9 e polimerase T7 sob o controlo de um promotor constitutivo, tal como Hsp70A-Rbc S2 ou Beta2-tubulina. RNA Guia será entregue, utilizando um vetor contendo o promotor T7 conduzindo RNA guia.

[1079] Método 3: Os Requerentes entregaram Cas9 mRNA e RNA guia transcrito in vitro em células de algas. RNA pode ser transcrito in vitro. Cas9 mRNA irá consistir na região de codificação para Cas9, bem como 3'UTR de Cop1 para assegurar a estabilização do mRNA Cas9.

[1080] Para a recombinação homóloga, os Requerentes fornecem um modelo reparação de homologia adicional dirigida.

[1081] A Sequência de um cassete conduzindo a expressão de Cas9 sob o controlo do promotor beta-2 tubulina, seguido por 3' UTR de COP1.

[1082] TCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGC GAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTT CGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCC CCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTA CCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCC TCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCG CCGAAGAAAAAGCGCAAGGTCGAAGCGTCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATC GGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAA TTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTG CTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGA TACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCC AAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAG AAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAG TACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTG CGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAG GGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACC TACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATC CTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGC GAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAAC TTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTAC GACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTG GCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAG ATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGAC CTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTC TTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAG TTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTG AAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCC CACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCA TTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTAC GTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAA ACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTC ATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCAC AGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACC GAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTG CTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAA ATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTG GGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAA AACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATG ATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTG AAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGG GACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGA AACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCC CAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCC GCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATG GGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAG AAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTG GGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTG TACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAAC CGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCC ATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCC TCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTG ATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTG GATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTG GCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGG GAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAG TTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCC GTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGC GACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAG GCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACC CTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAG ATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAA GTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTG CCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTAC GGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAG GGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGA AGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAA AAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAG AGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAA TATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGAT AATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAG CAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTG TCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCAC CTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATC GACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGC ATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACAGCCCCAAG AAGAAGAGAAAGGTGGAGGCCAGCTAAGGATCCGGCAAGACTGGCCCCGCTTGGCAACGC AACAGTGAGCCCCTCCCTAGTGTGTTTGGGGATGTGACTATGTATTCGTGTGTTGGCCAA CGGGTCAACCCGAACAGATTGATACCCGCCTTGGCATTTCCTGTCAGAATGTAACGTCAG TTGATGGTACT (SEQ ID NO:__)

[1083] Sequência de um cassete conduzindo a expressão de polimerase T7 sob o controlo do promotor beta-2 tubulina, seguido por 3' UTR de Cop1:

[1084] TCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGC GAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTT CGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCC CCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTA CCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCC TCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACatgcctaagaagaagaggaaggttaacacgatt aacatcgctaagaacgacttctctgacatcgaactggctgctatcccgttcaacactctg gctgaccattacggtgagcgtttagctcgcgaacagttggcccttgagcatgagtcttac gagatgggtgaagcacgcttccgcaagatgtttgagcgtcaacttaaagctggtgaggtt gcggataacgctgccgccaagcctctcatcactaccctactccctaagatgattgcacgc atcaacgactggtttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccgacagccttccag ttcctgcaagaaatcaagccggaagccgtagcgtacatcaccattaagaccactctggct tgcctaaccagtgctgacaatacaaccgttcaggctgtagcaagcgcaatcggtcgggcc attgaggacgaggctcgcttcggtcgtatccgtgaccttgaagctaagcacttcaagaaa aacgttgaggaacaactcaacaagcgcgtagggcacgtctacaagaaagcatttatgcaa gttgtcgaggctgacatgctctctaagggtctactcggtggcgaggcgtggtcttcgtgg cataaggaagactctattcatgtaggagtacgctgcatcgagatgctcattgagtcaacc ggaatggttagcttacaccgccaaaatgctggcgtagtaggtcaagactctgagactatc gaactcgcacctgaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcgctggctggcatc tctccgatgttccaaccttgcgtagttcctcctaagccgtggactggcattactggtggt ggctattgggctaacggtcgtcgtcctctggcgctggtgcgtactcacagtaagaaagca ctgatgcgctacgaagacgtttacatgcctgaggtgtacaaagcgattaacattgcgcaa aacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcggtcgccaacgtaatcaccaagtgg aagcattgtccggtcgaggacatccctgcgattgagcgtgaagaactcccgatgaaaccg gaagacatcgacatgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaacgtgctgccgctgctgtg taccgcaaggacaaggctcgcaagtctcgccgtatcagccttgagttcatgcttgagcaa gccaataagtttgctaaccataaggccatctggttcccttacaacatggactggcgcggt cgtgtttacgctgtgtcaatgttcaacccgcaaggtaacgatatgaccaaaggactgctt acgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaaggttactactggctgaaaatccacggt gcaaactgtgcgggtgtcgacaaggttccgttccctgagcgcatcaagttcattgaggaa aaccacgagaacatcatggcttgcgctaagtctccactggagaacacttggtgggctgag caagattctccgttctgcttccttgcgttctgctttgagtacgctggggtacagcaccac ggcctgagctataactgctcccttccgctggcgtttgacgggtcttgctctggcatccag cacttctccgcgatgctccgagatgaggtaggtggtcgcgcggttaacttgcttcctagt gaaaccgttcaggacatctacgggattgttgctaagaaagtcaacgagattctacaagca gacgcaatcaatgggaccgataacgaagtagttaccgtgaccgatgagaacactggtgaa atctctgagaaagtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaatggctggcttacggt gttactcgcagtgtgactaagcgttcagtcatgacgctggcttacgggtccaaagagttc ggcttccgtcaacaagtgctggaagataccattcagccagctattgattccggcaagggt ctgatgttcactcagccgaatcaggctgctggatacatggctaagctgatttgggaatct gtgagcgtgacggtggtagctgcggttgaagcaatgaactggcttaagtctgctgctaag ctgctggctgctgaggtcaaagataagaagactggagagattcttcgcaagcgttgcgct gtgcattgggtaactcctgatggtttccctgtgtggcaggaatacaagaagcctattcag acgcgcttgaacctgatgttcctcggtcagttccgcttacagcctaccattaacaccaac aaagatagcgagattgatgcacacaaacaggagtctggtatcgctcctaactttgtacac agccaagacggtagccaccttcgtaagactgtagtgtgggcacacgagaagtacggaatc gaatcttttgcactgattcacgactccttcggtacgattccggctgacgctgcgaacctg ttcaaagcagtgcgcgaaactatggttgacacatatgagtcttgtgatgtactggctgat ttctacgaccagttcgctgaccagttgcacgagtctcaattggacaaaatgccagcactt ccggctaaaggtaacttgaacctccgtgacatcttagagtcggacttcgcgttcgcgtaa GGATCCGGCAAGACTGGCCCCGCTTGGCAACGCAACAGTGAGCCCCTCCCTAGTGTGTTT GGGGATGTGACTATGTATTCGTGTGTTGGCCAACGGGTCAACCCGAACAGATTGATACCC GCCTTGGCATTTCCTGTCAGAATGTAACGTCAGTTGATGGTACT (SEQ ID NO:__)

[1085] Sequência de RNA guia conduzido pelo promotor T7 (promotor T7, Ns representa a sequência de direcionamento):

[1086] gaaat TAATACGACTCAC TATANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttt tagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggca ccgagtcggtgcttttttt (SEQ ID NO:__)

[1087] Aplicação de genes:

[1088] A estirpe Chlamydomonas reinhardtii CC-124 e CC-125 a partir do Chlamydomonas Resource Center será usada para eletroporação. Protocolo de eletroporação segue o protocolo padrão recomendado a partir do kit GeneArt Chlamydomonas Engineering.

[1089] Além disso, os Requerentes geraram uma linha de Chlamydomonas reinhardtii que expressa constitutivamente Cas9. Isto pode ser feito usando pChlamy1 (linearizado usando Pvul) e selecionando para colônias resistentes à higromicina. A sequência para pChlamy1 contendo Cas9 está a seguir. Nesta forma de conseguir uma inativação do gene simplesmente precisa de aplicar o RNA ao RNA guia. Por recombinação homóloga, os Requerentes entregaram RNA guia, bem como um modelo de recombinação homóloga linearizado.

[1090] pChlamy1-Cas9:

[1091] TGCGGTATTTCACACCGCATCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTG CGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGA TTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATC TAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCT ATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATA ACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCA CGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGA AGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGA GTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTG GTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGA GTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTT GTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCT CTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCA TTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAAT ACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGA AAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCC AACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGG CAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTC CTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGACCAAAATCCCTTAA CGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGA GATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCG GTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGC AGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAG AACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGTTGCC AGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCG CAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTAC ACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGA AAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTT CCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAG CGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCG GCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTA TCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGC AGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGTCGCTGAGGCTTGACAT GATTGGTGCGTATGTTTGTATGAAGCTACAGGACTGATTTGGCGGGCTATGAGGGCGGGG GAAGCTCTGGAAGGGCCGCGATGGGGCGCGCGGCGTCCAGAAGGCGCCATACGGCCCGCT GGCGGCACCCATCCGGTATAAAAGCCCGCGACCCCGAACGGTGACCTCCACTTTCAGCGA CAAACGAGCACTTATACATACGCGACTATTCTGCCGCTATACATAACCACTCAGCTAGCT TAAGATCCCATCAAGCTTGCATGCCGGGCGCGCCAGAAGGAGCGCAGCCAAACCAGGATG ATGTTTGATGGGGTATTTGAGCACTTGCAACCCTTATCCGGAAGCCCCCTGGCCCACAAA GGCTAGGCGCCAATGCAAGCAGTTCGCATGCAGCCCCTGGAGCGGTGCCCTCCTGATAAA CCGGCCAGGGGGCCTATGTTCTTTACTTTTTTACAAGAGAAGTCACTCAACATCTTAAAA TGGCCAGGTGAGTCGACGAGCAAGCCCGGCGGATCAGGCAGCGTGCTTGCAGATTTGACT TGCAACGCCCGCATTGTGTCGACGAAGGCTTTTGGCTCCTCTGTCGCTGTCTCAAGCAGC ATCTAACCCTGCGTCGCCGTTTCCATTTGCAGGAGATTCGAGGTACCATGTACCCATACG ATGTTCCAGATTACGCTTCGCCGAAGAAAAAGCGCAAGGTCGAAGCGTCCGACAAGAAGT ACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGT ACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGA AGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGA AGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGA TCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCT TCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACG AGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACA GCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCC GGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGT TCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCG GCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATC TGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGA GCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGC AGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACC AGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACA TCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGAT ACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTG AGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACG GCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACG GCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCT TCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGC GGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGA CCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGA TGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGG GCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACG AGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGA CCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGA AAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGA AAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAG ATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGG ACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACAC TGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACG ACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGA AGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGT CCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTA AAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTG CCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGG ACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCA GAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCG AAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCC AGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGG ACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGA GCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGG GCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGC AGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGA GAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCC GGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACG AGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCG ATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCC ACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGG AAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGA GCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACT TTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGA CAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGA AAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCT TCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGG ACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGG TGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGG GGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCA AGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCG AGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACG AACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGC TGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACT ACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACG CTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGC AGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCA AGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACG CCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGC TGGGAGGCGACAGCCCCAAGAAGAAGAGAAAGGTGGAGGCCAGCTAACATATGATTCGAA TGTCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCC CGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATG GGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAA GACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACAC AGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAG TCACAACCCGCAAACATGACACAAGAATCCCTGTTACTTCTCGACCGTATTGATTCGGAT GATTCCTACGCGAGCCTGCGGAACGACCAGGAATTCTGGGAGGTGAGTCGACGAGCAAGC CCGGCGGATCAGGCAGCGTGCTTGCAGATTTGACTTGCAACGCCCGCATTGTGTCGACGA AGGCTTTTGGCTCCTCTGTCGCTGTCTCAAGCAGCATCTAACCCTGCGTCGCCGTTTCCA TTTGCAGCCGCTGGCCCGCCGAGCCCTGGAGGAGCTCGGGCTGCCGGTGCCGCCGGTGCT GCGGGTGCCCGGCGAGAGCACCAACCCCGTACTGGTCGGCGAGCCCGGCCCGGTGATCAA GCTGTTCGGCGAGCACTGGTGCGGTCCGGAGAGCCTCGCGTCGGAGTCGGAGGCGTACGC GGTCCTGGCGGACGCCCCGGTGCCGGTGCCCCGCCTCCTCGGCCGCGGCGAGCTGCGGCC CGGCACCGGAGCCTGGCCGTGGCCCTACCTGGTGATGAGCCGGATGACCGGCACCACCTG GCGGTCCGCGATGGACGGCACGACCGACCGGAACGCGCTGCTCGCCCTGGCCCGCGAACT CGGCCGGGTGCTCGGCCGGCTGCACAGGGTGCCGCTGACCGGGAACACCGTGCTCACCCC CCATTCCGAGGTCTTCCCGGAACTGCTGCGGGAACGCCGCGCGGCGACCGTCGAGGACCA CCGCGGGTGGGGCTACCTCTCGCCCCGGCTGCTGGACCGCCTGGAGGACTGGCTGCCGGA CGTGGACACGCTGCTGGCCGGCCGCGAACCCCGGTTCGTCCACGGCGACCTGCACGGGAC CAACATCTTCGTGGACCTGGCCGCGACCGAGGTCACCGGGATCGTCGACTTCACCGACGT CTATGCGGGAGACTCCCGCTACAGCCTGGTGCAACTGCATCTCAACGCCTTCCGGGGCGA CCGCGAGATCCTGGCCGCGCTGCTCGACGGGGCGCAGTGGAAGCGGACCGAGGACTTCGC CCGCGAACTGCTCGCCTTCACCTTCCTGCACGACTTCGAGGTGTTCGAGGAGACCCCGCT GGATCTCTCCGGCTTCACCGATCCGGAGGAACTGGCGCAGTTCCTCTGGGGGCCGCCGGA CACCGCCCCCGGCGCCTGATAAGGATCCGGCAAGACTGGCCCCGCTTGGCAACGCAACAG TGAGCCCCTCCCTAGTGTGTTTGGGGATGTGACTATGTATTCGTGTGTTGGCCAACGGGT CAACCCGAACAGATTGATACCCGCCTTGGCATTTCCTGTCAGAATGTAACGTCAGTTGAT GGTACT (SEQ ID NO:__)

[1092] Para todas as células de Chlamydomonas reinhardtii modificadas, os Requerentes usaram PCR, ensaio de nuclease SURVEYOR, e sequenciamento de DNA para verificar a modificação bem-sucedida.

Exemplo 25: Uso de Cas9 para direcionar uma variedade de tipos de doenças

[1093] Doenças que envolvem mutações em sequência de codificação de proteína:

[1094] Afecções dominantes podem ser direcionadas por inativação do alelo dominante negativo. Os Requerentes usam Cas9 para direcionar uma sequência única no alelo dominante negativo e introduzir uma mutação via NHEJ. A indel induzido por NHEJ pode ser capaz de introduzir uma mutação por deslocamento no alelo negativo dominante e eliminar a proteína dominante negativa. Isto pode funcionar se o gene é haplo- suficiente (por exemplo, glaucoma e doença de Huntington induzidos pela mutação MYOC).

[1095] Afecções recessivas podem ser direcionadas por reparação da mutação da doença em ambos os alelos. Para as células em divisão, os Requerentes utilizam Cas9 para introduzir quebras na cadeia dupla perto do local de mutação e aumentar a taxa de recombinação homóloga utilizando um modelo de recombinação exógena. Para as células em divisão, tal pode ser conseguido utilizando a atividade da nickase multiplexada para catalisar a substituição da sequência mutante em ambos os alelos através da ligação mediada por NHEJ de um fragmento de DNA exógeno, contendo realização saliências complementares.

[1096] Os Requerentes também usaram Cas9 para introduzir mutações de proteção (por exemplo, inativação de CCR5 para prevenir a infecção por VIH, a inativação de PCSK9 para redução do colesterol, ou a introdução do A673T em APP para reduzir o risco de doença de Alzheimer).

[1097] Doenças que envolvem sequências não codificadoras

[1098] Os Requerentes usaram Cas9 para a disrupção das sequências não codificantes na região do promotor, para alterar os locais de ligação do fator de transcrição e alterar elementos potenciadoras ou repressores. Por exemplo, Cas9 pode ser utilizado para excisar Klf1 potenciador EHS1 em células estaminais hematopoiéticas para reduzir os níveis de BCL11A e reativar a expressão do gene da globina fetal em eritrócitos diferenciados.

[1099] Os Requerentes também usaram Cas9 para a disrupção dos motivos funcionais nas regiões não traduzidas 5 'ou 3'. Por exemplo, para o tratamento de distrofia miotônica, Cas9 pode ser usado para remover expansões das repetições CTG no gene DMPK.

Exemplo 26: Nickase Multiplexada

[1100] Os aspectos da otimização e os ensinamentos de Cas9 detalhados neste pedido também podem ser usado para gerar nickases Cas9. Os Requerentes usam nickases Cas9 em combinação com pares de RNAs guia para gerar ruturas da cadeia dupla do DNA com saliências definidas. Quando dois pares de RNA guia são utilizados, é possível excisar um fragmento de DNA interveniente. Se um pedaço de DNA exógeno é clivado por dois pares de RNA guia para gerar saliências compatíveis com o DNA genômico, em seguida, o fragmento de DNA exógeno pode ser ligado ao DNA genômico para substituir o fragmento excisado. Por exemplo, este pode ser usado para remover a expansão da repetição de trinucleotídeos no gene huntintina (HTT) para tratar a Doença de Huntington.

[1101] Se um DNA exógeno que comporta o menor número de repetições CAG é fornecido, então pode ser capaz de gerar um fragmento de DNA que tem as mesmas saliências e pode ser ligado dentro do local genômico HTT e substituir o fragmento excisado.

[1102] Estas são SEQ ID NOS:___ a , respectivamente. A ligação do fragmento de DNA exógeno no genoma não requer maquinaria de recombinação homóloga e por conseguinte este método podem ser usado nas células pós- mitóticas tais como neurônios.

Exemplo 27: aplicação do Sistema CRISPR

[1103] Cas9 e o seu RNA guia quimérico, ou a combinação de tracrRNA e crRNA, podem ser aplicados, quer como DNA ou RNA. A aplicação de Cas9 e RNA guia como moléculas de RNA (normal ou contendo modificações nas bases ou na estrutura) podem ser usadas para reduzir a quantidade de tempo que a proteína Cas9 persiste na célula. Isto pode reduzir o nível de atividade de clivagem fora do alvo na célula alvo. Uma vez que a aplicação de Cas9 como mRNA leva tempo a ser traduzida em proteína, pode ser vantajoso aplicar o RNA guia várias horas após a aplicação de Cas9 mRNA, para maximizar o nível de RNA guia que está disponível para a interação com a proteína Cas9.

[1104] Em situações em que a quantidade de RNA guia é limitante, pode ser desejável introduzir Cas9 como mRNA e RNA guia sob a forma de um cassete de expressão de DNA com um promotor que conduz a expressão do RNA guia. Desta forma, a quantidade de RNA guia disponível irá ser amplificado por meio de transcrição.

[1105] Uma variedade de sistemas de aplicação podem ser introduzidos para introduzir Cas9 (DNA ou RNA) e RNA guia (DNA ou RNA) para a célula hospedeira. Estes incluem a utilização de lipossomos, vetores virais, eletroporação, nanopartículas, nanofios (Shalek et al., Nano Letters, 2012), exossomos. Lipossomos moleculares Cavalo de Tróia (Pardridge et al., Cold Spring Harb Protoc; 2010; doi:10.1101/pdb.prot5407) pode ser utilizado para aplicar Cas9 e RNA guia através da barreira sanguínea do cérebro.

Exemplo 28: Estratégias terapêuticas para afecções de repetição de trinucleotídeos

[1106] Conforme previamente mencionado no pedido, o polinucleotídeo alvo de um complexo CRISPR pode incluir uma série de genes e polinucleotídeos associados à doença e alguns destes genes associados à doença podem pertencer a um conjunto de distúrbios genéticos referidos como distúrbios de repetição de trinucleotídeos (referidos como também distúrbios de expansão de repetição de trinucleotídeos, afecções de expansão de repetição tripleto ou distúrbios reiteração de códon).

[1107] Estas doenças são causadas por mutações em que as repetições de trinucleotídeos de certos genes excedem o limiar normal, estável, que pode geralmente diferir em um gene. A descoberta de mais distúrbios de expansão repetidas permitiram a classificação destas afecções em um certo número de categorias, com base em características semelhantes subjacentes. Doença de Huntington (DH) e as ataxias espinocerebelares que são causadas por uma expansão da repetição CAG em porções de codificação de proteínas de genes específicos estão incluídas na Categoria I. Doenças ou distúrbios com expansões que tendem a torná-los fenotipicamente diversos e incluem expansões que são geralmente pequenas em magnitude e também encontradas em éxons de genes estão incluídas na Categoria II. A categoria III inclui afecções ou doenças que são caracterizadas por expansões repetidas muito maiores do que as das Categorias I ou II e estão geralmente localizadas fora das regiões de codificação de proteínas. Exemplos de doenças ou distúrbios de Categoria III incluem, mas não estão limitadas a síndrome X frágil, distrofia miotônica, duas das ataxias espinocerebelares, epilepsia mioclônica juvenil, e ataxia de Friedreich.

[1108] Estratégias terapêuticas similares, como o mencionado para a ataxia de Friedreich abaixo podem ser adotadas para tratar outros transtornos de repetição de trinucleotídeos ou de expansão também. Por exemplo, uma outra doença de repetição tripla que pode ser tratada usando a estratégia quase idêntica é a distrofia miotônica 1 (DM1), onde existe um motivo CTG expandido no UTR 3'. Na ataxia de Friedreich, a doença resulta de expansão de trinucleotídeos GAA no primeiro íntron de frataxina (FXN). Uma estratégia terapêutica usando CRISPR consiste em excisar a repetição GAA a partir do primeiro íntron. Pensa-se que a repetição GAA afeta a estrutura do DNA e leva a recrutar a formação de heterocromatina que desligar o gene da frataxina (Fig. 32A).

[1109] Vantagens competitivas sobre outras estratégias terapêuticas estão listados abaixo:

[1110] A inativação de siRNA não é aplicável neste caso, por a doença ser devida à redução da expressão da frataxina. Terapia gênica viral está atualmente a ser explorada. Vetores baseados em HSV-1 foram usados para aplicar o gene frataxina em modelos animais e mostraram efeito terapêutico. No entanto, a eficácia a longo prazo de aplicação à base de vírus de frataxina sofre vários problemas: Em primeiro lugar, é difícil regular a expressão de frataxina para coincidir com os níveis naturais em indivíduos saudáveis, e em segundo lugar, a sobre-expressão a longo prazo de frataxina conduz à morte celular.

[1111] As nucleases podem ser utilizadas para excisar a repetição GAA para restaurar o genótipo saudável, mas estratégias de Nuclease Dedo de Zinco e TALEN requerem a aplicação de dois pares de nucleases de alta eficácia, o que é difícil para ambas as aplicações bem como as técnicas de nuclease (excisão eficaz de DNA genômico por ZFN ou TALEN é difícil de conseguir).

[1112] Em contraste com as estratégias acima, o sistema CRISPR-Cas tem vantagens claras. A enzima Cas9 é mais eficiente e mais multiplexivel, pelo qual entenda-se que um ou mais alvos podem ser ajustados ao mesmo tempo. Até agora, a eficiência de excisão de DNA genômico > 30% por Cas9 em células humanas e pode ser tão elevada como 30%, e pode ser melhorada no futuro. Além disso, no que diz respeito a certos distúrbios de repetição de trinucleotídeo como a doença de Huntington (HD), repetições de trinucleotídeos na região de codificação podem ser conseguidas se existirem diferenças entre os dois alelos. Especificamente, se um paciente de HD é heterozigótico para mutante HTT e se existirem diferenças de nucleotídeos, tais como SNPs entre os alelos mutantes o peso e os alelos HTTmutantes, então Cas9 pode ser utilizada para direcionar especificamente o alelo HTT mutante. ZFN ou TALENS não têm a capacidade de distinguir dois alelos com base em diferenças de uma única base.

[1113] Ao adotar uma estratégia usando a enzima CRISPR-Cas 9 para a ataxia de Friedreich, os Requerentes desenharam uma série de RNAs guia direcionados para locais que flanqueiam a expansão GAA e os mais eficientes e específicos são escolhidos (Fig. 32B).

[1114] Os Requerentes entregaram uma combinação de RNAs guia direcionado para o íntron 1 de FXN juntamente com Cas9 para mediar a excisão da região de expansão GAA. AAV9 pode ser usado para mediar a aplicação eficiente de Cas9 e na medula espinal.

[1115] Se o elemento Alu adjacente à expansão GAA é considerado importante, pode haver restrições para o número de locais que podem ser direcionados mas os Requerentes podem adotar estratégias para evitar a sua rutura.

[1116] Estratégias alternativas:

[1117] Em vez de modificar o genoma usando Cas9, os Requerentes também podem ativar diretamente o gene FXN usando o domínio de ligação de Cas9 (atividade nuclease deficiente) à base de DNA para direcionar um domínio de ativação transcricional para o gene FXN. Os Requerentes poderão ter que considerar a robusteza da ativação da transcrição artificial mediada por Cas9 para assegurar que é robusta o suficiente em comparação com outros métodos (Tremblay et al., Transcription Activator-Like Effector Proteins Induce the Expression of the Frataxin Gene; Human Gene Therapy. Agosto 2012, 23(8): 883 890).

Exemplo 29: Estratégias para minimizar a clivagem fora do alvo usando Cas9 nickase

[1118] Como mencionado anteriormente na aplicação, a Cas9 pode ser mutada para mediar a clivagem de cadeia única por meio de uma ou mais das seguintes mutações: D10A, E762A, e H840A.

[1119] Para mediar a inativação gênica via NHEJ, os Requerentes usaram uma versão nickase de Cas9 com dois RNAs guia. Corte fora do alvo por cada RNA guia individual pode ser reparado principalmente sem mutação, quebras de cadeia dupla (o que pode levar a mutações via NHEJ) só ocorrem quando os locais alvo são adjacentes uns aos outros. Uma vez que as ruturas das cadeias duplas introduzidas pelo corte duplo não são bruscas, a coexpressão de enzimas de processamento final como TREX1 vai aumentar o nível de atividade NHEJ.

[1120] A seguinte lista de alvos em forma de tabela são para genes envolvidos nas seguintes doenças:

[1121] Doença Lafora - alvo GSY1 ou PPP1R3C (PTG) para reduzir o glicogênio em neurônios.

[1122] Hipercolesterolemia - alvo PCSK9

[1123] As sequências alvo são listados em pares (L e R) com um número diferente de nucleotídeos no espaçador (0 a 3pb). Cada espaçador também pode ser usado por si só com o tipo selvagem Cas9 para introduzir rutura de cadeia dupla no local alvo.

[1124] Estratégias alternativas para melhorar a estabilidade do RNA guia e aumentar a especificidade

[1125] 1. Os nucleotídeos em 5' do RNA guia podem ser ligados através de ligações tioéster, em vez de ligação fosfoéster como no RNA natural. Ligação tioéster pode impedir o RNA guia de ser digerido por maquinaria endógena de degradação de RNA.

[1126] 2. Os nucleotídeos na sequência guia (5' 20 pb) do RNA guia pode utilizar ácidos nucleicos em ponte (BNA) como bases para melhorar a especificidade de ligação.

Exemplo 30: CRISPR-cas para edição rápida de genoma multiplexado

[1127] Alguns aspectos da invenção referem-se a protocolos e métodos pelos quais a eficiência e especificidade de modificação genética pode ser testada no prazo de 3-4 dias após o desenho do alvo, e linhas celulares clonais modificadas podem ser derivadas dentro de 2-3 semanas.

[1128] Nucleases programáveis são tecnologias poderosas para mediar alteração do genoma com alta precisão. A nuclease Cas9 mediada por RNA guia a partir do sistema imunitário adaptativo CRISPR microbiano pode ser usada para facilitar a edição do genoma eficiente em células eucarióticas, simplesmente especificando uma sequência de direcionamento de 20 nt no seu RNA guia. Os Requerentes descrevem um conjunto de protocolos de aplicação de Cas9 para facilitar a edição do genoma eficiente em células de mamíferos e gerar linhas celulares para estudos funcionais a jusante. Começando com o desenho do alvo, a modificação eficiente de genes específicos pode ser conseguida dentro de 3-4 dias, e as linhas celulares clonais modificadas podem ser derivadas dentro de 2-3 semanas.

[1129] A capacidade para modificar sistemas biológicos e organismos possui um enorme potencial para aplicações em ciência básica, medicina e biotecnologia. As endonucleases específicas para sequência programáveis que facilitam a edição precisa de locais genômicos endógenos estão agora permitindo a interrogação sistemática de elementos genéticos e variações genéticas causais em uma ampla variedade de espécies, incluindo aqueles que não eram geneticamente tratáveis anteriormente. Uma série de tecnologias de edição do genoma têm surgido nos últimos anos, incluindo nucleases dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TALENS), e o sistema de nuclease CRISPR-Cas RNA guia. As duas primeiras tecnologias usam uma estratégia comum de amarrar domínios catalíticos de endonuclease a proteínas de ligação de DNA modulares para induzir quebras de cadeia dupla no DNA alvo (DSB) nos locais genômicos específicos. Por outro lado, Cas9 é uma nuclease guiada por pequenos RNAs através de emparelhamento de bases de Watson-Crick com o DNA alvo, que apresenta um sistema que é fácil de conceber, eficiente e bem adaptado para alto rendimento e edição de gene multiplexado por uma variedade de células tipos e organismos. Aqui os Requerentes descrevem um conjunto de protocolos de aplicação da recente desenvolvida nuclease Cas9 para facilitar a edição do genoma eficiente em células de mamíferos e gerar linhas celulares para estudos funcionais a jusante.

[1130] Tal como ZFNs e TALENs, Cas9 promove a edição do genoma, estimulando DSB nos locais alvo genômicos. Após a clivagem por Cas9, o local alvo sofre uma das duas principais vias de reparação de danos no DNA, a via da junção da extremidade não homóloga com tendência a erro (NHEJ) ou a via da reparação de homologia dirigida de alta fiabilidade (HDR). Ambas as vias podem ser utilizadas para alcançar o resultado de edição desejado.

[1131] NHEJ: Na ausência de um modelo de reparação, o processo NHEJ religa DSBs, o que pode deixar uma cicatriz na forma de mutações Indel. Este processo pode ser aproveitado para alcançar inativações de genes, como indels que ocorrem dentro de um éxon de codificação podem conduzir a mutações de deslocamento de grelha e um códon de paragem prematuro. Várias DSBs também podem ser explorados para mediar deleções maiores no genoma.

[1132] HDR: Reparação direta de homologia é uma importante via de reparação do DNA alternativa a NHEJ. Embora HDR tipicamente ocorra a frequências mais baixas do que NHEJ, pode ser aproveitada para gerar modificações precisas definidas em um local alvo na presença de um modelo de reparação introduzida exogenamente. O modelo de reparação pode ser quer na forma de DNA de cadeia dupla, concebido de forma semelhante a construções de DNA convencionais com braços de homologia que flanqueiam a sequência de inserção, ou oligonucleotídeos de DNA de cadeia simples (ssODNs). Este último fornece um método eficaz e simples para fazer pequenas edições no genoma, tais como a introdução de mutações de nucleotídeos individuais para sondar variações genéticas causais. Ao contrário de NHEJ, HDR é geralmente ativa apenas em células em divisão e a sua eficácia varia dependendo do tipo e do estado da célula.

[1133] Resumo de CRISPR: O sistema CRISPR-cas, pelo contrário, é, no mínimo, um sistema de dois componentes constituído por nuclease Cas9 e um RNA guia curto. Redirecionamento de Cas9 a diferentes locais ou edição simultânea de múltiplos genes simplesmente requer a clonagem de um oligonucleotídeo de 20 pb diferente. Embora a especificidade de nuclease Cas9 tenha ainda que ser completamente elucidada, o emparelhamento de bases simples de Watson-Crick do sistema CRISPR-Cas é provavelmente mais previsível do que dos domínios ZFN ou TALEN.

[1134] CRISPR-Cas tipo II (repetições curtas palindrômicas agrupadas regularmente Interespaçadas) é um sistema imune adaptativo bacteriano que utiliza Cas9, para clivar elementos genéticos estranhos. Cas9 é guiada por um par de RNAs não-codificantes, um crRNA variável e um tracrRNA auxiliar necessário. O crRNA contém uma sequência guia de 20 nt determina a especificidade localizando o DNA alvo através de emparelhamento de bases de Watson-Crick. No sistema bacteriano nativo, múltiplos crRNAs são cotranscritos para dirigir Cas9 contra vários alvos. No sistema CRISPR-Cas derivado de Streptococcus pyogenes, o DNA alvo deve preceder imediatamente ao motivo adjacente vizinho protoespaçador 5'- NGG/NRG (PAM), que pode variar para outros sistemas de CRISPR.

[1135] CRISPR-Cas é reconstituído em células de mamífero através da expressão heteróloga de Cas9 otimizado de códon humana e os componentes de RNA necessários. Além disso, o crRNA e tracrRNA podem ser fundidos para criar um anticorpo quimérico, RNA guia sintético (sgRNA). Cas9 pode, portanto, ser redirigida para qualquer alvo de interesse por alteração da sequência guia 20nt dentro do sgRNA.

[1136] Dada a sua facilidade de execução e capacidade multiplexada, Cas9 foi usada para gerar células eucarióticas manipuladas portadoras de mutações específicas através de ambos NHEJ e HDR. Além disso, a injeção direta de sgRNA e mRNA que codifica Cas9 em embriões permitiu a rápida geração de camundongos transgênicos com múltiplos alelos modificados; estes resultados são promissores para a edição de organismos que são de outra forma geneticamente intratáveis.

[1137] Cas9 mutante carregando uma rutura em um dos seus domínios catalíticos foi modificado para corte ao invés de clivagem de DNA, permitindo quebras de cadeia simples e reparação preferencial através de HDR, potencialmente melhorando mutações indel indesejadas fora do alvo DSBs. Além disso, um mutante Cas9 com ambos os resíduos catalíticos de clivagem de DNA mutados foi adaptado para permitir a regulação da transcrição em E. coli, o que demonstra o potencial de funcionalização Cas9 para diversas aplicações. Certos aspectos da presente invenção dizem respeito à construção e a aplicação de Cas9 para edição multiplexada de células humanas.

[1138] Os Requerentes têm proporcionado um códon otimizado humano, localização nuclear de Cas9 com sequência flanqueada para facilitar a edição gene eucariótica humano. Os Requerentes descrevem considerações para a conceção da sequência guia de 20 nt, protocolos para a construção rápida e a validação de sgRNAs funcional e, finalmente, utilizar a nuclease Cas9 para mediar tanto modificações do genoma baseadas em NHEJ- e em HDR- em linha celulares de rim embrionário humano (células HEK-293FT) e de células estaminais humanas (HUES9). Este protocolo pode igualmente ser aplicado a outros tipos de células e organismos.

[1139] Seleção do alvo para sgRNA: Existem duas principais considerações na seleção da sequência guia de 20 nt para direcionamento do gene: 1) a sequência alvo deve preceder o 5'-NGG PAM para Cas9 de S. pyogenes, e 2) sequências guia devem ser escolhidas para minimizar a atividade fora do alvo. Os Requerentes fornecem uma ferramenta de desenho on-line para o desenho de Cas9 que contempla uma entrada para a sequência de interesse e identifica locais alvo adequados. Para avaliar experimentalmente as modificações fora do alvo para cada sgRNA, os Requerentes também fornecem previsão computacional dos locais fora do alvo para cada alvo pretendido, classificados de acordo com a análise quantitativa específica dos Requerentes sobre os efeitos da identidade da incompatibilidade de emparelhamento de bases, posição e distribuição.

[1140] A informação detalhada sobre locais computacionais previstos fora do alvo é a seguinte:

[1141] Considerações de atividades de clivagem fora do alvo: Semelhante a outras nucleases, Cas9 pode clivar alvos de DNA fora do alvo no genoma a frequências reduzidas. A medida em que uma atividade fora do alvo é exibida por uma dada sequência guia depende de uma combinação de fatores, incluindo a concentração da enzima, termodinâmicas da sequência guia específica empregue, e a abundância de sequências semelhantes no genoma alvo. Para a aplicação de rotina de Cas9, é importante considerar formas de minimizar o grau de clivagem fora do alvo e também de ser capaz de detectar a presença de clivagem fora do alvo.

[1142] Minimizando a atividade fora do alvo: Para aplicação em linhas celulares, os Requerentes recomendam seguir dois passos para reduzir o grau de modificação do genoma fora do alvo. Em primeiro lugar, através da ferramenta de seleção de alvos CRISPR online dos Requerentes, é possível computacionalmente avaliar a probabilidade de uma determinada sequência guia para ter locais fora do alvo. Estas análises são realizadas através de uma busca exaustiva no genoma de sequências fora do alvo que são sequências similares como a sequência guia. Investigação experimental do efeito de bases que não combinam entre o sgRNA e o seu DNA alvo revelou que a incompatibilidade de tolerância é 1) dependente posição - 8- 14pb na extremidade 3' da sequência guia é menos tolerante de incompatibilidade do que bases em 5', 2) dependente de quantidade - em geral mais de 3 incompatibilidades não são toleradas, 3) dependente da sequência guia - algumas sequências guia são menos tolerantes de incompatibilidades do que outros, e 4) dependente da concentração - clivagem fora do alvo é altamente sensível à quantidade de DNA transfectado. O site web de análise do local alvo dos Requerentes (disponível em website genome-engineering.org/tools) integra estes critérios para fornecer previsões para prováveis locais fora do alvo no genoma alvo. Em segundo lugar, os Requerentes recomendam titulação da quantidade de Cas9 e plasmídeo de expressão sgRNA para minimizar a atividade fora do alvo.

[1143] Deleção de atividade fora do alvo: Usando a ferramenta web dos Requerentes de direcionamento CRISPR, é possível gerar uma lista de mais prováveislocais fora do alvo, bem como iniciadores SURVEYOR ou análise de sequenciação desses locais. Para clones isogênicos gerados usando Cas9, os Requerentes recomendam altamente que se sequenciem esses locais candidatos fora do alvo para verificar quaisquer mutações indesejadas. Vale a pena notar que podem haver modificações fora do alvo em locais que não estão incluídos na lista de candidatos previstos e o sequenciamento do genoma completo deve ser realizado para verificar completamente a ausência de locais de fora do alvo. Além disso, em ensaios multiplexados onde vários DSBs são induzidos dentro do mesmo genoma, podem haver baixas taxas de eventos de translocação e podem ser avaliadas usando uma variedade de técnicas, tais como a sequenciação profunda.

[1144] A ferramenta online proporciona as sequências para todos os oligos e os iniciadores necessários para 1) preparar as construções sgRNA, 2) ensaiar a eficiência de modificação alvo, e 3) avaliar a clivagem em sítios potenciais fora do alvo. Vale a pena notar que, porque o promotor U6 da RNA polimerase III utilizado para expressar o sgRNA prefere o nucleotídeo guanina (G) como a primeira base do seu transcrito, um G adicional é acrescentado na extremidade 5' do sgRNA onde a sequência guia 20 nt sequência não começa com G.

[1145] Abordagens para a construção e aplicação de sgRNA: Dependendo da aplicação desejada, sgRNAs podem ser entregues ou como 1) produtos de amplificação de PCR contendo um cassete de expressão ou como 2) plasmídeos que expressam sgRNA. A aplicação de sgRNA baseado em PCR é anexa à sequência sgRNA personalizada para o iniciador reverso de PCR utilizado para amplificar um modelo promotor U6. O amplicon resultante pode ser cotransfectado com um plasmídeo contendo Cas9 (PX165). Este método é ótimo para a triagem rápida de múltiplos sgRNAs candidatos, como transfecções de células para o teste funcional e pode ser realizado poucas horas após a obtenção dos iniciadores de codificação sgRNA Uma vez que este método simples evita a necessidade de clonagem com base em plasmídeos e verificação da sequência, que é bem adequado para o teste ou a cotransfecção de um grande número de sgRNAs para gerar bibliotecas de grandes inativações ou outras aplicações sensíveis à escala. Note-se que os iniciadores de codificação sgRNA têm mais de 100 pb, em comparação com os oligos com ~ 20 pb necessárias para aplicação de sgRNA à base de plasmídeo.

[1146] A construção de um plasmídeo de expressão para sgRNA também é simples e rápida, que envolve um único passo de clonagem com um par de oligonucleotídeos parcialmente complementares. Após a hibridação dos pares de oligo, as sequências guia resultantes podem ser inseridas em um plasmídeo que possui a Cas9 e um suporte invariável tendo o restante da sequência sgRNA (PX330). Os plasmídeos de transfecção também podem ser modificados para permitir a produção de vírus para a aplicação in vivo.

[1147] Em adição a PCR e métodos de aplicação baseados em plasmídeo, tanto Cas9 e sgRNA podem ser introduzidos nas células como RNA.

[1148] Desenho do modelo de reparação: Tradicionalmente, as modificações de DNA alvo têm exigido a utilização de moldes de reparação com base em plasmídeos dadores que contêm braços de homologia que flanqueiam o local de alteração. Os braços de homologia em cada lado pode variar em comprimento, mas são tipicamente mais do que 500 pb. Este método pode ser usado para gerar grandes modificações, incluindo a inserção de genes repórter, tais como proteínas fluorescentes ou marcadores de resistência aos antibióticos. A conceção e construção de plasmídeos de direcionamento têm sido descritos em outros lugares.

[1149] Mais recentemente, os oligonucleotídeos de DNA de cadeia simples (ssODNs) têm sido utilizados em lugar de plasmídeos alvo para modificações pequenas dentro um local definido sem clonagem. Para obter elevadas eficiências de HDR, ssODNs contêm sequências flanqueantes de pelo menos 40 pb em cada lado que são homólogas à região alvo, e pode ser orientada quer na direção senso ou antissenso em relação ao local alvo.

[1150] Teste funcional

[1151] Ensaio de nuclease SURVEYOR: Os Requerentes detectaram mutações indel quer pelo ensaio nuclease SURVEYOR (ou sequenciamento PCR de amplicon. A ferramenta online de desenhos de CRISPR alvo recomenda iniciadores para ambas as abordagens. No entanto, os iniciadores de sequenciação ou SURVEYOR também podem ser concebidos manualmente para amplificar a região de interesse a partir de DNA genômico e para evitar produtos de amplificação não específicos usando NCBI Primer-BLAST. Iniciadores SURVEYOR devem ser concebidos para amplificar 300-400 pb (para um total de 600-800 pb de amplicon) em ambos os lados do alvo Cas9 para permitir melhor visualização das bandas de clivagem por eletroforese em gel. Para evitar a formação excessiva de dímero de iniciadores, iniciadores SURVEYOR devem ser concebidos para terem, geralmente, menos de 25-nt de comprimento a temperaturas de fusão de ~ 60 °C. Os Requerentes recomendam testar cada par de iniciadores candidatos para amplicons de PCR específicos, assim como para a ausência de clivagem não específica durante o processo de digestão com nuclease SURVEYOR.

[1152] HDR mediado por plasmídeos ou ssODN: HDR pode ser detectado através de amplificação por PCR e sequenciação da região modificada. Iniciadores de PCR para este fim devem emparelhar fora da região gerada pelos braços de homologia para evitar a detecção falsa de modelo reparação residual (HDR Fwd e Rev, Fig. 30). Para a HDR mediada por ssODN, iniciadores de PCR SURVEYOR podem ser usados.

[1153] A detecção de indels ou HDR por sequenciação: Os Requerentes detectaram modificações alvo do genoma por qualquer sequenciamento Sanger ou de próxima geração profundo (NGS). Para o primeiro DNA genômico da região modificada pode ser amplificado utilizando iniciadores SURVEYOR ou HDR. Os amplicons devem ser subclonados em um plasmídeo, tal como pUC19 para a transformação; colônias individuais podem ser sequenciadas para revelar genótipo clonal.

[1154] Os Requerentes desenharam iniciadores para o sequenciamento de próxima geração (NGS) de amplicons mais curtos, normalmente na faixa de tamanho de 100-200 pb. Para a deteção de mutações NHEJ, é importante conceber iniciadores com, pelo menos, 10-20 pb entre as regiões de iniciação e o sítio alvo Cas9 para permitir a detecção de indels mais longos. Os Requerentes fornecem orientações para um método de duas etapas de PCR para anexar os adaptadores com código de barras para o sequenciamento profundo multiplexado. Os Requerentes recomendam a plataforma Illumina, devido aos seus, geralmente, baixos níveis de indels falsos positivos. Análise fora do alvo (descrita anteriormente) pode então ser realizada por meio de programas de alinhamento tais como, ClustalW, Geneious, ou scripts simples de análise de sequências.

[1155] Materiais e Reagentes

[1156] Preparação de sgRNA:

[1157] Água destilada Ultra Pura sem DNaseRNase (Life Technologies, cat. no. 10977-023)

[1158] Polimerase de fusão Herculase II (Agilent Technologies, cat. no. 600679)

[1159] FUNDAMENTAL. Taq polimerase padrão, que carece de atividade corretora 3'-5 'exonuclease, tem baixa fiabilidade e pode conduzir a amplificação de erros. Herculase II é uma polimerase de alta fiabilidade (fiabilidade equivalente a Pfu) que produz rendimentos elevados de produto de PCR com otimização mínima. Outras polimerases de alta fiabilidade podem ser substituídas.

[1160] Tampão reação Herculase II (5x; Agilent Technologies, incluído com polimerase)

[1161] Mistura solução de dNTP (25 mM cada;.Enzymatics, cat. no. N205L)

[1162] MgCl2 (25 mM; ThermoScientific, cat. no. R0971)

[1163] Kit de extração de gel QIAquick (Qiagen, cat. no. 28704)

[1164] kit QIAprep spin miniprep (Qiagen, cat. No. 27106)

[1165] Tampão TBE UltraPure (10X; Life Technologies, cat. no. 15581-028)

[1166] SeaKem LE agarose (Lonza, cat. No. 50004)

[1167] SYBR Safe DNA stain (10,000x; Life Technologies, cat. no. S33102)

[1168] 1-kb Plus DNA ladder (Life Technologies, cat. no. 10787-018)

[1169] Tampão de carregamento Trackit CyanOrange (Life Technologies, cat. No. 10.482-028)

[1170] FastDigest BbsI (BpiI) (Fermentas/ThermoScientific, cat. no. FD1014)

[1171] Tampão Tango Fermentas (Fermentas/ThermoScientific, cat. No. By5)

[1172] DL-ditiotreitol (DTT;Fermentas/ThermoScientific, cat. No. R0862)

[1173] Ligase T7 DNA (Enzymatics, cat. no. L602L)

[1174] Fundamental: Não substitua a ligase T4 mais comumente usada. Ligase T7 tem uma atividade 1.000 vezes maior nas extremidades aderentes do que nas extremidades sem corte e atividade global superior em relação às ligases T4 concentradas disponíveis comercialmente.

[1175] Tampão de ligação T7 2X Rápido (incluído com ligase DNA T7, Enzymatics, cat. No. L602L)

[1176] Quinase Polinucleotídeo T4 (New England Biolabs, cat. No M0201S)

[1177] Tampão de reação da ligase T4 DNA (10X; New England Biolabs, cat N° B0202S)

[1178] Adenosina 5'-trifosfato (10 mM; New England Biolabs, cat no P0756S)

[1179] DNase dependente de ATP PlasmidSafe (Epicentre, cat. no. E3101K)

[1180] One Shot Stbl3 Escherichia coli quimicamente competente (E. coli) (Life Technologies, cat. No. C7373-03)

[1181] Meio SOC (New England Biolabs, cat. N. B9020S)

[1182] Meio LB (Sigma, cat. No. L3022)

[1183] Meio de agar LB (Sigma, cat. No. L2897)

[1184] Ampicilina, esterilizada por filtração (100 mg mL-1; Sigma, cat no A5354)

[1185] Cultura de células de mamíferos:

[1186] Células HEK293FT (Life Technologies, cat. No. R700-07)

[1187] Meio mínimo Eagle de Dulbecco (DMEM, 1X, glicose elevada; Life Technologies, cat no.10.313-039)

[1188] Meio mínimo Eagle de Dulbecco (DMEM, 1X, glicose elevada, sem vermelho de fenol; Life Technologies, cat. n° 31053-028)

[1189] Salino tamponado com fosfato Dulbecco (DPBS, 1X;Life Technologies, cat. n° 14190-250)

[1190] Soro bovino fetal, inativado pelo calor e qualificado (Life Technologies, Cat. n°. 10438-034)

[1191] Meio de soro reduzido Opti-MEM I (FBS;Life Technologies, cat n° 11058-021)

[1192] Penicilina-estreptomicina (100X; Life Technologies, cat. no. 15140-163)

[1193] TrypLE™ Express (1X, sem Vermelho de Fenol; Life Technologies, Cat. n° 12604-013)

[1194] Reagente de transfecção 2000 Lipofectamina (Life Technologies, Cat. n°. 11.668.027)

[1195] Linha celular Amaxa SF 4D-Nucleofector® X Kit S (32 RCT; Lonza, cat. n° V4XC-2032)

[1196] Linha celular HUES 9 (HARVARD STEM CELL SCIENCE)

[1197] Geltrex LDEV-Matriz de Membrana Base do Fator de Crescimento Reduzido Livre (Life Technologies, cat. no. A1413201)

[1198] Meio mTeSR1 (Stemcell Technologies, cat. no. 05850)

[1199] Solução Acutase de separação celular (Stemcell Technologies, cat. n°. 07920)

[1200] Inibidor ROCK (Y-27632; Millipore, cat. no. SCM075)

[1201] Célula Primária Amaxa P3 4D-Nucleofector® X Kit S (32 RCT; Lonza cat. n°. V4XP-3032)

[1202] Análise de genotipagem:

[1203] Solução de extração de DNA QuickExtract (Epicentre, cat. no. QE09050)

[1204] Iniciadores PCR para SURVEYOR, análise RFLP ou sequenciação (ver tabela de Iniciadores)

[1205] Polimerase de fusão Herculase II (Agilent Technologies, cat. no. 600679)

[1206] FUNDAMENTAL. Como o ensaio Surveyor é sensível a diferenças de base única, é particularmente importante a utilização de uma polimerase de alta fiabilidade. Outras polimerases de alta fiabilidade podem ser substituídas.

[1207] Tampão de reação Herculase II (5x; Agilent Technologies, incluído com polimerase)

[1208] Mistura solução de dNTP (25 mM cada;.Enzymatics, cat. no. N205L)

[1209] Kit de extração de gel QIAquick (Qiagen, cat. no. 28704)

[1210] Tampão Taq (10x; Genscript, cat. no. B0005)

[1211] Kit para deteção de mutação SURVEYOR para eletroforese em gel (Transgenomic, cat. n°. 706025)

[1212] Tampão TBE UltraPure (10X; Life Technologies, cat. no. 15581-028)

[1213] SeaKem LE agarose (Lonza, cat. n° 50004)

[1214] Géis 4-20% TBE 1,0 mm, 15 poços (Life Technologies, cat. no. EC62255BOX)

[1215] Tampão amostra TBE alta densidade Novex® (5X; Life Technologies, cat. n°. LC6678)

[1216] SYBR Corante Gel Ouro de Ácido Nucleico (10.000X; Life Technologies, cat. n°. S-11494)

[1217] 1-kb Plus DNA ladder (Life Technologies, cat. no. 10787-018)

[1218] Tampão de carregamento Trackit CyanOrange (Life Technologies, cat. n°. 10.482-028)

[1219] FastDigest HindIII (Fermentas/ThermoScientific, cat. n°. FD1014)

[1220] Equipamento

[1221] Pontas de pipetas estéreis filtradas (Corning)

[1222] Tubos de 1,5 mL de microcentrífuga padrão (Eppendorf, cat. N°. 0.030 125,150)

[1223] Placas de PCR Axygen de 96 poços (VWR, cat. n°. PCR-96M2-HSC)

[1224] Tubos PCR Axygen 8 faixas (Fischer Scientific, cat. n°. 14-222-250)

[1225] Tubos Falcon, polipropileno, 15 mL (BD Falcon, cat. n°. 352.097)

[1226] Tubos Falcon, polipropileno, 50 mL (BD Falcon, cat. n°. 352070)

[1227] Tubo de fundo redondo com tampa de filtro de células, 5 mL (BD Falcon, cat. n°. 352.235)

[1228] Placas de Petri (60 mm x 15 mm; BD Biosciences, cat. n°. 351007)

[1229] Placa de cultura de tecido (24 poços;BD Falcon, cat. n° 353,047)

[1230] Placa de cultura de tecido (96 poços, fundo plano; BD Falcon, cat. n°. 353075)

[1231] Placa de cultura de tecidos (100 mm; BD Falcon, 353,003)

[1232] Termociclador de 96 poços com a funcionalidade de temperatura programável (Applied Biosystems Veriti, cat. n° . 4375786) .

[1233] Microcentrifugadoras de bancada 5424, 5804 (Eppendorf)

[1234] Sistema de eletroforese em gel (PowerPac basic power supply, Bio-Rad,cat. no. 164-5050, e Sub-Cell GT System gel tray, Bio-Rad, cat. n°. 170-4401)

[1235] Novex XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies, cat. n°. EI0001)

[1236] Sistema de imagem gel digital (GelDoc EZ, Bio-Rad, cat. n°. 170-8270, and blue sample tray, Bio-Rad, cat. n°. 170-8273)

[1237] Transiluminator luz azul e óculos de filtro laranja (SafeImager 2.0; Invitrogen, cat. n°. G6600)

[1238] Software quantificação Gel (Bio-Rad, ImageLab, incluído com GelDoc EZ ou Imagem de fonte livre de National Institutes of Health, disponível no website rsbweb.nih.gov/ij/) espectômetro UV (NanoDrop 2000c, Thermo Scientific)

[1239] Configuração de Reagentes

[1240] Solução de Tris-borato EDTA (TBE) de eletroforese diluída para tampão TBE em água destilada para 1x solução de trabalho para preparação de géis de agarose e para utilização como um tampão para gel de eletroforese. Tampão pode ser armazenado à temperatura ambiente (18-22 °C) durante pelo menos 1 ano.

[1241] • ATP 10 mM, dividir ATP 10 mM em alíquotas de 50 μL e armazenar a - 20 °C por até 1 ano; evitar ciclos de congelamento e descongelamento repetidos.

[1242] • DTT, 10 mM Preparar solução de DTT 10 mM em água destilada e armazenar em alíquotas de 20 μL a - 70 °C por até 2 anos; para cada reação, usar uma nova alíquota, como DTT é facilmente oxidado.

[1243] • D10 meio de cultura Para a cultura de células HEK293FT, preparar meio de cultura D10 DMEM com 1X GlutaMAX e 10% (vol/vol) soro fetal de bovino. Tal como indicado no protocolo, este meio pode também ser suplementado com 1X penicilina-estreptomicina. O meio D10 pode ser feito com antecedência e guardado a 4 °C durante até 1 mês.

[1244] • meio de cultura mTeSR1 para cultura de células estaminais embrionárias humanas, preparar o meio mTeSR1 completando com o suplemento 5X (incluído com mTeSR1 meio basal), e 100 μg/mL Normocina.

[1245] Procedimento

[1246] Desenho do direcionamento dos componentes e uso da ferramenta on-line • Momento 1d

[1247] 1| Entrada da sequência de DNA genômico. Os Requerentes forneceram uma ferramenta de desenho on-line para o direcionamento de Cas9, que identifica e classifica alvos adequados, e computacionalmente prevê locais fora do alvo para cada alvo. Alternativamente, pode-se selecionar manualmente a sequência guia através da identificação da sequência de 20 pb diretamente a montante de qualquer 5'-NGG.

[1248] 2| Encomendar oligos e iniciadores necessários, conforme especificado pela ferramenta on-line. Se o local for escolhido manualmente, os oligos e os iniciadores devem ser desenhados.

[1249] Preparação da construção de expressão de sgRNA

[1250] 3| Para gerar construção de expressão de sgRNA, pode ser usado um protocolo tanto por PCR como baseado em plasmídeos.

[1251] (A) via amplificação por PCR • Momento 2 h

[1252] (i) Os Requerentes prepararam um modelo U6 PCR diluído. Os Requerentes recomendam PX330 como modelo de PCR, mas qualquer plasmídeo contendo U6 pode igualmente ser usado como modelo de PCR. Os Requerentes diluíram o modelo com ddH2O a uma concentração de 10 ng/μL. Note-se que se um plasmídeo ou cassete já contendo umU6 sgRNA é utilizado como um modelo, uma extração em gel tem de ser realizada para assegurar que o produto contém apenas o sgRNA pretendido e sem sgRNA do modelo.

[1253] (ii) os Requerentes prepararam oligos de PCR diluídos. Iniciadores U6-Fwd e U6-sgRNA-Rev são diluídos para uma concentração final de 10 μM em ddH2O (adicionar 10 μL de 100 μM de iniciador a 90 μL ddH2O).

[1254] (iii) reação PCR U6-sgRNA. Os Requerentes configuraram a seguinte reação para cada iniciador U6-sgRNA- Rev e MasterMix conforme o necessário:

[1255] (iv) Os Requerentes realizaram uma reação de PCR nas reações do passo (iii), utilizando as seguintes condições de ciclo:

[1256] (v) Após a reação estar completa, os Requerentes correram o produto em um gel para verificar a amplificação bem-sucedida de uma única banda. Teste de gel de agarose a 2% (p/v) em tampão TBE 1X com corante Safe SYBR 1X. Correr 5 μL do produto de PCR em gel a 15 V cm-1 durante 2030 min. Amplicons de sucesso devem produzir um único produto de 370 pb e o modelo deve ser invisível. Não deve ser necessário extrair do gel o fragmento amplificado por PCR.

[1257] (vi) Os Requerentes purificaram o produto de PCR utilizando o kit de purificação de PCR QIAquick de acordo com as instruções do fabricante. Eluiu-se o DNA em 35 μL de tampão EB ou água. Os produtos de PCR purificados podem ser armazenados a 4 °C ou -20 °C.

[1258] (B) Clonagem de sgRNA em vetor de expressão bicistrônico contendo Cas9 • Momento 3 d

[1259] (i) Preparar as inserções sgRNA oligo. Os Requerentes ressuspenderam as cadeias superior e inferior de oligos para cada desenho de sgRNA a uma concentração final de 100 μM. Fosforilação e emparelhamento do oligo como se segue:

[1260] (ii) Hibridação em um termociclador utilizando os seguintes parâmetros:

[1261] 37 °C durante 30 m

[1262] 95 °C durante 5 m

[1263] Rampa até 25 °C a 5 °C por minuto

[1264] (iii) Os Requerentes diluíram oligos fosforilados e hibridados 1:200 por adição de 1μl de oligo para 199 μL ddH2O à temperatura ambiente.

[1265] (iv) Clonar sgRNA oligo em PX330. Os Requerentes configuraram a reação Golden Gate para cada sgRNA. Os Requerentes recomendaram também a criação de uma não- inserção, PX330 como único controle negativo.

[1266] (v) Incubação da reação Golden Gate durante o total de 1 h: (vi) Os Requerentes trataram a reação Golden Gate com exonuclease PlasmidSafe para digerir qualquer DNA linearizado residual. Este passo é opcional, mas altamente recomendado.

[1267] Reação Golden Gate do passo 4 11 μL

[1268] Tampão Plasmid Safe 10X 1,5 μL

[1269] ATP, 10 mM 1,5 μL

[1270] PlasmidSafe exonuclease 1μL

[1271] Total 15 μL

[1272] (vii) Os Requerentes incubaram a reação PlasmidSafe a 37 °C durante 30 min, seguido de inativação a 70 °C durante 30 min. Ponto de pausa: Após conclusão, a reação pode ser congelada e continuada depois. O DNA circular deve ser estável durante pelo menos 1 semana.

[1273] (viii) Transformação. Os Requerentes transformaram o plasmídeo tratado com PlasmidSafe em uma estirpe de E. coli competente, de acordo com o protocolo fornecido com as células. Os Requerentes recomendaram Stbl3 para a transformação rápida. Resumidamente, os Requerentes adicionaram 5 μL do produto do passo (vii) em 20μl de células quimicamente competentes Stbl3 geladas. Em seguida, são incubadas em gelo durante 10 m, choque térmico a 42 °C durante 30 s, voltaram imediatamente para gelo durante 2 m, 100 μL de meio SOC é adicionado, e é plaqueado sobre uma placa de LB contendo 100 μg/mL de ampicilina durante a noite, com incubação a 37 °C.

[1274] (ix) Dia 2: Os Requerentes inspecionaram as placas para verificar crescimento de colônias. Tipicamente, não há colônias nas placas de controlo negativo (ligação de PX330 digerido só com Bbsl, nenhum oligo sgRNA emparelhado), e dezenas a centenas de colônias nas placas de clonagem PX330- sgRNA.

[1275] (x) A partir de cada placa, os Requerentes escolheram 2-3 colônias para verificar a correta inserção de sgRNA. Os Requerentes utilizaram um ponta de pipeta estéril para inocular uma única colônia em uma cultura de 3 mL de meio LB com 100 μg/mL de ampicilina. Incubação e agitação a 37 °C durante a noite.

[1276] (xi) Dia 3: Os Requerentes isolaram DNA de plasmídeo a partir de culturas durante a noite utilizando um kit QIAprep spin miniprep de acordo com as instruções do fabricante.

[1277] (xii) Validação da sequência do plasmídeo CRISPR. Os Requerentes verificaram a sequência de cada colônia por sequenciação a partir do promotor U6 utilizando o iniciador U6-FWd. Opcional: sequência do gene Cas9 utilizando os iniciadores listados na seguinte tabela Primer.

[1278] Os Requerentes referenciaram os resultados da sequenciação para a sequência do vetor de clonagem PX330 para verificar que a sequência guia de 20 pb foi inserida entre o promotor U6 e o restante do suporte sgRNA. Detalhes e sequência do mapa PX330 no mapa formato vetorial GenBank (ficheiro *.gb) pode ser encontrado no site crispr.genome-engineering.org.

[1279] (Opcional) Desenho do modelo ssODN • Momento 3 d planejamento futuro

[1280] 3| Desenho e ordem ssODN. ssODN tanto senso ou antissenso pode ser comprado diretamente do fornecedor. Os Requerentes recomendam desenhar braços de homologia de pelo menos 40 pb de cada lado e 90 pb para a eficiência ótima HDR. Na experiência dos Requerentes, oligos antissenso têm eficiências de modificação ligeiramente superiores.

[1281] 4|Os Requerentes ressuspenderam e diluíram ultrâmeros ssODN para uma concentração final de 10 μM. Não combinar ou emparelhar as sssODN senso e antissenso. Armazenar a -20 °C.

[1282] 5|Nota para aplicações de HDR, os Requerentes recomendam clonagem sgRNA no plasmídeo PX330.

[1283] Validação funcional de sgRNAs: cultura de células e transfecções • Momento 3-4 d

[1284] O sistema CRISPR-Cas tem sido utilizado em uma série de linhas celulares de mamífero. As condições podem variar para cada linha celular. Os protocolos abaixo detalham as condições da transfecção para células HEK239FT. Nota para transfecções HDR ssODN-mediadas, o kit da linha celular Amaxa SF Nucleofector é utilizado para aplicação ideal de ssODNs. Isso é descrito na próxima seção.

[1285] 7|Manutenção HEK293FT. As células são mantidas de acordo com as recomendações do fabricante. Em resumo, os Requerentes fizeram cultura de células em meio D10 (GlutaMax DMEM suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino), a 37 °C e 5% de CO2.

[1286] 8|Para a passagem, os Requerentes removeram o meio e enxaguaram uma vez através da adição suave de DPBS para o lado do frasco, de modo a não desagregar as células. Os Requerentes adicionaram-se 2 mL de TrypLE para um frasco T75 e incubaram-se durante 5 min a 37 °C. 10 mL de meio morno D10 é adicionado para inativar e transferir para um tubo Falcon de 50 mL. Os Requerentes dissociaram as células por trituração suave, e ressemearam em novos frascos, conforme necessário. Os Requerentes tipicamente fizeram a passagem de células a cada 2-3 d a uma razão de divisão de 1:4 ou 1:8, nunca permitindo que as células atingissem mais do que 70% de confluência. As linhas celulares são reiniciadas ao atingirem a passagem número 15.

[1287] 9|Preparação das células para transfecção. Os Requerentes plaquearam células bem dissociadas em placas de 24 poços em meio sem antibióticos D10 16-24 h antes da transfecção a uma densidade de 1,3 x 105 células por poço, e um volume de 500 μL. O aumento ou diminuição de escala para cima ou para baixo é de acordo com o manual do fabricante, conforme necessário. Sugere-se não plaquear mais células do que a densidade recomendada pois isso pode reduzir a eficiência de transfecção.

[1288] 10|No dia da transfecção, as células estão ótimas a 70-90% de confluência. As células podem ser transfectadas com Lipofectamina 2000 ou o kit da linha celular Amaxa SF Nucleofector de acordo com os protocolos dos fabricantes.

[1289] (A) Para sgRNAs clonados em PX330, os Requerentes transfectaram 500 ng de plasmídeo CRISPR de sequência verificada; se a transfecção de mais do que um plasmídeo, mistura-se a razão equimolar e não mais do que 500 ng total.

[1290] (B) Para sgRNA amplificado por PCR, os Requerentes misturam o seguinte:

[1291] Os Requerentes recomendam transfecção em técnicas por triplicado para quantificação confiável e incluindo controles de transfecção (por exemplo plasmídeo GFP) para monitorar a eficiência de transfecção. Além disso, plasmídeo de clonagem PX330 e/ou amplicon sgRNA pode ser transfectado sozinho como um controlo negativo para ensaios funcionais a jusante.

[1292] 11|Os Requerentes adicionaram o complexo Lipofectamina às células suavemente pois as células HEK293FT podem desligar facilmente da placa e facilmente resultar em menor eficiência de transfecção.

[1293] 12|Os Requerentes verificaram as células 24 h após a transfecção para a eficiência, através da estimativa da fração de células fluorescentes no controle da transfecção (por exemplo, GFP) utilizando um microscópio de fluorescência. Tipicamente as células estão mais do que 70 % transfectadas.

[1294] 13|Os Requerentes completaram o meio de cultura com 500 μL adicionais de médio D10 quente. Adicionaram D10 muito lentamente para o lado do poço e não utilizam o meio frio, pois as células podem separar facilmente.

[1295] 14|As células são incubadas durante um total de 48-72 h pós-transfecção antes de colhidas para análise indel. A eficiência Indel não aumenta sensivelmente após 48 h.

[1296] (Opcional) Cotransfecção de plasmídeos CRISPR e ssODNs ou plasmídeos de direcionamento para HR • Momento 34 d

[1297] 15|Linearização de plasmídeo alvo. O vetor de direcionamento foi linearizado por corte, se possível, uma vez em um local de restrição do vetor perto de um dos braços de homologia ou na extremidade distal de cada braço de homologia.

[1298] 16|Os Requerentes correram uma pequena quantidade do plasmídeo linearizado ao lado do plasmídeo sem cortes em gel de agarose 0,8-1% para verificar se a linearização foi bem-sucedida. O plasmídeo linearizado deve correr à frente do plasmídeo superenrolado.

[1299] 17|Os Requerentes purificaram o plasmídeo linearizado com o kit de purificação QIAquick PCR.

[1300] 18|Preparação das células para transfecção. Os Requerentes cultivaram HEK293FT em frascos T225 ou T75. A contagem de células suficiente antes do dia da transfecção é planejada. Para a cuvete em formato de tira Amaxa, são utilizadas 2 x 106 células por transfecção.

[1301] 19|Preparação das placas para transfecção. Os Requerentes adicionaram 1 mL de meio D10 morno em cada poço de uma placa de 12 poços. As placas são colocadas na incubadora para manter o calor médio.

[1302] 20|Nucleofecção Os Requerentes transfectaram células HEK293FT de acordo com as instruções do kit da linha celular Amaxa SF Nucleofector 4D, adaptadas nas etapas abaixo.

[1303] a. Para a cotransfecção de ssODN e CRISPR, é realizada a pré-mistura do seguinte DNA em tubos de PCR: plasmídeo pCRISPR (Cas9 + sgRNA) 500 ng Modelo ssODN (10μM) 1 μL

[1304] b. Para a cotransfecção de CRISPR e plasmídeo de direcionamento HDR, é realizada a pré-mistura do seguinte DNA em tubos de PCR: plasmídeo CRISPR (Cas9 + sgRNA) 500 ng Direcionamento de plasmídeo linearizado 500 ng

[1305] Para os controles de transfecção, consulte a seção anterior. Além disso, os Requerentes recomendam transfecção de ssODN ou plasmídeo de direcionamento sozinho como controle negativo.

[1306] 21|Dissociação das células individuais. Os Requerentes removeram o meio e lavaram suavemente uma vez com DPBS, tendo cuidado para não desalojar células. 2 mL de TrypLE foram adicionados em um frasco T75 e incubaram durante 5 min a 37 °C. 10 mL de meio morno D10 é adicionado para inativar e triturado para um tubo Falcon de 50 mL. Recomenda-se que as células sejam trituradas gentilmente e dissociadas para células individuais. Grandes aglomerações irão reduzir a eficiência de transfecção. Os Requerentes retiraram uma alíquota de 10 μL da suspensão e diluiu-se em 90 μL de meio de D10 para contagem. Os Requerentes contaram as células e calcularam o número de células e o volume de suspensão necessário para a transfecção. Os Requerentes normalmente transfectam 2 x 105 células por condição usando as Nucleocuvetes em tiras Amaxa, e recomendam o cálculo para mais 20% de células do que o necessário para ajustar à perda de volume nos passos de pipetagem subsequentes. O volume necessário é transferido para um novo tubo Falcon.

[1307] 23|Os Requerentes centrifugaram o novo tubo a 200 x g durante 5 min.

[1308] Os Requerentes preparam a solução de transfecção, misturando a solução de SF e o suplemento S1 tal como recomendado pela Amaxa. Para as cuvetes em tira Amaxa, é necessário um total de 20 μL de solução de SF suplementado por transfecção. Do mesmo modo, os Requerentes recomendam calcular mais 20% do que o volume requerido.

[1309] 25|Os Requerentes removeram completamente o meio das células sedimentadas a partir do passo 23 e suavemente ressuspenderam em um volume apropriado (20 μL por 2 x 105 células) de solução SF S1-suplementada. Não deixar células na solução SF por um período de tempo prolongado.

[1310] 26|20 μL das células ressuspensas são pipetados para cada pré-mistura de DNA do passo 20. Pipetar suavemente para misturar e transferir para câmara da Nucleocuvete-tira. Isto é repetido para cada uma das condições de transfecção.

[1311] Eletroporar as células usando o programa Nucleofector 4D recomendado por Amaxa, CM-130.

[1312] 28|Os Requerentes suave e lentamente pipetaram 100 μL de meio D10 quente para cada câmara Nucleocuvete-tira, e transferiram todo o volume para a placa pré-aquecida a partir do passo 19. FUNDAMENTAL. As células são muito frágeis neste estágio e pipetagem dura podem causar morte celular. Incubação durante 24 h. Neste ponto, a eficiência de transfecção pode ser estimada a partir da fração de células fluorescentes em controle de transfecção positiva. A nucleofacção tipicamente resulta em mais de 70-80% de eficiência de transfecção. Os Requerentes adicionaram lentamente 1 mL de meio D10 quente a cada poço sem desalojar as células. Incubaram as células durante um total de 72 h.

[1313] Cultura e transfecção de células-estaminais embrionárias humanas (HUES 9) • Momento 3-4 d

[1314] Manutenção de linha hESC (HUES9). Os Requerentes rotineiramente mantiveram a linha celular HUES9 em condições livres de alimentação com meio mTesR1. Os Requerentes prepararam meio mTeSR1 adicionando o suplemento 5X incluído com meio basal e 100 μg/mL Normocina. Os Requerentes prepararam uma alíquota de 10 mL de meio suplementado mTeSR1 ainda com 10 uM de inibidor Rock. Revestimento da placa de cultura de tecidos. Diluir GelTrex fria 1:100 em DMEM frio e revestir toda a superfície de uma placa de 100 milímetros de cultura de tecidos.

[1315] Colocar a placa na incubadora durante pelo menos 30 m, a 37 °C. Descongelar uma ampola de células a 37 °C em um tubo Falcon de 15 mL, adicionam-se 5 mL de meio mTeSR1 e pélete a 200 x g durante 5 min. Aspirar o revestimento GelTrex e cultivar ~ 1 x 106 células com 10 mL de meio mTeSR1 contendo Inibitor Rock. Mudar para meio normal mTeSR1 24 h após a transfecção e realimentar diariamente. Passagem de células. Realimentar as células com meio mTeSR1 fresco diariamente e fazer passagem antes de atingir 70% de confluência. Aspirar o meio mTeSR1 e lavar as células uma vez com DPBS. Separar as células por adição de 2 mL de Accutase e incubando a 37 °C durante 3 - 5 m. Adicionar 10 mL de meio mTeSR1 às células isoladas, transferir para tubo Falcon de 15 mL e delicadamente ressuspender. Replaquear em placas revestidas GelTrex em meio mTeSR1 com 10 uM de inibidor Rock. Alterar para meio normal mTeSR1 24 h após o plaqueamento.

[1316] Transfecção Os Requerentes recomendam a cultura de células durante, pelo menos, uma semana de pós- descongelamento antes de transfecção usando o kit Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector® (Lonza). Realimentação em fase log das células em crescimento, com meio fresco 2 h antes da transfecção. Dissociar a células individuais ou pequenos grupos de não mais de 10 células com Accutase e ressuspender suavemente. Contar o número de células necessárias para nucleofecção e girar a 200 x g durante 5 min. Remover o meio completamente e ressuspender em volume recomendado de solução de nucleofecção P3 suplementada com S1. Suavemente plaquear as células eletroporadas para placas revestidas na presença de 1X Inibidor Rock.

[1317] Verificar sucesso transfecção e realimentar diariamente com meio regular mTeSR1 começando 24 horas após nucleofecção. Tipicamente, os Requerentes observam mais do que 70% de eficácia de transfecção com Amaxa Nucleofecção. Colheita de DNA. 48-72 h após a transfecção, dissociar células usando Accutase e inativar por adição de 5 x volume de mTeSR1. Girar as células a 200 x g durante 5 m. As células sedimentadas podem ser diretamente processadas para extração de DNA com solução QuickExtract. Recomenda-se não dissociar mecanicamente as células sem Accutase. Recomenda-se sedimentar as células, sem inativar a Accutase ou acima da velocidade recomendada; isso pode causar a lise das células.

[1318] Isolamento de linhas celulares clonais por FACS. Tempo • 2-3 h de trabalho; 2-3 semanas de expansão

[1319] Isolamento clonal pode ser realizado 24 horas após a transfecção por FACS ou por diluição em série.

[1320] 54|Preparação de tampão FACS. As células que não precisam de classificação usando fluorescência de cor podem ser classificadas em meio D10 normal suplementado com penicilina/estreptomicina1X. Se a ordenação via fluorescência de cor também é necessária, um meio DMEM isento de fenol ou DPBS é substituído por DMEM normal. Suplemento com 1X penicilina/estreptomicina e filtração através de um filtro de 0,22 μm Steriflip.

[1321] 55|Prepararação de placas de 96 poços. Os Requerentes adicionaram 100 μL de meio C10 suplementado com 1X penicilina/estreptomicina por poço e preparara,m o número de placas, conforme necessário, para o número desejado de clones.

[1322] 56|Preparação das células para FACS. Os Requerentes dissociaram as células por aspiração do meio completo e adição de 100 μL de TrypLE por poço de uma placa de 24 poços. Incubação durante 5 m e adicionação de 400 μL de meio D10 quente.

[1323] 57|Células ressuspensas foram transferidas para um tubo Falcon de 15 mL e cuidadosamente trituradas 20 vezes. É recomendado verificar sob o microscópio para garantir a dissociação de células individuais.

[1324] 58|Girar as células a 200 x g durante 5 minutos.

[1325] 59|Os Requerentes aspiraram o meio, e ressuspenderam as células em 200 μL de meio FACS.

[1326] 60|As células são filtradas através de um filtro de malha de 35 um em tubos de FACS rotulados. Os Requerentes recomendam o uso do tubo BD Falcon 12 x 75 milímetros com tampa de filtro de células. Coloque as células em gelo até a classificação.

[1327] 61|Os Requerentes classificaram as células individuais em placas de 96 poços preparadas a partir do passo 55. Os Requerentes recomendam que em um único poço designado em cada placa, classificar 100 células como um controle positivo.

[1328] NOTA. O restante das células pode ser conservado e utilizado para determinação do genótipo a nível da população para avaliar a eficiência global da modificação.

[1329] 62|Os Requerentes retornaram as células à incubadora e permitiu-lhes expandir por 2-3 semanas. 100 μL de meio D10 quente é adicionado 5 d pós classificação. Mudar 100 μL de meio a cada 3-5 d como necessário.

[1330] 63|Colônias são inspecionados para a aparência "clonal" 1 semana após triagem: colônias arredondadas que irradiam de um ponto central. Marcar poços que estão vazias ou podem ter sido semeados com dupletos ou multipletos.

[1331] 64|Quando as células estão mais de 60% confluentes, os Requerentes prepararam um conjunto de placas de réplica para passagem. 100 μL de meio D10 é adicionado a cada poço nas placas réplica. Os Requerentes dissociaram as células diretamente por pipetagem para cima e para baixo vigorosamente 20 vezes. 20% do volume ressuspenso foi plaqueado em placas réplica preparadas para manter as linhas clonais. Mudar o meio a cada 2-3 d depois e fazer passagem em conformidade.

[1332] 65|Utilização do restante 80% das células para isolamento de DNA e genotipagem.

[1333] Opcional: Isolamento de linhas celulares clonais por diluição. Momento • 2-3 h de trabalho; 2-3 semanas de expansão

[1334] 66|Os Requerentes dissociaram as células a partir de placas de 24 poços como descrito acima. Certifique- se que as células individuais são dissociadas. Um filtro de células pode ser usado para prevenir a aglutinação de células.

[1335] 67|O número de células são contadas em cada condição. Serialmente é realizada a diluição do meio D10 de cada condição a uma concentração final de 0,5 células por 100 μL. Para cada placa de 96 poços, os Requerentes recomendam diluição para uma contagem final de 60 células em 12 mL de D10. A contagem precisa do número de células é recomendada para diluição clonal apropriada. As células podem ser recontadas em uma fase intermédia de diluição em série para assegurar a precisão.

[1336] 68|Foi usada uma pipeta Multicanal para pipetar 100 μL de células diluídas em cada poço de uma placa de 96 poços.

[1337] NOTA. O restante das células pode ser conservado e utilizado para determinação do genótipo a nível da população para avaliar a eficiência global da modificação.

[1338] 69|Os Requerentes inspecionaram as colônias para a aparência "clonal" 1 semana após plaqueamento: colônias arredondadas que irradiam de um ponto central. Marcar poços que estão vazias ou podem ter sido semeados com dupletos ou multipletos.

[1339] 70|Os Requerentes retornaram as células à incubadora e permitiu-lhes expandir por 2-3 semanas. Realimentação das células, conforme necessário, é de acordo com o detalhado na seção anterior.

[1340] Ensaio SURVEYOR para a eficiência da clivagem CRISPR. Momento • 5-6 h

[1341] Antes do ensaio da eficiência de clivagem das células transfectadas, os Requerentes consideram aconselhável testar cada novo iniciador SURVEYOR em amostras de controle negativo (não transfectadas) através do passo de digestão com nuclease SURVEYOR utilizando o protocolo descrito abaixo. Ocasionalmente, mesmo para produtos limpos PCR SURVEYOR de única banda pode haver a produção de bandas SURVEYOR de clivagem por nuclease não específicas e potencialmente interferir com a análise indel precisa.

[1342] 71|Recolha de células para DNA. Dissociar as células e girar a 200 x g durante 5 m. NOTA. Replicar a placa, nesta fase, conforme necessário para manter as linhas celulares transfectadas.

[1343] 72|Aspirar o sobrenadante completamente.

[1344] 73|Os Requerentes utilizaram a solução de extração de DNA QuickExtract de acordo com as instruções do fabricante. Os Requerentes tipicamente utilizaram 50 μL de solução para cada poço de uma placa de 24 poços e 10 μL de uma placa de 96 poços.

[1345] 74|Os Requerentes normalizaram o DNA extraído para uma concentração final de 100-200 ng/μL com ddH2O. Ponto de pausa: O DNA extraído pode ser armazenado a -20 °C durante vários meses.

[1346] 75|Configuração de SURVEYOR PCR. Misturar o a seguir descrito, utilizando os iniciadores SURVEYOR fornecidos pelos Requerentes com ferramenta algoritmo online/computador

[1347] 76|Os Requerentes adicionaram 100-200 ng de DNA modelo genômico normalizado a partir do passo 74 para cada reação.

[1348] 77|Reação de PCR foi realizada usando as seguintes condições de ciclo, para não mais do que 30 ciclos de amplificação:

[1349] 78|Os Requerentes correram 2-5 μL de produto de PCR em um gel a 1% para verificar se há produto de banda única. Embora estas condições de PCR sejam concebidas para funcionar com a maioria dos pares de iniciadores SURVEYOR, alguns iniciadores podem precisar de otimização adicional através do ajuste da concentração de modelo, concentração de MgCl2, e/ou a temperatura de hibridação.

[1350] 79| Os Requerentes purificaram as reações de PCR utilizando o kit de purificação de PCR QIAquick e normalizaram o eluente para 20 ng/μL. Ponto de pausa: O produto de PCR purificado pode ser armazenado a -20 °C.

[1351] 80|Formação de heterodúplex de DNA. A reação de hibridação foi realizada como se segue:

[1352] Tampão Taq PCR, 10X 2 μL

[1353] DNA Normalizado (20 ng/μL) 18 μL

[1354] Volume Total 20 μL

[1355] 81| Hibridar a reação usando as seguintes condições:

[1356] 82|Digestão SURVEYOR nucl ease S. Os Requerentes prepararam a mistura master e acrescentaram os seguintes componentes no gelo para hibridação dos heterodupletes do passo 81 para um volume total final de 25 μL:

[1357] 83|Agitar bem em Vórtex e sedimentar. Incubar a reação a 42 °C durante 1 h.

[1358] 84|Opcional: Podem ser adicionados 2 μL da solução de paragem do kit Surveyor. Ponto de pausa. O produto digerido pode ser armazenado a -20 °C para análise em um momento posterior.

[1359] 85|Visualização da reação SURVEYOR. Os produtos SURVEYOR de digestão de nucleases podem ser visualizados em um gel de agarose a 2%. Para uma melhor resolução, os produtos podem ser corridos em um gel de poliacrilamida de gradiente 4-20% TBE. Os Requerentes carregaram 10 μL de produto com o tampão de carga recomendado e correram o gel de acordo com as instruções do fabricante. Tipicamente, os Requerentes correram até que o corante azul de bromofenol migrar para o fundo do gel. Incluir o marcador DNA e os controles negativos no mesmo gel.

[1360] 86|Os Requerentes coraram o gel com o corante 1X SYBR Gold diluído em TBE. O gel foi suavemente agitado durante 15 m.

[1361] 87|Os Requerentes fotografaram o gel usando um sistema de imagem quantitativa sem a superexposição das bandas. Os controles negativos devem ter apenas uma banda correspondente ao tamanho do produto de PCR, mas pode, ocasionalmente, ter bandas de clivagem não específicas de outros tamanhos. Estes não irão interferir com a análise se foram de tamanho diferente das bandas de clivagem do alvo. A soma dos tamanhos das bandas de clivagem do alvo, fornecidos pelas ferramentas algoritmo online/computador dos Requerentes, deve ser igual ao tamanho do produto de PCR.

[1362] 88|Estimar a intensidade de clivagem. Os Requerentes quantificaram a intensidade integrada de cada banda usando ImageJ ou outro software de quantificação gel.

[1363] 89|Para cada linha, os Requerentes calcularam a fração do produto de PCR clivado (fcut) com a seguinte fórmula: fcut = (b + c) / (a + b + c), onde a é a intensidade integrada do produto de PCR digerido e b e c são as intensidades integradas de cada produto de clivagem. 90 | A eficiência de clivagem pode ser estimada utilizando a seguinte fórmula, com base na distribuição de probabilidade binomial da formação duplex:

[1364]

[1365] Sequenciamento Sanger para aferir a eficiência da clivagem CRISPR. Momento • 3 d

[1366] Os passos iniciais são idênticos aos passos 71 79 do ensaio SURVEYOR. Nota: Iniciadores SURVEYOR podem ser utilizados para sequenciamento Sanger se os locais de restrição apropriados são acrescentados aos iniciadores diretos e inversos. Para a clonagem na estrutura de pUC19 recomendado, EcoRI pode ser utilizado para o iniciador Fwd e HindIII para o iniciador Rev.

[1367] 92|Digestão do amplicon. Estabelecimento da reação de digestão como se segue:

[1368] 93|Digestão da estrutura pUC19. Estabelecimento da reação de digestão como se segue:

[1369] 94|Os Requerentes purificaram as reações de digestão usando o kit de purificação QIAquick PCR. Ponto de pausa: O produto de PCR purificado pode ser armazenado a -20

[1370] 95|Os Requerentes ligaram a pUC19 digerido e amplicons Sanger em uma razão molar de vetor:inserção de 1:3 da seguinte forma:

[1371] 96|Transformação. Os Requerentes transformaram o plasmídeo tratado com PlasmidSafe em uma estirpe de E. coli competente, de acordo com o protocolo fornecido com as células. Os Requerentes recomendaram Stbl3 para a transformação rápida. Resumidamente, 5 μL do produto a partir do passo 95 é adicionado a 20ul de células quimicamente competentes Stbl3 geladas, incubadas em gelo durante 10 m, com choque térmico a 42 °C durante 30 s, imediatamente colocadas em gelo durante 2 m, 100 μL de meio SOC é adicionado, e plaqueadas em uma placa de LB contendo 100 μg/mL de ampicilina. Isto é incubado durante a noite a 37 °C.

[1372] 97|Dia 2: Os Requerentes inspecionaram as placas para verificar crescimento de colônias. Tipicamente, não há colônias nas placas de controlo negativo (de ligação de pUC19 só digerido com EcoRI-HindIIIl, nenhum amplicon Sanger inserido), e dezenas a centenas de colônias nas placas de clonagem de amplicon pUC19-Sanger.

[1373] 98|Dia 3: Os Requerentes isolaram DNA de plasmídeo a partir de culturas durante a noite utilizando um kit QIAprep spin miniprep de acordo com as instruções do fabricante.

[1374] 99|Sequenciação Sanger. Os Requerentes verificaram a sequência de cada colônia por sequenciação a partir da estrutura pUC19 utilizando o iniciador pUC19-For. Os Requerentes referenciaram os resultados da sequenciação da sequência de DNA genômico esperada para verificar a presença de mutações NHEJ induzidas por Cas9. % Eficiência de edição = (# clones modificados)/(# clones totais). É importante escolher um número razoável de clones (> 24) para gerar eficiências de modificação precisas.

[1375] Genotipagem para microdeleção. Momento • 2-3 h de trabalho; 2-3 semanas de expansão

[1376] 100|As células foram transfectadas como descrito acima com um par de sgRNAs direcionados para a região a ser excluída.

[1377] 101|24 h pós-transfecção, as linhas clonais são isolados por FACS ou diluição em série, como descrito acima.

[1378] 102|As células são expandidas durante 2-3 semanas.

[1379] 103|Os Requerentes colheram o DNA a partir de linhas clonais como descrito acima, utilizando 10 μL de solução QuickExtract e DNA genômico normalizado com ddH2O até uma concentração final de 50-100 ng/μL.

[1380] 104|Amplificação por PCR da região modificada. A reação PCR foi realizada como se segue:

[1381] Nota: se o tamanho de deleção é mais do que 1 kb, define-se um conjunto de reações de PCR em paralelo com iniciadores In-Fwd e In-Rev para rastrear a presença do alelo em peso.

[1382] 105|Para o rastreio de inversões, uma reação de PCR é preparada como se segue:

[1383] Nota: iniciadores são emparelhados como Out-Fwd + In Fwd, ou Out-Rev + In-Rev.

[1384] 106|Os Requerentes adicionaram 100-200 ng do modelo de DNA genômico normalizado a partir do passo 103 para cada reação.

[1385] 107|Reação de PCR foi realizada usando as seguintes condições de ciclo:

[1386] 108|Os Requerentes correram 2-5 μL de produto de PCR em um gel de 1-2% para verificar se há produto. Embora estas condições de PCR sejam concebidas para funcionar com a maioria dos iniciadores, alguns iniciadores podem precisar de otimização adicional através do ajuste da concentração do modelo, concentração de MgCl2, e/ou a temperatura de hibridação.

[1387] Genotipagem de modificações alvo via HDR. Momento • 2-3 d, 2-3 h de trabalho

[1388] 109|Os Requerentes colheram o DNA como descrito acima, utilizando solução QuickExtract e DNA genômico normalizado com TE a uma concentração final de 100-200 ng/μL.

[1389] 110|Amplificação por PCR da região modificada. A reação PCR foi realizada como se segue:

[1390] 111|Os Requerentes adicionaram 100-200 ng do modelo de DNA genômico normalizado a partir do passo 109 para cada reação e correram o seguinte programa.

[1391] 112|Os Requerentes correram 5 μL de produto de PCR em um gel de 0,8-1% para verificar se há produto de banda única. Os iniciadores podem precisar de otimização adicional através do ajuste da concentração do modelo, concentração de MgCl2, e/ou a temperatura de hibridação.

[1392] 113|Os Requerentes purificaram as reações de digestão usando o kit de purificação QIAquick PCR. [001523] 114|No exemplo HDR, um sítio de restrição HindIII é inserido no gene EMX1. Estas são detectados por uma digestão de restrição do fragmento amplificado por PCR:

[1393] i. O DNA é digerido durante 10 m a 37 °C:

[1394] ii. Os Requerentes correram 10 μL do produto digerido com corante de carga sobre um gel de poliacrilamida TBE de gradiente de 4-20% até que a banda de xileno cianol migre para o fundo do gel.

[1395] iii. Os Requerentes coraram o gel com o corante SYBR 1X Gold, com balanço durante 15 m.

[1396] iv. Os produtos de clivagem são analisados e quantificados como descrito anteriormente na secção de ensaio SURVEYOR. Eficiência HDR é estimada pela fórmula: (b + c)/(a + b + c), onde a é a intensidade integrada do produto de PCR HDR não digerido e b e c são as intensidades integradas para os fragmentos de corte HindIII.

[1397] 115|Alternativamente, amplicons de PCR purificados a partir do passo 113 podem ser clonado se genotipados utilizando sequenciamento Sanger ou NGS.

[1398] Sequenciamento profundo e análise fora do alvo • Momento 1-2 d

[1399] A ferramenta online de design de CRISPR alvo gera locais genômicos fora do alvo candidatos para cada local alvo identificado. Análise fora do alvo nestes locais pode ser realizada por ensaio nuclease SURVEYOR, sequenciação de Sanger, ou sequenciação profunda de próxima geração. Dada a probabilidade de taxas baixas ou indetectáveis de modificação em muitos desses locais, os Requerentes recomendam sequenciação profunda com a plataforma Illumina Miseq para uma alta sensibilidade e precisão. Protocolos irão variar com a plataforma de sequenciamento; aqui, os Requerentes descrevem brevemente um método de PCR de fusão para anexar os adaptadores de sequenciamento.

[1400] 116|Desenho de iniciadores de sequenciação de profundidade. Os iniciadores para o sequenciamento de próxima geração (NGS) são desenhados para amplicons mais curtos, normalmente na faixa de tamanho de 100-200 pb. Iniciadores podem ser desenhados manualmente usando NCBI Primer-Blast ou gerados com ferramentas on-line para o alvo CRISPR (site em genome-engineering.org/tools).

[1401] 117|Colheita de DNA genômico a partir de células Cas9 alvo. Normalizar DNA genômico QuickExtract a 100200 ng/μL com ddH2O.

[1402] 118|Preparação da biblioteca inicial PCR. Utilizando os iniciadores NGS a partir do passo 116, preparar a preparação PCR da biblioteca inicial

[1403] 119|Adicionar 100-200 ng do modelo de DNA genômico normalizado para cada reação. [001550] 120|Reação de PCR foi realizada usando as seguintes condições de ciclo, para não mais do que 20 ciclos de amplificação:

[1404] 121|Correr 2-5 μL de produto de PCR em um gel 1% para verificar se há produto de banda única. Como todos os PCRs de DNA genômico, os iniciadores podem precisar de otimização adicional através do ajuste da concentração do modelo, concentração de MgCl2, e/ou a temperatura de hibridação.

[1405] 122|Purificação das reações de PCR utilizando o kit de purificação de PCR QIAquick e normalização do eluente para 20 ng/μL. Ponto de pausa: O produto de PCR purificado pode ser armazenado a -20 °C.

[1406] 123|Preparação de amostras DNA com o kit Nextera XT Seguindo o protocolo do fabricante, gerar bibliotecas Miseq de sequenciação prontas com códigos de barras únicas para cada amostra.

[1407] 124|Análise dos dados de sequenciamento. Análise fora do alvo pode então ser realizada por meio de programas de alinhamento tais como, ClustalW, Geneious, ou scripts simples de análise de sequências.

[1408] Momento

[1409] Passos 1 - 2 Desenho e síntese de oligos sgRNA oligos e ssODNs: 1-5 d, variável dependente do fornecedor

[1410] Passos 3 - 5 Construção do plasmídeo CRISPR ou cassete de expressão PCR: 2 h a 3 d

[1411] Passos 6 - 53 Transfecção de linhas celulares: 3 d (1 h de tempo de trabalho)

[1412] Passos 54 - 70 Derivação opcional de linhas clonais: 1-3 semanas, variável dependendo do tipo de célula

[1413] Passos 71 - 91 Validação funcional de NHEJ via SURVEYOR: 5-6 h

[1414] Passos 92 - 124 Genotipagem via Sanger ou sequenciamento profundo de próxima geração: 2-3 d (3-4 h de trabalho)

[1415] Endereçamento de situações relativas aos Exemplos Aqui

[1416] Discussão

[1417] CRISPR-Cas podem ser facilmente multiplexadas para facilitar a alteração simultânea de vários genes e mediar microdeleções cromossômicas em altas eficiências. Os Requerentes utilizaram dois sgRNAs para demonstrar o direcionamento simultâneo dos locais GRIN2B e DYRK1A humano em ganhos de eficiência até 68% em células HEK293FT. Do mesmo modo, um par de sgRNAs pode ser usado para mediar as microdeleções, tais como a excisão de um éxon, que pode ser genotipado por PCR em um nível clonal. Note-se que a localização exata das junções de éxons podem variar. Os Requerentes demonstraram também a utilização de ssODNs e vetor de direcionamento para mediar HDR tanto de tipo selvagem e mutante nickase de Cas9 em células HEK 293FT e HUES9 (Fig. 30). Note que os Requerentes não foram capazes de detectar HDR em células HUES9 usando nickase Cas9, o que pode ser devido à baixa eficiência ou a uma diferença de potencial nas atividades de reparação em células HUES9. Embora estes valores sejam típicos, existe alguma variabilidade na eficiência de clivagem de um determinado sgRNA, e em raras ocasiões certos sgRNAs podem não funcionar por razões ainda desconhecidas. Os Requerentes recomendam projetar dois sgRNAs para cada local, e testar sua eficiência no tipo de célula que se destinam.

Exemplo 31: NLSs

[1418] Modulador Transcricional de Cas9: Os Requerentes preveem ligar o sistema Cas9/gRNA CRISPR em um sistema de ligação de DNA generalizado em que as funções para além de clivagem de DNA podem ser executadas. Por exemplo, através da fusão do(s) domínio(s) funcional(ais) para um Cas9 cataliticamente inativo, os Requerentes transmitiram funções novas, tais como modificações de ativação/repressão, metilação/desmetilação, ou cromatina de transcrição. Para atingir esta meta, os Requerentes fizeram um mutante Cas9 cataliticamente inativo, alterando dois resíduos essenciais para a atividade nuclease, D10 e H840, a alanina. Com a mutação destes dois resíduos a atividade de nuclease de Cas9 é abolida enquanto se mantém a capacidade de se ligar ao DNA alvo. Os domínios funcionais, os Requerentes decidiram se concentrar em testar a hipótese de que é o ativador da transcrição VP64 e os repressores de transcrição SID e KRAB.

[1419] Localização Nuclear de Cas9: Os Requerentes colocaram a hipótese de que o mais eficaz modulador transcricional Cas9 seria fortemente localizado no núcleo onde teria a sua maior influência na transcrição. Além disso, qualquer Cas9 residual no citoplasma pode ter efeitos indesejáveis. Os Requerentes determinaram que Cas9 de tipo selvagem não se localiza no núcleo sem incluir vários sinais de localização nuclear (NLSs) (embora um sistema CRISPR não necessite de ter um ou mais NLSs mas tem, vantajosamente, pelo menos, um ou mais NLS (s)). Porque foram necessárias múltiplas sequências NLS foi fundamentado que é difícil de levar a Cas9 para o núcleo e qualquer domínio adicional que seja fundido com Cas9 poderá perturbar a localização nuclear. Assim, os Requerentes fizeram quatro construções de fusão Cas9-VP64-GFP com diferentes sequências NLS (pXRP02- pLenti2-EF1a-NLS- hSpCsn1(10A,840A)-NLS-VP64-EGFP, pXRP04- pLenti2-EF1a-NLS- hSpCsn1(10A,840A)-NLS-VP64-2A-EGFP-NLS, pXRP06- pLenti2-EF1a- NLS-EGFP-VP64-NLS-hSpCsn1(10A,840A)-NLS, pXRP08- pLenti2- EF1a-NLS-VP64-NLS-hSpCsn1(10A,840A)-NLS-VP64-EGFP-NLS). Estas construções foram clonadas em uma estrutura lenti sob a expressão do promotor EF1a humano. O elemento WPRE também foi adicionado para a expressão da proteína mais robusta. Cada construção foi transfectada em células HEK 293FT usando Lipofectame 2000 e fotografada 24 horas após a transfecção. A melhor localização nuclear é obtida quando as proteínas de fusão têm sequências NLS, tanto no N- e C-terminal da proteína de fusão. A maior localização nuclear observada ocorreu na construção com quatro elementos NLS.

[1420] Para compreender de forma mais enérgica a influência de elementos NLS na Cas9, os Requerentes realizaram16 fusões Cas9-GFP adicionando a mesma sequência NLS alfa importina quer no N ou C terminal olhando para zero a três repetições em série. Cada construção foi transfectada em células HEK 293FT usando Lipofectame 2000 e fotografada 24 horas após a transfecção. Notavelmente, o número de elementos NLS não se correlaciona diretamente com o grau de localização nuclear. Adicionando um NLS no C-terminal tem uma maior influência sobre a localização nuclear do que a adição do N- terminal.

[1421] Ativador Transcricional de Cas9: Os Requerentes testaram funcionalmente a proteína Cas9-VP64 direcionando para o local Sox2 e quantificaram a ativação da transcrição por RT- qPCR. Oito locais-alvo de DNA foram escolhidos para abranger o promotor de Sox2. Cada construção foi transfectada em células HEK 293FT usando Lipofectame 2000 e 72 horas após a transfecção o RNA total foi extraído a partir das células. 1 μg de RNA foi transcrito de forma inversa em cDNA (qScript Supermix) em uma reação de 40 μL. 2 μL de produto de reação foi adicionada em 20 μL de um único ensaio TaqMan de reação qPCR. Cada experiência foi efetuada em moldes de biológicos e técnicas triplicados. O controle de RT e o modelo de reações de controle não mostraram amplificação. Construções que não mostram forte localização nuclear, pXRP02 e pXRP04, resultarão em ausência de ativação. Para a construção que mostrou forte localização nuclear, pXRP08, uma ativação moderada foi observada. Estatisticamente, uma ativação significativa foi observada no caso de RNA guia Sox2.4 e Sox2.5.

Exemplo 32: Dados de Camundongos In Vivo

[1422] Material e reagentes

[1423] Polimerase de fusão Herculase II (Agilent Technologies, cat. n°. 600679)

[1424] 10x NETampão 4 (NEB, cat. n°. B7004S)

[1425] BsaI HF (NEB, cat. n°. R3535S)

[1426] Ligase T7 DNA (Enzymatics, cat. n°. L602L)

[1427] Tampão digestão rápida, 10X (ThermoScientific, cat. n°. B64)

[1428] FastDigest NotI (ThermoScientific, cat. n°. FD0594)

[1429] Fosfatase alcalina FastAP (ThermoScientific, cat. n°. EF0651)

[1430] Lipofectamine2000 (Life Technologies, cat. n°. 11668-019)

[1431] Tripsina (Life Technologies, cat. n°. 15400054)

[1432] Fórceps #4 (Sigma, cat. n°. Z168777-1EA)

[1433] Fórceps #5 (Sigma, cat. n°. F6521-1EA)

[1434] Solução Salina Equilibrada de Hank's (Sigma, cat. n°. H4641-500ML)

[1435] Solução Penicillina/Estreptomicina (Life Technologies, cat. n°. P4333)

[1436] Neurobasal (Life Technologies, cat. n°. 21103049)

[1437] Suplemento B27 (Life Technologies, cat. n°. 17504044)

[1438] L-glutamina (Life Technologies, cat. n°. 25030081)

[1439] Glutamato (Sigma, cat. n°. RES5063G-A7)

[1440] β-mercaptoetanol (Sigma, cat. n°. M6250-100ML)

[1441] Anticorpo HA de coelho (Cell Signaling, cat. n°. 3724S)

[1442] Kit imagens de células LIVE/DEAD® (Life Technologies, cat. n°. R37601)

[1443] Seringa 30 G da World Precision Instrument (World Precision Instruments, cat. n°. NANOFIL)

[1444] Aparelho Stereotaxic (Kopf Instruments)

[1445] UltraMicroPump3 (World Precision Instruments, cat. n°. UMP3-4)

[1446] Sacarose (Sigma, cat. n°. S7903)

[1447] Cloreto de cálcio (Sigma, cat. n°. C1016)

[1448] Acetato de Magnésio (Sigma, cat. n°. M0631)

[1449] Tris-HCl (Sigma, cat. n°. T5941)

[1450] EDTA (Sigma, cat. n°. E6758)

[1451] NP-40 (Sigma, cat. n°. NP40)

[1452] Fluoreto Fenilmetanossulfonil (Sigma, cat. n°. 78830)

[1453] Cloreto de magnésio (Sigma, cat. n°. M8266)

[1454] Cloreto de Potássio (Sigma, cat. n°. P9333)

[1455] β -glicerofosfato (Sigma, cat. n°. G9422)

[1456] Glicerol (Sigma, cat. n°. G9012)

[1457] Vybrant® DyeCycle™ Ruby Stain (Life technologies, cat. n°. S4942)

[1458] FACS Aria Flu-act-cell sorter (Koch Institute of MIT, Cambridge US)

[1459] DNAeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, cat. n°. 69504)

[1460] Procedimento

[1461] Construção de multiplexes gRNA para usar in vivo no cérebro

[1462] Os Requerentes conceberam e amplificaram por PCR gRNAs individuais dirigidas para membros da família TET e DNMT de rato (como aqui descrito) eficácia de direcionamento foi avaliada em uma linha celular N2a (Fig. 33). Para obter alteração simultânea de vários genes in vivo, eficiente gRNA foi multiplexado em vetor embalagem de AAV (Fig. 34). Para facilitar ainda mais a análise do sistema de eficiência, os Requerentes adicionaram ao sistema de cassete de expressão consistente com proteína de fusão de domínio GFP-KASH sob o controle do promotor humano sinapsina I (Fig. 34). Esta modificação permite uma análise mais aprofundada da eficiência do sistema na população neuronal (mais detalhes do procedimento na seção Classificação de núcleos e resultados in vivo).

[1463] Todas as 4 partes do sistema foram amplificadas por PCR usando polimerase Herculase II Fusão utilizando os seguintes iniciadores:

[1464] 1° U6 Fw: gagggtctcgtccttgcggccgcgctagcgagggcctatttcccatgatt c (SEQ ID NO:__)

[1465] 1° gRNA Rv: ctcggtctcggtAAAAAAgcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactag c cttattttaacttgctaTTTCtagctctaaaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGTGTTT C GTCCTTTCCAC (SEQ ID NO:__)

[1466] 2° U6 Fw:

[1467] gagggtctcTTTaccggtgagggcctatttcccatgattcc (SEQ ID NO:__)

[1468] 2° gRNA Rv:ctcggtctcctcAAAAAAgcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggac tagc cttattttaacttgctaTTTCtagctctaaaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGTGTTT C GTCCTTTCCAC (SEQ ID NO:__)

[1469] 3° U6 Fw:

[1470] gagggtctcTTTgagctcgagggcctatttcccatgattc (SEQ ID NO:__)

[1471] 3° gRNA Rv:ctcggtctcgcgtAAAAAAgcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacgga ctag ccttattttaacttgctaTTTCtagctctaaaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGTGTT T CGTCCTTTCCA (SEQ ID NO:__)

[1472] hSyn_GFP-kash Fw: gagggtctcTTacgcgtgtgtctagac (SEQ ID NO:__)

[1473] hSyn_GFP-kash Rv: ctcggtctcAaggaCAGGGAAGGGAGCAGTGGTTCACGCCTGTAATCCCAGCAATTTGGG A GGCCAAGGTGGGTAGATCACCTGAGATTAGGAGTTGC (SEQ ID NO:__)

[1474] (NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO:__) é a sequência genômica reversa)

[1475] Requerentes utilizaram estratégia Golden Gate para montar todas as partes (proporção molecular 1:1) do sistema em um único passo de reação: 1a U6_gRNA 18 ng 2a U6_gRNA 18 ng 3a U6_gRNA 18 ng Syn_GFP-kash 100 ng 10x NETampão 4 1,0 μL 10x BSA 1,0 μL 10 mM ATP 1,0 μL Bsal HF 0,75 μL Ligase T7 0,25 μL ddH2O 10 μL Número de ciclo Condição 1-50 37 °C por 5 m, 21 °C por 5 m

[1476] Produto de reação Golden Gate foi amplificado por PCR usando polimerase II Herculase fusão e seguintes iniciadores:

[1477] Fw 5’ cctgtccttgcggccgcgctagcgagggcc (SEQ ID NO:__)

[1478] Rv 5’ cacgcggccgcaaggacagggaagggagcag (SEQ ID NO:__)

[1479] Produto de PCR foi clonado em AAV, entre sequências ITR utilizando locais de restrição Notl:

[1480] Produto de Digestão PCR: 3 μL Tampão digestão rápida, 10X 3 μL FastDigest NotI 1 μL DNA 1 μg ddH2O mais de 30 μL

[1481] Digestão da estrutura AAV: Tampão digestão rápida, 10X 3 μL FastDigest NotI 1 μL Fosfatase alcalina FastAP 1 μL Estrutura AAV 1 μg ddH2O mais de 30 μL

[1482] Após 20 minutos de incubação a 37 °C as amostras foram purificadas utilizando o kit de purificação de PCR QIAquick. Amostras padronizadas foram ligadas em uma proporção de 1:3 vetor:fragmento como se segue: pUC19 digerido 50 ng fragmento digerido razão molar de 1:3 vetor:fragmento Ligase T7 1 μL Tampão de ligação rápida 2X 5 μL ddH2O mais de 10 μL

[1483] Após a transformação de bactérias com o produto da reação de ligação, os Requerentes confirmaram ter obtido clones com sequenciamento Sanger.

[1484] Clones de DNA positivos foram testados em células N2a após a cotransfecção com construção Cas9 (Figs. 35 e 36).

[1485] Desenho da nova construção de Cas9 para aplicação de AAV

[1486] Sistema de aplicação de AAV, apesar de as suas características únicas terem limitação de empacotamento - para entregar com sucesso expressando o cassete in vivo tem que ser em tamanho < que 4,7 kb. Para diminuir o tamanho de SpCas9 expressar a cassete e facilitar a aplicação, os Requerentes testaram várias alterações: diferentes promotores, sinal poliA mais curto e, finalmente, uma versão menor do Cas9 de Staphylococcus aureus (SaCas9) (fig. 37 e 38). Todos os promotores testados foram previamente testados e publicados como sendo ativos em neurônios, incluindo rato MeCP2 (Gray et al., 2011), de rato MAP1b e rato truncado MAP1b (Liu e Fischer, 1996). Sequência de poliA sintética alternativa foi anteriormente mostrada como sendo também funcional (Levitt et al., 1989;. Gray et al., 2011.). Todas as construções clonadas foram expressas em células N2a após transfecção com Lipofectamina 2000, e testadas com o método de transferência de Western (Fig. 39).

[1487] Teste do sistema multiplex AAV em neurônios primários

[1488] Para confirmar a funcionalidade do sistema desenvolvido em neurônios, os Requerentes utilizam culturas primárias neuronais in vitro. Neurônios corticais de camundongo foram preparados de acordo com o protocolo publicado anteriormente por Banker e Goslin (Banker e Goslin, 1988).

[1489] Células neuronais são obtidas a partir do dia embrionário 16. Os embriões são extraídos da fêmea grávida e decapitados, e as cabeças são colocados em HBSS arrefecido com gelo. Os cérebros são então extraídos dos crânios com uma pinça (# 4 e # 5) e transferidos para uma outra mudança de HBSS arrefecido com gelo. Outros passos são realizados com o auxílio de um microscópio estereoscópico em uma placa de Petri cheia de gelo-HBSS frio e #5 fórceps. Os hemisférios são separados uns dos outros e do tronco cerebral e afastados das meninges. Os hipocampos são então cuidadosamente dissecados e colocados em um tubo cônico de 15 mL cheio com gelo-HBSS frio. Córtices que permanecem após a dissecação do hipocampo podem ser utilizados para posterior isolamento das células utilizando um protocolo análogo após a remoção dos resíduos de vapor cérebro e bulbos olfativos. Hipocampos isolados são lavados três vezes com 10 mL de HBSS arrefecido com gelo e dissociados por 15 min de incubação com tripsina em HBSS (4 mL de HBSS com a adição de 10 μL de 2,5% de tripsina por hipocampo) a 37 °C. Após tripsinização, os hipocampos são muito cuidadosamente lavados três vezes para remover quaisquer vestígios de tripsina com HBSS pré-aquecido a 37 °C e dissociados em HBSS quente. Os Requerentes geralmente dissociam as células obtidas de 10-12 embriões em 1 mL de HBSS com pontas de pipeta de 1 mL e diluem as células dissociadas até 4 mL. As células são plaqueadas a uma densidade de 250 células/mm2 e cultivadas a 37 °C e 5% de CO2 durante até 3 semanas

[1490] HBSS

[1491] 435 mL H2O

[1492] 50 mL 10x Solução Salina balanceada Hank’s

[1493] 16,5 mL 0,3M HEPES pH 7,3

[1494] 5 mL solução penicillina-streptomicina

[1495] Filtro (0,2 μm) e armazenar a 4 °C

[1496] Meio Neuron Plating (100 mL)

[1497] 97 mL Neurobasal

[1498] 2 mL B27 Suplemento

[1499] 1 mLl solução penicillina-streptomicina

[1500] 250 μL glutamina

[1501] 125 μL glutamato

[1502] Os neurônios são transduzidos com vírus AAV concentrado 1/2 ou vírus AAV1 a partir do meio de células HEK293FT filtrado, entre 4-7 dias em cultura e manter durante pelo menos uma semana em cultura após a transdução para permitir a expressão de genes entregues.

[1503] Expressão conduzida por AAV do sistema

[1504] Os Requerentes confirmam a expressão de SpCas9 e SaCas9 em culturas neuronais após a aplicação de AAV utilizando o método de transferência de Western (Fig. 42). Uma semana após a transdução, os neurônios foram recolhidos em tampão de carga SDS NuPage com β-mercaptoetanol para desnaturar proteínas a 95 °C durante 5 min. As amostras foram separadas em gel de SDS-PAGE e transferidas em uma membrana de PVDF para a detecção de proteína WB. Proteínas Cas9 foram detectadas com o anticorpo HA.

[1505] Expressão de Syn-GFP-kash de gRNA multiplex AAV foi confirmada com microscopia fluorescente (Fig. 50).

[1506] Toxicidade

[1507] Para avaliar a toxicidade de AAV com sistema CRISPR, os Requerentes testaram a morfologia global dos neurônios uma semana após a transdução do vírus (Fig. 45). Além disso, os Requerentes testaram a toxicidade potencial do sistema projetado com o kit LIVE/DEAD® Cell Imaging, o que permite distinguir as células vivas e mortas em cultura. Baseia-se na presença de atividade intracelular de esterase (tal como determinado pela conversão enzimática da calceína AM não fluorescente a calceína fluorescente verde intenso). Por outro lado, o componente vermelho impermeabilizante da célula do Kit entra nas células apenas com membranas danificadas e se ligam a DNA de geração de fluorescência em células mortas. Ambos os fluoróforos podem ser facilmente visualizados em células vivas com microscopia fluorescente. Expressão de proteínas Cas9 conduzida por AAV e construções gRNA multiplex nos neurônios corticais primários foi bem tolerada e não tóxico (Figs. 43 e 44), o que indica que o sistema de AAV concebido é apropriado para testes in vivo.

[1508] Produção de vírus

[1509] Vírus concentrado foi produzido de acordo com os métodos descritos em McClure et al., 2011. A produção de vírus ocorreu em células sobrenadante HEK293FT.

[1510] Cirurgias cerebrais

[1511] Para injeções de vetores virais em camundongos machos de 10-15 semanas de idade, C57BL/6N, foram anestesiados com cocktail de cetamina/xilazina (cetamina dose de 100 mg/kg xilazina dose de 10 mg/kg) por injeção intraperitoneal. Administração intraperitoneal de Buprenex foi utilizada como um analgésico preventivo (1 mg/kg). Os animais foram imobilizados em um aparelho estereotáxico Kopf usando pregos de posicionamento intra-aurais e barra de dentes para manter um crânio imóvel. Utilizando uma broca de mão, um furo (1-2 mm) a -3,0 mm posterior ao Bregma e 3,5 mm lateral para injeção na região CA1 do hipocampo foi feita. Usando 30G World Precision Instrument seringa a uma profundidade de 2,5 mm, a solução de partículas virais de AAV em um volume total de 1 μL foi injetada. A injeção foi monitorizada por uma bomba de injeção "World Precision Instruments UltraMicroPump3" a uma taxa de fluxo de 0,5 μL/min para evitar danos nos tecidos. Quando a injeção foi completa, a agulha de injeção foi retirada lentamente, a uma taxa de 0,5 mm/min. Após a injeção, a pele foi selada com 6-0 Ethilon. Os animais foram hidratados no pós-operatório com 1 mL de Ringer com lactato (subcutânea) e alojados em uma temperatura controlada (37 °C) até alcançar um ambiente de recuperação ambulatório. 3 semanas após a cirurgia, os animais foram sacrificados por anestesia profunda seguido de remoção do tecido para núcleos de triagem ou com 4% de paraformaldeído perfusão para imunoquímica.

[1512] Classificação de núcleos e resultados in vivo

[1513] Os Requerentes conceberam um método para especificamente marcar geneticamente o gRNA direcionado para os núcleos de células neuronais com GFP para Separação de Células Ativada por Fluorescência (FACS) dos núcleos das células marcadas e o processamento a jusante de DNA, RNA e proteínas nucleares. Para esse efeito o vetor de direcionamento multiplex dos Requerentes foi concebido para expressar tanto uma proteína de fusão entre GFP e domínio da proteína KASH da membrana nuclear de camundongo (Starr DA, 2011, Current Biology) e os 3 gRNAs para direcionar o local do gene específico de interesse (Fig. 34). GFP-KASH foi expresso sob o controlo do promotor de sinapsina humano para marcar especificamente os neurônios. O aminoácido da proteína de fusão GFP-KASH foi:

[1514] MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLK FICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGN YKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNF KIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVT AAGITLGMDELYKSGLRSREEEEETDSRMPHLDSPGSSQPRRSFLSRVIRAALPLQLLLL LLLLLACLLPASEDDYSCTQANNFARSFYPMLRYTNGPPPT (SEQ ID NO:__)

[1515] Uma semana após aplicação de AAV1/2 mediada no cérebro foi observada uma expressão forte de GFP-KASH. Para FACS e o processamento a jusante de núcleos marcados, os hipocampos foram dissecados 3 semanas após a cirurgia e processados para purificação de núcleos de células utilizando um passo de centrifugação em gradiente. Para esse efeito, o tecido foi homogeneizado em sacarose 320 mM, CaCl 5 mM, Mg(Ac)2 3 mM, 10 mM de Tris a pH 7,8, EDTA 0,1 mM, NP40 a 0,1%, 0,1 mM de fluoreto de fenilmetanossulfonilo (PMSF), 1 mM de β- mercaptoetanol usando 2 mL de homogeneizador Dounce (Sigma). O homogenizado foi centrifugado em 25% a 29% de gradiente de Optiprep® de acordo com o protocolo do fabricante durante 30 minutos a 3.500 rpm a 4 °C. O sedimento nuclear foi ressuspenso em sucrose 340 mM, MgCl2 2 mM, KCl 25 mM, 65 mM de glicerofosfato, 5% de glicerol, PMSF 0,1 mM, 1 mM β- mercaptoetanol e Vybrant® DyeCycle™ Ruby Stain (Life Technologies) foi adicionado a etiqueta de núcleos celulares (oferece emissão para DNA perto de infravermelho). Os núcleos purificados e marcados foram ordenados por FACS utilizando um classificador Flu-act-cell Aria e software BDFACS Diva. Os núcleos classificados GFP- e GFP+ foram finalmente usados para purificar o DNA genômico utilizando o kit DNAeasy Blood & Tissue (Qiagen) para análise ensaio Surveyor das regiões genômicas alvo. A mesma abordagem pode ser facilmente utilizada para purificar RNA ou proteína nuclear a partir de células alvo para o processamento a jusante. Devido ao sistema de 2 vetores (Fig. 34) os Requerentes utilizam nesta abordagem eficiente de clivagem de Cas9 mediada por DNA era esperado que ocorresse apenas em um pequeno subconjunto de células no cérebro (células que foram coinfetadas tanto com o vetor de direcionamento multiplex e o vetor que codifica Cas9). O método aqui descrito permite que os Requerentes para purificar especificamente DNA, RNA e proteínas nucleares a partir da população de células que expressam as três gRNAs de interesse e, portanto, devem sofrer clivagem de DNA mediada Cas9. Utilizando este método, os Requerentes foram capazes de visualizar a clivagem eficiente de DNA in vivo ocorrendo somente em um pequeno subconjunto de células.

[1516] Essencialmente, o que os Requerentes aqui mostraram é clivagem in vivo direcionada. Ainda, os Requerentes usaram uma abordagem múltipla, com várias sequências diferentes visadas ao mesmo tempo, mas independentemente. O sistema apresentado pode ser aplicado para estudar condições patológicas do cérebro (gene inativado, por exemplo, doença de Parkinson) e também abrir um campo para o desenvolvimento de ferramentas de edição genoma no cérebro. Ao substituir a atividade nuclease com reguladores de transcrição do gene ou reguladores epigenéticos será possível responder todo espectro da questão científica sobre o papel da regulação de genes e alterações epigenéticas no cérebro, não só nas condições patológicas, mas também no processo fisiológico como formação de aprendizagem e memória. Finalmente, apresentada a tecnologia pode ser aplicada no sistema de mamífero mais complexo como primatas, o que permite superar as limitações da tecnologia atual.

Exemplo 33: Dados do modelo

[1517] Vários modelos da doença foram especificamente investigados. Estes incluem genes de novo de risco do autismo CHD8, KATNAL2, e SCN2A; e o gene UBE3A do autismo sindrômico (Síndrome de Angelman). Estes genes e modelos de autismo resultantes são naturalmente preferenciais, mas mostram que a invenção pode ser aplicada a qualquer gene e, portanto, qualquer modelo é possível.

[1518] Os Requerentes fizeram estas linhas celulares usando nuclease Cas9 em células estaminais embrionárias humanas (hESCs). As linhas foram criadas por transfecção transiente de hESCs com CBH-Cas9-2A-EGFP e pU6-sgRNA. Dois sgRNAs são desenhados para cada gene alvo na maioria das vezes os mesmos éxons em que mutações não senso (inativadas) do paciente foram recentemente descritas a partir de estudos integrais de sequenciamento de éxons de doentes autistas. Os plasmídeos Cas9-2A-EGFP e pU6 foram criados especificamente para este projeto.

Exemplo 34: Sistema ou protocolo de produção de AAV

[1519] Um sistema ou um protocolo de produção de AAV que foi desenvolvido para, e funciona particularmente bem com as utilizações de rastreio aqui proporcionadas, mas tem aplicabilidade mais ampla também na presente invenção. Manipular a expressão do gene endógeno apresenta vários desafios, pois a taxa de expressão depende de muitos fatores, incluindo elementos reguladores, processamento de mRNA, transcrito e estabilidade. Para ultrapassar este desafio, os Requerentes desenvolveram um vírus baseado no vírus adenoassociado (AAV) para a aplicação. AAV tem um genoma baseados em ssDNA e é portanto menos suscetíveis a recombinação.

[1520] Protocolo do vírus concentrado AAV1/2 (sorotipo AAV1/2, ou seja, capsídeo AAV AAV1/AAV2 híbrido ou mosaico) heparina purificada.

[1521] Meios: D10 + HEPES

[1522] 500ml garrafa DMEM elevada glucose + Glutamax (GIBCO)

[1523] 50ml Hyclone FBS (inativado pelo calor) (Thermo Fischer)

[1524] 5,5ml solução HEPES (1M, GIBCO)

[1525] Células: baixa passagem HEK293FT (passagem <10 no momento da produção do vírus, descongelar novas células de passagem 2-4 para a produção de vírus, crescer por 3-5 passagens)

[1526] Reagente de transfecção: Polietilenimina (PEI) “Max”

[1527] Dissolver 50mg PEI “Max” em 50ml de H2O estéril Ultrapura

[1528] Ajustar pH a 7,1

[1529] Filtrar com filtro de 0,22 μm fliptop

[1530] Fechar o tubo e envolver com parafilme

[1531] Congelar alíquotas a -20 °C (para armazenamento, pode também ser utilizado imediatamente)

[1532] Cultura de células

[1533] Baixa passagem de cultura HEK293FT em D10 + HEPES

[1534] Passagem diária entre 1:2 e 1:2,5

[1535] Vantajosamente não permite que as células atinjam mais do que 85% de confluência

[1536] Para T75

[1537] 10 mL HBSS quente -Mg2+, -Ca2+, GIBCO) + 1 mL TrypLE Express (GIBCO) por frasco a 37 °C (Banho de água)

[1538] Aspirar totalmente o meio

[1539] Adicionar 10 mL de HBSS quente com cuidado (para lavar o meio completamente)

[1540] Adicionar 1 mL por frasco TrypLE

[1541] Colocar o frasco na incubadora (37 °C) durante 1 min

[1542] Frasco Rock para retirar células

[1543] Adicionar 9 mL D10 + meio HEPES (37 °C)

[1544] Pipetar para cima e para baixo 5 vezes para gerar suspensão única de células

[1545] Dividir a 1:2 - 1:2,5 (12ml meio para T75) proporção (se as células estão a crescer mais lentamente, descartar e descongelar um novo lote, que não estão em crescimento ótimo)

[1546] Transferir para T225, logo que estão presentes células suficientes (para facilitar a manipulação de grandes quantidades de células)

[1547] Produção de AAV (5*15 cm escala de placa por construção):

[1548] Plaquear 10 milhões de células em 21,5 mL de meio em uma placa de 15 centímetros

[1549] Incubar durante 18-22 horas a 37 °C

[1550] A transfecção é ideal em 80% de confluência

[1551] Por placa

[1552] Pré-aquecer o meio 22 mL (D10 + HEPES)

[1553] Preparar tubo com mistura de DNA (usar DNA maxiprep endofree):

[1554] 5,2 μg vetor plasmídeo de interesse

[1555] 4,35 μg AAV 1 plasmídeo serotipo

[1556] 4,35 μg AAV 2 plasmídeo serotipo

[1557] 10,4 μg pDF6 plasmídeo (adenovírus helper genes) Vórtex para misturar

[1558] Adicionar 434 μL DMEM (sem soro!)

[1559] Adicionar 130 μL solução PEI

[1560] Vórtex 5-10 segundos

[1561] Adicionar mistura DNA/DMEM/PEI a meio pré- aquecido

[1562] Vórtex brevemente para misturar

[1563] Substituir meio na placa 15cm com mistura DNA/DMEM/PEI

[1564] Colocar na incubadora a 37 °C

[1565] Incubar 48h antes de armazenar (certificar que o meio não se torna muito ácido)

[1566] Colheita de vírus:

[1567] 1. Aspirar cuidadosamente o meio de discos de 15 centímetros (vantajosamente não desalojar as células)

[1568] 2. Adicionar 25 mL de DPBS RT (Invitrogen) a cada placa e remover suavemente as células com um raspador de células. Recolher a suspensão em tubos de 50 mL.

[1569] 3. Precipitado de células a 800x g durante 10 minutos.

[1570] 4. Descartar o sobrenadante

[1571] Ponto de pausa: congelar o agregado de células a -80 C se desejado

[1572] 5. Ressuspender o precipitado em 150 mM de NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, utilizar 10 mL por placa de cultura de tecido.

[1573] 6. Preparar uma solução fresca de desoxicolato de sódio a 10% em dH2O. Adicionar 1,25 mL disto por placa de cultura de tecido para uma concentração final de 0,5%. Adicionar Benzonase nuclease para uma concentração final de 50 unidades por mL. Misturar completamente.

[1574] 7. Incubar a 37 °C durante 1 hora (Banho de água).

[1575] 8. Remover os detritos celulares por centrifugação a 3000 xg durante 15 minutos. Transferir para tubo novo de 50 mL e garantir que todos os detritos celulares foi removidos para evitar o bloqueio de colunas de heparina.

[1576] Coluna de purificação de heparina AAV1/2:

[1577] 1. Preparar colunas de heparina HiTrap utilizando uma bomba peristáltica de modo que as soluções fluam através da coluna a 1 mL por minuto. É importante garantir que não há bolhas de ar introduzidas na coluna de heparina.

[1578] 2. Equilibrar a coluna com 10 mL de 150 mM NaCl, Tris 20 mM, pH 8,0 usando a bomba peristáltica.

[1579] 3. Ligação do vírus: Aplicar a solução de 50 mL de vírus a coluna e permitir que flua.

[1580] 4. Lavagem passo 1: coluna com 20 mL 100 mM de NaCl, Tris 20 mM, pH 8,0. (Usando a bomba peristáltica)

[1581] 5. Lavagem passo 2: Usando uma seringa de 3 mL ou 5 mL continuar a lavagem da coluna com NaCl 1 mL de 200 mM, Tris 20 mM, pH 8,0, seguido de 1 mL de 300 mM de NaCl, Tris 20 mM, pH 8,0.

[1582] Descartar o fluxado de passagem.

[1583] (Preparar as seringas com diferentes tampões durante o fluxo de 50 min através de solução de vírus acima)

[1584] 6. Eluição utilizando seringas de 5 mL e uma pressão suave (taxa de de fluxo de <1 mL/min) eluir o vírus a partir da coluna por aplicação de:

[1585] 1,5 mL 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0

[1586] 3,0 mL 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0

[1587] 1.5 mL 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0

[1588] Recolha estes em um tubo de centrífuga de 15 mL.

[1589] Concentração de AAV1/2:

[1590] 1. Passo de concentração 1: Concentra-se o vírus eluído utilizando unidades de filtro de ultra centrifugação Amicon de 15 mL com um cutoff molecular de 100.000. Carregar o eluído na coluna para o concentrador e centrifugar a 2000x g durante 2 minutos (à temperatura ambiente. Verificar o volume concentrado - que deve ser de aproximadamente 500 mL. Se necessário, centrifugar em intervalos de 1min até ser alcançado o volume correto

[1591] 2. troca de tampão: Adicionar DPBS estéril 1 mL à unidade de filtração, centrifugar em intervalos de 1min até que o volume correto (500μl) seja atingido.

[1592] 3. Passo de concentração 2: Adicionar concentrado 500ul a uma unidade de filtro de 0,5 mL Ultra 100K Amicon. Centrifugar a 6000 g por 2min. Verificar o volume concentrado - que deve ser de aproximadamente 100 mL. Se necessário, centrifugar em intervalos de 1min até ser alcançado o volume correto.

[1593] 4. Recuperação: Inverter o elemento filtrante e inserir no tubo de coleta fresco. Centrifugar a 1000 g por 2min.

[1594] Recolher alíquota e congelar a -80 °C

[1595] 1μl é normalmente necessário por local de injeção, pequenas alíquotas (5 μL por exemplo) são, portanto, recomendadas (evitar o congelamento-descongelamento de vírus).

[1596] determinar o título partícula de GC resistente a DNaseI usando qPCR (ver protocolo separado)

[1597] Materiais

[1598] Amicon Ultra, 0.5ml, 100K; MILLIPORE; UFC510024

[1599] Amicon Ultra, 15ml, 100K; MILLIPORE; UFC910024

[1600] Benzonase nuclease; Sigma-Aldrich, E1014

[1601] HiTrap Heparin cartridge; Sigma-Aldrich; 54836

[1602] Desoxicolato de sódio; Sigma-Aldrich; D5670

[1603] Protocolo de produção de supernadante AAV1

[1604] Meio: D10 + HEPES

[1605] garrafa de 500ml DMEM de elevada glucose + Glutamax (Invitrogen)

[1606] 50ml Hyclone FBS (inativado pelo calor) (Thermo Fischer)

[1607] 5,5ml solução HEPES (1M, GIBCO)

[1608] Células: baixa passagem HEK293FT (passagem <10 na altura da produção de vírus)

[1609] Descongelar novas células de passagem 2-4 para a produção de vírus, crescer por 2-5 passagens

[1610] Reagente de Transfecção: Polietilenimina (PEI) “Max”

[1611] Dissolver 50mg PEI “Max” em 50mL de H2O Ultrapura estéril

[1612] Ajustar pH a 7.1

[1613] Filtro com 0,22um fliptop filter

[1614] Fechar o tubo e envolve com parafilme

[1615] Congelar alíquotas a -20 °C (para armazenamento, pode também ser utilizado imediatamente)

[1616] Cultura celular

[1617] Cultura de HEK293FT baixa passagem em D10 + HEPES Passagem todos os dias, entre 1:2 e 1:2,5

[1618] Vantajosamente não permitir que as células atinjam mais do que 85% de confluência

[1619] Para T75

[1620] 10 mL HBSS quente -Mg2+, -Ca2+, GIBCO) + 1 mL TrypLE Express (GIBCO) por frasco a 37 °C (Banho de água)

[1621] Aspirar o meio totalmente

[1622] Adicionar 10 mL de HBSS quente com cuidado (para lavar o meio completamente)

[1623] Adicionar 1 mL por frasco TrypLE

[1624] Colocar o frasco na incubadora (37 °C) durante 1 min

[1625] Adicionar 9 mL D10 + meio HEPES (37 °C)

[1626] Pipetar para cima e para baixo 5 vezes para gerar suspensão única de células

[1627] Dividir a 1:2 - 1:2,5 (12ml meio para T75) proporção (se as células estão a crescer mais lentamente, descartar e descongelar um novo lote, que não estão em crescimento ótimo)

[1628] Transferir para T225, logo que estão presentes células suficientes (para facilitar a manipulação de grandes quantidades de células)

[1629] Produção de AAV (escala de placa única 15 cm)

[1630] Plaquear 10 milhões de células em 21,5 mL de meio em uma placa de 15 centímetros

[1631] Incubar durante 18-22 horas a 37 °C

[1632] A transfecção é ideal em 80% de confluência por placa

[1633] Pré-aquecer o meio 22 mL (D10 + HEPES)

[1634] Preparar tubo com mistura de DNA (usar DNA maxiprep endofree):

[1635] 5,2 μg vetor plasmídeo de interesse

[1636] 8,7 μg AAV 1 plasmídeo serotipo

[1637] 10,4 μg de DF6 plasmídeo (genes auxiliares de adenovírus)

[1638] Vórtex para misturar

[1639] Adicionar 434 μL DMEM (sem soro!) Adicionar 130 μL solução PEI

[1640] Vórtex 5-10 segundos

[1641] Adicionar mistura DNA/DMEM/PEI a meio pré- aquecido

[1642] Vórtex brevemente para misturar

[1643] Substituir meio na placa 15cm com mistura DNA/DMEM/PEI

[1644] olocar na incubadora a 37 °C

[1645] Incubar 48h antes de armazenar (vantajosamente monitorizar para certificar que o meio não se torna muito ácido)

[1646] Colheita de vírus:

[1647] Remover o sobrenadante a partir da placa de 15 cm

[1648] Filtrar com um filtro de 0,45 um (baixa ligação proteica) Alíquotas e congelar a -80 °C

[1649] Transdução (Culturas de neurônios primários em formato de 24 poços, 5DIV)

[1650] Substituir o meio neurobasal completo em cada poço de neurônios a serem transduzidos com neurobasal fresco (normalmente 400ul de 500ul por poço é substituído)

[1651] Sobrenadante AAV em banho maria 37 °C

[1652] Deixar equilibrar durante 30 minutos na incubadora

[1653] Adicionar 250 μL de sobrenadante de AAV para cada poço

[1654] Incubar 24 horas a 37 °C

[1655] Remover o meio/sobrenadante e substituir por neurobasal completo fresco

[1656] A expressão começa a ser visível após 48h, saturando cerca de 6-7 dias após a infecção

[1657] Construções para pAAV com GOI não devem exceder 4,8kb incluindo ambos ITRS.

[1658] Exemplo de uma sequência otimizada de códon humano (isto é, ser otimizado para a expressão em humanos): SaCas9 é fornecido abaixo: (SEQ ID NO:__)

[1659] ACCGGTGCCACCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCGC CGAAGAAAAAGCGCAAGGTCGAAGCGTCCATGAAAAGGAACTACATTCTGGGGCTGGACA TCGGGATTACAAGCGTGGGGTATGGGATTATTGACTATGAAACAAGGGACGTGATCGACG CAGGCGTCAGACTGTTCAAGGAGGCCAACGTGGAAAACAATGAGGGACGGAGAAGCAAGA GGGGAGCCAGGCGCCTGAAACGACGGAGAAGGCACAGAATCCAGAGGGTGAAGAAACTGC TGTTCGATTACAACCTGCTGACCGACCATTCTGAGCTGAGTGGAATTAATCCTTATGAAG CCAGGGTGAAAGGCCTGAGTCAGAAGCTGTCAGAGGAAGAGTTTTCCGCAGCTCTGCTGC ACCTGGCTAAGCGCCGAGGAGTGCATAACGTCAATGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACG AGCTGTCTACAAAGGAACAGATCTCACGCAATAGCAAAGCTCTGGAAGAGAAGTATGTCG CAGAGCTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGATGGCGAGGTGAGAGGGTCAATTAATAGGT TCAAGACAAGCGACTACGTCAAAGAAGCCAAGCAGCTGCTGAAAGTGCAGAAGGCTTACC ACCAGCTGGATCAGAGCTTCATCGATACTTATATCGACCTGCTGGAGACTCGGAGAACCT ACTATGAGGGACCAGGAGAAGGGAGCCCCTTCGGATGGAAAGACATCAAGGAATGGTACG AGATGCTGATGGGACATTGCACCTATTTTCCAGAAGAGCTGAGAAGCGTCAAGTACGCTT ATAACGCAGATCTGTACAACGCCCTGAATGACCTGAACAACCTGGTCATCACCAGGGATG AAAACGAGAAACTGGAATACTATGAGAAGTTCCAGATCATCGAAAACGTGTTTAAGCAGA AGAAAAAGCCTACACTGAAACAGATTGCTAAGGAGATCCTGGTCAACGAAGAGGACATCA AGGGCTACCGGGTGACAAGCACTGGAAAACCAGAGTTCACCAATCTGAAAGTGTATCACG ATATTAAGGACATCACAGCACGGAAAGAAATCATTGAGAACGCCGAACTGCTGGATCAGA TTGCTAAGATCCTGACTATCTACCAGAGCTCCGAGGACATCCAGGAAGAGCTGACTAACC TGAACAGCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAACAGATTAGTAATCTGAAGGGGTACACCG GAACACACAACCTGTCCCTGAAAGCTATCAATCTGATTCTGGATGAGCTGTGGCATACAA ACGACAATCAGATTGCAATCTTTAACCGGCTGAAGCTGGTCCCAAAAAAGGTGGACCTGA GTCAGCAGAAAGAGATCCCAACCACACTGGTGGACGATTTCATTCTGTCACCCGTGGTCA AGCGGAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGC CCAATGATATCATTATCGAGCTGGCTAGGGAGAAGAACAGCAAGGACGCACAGAAGATGA TCAATGAGATGCAGAAACGAAACCGGCAGACCAATGAACGCATTGAAGAGATTATCCGAA CTACCGGGAAAGAGAACGCAAAGTACCTGATTGAAAAAATCAAGCTGCACGATATGCAGG AGGGAAAGTGTCTGTATTCTCTGGAGGCCATCCCCCTGGAGGACCTGCTGAACAATCCAT TCAACTACGAGGTCGATCATATTATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAATTCCTTTAACA ACAAGGTGCTGGTCAAGCAGGAAGAGAACTCTAAAAAGGGCAATAGGACTCCTTTCCAGT ACCTGTCTAGTTCAGATTCCAAGATCTCTTACGAAACCTTTAAAAAGCACATTCTGAATC TGGCCAAAGGAAAGGGCCGCATCAGCAAGACCAAAAAGGAGTACCTGCTGGAAGAGCGGG ACATCAACAGATTCTCCGTCCAGAAGGATTTTATTAACCGGAATCTGGTGGACACAAGAT ACGCTACTCGCGGCCTGATGAATCTGCTGCGATCCTATTTCCGGGTGAACAATCTGGATG TGAAAGTCAAGTCCATCAACGGCGGGTTCACATCTTTTCTGAGGCGCAAATGGAAGTTTA AAAAGGAGCGCAACAAAGGGTACAAGCACCATGCCGAAGATGCTCTGATTATCGCAAATG CCGACTTCATCTTTAAGGAGTGGAAAAAGCTGGACAAAGCCAAGAAAGTGATGGAGAACC AGATGTTCGAAGAGAAGCAGGCCGAATCTATGCCCGAAATCGAGACAGAACAGGAGTACA AGGAGATTTTCATCACTCCTCACCAGATCAAGCATATCAAGGATTTCAAGGACTACAAGT ACTCTCACCGGGTGGATAAAAAGCCCAACAGAGAGCTGATCAATGACACCCTGTATAGTA CAAGAAAAGACGATAAGGGGAATACCCTGATTGTGAACAATCTGAACGGACTGTACGACA AAGATAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAAAGTCCCGAGAAGCTGCTGATGTACC ACCATGATCCTCAGACATATCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAGCAGTACGGCGACGAGA AGAACCCACTGTATAAGTACTATGAAGAGACTGGGAACTACCTGACCAAGTATAGCAAAA AGGATAATGGCCCCGTGATCAAGAAGATCAAGTACTATGGGAACAAGCTGAATGCCCATC TGGACATCACAGACGATTACCCTAACAGTCGCAACAAGGTGGTCAAGCTGTCACTGAAGC CATACAGATTCGATGTCTATCTGGACAACGGCGTGTATAAATTTGTGACTGTCAAGAATC TGGATGTCATCAAAAAGGAGAACTACTATGAAGTGAATAGCAAGTGCTACGAAGAGGCTA AAAAGCTGAAAAAGATTAGCAACCAGGCAGAGTTCATCGCCTCCTTTTACAACAACGACC TGATTAAGATCAATGGCGAACTGTATAGGGTCATCGGGGTGAACAATGATCTGCTGAACC GCATTGAAGTGAATATGATTGACATCACTTACCGAGAGTATCTGGAAAACATGAATGATA AGCGCCCCCCTCGAATTATCAAAACAATTGCCTCTAAGACTCAGAGTATCAAAAAGTACT CAACCGACATTCTGGGAAACCTGTATGAGGTGAAGAGCAAAAAGCACCCTCAGATTATCA AAAAGGGCTAAGAATTC

Exemplo 35: Minimização de clivagem fora do alvo usando Cas9 nickase e dois RNAs guia:

[1660] Cas9 é uma nuclease de DNA guia de RNA que pode ser direcionada para locais específicos no genoma com a ajuda de um RNA guia de 20 pb. No entanto, a sequência guia pode tolerar algumas discrepâncias entre a sequência guia e a sequência de DNA alvo. A flexibilidade é indesejável devido ao potencial para a clivagem fora do alvo, quando RNA guia visam Cas9 para uma sequência fora do alvo que tem algumas bases diferentes a partir da sequência guia. Para todas as aplicações experimentais (direcionamento do gene, engenharia de cultura, aplicações terapêuticas, etc.), é importante ser capaz de melhorar a especificidade de direcionamento de genes mediada por Cas9 e reduzir a probabilidade de modificação fora do alvo pela Cas9.

[1661] Os Requerentes desenvolveram um método de utilização de um mutante nickase Cas9 em combinação com dois RNAs guia para facilitar as quebras de cadeia dupla específicas no genoma, sem alterações, fora do alvo. A mutante nickase Cas9 pode ser gerada a partir de uma nuclease Cas9 desativando a sua atividade de clivagem de modo a que, em vez de ambas as cadeias do duplex de DNA serem clivadas apenas uma cadeia é clivada. A nickase Cas9 pode ser gerada por indução de mutações em um ou mais domínios da nuclease Cas9, por exemplo, Ruvc1 ou HNH. Estas mutações podem incluir, mas não estão limitados a mutações em um domínio catalítico Cas9, por exemplo, em SpCas9 estas mutações podem ser em posições D10 ou H840. Estas mutações podem incluir, mas não estão limitadas a D10A, E762A, H840A, N854A, N863A ou D986A em SpCas9 mas as nickases mas podem ser geradas através da indução de mutações em posições em outras enzimas CRISPR ou ortólogos Cas9 correspondentes. em uma forma de realização mais preferencial da invenção, o mutante nickase Cas9 é uma nickase SpCas9 com uma mutação D10A.

[1662] A maneira como isso funciona é que cada RNA guia em combinação com Cas9 nickase induziria a quebra da cadeia simples de um alvo de DNA duplex. Uma vez que cada RNA guia corta uma cadeia, o resultado líquido é uma quebra de cadeia dupla. A razão pela qual este método elimina mutações fora do alvo é porque é muito pouco provável que tenha um local fora do alvo que tenha um alto grau de semelhança para as duas sequências guia (20 pb + 2bp (PAM) = 22 pb especificidade para cada guia, e dois guias significa que qualquer local fora do alvo terá que ter perto 44pb de sequência homóloga). Embora ainda seja provável que os guias individuais possam ter locais fora do alvos, mas esses só irão ser cortados, o que é improvável de ser reparado pelo processo de NHEJ mutagênico. Portanto, a multiplexação de duplo corte de cadeia de DNA fornece uma maneira poderosa de introdução de quebras na dupla cadeia de DNA alvo sem efeitos mutagénicos fora do alvo.

[1663] Os Requerentes levaram a cabo experiências que envolvem a cotransfecção de células HEK293FT com um plasmídeo que codifica Cas9 (D10A) nickase, bem como a cassetes de expressão de DNA para um ou mais guias. Os Requerentes transfectaram células utilizando Lipofectamina 2000, e as células transfectadas foram colhidas 48 ou 72 horas após as transfecções. Cortes Duplos induzidos por NHEJ foram detectados usando o ensaio de nuclease de SURVEYOR como descrito aqui anteriormente (figs. 51, 52 e 53).

[1664] Os Requerentes identificaram adicionalmente parâmetros que relacionam clivagem eficiente pelo mutante nickase Cas9 quando em combinação com dois RNAs guia e estes parâmetros incluem mas não estão limitados ao comprimento de uma saliência 5’. Clivagem eficiente é relatada para saliência 5' de pelo menos 26 pares de bases. em uma forma de realização preferencial da invenção, a saliência 5' tem de pelo menos 30 pares de bases e mais preferencialmente pelo menos 34 pares de bases. Saliências até 200 pares de bases podem ser aceitáveis para a clivagem, enquanto saliências 5' de menos de 100 pares de bases são preferenciais e saliências 5' de menos de 50 pares de bases são as mais preferenciais (Figs. 54 e 55).

Exemplo 36: Interrogação da função de genes in vivo no cérebro de mamífero usando Cas9

[1665] A capacidade de manipular precisamente in vivo o genoma de neurônios no cérebro permite dissecção rápida da função de genes em processos cerebrais normais e relacionados com doenças. Os Requerentes mostram que a aplicação mediada por AAV da endonuclease microbiana Cas9 e RNA guia único em tipos de células específicos no cérebro de camundongos adultos facilitou silenciamentos de genes únicos e em multiplex. No espaço de duas semanas, o silenciamento mediado por Cas9 da proteína de ligação a CpG de metila (MeCP2) induziu mudanças morfológicas em neurônios visados, e o silenciamento em multiplex da família das proteínas DNA metiltransferases (Dnmt1, Dnmt3a e Dnmt3b) alterou o comportamento dos camundongos no condicionamento contextual do medo. Em conjunto, os resultados dos Requerentes demonstram o potencial de Cas9 para facilitar estudos genéticos reversos rápidos da função de genes no cérebro e provêm uma alternativa atrativa ao uso de modelos de animais transgênicos morosos.

[1666] Modelos de animais transgênicos transportando mutações associadas a doenças são enormemente úteis para o estudo de distúrbios neuropsiquiátricos, ajudando a elucidar o mecanismo genético e patofisiológico de doença. No entanto, embora se saiba que alguns distúrbios neuropsiquiátricos estão associados a defeitos de genes únicos, a maioria dos distúrbios cognitivos e psiquiátricos, incluindo esquizofrenia, autismo e depressão, está associada a variações genéticas múltiplas. A geração de modelos animais que simultaneamente transportem modificações genéticas múltiplas é particularmente intensiva em termos de mão-de-obra e requer melhoramento moroso ao longo de muitas gerações. Se mostrou que a endonuclase Cas9 associada a CRISPR de S. pyogenes (SpCas9) medeia clivagem do genoma precisa e eficaz de genes únicos e múltiplos na replicação de células eucarióticas. A Cas9 nuclease pode ser instruída para clivar locais genômicos específicos para induzir quebras de fita dupla visadas, o que resulta em mutações de inserção/deleção (indel) de troca de grelha (Fig. 59A) . Os Requerentes procuraram explorar a possibilidade de usar Cas9 para estudar a função de genes individuais ou grupos de genes em processos cerebrais bem como modelar distúrbios mono- e multigênicos in vivo.

[1667] Vetores virais adenoassociados (AAV) são comummente usados para aplicar genes recombinantes ao cérebro de camundongos. Os Requerentes desenharam um sistema de aplicação de Cas9 e sgRNA à base de AAV de vetor dual (Fig. 56A). A principal limitação do sistema AAV é o tamanho de involucramento do cassete de transgene (~4,5 kb sem as ITRs). O tamanho da SpCas9 é ~4,2 kb, o que deixa menos do que 0,3 kb para outros elementos genéticos necessários para expressão de genes eficaz e específica do tipo de células. Os Requerentes identificaram que uma versão truncada do promotor Mecp2 de camundongo (235 pb, sMecp2) e um curto sinal de poliadenilação (48 pb, spA) são suficientes para conduzir a expressão robusta de Cas9 em neurônios corticais de camundongo cultivados (Fig. 56B; Fig. 59B-D) . Para conduzir a expressão de sgRNA em neurônios, os Requerentes usaram um segundo vetor codificando sgRNA. Adicionalmente, os Requerentes combinaram a aplicação de sgRNA com marcação fluorescente simultânea dos núcleos de células visados. A fusão da proteína fluorescente verde (GFP) com o domínio transmembranar nuclear KASH dirige a GFP para a membrana nuclear externa, e permite visualização fácil de células transduzidas por AAV (Fig. 56B).

[1668] Os Requerentes testaram em primeiro lugar a eficácia de aplicação deste sistema de aplicação de Cas9 de vetor dual in vivo usando neurônios corticais de camundongos primários e observaram eficácia de cotransdução maior do que 80 % (Figura 56C) . Importantemente, a expressão de Cas9 não afetou adversamente a morfologia e taxa de sobrevivência de neurônios transduzidos (Figura 59D, E). Para testar a edição do genoma mediada por Cas9 em neurônios primários de camundongos, os Requerentes visaram o gene Mecp2, que desempenha um papel principal na síndrome de Rett. Se mostrou que a deficiência de MeCP2 está associada a anormalidades na árvore dendrítica e defeitos na morfogênese da espinha em neurônios, e se acredita que ambos os fenótipos morfológicos contribuem para os sintomas neurológicos observados em pacientes com síndrome de Rett.

[1669] Para alcançar direcionamento eficaz de Mecp2, os Requerentes geraram em primeiro lugar vários sgRNAs para visar múltiplos locais dentro do éxon 3 do local Mecp2 de camundongo (Fig. S2A, B) e selecionaram o sgRNA mais eficaz com base em resultados de ensaio de nuclease SURVEYOR™ de células Neuro-2a (Fig. 56D, Fig. 60). Para avaliar a eficácia de edição do sistema de vetores duais dos Requerentes em neurônios in vitro, os Requerentes transduziram neurônios corticais de camundongos primários ao dia 7 in vitro (7DIV) e mediram a taxa de indel usando o ensaio de nuclease SURVEYOR™ 7 dias pós-transdução (Fig. 56E). De nota, a cultura de neurônios cotransduzida com Cas9 e sgRNA mostrou redução em torno de 80 % nos níveis de proteína MeCP2 em comparação com neurônios transduzidos com Cas9 sozinha (Fig. 56F; Fig. 61). Além do mais, os neurônios cotransduzidos com Cas9 e sgRNA exibiram também morfologia da árvore dendrítica (Fig. 56G-I) e densidade da espinha (Fig. 69J, K) alteradas quando em comparação com a população neuronal somente com Cas9.

[1670] Os Requerentes perguntaram de seguida se Cas9 poderia mediar modificações genômicas estáveis em um subconjunto de células no cérebro de camundongos vivos. Para analisar especificamente as células transduzidas por AAV, os Requerentes desenvolveram um método de purificar núcleos marcados com GFP-KASH usando separação de células ativada por fluorescência (FACS) (Fig. 57A, Fig. 62). Similarmente aos neurônios primários em cultura, os Requerentes coaplicaram uma mistura (razão 1:1) de AAV1/2 de elevado título transportando Cas9 e sgRNA visando Mecp2 no giro denteado de camundongos adultos (Fig. 57B). Os Requerentes observaram elevada eficácia de cotransdução de ambos os vetores em células granuladas do hipocampo às 4 semanas após aplicação viral (Fig. 57C). Para testar a eficácia da modificação do genoma no local Mecp2 in vivo, os Requerentes purificaram os núcleos marcados com GFP- KASH e detectaram frequência de indel de até 34 % na população de núcleos separados (Fig. 57D). O corte mediado por Cas9 do local Mecp2 diminuiu eficazmente os níveis da proteína MeCP2 (Fig. 57E-G), e reduziram a densidade da espinha na população de neurônios visada (Fig. 57H, I), similar aos efeitos observados em camundongos nocaute em MeCP2. Estes resultados demonstram a versatilidade de Cas9 para facilitação do silenciamento de genes visado no cérebro de mamíferos in vivo.

[1671] Uma vantagem-chave do sistema de Cas9 é a sua capacidade de facilitar a edição do genoma em multiplex. A introdução de silenciamentos estáveis de múltiplos genes no cérebro de animais vivos terá aplicações potencialmente de longo alcance, tais como interrogação causal de mecanismos multigênicos em afecções fisiológicas e neuropatológicas. Para testar a possibilidade de edição do genoma em multiplex no cérebro, os Requerentes desenharam um vetor de expressão de sgRNA em multiplex consistindo em três sgRNAs em tandem, em conjunto com GFP-KASH para marcação dos núcleos (Fig. 58A) . Os Requerentes escolheram sgRNAs visando a família dos genes de DNA metiltransferases (DNMTs), que consiste em Dnmtl, Dnmt3a e Dnmt3b. Dnmtl e 3a que são expressos no cérebro de adultos ao passo que Dnmt3b é expresso principalmente durante o neurodesenvolvimento. Se mostrou previamente que a atividade de DNMT altera a metilação de DNA no cérebro e Dnmt3a e Dnmt1 são requeridas para plasticidade sináptica e aprendizagem e formação da memória. Os Requerentes selecionaram sgRNAs individuais com elevada eficácia de modificação e otimizaram combinações de guias para elevada clivagem de DNA simultânea para todos os três genes visados (Fig. 58B; Fig. 63) .

[1672] Para testar a eficácia da edição do genoma em multiplex in vivo, os Requerentes aplicaram estereotaxicamente uma mistura de AAVs expressando Cas9 e sgRNA de elevado título giro denteado dorsal e ventral de camundongos adultos. Após 4 semanas, os hipocampos foram dissecados e os núcleos de células visados foram separados através de FACS. Usando sequenciação profunda, os Requerentes observaram elevados níveis de formação de indels em todos os três locais visados, variando de ~20-70 % (Fig. 58C, Fig. 64). Dnmt3a e Dnmt1, que são ambas altamente expressas no cérebro de adultos, mostram níveis de proteína significativamente diminuídos em tecido de giro denteado dissecado ~12 semanas após aplicação do vírus (Fig. 58D) . Devido à baixa expressão de Dnmt3b no cérebro de adultos, os Requerentes não foram capazes de detectar a proteína Dnmt3b em esta análise.

[1673] Trabalho prévio com Cas9 tem mostrado que locais genômicos que correspondem parcialmente ao sgRNA podem resultar em formações de indel fora do alvo. A análise de indel dos locais fora do alvo mais previstos revelou uma taxa de 0-1,6 % de formações de indel demonstrando que a modificação por Cas9 é altamente específica (Tabela 2). A baixa taxa observada de fora do alvo é provavelmente devida a níveis relativamente fracos de expressão de Cas9 resultando do promotor sMecp2 e curto sinal de poliA.

[1674] Tabela 2. Análise fora do alvo para direcionamento de DNMTs

[1675] Estudos prévios sugeriram que o silenciamento de Dnmt3a e Dnmt1 pode impactar a formação de memória dependente do hipocampo. Consequentemente, os Requerentes realizaram testes de condicionamento contextual do meio para investigar o efeito do silenciamento triplo mediado por Cas9 (Dnmt3a, Dnmt1 e Dnmt3b) na aquisição e consolidação da formação de memória. Embora os Requerentes não tenham observado quaisquer diferenças entre camundongos de controle e com silenciamento triplo na fase de aquisição de memória, os camundongos nocaute mostraram consolidação de memória defeituosa quando testados sob condições de contexto de treino (Fig. 58E, F). Este efeito foi abolido quando os camundongos foram testados no contexto alterado, demonstrando que a aprendizagem contextual é prejudicada no modelo de camundongo dos Requerentes. Os resultados dos Requerentes demonstram que o silenciamento mediado por CRISPR-Cas9 de membros da família DNMT em neurônios do giro denteado é suficiente para sondar a função de genes em tarefas comportamentais.

[1676] Em conjunto, os resultados dos Requerentes demonstram que a aplicação in vivo do sistema CRISPR-Cas9 representa uma tecnologia precisa, flexível e altamente eficaz para geração de modelos de doença e manipulação de comportamento de camundongos por edição do genoma em multiplex. A aplicação in vivo do sistema Cas9 mostrada aqui terá aplicações amplas em ciência básica, bem como em biotecnologia e medicina.

[1677] Constructos de DNA: Para a seleção de alvos de Cas9 e geração de RNA de guia único (sgRNA), as sequências alvo de 20 nt foram selecionadas para precederem uma sequência de PAM 5'-NGG. Para minimizar os efeitos fora do alvo, a ferramenta de desenho de CRISPR foi usada (http://tools.genome-engineering.org). O sgRNA foi amplificado por PCR usando promotor U6 como um molde com iniciador direto: 5’-CGCACGCGTAATTCGAACGCTGACGTCATC-3’ e iniciador reverso contendo o sgRNA com local alvo de DNA com 20 nt (Negrito): 5’- CACACGCGTAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCT TATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGGTGTTTCG TCCTTTCCAC-3’. (SEQ ID NO: ). O constructo de EGFP-KASH foi usado como molde de PCR para clonagem do cassete de expressão na estrutura principal de AAV sob o promotor de Sinapsina de humano (hSyn). De seguida, a sequência de codificação de U6- Mecp2_sgRNA foi introduzida usando local MluI. Para a estratégia de direcionamento de genes em multiplex, sgRNAs individuais foram amplificados por PCR como descrito acima. Todos os três sgRNAs foram ligados com cassete hSyn-GFP-KASH- bGHpA amplificado por PCR (ver Fig. 58A) por uso da estratégia de clonagem Golden Gate. Após amplificação por PCR, o produto de ligação Golden Gate contendo 3 sgRNAs e hSyn-GFP-KASH-bGH pA foi clonado na estrutura principal de AAV. Todos os constructos obtidos foram verificados quanto à sequência. De modo a encontrar a sequência do promotor ótima para conduzir a expressão de Cas9 em neurônios, os Requerentes testaram: sequências de promotor de hSynl, Mecp2 truncado de camundongo (sMecp2), e Maplb truncado de rato (rMaplb) (ver Fig. 59B) . Foram usados os seguintes iniciadores para amplificar regiões do promotor: hSyn_F: 5’-GTGTCTAGACTGCAGAGGGCCCTG-3’ (SEQ ID NO: ); hSyn_R: 5’-GTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGTCGAGAA-3’ (SEQ ID NO: ); mMecp2_F 5’-GAGAAGCTTAGCTGAATGGGGTCCGCCTC-3’ (SEQ ID NO:__); mMecp2_R 5’-CTCACCGGTGCGCGCAACCGATGCCGGGACC-3’ (SEQ ID NO: ); rMap1b-283/-58_F 5‘- GAGAAGCTTGGCGAAATGATTTGCTGCAGATG-3’ (SEQ ID NO: __); rMap1b- 283/-58_R 5’-CTCACCGGTGCGCGCGTCGCCTCCCCCTCCGC-3’ (SEQ ID NO:__). Outra truncação do promotor de map1b de rato foi montada com os seguintes oligos: 5’- AGCTTCGCGCCGGGAGGAGGGGGGACGCAGTGGGCGGAGCGGAGACAGCACCTTCGGAGA TAATCCTTTCTCCTGCCGCAGAGCAGAGGAGCGGCGGGAGAGGAACACTTCTCCCAGGCT TTAGCAGAGCCGGA-3’ (SEQ ID NO: ) e 5’- CCGGTCCGGCTCTGCTAAAGCCTGGGAGAAGTGTTCCTCTCCCGCCGCTCCTCTGCTCTG CGGCAGGAGAAAGGATTATCTCCGAAGGTGCTGTCTCCGCTCCGCCCACTGCGTCCCCCC TCCTCCCGGCGCGA-3’ (SEQ ID NO: ). O sinal de poliadenilação sintético curto (spA) (3) foi montado usando os seguintes oligos: AATTCAATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGT

[1678] GTGC-3’ (SEQ ID NO: ) e 5’- GGCCGCACACAA AAAACCAACACACAGATCTAATGAAAATAAAGATCTTTTATTG-3’ (SEQ ID NO: ) . O plasmídeo codificando proteína fluorescente vermelha (mCherry) sob controle do promotor EF1α foi usado para transfecção de neurônios com Lipofectamine®2000 (Life Technologies).

[1679] Culturas de linhas celulares e transfecção: Células Neuro-2a (N2a) foram cultivadas em DMEM contendo soro fetal de bovino (BSA) a 5 %. Para células HEK293FT foi usado DMEM contendo soro fetal de bovino (FBS) a 10 %. As células foram mantidas a 37 °C em atmosfera de CO2 a 5 %. As células foram transfectadas usando Lipofectamine®2000 ou reagente Polietilenimina (PEI) “MAX” (Polysciences), de acordo com o protocolo do fabricante.

[1680] Produção de vetores AAV concentrados: Partículas de AAV1/2 de elevado título foram produzidas usando plasmídeos de serotipo AAV1 e AAV2 a razões iguais e plasmídeo ajudante pDF6 e purificadas em coluna de afinidade de heparina. A titulação de partículas virais foi feita por qPCR. Partículas de AAV1 de elevado título foram produzidas pelos Serviços Nucleares de Vetores da UNC (University of North Carolina em Chapel Hill). Partículas de AAV1 a baixo título em DMEM foram produzidas como previamente descrito. Brevemente, células HEK293FT foram transfectadas com plasmídeo de transgene, plasmídeo de serotipo pAAV1 e plasmídeo ajudante pDF6 usando PEI “MAX”. O meio de cultura foi coletado após 48 h e filtrado através de um filtro de PVDF de 0,45μm (Millipore).

[1681] Cultura de neurônios corticais primários: Os animais usados para se obterem neurônios para culturas de tecidos foram sacrificados de acordo com o protocolo aprovado pelo Comité em Cuidado Animal do MIT (MIT CAC). Culturas primárias foram preparadas a partir de cérebros de camundongos embriônicos ao dia 16 como descrito em G. Banker, K. Goslin, Developments in neuronal cell culture. Nature 336, 185 (10 de nov, 1988). Foram usados embriões de ambos os sexos. As células foram plaqueadas em placas de 24 poços revestidos por poli-D- lisina (PDL) (BD Biosciences) ou lâminas revestidas por laminina/PDL (VWR). As culturas foram cultivadas a 37 °C e CO2 a 5 % em meio Neurobasal, suplementadas com B27, Glutamax (Life Technologies) e mistura de penicilina/estreptomicina.

[1682] Para transdução de AAV, neurônios corticais em 500 μL de meio de cultura Neurobasal foram incubados a 7 DIV com 300 μL (infecção dupla a razão 1:1) de meio condicionado contendo AAV1 de células HEK293FT. Uma semana após transdução, os neurônios foram coletados para processamento a jusante ou fixos em paraformaldeído a 4 % para colorações imunofluorescentes e análise de morfologia.

[1683] Para visualização da morfologia neuronal, as células a DIV7 foram transfectadas com vetor de expressão EF1α- mCherry usando Lipofectamine®2000 (Life Technologies) durante uma semana como previamente descrito em L. Swiech et al., CLIP- 170 and IQGAP1 cooperatively regulate dendrite morphology. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience 31, 4555 (23 de mar, 2011). Para medição do comprimento de dendritos total, todos os dendritos de neurônios individuais foram rastreados usando software ImageJ. A quantificação do número de dendritos primários, pontas dendríticas e a análise de Sholl foram realizadas em imagens adquiridas com microscópio fluorescente a uma objetiva de 40x (microscópio Zeiss AxioCam Ax10, câmara Axiocam MRm). Para o número de dendritos foram contadas as extremidades de todas as protusões não axonais maiores do que 10 μm. Para a análise de Sholl, círculos concêntricos com passo de 5 μm em diâmetro foram automaticamente desenhados em torno do corpo celular, e o número de dendritos atravessando cada círculo foi contado usando software ImageJ com um plug-in Sholl.

[1684] Injeção estereotáxica de AAV1/2 no cérebro de camundongos: O MIT CAC aprovou todos os procedimentos em animais descritos aqui. Os camundongos C57BL/6N macho adultos (idade de 12-16 semanas) foram anestesiados por injeção intraperitoneal (i.p.) de Cetamina a 100 mg/kg e Xilazina a 10 mg/kg. Foi dada analgesia preemptiva (Buprenex, 1 mg/kg, i.p.). Foi realizada craniotomia de acordo com procedimentos aprovados e 1 μL de mistura de AAV 1:1 (1x1013 Vg/mL de sMecp2 - SpCas9; 6x1012 Vg/mL de DNMT 3xsgRNA; 3-5x1012 Vg/mL de hSyn- GFP-KASH) foi injetado em: giro denteado dorsal (anterior/posterior: -1,7; médiolateral: 0,6; dorsal/ventral: -2,15) e/ou giro denteado ventral (anterior/posterior: -3,52; médiolateral: 2,65; dorsal/ventral: -3). A incisão foi suturada e analgésicos pós-operativos apropriados (Meloxicam, 1-2 mg/kg) foram administrados durante três dias após cirurgia.

[1685] Purificação de núcleos de células de tecido do cérebro: O hipocampo total ou giro denteado foi rapidamente dissecado em DPBS gelado (Life Sciences) e congelado em gelo seco. O tecido foi gentilmente homogeneizado em 2 mL de tampão de homogeneização (HB) gelado (Sacarose a 320 mM, CaCl a 5 mM, Mg(Ac)2 a 3 mM, Tris a 10 mM pH 7,8, EDTA a 0,1 mM, NP40 a 0,1 %, PMSF a 0,1 mM, beta-mercaptoetanol a 1 mM) usando 2 mL de homogeneizador Dounce (Sigma); 25 vezes com pilão A, seguido por 25 vezes com pilão B. De seguida, 3 mL de HB foram adicionados a 5 mL total e mantidos em gelo durante 5 min. Para centrifugação de gradiente, 5 mL de meio de gradiente da densidade OptiPrepTM a 50 % (Sigma) contendo CaCl a 5 mM, Mg(Ac)2 a 3 mM, Tris a 10 mM pH 7,8, PMSF a 0,1 mM, beta- mercaptoetanol a 1 mM foram adicionados e misturados. O lisato foi gentilmente carregado no topo de 10 mL de solução OptiPrepTM iso-osmolar a 29 % em um tubo centrífuga de 30 mL cônico (Beckman Coulter, rotor SW28). As amostras foram centrifugadas a 10.100 xg (7.500 rpm) durante 30 min a 4 °C. O sobrenadante foi removido e o pélete de núcleos foi gentilmente ressuspenso em beta-glicerofosfato a 65 mM (pH 7,0), MgCl2 a 2 mM, KCl a 25 mM, sacarose a 340 mM e glicerol a 5 %. O número e qualidade de núcleos purificados foram controlados usando microscopia de campo brilhante.

[1686] Separação de núcleos de células: Os núcleos intactos positivos (GFP+) e negativos (GFP-) quanto a GFP foram comarcados com Vybrant® DyeCycle™ Ruby Stain (1:500, Life Technologies) e separados usando BD FACSAria III (Koch Institute Flow Cytometry Core, MIT). Os núcleos GFP+ e GFP- foram coletados em tubos Eppendorf de 1,5 mL revestidos com BSA a 1 % e contendo 400 μL de tampão de ressuspensão (beta- glicerofosfato a 65 mM pH 7,0, MgCl2 a 2 mM, KCl a 25 mM, sacarose a 340 mM e glycerol a 5 %). Após separação, todas as amostras foram mantidas em gelo e centrifugadas a 10.000 xg durante 20 min a 4 °C. Os péletes de núcleos foram armazenados a -80 °C ou foram diretamente usados para processamento a jusante.

[1687] Extração de DNA genômico e ensaio SURVEYOR™: Para teste funcional de sgRNA, células N2a confluentes a 5070 % foram cotransfectadas com um único sgRNA amplificado por PCR e vetor Cas9. As células transfectadas com Cas9 serviram somente como controle negativo. As células foram coletadas 48 h após transfecção, e DNA foi extraído usando DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. Para isolar DNA genômico de neurônios primários transduzidos com AAV1, foi usado o DNeasy Blood & Tissue Kit 7 dias pós- transdução de AAV, de acordo com a instrução do fabricante.

[1688] Os núcleos separados ou tecidos dissecados foram lisados em tampão de lise (Tris a 10 mM, pH 8,0, NaCl a 10 mM, EDTA e 10 mM, SDS a 0,5 mM, Proteinase K (PK, 1 mg/mL) e RNAse A) a 55 °C durante 30 min. De seguida foi realizada extração com clorofórmio-fenol seguida por precipitação do DNA com etanol, de acordo com procedimentos padrão. O DNA foi finalmente ressuspenso em Tampão TE (Tris a 10 mM pH 8,0, EDTA a 0,1 mM) e usado para análise a jusante. O teste funcional de sgRNAs individuais foi realizado por ensaio de nuclease SURVEYOR™ (Transgenomics) usando iniciadores de PCR listados na Tabela 3. A quantificação da intensidade das bandas foi realizada como descrito antes em F. A. Ran et al., Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols 8. 2281 (nov, 2013). Tabela 3. Iniciadores de PCR usados no ensaio SURVEYOR™

[1689] Coloração imunofluorescente:

[1690] Cultura de células: Para coloração imunofluorescente de neurônios primários, as células foram fixas 7 dias após aplicação viral com paraformaldeído (PFA) a 4 % durante 20 à RT. Após lavagem 3 vezes com PBS, as células foram bloqueadas com soro de cabra normal (NGS) a 5 % (Life Technologies), soro de burro (DS) a 5 % (Sigma) e Triton-X100 a 0,1 % (Sigma) em PBS durante 30 min à RT. As células foram incubadas com anticorpos primários em NGS a 2,5 %, DS a 2,5 % e Triton-X100 a 0,1 % durante 1 hora à RT ou durante a noite a 4 °C. Após lavagem 3 vezes com PBST, as células foram incubadas com anticorpos secundários durante 1 hora à RT. Finalmente, lâminas foram montadas usando VECTASHIELD HardSet Mounting Medium com DAPI (Vector Laboratories) e visualizadas usando um microscópio Zeiss AxioCam Ax10 e uma câmara Axiocam MRm. As imagens foram processadas usando o software Zen 2012 (Zeiss). As quantificações foram realizadas por uso do software ImageJ 1.48 h e plug-in detector de Neurônios.

[1691] Os camundongos foram sacrificados 4-8 semanas após aplicação viral por uma dose letal de Cetamina/Xilazina e perfundidos transcardiacamente com PBS seguido por PFA. O tecido fixo foi secionado usando vibratome (Leica, VT1000S). De seguida, seções de 30 μm foram fervidas durante 2 min em tampão citrato de sódio (citrato trissódico desidratado a 10 mM, Tween20 a 0,05 %, pH 6,0) e resfriadas até à RT durante 20 min. As seções foram bloqueadas com soro de cabra normal (NGS) a 4 % em TBST (NaCl a 137 mM, Tris a 20 mM pH 7,6, Tween- 20 a 0,2 %) durante 1 hora. Seções com parafina foram cortadas usando um micrótomo (Leica RM2125 RTS) até 8 μm, e coradas como previamente descrito em A. V. Tzingounis et al. , The KCNQ5 potassium channel mediates a component of the afterhyperpolarization current in mouse hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, 10232 (1 de jun, 2010) .

[1692] As seções foram incubadas com anticorpos primários diluídos em TBST com NGS a 4 % durante a noite a 4 °C. Após 3 lavagens em TBST, as amostras foram incubadas com anticorpos secundários. Após lavagem com TBST 3 vezes, as seções foram montadas usando VECTASHIELD HardSet Mounting Medium com DAPI e visualizadas com microscópio confocal (Zeiss LSM 710, Ax10 ImagerZ2, Software Zen 2012).

[1693] Foram usados os seguintes anticorpos primários: anti-Dnmt3a de coelho (Santa Cruz, 1:100); anti-MeCP2 de coelho (Millipore, 1:200); anti-NeuN de camundongo (Millipore, 1:50-1:400); anti-GFAP de galinha (Abcam, 1:400); anti-Map2 de camundongo (Sigma, 1:500); anti-GFP de galinha (Aves labs, 1:200-1:400); anti-HA de camundongo (Cell Signaling, 1:100). Anticorpos secundários: AlexaFluor®488, 568 ou 633 (Life Technologies, 1:500-1:1.000).

[1694] Coloração de Golgi-Cox: A coloração de Golgi- Cox foi realizada usando o kit FD Rapid GolgiStain (FD NeuroTechnologies). Camundongos machos adultos 1-4 semanas após injeção com CRISPR-Cas9 visando local Mecp2 foram sacrificados por desarticulação cervical de acordo com o protocolo MIT CAC. Imediatamente após dissecção, os cérebros foram processados de acordo com o protocolo do fabricante. A morfologia das células foi analisada em criosseções com espessura de 100 μm de giro denteado usando microscópio de luz sob lente objetiva de 100x (Zeiss Axioplan 2 com controle de foco fino motorizado, câmara digital OcraER). A densidade da espinha foi manualmente contada usando software MetaMorph4.

[1695] Quantificação de ensaio LIVE/DEAD®: Neurônios primários de controle e transduzidos foram corados usando o ensaio LIVE/DEAD® (Life technologies) de acordo com a instrução do fabricante. Para evitar interferência com o sinal de GFP da expressão de GFP-KASH, as células foram coradas para DEAD (homodímero de etídio) e DAPI (todas as células) somente. As células coradas foram visualizadas usando microscopia de fluorescência e as células positivas quanto a DEAD, GFP e DAPI foram contadas por uso de software ImageJ 1.48h e plug-in detector de Neurônios.

[1696] Análise de transferência de Western: Os neurônios corticais primários transduzidos (7 dias após aplicação viral) e amostras de tecido transduzido (4 semanas após aplicação viral) foram lisados em 50 μL de tampão RIPA gelado (Cell Signaling) contendo SDS a 01 % e inibidores de protease (Roche, Sigma). Os lisatos de células foram sonicados durante 5 min em um sonicador Bioruptor (Diagenode) e a concentração de proteína foi determinada usando o BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, Inc.). Os lisatos de proteína foram dissolvidos em tampão de amostra de SDS-PAGE, separados sob condições redutoras em géis de Tris-HCl a 4-15 % (Bio-Rad) e analisados por transferência de Western usando anticorpos primários: anti-Dnmt3a de coelho (Santa Cruz, 1:500), anti- Dnmt1 de camundongo (Novus Biologicals, 1:800), anti-Mecp2 de coelho (Millipore, 1:400), anti-Tubulina de Coelho (Cell Signaling, 1:10,000) seguido por anticorpos para HRP anticamundongo e anticoelho secundários (Sigma-Aldrich, 1:10.000). GAPDH foi diretamente visualizado com anticorpo anti-GAPDH acoplado a HRP de Coelho (Cell Signaling, 1:10.000). Tubulina ou GAPDH serviu como controle de carga. As transferências foram visualizadas com sistema ChemiDoc™ MP com software ImageLab 4.1 (BioRad), e quantificadas usando software ImageJ 1.48h.

[1697] Condicionamento de Medo Contextual Atrasado (DCFC): 8 semanas após aplicação bilateral de Cas9/DNMT 3xsgRNA ao giro denteado dorsal e ventral de camundongos C57BL/6N machos com 12 semanas de idade, os animais estavam habituados ao experimentador e à câmara de comportamento durante 7 dias. Filhotes injetados com Cas9/GFP-KASH serviram como controles. Ao dia 1 de DCFC, as jaulas de camundongos foram colocadas em uma antecâmara isolada para prevenir camundongos de sinais sonoros antes do e após o teste. Camundongos individuais foram colocados na câmara FC (Med Associates Inc.) e foi realizado um período de habituação de 12 min. Após habituação, os camundongos foram colocados de volta nas suas jaulas originais. No dia seguinte (dia de treino), os camundongos individuais foram colocados na câmara e se permitiu que se habituassem durante 4 min. Após outro intervalo de 20 seg (pré-tom), o tom (sinal sonoro) a um nível de 85 dB, 2,8 kHz foi apresentado durante 20 seg seguido por intervalo de atraso de 18 seg antes de o choque ao pé ter sido apresentado (0,5 mA, 2 seg). Após o choque no pé, um intervalo de 40 seg (pós-tom/choque) precede um próximo ensaio idêntico começando com o período pré-tom de 20 seg. O ensaio de treino foi repetido 6 vezes antes de os camundongos serem colocados de volta nas suas jaulas originais. Ao dia 3 (dia de teste), os camundongos foram primeiramente colocados na câmara de contexto de condicionamento durante 3 min. De seguida, os camundongos foram submetidos a ensaios de teste de 4x100 seg começando com um intervalo de 20 seg seguido por intervalo de tom de 20 seg e pós-tom de 60 seg. Finalmente, os camundongos foram colocados em uma câmara de condicionamento de contexto alterado (chão plano vs. grelha, câmara tetramérica vs. heptamérica, aroma de vanilina) e o ensaio de teste foi repetido. O comportamento de congelamento foi registrado e a análise foi realizada cega off-line manualmente e confirmada com software Noldus EthoVision XT (Noldus Information Technology).

[1698] Análise de sequenciação profunda e detecção de indels: A Ferramenta de Desenho CRISPR (disponível no website crispr.mit.edu/) foi usada para encontrar potenciais fora do alvo para genes da família DNMT, visados por CRISPR-Cas9 no cérebro. Núcleos de células visados do giro denteado foram separados por FACS 12 semanas após aplicação viral e o DNA genômico foi purificado como descrito acima. Para cada gene de interesse, a região genômica flanqueando o local alvo de CRISPR foi amplificada por um método de PCR de fusão para anexar os adaptadores Illumina P5 bem como códigos de barras específicos de amostras únicos para os amplicons alvo (para iniciadores no e fora do alvo ver Tabela 4) . As amostras de DNA com códigos de barras e purificadas foram quantificadas por Fluorômetro Qubit 2.0 (Life Technologies) e agrupadas em uma razão equimolar. Bibliotecas de sequenciação foram depois sequenciadas com o Illumina MiSeq Personal Sequencer (Life Technologies), com comprimento de leitura 300 pb. Tabela 4. Iniciadores usados para amplificação de locais genômicos no e fora do alvo

[1699] As leituras MiSeq foram analisadas como previamente descrito em. Brevemente, as leituras foram filtradas por qualidade Phred (pontuação Q) e alinhadas usando um algoritmo de Smith-Waterman para a região genômica 50 nucleotídeos a montante e a jusante do local alvo. Os indels foram estimados na região alinhada de 5 nucleotídeos a montante a 5 nucleotídeos a jusante do local alvo (um total de 30 pb) . Controles negativos para cada amostra foram usados para estimar a inclusão ou exclusão de indels como eventos de corte putativos. Computámos um estimador de probabilidade máxima (MLE) para a fração de leituras tendo regiões alvo com indels verdadeiros, usando a taxa de erros por-região-alvo-por- leitura a partir dos dados da amostra de controle negativo. As pontuações MLE e taxas de corte para cada alvo estão listadas na Tabela 2.

[1700] Análise estatística: Todas as experiências foram realizadas com um mínimo de dois replicados biológicos independentes. A estatística foi realizada com Prism6 (GraphPad) usando teste t de duas caudas de Student.

[1701] Para caracterização adicional de CRISPR no cérebro, os Requerentes testaram os efeitos de toxicidade usando coloração TUNEL para células apoptóticas e histologia padrão (p.ex., coloração com hematoxilina). Para testar a eficácia de modificação de locais múltiplos de modo mais detalhado, os Requerentes separam então células únicas positivas quanto a GFP e analisam a eficácia de modificação por célula usando sequenciação de próxima geração.

[1702] Os Requerentes caracterizam os efeitos do silenciamento de Mecp2 no cérebro com fenótipo fisiológico de células visadas no córtex usando patch clamp in vivo sob microscopia de dois fotões. Para entender os efeitos do silenciamento de Mecp2 no cérebro de adultos, os Requerentes analisam o transcriptoma de células visadas in vivo. Genes candidatos interessantes serão selecionados para estudos de acompanhamento.

[1703] Para purificar/visualizar eficazmente células visadas com ambos os componentes do sistema (Cas9 e sgRNA), os Requerentes construíram uma versão dividida de Cas9 combinada com versão dividida de GFP, que se reconstitui somente quanto ambos os AAV estão na mesma célula. Finalmente, os Requerentes realizam experiências como descrito aqui para alcançar recombinação homóloga em neurônios pós-mitóticos in vitro e in vivo.

Exemplo 37: Mudança genotípica e fenotípica de ApoB vista in vivo com guias e SaCas9 aplicados intravenosamente ao Fígado usando um vetor AAV e um promotor de Cas9 específico do Fígado

[1704] Em este exemplo, inter alia: • AAV2/8 é um vetor adenoviral visando o Fígado; • TBG é um promotor específico do fígado e é usado aqui para conduzir a expressão de SaCas9; • U6 é usado aqui para conduzir a expressão do sgRNA (guia); • ApoB é um gene do metabolismo de lípidos. Se pode dizer que é o “padrão de ouro” na aplicação ao fígado, e é amplamente usado em modelos da obesidade de camundongo. • “Alvo1 até Alvo 4” significa que foram escolhidos 4 alvos dentro de ApoB, dos quais os Alvos 1 e três (T1 e T3) foram os mais úteis; • A aplicação através da expressão através de um vetor viral como visto aqui é uma melhoria em relação ao uso de aplicação hidrodinâmica segundo Anderson/Yin (NBT 2884) como o método de aplicação, porque a aplicação hidrodinâmica requer que vários mLs de fluido sejam injetados, o que é estressante para o corpo de murino e pode ser fatal. A aplicação hidrodinâmica está bem adequada para aplicação de DNA de plasmídeo (nu), ao passo que os Requerentes mostraram que o involucramento das sequências guia e de Cas9 dentro de um vetor de aplicação viral é preferencial em termos de eficácia grandemente aumentada. De fato, somente volumes relativamente pequenos necessitam de ser introduzidos, e isto pode ser feito intravenosamente (i.v.), o que é provável que seja mais aceitável terapeuticamente. • O que foi particularmente encorajante foi que não só foi vista uma mudança genotípica em um gene “padrão de ouro” para o fígado tal como ApoB, mas mudanças fenotípicas foram também registradas. Trabalho prévio com PCSK9 havia mostrado mudanças genotípicas, mas não fenotípicas, logo as mudanças fenotípicas vistas com ApoB validam a plausibilidade da aplicação de CRISPR ao, e a sua capacidade de efetuar mudança fenotípica no, Fígado. Isto é em combinação com o meio mais terapeuticamente aceitável de aplicação (i.v. em comparação com aplicação hidrodinâmica). Como tal, a aplicação viral de CRISPR (guia e Cas9) é preferencial, especialmente intravenosamente. • Os alvos incluem: PCSK9, HMGCR, APOB, LDLR, ANGPTL3, F8, F9/FIX, AAT, FAH, HPD, TAT, ATP7B, UGT1A1, OTC, ARH

[1705] Material e Métodos

[1706] Vírus e Parâmetros de Injeção

[1707] Constructos usados:

[1708] -AAV2/8 - TBG—SaCas9—U6—sgRNA (Apob-Alvol até Alvo 4).

[1709] Teste in vitro: Todos induzirem clivagem do local Apob a eficácia a 10 %-15 % em células Hepa.

[1710] Resultados in vivo:

[1711] Camundongo - 8 semanas, C57BL/6 (2 animais cada momento e com 1 animal como controle de tipo selvagem injetado com salino)

[1712] Injeção na Veia da Cauda:

[1713] Volume de Injeção: 100 ul de 0,8E12 vp/mL (vp = partícula viral)

[1714] Partícula viral aplicada: 0,8E11 vp totais/animal

[1715] Processamento de Tecidos e Coleta de Dados

[1716] O processamento de tecidos e coleta de dados ocorreram como se segue:

[1717] Primeiro momento ~ 1 semana (8 dias). Segundo momento ~ 4 semanas.

[1718] Perfusão com salino seguida por dissecção aguda de tecido do fígado.

[1719] (A) Meio fígado colocado em armazenamento a - 80 °C para análise de proteínas por Surveyor & qPCR & Transferência de Western (X12 tubos/animal).

[1720] (B) Meio fígado colocado em Crioprotetor e congelado instantaneamente para processamento cryostat. As criosseções foram sujeitas a H&E e coloração com Vermelho de Óleo.

[1721] Análises QuickExtract e Surveyor foram usadas para detectar e quantificar indels de 2 pedaços de fígado por animal.

[1722] Resultados

[1723] Avaliação de Indel In vivo

[1724] As figuras mostram avaliação de indel in vivo para a guia de ApoB (alvos) ao longo do tempo (até 4 semanas pós-injeção). A Figura 56A mostra que o guia (alvo) 1 induzir a percentagem mais elevada de indels em ApoB. Os alvos 2 e 4 mostraram pouco ou nenhum efeito, no sentido em que resultaram em formação de indel somente nula ou muito fraca, ao passo que o Alvo 3 mostrou alguma atividade. A Figura 56B mostra os resultados de um ensaio em gel de nuclease Surveyor quanto à eficácia de formação de indel, 4 semanas pós-injeção.

[1725] O alvo 1 pode ser visto como tendo quase 9 % de formação de indel, representando níveis aceitáveis de local alvo.

[1726] Mudança de Fenótipo com 2 dos 4 guias desenhados para visar

[1727] Foram vistas mudanças fenotípicas com dois dos três guias usados (alvos 1 e 3), como visto na Figura 66, que mostra coloração com vermelho de óleo para detectar fenótipo de acúmulo de lípidos hepáticos in vivo após aplicação de AAV- Cas9-sgRNA. As manchas vermelhas de óleo mostradas como se acumulando nas Figura 66 à esquerda, alvos 1 e 3, mostram que ApoB foi desagregado e são comparadas com o controle, fundo à direita. O gene ApoB foi desagregado como resultando de clivagem genômica dirigida induzida por Cas9, dando origem a esta mudança fisiológica/fenotípica. O alvo 2 não mostrou diferença notável em relação ao controle e o alvo 4 não é mostrado. Esta coloração O com vermelho de óleo é um ensaio onde as gorduras no fígado são visualizadas através de coloração histológica. Esta coloração é frequentemente usada em investigação para avaliar a quantidade de gorduras no fígado. Na prática clínica, a coloração O com Vermelho de Óleo é principalmente pedida em seções congeladas de espécimens de biópsia do fígado para avaliar a quantidade de gordura no fígado durante transplante de fígado e outros procedimentos. Para um protocolo e informação sobre este aspecto dos Exemplos é feita menção de: Mehlem et al., “Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease”, Nature Protocols 8, 1149-1154(2013); Maczuga et al., “Therapeutic expression of hairpins targeting apolipoprotein B100 induces phenotypic and transcriptome changes in murine liver”, Gene Therapy (2014) 21, 60-70; Koornneef et al., “Apolipoprotein B Knockdown by AAV-delivered shRNA Lowers Plasma Cholesterol in Mice”, Molecular Therapy (2011) 19 4, 731-740; Tadin-Strapps et al., “siRNA-induced liver ApoB knockdown lowers serum LDL-cholesterol in a mouse model with human-like serum lipids”, Journal of Lipid Research Volume 52, 1084-1097 (2011). A barra de escala na Figura 66 representa 20 mícrons.

Exemplo 38: Experiências de Otimização de SaCas9

[1728] O que se segue foi investigado:

[1729] Otimização do Comprimento de Guias

[1730] Teste de Íntron

[1731] promotor H1

[1732] Teste de nickase dupla D10A

[1733] Teste de Comprimento/DN Adicional

[1734] Teste do Comprimento de Guias de SaCas9: Para se determinarem comprimentos de guias de sgRNA: 20 vs. 21 vs. 22 pb bem como o efeito de um ‘G’ no início (extremidade 5’) do guia. Em esta experiência

[1735] Locais alvo: A1: AAVS1 E1: EMX1 T1, T2, ...: Numeração de locais alvo TGC, GTC, ...: Composição em bases na posição 23, 22, 21 nts a partir da extremidade 5’ de PAM

[1736] A experiência em este Exemplo é realizada por: 1. Selecionar alvos usando NNGRR como PAM dentro de dois genes de interesse, AAVS1 e EMX1. 2. Sintetizar oligos correspondendo aos alvos, mas variar o comprimento da parte das sequências guia dentro do sgRNA de 20, a 21, a 22. 3. Usar os oligos para criar cassete de expressão de sgRNA e cotransfectar em linha celular HEK 293FT com plasmídeos expressando a proteína SaCas9. 4. 72 horas pós-transfecção, as células foram coletadas e depois analisadas por ensaio Surveyor para detectar indels. 5. A frequência de formação de indels induzida por Cas9 foi depois calculada e resumida nas figuras aqui.

[1737] A Figura 67 mostra que 21 nts/pares de bases (pb), representados pelas barras cinza, são o comprimento de espaçador ótimo, pelo menos em comparação com 20 ou 22 pares de bases (representados pelas barras pretas e brancas, respectivamente) ao longo de uma gama de alvos e dentro de dois genes diferentes (AAVS1 e EMX1). Não se pensa que os alvos e genes sejam importantes, são meramente representativos. Como tal parece que 21 nts ou pares de bases são ótimos para bom comprimento, especialmente em ou em relação a SaCas9. A Figura 67 mostra também que um nt G na extremidade 5' da sequência guia / alvo é pode ser vantajoso, p.ex., para o promotor U6. O comprimento de guia ótimo pode ser específico para cada proteína Cas9. Por exemplo, para SpCas9, o comprimento de guia ótimo poderia ser 19-20 nt. Consequentemente, este exemplo demonstra como se pode determinar e usar comprimento de guia ótimo.

[1738] Teste de Íntron

[1739] Esta experiência pretendeu testar se uma sequência guia poderia ser inserida na sequência intrônica de Cas9.

[1740] Foi usado o seguinte constructo. Notar a presença do RNA guia (sgRNA) dentro do íntron (entre os éxons N’ e C’ terminais de Cas9).

[1741] CMV-SaCas9(N-term)-Íntron(sgRNA)-SaCas9(C- term)

[1742] O constructo foi expresso em células Hepa.

[1743] [001924] Cada íntron foi testado com 2 guias diferentes: sgRNA de Pcsk9 e Hmgcr.

[1744] Um total de 9 constructos mostrados: três EBV1, três EBV2 e três ADV: - Linhas 1-3: mostram EBV1-152 (à base de EBV, íntron 1 de 152 pb do genoma de EBV) - Linhas 4-6: mostram EBV2 (à base de EBV, íntron da repetição W do genoma da EBV) - Linhas 7-9: mostram ADV (Íntron à base de adenovírus, origem similar a Kiani et al., “CRISPR transcriptional repression devices and layered circuits in mammalian cells”. Nature Methods doi:10.1038/nmeth.2969 Publicado online 5 de maio de 2014 e Nissim et al., “Multiplexed and Programmable Regulation of Gene Networks with an Integrated RNA and CRISPR/Cas Toolkit in Human Cells ”, Volume 54, Edição 4, p698-710, 22 de maio 2014; DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2014.04.022).

[1745] Dentro de cada grupo de desenhos, os três constructos correspondendo a três locais de inserção diferentes de sgRNA dentro do íntron.

[1746] Desenho de ADV 3

[1747] Os resultados são mostrados na Figura 68. Estes resultados provêm prova de princípio de involucramento bem- sucedida de uma sequência guia em um íntron de SaCas9 é certamente possível. O sgRNA transportando a sequência guia é inserido dentro de um íntron sintético derivado de Adenovírus, e então este cassete íntron-sgRNA inteiro é inserido no gene SaCas9. Os íntrons podem ser inseridos em qualquer lugar dentro do gene SaCas9 sem disrupção significativa da expressão normal da proteína SaCas9. Múltiplos íntrons com sgRNAs podem ser inseridos em diferentes posições dentro do gene SaCas9. O posicionamento é flexível e esta abordagem ampla é vantajosa incluindo nas seguintes duas maneiras:

[1748] A minimização dos locais permite que o número total de pb ou nts no constructo seja reduzido.

[1749] A multiplexação permite graus de multiplexação (coaplicação de múltiplos guias) maiores pois “espaço” é sempre uma questão aqui também. Como os guias não necessitam necessariamente um promotor específico, um ou mais guias podem ser similarmente involucrados em um/no íntron de Cas9.

[1750] O texto anterior usa “um/o” porque o, como discutido acima, um número de íntrons sintéticos pode ser introduzido em Cas9. Pode ser vantajoso inserir o sgRNA em uma posição próxima mas pelo menos 5-15 pb a partir da extremidade 5' do íntron e também antes do ponto de ramificação do intron. Alguma da sequência do espaçador de íntron entre o local dador de processamento 5' e o ponto de ramificação no meio do íntron pode ser eliminada se a pessoa perita assim o desejar. Que isto tenha sido alcançado em uma Cas9, especialmente SaCas9, é surpreendente, incluindo porque a estrutura de sgRNA é diferente entre Sa e Sp.

[1751] Por agora, ADV são preferenciais, mas esta abordagem tem aplicabilidade ampla ao longo de uma gama de vírus e Cas9s (Sa, Sp, etc.).

[1752] Testes de promotores H1

[1753] Esta experiência pretendeu investigar promotores alternativos ao promotor U6.

[1754] A) H1 de comprimento total

[1755] Foram construídos os seguintes constructos:

[1756] CMV-SaCas9 com promotor H1 conduzindo um sgRNA (ou Pcsk9-Alvo201 ou Hmgcr-NovoAlvo5)

[1757] Como pode ser visto na Figura 69, o promotor H1 de comprimento total (barra cinza) é ainda mais fraco do que o promotor U6 (barra preta), pois o U6 mostra percentagem de formação de indels aumentada para cada alvo testado.

[1758] B) Teste de promotores H1 duplos (H1 curto)

[1759] Foram construídos os seguintes constructos:

[1760] TBG-SaCas9 com dois promotores H1 curtos conduzindo dois sgRNAs (Pcsk9-Alvo201 e Hmgcr-NovoAlvo5) simultaneamente com o promotor H1 curto Duplo usado na mesma orientação e em orientações opostas.

[1761] Como pode se visto na Figura 70, o promotor H1 curto é mais fraco do que o H1 de comprimento total.

[1762] Teste de nickase de SaCas9 (usando o mutante D10A)

[1763] Esta experiência olhou para a distância entre as extremidades 5' de duas sequências guia em um constructo e depois mediu esta em relação à eficácia de clivagem da nickase dupla de SaCas9 D10A. Os alvos foram para o gene AAT1 Humano. Estes testes foram feitos com guias de 20 pb + G clonados em plasmídeos.

[1764] Foram mostrados resultados ótimos entre -5 e +1 pb (5’ para 5’), ver Figura 71.

Exemplo 39: Interrogação da função de genes in vivo no cérebro de mamífero usando CRISPR-Cas9

[1765] Este trabalho apresenta os seguintes pontos principais: • Primeira demonstração de aplicação de Cas9 mediada por AAV in vivo bem-sucedida bem como modificação do genoma eficaz em neurônios pós-mitóticos. • Desenvolvimento de uma técnica de marcação nuclear que permite isolamento fácil de núcleos de neurônios de células expressando Cas9 e sgRNA. • Demonstração de aplicação na direção de análise RNAseq de transcriptoma neuronal; • Integração de estudos eletrofisiológicos com perturbação do genoma mediada por Cas9; e • demonstração de direcionamento multiplex e da capacidade de estudar a função de genes no comportamento de roedores usando edição do genoma mediada por Cas9.

[1766] Modelos de animais transgênicos transportando mutações associadas a doenças são enormemente úteis para o estudo de distúrbios neurológicos, ajudando a elucidar o mecanismo genético e patofisiológico de doença1. No entanto, a geração de modelos animais que transportem modificações genéticas únicas ou múltiplas é particularmente intensiva em termos de mão-de-obra e requer melhoramento moroso ao longo de muitas gerações. Portanto, para facilitar a dissecção rápida da função de genes em processos do cérebro normais e relacionados com doença, os Requerentes necessitam da capacidade de manipular precisamente e eficazmente o genoma de neurônios in vivo. Se mostrou que a endonuclase Cas9 associada a CRISPR de Streptococcus pyogenes (SpCas9) medeia clivagem do genoma precisa e eficaz de genes únicos e múltiplos na replicação de células eucarióticas, resultando em mutações de inserção/deleção (indel) de troca de grelha2, 3. Aqui, os Requerentes integram a perturbação do genoma mediada por Cas9 com leituras bioquímicas, de sequenciação, eletrofisiológicas, e comportamentais para estudar a função de genes individuais bem como grupos de genes em processos neurais e seus papéis em distúrbios do cérebro in vivo.

[1767] Discussão

[1768] Vetores virais adenoassociados (AAV) são comummente usados para aplicar genes recombinantes ao cérebro de camundongos4. A principal limitação do sistema AAV é o seu pequeno tamanho de involucramento, tampado a aproximadamente 4,5 kb sem ITRs5, o que limita a quantidade de material genético que pode ser involucrado em um único vetor. Uma vez que o tamanho da SpCas96 é já 4,2 kb, deixando menos do que 0,3 kb para outros elementos genéticos dentro de um único vetor AAV, os Requerentes desenharam um sistema de vetor dual que involucra cassetes de expressão de SpCas9 (AAV-SpCas9) e sgRNA (AAV-SpGuia) em dois vetores virais separados (Figura 72). Enquanto desenhávamos o vetor AAV-SpCas9, os Requerentes compararam vários promotores específicos de neurônios curtos bem como sinais de poliadenilação para otimizar a expressão de SpCas9. Para o desenho final dos Requerentes, os Requerentes escolheram o promotor Mecp2 de camundongo (235 pb, pMecp2)7 e um sinal de poliadenilação mínimo (48 pb, spA)8 com base na sua capacidade de alcançar níveis suficiente de expressão de SpCas9 em neurônios corticais de camundongo primários cultivados (Figura 76-c). Para facilitar a identificação por imunofluorescência de neurônios expressando SpCas9, os Requerentes marcaram SpCas9 com um marcador de epítopo de HA. Para o vetor AAV-SpGuia, os Requerentes involucraram um cassete de expressão de U6-sgRNA bem como a proteína fluorescente verde (GFP) fundida com o domínio transmembranar nuclear KASH9 conduzido pelo promotor de Sinapsina I humano (Figura 72a). A proteína de fusão GFP-KASH dirige a GFP para a membrana nuclear externa (Figura 76c, d) e permite identificação à base de fluorescência e purificação de núcleos neuronais intactos transduzidos por AAV-SpGuia.

[1769] Para testar a eficácia de aplicação do sistema de aplicação de vetor dual dos Requerentes, os Requerentes transduzimos em primeiro lugar neurônios corticais de camundongo primários cultivados in vitro e observámos expressão robusta por AAV-SpCas9 e AAV-SpGuia (Figura 76c), com eficácia de cotransdução maior do que 80 % (Figura 76e). Importantemente, em comparação com neurônios não transduzidos, a expressão de SpCas9 não afetou adversamente a morfologia e taxa de sobrevivência de neurônios transduzidos (Figura 76c,f) .

[1770] Tendo estabelecido um sistema de aplicação eficaz, os Requerentes procuraram de seguida testar a edição do genoma mediada por SpCas9 em neurônios primários de camundongo. Enquanto SpCas9 tem sido usada para alcançar modificações do genoma eficazes em uma variedade de tipos de células em divisão, não é claro se SpCas9 pode ser usada para alcançar eficazmente edição do genoma em neurônios pós- mitóticos. Para o teste inicial dos Requerentes, os Requerentes visaram o gene Mecp2, que desempenha um papel principal na síndrome de Rett10, um tipo de distúrbio do espectro do autismo. A proteína MeCP2 é ubiquamente expressa em neurônios ao longo do cérebro mas está quase ausente em células da glia11, 12 e se mostrou que a sua deficiência está associada a fenótipos morfológicos e eletrofisiológicos graves em neurônios, e se acredita que ambos contribuem para os sintomas neurológicos observados em pacientes com síndrome de Rett13-16. Para visar Mecp2 desenhámos em primeiro lugar vários sgRNAs visando o éxon 3 do gene Mecp2 de camundongo (Figura 77a) e avaliámos a sua eficácia usando células Neuro-2a. O sgRNA mais eficaz foi identificado usando o ensaio de nuclease SURVEYOR (Figura 77b). Os Requerentes escolheram o sgRNA mais eficaz (alvo de Mecp2 5) para experiências de direcionamento de Mecp2 in vitro e in vivo.

[1771] Para avaliar a eficácia de edição do sistema de vetor dual dos Requerentes em neurônios, os Requerentes transduziram neurônios corticais de camundongo primários aos 7 dias in vitro (7 DIV, Figura 78a) e medimos a taxa de indels usando o ensaio de nuclease SURVEYOR 7 dias pós-transdução (Figura 78b). De nota, a cultura de neurônios cotransduzida com AAV-SpCas9 e AAV-SpGuia visando Mecp2 mostrou redução de até 80 % nos níveis de proteína MeCP2 em comparação com neurônios de controle (Figura 78c, d). Uma explicação possível para a discrepância observada entre frequência de indels relativamente baixa (~14 %) e esgotamento de proteína robusta (~80 %) poderia ser que a mera ligação por SpCas9 no local alvo pode interferir com a transcrição, o que foi mostrado em E. coli 17, 18. Os Requerentes investigaram esta possibilidade usando um mutante de SpCas9 com ambos os domínios catalíticos RuvC e HNH inativados19, 20 (D10A e H840A, dSpCas9) . A coexpressão de dSpCas9 e sgRNA visando Mecp2 não reduziu os níveis de proteína MeCP2 (Figura 78a, d), sugerindo que a diminuição reduzida do nível de MeCP2 na presença de SpCas9 ativa é devida à ocorrência de modificação no local Mecp2. Outra explicação possível para a discrepância entre o baixo nível de indel detectado e elevado nível de esgotamento de proteína pode ser devida à subestimação da verdadeira taxa de indel pelo ensaio de nuclease SURVEYOR - se mostrou previamente a precisão de detecção de SURVEYOR é sensível à composição da sequência de indel21.

[1772] Se mostrou previamente que a perda de função de MeCP2 está associada a anormalidades na árvore dendrítica e defeitos na morfogênese da espinha em neurônios14, 16. Estes fenótipos de privação de MeCP2 foram também reproduzidos em neurônios diferenciados a partir de células MeCP-KO iPS15. Portanto, os Requerentes investigaram se o esgotamento de MeCP2 mediado por SpCas9 em neurônios pode similarmente recapitular fenótipos morfológicos da síndrome de Rett. De fato, neurônios coexpressando SpCas9 e sgRNA visando Mecp2 exibiram morfologia da árvore dendrítica e densidade da espinha alteradas quando em comparação com neurônios de controle (Figura 79) . Estes resultados demonstram que SpCas9 pode ser usada para facilitar o estudo de funções de genes em ensaios celulares permitindo silenciamento dirigido em neurônios pós-mitóticas.

[1773] Dada a complexidade do sistema nervoso, que consiste em redes intricadas de tipos de células heterogéneo, ser-se capaz de editar eficazmente o genoma de neurônios in vivo permitiria teste direto da função de genes em tipos de células relevantes embebidos em contextos nativos. Consequentemente, os Requerentes injetaram estereotaxicamente uma mistura (razão de 1:1) de AAV-SpCas9 e AAV-SpGuia de elevado título no giro denteado do hipocampo em camundongos adultos. Os Requerentes observaram elevada eficácia de cotransdução de ambos os vetores (mais do que 80 %) em células do grânulo do hipocampo às 4 semanas após injeção viral (Figura 72b,c) resultando em modificações genômicas do local Mecp2. (Figura 72d). Usando ensaio de nuclease SURVEYOR, os Requerentes detectaram ~13 % de frequência de indels em punções do cérebro obtidas de regiões do cérebro injetadas (Figura 72e) . Similarmente à descoberta dos Requerentes em neurônios primários cultivados, o corte mediado por SpCas9 do local Mecp2 diminuiu eficazmente os níveis de proteína MeCP2 por mais do que 60 % (Fig. 72f) . Adicionalmente, o número de núcleos positivos quanto a MeCP2 no giro denteado diminuiu por mais do que 7 5 % quando injetados com AAV-SpCas9 e AAV-SpGuia em comparação com AAV-SpCas9 sozinho (Figura 72g-h). Estes resultados sugerem que SpCas9 pode ser usada para perturbar diretamente genes específicos dentro de contextos biológicos intactos.

[1774] As perturbações genômicas dirigidas podem ser acopladas com leituras quantitativas para prover conhecimentos sobre a função biológica de elementos genômicos específicos. Para facilitar a análise de células transduzidas com AAV- SpCas9 e AAV-SpGuia, os Requerentes desenvolveram um método de purificar núcleos marcados com GFP-KASH usando separação de células ativada por fluorescência (FACS) (Figura 73a) . Os núcleos separados podem ser diretamente usados para purificar DNA e RNA nuclear para análise bioquímica e de sequenciação a jusante. Usando sequenciação de Sanger, os Requerentes descobriram que 13 de 14 núcleos positivos quanto a GFP continham uma mutação indel no local alvo de sgRNA.

[1775] Adicionalmente à sequenciação de DNA genômico, os núcleos positivos quanto a GFP purificados podem ser também usados para análise de RNAseq para estudar as consequências transcricionais de esgotamento de MeCP2 (Figura 73b e Figura 80). Para testar o efeito do silenciamento de Mecp2 na transcrição de neurônios do giro denteado, os Requerentes prepararam bibliotecas de RNAseq usando núcleos GFP+ purificados por FACS de animais recebendo AAV-SpCas9 bem como ou um sgRNA de controle que foi desenhado para visar o gene lacZ bacteriano e não o genoma de camundongo, ou um sgRNA visando Mecp2. Todos os sgRNAs foram otimizados para minimizar a sua pontuação fora do alvo (Ferramenta de Desenho de CRISPR: http://tools.genome-engineering.org)2. Os Requerentes foram capazes de encontrar genes diferencialmente expressos (Figura 70b) entre núcleos de controle e expressando sgRNA de Mecp2 (p<0,01). Os Requerentes identificaram vários candidatos interessantes entre genes que estavam subregulados nos núcleos expressando sgRNA de Mecp2: Hpca, Olfml, e Ncdn, que se relatou previamente que desempenham papéis importantes em comportamentos de aprendizagem22-24 ; e Cplx2, que se mostrou que está envolvido na liberação da vesicular sináptica e relacionado com taxa de disparo neuronal25, 26 . Estes resultados demonstram que a combinação de perturbação genômica mediada por SpCas9 e análise de RNAseq do nível de população prove um meio de caracterizar regulações transcricionais em neurônios e sugere genes que podem ser importantes para funções neuronais ou processos de doença específicos.

[1776] A edição do genoma in vivo mediada por SpCas9 no cérebro pode ser também acoplada com registro eletrofisiológico para estudar os efeitos de perturbação genômica em tipos de células ou componentes de circuito específicos. Para estudar o efeito funcional do esgotamento de MeCP2 na fisiologia neuronal, os Requerentes coaplicaram estereotaxicamente AAV-SpCas9 e AAV-SpGuia visando Mecp2 na camada superficial do córtex visual primário (V1) de camundongos machos. V1 foi escolhido uma vez que os neurônios de excitação corticais da camada superficial são mais acessíveis a imagiologia de dois fótons e registro visado guiado de dois fótons. Duas semanas após aplicação de SpCas9, os camundongos foram sujeitos a registros justacelular guiados de dois fótons (Figura 74) para comparar a resposta eletrofisiológica de neurônios KASH-GFP+ e neurônios da vizinhança GFP- na camada 2/3 de V1 de camundongo (Figura 72a- c) . Os Requerentes mediram as respostas neuronais a 18 estímulos visuais periódicos espaçotemporais em incrementos de 20 graus e calculámos a taxa de disparo (FR) evocada e índice de seletividade da orientação (OSI) de células por cálculo da média por vetores da resposta. Tanto FR como OSI foram significativamente reduzidas para neurônios com silenciamento de MeCP2, GFP+ de excitação, em comparação com neurônios de excitação GFP- da vizinhança (Figura 73d-e). Em comparação, a expressão de sgRNA de controle em conjunto com SpCas9 não teve qualquer efeito em FR e OSI quando em comparação com neurônios não infetados da vizinhança (Figura 73d-e). Estes resultados mostram que o esgotamento mediado por SpCas9 de MeCP2 em neurônios corticais de V1 de adulto altera as propriedades de resposta visual de neurônios de excitação in vivo no espaço de duas semanas e demonstram adicionalmente a versatilidade de SpCas9 na facilitação do silenciamento de genes dirigido no cérebro de mamíferos in vivo, para estudo de funções de genes e dissecção de circuitos neuronais.

[1777] Uma vantagem-chave do sistema SpCas9 é a sua capacidade de edição do genoma em multiplex2. A introdução de silenciamentos estáveis de múltiplos genes no cérebro de animais vivos terá aplicações potencialmente de longo alcance, tais como interrogação causal de mecanismos multigênicos em afecções fisiológicas e neuropatológicas. Para testar a possibilidade de edição do genoma em multiplex no cérebro, os Requerentes desenharam um vetor de expressão de sgRNA em multiplex consistindo em três sgRNAs em tandem, em conjunto com GFP-KASH para marcação dos núcleos (Figura 74a) . Os Requerentes escolheram sgRNAs visando a família dos genes de DNA metiltransferases (DNMTs), que consiste em Dnmtl, Dnmt3a e Dnmt3b. Dnmtl e 3a são altamente expressos no cérebro de adultos e se mostrou previamente que a atividade de DNMT altera a metilação de DNA e tanto Dnmt3a como Dnmt1 são requeridas para plasticidade sináptica e aprendizagem e formação da memória27. Os Requerentes desenharam sgRNAs individuais contra Dnmt3a e Dnmtl com elevada eficácia de modificação. Para evitar qualquer efeitos compensatórios potenciais por Dnmt3b, os Requerentes decidiram também visar adicionalmente este gene embora seja expresso principalmente durante o neurodesenvolvimento27. Os Requerentes selecionaram finalmente sgRNAs individuais para elevada clivagem de DNA simultânea para todos os três genes visados (Figura 75b e Figura 81).

[1778] Para testar a eficácia da edição do genoma em multiplex in vivo, os Requerentes aplicaram estereotaxicamente uma mistura de AAV-SpCas9 e AAV-SpGuia a elevado título no giro denteado dorsal e ventral de camundongos adultos machos. Após 4 semanas, os hipocampos foram dissecados e os núcleos de células visados foram separados através de FACS. Os Requerentes detectaram frequência de indels de ~19 % (Dnmt3a), 18 % (Dnmtl) e 4 % (Dnmt3b) na população de núcleos separados usando ensaio de nuclease SURVEYOR (Figura 75c) e sequenciação (Figura 82) . O direcionamento de múltiplos locais levanta a questão sobre a taxa de múltiplos silenciamentos eficaz em células individuais. Pelo uso de separação de núcleos únicos combinada com sequenciação dirigida, os Requerentes quantificaram o direcionamento simultâneo de múltiplos locais DNMT em núcleos neuronais individuais (Fig. 75d). Dos núcleos neuronais transportando modificação em pelo menos um local Dnmt, mais do que 70 % de núcleos continham indels em Dnmt3a e Dnmtl (~40 % continham indels em todos os 3 locais, e ~30 % em locais Dnmt3a e Dnmtl). Estes resultados estão de acordo com os níveis de esgotamento da proteína Dnmt3a e Dnmt1 no giro denteado (Figura 75e). Devido à baixa expressão de Dnmt3b no cérebro de adultos, os Requerentes não forom capazes de detectar a proteína Dnmt3b.

[1779] Estudos recentes com SpCas9 têm mostrado que, embora cada base dentro da sequência de sgRNA com 20 nt contribua para a especificidade global, locais genômicos que correspondem parcialmente ao sgRNA podem resultar em formações de quebras de fita dupla fora do alvo e indels28, 29 . Para avaliar a taxa de modificações fora do alvo, os Requerentes identificaram computacionalmente uma lista de locais alvo genômicos altamente similares 2 e quantificámos a taxa de modificações usando sequenciação profunda dirigida. A análise de indels dos locais fora do alvo mais previstos revelou uma taxa de 0-1,6 % de formações de indels demonstrando que a modificação por SpCas9 é específica (Tabela Suplementar 1) . Para aumentar a especificidade da edição do genoma mediado por SpCas9 in vivo, estudos futures podem usar estratégias de minimização fora do alvo tais como nicking duplo30, 31 e sgRNAs truncados28.

[1780] Se mostrou previamente que o silenciamento de Dnmt3a e Dnmt1 impactam a formação de memórias dependente do hipocampo27. Consequentemente, os Requerentes realizaram testes de comportamento de condicionamento do medo contextuais para investigar o efeito do silenciamento triplo mediado por SpCas9 (Dnmt3a, Dnmtl e Dnmt3b) na aquisição e consolidação de memórias. Embora os Requerentes não tenham observado quaisquer diferenças entre camundongos de controle e com silenciamento triplo na fase de aquisição de memórias, os camundongos com silenciamento mostraram consolidação de memórias defeituosa quando testados sob condições de contexto de treino (Figura 75f) . Este efeito foi abolido quando os camundongos foram testados no contexto alterado. Os resultados dos Requerentes demonstram que o silenciamento mediado por CRISPR-Cas9 de membros da família DNMT em neurônios do giro denteado é suficiente para sondar a função de genes em tarefas comportamentais.

[1781] Em conjunto, os resultados dos Requerentes demonstram que a aplicação in vivo mediada por AAV de SpCas9 e sgRNA provê uma tecnologia rápida e poderosa para alcance de perturbações genômicas precisas dentro de circuitos neurais intactos. Ao passo que SpCas9 tem sido amplamente usada para manipular células em divisão, os Requerentes demonstram que SpCas9 pode ser também usada para manipular o genoma de neurônios pós-mitóticos com elevada eficácia através da geração de indels mediada por NHEJ. As perturbações genômicas mediadas por SpCas9 podem ser combinadas análise bioquímica, de sequenciação, eletrofisiológica, e comportamental para estudar a função do elemento genômico visado. Os Requerentes demonstraram que o direcionamento mediado por SpCas9 de genes únicos ou múltiplos consegue recapitular fenótipos morfológicos, eletrofisiológicos, e comportamentais observados usando modelos de camundongo genéticos mais morosos, clássicos. O estudo corrente empregou a Cas9 de Streptococcus pyogenes, que não só necessita do uso de dois vetores AAV mas também limita o tamanho de elementos promotores podem ser usados para alcançar direcionamento específico do tipo de células. Dada a diversidade de ortólogos de Cas9, com alguns sendo substancialmente mais curtos que SpCas92, 32, 33, deve ser possível manipular vetores AAV únicos expressando tanto Cas9 como sgRNAs, como descrito aqui.

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[1816] Métodos

[1817] Constructos de DNA

[1818] Para a seleção de alvos de SpCas9 e geração de RNA de guia único (sgRNA), as sequências alvo de 20 nt foram selecionadas para precederem uma sequência de PAM 5'-NGG. Para minimizar os efeitos fora do alvo, a ferramenta de desenho de CRISPR foi usado (http://tools.genome-engineering.org). O sgRNA foi amplificado por PCR usando promotor U6 como um molde com iniciador direto: 5’-CGCACGCGTAATTCGAACGCTGACGTCATC-3’ e iniciador reverse contendo o sgRNA com local alvo de DNA com 20 nt (Negrito)

[1819] 5’- CACACGCGTAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACG GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC GGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3’. (SEQ ID NO: )

[1820] A sequência de sgRNA de controle foi desenhada para visar o gene lacZ de E. coli:

[1821] sequência alvo: TGCGAATACGCCCACGCGATGGG (SEQ ID NO: ) .

[1822] O constructo de EGFP-KASH1 foi uma oferta generosa do Prof. Worman (Columbia University, CNI) e foi usado como molde de PCR para clonagem do cassete de expressão na estrutura principal de AAV sob o promotor de Sinapsina de humano (hSyn). De seguida, a sequência de codificação de U6- Mecp2sgRNA foi introduzida usando local MluI. Para a estratégia de direcionamento de genes em multiplex, sgRNAs individuais foram amplificados por PCR como descrito acima. Todos os três sgRNAs foram ligados com cassete hSyn-GFP-KASH- bGHpA amplificado por PCR ver Figura 4A) por uso da estratégia de clonagem Golden Gate. Após amplificação por PCR, o produto de ligação Golden Gate contendo 3 sgRNAs e hSyn-GFP-KASH-bGH pA foi clonado na estrutura principal de AAV. Todos os constructos obtidos foram verificados quanto à sequência. De modo a encontrar a sequência do promotor ótima para conduzir a expressão de SpCas9 em neurônios, os Requerentes testaram: sequências de promotor de hSynl, Mecp2 truncado de camundongo (pMecp2), e Maplb truncado de rato (pMap1b)2 (ver Figura Suplementar 1A) . Foram usados os seguintes iniciadores para amplificar regiões do promotor:

[1823] hSyn_F: 5’-GTGTCTAGACTGCAGAGGGCCCTG-3’; (SEQ ID NO: )

[1824] hSyn_R: 5’-GTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGTCGAGAA-3’; (SEQ ID NO: )

[1825] Mecp2_F 5’-GAGAAGCTTAGCTGAATGGGGTCCGCCTC-3’; (SEQ ID NO: )

[1826] Mecp2_R 5’-CTCACCGGTGCGCGCAACCGATGCCGGGACC-3’; (SEQ ID NO: )

[1827] Map1b-283/-58_F 5’- GAGAAGCTTGGCGAAATGATTTGCTGCAGATG-3’; (SEQ ID NO: )

[1828] Map1b-283/-58_R 5’- CTCACCGGTGCGCGCGTCGCCTCCCCCTCCGC-3’. (SEQ ID NO: )

[1829] Outra truncação do promotor de map1b de rato foi montada com os seguintes oligos:

[1830] 5‘- AGCTTCGCGCCGGGAGGAGGGGGGACGCAGTGGGCGGAGCGGAGACAGC ACCTTCGGAGATAATCCTTTCTCCTGCCGCAGAGCAGAGGAGCGGCGGGAGAGGAACACT TCTCCCAGGCTTTAGCAGAGCCGGA-3’ e

[1831] 5’- CCGGTCCGGCTCTGCTAAAGCCTGGGAGAAGTGTTCCTCTCCCGCCGCTC CTCTGCTCTGCGGCAGGAGAAAGGATTATCTCCGAAGGTGCTGTCTCCGCTCCGCCCACT GCGTCCCCCCTCCTCCCGGCGCGA-3’. (SEQ ID NO: )

[1832] O sinal de poliadenilação sintético curto (spA)3 foi montado usando os seguintes oligos:

[1833] 5’- AATTCAATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTG TGTGC-3 (SEQ ID NO: ) e

[1834] 5’

[1835] GGCCGCACACAAAAAACCAACACACAGATCTAATGAAAATAAAGAT CTTTTATTG-3’. (SEQ ID NO: )

[1836] SpCas9 e a sua versão mutante D10A (dSpCas9) foram previamente descritas4, 5. O plasmídeo codificando proteína fluorescente vermelha (mCherry) sob controle do promotor EF1α foi usado para transfecção de neurônios com Lipofectamine®2000 (Life Technologies).

[1837] Culturas de linhas celulares e transfecção

[1838] Células Neuro-2a (N2a) foram cultivadas em DMEM contendo soro fetal de bovino (BSA) a 5 %. Para células HEK293FT foi usado DMEM contendo soro fetal de bovino (FBS) a 10 %. As células foram mantidas a 37 °C em atmosfera de CO2 a 5 %. As células foram transfectadas usando Lipofectamine®2000 ou reagente Polietilenimina (PEI) “MAX” (Polysciences), de acordo com o protocolo do fabricante.

[1839] Produção de vetores AAV concentrados

[1840] Partículas de AAV1/2 de elevado título foram produzidas usando plasmídeos de serotipo AAV1 e AAV2 a razões iguais e plasmídeo ajudante pDF6 e purificadas em coluna de afinidade de heparina6. A titulação de partículas virais foi feita por qPCR. Partículas de AAV1 de elevado título foram produzidas pelos Serviços Nucleares de Vetores da UNC (University of North Carolina em Chapel Hill). Partículas de AAV1 a baixo título em DMEM foram produzidas como previamente descrito7. Brevemente, células HEK293FT foram transfectadas com plasmídeo de transgene, plasmídeo de serotipo pAAV1 e plasmídeo ajudante pDF6 usando PEI “MAX”. O meio de cultura foi coletado após 48 h e filtrado através de um filtro de PVDF de 0,45μm (Millipore) .

[1841] Cultura de neurônios corticais primários

[1842] Os animais usados para se obterem neurônios para culturas de tecidos foram sacrificados de acordo com o protocolo aprovado pelo Comité em Cuidado Animal do MIT (MIT CAC). Culturas primárias foram preparadas a partir de cérebros de camundongos embriônicos ao dia 168. Foram usados embriões de ambos os sexos. As células foram plaqueadas em placas de 24 poços revestidos por poli-D-lisina (PDL) (BD Biosciences) ou lâminas revestidas por laminina/PDL (VWR). As culturas foram cultivadas a 37 °C e CO2 a 5 % em meio Neurobasal, suplementadas com B27, Glutamax (Life Technologies) e mistura de penicilina/estreptomicina.

[1843] Para transdução de AAV, neurônios corticais em 500 μL de meio de cultura Neurobasal foram incubados a 7 DIV com 300 μL (infecção dupla a razão 1:1) de meio condicionado contendo AAV1 de células HEK293FT7. Uma semana após transdução, os neurônios foram coletados para processamento a jusante ou fixos em paraformaldeído a 4 % para colorações imunofluorescentes e análise de morfologia.

[1844] Para visualização da morfologia neuronal, as células a DIV7 foram transfectadas com vetor de expressão EF1α- mCherry usando Lipofectamine®2000 (Life Technologies) durante uma semana como previamente descrito9. Para medição do comprimento de dendritos total, todos os dendritos de neurônios individuais foram rastreados usando software ImageJ. A quantificação do número de dendritos primários, pontas dendríticas e a análise de Sholl10 foram realizadas em imagens adquiridas com microscópio fluorescente a uma objetiva de 40x (microscópio Zeiss AxioCam Ax10, câmara Axiocam MRm). Para o número de dendritos foram contadas as extremidades de todas as protusões não axonais maiores do que 10 μm. Para a análise de Sholl, círculos concêntricos com passo de 5 μm em diâmetro foram automaticamente desenhados em torno do corpo celular, e o número de dendritos atravessando cada círculo foi contado usando software ImageJ com um plug-in Sholl.

[1845] Injeção estereotáxica de AAV1/2 no cérebro de camundongos

[1846] O MIT CAC aprovou todos os procedimentos em animais descritos aqui. Os camundongos C57BL/6N macho adultos (idade de 12-16 semanas) foram anestesiados por injeção intraperitoneal (i.p.) de Cetamina a 100 mg/kg e Xilazina a 10 mg/kg. Foi dada analgesia preemptiva (Buprenex, 1 mg/kg, i.p.). Foi realizada craniotomia de acordo com procedimentos aprovados e 1 μL de mistura de AAV 1:1 (1x1013 Vg/mL de sMecp2- SpCas9; 6x1012 Vg/mL de DNMT 3xsgRNA; 3-5x1012 Vg/mL de hSyn- GFP-KASH) foi injetado em: giro denteado dorsal (anterior/posterior: -1,7; médiolateral: 0,6; dorsal/ventral: -2,15) e/ou giro denteado ventral (anterior/posterior: -3,52; médiolateral: 2,65; dorsal/ventral: -3). Para experiências de registros de eletrofisiologia in vivo (Fig. 74), as coordenadas de injeção de vírus foram 3 mm lateral (da Bregma) e 1 mm anterior a partir da sutura posterior. O crânio foi diluído usando uma broca da Dremel com resfriamento ocasional com salino, e a dura restante foi perfurada usando uma micropipeta de vidro cheia com o vírus suspenso em óleo mineral. Várias injeções (3-4) foram feitas em locais da vizinhança, a uma profundidade de 200-250 μm. Um volume de 150-200 nL de mistura de vírus foi injetado a taxa de 75 nL/min em cada local. Após cada injeção, a pipeta foi mantida no lugar durante 3-5 minutos antes da retração para prevenir fuga. A incisão foi suturada e analgésicos pós-operativos apropriados (Meloxicam, 1-2 mg/kg) foram administrados durante três dias após cirurgia.

[1847] Registros de loose patch dirigido guiado de dois fótons in vivo

[1848] Duas semanas após injeção de vírus, os camundongos foram usados para experiências de eletrofisiologia. Os camundongos foram anestesiados com isoflurano a 2 % e mantidos usando isoflurano a 0,8 %. A pele foi excisada, limpa com sugi e uma placa de cabeça de metal foi anexada ao crânio usando cola e acrílico dentário, e uma craniotomia de 2 mm x 2 mm foi realizada sobre o córtex visual primário (V1). A área exposta foi depois coberta com uma camada fina de agarose a 1,5 % em fluido cerebroespinhal artificial (aCSF; NaCl a 140 mM, KCl a 5 mM, CaCl2 a 2 mM, MgCl2 a 1 mM, EDTA a 0,01 mM, HEPES a 10 mM, glucose a 10 mM; pH 7,4). A temperatura corporal do animal foi mantidas durante a experiência a 37,5 °C com uma manta de aquecimento.

[1849] Pipetas de borossilicato (WPI) foram puxadas usando um puxador a laser Sutter P-2000 (Sutter Instruments). O diâmetro da ponta era em torno de 1 μm enquanto a resistência era entre 3-5 MQ. Foram feitos registros usando software customizado (Network Prism, Sur lab), escrito em Matlab (MathWorks), controlando um amplificador MultiClamp 700B (Axon). Um elétrodo de pipeta de vidro foi inserido no cérebro a um ângulo de 20-35° e um pélete de eletródo triturado de Ag/AgCl (Warner Instruments) foi posicionado na mesma solução do cérebro e da objetiva. Para visualização fluorescente, as pipetas foram cheias com Alexa Fluor 594 (Molecular Probes). A pipeta foi primeiramente dirigida para o local de injeção usando uma lente 10x, e depois dirigida para células GFP+ individuais usando uma lente 25x através de imagiologia de dois fótons simultânea a 770 nm. A proximidade das células foi detectada através de defleções na resistência observadas no fixador de tensão durante um pulso de voltage de comando de 5 mV rapidamente variável com o tempo. Logo que a resistência aumentou por 5-10 MQ, o amplificador foi trocado para fixador de corrente, e os disparos foram registrados com corrente injetada zero, sob um filtro Bessel de 4 kHz e um filtro AC de 300 Hz. Os cérebros injetados com vírus foram perfundidos post hoc e imunohistoquímica foi realizada.

[1850] Estimulação visual e análise de dados de registros de loose patch dirigido guiado de dois fótons in vivo

[1851] Para avaliar a seletividade da orientação e afinação de neurônios editados pelo genoma, os Requerentes apresentaram estímulos orientados usando software customizado escrito em Matlab PsychToolbox-3. Os estímulos foram otimizados por incremento da orientação a partir de 0-360 graus em incrementos de 20 graus, com cada apresentação de estímulo sendo precedida durante 4 segundos “desligado” seguido por 4 segundos “ligado”, para uma duração de apresentação total de 144 segundos.

[1852] Os dados foram diretamente adquiridos no Matlab e guardados como ficheiros .mat. A detecção dos disparos foi realizada através de rotinas de análise que usaram limiares manualmente definidos seguidos por correspondência ao molde de forma dos disparos para verificação adicional. Cada disparo foi marcado e exibido no ecrã em uma interface de usuário gráfica após o que foi manualmente revisto quanto a falsos positives e negatives pelo experimentador. Os tempos de disparo em resposta a todos os estímulos foram depois agrupados em períodos “ligados” ou “desligados” com base na sua ocorrência em relação à estimulação visual, e os disparos ligados” para cada estímulo foram subtraídos ao número de disparos “desligados” observados durante um período de tempo igual. Para experiências de orientação,, # disparos por estímulo = (# disparos “ligados”) ligados” e “desligados” tiveram a mesma duração.

[1853] Para cada célula de interesse, os métodos foram usados para coletar respostas para cada estímulo orientado (0 a 360 graus, em incrementos de 20 graus). Estas respostas foram depois transformadas em uma “curva de afinação” de orientação vs. resposta para cada ensaio. O Índice de Seletividade da Orientação (OSI) foi calculado tomando a média por vetores para a orientação preferencial de acordo com a fórmula como se segue:

[1854]

[1855] Preparação de tecidos e purificação de núcleos de células

[1856] O hipocampo total ou giro denteado foi rapidamente dissecado em DPBS gelado (Life Sciences) e congelado em gelo seco. Para a purificação dos núcleos de células, o tecido foi gentilmente homogeneizado em 2 mL de tampão de homogeneização (HB) gelado (Sacarose a 320 mM, CaCl a 5 mM, Mg(Ac)2 a 3 mM, Tris a 10 mM pH 7,8, EDTA a 0,1 mM, NP40 a 0,1 %, PMSF a 0,1 mM, beta-mercaptoetanol a 1 mM) usando 2 mL de homogeneizador Dounce (Sigma); 25 vezes com pilão A, seguido por 25 vezes com pilão B. De seguida, 3 mL de HB foram adicionados a 5 mL total e mantidos em gelo durante 5 min. Para centrifugação de gradiente, 5 mL de meio de gradiente da densidade OptiPrepTM a 50 % (Sigma) contendo CaCl a 5 mM, Mg(Ac)2 a 3 mM, Tris a 10 mM pH 7,8, PMSF a 0,1 mM, beta- mercaptoetanol a 1 mM foram adicionados e misturados. O lisato foi gentilmente carregado no topo de 10 mL de solução OptiPrepTM iso-osmolar a 29 % em um tubo centrífuga de 30 mL cônico (Beckman Coulter, rotor SW28). As amostras foram centrifugadas a 10.100 xg (7.500 rpm) durante 30 min a 4 °C. O sobrenadante foi removido e o pélete de núcleos foi gentilmente ressuspenso em beta-glicerofosfato a 65 mM (pH 7,0), MgCl2 a 2 mM, KCl a 25 mM, sacarose a 340 mM e glycerol a 5 %. O número e qualidade de núcleos purificados foram controlados usando microscopia de campo brilhante.

[1857] Separação de núcleos de células

[1858] Os núcleos intactos positivos (GFP+) e negativos (GFP-) quanto a GFP foram comarcados com Vybrant® DyeCycle™ Ruby Stain (1:500, Life Technologies) e separados usando BD FACSAria III (Koch Institute Flow Cytometry Core, MIT). Os núcleos GFP+ e GFP- foram coletados em tubos Eppendorf de 1,5 mL revestidos com BSA a 1 % e contendo 400 μL de tempão de ressuspensão (beta-glicerofosfato a 65 mM pH 7,0, MgCl2 a2 mM, KCl a 25 mM, sacarose a 340 mM e glycerol a 5 %). Após separação, todas as amostras foram mantidas em gelo e centrifugadas a 10.000 xg durante 20 min a 4 °C. Os péletes de núcleos foram armazenados a -80 °C ou foram diretamente usados para processamento a jusante.

[1859] Extração de DNA genômico e ensaio SURVEYOR™

[1860] Para teste funcional de sgRNA, células N2a confluentes a 50-70 % foram cotransfectadas com um único sgRNA amplificado por PCR e vetor SpCas9. As células transfectadas com SpCas9 serviram somente como controle negativo. As células foram coletadas 48 h após transfecção, e DNA foi extraído usando DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. Para isolar DNA genômico de neurônios primários transduzidos com AAV1, foi usado o DNeasy Blood & Tissue Kit 7 dias pós-transdução de AAV, de acordo com a instrução do fabricante.

[1861] Os Núcleos Separados Ou Tecidos Dissecados Foram Lisados Em Tampão De Lise (Tris A 10 Mm, Ph 8,0, Nacl A 10 Mm, Edta E 10 Mm, Sds A 0,5 Mm, Proteinase K (Pk, 1 Mg/Ml) E Rnase A) A 55 °c Durante 30 Min. De Seguida Foi Realizada Extração Com Clorofórmio-fenol Seguida Por Precipitação Do Dna Com Etanol, De Acordo Com Procedimentos Padrão. O Dna Foi Finalmente Ressuspenso Em Tampão Te (Tris A 10 Mm Ph 8,0, Edta A 0,1 Mm) E Usado Para Análise A Jusante. O Teste Funcional De Sgrnas Individuais Foi Realizado Por Ensaio De Nuclease Surveyor™ (Transgenomics) Usando Iniciadores De Pcr Listados Na Tabela Suplermentar 2. A Quantificação Da Intensidade Das Bandas Foi Realizada Como Descrito Antes11.

[1862] Preparação e sequenciação de bibliotecas de RNA

[1863] Duas semanas após aplicação viral bilateral de SpCas9 com guia visando Mecp2 (4 animais) ou SpCas9 com gRNA visando lacZ (4 animais), o giro denteado foi rapidamente dissecado em DPBS gelado (Life Sciences) e transferido imediatamente para solução RNA-later (Ambion). Após 24 horas em 4 °C, o tecido foi movido para -80 °C. As populações de 100 núcleos neuronais visados foram separados por FACS em 10 μL de tampão TCL suplementado com 2-mercaptoetanol a 1 % (Qiagen). Após centrifugação, as amostras foram imediatamente congeladas a -80 °C. O RNA foi purificado por esférulas AMPure RNAcleanXP SPRI (Beckman Coulter Genomics) seguindo as instruções do fabricante, e lavado três vezes com etanol a 80 %, omitindo a eluição final. As esférulas com RNA capturado foram secas ao ar e processadas imediatamente quanto a síntese de cDNA. Amostras sem núcleos foram usadas como controles negativos. Três amostras de populações foram usadas para cada animal, total de 24 amostras de populações, em preparações de bibliotecas de cDNA seguindo o protocolo SMART-seq212 substituindo somente a enzima transcriptase reversa por 0,1 uL de enzima Maxima H Minus (200 U/uL, Thermo Scientific), e escalonamento para baixo a reação de PCR até um volume de 25 uL. A reação de tagmentação e amplificação de PCR final foram feitas usando o Nextera XT DNA Sample preparation kit (Illumina), com as seguintes modificações. Todos os volumes de reação foram escalonados para baixo por um fator de 4, e as bibliotecas foram agrupadas após o passo de amplificação por PCR tomando 2,5 uL de cada amostra. As bibliotecas agrupadas foram limpas e selecionadas com base no tamanho usando duas rondas de 0,7 volume de AMPure XP SPRI bead cleanup (Beckman Coulter Genomics). As amostras foram carregadas em um chip High-Sensitivity DNA (Agilent) para checar a qualidade da biblioteca, enquanto a quantificação foi feita com Qubit High-Sensitivity DNA kit (Invitrogen). As bibliotecas agrupadas foram diluídas até uma concentração final de 4 nM e 12 pmol e foram sequenciadas usando Illumina Miseq com leituras com extremidades emparelhadas de 75 pb.

[1864] Análise dos dados das bibliotecas de RNA

[1865] Foi criado o índice Bowtie2 com base no genoma mm9 UCSC de camundongo e transcriptoma de Genes conhecido13, e leituras com extremidades emparelhadas foram alinhadas diretamente com este índice usando Bowtie2 com opções de comando -q --phred33-quals -n 2 -e 99999999 -l 25 -I 1 -X 1000 -a -m 200 -p 4 --chunkmbs 512. De seguida, RSEM v1.27 foi operado com parâmetros padrão nos alinhamentos criados por Bowtie2 para estimar os níveis de expressão. As estimativas da expressão do nível dos genes por RSEM (tau) foram multiplicadas por 1.000.000 para se obterem estimativas de transcrito por milhão (TPM) para cada gene, e as estimativas de TPM foram transformadas em log-space tomando log2(TPM+1). Os gene foram considerados detectados se o seu nível de expressão transformado igual a ou acima de 2 (em escala de log2(TPM+1)). Uma biblioteca é descartada se tiver menos do que 8000 genes detectados. Com base em este critério, 4 bibliotecas foram filtradas e excluídas da análise a jusante. Para encontrar genes diferencialmente expressos entre animais de controle e animais expressando sgRNA de Mecp2, teste t de Student (Matlab V2013b) e validação cruzada foram usados em 20 operações de permutação aleatória, onde, em cada operação, se escolheu aleatoriamente uma biblioteca de cada animal para se excluir (isto resulta em um total de 12 bibliotecas usadas no teste t de cada vez). O teste t foi operado em todos os genes que tivessem nível de expressão médio acima de 0,9 quantil (usualmente em torno de 5 log2(TPM+1)) para cada amostra. Depois, os genes que eram significativos (p<0,01) em mais do que um terço das operações de permutação foram escolhidos. Os níveis de expressão log2(TPM+1) destes genes ao longo d amostras foram agrupados usando agrupamento hierárquico (Matlab V2013b).

[1866] Coloração imunofluorescente

[1867] Cultura de células: Para coloração imunofluorescente de neurônios primários, as células foram fixas 7 dias após aplicação viral com paraformaldeído (PFA) a 4 % durante 20 à RT. Após lavagem 3 vezes com PBS, as células foram bloqueadas com soro de cabra normal (NGS) a 5 % (Life Technologies), soro de burro (DS) a 5 % (Sigma) e Triton-X100 a 0,1 % (Sigma) em PBS durante 30 min à RT. As células foram incubadas com anticorpos primários em NGS a 2,5 %, DS a 2,5 % e Triton-X100 a 0,1 % durante 1 hora à RT ou durante a noite a 4 °C. Após lavagem 3 vezes com PBST, as células foram incubadas com anticorpos secundários durante 1 hora à RT. Finalmente, lâminas foram montadas usando VECTASHIELD HardSet Mounting Medium com DAPI (Vector Laboratories) e visualizadas usando um microscópio Zeiss AxioCam Ax10 e uma câmara Axiocam MRm. As imagens foram processadas usando o software Zen 2012 (Zeiss). As quantificações foram realizadas por uso do software ImageJ 1.48 h e plug-in detector de Neurônios.

[1868] Os camundongos foram sacrificados 4 semanas após aplicação viral por uma dose letal de Cetamina/Xilazina e perfundidos transcardiacamente com PBS seguido por PFA. O tecido fixo foi secionado usando vibratome (Leica, VT1000S). De seguida, seções de 30 μm foram fervidas durante 2 min em tampão citrato de sódio (citrato trissódico desidratado a 10 mM, Tween20 a 0,05 %, pH 6,0) e resfriadas até à RT durante 20 min. As seções foram bloqueadas com soro de cabra normal (NGS) a 4 % em TBST (NaCl a 137 mM, Tris a 20 mM pH 7,6, Tween- 20 a 0,2 %) durante 1 hora. Seções com parafina foram cortadas usando um micrótomo (Leica RM2125 RTS) até 8 μm, e coradas como previamente descrito14. [002049] As seções foram incubadas com anticorpos primários diluídos em TBST com NGS a 4 % a 4 °C. Após 3 lavagens em TBST, as amostras foram incubadas com anticorpos secundários. Após lavagem com TBST 3 vezes, as seções foram montadas usando VECTASHIELD HardSet Mounting Medium com DAPI e visualizadas com microscópio confocal (Zeiss LSM 710, Ax10 ImagerZ2, Software Zen 2012).

[1869] Foram usados os seguintes anticorpos primários: anti-Dnmt3a de coelho (Santa Cruz, 1:100); anti-MeCP2 de coelho (Millipore, 1:200); anti-NeuN de camundongo (Millipore, 1:50-1:400); anti-GFAP de galinha (Abcam, 1:400); anti-Map2 de camundongo (Sigma, 1:500); anti-GFP de galinha (Aves labs, 1:200-1:400); anti-HA de camundongo (Cell Signaling, 1:100). Anticorpos secundários: AlexaFluor®488, 568 ou 633 (Life Technologies, 1:500-1:1.000).

[1870] Quantificação de ensaio LIVE/DEAD®

[1871] Neurônios primários de controle e transduzidos foram corados usando o ensaio LIVE/DEAD® (Life technologies) de acordo com a instrução do fabricante. Para evitar interferência com o sinal de GFP da expressão de GFP-KASH, as células foram coradas para DEAD (homodímero de etídio) e DAPI (todas as células) somente. As células coradas foram visualizadas usando microscopia de fluorescência e as células positivas quanto a DEAD, GFP e DAPI foram contadas por uso de software ImageJ 1.48h e plug-in detector de Neurônios.

[1872] Análise de transferência de Western

[1873] Os neurônios corticais primários transduzidos (24 poços, 7 dias após aplicação viral) e amostras de tecido transduzido (4 semanas após aplicação viral) foram lisados em 50 μL de tampão RIPA gelado (Cell Signaling) contendo SDS a 01 % e inibidores de protease (Roche, Sigma). Os lisatos de células foram sonicados durante 5 min em um sonicador Bioruptor (Diagenode) e a concentração de proteína foi determinada usando o BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, Inc.). Os lisatos de proteína foram dissolvidos em tampão de amostra de SDS-PAGE, separados sob condições redutoras em géis de Tris- HCl a 4-15 % (Bio-Rad) e analisados por transferência de Western usando anticorpos primários: anti-Dnmt3a de coelho (Santa Cruz, 1:500), anti-Dnmt1 de camundongo (Novus Biologicals, 1:800), anti-Mecp2 de coelho (Millipore, 1:400), anti-Tubulina de Coelho (Cell Signaling, 1:10,000) seguido por anticorpos para HRP anticamundongo e anticoelho secundários (Sigma-Aldrich, 1:10.000). GAPDH foi diretamente visualizado com anticorpo anti-GAPDH acoplado a HRP de Coelho (Cell Signaling, 1:10.000). Tubulina ou GAPDH serviu como controle de carga. As transferências foram visualizadas com sistema ChemiDoc™ MP com software ImageLab 4.1 (BioRad), e quantificadas usando software ImageJ 1.48h.

[1874] Condicionamento de Medo Contextual Atrasado (DCFC)

[1875] 8 semanas após aplicação bilateral de SpCas9/DNMT 3xsgRNA ao giro denteado dorsal e ventral de camundongos C57BL/6N machos com 12 semanas de idade, os animais estavam habituados ao experimentador e à câmara de comportamento durante 7 dias. Filhotes injetados com SpCas9/GFP-KASH serviram como controles. Ao dia 1 de DCFC, as jaulas de camundongos foram colocadas em uma antecâmara isolada para prevenir camundongos de sinais sonoros antes e após teste. Camundongos individuais foram colocados na câmara FC (Med Associates Inc.) e foi realizado um período de habituação de 12 min. Após habituação, os camundongos foram colocados de volta nas suas jaulas originais. No dia seguinte (dia de treino), os camundongos individuais foram colocados na câmara e se permitiu que se habituassem durante 4 min. Após outro intervalo de 20 seg (pré-tom), o tom (sinal sonoro) a um nível de 85 dB, 2,8 kHz foi apresentado durante 20 seg seguido por intervalo de atraso de 18 seg antes de o choque ao pé ter sido apresentado (0,5 mA, 2 seg). Após o choque no pé, um intervalo de 40 seg (pós-tom/choque) precede um próximo ensaio idêntico começando com o período pré-tom de 20 seg. O ensaio de treino foi repetido 6 vezes antes de os camundongos serem colocados de volta nas suas jaulas originais. Ao dia 3 (dia de teste), os camundongos foram primeiramente colocados na câmara de contexto de condicionamento durante 3 min. De seguida, os camundongos foram submetidos a ensaios de teste de 4x100 seg começando com um intervalo de 20 seg seguido por intervalo de tom de 20 seg e pós-tom de 60 seg. Finalmente, os camundongos foram colocados em uma câmara de condicionamento de contexto alterado (chão plano vs. grelha, câmara tetramérica vs. heptamérica, aroma de vanilina) e o ensaio de teste foi repetido. O comportamento de congelamento foi registrado e a análise foi realizada cega off-line manualmente e confirmada com software Noldus EthoVision XT (Noldus Information Technology).

[1876] Análise de sequenciação profunda e detecção de indels

[1877] A Ferramenta de Desenho CRISPR (http://crispr.mit.edu/) foi usada para encontrar potenciais fora do alvo para genes da família DNMT, visados por CRISPR- SpCas9 no cérebro. Núcleos de células visados do giro denteado foram separados por FACS 12 semanas após aplicação viral e o DNA genômico foi purificado como descrito acima. Para cada gene de interesse, a região genômica flanqueando o local alvo de CRISPR foi amplificada por uma método de PCR de fusão para anexar os adaptadores Illumina P5 bem como códigos de barras específicos de amostras únicos para os amplicons alvo (para iniciadores no e fora do alvo ver Tabela Suplementar 3)15. As amostras de DNA com códigos de barras e purificadas foram quantificadas por Fluorômetro Qubit 2.0 (Life Technologies) e agrupadas em uma razão equimolar. Bibliotecas de sequenciação foram depois sequenciadas com o Illumina MiSeq Personal Sequencer (Life Technologies), com comprimento de leitura 300 pb.

[1878] As leituras MiSeq foram analisadas como previamente descrito em15. Brevemente, as leituras foram filtradas por qualidade Phred (pontuação Q) e alinhadas usando um algoritmo de Smith-Waterman para a região genômica 50 nucleotídeos a montante e a jusante do local alvo. Os indels foram estimados na região alinhada de 5 nucleotídeos a montante a 5 nucleotídeos a jusante do local alvo (um total de 30 pb). Controles negativos para cada amostra foram usados para estimar a inclusão ou exclusão de indels como eventos de corte putativos. Os Requerentes computaram um estimador de probabilidade máxima (MLE) para a fração de leituras tendo regiões alvo com indels verdadeiros, usando a taxa de erros por-região-alvo-por-leitura a partir dos dados da amostra de controle negativo. As pontuações MLE e taxas de corte para cada alvo estão listadas na Tabela Suplementar 1.

[1879] Análise estatística

[1880] Todas as experiências foram realizadas com um mínimo de dois replicados biológicos independentes. A estatística foi realizada com Prism6 (GraphPad) usando teste t de duas caudas de Student.

[1881] Tabela Suplementar 1. Análise fora do alvo para direcionamento de DNMTs

[1882] Tabela Suplementar 2. Iniciadores de PCR usados no ensaio SURVEYOR

[1883] Tabela Supl ementar 3. Iniciadores usados para amplificação de locais genômicos no e fora do alvo

[1884] REFERÊNCIAS

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Exemplo 40: Investigação Adicional sobre Técnica de Marcação Nuclear

[1901] Este Exemplo 38 diz respeito à marcação de epítopo de Cas9. Em resumo, os Requerentes descobriram que um marcador de epítopo triplo (especificamente 3xHA) melhora o sinal de detecção.

[1902] Materiais e Métodos

[1903] Cultura de células e transfecção

[1904] A linha celular de rim embriônico humano (HEK) 293FT (Life Technologies) ou linha celular Hepa1-6 de camundongo (Sigma-Aldrich) foi mantidas em Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro fetal de bovino a 10 % (HyClone), GlutaMAX a 2 mM (Life Technologies), penicilina a 100 U/mL, e estreptomicina a 100 μg/mL a 37 °C com incubação de CO2 a 5 %.

[1905] As células foram inoculadas em placas de 24 poços (Corning) a uma densidade de 120.000 células/poço, 24 horas antes da transfecção. As células foram transfectadas usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) a confluência a 80-90 % seguindo o protocolo recomendado do fabricante. Um total de 500 ng de plasmídeo de Cas9 e 100 ng de produto de PCR U6-sgRNA foi transfectado.

Ensaio de nuclease SURVEYOR para modificação do genoma

[1906] Células 293FT e HUES62 foram transfectadas com DNA como descrito acima. As células foram incubadas a 37 °C durante 72 horas pós-transfecção antes da extração de DNA genômico. O DNA genômico foi extraído usando a Solução de Extração de DNA QuickExtract (Epicentre) seguindo o protocolo do fabricante. Brevemente, células peletizadas foram ressuspensas em solução QuickExtract e incubadas a 65 °C durante 15 minutos, 68 °C durante 15 minutos, e 98 °C durante 10 minutos.

[1907] A região genômica flanqueando o local alvo de CRISPR para cada gene foi amplificada por PCR, e os produtos foram purificados usando Coluna QiaQuick Spin (Qiagen) seguindo o protocolo do fabricante. 400 ng totais dos produtos de PCR purificados foram misturados com 2 microlitros de tampão 10X Taq DNA Polymerase PCR (Enzymatics) e água ultrapura até um volume final de 20 microlitros, e sujeitos a um processo de re-emparelhamento para permitir formação de heterodúplexes: 95 °C durante 10 min, 95 °C a 85 °C rampa a - 2 °C/s, 85 °C a 25 °C a - 0,25 °C/s, e 25 °C mantido durante 1 minuto. Após re-emparelhamento, os produtos foram tratados com nuclease SURVEYOR e intensificador S de SURVEYOR (Transgenomics) seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante, e analisados em géis de poliacrilamida Novex TBE a 420 % (Life Technologies). Os géis foram colorados com coloração SYBR Gold DNA (Life Technologies) durante 30 minutos e visualizados com um sistema de visualização em gel Gel Doc (Bio-rad). A quantificação foi baseada em intensidades de banda relativas. A percentagem de indels foi determinada pela fórmula, 100 x (1 - (1 - (b + c) / (a + b + c))1/2), onde a é a intensidade integrada do produto de PCR não digerido, e b e c são as intensidades integradas de cada produto de clivagem.

[1908] Transferência de Western

[1909] Células HEK 293FT foram transfectadas e lisadas em tampão 1X RIPA (Sigma-Aldrich) suplementado com Inibidor de Protease (Roche). Os lisatos foram carregados em Géis Bolt 4-12% Bis-Tris Plus (Invitrogen) e transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas em salino tamponado com Tris contendo Tween-20 a 0,1 % e agente de bloqueio a 5 % (G-Biosciences). As membranas foram sondadas com anti-FLAG de coelho (1:5.000, Abcam), anti-GAPDH conjugado com HRP (1:5.000 Cell Signaling Technology), e anticorpos anticoelho (1:1.000) conjugados com HRP e visualizados com um Sistema Gel Doc XR+ (Bio-Rad).

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[1995] Embora formas de realização preferenciais da presente invenção tenham sido mostradas e descritas aqui será óbvio àqueles peritos na técnica que tais formas de realização são providas a título de exemplo somente. Numerosas variações, mudanças, e substituições ocorrerão agora àqueles peritos na técnica sem se afastar da invenção. Deve ser entendido que várias alternativas às formas de realização da invenção descritas aqui podem ser empregues na prática da invenção.

Claims

1. Vetor viral que contém molécula(s) de ácido nucleico heterólogo e resulta em expressão in vivo em uma célula de mamífero da(s) molécula(s) de ácido nucleico heterólogo, caracterizado pelo fato de que a(s) molécula(s) de ácido nucleico heterólogo codifica(m) uma Cas9 e um ou mais guias de sistema CRISPR-Cas, em que pelo menos um dos guias tem como alvo uma sequência de DNA na célula eucariótica, e depois de expressão in vivo na célula eucariótica, a Cas9 e o um ou mais guias formam um ou mais complexos CRISPR-Cas, em que o complexo CRISPR-Cas compreende a Cas9 complexada com a guia, e em que o referido vetor viral é um vetor de vírus adenoassociado (AAV) selecionado de um grupo que compreende: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAV1/2 e AAV2/8.

2. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos guias de sistema compreende(m): (a) uma sequência guia que hibrida à sequência alvo, (b) uma sequência tracr mate, e (c) uma sequência tracr, (d) em que (a), (b) e (c) são organizados em uma orientação 5'a 3'.

3. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que há formação indel a partir da edição maior que 20%.

4. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o vetor viral compreende dois ou mais guias de sistema.

5. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos guias de sistema compreende(m) um RNA quimérico (chiRNA).

6. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que um único vetor viral compreende molécula(s) de ácido nucleico heterólogo codificando uma Cas9 e um ou mais guias de sistema CRISPR-Cas.

7. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a expressão da sequência guia está sob o controle do promotor T7 e é dirigida pela expressão de T7 polimerase.

8. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a Cas9 é do gênero Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma ou Campylobacter.

9. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a Cas9 compreende SpCas9, SaCas9, ou CjCas9.

10. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a Cas9 é uma nuclease direcionadora de clivagem de ambas as fitas na localização da sequência alvo.

11. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a Cas9 compreende uma ou mais mutações.

12. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a Cas9 é uma nickase direcionadora de clivagem na localização da sequência alvo.

13. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a sequência codificadora de Cas9 compreende pelo menos um ou mais sequências de localização nuclear (NLS).

14. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a Cas9 tem uma ou mais mutações em um domínio catalítico, em que a Cas9 adicionalmente compreende um domínio funcional.

15. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a sequência alvo de DNA está associada à condição ou defeito de uma célula neural.

16. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a sequência alvo de DNA está associada à condição ou defeito de uma célula muscular, uma condição ou defeito de uma célula pulmonar, uma condição ou defeito de uma célula pancreática, uma condição ou defeito de uma célula epitelial, condição ou defeito de uma célula do olho, uma condição ou defeito de uma célula hepática.

17. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a condição ou defeito de uma célula muscular é uma célula muscular cardíaca ou Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), a condição ou defeito de uma célula pulmonar é fibrose cística, a condição ou defeito de uma célula do olho é Amaurose Congenital de Leber (LCA) ou Síndrome de Usher, a condição ou defeito de uma célula hepática é doença de armazenamento de glicogênio.

18. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um vetor viral conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.

19. Uso de um vetor viral conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que é para preparar uma composição para expressar ao menos uma molécula de ácido nucléico heterólogo em uma célula de mamífero.

20. Método de preparo do vetor viral conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende transfectar plasmídeo(s) compreendendo ou consistindo essencialmente de molécula(s) de ácido nucleico codificando o vírus em células do vírus, e fornecendo vírus rep e/ou cap e/ou moléculas auxiliares de ácido nucleico obrigatórias para replicação e empacotamento do vírus.

21. Método de modificação de uma célula ou organismo por manipulação de uma sequência alvo em um local genômico de interesse compreendendo distribuição para a célula ou organismo de um vetor viral que contém molécula(s) de ácido nucleico heterólogo e resulta em expressão in vivo em uma célula de mamífero da(s) molécula(s) de ácido nucleico heterólogo, caracterizado pelo fato de que a(s) molécula(s) de ácido nucleico heterólogo codifica(m) uma Cas9 e um ou mais guias de sistema CRISPR-Cas, em que pelo menos um dos guias tem como alvo uma sequência de DNA na célula eucariótica, e depois de expressão in vivo na célula eucariótica, a Cas9 e um ou mais guias formam um ou mais complexos CRISPR-Cas, em que o complexo CRISPR-Cas compreende a Cas9 complexada com a guia, (a) em que o vetor viral compreende AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAV1/2, AAV2/8, ou um vetor de lentivírus baseado em vírus de imunodeficiência Humana (HIV), vírus de anemia infecciosa Equina (EIAV), ou vírus de imunodeficiência Símia (SIV); (b) pelo qual a sequência alvo no local genômico de interesse é modificada; em que o método é realizado in vitro ou ex vivo.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos guias de sistema compreende: (a) uma sequência guia que hibrida à sequência alvo, (b) uma sequência tracr mate, e (c) uma sequência tracr, (d) em que (a), (b) e (c) são organizados em uma orientação 5'a 3'.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos guias de sistema compreende(m) um RNA quimérico (chiRNA).

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizado pelo fato de que a expressão da sequência guia está sob o controle do promotor T7 e é direcionado pela expressão de T7 polimerase.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 24, caracterizado pelo fato de que a Cas9 é do gênero Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma ou Campylobacter.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, caracterizado pelo fato de que a Cas9 compreende SpCas9, SaCas9, ou CjCas9.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26, caracterizado pelo fato de que inclui induzir expressão.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 27, caraterizado pelo fato de que um ou mais dos vetores virais são distribuídos via transdução.