ES2767318T3 - Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para generar modelos y actuar sobre enfermedades y trastornos de células posmitóticas - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende un sistema CRISPR-Cas para su uso en el tratamiento de un trastorno celular posmitótico seleccionado de la Tabla A o Tabla B; donde dicho sistema CRISPR-Cas comprende una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de ubicación nuclear; una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula eucariota posmitótica; una secuencia pareja de tracr; y una secuencia tracr; o uno o más polinucleótidos que codifican dicha enzima CRISPR, dicha secuencia guía, dicha secuencia pareja de tracr, y dicha secuencia tracr.

Description

DESCRIPCIÓN
Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para generar modelos y actuar sobre enfermedades y trastornos de células posmitóticas
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere en general al suministro, modificación, optimización y aplicaciones terapéuticas de sistemas, métodos y composiciones utilizados para el control de la expresión génica donde se utiliza la modificación dirigida de secuencias, tal como perturbación genómica o edición de genes, que se refieren a las repeticiones palindrómicas cortas espaciadas entre sí regularmente y agrupadas (CRISPR, por sus siglas en inglés) y sus componentes. En particular, la presente invención se refiere a aspectos relacionados con el suministro a células posmitóticas, incluidas sin carácter limitante las del cerebro o riñón, para la terapia génica de afecciones en dichas células, comprensión de la función génica en dichas células y creación de modelos que comprenden dichas células. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los recientes avances en las técnicas de secuenciación genómica y métodos de análisis han acelerado de manera significativa la capacidad de clasificar y cartografiar los factores genéticos asociados con una amplia gama de enfermedades y funciones biológicas. Se necesitan tecnologías de modificación genómica dirigida precisas que posibiliten la ingeniería inversa sistemática de variaciones genéticas causales permitiendo perturbaciones selectivas de elementos genéticos individuales, así como también para obtener progresos en las aplicaciones médicas, biotecnológicas y en la biología sintética. Aunque se dispone de técnicas de edición genómicas tales como los dedos de zinc de diseño, efectores de tipo activadores de la transcripción (TALE, por sus siglas en inglés) o meganucleasas de asentamiento para producir perturbaciones genómicas dirigidas, se siguen necesitando tecnologías de modificación genómica nuevas que sean económicas, fáciles de instalar, que se puedan escalar y susceptibles de tener como dianas múltiples posiciones dentro del genoma eucariótico.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
El sistema CRISPR-Cas no requiere la generación de proteínas a medida que tengan como diana secuencias específicas sino que en su lugar una única enzima Cas pueda ser programada por una molécula corta de ARN para reconocer un ADN diana específico. Añadir el sistema CRISPR-Cas al repertorio de técnicas de secuenciación genómica y métodos de análisis podrán simplificar significativamente la metodología y acelerar la capacidad de clasificar y cartografiar los factores genéticos asociados con una amplia gama de enfermedades y funciones biológicas. Para utilizar el sistema CRISPR-Cas de manera eficaz para la edición genómica sin efectos perniciosos, es crucial comprender los aspectos de la modificación, optimización y suministro específico para el tipo celular/tejido/órganos de estas herramientas de modificación genómica, que son aspectos de la invención reivindicada.
Se necesitan de manera apremiante sistemas y técnicas alternativos y robustos para la modificación dirigida de secuencias nucleicas con una amplia gama de aplicaciones. Los aspectos de esta invención abordan esta necesidad y proporcionan ventajas relacionadas. Un complejo CRISPR ilustrativo comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada con una secuencia diana dentro del polinucleótido diana. La secuencia guía se une a una secuencia pareja de tracr, que a su vez se hibrida con una secuencia tracr.
En un aspecto, la divulgación proporciona métodos para utilizar uno o más elementos de un sistema CRISPR-Cas. El complejo CRISPR de la invención proporciona un medio eficaz para modificar un polinucleótido diana. El complejo CRISPR de la invención tiene una amplia variedad de utilidades que incluyen modificar (p. ej., eliminar, insertar, traslocar, inactivar, activar) un polinucleótido diana en una multiplicidad de tipos celulares en diversos tejidos y órganos. En este sentido, el complejo CRISPR de la invención tiene un amplio espectro de aplicaciones en, p. ej., edición génica o genómica, terapia génica, descubrimiento de fármacos, cribado de fármacos, diagnóstico de enfermedades y pronóstico. Se contemplan los usos in vivo, in vitro y ex vivo.
Los aspectos de la invención se refieren a enzimas Cas9 que tienen una especificidad de direccionamiento a células posmitóticas mejorada en un sistema CRISPR-Cas9 que tiene ARN guías que tienen una actividad óptima, tienen una longitud menor que las enzimas Cas9 no modificadas y las moléculas de ácido nucleico que las codifican y que las enzimas Cas9 quiméricas, así como también métodos para mejorar la especificidad respecto a la diana de una enzima Cas9 o para diseñar un sistema CRISPR-Cas9 que comprenden diseñar o preparar ARN guías que tienen una actividad óptima y/o seleccionar o preparar una enzima Cas9 que tiene un tamaño o una longitud menores que la Cas9 no modificada, donde el empaquetamiento de un ácido nucleico que la codifica en un vector de suministro avanza en mayor grado ya que hay menos materia codificante en el vector de suministro que para una Cas9 no modificada, y/o generar enzimas Cas9 quiméricas.
También se proporcionan usos en medicina para las secuencias, vectores, enzimas o sistemas presentes. También se proporcionan usos de estos en la edición génica o genómica. Esto se relaciona con células o tejidos con células posmitóticas.
En un aspecto adicional de la invención, la enzima Cas9 podrá comprender una o más mutaciones y se podrá utilizar como una proteína de unión a ADN genérico con o sin fusión a un dominio funcional. Las mutaciones podrán ser mutaciones introducidas artificialmente o mutaciones de ganancia o pérdida funcional. Las mutaciones podrán incluir, sin carácter limitante, mutaciones en uno de los dominios catalíticos (D10 y H840) de los dominios catalíticos RuvC y HNH, respectivamente. Se han caracterizado mutaciones adicionales. En un aspecto de la invención, el dominio de activación transcripcional podrá ser VP64. En otros aspectos de la invención, el dominio represor transcripcional podrá ser KRAB o SID4X. Otros aspectos de la invención se refieren a la fusión de la enzima Cas 9 mutada con dominios que incluyen, sin carácter limitante, un represor, activador transcripcional, una recombinasa, una transposasa, un remodelador de histonas, una desmetilasa, una ADN metil-transferasa, un criptocromo, un dominio inducible/controlable lumínicamente o un dominio inducible/controlable químicamente.
En una realización adicional, la divulgación proporciona métodos para generar un tracrARN mutante y secuencias repetidas directas o secuencias guía quiméricas mutantes que permitan mejorar el comportamiento de estos ARN en las células. Los aspectos de la divulgación también proporcionan una manera de seleccionar dichas secuencias. Los aspectos de la divulgación también proporcionan métodos para simplificar la clonación y suministro de los componentes del complejo CRISPR. En una realización preferida de la divulgación, se amplifica un promotor adecuado, tal como el promotor U6, con un oligo ADN y se añade al ARN guía. El producto de la PCR resultante se puede utilizar a continuación para transfectar células con el fin de impulsar la expresión del ARN guía. Los aspectos de la divulgación también se refieren a transcribir in vitro el ARN guía o encargarlo a una compañía de síntesis y transfectarlo directamente.
En un aspecto, la divulgación proporciona métodos para mejorar la actividad utilizando una polimerasa más activa. En una realización preferida, la expresión de los ARN guía controlados por el promotor T7 está impulsada por la expresión de la polimerasa T7 en la célula. En una realización conveniente, la célula es una célula eucariota. En una realización preferida, la célula eucariota es una célula humana. En una realización más preferida, la célula humana es una célula específica de un paciente.
En un aspecto, la divulgación proporciona métodos para reducir la toxicidad de las enzimas Cas. En ciertos aspectos, la enzima Cas es cualquier Cas9 según se ha descrito en la presente, por ejemplo, cualquier Cas9 bacteriana de origen natural así como también cualesquiera quimeras, mutantes, homólogos u ortólogos. En una realización preferida, la Cas9 se suministra en el interior de la célula en forma de un ARNm. Esto permite la expresión transitoria de la enzima y la reducción de esta manera de la toxicidad. En otra realización preferida, la divulgación también proporciona métodos para expresar Cas9 mediante el control de un promotor inducible y los constructos utilizados en ella.
En otro aspecto, la divulgación proporciona métodos para mejorar las aplicaciones in vivo del sistema CRISPR-Cas. En la realización preferida, la enzima Cas es Cas9 natural o cualquiera de las versiones modificadas descritas en la presente, que incluyen cualquier Cas9 bacteriana de origen natural así como también cualesquiera quimeras, mutantes, homólogos u ortólogos. Un aspecto conveniente de la invención proporciona la selección de homólogos de Cas9 que se empaquetan fácilmente en vectores víricos para el suministro. Los ortólogos de Cas9 normalmente compartirán la organización general de 3-4 dominios RuvC y un dominio HNH. El dominio RuvC más cercano al extremo 5' escinde la hebra no complementaria y el dominio HNH escinde la hebra complementaria. Todas las notaciones hacen referencia a la secuencia guía.
El residuo catalítico en el dominio RuvC 5’ se identifica mediante comparación de la homología de la Cas9 de interés con otros ortólogos de Cas9 (del locus de CRISPR de tipo II de S. pyogenes, locus 1 de CRISPR de S. thermophilus, locus 3 de CRISPR de S. thermophilus y locus de CRISPR de tipo II de Franciscilla novicida) y el residuo de Asp conservado (D10) se muta en alanina para convertir Cas9 en una enzima que practica cortes monocatenarios (nicking enzyme) en la hebra complementaria. De manera similar, los residuos de His y Asn conservados en los dominios h Nh se mutan en alanina para convertir Cas9 en una enzima que practica cortes monocatenarios en la hebra no complementaria. En algunas realizaciones, se pueden realizar ambos conjuntos de mutaciones para convertir Cas9 en una enzima que no escinda.
En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima CRISPR de tipo I o III, preferentemente una enzima CRISPR de tipo II. Esta enzima CRISPR de tipo II podrá ser cualquier enzima Cas. Una enzima Cas preferida se podrá identificar como Cas9 ya que esto se puede referir a la clase general de enzimas que comparten homología con la nucleasa más grande con dominios de tipo nucleasa múltiples del sistema CRISPR de tipo II. Más preferentemente, la enzima Cas9 procede de spCas9 o saCas9 o se puede obtener a partir de estas. Con "se puede obtener a partir de" los solicitantes se refieren a que la enzima obtenida a partir de otra se basa en gran medida en una enzima natural, en el sentido que tiene un grado elevado de homología secuencial con ella, pero que se ha mutado (modificado) de alguna manera descrita en la presente.
Se apreciará que las expresiones enzima CRISPR y Cas se utilizan, en general, indistintamente en la presente a menos que lo contrario sea evidente. Tal y como se ha mencionado anteriormente, muchas de las numeraciones de residuos utilizadas en la presente se refieren a la enzima Cas9 del locus CRISPR de tipo II de Streptococcus pyogenes. Sin embargo, se apreciará que está invención incluye muchas más Cas9 de otras especies de microbios tales como SpCas9, SaCas9, St1Cas9 y así sucesivamente. En la presente se proporcionan ejemplos adicionales. El experto será capaz de determinar los residuos correspondientes apropiados en enzimas Cas9 que no sean SpCas9 comparando las secuencias de aminoácidos relevantes. Por lo tanto, donde se hace referencia a un reemplazo de aminoácidos específico utilizando la numeración de SpCas9 entonces, a menos que el contexto haga evidente que no se pretende que haga referencia a otras enzimas Cas9, la divulgación pretende abarcar las modificaciones correspondientes en otras enzimas Cas9. SaCas9 es particularmente ventajosa.
En la presente se proporciona un ejemplo de una secuencia con codones optimizados, en este caso optimizada para seres humanos (es decir, que se está optimizando para la expresión en seres humanos), remítase a la secuencia optimizada para los codones humanos de SaCas9. Aunque se prefiere esto, se apreciará que son posibles otros ejemplos y existe constancia de la optimización de codones para una especie hospedadora.
En realizaciones adicionales, la divulgación proporciona métodos para mejorar la función de Cas9 generando proteínas Cas9 quiméricas. Las proteínas Cas9 quiméricas Cas9s quiméricas podrán ser nuevas Cas9 que contengan fragmentos procedentes de más de una Cas9 de origen natural. Estos métodos podrán comprender fusionar fragmentos N-terminales de un homólogo de Cas9 con fragmentos C-terminales de otro homólogo de Cas9. Estos métodos también permiten la selección de nuevas propiedades mostradas por las proteínas Cas9 quiméricas. Se apreciará que en los presentes métodos, cuando el organismo es un animal o una planta, la modificación podrá ocurrir ex vivo o in vitro, por ejemplo, en un cultivo celular y en algunos casos no in vivo. En otras realizaciones, podrá ocurrir in vivo.
En un aspecto, la invención proporciona un método para modificar un organismo o un organismo no humano manipulando una secuencia diana en un locus genómico de interés que comprende:
suministrar una composición de origen no natural o modificada que comprende:
(A) - I. una secuencia polinucteótida de ARN, opcionalmente una secuencia polinucleotídica de ARN quimérico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, donde la secuencia polinucleotídica comprende:
(a) una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula eucariota,
(b) una secuencia pareja de tracr, y
(c) una secuencia tracr, y
II. una secuencia polinucleotídica que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de ubicación nuclear,
donde (a), (b) y (c) se disponen en una orientación de 5' a 3',
donde, cuando se transcriben, la secuencia pareja de tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica respecto a la secuencia de un complejo CRISPR con la secuencia diana, y
donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia pareja de tracr que se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia polionucleotídica que codifica una enzima CRISPR es ADN o ARN,
o
(B) I. polinucleótidos que comprenden:
(a) una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula eucariota, y
(b) al menos una o más secuencias pareja de tracr,
II. una secuencia polinucleotídica que codifica una enzima CRISPR, y
III. una secuencia polinucleotídica que comprende una secuencia tracr,
donde, cuando se transcriben, la secuencia pareja de tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica respecto a la secuencia de un complejo CRISPR con la secuencia diana, y
donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia pareja de tracr que se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia polionucleotídica que codifica una enzima CRISPR es ADN o ARN.
Lo siguiente se aplica igualmente a todos los aspectos de la invención. La secuencia diana es, más preferentemente, una secuencia diana de células posmitóticas. Donde pueda mencionarse el hígado en la presente, se sobreentenderá que es una referencia a las células posmitóticas en general, especialmente las células de riñón o cerebro. Las células posmitóticas podrán estar o proceder (es decir, la fuente de las células o el tipo celular) de cualquiera de los siguientes órganos o podrán ser organoides o modelos ex vivo o colecciones de células que comprenden células de:
Riñón, tal como las células glomerulares;
Sistema digestivo incluido el estómago, páncreas, duodeno, íleon y/o colon;
Corazón;
Pulmón;
Cerebro, en particular neuronas y/o SNC en general;
Ojo, incluido el tejido retiniano;
Oído, incluido el oído interno;
Piel;
Músculo;
Hueso; y/o
Hígado en general, aunque se excluye en algunas realizaciones ya que es también el objeto de una solicitud independiente.
Se prefieren particularmente el cerebro y el riñón. En algunas realizaciones, la célula es una célula cerebral tal como una neurona. En algunas realizaciones la célula es una célula renal.
Las células renales preferidas incluyen una o más de una cualesquiera de:
Célula parietal glomerular renal;
Podocito glomerular renal;
Célula del borde en cepillo del túbulo proximal renal;
Célula del segmento delgado del asa de Henle;
Célula de la rama gruesa ascendente;
Célula del túbulo distal renal;
Célula del conducto colector renal; y
Células renales intersticiales.
Se proporcionan ejemplos preferidos de las dianas en el riñón en la tabla posterior en la sección titulada riñón, así como también en la Tabla B. Se prefiere una o más de una cualesquiera de estas dianas. Los Ejemplos 1 y 18 también tienen como diana células renales (aunque células madre, que no son células posmitóticas), no obstante podrá ser aplicable el contenido referente al suministro.
En algunas realizaciones particularmente preferidas, la manipulación provoca un cambio fenotípico en la célula. En algunas realizaciones, el cambio fenotípico se podrá provocar o mantener en la célula in vivo. La célula se transfecta in vivo o se extrae, se transfecta ex vivo y posteriormente se reinserta (trasplanta) de nuevo en el mismo hospedador o en otro diferente.
La expresión de la enzima CRISPR, y opcionalmente la secuencia guía, podrá estar controlada por un promotor específico de la célula posmitótica, por ejemplo, comprendido dentro de un casete de expresión capaz de expresar la enzima y la guía opcional en dicha célula posmitótica. Dicho de otra manera, la enzima CRISPR, y opcionalmente la secuencia guía, está/están ligada(s) operablemente a dicho promotor específico de la célula posmitótica. Se prefieren especialmente los sistemas vectoriales de AAV, especialemnte cuando la célula posmitótica es una neurona.
El promotor para la enzima CRISPR y el promotor opcional para la secuencia guía podrán ser el mismo o diferentes. Lo siguiente también se aplica a cualquier método, uso o composición descritos en la presente. El ARN del sistema CRISPR-Cas podrá ser un ARN quimérico (ARNqui). El sistema CRISPR-Cas podrá ser un sistema enzimático CRISPR múltiple que además comprenda múltiples quimeras y/o múltiples secuencias multiguía y una secuencia tracr única. La enzima CRISPR podrá ser una nucleasa que dirija la escisión de ambas hebras a la ubicación de la secuencia diana. La enzima CRISPR podrá comprender una o más mutaciones. La enzima CRISPR podrá comprender una o más mutaciones D10a , E762A, H840A, N854A, N863A o D986A. La mutación o mutaciones podrán estar en un dominio RuvC1 de la enzima CRISPR. La enzima CRISPR podrá ser una nickasa que dirija la escisión a la ubicación de la secuencia diana. La nickasa podrá ser una nickasa doble. Se prefieren al menos dos o más NLS.
La enzima CRISPR podrá ser de tipo II, preferentemente una Cas y más preferentemente una Cas9. Se sobreentenderá que la referencia a Cas o Cas9 (por ejemplo en CRISPR-Cas o CRISPR Cas9) engloba cualquier Cas, más preferentemente Cas9 y particularmente Sa o SpCas9 (que engloba todas las mutaciones tales como D10A para proporcionar una función DSB, nickasa o nickasa dual).
La enzima CRISPR podrá tener una o más mutaciones en un dominio catalítico donde, cuando se transcriben, la secuencia pareja de tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica respecto a la secuencia de un complejo CRISPR con la secuencia diana, y donde la enzima comprende además un dominio funcional. El dominio funcional podrá ser un dominio de activación transcripcional. El dominio de activación transcripcional podrá ser VP64.
Los métodos podrán comprender además minimizar las modificaciones fuera de la diana manipulando una primera y una segunda secuencias diana en hebras opuestas de un ADN bicatenario en un locus genómico de interés en una célula que comprende
suministrar una composición que no tiene origen natural o modificada que comprende:
I. una secuencia polinucleotídica de ARN quimérico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, donde la secuencia polinucleotídica comprende:
(a) una primera secuencia guía capaz de hibridarse con la primera secuencia diana,
(b) una primera secuencia pareja de tracr,
(c) una primera secuencia tracr,
(d) una segunda secuencia guía capaz de hibridarse con la segunda secuencia diana,
(e) una segunda secuencia pareja de tracr, y
(f) una segunda secuencia tracr, y
opcionalmente, donde una secuencia conectora está presente entre la primera secuencia tracr y la segunda secuencia guía, y de esta manera la primera secuencia guía y la segunda secuencia guía están en tándem;
y
II. una secuencia polinucleotídica que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de ubicación nuclear, donde (a), (b), (c), (d), (e) y (f) se disponen en una orientación de 5’ a 3’, donde la secuencia polinucleotídica comprende una secuencia conectora entre la primera secuencia tracr y la segunda secuencia guía, y de esta manera la primera secuencia guía y la segunda secuencia guía están en tándem y donde, cuando se transcriben, la primera y la segunda secuencias pareja de tracr se hibridan con la primera y la segunda secuencias tracr, respectivamente, y la primera y la segunda secuencias guías dirigen la unión específica respecto a la secuencia de un primer y un segundo complejos CRISPR con la primera y segunda secuencias diana respectivamente,
o
II. un segundo elemento regulador ligado operablemente a una secuencia codificante de enzimas que codifica una enzima CRISPR, y donde los componentes I y II están ubicados en el mismo vector o en vectores diferentes del sistema y, cuando se transcriben, una primera secuencia pareja de tracr se hibrida con una primera secuencia tracr y la primera y la segunda secuencias guía dirigen la unión específica respecto a la secuencia de un primer y un segundo complejos CRISPR con la primera y la segunda secuencias diana, respectivamente;
donde el primer complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la primera secuencia guía que se hibrida con la primera secuencia diana, y (2) la primera secuencia pareja de tracr que se hibrida con la primera secuencia tracr,
donde el segundo complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la segunda secuencia guía que se hibrida con la segunda secuencia diana, y (2) la segunda secuencia pareja de tracr que se hibrida con la segunda secuencia tracr,
donde la secuencia polinucleotídica que codifica una enzima CRISPR es ADN o ARN, y
donde la primera secuencia guía dirige la escisión de una hebra del ADN bicatenario cerca de la primera secuencia diana y la segunda secuencia guía dirige la escisión de otra hebra cerca de la segunda secuencia diana e inducen una rotura bicatenaria, y de esta manera modifican el organismo o el organismo no humano minimizando las modificaciones fuera de la diana.
En algunas realizaciones, se prefiere la segunda alternativa (B) anterior. Sin embargo, se prefiere particularmente la primera alternativa (A). Esto se aplica a todos los aspectos de la invención que presentan las dos estrategias CRISPR alternativas.
Se comprenderá que la presente solicitud se refiere a células posmitóticas, ya sea a un órgano per se o a un tejido dentro de él o simplemente a una o células posmitóticas, tales como neuronas. Se prefieren las células renales y neuronas. Las células posmitóticas podrán estar comprendidas en un animal vertebrado, ya sea un paciente (en el sentido de un animal que necesite la terapia génica dirigida por CRISPR) o un organismo modelo, o podrán estar en un cultivo celular, un organoide u otro tejido ex vivo, tal como un “hígado en una matriz”, por ejemplo, donde los hepatocitos se siembran sobre un esqueleto y se cultivan. Los hepatocitos recolectados a partir de órganos no trasplantados también son una diana útil. Con la aplicación en biología de las técnicas de impresión en 3-D desarrolladas, los tejidos impresos están al alcance de la mano y es totalmente factible que las células o tejidos hepáticos impresos de esta manera para crear un organoide o sobre una matriz también puedan escogerse como diana. También se contemplan alternativas no hepáticas, particularmente para tejidos renales y otras células/tejidos posmitóticos.
Por lo tanto, se proporciona un organismo modelo que comprende células posmitóticas, tales como neuronas o células renales, a las cuales se ha suministrado el presente sistema CRISPR-Cas. Igualmente, también se proporciona una colección ex vivo de dos o más células posmitóticas, tales como neuronas o células renales, a las cuales se ha suministrado el presente sistema CRISPR-Cas. Tales colecciones podrán incluir órganos, organoides, células que pueblan un esqueleto posmitóticos (“riñón en una matriz”). También se proporcionan métodos para crear tales modelos o colecciones.
En particular, tales células posmitóticas podrán expresar una enzima Cas o comprender polinucleótidos capaces de expresarla. Tal y como se discute en la presente, esto presenta la ventaja de proporcionar un modelo listo para investigar la función génica mediante la perturbación génica, incluida la atenuación génica. Esto es particularmente útil para estudiar afecciones de las células posmitóticas, tales como el riñón o cerebro, tales como las enumeradas en la presente, así como también afecciones más amplias tales como la obesidad.
En la presente también se proporcionan métodos para investigar la función génica de células posmitóticas. Estos comprenden normalmente suministrar a las células posmitóticas, ya sea in o ex vivo, el sistema CRISPR-Cas. Sin embargo, si las células ya comprenden Cas, ya sea expresada como una proteína o codificada por polinucleótidos que ya están comprendidos en las células, entonces únicamente es necesario suministrar el polinucleótido CRISPR. El método podrá incluir la extracción de la célula posmitótica y, opcionalmente, su reinserción en esta. Con “suministro” se quiere dar a entender de hecho el suministro físico de los polinucleótidos al núcleo de la célula, pero también la transfección. Por lo tanto, también se debe interpretar que “suministro” incluye la transfección a menos que sea evidente lo contrario.
También se proporciona un método para inducir la perturbación génica en una o más células posmitóticas, que comprende transducir una primera población de células con un sistema CRISPR-Cas para alterar de esta manera el genoma de la primera población de células con el fin de obtener una segunda población de células. El método podrá ser ex vivo o in vitro, por ejemplo, en un cultivo celular o en un modelo ex vivo o in vitro (tal como un organoide o “una célula posmitótica en una matriz”). Como alternativa, el método podrá ser in vivo, en cuyo caso también podrá incluir aislar la primera población de células a partir del sujeto y trasplantar la segunda población de células (de vuelta) en el sujeto. La perturbación génica podrá tener lugar para uno o más, o dos o más, o tres o más, o cuatro o más genes. La perturbación génica podrá ser una reducción de la función génica (es decir, la actividad del producto génico codificado). Esta podrá, por ejemplo, inducirse mediante la alteración del genoma de la primera población de células con el fin de obtener la segunda población de células, donde la segunda población de células tiene un genotipo defectuoso, tal como una afección monogénica, que está ausente en la primera población de células. Esto podrá requerir un molde de reparación correspondiente, tal como se discute en la presente, para proporcionar la secuencia defectuosa o podrá tener lugar mediante la inducción de una DSB. En particular, la perturbación génica es una atenuación génica. En algunas realizaciones, la célula posmitótica es, más preferentemente, una célula renal o cerebral (neurona) o una célula hepática, tal como un hepatocito primario.
Como alternativa, la perturbación génica podrá ser un incremento de la función génica (es decir, la actividad del producto génico codificado). Este podrá, por ejemplo, inducirse mediante la alteración del genoma de la primera población de células con el fin de obtener la segunda población de células, donde la primera población de células tiene un genotipo defectuoso, tal como una afección monogénica, que está ausente (es decir, corregida) en la segunda población de células. Esto podrá requerir un molde de reparación correspondiente, tal como se discute en la presente, para proporcionar la secuencia corregida.
Si se utiliza la multiplicación, entonces se prevé una mezcla de la reducción de uno o más genes y un incremento de uno o más genes. Esto se podrá lograr proporcionando una o más guías (en la multiplicación) y los correspondientes moldes de reparación se podrán utilizar para reducir la función, mientras una o más guías y sus correspondientes moldes se podrán utilizar para incrementar la función.
También se proporciona un método para investigar la función de uno o más genes en una o más células posmitóticas, que comprende determinar los cambios en la expresión de uno o más genes en las primeras poblaciones de células posmitóticas, inducir dicha perturbación génica en dicha primera población con el fin de proporcionar dicha segunda población con un genoma (o genotipo) alterado y determinar los cambios en la expresión del gen o genes en la segunda población de células posmitóticas, para investigar de esta manera la función del gen o los genes. En algunas realizaciones, la célula posmitótica es más preferentemente, una célula renal o cerebral (neurona) o una célula hepática, tal como un hepatocito primario.
También se proporciona un modelo y un método para crear dicho modelo. El modelo podrá ser un animal que comprenda una célula posmitótica (un modelo in vivo) o podrá ser un modelo ex vivo o in vitro, tal como un organoide posmitótico o una “célula posmitótica en una matriz” o la colección de células posmitóticas, tal como las que están sobre un esqueleto, tal como se describe en la presente. Las células posmitóticas de cualquier modelo se transfectarán preferentemente con Cas9. En consecuencia, se proporciona específicamente un modelo que comprende una o más células posmitóticas que comprenden la enzima CRISPR, preferentemente una Cas9 tal como Sa o SpCas9. Las células modelo podrán haberse transfectado o transducido con el segundo elemento regulador que se proporciona en la presente, el cual es un segundo elemento regulador ligado operablemente a una secuencia codificante de enzimas que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de ubicación nuclear (NLS, por sus siglas en inglés). El modelo podrá ser, tal como se ha descrito anteriormente, un modelo in vivo o podrá ser un modelo ex vivo o in vitro. Un modelo de este tipo permite la investigación rápida de la función de uno o más genes, ya que únicamente es necesario suministrar la secuencia polinucleotídica del sistema CRISPR-Cas (que comprende una o más secuencias guía cuya diana son el gen o los genes) para perturbar la función de dicho gen. Dicho de otra manera, los métodos para investigar la función génica en tales modelos podrán comprender únicamente el suministro de la secuencia polinucleotídica del sistema CRISPR-Cas (que comprende la secuencia o secuencias guía), ya que la Cas (enzima CRISPR) se ha proporcionado previamente a la célula o las células del modelo. También se proporcionan los métodos para crear tales modelos, que comprenden transducir o transfectar una o más células posmitóticas en una primera población de células posmitóticas con un segundo elemento regulador ligado operablemente a una secuencia codificante de enzimas que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de ubicación nuclear (NLS) tal como se describe en la presente para proporcionar de esta manera una o más segundas poblaciones de células posmitóticas que comprenden o expresan la enzima CRISPR. En algunas realizaciones, la célula posmitótica es más preferentemente una célula renal o cerebral (neurona) o una célula hepática, tal como un hepatocito primario.
También se proporcionan métodos para crear modelos perturbados génicamente, en particular modelos de atenuación génica. Estos métodos podrán comprender normalmente inducir la perturbación génica en uno o más genes, tal como se describe en la presente, en una primera población de células para proporcionar de esta manera una segunda población de células con un genoma (o genotipo) alterado. La segunda población de células podrá sembrarse a continuación en un esqueleto o en una matriz, por ejemplo, para proporcionar de esta manera un modelo ex vivo o in vitro. Como alternativa, la segunda población también podrá estar comprendida en un animal in vivo.
También se contemplan métodos de terapia génica. Por ejemplo, la corrección de uno o más genotipos deficientes (por ejemplo, mutaciones de punto único) se puede lograr mediante el uso del presente sistema CRISPR-Cas en las células posmitóticas discutido en la presente (incluidos los modelos). Las afecciones monogénicas asociadas con las células posmitóticas son particularmente preferidas y se ejemplifican en la presente, remítase al Ejemplo 36 donde la diana del sistema CRISPR-Cas9 fue ApoB, un gen del metabolismo lipídico, fue eficaz para inducir un cambio fenotípico in vivo. El Ejemplo 38 también es ilustrativo en lo que se refiere a cambios conductuales fenotípicos observados in vivo en el cerebro de ratones trasducidos con el presente sistema. También se proporcionan composiciones para su uso en la terapia génica.
Aunque se contemplan varias enzimas Cas, se prefiere particularmente Cas9 y los inventores han demostrado una eficacia notable en el hígado de SaCas9. También se prefiere la secuencia tracr de Sa si la enzima Cas es una enzima SaCas. En tales circunstancias un PAM adecuado es NNGRR.
Aunque se podrá utilizar una guía, la llamada multiplicación con dos, tres, cuatro o más guías es particularmente útil para investigar la función génica y la creación de un modelo (para proporcionar múltiples atenuaciones génicas), pero también en la terapia génica donde se han de corregir múltiples genotipos defectuosos (ya sean múltiples errores en un único gen o, más probablemente, múltiples errores distribuidos en varios genes). Como alternativa, la multiplicación con dos guías es útil en una estrategia con una nickasa dual para reducir los efectos fuera de la diana o simplemente para la selección de múltiples dianas dentro de un gen para garantizar el reclutamiento de Cas. Se prefieren las guías triples y cuádruples. En la presente se hace referencia a gen y locus genómico indistintamente. La estrategia con intrones descrita en la presente también es útil en este sentido, donde la guía se sitúa dentro del intrón Cas.
Los medios preferidos de suministro incluyen los métodos descritos por Kanasty posteriormente, tales como LNP, especialmente cuando únicamente se ha de suministrar la guía o esta se ha de suministrar sola. Sin embargo, los vectores víricos, incluidos el lentivírico y de AAV, se prefieren en general para el hígado ya que hasta la fecha han tenido éxito. De estos, se prefiere AAV y especialmente el serotipo 8, habiéndose demostrado que AAV2/8 es eficaz. Algunas diana preferidas, en la medida en la que están presentes en el riñón o en afecciones del riñón son los trastornos metabólicos, tales como cualquiera de los siguientes: neuropatía amiloide (TTR, PALB); amiloidosis (APOA1, APP, AAA, CVAP, AD1, GSN, FGA, LYZ, TTR, PALB); cirrosis (KRT18, KRT8, CIRH1A, NAIC, TEX292, KIAA1988); fibrosis quística (CFTR, ABCC7, CF, MRP7); glucogenosis (SLC2A2, GLUT2, G6PC, G6PT, G6PT1, GAA, LAMP2, LAMPB, AGL, GDE, GBE1, GYS2, PYGL, PFKM); adenoma hepático, 142330 (TCF1, HNF1A, MODY3), insuficiencia hepática, inicio temprano, y trastorno neurológico (SCOD1, SCO1), deficiencia de la lipasa hepática (LIPC), hepatoblastoma, cáncer y carcinomas (CTNNB1, PDGFRL, PdGRL, PRLTS, AXIN1, AXIN, CTNNB1, TP53, P53, LFS1, IGF2R, MPRI, MET, CASP8, m Ch5; enfermedad renal quística medular (UMOD, HNFJ, FJHN, MCKD2, ADMCKD2); fenilcetonuria (PAH, PKU1, QDPR, DHPR, PTS); poliquistosis renal y enfermedad hepática (FCYT, PKHD1, ARPKD, PKD1, PKD2, PKD4, PKDTS, PRKCSH, G19P1, PCLD, SEC63). Otras dianas preferidas incluyen uno o más cualesquiera de los siguientes: PCSK9, HMGCR, APOB, LDLR, ANGPTL3, F8, F9/FIX, AAT, FAH, HPD, TAT, ATP7B, UGT1A1, OTC, ARH.
Se comprenderá que los métodos para alterar la expresión en la célula posmitótica no conllevan la alteración de la línea germinal, la cual se podrá excluir desde un punto de vista ético. De hecho, aunque la transfección de células madre se contempla y ciertamente se prefiere en algunas realizaciones, se prefieren especialmente las células renales o neuronas, particularmente cuando puedan mostrar o se puedan estimular para que muestren alguna regeneración.
Se prefieren especialmente los CRISPR de Tipo II, especialmente para su uso en eucariotas, como en el presente caso, donde los hígados se encuentran únicamente en eucariotas, concretamente en animales vertebrados, en todos los casos.
La utilización de sistemas CRISPR-Cas para inducir un cambio fenotípico es particularmente conveniente, especialmente in vivo. Los inventores han mostrado esto en la presente solicitud.
Cuando se contemplen aplicaciones terapéuticas, o para otra modificación genómica en las células posmitóticas, entonces, cuando se requiera una corrección se comprenderá que, tras el corte monocatenario o la escisión del ADN genómico diana, se prefiere a continuación la corrección mediante la ruta HDR. Para la atenuación génica, NHEJ es conveniente, sin embargo, para la terapia se prefiere la corrección mediante la ruta HDR. En tales circunstancias es preferible suministrar un molde de reparación. Este será más preferentemente ADNmc aunque también es posible ARN mediante un vector retrovírico para proporcionar un molde de ADN correspondiente. El experto en la técnica podrá llevar a la práctica la invención fácilmente a partir de los contenidos de la presente que contribuyen al conocimiento en la técnica; y en este sentido, cabe mencionar que el experto en la técnica, a partir de los contenidos de la presente que contribuyen al conocimiento de la técnica, puede comprender e implementar fácilmente consideraciones respecto a la longitud del brazo homólogo. Cabe mencionar solicitudes y publicaciones de patente que incluyen al inventor Zhang de la presente, incluidas aquellas citadas en la presente. Preferentemente, el molde de reparación se suministra conjuntamente con uno o más elementos del sistema CRISPR-Cas.
También se proporciona un método para alterar la expresión de al menos un producto génico de una célula posmitótica que comprende introducir en una célula hepática eucariota, por ejemplo, un hepatocito, que contiene y expresa una molécula de ADN que tiene una secuencia diana y que codifica el producto génico, un sistema de repeticiones palindrómicas cortas espaciadas entre sí regularmente y agrupadas (CRISPR)-CRISPR asociado a (Cas) (CRISPR-Cas) modificado, de origen no natural que comprende uno o más vectores que comprenden: a) un primer elemento regulador operable en una célula eucariota ligado operablemente a al menos una secuencia nucleotídica que codifica un ARN guía de un sistema CRISPR-Cas que se hibrida con la secuencia diana, y b) un segundo elemento regulador operable en una célula eucariota ligado operablemente a una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas9 de Tipo II,
donde los componentes (a) y (b) se ubican en el mismo vector o en vectores diferentes del sistema, de esta manera el ARN guía se dirige a la secuencia diana y la proteína Cas9 escinde la molécula de ADN, y de esta manera se altera la expresión del producto o productos de la célula posmitótica; y donde la proteína Cas9 y el ARN guía no se presentan juntos de manera natural.
Se sobreentenderá que la referencia posterior a las dianas se refiere a genes o dianas en células posmitóticas que se expresan en las células posmitóticas a menos que sea evidente lo contrario.
Cualquiera o todas las secuencias polinucleotídicas que codifican una enzima CRISPR, secuencia guía, secuencia pareja de tracr o secuencia tracr, podrán ser ARN. Los polinucleótidos que codifican la secuencia que codifica una enzima CRISPR, la secuencia guía, la secuencia pareja de tracr o la secuencia tracr podrán ser ARN y se podrán suministrar mediante liposomas, nanopartículas, exosomas, microvesículas o un cañón de genes.
Se apreciará que cuando se hace referencia a un polinucleótido, que es ARN y del que se dice que "comprende" una característica tal como una secuencia pareja de tracr, la secuencia de ARN incluye la característica. Cuando el polinucleótido es ADN y se dice que comprende una característica tal como una secuencia pareja de tracr, la secuencia de ADN es o se puede transcribir en ARN que incluye la característica en cuestión. Cuando la característica es una proteína, tal como la enzima CRISPR, la secuencia de ADN o ARN a la que se hace referencia se traduce, o se puede traducir (y en el caso del ADN se transcribe en primer lugar).
En consecuencia, en ciertas realizaciones, la divulgación proporciona un método para modificar las células posmitóticas de un organismo, p. ej., un mamífero incluido un ser humano o un mamífero no humano o un organismo, manipulando una secuencia diana en un locus genómico de interés que comprende suministrar una composición modificada o de origen no natural que comprende un sistema vectorial plasmídico o vírico que comprende uno o más vectores plasmídicos o víricos que codifican operablemente una composición para su expresión, donde la composición comprende: (A) una composición de origen no natural o modificada que comprende un sistema vectorial que comprende uno o más vectores que comprende I. un primer elemento regulador ligado operablemente a una secuencia polinucleotídica de ARN quimérico (ARNqui) de un sistema CRISPR-Cas, donde la secuencia polinucleotídica comprende (a) una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula eucariota, (b) una secuencia pareja de tracr y (c) una secuencia tracr, y II. un segundo elemento regulador ligado operablemente a una secuencia codificante de enzimas que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de ubicación nuclear (u opcionalmente al menos una o más secuencias de ubicación nuclear ya que en algunas realizaciones puede ser que no participe una NLS), donde (a), (b) y (c) se disponen en una orientación 5' a 3', donde los componentes I y II se ubican en el mismo vector o en diferentes vectores del sistema, donde cuando se transcriben, la secuencia pareja de tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica respecto a la secuencia de un complejo CRISPR con la secuencia diana y donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana y (2) la secuencia pareja de tracr que se hibrida con la secuencia tracr, o (B) una composición de origen no natural o modificada que comprende un sistema vectorial que comprende uno o más vectores que comprende I. un primer elemento regulador ligado operablemente (a) a una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula eucariota y (b) al menos una o más secuencias pareja de tracr, II. un segundo elemento regulador ligado operablemente a una secuencia codificante de enzimas que codifica una enzima CRISPR, y III. un tercer elemento regulador ligado operablemente a una secuencia tracr, donde los componentes I, II y III se ubican en el mismo vector o en diferentes vectores del sistema, donde, cuando se transcriben, la secuencia pareja de tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica respecto a la secuencia de un complejo CRISPR con la secuencia diana y donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana y (2) la secuencia pareja de tracr que se hibrida con la secuencia tracr. En algunas realizaciones, los componentes I, II y III se ubican en el mismo vector. En otras realizaciones, los componentes I y II se ubican en el mismo vector, mientras que el componente III se ubica en otro vector. En otras realizaciones, los componentes I y III se ubican en el mismo vector, mientras que el componente II se ubica en otro vector. En otras realizaciones, los componentes II y III se ubican en el mismo vector, mientras que el componente I se ubica en otro vector. En otras realizaciones, cada uno de los componentes I, II y III se ubican en diferentes vectores. La divulgación también proporciona un sistema vectorial vírico o plasmídico tal como se describe en la presente.
Preferentemente, el vector es un vector vírico, tal como vectores lenti- o baculo- o preferentemente adenovíricos/víricos adenoasociados, pero se conocen y se proporcionan otros medios de suministro (tales como sistemas de levaduras, microvesículas, cañones de genes/medios de incorporar vectores a nanopartículas de oro). En algunas realizaciones, uno o más de los vectores víricos o plasmídicos se podrán suministrar mediante liposomas, nanopartículas, exosomas, microvesículas o un cañón de genes.
Con la expresión "manipulación de una secuencia diana", los solicitantes también se refieren a la manipulación epigenética de una secuencia diana. Esta podrá ser del estado de cromatina de una secuencia diana, tal como por la modificación del estado de metilación de la secuencia diana (es decir, adición o eliminación de metilación o patrones de metilación o islas de CpG), modificación de histonas, aumentar o disminuir la accesibilidad a la secuencia diana o favoreciendo el plegamiento 3D.
Se apreciará que cuando se hace referencia a un método para modificar un organismo o un mamífero, que incluye un mamífero humano o no humano o un organismo, manipulando una secuencia diana en el locus genómico de interés, esto se podrá aplicar al organismo (o mamífero) en su conjunto o solamente a una única célula o población de células de ese organismo (si el organismo es multicelular). En el caso de los seres humanos, por ejemplo, los solicitantes contemplan, inter alia, una única célula o una población de células y estas se podrán modificar preferentemente ex vivo y ser reintroducidas a continuación. En este caso, podrá ser necesaria una biopsia u otra muestra de un fluido biológico o un tejido. En este sentido, las células madre también son particularmente preferidas. Pero, obviamente, las realizaciones in vivo también se contemplan.
En ciertas realizaciones, la divulgación proporciona un método para tratar o inhibir una afección causada por un defecto en una secuencia diana en un locus genómico de interés en un sujeto (p. ej., un mamífero o un ser humano) o un sujeto no humano (p. ej., un mamífero) que lo necesite, que comprende modificar el sujeto o el sujeto no humano manipulando la secuencia diana y donde la afección es susceptible de ser tratada o inhibida manipulando la secuencia diana que comprende proporcionar un tratamiento que comprende: suministrar una composición de origen no natural o modificada que comprende un sistema vectorial derivado de lentivirus o AAV que comprende uno o más vectores derivados de lentivirus o AAV que codifican operablemente una composición para su expresión, donde la secuencia diana se manipula mediante la composición cuando se expresa, donde la composición comprende: (A) una composición de origen no natural o modificada que comprende un sistema vectorial que comprende uno o más vectores que comprende I. un primer elemento regulador ligado operablemente a una secuencia polinucleotídica de ARN quimérico (ARNqui) de un sistema CRISPR-Cas, donde la secuencia polinucleotídica comprende (a) una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula eucariota, (b) una secuencia pareja de tracr y (c) una secuencia tracr, y II. un segundo elemento regulador ligado operablemente a una secuencia codificante de enzimas que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de ubicación nuclear (u opcionalmente al menos una o más secuencias de ubicación nuclear ya que en algunas realizaciones puede ser que no participe una NLS), donde (a), (b) y (c) se disponen en una orientación 5' a 3', donde los componentes I y II se ubican en el mismo vector o en diferentes vectores del sistema, donde, cuando se transcriben, la secuencia pareja de tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica respecto a la secuencia de un complejo CRISPR con la secuencia diana y donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana y (2) la secuencia pareja de tracr que se hibrida con la secuencia tracr, o (B) una composición de origen no natural o modificada que comprende un sistema vectorial que comprende uno o más vectores que comprende I. un primer elemento regulador ligado operablemente (a) a una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula eucariota y (b) al menos una o más secuencias pareja de tracr, II. un segundo elemento regulador ligado operablemente a una secuencia codificante de enzimas que codifica una enzima CRISPR, y III. un tercer elemento regulador ligado operablemente a una secuencia tracr, donde los componentes I, II y III se ubican en el mismo vector o en diferentes vectores del sistema, donde, cuando se transcriben, la secuencia pareja de tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica respecto a la secuencia de un complejo CRISPR con la secuencia diana y donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana y (2) la secuencia pareja de tracr que se hibrida con la secuencia tracr. En algunas realizaciones, los componentes I, II y III se ubican en el mismo vector. En otras realizaciones, los componentes I y II se ubican en el mismo vector, mientras que el componente III se ubica en otro vector. En otras realizaciones, los componentes I y III se ubican en el mismo vector, mientras que el componente II se ubica en otro vector. En otras realizaciones, los componentes II y III se ubican en el mismo vector, mientras que el componente I se ubica en otro vector. En otras realizaciones, cada uno de los componentes I, II y III se ubican en diferentes vectores. La divulgación también proporciona un sistema vectorial vírico (p. ej., derivado de un AAV o un lentivirus) tal como se describe en la presente, y puede ser parte de un sistema vectorial como se describe en la presente.
Algunos métodos de la invención pueden incluir inducir la expresión. El organismo o sujeto es una eucariota (que incluye mamíferos que incluyen seres humanos) o una eucariota que no es de ser humano o un animal no humano o un mamífero no humano, siempre y cuando tenga una célula posmitótica (por ej., el cerebro o riñón) y su función correspondiente. En algunas realizaciones, el organismo o sujeto es un animal no humano y podrá ser un artrópodo, por ejemplo, un insecto o podrá ser un nematodo. En algunos métodos de la invención, el organismo o sujeto es un mamífero o un mamífero no humano. Un mamífero no humano podrá ser, por ejemplo, un roedor (preferentemente un ratón o una rata), un ungulado o un primate. En algunos métodos de la invención, el vector vírico es un AAV o un lentivirus y puede ser parte de un sistema vectorial como se describe en la presente. En algunos métodos de la invención, la enzima CRISPR es una Cas9. En algunos métodos de la invención, la expresión de la secuencia guía está controlada por el promotor T7 y está impulsada por la expresión de la polimerasa T7.
La divulgación en algunas realizaciones abarca un método para suministrar una enzima CRISPR que comprende el suministro a una célula de ARNm que codifica la enzima CRISPR. En algunos de estos métodos la enzima CRISPR es una Cas9.
La divulgación también proporciona métodos para preparar los sistemas vectoriales de la divulgación, en particular los sistemas vectoriales víricos como se describen en la presente. La divulgación en algunas realizaciones abarca un método para preparar el AAV que comprende utilizar uno o más plásmidos que contienen o están constituidos esencialmente por una o más moléculas de ácido nucleico que codifica el AAV para transfectar células infectadas por AAV y suministrar el rep y/o cap de AAV necesarios para la replicación y empaquetamiento del AAV. En algunas realizaciones, el rep y/o cap de AAV necesarios para la replicación y empaquetamiento del AAV se suministran transfectando las células con uno o más plásmidos cooperadores o uno o más virus cooperadores. En algunas realizaciones, el virus cooperador es un poxvirus, adenovirus, herpesvirus o baculovirus. En algunas realizaciones, el poxvirus es un virus de la variolovacuna. En algunas realizaciones, las células son células de mamífero. Y en algunas realizaciones, las células son células de insecto y el virus cooperador es un baculovirus. En otras realizaciones, el virus es un lentivirus.
La invención además abarca una composición de la invención o una enzima CRISPR de esta (como alternativa ARNm que codifica la enzima CRISPR o que lo incluye) para su uso en medicina o en terapia. En algunas realizaciones, la invención abarca una composición de acuerdo con la invención o una enzima CRISPR de esta (como alternativa ARNm que codifica la enzima CRISPR o que lo incluye) para su uso en un método de acuerdo con la invención. En algunas realizaciones, la invención proporciona el uso de una composición de la invención o una enzima CRISPR de esta (como alternativa ARNm que codifica la enzima CRISPR o que lo incluye) en la edición genómica o de genes ex vivo. En ciertas realizaciones, la invención abarca el uso de una composición de la invención o una enzima CRISPR de esta (como alternativa ARNm que codifica la enzima CRISPR o que lo incluye) en la producción de un medicamento para la edición genómica o de genes ex vivo o para su uso en un método de acuerdo con la invención. La invención abarca en algunas realizaciones una composición de la invención o una enzima CRISPR de esta (como alternativa ARNm que codifica la enzima CRISPR o que lo incluye), donde la secuencia diana está flanqueada en su extremo 3' por una secuencia PAM (siglas en inglés de motivo adyacente a los protoespaciadores) que comprende 5'-motivo, especialmente cuando Cas9 es (o se obtiene a partir de) Cas9 de S. pyogenes o S. aureus. Por ejemplo, una PAM adecuada es 5'-NRG o 5'-NNGRR (donde N es cualquier nucleótido) para las enzimas SpCas9 o SaCas9 (o enzimas que se obtienen a partir de ellas), respectivamente, como se ha mencionado anteriormente.
Se apreciará que SpCas9 o SaCas9 son aquellas procedentes o que se obtienen a partir de S. pyogenes o S. aureus Cas9. Ciertamente, podrá estar mutada o modificada de otra manera respecto al tipo no modificado para adecuarse al uso previsto, tal y como se describe en la presente. Se prefiere la variante o mutante D10A nickasa dual, especialmente combinada con dos guías solapadas dirigidas como sitios opuestos en diferentes hebras del mismo cromosoma.
Los aspectos de la invención abarcan mejorar la especificidad de una enzima CRISPR, p. ej., una Cas9, modificación dirigida de genes mediada y reducir la posibilidad de modificación fuera de la diana por parte de la enzima CRISPR, p. ej., Cas9. La invención en algunas realizaciones abarca un método para modificar un organismo u organismo no humano minimizando las modificaciones fuera de la diana manipulando una primera y una segunda secuencia diana de hebras opuestas de un ADN bicatenario en un locus genómico de interés en una célula que comprende suministrar una composición que no tiene origen natural o modificada que comprende:
I. una primera secuencia polinucleotídica de ARN quimérico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, donde la primera secuencia polinucleotídica comprende:
(a) una primera secuencia guía capaz de hibridarse con la primera secuencia diana,
(b) una primera secuencia pareja de tracr, y
(c) una primera secuencia tracr,
I. una segunda secuencia polinucleotídica de ARNqui del sistema CRISPR-Cas, donde la segunda secuencia polinucleotídica comprende:
(a) una segunda secuencia guía capaz de hibridarse con la segunda secuencia diana,
(b) una segunda secuencia pareja de tracr, y
(c) una segunda secuencia tracr, y
III. una secuencia polinucleotídica que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de ubicación nuclear y que comprende una o más mutaciones, donde (a), (b) y (c) se disponen en una orientación 5' a 3', donde, cuando se transcriben, la primera y la segunda secuencia pareja de tracr se hibridan con la primera y la segunda secuencia tracr respectivamente y la primera y la segunda secuencia guía dirigen la unión específica respecto a la secuencia de un primer y un segundo complejo CRISPR a la primera y segunda secuencia diana respectivamente, donde el primer complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la primera secuencia guía que se hibrida con la primera secuencia diana y (2) la primera secuencia pareja de tracr que se hibrida con la primera secuencia tracr, donde el segundo complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la segunda secuencia guía que se hibrida con la segunda secuencia diana y (2) la segunda secuencia pareja de tracr que se hibrida con la segunda secuencia tracr, donde la secuencia polinucleotídica que codifica una enzima CRISPR es ADN o ARN y donde la primera secuencia guía dirige la escisión de una hebra del ADN bicatenario cerca de la primera secuencia diana y la segunda secuencia guía dirige la escisión de la otra hebra cerca de la segunda secuencia diana, induce una rotura de la hebra bicatenaria, y modifica de esta manera el organismo o el organismo no humano minimizando modificaciones fuera de la diana.
En algunos métodos de la invención todas o algunas de las secuencias polinucleotídicas que codifican la enzima CRISPR, la primera y la segunda secuencia guía, la primera y la segunda secuencia pareja de tracr o la primera y la segunda secuencia tracr es/son ARN. En realizaciones adicionales de la invención los polinucleótidos que codifican la secuencia que codifica la enzima CRISPR, la primera y la segunda secuencia guía, la primera y la segunda secuencia pareja de tracr o la primera y la segunda secuencia tracr es/son ARN y se suministran mediante liposomas, nanopartículas, exosomas, microvesículas o un cañón de genes. En ciertas realizaciones de la invención, la primera y segunda secuencia pareja de tracr comparten un 100% de identidad y/o la primera y la segunda secuencia tracr comparten un 100% de identidad. En algunas realizaciones, los polinucleótidos podrán estar comprendidos dentro de un sistema vectorial que comprende uno o más vectores. En realizaciones preferidas de la invención, la enzima CRISPR es una enzima Cas9, p. ej., SpCas9. En un aspecto de la invención, la enzima CRISPR comprende una o más mutaciones en un dominio catalítico, donde la mutación o las mutaciones se seleccionan a partir del grupo constituido por D10A, E762A, H840A, N854A, N863A y D986A. En una realización sumamente preferida, la enzima CRISPR tiene la mutación D10A. En realizaciones preferidas, la primera enzima CRISPR tiene una o más mutaciones de modo que la enzima es una enzima que practica un corte monocatenario en la hebra complementaria y una segunda enzima CRISPR que tiene una o más mutaciones de modo que la enzima es una enzima que practica un corte monocatenario en la hebra no complementaria. Como alternativa, la primera enzima podrá ser una enzima que practica un corte monocatenario en la hebra no complementaria y la segunda enzima podrá ser una enzima que practica un corte monocatenario en la hebra complementaria.
En métodos preferidos de la invención, la primera secuencia guía dirige la escisión de una hebra del ADN bicatenario cerca de la primera secuencia diana y la segunda secuencia guía dirige la escisión de la otra hebra cerca de la segunda secuencia diana lo que da como resultado una región protuberante 5'. En realizaciones de la invención, la región protuberante 5' tiene como mucho 200 pares de bases, preferentemente, como mucho 100 pares de bases o más preferentemente como mucho 50 pares de bases. En realizaciones de la invención, la región protuberante 5' tiene como mínimo 26 pares de bases, preferentemente, como mínimo 30 pares de bases o más preferentemente 34-50 pares de bases. Más preferentemente, el solapamiento está comprendido entre 5 y 1 pares de bases.
La invención en algunas realizaciones abarca un método para modificar un organismo u organismo no humano minimizando las modificaciones fuera de la diana manipulando una primera y una segunda secuencia diana de hebras opuestas de un ADN bicatenario en un locus genómico de interés en una célula que comprende suministrar una composición que no tiene origen natural o modificada que comprende un sistema vectorial que comprende uno o más vectores que comprenden
I. un primer elemento regulador ligado operablemente a
(a) una primera secuencia guía capaz de hibridarse con la primera secuencia diana, y
(b) al menos una o más secuencias pareja de tracr,
II. un segundo elemento regulador ligado operablemente a
(a) una segunda secuencia guía capaz de hibridarse con la segunda secuencia diana, y
(b) al menos una o más secuencias pareja de tracr,
III. un tercer elemento regulador ligado operablemente a una secuencia codificante de enzimas que codifica una enzima CRISPR, y
IV. un cuarto elemento regulador ligado operablemente a una secuencia tracr,
donde los componentes I, II, III y IV están ubicados en el mismo vector o en diferentes vectores del sistema, la secuencia pareja de tracr, cuando se transcribe, se hibrida con la secuencia tracr y la primera y la segunda secuencia guía dirigen la unión específica respecto a la secuencia de un primer y un segundo complejo CRISPR a la primera y segunda secuencia diana respectivamente, donde el primer complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la primera secuencia guía que se hibrida con la primera secuencia diana y (2) la secuencia pareja de tracr que se hibrida con la secuencia tracr, donde el segundo complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la segunda secuencia guía que se hibrida con la segunda secuencia diana y (2) la secuencia pareja de tracr que se hibrida con la secuencia tracr, donde la secuencia polinucleotídica que codifica una enzima CRISPR es ADN o ARN y donde la primera secuencia guía dirige la escisión de una hebra del ADN bicatenario cerca de la primera secuencia diana y la segunda secuencia guía dirige la escisión de la otra hebra cerca de la segunda secuencia diana, induce una rotura de la hebra bicatenaria y modifica de esta manera el organismo o el organismo no humano minimizando modificaciones fuera de la diana.
La divulgación también proporciona un sistema vectorial tal como se describe en la presente. El sistema podrá comprender uno, dos, tres o cuatro vectores diferentes. Por lo tanto, los componentes I, II, III y IV podrán estar ubicados en uno, dos, tres o cuatro vectores diferentes y en la presente se contemplan todas las combinaciones para las ubicaciones posibles de los componentes, por ejemplo: los componentes I, II, III y IV se pueden ubicar en el mismo vector; los componentes I, II, III y IV se pueden ubicar cada uno en vectores diferentes; los componentes I, II, III y IV se podrán ubicar en un total de dos o tres vectores diferentes, contemplándose todas las combinaciones de ubicaciones, etc.
En algunos métodos de la invención todas o algunas de las secuencias polinucleotídicas que codifican la enzima CRISPR, la primera y la segunda secuencia guía, la primera y la segunda secuencia pareja de tracr o la primera y la segunda secuencia tracr es/son ARN. En realizaciones adicionales de la invención, la primera y segunda secuencia pareja de tracr comparten un 100% de identidad y/o la primera y segunda secuencia tracr comparten un 100% de identidad. En realizaciones preferidas de la invención, la enzima CRISPR es una enzima Cas9, p. ej., SpCas9. En un aspecto de la invención, la enzima CRISPR comprende una o más mutaciones en un dominio catalítico, donde la mutación o las mutaciones se seleccionan a partir del grupo constituido por D10A, E762A, H840A, N854A, N863A y D986A. En una realización sumamente preferida, la enzima CRISPR tiene la mutación D10A. En realizaciones preferidas, la primera enzima CRISPR tiene una o más mutaciones de modo que la enzima es una enzima que practica un corte monocatenario en la hebra complementaria y una segunda enzima CRISPR que tiene una o más mutaciones de modo que la enzima es una enzima que practica un corte monocatenario en la hebra no complementaria. Como alternativa, la primera enzima podrá ser una enzima que practica un corte monocatenario en la hebra no complementaria y la segunda enzima podrá ser una enzima que practica un corte monocatenario en la hebra complementaria. En una realización adicional de la invención, se suministran uno o más de los vectores víricos mediante liposomas, nanopartículas, exosomas, microvesículas o un cañón de genes.
En métodos preferidos de la invención, la primera secuencia guía dirige la escisión de una hebra del ADN bicatenario cerca de la primera secuencia diana y la segunda secuencia guía dirige la escisión de otra hebra cerca de la segunda secuencia diana lo que da como resultado una región protuberante 5'. En realizaciones de la invención, la región protuberante 5' tiene como mucho 200 pares de bases, preferentemente, como mucho 100 pares de bases o más preferentemente como mucho 50 pares de bases. En realizaciones de la invención, la región protuberante 5' tiene como mínimo 26 pares de bases, preferentemente, como mínimo 30 pares de bases o más preferentemente 34-50 pares de bases.
La invención abarca en algunas realizaciones un método para modificar un locus genómico de interés minimizando las modificaciones fuera de la diana introduciendo en una célula que contiene y expresa una molécula de ADN bicatenario que codifica un producto génico de interés, un sistema CRISPR-Cas modificado que no tiene un origen natural que comprende una proteína Cas que tiene una o más mutaciones y dos ARN guía cuyas dianas son una primera hebra y una segunda hebra de la molécula de ADN respectivamente, en el cual la diana de los ARN guía es la molécula de ADN que codifica el producto génico y la proteína Cas practica un corte monocatenario en cada una de la primera hebra y de la segunda hebra de la molécula de ADN que codifica el producto génico, con lo que se altera la expresión del producto génico; y donde la proteína Cas y los dos ARN guía no se presentan juntos de manera natural.
En métodos preferidos de la invención, la proteína Cas practica un corte monocatenario en cada una de la primera hebra y la segunda hebra de la molécula de ADN que codifica el producto génico y da como resultado una región protuberante 5'. En realizaciones de la invención, la región protuberante 5' tiene como mucho 200 pares de bases, preferentemente, como mucho 100 pares de bases o más preferentemente como mucho 50 pares de bases. En realizaciones de la invención, la región protuberante 5' tiene como mínimo 26 pares de bases, preferentemente, como mínimo 30 pares de bases o más preferentemente 34-50 pares de bases.
Las realizaciones de esta invención también abarcan los ARN guía que comprenden una secuencia guía fusionada con una secuencia pareja de tracr y una secuencia tracr. En un aspecto de la invención, la proteína Cas con codones optimizados para la expresión en una célula eucariota, preferentemente una célula de mamíferos o una célula humana. En realizaciones adicionales de la invención, la proteína Cas es una proteína CRISPR de tipo II-Cas, p. ej., una proteína Cas9. En una realización sumamente preferida, la proteína Cas es una proteína Cas9, p. ej., SpCas9. En aspectos de la invención, la proteína Cas tiene una o más mutaciones seleccionadas a partir del grupo constituido por D10A, E762A, H840A, N854A, N863A y D986A. En una realización sumamente preferida, la proteína Cas tiene la mutación D10A.
Algunos aspectos de la invención se refieren a la disminución de la expresión del producto génico o a un polinucleótido molde que se introduce adicionalmente en la molécula de ADN que codifica el producto génico o a un intrón que se escinde de manera precisa y permite que las dos regiones protuberantes 5' se hibriden y liguen o la alteración de la actividad o función del producto génico o al incremento de la expresión del producto génico. En una realización de la invención, el producto génico es una proteína.
La divulgación también abarca un sistema CRISPR-Cas modificado, que no tiene un origen natural que comprende una proteína Cas que tiene una o más mutaciones y dos ARN guía cuyas dianas son una primera hebra y una segunda hebra, respectivamente, de una molécula de ADN bicatenario que codifica un producto génico en una célula, en el cual la molécula de ADN que codifica el producto génico es la diana de los ARN guía y la proteína Cas practica un corte monocatenario en cada una de la primera hebra y de la segunda hebra de la molécula de ADN que codifica el producto génico, con lo que se altera la expresión del producto génico; y donde la proteína Cas y los dos ARN guía no se presentan juntos de manera natural.
En algunos aspectos de la invención los ARN guía podrán comprender una secuencia guía fusionada con una secuencia pareja de tracr y una secuencia tracr. En una realización de la invención, la proteína Cas es una proteína CRISPR de tipo II-Cas. En un aspecto de la invención, la proteína Cas con codones optimizados para la expresión en una célula eucariota, preferentemente una célula de mamíferos o una célula humana. En realizaciones adicionales de la invención, la proteína Cas es una proteína CRISPR de tipo II-Cas, p. ej., una proteína Cas9. En una realización sumamente preferida, la proteína Cas es una proteína Cas9, p. ej., SpCas9. En aspectos de la invención, la proteína Cas tiene una o más mutaciones seleccionadas a partir del grupo constituido por D10A, E762A, H840A, N854A, N863A y D986A. En una realización sumamente preferida, la proteína Cas tiene la mutación D10A.
Algunos aspectos de la invención se refieren a la disminución de la expresión del producto génico o a un polinucleótido molde que se introduce adicionalmente en la molécula de ADN que codifica el producto génico o a un intrón que se escinde de manera precisa y permite que las dos regiones protuberantes 5' se hibriden y liguen o la alteración de la actividad o función del producto génico o al incremento de la expresión del producto génico. En una realización de la invención, el producto génico es una proteína.
La divulgación también abarca un sistema vectorial modificado, que no tiene un origen natural que comprende uno o más vectores que comprenden:
(a) un primer elemento regulador ligado operablemente a cada uno de los dos ARN guía del sistema CRISPR-Cas que tienen como diana una primera hebra y una segunda hebra, respectivamente, de una molécula de ADN bicatenario que codifica un producto génico,
(b) un segundo elemento regulador ligado operablemente a una proteína Cas,
donde los componentes (a) y (b) se ubican en el mismo vector o en diferentes vectores del sistema, en el cual la molécula de ADN que codifica el producto génico es la diana de los ARN guía y la proteína Cas practica un corte monocatenario en cada una de la primera hebra y de la segunda hebra de la molécula de ADN que codifica el producto génico, con lo que se altera la expresión del producto génico; y donde la proteína Cas y los dos ARN guía no se presentan juntos de manera natural.
En algunos aspectos de la invención los ARN guía podrán comprender una secuencia guía fusionada con una secuencia pareja de tracr y una secuencia tracr. En una realización de la invención, la proteína Cas es una proteína CRISPR de tipo II-Cas. En un aspecto de la invención, la proteína Cas con codones optimizados para la expresión en una célula eucariota, preferentemente una célula de mamíferos o una célula humana. En realizaciones adicionales de la invención, la proteína Cas es una proteína CRISPR de tipo II-Cas, p. ej., una proteína Cas9. En una realización sumamente preferida, la proteína Cas es una proteína Cas9, p. ej., SpCas9. En aspectos de la invención, la proteína Cas tiene una o más mutaciones seleccionadas a partir del grupo constituido por D10A, E762A, H840A, N854A, N863A y D986A. En una realización sumamente preferida, la proteína Cas tiene la mutación D10A.
Algunos aspectos de la invención se refieren a la disminución de la expresión del producto génico o a un polinucleótido molde que se introduce adicionalmente en la molécula de ADN que codifica el producto génico o a un intrón que se escinde de manera precisa y permite que las dos regiones protuberantes 5' se hibriden y liguen o la alteración de la actividad o función del producto génico o al incremento de la expresión del producto génico. En una realización de la invención, el producto génico es una proteína. En las realizaciones preferidas de la invención, los vectores del sistema son vectores víricos. En una realización adicional, los vectores del sistema se suministran mediante liposomas, nanopartículas, exosomas, microvesículas o un cañón de genes.
En un aspecto, la divulgación proporciona un método para modificar un polinucleótido diana en una célula eucariota posmitótica. En algunas realizaciones, el método comprende permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleótido diana para efectuar la escisión de dicho polinucleótido diana y modificar de este modo el polinucleótido diana, donde el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada con una secuencia diana dentro de dicho polinucleótido diana, donde dicha secuencia guía se une a una secuencia pareja de tracr que a su vez se hibrida con una secuencia tracr. En algunas realizaciones, dicha escisión comprende escindir una o dos hebras en la ubicación de la secuencia diana por parte de dicha enzima CRISPR. En algunas realizaciones, dicha escisión da como resultado una disminución de la transcripción de un gen diana. En algunas realizaciones, el método comprende además reparar dicho polinucleótido diana escindido mediante recombinación homóloga con un polinucleótido molde exógeno, donde dicha reparación da como resultado una mutación que comprende una inserción, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos de dicho polinucleótido diana. En algunas realizaciones, dicha mutación da como resultado uno o más cambios de aminoácidos en una proteína expresada a partir de un gen que comprende la secuencia diana. En algunas realizaciones, el método comprende además suministrar uno o más vectores a dicha célula eucariota, donde el vector o los vectores impulsan la expresión de uno o más de: la enzima CRISPR, la secuencia guía unida a la secuencia pareja de tracr y la secuencia tracr. En algunas realizaciones, dichos vectores se suministran a la célula eucariota en un sujeto. En algunas realizaciones, dicha modificación tiene lugar en dicha célula eucariota en un cultivo celular. En algunas realizaciones, el método comprende además aislar dicha célula eucariota de un sujeto antes de dicha modificación. En algunas realizaciones, el método comprende además devolver dicha célula eucariota y/o células obtenidas a partir de ella a dicho sujeto.
En un aspecto, la divulgación proporciona un método para modificar la expresión de un polinucleótido en una célula eucariota posmitótica. En algunas realizaciones, el método comprende permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleótido de modo que dicha unión de como resultado un aumento o un descenso de la expresión de dicho polinucleótido; donde el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada con una secuencia diana dentro de dicho polinucleótido, donde dicha secuencia guía se une a una secuencia pareja de tracr que a su vez se hibrida con una secuencia tracr. En algunas realizaciones, el método comprende además suministrar uno o más vectores a dichas células eucariotas, donde el vector o los vectores impulsan la expresión de uno o más de: la enzima CRISPR, la secuencia guía unida a la secuencia pareja de tracr y la secuencia tracr.
En un aspecto, la divulgación proporciona un método para generar una célula eucariota posmitótica modelo que comprende un gen ligado a una enfermedad mutado. En algunas realizaciones, un gen ligado a una enfermedad es cualquier gen asociado con un aumento en el riesgo de padecer o desarrollar una enfermedad. En algunas realizaciones, el método comprende (a) introducir uno o más vectores en una célula eucariota, donde el vector o los vectores impulsan la expresión de uno o más de: una enzima CRISPR, una secuencia guía unida a una secuencia pareja de tracr y una secuencia tracr; y (b) permitir que un complejo CRISPR se una a un polinucleótido diana para efectuar la escisión del polinucleótido diana dentro de dicho gen ligado a la enfermedad, donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana dentro del polinucléotido diana y (2) la secuencia pareja de tracr que se hibrida con la secuencia tracr, para generar de esta manera una célula eucariota modelo que comprende un gen ligado a una enfermedad mutado. En algunas realizaciones, dicha escisión comprende escindir una o dos hebras en la ubicación de la secuencia diana por parte de dicha enzima CRISPR. En algunas realizaciones, dicha escisión da como resultado una disminución de la transcripción de un gen diana. En algunas realizaciones, el método comprende además reparar dicho polinucleótido diana escindido mediante recombinación homóloga con un polinucleótido molde exógeno, donde dicha reparación da como resultado una mutación que comprende una inserción, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos de dicho polinucleótido diana. En algunas realizaciones, dicha mutación da como resultado uno o más cambios de aminoácidos en la expresión de la proteína que procede de un gen que comprende la secuencia diana.
En un aspecto la divulgación proporciona un método para seleccionar una o más células posmitóticas introduciendo una o más mutaciones en un gen en la célula o las células, donde el método comprende: introducir el vector o vectores en la célula o las células, donde el vector o los vectores impulsan la expresión de uno o más de: una enzima CRISPR, una secuencia guía unida a una secuencia pareja de tracr, una secuencia tracr y un molde para la edición; donde el molde para la edición comprende la mutación o las mutaciones que anulan la escisión de la enzima CRISPR; permitir la recombinación homologa del molde para la edición con el polinucleótido diana en la célula o las células que se van a seleccionar; permitir que un complejo CRISPR se una a un polinucleótido diana para efectuar la escisión del polinucleótido diana dentro de dicho gen, donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana dentro del polinucleótido diana y (2) la secuencia pareja de tracr que se hibrida con la secuencia tracr, donde la unión del complejo CRISPR al polinucleótido diana induce la muerte celular, y permite de esta manera que se seleccionen una o más células procariotas en las que se han introducido una o más mutaciones. En una realización preferida, la enzima CRISPR es Cas9. Algunos aspectos de la invención permiten la selección de células específicas sin requerir un marcador de selección o un proceso de dos pasos que pueda incluir un sistema de contraselección.
En un aspecto, la divulgación proporciona métodos para modificar un polinucleótido diana en una célula eucariota posmitótica. En algunas realizaciones, el método comprende permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleótido diana para efectuar la escisión de dicho polinucleótido diana y modificar de este modo el polinucleótido diana, donde el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada con una secuencia diana dentro de dicho polinucleótido diana, donde dicha secuencia guía se liga a una secuencia pareja de tracr que a su vez se hibrida con una secuencia tracr.
En otras realizaciones, esta divulgación proporciona un método para modificar la expresión de un polinucleótido en una célula eucariota posmitótica. El método comprende incrementar o disminuir la expresión de un polinucleótido diana utilizando un complejo CRISPR que se une al polinucleótido.
Cuando se desee, para efectuar la modificación de la expresión en una célula, uno o más vectores que comprenden una secuencia tracr, una secuencia guía unida a la secuencia pareja de tracr, una secuencia que codifica una enzima CRISPR se suministran a una célula. En algunos métodos, el vector o los vectores comprenden un elemento regulador ligado operablemente a una secuencia codificante de enzimas que codifica dicha enzima CRISPR que comprende una secuencia de ubicación nuclear; y un elemento regulador ligado operablemente a una secuencia pareja de tracr y uno o más sitios de inserción para insertar una secuencia guía en dirección 5' respecto a la secuencia pareja de tracr. Cuando se expresa, la secuencia guía dirige la unión específica respecto a la secuencia de un complejo CRISPR con una secuencia diana en una célula. Normalmente, el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia pareja de tracr que se hibrida con la secuencia tracr.
En algunos métodos, se puede inactivar un polinucleótido diana para efectuar la modificación de la expresión en una célula. Por ejemplo, tras la unión de un complejo CRISPR a la secuencia diana en una célula, el polinucleótido diana se inactiva de modo que la secuencia no se transcriba, la proteína codificada no se produce o la secuencia no funciona como lo hace la secuencia no modificada. Por ejemplo, una proteína o una secuencia codificante de microARN se podrán inactivar de modo que no se produzca la proteína.
En ciertas realizaciones, la enzima CRISPR comprende una o más mutaciones seleccionadas a partir del grupo constituido por D10A, E762A, H840A, N854A, N863a o D986A y/o la mutación o las mutaciones están en un dominio RuvC1 o HNH de la enzima CRISPR o si no era mutación como las que se discuten en la presente. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR tiene una o más mutaciones en un dominio catalítico donde, cuando se transcriben, la secuencia pareja de tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica respecto a la secuencia de un complejo CRISPR con la secuencia diana y donde la enzima comprende además un dominio funcional. En algunas realizaciones, el dominio funcional es un dominio de activación transcripcional, preferentemente VP64. En algunas realizaciones, el dominio funcional es un dominio de represión transcripcional, preferentemente KRAB. En algunas realizaciones, el dominio de represión transcripcional es SID, o concatémeros de SID (p. ej., SID4X). En algunas realizaciones, el dominio funcional es un dominio de modificación epigenética, de modo que se proporciona una enzima de modificación epigenética. En algunas realizaciones, el dominio funcional es un dominio de activación, que podrá ser el dominio de activación P65.
En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima CRISPR de tipo I o III, pero es preferentemente una enzima CRISPR de tipo II. Esta enzima CRISPR de tipo II podrá ser cualquier enzima Cas. Una enzima Cas se podrá identificar como Cas9 ya que esto se puede referir a la clase general de enzimas que comparten homología con la nucleasa más grande con dominios de tipo nucleasa múltiples del sistema CRISPR de tipo II. Más preferentemente, la enzima Cas9 procede de spCas9 o saCas9 o se puede obtener a partir de estas. Con "se puede obtener a partir de" los solicitantes se refieren a que la enzima obtenida a partir de otra se basa en gran medida en una enzima natural, en el sentido que tiene un grado elevado de homología secuencial con ella, pero que se ha mutado (modificado) de alguna manera descrita en la presente.
Se apreciará que las expresiones enzima CRISPR y Cas se utilizan, en general, indistintamente en la presente a menos que lo contrario sea evidente. Tal y como se ha mencionado anteriormente, muchas de las numeraciones de residuos utilizadas en la presente se refieren a la enzima Cas9 del locus CRISPR de tipo II de Streptococcus pyogenes. Sin embargo, se apreciará que esta invención incluye muchas más Cas9s de otras especies de microbios tales como SpCas9, SaCa9, St1Cas9 y así sucesivamente.
En la presente se proporciona un ejemplo de una secuencia con codones optimizados, en este caso optimizada para seres humanos (es decir, que se está optimizando para la expresión en seres humanos), remítase a la secuencia optimizada para los codones humanos de SaCas9. Aunque se prefiere esto, se apreciará que son posibles otros ejemplos y existe constancia de la optimización de codones para una especie hospedadora.
Preferentemente, el suministro adopta la forma de un vector que podrá ser un vector vírico, tal como vectores lenti- o baculo- o preferentemente adenovíricos/víricos adenoasociados, pero se conocen y se proporcionan otros medios de suministro (tales como sistemas de levaduras, microvesículas, cañones de genes/medios de incorporar vectores a nanopartículas de oro). Un vector se podrá referir no solamente a un sistema vírico o de levaduras (por ejemplo, donde los ácidos nucleicos de interés podrán estar ligados operablemente a un promotor y controlados por este (en lo que se refiere a la expresión, tal como a proporcionar en última instancia un ARN procesado)), pero también al suministro directo de ácidos nucleicos en una célula hospedadora. Aunque en los métodos de la presente el vector podrá ser un vector vírico, y este es convenientemente un AAV, se pueden emplear otros vectores víricos como se discute en la presente, tal como un lentivirus. Por ejemplo, se podrán utilizar baculovirus para la expresión en células de insecto. Estas células de insecto podrán a su vez ser útiles para producir grandes cantidades de más vectores, tales como vectores derivados de lentivirus o AAV adaptados para el suministro. También se contempla un método para suministrar la enzima CRISPR de la presente que comprende el suministro a una célula de ARNm que codifica la enzima CRISPR. Se apreciará que en ciertas realizaciones, la enzima CRISPR está truncada y/o comprende menos de mil aminoácidos o menos de cuatro mil aminoácidos y/o es una nucleasa o nickasa, y/o tiene codones optimizados y/o comprende una o más mutaciones y/o comprende una enzima CRISPR quimérica y/o las otras opciones como se ha discutido en la presente. Se prefieren los vectores lentivíricos y de AAV.
En ciertas realizaciones, la secuencia diana está flanqueada o seguida en su extremo 3' por una PAM adecuada para la enzima CRISPR, normalmente una Cas y en particular una Cas9.
Por ejemplo, una PAM adecuada es 5'-NRG o 5'-NNGRR para las enzimas SpCas9 o SaCas9 (o enzimas que se obtienen a partir de ellas), respectivamente.
Se apreciará que SpCas9 o SaCas9 son aquellas procedentes o que se obtienen a partir de S. pyogenes o S. aureus Cas9.
Estas y otras realizaciones se divulgan en la siguiente Descripción Detallada o son obvias a raíz de esta y están abarcadas por esta.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las características novedosas de la invención se exponen con especificidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las cuales se utilizan los principios de la invención, y los dibujos que la acompañan en los cuales:
La Figura 1 muestra un modelo esquemático del sistema CRISPR. La nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes (amarillo) se dirige al ADN genómico mediante un ARN sintético guía (ARNsg) constituido por una secuencia guía de 20 nt (azul) y un esqueleto (rojo). La secuencia guía empareja sus bases con las del ADN diana (azul), en una zona contigua en dirección 5' respecto a un motivo adyacente al protoespaciador 5'-NGG necesario (PAM; magenta) y Cas9 media una rotura bicatenaria (DBS, por sus siglas en inglés) a una distancia de ~3 pb en dirección 5' respecto a PAM (triángulo rojo).
Las Figuras 2A-F muestran un sistema CRISPR ilustrativo, un posible mecanismo de acción, un ejemplo de la adaptación para la expresión en células eucariotas y los resultados de las pruebas que evalúan la ubicación nuclear y la actividad CRISPR.
Las Figuras 3A/D muestran los resultados de una evaluación de la especificidad de SpCas9 por una diana de ejemplo.
Las Figuras 4A-G muestran un sistema vectorial ilustrativo y los resultados de su uso para dirigir la recombinación homóloga en células eucariotas.
La Figura 5 proporciona una tabla de secuencias de protoespaciadores y resume los resultados de la eficacia de la modificación para las dianas de protoespaciadores diseñados basándose en los sistemas CRISPR ilustrativos de S. pyogenes y S. thermophilus con las correspondientes PAM contra los loci en genomas humanos y de ratón. Las células se transfectaron con Cas9 y pre-ARNcr/ARNtracr o ARN quimérico y se analizaron 72 horas después de la transfección. Los porcentajes indel se calculan basándose en los resultados del ensayo de Surveyor de las líneas celulares indicadas (N=3 para todas las dianas de protoespaciadores, los errores son EEM, N.D. indica no detectable utilizando el ensayo Surveyor y N.T. indica no estudiado en este estudio).
Las Figuras 6A-C muestran una comparación de diferentes transcritos de ARNtracr para la modificación dirigida de genes mediada por Cas9.
La Figura 7 muestra un diagrama esquemático de un ensayo de nucleasa surveyor para la detección de microinserciones y -deleciones inducidas por una rotura bicatenaria.
Las Figuras 8A-B muestran vectores de expresión bicistrónicos ilustrativos para la expresión de elementos del sistema CRISPR en células eucariotas.
Las Figuras 9A-C muestran histogramas de las distancias entre la PAM del locus 1 de S. pyogenes SF370 (NGG) (Figura 9A) y la PAM del locus 2 de S. thermophilus LMD9 (NNAGAAW) (Figura 9B) adyacentes en el genoma humano; y las distancias para cada PAM por cromosoma (Cr) (Figura 9C).
Las Figuras 10A-D muestran un sistema CRISPR ilustrativo, un ejemplo de la adaptación para la expresión en células eucariotas y los resultados de las pruebas que evalúan la actividad CRISPR.
Las Figuras 11A-C muestran manipulaciones ilustrativas de un sistema CRISPR cuya diana son los loci genómicos en células de mamíferos.
Las Figuras 12A-B muestran los resultados de la técnica de Northern del procesamiento de ARNcr en células de mamífero.
Las Figuras 13A-B muestran una selección ilustrativa de protoespaciadores en loci de PVALB humana y Th de ratón. La Figura 14 muestra un ejemplo de un protoespaciador y la secuencia PAM correspondiente que son las dianas del sistema CRISPR de S. thermophilus en el locus EMX1 humano.
La Figura 15 proporciona una tabla de secuencias de cebadores y sondas utilizados en los ensayos Surveyor, RFLP, secuenciación genómica y de Northern.
Las Figuras 16A-C muestran una manipulación ilustrativa de un sistema CRISPR con ARN quiméricos y los resultados del ensayo SURVEYOR para determinar la actividad del sistema en células eucariotas.
Las Figuras 17A-B muestran una representación gráfica de los resultados de los ensayos SURVEYOR para determinar la actividad del sistema CRISPR en células eucariotas.
La Figura 18 muestra una visualización ilustrativa de algunos sitios diana de Cas9 de S. pyogenes en el genoma humano utilizando el explorador genómico de UCSC.
Las Figuras 19A-D muestran una representación circular del análisis filogenético que revela cinco familias de Cas9s, incluidos tres grupos de Cas9s grandes (~1400 aminoácidos) y dos de Cas9s pequeñas (~1100 aminoácidos). Las Figuras 20A-F muestran la representación lineal del análisis filogenético que revela cinco familias de Cas9s, incluidos tres grupos de Cas9s grandes (~1400 aminoácidos) y dos de Cas9s pequeñas (~1100 aminoácidos). Las Figuras 21A-D muestran la edición genómica mediante recombinación homóloga. (a) Representación esquemática de la nickasa SpCas9, con una mutación D10A en el dominio catalítico RuvC I. (b) Representación esquemática de la recombinación homóloga (RH) en el locus de EMX1 humano utilizando oligonucleótidos monocatenarios sentido antisentido como moldes para la reparación. La flecha roja de la parte superior indica el sitio de escisión del ARNsg; los cebadores de la PCR para el genotipado (Tablas J y K) se indican como flechas en el cuadro derecho. (c) Secuencia de la región modificada por RH. d, ensayo SURVEYOR para los indels mediados por SpCas-9 no modificada (wt) y la nickasa (D10A) en el locus 1 de la diana de EMX1 (n=3). Las flechas indican las posiciones de los tamaños de los fragmentos esperados.
Las Figuras 22A-B muestran diseños de vectores únicos para SpCas9.
La Figura 23 muestra un gráfico que representa la distribución de la longitud de los ortólogos de Cas9.
Las Figuras 24A-M muestran las secuencias donde se ubican los puntos de mutación dentro del gen de SpCas9. La Figura 25A muestra el mapa del vector dirigido Cas9, Rosa26 condicional.
La Figura 25B muestra el mapa del vector dirigido Cas9, Rosa26 constitutivo.
La Figura 26 muestra una representación esquemática de los elementos importantes en los constructos constitutivos y condicionales de Cas9.
La Figura 27 muestra el suministro y los datos de expresión de Cas9 en el cerebro de ratón in vivo.
La Figura 28 muestra el suministro de ARN de Cas9 y de ARN quimérico en el interior de las células (A) Suministro de un indicador de tipo GFP en forma de ADN o ARNm en el interior de células Neuro-2A. (B) El suministro de Cas9 y ARN quimérico frente al gen Icam2 en forma de ARN da como resultado el corte de uno de los dos espaciadores probados. (C) El suministro de Cas9 y ARN quimérico frente al gen F7 en forma de ARN da como resultado el corte de uno de los dos espaciadores probados.
La Figura 29 muestra cómo la reparación de una rotura bicatenaria (DSB) del AND promueve la edición génica. En la ruta de unión de extremos no homólogos (NHEJ, por sus siglas en inglés) propensa a error, los extremos de una DSB son procesados por la maquinaria de reparación del ADN endógena y se vuelven a unir entre sí, lo que puede dar como resultado mutaciones de inserción/deleción (indel) aleatorias en el sitio de unión. Las mutaciones indel que ocurren dentro de la región codificante de un gen pueden dar como resultado un desplazamiento del marco y un codón de parada prematuro, lo que lleva a la inactivación del gen. Como alternativa, se puede suministrar un molde de reparación en forma de un plásmido u oligodesoxinucleótidos monocatenarios (ODNmc) para impulsar la ruta de la reparación dirigida por homología (HDR, por sus siglas en inglés), que permite una edición precisa y sumamente fiel.
Las Figuras 30A-C muestran los resultados anticipados para la HDR en células HEK y HUES9. (a) Se puede utilizar bien un plásmido dirigido o un ODNmc (sentido o antisentido) con brazos de homología para editar la secuencia en un locus genómico diana escindido por Cas9 (triángulo rojo). Para someter a ensayo la eficacia de la HDR, los autores introdujeron un sitio HindIII (barra roja) en el locus diana, que se amplificó por PCR con cebadores que se hibridaban fuera de la región de homología. La digestión del producto de la PCR con HindIII revela la presencia de eventos de HDR. (b) Se pueden utilizar ODNmc, orientados bien en dirección sentido o antisentido (s o a) respecto al locus de interés, combinados con Cas9 para lograr una edición mediada por HDR eficaz en el locus diana. Se recomienda una región de homología mínima de 40 pb, y preferentemente 90 pb, en cada lado de la modificación (barra roja). (c) Se muestra un ejemplo del efecto de los ODNmc en la HDR en el locus EMX1 utilizando tanto la nickasa Cas9 (D10A) como Cas9 no modificada. Cada ODNmc contiene brazos de homología de 90 pb que flanquean una inserción de 12 pb de dos sitios de restricción.
Las Figuras 31A-C muestran la estrategia de reparación para la mutación delta F508 de la fibrosis quística.
Las Figuras 32A-B muestran (a) una representación esquemática de la expansión de la repetición GAA en el intrón 1 de FXN y (b) una representación esquemática de la estrategia adoptada para escindir la región de expansión de GAA utilizando el sistema CRISPR/Cas.
La Figura 33 muestra un cribado para determinar un direccionamiento eficaz mediado por SpCas9 a los loci génicos Dnmt1, 3a, 3b y Tet1-3. El ensayo SURVEYOR con ADN procedente de células N2A transfectadas demuestra una escisión de ADN eficaz utilizando diferentes ARNg.
La Figura 34 muestra una estrategia de la modificación dirigida genómica múltiple utilizando un sistema vectorial 2 en un sistema de suministro AAV1/2. ARNg de Tet1-3 y Dnmt1, 3a y 3b controlado por el promotor U6. GFP-KASH controlado por el promotor de la sinapsina humana. Los sitios de restricción muestran una estrategia de reemplazo del ARNg simple mediante subclonación. Se muestra SpCas9 con el identificador HA flanqueada por dos señales de ubicación nuclear (NLS, por sus siglas en inglés. Ambos vectores se suministran en el cerebro mediante el virus AAV1/2 con una relación 1:1.
La Figura 35 muestra la verificación de la funcionalidad del vector dirigido de DNMT múltiple #1 utilizando el ensayo SURVEYOR. Las células N2A se cotransfectaron con el vector dirigido de DNMT #1 (+) y el vector que codifica SpCas9 para estudiar la escisión mediada por SpCas9 de loci de la familia de genes DNMT. ARNg solo (-) constituye el control negativo. Se recolectaron las células para la purificación de ADN y el procesamiento posterior 48 h después de la transfección.
La Figura 36 muestra la verificación de la funcionalidad del vector dirigido de DNMT múltiple #2 utilizando el ensayo SURVEYOR. Las células N2A se cotransfectaron con el vector dirigido de DNMT #1 (+) y el vector que codifica SpCas9 para estudiar la escisión mediada por SpCas9 de loci de la familia de genes DNMT. ARNg solo (-) constituye el control negativo. Se recolectaron las células para la purificación de ADN y el procesamiento posterior 48 h después de la transfección.
La Figura 37 muestra un resumen esquemático de versiones de poliA cortas y promotores cortos utilizados para la expresión de HA-SpCas9 in vivo. En la derecha se muestran los tamaños de la región codificante desde L-ITR hasta R-ITR.
La Figura 38 muestra un resumen esquemático de versiones de poliA cortas y promotores cortos utilizados para la expresión de HA-SaCas9 in vivo. En la derecha se muestran los tamaños de la región codificante desde L-ITR hasta R-ITR.
La Figura 39 muestra la expresión de SpCas9 y SaCas9 en células N2A. Inmunoelectrotransferencias representativas de versiones de SpCas9 y SaCas9 con el identificador HA controladas por diferentes promotores cortos y con secuencias cortas de poliA (spA) o por ellas. La tubulina es control de carga. mCherry (mCh) es un control de la transfección. Se recolectaron las células y se procesaron adicionalmente para una inmunoelectrotransferencia 48 h después de la transfección.
La Figura 40 muestra un cribado para determinar un direccionamiento eficaz mediado por SaCas9 al locus génico Tet3. El ensayo SURVEYOR con ADN procedente de células N2A transfectadas demuestra una escisión de ADN eficaz utilizando diferentes ARNg con la secuencia NNGGGT PUM. Las células transfectadas con GFP y las células que expresan solo SaCas9 son los controles.
La Figura 41 muestra la expresión de HA-SaCas9 en el cerebro de ratón. Se inyectó a los ratones en el giro dentado con virus que impulsaban la expresión de HA-SaCas9 controlada por el promotor de la Sinapsina humana. Los animales se sacrificaron 2 semanas después de la cirugía. Se detectó el identificador HA utilizando anticuerpo monoclonal de ratón C29F4 (Cell Signaling). Los núcleos celulares se tiñeron de azul con la tinción DAPI.
La Figura 42 muestra la expresión de SpCas9 y SaCas9 en neuronas primarias corticales en cultivo 7 días después de la transducción. Inmunoelectrotransferencias representativas de versiones de SpCas9 y SaCas9 con el identificador HA controladas por diferentes promotores y con bgh o secuencias cortas de poliA (spA). La tubulina es el control de carga.
La Figura 43 muestra la tinción LIVE/DEAD de neuronas primarias corticales 7 días después de la transducción con partículas de AAV1 que portaban SpCas9 con diferentes promotores y constructos de ARNg múltiples (el ejemplo se muestra en el último cuadro para DNMT). Se compararon las neuronas tras la transducción con AAV con controles de neuronas no transducidas. Los núcleos rojos indican células muertas, permeabilizadas (segunda línea de cuadros). Las células vivas están marcadas con color verde (tercera línea de cuadros).
La Figura 44 muestra la tinción LIVE/DEAD de neuronas primarias corticales 7 días después de la transducción con partículas de AAV1 que portaban SaCas9 con diferentes promotores. Los núcleos rojos indican células muertas, permeabilizadas (segunda línea de cuadros). Las células vivas están marcadas con color verde (tercera línea de cuadros).
La Figura 45 muestra la comparación de la morfología de las neuronas tras la transducción con virus AAV1 que portan SpCas9 y ARNg múltiples para loci de genes TET y DNMT. Se muestran neuronas sin transducción como control.
La Figura 46 muestra la verificación de la funcionalidad del vector dirigido de DNMT múltiple #1 utilizando el ensayo SURVEYOR en neuronas primarias corticales. Las células se cotransdujeron con el vector dirigido de DNMT #1 y virus SpCas9 con diferentes promotores para estudiar la escisión mediada por SpCas9 de loci de la familia de genes DNMT.
La Figura 47 muestra la eficacia in vivo de la escisión por SpCas9 en el cerebro. Se inyectó a los ratones virus AAV1/2 que portaban ARNg múltiples para modificar de manera selectiva loci de genes de la familia DNMT junto con virus SpCas9 controlados por 2 promotores diferentes: Mecp2 de ratón y Map1b de rata. Dos semanas después de la inyección se extrajo tejido cerebral y se prepararon los núcleos y se clasificaron utilizando FACS, basándose en la expresión de GFP impulsada por el promotor Sinapsina del constructo de ARNg múltiple. Después de la extracción del ADNg se llevó a cabo un ensayo Surveyor. indica núcleos positivos para GFP y - el control, núcleos negativos para GFP procedentes del mismo animal. Los números en el gel indican la eficacia evaluada de SpCas9.
La Figura 48 muestra la purificación de núcleos celulares marcados con GFP-KASH procedentes de neuronas del hipocampo. La membrana nuclear externa (MNE) de la membrana nuclear celular se identifica con una fusión de GFP y el dominio transmembrana de la proteína KASH. Expresión marcada de GFP en el cerebro después de una semana de la cirugía estereotáctica e inyección de AAV1/2. Paso de centrifugación en gradiente de densidad para purificar los núcleos celulares del cerebro intacto. Se muestran los núcleos purificados. Se muestra la tinción de la cromatina por el tinte Vybrant® DyeCycle™ Rubí en rojo, los núcleos marcados con GFP son verdes. Perfil FACS representativo de núcleos celulares g Fp+ y GFP-(Magenta: Tinte Vybrant® DyeCycle™ Rubí, Verde: GFP).
La Figura 49 muestra la eficacia de la escisión por SpCas9 en el cerebro de ratón. Se inyectó a los ratones virus AAV1/2 que portaban ARNg múltiples para modificar de manera selectiva loci de genes de la familia TET junto con virus SpCas9 controlados por 2 promotores diferentes: Mecp2 de ratón y Map1b de rata. Tres semanas después de la inyección se extrajo tejido cerebral, se prepararon los núcleos y se clasificaron utilizando FACS, basándose en la expresión de GFP impulsada por el promotor Sinapsina del constructo de ARNg múltiples. Después de la extracción del ADNg se llevó a cabo un ensayo Surveyor. indica núcleos positivos para GFP y - el control, núcleos negativos para GFP procedentes del mismo animal. Los números en el gel indican la eficacia evaluada de SpCas9.
La Figura 50 muestra la expresión de GFP-KASH en neuronas corticales en cultivo. Se transdujeron las neuronas con virus AAV1 que portaban constructos de ARNg múltiples para modificar de manera selectiva loci de genes TET. La señal más fuerte se ubica alrededor de los núcleos celulares debido a la ubicación del dominio KASH.
La Figura 51 muestra (parte superior) una lista de espaciamientos (tal como lo indica el patrón de la disposición para dos secuencias PAM) entre pares de ARN guía. Únicamente los pares de ARN guía que cumplen los patrones 1, 2, 3, 4 exhibieron indels cuando se utilizaron con la nickasa SpCas9(D10A). (Parte inferior) Imágenes del gel que muestra que la combinación de SpCas9(D10A) con pares de ARN guía que cumplen los patrones 1, 2, 3, 4 conllevó la formación de indels en el sitio diana.
La Figura 52 muestra una lista de secuencias del cebador inverso U6 utilizadas para generar los casetes de expresión U6-ARN guía. Cada cebador necesita emparejarse con el cebador directo U6 “gcactgagggcctatttcccatgattc” (SEQ ID NO: 1) para generar amplicones que contengan U6 y el ARN guía deseado. La Figura 53 muestra un mapa de la secuencia genómica del locus Emx1 humano que muestra las ubicaciones de los 24 patrones enumerados en la Figura 33.
La Figura 54 muestra una imagen de un gel (derecha) que indica la formación de indels en el sitio diana cuando están presentes regiones protuberantes 5' variables tras la escisión por la nickasa Cas9 dirigida de diferentes pares de ARN guía. En una tabla (izquierda) que indica los números del carril del gel de la derecha y diversos parámetros que incluyen la identificación de los pares de ARN guía utilizados y la longitud de la región protuberante 5' presente tras la escisión por la nickasa Cas9.
La Figura 55 muestra un mapa de la secuencia genómica del locus Emx1 humano que muestra las ubicaciones de los diferentes pares de ARN guía que dan como resultado los patrones en el gel de la Fig. 54 (derecha) y que se describen adicionalmente en el Ejemplo 35.
La Figura 56A muestra que la guía (diana) 1 indujo el porcentaje más elevado de indel en ApoB.
La Figura 568B muestra los resultados de un ensayo en gel con la nucleasa Surveyor para determinar la eficacia de formación de indel, 4 semanas después de la inyección.
La Figura 57B muestra la tinción con aceite rojo para detectar el fenotipo de acumulación lipídica hepática in vivo tras el suministro de AAV-Cas9-ARNsg. La barra de escala en cada cuadrado representa 20 micrómetros.
La Figura 58 muestra que 21 nt/pares de bases (pb), representados mediante las barras grises, constituyen la longitud óptima del espaciador, al menos en comparación con 20 o 22 pares de bases (representadas mediante las barras negras y blancas, respectivamente) a lo largo de un conjunto de dianas y dentro de dos genes diferentes (AAVS1 y EMX1).
La Figura 59 muestra si podría insertarse una secuencia guía en la secuencia intrónica de Cas9.
La Figura 60 muestra que el promotor H1 completo (barra gris) es todavía más débil que el promotor U6 (barra negra), ya que U6 muestra un incremento de la formación porcentual de indel para cada diana estudiada.
La Figura 61 muestra que un promotor H1 corto es más débil que el H1 completo.
La Figura 62 muestra la distancia entre los extremos 5’ de dos secuencias guía en un constructo medido respecto a la eficacia de escisión de la nickasa doble de SaCas9 D10A.
La Figura 63 (Ejemplo 38) muestra el suministro del sistema CRISPR-Cas9 y el direccionamiento al locus Mecp2 en el cerebro de ratón. (a) Vectores de expresión AAV-SpCas9 y AAV-SpGuía(Mecp2). El vector de ARNsg contiene la secuencia codificante de la proteína de fusión GFP-KASH para la identificación de las neuronas transducidas. (b) Expresión de HA-Cas9 y GFP-KASH en el giro dentado (GD) dorsal del hipocampo de ratón. Barra de escala, 100 pm. (c) Cuantificación de las células a las que el sistema CRISPR-Cas9 vector dual se ha dirigido eficazmente. (d) Representación gráfica del locus Mecp2 de ratón que muestra la ubicación de la diana de Cas9; ARNsg indicado en azul. Secuencia PAM marcada en púrpura. Los patrones de mutaciones representativas detectados mediante la secuenciación del locus Mecp2 se muestran debajo: verde - secuencia no modificada; guiones rojos - bases eliminadas; bases rojas: inserción o mutaciones; la punta de la flecha roja indica el sitio de corte de CR|SPR-Cas9. (e) Gel del ensayo SURVEYOR™ que muestra la modificación del locus Mecp2, 2 semanas después del suministro de AAV en la región del GD. (f) Análisis por inmunoelectrotransferencia de la expresión de la proteína MeCP2 en la región del cerebro diana y cuantificación de los niveles de proteína MeCP2 en el GD dorsal (prueba de la t, **p<0.001, n=4 de 3 animales, barras de error: eem). (g) Imágenes de la región dorsal del GD, 2 semanas después de direccionar CRISPR-Cas al locus Mecp2. Barra de escala, 150 pm. (h) Cuantificación de una población de células positivas para MeCP2 en todas las células detectadas (tinción DAPI) en la región diana del cerebro en comparación con el sitio colateral de control (prueba de la t, ****p<0.0001, n=290 y 249 células procedentes de 2 animales respectivamente; barras de error: eem). (ITR - repetición terminal invertida; HA - identificador de hemaglutinina; NLS - señal de ubicación nuclear; spA - señal de poliadenilación sintética; U6 - promotor PolIII; ARNsg - ARN sencillo guía; hSin - promotor 1 de la sinapsina humano; GFP - proteína fluorescente verde; KASH - dominio transmembrana nuclear de homología Syne, ANC1, Klarsicht; bGH pA - señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino; WPRE - elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de Woodchuck).
La Figura 64 (Ejemplo 38) muestra el análisis de la expresión génica en neuronas con una atenuación génica para MeCP2 mediada por Cas9. (a) Estrategia para la purificación de núcleos celulares de las células diana de CRISPR-Cas9 procedentes del cerebro de ratón. (b) Agrupamiento jerárquico de genes expresados de manera diferencial (prueba de la t, p<0.01, n=19 poblaciones de núcleos clasificados procedentes de 8 animales) detectados según secARN. Los niveles de expresión de log2(TPM+1) relativos de los genes se normalizan para cada fila y se muestran en una escala de color rojo-azul. Cada columna representa una población de 100 núcleos neuronales diana clasificados por FACS procedente de la población de células del giro dentado aisladas, ya sea de los animales transducidos con ARNsg para Mecp2 o de control, tal como se indica.
La Figura 65 (Ejemplo 38) muestra defectos autónomos celulares en las propiedades de respuesta celular de las neuronas tras la atenuación génica de MeCP2 mediada por CRISPR. (a) Dibujo que muestra la configuración del experimento in vivo de la corteza visual del ratón y parámetro de estimulación visual. Se muestra una neurona GFP+. Barra de escala, 20 gm. (b) Dibujo que muestra la configuración registrada en la capa 2/3 de neuronas excitatorias que reciben un estímulo de entrada específico en el ojo tanto contra- como ipsilateral. Las células GFP+ con el genoma modificado están en verde mientras que las células no modificadas están en gris. La forma del impulso normalizada muestra neuronas excitatorias con impulsos regulares. (c,d) Se midió el OSI promedio (c) y FR provocada (d) en células GFP+ que expresaban ARNsg para Mecp2 y de control, respectivamente (prueba de la t, *p<0.05; los números en la gráfica indican los números de células registradas; n=2-3 animales; barras de error: eem).
La Figura 66 (Ejemplo 38) muestra la edición génica múltiple, simultánea en el cerebro de ratón. (a) Ilustración esquemática del sistema CRISPR-Cas9 diseñado para tener múltiples dianas en el genoma. (b) Representación gráfica de los loci DNMT de ratón diana. Los ARN guía se indican en azul. Las secuencias PAM se marcan en púrpura. (c) Gel del ensayo SURVERYOR™ que muestra la modificación de los loci DNMT en células positivas para GFP-KASH clasificadas por FACS, 4 semanas después del suministro de AAV en la región del GD. (d) Análisis basado en la secuenciación profunda de la modificación de loci DNMT en células únicas, que muestra la existencia conjunta de modificación en múltiples loci. (e) Análisis por inmunoelectrotransferencia de las proteínas Dnmt3a y Dnmtl tras el suministro in vivo del sistema CRISPR-Cas9 que tiene como diana genes de la familia DNMT (parte superior). Cuantificación por inmunoelectrotransferencia de los niveles de proteínas Dnmt3a y Dnmtl en el GD después del direccionamiento de CRISPR-Cas9 in vivo (parte inferior; prueba de la t; **p<0.001, *p<0.05, Dnmt3a: n=7; Dnmtl: n=5 procedente de 5 animales; barras de error: eem). (f) Déficits de aprendizaje contextual, 8 semanas después de modificar los genes DNMT utilizando SpCas9 en la región del GD del hipocampo, estudiado en un contexto con entrenamiento y alterado (prueba de la t, ***p<0.0001, n=18 animales, 2 experimentos independientes; barras de error: eem).
La Figura 67 (Ejemplo 38) muestra la clonación y expresión de SpCas9 con el identificador HA (Ha-SpCas9) para el empaquetamiento en AAV. (a) Resumen esquemático de diferentes estrategias de clonación para minimizar el tamaño del casete de expresión de SpCas9 utilizando el promotor Maplb de rata corto (pMap1b), una versión truncada del promotor Mecp2 de ratón (pMecp2) y un motivo de poliA corto (spA). (b) Análisis por inmunoelectrotransferencia de un cultivo de neuronas corticales primarias que expresan HA-SpCas9 utilizando diferentes casetes de expresión de SpCas9. (c) El promotor Mecp2 impulsa la expresión de HA-SpCas9 (rojo) en las neuronas (Map1b, NeuN; flechas) pero no en la astroglía (GFAP, puntas de flecha). Se muestra la expresión conjunta de HA-SpCas9 con GFP-KASH (parte inferior). Se marcaron los núcleos con DAPI (azul). Barras de escala, 20 gm. (d) Resumen esquemático de la identificación con GFP. Se muestra la proteína fluorescente verde (GFP) potenciada fusionada al dominio KASH transmembrana nuclear e integración de GFP-KASH en la membrana nuclear externa. (e) Cálculo de la eficacia de la infección conjunta, que muestra poblaciones de células que expresan tanto HA-SpCas9 como GFP-KASH (n=973 neuronas procedentes de 3 cultivos; barras de error: eem). (f) Se tiñeron las células con el kit LIVE/DEAD® 7 días después del suministro del virus. Cuantificación de células DAPI+ y muertas (MUERTAS+) (control n=518 núcleos DAPI+; SpCas9/GFP-KASH n=1003 núcleos DAPI+ procedentes de 2 cultivos; barras de error: eem). (ITR - repetición terminal invertida; HA - identificador de hemaglutinina; NLS - señal de ubicación nuclear; spA - señal de poliadenilación sintética; U6 - promotor PolIII; ARNsg - ARN sencillo guía; hSin -promotor 1 de la sinapsina humano; GFP - proteína fluorescente verde; KASH - dominio transmembrana nuclear de homología Syne, ANC1, Klarsicht; bGH pA - señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino; WPRE -elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de Woodchuck).
La Figura 68 (Ejemplo 38) muestra la elección como diana de Mecp2 en células Neuro-2a. (a) Secuencias cuya diana es Mecp2 y motivos adyacentes al protoespaciador (PAM) correspondientes. (b) Evaluación de la transfección conjunta de células Neuro-2a con 6 ARNsg para Mecp2 y SpCas9. Se analizaron las eficacias de modificación del locus 48 h después de la transfección utilizando el ensayo SURVEYOR™.
La Figura 69 (Ejemplo 38) muestra CRISPR-SpCas9 dirigido a Mecp2 en neuronas corticales primarias. (a) Tinción inmunofluorescente de MeCP2 (rojo) en neuronas cultivadas 7 días después de la transducción con AAV-CRISPR (verde, GFP-KASH). Se marcaron los núcleos con DAPI (azul). Barra de escala, 20 gm. (b) Evaluación del direccionamiento al locus Mecp2 utilizando SpCas9 o dSpCas9, junto con ARNsg para Mecp2 o ARNsg de control (direccionado al gen lacZ bacteriano), utilizando el ensayo SURVEYOR™ en gel. (c) Cuantificación de núcleos positivos para MeCP2 en una población diana de neuronas (GFP+). (d) Inmunoelectrotransferencia de los niveles de la proteína MeCP2 tras direccionar CRISPR-SpCas9 al locus Mecp2 y cuantificación de los niveles de la proteína MeCP2 (prueba de la t, **p<0.001, n=5 procedente de 3 cultivos, barras de error: eem).
La Figura 70 (Ejemplo 38) muestra los cambios morfológicos en el árbol dendrítico de las neuronas tras la atenuación génica in vitro de MeCP2 mediada por SpCas9. (a) Complejidad reducida del árbol dendrítico en las neuronas después de direccionar CRISPR-SpCas9 al locus Mecp2. Barra de escala, 20 gm. (b) Cambios en la morfología de las espinas dendríticas en las neuronas diana de SpCas9 y ARNsg para Mecp2. Barra de escala, 10 gm. Se visualizó la morfología de las células mediante una transfección conjunta con el constructo mCherry. Se escogieron las células para el análisis de la morfología en función del resultado de la tinción de Mecp2. (c) Morfología del árbol dendrítico evaluada según el número de extremos dendríticos y (d) análisis de Sholl (prueba de la t, ***p<0.0001, n=40 procedente de 2 cultivos). (e) Cuantificación de la densidad de espinas (prueba de la t, ***p<0.0001, n=40 procedente de 2 cultivos, barras de error: eem).
La Figura 71 (Ejemplo 38) muestra la secARN de los núcleos neuronales procedentes de animales de control y de la atenuación génica de Mecp2 mediada por SpCas9. La representación con rectángulos presenta el número de genes detectados a lo largo de la colección de secARN (19 colecciones, cada una de 100 núcleos tomados entre núcleos transducidos con ARNsg de control o ARNsg para Mecp2; n=4 animales/grupo) por cuantil del nivel de expresión. Todos los genes se dividen en 10 cuantiles según su nivel de expresión de log2(TPM+1) medio, a continuación para cada cuantil se contó en cada muestra el número de genes que se detectan (log2(TPM+1)>2). Las tres secuencias diana que se muestran son la SEQ ID NO:_545_, SEQ ID NO:_546_ y la SEQ ID NO:_547_, para Dnmt3a, Dnmt1 y Dnmt3b, respectivamente.
La Figura 72 (Ejemplo 38) muestra el direccionamiento a múltiples dianas genómicas de miembros de la familia DNMT in vitro. (a) Secuencias cuya diana es Dnmt3a, Dnmtl y Dnmt3b y los motivos adyacentes a los protoespaciadores (PAM) correspondientes. (b) Análisis mediante el ensayo con nucleasa SURVEYOR™ de células Neuro-2a 48 horas después de la transfección con el vector con 3xARNsg para DNMT y SpCas9 cuya diana son los loci Dnmt3a, Dnmtl y Dnmt3b. Se muestra una edición genómica eficaz de la totalidad de los tres genes diana. La Figura 73 (Ejemplo 38) muestra la secuenciación de nueva generación de los loci diana Dnmt3a, Dnmtl y Dnmt3b. Ejemplos de los resultados de secuenciación de los loci Dnmt3a (a), Dnmtl (b) y Dnmt3b (c) mutados después del suministro in vivo de SpCas9 y 3xARNsg para DNMT en el giro dentado de ratón. Verde: secuencia no modificada, guiones rojos: bases eliminadas, bases rojas: inserción o mutaciones. Las puntas de flecha rojas indican el sitio de corte de CRISPR-SpCas9. Las secuencias completas utilizadas en esta figura se proporcionan como las SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5 para los loci Dnmt3a, Dnmt1 y Dnmt3b, respectivamente. Estas son:
SEQ ID NO: (Dnmt3a): CCT CCG TGT CAG CGA CCC ATG CCA A
SEQ ID NO: (Dnmt1): CCA GCG TCG AAC AGC TCC AGC CCG
SEQ ID NO: (Dnmt3b) AGA GGG TGC CAG CGG GTA TAT GAG G
La Figura 74 muestra las secuencias de la proteína SaCas9 con codones optimizados (“reopt”) y a las que se han eliminado las señales de ubiquitinización (“reopt(Ub)”) para potenciar la expresión. Las transferencias de proteína frente a SaCas9 con el identificador FLAG y HA muestran aproximadamente un incremento en un factor de 2 de la expresión de SaCas9 optimizada (reopt, n.os 2-4) respecto a los constructores originales (n.os 0, 5 y 6) y un nivel similar a SpCas9 (SpCas9330, barra superior del cuadro de la izquierda; SpCas9414, barra superior del cuadro de la derecha). La adición del identificador 3xHA (cuadro de la derecha n.° 6) mejora la señal de detección respecto al identificador 1xHA (panel de la derecha, n.° 5) en un factor de ~2.
La Figura 75 muestra la eficacia de indel utilizando ARNsg transcrito mediante el promotor U6 tal cual (gris, barra de la izquierda para cada número de nt) o incorporando una “G” (azul, barra de la derecha para cada número de nt y con un borde más grueso) a la posición más 5’ del ARNsg para SaCas9. En el eje x se indican las longitudes de los espaciadores de ARNsg totales (incluida la G). La gráfica representa datos agregados de 5 ARNsg.
La Figura 76 muestra la optimización de la longitud del espaciador del ARNsg (eje x). Las gráficas muestran la formación de indel con longitudes diferentes del espaciador del ARNsg en células HEK (izquierda) y Hepa (derecha). Las figuras de la presente tienen únicamente un objetivo ilustrativo y no están necesariamente dibujadas a escala. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
También con respecto a la información general sobre los sistemas CRISPR-Cas, cabe mencionar:
> Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A. y zhang, F. Science, 15 de febrero;339(6121 ):819-23 (2013); > RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Jiang W., Bikard D., Cox D., Zhang F, Marraffini LA. NatBiotechnol, marzo ; 31(3):233-9 (2013);
> One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Wang H., Yang H., Shivalila CS., Dawlaty MM., Cheng AW., Zhang F., Jaenisch R. Cell 9 de mayo;153(4):910-8 (2013);
> Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Hsu PD, Heidenreich M, Cong L, Platt RJ, Scott DA, Church GM, Zhang F. Nature. 22 de agosto de 2013;500(7463):472-6. doi: 10.1038/Nature12466. Publicación electrónica 23 de agosto de 2013;
> Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity. Ran, FA., Hsu, PD., Lin, CY., Gootenberg, j S., Konermann, S., Trevino, AE., Scott, DA., Inoue, A., Matoba, S., Zhang, Y. y Zhang, F. Cell 28 de agosto. pii: S0092-8674(13)01015-5. (2013J;
> DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Hsu, P., Scott, D., Weinstein, J., Ran, FA., Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, E., Wu, X., Shalem, O., Cradick, TJ., Marraffini, LA., Bao, G. y Zhang, F. Nat Biotechnol doi:10.1038/nbt.2647 (2013);
> Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Ran, FA., Hsu, PD., Wright, J., Agarwala, V., Scott, DA., Zhang, F. Nature Protocols noviembre; 8(11 ):2281 -308. (2013);
> Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Shalem, O., Sanjana, NE., Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA., Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BL., Root, DE., Doench, JG., Zhang, F. Science 12 de diciembre (2013). [Publicación electrónica previa a la impresión];
> Crystal structure of cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Nishimasu, H., Ran, FA., Hsu, PD., Konermann, S., Shehata, SI., Dohmae, N., Ishitani, R., Zhang, F., Nureki, O. Cell 27 de febrero (2014). 156(5):935-49;
> Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Wu X., Scott DA., Kriz AJ., Chiu AC., Hsu PD., Dadon DB., Cheng AW., Trevino AE., Konermann S., Chen S., Jaenisch R., Zhang F., Sharp PA. Nat Biotechnol. (2014) 20 de abril. doi: 10.1038/nbt.2889 y
> Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering, Hsu et al, Cell 157, 1262-1278 (5 de junio de 2014) (Hsu 2014),
y se discute brevemente a continuación:
■ Cong. et al. modificaron los sistemas CRISPR/Cas de tipo II para su uso en células eucariotas basados tanto en la Cas9 de Streptococcus thermophilus como Cas9 de Streptoccocus pyogenes y demostraron que las nucleasas Cas9 se pueden dirigir con ARN cortos para inducir una escisión precisa del ADN en células humanas y de ratón. Su estudio además mostró que Cas9 convertida en una enzima que practica cortes monocatenarios se puede utilizar para facilitar la reparación dirigida por homología en células eucariotas con una mínima actividad mutagénica. Además, su estudio demostró que pueden codificarse múltiples secuencias guía en una única matriz de CRISPR para permitir la edición simultánea de varios sitios de loci genómicos endógenos en el genoma de mamíferos, lo que demuestra una programabilidad fácil y una aplicabilidad amplia de la tecnología de nucleasas guiadas por ARN. Esta capacidad para utilizar el ARN para programar la escisión del ADN específica de la secuencia en las células definió una nueva clase de herramientas de modificación genómica. Esos estudios además mostraron que es probable que se puedan transferir otros loci de CRISPR a las células de mamífero y que también puedan mediar la escisión genómica en mamíferos. De manera importante, se puede prever que se puedan mejorar adicionalmente varios aspectos del sistema CRISPR/Cas para aumentar su eficacia y versatilidad.
■ Jiang et al. utilizaron una endonucleasa Cas9 asociada a las repeticiones palindrómicas cortas espaciadas entre sí regularmente y agrupadas (CRISPR) complejada con ARN duales para introducir mutaciones precisas en los genomas de Streptococcus pneumoniae y Escherichia coli. La estrategia se basó en la escisión dirigida por Cas9:ARN dual en el sitio genómico diana para aniquilar las células no mutadas y evitar que se necesiten marcadores seleccionables o sistemas de contraselección. El estudio señaló la reprogramación de la especificidad del Cas9:ARN dual al cambiar la secuencia del ARN de CRISPR corto (ARNcr) para realizar cambios en un único y en múltiples nucleótidos que se llevan a cabo en los moldes de edición. El estudio mostró que el uso simultáneo de dos ARNcr permitió una mutagénesis múltiple. Además, cuando la estrategia se llevó a cabo combinada con la recombinación, en S. penumoniae, casi el 100% de las células que se recuperaron utilizando la estrategia descrita contuvieron la mutación deseada, y en E. coli, un 65% de las que se recuperaron contuvieron la mutación.
■ Konermann et al. abordaron la necesidad de la técnica de tecnologías versátiles y robustas que permitieran la modulación óptica y química de los dominios de unión a ADN basada en la enzima CRISPR Cas9 y también los efectores de tipo activadores de la transcripción.
■ Tal y como se discute en la presente memoria descriptiva, la nucleasa Cas9 del sistema CRISPR-Cas microbiano se dirige a loci genómicos específicos mediante una secuencia guía de 20 nt, que puede tolerar ciertos emparejamientos erróneos con el ADN diana y de esta manera promueve una mutagénesis fuera de la diana no deseada. Para abordar este problema, Ran et al. describieron una estrategia que combinaba una nickasa Cas9 mutante con ARN guías emparejados para introducir roturas bicatenarias objetivo. Debido a que los cortes monocatenarios individuales en el genoma se reparan con una fidelidad elevada, se requiere la realización de cortes monocatenarios simultáneos mediante ARN guía compensados de manera apropiada para las roturas bicatenarias y extiende el número de bases reconocidas específicamente para una escisión objetivo. Los autores demostraron que utilizando cortes monocatenarios emparejados se puede reducir la actividad fuera de la diana entre 50 y 1500 veces en las líneas celulares y facilitar la inactivación génica en zigotos de ratón sin perder la eficacia de escisión en la diana. Esta versátil estrategia posibilita una amplia variedad de aplicaciones de edición genómica que requieren una especificidad elevada.
■ Hsu et al. caracterizaron la especificidad de direccionamiento de SpCas9 en células humanas para proporcionar información sobre la selección de sitios diana y evitar efectos fuera de la diana. El estudio evaluó >700 variantes de ARN guía y los niveles de mutación indel inducida por SpCas9 en >100 loci fuera de la diana genómicos predichos en células 293T y 293FT. Los autores que SpCas9 tolera emparejamientos erróneos entre el ARN guía y el ADN diana en diferentes posiciones en una manera dependiente de la secuencia, sensible al número, posición y distribución de los emparejamientos erróneos. Los autores además mostraron que la escisión mediada por SpCas9 no se ve afectada por la metilación del ADN y que la dosificación de SpCas9 y ARNsg se puede titular para minimizar la modificación fuera de la diana. Además, para facilitar las aplicaciones en la modificación genómica en mamíferos, los autores mencionaron que proporcionaban una herramienta de software en una página web para guiar la selección y validación de secuencias diana así como también de análisis fuera de la diana.
■ Ran et al. describieron un conjunto de herramientas para la edición genómica mediada por Cas9 mediante la unión de extremos no homólogos (NHEJ) o la reparación dirigida por homología (HDR) en células de mamífero, así como también la generación de líneas celulares modificadas para estudios funcionales posteriores. Para minimizar la escisión fuera de la diana, los autores además describieron una estrategia de cortes monocatenarios dobles que utilizaba la nickasa Cas9 mutante con ARN guía emparejados. El protocolo que los autores proporcionaron obtenía experimentalmente directrices para la selección de sitios diana, evaluación de la eficacia de escisión y análisis de la actividad fuera de la diana. Los estudios mostraron que comenzando con el diseño de la diana, se pueden lograr modificaciones génicas en tan solo 1-2 semanas y se pueden derivar líneas celulares clonales modificadas en 2-3 semanas.
■ Shalem et al. describieron una nueva manera de investigar la función génica a escala hologenómica. Sus estudios mostraron que el suministro de una colección de inactivaciones génicas de CRISPR-Cas9 a escala genómica (GeCKO) que tenía como diana 18080 genes con 64 751 secuencias guía únicas posibilitaba tanto un cribado de selección negativo como positivo en células humanas. En primer lugar, los autores mostraron el uso de la colección GeCKO para identificar genes esenciales para la viabilidad celular en las células madre pluripotentes y cancerosas. A continuación, en un modelo de melanoma, los autores seleccionaron los genes cuya pérdida está involucrada en la resistencia a vemurafenib, un agente terapéutico que inhibe la proteína cinasa BRAF mutante. Sus estudios mostraron que los candidatos con posiciones más elevadas en la clasificación incluían los genes NF1 y MED12 validados previamente, así como también los elementos activos novedosos NF2, CUL3, TADA2B y TADA1. Los autores observaron un nivel elevado de coherencia entre ARN guía independientes que tenían como diana el mismo gen y una tasa elevada de confirmación de elementos activos, y de esta manera demostraron el potencial de cribado a escala genómica con Cas9.
■ Nishimasu et al. publicaron la estructura cristalina de la Cas9 de Streptococcus pyogenes en un complejo con ARNsg y su ADN diana con una resolución de 2.5 A°. La estructura reveló una arquitectura con dos lóbulos, compuesta por lóbulos de reconocimiento de la diana y nucleasa, que alojaba el elemento heterobicatenario ARNsg:ADN en un surco cargado positivamente en su interfaz. Aunque el lóbulo de reconocimiento es esencial para la unión del ARNsg y el ADN, el lóbulo nucleasa contiene los dominios nucleasa RuvC y HNH, los cuales están situados de una manera adecuada para la escisión de las hebras complementaria y no complementaria del ADN diana, respectivamente. El lóbulo nucleasa también contiene un dominio carboxilo-terminal responsable de la interacción con el motivo adyacente al protoespaciador (PAM). Esta estructura con una resolución elevada y los análisis funcionales adjuntos han revelado el mecanismo molecular por el cual Cas9 es direccionada al ADN guiada por el ARN y, por lo tanto, sienta los fundamentos para el diseño racional de nuevas y versátiles tecnologías de edición genómica.
■ Wu et al. han cartografiado los sitios de unión hologenómicos de una Cas catalíticamente inactiva (dCas9) procedente de Streptococcus pyogenes cargada con ARN sencillo guía (ARNsg) en células madre embrionarias de ratón (mESC). Los autores mostraron que cada uno de los cuatro ARNsg probados dirige dCas9 a entre decenas y miles de sitios genómicos, caracterizados frecuentemente por una región de siembra de 5 nucleótidos en el ARNsg y un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) NGG. La inaccesibilidad de la cromatina disminuye la unión de dCas9 a otros sitios con secuencias de siembra emparejadas; por lo tanto, un 70% de los sitios fuera de la diana están asociados con genes. Los autores mostraron que la secuenciación dirigida de 295 sitios de unión de dCas9 en mESC transfectadas con Cas9 catalíticamente activa identificó solamente un sitio mutado por encima de los niveles de referencia. Los autores propusieron un modelo de dos estados para la unión y escisión de Cas9, en el cual un emparejamiento inicial desencadenará la unión pero se requiere un mayor grado de emparejamiento con el ADN diana para la escisión.
■ Hsu 2014 es un artículo de revisión que discute de manera general los antecedentes de CRISPR-Cas9 desde el yogur a la edición genómica, incluido el cribado genético de células, que están en la información, datos y hallazgos de las solicitudes relacionadas con esta memoria descriptiva presentadas antes del 5 de junio de 2014. Los contenidos generales de Hsu 2014 no conllevan los animales y modelos específicos de la presente memoria descriptiva.
La divulgación se refiere a la modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones utilizados para el control de la expresión génica donde se utiliza la modificación dirigida de secuencias, tal como perturbación genómica o edición de genes, que se refieren al sistema CRISPR-Cas y sus componentes. En algunas realizaciones convenientes, la enzima Cas es Cas9.
La secuencia polinucleotídica de CRISPR-Cas se denomina por lo general en la presente guía, o incluso ARN guía (ARNsg), aunque se comprenderá que esa terminología no era común anteriormente. Además, en la presente se hace referencia a un sistema CRISPR-Cas9, aunque se comprenderá que esta es una referencia amplia a cualquier Cas, siempre que tenga una función nucleasa ya sea para inducir una DSB, un corte monocatenario o un corte monocatenario doble, aunque se prefiere Cas9 y se prefiere particularmente SaCas9.
Algunos de los puntos claves en los presentes datos hepáticos se resumen a continuación y se refieren a las células posmitóticas en general, ya que las células hepáticas son típicamente posmitóticas:
AAV2/8
El suministro preferido para el sistema CRISPR-Cas es mediante un vector vírico. Este vector podrá ser un vector lentivírico o un vector de AAV, tal como se discute en cierta profundidad en la presente. Lo que los inventores han mostrado concretamente es que AAV es un ejemplo preferido de un vector vírico. Dentro de esto, los inventores continuaron para demostrar que AAV8, y en particular AAV2/8 (AAV8 empaquetado con una señal ITR de empaquetamiento de AAV2), es útil en el suministro al hígado, especialmente in vivo.
Cambios fenotípicos observados in vivo
Tal como se discute en otro punto, los inventores han sido capaces de demostrar in vivo que se puede detectar un cambio fenotípico. Esto supone un paso significativo hacia adelante ya que en una deficiencia equilibrada normalmente en la iARN no se aprecia un efecto duradero. Con la presente invención, se puede observar un cambio fenotipo en el hígado por primera vez. Una configuración preferida para lograr esto es su utilización en el Ejemplo 36. Los elementos importantes de este se prefieren solos o combinados, concretamente:
SaCas9;
Uso de un ARN guía quimérico que comprende la guía, secuencia tracr y pareja de tracr;
Para la secuencia tracr, se prefiere tracr de Sa para reclutar la SaCas9;
AAV8 o más preferentemente AAV2/8;
A efectos experimentales, Rosa26 es un control negativo útil;
Aunque el uso del promotor de CMV en un vector de AAV es útil, el uso de un promotor específico del hígado (cuando se quiere actuar sobre el hígado) tal como TBG es particularmente eficaz;
• La diana o las dianas podrán estar muy distribuidas ya que se ha demostrado que CRISPR tiene una amplia aplicabilidad a lo largo de las dianas, una vez que las guías se suministran con éxito y las enzimas Cas9 se expresan de manera adecuada. Sin embargo, las dianas preferidas en el hígado (para las cuales se podrán diseñar las guías) incluyen, sin embargo, una o más de las siguientes: PCSK9; Hmgcr; SERPINA1; ApoB; y/o LDL.
En consecuencia, en algunas realizaciones se prefiere particularmente que la enzima Cas sea una SaCas9. Preferentemente, la secuencia polinucleotídica de CRISPR-Cas es quimérica e incluye preferentemente una tracr de Sa donde la Cas9 es una SaCaS9. Se podrá utilizar un vector vírico que es preferentemente AAV2/8. Además, un promotor específico del hígado es ideal y un ejemplo preferido es TBG. Todos estos se podrán utilizar combinados para proporcionar una secuencia polinucleotídica de CRISPR-Cas quimérica que incluye un tracr de Sa, donde la Cas9 es una SaCas9, y el vector es AAV2/8, donde al menos la Cas9 está controlada por un elemento específico del hígado tal como TBG. Cualquiera de las dianas anteriores se podrá utilizar en este sistema, en particular ApoB debido a su importancia en la obesidad.
El último artículo de Yin y Anderson en Nature Biotech (NBT 2884, referenciado en la presente) proporciona un respaldo adicional para los cambios fenotípicos in vivo que los inventores ya han mostrado.
Los datos adicionales que los inventores proporcionan ofrecen entonces un respaldo adicional al demostrar la edición in vivo eficaz del tejido hepático somático mediante Cas9. Además, el suministro mediante AAV2/8 y el uso de una SaCas9 de nuevo muestran la utilidad de esta estrategia particular in vivo. La diana elegida fue de nuevo el preferido ApoB.
Los ejemplos posteriores 36 y 37 muestran unos datos in vivo excelentes para la eficacia para inducir un cambio fenotípico in vivo: específicamente ApoB, un gen del metabolismo lipídico, mientras que el Ejemplo 38 muestra la aplicabilidad de la técnica en las células posmitóticas, de las cuales el hígado es un ejemplo importante. El Ejemplo 39 muestra que se prefieren múltiples epítopos de identificación a efectos de detección.
Aunque se prefieren los vectores víricos, en algunas realizaciones, el uso de péptidos que penetran en las células es una alternativa viable y, por tanto, también se prefiere.
El Ejemplo 36 mostró que se observan cambios genotípicos y, de manera esencial, fenotípicos con sistemas CRISPR-Cas. No solamente esto, sino que el sistema CRISPR-Cas9 fue eficaz para inducir un cambio fenotípico in vivo. Específicamente, la diana fue ApoB, un gen del metabolismo lipídico. Lo que también es alentador es que ApoB se puede considerar el “patrón de oro” en el suministro al hígado y se utiliza ampliamente en modelos de obesidad en ratones. El hígado es una célula posmitótica preferida en algunas realizaciones aunque también podrá excluirse en otras. De cualquier modo, este trabajo proporciona un estudio preliminar demostrativo de que se observa un cambio fenotípico, incluso in vivo, y esto es igualmente aplicable a otras células posmitóticas. Ciertamente, el Ejemplo 38 proporciona un estudio preliminar demostrativo adicional de esto en un tejido independiente, el cerebro, con células posmitóticas. El suministro en el Ejemplo 36 se realizó mediante inyección intravenosa. Se utilizó un vector de AAV, así como también un promotor específico del hígado (TBG) para Cas9. El suministro mediante la expresión a partir de un vector vírico como se observa en la presente es una mejora respecto al uso de Anderson/Yin (NBT 2884) del suministro hidrodinámico como método de suministro, debido a que el suministro hidrodinámico requiere inyectar varios mL de fluido, lo que es estresante para el cuerpo murino y puede ser letal. El suministro hidrodinámico se adecua mejor al suministro del ADN plasmídico (desnudo), mientras que los autores han mostrado que el empaquetamiento de las secuencias de Cas9 y guía en un vector de suministro vírico es preferible desde el punto de vista de un gran incremento de la eficacia. Ciertamente, únicamente es necesario introducir volúmenes relativamente pequeños y esto se puede realizar por vía intravenosa (i.v.), que probablemente será mucho más aceptable desde un punto de vista terapéutico. Lo que fue particularmente alentador fue que no solamente se observó un cambio genotípico en un gen de tipo “patrón de oro” para el hígado tal como ApoB, sino que también se registraron cambios fenotípicos. Trabajos previos con PCSK9 habían mostrado cambios genotípicos pero no fenotípicos, de modo que los cambios fenotípicos observados con ApoB validan la verosimilitud del suministro de CRISPR al hígado y su capacidad para realizar un cambio fenotípico en el hígado. Esto está combinado con un medio de suministro más aceptable terapéuticamente (i.v. en comparación con el suministro hidrodinámico). Como tal, el suministro vírico del sistema CRISPR-Cas9 (guía y Cas9) se prefiere, especialmente por vía intravenosa.
Las posibles dianas incluyen: PCSK9, HMGCR, APOB, LDLR, ANGPTL3, F8, F9/FIX, AAT, FAH, HPD, TAT, ATP7B, UGT1A1, OTC, ARH.
En consecuencia, se proporcionan métodos para inducir un cambio fenotípico in vivo que comprenden administrar el sistema CRISPR-Cas9 a las células diana, por ejemplo, el hígado. En la presente se describen vías de suministro adecuadas, pero se prefiere la inyección i.v. en algunas realizaciones. Se prefieren los vectores víricos, particularmente AAV, en particular AAV serotipo 2/8.
También se proporciona un sistema CRISPR-Cas9 que comprende una o más guías cuya diana son genes del metabolismo lipídico, por ejemplo, ApoB. Los métodos para tratar la obesidad, que comprenden administrar dicho sistema CRISPR-Cas9, también se contemplan. Se prefiere un modelo en ratones que comprenda una o más atenuaciones génicas en el hígado, especialmente de un gen o genes del metabolismo lipídico, por ejemplo, que incluyan ApoB.
Serán evidentes promotores específicos del hígado para la Cas9 pero podrá incluir aquellos mencionados en la presente. Un ejemplo preferido es TBG.
Como se muestra en el Ejemplo 37, la guía podrá tener una longitud de 18-23 nucleótidos. Podrá tener una longitud de 18-22, 19-22, 18-21,20-22, pero preferentemente tendrá 22 y más preferentemente 21 nucleótidos.
También se proporciona un estudio preliminar demostrativo del empaquetamiento con éxito de una secuencia guía en un intrón de SaCas9. En consecuencia, se prefieren los sistemas CRISPR-Cas9, donde se empaquetan una o más secuencias guía (situadas o insertadas) en un intrón de Cas9.
Se puede utilizar el promotor H1 y podrá ser preferible en algunas circunstancias.
Desarrollando el trabajo de Ran (Cell, 154, 21 de agosto de 2013), se investigó el grado de solapamiento en la estrategia de la guía dual utilizando una nickasa doble D10A. Se muestran los resultado óptimos entre -5 y 1 pb (5’ a 5’). En consecuencia, se prefiere el uso de una estrategia con una guía dual para minimizar los efectos fuera de la diana. Estas se solapan preferentemente, o casi se solapan, en sus extremos 5’, en hebras diferentes de ADN en la diana genómica. Preferentemente, el solapamiento está comprendido en el intervalo entre -5 y 1 pb. En estos casos, se comprenderá que Cas9 es una nickasa doble, tal como la variante D10A preferida.
Para la Cas9 se prefieren epítopos de identificación múltiples o repetidos. En particular, en el Ejemplo 39 se mostró que un epítopo de identificación triple mejora la detección. El identificador es preferentemente una repetición, más preferentemente una repetición triple. HA es un epítopo de identificación para Cas9 preferido. Por lo tanto, en algunas realizaciones se prefiere el epítopo de identificación HA triple.
El Ejemplo 38 presenta los siguientes puntos específicos. Proporciona:
- una primera demostración del suministro exitoso de Cas9 mediado por AAV in vivo así como también de la modificación genómica eficaz en neuronas posmitóticas;
- el desarrollo de una técnica de marcaje nuclear que permita el aislamiento fácil de núcleos neuronales a partir de células que expresan ARNsg y Cas9;
- una demostración de aplicaciones respecto al análisis de secARN del transcriptoma neuronal;
- la posible integración de estudios electrofisiológicos y otras técnicas con la perturbación genómica mediada por Cas9 para determinar cambios fenotípicos; y
- una demostración de un direccionamiento múltiple y la capacidad de estudiar la función génica en el comportamiento de roedores utilizando la edición genómica mediada por Cas9.
Basándose en esto, se puede observar que el Ejemplo 38 proporciona un estudio preliminar demostrativo en 2 áreas principales:
• en la comprensión y estudio de la función génica, incluida la creación y estudio de modelos; y
• en la terapia génica.
Un aspecto adicional, discutido adicionalmente a continuación, está relacionado con un método de marcaje nuclear. Se sobreentenderá que la referencia en la presente a los sistemas CRISPR-Cas9 es una manera abreviada de referirse a las enzimas Cas9 proporcionadas en la presente combinadas con las guías o guías utilizadas para dirigirse a una o más secuencias genómicas. La referencia a la guía o las guías incluye el ARNsg, así como también las secuencias polinucleotídicas quiméricas descritas en la presente, que comprende las secuencias guía capaces de hibridarse con las secuencias diana en el genoma del sujeto, una secuencia pareja de tracr y una secuencia tracr. Los datos muestran esencialmente cambios fenotípicos resultado de la atenuación génica utilizando dos sistemas CRISPR-Cas9 separados de acuerdo con la invención (ARN guía combinado con una enzima Cas9), en este caso para perturbar la función génica con éxito. El tejido elegido fue el tejido cerebral, pero los resultados proporcionan un estudio preliminar demostrativo para una amplia gama de tejidos posmitóticos. Esto supone una distinción importante, debido a que las investigaciones previas se han centrado en células en división (es decir, premitóticas). En otras palabras, aunque SpCas9 se ha utilizado ampliamente para modificar células en división, los autores demuestran que SpCas9 también se puede utilizar para modificar el genoma de neuronas posmitóticas. Esto se realiza con suma eficacia mediante la generación de indel mediada por NHEJ para crear atenuaciones génicas, pero también se contemplan los usos terapéuticos que conllevan la corrección mediante el mecanismo HDR (tras proporcionar un molde de reparación). Ambos casos dependen del suministro y expresión funcional con éxito de Cas9 y la guía o guías de ARN, lo que se muestra en la presente.
El hecho de que los cambios genotípicos inducidos por los sistemas CRISPR-Cas9 conlleven posteriormente un cambio fenotípico también es importante para las dos áreas anteriores (función génica y terapia génica).
El primer sistema CRISPR-Cas9 empleó secuencias guía dirigidas a (cuya diana era) Mecp2. Se empleó con éxito un sistema CRISPR-Cas9 vectorial dual, donde un vector comprende la guía y otro comprende Cas9, lo que muestra un estudio preliminar demostrativo adicional para tales sistemas vectoriales duales. El sistema CRISPR-Cas9 vectorial dual se suministró con éxito, mediante inyección estereotáctica, a dos ubicaciones del cerebro separadas, específicamente el giro dentado del hipocampo y la corteza visual. En ambos casos se observó la perturbación génica del mismo gen, Mecp2, lo que indica que el sistema vectorial dual se suministró con éxito y actuó tal y como se esperaba, con transcripción y actividad funcional de la enzima Cas9 (en este caso, una SpCas9) y el reclutamiento con éxito de Cas9 a la secuencia diana genómica mediante las secuencias guía.
El suministro in vivo de SpCas9 y ARNsg mediado por AAV proporciona una tecnología rápida y poderosa para lograr perturbaciones genómicas precisas dentro de circuitos neurales intactos. Como tal, el vector utilizado fue un vector de AAV, lo que proporciona evidencia adicional para su uso en general y en sistemas CRISPR-Cas9 vectoriales duales en particular, especialmente en células y tejidos posmitóticos y, en particular, en el cerebro.
Evidentemente, se comprenderá que la elección del promotor es importante para lograr la expresión a partir del sistema CRISPR-Cas9, en particular Cas9 o la guía o guías y Cas9. A partir de la bibliografía se pueden determinar ejemplos adecuados para la especificidad de la célula y la etapa del ciclo vital celular. No obstante, los autores proporcionan algunos ejemplos no limitantes: TBG, un promotor específico del hígado y se utiliza en la presente para impulsar la expresión de SaCas9; el promotor H1; un promotor H1 truncado; el promotor U6. Asimismo, como las guías no requieren necesariamente un promotor específico, se podrían empaquetar de manera similar una o más guías en el/un intrón de Cas9.
El segundo sistema CRISPR-Cas9 utilizado incluyó una estrategia múltiple. Una ventaja clave del sistema SpCas9 es su capacidad para facilitar una edición genómica múltiple. Este segundo sistema se dirigió con éxito a tres o más genes de la misma familia (en este caso, Dmntl, 3a y 3b) incluyendo guías adecuadas y conllevó inactivaciones génicas estables de múltiples genes. Esto tiene implicaciones amplias para la exploración de la función no solamente de genes individuales, sino también de familias génicas completas, en los tejidos de animales vivos. Esto es especialmente importante para tejidos tales como el cerebro donde esto no había sido posible anteriormente, o se podía lograr únicamente mediante largos años de prácticas genéticas convencionales. Los autores han demostrado que una perturbación génica única o múltiple (incluso una atenuación génica completa) puede ocurrir en células posmitóticas en un animal normal. Sin embargo, esto se podría aplicar igualmente a un organismo modelo (por ejemplo, uno que ya porte una perturbación o mutación génica o que comprenda la expresión alterada de algún tipo) o un organismo transgénico, lo que supone una alternativa rápida a los métodos existentes para producir organismos modelo y utilizar organismos modelo para comprender la función génica. Se podrían emplear guías adicionales (y/o sistemas CRISPR-Cas9 completos) para generar ciclos posteriores de perturbaciones y/o reinstauraciones génicas (reparación de la función génica, por ejemplo, mediante la corrección de gen perturbado al proporcionar, por ejemplo, un molde de reparación, tal como un ADNmc adecuado para la HDR) dentro del mismo organismo.
De hecho, en general, el direccionamiento a uno o múltiples genes mediado por SpCas9 puede recapitular fenotipos morfológicos, electrofisiológicos y conductuales observados utilizando modelos en ratones genéticos clásicos y que requieren más tiempo.
Como alternativa a la atenuación génica de familias completas de genes o genes relacionados, los datos de la presente también proporcionan un estudio preliminar demostrativo de que la atenuación génica simultánea de tres o más genes no relacionados es igualmente factible. Esto es aplicable en todos los tejidos, pero se presenta de manera especialmente marcada con respecto a tejidos posmitóticos, especialmente el cerebro.
Otro aspecto útil del trabajo es que mostró que se podía poner en práctica una estrategia combinada, o integrada, para estudiar la función génica, que emplea CRISPR para efectuar un cambio genotípico y utilizar a continuación herramientas clásicas tales como la electrofisiología (particularmente relevante para el tejido cerebral y del SNC), lecturas bioquímicas, de secuenciación, electrofisiológicas y/o conductuales para establecer que, si hay alguno, los cambios fenotípicos son el resultado del cambio genotípico inducido por el sistema CRISPR-Cas9. Por ejemplo, en el cerebro, esto permite el estudio de la función de genes individuales así como también como de grupos de estos en los procesos neurales y sus funciones en los trastornos del cerebro in vivo.
La perturbación con éxito de los genes en este trabajo es igualmente aplicable a la corrección o reinstauración de la función génica, es decir, el uso de sistemas CRISPR-Cas9 en la terapia génica. Particularmente, en relación con la elección como diana de células posmitóticas, especialmente el cerebro.
En general, el uso de los sistemas CRISPR-Cas9 muestra mejoras respecto a las técnicas existentes, tales como los dedos de Zn, que requieren un tiempo prolongado para su diseño y producción y no pueden multiplicarse, y el ARNhc, que tiene demasiados efectos fuera de la diana, mientras que los efectos fuera de la diana de CRISPR se pueden minimizar utilizando estrategias con una nickasa doble.
Modificación dirigida de tejidos
El trabajo de la presente respalda el uso de sistemas CRISPR-Cas9 para elegir como diana genes en células posmitóticas mediante el suministro del sistema CRISPR-Cas9 en la ubicación apropiada (es decir, a las células en los órganos o tejidos de interés). Los tejidos preferidos están comprendidos en los siguientes órganos:
• Riñón;
• Sistema digestivo, incluidos el estómago, páncreas, duodeno, íleon y/o colon;
• Corazón;
• Pulmón;
• Cerebro, en particular, neuronas y/o SNC en general;
• Ojo, incluido el tejido retiniano;
• Oído, incluido el oído interno;
• Piel;
• Músculo;
• Hueso; y/o
• Hígado en general.
Se comprenderá que muchos de los anteriores podrán comprender células premitóticas, pero que este aspecto de la invención se refiere a células o tejidos posmitóticos comprendidos en esos órganos.
Se prefiere que el órgano sea el riñón o el cerebro. En el cerebro, los datos muestran específicamente el suministro al giro dentado del hipocampo y la corteza visual, que son los tejidos preferidos, aunque en algunas realizaciones también se prefieren otros tejidos, incluidos uno o más cualesquiera de los siguientes: corteza motora primaria, corteza auditiva primaria, corteza somatosensorial primaria, cerebelo, bulbo olfativo primario, corteza prefrontal, núcleo endopiriforme, amígdala, sustancia negra, cuerpo estriado, pallidum, tálamo, hipotálamo, núcleo parabranquial, complejo olivar superior, núcleo coclear, núcleos mamilares.
Las células del cerebro, y las neuronas en particular, son especialmente preferidas.
La elección del promotor para impulsar la expresión del sistema CRISPR-Cas9, especialmente la Cas9, es importante, tal y como se ha mencionado anteriormente. Cuando se está seleccionando un promotor se ha de tener en cuenta la etapa del ciclo celular (temprana/tardía) y el tipo celular, ya que los promotores serán específicos para uno o más tipos celulares y etapas del ciclo celular. En algunas realizaciones, los promotores adecuados podrán incluir uno o más cualesquiera de los siguientes:
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El sistema CRISPR-Cas9 vectorial dual utilizado para dirigirse al cerebro, en particular, el giro dentado del hipocampo, empaquetó los casetes de expresión de ARNsg y SpCas9 en dos vectores víricos independientes. Las Cas9, en particular SpCas9, por lo tanto, se suministran de manera preferida mediante vectores adenovíricos, especialmente AAV (es decir, como AAV-SpCas9). Las guías se suministran preferentemente como casetes de expresión de ARNsg mediante vectores adenovíricos, especialmente AAV (es decir, AAV-SpGuía). Una vía preferida para este tejido (el giro dentado del hipocampo), y para el cerebro en general, es la inyección estereotáctica.
Comprensión y prueba de la función génica y creación y uso de modelos para llevarlo a cabo
Las afecciones que se podrían examinar incluyen la de Huntington, pero esencialmente incluyen cualquier afección observada en células posmitóticas y especialmente aquellas que podrán beneficiarse de su estudio in vivo o que carecen de un modelo útil.
Tal y como se mencionó anteriormente, los sistemas CRISPR-Cas9 se pueden utilizar para investigar la función de uno o más genes en las células posmitóticas. Esto se podrá lograr mediante el suministro y la expresión del sistema CRISPR-Cas9 a la célula posmitótica, donde la guía o guías del sistema CRISPR-Cas9 se diseñan para reclutar Cas9 en la diana o dianas genómicas de interés. Igualmente, cuando Cas9 ya esté comprendida en la célula posmitótica, en forma proteica (transcrita), entonces será suficiente el suministro de las guías a la célula posmitótica. Cuando Cas9 ya esté comprendida en la célula posmitótica, en polinucleótido (no transcrito), entonces será necesario el suministro de las guías a la célula posmitótica así como también la inducción de la transcripción del polinucleótido de Cas9. En esta situación podrá ser conveniente tener Cas9 controlado por un promotor inducible o reprimible, tal como el sistema de encendido-apagado tet (tetraciclina).
Un aspecto que es particularmente prometedor es la integración de las técnicas CRISPR con ensayos fenotípicos para determinar los cambios fenotípicos, si hay alguno, que son el resultado de las perturbaciones génicas, especialmente las atenuaciones génicas. Por ejemplo, el Ejemplo 40 muestra lo que se puede lograr con perturbaciones genómicas dirigidas acopladas con lecturas cuantitativas para proporcionar una idea de la función biológica de elementos genómicos específicos. En particular, la edición genómica in vivo mediada por Cas9 en el cerebro también se puede acoplar con el registro electrofisiológico para estudiar los efectos de la perturbación genómica en componentes del circuito o tipos celulares específicos. En un sentido más amplio, el uso de los sistemas CRISPR-Cas9 (para proporcionar perturbaciones genómicas mediadas por Cas9) se puede combinar con análisis bioquímicos, de secuenciación, electrofisiológicos y conductuales para estudiar la función del elemento genómico diana.
Por lo tanto, en un aspecto se proporciona: un método para investigar la función de uno o más genes en una célula posmitótica, que comprende: inducir un genotipo deficiente o una atenuación génica tal como se describe posteriormente; y determinar cambios en la expresión de uno o más genes en la afección y de este modo investigar la función del gen o genes.
Opcionalmente, el método también podrá incluir: trasplantar la segunda población de células en el sujeto para inducir esta manera la afección asociada con el genotipo deficiente o la atenuación génica. Esto podrá realizarse antes del paso determinante.
Lo siguiente se aplica de manera amplia a aspectos apropiados de la invención. La célula podrá estar en un sujeto, tal como un ser humano, animal u organismo modelo, de modo que la función génica se investigue in vivo. Sin embargo, también se contempla que la célula pueda estar ex vivo, por ejemplo, en un cultivo celular o en un órgano modelo u organoide. En algunas realizaciones, el método podrá incluir aislar una primera población de células del sujeto, opcionalmente cultivarlas y transducirlas con uno o más sistemas CRISPR-Cas9. A continuación se podrá cultivar durante más tiempo. A continuación, podrá tener lugar el trasplante de las células transducidas de nuevo en el sujeto.
La célula podrá proceder de cualquiera de los tejidos u órganos descritos en la presente. El cerebro es un ejemplo preferido, que hace posible dicho método de investigación de la función de uno o más genes, donde la célula posmitótica es una célula cerebral, por ejemplo, una neurona. Particularmente in vivo, esto permite la investigación de la función génica en el comportamiento animal. Preferentemente, el animal es un mamífero, por ejemplo, un roedor. Dada la complejidad del sistema nervioso, que está constituido por redes intrincadas de tipos celulares heterogéneos, la capacidad de editar eficazmente el genoma de las neuronas in vivo hace posible estudiar de manera directa la función génica en tipos celulares relevantes integrados en contextos naturales. Esto está respaldado por los datos de los autores, donde los ratones con inactivaciones génicas mostraron un trastorno de la consolidación de la memoria cuando se sometieron a pruebas en condiciones de contexto de entrenamiento. Los resultados de la presente demuestran que la inactivación génica mediada por CRISPR-Cas9 de los miembros de la familia DNMT en las neuronas del giro dentado es suficiente para explorar la función de los genes en tareas conductuales.
Esto muestra la versatilidad de las Cas9 para facilitar la inactivación génica dirigida en el cerebro de mamíferos in vivo, para estudiar las funciones génicas y, en particular, para disecar los circuitos neuronales. La introducción de inactivaciones génicas estables en múltiples genes en el cerebro de animales vivos tendrá aplicaciones potencialmente de largo alcance, tal como la investigación causal de los mecanismos multigénicos en las afecciones fisiológicas y neuropatológicas.
Los detalles específicos de este trabajo son que los solicitantes escogieron el promotor Mecp2 de ratón (235 pb, pMecp2)7 y una señal de poliadenilación mínima (48 pb, spA) en función de su capacidad para lograr niveles suficientes de la expresión de SpCas9 en neuronas corticales de ratón primarias cultivadas. El gen Mecp2 desempeña una función principal en el síndrome de Rett, un tipo de trastorno del espectro autista. Para tener como diana Mecp2, en primer lugar los autores diseñaron varios ARNsg cuya diana era el exón 3 del gen Mecp2 de ratón y evaluaron su eficacia utilizando las células Neuro-2a. Se identificó el ARNsg más eficaz utilizando el ensayo con nucleasa SURVEYOR. El suministro se realizó mediante la inyección estereotáctica de una mezcla (proporción 1:1) de un título elevado de AAV-SpCas9 y AAV-SpGuía. Los autores también estudiaron con éxito la posibilidad de una edición genómica múltiple en el cerebro. Los solicitantes diseñaron un vector de expresión de ARNsg múltiple constituido por tres ARNsg en tándem, junto con GFP-KASH para el marcaje del núcleo.
Por lo tanto, también se proporcionan métodos para inducir afecciones caracterizadas por una o más atenuaciones génicas en una célula posmitótica. Los ejemplos de tales afecciones son numerosos, pero podrán incluir el síndrome de Rett, tal y como se ha ejemplificado. Los promotores adecuados serán evidentes y el promotor Mecp2 es ideal para el síndrome de Rett. Una manera de seleccionar un promotor para impulsar la expresión del sistema CRISPR-Cas9, en particular la Cas9, es seleccionar el promotor para el gen de interés.
Por lo tanto, en un aspecto, se proporciona: un método para inducir afecciones caracterizadas por uno o más genes (o genotipos) deficientes o atenuaciones génicas en una célula posmitótica, que comprende:
transducir una primera población de células con una composición modificada o de origen no natural que comprende un sistema vectorial que comprende uno o más vectores que comprenden
I. un primer elemento regulador ligado operablemente a una secuencia polinucleotídica de un ARN quimérico (ARNqui) de un sistema CRISPR-Cas, donde la secuencia polinucleotídica comprende
(a) una, dos, tres, cuatro o más secuencias guía capaces de hibridarse con tres o más secuencias diana en el genoma del sujeto,
(b) una secuencia pareja de tracr, y
(c) una secuencia tracr, y
II. un segundo elemento regulador ligado operablemente a una secuencia codificante de enzimas que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de ubicación nuclear (NLS), donde (a), (b) y (c) se disponen en una orientación 5' a 3',
donde los componentes I y II se ubican en el mismo vector o en diferentes vectores del sistema, donde cuando se transcriben, la secuencia pareja de tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica respecto a la secuencia de complejos CRISPR con la secuencia diana,
donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana y (2) la secuencia pareja de tracr que se hibrida con la secuencia tracr,
donde la enzima CRISPR altera el genoma de la primera población de células para obtener una segunda población de células que portan el gen o los genes deficientes o el gen o los genes atenuados.
Opcionalmente, el método también podrá incluir: aislar una primera población de células a partir del sujeto.
Opcionalmente, el método también podrá incluir: trasplantar la segunda población de células en el sujeto para inducir de esta manera la afección proliferativa.
Esto podrá conllevar inducir un genotipo no funcional (que incluye el parcialmente no funcional) en la célula diana, para proporcionar de esta manera un modelo para el estudio (que incluye la restauración futura del genotipo funcional).
Los sistemas CRISPR-Cas9 también se pueden utilizar para facilitar el estudio de las funciones génicas en los ensayos celulares al hacer posible la inactivación génica dirigida en las neuronas posmitóticas.
Los métodos para suministrar nucleótidos a las células neuronales son muy conocidos y se revisan en The Journal of Neuroscience, de Karra y Dahm (5 de mayo de 2010, 30(18): 6171-6177; doi: 10.1523/JNEUROSCI.0183-10.2010). Los ejemplos incluyen los métodos de transfección eléctrica (tales como la electroporación, nucleofección y electroporación de una única célula); métodos de transfección química (tales como la co/precipitación con fosfato de Ca2+ y la lipofección); suministro vírico (tal como adenovírico, virus adeno-asociado (AAV), lentivírico y virus del herpes simple); y métodos de transfección física (tales como la microinyección y biolística (partículas de oro recubiertas con ADN). Todos estos se pueden utilizar para el suministro del sistema CRISPR-Cas9, pero se prefieren la lipofección o los métodos víricos, especialmente AAV o lentivíricos.
Modelos
Se proporcionan modelos con atenuaciones génicas en uno o múltiples genes. Un ejemplo sería un modelo en roedores del síndrome de Rett, una atenuación génica de Mecp2. Otros incluyen las atenuaciones génicas de la familia Dmnt, específicamente atenuaciones génicas de Dmnt1, 3a y 3b. Como tales, se proporcionan modelos que estudian afecciones neurológicas. Todo lo que se necesita hacer es identificar los genes diana de interés, diseñar una guía o guías adecuadas e incluirlas en un sistema CRISPR-Cas9 adecuado y suministrarlo a la célula o células posmitóticas ya sea in vivo o ex vivo, según sea necesario. Por ejemplo, se proporcionan modelos que podrán tener una morfología del árbol dendrítico y/o una densidad de espinas alteradas.
Tal y como se ha mencionado anteriormente, también se proporcionan tejidos modelo, tales como organoides o un “hígado en una matriz” o equivalentes de estos no hepáticos tales como tejidos del oído, riñón y cerebro, por ejemplo, en una matriz o soportados sobre un esqueleto. Se prefieren los modelos en animales y tejidos modelo. Estos se podrán haber transformado previamente con Cas9 de modo que comprendan Cas9 en forma de nucleótido o proteína, tal como se ha mencionado anteriormente. Estos tienen la ventaja de que no es necesario suministrar Cas9 junto con la guía o las guías y, a su vez, esto podrá permitir que se incorpore un grado mucho mayor de multiplicación (de las guías) en los vectores de suministro. De nuevo, el uso de sistemas inducibles o reprimibles tales como tet-encendido o tet-apagado podrá ser conveniente aquí.
Todos estos modelos se obtienen utilizando el sistema CRISPR-Cas9 tal como se ha descrito anteriormente. Debido a la versatilidad del sistema CRISPR-Cas9, la gama de modelos posibles, ya sean de seres humanos, roedores, mamíferos o de otro tipo es sumamente diversa y se puede establecer mediante una simple selección de la guía o las guías apropiadas. También se proporcionan métodos para crear tales modelos que comprenden
Terapia génica
Los datos en el Ejemplo 40 se centran en la perturbación génica, principalmente atenuación génica. La atenuación génica probablemente será tan solo una parte pequeña, aunque importante, del conjunto total de posibles aplicaciones de los sistemas CRISPR-Cas9 en la terapia génica. Como ya se ha mostrado en el artículo de Yin y Anderson (Nature Biotech 2884, publicado en internet el 30 de marzo de 2014), se puede restaurar un fenotipo funcional tras la corrección de una mutación deficiente en la tirosinemia hereditaria de tipo I (HTI), una afección de otro modo letal provocada por una mutación de la fumarilacetoacetato-hidrolasa (FAH) (de G a A en el último nucleótido del exón 8) que provoca que no se tenga en cuenta el exón 8 durante el corte y empalme y conlleva la formación de una proteína FAH truncada, inestable, que da como resultado la acumulación de metabolitos tóxicos. La corrección de la mutación con la A para recuperar el genotipo con la G natural dio como resultado el fenotipo restaurado.
Como tal, las estrategias que se implementan en la presente demuestran que la presente invención se puede aplicar razonablemente a la terapia génica. En particular, la estrategia con el vector dual, la estrategia del marcaje nuclear, los detalles específicos del suministro al cerebro (la forma de inyección, los promotores y/o vectores víricos utilizados), así como también la multiplicación (utilización de múltiples guías para múltiples dianas en el mismo gen o en genes diferentes) se podrían aplicar igualmente en la terapia génica correctora (es decir, donde se corrige un genotipo deficiente) como en la atenuación génica ejemplificada. La principal diferencia entre la terapia génica correctora y la atenuación génica es que con el fin de corregir un genotipo deficiente, tal como una mutación de punto único (por ejemplo, en la fibrosis quística, remítase a la referencia de Schwank et al., Cell Stem Cell 13, 653­ 658, 5 de diciembre de 2013), es conveniente proporcionar un molde de reparación para estimular el mecanismo de HDR e idealmente proporcionar asimismo una nickasa Cas9 adecuada.
En consecuencia, los vectores de la presente tienen como diana preferentemente células posmitóticas. Cuando la guía o las guías tienen como diana un genotipo deficiente, también se proporcionan preferentemente con un molde de reparación, por ejemplo, ADNmc correspondiente a la secuencia corregida (un genotipo que proporcione un fenotipo funcional). En la presente se describen moldes de reparación. Se podrá proporcionar la Cas9 en el mismo vector o en un vector diferente del de la guía o las guías. Los vectores son preferentemente vectores víricos, más preferentemente vectores adenovíricos y de la manera más preferida vectores de AAV. El suministro a las células se realiza preferentemente mediante inyección intravenosa o mediante inyección estereotáctica, según sea apropiado.
La selección del promotor también puede ser importante y en la presente se proporcionan ejemplos convenientes. Se proporcionan métodos para tratar afecciones o enfermedades genéticas provocadas por un genotipo deficiente en las células posmitóticas, o asociadas con este, que comprenden suministrar el sistema CRISPR-Cas9 a la célula apropiada. Un genotipo deficiente podrá ser el genotipo no natural. En particular, las mutaciones de punto único y/o los trastornos monogénicos son especialmente adecuados para su tratamiento utilizando sistemas CRISPR-Cas9. Cuando múltiples genes requieren la edición o corrección, entonces se podrá utilizar una estrategia múltiple para tenerlos a todos como diana simultáneamente. Como alternativa, se podrían contemplar dos o más rondas de sistemas CRISPR-Cas9 diferentes. Preferentemente la corrección obtendrá un genotipo natural. Este no ha de ser necesariamente el genotipo más común, siempre que se restaure o mejore la función en el fenotipo.
Un ejemplo de un fenotipo restaurado es la restauración de la audición para restaurar la función de VGLUT3 y, por tanto, la audición en el oído interno de ratones (Omar Akil, Rebecca P. Seal, Kevin Burke, Chuansong Wang, Aurash Alemi, Matthew During, Robert H. Edwards, Lawrence R. Lustig. Restoration of Hearing in the VGLUT3 Knockout Mouse Using Virally Mediated Gene Therapy. Neuron, 2012; 75 (2): 283 DOI: 10.1016/j.neuron.2012.05.019). Esto se logró utilizando el suministro mediado por AAV del propio VGLUT3, pero es totalmente verosímil que el sistema CRISPR-Cas9 también pueda utilizarse, preferentemente utilizando también vectores de AAV para tener como diana las células del oído interno y corregir el genotipo VGLUT3 no funcional, con consecuencias fenotípicas similares, concretamente la restauración de la audición. Como tal, se prefiere el suministro del sistema CRISPR-Cas9 al oído interno, preferentemente utilizando vectores de AAV, por lo tanto, para tratar la pérdida de audición. Ciertamente, se prefiere la restauración de la función génica en los órganos sensoriales tales como el ojo, incluida la retina, nariz y oído (particularmente el oído interno).
Un artículo de revisión relativamente reciente, que incluye una discusión de trastornos en los tejidos posmitóticos (ojo, oído y otros) es el de Kaufmann et al. (EMBO Mol Med (2013, 5, págs. 1642-1661). Esto confirma la utilidad de AAV en la corrección de trastornos monogénicos en los tejidos posmitóticos. Afirma que “combinados con otras características tales como una actividad inflamatoria baja, han mostrado tener un excelente perfil de seguridad y, por lo tanto, son unas herramientas sumamente atractivas para la terapia génica in vivo. Ciertamente, Glybera® es un AAV recombinante para la inyección intramuscular directa...”. El artículo, con citas, revisa la terapia génica en la retina, sistema nervioso central, hígado, músculo esquelético y cardiaco como tejidos diana. Y, con citas, indica que “los estudios iniciales hicieron uso del vector prototipo de a Av serotipo 2, el conjunto de vectores de AAV se ha expandido recientemente para incluir serotipos adicionales e incluso cápsides modificadas”. Kaufmann y los documentos citados por Kaufmann se incorporan a la presente por referencia.
Análisis de secARN del transcriptoma
La combinación de la perturbación genómica mediada por SpCas9 y el análisis de secARN del nivel de la población proporciona una manera de caracterizar la regulación transcripcional y sugiere genes que podrán ser importantes en funciones específicas o procesos patológicos en las células que se están considerando. En particular, las células proceden del cerebro, en particular neuronas. Las técnicas de actuación rápida tales como un sistema CRISPR-Cas9 son convenientes para estudiar el transcriptoma, el cual es, por su naturaleza, transitorio. Como tal, se proporciona el uso de sistemas CRISPR-Cas9 de acuerdo con la presente invención en el análisis del transcriptoma (secARN).
Método de mareaje nuclear
Para facilitar la identificación inmunofluorescente de neuronas que expresan SpCas9, los autores marcaron SpCas9 con un epítopo de identificación HA (derivado de la hemaglutinina de influenza humana, un epítopo de identificación general utilizado ampliamente en los vectores de expresión).
Para el vector AAV-SpGuía, los solicitantes empaquetaron un casete de expresión de U6-ARNsg así como también la proteína fluorescente verde (GFP) fusionada con el dominio transmembrana nuclear KASH impulsado por el promotor de la Sinapsina I humano. La proteína de fusión GFP-KASH dirige GFP a la membrana nuclear externa y hace posible la identificación en función de la fluorescencia y la purificación de los núcleos neuronales intactos transducidos con AAV-SpGuía.
En consecuencia, los vectores de la presente invención se adaptan preferentemente de una manera similar. Por lo tanto, se proporcionan los vectores donde Cas9 se marca con un epítopo de identificación, tal como el epítopo de identificación HA. La Cas9 podrá ser cualquiera de las Cas9 descritas en la presente, por ejemplo, Sp o SaCas9 y podrá ser cualquier variante (tal como una nickasa doble D10A, etc.), siempre que estén marcadas o se puedan marcar de manera apropiada.
Los vectores también se podrán adaptar de modo que el ARN guía se empaquete en un casete de expresión, que comprende:
• una proteína indicadora; y
• opcionalmente, un promotor adecuado para el ARN guía, tal como U6;
donde la proteína indicadora se fusiona con un dominio transmembrana nuclear ligado operablemente a un promotor adecuado para este.
La proteína indicadora es preferentemente una proteína fluorescente, por ejemplo, una proteína fluorescente verde, roja o amarilla (GFP, RFP, YFP) y así sucesivamente.
Los ejemplos de dominios transmembrana nucleares incluyen los dominios de tipo KASH, dominios Sun2, dominios LEM. En algunas realizaciones preferidas, el dominio transmembrana nuclear es el transmembrana nuclear KASH. Preferentemente, el promotor para el dominio transmembrana es el promotor de la Sinapsina I humano; remítase también a los documentos citados en la presente.
Esta estrategia de marcaje se podrá utilizar con sistemas vectoriales únicos o duales, pero preferentemente con sistemas vectoriales duales ya que el espacio está limitado en los sistemas vectoriales únicos y asimismo disminuye la necesidad de identificadores separados.
Además, cada aspecto de esta técnica de marcaje se puede utilizar independientemente del otro, de manera que el marcaje con epítopos de la Cas9 se puede utilizar solo o la estrategia con un casete de proteína indicadora/fluorescente se puede utilizar sola o, más preferentemente, ambos se pueden utilizar juntos.
Kanasty y Anderson (Nature Materials, vol 12 noviembre de 2013) es un artículo de revisión útil, presentado inicialmente el 11 de marzo de 2013 y publicado en internet el 23 de octubre de 2013 de un suministro de iARN. Debido a las similitudes entre las secuencias guía de CRISPR y iARN, los contenidos de este y de otros documentos de la técnica en lo que se refiere a la iARN proporcionan información de los mecanismos de suministro de las guías en el sistema CRISPR-Cas9 de los autores. Asimismo, algunas de las técnicas descritas también son adecuadas para el suministro de la Cas9. En algunos casos, podrá ser útil suministrar las guías del sistema CRISPR-Cas9 de los autores independientemente de la Cas9. Esto podrá ser parte de un sistema de suministro vectorial dual, donde se consideran los vectores en su sentido más amplio simplemente como un medio cualquiera de suministro, más que como vectores específicamente víricos. Se contempla que la Cas9 podrá suministrarse mediante un vector vírico y que las guías específicas para las dianas genómicas se suministren por separado. Tal y como se discute en la presente, las guías se podrían suministrar mediante los mismos tipos de vectores que para Cas9, por ejemplo, un sistema vectorial dual donde se suministra la Cas9 en un vector de AAV y la guía o las guías se suministran en un vector de AAV separado. Esto se puede realizar de una manera sustancialmente simultánea (es decir, suministro conjunto), pero también se podría realizar en puntos separados en el tiempo, separados incluso por semanas o meses. Por ejemplo, si se ha suministrado una primera ronda de sistemas CRISPR-Cas9, pero a continuación se requiere proporcionar posteriormente guías adicionales, entonces se podrá reutilizar la Cas9 original que se espera que sea todavía funcional en las células diana. Si la Cas9 está controlada por un promotor inducible, entonces se prefiere la inducción de la transcripción de la Cas9 nueva en las células diana. Igualmente, si se utiliza un modelo que expresa Cas9 proporcionado en la presente, entonces únicamente se necesita el suministro de la guía o las guías. En consecuencia, cuando se requiere el suministro de la guía o las guías independientemente de Cas9, entonces se podrá suministrar esencialmente de la misma manera que la iARN. Como tal, el artículo de revisión de Kanasty es útil para identificar varias estrategias conocidas que sean adecuadas, centrándose especialmente en el hígado, aunque los medios de suministro son generalmente apropiados para una amplia gama de células. Los ejemplos incluyen:
• “Un sistema de suministro liposomal, así como también ARNip conjugado con moléculas lipófilas, interacciona con lipoproteínas séricas y posteriormente consigue entrar en los hepatocitos que captan estas lipoproteínas”; • PEGilación;
• Conjugados tales como:
a. Policonjugados dinámicos (DPC, por sus siglas en inglés, nanopartículas de 10 nm), de las que se ha demostrado que suministran iARN para suprimir con éxito ApoB (de este modo se cruza con el trabajo de los autores para actuar sobre ApoB mediante un sistema CRISPR-Cas9); y
b. Conjugados de GalNac con tres ramas
c. son “ambos sumamente eficaces, especialmente GalNac;
• Otras nanopartículas incluyen:
d. Nanopartículas poliméricas de ciclodextrina (CDP, por sus siglas en inglés), que incluyen componentes de formulación adicionales tales como adamantina-PEG (AD-PEG) y adamantina-PEG-transferrina (AD-PEG-Tf);
e. Nanopartículas lipídicas (LNP, por sus siglas en inglés), que incluyen lípidos catiónicos o ionizables, lípidos protectores, colesterol y ligandos de direccionamiento endógenos o exógenos. Un ejemplo de un ligando de direccionamiento endógeno es la proteína de unión a retinol (RBP, por sus siglas en inglés) útil para el direccionamiento a las células estrelladas pancreáticas y hepáticas, que expresan el receptor de RBP. Un ejemplo de un ligando de direccionamiento exógeno es GalNac, que también tiene como diana el hígado mediante el receptor de asialoglicoproteína en los hepatocitos. Se observa una estrategia combinada en los ALN-VSP de Anlylams;
• “Los orificios en el endotelio hepático permiten que moléculas con un diámetro de 100-200 nm abandonen por difusión el torrente sanguíneo y entren en los hepatocitos y otras células hepáticas”;
• Los ligandos tales como GalNAc son adecuados para suministro a las células hepáticas no parenquimatosas que expresan el receptor de manosa y a los hepatocitos donde se ha demostrado que la conjugación de ARNip adecuado con un ligando GalNAc suprime con éxito PCSK9; y
• Las nanopartículas oligonucleotídicas (ONP, por sus siglas en inglés) compuestas por fragmentos de ADN complementario diseñados para hibridarse en una estructura 3D predefinida. Con la utilización de secuencias protuberantes 3’ adecuadas, se podrían incorporar 6 hebras de ARNip a cada partícula, incluso en una posición especificada. El diámetro hidrodinámico fue de aproximadamente 29 nm.
Se prefieren estas estrategias en algunas realizaciones para el suministro de al menos las guías para un sistema CRISPR-Cas9. Se prefieren especialmente los policonjugados dinámicos o el uso de ligandos de direccionamiento endógenos tales como la proteína de unión a retinol o ligandos de direccionamiento exógeno tales como GalNac.
Sistemas y/o formulaciones de suministro de partículas:
Existe constancia de la utilidad de varios tipos de sistemas y/o formulaciones de suministro de partículas en un diverso espectro de aplicaciones biomédicas. En general, se define una partícula como un objeto pequeño que se comporta como unidad solidaria con respecto a su transporte y propiedades. Las partículas se clasifican además de acuerdo con su diámetro. Las partículas gruesas incluyen un intervalo comprendido entre 2500 y 10 000 nanómetros. Las partículas finas tienen un tamaño comprendido entre 100 y 2500 nanómetros. Las partículas ultrafinas, o nanopartículas, tienen un tamaño comprendido por lo general entre 1 y 100 nanómetros. El fundamento del límite de 100 nm es el hecho de que las propiedades nuevas que diferencian las partículas del material a granel se desarrollan normalmente en una escala de longitud crítica inferior a 100 nm.
Tal y como se utiliza en la presente, se define un sistema/formulación de suministro de partículas como cualquier sistema/formulación de suministro biológico que incluye una partícula de acuerdo con la presente invención. Una partícula de acuerdo con la presente invención es cualquier entidad que tiene una dimensión máxima (p. ej., diámetro) inferior a 100 micras (pm). En algunas realizaciones, las partículas de la invención tienen una dimensión máxima inferior a 10 pm. En algunas realizaciones las partículas de la invención tienen una dimensión máxima inferior a 2000 nanómetros (nm). En algunas realizaciones, las partículas de la invención tienen una dimensión máxima inferior a 1000 nanómetros (nm). En algunas realizaciones, las partículas de la invención tienen una dimensión máxima inferior a 900 nm, 800 nm, 700 nm, 600 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm o 100 nm. Normalmente, las partículas de la invención tienen una dimensión máxima (p. ej., diámetro) de 500 nm o menos. En algunas realizaciones, las partículas de la invención tienen una dimensión máxima (p. ej., diámetro) de 250 nm o menos. En algunas realizaciones, las partículas de la invención tienen una dimensión máxima (p. ej., diámetro) de 200 nm o menos. En algunas realizaciones, las partículas de la invención tiene una dimensión máxima (p. ej., diámetro) de 150 nm o menos. En algunas realizaciones, las partículas de la invención tienen una dimensión máxima (p. ej., diámetro) de 100 nm o menos. Las partículas más pequeñas, p. ej., que tiene una dimensión máxima de 50 nm o menos se utilizan en algunas realizaciones de la invención. En algunas realizaciones, las partículas de la invención tienen una dimensión máxima comprendida entre 25 nm y 200 nm.
La caracterización de las partículas (incluidas por ejemplo la dimensión, morfología característica, etc.) se realizó utilizando varias técnicas diferentes. Las técnicas comunes son la microscopía electrónica (TEM, SEM), la microscopía de fuerza atómica (AFM), la dispersión dinámica de la luz (DLS), espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS), difracción de rayos X de polvo (XRD), espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier (FTIR), espectrometría de masas con tiempo de vuelo con desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI-TOF), espectroscopía ultravioleta-visible, interferometría de polarización dual y resonancia magnética nuclear (RMN). La caracterización (mediciones de la dimensión) se podrá realizar con partículas naturales (es decir, antes de añadir la carga) o después de añadir la carga (en la presente la carga se refiere a, p. ej., uno o más componentes del sistema CRISPR-Cas, p. ej., el ARNm o ARN guía o enzima de CRISPR, o cualquier combinación de estos y podrá incluir portadores y/o excipientes adicionales) para proporcionar partículas con un tamaño óptimo para el suministro en cualquier aplicación in vitro, ex vivo y/o in vivo de la presente invención. En ciertas realizaciones preferidas, la caracterización de la dimensión de las partículas (p. ej., diámetro) se basa en mediciones que utilizan la dispersión por láser dinámica (DLS). Cabe mencionar la patente de EE. UU. N.° 8709843; patente de EE. UU. N.° 6007845; patente de EE. UU. N.° 5 855 913; patente de EE. UU. N.° 5 985 309; patente de EE. UU. N.° 5 543 158; y la publicación de James E. Dahlman y Carmen Barnes et al., Nature Nanotechnology (2014) publicada en internet el 11 de mayo de 2014, doi:10.1038/nnano.2014.84, que trata sobre partículas, métodos para su elaboración y utilización y mediciones de estas.
Los sistemas de suministro de partículas comprendidos en el alcance de la presente invención se podrán proporcionar en cualquier forma, incluidas, sin carácter limitante, las partículas sólidas, semisólidas, en emulsión o coloidales. Como tal, cualquiera de los sistemas de suministro descritos en la presente, que incluyen, sin carácter limitante, p. ej., sistemas basados en lípidos, liposomas, micelas, microvesículas, exosomas o cañón de genes se podrán proporcionar como sistemas de suministro de partículas comprendidos en el alcance de la presente invención.
Nanopartículas
En lo que se refiere a esta invención, se prefiere tener uno o más componentes del complejo CRISPR, p. ej., el ARNm o el ARN guía o la enzima de CRISPR suministrados utilizando nanopartículas o envueltas lipídicas. Se podrán utilizar otros vectores o sistemas de suministro junto con los aspectos de nanopartículas de la invención. En general, una “nanopartícula” se refiere a cualquier partícula que tiene un diámetro inferior a 1000 nm. En ciertas realizaciones preferidas, las nanopartículas de la invención tienen una dimensión máxima (p. ej., diámetro) de 500 nm o menos. En otras realizaciones preferidas, las nanopartículas de la invención tienen una dimensión máxima comprendida entre 25 nm y 200 nm. En otras realizaciones preferidas, las nanopartículas de la invención tienen una dimensión máxima de 100 nm o menos. En otras realizaciones preferidas, las nanopartículas de la invención tienen una dimensión máxima comprendida entre 35 nm y 60 nm.
Las nanopartículas englobadas en la presente invención se podrán proporcionar en diferentes formas, p. ej., como nanopartículas sólidas (p. ej., metálicas tales como de plata, oro, hierro, titanio, no metálicas, sólidos con base lipídica, polímeros), suspensiones de nanopartículas o combinaciones de estas. Se podrán preparar nanopartículas metálicas, dieléctricas y semiconductoras así como también estructuras híbridas (p. ej., nanopartículas núcleocoraza). Las nanopartículas elaboradas con un material semiconductor también se podrán denominar puntos cuánticos si son lo suficientemente pequeñas (normalmente inferiores a 10 nm) para que tenga lugar la cuantización de los niveles energéticos electrónicos. Tales partículas a nanoescala se utilizan en aplicaciones biomédicas como portadores farmacológicos o agentes para obtener imágenes y se podrán adaptar para objetivos similares en la presente invención.
Se han producido nanopartículas suaves y semisólidas y están comprendidas en el alcance de la presente invención. Una nanopartícula prototipo de naturaleza semisólida es el liposoma. En la actualidad se utilizan en el ámbito clínico varios tipos de nanopartículas liposómicas como sistemas de suministro de fármacos contra el cáncer y vacunas. Las nanopartículas con una mitad hidrófila y la otra mitad hidrófoba se denominan partículas Janus y son especialmente eficaces para estabilizar emulsiones. Se pueden autoensamblar en la superficie interfacial agua/aceite y actúan como surfactantes sólidos.
La patente de EE. UU. N.° 8709843 proporciona un sistema de suministro de fármacos para el suministro dirigido de partículas que contienen un agente terapéutico a los tejidos, células y compartimentos intracelulares. La invención proporciona partículas dirigidas que comprenden un polímero conjugado con un surfactante, lípido o polímero hidrófilo.
La patente de EE.UU. N.° 6 007 845 proporciona partículas que tienen un núcleo de un copolímero multibloque formado mediante la unión covalente de un compuesto multifuncional con uno o más polímeros hidrófobos y uno o más polímeros hidrófilos y contiene un material biológicamente activo.
La patente de EE. UU. N.° 5 855 913 proporciona una composición particulada que tiene partículas aerodinámicamente ligeras que tienen una densidad aparente del polvo después de hacer vibrar el contenido inferior a 0.4 g/cm3 con un diámetro medio comprendido entre 5 qm y 30 qm, que incorpora un surfactante en su superficie para el suministro del fármaco al sistema pulmonar.
La patente de EE. UU. N.° 5985309 proporciona partículas que incorporan un surfactante y/o un complejo hidrófilo o hidrófobo de un agente terapéutico o diagnóstico cargado positiva o negativamente y una molécula cargada con carga opuesta para su suministro en el sistema pulmonar.
La patente de EE. UU. N.° 5543 158 proporciona nanopartículas inyectables biodegradables que tienen un núcleo sólido biodegradable que contiene un material biológicamente activo y restos de poli(alquilenglicol) en la superficie. El documento WO2012135025 (también publicado como US20120251560) describe polímeros de polietilenimina (PEI) conjugados y azamacrociclos conjugados (denominados de manera global “lipómero conjugado” o “lipómeros”). En ciertas realizaciones, se puede contemplar que tales lipómeros conjugados se puedan utilizar en el contexto del sistema CRISPR-Cas para lograr perturbaciones genómicas in vitro, ex vivo e in vivo para modificar la expresión génica, incluida la modulación de la expresión proteica.
En una realización, la nanopartícula podrá ser un lípido-polímero modificado con un epóxido, convenientemente 7C1 (remítase, p. ej., a James E. Dahlman y Carmen Barnes et al., Nature Nanothechnology (2014) publicado en internet el 11 de mayo de 2014, doi:10.1038/nnano.2014.84). C71 se sintetizó haciendo reaccionar lípidos con un epóxido terminal C15 con PEI600 con una proporción molar de 14:1, y se formuló con C14PEG2000 para producir nanopartículas (diámetro entre 35 y 60 nm) que fueron estables en una solución de PBS durante al menos 40 días. Se podrá utilizar un polímero-lípido modificado con un epóxido para suministrar el sistema CRISPR-Cas a células pulmonares, cardiovasculares o renales, sin embargo, el experto en la técnica podrá adaptar el sistema para el suministro a otros órganos diana. Se contemplan dosificaciones comprendidas entre aproximadamente 0.05 y aproximadamente 0.6 mg/kg. También se contemplan dosificaciones a lo largo de varios días o semanas, con una dosificación total de aproximadamente 2 mg/kg.
Una ventaja de los métodos de la presente es que el sistema CRISPR evita la unión fuera de la diana y los consiguientes efectos secundarios. Esto se logra utilizando sistemas dispuestos para tener un grado elevado de especificidad secuencial por el ADN diana.
Cas9
Se podrá utilizar la optimización de Cas9 para mejorar la función o para desarrollar nuevas funciones, se pueden generar proteínas Cas9 quiméricas. Los ejemplos que los solicitantes han generado se proporcionan en el Ejemplo 6. Se pueden obtener proteínas Cas9 quiméricas combinando fragmentos procedentes de diferentes Cas9 homólogas. Por ejemplo, en la presente se describen dos ejemplos de proteínas Cas9 quiméricas procedentes de Cas9s. Por ejemplo, los solicitantes fusionaron el extremo N de St1Cas9 (el fragmento de esta proteína está en negrita) con el extremo C de SpCas9. El beneficio de obtener Cas9s quiméricas incluye alguno de los siguientes o todos ellos: toxicidad reducida; expresión mejorada en células eucariotas; especificidad mejorada; peso molecular reducido de la proteína, por ejemplo, obtener una proteína más pequeña combinando los dominios más pequeños de diferentes Cas9 homólogas; y/o alterar los requisitos de la secuencia PAM.
Se podrá utilizar Cas9 como una proteína de unión a ADN genérico. Por ejemplo, y tal como se muestra en el Ejemplo 7, los solicitantes utilizaron Cas9 como una proteína de unión a ADN genérico mutando los dos dominios catalíticos (D10 y H840) responsables de escindir ambas hebras del ADN diana. Con el fin de aumentar la transcripción génica en un locus diana, los solicitantes fusionaron un dominio de activación transcripcional (VP64) con Cas9. Existe constancia de otros dominios de activación transcripcionales. Tal y como se muestra en el Ejemplo 17, es posible la activación transcripcional. Tal y como se muestra también en el Ejemplo 17, la represión génica (en este caso del gen beta-catenina) es posible utilizando un represor Cas9 (dominio de unión al ADN) que se una a la secuencia génica diana y reprima de esta manera su actividad.
Se pueden suministrar Cas9 y uno o más ARN guía utilizando un virus adenoasociado (AAV), lentivirus, adenovirus u otro plásmido o tipos de vectores víricos, en particular, utilizando las formulaciones y dosis de, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. con N.os 8454972 (formulaciones, dosis para adenovirus), 8404658 (formulaciones, dosis para AAV) y 5846946 (formulaciones, dosis para ADN plasmídico) y de ensayos clínicos y publicaciones acerca de ensayos clínicos en los que se utilizan lentivirus, AAV y adenovirus. Por ejemplo, para AAV, la vía de administración, formulación y dosis puede ser como en la patente de los EE. UU. con N.° 8454972 y como en los ensayos clínicos en los que se utilizan AAV. Para adenovirus, la vía de administración, formulación y dosis puede ser como en la patente de los EE. UU. con N.° 8404658 y como en los ensayos clínicos en los que se utilizan adenovirus. Para el suministro con plásmidos, la vía de administración, formulación y dosis puede ser como en la patente de los EE. UU. con N.° 5846946 y como en los ensayos clínicos en los que se utilizan plásmidos. Las dosis se pueden basar en un individuo de 70 kg de promedio, o extrapolarse a partir de este, y se pueden ajustar para pacientes, sujetos, mamíferos con pesos diferentes y de especies diferentes. La frecuencia de administración está comprendida en las competencias del facultativo médico o veterinario (p. ej., médico, veterinario), dependiendo de factores normales que incluyen la edad, sexo, salud general, otras afecciones del sujeto o paciente y la afección o síntomas particulares que se están abordando.
Los vectores víricos se pueden inyectar en el tejido de interés. Para la modificación genómica específica del tipo celular, la expresión de Cas9 puede estar impulsada por un promotor específico de un tipo celular. Por ejemplo, la expresión hepatoespecífica podrá utilizar el promotor de la albúmina y la expresión específica de las neuronas podrá utilizar el promotor de la sinapsina I.
Animales transgénicos
También se proporcionan animales (modelos) transgénicos y lo siguiente se aplica de igual forma a tejidos y colecciones de tejidos modelo ex vivo, tales como organoides, hígado en una matriz y demás. Los ejemplos preferidos incluyen animales que comprenden Cas9, en lo que se refiere a polinucleótidos que codifican Cas9 o la propia proteína. Se prefieren ratones, ratas y conejos. Para generar ratones transgénicos con los constructos, tal y como se ejemplifica en la presente, se puede inyectar ADN lineal, puro en el pronúcleo de un zigoto de una hembra con un pseudoembarazo, p. ej., una hembra CB56. A continuación se podrán identificar los fundadores, genotiparlos y retrocruzar en ratones CB57. A continuación se podrán clonar los constructos y verificarlos opcionalmente, por ejemplo, mediante secuenciación Sanger. Se conciben elementos inactivados génicamente donde, por ejemplo, se inactivan uno o más genes en un modelo. Sin embargo, también se conciben inserciones génicas (solas o combinadas). Se generó un ejemplo de un ratón con una inserción génica Cas9 y esto se ejemplifica, pero se prefieren las inserciones génicas Cas9. Para generar un ratón con una inserción génica Cas9 se pueden dirigir los mismos constructos constitutivos y condicionales al locus Rosa26, tal como se describe en la presente (Figs. 25A-B y 26). Se podrán alterar los métodos de las patentes de los EE. UU. con N.os de publicación 20120017290 y 20110265198 adjudicadas a Sangamo BioSciences, Inc. que se refieren a métodos que tienen como diana el locus Rosa para utilizar el sistema CRISPR Cas. En otra realización, también se podrán alterar los métodos de la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20130236946 adjudicada a Cellectis que se refieren a métodos que tienen como diana el locus Rosa para utilizar el sistema CRISPR Cas.
Utilidad del ratón Cas9 condicional: los solicitantes han demostrado en células 293 que el constructo de expresión de Cas9 condicional se puede activar mediante la expresión conjunta con Cre. Los solicitantes han demostrado también que R1 mESC modificadas de manera dirigida correctamente pueden tener una Cas9 activa cuando se expresa Cre. Debido a que Cas9 está seguida por la secuencia de escisión peptídica de P2A y a continuación EGFP, los solicitantes identifican una expresión exitosa observando EGFP. Los solicitantes han demostrado activación de Cas9 en mESC. Este mismo concepto es el que hace que el ratón Cas9 condicional sea tan útil. Los solicitantes podrán cruzar su ratón Cas9 condicional con un ratón que exprese ubicuamente Cre (línea ACTB-Cre) y podrán lograr un ratón que exprese Cas9 en cada célula. Solamente se debería necesitar el suministro de ARN quimérico para inducir la edición genómica en ratones embrionarios o adultos. De manera interesante, si el ratón Cas9 condicional se cruza con un ratón que expresa Cre controlado por un promotor específico del tejido, únicamente debería haber Cas9 en los tejidos que también expresen Cre. Esta estrategia se podrá utilizar para editar el genoma únicamente en tejidos concretos suministrando el ARN quimérico al mismo tejido.
Como se ha mencionado anteriormente, también se proporcionan animales transgénicos. En este aspecto, se prefieren los animales transgénicos, especialmente mamíferos tal como el ganado (vacas, ovejas, cabras y cerdos), pero también las aves de corral y los insectos comestibles.
Virus adenoasociado (AAV)
En lo que se refiere al suministro in vivo, AAV es más conveniente respecto a otros vectores víricos por un par de razones:
Toxicidad baja (esta se puede deber a que el método de purificación no requiere ultracentrifugación de partículas celulares que puedan activar la respuesta inmunitaria).
Probabilidad baja de provocar mutagénesis por inserción debido a que no se integra en el genoma del hospedador.
AAV tiene un límite de empaquetamiento de 4.5 o 4.75 Kb. Esto significa que Cas9 así como también un promotor y un terminador de la transcripción tendrán que poder introducirse en el mismo vector vírico. Los constructos más grandes de 4.5 o 4.75 Kb conllevarán un reducción significativa de la producción vírica. SpCas9 es bastante grande, el propio gen tiene más de 4.1 Kb, lo que hace que sea difícil de empaquetar en un AAV. Por lo tanto, las realizaciones de la invención incluyen utilizar homólogos de Cas9 que sean más cortos. Por ejemplo:
Especies Tamaño de Cas9
Corynebacter diphtheriae 3252
Eubacterium ventriosum 3321
Streptococcus pasteurianus 3390
Lactobacillus farciminis 3378
Sphaerochaeta globus 3537
Azospirillum B510 3504
Gluconacetobacter diazotrophicus 3150
Neisseria cinerea 3246
Roseburia intestinalis 3420
Parvibaculum lavamentivorans 3111
Staphylococcus aureus 3159
Nitratifractor salsuginis DSM 16511 3396
Campylobacter lari CF89-12 3009
Streptococcus thermophilus LMD-9 3396
Por lo tanto, estas especies son, en general, las especies de Cas9 preferidas. Los solicitantes han demostrado el suministro y los datos de expresión de Cas9 en el cerebro de ratón in vivo.
Se prefieren dos maneras de empaquetar moléculas de ácido nucleico que codifican Cas9, p. ej., ADN, en vectores víricos para mediar la modificación genómica in vivo:
Para lograr la inactivación génica mediada por NHEJ:
Vector vírico único:
Vector que contiene dos o más casetes de expresión:
Promotor-molécula de ácido nucleico que codifica Cas9-terminador
Promotor-ARNg1-terminador
Promotor-ARNg2-terminador
Promotor-ARNg(N)-terminador (hasta el tamaño límite del vector)
Vector vírico doble:
Vector 1 que contiene un casete de expresión para impulsar la expresión de Cas9
Promotor-molécula de ácido nucleico que codifica Cas9-terminador
Vector 2 que contiene un casete de expresión más para impulsar la expresión de uno o más ARN guía Promotor-ARNg1-terminador
Promotor-ARNg(N)-terminador (hasta el tamaño límite del vector)
Para mediar la reparación dirigida por homología. Además de las estrategias del vector vírico único y doble descritas anteriormente, se utiliza un vector adicional para suministrar un molde de reparación dirigida por homología.
El promotor utilizado para impulsar la expresión de la molécula de ácido nucleico que codifica Cas9 puede incluir: La ITR de AAV puede actuar como promotor: esto es conveniente para eliminar la necesidad de un elemento promotor adicional (que puede ocupar espacio en el vector). El espacio adicional liberado se puede utilizar para impulsar la expresión de elementos adicionales (ARNg, etc.). Asimismo, la actividad de la ITR es relativamente débil, así que se puede utilizar para reducir la toxicidad debida a la sobreexpresión de Cas9.
Para la expresión ubicua se pueden utilizar los promotores: CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, cadena ligera o pesada de la ferritina, etc.
Para la expresión en el cerebro, se pueden utilizar los promotores: SinapsinaI para todas las neuronas, CaMKIIalfa para las neuronas excitatorias, GAD67 o GAD65 o VGAT para las neuronas GABAérgicas, etc.
Para la expresión en el hígado, se puede utilizar el promotor de la albúmina.
Para la expresión en el pulmón, se puede utilizar SP-B.
Para las células endoteliales, se puede utilizar ICAM.
Para las células hematopoyéticas, se puede utilizar IFNbeta o CD45.
Para los osteoblastos, se puede utilizar OG-2.
El promotor utilizado para impulsar el ARN guía puede incluir:
promotores de Pol III tal como U6 o H1
La utilización del promotor de Pol II y casetes intrónicos para expresar ARNg
En lo que se refiere a AAV, el AAV puede ser AAV1, AAV2, AAV5 o cualquier combinación de estos. Se puede seleccionar el AAV de los AAV teniendo en cuenta las células que se quieren modificar de manera dirigida; p. ej., se pueden seleccionar los serotipos 1,2, 5 de AAV o una cápside híbrida de AAV1, AAV2, AAV5 o cualquier combinación de estos para que tengan como diana células neuronales o del cerebro; y se puede seleccionar AAV4 para que tenga como diana el tejido cardiaco. AAV8 es útil para el suministro al hígado. Los promotores y vectores anteriores se prefieren individualmente.
El suministro de ARN también es un método útil para el suministro in vivo. La Figura 27 muestra el suministro y los datos de expresión de Cas9 en el cerebro de ratón in vivo. Es posible suministrar Cas9 y ARNg (y, por ejemplo, el molde de reparación por RH) a las células utilizando liposomas o nanopartículas. Por lo tanto, el suministro de la enzima CRISPR, tal como Cas9 y/o el suministro de los ARN de la invención, se podrá producir en forma de ARN y mediante microvesículas, liposomas o nanopartículas. Por ejemplo, el ARNg y el ARNm de Cas9 se pueden empaquetar en partículas liposomales para el suministro in vivo. Los reactivos de transfección liposomal tales como lipofectamina de Life Technologies y otros reactivos comercializados pueden suministrar de manera eficaz moléculas de ARN en el hígado.
También es útil la mejora de la eficacia de la RH o NHEJ para el suministro. Se prefiere mejorar la eficacia de la NHEJ mediante la coexpresión de enzimas que procesan el extremo tal como Trex2 (Dumitrache et al. Genetics. agosto de 2011; 188(4): 787-797 h Se prefiere incrementar la eficacia de la RH inhibiendo de manera transitoria la maquinaria de la NHEJ tal como Ku70 y Ku86. También se puede incrementar la eficacia de la RH coexpresando enzimas de recombinación homóloga eucariotas o procariotas tales como RecBCD, RecA.
En la presente se describen varios medios de suministro y se discuten adicionalmente en esta sección.
Suministro vírico: La enzima CRISPR, por ejemplo, una Cas9 y/o cualquiera de los ARN de la presente, por ejemplo, un ARN guía, se pueden suministrar utilizando un virus adenoasociado (AAV), lentivirus, adenovirus u otros tipos de vectores víricos o combinaciones de estos. Se pueden empaquetar Cas9 y uno o más ARN guía en uno o más vectores víricos. En algunas realizaciones, el vector vírico se suministra en el tejido de interés, por ejemplo, mediante inyección intramuscular, mientras que otras veces el suministro vírico es por medio de métodos de suministro intravenoso, transdérmico, intranasal, oral, mucosal o de otro tipo. Este tipo de suministro podrá ser mediante una única dosis o múltiples dosis. El experto en la técnica sobreentenderá que la dosificación real que se ha de suministrar en la presente podrá variar enormemente dependiendo de varios factores tales como la elección del vector, la célula, organismo o tejido diana, el estado general del sujeto que se va a tratar, el grado de transformación/modificación que se busca, la vía de administración, el modo de administración, el tipo de transformación/modificación buscada, etc.
Una dosificación de este tipo podrá contener además, por ejemplo, un portador (agua, solución salina, etanol, glicerol, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuate, aceite de sésamo, etc.), un diluyente, un portador farmacéuticamente aceptable (p. ej., solución salina tamponada con fosfato), un excipiente farmacéuticamente aceptable y/u otros compuestos conocidos en la técnica. El experto en la técnica puede determinar fácilmente una formulación posológica de este tipo. La dosificación podrá contener además una o más sales farmacéuticamente aceptables tales como, por ejemplo, una sal de un ácido mineral tal como un clorhidrato, un bromhidrato, un fosfato, un sulfato, etc.; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, etc. Adicionalmente, también podrán estar presentes en este documento sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH, geles o materiales gelificantes, saborizantes, colorantes, microesferas, polímeros, agentes de suspensión, etc. Además, también podrán estar presentes uno o más ingredientes farmacéuticos convencionales tales como conservantes, humectantes, agentes de suspensión, surfactantes, antioxidantes, agentes antiapelmazantes, materiales de relleno, agentes quelantes, agentes de recubrimiento, estabilizantes químicos, etc., especialmente si la forma farmacéutica es una forma reconstituible. Los ingredientes ilustrativos adecuados incluyen celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa de sodio, polisorbato 80, alcohol feniletílico, clorobutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, galato de propilo, los parabenos, etilvanillina, glicerina, fenol, paraclorofenol, gelatina, albúmina y combinaciones de estos. Se puede consultar una discusión exhaustiva de excipientes farmacéuticamente aceptables en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991).
En una realización de la presente, el suministro tiene lugar mediante un adenovirus, que podrá ser una dosis de refuerzo única que contenga al menos 1 x 105 partículas (también denominadas unidades de partículas, up) de un vector adenovírico. En una realización de la presente, preferentemente la dosis es de al menos aproximadamente 1 x 106 partículas (por ejemplo, aproximadamente 1 x 106-1 x 1012 partículas), más preferentemente al menos aproximadamente 1 x 107 partículas, más preferentemente al menos aproximadamente 1 x 108 partículas (p. ej., aproximadamente 1 x 108-1 x 1011 partículas o aproximadamente 1 x 108-1 x 1012 partículas) y de la manera más preferida al menos aproximadamente 1 x 100 partículas (p. ej., aproximadamente 1* x 109-1 x 1010 partículas o aproximadamente 1 x 109-1 x 1012 partículas) o incluso al menos aproximadamente 1 x 1010 partículas (p. ej., aproximadamente 1 x 1010-1 x 1012 partículas) del vector adenovírico. Como alternativa, la dosis comprende no más de aproximadamente 1 x 1014 partículas, preferentemente no más de aproximadamente 1 x 1013 partículas, aún más preferentemente no más de aproximadamente 1 x 1012 partículas, aún más preferentemente no más de aproximadamente 1 x 1011 partículas y de la manera más preferida no más de aproximadamente 1 x 1010 partículas (p. ej., no más de aproximadamente 1 x 109 partículas). Por lo tanto, la dosis podrá contener una dosis única del vector adenovírico con, por ejemplo, aproximadamente 1 x 106 unidades de partículas (up), aproximadamente 2 x 106 up, aproximadamente 4 x 106 up, aproximadamente 1 x 107 up, aproximadamente 2 x 107 up, aproximadamente 4 x 107 up, aproximadamente 1 x 108 up, aproximadamente 2 x 108 up, aproximadamente 4 x 108 up, aproximadamente 1 x 109 up, aproximadamente 2 x 109 up, aproximadamente 4 x 109 up, aproximadamente 1 x 1010 up, aproximadamente 2 x 1010 up, aproximadamente 4 x 1010 up, aproximadamente 1 x 1011 up, aproximadamente 2 x 1011 up, aproximadamente 4 x 1011 up, aproximadamente 1 x 1012 up, aproximadamente 2 x 1012 up o aproximadamente 4 x 1012 up del vector adenovírico. Remítase, por ejemplo, a los vectores adenovíricos de la patente de los EE. UU. con N.° 8454972 B2 de Nabel et al., otorgada el 4 de junio de 2013; y las dosificaciones de la col 29, líneas 36-58 de esta. En una realización de la presente, se suministra el adenovirus mediante múltiples dosis.
En una realización de la presente, el suministro se realiza mediante un AAV. Se cree que una dosificación terapéuticamente eficaz para el suministro in vivo del AAV a un ser humano está comprendida en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mL de solución salina que contiene de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1010 AAV funcionales/mL de solución. La dosificación se podrá ajustar para encontrar el equilibrio entre el beneficio terapéutico y cualesquiera efectos secundarios. En una realización de la presente, la dosis de AAV está comprendida generalmente en el intervalo de concentraciones de aproximadamente 1 x 105 a 1 x 1050 genomas de AAV, entre aproximadamente 1 x 108 y 1 x 1020 genomas de AAV, entre aproximadamente 1 x 1010 y aproximadamente 1 x 1016 genomas o entre aproximadamente 1 x 1011 y aproximadamente 1 x 1016 genomas de AAV. Una dosificación para seres humanos podrá ser de aproximadamente 1 x 1013 genomas de AAV. Se podrán suministrar este tipo de concentraciones en una cantidad de entre aproximadamente 0.001 mL y aproximadamente 100 mL, entre aproximadamente 0.05 y aproximadamente 50 mL o entre aproximadamente 10 y aproximadamente 25 mL de una solución portadora. El experto en la técnica podrá determinar fácilmente otras dosificaciones eficaces mediante ensayos habituales determinando las curvas de dosis de respuesta. Remítase, por ejemplo, a la patente de los EE. UU. con N.° 8404658 B2 de Hajjar et al., otorgada el 26 de marzo de 2013, en la col. 27, líneas 45-60.
En una realización de la presente, el suministro se realiza mediante un plásmido. En tales composiciones plasmídicas, la dosificación debería ser una cantidad de plásmido suficiente para suscitar una respuesta. Por ejemplo, las cantidades adecuadas de ADN plasmídico en las composiciones plasmídicas podrán estar comprendidas entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 2 mg o entre aproximadamente 1 gg y aproximadamente 10 gg.
En la presente, las dosis se basan en un individuo de 70 kg de promedio. La frecuencia de administración está comprendida en las competencias del facultativo médico o veterinario (p. ej., médico, veterinario) o científico experto en la técnica. Los ratones utilizados en los experimentos son de aproximadamente 20 g. Puede extrapolarse la dosis que se administra a un ratón de 20 g para un individuo de 70 kg.
Lentivirus
Los lentivirus son retrovirus complejos que tienen la capacidad de infectar y expresar sus genes tanto en células mitóticas como posmitóticas. El lentivirus conocido más comúnmente es el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), que utiliza glucoproteínas de la envoltura de otros virus para actuar sobre una gama amplia de tipos celulares. Se podrán preparar lentivirus de la siguiente manera. Después de clonar pCasES10 (que contiene un esqueleto plasmídico de transferencia lentivírico), se sembraron HEK293FT que habían sido sometidas a pocos pases (p=5) en un matraz T-75 hasta alcanzar una confluencia de un 50% el día antes de la transfección en DMEM con un 10% de suero bovino fetal y sin antibióticos. Se cambió el medio después de 20 horas por medio OptiMEM (exento de suero) y se realizó la transfección 4 horas más tarde. Se transfectaron las células con 10 gg de plásmido de transferencia lentivírico (pCasES10) y los siguientes plásmidos de empaquetamiento: 5 gg de pMD2.G (pseudotipo VSV-g) y 7.5 gg de psPAX2 (gag/pol/rev/tat). Se realizó la transfección en 4 mL de OptiMEM con un agente de suministro lipídico catiónico (50 gL de Lipofectamina 2000 y 100 gL de reactivo Plus). Después de 6 horas, se cambió el medio por DMEM exento de antibióticos con un 10% de suero bovino fetal.
Se podrán purificar lentivirus de la siguiente manera. Se recolectaron los sobrenadantes víricos después de 48 horas. Se limpiaron los sobrenadantes de desechos en primer lugar y se filtraron a través de un filtro con una unión a proteínas baja (PVDF, por sus siglas en inglés) de 0.45 gm. A continuación se centrifugaron en una ultracentrífuga durante 2 horas a 24000 rpm. Se resuspendieron los sedimentos víricos en 50 gL de DMEM durante toda la noche a 4 °C. Seguidamente se alicuotaron y se congelaron inmediatamente a -80 °C.
En otra realización, también se contemplan vectores lentivíricos que no son de primates mínimos basados en el virus de la anemia infecciosa equina (EIAV, por sus siglas en inglés), especialmente para la terapia génica ocular (remítase a, p. ej., Balagaan, J Gene Med 2006; 8: 275 - 285, publicado electrónicamente el 21 de noviembre de 2005 en Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002/jgm.845). En otra realización, también se contempla RetinoStat®, un vector para la terapia génica lentivírico derivado del virus de la anemia infecciosa equina que expresa las proteínas angiostáticas endostatina y angiostatina que se suministra mediante inyección subretinal para el tratamiento de la forma húmeda de degeneración macular senil (remítase a, p. ej., Binley et al., HUMAN GENE THERAPY 23:980-991 (septiembre de 2012)) y se podrá modificar para el sistema sistema CRISPR-Cas. En otra realización, los vectores lentivíricos autoinactivantes con ARNip cuya diana es un exón común compartido con el tat/rev del VIH, un señuelo TAR de ubicación nucleolar y una ribozima de cabeza de martillo específico contra CCR5 (remítase a, p. ej., DiGiusto et al. (2010) Sci Transl Med 2:36ra43) se podrán utilizar y/o adaptar al sistema CRISPR-Cas. Se podrá recoger un mínimo de 2.5 x 106 células CD34+ por kilogramo de peso del paciente y preestimular durante 16-20 horas en medio X-VIVO 15 (Lonza) que contiene L-glutamina 2 micromoles, factor de células madre (100 ng/mL), ligando Flt-3 (Flt-3L) (100 ng/mL) y trombopoyetina (10 ng/mL) (CellGenix) con una densidad de 2 x 106 células/mL. Las células preestimuladas se podrán transducir con lentivirus con una multiplicidad de infección de 5 durante 16-24 horas en matraces de cultivo tisular de 75-cm2 recubiertos con fibronectina (25 mg/cm2) (RetroNectin,Takara Bio Inc.).
Se han divulgado vectores lentivíricos en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, remítase a, p. ej., la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20120295960 y las patentes de los EE. UU. con N.os 7303910 y 7351585. También se han divulgado vectores lentivíricos para el tratamiento de enfermedades oculares, remítase a, p. ej., las patentes de los EE. UU. con N.os de publicación 20060281180, 20090007284, US20110117189; US20090017543; US20070054961, US20100317109. También se han divulgado vectores lentivíricos para el suministro al cerebro, remítase a, p. ej., las patentes de los EE. UU. con N.os de publicación US20110293571; US20110293571, US20040013648, US20070025970, US20090111106 y la patente de los EE. UU. con N.2 US7259015.
Suministro de ARN
Suministro de ARN: La enzima CRISPR, por ejemplo, una Cas9, y/o cualquiera de los ARN de la presente, por ejemplo, un ARN guía, también se pueden suministrar en forma de ARN. Se puede generar ARNm de Cas9 utilizando transcripción in vitro. Por ejemplo, se puede sintetizar ARNm de Cas9 utilizando un casete de PCR que contiene los siguientes elementos: promotor_T7-secuencia kozak (GCCACC)-Cas9-UTR 3’ de la beta globina-cola de poliA (una cadena de 120 o más adeninas). El casete puede ser utilizado para la transcripción por la polimerasa T7. También se pueden transcribir ARN guía utilizando la transcripción in vitro de un casete que contiene la secuencia promotor_T7-GG-ARN guía.
Para potenciar la expresión y reducir la toxicidad, la enzima CRISPR y/o el ARN guía se pueden modificar utilizando pseudo-U o 5-metil-C.
Los métodos de suministro de ARNm son especialmente prometedores en la actualidad para el suministro al hígado.
En particular, se prefiere particularmente AAAV8 para el suministro al hígado.
Nanopartículas
El ARNm de la enzima CRISPR y el ARN guía se podrán suministrar simultáneamente utilizando nanopartículas o envolturas lipídicas.
Por ejemplo, Su X, Fricke J, Kavanagh DG, Irvine DJ (“In vitro and in vivo mRNA delivery using lipid-enveloped pH-responsive polymer nanoparticles” Mol Pharm. junio de 2011 6;8(3):774-87. doi: 10.1021/mp100390w. publicación electrónica del 1 de abril de 2011) describen nanopartículas biodegradables con una estructura núcleo-coraza con un núcleo de poli(p-aminoéster)(PBAE) envuelto por una coraza de tipo bicapa fosfolipídica. Estas se desarrollaron para el suministro de ARNm in vivo. Se escogió el componente de tipo PBAE sensible al pH para promover la desorganización de endosomas, mientras que la capa de la superficie lipídica se seleccionó para minimizar la toxicidad del núcleo policatiónico. Estos son, por lo tanto, los sistemas preferidos para el suministro de ARN.
En una realización, se contemplan nanopartículas basadas en polímeros bioadhesivos autoensamblables, que se podrán aplicar para el suministro oral de péptidos, suministro intravenoso de péptidos y suministro nasal de péptidos, en todos los casos al cerebro. También se contemplan otras realizaciones, tales como la absorción oral y el suministro ocular de fármacos hidrófobos. En la tecnología de la envoltura molecular participa una envoltura polimérica modificada que se protege y se suministra en el sitio de la enfermedad (remítase a, p. ej., Mazza, M. et al. ACSNano, 2013. 7(2): 1016-1026; Siew, A., et al. Mol Pharm, 2012. 9(1):14-28; Lalatsa, A., et al. J Contr Rel, 2012.
161 (2):523-36; Lalatsa, A., et al., Mol Pharm, 2012. 9(6):1665-80; Lalatsa, A., et al. Mol Pharm, 2012. 9(6):1764-74; Garrett, N.L., et al. J Biophotonics, 2012. 5(5-6):458-68; Garrett, N.L., et al. J Raman Spect, 2012. 43(5):681-688; Ahmad, S., et al. J Royal Soc Interface 2010. 7:S423-33; Uchegbu, I.F. Expert Opin Drug Deliv, 2006. 3(5):629-40; Qu, X.,et al. Biomacromolecules, 2006. 7(12):3452-9 y Uchegbu, I.F., et al. Int J Pharm, 2001. 224:185-199). Se contemplan dosis de aproximadamente 5 mg/kg, con dosis únicas o múltiples, dependiendo del tejido diana.
En una realización, se podrán utilizar y/o adaptar al sistema CRISPR Cas, nanopartículas que pueden suministrar ARN a una célula cancerosa para detener el crecimiento tumoral desarrolladas por el laboratorio de Dan Anderson en el MIT. En particular, el laboratorio de Anderson ha desarrollado sistemas combinatorios, totalmente automáticos para la síntesis, purificación, caracterización y formulación de nuevos biomateriales y nanoformulaciones. Remítase a, p. ej., Alabi et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 6 de agosto de 2013;110(32):12881-6; Zhang et al., Adv Mater. 6 de septiembre de 2013;25(33):4641-5; Jiang et al., Nano Lett. 13 de marzo de 2013;13(3):1059-64; Karagiannis et al., a Cs Nano. 23 de octubre de 2012;6(10):8484-7; Whitehead et al., ACS Nano. 28 de agosto de 2012;6(8):6922-9 y Lee et al., Nat Nanotechnol. 3 de junio de 2012;7(6):389-93.
La patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20110293703 se refiere a compuestos lipidoideos que son también particularmente útiles en la administración de polinucleótidos, que se podrán aplicar al suministro del sistema CRISPR Cas. En un aspecto, los compuestos lipidoideos aminoalcohólicos se combinan con un agente que va a ser suministrado a una célula o un sujeto para formar micropartículas, nanopartículas, liposomas o micelas. El agente que va a ser suministrado por las partículas, liposomas o micelas podrá estar en forma de un gas, líquido o sólido y el agente podrá ser un polinucleótido, proteína, péptido o molécula de bajo peso molecular. Los compuestos lipidoideos aminoalcohólicos se podrán combinar con otros compuestos lipidoideos aminoalcohólicos, polímeros (sintéticos o naturales), surfactantes, colesterol, carbohidratos, proteínas, lípidos, etc. para formar las partículas. Estas partículas se podrán combinar a continuación opcionalmente con un excipiente farmacéutico para formar una composición farmacéutica.
La patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20110293703 también proporciona métodos para preparar los compuestos lipidoideos aminoalcohólicos. Se permite que uno o más equivalentes de una amina reaccionen con uno o más equivalentes de un compuesto con un epóxido terminal en condiciones adecuadas para formar un compuesto lipidoideo aminoalcohólico. En ciertas realizaciones, todos los grupos amino de la amina se hacen reaccionar totalmente con el compuesto con un epóxido terminal para formar aminas terciarias. En otras realizaciones, todos los grupos amino de la amina se hacen reaccionar de manera no total con el compuesto con un epóxido terminal para formar aminas terciarias y de esta manera se obtienen como resultado aminas primarias o secundarias en el compuesto lipidoideo aminoalcohólico. Estas aminas primarias o secundarias se dejan tal cual o se podrán hacer reaccionar con otro electrófilo tal como un compuesto con epóxido terminal diferente. Como apreciará el experto en la técnica, la reacción de una amina con una cantidad que es menor que un exceso del compuesto con un epóxido terminal dará como resultado varios compuestos lipidoideos aminoalcohólicos diferentes con diversos números de colas. Ciertas aminas podrán estar totalmente funcionalizadas con dos colas que son compuestos derivados de epóxidos mientras que otras moléculas no estarán completamente funcionalizadas con colas que son compuestos derivados de epóxidos. Por ejemplo, una diamina o poliamina podrá incluir una, dos, tres o cuatro colas que son compuestos derivados de epóxidos unidos a varios restos amino de la molécula lo que da como resultado aminas primarias, secundarias y terciarias. En ciertas realizaciones, todos los grupos amino no están totalmente funcionalizados. En ciertas realizaciones, se utilizan dos compuestos con un epóxido terminal del mismo tipo. En otras realizaciones, se utilizan dos o más compuestos con un epóxido terminal diferentes. La síntesis de los compuestos lipidoideos aminoalcohólicos se realiza con o sin disolvente y la síntesis se podrá realizar a temperaturas más elevadas que están comprendidas entre 30-100 °C, preferentemente a aproximadamente 50-90 2C. Los compuestos lipidoideos aminoalcohólicos preparados se podrán purificar opcionalmente. Por ejemplo, la mezcla de compuestos lipidoideos aminoalcohólicos se podrá purificar para generar un compuesto lipidoideo aminoalcohólico con un número concreto de colas que son un compuesto derivado de un epóxido. O la mezcla se podrá purificar para generar un estereo- o regioisómero concreto. Los compuestos lipidoideos aminoalcohólicos también se podrán alquilar utilizando un haluro de alquilo (p. ej., yoduro de metilo) u otro agente alquilante y/o se podrán acilar.
La patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20110293703 también proporciona colecciones de compuestos lipidoideos aminoalcohólicos preparados con los métodos de la invención. Estos compuestos lipidoideos aminoalcohólicos se podrán preparar y/o cribar utilizando técnicas ultrarrápidas que conllevan manipuladores de líquidos, robots, placas de microvaloración, computadoras, etc. En ciertas realizaciones, los compuestos lipidoideos aminoalcohólicos se criban para determinar su capacidad de transfectar la célula con polinucleótidos u otros agentes (p. ej., proteínas, péptidos, moléculas de bajo peso molecular).
La patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20130302401 se refiere a una clase de poli(beta-aminoalcoholes) (PBAA) que se ha preparado utilizando polimerización combinatoria. Los PBAA de la invención se podrán utilizar en aplicaciones biomédicas y biotecnológicas tales como recubrimientos (tales como recubrimientos de películas o películas multicapa para implantes o dispositivos médicos), aditivos, materiales, excipientes, agentes para evitar la bioincrustación, agentes para la miniaturización de patrones y agentes de encapsulación celular. Cuando se utilizan como recubrimientos de superficies, estos PBAA suscitan diferentes niveles de inflamación, tanto in vitro como in vivo, dependiendo de sus estructuras químicas. La gran diversidad química de esta clase de materiales ha permitido a los autores identificar recubrimientos poliméricos que inhiben la activación de macrófagos in vitro. Además, estos recubrimientos reducen el reclutamiento de células inflamatorias y reducen la fibrosis, tras la implantación subcutánea de micropartículas de poliestireno carboxilado. Estos polímeros se podrán utilizar para formar cápsulas de complejos polielectrolíticos para la encapsulación celular. La invención también podrá tener otras aplicaciones biológicas tales como recubrimientos antimicrobianos, suministro de ADN o ARNip y modificación tisular con células madre. Los contenidos de la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20130302401 se podrá aplicar al sistema CRISPR Cas.
En otra realización, se contemplan nanopartículas lipídicas (LNP). En particular, se podrá aplicar un ARN interferente pequeño antitranstiretina encapsulado en nanopartículas lipídicas (remítase a, p. ej., Coelho et al., N Engl J Med 2013;369:819-29) al sistema CRISPR Cas. Se contemplan dosis comprendidas entre aproximadamente 0.01 y aproximadamente 1 mg por kg de peso corporal administradas por vía intravenosa. Se contemplan medicaciones para reducir el riesgo de reacciones relacionadas con la infusión, por ejemplo, se contemplan dexametasona, acetaminofeno, difenhidramina o cetirizina y ranitidina. También se contemplan dosis múltiples de aproximadamente 0.3 mg por kilogramo cada 4 semanas durante cinco dosis.
Se ha demostrado que las LNP son sumamente eficaces para suministrar ARNip al hígado (remítase, p. ej., a Tabernero et al., Cáncer Discovery, abril de 2013, Vol. 3, N.° 4, páginas 363-470) y por lo tanto se contemplan para suministrar CRISPR Cas al hígado. Se podrá contemplar una dosificación de aproximadamente cuatro dosis de 6 mg/kg de la LNP (o ARN del sistema CRISPR-Cas) cada dos semanas. Tabernero et al. han demostrado que se observó una regresión tumoral después de los 2 primeros ciclos de LNP con una dosificación de 0.7 mg/kg, y que al final de los 6 ciclos el paciente había logrado una respuesta parcial con una regresión completa de la metástasis de los nódulos linfáticos y una reducción sustancial del volumen de los tumores hepáticos. Se obtuvo una respuesta completa tras 40 dosis en este paciente, que ha permanecido en remisión y completado el tratamiento tras recibir dosis a lo largo de 26 meses. Dos pacientes con RCC y sitios de enfermedad extrahepáticos que incluían el riñón, pulmón y nódulos linfáticos que estaban evolucionando tras la terapia inicial con inhibidores de la ruta VEGF experimentaron una estabilización de la enfermedad en todas las zonas durante aproximadamente 8-12 meses y un paciente con PNET y metástasis hepáticas continuó en la extensión del estudio durante 18 meses (36 dosis) con una enfermedad estabilizada.
Sin embargo, debe tenerse en cuenta la carga de la LNP. Los lípidos catiónicos se combinaron con lípidos cargados negativamente para inducir estructuras que no son bicapas para facilitar el suministro intracelular. Debido a que las LNP cargadas se eliminan rápidamente de la circulación tras la inyección intravenosa, se desarrollaron lípidos catiónicos ionizables con valores de pKa por debajo de 7 (remítase a, p. ej., Rosin et al., Molecular Therapy, vol. 19, n.° 12, páginas 1286-2200, diciembre de 2011). Se pueden cargar los polímeros cargados negativamente tales como oligonucleótidos de ARNip en LNP con valores de pH bajos (p. ej., pH 4) donde los lípidos ionizables muestran una carga positiva. Sin embargo, a valores de pH fisiológicos, las LNP exhiben una carga superficial baja compatible con tiempos de circulación más prolongados. Cuatro especies de lípidos catiónicos ionizables han recibido una atención especial, concretamente 1,2-dilineoil-3-dimetilamoniopropano (DLinDAP), 1,2-dilinoleiloxi-3-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleiloxiceto-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLinKDMA) y 1,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLinKC2-DMA). Se ha demostrado que sistemas LNP ARNip que contienen estos lípidos muestran unas propiedades de silenciamiento génico notablemente diferentes en hepatocitos in vivo, con potencias que varían de acuerdo con la serie DLinKC2-DMA>DLinKDMA>DLinDMA>>DLinDAP empleando un modelo de silenciamiento del gen del Factor VII (remítase a, p. ej., Rosin et al., Molecular Therapy, vol. 19, n.° 12, páginas 1286-2200, diciembre de 2011). Se podrá contemplar una dosificación de niveles de 1 pg/mL, especialmente para una formulación que contiene DLinKC2-DMA.
La preparación de LNP y la encapsulación de CRISPR Cas se podrá utilizar y/o adaptar de Rosin et al., Molecular Therapy, vol. 19, n.° 12, páginas 1286-2200, diciembre de 2011). Los lípidos catiónicos 1,2-dilineoil-3-dimetilamoniopropano (DLinDAP), 1,2-dilinoleiloxi-3-W,W-dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleiloxiceto-A/,W-dimetil-3-aminopropano (DLinK-DMA), 1,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLinKC2-DMA), (3-o-[2"-(metoxipolietilenglicol 2000)succinoíl]-1,2-dimiristoil-sn-glicol (PEG-S-DMG) y R-3-[(w-metoxipoli(etilenglicol)2000)carbamoil]-1,2-dimiristiloxlpropil-3-amina (PEG-C-DOMG) se podrán adquirir de Tekmira Pharmaceuticals (Vancouver, Canadá) o sintetizar. El colesterol se podrá adquirir de Sigma (San Luis, MO). Se podrá encapsular el ARN de CRISPR Cas específico en las LNP que contienen DLinDAP, DLinDMA, DLinK-DMA y DLinKC2-DMA (lípidos catiónicos:DSPC:COL: PEGS-DMG o PEG-C-DOMG con relaciones molares de 40:10:40:10). Cuando sea necesario, se podrá incorporar un 0.2% de SP-D¡OC18 (Invitrogen, Burlington, Canadá) para evaluar la captación celular, suministro intracelular y biodistribución. La encapsulación se podrá realizar disolviendo mezclas lípidicas que comprenden lípidos catiónicos:DSPC:colesterol:PEG-c-DOMG (con relaciones molares de 40:10:40:10) en etanol hasta alcanzar una concentración lipídica final de 10 mmol/L. Esta solución etanólica de lípidos se podrá añadir gota a gota a una solución de 50 mmol/L de citrato, pH 4.0 para formar vesículas multilamelares para producir una concentración final de un 30% de etanol vol/vol. Se podrán formar vesículas unilamelares grandes tras la extrusión de vesículas multilamelares a través de dos filtros de policarbonato Nuclepore de 80 nm apilados utilizando el Extrusor (Northern Lipids, Vancouver, Canadá). Se podrá lograr la encapsulación añadiendo ARN disuelto con una concentración de 2 mg/mL en una solución de 50 mmol/L de citrato, pH 4.0 que contenga un 30% de etanol vol/vol gota a gota a las vesículas unilamelares grandes preformadas extruídas e incubando a 31 °C durante 30 minutos con una agitación constante hasta alcanzar una relación ponderal ARN/lípidos final de 0.06/1 p/p. La eliminación del etanol y la neutralización del tampón de formulación se realizaron por diálisis frente a una solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.4 durante 16 horas utilizando membranas de diálisis de celulosa regenerada Spectra/Por 2. La distribución del tamaño de las nanopartículas se podrá determinar mediante dispersión dinámica de la luz utilizando un clasificador de las partículas por tamaño NICOMP 370, los modos vesícula/intensidad y el ajuste Gaussian (Nicomp Particle Sizing, Santa Barbara, CA). El tamaño de las partículas para todos los tres sistemas de LNP podrá ser de ~70 nm de diámetro. La eficacia de la encapsulación de ARNip se podrá determinar eliminando el ARNip libre utilizando columnas VivaPureD MiniH (Sartorius Stedim Biotech) a partir de muestras recogidas antes y después de la diálisis. Se podrá extraer el ARN encapsulado a partir de nanopartículas eluidas y cuantificadas a 260 nm. Se determinó la relación de ARNip respecto a lípidos midiendo el contenido de colesterol en las vesículas utilizando el ensayo enzimático del colesterol E de Wako Chemicals USA (Richmond, VA). Los liposomas PEGilados (o LNP) también pueden utilizarse para el suministro.
La preparación de LNP grandes se podrá utilizar y/o adaptar de Rosin et al., Molecular Therapy, vol. 19, n.° 12, páginas 1286-2200, diciembre de 2011. Se podrá preparar una solución de premezcla lipídica (concentración lipídica total de 20.4 mg/mL) en etanol que contenga DLinKC2-DMA, DSPC y colesterol con relaciones molares de 50:10:38.5. Se podrá añadir acetato de sodio a la premezcla lipídica con una relación molar de 0.75:1 (acetato de sodio:DLinKC2-DMA). Los lípidos se podrán hidratar posteriormente combinando la mezcla con 1.85 volúmenes de tampón citrato (10 mmol/L, pH 3.0) agitando vigorosamente, para dar como resultado la formación de liposomas espontánea en tampón acuoso que contenga un 35% de etanol. La solución con liposomas se podrá incubar a 37 °C para permitir un incremento dependiente del tiempo del tamaño de las partículas. Se podrán retirar alícuotas en diversos momentos durante la incubación para estudiar cambios en el tamaño de los liposomas mediante dispersión dinámica de la luz (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido). Una vez que se ha logrado el tamaño de partícula deseado, se podrá añadir una solución de PEG lípidos acuosa (solución madre = 10 mg/mL de PEG-DMG en etanol al 35% (vol/vol) a la mezcla de liposomas para obtener una concentración molar de PEG final de un 3.5% de los lípidos totales. Tras la adición del PEG-lípidos, los liposomas deberían su tamaño, y detener de manera eficaz un crecimiento adicional. A continuación se podrá añadir ARN a los liposomas vacíos con una relación de ARNip respecto a los lípidos totales de aproximadamente 1:10 (p:p), seguido por una incubación durante 30 minutos a 37 °C para formar LNP cargadas. Posteriormente, la mezcla se podrá dializar durante toda la noche en PBS y filtrar con un filtro de jeringa de 0.45 pm.
También se contemplan los constructos de ácido nucleico esférico (SNA™) y otras nanopartículas (especialmente nanopartículas de oro) como medios para suministrar el sistema CRISPR/Cas a las dianas previstas. Se dispone de datos significativos que muestran que los constructos de ácido nucleico esférico de AuraSense Therapeutics (SNA™), basados en nanopartículas de oro funcionalizadas con ácido nucleico, son superiores a plataformas alternativas basadas en múltiples factores de éxito clave, tales como:
Elevada estabilidad in vivo. Debido a su carga densa, la mayor parte del material que se carga (ADN o ARNip) permanece unido a los constructos dentro de las células, lo que confiere estabilidad al ácido nucleico y resistencia a la degradación enzimática.
Posibilidad de ser suministrado. Para todos los tipos celulares estudiados (p. ej., neuronas, líneas celulares tumorales, etc.) los constructos han demostrado una eficacia de transfección de un 99% sin necesidad de portadores o agentes de transfección.
Modificación dirigida terapéutica. La singular afinidad de unión a la diana y la especificidad de los constructos permiten una especificidad excelente para las secuencias diana emparejadas (es decir, efectos fuera de la diana limitados).
Eficacia superior. Los constructos superan significativamente a los principales reactivos de transfección convencionales (Lipofectamina 2000 y Citofectina).
Toxicidad baja. Los constructos pueden entrar en varias células cultivadas, células primarias y tejidos sin toxicidad aparente.
Sin respuesta inmunitaria significativa. Los constructos suscitan cambios mínimos en la expresión génica global medida por estudios de micromatriz holeogenómicos y ensayos de proteínas específicos de citocinas.
Adaptación química a medida. Se pueden utilizar varios agentes combinatorios o únicos (p. ej., proteínas, péptidos, moléculas de bajo peso molecular) para adaptar a medida la superficie de los constructos.
Esta plataforma para tratamientos con ácidos nucleicos podrá ser aplicable a diversos estados patológicos que incluyen la inflamación y la enfermedad infecciosa, el cáncer, trastornos de la piel y enfermedad cardiovascular. Las citas de la bibliografía incluyen: Cutler et al.,. J. Am. Chem. Soc. 2011 133:9254-9257, Hao et al., Small. 2011 7:3158-3162, Zhang et al., ACS Nano. 2011 5:6962-6970, Cutler et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:1376-1391, Young et al.,. Nano Lett. 2012 12:3867-71, Zheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012 109:11975-80, Mirkin, Nanomedicine 2012 7:635-638 Zhang et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:16488-1691, Weintraub, Nature 2013 495:S14-S16, Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013 110(19):7625-7630, Jensen et al., Sci. Transl. Med. 5, 209ra152 (2013) y Mirkin, et al, Small, doi.org/10.1002/smll.201302143.
Se podrán construir nanopartículas autoensamblables con ARNip utilizando polietilenimina (PEI) que está PEGilada con un ligando peptídico Arg-Gly-Asp (RGD) incorporado al extremo distal del polietilenglicol (PEG), por ejemplo, como un medio de modificar de manera selectiva la neovasculatura tumoral que expresa integrinas y utilizarlas para suministrar ARNip que inhiba la expresión del receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF R2) y de esta manera la angiogénesis tumoral (remítase a, p. ej., Schiffelers et al, Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, N.° 19). Se podrán preparar nanoplexes mezclando volúmenes iguales de soluciones acuosas de un polímero catiónico y un ácido nucleico para proporcionar un exceso molar neto de nitrógeno ionizable (polímero) respecto al fosfato (ácido nucleico) en el intervalo de 2 a 6. Las interacciones electrostáticas entre polímeros catiónicos y ácido nucleico dieron como resultado la formación de polyplexes con una distribución del tamaño de partículas promedio de aproximadamente 100 nm, denominadas pues en la presente nanoplexes. Se prevé una dosificación comprendida entre aproximadamente 100 y 200 mg de CRISPR Cas para el suministro en las nanopartículas autoensamblables de Schiffelers et al.
Los nanoplexes de Bartlett et al. (PNAS, 25 de septiembre de 2007,vol. 104, n.° 39) también se podrán aplicar a la presente invención. Los nanoplexes de Bartlett et al. se preparan mezclando volúmenes iguales de soluciones acuosas de un polímero catiónico y un ácido nucleico para proporcionar un exceso molar neto de nitrógeno ionizable (polímero) respecto al fosfato (ácido nucleico) en el intervalo de 2 a 6. Las interacciones electrostáticas entre polímeros catiónicos y ácido nucleico dieron como resultado la formación de polyplexes con una distribución del tamaño de partículas promedio de aproximadamente 100 nm, denominadas pues en la presente nanoplexes. El DOTA-ARNip de Bartlett et al. se sintetizó de la siguiente manera: Se encargó el monoéster de la N-hidroxisuccinimida y el ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA-ésterNHS) de Macrocyclics (Dallas, TX). Se añadió la hebra sentido de ARN modificada en la amina con un exceso molar de 100 veces de DOTA-éster-NHS en tampón carbonato (pH 9) a un tubo de microcentrífuga. Los contenidos se hicieron reaccionar agitando durante 4 horas a temperatura ambiente. El conjugado de DOTA-ARN sentido se precipitó en etanol, se resuspendió en agua y se hibridó con la hebra antisentido no modificada para generar DOTA-ARNip. Se pretrataron todos los líquidos con Chelex-100 (Bio-Rad, Hercules, CA) para eliminar todas las trazas de contaminantes metálicos. Se podrán formar nanopartículas de ARNip dirigidas y no dirigidas al Tf utilizando policationes que contienen ciclodextrina. Normalmente, se formaron nanopartículas en agua con una relación de carga de 3 (+/-) y una concentración de ARNip de 0.5 g/litro. Un uno por ciento de las moléculas de adamantano-PEG de la superficie de las nanopartículas dirigidas se modificaron con Tf (adamantano-PEG-Tf). Se suspendieron las nanopartículas en una solución portadora de glucosa al 5% (p/v) inyectable.
Davis et al. (Nature, Vol 464, 15 de abril de 2010) llevan a cabo un ensayo clínico con ARNip que utiliza un sistema de suministro con nanopartículas dirigidas (número de registro del ensayo clínico NCT00689065). A los pacientes con distintos tipos de cáncer sólido resistente a las terapias asistenciales habituales se les administran dosis de las nanopartículas dirigidas en los días 1, 3, 8 y 10 de un ciclo de 21 días mediante una infusión intravenosa de 30 min. Las nanopartículas están constituidas por un sistema de suministro sintético que contiene: (1) un polímero lineal basado en la ciclodextrina (CDP), (2) un ligando cuya diana sea una proteína de tipo transferrina (TF) humana presentado en el exterior de la nanopartícula para unirse a los receptores de TF (TFR) en la superficie de las células cancerosas, (3) un polímero hidrófilo (polietilenglicol (PEG) utilizado para promover la estabilidad de las nanopartículas en fluidos biológicos) y (4) un ARNip diseñado para reducir la expresión de RRM2 (la secuencia utilizada en la clínica se denominó previamente siR2B+5). Hace tiempo que existe constancia del aumento de TFR en las células malignas y RRM2 es una diana contra el cáncer conocida. En estudios multidosis en primates no humanos se ha demostrado que estas nanopartículas (versión clínica denominada CALAA-01) se toleran bien. Aunque se ha administrado ARNip mediante suministro con liposomas a un único paciente con leucemia mieloide crónica, el ensayo clínico de Davis et al. es el ensayo inicial en seres humanos para suministrar de manera sistémica ARNip con un sistema de suministro dirigido y para tratar pacientes con un cáncer sólido. Para averiguar si el sistema de suministro dirigido puede proporcionar el suministro eficaz de ARNip funcional a los tumores humanos, Davis et al., estudiaron biopsias de tres pacientes de tres cohortes de dosificación diferentes; los pacientes A, B y C, todos los cuales tenían un melanoma metastásico y recibieron dosis CALAA-01 de 18, 24 y 30 mg m-2 de ARNip, respectivamente. También se podrán contemplar dosis similares para el sistema CRISPR Cas. El suministro de la invención se podrá lograr con nanopartículas que contengan un polímero lineal basado en la ciclodextrina (CDP), un ligando cuya diana es un tipo proteína de la transferrina (TF) humana presentado en el exterior de las nanopartículas para unirse a los receptores de la TF (TFR) en la superficie de las células cancerosas y/o un polímero hidrófilo (por ejemplo, polietilenglicol (PEG) utilizado para promover la estabilidad de las nanopartículas en los fluidos biológicos).
Exosomas
Los exosomas son nanovesículas endógenas que transportan ARN y proteínas que pueden suministrar ARN(ip) al cerebro en ratones. Para reducir la inmunogenicidad, Alvarez-Erviti et al. (2011, Nat Biotechnol 29: 341) utilizaron células dendríticas autoderivadas para la producción de exosomas. Se logró el direccionamiento modificando las células dendríticas para que expresaran Lamp2b, una proteína de membrana exosómica, fusionada con el péptido 3 RVG específico de las neuronas. Se cargaron los exosomas purificados con ARNip exógeno mediante electroporación. La inyección intravenosa de exosomas dirigidos con RVG suministró ARNip GAPDH específicamente a las neuronas, microglía, oligodendrocitos en el cerebro, lo que dio como resultado una atenuación génica específica. La preexposición a los exosomas RVG no atenuó la atenuación génica y no se observó una captación no específica en otros tejidos. Se demostró el potencial terapéutico del suministro de ARNip mediado por exosomas mediante la fuerte atenuación de la proteína (62%) y del ARNm (60%) de BACE1, una diana terapéutica en la enfermedad de Alzheimer.
Para obtener un conjunto de exosomas inmunológicamente inertes, Alvarez-Erviti et al. recolectaron médula ósea de ratones endogámicos C57BL/6 con un haplotipo homogéneo del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés). Ya que las células dendríticas inmaduras producen grandes cantidades de exosomas desprovistos de activadores de los linfocitos T tales como MHC-II y CD86, Alvarez-Erviti et al. seleccionaron células dendríticas con el factor estimulador de colonias de macrófagos/granulocitos (GM-GSF, por sus siglas en inglés) durante 7 d. Se purificaron los exosomas del sobrenadante del cultivo al día siguiente utilizando protocolos sobradamente establecidos de ultracentrifugación. Los exosomas producidos fueron físicamente homogéneos, con una distribución del tamaño que tenía un máximo en 80 nm de diámetro tal como lo determinó el análisis de rastreo de nanopartículas (NTA, por sus siglas en inglés) y la microscopía electrónica. Alvarez-Erviti et al. obtuvieron 6-12 pg de exosomas (medidos basándose en la concentración de proteína) por 106 células.
A continuación, Alvarez-Erviti et al. estudiaron la posibilidad de cargar exosomas modificados con material de carga exógeno utilizando protocolos de electroporación adaptados para las aplicaciones a nanoescala. Ya que la electroporación para las partículas con membrana a escala nanométrica no está bien caracterizada, se utilizó ARNip marcado con Cy5 no específico para la optimización empírica del protocolo de electroporación. Se determinó mediante un ensayo la cantidad de ARNip encapsulado tras la ultracentrifugación y lisis de los exosomas. La electroporación a 400 V y 125 pF dio como resultado la mayor retención de ARNip y se utilizó para todos los experimentos posteriores.
Alvarez-Erviti et al. administraron 150 pg de cada ARNip BACE1 encapsulado en 150 pg de exosomas RVG a ratones C57BL/6 normales y se comparó con la eficacia de atenuación génica en cuatro controles: ratones no tratados, ratones a los que se inyectó únicamente exosomas RVG, ratones a los que se inyectó ARNip BACE1 complejado con un reactivo liposómico catiónico in vivo y ratones a los que se inyectó ARNip BACE1 complejado con RVG-9R, el péptido RVG conjugado con 9 D-argininas que se unen electrostáticamente al ARNip. Se analizaron muestras tisulares corticales 3 d después de la administración y se observó una atenuación significativa de la proteína (45%, P < 0.05, frente a 62%, P < 0.01) tanto en ratones tratados con ARNip-RVG-9R como tratados con exosomas con ARNipRVG, lo que fue el resultado de un descenso significativo en niveles de ARNm de BACE1 (66% [+ o -] 15%, P < 0.001 y 61% [+ o -] 13% respectivamente, P < 0.01). Además, los solicitantes demostraron un descenso significativo (55%, P < 0.05) en los niveles totales de [beta]-amiloide 1-42, un componente principal de las placas de amiloide en la patología de Alzheimer, en los animales tratados con exosomas RVG. El descenso observado fue superior al descenso de p-amiloide 1-40 demostrado en ratones normales tras la inyección intraventricular de inhibidores de BACE1. Alvarez-Erviti et al. llevaron a cabo una amplificación rápida en 5' de los extremos del ADNc (RACE) en el producto de escisión de BACE1, que proporcionó evidencia de la atenuación génica mediada por iARN por parte del ARNip.
Finalmente, Alvarez-Erviti et al. estudiaron si los exosomas con ARNip-RVG inducían respuestas inmunitarias in vivo evaluando las concentraciones séricas de IL-6, IP-10, TNFa y IFN-a. Tras el tratamiento con exosomas con ARNip-RVG se registraron cambios no significativos en todas las citocinas similares al tratamiento con el reactivo de transfección de ARNip a diferencia de ARNip-RVG-9R, que estimuló notablemente la secreción de IL-6, y confirmó de esta manera el perfil inmunológicamente inerte del tratamiento con exosomas. Dado que los exosomas encapsulan únicamente un 20% del ARNip, el suministro con exosomas con RVG parece ser más eficaz que el suministro con RVG-9R ya que se logró una atenuación génica del ARNm comparable y una atenuación génica de la proteína mayor con una cantidad de ARNip cinco veces menor sin el nivel correspondiente de estimulación inmunitaria. Este experimento demostró el potencial terapéutico de la tecnología de exosomas con RVG, que es potencialmente adecuado para el silenciamiento a largo plazo de genes relacionados con enfermedades neurodegenerativas. El sistema de suministro con exosomas de Alvarez-Erviti et al., se podrá aplicar al suministro del sistema CRISPR-Cas a dianas terapéuticas, especialmente en enfermedades neurodegenerativas. Para la presente invención se podrá contemplar una dosificación comprendida entre aproximadamente 100 y 1000 mg de CRISPR Cas encapsulado en una cantidad de exosomas con RVG comprendida entre aproximadamente 100 y 1000 mg.
El-Andaloussi et al. (Nature Protocols 7,2112-2126(2012)) divulgan cómo exosomas obtenidos a partir de células cultivadas se pueden aprovechar para el suministro de ARNip in vitro e in vivo. Este protocolo describe en primer lugar la generación de exosomas dirigidos mediante la transfección con un vector de expresión que comprende una proteína exosómica fusionada con un ligando peptídico. A continuación, El-Andaloussi et al. explican cómo purificar y caracterizar exosomas a partir del sobrenadante celular transfectado. A continuación, El-Andaloussi et al. detallan los pasos cruciales para cargar ARNip en los exosomas. Finalmente, El-Andaloussi et al. describen brevemente cómo utilizar exosomas para suministrar de manera eficaz ARNip in vitro e in vivo en el cerebro del ratón. También se proporcionan ejemplos de los resultados previstos en los que se evalúa el suministro de ARNip mediado por exosomas mediante ensayos funcionales y obtención de imágenes. Todo el protocolo requiere ~3 semanas. El suministro o la administración de acuerdo con la invención se podrá realizar utilizando exosomas producidos a partir de células dendríticas autoderivadas.
En otra realización, se contemplan los exosomas plasmáticos de Wahlgren et al. (Nucleic Acids Research, 2012, Vol.
40, No. 17 e130). Los exosomas son vesículas de tamaño nano (tamaño de 30-90 nm) producidos por muchos tipos celulares, incluidas las células dendríticas (DC, por sus siglas en inglés), linfocitos B, linfocitos T, mastocitos, células epiteliales y células tumorales. Estas vesículas se forman por gemación hacia el interior de endosomas tardíos y se liberan a continuación al entorno extracelular tras la fusión con la membrana plasmática. Debido a que los exosomas portan de manera natural ARN entre células, esta propiedad podría ser útil en la terapia génica.
Se preparan exosomas a partir del plasma por centrifugación de la capa leucocitaria a 900g durante 20 min para aislar el plasma y a continuación se recolectan los sobrenadantes celulares, se centrifugan a 300g durante 10 min para eliminar células y a 16500g durante 30 min seguido por filtración a través de un filtro de 0.22 mm. Se obtiene el sedimento con los exosomas mediante ultracentrifugación a 120000g durante 70 min. La transfección química del ARNip al interior de los exosomas se lleva a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante con el kit Starter para iARN de Seres humanos/Ratones (Quiagen, Hilden, Alemania). Se añade ARNip a 100 mL de PBS con una concentración final de 2 mmol/mL. Después de añadir el reactivo de transfección HiPerFect, se incuba la mezcla durante 10 min a t. amb. Con el fin de eliminar el exceso de micelas, se vuelven a aislar los exosomas utilizando perlitas de látex con aldehído/sulfato. La transfección química de exosomas con CRISPR Cas se podrá llevar a cabo de manera similar al ARNip. Los exosomas se podrán cocultivar con monocitos y linfocitos aislados de sangre periférica de donantes sanos. Por lo tanto, se podrá contemplar que exosomas que contienen CRISPR Cas se podrán introducir en monocitos y linfocitos de un ser humano y reintroducirse autólogamente en este. En consecuencia, el suministro o administración de acuerdo con la invención se podrá realizar utilizando exosomas plasmáticos.
Liposomas
El suministro o la administración de acuerdo con la invención se podrá realizar con liposomas. Los liposomas son estructuras vesiculares esféricas compuestas de una bicapa lipídica uni- o multilamelar que rodea compartimentos acuosos internos y una bicapa fosfolipídica lipófila externa relativamente impermeable. Los liposomas han atraído una atención considerable como portadores para el suministro de fármacos ya que son biocompatibles, atóxicos, pueden suministrar tanto moléculas farmacológicas hidrófilas como lipófilas, protegen su material de carga de la degradación por parte de enzimas plasmáticas y transportan su carga a través de membranas biológicas y de la barrera hematoencefálica (BHE) (para una revisión remítase a, p. ej., Spuch y Navarro, Journal of Drug Delivery, vol.
2011, ID del artículo 469679, 12 páginas, 2011. doi:10.1155/2011/469679).
Se pueden obtener liposomas a partir de varios tipos de lípidos diferentes; sin embargo, los fosfolípidos son los que se utilizan más habitualmente para generar liposomas como portadores de fármacos. Aunque la formación de liposomas es espontánea cuando una película lipídica se mezcla con una solución acuosa, también se puede acelerar aplicando fuerza en forma de agitación utilizando un homogeneizador, sonicador o un aparato de extrusión (para una revisión remítase a, p. ej., Spuch y Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, ID del artículo 469679, 12 páginas, 2011. doi:10.1155/2011/469679).
Se podrán añadir varios aditivos diferentes a los liposomas para modificar su estructura y propiedades. Por ejemplo, se podrán añadir colesterol o esfingomielina a la mezcla de liposomas con el fin de ayudar a estabilizar la estructura liposomal y para prevenir el escape del material de carga interno liposomal. Además, los liposomas se preparan a partir de fosfatidilcolina de huevo hidrogenada o fosfato dicetílico, colesterol y fosfatidilcolina de huevo y sus tamaños vesiculares medio se ajustan entre aproximadamente 50 y 100 nm (para una revisión remítase a, p. ej., Spuch y Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, ID del artículo 469679, 12 páginas, 2011.
doi:10.1155/2011/469679).
La formulación de liposomas convencional comprende principalmente fosfolípidos y lípidos naturales tales como 1,2-diestearoril-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DSPC, por sus siglas en inglés), esfingomielina, fosfatidilcolinas de huevo y monosialogangliósido. Debido a que esta formulación está constituida únicamente por fosfolípidos, las formulaciones liposomales se han topado con muchos obstáculos, siendo uno de ellos la inestabilidad en plasma. Se han realizado varios intentos de superar estos obstáculos, específicamente en la manipulación de la membrana lipídica. Uno de estos intentos se ha centrado en la manipulación del colesterol. La adición de colesterol a las formulaciones convencionales reduce la liberación rápida del compuesto bioactivo encapsulado en el plasma o la 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) incrementa la estabilidad (para una revisión remítase a, p. ej., Spuch y Navarro, Journal of Drug Deiivery, vol. 2011, ID del artículo 469679, 12 páginas, 2011. doi:10.1155/2011/469679).
En una realización particularmente conveniente, son deseables los liposomas de tipo caballo de Troya (también conocidos como caballos de Troya moleculares) y se podrán acceder a protocolos en http://cshprotocols.cshlp.org/content/2010/4/pdb.prot5407.long. Estas partículas permiten el suministro de un transgén a todo el cerebro tras una inyección intravascular. Sin querer ceñirse a ninguna teoría, se cree que las partículas lipídicas neutras con anticuerpos específicos conjugados a la superficie permiten cruzar la barrera hematoencefálica mediante endocitosis. El solicitante propone utilizar liposomas de tipo caballo de Troya para suministrar la familia CRISPR de nucleasas al cerebro mediante una inyección intravascular, lo que permitiría animales transgénicos en la totalidad de su cerebro sin requerir manipulación de embriones. Se podrán contemplar aproximadamente 1-5 g de molécula de ácido nucleico, por ej., ADN, ARN para la administración in vivo en liposomas.
En otra realización, el sistema CRISPR Cas se podrá administrar en liposomas, tales como una partícula ácido nucleico-lípido estable (SNALP, por sus siglas en inglés) (remítase a, p. ej., Morrissey et al., Nature Biotechnology, vol. 23, N.° 8, agosto de 2005). Se contemplan inyecciones intravenosas diarias de aproximadamente 1, 3 o 5 mg/kg/día de un CRISPR Cas específico dirigido en una SNALP. El tratamiento diario podrá prolongarse durante aproximadamente tres días y a continuación semanalmente durante aproximadamente cinco semanas. En otra realización, también se contempla un CRISPR Cas específico encapsulado en una SNALP administrado mediante inyección intravenosa con dosis de aproximadamente 1 o 2.5 mg/kg (remítase a, p. ej., Zimmerman et al., Nature Letters, Vol. 441, 4 de mayo de 2006). La formulación de SNALP podrá contener los lípidos 3-N-[(wmetoxipoli(etilenglicol) 2000) carbamoil]-1 ,2-dimiristiloxipropilamina (PEG-C-DMA), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLinDMA), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) y colesterol con una relación molar porcentual de 2:40:10:48 (remítase a, p. ej., Zimmerman et al., Nature Letters, Vol. 441,4 de mayo de 2006).
En otra realización, se ha demostrado que las partículas de ácido nucleico-lípido estables (SNALP) son moléculas de suministro eficaces para tumores hepáticos derivados de HepG2 sumamente vascularizados pero no para los tumores hepáticos derivados de HCT-116 poco vascularizados (remítase a, p. ej., Li, Gene Therapy (2012) 19, 775­ 780). Se podrán preparar liposomas de SNALP formulando D-Lin-DMA y p EG-C-DMA con diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), colesterol y ARNip utilizando una relación 25:1 de lípido/ARNip y una relación molar de 48/40/10/2 de colesterol/D-Lin-DMA/DSPC/PEG-C-DMA. Los liposomas de SNa Lp resultantes tienen un tamaño de aproximadamente 80-100 nm.
En otra realización más, una SNALP podrá comprender colesterol sintético (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, EE. UU.), dipalmitoilfosfatidilcolina (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, EE. UU.), 3-N-[(wmetoxipoli(etilenglicol)2000)carbamoil]-1,2-dimirestiloxipropilamina y 1,2-dilinoleiloxi-3-N,N-dimetilaminopropano catiónico (remítase a, p. ej., Geisbert et al., Lancet 2010; 375: 1896-905 h Se podrá contemplar una dosificación de aproximadamente 2 mg/kg de CRISPR Cas total por dosis administrada, por ejemplo, como una inyección intravenosa rápida.
En otra realización más, una SNALP podrá comprender colesterol sintético (Sigma-Aldrich), 1,2-diestearoil-snglicero-3-fosfocolina (DSPC; Avanti Polar Lipids Inc.), PEG-cDMA y 1,2-dilinoleiloxi-3-(N,N-dimetil)aminopropano (DLinDMA) (remítase a, p. ej., Judge, J. Clin. Invest. [119] 6611 Día 2009: Las formulaciones utilizadas para los estudios in vivo podrán comprender una relación másica de lípidos/ARN final de aproximadamente 9:1.
Barros y Gollob de Alnylam Pharmaceuticals (remítase a, p. ej., Advanced Drug Delivery Reviews 64 (2012) 1730­ 1737) han revisado el perfil de seguridad de las nanomedicinas con iARN. La partícula de ácido nucleico y lípido estable (SNALP) comprende cuatro lípidos diferentes - un lípido ionizable (DLinDMA) que es catiónico a un pH bajo, un lípido neutro cooperador, colesterol y un polietilenglicol (PEG) difundible-lípido. La partícula tiene un diámetro de aproximadamente 80 nm y el pH fisiológico tiene una carga neutra. Durante la formulación, el lípido ionizable sirve para condensar el lípido con el ARNip aniónico durante la formación de la partícula. Cuando se carga positivamente en condiciones endosómicas cada vez más ácidas, el lípido ionizable también media en la fusión de la SNALP con la membrana endosómica y hace posible la liberación del ARNip en el citoplasma. El PEG-lípido estabiliza la partícula y reduce la agregación durante la formulación y posteriormente proporciona un exterior hidrófilo neutro que mejora las propiedades farmacocinéticas.
Hasta la fecha, se han iniciado dos programas clínicos utilizando formulaciones de SNALP-ARNip. Tekmira Pharmaceuticals completó recientemente un estudio de fase I de dosis única de SNALP-ApoB en voluntarios adultos con un nivel de colesterol LDL elevado. ApoB se expresa predominantemente en el hígado y el yeyuno y es esencial para el ensamblaje y secreción de VLDL y LDL. ApoB también es una diana exitosa de los sistemas CRISPR-Cas de los autores, remítase a los ejemplos 38-39. Diecisiete sujetos recibieron una dosis única de SNALP-ApoB (aumento escalonado de la dosis en 7 niveles de dosis). No se dispone de evidencia de hepatotoxicidad (prevista debido a la toxicidad limitante de la dosis potencial según los estudios preclínicos). Uno (de los dos) sujetos con la dosis más alta experimentaron síntomas similares a los de la gripe coherentes con una estimulación del sistema inmunitario y se tomó la decisión de finalizar el ensayo.
Alnylam Pharmaceuticals ha avanzado de manera similar ALN-TTR01, que emplea la tecnología de SNALP descrita anteriormente y actúa sobre la producción de hepatocitos tanto en TTR no modificada como la mutante para tratar la amiloidosis TTR (ATTR, por sus siglas en inglés). Se han descrito tres síndromes de ATTR: la polineuropatía amiloidótica familiar (FAP, por sus siglas en inglés) y la cardiomiopatía amiloidótica familiar (FAC, por sus siglas en inglés) - ambas provocadas por mutaciones dominantes autosómicas en la TTR; y la amiloidosis sistémica senil (SSA, por sus siglas en inglés) provocada por la TTR no modificada. Recientemente se ha completado un ensayo controlado con placebo de fase I con aumento escalonado de una dosis única de ALN-TTR01 en pacientes con ATTR. Se administró ALN-TTR01 como una infusión IV de 15 min a 31 pacientes (23 con el fármaco de estudio y 8 con el placebo) con una dosis comprendida en el intervalo de 0.01 a 1.0 mg/kg (basándose en el ARNip). El tratamiento se toleró bien sin aumentos significativos en las pruebas de la función hepática. Se observaron reacciones relacionadas con la infusión en 3 de los 23 pacientes con >0.4 mg/kg; todos respondieron a una ralentización de la velocidad de infusión y todos continuaron en el estudio. Se observaron elevaciones transitorias y mínimas de las citocinas séricas IL-6, IP-10 e IL-1 ra en dos pacientes con la dosis más alta de 1 mg/kg (tal como se había previsto a partir de los estudios preclínicos y en NHP). Al bajar la TTR sérica, se observó el efecto farmacodinámico esperado de ALN-TTR01 con 1 mg/kg.
En otra realización más, se puede generar una SNALP solubilizando un lípido catiónico, DSPC, colesterol y PEG-lípido se solubilizaron en etanol con una relación molar de 40:10:40:10, respectivamente (remítase a Semple et al., Nature Biotechnology, Volumen 28 Número de 2 febrero de 2010, págs. 172-177). Se añadió la mezcla lipídica a un tampón acuoso (citrato 50 mM, pH 4) mientras se agitaba hasta alcanzar una concentración final de etanol y lípidos de un 30% (vol/vol) y 6.1 mg/mL, respectivamente, y se permitió que se equilibrara a 22 °C durante 2 min antes de la extrusión. Se extruyeron los lípidos hidratados a través de dos filtros apilados con un tamaño de poro de 80 nm (Nuclepore) a 22 °C utilizando un Extrusor Lipex (Northern Lipids) hasta obtener vesículas con un diámetro de 70-90 nm, tal como se determinó mediante análisis de dispersión dinámica de la luz. Esto requirió, en general, 1-3 pases. El ARNip (solubilizado en una solución acuosa de citrato 50 mM, pH 4, que contenía un 30% de etanol) se añadió a las vesículas preequilibradas (35 °C) con una velocidad de ~5 mL/min mientras se agitaba. Después de alcanzar la relación ARNip/lípido objetivo final de 0.06 (p/p), se incubó la mezcla durante 30 min más a 35 °C para permitir la reorganización de las vesículas y la encapsulación del ARNip. A continuación el etanol se eliminó y el tampón externo se reemplazó con PBS (NaCl 155 mM, Na2HPÜ4 3 mM, KH2 PO4 1 mM, pH 7.5) ya sea por diálisis o diafiltración con flujo tangencial. Se encapsuló el ARNip en SNALP utilizando un proceso metodológico de dilución en etapas controlado. Los constituyentes lipídicos de KC2-SNALP fueron DLin-KC2-DMA (lípido catiónico), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC; Avanti Polar Lipids), colesterol sintético (Sigma) y PEG-C-DMA utilizados con una relación molar de 57.1:7.1:34.3:1.4. Tras la formación de las partículas con el material de carga, se dializaron las SNALP frente a PBS y se esterilizaron por filtración a través de un filtro de 0.2 gm antes de su uso. Los tamaños de partículas medios fueron de 75-85 nm y se encapsuló un 90-95% del ARNip dentro de las partículas lipídicas. La relación final de ARNip/lípido en las formulaciones utilizadas para las pruebas in vivo fue de ~0.15 (p/p). Los sistemas de LNP-ARNip que contenían ARNip contra el Factor VII se diluyeron hasta alcanzar las concentraciones apropiadas en PBS estéril inmediatamente antes de su uso y se administraron las formulaciones por vía intravenosa a través de la vena de la cola lateral en un volumen total de 10 mL/kg. Este método se podrá extrapolar al sistema CRISPR Cas.
Otros lípidos
Se podrán utilizar otros lípidos catiónicos, tales como el amino lípido 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA) para encapsular CRISPR Cas de manera similar al ARNip (remítase a, p. je., Jayaraman, Angew. Chem. Int. Ed. agosto de 51, 8529(-8533): Se podrá contemplar una vesícula preformada con la siguiente composición lipídica: amino lípido, diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), colesterol y (R)-2,3-bis(octadeciloxi)propil-1-(metoxipoli(etilenglicol)2000)propilcarbamato (PEG-lípido) con una relación molar de 40/10/40/10, respectivamente, y una relación ARNip contra FVII/lípidos totales de aproximadamente 0.05 (p/p). Para garantizar una distribución del tamaño de las partículas estrecho comprendido en el intervalo de 70-90 nm y un índice de polidispersidad bajo de 0.11-0.04 (n=56), las partículas se podrán extruir hasta tres veces a través de membranas de 80 nm antes de añadir el ARN de CRISPR Cas. Se podrán utilizar partículas que contengan un amino lípido 16 sumamente potente, donde la relación molar de los cuatro componentes lipídicos 16, DSPC, colesterol y PEG-lípido (50/10/38.5/1.5) se podrá optimizar en mayor grado para potenciar la actividad in vivo.
Michael S D Kormann et al. ("Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice: Nature Biotechnology, Volumen:29, Páginas: 154-157 (2011) publicado electrónicamente el 9 de enero de 2011) describen el uso de envolturas lipídicas para suministrar ARN. También se prefiere la utilización de envolturas lipídicas en la presente invención.
En otra realización, se podrán formular los lípidos con el sistema CRISPR Cas para formar nanopartículas lipídicas (LNP). Los lípidos incluyen, sin carácter limitante, DLin-KC2-DMA4, C12-200 y los colípidos diesteroilfosfatidilcolina, colesterol y PEG-DMG, y se podrán formular con CRISPR Cas en lugar de ARNip (remítase a, p. ej., Novobrantseva, Molecular Therapy-Nucleic Acids (2012) 1, e4; doi:10.1038/mtna.2011.3) utilizando un procedimiento de formación de vesículas espontáneo. La relación molar de los componentes podrá ser aproximadamente 50/10/38.5/1.5 (DLin-KC2-DMA o C12-200/diesteroilfosfatidilcolina/colesterol/PEG-DMG). La relación ponderal final lípido:ARNip podrá ser ~12:1 y 9:1 en el caso de nanopartículas lipídicas (LNP) de DLin-KC2-DMA y C12-200, respectivamente. Las formulaciones podrán tener diámetros de partículas promedio de ~80 nm con una eficacia de atrapamiento de >90%. Se podrá contemplar una dosis de 3 mg/kg.
Tekmira tiene una cartera de aproximadamente 95 familias de patentes, en los EE. UU. y otros países, que tratan sobre diversos aspectos de la LNP y formulaciones con LNP (remítase a, p. ej., las patentes de los EE. UU. con N.os 7 982027; 7799565; 8058069; 8283333; 7901 708; 7745651; 7803397; 8101 741; 8188263; 7915399; 8 236 943 y 7838 658 u patentes europeas con N.os 1766035; 1519714; 1781593 y 1664316), todas las cuales se podrán utilizar y/o adaptar a la presente invención.
El sistema CRISPR Cas se podrá suministrar encapsulado en microesferas de PLGA como las que se describen adicionalmente en las solicitudes publicadas en los EE. UU. 20130252281 y 20130245107 y 20130244279 (adjudicada a Moderna Therapeutics) que se refieren a aspectos de la formulación de composiciones que comprenden moléculas de ácido nucleico modificado que podrán codificar una proteína, un precursor proteico o una forma parcial o totalmente procesada de la proteína o precursor proteico. La formulación podrá tener una relación molar de 50:10:38.5:1.5-3.0 (lípido catiónico:lípido fusogénico:colesterol:PEG lípido). El PEG lípido se podrá seleccionar entre, sin carácter limitante, PEG-c-DOMG, PEG-DMG. El lípido fusogénico podrá ser DSPC. Remítase también a Schrum et al., Delivery and Formulation of Engineered Nucleic Acids, solicitud publicada de los EE. UU.
20120251618.
La tecnología de Nanomerics, aborda los obstáculos referentes a la biodisponibilidad para una gama amplia de tratamientos, que incluyen tratamientos con ácido nucleico (plásmidos, ARNip, ARNmi), péptidos y fármacos hidrófobos con un bajo peso molecular. Las vías de administración específicas para las que esta tecnología ha demostrado ventajas claras incluyen la vía oral, transporte a través de la barrera hematoencefálica, suministro a tumores sólidos así como también al ojo. Remítase a, p. ej., Mazza et al., 2013, ACS Nano. 26 de febrero de 2013;7(2):1016-26; Uchegbu y Siew, 2013, J Pharm Sci. 102(2):305-10 y Lalatsa et al., 2012, J Control Release. 20 de julio de 2012;161(2):523-36.
La patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20050019923 describe dendrímeros catiónicos para el suministro de moléculas bioactivas tales como moléculas polinucleotídicas, péptidos y polipéptido y/o agentes farmacéuticos, al cuerpo de un mamífero. Los dendrímeros son adecuados para dirigir el suministro de moléculas bioactivas a, por ejemplo, el hígado, bazo, pulmón, riñón o corazón. Los dendrímeros son macromoléculas sintéticas 3-dimensionales que se preparan por etapas a partir de unidades monoméricas ramificadas simples, donde su naturaleza y funcionalidad se pueden controlar y variar fácilmente. Los dendrímeros se sintetizan a partir de la adición repetida de unidades básicas a un núcleo multifuncional (estrategia divergente para la síntesis) o hacia un núcleo multifuncional (estrategia convergente para la síntesis) y cada adición de una coraza 3-dimensional de unidades básicas conduce a la formación de una generación más elevada de dendrímeros. Los dendrímeros de polipropilenimina comienzan con un núcleo de diaminobutano al que se añaden el doble de grupos amino mediante una adición doble de Michael de acrilonitrilo a las aminas primarias seguido por la hidrogenación de nitrilos. Esto da como resultado la duplicación de los grupos amino. Los dendrímeros de polipropilenimina contienen un 100% de nitrógenos protonables y hasta 64 grupos amino terminal (generación 5, 64 DBA). Los grupos protonables son normalmente grupos amino que son capaces de aceptar protones a un pH neutro. El uso de dendrímeros como agentes de suministro de genes se ha centrado principalmente en el uso de la poliamidoamina y compuestos que contienen fósforo con una mezcla de amina/amida o N--P(O2 )S como unidades de conjugación respectivamente sin que se haya publicado ningún trabajo sobre el uso de dendrímeros de polipropilenimina con una generación más baja para el suministro de genes. También se han estudiado dendrímeros de polipropilenimina como sistemas de liberación controlada sensibles al pH para el suministro de fármacos y para la encapsulación de moléculas externas cuando se modifican químicamente mediante grupos de tipo aminoácido periféricos. La citotoxicidad y la interacción de los dendrímeros de polipropilenimina con ADN así como también la eficacia de transfección de DAB 64 también se han estudiado.
La patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20050019923 se basa en la observación de que, a diferencia de informes anteriores, los dendrímeros catiónicos tales como dendrímeros de polipropilenimina, presentan propiedades adecuadas tales como un direccionamiento específico y una toxicidad baja, para su uso en el suministro dirigido de moléculas bioactivas, tal como el material genético. Además, los derivados de dendrímeros catiónicos también presentan propiedades adecuadas para el suministro dirigido de moléculas bioactivas. Remítase también a, Bioactive Polymers, solicitud de los EE. UU. publicada 20080267903, que divulga "diversos polímeros, que incluyen polímeros de poliamina catiónica y polímeros dendriméricos de los que se demuestra que poseen actividad antiproliferativa y, por lo tanto, podrán ser útiles para el tratamiento de afecciones caracterizadas por una proliferación celular no deseada tales como neoplasias y tumores, trastornos inflamatorios (que incluyen los trastornos autoimunitarios), psoriasis y aterosclerosis. Los polímeros se podrán utilizar solo como agentes activos o como vehículos para el suministro de otros agentes terapéuticos tales como moléculas farmacológicas o ácidos nucleicos para la terapia génica. En tales casos, la propia actividad antitumoral intrínseca de los polímeros podrá complementar la actividad del agente que se va a suministrar".
Proteínas supercargadas
Las proteínas supercargadas son una clase de proteínas modificadas o que están presentes de manera natural con una carga teórica neta positiva o negativa inusualmente elevada. Tanto las proteínas cargadas supernegativamente como superpositivamente exhiben una capacidad notable de soportar la agregación inducida térmica o químicamente. Las proteínas cargadas superpositivamente también son capaces de penetrar en células de mamíferos. La asociación de material de carga con estas proteínas, tales como ARNip, ADN plasmídico u otras proteínas, puede posibilitar el suministro funcional de estas macromoléculas en células de mamífero tanto in vitro como in vivo. El laboratorio de David Liu publicó la creación y caracterización de proteínas supercargadas en 2007 (Lawrence et al., 2007, Journal of the American Chemical Society 129, 10110-10112).
El suministro no vírico de ARNip y ADN plasmídico a células de mamíferos es valioso tanto para aplicaciones terapéuticas como en investigación (Akinc et al., 2010, Nat. Biotech. agosto de 26, 561 (-569): La proteína 36 GFP purificada (u otra proteína cargada superpositivamente) se mezcla con ARNip en el medio exento de suero apropiado y se permite que compleje antes de la adición de células. La inclusión de suero en esta etapa inhibe la formación de los complejos proteína supercargada-ARNip y reduce la eficacia del tratamiento. Se ha comprobado que el siguiente protocolo es eficaz para varias líneas celulares (McNaughton et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 6111-6116). Sin embargo, deberán realizarse experimentos piloto en los que se varíe la dosis de proteína y ARNip para optimizar el procedimiento para líneas celulares específicas.
(1) Un día antes del tratamiento, colocar en placas 1 x 105 células por pocillo en una placa de 48 pocillos.
(2) El día del tratamiento, diluir la proteína 36 GFP purificada en medio exento de suero hasta una concentración final de 200 nM. Añadir ARNip hasta una concentración final de 50 nM. Agitar vorticialmente para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
(3) Durante la incubación, aspirar el medio de las células y lavar una vez con PBS.
(4) Tras la incubación de 36 GFP y ARNip, añadir los complejos proteína-ARNip a las células.
(5) Incubar las células con complejos a 37 °C durante 4 h.
(6) Tras la incubación, aspirar el medio y lavar tres veces con 20 U/mL de heparina PBS. Incubar las células con medio que contenga suero durante 48 h más o durante más tiempo dependiendo del ensayo para determinar la atenuación génica.
(7) Analizar las células mediante inmunotransferencia, PCRc, ensayo fenotípico u otro método apropiado.
Se ha encontrado que 36 GFP es un reactivo de suministro plasmídico eficaz con una gama de células. Ya que el ADN plasmídico es un material de carga mayor que el ARNip, se requiere proporcionalmente más proteína 36 GFP para complejar de manera eficaz los plásmidos. Para el suministro plasmídico eficaz, los solicitantes han desarrollado una variante de 36 GFP que porta un identificador peptídico HA2 C-terminal, un conocido péptido desorganizador de endosomas obtenido a partir de la proteína hemaglutinina del virus influenza. El siguiente protocolo ha sido eficaz en varias células, pero al igual que anteriormente, se aconseja que las dosis de ADN plasmídico y proteína supercargada se optimicen para líneas celulares específicas y aplicaciones de suministro. (1) Un día antes del tratamiento, colocar en placas 1 x 105 por pocillo en una placa de 48 pocillos.
(2) El día del tratamiento, diluir la proteína p36 GFP purificada en medio exento de suero hasta una concentración final de 2 mM. Añadir 1 mg de ADN plasmídico. Agitar vorticialmente para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
(3) Durante la incubación, aspirar el medio de las células y lavar una vez con PBS.
(4) Tras la incubación de p36 GFP y ADN plasmídico, añadir cuidadosamente los complejos proteína-ADN a las células.
(5) Incubar las células con complejos a 37 °C durante 4 h.
(6) Tras la incubación, aspirar el medio y lavar con PBS. Incubar las células en medio que contenga suero e incubar durante 24-48 h más.
(7) Analizar el suministro del plásmido (p. ej., mediante expresión génica impulsada por el plásmido) según sea apropiado.
Remítase también a, p. ej., McNaughton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 6111-6116 (2009); Cronican et al., ACS Chemical Biology 5, 747-752 (2010); Cronican et al., Chemistry & Biology 18, 833-838 (2011); Thompson et al., Methods in Enzymology 503, 293-319 (2012); Thompson, D.B., et al., Chemistry & Biology 19 (7), 831-843 (2012). Los métodos de las proteínas supercargadas se podrán utilizar y/o adaptar para el suministro del sistema CRISPR Cas de la presente invención.
Péptidos de penetración celular
En otra realización más, se contemplan los péptidos de penetración celular (CPP, por sus siglas en inglés) para el suministro del sistema CRISPR Cas. Los CPP son péptidos cortos que facilitan la captación celular de una carga molecular diversa (desde partículas con un tamaño nano hasta moléculas químicas con un bajo peso molecular y fragmentos grandes de ADN). El término “carga” tal como se utiliza en la presente incluye, sin carácter limitante, el grupo constituido por agentes terapéuticos, sondas diagnósticas, péptidos, ácidos nucleicos, oligonucleótidos antisentido, plásmidos, proteínas, nanopartículas, liposomas, cromóforos, moléculas con un bajo peso molecular y materiales radioactivos. En algunos aspectos de la invención, la carga también podrá comprender cualquier componente del sistema CRISPR Cas o el sistema CRISPR Cas funcional completo. Algunos aspectos de la presente divulgación además proporcionan métodos para suministrar una carga deseada en un sujeto que comprenden: (a) preparar un complejo que comprende el péptido de penetración celular y una carga deseada, y (b) administrar por vía oral, intraarticular, intraperitoneal, intratecal, intraarterial, intranasal, intraparenquimal, subcutánea, intramuscular, intravenosa, dérmica, intrarrectal o tópica el complejo a un sujeto. La carga se asocia con los péptidos ya sea mediante una unión química a través de enlaces covalentes o mediante interacciones no covalentes.
La función de los CPP consiste en suministrar la carga al interior de las células, un proceso que ocurre normalmente mediante la endocitosis donde la carga se suministra a los endosomas de células vivas de mamífero. Los péptidos de penetración celular tienen diferentes tamaños, secuencias de aminoácidos y cargas pero todos los CPP tienen una característica distintiva, que es la capacidad de traslocarse en la membrana plasmática y facilitar el suministro de diversas cargas moleculares al citoplasma o a un orgánulo. La traslocación de los CPP se podrá clasificar en tres mecanismos de entrada principales: penetración directa en la membrana, entrada mediada por endocitosis y traslocación mediante la formación de una estructura transitoria. Los CPP han encontrado numerosas aplicaciones en medicina como agentes de suministro de fármacos en el tratamiento de diferentes enfermedades, incluido el cáncer, e inhibidores de virus, así como también agentes de contraste para el marcaje celular. Algunos ejemplos de este último incluyen actuar como un portador para GFP, agentes de contraste para IRM o puntos cuánticos. Los CPP poseen un gran potencial como vectores de suministro in vitro e in vivo para su uso en investigación y medicina. Los CPP tienen normalmente una composición de aminoácidos que o bien contiene una abundancia relativa elevada de aminoácidos cargados positivamente, tales como lisina o arginina, o bien tiene secuencias que contienen un patrón alternante de aminoácidos polares/cargados y aminoácidos no polares, hidrófobos. Estos dos tipos de estructuras se denominan policatiónicas o anfipáticas, respectivamente. Una tercera clase de CPP son los péptidos hidrófobos, que contienen únicamente residuos apolares, con una carga neta baja o que tienen grupos de aminoácidos hidrófobos que son clave para la captación celular. Uno de los CPP iniciales descubierto fue el activador transcripcional trans­ activador (Tat) del virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1), el cual se observó que era captado eficazmente por parte de numerosos tipos celulares en cultivo del medio que los rodeaba. Desde entonces, el número de CPP conocidos se ha expandido considerablemente y se han generado análogos sintéticos que son moléculas con un bajo peso molecular con unas propiedades de transducción de proteínas más eficaces. Los CPP incluyen, sin carácter limitante, Penetratina, Tat (48-60), Transportano y (R-AhX-R4) (Ahx=aminohexanoilo).
La patente de EE. UU. 8372951, proporciona un CPP derivado de una proteína catiónica eosinófila (ECP, por sus siglas en inglés), el cual muestra una eficacia de penetración en células muy elevada y una baja toxicidad. También se proporcionan los aspectos del suministro de CPP con su carga en un sujeto vertebrado. Se pueden consultar aspectos adicionales de los CPP y su suministro en las patentes de EE. UU. 8575305; 8614194 y 8044019.
También se señala que los CPP se pueden emplear para suministrar el sistema CRISPR-Cas en el artículo “Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA”, de Suresh Ramakrishna, Abu-Bonsrah Kwaku Dad, Jagadish Beloor, et al. Genome Res., 2 de abril de 2014. [publicación electrónica previa a la impresión], incorporado por referencia en su totalidad donde se demuestra que el tratamiento con una proteína Cas9 recombinante conjugada con CPP y ARN guía complejado con CPP provoca desactivaciones génicas endógenas en líneas celulares humanas. En el artículo, la proteína Cas9 se conjugó con CPP mediante un enlace tioéter, mientras que el ARN guía se complejó con CPP y se formaron nanopartículas cargadas positivamente y condensadas. Se demostró que el tratamiento secuencial y simultáneo de células humanas, incluidas las células madre embrionarias, fibroblastos dérmicos, células HEK293T, células HeLa y células de carcinoma embrionarias, con la Cas9 modificada y ARN guía provocó desactivaciones génicas eficaces con pocas mutaciones fuera de la diana con respecto a las transfecciones con plásmidos.
Dispositivos implantables
En otra realización, también se contemplan dispositivos implantables para el suministro del sistema CRISPR Cas. Por ejemplo, la publicación de patente de los EE. UU. 20110195123 divulga un dispositivo médico implantable el cual eluye un fármaco de manera localizada y en un periodo prolongado, que incluye varios tipos de dispositivos de este tipo, y se proporcionan modos de tratamiento de la implementación y métodos de la implantación. El dispositivo comprende un sustrato polimérico tal como una matriz, por ejemplo, que se utiliza como el cuerpo del dispositivo y fármacos y, en algunos casos, materiales que sirven de esqueleto adicionales tales como metales o polímeros adicionales y materiales para potenciar la visibilidad y obtención de imágenes. La selección del fármaco se basa en las ventajas de liberar un fármaco de manera localizada y en un periodo prolongado, donde el fármaco se libera directamente a la matriz extracelular (ECM, por sus siglas en inglés) del área con la enfermedad tal como el tumor, inflamación, degeneración o con objetivos sintomáticos o a células del músculo liso herido o para la prevención. Un tipo de fármacos son los fármacos para el silenciamiento génico que se basan en la interferencia por el ARN (iARN) que incluye, sin carácter limitante, ARNip, ARN hc (shRNA) o ARN/ADN antisentido, ribozima y análogos de nucleósidos. Por lo tanto, este sistema se podrá utilizar y/o adaptar al sistema CRISPR Cas. Los modos de implantación en algunas realizaciones son los procedimientos de implantación existentes que se han desarrollado y se utilizan en la actualidad para otros tratamientos que incluyen la braquirradioterapia y la punción biópsica. En tales casos, las dimensiones del nuevo implante descrito en esta invención son similares a las del implante original. Normalmente, se implantan unos pocos dispositivos durante el mismo procedimiento del tratamiento.
Tal y como se ha descrito en la publicación de patente de los EE. UU. 20110195123, se proporciona un sistema insertable o implantable para el suministro del fármaco que incluye sistemas aplicables a una cavidad tal como la cavidad abdominal y/o cualquier otro tipo de administración en la que el sistema de suministro del fármaco no está anclado o unido, que comprende un sustrato polimérico bioestable y/o degradable y/o bioabsorbible que podrá ser, por ejemplo, opcionalmente una matriz. Cabe señalar que el término "inserción" también incluye la implantación. El sistema de suministro del fármaco se implementa preferentemente como un "Loder" tal y como se describe en la publicación de patente de los EE. UU. 20110195123.
El polímero o pluralidad de polímeros son biocompatibles, incorporan un agente y/o una pluralidad de agentes, lo que hace posible la liberación del agente con una velocidad controlada, donde el volumen total del sustrato polimérico, tal como una matriz, por ejemplo, en algunas realizaciones es opcional y preferentemente no superior a un volumen máximo que permite que se alcance un nivel terapéutico del agente. Como un ejemplo no limitante, un volumen de este tipo está comprendido preferentemente en el intervalo de 0.1 m3 a 1000 mm3, tal y como lo requiere el volumen para alojar el agente. El Loder podrá ser opcionalmente más grande, por ejemplo, cuando tiene incorporado un dispositivo cuyo tamaño está determinado por la funcionalidad, por ejemplo, y sin carácter limitante, la articulación de la rodilla, un anillo intrauterino o cervicouterino y similares.
El sistema de suministro de fármacos (para suministrar la composición) se diseña en algunas realizaciones para emplear preferentemente polímeros degradables, donde el principal mecanismo de liberación es la erosión de todo el volumen; o en algunas realizaciones se utilizan polímeros no degradables o de degradación lenta, donde el principal sistema de liberación es la difusión más que la erosión de todo el volumen, de modo que la parte externa funciona como una membrana y su parte interna funciona como un depósito del fármaco, el cual prácticamente no se ve afectado por el entorno durante un periodo prolongado (por ejemplo, desde aproximadamente una semana hasta aproximadamente unos pocos meses). También se podrán utilizar opcionalmente combinaciones de polímeros diferentes con mecanismos de liberación diferentes. Preferentemente, el gradiente de concentración en la superficie se mantiene eficazmente constante durante un periodo de tiempo significativo del periodo total de liberación del fármaco y, por lo tanto, la velocidad de difusión es eficazmente constante (denominada difusión de "modo cero"). El término "constante" se refiere a una velocidad de difusión que se mantiene preferentemente por encima del umbral inferior de la eficacia terapéutica pero que aún podrá presentar opcionalmente una fluctuación y/o variación brusca inicial, por ejemplo, un incremento y disminución hasta cierto grado. La velocidad de difusión se mantiene de esta manera preferentemente durante un periodo prolongado y se puede considerar constante hasta un cierto nivel para optimizar el periodo terapéuticamente eficaz, por ejemplo, el periodo de silenciamiento eficaz.
Opcional y preferentemente el sistema de suministro de fármacos se diseña para proteger el agente terapéutico nucleotídico de la degradación, ya sea de naturaleza química o debida al ataque de enzimas y otros factores del cuerpo del sujeto.
El sistema de suministro de fármacos tal y como se describe en la publicación de patente de los EE. UU.
20110195123 se asocia opcionalmente con aparatos de detección y/o activación operados en la implantación del dispositivo y/o después de esta, mediante métodos de activación y/o aceleración/desaceleración no invasivos, y/o mínimamente invasivos, por ejemplo, que incluyen opcionalmente, pero sin carácter limitante, métodos o dispositivos de enfriamiento y calentamiento térmico, haces de rayos láser y ultrasónicos, que incluyen los ultrasonidos focalizados y/o RF (radiofrecuencia).
De acuerdo con algunas realizaciones de la publicación de patente de los EE. UU. 20110195123, el sitio para el suministro localizado podrá incluir opcionalmente sitios diana caracterizados por una proliferación elevada anómala de células y una supresión de la apoptosis que incluyen tumores, la inflamación crónica y/o activa y la infección que incluye los estados patológicos autoimunitarios, tejido que se está degenerando que incluye el tejido muscular y nervioso, dolor crónico, sitios degenerativos y ubicación de fracturas óseas y otras ubicaciones de heridas para potenciar la regeneración del tejido y músculo liso y estriado cardiaco lesionado. El sitio para el suministro localizado también podrá incluir opcionalmente sitios que hagan posible realizar actividades preventivas que incluyen el embarazo, la prevención de la infección y el envejecimiento.
El sitio para la implantación de la composición, o sitio diana, presenta preferentemente un radio, área y/o volumen que sea lo suficientemente pequeño para el suministro localizado dirigido. Por ejemplo, el sitio diana tiene opcionalmente un diámetro comprendido en el intervalo de aproximadamente 0.1 mm a aproximadamente 5 cm. Preferentemente, se selecciona la ubicación del sitio diana para una eficacia terapéutica máxima. Por ejemplo, la composición del sistema de suministro del fármaco (opcionalmente con un dispositivo para la implantación tal como se ha descrito anteriormente) se implanta opcional y preferentemente en las proximidades del entorno tumoral o en este, o en el suministro sanguíneo asociado con este.
Por ejemplo, la composición (opcionalmente con el dispositivo) se implanta opcionalmente dentro o en las proximidades del páncreas, próstata, mama, hígado, mediante el pezón, dentro del sistema vascular y así sucesivamente.
La ubicación diana se selecciona opcionalmente a partir del grupo constituido por (únicamente a modo de ejemplos no limitantes, ya que opcionalmente cualquier sitio dentro del cuerpo podrá ser adecuado para implantar un Loder): 1. cerebro en sitios degenerativos como en la enfermedad de Parkinson o Alzheimer en los núcleos basales, materia blanca y gris; 2. columna vertebral como en el caso de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA); cuello uterino para prevenir la infección por HPV; 4. articulaciones que padecen inflamación crónica y activa; 5. dermis como en el caso de la psoriasis; 6. sitios nerviosos sensoriales y simpáticos para un efecto analgésico; 7. implantación intraósea; 8. sitios de infección crónica y aguda; 9. intravaginal; 10. oído interno--sistema auditivo, laberinto del oído interno, sistema vestibular; 11. intratraqueal; 12. intracardiaco; coronario, epicardiaco; 13. vejiga urinaria; 14. sistema biliar; 15. tejido parenquimatoso que incluye sin carácter limitante el riñón, hígado, bazo; 16. nódulos linfáticos; 17. glándulas salivares; 18. encías; 19. intraarticular (al interior de las articulaciones); 20. intraocular; 21. tejido cerebral; 22. ventrículos cerebrales; 23. cavidades, que incluyen la cavidad abdominal (por ejemplo, sin carácter limitante, para el cáncer de ovario); 24. intraesofágica y 25. intrarrectal.
Opcionalmente, la inserción del sistema (por ejemplo, un dispositivo que contiene la composición) se asocia con la inyección de material a la ECM en el sitio diana y las inmediaciones de ese sitio para afectar a la temperatura y/o pH local y/u otros factores biológicos que afectan a la difusión del fármaco y/o cinética del fármaco en la ECM del sitio diana y las inmediaciones de tal sitio.
Opcionalmente, de acuerdo con algunas realizaciones, la liberación de dicho agente se podría asociar con aparatos de detección y/o activación operados antes de la inserción y/o en esta y/o después de esta, mediante métodos de activación y/o aceleración/desaceleración no invasivos y/o mínimamente invasivos y/o de otro tipo, que incluyen métodos o dispositivos de haz de rayos láser, radiación, enfriamiento y calentamiento térmico, y ultrasónicos, que incluyen el ultrasonido focalizado y/o RF (radiofrecuencia), y activadores químicos.
De acuerdo con otras realizaciones de la publicación de patente de los EE. UU. 20110195123, el fármaco comprende preferentemente un fármaco de iARN biológico para el silenciamiento génico, por ejemplo, para casos de cáncer ubicados en la mama, páncreas, cerebro, riñón, vejiga, pulmón y próstata como se ha descrito anteriormente. Además, muchos fármacos aparte del ARNip son adecuados para ser encapsulados en el Loder, y se pueden utilizar asociados con esta invención, siempre y cuando tales fármacos se puedan encapsular con el sustrato Loder, tal como una matriz, por ejemplo. Tales fármacos incluyen fármacos aprobados que se suministran en la actualidad mediante métodos diferentes al de la invención, que incluyen la anfotericina B para la infección fúngica; antibióticos tales como los de la osteomielitis; analgésicos tales como narcóticos; agentes antidegenerativos tales como los de las enfermedades de Alzheimer o de Parkinson en un Loder implantado en las inmediaciones de la columna vertebral en el caso del dolor en la espalda. Un sistema de este tipo se podrá utilizar y/o adaptar para suministrar el CRISPR Cas.
Por ejemplo, para las aplicaciones específicas tales como la prevención del crecimiento o el crecimiento de nuevo de las células de músculo liso (que se dañan durante un procedimiento de introducción de prótesis intravasculares y como resultado tienden a proliferar), el fármaco podrá ser opcionalmente un ARNip que silencie células del músculo liso, incluido el silenciamiento de H19, o un fármaco seleccionado a partir del grupo constituido por taxol, rapamicina y análogos de rapamicina. En tales casos, el Loder es preferentemente una prótesis intravascular de la que eluye un fármaco (DES, por sus siglas en inglés), con una liberación prolongada a una velocidad constante o un dispositivo dedicado que se implanta por separado asociado a la prótesis intravascular. Todo esto se podrá utilizar y/o adaptar al sistema CRISPR Cas.
Como otro ejemplo de una aplicación específica, las enfermedades neurodegenerativas y musculares degenerativas se desarrollan debido a una expresión génica anómala. El suministro localizado de ARN silenciadores podrá tener propiedades terapéuticas para interferir con tal expresión génica anómala. El suministro localizado de fármacos antiapoptóticos, antiinflamatorios y antidegenerativos incluidos los fármacos con un bajo peso molecular y macromoléculas también podrá ser opcionalmente terapéutico. En tales casos, se aplica el Loder para una liberación prolongada a una velocidad constante y/o a través de un dispositivo dedicado que se implanta por separado. Todo esto se podrá utilizar y/o adaptar al sistema CRISPR Cas.
Como otro ejemplo más de la aplicación específica, los trastornos cognitivos y psiquiátricos se tratan con modificadores génicos. La atenuación génica con ARN silenciador es una opción de tratamiento. Los Loders que suministran de manera localizada agentes nucleotídicos a sitios del sistema nervioso central son opciones terapéuticas para trastornos cognitivos y psiquiátricos que incluyen, sin carácter limitante, la psicosis, enfermedades bipolares, trastornos neuróticos y enfermedades conductuales. Los Loder también podrían suministrar de manera localizada fármacos, incluidos fármacos de bajo peso molecular y macromoléculas tras la implantación en sitios cerebrales específicos. Todo esto se podrá utilizar y/o adaptar al sistema CRISPR Cas de la presente invención. Como otro ejemplo de la aplicación específica, el silenciamiento de mediadores inmunitarios innatos y/o adaptativos en sitios localizados posibilita la prevención del rechazo del trasplante de órganos. El suministro localizado de ARN silenciadores y reactivos inmunomoduladores con el Loder implantado en el órgano trasplantado y/o sitio implantado produce la supresión inmunitaria localizada repeliendo las células inmunitarias tales como CD8 activadas contra el órgano trasplantado. Todo esto se podrá utilizar y/o adaptar al sistema CRISPR Cas.
Como otro ejemplo de la aplicación específica, los factores de crecimiento vascular incluidos los VEGF y la angiogenina y otros son esenciales para la neovascularización. El suministro localizado de factores, péptidos, peptidomiméticos o la supresión de sus represores es una modalidad terapéutica importante; el silenciamiento de los represores y el suministro localizado de los factores, péptidos, macromoléculas y fármacos de bajo peso molecular que estimulan la angiogénesis con el Loder es terapéutico para la enfermedad vascular periférica, sistémica y cardiaca.
El método de inserción, tal como implantación, podrá, opcionalmente, ya estar siendo utilizado para otros tipos de implantación tisular y/o para inserciones y/u obtención de muestras tisulares opcionalmente sin modificaciones o, como alternativa, opcionalmente únicamente con modificaciones no importantes en tales métodos. Tales métodos incluyen opcionalmente, sin carácter limitante, métodos de braquirradioterapia, biopsia, endoscopia con y/o sin ultrasonido tal como la ERCP, métodos estereotácticos en el tejido cerebral, laparoscopia, incluida la implantación con un laparoscopio en las articulaciones, órganos abdominales, la pared de la vejiga y las cavidades corporales. ARNm de la enzima CRISPR y ARN guía
El ARNm de la enzima CRISPR y el ARN guía también se podrán suministrar por separado. El ARNm de la enzima CRISPR se podrá suministrar antes que el ARN guía para dar tiempo a que la enzima CRISPR se exprese. El ARNm de la enzima CRISPR se podrá administrar 1-12 horas (preferentemente aproximadamente 2-6 horas) antes de la administración del ARN guía.
Como alternativa, el ARNm de la enzima CRISPR y el ARN guía se pueden administrar juntos. Convenientemente, se puede administrar una segunda dosis de refuerzo de ARN guía 1-12 horas (de manera preferida aproximadamente 2-6 horas) después de la administración inicial del ANRm de la enzima CRISPR el ARN guía. Las administraciones adicionales del ANRm de la enzima CRISPR y/o ARN guía podrán ser útiles para lograr los niveles más eficaces de modificación genómica.
Para minimizar la toxicidad y los efectos fuera de la diana, será importante controlar la concentración suministrada del ARNm de la enzima CRISPR y del ARN guía. Se pueden determinar las concentraciones óptimas del ARNm de la enzima CRISPR y del ARN guía probando diferentes concentraciones en un modelo en células o en animales y utilizando una secuenciación profunda para analizar el grado de modificación en loci genómicos fuera de la diana potenciales. Por ejemplo, para la secuencia guía que se dirige a 5’-GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA-3’ (SEQ ID NO: 5) en el gen EMX1 del genoma humano, se puede utilizar la secuenciación profunda para evaluar el nivel de modificación de los dos siguientes loci fuera de la diana, 1: 5’-GAGTCCTAGCAGGAGAAGAA-3’ (SEQ ID NO: 6) y 2: 5’-GAGTCTAAGCAGAAGAAGAA-3’ (SEQ ID NO: 7). Debería elegirse la concentración que proporcione el nivel más elevado de modificación en la diana y a la vez minimice el nivel de modificación fuera de la diana para el suministro in vivo.
Como alternativa, para minimizar el nivel de toxicidad y efecto fuera de la diana, se puede suministrar el ARNm de la enzima nickasa de CRISPR (por ejemplo, Cas9 de S. pyogenes con la mutación D10A) con un par de ARN guía que tengan como diana el sitio de interés. Los dos a Nr guía necesitan espaciarse de la siguiente manera. Secuencias guía en rojo (subrayado sencillo) y azul (subrayado doble) respectivamente (estos ejemplos se basan en el requisito de PAM para la Cas9 de Streptococcus pyogenes).
(SEQ ID NO: 8-61)
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Un análisis más exhaustivo del sistema ha proporcionado evidencia a los solicitantes de la región protuberante 5' (remítase a, p. ej., Ran et al., Cell. 23 de septiembre de 2013;154(6):1380-9). Los solicitantes han identificado además los parámetros relacionados con una escisión eficaz por parte de la nickasa mutante de Cas9 cuando se combina con dos ARN guía y estos parámetros incluyen, sin carácter limitante, la longitud de la región protuberante 5'. En realizaciones de la invención, la región protuberante 5' tiene como mucho 200 pares de bases, preferentemente, como mucho 100 pares de bases o más preferentemente como mucho 50 pares de bases. En realizaciones de la invención, la región protuberante 5' tiene como mínimo 26 pares de bases, preferentemente, como mínimo 30 pares de bases o más preferentemente 34-50 pares de bases o 1-34 pares de bases. En otros métodos preferidos de la invención, la primera secuencia guía dirige la escisión de una hebra del ADN bicatenario cerca de la primera secuencia diana y la segunda secuencia guía dirige la escisión de otra hebra cerca de la segunda secuencia diana lo que da como resultado un corte romo o una región protuberante 3'. En realizaciones de la invención, la región protuberante 3' tiene como mucho 150, 100 o 25 pares de bases o, como mínimo, 15, 10 o 1 pares de bases. En algunas realizaciones preferidas, la región protuberante 3' tiene 1-100 pares de bases.
Algunos aspectos de la divulgación se refieren a la disminución de la expresión del producto génico o a un polinucleótido molde que se introduce adicionalmente en la molécula de ADN que codifica el producto génico o a un intrón que se escinde de manera precisa y permite que las dos regiones protuberantes 5' se hibriden y liguen o la alteración de la actividad o función del producto génico o al incremento de la expresión del producto génico. En una realización de la invención, el producto génico es una proteína.
Únicamente pares ARNsg que crean las regiones protuberantes 5' con un solapamiento de menos de 8 pb entre las secuencias guías (compensación mayor que -8 pb) fueron capaces de mediar una formación de indel detectable. De manera importante, cada guía utilizada en estos ensayos es capaz de inducir eficazmente indels cuando se empareja con Cas9 no modificado, lo que indica que las posiciones relativas de los pares de guías son los parámetros más importantes para predecir la actividad de corte monocatenario doble.
Debido a que Cas9n y Cas9H840A practican cortes monocatenarios en hebras opuestas de ADN, la sustitución de Cas9n con Cas9H840A en un par de ARNsg concreto debería dar como resultado la inversión del tipo de región protuberante. Por ejemplo, un par de ARNsg que generen una región protuberante 5' con Cas9n deberían, en teoría, generar en su lugar la región protuberante 3' correspondiente. Por lo tanto, los pares de ARNsg que conlleven la generación de una región protuberante 3' con Cas9n podrían utilizarse con Cas9H840A para generar una región protuberante 5'. De manera inesperada, los solicitantes probaron Cas9H840A con un conjunto de ARNsg diseñados para generar tanto regiones protuberantes 5' como 3' (intervalo de compensación entre -278 y 58 pb), pero fueron incapaces de observar formación de indel. Podrá necesitarse más trabajo para identificar las reglas de diseño necesarias para emparejar ARNsg que permita practicar un corte monocatenario doble por parte de Cas9H840A. Proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) hepática
Los datos muestran conversión fenotípica.
La proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) es un miembro de la familia de las serínproteasas subtilisina. PCSK9 es expresada principalmente por el hígado y es crucial para la disminución de la expresión de receptores LDL en los hepatocitos. Los niveles de LDL-C en plasma están sumamente elevados en seres humanos con una mutación de ganancia funcional en PCSK9, que hace que se clasifiquen como pacientes que padecen hipercolesterolemia grave. Por lo tanto, PCSK9 es una diana atractiva para CRISPR. CRISPR dirigido a PCS9K se podrá formular en una partícula lipídica y, por ejemplo, administrarse en una cantidad de aproximadamente 15, 45, 90, 150, 250 y 400 pg/kg por vía intravenosa (remítase a, p. ej., http://www.alnylam.com/capella/wpcontent/uploads/2013/08/ALN-PCS02-001 -Protocol-Lancet.pdf).
Bailey et al. (J Mol Med (Berl). enero de 1999;77(1):244-9) divulga el suministro de insulina mediante terapia génica en células somátias ex vivo que conlleva la extracción de células somáticas que no son linfocitos B (p. ej., fibroblastos) de un paciente diabético y su alteración genética in vitro para producir y secretar insulina. Las células se pueden cultivar en un cultivo y devolver al donante como una fuente de reemplazo de insulina. Las células modificadas de esta manera se podrían evaluar antes de la implantación y se podrían crioconservar soluciones madre. Utilizando las células del propio paciente, el procedimiento debería obviar el requisito de la inmunosupresión y resolver el problema del suministro de tejidos a la vez que evitaría una destrucción de células recurrente. La terapia génica con células somáticas ex vivo requiere un tipo celular accesible y robusto susceptible de experimentar múltiples transfecciones y que se pueda someter a una proliferación controlada. Los problemas especiales asociados con el uso de células somáticas que no sean linfocitos B incluyen el procesamiento de proinsulina en insulina y el desarrollo de sensibilidad a la biosíntesis de proinsulina estimulada por la glucosa y la liberación de insulina regulada. Los estudios preeliminares que utilizan fibroblastos, células pituitarias, células (COS) de riñón y células (CHO) de ovario sugieren que estos retos se podrían superar y que la terapia génica con células somáticas ex vivo ofrece una estrategia viable para la terapia de reemplazo de insulina. El sistema de Bailey et al. se podrá utilizar y/o adaptar al sistema CRISPR Cas de la presente invención para el suministro al hígado.
Los métodos de Sato et al. (Nature Biotechnology Volumen 26 Número 4 de abril de 2008, Páginas 431-442) se podrá aplicar al sistema CRISPR Cas de la presente invención para el suministro al hígado. Sato et al. observaron que con los tratamientos con liposomas acoplados con vitamina A que portan ARNip la fibrosis hepática se resolvía casi completamente y se prolongaba la supervivencia en ratas con cirrosis hepática inducida por dimetilnitrosamina que de otra manera sería letal en una manera dependiente de la dosis y la duración. Los liposomas catiónicos (Lipotrust) que contienen cloruro de 0,0'-ditetradecanoil-N-(a-trimetilamonioacetil) dietanolamina (DC-6-14) como lípido catiónico, colesterol y dioleilfosfatidiletanolamina con una relación molar de 4:3:3 (que ha mostrado una eficacia de transfección elevada en condiciones que contienen suero para el suministro génico in vitro e in vivo) se adquirieron de Hokkaido System Science. Los liposomas se produjeron utilizando un método de liposomas vacíos lifolizados y se prepararon con una concentración de (DC-16-4) 1 mM añadiendo agua doblemente destilada (DDW, por sus siglas en inglés) a la mezcla lipídica liofilizada con agitación vorticial antes de su uso. Para preparar liposomas acoplados con VA, se mezclaron 200 nmol de vitamina A (retinol, Sigma) disueltos en DMSO con las suspensiones de liposomas (100 nmol como DC-16-4) mezclando vorticialmemte en un tubo de 1.5 mL a 25 °C. Para preparar liposomas acoplados con VA que portaban ARNipgp46 (VA-lip-ARNipgp46), se añadió una solución de ARNipgp46 (580 pmol/mL en DDW) a la solución con liposomas acoplados con retinol mientras se agitaba a 25 °C. La relación de ARNip respecto a CD-16-4 fue de 1:11.5 (mol/mol) y la relación de ARNip respecto a los liposomas (p/p) fue de 1:1. Se separó toda la vitamina A o ARNip libre que no hubiera sido captado por los liposomas de las preparaciones liposomales utilizando un sistema de micropartición (concentrador VIVASPIN 2, 30000 MWCO PES, VIVASCIENCE). Se añadió la suspensión liposomal a los filtros y se centrifugó a 1500g durante 5 min 3 veces a 25 °C. Se recogieron las fracciones y el material atrapado en el filtro se reconstituyó con PBS para lograr la dosis deseada para la utilización in vitro o in vivo. Se administraron tres inyecciones de 0.75 mg/kg de ARNip a las ratas en días alternos. El sistema de Sato et al. se podrá utilizar y/o adaptar al sistema CRISPR Cas para el suministro en el hígado, suministrando aproximadamente 0.5 a 1 mg/kg de ARN de CRISPR Cas en los liposomas tal como lo describen Sato et al. a los seres humanos.
Los métodos de Rozema et al. (PNAS, 7 de agosto de 2007, vol. 104, n.° 32) para un vehículo para el suministro de ARNip a hepatocitos tanto in vitro como in vivo, que Rozema et al. han denominado PoliConjugados Dinámicos de ARNip, también se podrán aplicar a la presente invención. Las características clave de la tecnología de PoliConjugados Dinámicos incluyen un polímero activo en la membrana, la capacidad de enmascarar de manera reversible la actividad de este polímero hasta que alcance el entorno ácido de los endosomas y la capacidad de dirigir este polímero modificado y su ARNip de carga específicamente a los hepatocitos in vivo después de una simple inyección i.v. a baja presión. Los ARNip modificados con SATA se sintetizan mediante la reacción de ARNip aminomodificado en 5' con 1 equivalente en peso (eq p) del reactivo N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA) (Pierce) y 0.36 eq p de NaHCO3 en agua a 4 °C durante 16 h. Los ARNip modificados se hacen precipitar a continuación mediante la adición de 9 vol de etanol y la incubación a 80 °C durante 2 h. El precipitado se resuspende en tampón para ARNip 1X (Dharmacon) y se cuantifica midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 260 nm. Se modifica PBAVE (30 mg/mL en MTAPS 5 mM, pH 9) añadiendo un 1.5% en peso de SMPT (Pierce). Después de una incubación de 1 h, se añaden 0.8 mg de SMPT-PBAVE a 400 pL de una solución isotónica de glucosa que contenía TAPS 5 mM (pH 9). A esta solución se añadieron 50 pg de ARNip modificado con SATA. Para los experimentos de dosis-respuesta donde la [PBAVE] fue constante, se añadieron diferentes cantidades de ARNip. A continuación se incubó la mezcla durante 16 h. A la solución se añadieron a continuación 5.6 mg de Hepes en forma de base libre seguido por una mezcla de 3.7 mg de CDM-NAG y 1.9mg de CDM-PEG. A continuación se incubó la solución durante al menos 1 h a temperatura ambiente antes de la inyección. Se sintetizaron CDM-PEG y CDM-NAG a partir del cloruro de ácido generado utilizando cloruro de oxalilo. Al cloruro de ácido se añadieron 1.1 equivalentes molares de éter polietilenglicol monometílico (peso molecular promedio de 450) para generar CDM-PEG o de (aminoetoxi)etoxi-2-(acetilamino)-2-desoxi-p-D-glucopiranósido para generar CDM-NAG. El producto final se purificó utilizando HPLC de fase inversa con un gradiente de agua/acetonitrilo con un 0.1% de TFA. Se suministraron de aproximadamente 25 a 50 pg de ARNip a los ratones. El sistema de Rozema et al. se podrá aplicar al sistema CRISPR Cas para el suministro al hígado, por ejemplo, pensando en una dosificación de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 mg de CRISPR Cas para el suministro a un ser humano.
Hueso
Oakes y Lieberman (Clin Orthop Relat Res. octubre de 2000;(379 Supl):S101-12) analizan el suministro de genes al hueso. Transfiriendo genes a las células en un sitio anatómico específico, se pueden utilizar las propiedades osteoinductivas de los factores de crecimiento con dosis fisiológicas durante un periodo prolongado para facilitar una respuesta curativa más significativa. El sitio anatómico específico, la calidad del hueso y la envoltura del tejido blando, influencian la selección de las células diana para la terapia génica regional. Los vectores para la terapia génica suministrados en un sitio de tratamiento en portadores osteoconductores han generado resultados prometedores. Varios investigadores han mostrado resultados atractivos utilizando la terapia génica regional ex vivo e in vivo en modelos en animales. Un sistema de este tipo se podrá utilizar y/o adaptar al sistema CRISPR Cas para el suministro al hueso.
Cerebro
Las opciones de suministro al cerebro incluyen la encapsulación de la enzima CRISPR y el ARN guía en forma de ADN o ARN en liposomas y la conjugación a caballos de Troya moleculares para el suministro a través de la barrera hematoencefálica (BHE). Los caballos de Troya moleculares han demostrado ser eficaces para el suministro de vectores de expresión B-gal el cerebro de primates no humanos. Se puede utilizar la misma estrategia para vectores de suministro que contengan la enzima CRISPR y el ARN guía. Por ejemplo, Xia CF y Boado RJ, Pardridge WM ("Antibody-mediated targeting of siRNA via the human insulin receptor using avidin-biotin technology." Mol Pharm. mayo-junio de 2009; 6(3):747-51. doi: 10.1021/mp800194) describen cómo es posible el suministro de ARN interferente pequeño (ARNip) a las células en cultivo, e in vivo, con el uso combinado de un anticuerpo monoclonal (mAb) específico del receptor y la tecnología de avidina-biotina. Los autores también han publicado que debido a que el enlace entre el mAb de direccionamiento y el ARNip es estable con la tecnología de avidina-biotina, y los efectos de la iARN en sitios distantes tales como el cerebro se observan in vivo tras la administración intravenosa del ARNip dirigido.
Zhang et al. (Mol Ther. enero de 2003; 7(1 ):11 -8.)) describen cómo se encapsularon plásmidos de expresión que codifican indicadores, tales como la luciferasa, en el interior de un "virus artificial" que comprende un inmunoliposoma pegilado de 85 nm, que se direccionó al cerebro del mono rhesus in vivo con un anticuerpo monoclonal (MAb) contra el receptor de la insulina humana (HIR, por sus siglas en inglés). El HIRMAb hace posible que el liposoma que porta el gen exógeno experimente transcitosis a través de la barrera hematoencefálica y endocitosis a través de la membrana plasmática neuronal tras la inyección intravenosa. El nivel de la expresión del gen de la luciferasa en el cerebro fue 50 veces más elevada en el mono rhesus en comparación con la rata. La expresión neuronal extendida del gen de la beta-galactosidasa en el cerebro de primates se demostró tanto mediante microscopía confocal como técnicas histoquímicas. Los autores indican que esta estrategia hace viable llevar a cabo una modificación reversible de tipo transgénico en adultos en 24 horas. En consecuencia, se prefiere el uso de inmunoliposomas. Se podrán utilizar conjuntamente con anticuerpos que se dirijan a proteínas de la superficie celular o tejidos específicos.
También se prefieren otros medios de suministro de ARN tales como mediante nanopartículas (Cho, S., Goldberg, M., Son, S., Xu, Q., Yang, F., Mei, Y., Bogatyrev, S., Langer, R. y Anderson, D., Lipid-like nanoparticles for small interfering RNA delivery to endothelial cells, Advanced Functional Materials, 19: 3112-3118, 2010) o exosomas (Schroeder, A., Levins, C., Cortez, C., Langer, R. y Anderson, D., Lipid-based nanotherapeutics for siRNA delivery, Journal of Internal Medicine, 267: 9-21,2010, Pm ID: 20059641).
Ciertamente, se ha demostrado que los exosomas son particularmente útiles en el suministro de ARNip, un sistema con ciertos paralelismos con el sistema CRISPR. Por ejemplo, El-Andaloussi S, et al. (“Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo.” Nat Protoc. diciembre de 2012;7(12):2112-26. doi: 10.1038/nprot.2012.131. Epub 15 de noviembre de 2012) describen cómo los exosomas son herramientas prometedoras para el suministro de fármacos a través de diferentes barreras biológicas y se pueden aprovechar para el suministro de ARNip in vitro e in vivo. Su estrategia consiste en generar exosomas dirigidos mediante la transfección con un vector de expresión que comprende una proteína exosómica fusionada con un ligando peptídico. A continuación se purifican los exosomas y se caracterizan a partir del sobrenadante de las células transfectadas, a continuación se carga el ARNip en los exosomas. El suministro o administración se puede realizar con exosomas en particular, sin carácter limitante, al cerebro.
La vitamina E (a-tocoferol) se podrá conjugar con CRISPR Cas y ser suministrado al cerebro junto con una lipoproteína de alta densidad (HDL), por ejemplo, de manera similar a como han hecho Uno et al., (HUMAN GENE THERAPY 22:711-719 (junio de 2011)) para suministrar ARN interferente pequeño (ARNip) al cerebro. Se administró una infusión a ratones mediante minibombas osmóticas (modelo 1007D; Alzet, Cupertino, CA) rellenada con solución salina tamponada con fosfato (PBS) o TocBACEip libre o Toc-BACEip/HDL y se conectó con el kit 3 de infusión cerebral (Alzet). Se colocó una cánula de infusión al cerebro aproximadamente 0.5 mm detrás de la bregma en la línea central para la infusión al tercer ventrículo dorsal. Uno et al. observaron que tan solo 3 nmol de Toc-ARNip con HDL pueden inducir una reducción objetivo de un grado comparable mediante el mismo método de infusión ICV. Se podrá contemplar una dosis similar de CRISPR Cas conjugado con a-tocoferol y administrada conjuntamente con HDL dirigida al cerebro para los seres humanos en la presente invención, por ejemplo, se podrán contemplar de aproximadamente 3 nmol a aproximadamente 3 pmol de CRISPR Cas dirigido al cerebro.
Zou et al. ((HUMAN GENE THERAPY22:465-475 (abril de 2011)) describen un método de suministro mediado por lentivirus de ARN de horquilla corta que tiene como diana PKCy para el silenciamiento génico in vivo en la médula espinal de ratas. Zou et al. administraron aproximadamente 10 pL de un lentivirus recombinante que tenía un título de 1 x 109 unidades de transducción (UT)/mL mediante un catéter intratecal. Se podrá contemplar una dosificación similar de CRISPR Cas expresado en un vector lentivírico dirigido al cerebro para los seres humanos en la presente invención, por ejemplo, se podrán contemplar aproximadamente 10-50 mL de CRISPR Cas dirigido al cerebro en un lentivirus que tiene un título de 1 x 109 unidades de transducción (UT)/mL.
Deleción dirigida, aplicaciones terapéuticas
Se prefiere la deleción dirigida de genes. Los ejemplos están ejemplificados en el Ejemplo 18. Por lo tanto, se prefieren genes que participan en la biosíntesis de colesterol, biosíntesis de ácidos grasos y otros trastornos metabólicos, genes que codifican proteínas plegadas erróneamente que participan en enfermedades amiloideas y de otro tipo, oncogenes que impulsan la transformación celular, genes víricos latentes y genes que conllevan trastornos negativos dominantes, entre otros trastornos. Tal y como se ejemplifica en la presente, los solicitantes prefieren el suministro génico de un sistema CRISPR-Cas al tejido hepático, cerebral, ocular, epitelial, hematopoyético o de otro tipo de un sujeto o paciente que lo necesite, que padezca trastornos metabólicos, amiloidosis y enfermedades relacionadas con la agregación proteica, transformación celular consecuencia de mutaciones y traslocaciones genéticas, efectos negativos dominantes de mutaciones génicas, infecciones víricas latentes y otros síntomas relacionados que utilizan un sistema de suministro vírico o con nanopartículas.
Las aplicaciones terapéuticas del sistema CRISPR-Cas incluyen el glaucoma, amiloidosis y la enfermedad de Huntington. Estas se ejemplifican en el Ejemplo 20 y se prefieren las características descritas en él solas o combinadas.
Otro ejemplo de una enfermedad de expansión de poliglutamina que se podrá tratar mediante la presente invención incluye la ataxia espinocerebelosa de tipo 1 (SCA1). Tras la inyección intracerebelosa, los vectores derivados del virus adenoasociado (AAV) recombinantes que expresan ARN de horquilla corta mejoraron enormemente la coordinación motora, restauraron la morfología cerebelosa y se resolvieron las características inclusiones de ataxina-1 en las células Purkinje de ratones SCA1 (remítase a, p. ej., Xia et al., Nature Medicine, vol 10, N.° 8, agosto de 2004). En particular, se prefieren los vectores AAV1 y AAV5 y son deseables títulos de AAV de aproximadamente 1 x 1012 genomas de vector/mL.
Como un ejemplo, se podrá tratar o prevenir la infección crónica por VIH-1. Con el fin de lograr esto, se podrán generar ARN guía para CRISPR-Cas que tengan como diana la inmensa mayoría del genoma del VIH-1 a la vez que se tienen en cuenta variantes de la cepa del VIH-1 para conseguir una eficacia y alcance máximos. Se podrá lograr el suministro del sistema CRISPR-Cas mediante la infección convencional mediada por adenovirus o lentivirus del sistema inmunitario de hospedador. Dependiendo de la estrategia, las células inmunitarias del hospedador se podrían a) aislar, transducir con CRISPR-Cas, seleccionar y reintroducir en el hospedador o b) transducir in vivo mediante el suministro sistémico del sistema CRISPR-Cas. La primera estrategia permite la generación de una población inmunitaria resistente mientras que la segunda es más probable que actúe sobre reservas víricas latentes dentro del hospedador. Esto se discute más detalladamente en la sección de Ejemplos.
En otro ejemplo, la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20130171732 adjudicada a Sangamo BioSciences, Inc. se refiere a la inserción de un transgén anti-VIH en el genoma, cuyos métodos se podrán aplicar al sistema CRISPR Cas. En otra realización, la diana podrá ser el gen CXCR4 y el sistema TALE de la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20100291048 adjudicada a Sangamo BioSciences, Inc. se podrá modificar para el sistema CRISPR Cas. El método de las patentes de los EE. UU. con N.os de publicación 20130137104 y 20130122591 adjudicadas a Sangamo BioSciences, Inc. y la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20100146651 adjudicada a Cellectis podrá ser aplicable de manera más general a la expresión del transgén ya que conlleva modificar un locus de la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HPRT, por sus siglas en inglés) para incrementar la frecuencia de la modificación génica.
También se contempla que la presente invención genere una colección de células con una inactivación génica. Cada célula podrá tener un único gen inactivado. Esto se ejemplifica en el Ejemplo 23.
Se podrá generar una colección de células ES donde cada célula tenga un único gen inactivado y la totalidad de la colección de células ES tendrá cada gen individual inactivado. Esta colección es útil para el cribado de la función génica en procesos celulares así como también en enfermedades. Para generar esta colección celular, se podrán integrar Cas9 impulsada por un promotor inducible (p. ej., promotor inducible por doxiciclina) en el interior de la célula ES. Además, se podrá integrar un único ARN guía cuya diana sea un gen específico de la célula ES. Para generar la colección de células ES, se podrán simplemente mezclar las células ES con una colección de genes que codifiquen ARN guía que tengan como diana cada gen del genoma humano. Se podrá introducir en primer lugar un único sitio BxB1 attB en el locus AAVS1 de la célula ES humana. A continuación se podrá utilizar la integrasa de BxB1 para facilitar la integración de los genes de ARN guía individuales en el sitio BxB1 attB en el locus AAVS1. Para facilitar la integración, cada gen de ARN guía podrá estar contenido en un plásmido que porte un único sitio attP. De esta manera, BxB1 recombinará el sitio attB en el genoma con el sitio attP en el plásmido que contiene el ARN guía. Para generar la colección celular, se podrá tomar la colección de células que tienen ARN guía únicos integrados e inducir la expresión de Cas9. Tras la inducción, Cas9 media la ruptura bicatenaria en los sitios especificados por el ARN guía.
La administración crónica de tratamientos proteicos podrá suscitar respuestas del sistema inmunitario inaceptables frente a la proteína específica. La inmunogenicidad de los fármacos proteicos se puede asociar con unos pocos epítopos de los linfocitos T cooperadores (HTL, por sus siglas en inglés) inmunodominantes. La reducción de la afinidad de unión al MHC de estos epítopos de HTL contenidos en estas proteínas puede generar fármacos con una inmunogenicidad menor (Tangris S, et al. (“Rationally engineered therapeutic proteins with reduced immunogenicity” J Immunol. 15 de marzo de 2005;174(6):3187-96.) En la presente invención, la inmunogenicidad de la enzima CRISPR en particular se podrá reducir siguiendo la estrategia propuesta en primer lugar por Tangri et al. con respecto a la eritropoyetina y desarrollada posteriormente. En consecuencia, se podrá utilizar la evolución dirigida o el diseño racional para reducir la inmunogenicidad de la enzima CRISPR (por ejemplo, una Cas9) en las especies hospedadoras (especie humana o de otro tipo).
En el Ejemplo 28, los solicitantes utilizaron 3 ARN guía de interés y únicamente fueron capaces de observar que tenía lugar una escisión del ADN eficaz in vivo en un pequeño subconjunto de células. Esencialmente, lo que los solicitantes muestran aquí es una escisión in vivo dirigida. En particular, esto proporciona una demostración preliminar de que también se puede lograr un direccionamiento específico en organismos superiores tales como mamíferos. Esto también resalta el aspecto múltiple según el cual se pueden utilizar múltiples secuencias guía (es decir, dianas separadas) simultáneamente (en el sentido de suministro conjunto). En otras palabras, los solicitantes utilizaron una estrategia múltiple, donde se escogen como diana diferentes secuencias a la vez, pero independientemente.
Un ejemplo adecuado de un protocolo para producir AAV, un vector preferido de la invención, se proporciona en el Ejemplo 34.
Los trastornos de repeticiones de trinucleótidos con las condiciones preferidas que se pueden tratar. También se ejemplifican en la presente.
Por ejemplo, la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20110016540, describe la utilización de nucleasas con dedos de zinc para modificar genéticamente células, animales y proteínas asociados con trastornos por expansión de repeticiones de trinucleótidos. Los trastornos por expansión de repeticiones de trinucleótidos son trastornos complejos y progresivos que comprometen el desarrollo neurobiológico y a menudo afectan a las funciones cognitivas así como también a las sensitivomotoras.
Las proteínas relacionadas con la expansión de repeticiones de trinucleótidos son un conjunto diverso de proteínas asociadas con la susceptibilidad de desarrollar un trastorno por expansión de repeticiones de trinucleótidos, la presencia de un trastorno por expansión de repeticiones de trinucleótidos, la gravedad de un trastorno por expansión de repeticiones de trinucleótidos o cualquier combinación de estos. Los trastornos por expansión de repeticiones de trinucleótidos se dividen en dos categorías determinadas por el tipo de repetición. La repetición más común es el triplete CAG el cual, cuando está presente en la región codificante de un gen, codifica el aminoácido glutamina (Q). Por lo tanto, estos trastornos se denominan trastornos poliglutamina (poliQ) y comprenden las siguientes enfermedades: enfermedad de Huntington (HD); atrofia muscular espinobulbar (SBMA); ataxias espinocerebelosas (SCA de los tipos 1, 2, 3, 6, 7 y 17); y atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana (DRPLA). El resto de los trastornos por expansión de repeticiones de trinucleótidos no implican al triplete CAG o el triplete CAG no está en la región codificante del gen y, por lo tanto, se denominan trastornos no poliglutamina. Los trastornos no poliglutamina comprenden el síndrome del cromosoma X frágil (FRAXA); retraso mental XE frágil (FRAXE); ataxia de Friedreich (FRDA), distrofia miotónica (DM); y ataxias espinocerebelosa (SCA de los tipos 8 y 12).
Las proteínas asociadas con los trastornos por expansión de repeticiones de trinucleótidos se seleccionan normalmente basándose en una asociación experimental de la proteína asociada con un trastorno por expansión de repeticiones de trinucleótidos con un trastorno por expansión de repeticiones de trinucleótidos. Por ejemplo, la velocidad de producción o la concentración de circulación de una proteína asociada con un trastorno por expansión de repetición de trinucleótidos podrá estar elevada o disminuida en una población que padece un trastorno por expansión de repeticiones de trinucleótidos respecto a una población que no padece el trastorno por expansión de repeticiones de trinucleótidos. Se podrán evaluar las diferencias en los niveles de proteína utilizando técnicas proteómicas que incluyen, sin carácter limitante, la inmunoelectrotransferencia, tinción inmunohistoquímica, ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) y espectrometría de masas. Como alternativa, se podrán identificar las proteínas asociadas con trastornos por expansión de repeticiones de trinucleótidos obteniendo los perfiles de expresión génica de los genes que codifican las proteínas utilizando técnicas genómicas que incluyen, sin carácter limitante, análisis por micromatriz de ADN, análisis en serie de la expresión génica (SAGE) y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (Q-PCR).
Los ejemplos no limitantes de proteínas asociadas con trastornos por expansión de repeticiones de trinucleótidos incluyen el AR (receptor androgénico), FMR1 (retraso mental 1 asociado al cromosoma X frágil), HTT (huntingtina), DMPK (proteína cinasa de la distrofia miotónica), FXN (frataxina), ATXN2 (ataxina 2), ATN1 (atrofina 1), FEN1 (endonucleasa específica 1 de la estructura de tipo solapa), TNRC6A (6A que contiene repeticiones de trinucleótidos), PABPN1 (proteína nuclear 1 de unión a poli (A)), JPH3 (junctofilina 3), MED15 (subunidad 15 del complejo mediador), ATXN1 (ataxina 1), ATXN3 (ataxina 3), TBP (proteína de unión a la caja TATA), CACNA1A (subunidad alfa 1A, tipo P/Q del canal de calcio dependiente de voltaje), ATXN80S (hebra opuesta a ATXN8 (no codifica proteína)), PPP2R2B (subunidad reguladora B, beta, de la proteína fosfatasa 2), ATXN7 (ataxina 7), TNRC6B (6B que contiene repeticiones de trinucleótidos), TNRC6C (6C que contiene repeticiones de trinucleótidos), CELF3 (miembro 3 de la familia de tipo Elav, CUGBP), MAB21L1 (mab-21-tipo 1 (C. elegans)), MSH2 (homólogo 2 de mutS, cáncer de colon, tipo 1 no poliposis (E. colí)), TMEM185A (proteína transmembrana 185A), SIX5 (homeosecuencia 5 de SIX), CNPY3 (homólogo 3 de canopy (pez cebra)), FRAXE (sitio frágil, tipo ácido fólico, raro, fra(X)(q28) E), GNB2 (proteína (proteína G) de unión al nucleótido guanine, beta polipéptido 2), RPL14 (proteína ribosomal L14), ATXN8 (ataxina 8), INSR (receptor de la insulina), TTR (transtiretina), EP400 (proteína p400 de unión a E1A), GIGYF2 (proteína 2 GYF de interacción con GRB10), OGG1 (ADN-glicosilasa de la 8-oxoguanina), STC1 (estaniocalcina 1), CNDP1 (dipeptidasa 1 de la carnosina (familia M20 de metalopeptidasas)), C10orf2 (marco de lectura abierto 2 del cromosoma 10), MAML3 tipo mastermind 3 (Drosophila), DKC1 (disquerina, disqueratosis congénita 1), PAXIP1 (proteína 1 (con un dominio de activación de la transcripción) que interacciona con PAX), CASK (cinasa de la serinproteína dependiente de calcio/calmodulina (familia MAGUK)), MAPT (proteína tau asociada a microtúbulos), SP1 (factor de transcripción Sp1), POLG (polimerasa (dirigida por ADN), gamma), AFF2 (familia AF4/FMR2, miembro 2), THBS1 (trombospondina 1), TP53 (proteína tumoral p53), ESR1 (receptor de estrógeno 1), CGGBP1 (proteína 1 de unión a repeticiones del triplete CGG), ABT1 (activador de la transcripción basal 1), KLK3 (peptidasa 3 relacionada con la kalikreína), PRNP (proteína priónica), JUN (oncogen jun), KCNN3 (miembro 3, subfamilia N, canal pequeño/intermedio de potasio activado por conductancia de calcio), BAX (proteína X asociada a BCL2), FRAXA (sitio frágil, tipo ácido fólico, raro, fra(X)(q27.3) A (macroorquidismo, retraso mental)), KBTBD10 (10 que contiene el dominio BTB (POZ) y repetición kelch), MBNL1 (tipo muscleblind (Drosophila)), RAD51 (homólogo de RAD51 (homólogo de RecA, E. coli) (S. cerevisiae)), NCOA3 (coactivador 3 del receptor nuclear), ERDA1 (dominio de repetición expandida, CAG/CTG 1), TSC1 (esclerosis tuberosa 1), COMP (proteína matricial oligomérica del cartílago), GCLC (glutamato-cisteína-ligasa, subunidad catalítica), RRAD (relacionada con Ras asociada con la diabetes), MSH3 (homólogo 3 de mutS (E. coli)), DRD2 (receptor de dopamina D2), CD44 (molécula CD44 (grupo sanguíneo de la India)), CTCF (factor de unión a CCCTC (proteína con dedos de zinc)), CCND1 (ciclina D1), CLSPN (homólogo de claspina (Xenopus laevis)), MEF2A (factor 2A potenciador de miocitos), PTPRU (proteína tirosina-fosfatasa, tipo de receptor, U), GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa), TRIM22 (22 que contiene el motivo tripartito), WT1 (tumor de Wilms 1), a Hr (receptor de arilhidrocarburo), GPX1 (glutatiónperoxidasa 1), TPMT (tiopurina S-metiltransferasa), NDP (enfermedad de Norrie (pseudoglioma)), ARX (homeosecuencia vinculada con un estado sin “arista”), MUS81 (homólogo de endonucleasas MUS81 (S. cerevisiae)), TYR (tirosinasa (albinismo oculocutáneo IA)), EGR1 (respuesta de crecimiento temprano 1), UNG (uracil-ADN-glicosilasa), NUMBL (de tipo homólogo de numb (Drosophila)), FABP2 (proteína de unión a ácidos grasos 2, intestinal), EN2 (homeosecuencia engrailed 2), CRYGC (cristalina, gamma C), SRP14 (partícula de 14 kDa de reconocimiento de la señal (proteína de unión a ARN homólogo Alu)), CRYGB (cristalina, gamma B), PDCD1 (muerte celular programada 1), HOXA1 (homeosecuencia A1), ATXN2L (tipo ataxina 2), PMS2 (de incremento 2 de la segregación posmeiótica PMS2 (S. cerevisiae)), GLA (galactosidasa, alfa), CBL (secuencia transformante retrovírica ecotrópica Cas-Br-M (murina)), FTH1 (ferritina, polipéptido pesado 1), IL12RB2 (receptor de interleucina 12, beta 2), OTX2 (homeosecuencia 2 de orthodenticle),HOXA5 (homeosecuencia A5), POLG2 (polimerasa (dirigida por ADN), gamma 2, subunidad accesoria), DLX2 (homeosecuencia distal-less 2), SIRPA (proteína alfa de la regulación de señal), OTX1 (homeosecuencia orthodenticle 1), AHRR (represor del receptor de arilhidrocarburos), MANF (factor neurotrófico derivado de astrocitos mesencefálicos), TMEM158 (proteína transmembrana 158 (gen/pseudogen)) y ENSG00000078687.
Las proteínas preferidas asociadas con los trastornos por expansión de repeticiones de trinucleótidos incluyen las HTT (Huntingtina), AR (receptor androgénico), FXN (frataxina), Atxn3 (ataxina), Atxn1 (ataxina), Atxn2 (ataxina), Atxn7 (ataxina), Atxn10 (ataxina), DMPK (proteína cinasa de la distrofia miotónica), Atn1 (atrofina 1), CBP (proteína de unión a CREB), VLDLR (receptor de lipoproteínas de muy baja densidad) y combinaciones de estos.
De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un método de terapia génica para el tratamiento de un sujeto que tiene una mutación en el gen CFTR y comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una partícula para terapia génica de CRISPR-Cas, opcionalmente mediante un portador farmacéutico biocompatible, a las células de un sujeto. Preferentemente, el ADN diana comprende la mutación deltaF508. En general, se prefiere que la mutación se repare para volver al estado no modificado. En este caso, la mutación es una deleción de tres nucleótidos que comprende el codón para fenilalanina (F) en la posición 508. En consecuencia, la reparación en este caso requiere la reintroducción del codón ausente en el mutante.
Para implementar esta estrategia de reparación génica, se prefiere que se introduzca un sistema vectorial derivado de adenovirus/AAV en el paciente, células o célula hospedadora. Preferentemente, el sistema comprende una Cas9 (o nickasa Cas9) y el ARN guía junto con un sistema vectorial derivado de adenovirus/AAV que comprende el molde de reparación por homología que contiene el residuo F508. Este se podrá introducir en el sujeto mediante uno de los métodos de suministro discutidos anteriormente. El sistema CRISPR-Cas podrá estar guiado por el ARN guía quimérico CFTRdelta 508. Su diana es un sitio específico del locus genómico CFTR que va a ser escindido o en el que se va a practicar un corte monocatenario. Después de la escisión, se inserta el molde de reparación en el sitio de escisión mediante recombinación homóloga y se corrige la deleción que da como resultado la fibrosis quística o causa síntomas relacionados con la fibrosis quística. Esta estrategia para dirigir el suministro y proporcionar una introducción sistémica de los sistemas CRISPR con los ARN guía apropiados se puede emplear para actuar sobre mutaciones genéticas para editar o manipular de otra manera genes que causan enfermedades y trastornos metabólicos, hepáticos, renales y proteicos tales como aquellos de la Tabla B.
Edición genómica
Los sistemas CRISPR/Cas9 de la presente invención se pueden utilizar para corregir mutaciones genéticas que se intentaron tratar previamente utilizando TALEN y ZFN con éxito limitado. Por ejemplo, WO2013163628 A2, Genetic Correction of Mutated Genes, solicitud publicada de la Universidad de Duke describe los esfuerzos por corregir, por ejemplo, una mutación con desplazamiento del marco de lectura que provoca un codón de parada prematura y un producto génico truncado que se puede corregir mediante la unión de extremos no homólogos mediada por nucleasas tal como las responsables de la distrofia muscular de Duchenne ("DMD") un trastorno ligado al cromosoma X recesivo y letal que da como resultado degeneración muscular debida a mutaciones en el gen de la distrofina. La mayoría de las mutaciones en la distrofina que causan DMD son deleciones de exones que alteran el marco de lectura y causan una terminación de la traducción prematura en el gen de la distrofina. La distrofina es una proteína citoplasmática que proporciona estabilidad estructural al complejo distroglicano de la membrana celular que es responsable de regular la función e integridad de las células musculares. El gen de la distrofina o "gen DMD", utilizado indistintamente en la presente, tiene 2.2 megabases en el locus Xp21. La transcripción primaria mide aproximadamente 2400 kb teniendo el ARNm maduro aproximadamente 14 kb. 79 exones codifican la proteína que tiene más de 3500 aminoácidos. El exón 51 está frecuentemente adyacente a la deleción que altera el marco de lectura en pacientes con DMD y ha sido la diana de los ensayos clínicos para omitir exones basada en los oligonucleótidos. Un ensayo clínico con el compuesto eteplirsen que omite el exón 51 presentó recientemente un beneficio funcional significativo a lo largo de 48 semanas, con un promedio de un 47% de fibras positivas para la distrofina en comparación con los valores iniciales. Las mutaciones en el exón 51 son especialmente adecuadas para la corrección permanente por edición genómica mediante NHEJ.
Los métodos de la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20130145487 adjudicada a Cellectis, que se refiere a variantes de meganucleasa para escindir una secuencia diana del gen de la distrofina humana (DMD), también se podrán modificar para el sistema CRISPR Cas.
Sangre
La presente divulgación también contempla el suministro del sistema CRISPR-Cas a la sangre.
Los exosomas plasmáticos de Wahlgren et al. (Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, N.° 17 e130) se han descrito previamente y podrán ser utilizados para suministrar el sistema CRISPR Cas a la sangre.
También se contempla el sistema CRISPR Cas para tratar hemoglobinopatías tales como talasemias y la anemia drepanocítica. Remítase a, p. ej., la patente internacional con N.° de publicación WO 2013/126794 para determinar dianas potenciales a las que se puede dirigir el sistema CRISPR Cas.
Las patentes de los EE. UU. con N os de publicación 20110225664, 20110091441, 20100229252, 20090271881 y 20090222937 adjudicadas a Cellectis, se refieren a variantes de CREI, donde al menos uno de los dos monómeros de I-CreI tiene al menos dos sustituciones, una en cada uno de los dos subdominios funcionales del dominio nuclear LAGLIDADG que se sitúan respectivamente en las posiciones 26-40 y 44-77 respecto a I-CreI, siendo dicha variante capaz de escindir una secuencia diana de ADN del gen de la cadena gamma del receptor de la interleucina-2 humana (IL2RG) también denominado gen de la cadena gamma del receptor común de citocinas o gen C gamma. Las secuencias diana identificadas en las patentes de los EE. UU. con N.os de publicación 20110225664, 20110091441,20100229252, 20090271881 y 20090222937 se podrán utilizar para el sistema CRISPR Cas.
La deficiencia inmunitaria combinada grave (SCID, por sus siglas en inglés) es el resultado de un defecto en la maduración de los linfocitos T, asociada siempre con un defecto funcional en los linfocitos B (Cavazzana-Calvo et al., Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585-602; Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109). Se estima que la incidencia global es de 1 entre 75 000 nacimientos. Los pacientes con SCID no tratada están sujetos a múltiples infecciones por microorganismos oportunistas y, en general, no viven más de un año. La SCID se puede tratar mediante transferencia de células madre hematopoyéticas alógenas, procedentes de un donante de la familia. La histocompatibilidad con el donante puede variar enormemente. En el caso de la deficiencia de la adenosinadesaminasa (ADA), una de las formas de SCID, los pacientes pueden ser tratados mediante inyección de la enzima adenosina-desaminasa recombinante.
Desde que se ha demostrado que el gen de ADA está mutado en los pacientes con SCID (Giblett et al., Lancet, 1972, 2, 1067-1069), se han identificado varios genes diferentes en la SCID (Cavazzana-Calvo et al., Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585-602; Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109). Existen cuatro causas principales para la SCID: (i) la forma más frecuente de SCID, SCID-X1 (SCID ligada al cromosoma X o X-SCID), está causada por una mutación en el gen de IL2RG, y da como resultado la ausencia de linfocitos T maduros y linfocitos citolíticos naturales. IL2RG codifica la proteína C gamma (Noguchi, et al., Cell, 1993, 73, 147-157), un componente común de al menos cinco complejos receptores interleucínicos. Estos receptores activan varias dianas mediante la cinasa JAK3 (Macchi et al., Nature, 1995, 377, 65-68), cuya inactivación da como resultado el mismo síndrome que la inactivación de la C gamma; (ii) la mutación en el gen de ADA da como resultado un defecto en el metabolismo de las purinas que es letal para los precursores de linfocitos, que a su vez da como resultado la ausencia casi total de linfocitos B, T y linfocitos citolíticos naturales; (iii) la recombinación V(D)J es un paso esencial en la maduración de los receptores de linfocitos T (TCR) e inmunoglobulinas. Las mutaciones en los genes 1 y 2 activadores de la recombinación (RAG1 y RAG2) y Artemis, tres genes que participan en este proceso, da como resultado la ausencia de linfocitos T y B maduros; y (iv) las mutaciones en otros genes tales como CD45, que participa en la señalización específica de linfocitos T, también se han descrito, aunque representan una minoría de casos (Cavazzana-Calvo et al., Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585-602; Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109).
Desde que se han identificado sus bases genéticas, las diferentes formas de SCID se han convertido en un modelo para las estrategias de terapia génica (Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109) por dos razones importantes. La primera, como en todas las enfermedades sanguíneas, se puede pensar en un tratamiento ex vivo.
Se pueden extraer células madre hematopoyéticas (HSC, por sus siglas en inglés) de la médula ósea y mantener sus propiedades pluripotentes durante unas pocas divisiones celulares. Por lo tanto, se pueden tratar in vitro, y se pueden volver a inyectar al paciente, donde repueblan la médula ósea. La segunda es que ya que la maduración de los linfocitos está alterada en los pacientes con SCID, las células corregidas tienen una ventaja selectiva. Por lo tanto, un número pequeño de células corregidas puede devolver un sistema inmunitario funcional. Esta hipótesis ha sido validada varias veces mediante (i) la restauración parcial de las funciones inmunitarias asociadas con la anulación de las mutaciones en pacientes con SCID (Hirschhorn et al., Nat. Genet., 1996, 13, 290-295; Stephan et al., N. Engl. J. Med., 1996, 335, 1563-1567; Bousso et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 274-278; Wada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98, 8697-8702; Nishikomori et al, Biood, 2004, 103, 4565-4572), (ii) la corrección de deficiencias de SCID-X1 in vitro en las células hematopoyéticas (Candotti et al, Blood, 1996, 87, 3097­ 3102; Cavazzana-Calvo et al, Blood, 1996, Blood, 88, 3901-3909; Taylor et al., Blood, 1996, 87, 3103-3107; Hacein-Bey et al., Blood, 1998, 92, 4090-4097), (iii) la corrección de SCID-X1 (Soudais et al., Blood, 2000, 95, 3071-3077; Tsai et al., Blood, 2002, 100, 72-79), JAK-3 (Bunting et al., Nat. Med., 1998, 4, 58-64; Bunting et al., Hum. Gene Ther., 2000, 11, 2353-2364) y deficiencias de RAG2 (Yates et al, Blood, 2002, 100, 3942-3949) in vivo en modelos en animales y (iv) mediante el resultado de ensayos clínicos de terapia génica (Cavazzana-Calvo et al., Science, 2000, 288, 669-672; Aiuti et al, Nat. Med, 2002; 8, 423-425; Gaspar et al, Lancet, 2004, 364, 2181-2187).
La patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20110182867 adjudicada a Children’s Medical Center Corporation y al President and Fellows of Harvard College se refiere a métodos y usos para modular la expresión de hemoglobina fetal (HbF) en células progenitoras hematopoyéticas mediante inhibidores de la expresión o actividad de BCL11A, tales como iARN y anticuerpos. Las dianas divulgadas en la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20110182867, tal como BCL11A, podrán ser las dianas del sistema CRISPR Cas para modular la expresión de hemoglobina fetal. Remítase también a Bauer et al. (Science 11 de octubre de 2013: Vol. 342 n.° 6155 págs. 253-257) y Xu et al. (Science 18 de noviembre de 2011: Vol. 334 n.° 6058 págs. 993-996) para dianas de tipo BCL11A adicionales.
Oídos
La presente divulgación también contempla el suministro del sistema CRISPR-Cas a uno o ambos oídos.
Los investigadores están estudiando si la terapia génica podría utilizarse como ayuda en los tratamientos para la sordera actuales - concretamente los implantes cocleares. La sordera está causada a menudo por la pérdida o el deterioro de las células ciliadas que no pueden transmitir señales a las neuronas auditivas. En tales casos, se podrán utilizar los implantes cocleares para que respondan al sonido y transmitan señales eléctricas a las células nerviosas. Pero estas neuronas a menudo se degeneran y se retraen de la cóclea ya que las células ciliadas dañadas liberan menos factores de crecimiento.
La solicitud de patente de los EE. UU. 20120328580 describe la inyección de una composición farmacéutica en el oído (p. ej., administración auricular), tal como en la luz de la cóclea (p. ej., la escala media, escala vestibular y escala timpánica), p. ej., utilizando una jeringa, p. ej., una jeringa de dosis única. Por ejemplo, se pueden administrar uno o más de los compuestos descritos en la presente mediante inyección intratimpánica (p. ej., en el oído medio) y/o inyecciones en el oído externo, medio y/o interno. Tales métodos se utilizan habitualmente en la técnica, por ejemplo, para la administración de esteroides y antibióticos a los oídos humanos. La inyección se puede realizar, por ejemplo, a través de la ventana redonda del oído o mediante la cápsula coclear. En la técnica se conocen otros métodos de administración al oído interno (remítase a, p. ej., Salt y Plontke, Drug Discovery Today, 10:1299-1306, 2005).
En otro modo de administración, se puede administrar la composición farmacéutica in situ o mediante un catéter o una bomba. Un catéter o una bomba pueden, por ejemplo, dirigir una composición farmacéutica al interior de la luz coclear o la ventana redonda del oído y/o la luz del colon. McKenna et al, (publicación de los EE. UU. con N.° 2006/0030837) y Jacobsen et al, (patente de los EE. UU. con N.° 7206639) describen métodos y aparato para el suministro de fármacos ilustrativos que son adecuados para suministrar uno o más compuestos descritos en la presente al oído, p. ej., un oído humano. En algunas realizaciones, se puede situar un catéter o una bomba, p. ej., en el oído (p. ej., el oído externo, medio y/o interno) de un paciente durante un procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se puede situar un catéter o una bomba, p. ej., en el oído (p. ej., el oído externo, medio y/o interno) de un paciente sin que sea necesario un procedimiento quirúrgico.
Como alternativa, o además de esto, se pueden administrar uno o más compuestos descritos en la presente combinados con un dispositivo mecánico tal como un implante coclear o una prótesis auditiva, que se coloca en el oído externo. Edge et al., (publicación de los EE. UU. con N.° 2007/0093878) describen un implante coclear ilustrativo que es adecuado para su uso en la presente invención.
En algunas realizaciones, los modos de administración descritos anteriormente podrán combinarse en cualquier orden y podrán ser simultáneos o estar separados.
Como alternativa, o además de esto, la presente invención se podrá administrar de acuerdo con cualquiera de los métodos aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos, por ejemplo, como se describe en CDER Data Standards Manual, número de versión 004 (que se puede consultar en fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htm). En general, los métodos de terapia celular descritos en la solicitud de patente de los EE. UU. 20120328580 se pueden utilizar para promover la diferenciación completa o parcial de una célula en un tipo celular maduro del oído interno o en una célula que tiende a esta (p. ej., una célula ciliada) in vitro. Las células generadas mediante este tipo de métodos se pueden trasplantar o implantar a continuación en un paciente que necesite un tratamiento de este tipo. Los métodos de cultivo celular requeridos para llevar a la práctica estos métodos, incluidos los métodos para identificar y seleccionar tipos celulares adecuados, métodos para promover la diferenciación parcial o completa de células seleccionadas, métodos para identificar tipos celulares parcial o completamente diferenciados y métodos para implantar células parcial o completamente diferenciadas se describen posteriormente.
Las células adecuadas para su uso en la presente invención incluyen, sin carácter limitante, células que son capaces de diferenciarse parcial o completamente en una célula madura del oído interno, p. ej., una célula ciliada (p. ej., una célula ciliada interna y/o externa), cuando se pone en contacto, p. ej., in vitro, con uno o más de los compuestos descritos en la presente. Las células ilustrativas que son capaces de diferenciarse en una célula ciliada incluyen, sin carácter limitante, células madre (p. ej., células madre del oído interno, células madre adultas, células madre obtenidas a partir de médula ósea, células madre embrionarias, células madre mesenquimatosas, células madre de la piel, células iPS y células madre obtenidas a partir de la grasa), células progenitoras (p. ej., células progenitoras del oído interno), células de soporte (p. ej., células de Deiters, células pilares, células falángicas internas, células tectales y células de Hensen) y/o células germinales. Li et al, (publicación de los EE. UU. con N.° 2005/0287127) y Li et al., (patente de los EE. UU. con N.° de serie 11/953797) describen el uso de células madre para el reemplazo de las células sensoriales del oído interno. Edge et al., PCT/US2007/084654, describen el uso de células madre obtenidas a partir de la médula ósea para el reemplazo de las células sensoriales del oído interno. Por ejemplo, Takahashi et al., Cell, volumen 131, número 5, páginas 861-872 (2007); Takahashi y Yamanaka, Cell 126, 663-76 (2006); Okita et al., Nature 448, 260-262 (2007); Yu, J. et al., Science 318(5858):1917-1920 (2007); Nakagawa et al, Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008); y Zaehres y Scholer, Cell 131 (5):834-835 (2007) describen células iPS.
Las células adecuadas de este tipo se pueden identificar analizando (p. ej., cualitativa o cuantitativamente) la presencia de uno o más genes específicos del tejido. Por ejemplo, se puede detectar la expresión génica detectando el producto proteico de uno o más genes específicos del tejido. Las técnicas de detección proteica conllevan la tinción de proteínas (p. ej., utilizando extractos celulares o células intactas) utilizando anticuerpos contra el antígeno apropiado. En este caso, el antígeno apropiado es el producto proteico de la expresión del gen específico del tejido. Aunque, en teoría, se puede marcar un primer anticuerpo (es decir, el anticuerpo que se une al antígeno) es más común (y mejora la visualización) utilizar un segundo anticuerpo dirigido contra el primero (p. ej., un anticuerpo anti-IgG). Este segundo anticuerpo está conjugado con fluorocromos, o enzimas apropiadas para reacciones colorimétricas, o perlitas de oro (para la microscopía electrónica) o con el sistema biotina-avidina, de modo que se pueda reconocer la ubicación del anticuerpo primario y, por lo tanto, del antígeno.
Las moléculas de CRISPR Cas se pueden suministrar al oído mediante aplicación directa de la composición farmacéutica al oído externo, con composiciones modificadas a partir de la solicitud de los EE. UU. publicada 20110142917. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se aplica al canal del oído. El suministro al oído también se puede denominar como suministro aural u ótico.
En algunas realizaciones, las moléculas de ARN se suministran en formulaciones de liposomas o lipofectina y similares y se pueden preparar mediante métodos muy conocidos por los expertos en la técnica. Tales métodos se describen, por ejemplo, en las patentes de los EE. UU. con N.os 5 593 972, 5 589 466 y 5 580 859, que se incorporan a la presente por referencia.
Se han desarrollado sistemas de suministro orientados específicamente al suministro potenciado y mejorado de ARNip al interior de células de mamífero (remítase a, por ejemplo, Shen et al. FEBS Let. 2003, 539:111-114; Xia et al., Nat. Biotech. 2002, 20:1006-1010; Reich et al., Mol. Vision. 2003, 9: 210-216; Sorensen et al., J. Mol. Biol. 2003, 327: 761-766; Lewis et al, Nat. Gen. 2002, 32: 107-108 y Simeoni et al., NAR 2003, 31, 11: 2717-2724) y se podrán aplicar a la presente invención. Recientemente se ha utilizado con éxito ARNip para la inhibición de la expresión génica en primates (remítase a, por ejemplo, Tolentino et al., Retina 24(4):660 que también se podrá aplicar a la presente invención.
Qi et al. divulgan métodos para una transfección eficaz de ARNip al oído interno a través de la ventana redonda intacta mediante una tecnología de suministro proteínico novedosa que se podrá aplicar al sistema CRISPR Cas (remítase a, p. ej., Qi et al., Gene Therapy (2013), 1-9). En particular, una TAT de unión a dominios de ARN bicatenario (TAT-DRBD), con la que se puede transfectar ARNip marcado con Cy3 en células del oído interno, incluidas las células ciliadas internas y externas, cresta ampular, mácula utricular y mácula sacular, mediante permeación en la ventana redonda intacta tuvo éxito para suministrar ARNip bicatenarios in vivo para tratar varias dolencias del oído interno y preservar la función auditiva. Se podrán contemplar aproximadamente 40 pL de ARN 10 mM como la dosificación para la administración al oído.
De acuerdo con Rejali et al. (Hear Res. junio de 2007;228(1 -2):180-7), se puede mejorar la función del implante coclear mediante una buena conservación de las neuronas del ganglio espiral que son la diana de la estimulación eléctrica del implante y se demostró previamente que el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, por sus siglas en inglés) potencia la supervivencia del ganglio espiral en oídos que se habían vuelto sordos experimentalmente. Rejali et al. probaron un diseño modificado del electrodo del implante coclear que incluye un recubrimiento de células de fibroblastos transducidos mediante un vector vírico con un inserto del gen de BDNF. Para lograr este tipo de transferencia génica ex vivo, Rejali et al. transdujeron fibroblastos de cobayas con un adenovirus con un inserto del casete del gen de BDNF y comprobaron que estas células secretaban BDNF, a continuación unieron las células secretoras de BDNF al electrodo del implante coclear mediante un gel de agarosa e implantaron el electrodo en la escala timpánica. Rejali et al. comprobaron que los electrodos que expresaban BDNF eran capaces de conservar significativamente más neuronas del ganglio espiral en la base de la cóclea 48 días después de la implantación cuando se comparó con electrodos de control y se demostró la viabilidad de combinar la terapia de implante coclear con transferencia génica ex vivo para potenciar la supervivencia de neuronas del ganglio espiral. Se podrá aplicar un sistema de este tipo al sistema CRISPR Cas para el suministro al oído.
Mukherjea et al. (Antioxidants & Redox Signaling, Volumen 13, Número 5, 2010) dejan constancia de que la atenuación génica de NOX3 utilizando ARN interferente pequeño (ip) anuló la ototoxicidad del cisplatino, como lo evidencia la protección de OHC frente al daño y la reducción en las variaciones en el umbral en las respuestas auditorias del tronco encefálico (ABR, por sus siglas en inglés). Se administraron diferentes dosis de NOX3ip (0.3, 0.6 y 0.9 pg) a ratas y se evaluó la expresión de NOX3 mediante RT-PCR en tiempo real. La dosis más baja de ARNip contra NOX3 utilizada (0.3 pg) no mostró ninguna inhibición del ARNm de NOX3 cuando se comparó con la administración transtimpánica de ARNip mezclado o en cócleas no tratadas. Sin embargo, la administración de la dosis más elevada de ARNip contra NOX3 (0.6 y 0.9 pg) redujeron la expresión de NOX3 en comparación con ARNip mezclado de control. Se podrá aplicar un sistema de este tipo al sistema CRISPR Cas para la administración transtimpánica con una dosificación de aproximadamente 2 mg a aproximadamente 4 mg de CRISPR Cas para la administración a un ser humano.
Jung et al. (Molecular Therapy, vol. 21 n.° 4, 834-841 abril de 2013) demostraron que niveles de Hes5 en el utrículo disminuían después de la aplicación de ARNip y que el número de células ciliadas en estos utrículos era significativamente mayor que tras el tratamiento de control. Los datos sugieren que la tecnología de ARNip podrá ser útil para inducir la reparación y regeneración en el oído interno y que la ruta de señalización de Notch es una diana potencialmente útil para una inhibición de la expresión génica específica. Jung et al. inyectaron 8 pg de ARNip contra Hes5 en un volumen de 2 pL, preparado añadiendo solución salina normal estéril a ARNip liofilizado, al epitelio vestibular del oído. Se podrá aplicar un sistema de este tipo al sistema CRISPR Cas para la administración al epitelio vestibular del oído con una dosificación de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mg de CRISPR Cas para la administración a un ser humano.
Ojos
La presente divulgación también contempla el suministro del sistema CRISPR-Cas a uno o ambos ojos.
En otro aspecto más de la invención, se podrá utilizar el sistema CRISPR-Cas para corregir defectos oculares que puedan surgir a partir de varias mutaciones genéticas descritas en más detalle en Genetic Diseases of the Eye, segunda edición, editado por Elias I. Traboulsi, Oxford University Press, 2012.
Para la administración al ojo, se prefieren especialmente los vectores lentivíricos, en particular los virus de la anemia infecciosa equina (EIAV, por sus siglas en inglés).
En otra realización, también se contemplan vectores lentivíricos que no son de primates mínimos basados en el virus de la anemia infecciosa equina (EIAV, por sus siglas en inglés), especialmente para la terapia génica ocular (remítase a, p. ej., Balagaan, J Gene Med 2006; 8: 275 - 285, publicado electrónicamente el 21 de noviembre de 2005 en Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002/jgm.845). Se contempla que los vectores tengan un promotor de citomegalovirus (CMV) que impulse la expresión del gen diana. Se contemplan las inyecciones intracamerales, subretinales, intraoculares e intravítreas (remítase a, p. ej., Balagaan, J Gene Med 2006; 8: 275 - 285, publicado electrónicamente el 21 de noviembre de 2005 en Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002/jgm.845). Las inyecciones intraoculares se podrán realizar con la ayuda de un microscopio quirúrgico. Para las inyecciones subretinal e intravítrea, los ojos se podrán prolapsar mediante una compresión digital leve y visualizar el fondo del ojo utilizando un sistema de lente de contacto constituido por una gota de una solución de medio de acoplamiento en la córnea cubierta con un cubreobjetos para microscopio de vidrio. Para las inyecciones subretinales, se podrá desplazar hacia adelante la punta de una aguja del calibre 34 de 10 mm, montada sobre una jeringa Hamilton de 5 pL, con visualización directa a través de la esclerótica ecuatorial superior tangencialmente hacia el polo posterior hasta que la apertura de la aguja sea visible en el espacio subretinal. A continuación, se podrán inyectar 2 pL de la suspensión con el vector para producir un desprendimiento de retina bulloso superior, y se confirma de esta manera la administración subretinal del vector. Esta estrategia crea una esclerotomía autosellante que permite retener la suspensión del vector en el espacio subretinal hasta que sea absorbida por el RPE, normalmente en las 48 h posteriores al procedimiento. Se podrá repetir este procedimiento en el hemisferio inferior para producir un desprendimiento de retina inferior. Esta técnica conlleva la exposición de aproximadamente un 70% de la retina neurosensorial y RPE a la suspensión del vector. Para las inyecciones intravítreas, se podrá desplazar hacia adelante la punta de la aguja a través de la esclerótica 1 mm detrás del limbo corneoescleral e inyectar 2 pL de la suspensión con el vector al interior de la cavidad vítrea. Para las inyecciones intracamerales, se podrá desplazar hacia adelante la punta de la aguja mediante una paracentesis del limbo corneoescleral, dirigir hacia la córnea central y se podrán inyectar 2 pL de la suspensión con el vector. Para las inyecciones intracamerales, se podrá desplazar hacia adelante la punta de la aguja mediante una paracentesis del limbo corneoescleral, dirigir hacia la córnea central y se podrán inyectar 2 pL de la suspensión con el vector. Estos vectores se podrán inyectar con títulos de 1.0-1.4 x 1010 o 1.0-1.4 x 109 unidades de transducción (UT)/mL.
En otra realización, también se contempla RetinoStat®, un vector para la terapia génica lentivírico derivado del virus de la anemia infecciosa equina que expresa las proteínas angiostáticas endostatina y angiostatina que se suministra mediante inyección subretinal para el tratamiento de la forma húmeda de degeneración macular senil (remítase a, p. ej., Binley et al., HUMAN GENE THERAPY 23:980-991 (septiembre de 2012)). Se podrá modificar un vector de este tipo para el sistema CRISPR-Cas. Se podrá tratar cada ojo con cualquier RetinoStat® con una dosis de 1.1 x 105 unidades de transducción por ojo (UT/ojo) en un volumen total de 100 pL.
En otra realización, se podrá contemplar un vector adenovírico con una deleción de E1, deleción parcial de E3 y deleción de E4 para el suministro al ojo. Se administró una inyección intravítrea única de un vector adenovírico con una deleción de E1, deleción parcial de E3 y deleción de E4 que expresaba un factor derivado del epitelio pigmentario humano (AdPEDF.ll) a veintiocho pacientes con degeneración macular senil (AMD, por sus siglas en inglés) neovascular avanzada (remítase a, p. ej., Campochiaro et al., Human Gene Therapy 17:167-176 (febrero de 2006)). Se estudiaron dosis comprendidas entre 106 y 1095 unidades de partículas (UP) y no se produjeron eventos adversos graves relacionados con AdPEDF.ll ni toxicidades limitantes de la dosis (remítase a, p. ej., Campochiaro et al., Human Gene Therapy 17:167-176 (febrero de 2006)). La transferencia génica ocular mediada por el vector adenovírico parece ser una estrategia viable para el tratamiento de los trastornos oculares y se podría aplicar al sistema CRISPR Cas.
En otra realización, el sistema sd-rxRNA® de RXi Pharmaceuticals se podrá utilizar y/o adaptar para el suministro de CRISPR Cas al ojo. En este sistema, una administración intravítrea única de 3 pg de sd-rxRNA da como resultado la reducción específica de la secuencia de los niveles de ARNm de PPIB durante 14 días. Se podrá aplicar el sistema sd-rxRNA® al sistema CRISPR Cas, contemplando una dosis de aproximadamente 3 a 20 mg de CRISPR administrado a un ser humano.
Millington-Ward et al. (Molecular Therapy, vol. 19 n.° 4, 642-649 abril de 2011) describe vectores víricos adenoasociados (AAV) para suministrar un supresor de rodopsina por interferencia por el ARN (iARN) y un gen de reemplazo de la rodopsina con codón modificado para la supresión debida a alteraciones nucleotídicas en posiciones degeneradas en el sitio diana de la iARN. Se inyectaron subretinalmente una inyección de 6.0 x 108 pv o 1.8 x 1010 pv de AAV en los ojos según Millington-Ward et al. Los vectores AAV de Millington-Ward et al. se podrán aplicar al sistema CRISPR Cas, contemplando una dosis de aproximadamente 2 x 1011 a aproximadamente 6 x 1013 pv administradas a un ser humano.
Dalkara et al. (Sci Transí Med 5, 189ra76 (2013)) también se refiere a la evolución dirigida in vivo para diseñar un vector AAV que suministre las versiones no modificadas de los genes defectuosos en toda la retina tras la inyección no lesiva en el humor vítreo de los ojos. Dalkara describe una colección de presentación de péptidos heptaméricos y una colección AAV construida reordenando ADN de genes cap de AAV1,2, 4, 5, 6, 8 y 9. Las colecciones de AAVcr y vectores AAVr que expresaban GFP con un promotor CAG o Rho se empaquetaron y se obtuvieron los títulos genómicos resistentes a desoxirribonucleasas mediante PCR cuantitativa. Se combinaron las colecciones y se realizaron dos ciclos de evolución, en los que cada uno consistía de una diversificación de la colección inicial seguida por tres pasos de selección in vivo. En cada uno de estos pasos, se inyectaron por vía intravítrea 2 mL de una colección dializada purificada con iodixanol, solución salina tamponada con fosfato (PBS), con un título genómico de aproximadamente 1 x 1012 gv/mL, a ratones P30 rho-GFP. Los vectores AAV de Dalkara et al. se podrán aplicar al sistema CRISPR Cas, contemplando una dosis de aproximadamente 1 x 1015 a aproximadamente 1 x 1016 gv/mL administrados a un ser humano.
En otra realización, la diana podrá ser el gen de la rodopsina para el tratamiento de la retinitis pigmentosa (RP, por sus siglas en inglés), donde el sistema de la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20120204282 adjudicada a Sangamo BioSciences, Inc. se podrá modificar para el sistema CRISPR Cas.
En otra realización, los métodos de la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20130183282 adjudicada a Cellectis, que se refiere a métodos para escindir una secuencia diana del gen de la rodopsina humana, también se podrán modificar para el sistema CRISPR Cas.
La patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20130202678 adjudicada a Academia Sinica se refiere a métodos para tratar retinopatías y trastornos oftalmológicos que afectan a la visión que se refieren al suministro del gen Puf-A (que se expresa en el ganglio retinal y células pigmentadas de los tejidos oculares y presenta una actividad antiapoptótica única) en el espacio subretinal o intravitreal del ojo. En particular, las dianas deseables son zgc:193933, prdm1a, spata2, tex10, rbb4, ddx3, zp2.2, Blimp-1 y HtrA2, todas las cuales podrán ser dianas del sistema CRISPR Cas.
Wu (Cell Stem Ce/l,13:659-62, 2013) diseñó un ARN guía que conduce Cas9 a una mutación de un único par de bases que provoca cataratas en ratones, donde se induce la escisión del ADN. A continuación, utilizando el otro alelo no modificado u oligos que se proporcionan a los mecanismos de reparación de zigotos, corrigieron la secuencia del alelo roto y corrigieron el defecto genético que causaba las cataratas en el ratón mutante.
La patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20120159653, describe la utilización de nucleasas con dedos de zinc para modificar genéticamente células, animales y proteínas asociados con la degeneración macular (MD). La degeneración macular (MD) es la causa principal de deficiencia visual en la población de edad avanzada, pero también es un síntoma distintivo de enfermedades de la infancia tales como la enfermedad de Stargardt, fondo de Sorsby y enfermedades neurodegenerativas de la infancia letales, con una edad de inicio muy temprana tal como el primer año de vida. La degeneración macular da como resultado la pérdida de visión del centro del campo visual (la mácula) debido al daño en la retina. En la actualidad, los modelos en animales existentes no manifiestan los distintivos principales de la enfermedad tal como se observa en seres humanos. Los modelos en animales disponibles que comprenden genes mutantes que codifican proteínas asociadas con la MD también producen fenotipos sumamente variables, lo que convierte en problemática su aplicación a la enfermedad humana y al desarrollo de una terapia.
Un aspecto de la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20120159653 se refiere a la edición de cualesquiera secuencias cromosómicas que codifican proteínas asociadas con la MD que se podrían aplicar al sistema CRISPR Cas. Las proteínas asociadas con la MD se seleccionan normalmente en función de una asociación experimental de la proteína asociada con la MD con un trastorno de tipo MD. Por ejemplo, la velocidad de producción o la concentración de circulación de una proteína asociada con la MD podrá estar elevada o disminuida en una población que padece un trastorno de tipo MD respecto a una población que no padece el trastorno de tipo MD. Se podrán evaluar las diferencias en los niveles de proteína utilizando técnicas proteómicas que incluyen, sin carácter limitante, la inmunoelectrotransferencia, tinción inmunohistoquímica, ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) y espectrometría de masas. Como alternativa, se podrán identificar las proteínas asociadas con la MD obteniendo los perfiles de expresión génica de los genes que codifican las proteínas utilizando técnicas genómicas que incluyen, sin carácter limitante, análisis por micromatriz de ADN, análisis en serie de la expresión génica (SAGE) y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (Q-PCR).
A modo de ejemplo no limitante, las proteínas asociadas con la MD incluyen, sin carácter limitante, las siguientes proteínas: (ABCA4) casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 4 de acromatopsia 1 ACHM1 (monocromatismo de los bastones) ApoE Apolipoproteína E (ApoE) C1QTNF5 (CTRP5) C1q y proteína 5 relacionada con el factor de necrosis tumoral (C1QTNF5) Componente 2 del complemento C2 (C2) Componentes del complemento C3 (C3) Ligando 2 de quimiocina CCL2 (motivo C-C) (CCL2) Receptor 2 de quimiocina (motivo C­ C) CCR2 (CCR2) CD36 Agrupación de diferenciación 36 CFB Factor B del complemento CFH Factor H del complemento CFH CFHR1 1 relacionado con el factor H del complemento CFHR33 relacionado con el factor H del complemento CNGB3 subunidad beta 3 del canal operado por nucleótidos cíclicos CP ceruloplasmina (CP) CRP proteína reactiva C (CRP) CST3 cistatina C o cistatina 3 (CST3) CTSD Catepsina D (CTSD) CX3CR1 receptor 1 de la quimiocina (motivo C-X3-C) ELOVL4 Elongación de ácidos grasos de cadena muy larga 4 ERCC6 reparación de escisión con complementación cruzada con la deficiencia de reparación en roedores, grupo de complementación 6 FBLN5 Fibulina-5 FBLN5 Fibulina 5 FBLN6 Fibulina 6 FSCN2 fascina (FSCN2) HMCN1 Hemicentrina 1 HMCN1 hemicentina 1 HTRA1 serínpeptidasa 1 HtrA (HTRA1) HTRA1 serínpeptidasa 1 HtrA IL-6 Interleucina 6 IL-8 Interleucina 8 LOC387715 Proteína hipotética PLEKHA1 miembro 1 de la familia A que contiene un dominio de homología con la pleckstrina (PLEKHA1) PROM1 Prominina 1(PROM1 o CD133) PRPH2 Periferina-2 RPGR regulador GTPasa de la retinitis pigmentosa SERPING1 inhibidor de la serpínpeptidasa, clado G, miembro 1 (inhibidor C1) TCOF1 Treacle TIMP3 Inhibidor 3 de metaloproteinasa (TIMP3) TLR3 Receptor 3 de tipo Toll.
La identidad de la proteína asociada con la MD cuya secuencia cromosómica se edita puede variar y variará. En realizaciones preferidas, las proteínas asociadas con la MD cuya secuencia cromosómica se edita podrán ser el casete de unión a ATP, proteína miembro 4 de la subfamilia A (ABC1)(ABCA4) codificada por el gen ABCR, la proteína apolipoproteína E (APOE) codificada por el gen APOE, la proteína ligando 2 de la quimiocina (motivo C-C) (CCL2) codificada por el gen CCL2, la proteína receptor 2 de la quimiocina (motivo C-C) (CCR2) codificada por el gen CCR2, la proteína ceruloplasmina (CP) codificada por el gen CP, la proteína catepsina D (CTSD) codificada por el gen CTSD o la proteína inhibidor 3 de metaloproteinasas (TIMP3) codificada por el gen TIMP3. En una realización ilustrativa, el animal modificado genéticamente es una rata y la secuencia cromosómica editada que codifica la proteína asociada con la MD podrá ser: (ABCA4) casete de unión a ATP, NM_000350 subfamilia A (ABC1), miembro 4 APOE Apolipoproteína E NM_138828 (APOE) CCL2 Ligando 2 de quimiocina (motivo C-C NM_031530) (CCL2) CCR2 Receptor 2 de quimiocina (motivo C-C NM_021866) (CCR2) Cp ceruloplasmina (CP) NM_012532 CTSD Catepsina D (CTSD) n M_134334 T iMP3 Inhibidor 3 de metaloproteinasas NM_012886 (TIMP3). El animal o célula podrá comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más secuencias cromosómicas alteradas que codifican una proteína asociada con la MD y cero, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más secuencias integradas cromosómicamente que codifican las proteínas alteradas asociadas con la MD.
La secuencia cromosómica editada o integrada podrá modificarse para codificar una proteína alterada asociada con la MD. Se han asociado con la MD varias mutaciones en las secuencias cromosómicas relacionadas con la MD. Los ejemplos no limitantes de mutaciones en las secuencias cromosómicas asociadas con la MD incluyen aquellas que podrán causar MD que incluyen en la proteína ABCR, E471K (es decir, glutamato en la posición 471 sustituido por lisina), R1129L (es decir, arginina en la posición 1129 sustituida por leucina), T1428M (es decir, treonina en la posición 1428 sustituida por metionina), R1517S (es decir, arginina en la posición 1517 sustituida por serina), I1562T (es decir, isoleucina en la posición 1562 sustituida por treonina) y G1578R (es decir, glicina en la posición 1578 sustituida por arginina); en la proteína CCR2, V64I (es decir, valina en la posición 192 sustituida por isoleucina); en la proteína CP, G969B (es decir, glicina en la posición 969 sustituida por asparagina o aspartato); en la proteína TIMP3, S156C (es decir, serina en la posición 156 sustituida por cisteína), G166C (es decir, glicina en la posición 166 sustituida por cisteína), G167C (es decir, glicina en la posición 167 sustituida por cisteína), Y168C (es decir, tirosina en la posición 168 sustituida por cisteína), S170C (es decir, serina en la posición 170 sustituida por cisteína), Y172C (es decir, tirosina en la posición 172 sustituida por cisteína) y S181C (es decir, serina en la posición 181 sustituida por cisteína). En la técnica existe constancia de otras asociaciones de variantes genéticas en genes asociados con la MD con enfermedades.
Corazón
La presente divulgación también contempla el suministro del sistema CRISPR-Cas al corazón. Para el corazón, se prefiere el virus adenoasociado miocardiotrópico (AAVM, por sus siglas en inglés), en particular AAVM41 que mostró una transferencia génica preferencial en el corazón (remítase a, p. ej., Lin-Yanga etal., PNAS, 10 de marzo de 2009, vol. 106, n.° 10). La administración podrá ser local o sistémica. Se contemplan dosificaciones de aproximadamente 1-10 x 1014 genomas de vectores para la administración sistémica. Remítase también a, p. ej., Eulalio et al. (2012) Nature 492: 376 y Somasuntharam et al. (2013) Biomaterials 34: 7790.
Por ejemplo, la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20110023139 describe la utilización de nucleasas con dedos de zinc para modificar genéticamente células, animales y proteínas asociados con la enfermedad cardiovascular. Las enfermedades cardiovasculares incluyen por lo general presión sanguínea elevada, ataques cardiacos, insuficiencia cardiaca y accidentes cerebrovasculares y TIA. Se podrá utilizar cualquier secuencia cromosómica implicada en la enfermedad cardiovascular o la proteína codificada por cualquier secuencia cromosómica implicada en la enfermedad cardiovascular en los métodos descritos en esta divulgación. Las proteínas relacionadas con el sistema cardiovascular se seleccionan normalmente en función de una asociación experimental del desarrollo de la enfermedad cardiovascular con la proteína relacionada con el sistema cardiovascular. Por ejemplo, la velocidad de producción o la concentración de circulación de una proteína asociada con el sistema cardiovascular podrá estar elevada o disminuida en una población que padece un trastorno cardiovascular respecto a una población que no padece trastorno cardiovascular. Se podrán evaluar las diferencias en los niveles de proteína utilizando técnicas proteómicas que incluyen, sin carácter limitante, la inmunoelectrotransferencia, tinción inmunohistoquímica, ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) y espectrometría de masas. Como alternativa, se podrán identificar las proteínas asociadas con el sistema cardiovascular obteniendo los perfiles de expresión génica de los genes que codifican las proteínas utilizando técnicas genómicas que incluyen, sin carácter limitante, análisis por micromatriz de ADN, análisis en serie de la expresión génica (SAGE) y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (Q-PCR).
A modo de ejemplo, la secuencia cromosómica podrá comprender, sin carácter limitante, IL1B (interleucina 1, beta), XDH (xantina-deshidrogenasa), TP53 (proteína tumoral p53), PTGIS (prostaglandina 12 (prostaciclina) sintasa), MB (mioglobina), IL4 (interleucina 4), ANGPT1 (angiopoyetina 1), ABCG8 (casete de unión a ATP, subfamilia G (WHITE), miembro 8), CTSK (catepsina K), pTg IR (prostaglandina 12 (prostaciclina) receptor (IP)), KCNJ11 (canal rectificador de potasio de entrada, subfamilia J, miembro 11), INS (insulina), CRP (proteína reactiva C, relacionada con pentraxina), PDGFRB (receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, polipéptido beta), CCNA2 (ciclina A2), PDGFB (polipéptido beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas (homólogo del oncogen vírico del sarcoma en simios (v-sis))), KCNJ5 (canal rectificador de potasio de entrada, subfamilia J, miembro 5), KCNN3 (canal de potasio intermedio/pequeño activado por la conductancia de calcio, subfamilia N, miembro 3), CAPN10 (calpaína 10), PTGES (prostaglandina E sintasa), ADRA2B (receptor, alfa-2B, adrenérgico), ABCG5 (casete de unión a ATP, subfamilia G (WHITE), miembro 5), PRDX2 (peroxirredoxina 2), CAPN5 (calpaína 5), PARP14 (familia de la polimerasa poli (ADP-ribosa), miembro 14), MEX3C (homólogo C de mex-3 (C. elegans)), ACE enzima conversora de angiotensina I (peptidil-dipeptidasa A) 1), TNF (factor de necrosis tumoral (superfamilia TNF, miembro 2)), IL6 (interleucina 6 (interferón, beta 2)), STN (estatina), SERPINE1 (inhibidor de la serpín-peptidasa, clado E (nexina, inhibidor del activador de plasminógeno, tipo 1), miembro 1), ALB (albúmina), ADIPOQ (adiponectina, que contiene dominio colágeno y C1Q), APOB (apolipoproteína B (incluído el antígeno Ag(x))), APOE (apolipoproteína E), LEP (leptina), MTHFR (5,10-metilentetrahidrofolato-reductasa (NADPH)), APOA1 (apolipoproteína A-I), EDN1 (endotelina 1), NPPB (precursor B del péptido natriurético), NOS3 (óxido nítrico sintasa 3 (célula endotelial)), PPARG (receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas), PLAT (activador de plasminógeno, tisular), PTGS2 (prostaglandina-endoperóxido sintasa 2 (prostaglandina G/H sintasa y ciclooxigenasa)), CETP (proteína de transferencia de ésteres de colesterol, plasmática), AGTR1 (receptor de angiotensina II, tipo 1), HMGCR (3-hidroxi-3-metilglutaril-Coenzima A-reductasa), IGF1 (factor de crecimiento insulínico 1 (somatomedina C)), SELE (selectin aE), REN (renina), PPARA (receptor alfa activado por el proliferador de perosixomas), PON1 (paraoxonasa 1), KNG1 (kininógeno 1), CCL2 (ligando 2 de quimiocinas (motivo C-C)), LPL (lipoproteína-lipasa), VWF (factor de von Willebrand), F2 (factor de coagulación II (trombina)), ICAM1 (molécula de adhesión intercelular 1), TGFB1 (factor de crecimiento transformante, beta 1), NPPA (precursor del péptido natriurético A), IL10 (interleucina 10), EPO (eritropoyetina), SOD1 (superóxido-dismutasa 1, soluble), VCAM1 (molécula de adhesión celular vascular 1), IFNG (interferón, gamma), LPA (lipoproteína, Lp(a)), MPO (mieloperoxidasa), ESR1 (receptor estrogénico 1), MAPK1 (proteína cinasa activada por mitógenos 1), HP (haptoglobina), F3 (factor de coagulación III (tromboplastina, factor tisular)), CST3 (cistatina C), COG2 (componente del complejo de golgi oligomérico 2), MMP9 (metalopeptidasa matricial 9 (gelatinasa B, gelatinasa de 92 kDa, colagenasa de tipo IV de 92 kDa)), SERPINC1 (inhibidor de la serpín-peptidasa, clado C (antitrombina), miembro 1), F8 (factor de coagulación VIII, componente procoagulante), HMOX1 (hemo-oxigenasa (deciclante) 1), APOC3 (apolipoproteína C-III), IL8 (interleucina 8), PROK1 (procineticina 1), CBS (cistationina-beta-sintasa), NOS2 (óxido-nítrico-sintasa 2, inducible), TLR4 (receptor de tipo toll 4), SELP (selectina P (proteína de la membrana granular 140 kDa, antígeno CD62)), ABCA1 (casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 1), AGT (angiotensinógeno (inhibidor de la serpín-peptidasa, clado A, miembro 8)), LDLR (receptor de la lipoproteína de baja densidad), GPT (glutámico-piruvato-transaminasa (alaninaaminotransferasa)), VEGFA (factor de crecimiento endotelial vascular A), NR3C2 (receptor nuclear subfamilia 3, grupo C, miembro 2), IL18 (interleucina 18 (factor inductor del interferón gamma)), NOS1 (óxido nítrico-sintasa 1 (neuronal)), NR3C1 (receptor nuclear subfamilia 3, grupo C, miembro 1 (receptor de glucocorticoides)), FGB (cadena beta del fibrinógeno), HGF (factor de crecimiento de hepatocitos (hepapoyetina A; factor de dispersión)), IL1A (interleucina 1, alfa), RETN (resistina), AKT1 (homólogo 1 del oncogén vírico del timoma murino v-akt), LIPC (lipasa, hepática), HSPD1 (proteína 1 de 60 kDa de choque térmico (chaperonina)), MAPK14 (proteína cinasa activada por mitógenos 14), SPP1 (fosfoproteína secretada 1), ITGB3 (integrina, beta 3 (glucoproteína de plaquetas 111a, antígeno CD61)), CAT (catalasa), UTS2 (urotensina 2), THb D (trombomodulina), F10 (factor de coagulación X), CP (ceruloplasmina (ferroxidasa)), TNFRSF11B (superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 11b), EDNRA (receptor de endotelina tipo A), EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico (homólogo del oncogén vírico de la leucemia eritroblástica (v-erb-b), aviar)), MMP2 (metalopeptidasa matricial 2 (gelatinasa A, gelatinasa de 72 kDa, colagenasa de tipo IV de 72 kDa)), PLG (plasminógeno), NPY (neuropéptido Y), RHOD (familia de genes homólogos a ras, miembro D), MAPK8 (proteína cinasa activada por mitógenos 8), MYC (homólogo del oncogén vírico de mielocitomatosis v-myc (aviar)), FN1 (fibronectina 1), CMA1 (quimase 1, mastocitos), PLAU (activador del plasminógeno, urocinasa), GNB3 (proteína de unión al nucleótido de guanina (proteína G), polipéptido beta 3), ADRB2 (receptor adrenérgico, beta-2-, superficial), APOA5 (apolipoproteína A-V), SOD2 (superóxido-dismutasa 2, mitocondrial), F5 (factor de coagulación V (proacelerina, factor lábil)), VDR (receptor de vitamina D (1,25-dihidroxivitamina D3)), ALOX5 (araquidonato 5-lipoxigenasa), HLA-DRB1 (complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DR beta 1), PARP1 (polimerasa poli (ADP-ribosa) 1 ), CD40LG (ligando de CD40), PON2 (paraoxonasa 2), AGER (receptor específico del producto final de glicosilación avanzado), IRS1 (sustrato del receptor insulínico 1), PTGS1 (prostaglandina-endoperóxido sintasa 1 (prostaglandina G/H sintasa y ciclooxigenasa)), ECE1 (enzima convertidora de endotelina 1), F7 (factor de coagulación VII (acelerador de la conversión de protrombina sérica)), URN (antagonista del receptor de la interleucina 1), EPHX2 (epóxido-hidrolasa 2, citoplasmática), IGFBP1 (proteína 1 de unión al factor de crecimiento insulínico), MAPK10 (proteína cinasa activada por mitógenos 10), FAS (Fas (superfamilia del receptor de TNF, miembro 6)), ABCB1 (casete de unión a ATP, subfamilia B (MDR/TAP), miembro 1), JUN (oncogén jun), IGFBP3 (proteína 3 de unión al factor de crecimiento insulínico), CD14 (molécula CD14), PDE5A (fosfodiesterasa 5A, específica de GMPc), AGTR2 (receptor de la angiotensina II, tipo 2), CD40 (molécula CD40, miembro 5 de la superfamilia del receptor de TNF), LCAT (lecitina-colesterol-aciltransferasa), CCR5 (receptor 5 de quimiocinas (motivo C-C)), MMP1 (metalopeptidasa matricial 1 (colagenasa intersticial)), TIMP1 (inhibidor 1 de metalopeptidasas TIMP), ADM (adrenomedulina), DYT10 (distonia 10), STAT3 (transductor de la señal y activador de la transcripción 3 (factor de respuesta de la fase aguda)), MMP3 (metalopeptidasa matricial 3 (estromelisina 1, progelatinasa)), ELN (elastina), USF1 (factor de transcripción 1 situado en 5’), CFH (factor del complemento H), HSPA4 (proteína 4 de 70 kDa de choque térmico), MMP12 (metalopeptidasa matricial 12 (elastasa de macrófagos)), MME (metaloendopeptidasa de la membrana), F2R (receptor del factor de coagulación II (trombina)), SELL (selectina L), CTSB (catepsina B), ANXA5 (anexina A5), ADRB1 (receptor adrenérgico, beta-1), CYBA (citocromo b-245, alfa polipéptido), FGA (cadena alfa del fibrinógeno), GGT1 (gamma-glutamiltransferasa 1), LIPG (lipasa, endotelial), HIF1A (factor 1 inducible por hipoxia, subunidad alfa (factor de transcripción hélice-bucle-hélice básico)), CXCR4 (receptor 4 de quimiocinas (motivo C-X-C)), PROC (proteína C (inactivador de los factores de coagulación Va and VIIIa)), SCARB1 (receptor depurador de clase B, miembro 1), CD79A (molécula CD79a,alfa asociada a inmunoglobulina), PLTP (proteína de transferencia de fosfolípidos), ADD1 (aducina 1 (alfa)), FGG (cadena gamma del fibrinógeno), SAA1 (amiloide A1 sérico), KCNH2 (canal de potasio activado por voltaje, subfamilia H (relacionada con eag), miembro 2), DPP4 (dipeptidil-peptidasa 4), G6PD (glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa), NPR1 (receptor A del péptido natriurético/guanilato ciclasa A (receptor A del péptido atrionatriurético)), VTN (vitronectina), KIAA0101 (KIAA0101), FOS (homólogo del oncogén vírico del osteosarcoma murino FBJ), TLR2 (receptor de tipo toll 2), PPIG (peptidilprolil isomerasa G (ciclofilina G)), IL1R1 (receptor de interleucina 1, tipo I), AR (receptor androgénico), CYP1A1 (citocromo P450, familia 1, subfamilia A, polipéptido 1), SERPINA1 (inhibidor de la serpín-peptidasa, clado A (antiproteinasa alfa 1, antitripsina), miembro 1), MTR (5-metiltetrahidrofolato-homocisteína metiltransferasa), RBP4 (proteína 4 de unión al retinol, plasmática), APOA4 (apolipoproteína A-IV), CDKN2A (inhibidor 2A de la cinasa dependiente de ciclinas (melanoma, p16, inhibe CDK4)), FGF2 (factor 2 de crecimiento fibroblástico (básico)), EDNRB (receptor de la endotelina de tipo B), ITGA2 (integrina, alfa 2 (CD49B, subunidad alfa 2 del receptor VLA-2)), CABIN1 (proteína 1 de unión a calcineurina), SHBG (globulina de unión a la hormona sexual), HMGB1 (secuencia 1 del grupo de movilidad elevada), HSP90B2P (proteína beta de choque término de 90 kDa (Grp94), miembro 2 (pseudogén)), CYP3A4 (citocromo P450, familia 3, subfamilia A, polypéptido 4), GJA1 (proteína de la conexión comunicante, alfa 1, 43 kDa), CAV1 (caveolina 1, proteína de las caveólas, 22 kDa), ESR2 (receptor estrogénico 2 (ER beta)), LTA (linfotoxina alfa (TNF superfamilia, miembro 1)), GDF15 (factor de diferenciación del crecimiento 15), BDNF (factor neurotrófico derivado del cerebro), CYP2D6 (citocromo P450, familia 2, subfamilia D, polipéptido 6), NGF (factor de cercimiento nervioso (polipéptido beta)), SP1 (factor de la transcripción Sp1), TGIF1 (homeosecuencia 1 del factor inducido por TGFB), SRC (homólogo del oncogén vírico del sarcoma v-src (Schmidt-Ruppin A-2) (aviar)), EGF (factor de crecimiento epidérmico (beta-urogastrona)), PIK3CG (fosfoinositido-3-cinasa, catalítico, polipéptido gamma), HLA-A (complejo mayor de histocompatibilidad, clase I, A), KCNQ1 (canal de potasio activado por voltaje, subfamilia tipo KQT, miembro 1), CNR1 (receptor cannabinoideo 1 (cerebro)), FBN1 (fibrilina 1), CHKA (alfa colina-cinasa), BEST1 (bestrofina 1), APP (proteína precursora del beta amiloide (A4)), CTNNB1 (catenina (proteína asociada a cadherina), beta 1, 88 kDa), IL2 (interleucina 2), CD36 (molécula CD36 (receptor de trombospondina)), PRKAB1 (proteína-cinasa, activada por AMP, beta 1 subunidad no catalítica), TPO (peroxidasa del tiroides), ALDH7A1 (familia aldehído-deshidrogenasa 7, miembro A1), CX3CR1 (receptor 1 de quimiocinas (motivo C-X3-C)), TH (tirosina-hidroxilasa), F9 (factor de coagulación IX), GH1 (hormona del crecimiento 1), TF (transferrina), HFE (hemocromatosis), IL17A (interleucina 17A), PTEN (homólogo de la fosfatasa y tensina), GSTM1 (glutatión S-transferasa mu 1), DMD (distrofina), GATA4 (proteína 4 de unión a GATA), F13A1 (factor de coagulación XIII, polipéptido A1), TTR (transtiretina), FABP4 (proteína 4 de unión a ácidos grasos, adipocitos), PON3 (paraoxonasa 3), APOC1 (apolipoproteína C-I), INSR (receptor insulínico), TNFRSF1B (superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 1B), HTR2A (receptor 2A de la 5-hidroxitriptamina (serotonina)), CSF3 (factor 3 estimulante de colonias (granulocitos)), CYP2C9 (citocromo P450, familia 2, subfamilia C, polipéptido 9), TXN (tiorredoxina), CYP11B2 (citocromo P450, familia 11, subfamilia B, polipéptido 2), PTH (hormona del paratiroides), CSF2 (factor 2 estimulador de colonias (granulocitos-macrófagos)), KDR (receptor del dominio de inserción cinasa (una tirosina-cinasa receptora de tipo III)), PLA2G2A (fosfolipasa A2, grupo IIA (plaquetas, líquido sinovial)), B2M (beta-2-microglobulina), THBS1 (trombospondina 1), GCG (glucagón), RHOA (familia del gen homólogo a ras, miembro A), ALDH2 (familia 2 de la aldehído-deshidrogenasa (mitocondrial)), TCF7L2 (factor de transcripción 7 de tipo 2 (específico de linfocitos T, secuencia HMG)), BDKRB2 (receptor B2 de bradiquinina), NFE2L2 (factor nuclear (2 derivado de eritroide) tipo 2), NOTCH1 (homólogo 1 de Notch, asociado a la traslocación (Drosophila)), UGT1A1 (familia de UDP glucuronosiltransferasa 1, polipéptido A1), IFNA1 (interferón, alfa 1), PPARD (receptor delta activado por el proliferador de peroxisomas), SIRT1 (sirtuina (homólogo 2 de regulación de información de tipo emparejamiento silencioso) 1 (S. cerevisiae)), GNRH1 (hormona 1 liberadora de gonadotropina (hormona de liberación luteinizante)), PAPPA (proteína A plasmática asociada al embarazo, papalisina 1), ARR3 (arrestina 3, retinal (X-arrestina)), NPPC (precursor C del péptido natriurético), AHSP (proteína estabilizante de la alfa hemoglobina), PTK2 (PTK2 proteína tirosina-cinasa 2), IL13 (interleucina 13), MTOR (diana mecanística de rapamicina (serina/treonina-cinasa)), ITGB2 (integrina, beta 2 (subunidad 3 y 4 del receptor del componente del complemento 3)), GSTT1 (glutatión S-transferasa theta 1), IL6ST (transductor de la señal de interleucina 6 (gp130, receptor M de oncostatina M)), CPB2 (carboxipeptidasa b2 (plasma)), CYP1A2 (citocromo P450, familia 1, subfamilia A, polipéptido 2), HNF4A (factor nuclear de hepatocitos 4, alfa), SLC6A4 (familia 6 portadora de solutos (transportador de neurotransmisores, serotonina), miembro 4), PLA2G6 (fosfolipasa A2, grupo VI (citosólico, independiente de calcio)), TNFSF11 (superfamilia (ligando) del factor de necrosis tumoral, miembro 11), SLC8A1 (familia 8 portadora de solutos (intercambiador de sodio/calcio), miembro 1), F2RL1 (receptor tipo 1 del factor de coagulación II (trombina)), AKR1A1 (familia 1 de aldo-ceto-reductasa, miembro A1 (aldehído-reductasa)), ALDH9A1 (familia de la aldehído-deshidrogenasa 9, miembro A1), BGLAP (proteína gamma-carboxiglutamato (gla) ósea), MTTP (proteína de transferencia de triglicéridos microsomal), MTRR (5-metiltetrahidrofolato-homocisteína metiltransferasa reductasa), SULT1A3 (familia de sulfotransferasa, citosólica, 1A, prefiere fenol, miembro 3), RAGE (antigen tumoral renal), C4B (componente 4B del complemento (grupo sanguíneo Chido), P2RY12 (receptor purinérgico P2Y, acoplado a la proteína G, 12), RNLS (renalasa, amino-oxidasa dependiente de FAD), CREB1 (proteína 1 de unión al elemento de respuesta a AMPc), POMC (proopiomelanocortina), RAC1 (sustrato 1 de la toxina botulínica C3 relacionado con ras (familia rho, proteína de unión a GTP pequeña Rac1)), LMNA (lamina NC), CD59 (molécula CD59, proteína reguladora del complemento), SCN5A (canal de sodio, activado por voltaje, tipo V, subunidad alfa), CYP1B1 (citocromo P450, familia 1, subfamilia B, polipéptido 1), MIF (factor inhibidor de la migración de macrófagos (factor inhibidor de la glicosilación)), MMP13 (metalopeptidasa matricial 13 (colagenasa 3)), TIMP2 (TIMP inhibidor 2 de metalopeptidasas), CYP19A1 (citocromo P450, familia 19, subfamilia A, polipéptido 1), CYP21A2 (citocromo P450, familia 21, subfamilia A, polipéptido 2), PTPN22 (proteína tirosina-fosfatasa, no tipo receptor 22 (linfoide)), MYH14 (miosina, cadena pesada 14, no músculo), MBL2 (lecina de unión a manosa (proteína C) 2, soluble (defecto opsónico)), SELPLG (ligando P de selectina), AOC3 (amino-oxidasa, que contiene cobre 3 (proteína 1 de adhesión vascular)), CTSL1 (catepsina L1), PCNA (antígeno nuclear celular de proliferación), IGF2 (factor de crecimiento 2 de tipo insulinoide (somatomedina A)), ITGB1 (integrina, beta 1 (receptor de fibronectina, polipéptido beta, antígeno CD29 incluye MDF2, MSK12)), cAsT (calpastatina), CXCL12 (ligando quimiocina 12 (motivo C-X-C) (factor 1 derivado de células estromales)), IGHE (inmunoglobulina pesada constante épsilon), KCNE1 (canal de potasio activado por voltaje, familia relacionada con Isk, miembro 1), TFRC (receptor de transferrina (p90, c D71)), COL1A1 (colágeno, tipo I, alfa 1), COL1A2 (colágeno, tipo I, alfa 2), IL2RB (receptor de la interleucina 2, beta), PLA2G10 (fosfolipasa a 2, grupo X), ANGPT2 (angiopoyetina 2), p Ro CR (receptor de la proteína C, endotelial (EPCR)), NOX4 (NADPH oxidasa 4), HAMP (péptido antimicrobiano hepcidina), PTPN11 (proteína tirosina-fosfatasa, no receptor de tipo 11), SLC2A1 (familia 2 portadora de solutos (transportador de glucosa facilitado), miembro 1), IL2RA (receptor de interleucina 2, alfa), CCL5 (ligando quimiocina 5 (motivo C-C)), IRF1 (factor 1 regulador de interferón), CFLAR (regulador de la apoptosis de tipo CASP8 y FADD), CALCA (polipéptido alfa relacionado con la calcitonina), EIF4E (factor de iniciación de la traducción eucariota 4E), GSTP1 (glutatión S-transferasa pi 1), JAK2 (cinasa de Janus 2), CYP3A5 (citocromo P450, familia 3, subfamilia A, polipéptido 5), HSPG2 (heparán sulfato proteoglicano 2), CCL3 (ligando quimiocina 3 (motivo C-C)), MYD88 (gen de respuesta primario de diferenciación mieloide (88)), VIP (péptido intestinal vasoactivo), SOAT1 (esterol O-aciltransferasa 1), ADRBK1 (adrenérgico, beta, receptor cinasa 1), NR4A2 (subfamilia 4 del receptor nuclear, grupo A, miembro 2), MMP8 (metalopeptidasa matricial 8 (neutrófilo colagenasa)), NPR2 (receptor del péptido natriurético B/guanilato ciclasa B (receptor B del péptido atrionatriurético)), GCH1 (GTP-ciclohidrolasa 1), EPRS (glutamil-prolil-ARNt sintetasa), PPARGC1A (receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas, coactivador 1 alfa), F12 (factor de coagulación XII (factor Hageman)), PECAM1 (molécula de adhesión celular a plaquetas/endotelial), CCL4 (ligando quimiocina 4 (motivo C-C)), SERPINA3 (inhibidor de la serpín-peptidasa, clado A (antiproteinasa alfa-1, antitripsina), miembro 3), CASR (receptor sensor de calcio), GJA5 (proteína de conexión comunicante, alfa 5, 40 kDa), FABP2 (proteína 2 de unión a ácidos grasos, intestinal), TTF2 (factor terminador de la transcripción, ARN polimerasa II), PROS1 (proteína S (alfa)), CTF1 (cardiotropina 1), SGCB (sarcoglicano, beta (glucoproteína asociada a la distrofina de 43 kDa)), YME1L1 (1 tipo YME1 (S. cerevisiae)), CAMP (péptido antimicrobiano catelicidina), ZC3H12A (12A que contiene dedos de zinc de tipo CCCH), AKR1B1 (familia 1 aldo-ceto reductasa, miembro B1 (aldosa-reductasa)), DES (desmina), MMP7 (metalopeptidasa matricial 7 (matrilisina, uterina)), AHR (receptor de arilhidrocarburos), CSF1 (factor 1 estimulador de colonias (macrófagos)), HDAC9 (histona-desacetilasa 9), CTGF (factor de crecimiento del tejido conectivo), KCNMA1 (canal de potasio grande activado por conductancia de calcio, subfamilia M, alfa miembro 1), UGT1A (UDP glucuronosiltransferasa 1 familia, polipéptido A locus complejo), PRKCA (proteína cinasa C, alfa), COMT (catechol-metiltransferasa,beta), S100B (S100 proteína B de unión a calcio), EGR1 (respuesta 1 de crecimiento temprano), PRL (prolactina), IL15 (interleucina 15), DRD4 (receptor de dopamina D4), CAMK2G (proteína cinasa II gamma dependiente de calcio/calmodulina), SLC22A2 (familia 22 portadora de solutos (transportador de cationes orgánicos), miembro 2), CCL11 (ligando quimiocina 11 (motivo C-C)), PGF (factor de crecimiento placentario B321), THPO (trombopoyetina), GP6 (glucoproteína VI (plaquetas)), TACR1 (receptor 1 de taquicinina), NTS (neurotensina), HNF1A (homeosecuencia A HNF1), SST (somatostatina), KCND1 (canal de potasio activado por voltaje, subfamilia relacionada con Shal, miembro 1), LOC646627 (inhibidor de fosfolipasa), TBXAS1 (tromboxano A sintasa 1 (plaquetas)), CYP2J2 (citocromo P450, familia 2, subfamilia J, polipéptido 2), TBXA2R (receptor de tromboxano a 2), ADH1C (alcohol-deshidrogenasa 1C (clase I), polipéptido gamma), ALOX12 (lipooxigenasa de araquidonato 12), AHSG (alfa-2-HS-glucoproteína), BHMT (betaína-homocisteína metiltransferasa), GJA4 (proteína de unión comunicante, alfa 4, 37 kDa), SLC25A4 (familia 25 portadora de solutos (portador mitocondrial; translocador del nucleótido adenina), miembro 4), ACLY (ATP citrato liasa), ALOX5AP (proteína activadora de la araquidonato 5-lipoxigenasa), NUMA1 (proteína 1 del aparato mitótico nuclear), CYP27B1 (citocromo P450, familia 27, subfamilia B, polipéptido 1), CYSLTR2 (receptor 2 de cisteinil leucotrieno), SOD3 (superóxido-dismutasa 3, extracelular), LTC4S (leucotrieno C4 sintasa), UCN (urocortina), GHRL (prepropéptido de grelina/obestatina), APOC2 (apolipoproteína C-II), CLEC4A (familia 4 con dominio de lectina de tipo C, miembro A), KBTBD10 (10 que contiene el dominio con repetición de kelch y BTB (POZ)), TNC (tenascina C), TYMS (timidilato sintetasa), SHCl (proteína transfomrante 1 SHC (que contiene el dominio 2 de homología con Src)), LRP1 (proteína 1 relacionada con el receptor de la lipoproteína de baja densidad), SOCS3 (supresor de la citocina de señalización 3), ADH1B (alcohol-deshidrogenasa 1b (clase I), polipéptido beta), KLK3 (peptidasa 3 relacionada con la kalikreína), HSD11B1 (hidroxiesteroide (11-beta)-deshidrogenasa 1), VKORC1 (complejo de la vitamina K epóxido-reductasa, subunidad 1), SERPINB2 (inhibidor de la serpín-peptidasa, clado B (ovalbúmina), miembro 2), TNS1 (tensina 1), RNF19A (proteína dedo RING 19A), EPOR (receptor de eritropoyetina), ITGAM (integrina, alfa M (subunidad del receptor 3 del componente del complemento 3)), PITX2 (homeodominio 2 de tipo emparejado), MAPK7 (proteína cinasa activada por mitógenos 7), FCGR3A (fragmento Fc de IgG, 111a de baja afinidad, receptor (CD16a)), LEPR (receptor de leptina), ENG (endoglina), GPX1 (glutatión-peroxidasa 1), GOT2 (glutámico-oxaloacético transaminasa 2, mitocondrial (aspartato aminotransferasa 2)), HRH1 (receptor de histamina H1), NR112 (subfamilia 1 del receptor nuclear, grupo I, miembro 2), CRH (hormona liberadora de corticotropina), HTR1A (receptor 1A de 5-hidroxitriptamina (serotonina)), VDAC1 (canal 1 de aniones dependiente de voltaje), HPSE (heparanasa), SFTPD (proteína surfactante D), t AP2 (transportador 2, casete de unión a ATP, subfamilia B (m Dr/TAP)), RNF123 (proteína dedo RING 123), PTK2B (PTK2B proteína tirosina-cinasa 2 beta), NTRK2 (receptor, tipo 2, tirosina-cinasa neurotrófica), IL6R (receptor de interleucina 6), ACHE (acetilcolinesterasa (grupo sanguíneo Yt)), GLP1R (receptor 1 peptídico tipo glucagón), GHR (receptor de la hormona de crecimiento), GSR (glutatión-reductasa), NQO1 (NAD(P)H-deshidrogenasa, quinona 1), NR5A1 (subfamilia 5 del receptor nuclear, grupo A, miembro 1), GJB2 (proteína de unión comunicante, beta 2, 26 kDa), SLC9A1 (familia 9 portadora de solutos (intercambiador de sodio/hidrógeno), miembro 1), MAOA (monoamino-oxidasa A), PCSK9 (proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9), FCGR2A (fragmento Fc de IgG, IIa de baja afinidad, receptor (Cd32)), SERPINF1 (inhibidor de la serpínpeptidasa, clado F (antiplasmina alfa-2, factor derivado del epitelio pigmentario), miembro 1), EDN3 (endotelina 3), DHFR (dihidrofolato-reductasa), GAS6 (6 específico de la parada del crecimiento), SMPD1 (esfingomielina fosfodiesterasa 1, lisosomal ácida), UCP2 (proteína 2 desacoplante (mitocondrial, portadora de protones)), TFAP2A (factor de transcripción AP-2 alfa (proteína 2 alfa de unión potenciadora activadora)), C4BPA (proteína de unión al componente 4 del complemento, alfa), SERPINF2 (inhibidor de la serpín-peptidasa, clado F (alfa-2 antiplasmina, factor derivado del epitelio pigmentario), miembro 2), TYMP (timidina-fosforilasa), ALPP (fosfatasa alcalina, placentaria (isozima Regan)), CXCR2 (receptor 2 de quimiocinas (motivo C-X-C)), SLC39A3 (familia 39 portadora de solutos (transportador de zinc), miembro 3), ABCG2 (casete de unión a ATP, subfamilia G (WHITE), miembro 2), ADA (adenosina-desaminasa), JAK3 (cinasa de Janus 3), HSPA1A (proteína 1A de choque térmico de 70 kDa), FASN (ácido graso-sintasa), FGF1 (factor de crecimiento fibroblástico 1 (ácido)), F11 (factor de coagulación XI), ATP7A (ATPasa, transportadora de Cu++, polipéptido alfa), CR1 (receptor 1 del componente del complemento (3b/4b) (grupo sanguíneo Knops)), GFAP (proteína ácida fibrilar glial), ROCK1 (asociada a Rho, proteína cinasa 1 que contiene superhélice), MECP2 (proteína 2 de unión a metil CpG (síndrome de Rett)), MYLK (cinasa de la cadena ligera de la miosina), BCHE (butirilcolinesterasa), LIPE (lipasa, sensible a hormonas), PRDX5 (peroxirredoxina 5), ADORA1 (receptor de adenosina A1), WRN (síndrome de Werner, tipo helicasa RecQ), CXCR3 (receptor 3 de quimiocinas (motivo C-X-C)), CD81 (molécula CD81), SMAD7 (miembro 7 de la familia SmAD), La Mc 2 (laminina, gamma 2), MAP3K5 (proteína cinasa activada por mitógenos cinasa cinasa 5), CHGA (cromogranina A (proteína secretora 1 paratiroidea)), IAPP (amilina), RHO (rodopsina), ENPP1 (ectonucleótido-pirofosfatasa/fosfodiesterasa 1), PTHLH (hormona similar a la hormona paratiroidea), NRG1 (neurregulina 1), VEGFC (factor de crecimiento endotelial vascular C), ENPEP (glutamil-aminopeptidasa (aminopeptidasa A)), CEBPB (CCAT/proteína de unión potenciadora (C/EBP), beta), NAGLU (N-acetilglucosaminidasa, alfa), F2RL3 (3 similar al receptor del factor de coagulación II (trombina)), CX3CL1 (ligando quimiocina 1 (motivo C-X3-C)), BDKRB1 (receptor B1 de bradiquinina), ADAMTS13 (metalopeptidasa ADAM con motivo de tipo 1 de trombospondina, 13), ELANE (elastasa, expresada en neutrófilos), ENPP2 (ectonucleótido-pirofosfatasa/fosfodiesterasa 2), CISH (proteína que contiene SH2 inducible por citocinas), GAST (gastrina), MYOC (miocilina, respuesta de glucocorticoides inducible de la red trabecular), ATP1A2 (ATPasa, transportador de Na+/K+, polipéptido alfa 2), NF1 (neurofibromina 1), GJB1 (proteína de unión comunicante, beta 1, 32 kDa), MEF2A (factor 2A potenciador de miocitos), VCL (vinculina), BMPR2 (proteína receptora morfogenética ósea, tipo II (serina/treonina-cinasa)), TUBB (tubulina, beta), CDC42 (ciclo 42 de la división celular (proteína de unión a GTP, 25 kDa)), KRT18 (keratina 18), HSF1 (factor de transcripción 1 de choque térmico), MYB (homólogo del oncogen vírico de mieloblastosis v-myb (aviar)), PRKAA2 (proteína-cinasa, activada por AMP, subunidad catalítica alfa 2), ROCK2 (proteína cinasa 2 que contiene superhélice, asociada a Rho), TFPI (inhibidor de la ruta del factor tisular (inhibidor de la coagulación asociado con lipoproteína)), PRKG1 (proteína cinasa, dependiente de GMPc, tipo I), BMP2 (proteína 2 morfogenética ósea), CTNND1 (catenina (proteína asociada a la cadherina), delta 1), CTH (cistationasa (cistationina gamma-liasa)), CTSS (catepsina S), VAV2 (factor de intercambio del nucleótido de guanina vav 2), NPY2R (receptor del neuropéptido Y Y2), IGFBP2 (proteína de unión 2 al factor de crecimiento insulínico, 36 kDa), CD28 (molécula CD28), GSTA1 (glutatión S-transferasa alfa 1), PPIA (peptidilprolil isomerasa A (ciclofilina A)), APOH (apolipoproteína H (beta-2-glucoproteína I)), S100A8 (S100 proteína de unión a calcio A8), IL11 (interleucina 11), ALOX15 (araquidonato 15-lipoxigenasa), FBLN1 (fibulina 1), NR1H3 (subfamilia 1 del receptor nuclear, grupo H, miembro 3), SCD (estearoil-CoA desaturasa (delta-9-desaturasa)), GIP (polipéptido inhibidor gástrico), CHGB (cromogranina B (secretogranina 1)), PRKCB (proteína cinasa C, beta), SRD5A1 (esteroide-5-alfa-reductasa, polipéptido 1 alfa (3-oxo-5 alfa-esteroide delta 4-deshidrogenasa alfa 1)), HSD11B2 (hidroxiesteroide (11-beta) deshidrogenasa 2), CALCRL (similar al receptor de calcitonina), GALNT2 (UDP-W-acetilalfa-D-galactosamina:polipéptido W-acetilgalactosaminiltransferasa 2 (GalNAc-T2)), ANGPTL4 (4 tipo angiopoyetina), KCNN4 (canal de potasio intermedio/pequeño activado por conductancia de calcio, subfamilia N, miembro 4), PIK3C2A (fosfoinositido-3-cinasa, clase 2, polipéptido alfa), HBEGF (factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina), CYP7A1 (citocromo P450, familia 7, subfamilia A, polipéptido 1), HLA-DRB5 (complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DR beta 5), BNIP3 (BCL2/proteína 3 de interacción con la proteína de adenovirus E1B de 19 kDa), GCKR (regulador de glucocinasa (hexocinasa 4)), S100A12 (S100 proteína de unión a calcio A12), PADI4 (peptidil arginina-desiminasa, tipo IV), HSPA14 (proteína 14 de 70 kDa de choque térmico), CXCR1 (receptor 1 de quimiocinas (motivo C-X-C)), H19 (H19, transcrito expresado por vía materna sellado (proteína no codificante)), KRTAP19-3 (proteína 19-3 asociada a la queratina), IDDM2 (diabetes mellitus 2 dependiente de insulina), RAC2 (sustrato 2 de la toxina botulínica C3 relacionado con ras (familia rho, proteína Rac2 pequeña de unión a GTP)), RYR1 (receptor 1 de rianodina (esquelética)), CLOCK (homólogo de clock (ratón)), NGFR (receptor del factor de crecimiento nervioso (superfamilia TNFR, miembro 16)), DBH (dopamina beta-hidroxilasa (dopamina betamonooxigenasa)), CHRNA4 (receptor colinérgico, nicotínico, alfa 4), CACNA1C (canal de calcio, dependiente de voltaje, tipo L, subunidad alfa 1C), PRKAG2 (proteína cinasa, activada por AMP, subunidad no catalítica gamma 2), CHAT (colina acetiltransferasa), PTGDS (prostaglandina D2 sintasa 21 kDa (cerebro)), NR1H2 (subfamilia 1 del receptor nuclear, grupo H, miembro 2), TEK (TEK tirosina-cinasa, endotelial), VEGFB (factor de crecimiento endotelial vascular B), MEF2C (factor 2C potenciador de miocitos), MAPKAPK2 (proteína cinasa 2 activada por la proteína cinasa activada por mitógenos), TNFRSF11A (superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 11a, activador de NFKB), HSPA9 (proteína 9 de 70 kDa de choque térmico (mortalina)), CYSLTR1 (receptor 1 de cisteinil leucotrieno), MAT1A (metionina adenosiltransferasa I, alfa), OPRL1 (1 similar al receptor de opiáceos), IMPA1 (inositol(mio)-1(o 4)-monofosfatasa 1), CLCN2 (canal de cloruro 2), DLD (dihidrolipoamida deshidrogenasa), PSMA6 (subunidad proteasoma (prosoma, complejo endopeptidásico multicatalítico), tipo alfa, 6), PSMB8 (subunidad proteasoma (prosoma, complejo endopeptidásico multicatalítico), tipo beta, 8 (peptidasa multifuncional grande 7)), CHI3L1 (1 similar a la quitinasa 3 (glucoproteína del cartílago-39)), ALDH1B1 (familia de aldehído deshidrogenasa 1, miembro B1), PARP2 (polimerasa 2 poli (ADP-ribosa)), STAR (proteína reguladora aguda esteroidogénica), LBP (proteína de unión a lipopolisacáridos), ABCC6 (casete de unión a ATP, subfamilia C(CFTR/MRP), miembro 6), rGs 2 (regulador de la señalización de la proteína G, 24 kDa), EFNB2 (efrina-B2), GJB6 (proteína de unión comunicante, beta 6, 30 kDa), APOA2 (apolipoproteína A-II), AMPD1 (adenosina monofosfato desaminasa 1), DYSF (disferlina, distrofia muscular de la cintura y extremidades 2B (recesiva autosómica)), FDFT1 (farnesil-difosfato farnesiltransferasa 1), EDN2 (endotelina 2), CCR6 (receptor de la quimiocina 6 (motivo C-C)), GJB3 (proteína de unión comunicante, beta 3, 31 kDa), IL1RL1 (1 similar al receptor de interleucina 1), ENTPD1 (ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa 1), BBS4 (síndrome de Bardet-Biedl 4), CELSR2 (cadherina, receptor 2 de tipo G de siete pasos EFG LAG (homólogo del flamenco, Drosophila)), F11R (receptor F11), RAPGEF3 (factor de intercambio 3 de nucleótido de guanina Rap (GEF) 3), HYAL1 (hialuronoglucosaminidasa 1), ZNF259 (proteína 259 con dedos de zinc), ATOX1 (ATX1 homólogo de la proteína 1 antioxidante (levaduras)), ATF6 (factor de transcripción activador 6), KHK (ketohexocinasa (fructocinasa)), SAT1 (espermidina/espermina N1-acetiltransferasa 1), GGH (gamma-glutamil hidrolasa (conjugasa, folilpoligammaglutamil hidrolasa)), TIMP4 (TIMP inhibidor 4 de metalopeptidasas), SLC4A4 (familia 4 portadora de solutos, cotransportador de bicarbonato de sodio, miembro 4), PDE2A (fosfodiesterasa 2A, estimulada por GMPc), PDE3B (fosfodiesterasa 3B, inhibida por GMPc), FADS1 (ácido graso-desaturasa 1), FADS2 (ácido graso-desaturasa 2), TMSB4X (timosina beta 4, ligada al cromosoma X), TXNIP (proteína de interacción con tiorredoxina), LIMS1 (dominios 1 similares al antígeno celular de senescencia y LIM), RHOB (familia de genes homólogos a ras, miembro B), LY96 (antígeno linfocítico 96), FOXO1 (secuencia cabeza de tenedor (forkhead) O1), PNPLA2 (2 que contiene el dominio fosfolipasa similar a patatina), TRH (hormona liberadora de tirotropina), GJC1 (proteína de unión comunicante, gamma 1,45 kDa), SLC17A5 (familia 17 portadora de solutos (transportador de aniones/azúcares), miembro 5), FTO (asociada a la masa grasa y obesidad), GJD2 (proteína de unión comunicante, delta 2, 36 kDa), PSRC1 (superhélice 1 rica en prolina/serina), CASP12 (caspasa 12 (gen/pseudogén)), GPBAR1 (bilis y receptor 1 acoplado a la proteína G), PXK (serina/treonina-cinasa que contiene un dominio PX), IL33 (interleucina 33), TRIB1 (homólogo 1 de tribbles (Drosophila)), PBX4 (homeosecuencia 4 de leucemia de pre-linfocitos B), NUPR1 (proteína nuclear, regulador transcriptional, 1), 15-Sep(selenoproteína de 15 kDa), CILP2 (proteína 2 de la capa intermedia del cartílago), TERC (ARN componente de la telomerasa), GGT2 (gamma-glutamiltransferasa 2), MT-CO1 (citocromo c oxidasa I codificada mitocondrialmente) y UOX (urato-oxidasa, pseudogén).
En una realización adicional, la secuencia cromosómica se podrá seleccionar adicionalmente entre Pon1 (paraoxonasa 1), LDLR (receptor de LDL), ApoE (Apolipoproteína E), Apo B-100 (Apolipoproteína B-100), ApoA (Apolipoproteína (a)), ApoA1 (Apolipoproteína A1), CBS (Cistatión B-sintasa), glucoproteína IIb/IIb, MTHRF (5,10-metilentetrahidrofolato-reductasa (NADPH) y combinaciones de estos. En una iteración, las secuencias cromosómicas y las proteínas codificadas por las secuencias cromosómicas implicadas en las enfermedades cardiovasculares se podrán escoger entre Cacna1C, Sod1, Pten, Ppar(alfa), ApoE, Leptina y combinaciones de estas.
Riñones
La presente divulgación también contempla el suministro del sistema CRISPR-Cas al riñón. Las estrategias de suministro para inducir la captación celular del ácido nucleico terapéutico incluyen la fuerza física o sistemas vectoriales tales como suministro con virus, lípidos o complejos o nanoportadores. Desde las aplicaciones iniciales con una posible relevancia clínica menor, cuando se presentaron los ácidos nucleicos a las células renales sistémicamente con una inyección hidrodinámica a presión elevada, ya se han aplicado una amplia gama de portadores teropéuticos no víricos y víricos génicos para actuar sobre eventos postranscripcionales en diferentes modelos de enfermedad renal en animales in vivo (Csaba Révész y Péter Hamar (2011). Delivery Methods to Target RNAs in the Kidney, Gene Therapy Applications, Prof. Chunsheng Kang (Ed.), ISBN: 978-953-307-541-9, InTech, se puede consultar en: http://www.intechopen.com/books/gene-therapy-applications/delivery-methods-to-target-rnas-inthe-kidney). Los métodos de suministro al riñón se resumen de la siguiente manera:
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Yuan et al. (Am J Physiol Renal Physiol 295: F605-F617, 2008) estudiaron si el suministro in vivo de ARN interferentes pequeños (ARNip) cuya diana es la ruta 12/15-lipoxigenasa (12/15-LO) del metabolismo del ácido araquidónico puede mejorar la lesión renal y la nefropatía diabética (DN, por sus siglas en inglés) en modelo de diabetes de tipo 1 en ratones a los que se ha inyectado estreptozotocina. Para lograr un mayor acceso in vivo y expresión de ARNip en el riñón, Yuan et al., utilizaron oligonucleótidos ARNip contra 12/15-LO bicatenarios conjugados con colesterol. Se inyectaron aproximadamente 400 pg de ARNip subcutáneamente a los ratones. El método de Yuang et al. se podrá aplicar al sistema CRISPR Cas, donde se contempla una inyección subcutánea de 1-2 g de CRISPR Cas conjugado con colesterol a un ser humano para el suministro a los riñones.
Molitoris et al. (J Am Soc Nephrol 20: 1754-1764, 2009) utilizan células tubulares proximales (PTC, por sus siglas en inglés), como el sitio de reabsorción de oligonucleótidos dentro del riñón para estudiar la eficacia de ARNip cuya diana es p53, una proteína esencial en la ruta apoptótica, para prevenir la lesión en el riñón. El ARNip contra p53 sintético desnudo inyectado por vía intravenosa 4 h después de la lesión isquémica protegió de manera máxima tanto las PTC como la función renal. Los datos de Molitoris et al. indican que el suministro rápido de ARNip a las células tubulares proximales sigue a la administración intravenosa. Para los análisis de dosis-respuesta, se inyectaron las ratas con dosis de P53ip, se administraron 0.33; 1,3 o 5mg/kg en los mismos cuatro puntos temporales lo que dio como resultado dosis acumulativas de 1.32; 4, 12 y 20 mg/kg, respectivamente. Todas las dosis de ARNip estudiadas produjeron un efecto reductor de SCr el día uno donde las dosis más elevadas fueron eficaces a lo largo de aproximadamente cinco días en comparación con ratas de control isquémicas tratadas con PBS. Las dosis acumulativas de 12 y 20 mg/kg proporcionaron el mejor efecto protector. El método de Molitoris et al. se podrá aplicar al sistema CRISPR Cas, donde se contemplan dosis acumulativas de 12 y 20 mg/kg a un ser humano para el suministro a los riñones.
Thompson et al. (Nucleic Acid Therapeutics, Volumen 22, Número 4, 2012) publican las propiedades toxicológicas y farmacocinéticas de los ARN I5NP interferentes pequeños sintéticos tras la administración intravenosa en roedores y primates no humanos. I5NP está diseñado para actuar mediante la ruta de interferencia por ARN (iARN) para inhibir temporalmente la expresión de la proteína pro-apoptótica p53 y se está desarrollando para proteger las células de las lesiones por isquemia aguda/reperfusión tales como la lesión renal aguda que puede ocurrir durante la cirugía cardiaca mayor y función del injerto retrasada que puede ocurrir tras el trasplante renal. Se requirieron dosis de 800 mg/kg de I5NP en roedores y de 1000 mg/kg de I5NP en primates no humanos para suscitar efectos adversos, que en los monos se relacionaron de manera aislada con efectos directos en la sangre que incluyeron una activación subclínica del complemento y un ligero incremento de los tiempos de coagulación. En las ratas, no se observaron efectos adversos adicionales con un análogo de I5NP para ratas, lo que indica que los efectos representan probablemente efectos de clase de ARN sintético bicatenario más que la toxicidad relacionada con la actividad farmacológica prevista de I5NP. En conjunto, estos datos respaldan la prueba clínica de la administración intravenosa de I5NP para preservar la función renal tras la lesión por isquemia aguda/reperfusión. La concentración máxima sin efecto adverso observado (NOAEL, por sus siglas en inglés) en los monos fue de 500 mg/kg. No se observaron efectos en los parámetros cardiovasculares, respiratorios y neurológicos en monos tras la administración i.v. con niveles de dosis de hasta 25 mg/kg. Por lo tanto, se podrá contemplar una dosificación similar para la administración intravenosa de CRISPR Cas a los riñones de un ser humano.
Shimizu et al. (J Am Soc Nephrol 21: 622-633, 2010) desarrollaron un sistema para el suministro dirigido de ARNip a los glomérulos mediante vehículos de poli(etilenglicol)-poli(L-lisina). El complejo ARNip/nanoportador tuvo un diámetro de aproximadamente 10-20 nm, un tamaño que le permitiría moverse a través del endotelio con microporos para acceder al mesangio. Tras la inyección intraperitoneal de complejos de ARNip marcado con fluorescencia/nanoportador, Shimizu et al. detectaron ARNip en la circulación sanguínea durante un tiempo prolongado. La administración intraperitoneal repetida de un complejo ARNip contra una proteína cinasa 1 activada por mitógenos (MAPK1)/nanoportador suprimió el ARNm de MAPK1 glomerular y la expresión de proteínas en un modelo de glomerulonefritis en ratones. Para el estudio de la acumulación de ARNip, se administraron a ratones BALB-c ARNip marcados con Cy5 complejados con nanoportadores de PIC (0.5 mL, 5 nmol de contenido de ARNip), ARNip marcados con Cy5 desnudos (0.5 mL, 5 nmol) o ARNip marcados con Cy5 encapsulados en HVJ-E (0.5 mL, 5 nmol de contenido de ARNip). El método de Shimizu et al. se podrá aplicar al sistema CRISPR Cas, donde se contempla una dosis de aproximadamente 10-20 pmol de CRISPR Cas complejado con nanoportadores en aproximadamente 1-2 litros para la administración intraperitoneal y el suministro a los riñones en un ser humano.
Pulmones
La presente divulgación también contempla el suministro del sistema CRISPR-Cas a uno o ambos pulmones.
Aunque los vectores derivados de AAV-2 se propusieron en un primer lugar para el suministro de CFTR a las vías respiratorias con CF, otros serotipos tales como AAV-1, AAV-5, AAV-6 y AAV-9 mostraron una eficacia de transferencia génica mejorada en varios modelos del epitelio pulmonar (remítase a, p. ej., Li et al., Molecular Therapy, vol. 17 n.° 12, 2067-2077 diciembre de 2009). Se demostró que AAV-1 era ~100 veces más eficaz que AAV-2 y AAV-5 para transducir células del epitelio de las vías respiratorias humanas in vitro,5 aunque AAV-1 transdujo el epitelio de las vías respiratorias traqueales de murino in vivo con una eficacia igual a la de a Av -5. Otros estudios han mostrado que AAV-5 es 50 veces más eficaz que AAV-2 en el suministro génico al epitelio de las vías respiratorias humanas (HAE, por sus siglas en inglés) in vitro y significativamente más eficaz en el epitelio de las vías respiratorias pulmonares de ratón in vivo. También se ha demostrado que AAV-6 es más eficaz que Aa V-2 en las células epiteliales de las vías respiratorias humanas in vitro y en las vías respiratorias murinas in vivo.8 Se ha demostrado que el aislado más reciente, AAV-9, muestra una eficacia de transferencia génica mayor que AAV-5 en epitelio alveolar y nasal murino in vivo donde se detectó expresión génica durante más de 9 meses, lo que sugiere que AAV podrá posibilitar la expresión génica a largo plazo in vivo, una propiedad deseable para un vector de suministro génico de CFTR. Además, se ha demostrado que AAV-9 se podría volver a administrar al pulmón murino sin que haya pérdida de la expresión de CFTR y con consecuencias inmunitarias mínimas. Los cultivos de HAE de CF y no CF se podrán inocular en la superficie apical con 100 pL de vectores de AAV durante horas (remítase a, p. ej., Li et al., Molecular Therapy, vol. 17 n.° 12, 2067-2077 diciembre de 2009). El MOI podrá variar entre 1 x 103 a 4 x 105 genomas de vector/célula, dependiendo de la concentración del virus y objetivos de los experimentos. Se contemplan los vectores citados anteriormente para el suministro y/o administración.
Zamora et al. (Am J Respir Crit Care Med Vol 183. págs. 531-538, 2011) publicaron un ejemplo de la aplicación de una interferencia por ARN terapéutica para el tratamiento de una enfermedad infecciosa humana y también un ensayo aleatorizado de un fármaco antivírico en receptores de trasplante de pulmón infectados con el virus sincitial respiratorio (RSV, por sus siglas en inglés). Zamora et al. realizaron un ensayo controlado con placebo, con enmascaramiento doble, aleatorizado en receptores de LTX con infección en el aparato respiratorio por RSV. Se permitió que los pacientes recibieran el tratamiento asistencial habitual para RSV. Se administró placebo o ALN-RSV01 aerosolizado (0.6 mg/kg) a diario durante 3 días. Este estudio demuestra que una ARNi terapéutica cuya diana sea RSV se puede administrar de manera segura a receptores de LTX con infección por RSV. Tres dosis diarias de ALN-RSV01 no dieron como resultado ninguna exacerbación de los síntomas del aparato respiratorio ni deterioro de la función pulmonar y no exhibieron ningún efecto proinflamatorio sistémico, tal como inducción de citocinas o CRP. Los estudios farmacocinéticos muestran únicamente una exposición sistémica transitoria, baja tras la inhalación, coherente con los datos preclínicos en animales que mostraron que ALN-RSV01, administrado por vía intravenosa o por inhalación, se elimina rápidamente de la circulación mediante digestión mediada por exonucleasas y excreción renal. El método de Zamora et al. se podrá aplicar al sistema CRISPR Cas y para la presente invención se podrá contemplar un CRISPR Cas aerosolizado, por ejemplo, con una dosificación de 0.6 mg/kg.
Para consultar un ejemplo del ARN guía quimérico CFTRdelta508 remítase al Ejemplo 22, que muestra una transferencia génica o suministro génico de un sistema CRISPR-Cas en las vías respiratorias de un sujeto o un paciente que lo necesite, aquejado de fibrosis quística o de síntomas relacionados con la fibrosis quística (CF), utilizando partículas de un virus adenoasociado (aAv ). En particular, se ejemplifica una estrategia de reparación para la mutación delta F508 de la fibrosis quística. Este tipo de estrategia se debería aplicar a todos los organismos. Refiriéndose en particular a la CF, los pacientes adecuados podrán incluir: Seres humanos, primates no humanos, cánidos, félidos, bóvidos, équidos y otros animales domésticos. En este caso, los solicitantes utilizaron un sistema CRISPR-Cas que comprende una enzima Cas9 que tuviera como diana deltaF508 u otras mutaciones inductoras de CFTR.
Los sujetos tratados en este caso recibieron una cantidad farmacéuticamente eficaz de un sistema vectorial de AAV aerosolizado por pulmón suministrado endobronquialmente mientras respiraban de manera espontánea. En este sentido, se prefiere el suministro aerosolizado para el suministro de AAV en general. Se podrá utilizar un adenovirus o una partícula de AAV para el suministro. Los constructos génicos adecuados, cada uno ligado operablemente a una o más secuencias reguladoras, se podrán clonar e introducir en el vector de suministro. En este caso, se proporcionan los siguientes constructos como ejemplos: Promotor EF1a o Cbh para Cas9, promotor H1 o U6 para ARN guía quimérico): Una disposición preferida consiste en utilizar una guía quimérica cuya diana sea CFTRdelta508, un molde de reparación para la mutación deltaF508 y una enzima Cas9 con codones optimizados (las Cas9 preferidas son aquellas con actividad nucleasa o nickasa) con opcionalmente una o más señales o secuencias (NLS) de ubicación nuclear, p. ej., dos (2) NLS. También se conciben constructos sin NLS.
Con el fin de identificar el sitio diana de Cas9, los solicitantes analizaron el locus genómico de CFTR humano e identificaron el sitio diana de Cas9. Preferentemente, en general y en este caso de CF, la PAM podrá contener un motivo NGG o NNAGAAW.
En consecuencia, en el caso de la CF, el método de la presente comprende la manipulación de una secuencia diana en un locus genómico de interés que comprende
suministrar una composición que no tiene origen natural o modificada que comprende un sistema vectorial vírico que comprende uno o más vectores víricos que codifican operablemente una composición para su expresión, donde la composición comprende:
una composición que no tiene origen natural o modificada que comprende un sistema vectorial que comprende uno o más vectores que comprenden
I. un primer elemento regulador ligado operablemente a una secuencia polinucleotídica de ARN quimérico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, donde la secuencia polinucleotídica comprende
(a) una secuencia guía capaz de hibridarse con la secuencia diana de CF en una célula de mamíferos adecuada, (b) una secuencia pareja de tracr, y
(c) una secuencia tracr, y
II. un segundo elemento regulador ligado operablemente a una secuencia codificante de enzimas que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de ubicación nuclear,
donde (a), (b) y (c) se disponen en una orientación de 5' a 3',
donde los componentes I y II están ubicados en el mismo vector o en diferentes vectores del sistema,
donde, cuando se transcriben, la secuencia pareja de tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica respecto a la secuencia de un complejo CRISPR con la secuencia diana, y
donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia pareja de tracr que se hibrida con la secuencia tracr. En lo que respecta a la CF, las secuencias de a Dn diana preferidas comprenden la mutación CFTRdelta508. Anteriormente se ha descrito una PAM preferida. Una enzima CRISPR preferida es cualquier Cas (descrita en la presente, pero particularmente la descrita en el Ejemplo 22).
Las alternativas a CF incluyen cualquier trastorno genético y los ejemplos de estos son muy conocidos. Otro método o uso preferido es uno que corrija defectos en los genes EMP2A y EMP2B cuya asociación con la enfermedad de Lafora se ha identificado.
En algunas realizaciones, una "secuencia guía" podrá ser diferente de un "ARN guía". Una secuencia guía se podrá referir a una secuencia de aprox. 20 pb dentro del ARN guía que especifique el sitio diana.
En algunas realizaciones, la Cas9 es (o se obtiene a partir de) SpCas9. En tales realizaciones, las mutaciones preferidas están en una cualquiera de las posiciones 10, 762, 840, 854, 863 y/o 986 de SpCas9, o en todas ellas, o en las posiciones correspondientes en otras Cas9 (que se podrán determinar, por ejemplo, mediante las herramientas de comparación de secuencias habituales. En particular se prefiere cualquiera de las siguientes mutaciones, o todas ellas, en SpCas9: D10A, E762A, H840A, N854A, N863A y/o D986A; así como también se contempla la sustitución conservadora de cualquiera de los aminoácidos de reemplazo. También se prefieren estas mismas (o sustituciones conservadoras de estas mutaciones) en las posiciones correspondientes de otras Cas9. Son particularmente preferidas D10 y H840 en SpCas9. Sin embargo, en otras Cas9, también se prefieren los residuos que corresponden a SpCas9 D10 y H840. Estas son convenientes ya que proporcionan actividad nickasa. Se podrán aplicar este tipo de mutaciones a todos los aspectos de la presente invención, no solamente al tratamiento de CF.
Schwank et al. (Cell Stem Cell, 13:653-58, 2013) utilizaron CRISPR/Cas9 para corregir un defecto asociado con la fibrosis quística en células madre humanas. El objetivo del equipo fue el gen para un canal iónico, receptor conductor transmembrana de la fibrosis quística (CFTR, por sus siglas en inglés). Una deleción en CFTR provoca que la proteína se pliegue de manera errónea en pacientes con fibrosis quística. Utilizando células madre intestinales cultivadas desarrolladas a partir de muestras celulares procedentes de dos niños con fibrosis quística, Schwank et al., fueron capaces de corregir el defecto utilizando CRISPR junto con un plásmido donante que contenía la secuencia reparadora que se iba a insertar. Los investigadores cultivaron posteriormente las células para obtener "organoides" intestinales, o intestinos en miniatura, y mostraron que funcionaban normalmente. En este caso, aproximadamente la mitad de los organoides clonales experimentaron la corrección genética oportuna.
Músculos
La presente divulgación también contempla el suministro del sistema CRISPR-Cas a uno o más músculos.
Bortolanza et al. (Molecular Therapy vol. 19 n.° 11, 2055-2064 noviembre de 2011) muestra que el suministro sistémico de los casetes de expresión de interferencia por ARN en el FRG1 de ratón, tras el inicio de la distrofia muscular fascioescapulohumeral (FSHD), conllevó una atenuación génica de FRG1 a largo plazo dependiente de la dosis sin señales de toxicidad. Bortolanza et al. observaron que una inyección intravenosa única de 5 x 1012 gv de rAAV6-sh1FRG1 repara la histopatología muscular y la función muscular de ratones FRG1. De manera más detallada, se inyectaron 200 pL que contenían 2 x 1012 o 5 x 1012 gv de vector en solución fisiológica en la vena de la cola utilizando una jeringa Terumo con un calibre 25. Se podrá aplicar el método de Bortolanza et al. a un AAV que exprese CRISPR Cas e inyectarlo en seres humanos con una dosificación de aproximadamente 2 x 1015 o 2 x 1016 gv de vector.
Dumonceaux et al. (Molecular Therapy vol. 18 n.° 5, 881-887 mayo de 2010) inhibieron la ruta de la miostatina utilizando la técnica de interferencia por ARN dirigida contra el ARNm del receptor AcvRIIb de miostatina (sh-AcvRIIb). La restauración de una cuasidistrofina estuvo mediada por la técnica para omitir exones U7 vectorizada (U7-DYS). Los vectores adenoasociados que portan el constructo sh-AcvrIIb solo, el constructo U7-DYS solo o una combinación de ambos constructos se inyectaron en el músculo tibial posterior (TA, por sus siglas en inglés) de ratones mdx distróficos. Las inyecciones se realizaron con 1011 genomas víricos de AAV. Se podrá aplicar el método de Dumonceaux et al. a un AAV que exprese CRISPR Cas e inyectarlo en seres humanos con, por ejemplo, una dosificación de aproximadamente 1014 a aproximadamente 1015 gv de vector.
Kinouchi et al. (Gene Therapy (2008) 15, 1126-1130) publican la eficacia de un suministro de ARNip in vivo al músculo esquelético de ratones normales o enfermos mediante la formación de nanopartículas de ARNip no modificados químicamente con atelocolágeno (ATCOL). La aplicación localizada mediada por ATCOL de ARNip cuya diana es la miostatina, un regulador negativo del crecimiento del músculo esquelético, en músculos esqueléticos de ratón o por vía intravenosa, provocó un incremento notable en la masa muscular pocas semanas después de la aplicación. Estos resultados dan a entender que la aplicación mediada por ATCOL de ARNip es una herramienta poderosa para un futuro uso terapéutico en enfermedades incluida la atrofia muscular. Se mezclaron Mst-ARNip (concentración final, 10 mM) con ATCOL (concentración final para la administración localizada, 0.5%) (AteloGene, Kohken, Tokio, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de anestesiar ratones (machos C57BL/6 de 20 semanas de edad) mediante Nembutal (25 mg/kg, i.p.), el complejo Mst-ARNip/ATCOL se inyectó en los músculos masetero y bíceps femoral. Se podrá aplicar el método de Kinouchi et al. a un CRISPR Cas e inyectarlo en un ser humano con, por ejemplo, una dosificación de aproximadamente 500 a 1000 mL de una solución 40 pM en el músculo.
Hagstrom et al. (Molecular Therapy Vol. 10, N.° 2, agosto de 2004) describen una metodología intravascular, no vírica que permite el suministro eficaz y reproducible de ácidos nucleicos a las células musculares (miofibras) a través de los músculos de las extremidades de los mamíferos. El procedimiento conlleva la inyección de ARNip o ADN plasmídico desnudo en una vena distal de una extremidad que se aísla temporalmente mediante un torniquete o un manguito de esfingomanómetro. El suministro del ácido nucleico a las miofibras está facilitado por su inyección rápida en un volumen suficiente para permitir la extravasación de la solución de ácido nucleico en el tejido muscular. Se lograron niveles elevados de la expresión del transgén en el músculo esquelético tanto en animales pequeños como grandes con una toxicidad mínima. También se obtuvo evidencia del suministro de ARNip a los músculos de las extremidades. Para la inyección intravenosa de ADN plasmídico en un mono rhesus, se conectó una llave de paso de tres vías a dos bombas de jeringa (Modelo PHD 2000; Harvard Instruments), cada una equipada con una jeringa única. Cinco minutos después de una inyección de papaverina, se inyectó ADNp (de 15.5 a 25.7 mg en 40-100 mL de solución salina) con una velocidad de 1.7 o 2.0 mL/s. Esta escala se pudo aumentar para ADN plasmídico que expresaba CRISPR Cas con una inyección de aproximadamente 300 a 500 mg en 800 a 2000 mL de solución salina para un ser humano. Paras las inyecciones del vector adenovírico en una rata, se inyectaron 2 x 109 partículas infecciosas en 3 mL de solución salina normal (NSS, por sus siglas en inglés). Esta escala se pudo aumentar para un vector adenovírico que expresaba CRISPR Cas con una inyección de aproximadamente 1 x 1013 partículas infecciosas que se inyectaron en 10 litros de NSS para un ser humano. Para el ARNip, se inyectaron 12.5 pg de un ARNip en la vena safena interna de una rata y se inyectaron 750 pg de un ARNip en la vena safena interna de un primate. Esta escala se pudo aumentar para un CRISPR Cas, por ejemplo, con una inyección de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 mg en la vena safena interna de un ser humano.
Piel
La presente divulgación también contempla el suministro del sistema CRISPR-Cas a la piel.
Hickerson et al. (Molecular Therapy—Nucleic Acids (2013) 2, e129) se refiere a un dispositivo de suministro a la piel con una matriz de microagujas motorizado para suministrar ARNip-(as) autosuministrable a la piel humana y murina. El desafío principal para adaptar los tratamientos de la piel con ARNip al ámbito de la atención sanitaria es el desarrollo de sistemas de suministro eficaces. Se han invertido esfuerzos sustanciales en varias tecnologías de suministro a la piel con un éxito limitado. En un estudio clínico en el que se trató la piel con ARNip, el dolor insufrible asociado con la inyección con una aguja hipodérmica imposibilitó la participación de pacientes adicionales en el ensayo, y resaltó cuán necesarias son estrategias de suministro mejoradas, más "cómodas para el paciente" (es decir, sin dolor o con poco dolor). Las microagujas representan una vía eficaz de suministrar cargamentos cargados grandes que incluyen ARNip a través de la barrera primaria, la capa córnea, y se consideran en general como menos dolorosas que las agujas hipodérmicas convencionales. Se ha demostrado que los dispositivos de microagujas de "tipo sello" motorizados, incluido el dispositivo de matriz de microagujas motorizado (MMNA, por sus siglas en inglés) utilizado por Hickerson et al., son seguros en estudios en ratones sin pelo y no causaron dolor, o muy poco, como lo evidencia (i) el uso extendido en la industria cosmética y (ii) la prueba limitada en la que casi todos los voluntarios encontraron el uso del dispositivo mucho menos doloroso que una inyección de la gripe, lo que sugiere que el suministro de ARNip utilizando este dispositivo conllevará mucho menos dolor del que se experimentó en los ensayos clínicos previos utilizando inyecciones con una agua hipodérmica. El dispositivo MMNA (comercializado como Triple-M o Tri-M por Bomtech Electronic Co, Seúl, Corea del Sur) se adaptó para el suministro de ARNip a piel de un ser humano y de ratón. Se introdujo una solución de ARNip-as (hasta 300 pL de 0.1 mg/mL de ARN) en la cámara de un cartucho de aguja Tri-M desechable (Bomtech), que se ajustó a una profundidad de 0.1 mm. Para tratar la piel humana, se estiró manualmente piel desidentificada (obtenida justo después de procedimientos quirúrgicos) y se clavó a una plataforma de corcho antes del tratamiento. Se realizaron inyecciones intradérmicas utilizando una jeringa de insulina con una aguja de 0.5 pulgadas de calibre 28. El dispositivo MMNA y el método de Hickerson et al. se podrían utilizar y/o adaptar para suministrar el CRISPR Cas, por ejemplo, con una dosificación de hasta 300 pL de 0.1 mg/mL de CRISPR Cas a la piel.
Leachman et al. (Molecular Therapy, vol. 18 no. 2, 442-446 Feb. 2010) se refiere a un ensayo clínico de fase Ib para el tratamiento del trastorno raro de la piel paquioniquia congénita (PC), un síndrome dominante autosómico que incluye un keratoderma plantar inhabilitante, que utiliza el primer tratamiento con ARN interferente pequeño (ARNip) para la piel. Este ARNip, denominado TD101, que tiene como diana potente y específicamente el ARNm mutante N171K de queratina 6a (K6a) sin afectar al ARNm de K6a no modificado. A continuación se muestra la programación para el aumento escalonado de la dosis:
Concentración de Dosis total de
Semana Dosis n.° Días Volumen (mL) TD101 (mg/mL) TD101 (mg)
i 1 -2 1 -7 0.1 1.0 0.10
2 3 -4 8 -14 0.25 1.0 0.25
3 5 -6 15 -21 050 1.0 0.50
4 7 -8 22 -28 1.0 1.0 1.0
5 9 -10 29 -35 1.5 1.0 15
6 11-12 36 -42 2.0 1.0 2.0
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Inlclalmente, se administraron 0.1 mL de una solución de 1.0 mg/mL de TD101 o vehículo solo (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio ni magnesio) a los callos simétricos. Se completaron seis volúmenes de dosis crecientes sin reacciones adversas frente a los incrementos: 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 mL de una solución de 1.0 mg/mL de solución de TD101 por inyección. Como el volumen previsto más elevado (2.0 mL) se toleró bien, se incrementó a continuación la concentración de TD101 cada semana desde 1 mg/mL hasta una concentración final de 8.5 mg/mL. Se contemplan dosificaciones similares para la administración de un CRISPR Cas que tiene como diana potente y específicamente el ARNm mutante N171K de la queratina 6a (K6a).
Zheng et al. (PNAS, 24 de julio de 2012, vol. 109, n.° 30, 11975-11980) muestra que los conjugados de nanopartículas con ácido nucleico esféricas (SNA-NC, por sus siglas en inglés), núcleos de oro rodeados por una coraza densa de un ARNip inmovilizado covalentemente, sumamente orientado, penetran libremente en casi un 100% de queratinocitos in vitro, piel de ratón y epidermis humana en las horas posteriores a la aplicación. Zheng et al. demostraron que una única aplicación de SNA-NC del receptor del factor de crecimiento epidérmico 25 nM durante 60 h demostraba una inactivación génica eficaz en la piel humana. Se podrá contemplar una dosificación similar para CRISPR Cas inmovilizado en SNA-NC para la administración a la piel.
Virus de la hepatitis
La presente invención también se podrá aplicar para tratar virus de la hepatitis B (HBV, por sus siglas en inglés). Sin embargo, el sistema CRISPR Cas se debe adaptar para evitar las deficiencias de las iARN, tales como el riesgo de sobresaturar rutas de ARN pequeño endógeno mediante, por ejemplo, la optimización de la dosis y secuencia (remítase a, p. ej., Grimm et al., Nature vol. 441, 26 de mayo de 2006). Por ejemplo, se contemplan dosis bajas, tales como de aproximadamente 1-10 x 1014 partículas por ser humano.
En otra realización, el sistema CRISPR Cas dirigido contra HBV se podrá administrar en liposomas, tales como una partícula ácido nucleico-lípido estable (SNALP) (remítase a, p. ej., Morrissey et al., Nature Biotechnology, vol. 23, N.° 8, agosto de 2005). Se contemplan inyecciones intravenosas diarias de aproximadamente 1, 3 o 5 mg/kg/día de un CRISPR Cas específico dirigido a ARN de HBV en una SNALP. El tratamiento diario podrá prolongarse durante aproximadamente tres días y a continuación semanalmente durante aproximadamente cinco semanas.
En otra realización, el sistema de Chen et al. (Gene Therapy (2007) 14, 11-19) se podrá utilizar y/o adaptar al sistema CRISPR Cas. Chen et al. utilizan un vector de pseudotipo del virus adenoasociado 8 bicatenario (AAV2bc/8) para suministar ARNhc. Una única administración del vector de AAV2bc/8 (1 x 1012 genomas de vector por ratón), que porta ARNhc específico de HBV, suprimió eficazmente el nivel estable de proteína de HBV, ARNm y ADN replicativo en el hígado de ratones transgénicos HBV, lo que condujo a una disminución de hasta 2-3 log10 en la viremia en la circulación. Se mantuvo una supresión de HBV significativa durante al menos 120 días tras la administración del vector. El efecto terapéutico del ARNhc no fue dependiente de la secuencia diana y no conllevó la activación de interferón. Para la presente invención, se podrá clonar un sistema CRISPR Cas dirigido contra HBV e introducirlo en un vector AAV, tal como un vector AAV2bc/8 y se administró a un ser humano, por ejemplo, con una dosificación de aproximadamente 1 x 1015 genomas de vector a aproximadamente 1 x 1016 genomas de vector por ser humano.
En otra realización, el método de Wooddell et al. (Molecular Therapy vol. 21 n.° 5, 973-985 mayo de 2013) se podrá utilizar y/o adaptar al sistema CRISPR Cas. Woodell et al. muestran que la simple coinyección de un péptido de tipo melitina conjugado con N-acetilgalactosamina, cuya diana son los hepatocitos (nAg -MLP) con un ARNip conjugado con colesterol hepatotrópico (col-ARNip) cuya diana es el factor de coagulación VII (F7) daba como resultado una inactivación génica de F7 eficaz en ratones y primates no humanos sin cambios en la química clínica ni la inducción de citocinas. Utilizando modelos en ratones transgénicos y transitorios de la infección de HBV, Wooddell et al. muestran que una única coinyección de NAG-MLP con col-ARNip potente cuya diana son las secuencias de HBV conservadas dio como resultado una represión multilog de ARN vírico, proteínas y ADN vírico con una duración prolongada del efecto. Para la presente invención se podrán contemplar coinyecciones intravenosas, por ejemplo, de aproximadamente 6 mg/kg de NAG-MLP y 6 mg/kg de CRISPR Cas específico de HBV. Como alternativa, se podrán suministrar en el día uno aproximadamente 3 mg/kg de NAG-MLP y 3 mg/kg de CRISPR Cas específico de HBV, seguidos por la administración de aproximadamente 2-3 mg/kg de NAG-MLP y 2-3 mg/kg de CRISPR Cas específico de HBV dos semanas más tarde.
La presente invención también se podrá aplicar para tratar virus de la hepatitis C (HCV, por sus siglas en inglés). Los métodos de Roelvinki et al. (Molecular Therapy vol. 20 n.° 9, 1737-1749 septiembre de 2012) se podrán aplicar al sistema CRISPR Cas. Por ejemplo, un vector contemplado podrá ser el vector de AAV tal como AAV8 y, por ejemplo, se podrá contemplar una dosificación de aproximadamente 1.25 x 1011 a 1.25 x 1013 genomas de vector por kilogramo de peso corporal (gv/kg).
En otra realización más, la edición genómica mediada por CRISPR-Cas9 se puede utilizar para corregir una mutación y/o fenotipo de una enfermedad. Que la edición genómica mediada por CRISPR-Cas9 se puede utilizar para corregir una mutación y/o fenotipo de una enfermedad en el hígado y o hepatocitos se ilustra en el artículo titulado “Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype” de Hao Yin et al. Publicado en Nature Biotechnology publicado en internet el 30 de marzo de 2014; corregido en internet el 31 de marzo de 2014, disponible en el sitio web nature.com/doifinder/10.1038/nbt.2884, incorporado a la presente por referencia en su totalidad. El artículo se refiere a la corrección mediada por CRISPR-Cas9 de una mutación Fah en hepatocitos en un modelo en ratones de la enfermedad humana tirosinemia hereditaria. Se demostró que el suministro de componentes del sistema CRISPR-Cas9 mediante inyección hidrodinámica daba como resultado la expresión inicial de la proteína Fah no modificada en ~1/250 células hepáticas. Se demostró además que la expansión de hepatocitos positivos para Fah evitaba el fenotipo de pérdida de peso corporal.
Será claramente evidente que un hospedador de otras enfermedades se puede tratar de una manera similar. En la presente se proporcionan algunos ejemplos de enfermedades genéticas provocadas por mutaciones, pero se conocen muchas otras. La estrategia anterior se podrá aplicar a estas enfermedades.
Enfermedad de Huntington (HD, por sus siglas en inglés)
La interferencia por ARN (iARN) ofrece un potencial terapéutico para este trastorno al reducir la expresión de HTT, el gen que provoca la enfermedad en la enfermedad de Huntington (remítase a, p. ej., McBride et al., Molecular Therapy vol. 19 n.° 12 de diciembre de 2011, págs. 2152-2162) y, por lo tanto, el solicitante postula que se podrá utilizar y/o adaptar al sistema CRISPR-Cas. Se podrá generar el sistema CRISPR-Cas utilizando un algoritmo para reducir el potencial de actuar fuera de la diana de secuencias antisentido. Las secuencias CRISPR-Cas podrán tener como diana una secuencia en el exón 52 de la huntingtina humana, de rhesus o de ratón y expresarse en un vector vírico, tal como AAV. Se podrá inyectar a los animales, incluidos seres humanos, aproximadamente tres microinyecciones por hemisferio (seis inyecciones en total): la primera 1 mm en dirección rostral respecto a la comisura anterior (12 gL) y las dos inyecciones restantes (12 gL y 10 gL, respectivamente) espaciadas 3 y 6 mm en dirección caudal respecto a la primera inyección con 1e12 gv/mL de aAv con una velocidad de aproximadamente 1 gL/minuto y la aguja se mantuvo en su lugar durante 5 minutos más para permitir que el inyectado se difundiera desde la punta de la aguja.
DiFiglia et al. (PNAS, 23 de octubre de 2007, vol. 104, n.° 43, 17204-17209) observaron que una única administración en el cuerpo estriado adulto de un ARNip cuya diana es Htt puede silenciar un Htt mutante, atenuar la patología neuronal y retrasar el fenotipo conductual anómalo observado en un modelo en ratones transgénicos vírico con un inicio rápido de HD. DiFiglia inyectó ratones en el cuerpo estriado con 2 gL de cc-ARNip-Htt marcado con Cy3 o ARNip-Htt no conjugado con una concentración de 10 gM. Se podrá contemplar una dosificación similar de CRISPR Cas cuya diana sea Htt para seres humanos en la presente invención, por ejemplo, se podrán inyectar aproximadamente 5-10 mL de CRISPR Cas 10 gM cuya diana sea Htt en el interior del cuerpo estriado.
En otro ejemplo, Boudreau et al. (Molecular Therapy vol. 17 n.° 6 de junio de 2009) inyectaron 5 gL de vectores del serotipo 2/1 de AAV recombinantes que expresaban virus para la iARN específica de htt (con 4 x 1012 genomas víricos/mL) en el cuerpo estriado. Se podrá contemplar una dosificación similar de CRISPR Cas cuya diana sea Htt para seres humanos en la presente invención, por ejemplo, se podrán inyectar aproximadamente 10-20 mL de 4 x 1012 genomas víricos/mL de CRISPR Cas cuya diana sea Htt en el interior del cuerpo estriado.
En otro ejemplo, un CRISPR Cas cuya diana sea HTT se podrá administrar de manera continua (remítase a, p. ej., Yu et al., Cell 150, 895-908, 31 de agosto de 2012). Yu et al. utilizan bombas osmóticas que suministran 0.25 mL/h (Modelo 2004) para suministrar 300 mg/día de ARNip-mc o solución salina tamponada con fosfato (Sigma Aldrich) durante 28 días y para suministrar 75 mg/día del control positivo MOE ASO durante 14 días se utilizaron bombas diseñadas para suministrar 0.5 gL/h (Modelo 2002). Se rellenaron las bombas (Durect Corporation) con ARNip-mc o MOE diluido en PBS estéril y a continuación se incubaron a 37 °C durante 24 o 48 horas (Modelo 2004) antes de la implantación. Se anestesiaron los ratones con un 2.5% de isofluorano y se practicó una incisión en la línea media en la base del cráneo. Utilizando guías estereotácticas, se implantó una cánula en el ventrículo lateral derecho y se aseguró con adhesivo Loctite. A la cánula se unió un catéter incorporado a una minibomba osmótica Alzet y se colocó la bomba subcutáneamente en el área escapular media. Se cerró la incisión con 5.0 suturas de nailon. Se podrá contemplar una dosificación similar de CRISPR Cas cuya diana sea Htt para seres humanos en la presente invención, por ejemplo, se podrán administrar de aproximadamente 500 a 1000 g/día de CRISPR Cas cuya diana sea Htt.
En otro ejemplo de infusión continua, Stiles et al. (Experimental Neurology 233 (2012) 463-471) implantaron un catéter intraparenquimatoso con una punta de aguja de titanio en el putamen derecho. Se conectó el catéter a una bomba SynchroMed® II (Medtronic Neurological, Minneapolis, MN) implantada subcutáneamente en el abdomen. Después de una infusión de 7 días de solución salina tamponada con fosfato con 6 gL/día, se rellenaron las bombas con el artículo de prueba y se programaron para el suministro continuo durante 7 días. Se infundieron de aproximadamente 2.3 a 11.52 mg/d de ARNip con velocidades de infusión variables comprendidas entre aproximadamente 0.1 y 0.5 gL/min. Se podrá contemplar una dosificación similar de CRISPR Cas cuya diana sea Htt para seres humanos en la presente invención, por ejemplo, se podrán administrar de aproximadamente 20 a 200 g/día de CRISPR Cas cuya diana sea Htt.
En otro ejemplo, también se podrán adaptar los métodos de la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20130253040 adjudicada a Sangamo de TALES al sistema CRIPSR Cas para tratar la enfermedad de Huntington. Ácidos nucleicos, aminoácidos y proteínas
La invención utiliza ácidos nucleicos para unirse a secuencias de ADN diana. Esto es conveniente ya que los ácidos nucleicos son mucho más fáciles y más baratos de producir que las proteínas y se puede variar la especificidad de acuerdo con la longitud del fragmento donde se desea la homología. Por ejemplo, no se requiere el posicionamiento 3-D complejo de múltiples dedos.
Los términos y expresiones "polinucleótido", "nucleótido", "secuencia nucleotídica", "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se utilizan indistintamente. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o análogos de estos. Los polinucleótidos podrán tener cualquier estructura tridimensional y podrán realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: regiones codificantes o no codificantes de un gen o fragmento génico, loci (locus) definidos a partir del análisis de la unión, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ARN interferente pequeño (ARNip), ARN de horquilla corta (ARNhc), micro-ARN (miARN), ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. El término o expresión también abarca estructuras de tipo ácido nucleico con esqueletos sintéticos, remítase a, p. ej., WO 97/03211; WO 96/39154. Un polinucleótido podrá comprender uno o más nucleótidos modificados tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si están presentes, las modificaciones en la estructura nucleotídica se podrán practicar antes o después del ensamblaje del polímero. Se podrá interrumpir la secuencia nucleotídica con componentes no nucleotídicos. Se podrá modificar un polinucleótido adicionalmente después de la polimerización, por ejemplo, conjugándolo con un componente marcador.
Tal y como se utiliza en la presente, la expresión "de tipo no modificado" es un término de la técnica cuyo significado conocen los expertos y se refiere a la forma típica de un organismo, cepa, gen o característica tal y como ocurre en la naturaleza y que se distingue de formas mutantes o variantes.
Tal y como se utiliza en la presente, se debería sobreentender que el término "variante" se refiere a la exhibición de cualidades que tienen un patrón que se desvía del que ocurre en la naturaleza.
El término y la expresión "manipulado" y "que no tiene un origen natural" se utilizan indistintamente e indican la participación del hombre. Los términos y expresiones, cuando se refieren a moléculas de ácido nucleico o polipéptidos se refieren a que la molécula de ácido nucleico o el polipéptido están al menos sustancialmente exentos de al menos otro componente con el que se asocian de manera natural en la naturaleza y tal y como se observan en la naturaleza.
El término "complementariedad" se refiere a la capacidad de un ácido nucleico para formar uno o más puentes de hidrógeno con otra secuencia de ácido nucleico ya sea por el emparejamiento tradicional de bases de Watson-Crick o mediante otros tipos no tradicionales. Una complementariedad porcentual indica el porcentaje de residuos en una molécula de ácido nucleico que pueden formar puentes de hidrógeno (p. ej., emparejamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de ácido nucleico (p. ej., 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 representan una complementariedad de un 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y 100%). La expresión "perfectamente complementario" se refiere a que todos los residuos contiguos de una secuencia de ácido nucleico se unirán mediante puentes de hidrógeno con el mismo número de residuos contiguos en una segunda secuencia de ácido nucleico. La expresión "sustancialmente complementario" tal y como se utiliza en la presente se refiere a un grado de complementariedad que es al menos de un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% a lo largo de una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos o se refiere a dos ácidos nucleicos que se hibridan entre sí en condiciones rigurosas.
Tal y como se utiliza en la presente, las "condiciones rigurosas" para la hibridación se refieren a condiciones en las que un ácido nucleico que tiene complementariedad con una secuencia diana se hibrida predominantemente con la secuencia diana y sustancialmente no se hibrida con secuencias que no son diana. Las condiciones rigurosas normalmente dependen de la secuencia y varían dependiendo de una serie de factores. En general, cuanto más larga sea la secuencia, mayor será la temperatura a la que la secuencia se hibride específicamente con su secuencia diana. Algunos ejemplos no limitantes de condiciones rigurosas se describen detalladamente en Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Segundo capítulo “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay”, Elsevier, N.Y. Cuando se hace referencia a una secuencia polinucleotídica, entonces también se contemplan secuencias complementarias o parcialmente complementarias. Estas son preferentemente capaces de hibridarse con la secuencia de referencia en condiciones sumamente rigurosas. En general, con el fin de maximizar la tasa de hibridación, se seleccionan condiciones de hibridación con una rigurosidad relativamente baja: de aproximadamente 20 a 25 °C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm ). La Tm es la temperatura a la cual un 50% de la secuencia diana específica se hibrida con una sonda perfectamente complementaria en solución con una fuerza iónica y pH definidos. En general, cuando se necesita al menos aproximadamente un 85% de complementariedad nucleotídica de las secuencias hibridadas, se seleccionan condiciones de lavado sumamente rigurosas y que son de aproximadamente 5 a 15 °C más bajas que la Tm . Cuando se necesita al menos aproximadamente un 70% de complementariedad nucleotídica de las secuencias hibridadas, se seleccionan condiciones de lavado moderadamente rigurosas y que son de aproximadamente 15 a 30 °C más bajas que la Tm . Las condiciones de lavado sumamente permisivas (rigurosidad muy baja) podrán ser de incluso 50 °C por debajo de la Tm, lo que permite un nivel elevado de emparejamientos erróneos entre las secuencias hibridadas. Los expertos en la técnica reconocerán que también se pueden alterar otros parámetros físicos y químicos en las etapas de hibridación y lavado para modificar la respuesta de una señal de hibridación detectable que procede de un nivel específico de homología entre las secuencias diana y sonda. Las condiciones sumamente rigurosas preferidas comprenden incubar en un 50% de formamida, 5xSSC y un 1% de SDS a 42 °C o incubar en 5xSSC y un 1% de SDS a 65 °C, lavando con 0.2xSSC y un 0.1% de SDS a 65 °C.
La "hibridación" se refiere a una reacción en la que uno o más polinucleótidos reaccionan para formar un complejo que se estabiliza mediante puentes de hidrógeno entre las bases de los residuos nucleotídicos. La formación de puentes de hidrógeno podrá ocurrir mediante el emparejamiento de bases de Watson y Crick, unión de Hoogstein o de cualquier otra manera específica de la secuencia. El complejo podrá comprender dos hebras que forman una estructura bicatenaria, tres o más hebras que forman un complejo con múltiples hebras o una hebra sencilla autohibridante o cualquier combinación de estos. Una reacción de hibridación podrá constituir un paso de un proceso más extenso, tal como la iniciación de la PCR o la escisión de un polinucleótido por una enzima. Una secuencia capaz de hibridarse con una secuencia dada se denomina la "(secuencia) complementaria" de una secuencia dada.
Tal y como se utiliza en la presente, el término "locus" o la expresión "locus genómico" (plural loci) es la ubicación específica de un gen o secuencia de ADN en un cromosoma. Un "gen" se refiere a fragmentos de ADN o ARN que codifican un polipéptido o una cadena de ARN que ejerce un papel funcional en un organismo y, por lo tanto, es la unidad molecular heredable en organismos vivos. A efectos de esta invención, se podrá considerar que los genes incluyen regiones que regulan la producción del producto génico, sin que importe si tales secuencias reguladoras son o no adyacentes a las secuencias codificantes y/o transcritas. En consecuencia, un gen incluye, sin carácter necesariamente limitante, secuencias promotoras, terminadores, secuencias reguladoras de la traducción tales como sitios de unión al ribosoma y sitios de entrada ribosómicos internos, potenciadores, silenciadores, aislantes, elementos frontera, orígenes de la replicación, sitios de unión a la matriz y regiones controladoras del locus.
Tal y como se utilizan en la presente, la "expresión de un locus genómico" o la "expresión génica" es el proceso por el cual la información de un gen se utiliza en la síntesis de un producto génico funcional. Los productos de la expresión génica son a menudo proteínas, pero en los genes que codifican compuestos que no son proteínas tales como genes de ARNr o genes de ARNt, el producto es un ARN funcional. Todas las formas de vida conocidas utilizan el proceso de expresión génica - eucariotas (incluidos organismos multicelulares), procariotas (bacterias y arqueas) y virus para generar productos funcionales para sobrevivir. Tal y como se utiliza en la presente, la "expresión" de un gen o ácido nucleico engloba no solamente la expresión génica celular sino también la transcripción y traducción de uno o más ácidos nucleicos en sistemas de clonación y en cualquier otro contexto. Tal como se utiliza en la presente, la "expresión" también se refiere al proceso por el cual se transcribe un polinucleótido a partir de un molde de ADN (tal como para obtener ARNm u otro transcrito de ARN) y/o el proceso por el cual un ARNm transcrito se traduce posteriormente para obtener péptidos, polipéptidos o proteínas. Los polipéptidos codificados y transcritos se podrán denominar de manera colectiva "producto génico". Si el polinucleótido se obtiene a partir de ADN genómico, la expresión podrá incluir el corte y empalme de ARNm en una célula eucariota.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en la presente para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero podrá ser lineal o ramificado y podrá comprender aminoácidos modificados y podrá estar interrumpido por componentes que no son aminoácidos. Los términos también engloban un polímero de aminoácidos que se ha modificado; por ejemplo, mediante formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación tal como conjugación con un componente marcador. Tal y como se utiliza en la presente, el término "aminoácido" incluye aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos que incluyen la glicina y tanto los isómeros ópticos D como los L, y análogos de aminoácidos y peptidomiméticos.
Tal y como se utiliza en la presente, el término "dominio" o la expresión "dominio proteico" se refieren a una parte de una secuencia proteica que podrá existir y funcionar independientemente del resto de la cadena proteica.
Tal y como se describe en los aspectos de la invención, la identidad secuencial está relacionada con la homología secuencial. Las comparaciones de la homología se podrán llevar a cabo a simple vista o, más comúnmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias a los que se puede acceder fácilmente. Estos programas computarizados comercializados podrán calcular la homología porcentual (%) entre dos o más secuencias y también podrán calcular la identidad secuencial compartida por dos o más secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. En algunas realizaciones preferidas, la región de adición de la caperuza de las dTALE descritas en la presente tienen secuencias que son idénticas en al menos un 95% o que comparten una identidad con las secuencias aminoacídicas de la región de adición de la caperuza que se proporcionan en la presente.
Se podrán generar homologías secuenciales mediante un programa cualquiera de un conjunto de programas computerizados conocidos en la técnica, por ejemplo, BLAST o FASTA, etc. Un programa computarizado adecuado para llevar a cabo una alineación de este tipo es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Universidad de Wisconsisn, EE. UU.; Devereux et al, 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Algunos ejemplos de otros softwares que podrán realizar las comparaciones secuenciales incluyen, sin carácter limitante, el paquete BLAST (remítase a Ausubel et al., 1999 ibid - Capítulo 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) y el grupo de herramientas de comparación GENEWORKS. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para búsquedas con conexión y sin conexión a internet (remítase a Ausubel et al, 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, se prefiere utilizar el programa GCG Bestfit. La homología secuencial porcentual (%) se podrá calcular en secuencias contiguas, es decir, se alinea una secuencia con otra secuencia y cada aminoácido o nucleótido de una secuencia se compara directamente con el aminoácido o nucleótido correspondiente de la otra secuencia, un residuo de cada vez. Esto se denomina alineación "sin huecos". Normalmente, se realizan alineaciones sin huecos solamente en números de residuos relativamente bajos.
Aunque este es un método muy simple y constante, falla a la hora de tener en cuenta que, por ejemplo, en pares de secuencias que por lo demás son idénticas, una inserción o deleción podrá provocar que los siguientes residuos aminoacídicos dejen de estar alineados lo que puede conllevar potencialmente una gran reducción en el % de homología cuando se realiza una alineación global. En consecuencia, la mayoría de los métodos para la comparación secuencial están diseñados para producir alineaciones óptimas que tengan en cuenta posibles inserciones y deleciones sin penalizar indebidamente la homología global o calificación de la identidad. Esto se logra insertando "gaps" en la alineación secuencial para tratar de maximizar la homología o identidad local.
Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones por hueco" a cada hueco que aparece en la alineación de modo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, una alineación secuencial con tan pocos huecos como sea posible - que refleje una gran semejanza entre las dos secuencias comparadas - podrá lograr una calificación más elevada que una con muchos huecos. Normalmente se utilizan "costos de hueco de afinidad" que imponen un costo relativamente elevado a la existencia de un hueco y una penalización más pequeña para cada residuo posterior del hueco. Este es el sistema de calificación de huecos utilizado más comúnmente. Las penalizaciones de hueco elevadas podrán, obviamente, producir alineaciones optimizadas con menos huecos. La mayoría de los programas de alineación permiten que se modifiquen las penalizaciones por hueco. Sin embargo, se prefiere utilizar los valores predeterminados cuando se utilice un software de este tipo para las comparaciones secuenciales. Por ejemplo, cuando se utilice el paquete GCG Wisconsin Bestfit la penalización de hueco predeterminada para las secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y -4 para cada extensión.
El cálculo del % de homología máximo, por lo tanto, requiere en primer lugar la producción de una alineación óptima que tenga en cuenta las penalizaciones por huecos. Un programa computarizado adecuado para llevar a cabo una alineación de este tipo es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al., 1984 Nuc. Acids Research 12 p387). Algunos ejemplos de otros softwares que podrán realizar las comparaciones secuenciales incluyen, sin carácter limitante, el paquete BLAST (remítase a Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4.a Ed. - Capítulo 18), FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403-410) y el grupo de herramientas de comparación GENEWORKS. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para búsquedas con conexión y sin conexión a internet (remítase a Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones, se prefiere utilizar el programa GCG Bestfit. Una nueva herramienta, denominada BLAST 2 Sequences también está disponible para comparar secuencias de nucleótidos y proteínas (remítase a FEMS Microbiol Lett. 1999174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett. 1999 177(1): 187-8 y la página web del Centro Nacional para la Información Biotecnológica en la página web de los Institutos Nacionales de Salud).
Aunque el % de homología final se podrá medir en función de la identidad, el propio proceso de alineación normalmente no se basa en una comparación de parejas de todo o nada. En su lugar, se utiliza en general una matriz de puntuación de la similaridad con escala que asigna calificaciones a cada comparación por parejas en función de la similitud química o la distancia evolutiva. Como un ejemplo de esto una matriz que se utiliza normalmente es la matriz BLOSUM62 - la matriz predeterminada del grupo de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin utilizan generalmente los valores predeterminados públicos o una tabla de comparación de símbolos personalizada, si se suministra (remítase al manual del usuario para más detalles). Para algunas aplicaciones, se prefiere utilizar los valores predeterminados públicos para el paquete GCG o, en el caso de otro software, la matriz predeterminada tal como BLOSUM62.
Como alternativa, las homologías porcentuales se podrán calcular utilizando la característica de alineación múltiple en DNASISTM (Hitachi Software), que se basa en un algoritmo análogo a CLUSTAL (Higgins DG y Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244). Una vez que el software ha producido una alineación óptima, es posible calcular el % de homología, preferentemente el % de identidad secuencial. El software normalmente hace esto como parte de la comparación secuencial y genera un resultado numérico.
Las secuencias también podrán tener deleciones, inserciones o sustituciones de residuos aminoacídicos que producen un cambio silencioso y dan como resultado una sustancia funcionalmente equivalente. Se pueden realizar sustituciones de aminoácidos deliberadas en función de la similitud de las propiedades de los aminoácidos (tales como la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos) y, por lo tanto, es útil agrupar los aminoácidos en grupos funcionales. Los aminoácidos se pueden agrupar en función únicamente de las propiedades de las cadenas laterales. Sin embargo, es más útil incluir también los datos de las mutaciones. Los conjuntos de aminoácidos que se obtienen de esta manera es probable que estén conservados por razones estructurales. Estos conjuntos se podrán describir en forma de un diagrama de Venn (Livingstone C.D. y Barton G.J. (1993) “Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation” Comput. Appl. Biosci. 9: 745-756) (Taylor W.R. (1986) “The classification of amino acid conservation” J. Theor. Biol. 119; 205-218). Se podrán realizar sustituciones conservadoras, por ejemplo, de acuerdo con la siguiente tabla que describe un diagrama de Venn de aceptación generalizada para agrupar aminoácidos.
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Las realizaciones de la divulgación incluyen secuencias (tanto de polinucleótidos como de polipéptidos) que podrán comprender una sustitución homóloga (tanto sustitución como reemplazo se utilizan en la presente para denotar el intercambio de un residuo aminoacídico o nucleótido existente con un residuo o nucleótido alternativo) que podrá ocurrir, es decir, la sustitución de igual por igual en el caso de los aminoácidos tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. La sustitución no homóloga también podrá ocurrir, es decir, de una clase de residuo a otro o como alternativa que conlleve la inclusión de aminoácidos no naturales tales como ornitina (denominado en lo sucesivo Z), ácido diaminobutírico ornitina (denominado en lo sucesivo B), norleucina ornitina (denominado en lo sucesivo O), piriilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.
Las secuencias aminoacídicas variantes podrán incluir grupos espaciadores adecuados que se podrán insertar entre dos residuos aminoacídicos cualesquiera de la secuencia que incluyen grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo o propilo además de espaciadores aminoacídicos tales como los residuos de glicina o p-alanina. Los expertos en la técnica podrán conocer bien una forma adicional de variación, que conlleva la presencia de uno o más residuos aminoacídicos en forma peptoide. Para evitar dudas, se utiliza "la forma peptoide" para referirse a residuos aminoacídicos variantes donde el grupo sustituyente del carbono a está en el átomo de nitrógeno del residuo más que en el carbono a. En la técnica existe constancia de procesos para preparar péptidos en forma peptoide, por ejemplo, Simon RJ etal, PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 y Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.
La puesta en práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de inmunología, bioquímica, química, biología molecular, microbiología, biología celular, genómica y ADN recombinante que están comprendidas en las competencias del experto en la técnica. Remítase a Sambrook, Fritsch y Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2.a edición (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); las series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTiCa L APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, y ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987)).
Vectores
En un aspecto, la divulgación proporciona vectores que se utilizan para modificar y optimizar sistemas CRISPR-Cas. Tal y como se utiliza en la presente, un "vector" es una herramienta que permite o facilita la transferencia de una entidad de un entorno a otro. Es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido en el cual se podrá insertar otro segmento de ADN de modo que provoque la replicación del segmento insertado. En general, un vector es capaz de replicarse cuando se asocia con los elementos de control apropiados. En general, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que está unido. Los vectores incluyen, sin carácter limitante, moléculas de ácido nucleico que son monocatenarias, bicatenarias o parcialmente bicatenarias; moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más extremos libres o sin extremos libres (p. ej., circulares); moléculas de ácido nucleico que comprende ADN, ARN o ambos; y otras variedades de polinucleótidos conocidos en la técnica. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario doble circular en el cual se pueden insertar segmentos de ADN adicionales, por ejemplo, mediante técnicas de clonación molecular habituales. Otro tipo de vector es un vector vírico, donde están presentes en el vector secuencias de ADN o ARN de origen vírico para empaquetarlo en un virus (p. ej., retrovirus, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus, adenovirus de replicación defectuosa y virus adenoasociados (AAV)). Los vectores víricos también incluyen polinucleótidos portados por un virus para la transfección de una célula hospedadora. Ciertos vectores son capaces de una replicación autónoma en la célula hospedadora en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episómicos de mamíferos). Otros vectores (p. ej., vectores no episómicos de mamíferos) se integran en el genoma de la célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora y, de esta manera, se replican junto con el genoma hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están ligados operablemente. Este tipo de vectores se denominan en la presente "vectores de expresión". Los vectores de expresión comunes útiles en las técnicas de ADN recombinante se encuentran a menudo en forma de plásmidos.
Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen uno o más elementos reguladores que se podrán seleccionar en función de las células hospedadoras que se van a utilizar para la expresión, que está ligado operablemente a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. En un vector de expresión recombinante, "ligado operablemente" se pretende que signifique que la secuencia nucleotídica de interés está ligada al elemento o los elementos reguladores de modo que permita la expresión de la secuencia nucleotídica (p. ej., en un sistema de transcripción/traducción in vivo o en una célula hospedadora cuando se introduce el vector en la célula hospedadora). En lo que respecta a los métodos de recombinación y clonación, cabe mencionar la solicitud de patente de los EE. UU. 10/815 730, publicada el 2 de septiembre de 2004 como US 2004-0171156 A1, cuyos contenidos se incorporan a la presente por referencia en su totalidad.
Algunos aspectos de la divulgación se refieren a vectores para ARN quimérico y Cas9. Se prefieren los vectores de expresión bicistrónicos para ARN quimérico y Cas9. En general y especialmente en esta realización Cas9 está impulsada preferentemente por el promotor CBh. El ARN quimérico podrá estar impulsado preferentemente por un promotor U6. Idealmente se combinan los dos. El ARN guía quimérico está constituido normalmente por una secuencia guía de 20 pb (Ns) y esta se podrá unir a la secuencia tracr (abarca desde el primer "U" de la hebra inferior hasta el final del transcrito). La secuencia tracr se podrá truncar en varias posiciones tal y como se indica. Las secuencias guía y tracr están separadas por la secuencia pareja de tracr que podrá ser GUUUUAGAGCUA (SEQ ID NO: 63). Esta podrá estar seguida por la secuencia bucle g AaA tal y como se muestra. En los ejemplos se prefieren estas dos. Los solicitantes han demostrado indels mediados por Cas9 en el EMX1 humano y los loci PVALB mediante ensayos SURVEYOR. Los ARNqui están indicados por su designación "+n" y ARNcr se refiere a un ARN híbrido donde las secuencias guía y tracr se expresan como transcritos separados. A lo largo de esta solicitud, el ARN quimérico también se podrá denominar ARN guía sencillo o ARN sintético guía (ARNsg). El bucle es preferentemente GAAA pero no está limitado a esta secuencia ni, por supuesto, a tener una longitud de solo 4 pb. Ciertamente, las secuencias que forman bucles preferidas para su uso en estructuras de tipo horquilla tienen una longitud de cuatro nucleótidos y, más preferentemente, tienen la secuencia GAAA. Sin embargo, se podrán utilizar secuencias bucle más largas o más cortas al igual que secuencias alternativas. Las secuencias incluyen preferentemente un triplete de nucleótidos (por ejemplo, AAA) y un nucleótido adicional (por ejemplo C o G). Los ejemplos de secuencias que forman bucles incluyen CAAA y AAAG.
La expresión "elemento regulador" se pretende que incluya promotores, potenciadores, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES, por sus siglas en inglés) y otros elementos de control de la expresión (p. ej., señales de terminación de la transcripción tales como señales de poliadenilación y secuencias poliU). Este tipo de elementos reguladores se describen, por ejemplo, en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Los elementos reguladores incluyen aquellos que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia nucleotídica en muchos tipos de células hospedadoras y aquellos que dirigen la expresión de la secuencia nucleotídica únicamente en ciertas células hospedadoras (p. ej., secuencias reguladoras específicas del tejido). Un promotor específico del tejido podrá dirigir la expresión principalmente en un tejido deseado de interés tal como músculo, neurona, hueso, piel, sangre, órganos específicos (p. ej., hígado, páncreas) o tipos celulares particulares (p. ej., linfocitos). Los elementos reguladores también podrán dirigir la expresión de manera dependiente del tiempo, tal como de manera dependiente del ciclo celular o dependiente de la etapa de desarrollo, que también podrá ser o no ser específica del tipo celular o del tejido. En algunas realizaciones, un vector comprende uno o más promotores de la pol III (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5 o más promotores de la pol III), uno o más promotores de la pol II (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5 o más promotores de la pol II), uno o más promotores de la pol I (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5 o más promotores de la pol I) o combinaciones de estos. Los ejemplos de los promotores de la pol III incluyen, sin carácter limitante, los promotores H1 y U6. Los ejemplos de los promotores de la pol II incluyen, sin carácter limitante, el promotor LTR retrovírico del virus del sarcoma de Rous (RSV, por sus siglas en inglés) (opcionalmente con el potenciador de RSV), el promotor del citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador de CMV) [remítase a, p. ej., Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)], el promotor de SV40, el promotor de la dihidrofolato-reductasa, el promotor de la p-actina, el promotor de la fosfoglicerol-cinasa (PGK, por sus siglas en inglés) y el promotor EF1a. La expresión "elemento regulador" también engloba los elementos potenciadores tales como WPRE; potenciadores de CMV; el segmento R-U5' de la LTR de HTLV-I (Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), págs. 466-472, 1988); potenciador de SV40 y la secuencia intrónica entre los exones 2 y 3 de la p-globina del conejo (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), págs. 1527-31, 1981). Los expertos en la técnica comprenderán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora que se va a transformar, el nivel de expresión deseado, etc. Se puede introducir un vector en las células hospedadoras para producir de esta manera transcritos, proteínas o péptidos, incluidos péptidos o proteínas de fusión, codificados por ácidos nucleicos como los descritos en la presente (p. ej., enzimas, proteínas, transcritos de repeticiones palindrómicas cortas espaciadas entre sí regularmente y agrupadas (CRISPR), formas mutantes de estos, proteínas de fusión de estos, etc.). En lo que se refiere a las secuencias reguladoras, cabe mencionar la solicitud de patente de los EE. UU. 10/491 026. En lo que se refiere a los promotores, cabe mencionar la publicación PCT WO 2011/028929 y la solicitud de los EE. UU. 12/511 940.
Se pueden diseñar vectores para la expresión de transcritos de CRISPR (p. ej., proteínas, enzimas o transcritos de ácido nucleico) en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, se pueden expresar transcritos de CRISPR en células bacterianas tales como Escherichia coli, células de insecto (utilizando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamíferos. Las células hospedadoras adecuadas se analizan en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Como alternativa, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo, utilizando secuencias reguladoras del promotor T7 y la polimerasa T7.
Los vectores se podrán introducir y propagar en un procariota o célula procariota. En algunas realizaciones, se utiliza un procariota para amplificar copias de un vector que se va a introducir en una célula eucariota o como un vector intermediario para la producción de un vector que se va a introducir en una célula eucariota (p. ej., amplificando un plásmido como parte de un sistema de empaquetamiento de un vector vírico). En algunas realizaciones, se utiliza un procariota para amplificar copias de un vector y expresar uno o más ácidos nucleicos, por ejemplo, para proporcionar una fuente de una o más proteínas para el suministro a una célula hospedadora u organismo hospedador. La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo muy a menudo en Escherichia coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de las proteínas de fusión o de proteínas que no son de fusión. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a una proteína que se ha codificado, tal como al extremo amino de la proteína recombinante. Tales vectores de fusión podrán cumplir uno o más propósitos, tales como: (i) incrementar la expresión de la proteína recombinante; (ii) incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y (iii) cooperar en la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando en la purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, se introduce el sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante y el resto de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento afines, incluyen el Factor Xa, trombina y enterocinasa. Los ejemplos de los vectores de expresión de fusión incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith y Johnson, 1988. Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) que fusionan glutatión S-transferasa (GST), la proteína de unión a la maltosa E o la proteína A, respectivamente, a una proteína recombinante diana.
Los ejemplos de vectores de expresión de E. coli inducibles adecuados que no son de fusión adecuados incluyen pTrc (Amrann etal., (1988) Gene 69:301-315) y pET 11d (Studier et al, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89).
En algunas realizaciones, un vector es un vector de expresión de levaduras. Los ejemplos de vectores para la expresión en la levadura Saccharomyces cerivisae incluyen pYepSec1 (Baldari, et al, 1987. EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kuijan y Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al, 1987. Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) y picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.).
En algunas realizaciones, un vector impulsa la expresión proteica en células de insecto utilizando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculoviurs disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (p. ej., células SF9) incluyen la serie pAc (Smith, et al, 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers, 1989. Virology 170: 31-39).
En algunas realizaciones, un vector es capaz de impulsar la expresión de una o más secuencias en células de mamífero utilizando un vector de expresión de mamíferos. Los ejemplos de vectores de expresión en mamíferos incluyen pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) y pMT2PC (Kaufman, et al, 1987. EMBO J. 6: 187-195). Cuando se utilizan en células de mamíferos, normalmente uno o más elementos reguladores son los que proporcionan las funciones de control del vector de expresión. Por ejemplo, los promotores utilizados normalmente se obtienen a partir del polioma, adenovirus 2, citomegalovirus, virus del simio 40 y otros divulgados en la presente y conocidos en la técnica. Para consultar otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como eucariotas remítase a, p. ej., los Capítulos 16 y 17 de Sambrook, et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
En algunas realizaciones, el vector de expresión de mamíferos recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo celular concreto (p. ej., se utilizan elementos reguladores específicos del tejido para expresar el ácido nucleico). En la técnica existe constancia de elementos reguladores específicos del tejido. Los ejemplos no limitantes de promotores específicos del tejido adecuados incluyen el promotor de la albúmina (específico del hígado; Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277), promotores con especificidad linfoide (Calame y Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275), en particular promotores de receptores de linfocitos T (Winoto y Baltimore, 1989. EMBO J.
8: 729-733) e immunoglobulinas (Baneiji, et al, 1983. Cell 33: 729-740; Queen y Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748), promotores específicos de las neuronas (p. ej., el promotor del neurofilamento; Byrne y Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), promotores específicos del páncreas (Edlund, et al, 1985. Science 230: 912-916) y promotores específicos de las glándulas mamarias (p. ej., promotor del suero de la leche, patente de los EE. UU. con N.° 4873316 y la solicitud europea con N.° de publicación 264 166). También se engloban los promotores regulados por el desarrollo, p. ej., los promotores hox murinos (Kessel y Gruss, 1990. Science 249: 374-379) y el promotor de la afetoproteína (Campes y Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546). En lo que se refiere a estos vectores procariotas y eucariotas, cabe mencionar la patente de los EE. UU. 6 750 059. Otras realizaciones de la divulgación se podrán relacionar con el uso de vectores víricos, respecto a los cuales cabe mencionar la solicitud de patente de los EE. UU.
13/092 085. En la técnica existe constancia de elementos reguladores específicos del tejido y en lo que se refiere a estos, cabe mencionar la patente de los EE. UU. 7776321.
Elementos reguladores
En algunas realizaciones, un elemento regulador está ligado operablemente a uno o más elementos de un sistema CRISPR de modo que impulse la expresión del elemento o elementos del sistema CRISPR. En general, los CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas espaciadas entre sí regularmente y agrupadas), también conocidas como SPIDR (siglas en inglés de repeticiones directas con espaciadores intercalados), constituyen una familia de loci de ADN que son específicos normalmente para una especie bacteriana particular. El locus CRISPR comprende una clase diferente de repeticiones de secuencias cortas espaciadas entre sí (SSR, por sus siglas en inglés) que se reconoció en E. coli (Ishino et al., J. Bacteriol, 169:5429-5433 [1987]; y Nakata et al., J. Bacteriol, 171:3553-3556 [1989]) y en genes asociados. Se han identificado SSR espaciadas entre sí similares en Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena y Mycobacterium tuberculosis (remítase a Groenen et al., Mol. Microbiol., 10:1057-1065 [1993]; Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5:254-263 [1999]; Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30 [1996]; y Mojica et al., Mol. Microbiol., 17:85-93 [1995]). Los loci CRISPR difieren normalmente de otras SSR en la estructura de las repeticiones, que se han denominado repeticiones cortas espaciadas regularmente (SRSR, por sus siglas en inglés) (Janssen et al., Om ICS J. Integ. Biol., 6:23-33 [2002]; y Mojica et al., Mol. Microbiol., 36:244-246 [2000]). En general, las repeticiones son elementos cortos que se presentan en agrupaciones que están espaciadas regularmente por secuencias intrónicas singulares con una longitud sustancialmente constante (Mojica et al., [2000], anteriormente). Aunque las secuencias repetidas están sumamente conservadas entre cepas, el número de las repeticiones espaciadas entre sí y las secuencias de las regiones espaciadoras difiere normalmente de cepa a cepa (van Embden et al., J. Bacteriol, 182:2393-2401 [2000]). Se han identificado loci de CRISPR en más de 40 procariotas (remítase a, p. ej. Jansen et al., Mol. Microbiol., 43:1565-1575 [2002]; y Mojica et al., [2005]) que incluyen, sin carácter limitante, Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema y Thermotoga.
En general, el "sistema CRISPR" se refiere de manera global a transcritos y otros elementos que participan en la expresión de los genes asociados a CRISPR ("Cas") o para dirigir la actividad de estos, que incluyen secuencias que codifican un gen Cas, una secuencia tracr (trans-activadora de CRISPR) (p. ej., un ARNtracr o un ARNtracr parcial activo), una secuencia pareja de tracr (que engloba una "repetición directa" y una repetición directa parcial procesada por ARNtracr en el contexto de un sistema CRISPR endógeno), una secuencia guía (también denominada "espaciador" en el contexto de un sistema CRISPR endógeno) u otras secuencias y transcritos de un locus CRISPR. En las realizaciones de la invención, las expresiones "secuencia guía" y "ARN guía" se utilizan indistintamente. En algunas realizaciones, uno o más elementos de un sistema CRISPR se obtienen a partir de un sistema CRISPR de tipo I, tipo II o tipo III. En algunas realizaciones, uno o más elementos de un sistema CRISPR se obtienen a partir de un organismo particular que comprende un sistema CRISPR endógeno, tal como Streptococcus pyogenes. En general, un sistema CRISPR está caracterizado por elementos que promueven la formación de un complejo CRISPR en el sitio de una secuencia diana (también denominada protoespaciadora en el contexto de un sistema CRISPR endógeno). En el contexto de la formación de un complejo CRISPR, la "secuencia diana" se refiere a una secuencia respecto a la cual se ha diseñado una secuencia guía complementaria, donde la hibridación entre una secuencia diana y una secuencia guía promueve la formación de un complejo CRISPR. Una secuencia diana podrá comprender cualquier polinucleótido, tal como polinucleótidos de ADN o ArN. En algunas realizaciones, una secuencia diana está ubicada en el núcleo o citoplasma de una célula.
En algunas realizaciones, se podrán identificar las repeticiones directas por métodos computerizados buscando motivos repetitivos que cumplan cualquiera de los siguientes criterios o todos ellos:
1. detectarse en un intervalo de 2 Kb de la secuencia genómica que flanquea el locus CRISPR de tipo II;
2. abarcar desde 20 hasta 50 pb; y
3. estar espaciadas entre sí por de 20 a 50 pb.
En algunas realizaciones, se podrán utilizar 2 de estos criterios, por ejemplo, 1 y 2, 2 y 3, o 1 y 3. En algunas realizaciones se podrán utilizar los 3 criterios.
En algunas realizaciones, los ARNtracr candidatos se podrán predecir posteriormente mediante secuencias que cumplan cualquiera de los siguientes criterios o todos ellos:
1. homología secuencia! con repeticiones directas (búsqueda del motivo en Geneious con hasta 18 pb emparejadas erróneamente);
2. presencia de un terminador transcripcional independiente de Rho predicho en la dirección de la transcripción; y 3. una estructura secundaria de tipo horquilla estable entre el ARNtracr y la repetición directa.
En algunas realizaciones, se podrán utilizar 2 de estos criterios, por ejemplo, 1 y 2, 2 y 3, o 1 y 3. En algunas realizaciones se podrán utilizar los 3 criterios.
En algunas realizaciones, los diseños de ARN sintético guía (ARNsg) quiméricos podrán incorporar al menos 12 pb de la estructura bicatenaria entre la repetición directa y el ARNtracr.
En las realizaciones preferidas de la invención, el sistema CRISPR es un sistema CRISPR de tipo II y la enzima Cas es Cas9, que cataliza la escisión del ADN. La activación enzimática por parte de Cas9 obtenida a partir de Streptococcus pyogenes o cualquier Cas9 estrechamente relacionada genera roturas bicatenarias en las secuencias del sitio diana que se hibridan a 20 nucleótidos de la secuencia guía y que tienen una secuencia de un motivo adyacente protoespaciador (PAM) (los ejemplos incluyen NGG/NRG o una PAM que se pueden determinar tal y como se describe en la presente) tras los 20 nucleótidos de la secuencia diana. La actividad de CRISPR mediante Cas9 para el reconocimiento y la escición del ADN específicos del sitio está definida por la secuencia guía, la secuencia tracr que se hibrida en parte con la secuencia guía y la secuencia PAM. Se describen más aspectos del sistema CRISPR en Karginov y Hannon, The CRISPR system: small RNA-guided defence in bacteria and archaea, Mole Cell 15 de enero de 2010; 37(1): 7.
El locus CRISPR de tipo II de Streptococcus pyogenes SF370, que contiene una agrupación de cuatro genes Cas9, Cas1, Cas2 y Csn1, así como también dos elementos de ARN no codificantes, ARNtracr y una matriz característica de secuencias repetitivas (repeticiones directas) espaciadas entre sí por fragmentos cortos de secuencias no repetitivas (espaciadores, cada uno de aproximadamente 30 pb). En este sistema, se genera una rotura bicatenaria de ADN (DBS) dirigida en cuatro pasos secuenciales (Fig. 2A). En primer lugar, dos ARN no codificantes, la matriz de pre-ARNcr y el ARNtracr, se transcriben a partir del locus CRISPR. En segundo lugar, el ARNtracr se hibrida con las repeticiones directas de pre-ARNcr que se procesa a continuación para generar ARNcr maduros que contienen secuencias espaciadoras individuales. En tercer lugar, el complejo ARNcrmaduro:ARNtracr dirige a Cas9 al ADN diana constituido por el protoespaciador y la PAM correspondiente mediante la formación de un complejo heterobicatenario entre la región espaciadora del ARNcr y el ADN protoespaciador. Finalmente, Cas9 media la escisión del ADN diana en dirección 5' respecto a PAM para crear una DSB en el protoespaciador (Fig. 2A). La Fig. 2B demuestra la ubicación nuclear de Cas9 con codones optimizados. Para promover una iniciación transcripcional precisa, se seleccionó el promotor U6 basado en la ARN polimerasa III para impulsar la expresión de ARNtracr (Fig. 2C). De manera similar, se desarrolló un constructo basado en el promotor U6 para expresar una matriz de pre-ARNcr constituida por un único espaciador flanqueado por dos repeticiones directas (DR, por sus siglas en inglés, también englobadas en la expresión "secuencias pareja de tracr"; Fig. 2C). Se diseñó el espaciador inicial para que su diana fuera un sitio diana de 33 pares de bases (pb) (protoespaciador de 30 pb más una secuencia con un motivo CRISPR de 3 pb (PAM) que cumpliera el requisito del motivo de reconocimiento NGG de Cas9) en el locus de EMX1 humano (Fig. 2C), un gen clave en el desarrollo de la corteza cerebral.
Normalmente, en el contexto de un sistema CRISPR endógeno, la formación de un complejo CRISPR (que comprende una secuencia guía que se hibrida con una secuencia diana y se compleja con una o más proteínas Cas) da como resultado la escisión de una o ambas hebras en la secuencia diana o cerca de esta (p. ej., a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 o más pares de bases de esta). Sin querer ceñirse a ninguna teoría, la secuencia tracr, que podrá comprender o estar constituida por toda la secuencia tracr no modificada o por una porción de esta (p. ej., aproximadamente o más de aproximadamente 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85 o más nucleótidos de una secuencia tracr no modificada) también podrá formar parte de un complejo CRISPR, por ejemplo, mediante hibridación a lo largo de al menos una porción de la secuencia tracr con toda la secuencia pareja de tracr, o con una porción de esta, que esté ligada operablemente a la secuencia guía. En algunas realizaciones, se introducen uno o más vectores que impulsan la expresión de uno o más elementos de un sistema CRISPR en una célula hospedadora de modo que la expresión de los elementos del sistema CRISPR dirija la formación de un complejo CRISPR en uno o más sitios diana. Por ejemplo, una enzima Cas, una secuencia guía ligada a una secuencia pareja de tracr y una secuencia tracr podrían estar cada una de ellas ligadas operablemente a elementos reguladores independientes en vectores independientes. Como alternativa, dos o más de los elementos expresados a partir del mismo o de diferentes elementos reguladores, se podrán combinar en un vector único, donde uno o más vectores adicionales proporcionan cualesquiera componentes del sistema CRISPR no incluidos en el primer vector. Los elementos del sistema CRISPR que se combinan en un vector único se podrán disponer en cualquier orientación adecuada, tal como un elemento ubicado en 5' respecto a un segundo elemento ("en dirección 5' respecto" a) o en 3' respecto a este ("en dirección 3' respecto" a). La secuencia codificante de un elemento podrá estar ubicada en la misma o en una hebra opuesta a la secuencia codificante de un segundo elemento, y orientada en una dirección igual u opuesta. En algunas realizaciones, el promotor único impulsa la expresión de un transcrito que codifica una enzima CRISPR y una o más de: la secuencia guía, la secuencia pareja de tracr (ligada operablemente de manera opcional con la secuencia guía) y una secuencia traer integradas en una o más secuencias intrónicas (p. ej., cada una en un intrón diferente, dos o más en al menos un intrón o todas en un único intrón). En algunas realizaciones, la enzima CRISPR, la secuencia guía, la secuencia pareja de tracr y la secuencia tracr se ligan operablemente con el mismo promotor y se expresan a partir de este.
En algunas realizaciones, un vector comprende uno o más sitios de inserción, tales como una secuencia de reconocimiento de una endonuclesasa de restricción (también denominada como un "sitio de clonación"). En algunas realizaciones, uno o más sitios de inserción (p. ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sitios de inserción) se ubican en dirección 5' y/o en dirección 3' respecto a uno o más elementos secuenciales de uno o más vectores. En algunas realizaciones, un vector comprende un sitio de inserción en dirección 5' respecto a una secuencia pareja de tracr y, opcionalmente, en dirección 3' respecto a un elemento regulador ligado operablemente con la secuencia pareja de tracr, de modo que después de la inserción de una secuencia guía en el sitio de inserción y tras la expresión la secuencia guía dirija la unión específica respecto a la secuencia de un complejo CRISPR con una secuencia diana en una célula eucariota. En algunas realizaciones, un vector comprende dos o más sitios de inserción, estando ubicada cada sitio de inserción entre dos secuencias pareja de tracr de modo que permitan la inserción de una secuencia guía en cada sitio. Con una disposición de este tipo, las dos o más secuencias guía podrán comprender dos o más copias de una secuencia guía única, dos o más secuencias guía diferentes o combinaciones de estas. Cuando se utilizan múltiples secuencias guía diferentes, se podrá utilizar un único constructo de expresión para dirigir la actividad CRISPR a múltiples secuencias diana diferentes correspondientes dentro de una célula. Por ejemplo, un único vector podrá comprender aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más secuencias guía. En algunas realizaciones, se podrán proporcionar aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más vectores que contienen secuencias guía de este tipo y, opcionalmente, suministrarlas a una célula.
En algunas realizaciones, un vector comprende un elemento regulador ligado operablemente a una secuencia codificante de enzimas que codifica una enzima CRISPR, tal como una proteína Cas. Algunos ejemplos no limitantes de proteínas Cas incluyen Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (también conocida como Csn1 y Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, homólogos de estas o versiones modificadas de estas. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR no modificada tiene actividad de escisión de ADN, tal como Cas9. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o ambas hebras en la ubicación de una secuencia diana, tal como dentro de la secuencia diana y/o dentro de la secuencia complementaria de la secuencia diana. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o ambas hebras dentro de un intervalo que se extiende aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 o más pares de bases desde el primer o último nucleótido de una secuencia diana. En algunas realizaciones, un vector codifica una enzima CRISPR que está mutada respecto a una enzima no modificada correspondiente de modo que la enzima CRISPR mutada carece de la capacidad de escindir una o ambas hebras de un polinucleótido diana que contiene una secuencia diana. Por ejemplo una sustitución de aspartato-por-alanina (D10A) en el dominio catalítico RuvC I de Cas9 procedente de S. pyogenes convierte Cas9, una nucleasa que escinde ambas hebras, en una nickasa (que escinde una única hebra). Otros ejemplos de mutaciones que transforman Cas9 en una nickasa incluyen, sin carácter limitante, H840A, N854A y N863A. Como un ejemplo adicional, se podrán mutar dos o más dominios catalíticos de Cas9 (RuvC I, RuvC II y RuvC III o el dominio HNH) para producir una Cas9 mutada que carezca sustancialmente de toda actividad de escisión de ADN. En algunas realizaciones, una mutación D10A se combina con una o más mutaciones H840A, N854A o N863A para producir una enzima Cas9 que carezca sustancialmente de toda actividad de escisión de ADN. En algunas realizaciones, se considera que una enzima CRISPR carece sustancialmente de toda actividad de escisión de ADN cuando la actividad de escisión de ADN de la enzima mutada es inferior a aproximadamente un 25%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01% o menos con respecto a su forma no mutada. Cuando la enzima no es SpCas9, se podrán realizar mutaciones en cualquiera de los residuos correspondientes a las posiciones 10, 762, 840, 854, 863 y/o 986 de SpCas9, o en todos ellos (que se podrán determinar, por ejemplo, mediante herramientas de comparación de secuencias habituales). En particular se prefiere cualquiera de las siguientes mutaciones, o todas ellas, en SpCas9: D10A, E762A, H840A, N854A, N863A y/o D986A; así como también se contempla la sustitución conservadora de cualquiera de los aminoácidos de reemplazo. También se prefieren estas mismas (o sustituciones conservadoras de estas mutaciones) en las posiciones correspondientes de otras Cas9. Son particularmente preferidas D10 y H840 en SpCas9. Sin embargo, en otras Cas9, también se prefieren los residuos que corresponden a SpCas9 D10 y H840.
Se practicó una sustitución de aspartato-por-alanina (D10A) en el dominio catalítico RuvC I de SpCas9 para convertir la nucleasa en una nickasa (SpCas9n) (remítase a, p. ej., Sapranauskas et al., 2011, Nucleic Acis Research, 39: 9275; Gasiunas et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109:E2579), de modo que el ADN genómico en el que se ha practicado un corte monocatenario experimente la reparación dirigida por la homología sumamente fiel (HDR). El ensayo Surveyor confirmó que SpCas9n no genera indels en el protoespaciador de EMX1 diana. La expresión conjunta del ARNcr quimérico cuya diana es EMX1 (que tiene también el componente ARNtracr) con SpCas9 produjo indels en el sitio diana, mientras que la expresión conjunta con SpCas9n no lo hizo (n=3). Además, en la secuenciación de 327 amplicones no se detectó ningún indel inducido por SpCas9n. Se seleccionó el mismo locus para estudiar la HR mediada por CRISPR cotransfectando células HEK 293FT con el ARN quimérico cuya diana es EMX1, hSpCas9 o hSpCas9n, así como también un molde de RH para introducir un par de sitios de restricción (HindIII y NheiI) cerca del protoespaciador.
En la presente se describen los ortólogos preferidos. Una enzima Cas se podrá identificar como Cas9 ya que esto se puede referir a la clase general de enzimas que comparten homología con la nucleasa más grande con dominios de tipo nucleasa múltiples del sistema CRISPR de tipo II. Más preferentemente, la enzima Cas9 procede de spCas9 o saCas9 o se puede obtener a partir de estas. Con "se puede obtener a partir de" los solicitantes se refieren a que la enzima obtenida a partir de otra se basa en gran medida en una enzima natural, en el sentido que tiene un grado elevado de homología secuencial con ella, pero que se ha mutado (modificado) de alguna manera tal como se describe en la presente.
Se apreciará que las expresiones enzima CRISPR y Cas se utilizan, en general, indistintamente en la presente a menos que lo contrario sea evidente. Tal y como se ha mencionado anteriormente, muchas de las numeraciones de residuos utilizadas en la presente se refieren a la enzima Cas9 del locus CRISPR de tipo II de Streptococcus pyogenes. Sin embargo, se apreciará que esta invención incluye muchas más Cas9 de otras especies de microbios tales como SpCas9, SaCa9, St1Cas9 y así sucesivamente.
Optimización de codones
En la presente se proporciona un ejemplo de una secuencia con codones optimizados, en este caso optimizada para seres humanos (es decir, que se está optimizando para la expresión en seres humanos), remítase a la secuencia optimizada para los codones humanos de SaCas9. Aunque se prefiere esto, se apreciará que son posibles otros ejemplos y existe constancia de la optimización de codones para una especie hospedadora.
En algunas realizaciones, una secuencia codificante de enzimas que codifica una enzima CRISPR tiene los codones optimizados para la expresión en células particulares, tal como células eucariotas. Las células eucariotas podrán ser aquellas de un organismo particular, o que se obtienen a partir de este, tal como un mamífero incluidos, sin carácter limitante, un ser humano, ratón, rata, conejo, perro o un mamífero o primate no humano. En algunas realizaciones, se podrán excluir los procesos para modificar la identidad genética de la línea germinal de seres humanos y/o los procesos para modificar la identidad genética de animales que es probable que causen sufrimiento sin ningún beneficio médico sustancial al hombre o al animal, y también los animales que sean el resultado de tales procesos.
En general, la optimización de codones se refiere a un proceso de modificación de una secuencia de ácido nucleico para potenciar la expresión en las células hospedadoras de interés reemplazando al menos un codón (p. ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 o más codones) de la secuencia natural con codones que se utilizan con mayor frecuencia o que son los más utilizados en los genes de esa célula hospedadora a la vez que se mantiene la secuencia de aminoácidos natural. Diversas especies exhiben un sesgo particular por ciertos codones de un aminoácido particular. El sesgo de codones (diferencias en el uso de codones entre organismos) a menudo se correlaciona con la eficacia de traducción del ARN mensajero (ARNm), la cual a su vez se cree que depende de, entre otras cosas, las propiedades de los codones que se están traduciendo y la disponibilidad de moléculas de ARN de transferencia (ARNt) particulares. La predominancia de los ARNt seleccionados en una célula es generalmente un reflejo de los codones utilizados más frecuentemente en la síntesis peptídica. En consecuencia, los genes se pueden adaptar a medida para la expresión génica óptima en un organismo dado basándose en la optimización de codones. Se puede disponer fácilmente de las tablas de uso de codones, por ejemplo, en la "Base de Datos de Uso de Codones" disponible en www.kazusa.orjp/codon/ (visitada el 9 de julio de 2002) y estas tablas se pueden adaptar de varias maneras. Remítase a Nakamura, Y., et al. “Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000). También están disponibles algoritmos computarizados para la optimización de codones de una secuencia particular para la expresión en una célula hospedadora particular, tales como Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA). En algunas realizaciones, uno o más codones (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 o más o todos los codones) de una secuencia que codifica una enzima CRISPR corresponden al codón utilizado más frecuentemente para un aminoácido particular.
Secuencias de ubicación nuclear (NLS)
En algunas realizaciones, un vector codifica una enzima CRISPR que comprende una o más secuencias de ubicación nuclear (NLS) tal como aproximadamente o más de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más NLS. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR comprende aproximadamente o más de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más NLS en el extremo amino, o cerca de este, aproximadamente o más de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más NLS en el extremo carboxi, o cerca de este, o una combinación de estos (p. ej., una o más NLS en el extremo amino y una o más NLS en el extremo carboxi). Cuando están presentes más de una NLS cada una se podrá seleccionar independientemente de las otras, de modo que una NLS única podrá estar presente en más de una copia y/o combinada con una o más NLS diferentes presentes en una o más copias. En una realización preferida de la invención, la enzima CRISPR comprende como máximo 6 NLS. En algunas realizaciones, se considera que una NLS está cerca del extremo N o C cuando el aminoácido de la NLS más cercano está a una distancia del extremo N o C de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o más aminoácidos de la cadena polipeptídica. Los ejemplos no limitantes del NLS incluyen la secuencia NLS que se obtiene a partir de: la NLS del antígeno-T grande del virus SV40, que tiene la secuencia de aminoácidos PKKKrKV (SEQ ID nO: 64); la NLS de la nucleoplasmina (p. ej., la NLS bipartita de la nucleoplasmina con la secuencia KRPAATKKAGQAKKKK) (SEQ ID NO: 65); la NLS c-myc que tiene la secuencia de aminoácidos PAAKRVKLD (SEQ ID NO: 66) o RQRRNELKRSP (SEQ ID NO: 67); la NLS de hRNPA1 M9 que tiene la secuenda NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY (SEQ ID NO: 68); la secuencia RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV (SEQ ID NO: 69) del dominio IBB de la importina-alfa; las secuencias VSRKRPRP (SEQ ID NO: 70) y PPKKARED (SeQ ID NO: 71) de la proteína T del mioma; la secuencia POPKKKPL (SEQ ID NO: 72) de p53 humano; la secuencia SALIKKKKKMAP (SEQ ID NO: 73) de c-abl IV de ratón; las secuencias DRLRR (SEQ ID NO: 74) y PKQKKRK (SEQ ID NO: 75) del virus influenza NS1; la secuencia RKLKKKIKKL (SEQ ID NO: 76) del antígeno delta del virus de la hepatitis; la secuencia REKKKFLKRR (SEQ ID NO: 77) de la proteína Mx1 de ratón; la secuencia KRKGDEVDGVDEVAKk Ks KK (SEQ ID NO: 78) de la polimerasa poli(ADP-ribosa) humana; y la secuencia RKCLQAGMNLEARKTKK (SEQ ID NO: 79) de los receptores glucocorticoideos de las hormonas esteroides (humanos).
En general, la o las NLS tienen una potencia suficiente para impulsar la acumulación de la enzima CRISPR en una cantidad detectable en el núcleo de una célula eucariota. En general, la potencia de la actividad de ubicación nuclear se podrá derivar de varias NLS en la enzima CRISPR, la o las NLS utilizadas específicas o una combinación de estos factores. La detección de la acumulación en el núcleo se podrá realizar mediante cualquier técnica adecuada. Por ejemplo, se podrá fusionar un marcador detectable a la enzima CRISPR, de modo que se pueda visualizar la ubicación dentro de una célula, por ejemplo, combinado con un medio para detectar la ubicación del núcleo (p. ej., una tinción específica para el núcleo tal como DAPI). También se podrán aislar los núcleos celulares de las células, cuyos contenidos se podrán analizar a continuación mediante cualquier proceso adecuado para detectar proteínas, tal como, técnicas inmunohistoquímicas, inmunoelectrotransferencia o ensayo de actividad enzimática. La acumulación en el núcleo también se podrá determinar indirectamente, tal como mediante un ensayo para determinar el efecto de la formación del complejo CRISPR (p. ej., un ensayo para la escisión de ADN o la mutación en la secuencia diana, o un ensayo para determinar la actividad de la expresión génica alterada afectada por la formación del complejo CRISPR y/o la actividad de la enzima CRISPR), en comparación con un control que no se ha expuesto al complejo o a la enzima CRISPR, o expuesto a una enzima CRISPR que carece de la o las NLS.
Secuencia guía
Las guías particularmente preferidas se encuentran dentro del intervalo de 20-22 nucleótidos (nt), como se describe en la presente y en el Ejemplo 39. En general, una secuencia guía es cualquier secuencia de polinucleótidos que tiene una complementariedad suficiente con una secuencia polinucleotídica diana para hibridarse con la secuencia diana y dirigir la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR con la secuencia diana. En algunas realizaciones, el grado de complementariedad entre una secuencia guía y su secuencia diana correspondiente, cuando se alinean de manera óptima utilizando un algoritmo de alineación adecuado, es aproximadamente o más de aproximadamente un 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% o más. Se podrá determinar la alineación óptima utilizando cualquier algoritmo adecuado para alinear secuencias, cuyos ejemplos no limitantes incluyen el algoritmo de Smith-Waterman, el algoritmo de Needleman-Wunsh, los algoritmos basados en la transformada de Burrows-Wheeler (p. ej., el alineador de Burrows Wheeler), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; disponible en www.novocraft.com), ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (disponible en soap.genomics.org.cn), y Maq (disponible en maq.sourceforge.net). En algunas realizaciones, una secuencia guía tiene una longitud de aproximadamente o más de aproximadamente 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, una secuencia guía tiene una longitud inferior a aproximadamente 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 o menos nucleótidos. La capacidad de una secuencia guía para dirigir una unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia diana se podrá evaluar mediante cualquier ensayo adecuado. Por ejemplo, se podrán proporcionar los componentes de un sistema CRISPR suficientes para formar un complejo CRISPR, incluida la secuencia guía que se va a probar, a una célula hospedadora que tenga la secuencia diana correspondiente, tal como por transfección con vectores que codifican los componentes de la secuencia CRISPR, y a continuación evaluar la escisión preferente dentro de la secuencia diana, tal como mediante el ensayo Surveyor tal y como se describe en la presente. De manera similar, se podrá evaluar la escisión de una secuencia de polinucleótidos diana en un tubo de ensayo proporcionando la secuencia diana, los componentes de un complejo CRISPR, incluida la secuencia guía que se va a probar y una secuencia guía de control diferente de la secuencia guía de prueba, y comparando la unión o la tasa de escisión en la secuencia diana entre las reacciones de la secuencia guía de control y de prueba. Son posibles otros ensayos como se darán cuenta los expertos en la técnica.
Se podrá seleccionar una secuencia guía para que tenga como diana cualquier secuencia diana. En algunas realizaciones, una secuencia diana es una secuencia dentro de un genoma de una célula. Las secuencias diana ilustrativas incluyen aquellas que son singulares en el genoma diana. Por ejemplo, para las Cas9 de S. pyogenes, una secuencia diana singular en el genoma podrá incluir un sitio diana de Cas9 que tenga la forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG donde NNNNNNNNNNNNXGG (N es A, G, T o C; y X puede ser uno cualquiera) ocurre una sola vez en el genoma. Una secuencia diana singular en el genoma podrá incluir un sitio diana de Cas9 de S. pyogenes que tenga la forma MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG donde NNNNNNNNNNNXGG (N es A, G, T o C; y X puede ser uno cualquiera) ocurre una sola vez en el genoma. Para los CRISPR1 Cas9 de S. thermophilus, una secuencia diana singular en el genoma podrá incluir un sitio diana de Cas9 que tenga la forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 80) donde NNNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 81) (N es A, G, T o C; X puede ser uno cualquiera y W es A o T) ocurre una sola vez en el genoma. Una secuencia diana singular en el genoma podrá incluir un sitio diana de CRISPR1 Cas9 de S. thermophilus que tenga la forma MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 82) donde NNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 83) (N es A, G, T o C; X puede ser uno cualquiera y W es A o T) ocurre una sola vez en el genoma. Para las Cas9 de S. pyogenes, una secuencia diana singular en el genoma podrá incluir un sitio diana de Cas9 que tenga la forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG donde NNNNNNNNNNNNXGGXG (N es A, G, T o C; y X puede ser uno cualquiera) ocurre una sola vez en el genoma. Una secuencia diana singular en el genoma podrá incluir un sitio diana de Cas9 de S. pyogenes que tenga la forma MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG donde NNNNNNNNNNNXGGXG (N es A, G, T o C; y X puede ser uno cualquiera) ocurre una sola vez en el genoma. En cada una de estas secuencias, "M" podrá ser A, G, T o C y no será necesario tenerlo en cuenta para identificar una secuencia como singular.
En algunas realizaciones, se selecciona una secuencia guía para reducir el grado de estructura secundaria dentro de la secuencia guía. En algunas realizaciones, aproximadamente o menos de aproximadamente un 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% o menos de los nucleótidos de la secuencia guía participan en un emparejamiento de bases autocomplementario cuando se pliegan de manera óptima. Se podrá determinar el plegamiento óptimo mediante cualquier algoritmo de plegamiento de polinucleótidos adecuado. Algunos programas están basados en el cálculo de la mínima energía libre de Gibbs. Un ejemplo de un algoritmo de este tipo es mFold, tal como lo describen Zuker y Stiegler (Nucleic Acids Res. agosto de 1981, 133(-148): Otro ejemplo de un algoritmo de plegamiento es el servidor web con conexión a internet RNAfold, desarrollado en el Instituto de Química Teórica de la Universidad de Viena, que utiliza el algoritmo de predicción con estructura centroide (remítase a, p. ej., A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; y PA Carr y GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62).
Secuencia pareja de traer
En general, una secuencia pareja de tracr incluye cualquier secuencia que tenga una complementariedad suficiente con una secuencia tracr para promover uno o más de: (1) la escisión de una secuencia guía flanqueada por las secuencias pareja de tracr en una célula que contenga la secuencia tracr correspondiente; y (2) la formación de un complejo CRISPR en una secuencia diana, donde el complejo CRISPR comprende la secuencia pareja de tracr hibridada con la secuencia tracr. En general, el grado de complementariedad se define haciendo referencia a la alineación óptima de la secuencia pareja de tracr y la secuencia tracr, a lo largo de la longitud de la secuencia más corta de las dos. Se podrá determinar la alineación óptima mediante cualquier algoritmo de alineación adecuado y podrá además justificar las estructuras secundarias tales como la autocomplementariedad dentro de la secuencia tracr o la secuencia pareja de tracr. En algunas realizaciones, el grado de complementariedad entre la secuencia tracr y la secuencia pareja de tracr a lo largo de la longitud de la más corta de las dos cuando se alinean óptimamente es aproximadamente o más de aproximadamente un 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97.5%, 99% o más. En algunas realizaciones, la secuencia tracr tiene una longitud de aproximadamente o más de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, la secuencia tracr y la secuencia pareja de tracr están contenidas dentro de un único transcrito, de modo que la hibridación entre los dos produce un transcrito que tiene una estructura secundaria, tal como una horquilla. En una realización de la invención, el transcrito o secuencia polinucleotídica transcrita tiene al menos dos o más horquillas. En las realizaciones preferidas, el transcrito tiene dos, tres, cuatro o cinco horquillas. En una realización adicional de la invención, el transcrito tiene como máximo cinco horquillas. En una estructura de horquilla, la porción de la secuencia 5' de la "N" final y que está en dirección 5' respecto al bucle se corresponde con la secuencia pareja de tracr, y la porción de la secuencia 3' del bucle se corresponde con la secuencia tracr. Algunos ejemplos adicionales no limitantes de polinucleótidos únicos que comprenden una secuencia guía, una secuencia pareja de tracr y una secuencia tracr son como se indica a continuación (enunciados de 5' a 3'), donde "N" representa una base de una secuencia guía, el primer bloque de letras en minúscula representa la secuencia pareja de tracr y el segundo bloque de letras en minúscula representa la secuencia tracr, y la secuencia final de poli-T representa el terminador de la transcripción: (1) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccct gt cattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT (SEQ ID NO: 84);
(2)
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggca ggg tgttttcgttatttaaTTTTTT (SEQ ID NO: 85);
(3) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggca ggg tgtTTTTTT (SEQ ID NO: 86);
(4) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcgg tgcTTTTTT (SEQ ID NO: 87);
(5) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaac ttgaaaaagtgTTTTTTT (SEQ ID NO: 88); y (6) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTT TTTTTT (SEQ ID NO: 89). En algunas realizaciones, las secuencias (1)-(3) se utilizan combinadas con Cas9 del CRISPR1 de S. thermophilus. En algunas realizaciones, las secuencias (4)-(6) se utilizan combinadas con Cas9 de S. pyogenes. En algunas realizaciones, la secuencia tracr es un transcrito separado de un transcrito que comprende la secuencia pareja de tracr.
Molde de recombinación
En algunas realizaciones, también se proporciona un molde de recombinación. Un molde de recombinación podrá ser un componente de otro vector tal y como se describe en la presente, contenido en un vector independiente, o proporcionado como un polinucleótido independiente. En algunas realizaciones, se diseña un molde de recombinación para que actúe como molde en la recombinación homóloga, por ejemplo, dentro o cerca de una secuencia diana a la que se ha practicado un corte monocatenario o escindida por una enzima CRISPR como parte de un complejo CRISPR. Un polinucleótido de molde podrá tener cualquier longitud apropiada, tal como una longitud de aproximadamente o más de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, el polinucleótido de molde es complementario a una porción de un polinucleótido que comprende la secuencia diana. Cuando se alinean óptimamente, el polinucleótido de molde se podrá solapar con uno o más nucleótidos de una secuencia diana (p. ej., de aproximadamente o más de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20 o más nucleótidos). En algunas realizaciones, cuando una secuencia molde y un polinucleótido que comprende una secuencia diana se alinean óptimamente, el nucleótido más cercano del polinucleótido de molde está dentro de un intervalo que se extiende aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000 o más nucleótidos desde la secuencia diana. En la presente se proporciona un análisis adicional sobre la vía HDR, por ejemplo, en relación con los “complejos CRISPR”.
Proteína de fusión
En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es parte de una proteína de fusión que comprende uno o más dominios proteicos heterólogos (p. ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dominios además de la enzima CriSp R). Una proteína de fusión de una enzima CRISPR podrá comprender cualquier secuencia proteica adicional y, opcionalmente, una secuencia conectora entre dos dominios cualesquiera. Los ejemplos de dominios proteicos que se podrán fusionar con una enzima CRISPR incluyen, sin carácter limitante, epítopos de identificación, secuencias génicas indicadoras y dominios proteicos que tienen una o más de las siguientes actividades: actividad metilasa, actividad desmetilasa, actividad de activación de la transcripción, actividad de represión de la transcripción, actividad del factor liberador de la transcripción, actividad de modificación de histonas, actividad de escisión del ARN y actividad de unión a ácido nucleico. Los ejemplos no limitantes de epítopos de identificación incluyen los identificadores de histidina (His), identificadores V5, identificadores FLAG, identificadores de la hemaglutinina de influenza (HA), identificadores Myc, identificadores VSV-G e identificadores de tiorredoxina (Trx). Los ejemplos de genes indicadores incluyen, sin carácter limitante, glutatión-S-transferasa (GST), peroxidasa de rábano picante (HRP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa, luciferasa, proteína fluorescente verde (GFP), HcRed, DsRed, proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente amarilla (YPF) y proteínas autofluorescentes incluida la proteína fluorescente azul (BFP). Se podrá fusionar una enzima CRISPR a una secuencia génica que codifique una proteína o un fragmento de una proteína que se une a moléculas de ADN o que se une a otras moléculas celulares incluidas, sin carácter limitante, la proteína de unión a maltosa (MBP), identificador S, fusiones del dominio de unión a ADN Lex A (DBD), fusiones del dominio de unión a ADN GAL4 y fusiones de la proteína BP16 del virus del herpes simple (HSV). Dominios adicionales que podrán formar parte de una proteína de fusión que comprende una enzima CRISPR se describen en US20110059502. En algunas realizaciones, se utiliza una enzima CRISPR marcada para identificar la ubicación de una secuencia diana.
Sistema inducible
En algunas realizaciones, una enzima CRISPR podrá formar un componente de un sistema inducible. La naturaleza inducible del sistema permitiría el control espaciotemporal de la edición génica o expresión génica utilizando una forma de energía. La forma de energía podrá incluir, sin carácter limitante, la radiación electromagnética, energía sonora, energía química y energía térmica. Los ejemplos de un sistema inducible incluyen promotores inducibles por tetraciclina (Tet-On o Tet-Off), sistemas activadores de la transcripción de doble híbrido que son moléculas de bajo peso molecular (FKBP, ABA, etc.) o sistemas inducibles por la luz (Fitocromo, dominios LOV o criptocromo). En una realización, la enzima CRISPR podrá ser una parte de un efector transcripcional inducible por la luz (LITE, por sus siglas en inglés) para dirigir cambios en la actividad transcripcional de una manera específica de la secuencia. Los componentes de una luz podrán incluir una enzima CRISPR, un heterodímero de un criptocromo que responde a la luz (p. ej., de Arabidopsis thaliana) y un dominio de activación/represión transcripcional. Los ejemplos adicionales de proteínas de unión a ADN inducibles y métodos para su uso se proporcionan en US 61/736465 y US 61/721 283.
Suministro
En algunos aspectos, la divulgación proporciona métodos que comprenden suministrar uno o más polinucleótidos, tal como uno o más vectores como se describen en la presente, uno o más transcritos de estos y/o una o proteínas transcritas a partir de ellos, a una célula hospedadora. En algunos aspectos, la divulgación proporciona además células producidas mediante tales métodos y animales que comprenden tales células o producidos a partir de ellas. En algunas realizaciones, se suministra a una célula una enzima CRISPR combinada con (y opcionalmente complejada con) una secuencia guía. Se pueden utilizar métodos de transferencia génica con virus y sin virus convencionales para introducir ácidos nucleicos en células de mamíferos o tejidos diana. Se pueden utilizar tales métodos para administrar ácidos nucleicos que codifican componentes de un sistema CRISPR a células en cultivo o en un organismo hospedador. Los sistemas de suministro con vectores no víricos incluyen plásmidos de ADN, ARN (p. ej., un transcrito de un vector descrito en la presente), ácido nucleico desnudo y ácido nucleico complejado con un vehículo de suministro, tal como un liposoma. Los sistemas de suministro vectoriales víricos incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episómicos o integrados tras el suministro a la célula. Para una revisión de los procedimientos de la terapia génica remítase a Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel y Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani y Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer y Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31 -44 (1995); Haddada et al., en Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler y Bóhm (eds) (1995); y Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).
Los métodos de suministro no víricos de ácidos nucleicos incluyen la lipofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión o lípido:ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales y captación de ADN potenciada por un agente. La lipofección se describe, p. ej., en las patentes de los EE. UU. con N.os 5 049 386, 4 946 787 y 4 897 355) y los reactivos de lipofección están comercializados (p. ej., Transfectam™ y Lipofectin™). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para una lipofección con reconocimiento del receptor eficaz de polinucleótidos incluyen los de Felgner, WO 91/17424; WO 91/16024. Se puede realizar el suministro a células (p. ej., administración in vitro o ex vivo) o a tejidos diana (p. ej., administración in vivo).
La preparación de complejos lípido:ácido nucleico, incluidos los liposomas dirigidos tales como los complejos de inmunolípidos, es muy conocida por el experto en la técnica (remítase a, p. ej., Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); patentes de los EE. UU. con N.os 4186183, 4217344, 4235871,4261 975, 4485054, 4501 728, 4774 085, 4837028 y 4946787).
El uso de sistemas con ARN o ADN vírico para el suministro de ácidos nucleicos aprovecha los procesos sumamente evolucionados para dirigir un virus a células específicas en el cuerpo y para introducir la carga dañina viral en el núcleo. Los vectores víricos se pueden administrar directamente a pacientes (in vivo) o se pueden utilizar para tratar células in vitro y las células modificadas se podrán administrar opcionalmente a pacientes (ex vivo). Los sistemas con virus convencionales podrían incluir vectores retrovíricos, lentivíricos, adenovíricos, adenoasociados y del virus del herpes simple para la transferencia génica. La integración en el genoma hospedador es posible con métodos de transferencia génica con retrovirus, lentivirus y virus adenoasociados y a menudo dan como resultado la expresión a largo plazo del transgén insertado. Además, se han observado eficacias de transducción elevadas en muchos tipos celulares y tejidos diana diferentes.
Se puede alterar el tropismo de un retrovirus incorporando proteínas de la envoltura foráneas para expandir la población diana potencial de células diana. Los vectores lentivíricos son vectores retrovíricos que son capaces de transducir o infectar células que no se dividen y normalmente producen títulos víricos elevados. La selección de un sistema de transferencia génico retrovírico podría depender, por lo tanto, del tejido diana. Los vectores retrovíricos comprenden repeticiones terminales largas que actúan en cis con capacidad de empaquetar hasta 6-10 kb de una secuencia foránea. Los LTR que actúan en cis mínimos son suficientes para la replicación y empaquetamiento de los vectores, que se utilizan a continuación para integrar el gen terapéutico en la célula diana para proporcionar una expresión del transgén permanente. Los vectores retrovíricos utilizados ampliamente incluyen los basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de la leucemia de monos gibones (GaLV), virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y combinaciones de estos (remítase a, p. ej., Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol.
63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700).
En otra realización, se contemplan partículas de vectores retrovíricos pseudotipados con envoltura de vesiculovirus Cocal (remítase a, p. ej., la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20120164118 adjudicada al Centro de Investigación sobre el Cáncer Fred Hutchinson). El virus cocal pertenece al género de vesiculovirus y es el agente causante de la estomatitis vesicular en mamíferos. El virus Cocal se aisló en un primer momento de ácaros en Trinidad (Jonkers et al., Am. J. Vet. Res. 25:236-242 (1964)) y se han identificado infecciones en Trinidad, Brasil y Argentina de insectos, ganado y caballos. Muchos de los vesiculovirus que infectan mamíferos se han aislado de artrópodos infectados de manera natural lo que sugieren que se transmiten mediante vectores. Los anticuerpos contra vesiculovirus son comunes entre personas que viven en áreas rurales donde los virus son endémicos y adquiridos en laboratorio; las infecciones en seres humanos normalmente conllevan síntomas similares a la gripe. La glucoproteína de la envoltura del virus Cocal comparte un 71.5% de identidad a nivel aminoacídico con el VSV-G Indiana y la comparación filogenética del gen de la envoltura de vesiculovirus muestra que el virus Cocal es serológicamente distinto, aunque estrechamente relacionado con ellas, de las cepas de VSV-G Indiana entre los vesiculovirus. Jonkers et al., Am. J. Vet. Res.25:236-242 (1964) y Travassos da Rosa et al., Am. J. Tropical Med. & Hygiene 33:999-1006 (1984). Las partículas del vector retrovírico pseudotipado con la envoltura del vesiculovirus Cocal podrán incluir, por ejemplo, partículas de vectores lentivíricos, alfarretrovíricos, betarretrovíricos, gammarretrovíricos, deltarretrovíricos y epsilonretrovíricos que podrán comprender la Gag, Pol y/o una o más proteínas accesorias retrovíricas y una proteína de envoltura del vesiculovirus Cocal. En ciertos aspectos de estas realizaciones, la Gag, Pol y proteínas accesorias son lentivíricas y/o gammaretrovíricas.
En las aplicaciones en las que se prefiere la expresión transitoria se podrán utilizar sistemas derivados de adenovirus. Los vectores derivados de adenovirus son capaces de una eficacia de transducción muy elevada en muchos tipos celulares y no requieren división celular. Con este tipo de vectores se han obtenido niveles de expresión y títulos elevados. Este vector se puede producir en grandes cantidades en un sistema relativamente simple.
Los vectores de virus adenoasociados ("AAV") también se podrán utilizar para transducir células con ácidos nucleicos diana, p. ej., en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos y para los procedimientos de terapia génica in vivo y ex vivo (remítase a, p. ej., West et al., Virology 160:38-47 (1987); patentes de los EE. UU. N.os 4 797 368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). La construcción de vectores de AAV recombinantes se describe en varias publicaciones, que incluyen la patente de los EE. UU. N.° 5173 414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat y Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); y Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989).
Normalmente se utilizan células empaquetadoras para formar partículas de virus que son capaces de infectar una célula hospedadora. Este tipo de células incluyen las células 293, que empaquetan adenovirus, y las células ^2 o células PA317, que empaquetan retrovirus. Los vectores víricos que se utilizan en la terapia génica se generan normalmente mediante una línea celular productora que empaqueta un vector con ácido nucleico para obtener una partícula vírica. Los vectores contienen normalmente las secuencias víricas mínimas requeridas para el empaquetamiento e integración posterior en un hospedador, reemplazándose otras secuencias víricas por un casete de expresión para el polinucleótido o los polinucleótidos que se van a expresar. Las funciones víricas ausentes se suministran normalmente por un mecanismo en trans desde la línea celular empaquetadora. Por ejemplo, los vectores AAV utilizados en la terapia génica normalmente poseen tan solo secuencias ITR procedentes del genoma de AAV necesarias para el empaquetamiento e integración en el genoma hospedador. El ADN vírico se empaqueta en una línea celular, que contiene un plásmido cooperador que codifica otros genes de AAV, concretamente rep y cap, pero que carece de las secuencias ITR. La línea celular también se podrá infectar con adenovirus como virus cooperador. El virus cooperador promueve la replicación del vector de AAV y la expresión de los genes de AAV procedentes del plásmido cooperador. El plásmido cooperador no se empaqueta en cantidades significativas debido a la ausencia de secuencias ITR. La contaminación con adenovirus se puede reducir mediante, p. ej., tratamiento térmico al cual los adenovirus son más sensibles que los AAV.
En consecuencia, AAV se considera un candidato ideal para su uso como vector transductor. Tales vectores de transducción de AAV pueden comprender funciones que actúan en cis suficientes para replicarse en presencia de funciones cooperadoras de adenovirus o herpesvirus o poxvirus (p. ej. el virus de la variolovacuna) que se proporcionen en trans. Se pueden utilizar AAV recombinantes (AAVr) para portar genes exógenos al interior de las células de varios linajes. En estos vectores, se eliminan los genes cap y/o rep de AAV del genoma vírico y se reemplazan con el segmento de ADN escogido. Los vectores de AAV actuales podrán alojar hasta 4300 bases de ADN insertado.
Se dispone de varias maneras de producir AAVr, y la divulgación proporciona AAVr y métodos para preparar AAVr. Por ejemplo, células infectadas se someten a una transfección con AAV con el plásmido o los plásmidos que contienen o están constituidos esencialmente por el constructo deseado. Además, estas células se someten a una transfección conjunta con un segundo plásmido cooperador o un plásmido cooperador adicional para proporcionar los genes rep y/o cap de AAV que son obligatorios para la replicación y empaquetamiento del constructo vírico recombinante. En estas condiciones, las proteínas rep y/o cap de AAV actúan en trans para estimular la replicación y empaquetamiento del constructo de AAVr. De dos a tres días después de la transfección, se recolecta el AAVr. Tradicionalmente, el AAVr se recolecta de las células junto con el adenovirus. A continuación se inactiva el adenovirus contaminante por tratamiento térmico. En la presente invención, se recolecta convenientemente AAVr no de las propias células sino del sobrenadante celular. En consecuencia, en un aspecto inicial, la divulgación proporciona la preparación de AAVr y, además de lo anterior, se puede preparar AAVr mediante un método que comprenda o esté constituido esencialmente por: la infección de células susceptibles con un AAVr que contenga ADN exógeno, que incluye ADN para su expresión, y un virus cooperador (p. ej., adenovirus, herpesvirus, poxvirus tal como el virus de la variolovacuna) donde el AAVr carece de cap y/o rep operativas (y el virus cooperador (p. ej., adenovirus, herpesvirus, poxvirus tal como el virus de la variolovacuna) proporciona la función cap y/o rev de la que carecen los AAVr); o la infección de células susceptibles con un AAVr que contenga ADN exógeno, que incluye ADN para su expresión, donde el recombinante carece de cap y/o rep operativas y la transfección de dichas células con un plásmido que suministre la función cap y/o rep de la que el AAVr carece; o la infección de células susceptibles con un AAVr que contenga ADN exógeno, que incluye ADN para su expresión, donde el recombinante carece de cap y/o rep operativas, donde dichas células suministran la función cap y/o rep de la que carece el recombinante; o la transfección de células susceptibles con un AAV que carece de cap y/o rep operativas y plásmidos para insertar ADN exógeno en el recombinante de modo que el recombinante exprese el a Dn exógeno y para suministrar las funciones rep y/o cap, de esta manera la transfección da como resultado un AAVr que contiene el ADN exógeno incluido ADN para la expresión que carece de cap y/o rep operativas.
El AAVr puede proceder de un AAV tal y como se describe en la presente, y convenientemente puede ser un rAAV1, rAAV2, AAV5 o rAAV que tiene una cápside híbrida que podrá comprender a AV1, AAV2, AAV5 o cualquier combinación de estos. Se puede seleccionar el AAV del AAVr teniendo en cuenta las células que serán la diana de los AAVr; p. ej., se pueden seleccionar los serotipos 1, 2, 5 de AAV o un híbrido o cápside de AAV1, AAV2, AAV5 o cualquier combinación de estos cuando la diana sean células neuronales o del cerebro; y se puede seleccionar AAV4 cuando la diana será el tejido cardiaco.
Además de células 293, se pueden utilizar otras células al llevar a la práctica la invención y la infectividad relativa de ciertos serotipos de AAV in vitro en lo que se refiere a esas células (remítase a Grimm, D. et al, J. Virol. 82: 5887-5911 (2008)) son las siguientes:
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La divulgación proporciona AAVr que contiene o está constituido esencialmente por una molécula de ácido nucleico exógena que codifica un sistema CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas espaciadas entre sí regularmente y agrupadas), p. ej., varios casetes que comprenden o están constituidos por un primer casete que comprende o está constituido esencialmente por un promotor, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína (Cas) asociada a CRISPR (proteínas helicasa o nucleasa putativa), p. ej., Cas9 y un terminador, y dos o más, convenientemente hasta el límite del tamaño de empaquetamiento del vector, p. ej., en total (incluido el primer casete) cinco, casetes que comprenden o están constituidos esencialmente de un promotor, molécula de ácido nucleico que codifica ARN guía (ARNg) y un terminador (p. ej., cada casete se representa esquemáticamente como Promotor-ARNg1-terminador, Promotor-ARNg2-terminador... Promotor-ARNg(N)-terminador (donde N es un número que se puede insertar que está en el límite superior del límite del tamaño de empaquetamiento del vector) o dos o más AAVr individuales, donde cada uno contiene uno o más de un casete de un sistema CRISPR, p. ej., un primer AAVr que contiene el primer casete que comprende o está constituido esencialmente por un promotor, una molécula de ácido nucleico que codifica Cas, p. ej., Cas9 y un terminador, y un segundo AAVr que contiene varios, cuatro, casetes que comprenden o están constituidos esencialmente por un promotor, una molécula de ácido nucleico que codifica un ARN guía (ARNg) y un terminador (p. ej., cada casete se representa esquemáticamente como Promotor-ARNg1-terminador, Promotor-ARNg2-terminador... Promotor-ARNg(N)-terminador (donde N es un número que se puede insertar que está en el límite superior del límite del tamaño de empaquetamiento del vector). Ya que AAVr es un virus con ADN, las moléculas de ácido nucleico en la presente discusión que trata sobre AAV o AAVr son convenientemente ADN. El promotor es convenientemente en algunas realizaciones el promotor de la sinapsina I humana (hSyn).
Los expertos en la técnica conocen métodos adicionales para el suministro de ácidos nucleicos a las células. Remítase a, por ejemplo, US20030087817. Remítase también al documento de Kanasty.
En algunas realizaciones, se transfecta una célula hospedadora de manera transitoria o no transitoria con uno o más vectores descritos en la presente. En algunas realizaciones, se transfecta una célula tal como ocurre de manera natural en un sujeto. En algunas realizaciones, la célula que se transfecta se toma de un sujeto. En algunas realizaciones, la célula se obtiene a partir de células que se toman de un sujeto, tal como una línea celular. En la técnica existe constancia de una gran variedad de líneas celulares para el cultivo tisular. Los ejemplos de líneas celulares incluyen, sin carácter limitante, C8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panc1, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, células epiteliales de riñón de mono BS-C-1, fibroblastos embrionarios de ratón BALB/ 3T3, 3T3 suizo, 3T3-L1, fibroblastos fetales embrionarios 132-d5; fibroblastos de ratón 10.1, 293-T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, células BCP-1, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepa1c1c7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, células JY, células K562, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, líneas celulares OPCN / OPCT, Peer, PNT-1A / PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, células Saos-2, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, línea celular THP1, U373, U87, U937, VCaP, células Vero, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR y variedades transgénicas de estos. Estas líneas celulares se pueden adquirir de varios proveedores que conocen los expertos en la técnica (remítase a, p. ej., la Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC, por sus siglas en inglés) (Manassus, Va.)). En algunas realizaciones, se utiliza una célula transfectada con uno o más vectores descritos en la presente para establecer una nueva línea celular que comprenda una o más secuencias derivadas de un vector. En algunas realizaciones, se utiliza una célula transfectada de manera transitoria con los componentes de un sistema CRISPR tal y como se describen en la presente (por ejemplo, mediante la transfección transitoria de uno o más vectores o la transfección con ARN) y modificada mediante la actividad de un complejo CRISPR para establecer una nueva línea celular que comprenda células que contengan la modificación pero que carezcan de cualquier otra secuencia exógena. En algunas realizaciones, se utilizan células transfectadas de manera transitoria o no transitoria con uno o más vectores descritos en la presente, o se utilizan líneas celulares obtenidas a partir de tales células para evaluar uno o más compuestos de prueba.
En algunas realizaciones, se utilizan uno o más vectores descritos en la presente para producir un animal no humano transgénico o una planta transgénica. En algunas realizaciones, el animal transgénico es un mamífero, tal como un ratón, rata o conejo. En la técnica existe constancia de métodos para producir plantas y animales transgénicos y generalmente comienzan con un método de transfección celular, tal como se describe en la presente.
En otra realización, se podrá contemplar un dispositivo para el suministro de fluidos con una matriz de agujas (remítase a, p. ej., la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20110230839 adjudicada al Centro de Investigación sobre el Cáncer Fred Hutchinson) para el suministro de CRISPR Cas al tejido sólido. Un dispositivo de la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20110230839 para el suministro de un fluido a un tejido sólido podrá comprender un conjunto de agujas dispuestas en una matriz; un conjunto de depósitos, cada uno en comunicación fluida con un elemento respectivo del conjunto de agujas; y un conjunto de actuadores acoplados operativamente con los elementos respectivos del conjunto de depósitos y configurado para controlar la presión fluida dentro del depósito. En ciertas realizaciones, cada elemento del conjunto de actuadores podrá comprender un elemento de un conjunto de émbolos, donde un primer extremo de cada elemento del conjunto de émbolos se aloja en un elemento respectivo del conjunto de depósitos y en ciertas realizaciones adicionales los émbolos del conjunto de émbolos se acoplan operativamente entre sí en los segundos extremos respectivos de modo que se desplacen hacia abajo simultáneamente. Ciertas realizaciones adicionales más podrán comprender un empujador de émbolos configurado para desplazar hacia abajo todos los elementos del conjunto de émbolos con una velocidad variable de manera selectiva. En otras realizaciones, cada elemento del conjunto de actuadores podrá comprender un elemento del conjunto de líneas de transmisión fluida que tenga un primer y segundo extremos, donde un primer extremo de cada elemento del conjunto de líneas de transmisión fluida se acopla con un elemento respectivo del conjunto de depósitos. En otras realizaciones, el dispositivo podrá comprender una fuente de presión fluida y cada elemento del conjunto de actuadores comprenderá un acoplamiento fluido entre la fuente de presión fluida y un elemento respectivo del conjunto de depósitos. En realizaciones adicionales, la fuente de presión fluida podrá comprender al menos uno de: compresor, acumulador de vacío, bomba peristáltica, cilindro maestro, bomba microfluídica y válvula. En otra realización, cada elemento del conjunto de agujas podrá comprender un conjunto de conexiones distribuidas a lo largo de su longitud.
Modificación de una diana
En un aspecto, la divulgación proporciona métodos para modificar un polinucleótido diana en una célula eucariota que podrán ser in vivo, ex vivo o in vitro. En algunas realizaciones, el método comprende obtener muestras o realizar biopsias de una célula o población de células de un ser humano o animal no humano y modificar la célula o las células. El cultivo podrá tener lugar en cualquier etapa ex vivo. La célula o las células incluso podrán reintroducirse al animal no humano. En el caso de las células reintroducidas, se prefiere particularmente que las células sean células madre.
En algunas realizaciones, el método comprende permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleótido diana para efectuar la escisión de dicho polinucleótido diana y modificar de este modo el polinucleótido diana, donde el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada con una secuencia diana dentro de dicho polinucleótido diana, donde dicha secuencia guía se une a una secuencia pareja de tracr que a su vez se hibrida con una secuencia tracr.
En un aspecto, la divulgación proporciona un método para modificar la expresión de un polinucleótido en una célula eucariota. En algunas realizaciones, el método comprende permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleótido de modo que dicha unión de como resultado un aumento o un descenso de la expresión de dicho polinucleótido; donde el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada con una secuencia diana dentro de dicho polinucleótido, donde dicha secuencia guía se une a una secuencia pareja de tracr que a su vez se hibrida con una secuencia tracr. Para los métodos de modificación de un polinucleótido diana son válidas consideraciones y condiciones similares a las mencionadas anteriormente. De hecho, estas opciones de obtención de muestras, cultivo y reintroducción son válidas en todos los aspectos de la presente invención.
Ciertamente, en cualquier aspecto de la invención, el complejo CRISPR podrá comprender una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada con una secuencia diana, donde dicha secuencia guía podrá estar ligada a una secuencia pareja de tracr que a su vez se podrá hibridar con una secuencia tracr. Para los métodos de modificación de un polinucleótido diana son válidas consideraciones y condiciones similares a las mencionadas anteriormente.
Kits
En un aspecto, la divulgación proporciona kits que contienen cualquier o cualesquiera elementos divulgados en los métodos y composiciones anteriores. Se podrán proporcionar los elementos individualmente o combinados y se podrán proporcionar en cualquier envase adecuado tal como un vial, botella o tubo. En algunas realizaciones, el kit incluye instrucciones en uno o más idiomas, por ejemplo, en más de un idioma.
En algunas realizaciones, un kit comprende uno o más reactivos para su uso en un proceso que utilice uno o más de los elementos descritos en la presente. Se podrán proporcionar los reactivos en cualquier envase adecuado. Por ejemplo, un kit podrá proporcionar uno o más tampones de reacción o de almacenamiento. Se podrán proporcionar los reactivos en una forma que se pueda utilizar en un ensayo particular, o en una forma que requiera la adición de uno o más componentes diferentes antes de su uso (p. ej., en forma concentrada o liofilizada). Un tampón puede ser cualquier tampón incluidos, sin carácter limitante, un tampón de carbonato de sodio, un tampón de bicarbonato de sodio, un tampón de borato, un tampón Tris, un tampón MOPS, un tampón HEPES y combinaciones de estos. En algunas realizaciones, el tampón es alcalino. En algunas realizaciones, el tampón tiene un pH comprendido entre aproximadamente 7 y aproximadamente 10. En algunas realizaciones, el kit comprende uno o más oligonucleótidos que corresponden a una secuencia guía para la inserción en un vector de modo que se ligue operablemente la secuencia guía y un elemento regulador. En algunas realizaciones, el kit comprende un polinucleótido molde de recombinación homóloga. En algunas realizaciones, el kit comprende uno o más de los vectores y/o uno o más de los polinucleótidos descritos en la presente. El kit podrá permitir convenientemente que se proporcionen todos los elementos de los sistemas de la invención.
Complejo CRISPR
En un aspecto, la divulgación proporciona métodos para utilizar uno o más elementos de un sistema CRISPR. El complejo CRISPR proporciona un medio eficaz para modificar un polinucleótido diana. El complejo CRISPR de la invención tiene una amplia variedad de utilidades que incluyen modificar (p. ej., eliminar, insertar, traslocar, inactivar, activar) un polinucleótido diana en una multiplicidad de tipos celulares. En este sentido, el complejo CRISPR tiene un amplio espectro de aplicaciones en, p. ej., terapia génica, cribado de fármacos, diagnóstico y pronóstico de enfermedades. Un complejo CRISPR ilustrativo comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada con una secuencia diana dentro del polinucleótido diana. La secuencia guía se une a una secuencia pareja de tracr, que a su vez se hibrida con una secuencia tracr.
En una realización, esta divulgación proporciona un método para escindir un polinucleótido diana. El método comprende modificar un polinucleótido diana utilizando un complejo CRISPR que se una al polinucleótido diana y efectúe la escisión de dicho polinucleótido diana. Normalmente, el complejo CRISPR de la divulgación, cuando se introduce en una célula, crea una rotura (p. ej., una rotura mono- o bicatenaria) en la secuencia genómica. Por ejemplo, se puede utilizar el método para escindir un gen ligado a una enfermedad en una célula.
La rotura creada por el complejo CRISPR se puede reparar mediante procesos de reparación tal como la ruta de unión de extremos no homólogos propensa a error (NHEJ) o la reparación dirigida por homología sumamente fiel (HDR) (Fig. 29). Durante este proceso de reparación, se puede introducir un molde de polinucleótidos exógeno en la secuencia genómica. En algunos métodos, el proceso de HDR se utiliza para modificar la secuencia genómica. Por ejemplo, se introduce en una célula un molde de polinucleótidos exógeno que comprende una secuencia que se va a integrar flanqueada por una secuencia en dirección 5' y una secuencia en dirección 3'. Las secuencias en dirección 5' y en dirección 3' comparten similaridad secuencial con cualquier lado de un sitio de integración del cromosoma.
Cuando se desee, un polinucleótido donante puede ser ADN, p. ej., un plásmido de ADN, un cromosoma artificial bacteriano (BAC, por sus siglas en inglés), un cromosoma artificial de levaduras (YAC, por sus siglas en inglés), un vector vírico, un fragmento lineal de ADN, un fragmento de PCR, un ácido nucleico desnudo o un ácido nucleico complejado con un vehículo de suministro tal como un liposoma o un poloxámero.
El molde de polinucleótidos exógeno comprende una secuencia que se va a integrar (p. ej., un gen mutado). La secuencia para la integración podrá ser una secuencia endógena o exógena para la célula. Los ejemplos de una secuencia que se va a integrar incluyen polinucleótidos que codifican una proteína o ARN no codificante (p. ej., un microARN). Por lo tanto, la secuencia para la integración podrá estar ligada operablemente a una secuencia o secuencias de control apropiadas. Como alternativa, la secuencia que se va a integrar podrá proporcionar una función reguladora.
Las secuencias en dirección 5' y en dirección 3' en el molde de polinucleótidos exógeno se seleccionan para promover la recombinación entre la secuencia cromosómica de interés y el polinucleótido donante. La secuencia en dirección 5' es una secuencia de ácido nucleico que comparte similaridad secuencial con la secuencia genómica en dirección 5' respecto al sitio diana para la integración. De manera similar, la secuencia en dirección 3' es una secuencia de ácido nucleico que comparte similaridad secuencial con la secuencia cromosómica en dirección 3' respecto al sitio diana de la integración. Las secuencias en dirección 5' y en dirección 3' en el molde de polinucleótidos exógeno puede tener un 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% de identidad secuencial con la secuencia genómica diana. Preferentemente, las secuencias en dirección 5' y en dirección 3' en el molde de polinucleótidos exógeno tiene aproximadamente un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% de identidad secuencial con la secuencia genómica diana. En algunos métodos, las secuencias en dirección 5' y en dirección 3' en el molde de polinucleótidos exógeno tienen aproximadamente un 99% o un 100% de identidad secuencial con la secuencia genómica diana.
Una secuencia en dirección 5' o en dirección 3' podrá comprender de aproximadamente 20 pb a aproximadamente 2500 pb, por ejemplo, aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400 o 2500 pb. En algunos métodos, la secuencia en dirección 5' o 3' ilustrativa tiene de aproximadamente 200 pb a aproximadamente 2000 pb, de aproximadamente 600 pb a aproximadamente 1000 pb o, más particularmente, de aproximadamente 700 pb a aproximadamente 1000 pb.
En algunos métodos, el molde de polinucleótidos exógeno podrá comprender además un marcador. Un marcador de este tipo podrá facilitar el cribado para detectar las integraciones objetivo. Los ejemplos de marcadores adecuados incluyen sitios de restricción, proteínas fluorescentes o marcadores seleccionables. Se puede construir el molde de polinucleótidos exógeno utilizando técnicas recombinantes (remítase a, por ejemplo, Sambrook eta l, 2001 y Ausubel et al, 1996).
En un método ilustrativo para modificar un polinucleótido diana integrando un molde de polinucleótidos exógeno, se introduce una rotura bicatenaria en la secuencia genómica mediante el complejo CRISPR, se repara la rotura mediante recombinación homóloga con un molde de polinucleótidos exógeno de modo que se integre el molde en el genoma. La presencia de una rotura bicatenaria facilita la integración del molde.
En otras realizaciones, esta divulgación proporciona un método para modificar la expresión de un polinucleótido en una célula eucariota. El método comprende incrementar o disminuir la expresión de un polinucleótido diana utilizando un complejo CRISPR que se une al polinucleótido.
En algunos métodos, se puede inactivar un polinucleótido diana para efectuar la modificación de la expresión en una célula. Por ejemplo, tras la unión de un complejo CRISPR a la secuencia diana en una célula, el polinucleótido diana se inactiva de modo que la secuencia no se transcriba, la proteína codificada no se produce o la secuencia no funciona como lo hace la secuencia no modificada. Por ejemplo, una proteína o una secuencia codificante de microARN se podrán inactivar de modo que no se produzca la proteína.
En algunos métodos, se puede inactivar una secuencia de control de modo que ya no actúe como una secuencia de control. Tal y como se utiliza en la presente una "secuencia de control" se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que efectúa la transcripción, traducción o accesibilidad de una secuencia de ácido nucleico. Los ejemplos de una secuencia de control incluyen un promotor, un terminador de la transcripción y un potenciador son secuencias de control.
La secuencia diana inactivada podrá incluir una mutación de tipo deleción (es decir, la deleción de uno o más nucleótidos), una mutación de tipo inserción (es decir, la inserción de uno o más nucleótidos) o una mutación interruptora (es decir, una sustitución de un único nucleótido por otro nucleótido de modo que se introduzca un codón de parada). En algunos métodos, la inactivación de una secuencia diana da como resultado una "desactivación" de la secuencia diana.
Modelos de enfermedades
Se podrá utilizar un método de la invención para crear un animal o célula que se podrá utilizar como un modelo de una enfermedad. Tal y como se utiliza en la presente, "enfermedad" se refiere a una enfermedad, trastorno o indicio en un sujeto. Por ejemplo, se podrá utilizar un método de la invención para crear un animal o célula que comprenda una modificación en una o más secuencias de ácido nucleico asociadas con una enfermedad, o una planta, animal o célula en la que está alterada la expresión de una o más secuencias de ácido nucleico asociadas con una enfermedad. Una secuencia de ácido nucleico de este tipo podrá codificar una secuencia proteica asociada con una enfermedad o podrá ser una secuencia de control asociada con una enfermedad. En consecuencia, se sobreentiende que en las realizaciones de la invención, una planta, sujeto, paciente, organismo o célula puede ser una célula, organismo, paciente o sujeto no humano. Por lo tanto, la divulgación proporciona una planta, animal o célula producidos por los métodos de la presente o una progenie de estos. La progenie podrá ser un clon del animal producido o podrá ser el resultado de la reproducción sexual por cruzamiento con otros individuos de la misma especie para lograr la introgresión de rasgos deseables adicionales en su descendencia. La célula podrá ser in vivo o ex vivo en los casos de organismos multicelulares, particularmente animales. En el caso en el que la célula esté en cultivo, se podrá establecer una línea celular si se cumplen las condiciones de cultivo apropiadas y preferentemente si la célula se adapta de manera adecuada para este fin (por ejemplo, una célula madre). Así, pues también se contemplan líneas celulares.
En algunos métodos, se puede utilizar el modelo de la enfermedad para estudiar los efectos de mutaciones en el animal o célula y el desarrollo y/o evolución de la enfermedad utilizando medidas utilizadas comúnmente en el estudio de la enfermedad. Como alternativa, un modelo de una enfermedad de este tipo es útil para estudiar el efecto de un compuesto farmacéuticamente activo en la enfermedad.
En algunos métodos, se puede utilizar el modelo de la enfermedad para evaluar la eficacia de una estrategia de terapia génica potencial. Es decir, se puede modificar un gen o polinucleótido asociados con una enfermedad de modo que se inhiba o reduzca el desarrollo y/o evolución de la enfermedad. En particular, el método comprende modificar un gen o polinucleótido asociados con una enfermedad de modo que se produzca una proteína alterada y, como resultado, el animal o célula tenga una respuesta alterada. En consecuencia, en algunos métodos, se podrá comparar un animal modificado genéticamente con un animal predispuesto al desarrollo de la enfermedad de modo que se pueda evaluar el efecto de la terapia génica.
En otra realización, esta divulgación proporciona un método para desarrollar un agente biológicamente activo que module un evento de señalización celular asociado con un gen ligado con una enfermedad. El método comprende poner en contacto un compuesto de prueba con una célula que comprenda uno o más vectores que impulsen la expresión de una o más enzimas CRISPR, una secuencia guía ligada a una secuencia pareja de tracr y una secuencia tracr; y detectar un cambio en una lectura que sea indicativa de una reducción o un aumento de un evento de señalización celular asociado con, p. ej., una mutación en un gen ligado a una enfermedad contenido en la célula.
Se puede construir un modelo en una célula, incluidos un organoide o colección de células como se describe en la presente, o un modelo en animales combinado con el método para cribar un cambio en la función celular. Se podrá utilizar un modelo de este tipo para estudiar los efectos de una secuencia genómica modificada por el complejo CRISPR en una función celular de interés. Por ejemplo, se podrá utilizar un modelo de una función celular para estudiar el efecto de una secuencia genómica modificada en la señalización intracelular o la señalización extracelular. Como alternativa, se podrá utilizar un modelo de una función celular para estudiar el efecto de una secuencia genómica modificada en la percepción sensorial. En algunos modelos de este tipo, una o más secuencias genómicas asociadas con una ruta bioquímica de señalización del modelo están modificadas.
Se han estudiado específicamente varios modelos de enfermedades. Estos incluyen los genes de riesgo del autismo de novo CHD8, KATNAL2 y SCN2A; y el gen del autismo sindrómico (síndrome Angelman) UBE3A. Obviamente, se prefieren estos genes y los modelos de autismo resultantes, pero sirven para mostrar la amplia aplicabilidad de la invención en genes y sus modelos correspondientes.
Se puede determinar una expresión alterada de una o más secuencias genómicas asociadas con una ruta bioquímica de señalización mediante un ensayo la diferencia en los niveles de ARNm de los genes correspondientes entre la célula modelo de estudio y una célula de control, cuando se ponen en contacto con un agente candidato. Como alternativa, se determina la expresión diferencial de las secuencias asociadas con una ruta bioquímica de señalización detectando una diferencia en el nivel del polipéptido codificado o producto génico.
Para determinar mediante un ensayo la alteración inducida por un agente en el nivel de los transcritos de ARNm o polinucleótidos correspondientes, se extrae en primer lugar el ácido nucleico contenido en una muestra de acuerdo con métodos habituales en la técnica. Por ejemplo, se puede aislar ARNm utilizando varias soluciones químicas o enzimas líticas de acuerdo con procedimientos expuestos en Sambrook et al. (1998), o extraer mediante resinas de unión a ácidos nucleicos siguiendo las instrucciones adjuntas que proporcionan los fabricantes. El ARNm contenido en la muestra de ácido nucleico extraída se detecta a continuación mediante procedimientos de amplificación o ensayos de hibridación convencionales (p. ej., un análisis mediante la técnica de Northern) de acuerdo con métodos ampliamente conocidos en la técnica o que se basan en los métodos ejemplificados en la presente.
A efectos de esta invención, el término amplificación se refiere a cualquier método que emplea un cebador y una polimerasa capaces de replicar una secuencia diana con una fidelidad razonable. La amplificación se puede llevar a cabo mediante polimerasas de ADN naturales o recombinantes tales como TaqGold™, ADN polimerasa T7, fragmento Klenow de la ADN polimerasa de E. coli y transcriptasa inversa. Un método de amplificación preferido es la PCR. En particular, el ARN aislado se puede someter a un ensayo de transcripción inversa que esté acoplado con una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (RT-PCR) con el fin de cuantificar el nivel de expresión de una secuencia asociada con una ruta bioquímica de señalización.
La detección del nivel de expresión génica se puede realizar en tiempo real en un ensayo de amplificación. En un aspecto, los productos amplificados se pueden visualizar directamente con agentes de unión a ADN fluorescentes que incluyen, sin carácter limitante, intercalantes de ADN y agentes de unión al surco del ADN. Debido a que la cantidad de intercalantes incorporada en las moléculas de ADN bicatenario es normalmente proporcional a la cantidad de los productos de ADN amplificados, se puede determinar convenientemente la cantidad de los productos amplificados cuantificando la fluorescencia del tinte intercalado utilizando sistemas ópticos convencionales de la técnica. El tinte de unión al ADN adecuado para esta aplicación incluye verde SYBR, azul SYBR, DAPI, yoduro de propidio, Hoeste, oro SYBR, bromuro de etidio, acridinas, proflavina, naranja de acridina, acriflavina, fluorocumanina, elipticina, daunomicina, cloroquina, distamicina D, cromomicina, homidio, mitramicina, polipiridilos de rutenio, antramicina y similares.
En otro aspecto, se pueden emplear otras marcas fluorescentes tales como sondas específicas de la secuencia en la reacción de amplificación para facilitar la detección y cuantificación de los productos amplificados. La amplificación cuantitativa con sonda se basa en la detección específica de la secuencia de un producto amplificado deseado. Utiliza sondas específicas de la diana fluorescentes (p. ej., sondas TaqMan®), lo que da como resultado un aumento de la especificidad y sensibilidad. Los métodos para realizar una amplificación cuantitativa con sonda están muy consolidados en la técnica y se exponen en la patente de los EE. UU. con N.° 5210015.
En otro aspecto más, se pueden realizar ensayos de hibridación convencionales que utilizan sondas de hibridación que comparten una homología secuencial con secuencias asociadas con una ruta bioquímica de señalización. Normalmente, se permite que las sondas formen complejos estables con las secuencias asociadas con una ruta bioquímica de señalización contenida dentro de la muestra biológica obtenida a partir del sujeto de estudio en una reacción de hibridación. El experto en la técnica comprenderá que cuando el antisentido se utiliza como el ácido nucleico sonda, los polinucleótidos diana que se proporcionan en la muestra se escogen para que sean complementarios con las secuencias de los ácidos nucleicos antisentido. Por el contrario, cuando la sonda de nucleótidos es un ácido nucleico sentido, el polinucleótido diana se selecciona para que sea complementario a las secuencias de ácido nucleico sentido. La hibridación se puede realizar en condiciones de rigurosidad variable. Las condiciones de hibridación adecuadas para llevar a la práctica la presente invención son tales que la interacción de reconocimiento entre la sonda y las secuencias asociadas con una ruta bioquímica de señalización es tanto lo suficientemente específica como lo suficientemente estable. Las condiciones que incrementan la rigurosidad de una reacción de hibridación son ampliamente conocidas y se han publicado en la técnica. Remítase a, por ejemplo, (Sambrook, etal., (1989); Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual, Boehringer Mannheim, segunda edición). El ensayo de hibridación se puede elaborar utilizando sondas inmovilizadas en cualquier soporte sólido que incluye, sin carácter limitante, nitrocelulosa, vidrio, silicio y diversas matrices génicas. Un ensayo de hibridación preferido se lleva a cabo en genochips de densidad elevada tal y como se describe en la patente de los EE. UU. con N.° 5445934.
Para una detección conveniente de los complejos sonda-diana formados durante el ensayo de hibridación, se conjugan las sondas de nucleótidos con una marca detectable. Las marcas detectables adecuadas para su uso en la presente invención incluyen cualquier composición detectable por medios fotoquímicos, bioquímicos, espectroscópicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. En la técnica existe constancia de una gran variedad de marcas detectables apropiadas, que incluyen marcas fluorescentes o quimioluminiscentes, marcas de isótopos radioactivos, enzimáticas o con otros ligandos. En las realizaciones preferidas, probablemente se deseará emplear una marca fluorescente o un identificador enzimático tal como digoxigenina, B-galactosidasa, ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, complejo avidina/biotina.
Los métodos de detección utilizados para detectar o cuantificar la intensidad de hibridación dependerán normalmente de la marca seleccionada anteriormente. Por ejemplo, las radiomarcas se podrán detectar utilizando una película fotográfica o un lector de luminiscencia fotoestimulada (phosphoimagei) Se podrán detectar y cuantificar los marcadores fluorescentes utilizando un fotodetector para detectar la luz emitida. Las marcas enzimáticas se detectan normalmente proporcionando a la enzima un sustrato y midiendo el producto de la reacción producido por la acción de la enzima sobre el sustrato; y finalmente las marcas colorimétricas se detectan simplemente visualizando la marca coloreada.
Un cambio inducido por un agente en la expresión de secuencias asociadas con una ruta bioquímica de señalización también se puede determinar examinando los productos génicos correspondientes. La determinación del nivel proteico normalmente conlleva a) poner en contacto la proteína contenida en la muestra biológica con un agente que se una específicamente a una proteína asociada con una ruta bioquímica de señalización; y (b) identificar cualquier complejo agente:proteína formado de esta manera. En un aspecto de esta realización, el agente que se une específicamente a la proteína asociada con la ruta bioquímica de señalización es un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo monoclonal. La reacción se lleva a cabo poniendo en contacto el agente con una muestra de las proteínas asociadas con una ruta bioquímica de señalización obtenida a partir de las muestras de prueba en condiciones que permitan que se forme un complejo entre el agente y las proteínas asociadas con una ruta bioquímica de señalización. La formación del complejo se puede detectar directa o indirectamente de acuerdo con procedimientos habituales en la técnica. En el método de detección directo, se suministran los agentes con una marca detectable y los agentes que no hayan reaccionado se podrán separar del complejo; y de esta manera la cantidad de marca restante indica la cantidad de complejo formado. Para un método de este tipo, es preferible seleccionar marcas que permanezcan unidas a los agentes incluso durante condiciones de lavado rigurosas. Es preferible que la marca no interfiera con la reacción de unión. Como alternativa, un procedimiento de detección indirecto podrá utilizar un agente que contenga una marca introducida química o enzimáticamente. Una marca deseable generalmente no interfiere con la unión o la estabilidad del complejo agente:polipéptido resultante. Sin embargo, la marca normalmente se diseña para que sea accesible a un anticuerpo para una unión eficaz y generar así pues una señal detectable.
En la técnica existe constancia de una amplia variedad de marcas adecuadas para detectar niveles de proteínas. Los ejemplos no limitantes incluyen radioisótopos, enzimas, metales coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos bioluminiscentes y compuestos quimioluminiscentes.
La cantidad de complejo agente:polipéptido formado durante la reacción de unión se puede cuantificar mediante ensayos cuantitativos habituales. Tal y como se ha ilustrado anteriormente, se puede medir la formación de un complejo agente: polipéptido directamente mediante la cantidad de marca que permanece en el sitio de unión. Como alternativa, se estudia la proteína asociada con una ruta bioquímica de señalización para determinar su capacidad para competir con un análogo marcado por los sitios de unión en el agente específico. En este ensayo competitivo, la cantidad de marca capturada es inversamente proporcional a la cantidad de secuencias proteicas asociadas con una ruta bioquímica de señalización presentes en una muestra de prueba.
En la técnica se dispone de varias técnicas para el análisis proteico basadas en los principios generales presentados de manera esquemática anteriormente. Estos incluyen, sin carácter limitante, radioinmunoensayos, ELISA (ensayos inmunorradiométricos enzimáticos), inmunoensayos de tipo “sándwich”, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos in situ (que utilizan, p. ej., oro coloidal, marcas con radioisótopos o enzimas), análisis por inmunoelectrotransferencia, ensayos de inmunoprecipitación, ensayos inmunofluorescentes y SDS-PAGE.
Los anticuerpos que reconocen o se unen específicamente a proteínas asociadas con una ruta bioquímica de señalización son preferibles para llevar a cabo los análisis proteicos mencionados anteriormente. Cuando se desee, se podrán utilizar anticuerpos que reconozcan un tipo específico de modificaciones postraduccionales (p. ej., modificaciones inducibles en la ruta bioquímica de señalización). Las modificaciones postraduccionales incluyen, sin carácter limitante, glicosilación, lipidación, acetilación y fosforilación. Estos anticuerpos se podrán adquirir de proveedores comerciales. Por ejemplo, los anticuerpos anti-fosfotirosina que reconocen específicamente proteínas fosforiladas en la tirosina se pueden adquirir de varios proveedores que incluyen Invitrogen y Perkin Elmer. Los anticuerpos anti-fosfotirosina son particularmente útiles para detectar proteínas que están fosforiladas de manera diferencial en sus residuos de tirosina como respuesta al estrés del RE. Tales proteínas incluyen, sin carácter limitante, el factor 2 alfa de la iniciación de la traducción eucariota (eIF-2a). Como alternativa, se pueden generar estos anticuerpos utilizando tecnologías convencionales con anticuerpos monoclonales o policlonales inmunizando un animal hospedador o una célula productora de anticuerpos con una proteína diana que exhiba la modificación postraduccional deseada.
Al llevar a la práctica el método en cuestión, puede ser deseable distinguir el patrón de expresión de una proteína asociada con una ruta bioquímica de señalización en diferentes tejidos corporales, en diferentes tipos celulares y/o en diferentes estructuras subcelulares. Estos estudios se pueden realizar con la utilización de anticuerpos específicos del tejido, específicos de la célula o específicos de la estructura subcelular que sean capaces de unirse a marcadores proteicos que se expresen de manera preferencial en ciertos tejidos, tipos celulares o estructuras subcelulares.
Una expresión alterada de un gen asociado con una ruta bioquímica de señalización también se puede determinar examinando un cambio en la actividad del producto génico respecto a una célula de control. El ensayo para determinar un cambio inducido por un agente en la actividad de una proteína asociada con una ruta bioquímica de señalización dependerá de la actividad biológica y/o la ruta de transducción de la señal que se esté estudiando. Por ejemplo, cuando la proteína es una cinasa, se puede determinar un cambio en su capacidad para fosforilar el sustrato o los sustratos posteriores mediante varios ensayos conocidos en la técnica. Los ensayos representativos incluyen, sin carácter limitante, inmunotransferencia e inmunoprecipitación con anticuerpos tales como anticuerpos anti-fosfotirosina que reconocen las proteínas fosforiladas. Además, se puede detectar la actividad cinasa mediante ensayos quimioluminiscentes ultrarrápidos tales como el ensayo AlphaScreen™ (se puede adquirir de Perkin Elmer) y eTag™ (Chan-Hui, et al. (2003) Clinical Immunology 111: 162-174).
Cuando la proteína asociada con una ruta bioquímica de señalización es parte de una cascada de señalización que conlleva una fluctuación de estado del pH intracelular, las moléculas sensibles al pH tales como tintes de pH fluorescentes se pueden utilizar como las moléculas indicadoras. En otro ejemplo, cuando la proteína asociada con una ruta bioquímica de señalización es un canal iónico, se pueden monitorizar las fluctuaciones en el potencial de membrana y/o concentración iónica intracelular. Varios kits comerciales y dispositivos ultrarrápidos son particularmente adecuados para un cribado rápido y robusto que detecte moduladores de canales iónicos. Los instrumentos representativos incluyen FLIPRTM (Molecular Devices, Inc.) y VIPR (Aurora Biosciences). Estos instrumentos son capaces de detectar reacciones simultáneamente en más de 1000 pocillos de muestra de una microplaca y de proporcionar medidas en tiempo real y datos funcionales en un segundo o incluso un milisegundo.
Al llevar a la práctica cualquiera de los métodos divulgados en la presente, se puede introducir un vector adecuado en una célula o un embrión mediante uno o más métodos conocidos en la técnica incluidos, sin carácter limitante, microinyección, electroporación, sonoporación, biolística, transfección mediada por fosfato de calcio, transfección catiónica, transfección con liposomas, transfección con dendrímeros, transfección por choque térmico, transfección por nucleofección, magnetofección, lipofección, empalafección (impalafection), transfección óptica, captación de ácidos nucleicos potenciada mediante un agente exclusivo y suministro mediante liposomas, inmunoliposomas, virosomas o viriones artificiales. En algunos métodos, se introduce el vector en un embrión por microinyección. El vector o los vectores se podrán microinyectar en el núcleo o en el citoplasma del embrión. En algunos métodos, el vector o los vectores se podrán introducir en una célula por nucleofección.
El polinucleótido diana de un complejo CRISPR puede ser cualquier polinucleótido endógeno o exógeno respecto a la célula eucariota. Por ejemplo, el polinucleótido diana puede ser un polinucleótido que resida en el núcleo de una célula eucariota. El polinucléotido diana puede ser una secuencia que codifique un producto génico (p. ej., una proteína) o una secuencia no codificante (p. ej., un polinucleótido regulador o ADN no codificante).
Los ejemplos de polinucleótidos diana incluyen una secuencia asociada con una ruta bioquímica de señalización, p. ej., un gen o un polinucleótido asociados con una ruta bioquímica de señalización. Los ejemplos de polinucleótidos diana incluyen un gen o polinucleótido asociado con una enfermedad. Un gen o polinucleótido "asociados con una enfermedad" se refiere a cualquier gen o polinucleótido que genere productos de transcripción o traducción con un nivel anómalo o en una forma anómala en células que se obtienen a partir de tejidos afectados por una enfermedad en comparación con tejidos o células de un control libre de la enfermedad. Podrá ser un gen que se exprese con un nivel anómalamente alto; podrá ser un gen que se exprese con un nivel anómalamente bajo, donde la expresión alterada se correlacione con la presencia y/o evolución de la enfermedad. Un gen asociado con una enfermedad también se refiere a un gen que posee una o más mutaciones o una variación genética que es responsable directamente de un gen o genes que son responsables por la etiología de una enfermedad o que está en un desequilibro de ligamiento con ellos. Los productos transcritos o traducidos podrán ser conocidos o desconocidos y podrán tener un nivel normal o anómalo. El polinucleótido diana de un complejo CRISPR puede ser cualquier polinucleótido endógeno o exógeno respecto a la célula eucariota. Por ejemplo, el polinucleótido diana puede ser un polinucleótido que resida en el núcleo de una célula eucariota. El polinucléotido diana puede ser una secuencia que codifique un producto génico (p. ej., una proteína) o una secuencia no codificante (p. ej., un polinucleótido regulador o ADN no codificante). Sin querer ceñirse a ninguna teoría, se cree que la secuencia diana debería estar asociada con un PAM (motivo adyacente a un protoespaciador); es decir, una secuencia corta reconocida por el complejo CRISPR. Los requisitos de secuencia y longitud precisos para el PAM difieren dependiendo de la enzima CRISPR utilizada, pero los PAM tienen normalmente secuencias de 2-5 pares de bases adyacentes a un protoespaciador (es decir, la secuencia diana). Se proporcionan ejemplos de las secuencias PAM en la sección de ejemplos posteriormente y el experto en la técnica será capaz de identificar secuencias PAM adicionales para su uso con una enzima CRISPR concreta.
El polinucleótido diana de un complejo CRISPR podrá incluir varios genes y polinucleótidos asociados a una enfermedad así como también genes y polinucleótidos asociados con una ruta bioquímica de señalización tal como se enumeran en las solicitudes de patente provisionales de los EE. UU. 61/736 527 y 61/748 427 que tienen como referencia Broad BI-2011/008/WSGR expediente N.° 44063-701 101 y BI-2011/008/WSGR expediente N.° 44063-701 102, respectivamente, ambas tituladas SYSTEMS METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION, presentadas el 12 de diciembre de 2012 y el 2 de enero de 2013, respectivamente, cuyos contenidos se incorporan a la presente por referencia en su totalidad.
Los ejemplos de polinucleótidos diana incluyen una secuencia asociada con una ruta bioquímica de señalización, p. ej., un gen o un polinucleótido asociados con una ruta bioquímica de señalización. Los ejemplos de polinucleótidos diana incluyen un gen o polinucleótido asociado con una enfermedad. Un gen o polinucleótido "asociados con una enfermedad" se refiere a cualquier gen o polinucleótido que genere productos de transcripción o traducción con un nivel anómalo o en una forma anómala en células que se obtienen a partir de tejidos afectados por una enfermedad en comparación con tejidos o células de un control libre de la enfermedad. Podrá ser un gen que se exprese con un nivel anómalamente alto; podrá ser un gen que se exprese con un nivel anómalamente bajo, donde la expresión alterada se correlacione con la presencia y/o evolución de la enfermedad. Un gen asociado con una enfermedad también se refiere a un gen que posee una o más mutaciones o una variación genética que es responsable directamente de un gen o genes que son responsables por la etiología de una enfermedad o que está en un desequilibro de ligamiento con ellos. Los productos transcritos o traducidos podrán ser conocidos o desconocidos y podrán tener un nivel normal o anómalo. En las Tablas A y B se enumeran ejemplos de genes y polinucleótidos asociados con una enfermedad. Se puede obtener información específica de la enfermedad del Instituto de Medicina Genética McKusick-Nathans, Universidad Johns Hopkins (Baltimore, MD) y del Centro Nacional de Información Biotecnológica, Biblioteca Nacional de Medicina (Bethesda, MD) a los que se puede acceder por internet. En la Tabla C se enumeran ejemplos de genes y polinucleótidos asociados con una ruta bioquímica de señalización.
Las mutaciones en estos genes y rutas pueden conllevar la producción de proteínas inadecuadas o proteínas en cantidades inadecuadas que afectan a la función. Se incorporan ejemplos adicionales de genes, enfermedades y proteínas de este modo por referencia de la solicitud provisional de los EE. UU. 61/736 527 presentada el 12 de diciembre de 2012. Tales genes, proteínas y rutas podrán ser el polinucleótido diana de un complejo CRISPR.
Tabla A
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Tabla B
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Tabla C:
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Las realizaciones de la invención también se refieren a métodos y composiciones relacionadas con la inactivación de genes, amplificación de genes y reparación de mutaciones particulares asociadas con la inestabilidad por repeticiones del ADN y trastornos neurológicos (Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, Segunda edición, Academic Press, 13 de octubre 2011 - Medical). Se ha observado que aspectos específicos de las secuencias de repeticiones tándem son responsables de más de veinte enfermedades humanas (New insights into repeat instability: role of RNA^DNA hybrids. Mclvor EI, Polak U, Napierala M. RNA Biol. septiembre-octubre de 2010;7(5):551 -8). Se ha aprovechado el sistema CRISPR-Cas para corregir estos defectos de inestabilidad genómica.
Un aspecto adicional se refiere a la utilización del sistema CRISPR-Cas para corregir defectos en los genes EMP2A y EMP2B de los que se ha identificado que están asociados con la enfermedad de Lafora. La enfermedad de Lafora es una afección autosómica recesiva que se caracteriza por una epilepsia mioclónica progresiva que podrá comenzar con convulsiones epilépticas en la adolescencia. Unos pocos casos de la enfermedad pueden estar provocados por mutaciones en genes que aún no se han identificado. La enfermedad provoca convulsiones, espasmos musculares, dificultad al caminar, demencia y en última instancia la muerte. En la actualidad no se dispone de una terapia que haya mostrado ser eficaz contra la evolución de la enfermedad. El sistema CRISPR-Cas también podrá tener como diana otras anomalías genéticas asociadas con la epilepsia y los factores genéticos subyacentes se describen más detalladamente en Genetics of Epilepsy and Genetic Epilepsies, editado por Giuliano Avanzini, Jeffrey L. Noebels, Mariani Foundation Paediatric Neurology:20; 2009).
Los métodos de la publicación de patente de los EE. UU. con N.° 20110158957 adjudicada a Sangamo BioSciences, Inc. sobre la inactivación de genes del receptor de los linfocitos T (TCR) también se podrán modificar para adaptarlos al sistema CRISPR Cas. En otro ejemplo, los métodos de la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20100311124 adjudicada a Sangamo BioSciences, Inc. y la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20110225664 adjudicada a Cellectis, que tratan las dos sobre la inactivación de la expresión génica del gen de la glutamina sintetasa también se podrán modificar para adaptarlos al sistema CRISPR Cas.
Varios aspectos adicionales de la invención se refieren a la corrección de defectos asociados con una amplia gama de enfermedades genéticas que se describen más detalladamente en la página web de los Institutos Nacionales de Salud en la subsección de tema de Trastornos genéticos (página web en health.nih.gov/topic/GeneticDisorders). Las enfermedades cerebrales genéticas podrán incluir, sin carácter limitante, Adrenoleucodistrofia, Agénesis del cuerpo calloso, síndrome de Aicardi, enfermedad de Alpers, enfermedad de Alzheimer, síndrome de Barth, enfermedad de Batten, CADASIL, degeneración cerebelosa, enfermedad de Fabry, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, enfermedad de Huntington y otros trastornos de repeticiones de tripletes, enfermedad de Leigh, síndrome de Lesch-Nyhan, enfermedad de Menkes, miopatías mitocondriales y colpocefalia de NINDS. Estas enfermedades se describen adicionalmente en la página web de los Institutos Nacionales de Salud en la subsección sobre Trastornos cerebrales genéticos.
En algunas realizaciones, la afección podrá ser una neoplasia. En algunas realizaciones, cuando la afección es una neoplasia, la diana será cualquiera de los genes enumerados en la Tabla A (en este caso PTEN y así sucesivamente). En algunas realizaciones, la afección podrá ser degeneración macular senil. En algunas realizaciones, la afección podrá ser un trastorno esquizofrénico. En algunas realizaciones, la afección podrá ser un trastorno por repetición de trinucleótidos. En algunas realizaciones, la afección podrá ser el síndrome ligado al cromosoma X frágil. En algunas realizaciones, la afección podrá ser un trastorno relacionado con la secretasa. En algunas realizaciones, la afección podrá ser un trastorno relacionado con priones. En algunas realizaciones, la afección podrá ser ELA. En algunas realizaciones, la afección podrá ser una toxicomanía. En algunas realizaciones, la afección podrá ser autismo. En algunas realizaciones, la afección podrá ser la enfermedad de Alzheimer. En algunas realizaciones, la afección podrá ser la inflamación. En algunas realizaciones, la afección podrá ser la enfermedad de Parkinson.
Por ejemplo, la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20110023145, describe la utilización de nucleasas con dedos de zinc para modificar genéticamente células, animales y proteínas asociados con trastornos del espectro autista (ASD, por sus siglas en inglés). Los trastornos del espectro autista (ASD) son un grupo de trastornos caracterizados por un deterioro cualitativo en la interacción social y comunicación y patrones de comportamiento, intereses y actividades estereotipados y repetitivos y restringidos. Los tres trastornos, autismo, síndrome de Asperger (SA) y trastornos generalizados del desarrollo no especificados de otra manera (PDD-NOS, por sus siglas en inglés) forman una serie continua del mismo trastorno con grados de gravedad variables, asociados con el funcionamiento intelectual y las afecciones médicas. Los ASD son trastornos determinados genéticamente de manera predominante con una heredabilidad de aproximadamente un 90%.
La patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20110023145 comprende editar cualquiera de las secuencias cromosómicas que codifican proteínas asociadas con los ASD que se podría aplicar al sistema CRISPR Cas. Las proteínas asociadas con los ASD se seleccionan normalmente en función de una asociación experimental de la proteína asociada con los ASD con una incidencia o señal de un ASD. Por ejemplo, la velocidad de producción o la concentración de circulación de una proteína asociada con los ASD podrá estar elevada o disminuida en una población que padece un trastorno de tipo ASD respecto a una población que no padece el trastorno de tipo ASD. Se podrán evaluar las diferencias en los niveles de proteína utilizando técnicas proteómicas que incluyen, sin carácter limitante, la inmunoelectrotransferencia, tinción inmunohistoquímica, ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) y espectrometría de masas. Como alternativa, se podrán identificar las proteínas asociadas con los ASD obteniendo los perfiles de expresión génica de los genes que codifican las proteínas utilizando técnicas genómicas que incluyen, sin carácter limitante, análisis por micromatriz de ADN, análisis en serie de la expresión génica (SAGE) y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (Q-PCR).
Los ejemplos no limitantes de trastornos o estados patológicos que podrán estar asociados con proteínas asociadas con los ASD incluyen el autismo, síndrome de Asperger (SA), trastornos generalizados del desarrollo no especificados de otra manera (PDD-NOS), síndrome de Rett, esclerosis tuberosa, fenilcetonuria, síndrome de Smith-Lemli-Optiz y síndrome asociado al cromosoma X frágil. A modo de ejemplo no limitante, las proteínas asociadas con los ASD incluyen, sin carácter limitante, las siguientes proteínas: ATP10C aminofosfolípido- MET MET receptor transportador de ATPasa tirosina cinasa (ATP10C) BZRAP1 MGLUR5 (GRM5) Receptor metabotrópico de glutamato 5 (MGLUR5) CDH10 Caderina-10 Mg Lu R6 (g Rm6) Receptor metabotrópico de glutamato 6 (Mg Lu R6) CDH9 Caderina-9 NLGN1 Neuroligina-1 CNTN4 Contactina-4 NLGN2 Neuroligina-2 CNTNAP2 Asociada a contactina SEMA5A Neuroligina-3 proteína-tipo 2 (CNTNAP2) DHCR77-deshidrocolesterol NLGN4X Neuroligina-4 X- reductasa (DHCR7) unida a DOC2A Dominio tipo C2 doble- NLGN4Y Neuroligina-4 proteína alfa que contiene y unida a DPP6 Dipeptidil NLGN5 Neuroligina-5 proteína tipo aminopeptidasa 6 EN2 engrailed 2 (EN2) NRCAM Molécula de adhesión celular neuronal (NRCAM) m DgA2 retraso mental ligado al cromosoma X frágil NRXN1 Neurexina-1 1 (MDGA2) FMR2 (AFF2) AF4/FMR2 miembro de la familia 2 OR4M2 Receptor olfatorio (AFF2) 4M2 FOXP2 Proteína de la secuencia cabeza de tenedor (forkhead) P2 OR4N4 Receptor olfatorio (FOXP2) 4N4 FXR1 Mental ligado al cromosoma X frágil OXTR receptor de oxitocina retraso, autosómico (OXTR) homólogo 1 (FXR1) FXR2 Frágil X mental PAH fenilalanina retraso, autosómico hidroxilasa (PAH) homólogo 2 (FXR2) GABRA1 Ácido gamma-aminobutírico PTEN Fosfatasa y subunidad del receptor alfa-1 homólogo de tensina (Ga BrA1) (PTEN) GABRA5 GABAA (.gamma.-aminobutírico PTPRZ1 Receptor-tipo ácido) receptor alfa 5 tirosina-proteína subunidad (GABRA5) fosfatasa zeta (PTPRZ1) GABRB1 Ácido gamma-aminobutírico RELN Receptor de reelina subunidad beta-1 (GABRB1) GABRB3 GAbAa (.gamma.-aminobutírico RPL10 60S ribosomal ácido) receptor .beta.3 subunidad proteína L10 (GABRB3) GABRG1 Ácido gamma-aminobutírico SEMA5A Semaforina-5A receptor subunidad gamma-1 (SEMA5A) (GABRG1) HIRIP3 proteína de interacción con HIRA 3 SEZ6L22 similar al homólogo 6 relacionado con las convulsiones (de ratón) HOXA1 Proteína con homeosecuencia Hox-A1 SHANK3 SH3 y múltiples (HOXA1) repeticiones de anquirina en dominios 3 (SHANK3) IL6 Interleucina-6 SHBZRAP1 SH3 y dominios con múltiples repeticiones de anquirina 3 (SHBZRAP1) LAMB1 Subunidad beta-1 de la laminina SLC6A4 Serotonina (LAMB1) transportador (SERT) MAPK3 Proteína activada por mitógenos TAS2R1 Receptor cinasa del gusto 3 tipo 2 miembro 1 TAS2R1 MAZ Dedo de zinc asociado a Myc TSC1 Proteína de la esclerosis tuberosa proteína 1 MDGA2 MAM dominio que contiene TSC2 Esclerosis tuberosa ancla 2 de proteína 2 de glucosilfosfatidilinositol (MDGA2) MECP2 Unión a metil CpG UBE3A Proteína ubiquitina proteína 2 (MECP2) ligasa E3A (UBE3A) MECP2 unión a metil CpG WNT2 Proteína 2 de tipo sin alas (MECP2) MmTV familia del sitio de integración, miembro 2 (WNT2)
La identidad de la proteína asociada con los ASD cuya secuencia cromosómica se edita puede variar y variará. En las realizaciones preferidas, las proteínas asociadas con los ASD cuya secuencia cromosómica se edita podrán ser la proteína 1 asociada con el receptor benzodiazepínico (periférico) (BZRAP1) codificada por el gen BZRAP1, la proteína 2 miembro de la familia AF4/FMR2 (AFF2) codificada por el gen AFF2 (también denominado MFR2), la proteína 1 homóloga autosómica del retraso mental ligado al cromosoma X frágil (FXR1) codificada por el gen FXR1, la proteína 2 homóloga autosómica del retraso mental ligado al cromosoma X frágil (FXR2) codificada por el gen FXR2, la proteína de anclaje 2 de glicosilfosfatidilinositol que contiene el dominio MAM (MDGA2) codificada por el gen MDGA2, la proteína 2 de unión a metil CpG (MECP2) codificada por el gen MECP2, el receptor de glutamato metabotrópico 5 (MGLUR5) codificado por el gen MGLUR5-1 (también denominado GRM5), la proteína neurexina 1 codificada por el gen NRXN1 o la proteína semaforina-5A (SEMA5A) codificada por el gen SEMA5A. En una realización ilustrativa, el animal modificado genéticamente es una rata, y la secuencia cromosómica editada que codifica la proteína asociada con los ASD es como se enuncia a continuación: BZRAP1 proteína 1 asociada XM_213427 con el receptor benzodiazepínico XM_002727789 (periférico) (BZRAP1), XM_002724533, XM_001081125 AFF2 (FMR2) miembro 2 de la familia AF4/FMR2 XM_219832, (AFF2) x M_001054673 FXR1 Retraso mental ligado al cromosoma X frágil NM_001012179, homólogo autosómico 1 (FXR2) FXR2 retraso mental ligado al cromosoma X frágil NM_001100647, homólogo autosómico 2 (FXR2) MDGA2 anclaje 2 de glicosilfosfatidilinositol NM_199269 que contiene el dominio MAM (MDGA2) MECP2 proteína 2 n M_022673 de unión a metil CpG (MECP2) MGLUR5 receptor metabotrópico de glutamato NM_017012 (GRM5) (MGLUR5) NRXN1 Neurexina-1 NM_021767 SEMA5A Semaforina-5A (SEMA5A) NM_001107659.
Los animales o células ilustrativos podrán comprender una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve o más secuencias cromosómicas inactivadas que codifican una proteína asociada con los ASD, y cero, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o más secuencias integradas cromosómicamente que codifican proteínas asociadas con los ASD. La secuencia cromosómica integrada o editada se podrá modificar para que codifique una proteína alterada asociada con los ASD. Los ejemplos no limitantes de mutaciones en proteínas asociadas con los ASD incluyen la mutación L18Q en la neurexina 1 donde la leucina de la posición 18 se reemplaza con una glutamina, la mutación R451C en la neuroligina 3 donde la arginina de la posición 451 se reemplaza con una cisteína, la mutación R87W en la neuroligina 4 donde la arginina de la posición 87 se reemplaza con un triptófano y la mutación I425V en el transportador de serotonina donde la isoleucina en la posición 425 se reemplaza con una valina. En la técnica existe constancia de varias mutaciones diferentes y transposiciones cromosómicas en secuencias cromosómicas relacionadas con ASD que se han asociado con ASD. Remítase a, por ejemplo, Freitag et al. (2010) Eur. Child. Adolesc. Psychiatry 19:169-178, y Bucan et al. (2009) PLoS Genetics 5: e1000536, cuyas divulgaciones se incorporan por referencia a la presente en su totalidad.
Los ejemplos de proteínas asociadas con la enfermedad de Parkinson incluyen, sin carácter limitante, a-sinucleína, DJ-1, LRRK2, PINK1, Parkina, UCHL1, Sinfilina-1 y NURR1.
Los ejemplos de proteínas relacionadas con la adicción podrán incluir, por ejemplo, ABAT.
Los ejemplos de proteínas relacionadas con la inflamación podrán incluir la proteína 1 quimioatractora de monocitos (MCP1) codificada por el gen Ccr2, el tipo 5 del receptor de quimiocinas C-C (CCR5) codificado por el gen Ccr5, el receptor IIB de IgG (FCGR2b, también denominado CD32) codificado por el gen Fcgr2b o la proteína Fc épsilon R1g (FCER1g) codificada por el gen Fcer1g, por ejemplo.
Los ejemplos de proteínas asociadas con enfermedades cardiovasculares podrán incluir IL1B (interleucina 1, beta), XDH (xantina-deshidrogenasa), TP53 (proteína tumoral p53), PTGIS (prostaglandina I2 (prostaciclina) sintasa), MB (mioglobina), IL4 (interleucina 4), ANGPT1 (angiopoyetina 1), ABCG8 (casete de unión a ATP, subfamilia G (WHITE), miembro 8) o CTSK (catepsina K), por ejemplo.
Por ejemplo, la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20110023153, describe la utilización de nucleasas con dedos de zinc para modificar genéticamente células, animales y proteínas asociados con la enfermedad de Alzheimer. Una vez modificados, las células y animales se podrán someter a más pruebas utilizando métodos conocidos para estudiar los efectos de las mutaciones objetivo en el desarrollo y/o evolución de la EA utilizando medidas que se utilizan habitualmente en el estudio de la EA tales como, sin carácter limitante, el aprendizaje y memoria, ansiedad, depresión, adicción y funciones sensitivomotoras así como también ensayos que midan la función bioquímica, metabólica, patológica, funcional y conductual.
La presente divulgación comprende editar cualquiera de las secuencias cromosómicas que codifican proteínas asociadas con la EA. Las proteínas relacionadas con la EA se seleccionan normalmente en función de una asociación experimental entre el trastorno de tipo EA y la proteína relacionada con la EA. Por ejemplo, la velocidad de producción o la concentración de circulación de una proteína relacionada con la EA podrá estar elevada o disminuida en una población que padece EA respecto a una población que no padece EA. Se podrán evaluar las diferencias en los niveles de proteína utilizando técnicas proteómicas que incluyen, sin carácter limitante, la inmunoelectrotransferencia, tinción inmunohistoquímica, ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) y espectrometría de masas. Como alternativa, se podrán identificar las proteínas relacionadas con la EA obteniendo los perfiles de expresión génica de los genes que codifican las proteínas utilizando técnicas genómicas que incluyen, sin carácter limitante, análisis por micromatriz de ADN, análisis en serie de la expresión génica (SAGE) y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (Q-PCR).
Los ejemplos de proteínas asociadas con la enfermedad de Alzheimer podrán incluir la proteína receptora de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDLR) codificada por el gen VLDLR, la enzima 1 activante modificadora de tipo ubiquitina (UBA1) codificada por el gen UBA1 o la proteína subunidad catalítica E1 de la enzima activante de NEDD8 (UBE1C) codificada por el gen UBA3, por ejemplo.
A modo de ejemplo no limitante, las proteínas asociadas con la EA incluyen, sin carácter limitante, las proteínas enunciadas a continuación: Proteína codificada por la secuencia cromosómica ALAS2 Delta-aminolevulinato sintasa 2 (ALAS2) ABCA1 Transportador de casete de unión a ATP (ABCA1) ACE Enzima conversora de angiotensina I (ACE) APOE Precursor de la apolipoproteína E (APOE) APP proteína precursora del amiloide (APP) AQP1 proteína acuaporina 1 (AQP1) BIN1 Proteína 1 de interacción dependiente de la secuencia myc o proteína 1 integradora de tipo puente (BIN1) BDnF factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) BTNL8 Proteína 8 de tipo butirofilina (BTNL8) C1ORF49 Marco abierto de lectura 49 del cromosoma 1 CDH4 Cadherina-4 CHRNB2 Subunidad beta-2 del receptor de acetilcolina neuronal CKLFSF2 Proteína 2 que contiene el dominio transmembrana MARVEL de tipo CKLF (CKLFSF2) CLEC4E Familia 4 con dominio de lectina de tipo C, miembro e (CLEC4E) CLU proteína clusterina (también conocida como apolipoproteína J) CR1 Receptor 1 del complemento de eritrocitos (CR1, también conocido como receptor de adherencia inmunitario y receptor CD35, C3b/C4b) CR1L Receptor 1 del complemento de eritrocitos (CR1L) CSF3R Receptor del factor 3 estimulante de colonias de granulocitos (CSF3R) CST3 Cistatina C o cistatina 3 CYP2C Citocromo P450 2C DAPK1 Proteína cinasa 1 asociada a la muerte (dApK1) ESR1 Receptor estrogénico 1 FCAR Receptor del fragmento Fc de IgA (FCAR, también conocido como CD89) FCGR3B Receptor del fragmento Fc de IgG, IIIb de baja afinidad (FCGR3B o CD16b) FFA2 Receptor 2 de ácidos grasos libres (FfA2) FGA Fibrinógeno (Factor I) GAB2 Proteína 2 de unión asociada a GRB2 (GAB2) GAB2 Proteína 2 de unión asociada a GRB2 (GAB2) GALP Péptido de tipo galanina GAPDHS Gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa, espermatogénica (GAPDHS) GMPB GMBP HP Haptoglobina (HP) HTR7 Receptor 7 de 5-hidroxitriptamina (serotonina) (acoplado a la adenilato ciclasa) IDE Enzima que degrada insulina IF127 IF127 IFI6 Interferón, proteína 6 alfa inducible (IFI6) IFIT2 Proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptidos 2 (IFIT2) IL1RN antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1RA) IL8RA Receptor de interleucina 8, alfa (IL8RA o CD181) IL8RB Receptor de interleucina 8, beta (IL8RB) JAG1 Jagged 1 (JAG1) KCNJ15 Canal de potasio rectificador de entrada, subfamilia J, miembro 15 (KCNJ15) LRP6 Proteína 6 relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP6) MAPT Proteína tau asociada a los microtúbulos (MAPT) MARK4 Cinasa 4 reguladora por afinidad a MAP/microtúbulos (MARK4) MPHOSPH1 Fosfoproteína 1 de la fase M MTHFR 5,10-metilenotetrahidrofolato-reductasa MX2 Proteína Mx2 de unión a GTP inducida por interferón NBN Nibrina, también conocida como NBN NCSTN Nicastrina NIACR2 Receptor 2 de niacina (NIACR2, también conocido como GPR109B) NMNAT3 nicotinamida nucleótido adenililtransferasa 3 NTM Neurotrimina (o HNT) ORM1 Orosmucoide 1 (ORM1) o glucoproteína ácida alfa-1 1 P2RY13 P2Y purinoceptor 13 (P2RY13) PbEf 1 Nicotinamida fosforribosiltransferasa (NAmPRTasa o Nampt) también conocida como factor 1 potenciador de colonias de prelinfocitos B (PBEF1) o visfatina PCK1 Fosfoenolpiruvato carboxicinasa PICALM proteína de reclutamiento de clatrina de unión a fosfatidilinositol (PICALM) PLAU Activador del plasminógeno de tipo urocinasa (PLAU) PLXNC1 Plexina C1 (PLXNC1) PRNP Proteína priónica PSEN1 Proteína presenilina 1 (PSEN1) PSEN2 Proteína presenilina 2 (PSEN2) PTPrA Proteína receptor tipo A de la proteína tirosina fosfatasa (PTPRA) RALGPS2 Ral GEF con dominio Ph y motivo 2 de unión a SH3 (RALGPS2) RGSL2 regulador de señalización de la proteína G tipo 2 (RGSL2) SELENBP1 Proteína 1 de unión a selenio (SELNBP1) SLC25A37 Mitoferrina-1 SORL1 Receptor L relacionado con sortilina (clase DLR) proteína que contiene repeticiones de A (SORL1) TF Transferrina TFAM Factor A de transcripción mitocondrial TNF Factor de necrosis tumoral TNFRSF10C Miembro 10C de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFRSF10C) TNFSF10 Superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 10a (TRAIL) (TNFSF10) u Ba 1 Enzima 1 activadora con modificación de tipo ubiquitina (UBA1) UBA3 Proteína subunidad catalítica E1 de la enzima activante de NEDD8 (UBE1C) UBB Proteína ubiquitina B (UBB) UBQLN1 Ubiquilina-1 UCHL1 Proteína L1 ubiquitina carboxiloterminal esterasa (UCHL1) UCHL3 Proteína isoenzima L3 ubiquitina carboxilo-terminal hidrolasa (UCHL3) VLDLR Proteína receptor de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDLR).
En las realizaciones ilustrativas, las proteínas asociadas con la EA cuya secuencia cromosómica se edita podrán ser la proteína receptor de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDLR) codificada por el gen VLDLR, la enzima 1 activadora con modificación de tipo ubiquitina (UBA1) codificada por el gen UBA1, la proteína subunidad catalítica E1 de la enzima activante de NEDD8 (UBE1C) codificada por el gen UBA3, la proteína acuaporina 1 (AQP1) codificada por el gen AQP1, la proteína L1 ubiquitina carboxilo-terminal esterasa (UCHL1) codificada por el gen UCHL1, la proteína isoenzima L3 ubiquitina carboxilo-terminal hidrolasa (UCHL3) codificada por el gen UCHL3, la proteína ubiquitina B (UBB) codificada por el gen UBB, la proteína tau asociada a microtúbulos (MAPT) codificada por el gen MAPT, la proteína receptor tipo A de la proteína tirosina fosfatasa (PTPRA) codificada por el gen PTPRA, la proteína de reclutamiento de clatrina de unión a fosfatidilinositol (PICALM) codificada por el gen PICALM, la proteína clusterina (también conocida como apolipoproteína J) codificada por el gen CLU, la proteína presenilina 1 codificada por el gen PSEN1, la proteína presenilina 2 codificada por el gen PSEN2, el receptor L relacionado con sortilina (clase DLR) proteína que contiene repeticiones de A (SORL1) proteína codificada por el gen SORL1, la proteína precursora del amiloide (APP) codificada por el gen APP, el precursor de la apolipoproteína E (APOE) codificada por el gen APOE o el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) codificado por el gen BDNF. En una realización ilustrativa, el animal modificado genéticamente es una rata, y la secuencia cromosómica editada que codifica la proteína asociada con la EA es como las siguientes: APP proteína precursora del amiloide (APP) Nm_019288 AQP1 proteína acuaporina 1 (AQP1) NM_012778 BDNF Factor neurotrófico derivado del cerebro NM_012513 CLU proteína clusterina (también conocida como NM_053021 apolipoproteína J) MAPT proteína tau asociada a microtúbulos NM_017212 (MAPT) PICALM proteína de reclutamiento de clatrina de unión a fosfatidilinositol NM_053554 (PICALM) PSEN1 proteína presenilina 1 (PSEN1) NM_019163 PSEN2 proteína presenilina 2 (PSEN2) NM_031087 PTPRA proteína receptor tipo A de la proteína tirosina fosfatasa NM_012763 (Pt PRA) SORL1 receptor L relacionado con sortilina (clase Dl R, NM_053519) proteína que contiene repeticiones de A XM_001065506 (SORL1) XM_217115 UBA1 enzima 1 activadora con modificación de tipo ubiquitina NM_001014080 (UBA1) UBA3 proteína subunidad catalítica E1 de la enzima activante de NEDD8 NM_057205 (UBE1C) UBB proteína ubiquitina B (UBB) NM_138895 UCHL1 proteína L1 ubiquitina carboxiloterminal esterasa NM_017237 (UCHL1) UCHL3 proteína isoenzima L3 ubiquitina carboxilo-terminal hidrolasa NM_001110165 (UCHL3) VLDLR proteína receptor de lipoproteínas de muy baja densidad NM_013155 (VLDLR). El animal o célula podrá comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15 o más secuencias cromosómicas alteradas que codifican una proteína asociada con la EA y cero, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más secuencias integradas cromosómicamente que codifican una proteína asociada con la EA.
La secuencia cromosómica integrada o editada se podrá modificar para que codifique una proteína alterada asociada con la EA. Se han asociado con la EA varias mutaciones en secuencias cromosómicas relacionadas con la EA. Por ejemplo, la mutación de aminoácido V7171 (es decir, se reemplaza valina de la posición 717 por isoleucina) en APP causa EA familiar. Múltiples mutaciones en la proteína presenilina-1, tales como H163R (es decir, se sustituye histidina en la posición 163 por arginina), A246E (es decir, se sustituye alanina en la posición 246 por glutamato), L286V (es decir, se sustituye leucina en la posición 286 por valina) y C410Y (es decir, se sustituye cisteína en la posición 410 por tirosina) provocan Alzheimer familiar de tipo 3. Las mutaciones en la proteína presenilina-2, tales como N141 I (es decir, se sustituye asparagina en la posición 141 por isoleucina), M293V (es decir, se sustituye metionina en la posición 239 por valina) y D439A (es decir, se sustituye aspartato en la posición 439 por alanina) provocan Alzheimer familiar de tipo 4. En la técnica existe constancia de otras asociaciones entre variantes genéticas en genes asociados con la EA y enfermedad. Remítase a, por ejemplo, Waring et al. (2008) Arch. Neurol. 65:329-334, cuya divulgación se incorpora por referencia a la presente en su totalidad.
Los ejemplos de proteínas asociadas con el trastorno del espectro autista podrán incluir la proteína 1 asociada con el receptor benzodiazepínico (periférico) (BZRAP1) codificada por el gen BZRAP1, la proteína 2 miembro de la familia AF4/FMR2 (AFF2) codificada por el gen AFF2 (también denominado MFR2), la proteína 1 homóloga autosómica del retraso mental ligado al cromosoma X frágil (FXR1) codificada por el gen FXR1 o la proteína 2 homóloga autosómica del retraso mental ligado al cromosoma X frágil (FXR2) codificada por el gen FXR2, por ejemplo.
Los ejemplos de proteínas asociadas con la degeneración macular podrán incluir el casete de unión a ATP, proteína 4 miembro de la subfamilia A (ABC1) codificada por el gen ABCR, la proteína apolipoproteína E (APOE) codificada por el gen APOE o la proteína quimiocina (motivo C-C) ligando 2 (CCL2) codificada por el gen CCL2, por ejemplo.
Los ejemplos de proteínas asociadas con la esquizofrenia podrán incluir NRG1, ErbB4, CPLX1, TPH1, TPH2, NRXN1, GSK3A, BDNF, DISC1, GSK3B y combinaciones de estas.
Los ejemplos de proteínas que participan en la supresión tumoral podrán incluir ATM (ataxia telangiectasia mutada), ATR (ataxia telangiectasia y relacionada con Rad3), EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico), ERBB2 (homólogo 2 del oncogén vírico de la leucemia eritroblástica v-erb-b2), ERBB3 (homólogo 3 del oncogén vírico de la leucemia eritroblástica v-erb-b2), ERBB4 (homólogo 4 del oncogén vírico de la leucemia eritroblástica v-erb-b2), Notch 1, Notch2, Notch 3 o Notch 4, por ejemplo.
Los ejemplos de proteínas asociadas con un trastorno de la secretasa podrán incluir PSENEN (homólogo 2 del potenciador de la presenilina (C. elegans)), CTSB (catepsina B), PSEN1 (presenilina 1), APP (proteína precursora del beta amiloide (A4)), APH1B (homólogo B de faringe anterior defectuosa 1(C. elegans)), PSEN2 (presenilina 2 (enfermedad de Alzheimer 4)) o BACE1 (enzima 1 de escisión de APP en el sitio beta), por ejemplo.
Por ejemplo, la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20110023146, describe la utilización de nucleasas con dedos de zinc para modificar genéticamente células, animales y proteínas asociados con trastornos asociados con la secretasa. Las secretasas son esenciales para procesar preproteínas y obtener sus formas biológicamente activas. Los defectos en diversos componentes de las rutas de la secretasa contribuyen a muchos trastornos, especialmente aquellos con placas amiloideas o amiloidogénesis distintivas, tal como la enfermedad de Alzheimer (EA).
Un trastorno de la secretasa y las proteínas asociadas con estos trastornos constituyen un conjunto diverso de proteínas que ejercen una función en la susceptibilidad para numerosos trastornos, la presencia del trastorno, la gravedad del trastorno o cualquier combinación de estos. La presente divulgación comprende editar cualquiera de las secuencias cromosómicas que codifican proteínas asociadas con un trastorno de la secretasa. Las proteínas asociadas con un trastorno de la secretasa se seleccionan normalmente en función de una asociación experimental entre las proteínas relacionadas con la secretasa y el desarrollo de un trastorno de la secretasa. Por ejemplo, la velocidad de producción o la concentración de circulación de una proteína asociada con un trastorno de la secretasa podrá estar elevada o disminuida en una población que padece un trastorno de la secretasa respecto a una población que no padece el trastorno de la secretasa. Se podrán evaluar las diferencias en los niveles de proteína utilizando técnicas proteómicas que incluyen, sin carácter limitante, la inmunoelectrotransferencia, tinción inmunohistoquímica, ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) y espectrometría de masas. Como alternativa, se podrá identificar la proteína asociada con un trastorno de la secretasa obteniendo los perfiles de expresión génica de los genes que codifican las proteínas utilizando técnicas genómicas que incluyen, sin carácter limitante, análisis por micromatriz de ADN, análisis en serie de la expresión génica (SAGE) y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (Q-PCR).
A modo de ejemplo no limitante, las proteínas asociadas con un trastorno de la secretasa incluyen PSENEN (homólogo 2 del potenciador de la presenilina (C. elegans)), CTSB (catepsina B), PSEN1 (presenilina 1), APP (proteína precursora del beta amiloide (A4)), APH1B (homólogo B de la faringe anterior defectuosa 1 (C. elegans)), PSEN2 (presenilina 2 (enfermedad de Alzheimer 4)), BACE1 (enzima 1 de escisión de APP en el sitio beta), ITM2B (proteína de membrana integral 2B), CTSD (catepsina D), NOTCH1 (homólogo 1 de Notch, asociado a la traslocación (Drosophila)), TNF (factor de necrosis tumoral (superfamilia de TNF, miembro 2)), INS (insulina), DYT10 (distonia 10), ADAM17 (dominio 17 de metalopeptidasa ADAM), APOE (apolipoproteína E), a Ce (enzima conversora de angiotensina I (peptidil-dipeptidasa A) 1) , STN (estatina), TP53 (proteína tumoral p53), iL6 (interleucina 6 (interferón, beta 2)), NGFR (receptor de factor de crecimiento nervioso (superfamilia de TNFR, miembro 16)), IL1B (interleucina 1, beta), ACHE (acetilcolinesterasa (grupo sanguíneo Yt)), CTNNB1 (catenina (proteína asociada a la caderina), beta 1, 88kDa), IGF1 (factor de crecimiento similar a la insulina 1 (somatomedina C)), IFNG (interferón, gamma), n RG1 (neurregulina 1), CASP3 (caspasa 3, cisteínapeptidasa relacionada con la apoptosis), MAPK1 (proteína cinasa 1 activada por mitógenos), CDH1 (caderina 1, tipo 1, E-caderina (epitelial)), APBB1 (unión a la proteína precursora del beta amiloide (A4), familia B, miembro 1 (Fe65)), HMGCR (3-hidroxi-3-metilglutaril-Coenzima A reductasa), CREB1 (proteína 1 de unión al elemento de respuesta a AMPc), PTGS2 (prostaglandina-endoperóxido sintasa 2 (prostaglandina G/H sintasa y ciclooxigenasa)), HES1 (pilosa y potenciadora del corte y empalme 1, (Drosophila)), CAT (catalasa), TGFB1 (factor de crecimiento transformante, beta 1), ENO2 (enolasa 2 (gamma, neuronal)), ERBB4 (homólgo 4 del oncogén vírico de la leucemia eritroblástica v-erb-a (aviar)), TRAPPC10 (complejo 10 de partículas del tráfico proteico), MAOB (monoamina oxidasa B), NGF (factor de crecimiento nervioso (polipéptido beta)), MMP12 (metalopeptidasa matricial 12 (elastasa de macrófagos)), JAG1 (jagged 1 (síndrome de Alagille)), CD40LG (ligando CD40), PPARG (receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas), FGF2 (factor de crecimiento fibroblástico 2 (básico)), IL3 (interleucina 3 (factor estimulador de colinas, múltiple)), LRP1 (proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad), NOTCH4 (homólogo 4 de Notch (Drosophila)), MAPK8 (proteína cinasa 8 activada por mitógenos), PREP (prolil endopeptidasa), NOTCH3 (homólgo 3 de Notch (Drosophila)), PRNP (proteína priónica), CTSG (catepsina G), EGF (factor de crecimiento epidérmico (beta-urogastrona)), rEn (renina), CD44 (molécula CD44 (grupo sanguíneo indio)), SELP (selectina P (proteína de la membrana granular de 140 kDa, antígeno CD62)), GHR (receptor de la hormona del crecimiento), ADCYAP1 (polipéptido 1 activador de la adenilato ciclasa (pituitaria)), INSR (receptor de la insulina), GFAP (proteína ácida fibrilar glial), MMP3 (metalopeptidasa matricial 3 (estromelisina 1, progelatinasa)), MAPK10 (proteína cinasa activada por mitógenos 10), SP1 (factor de transcripción Sp1), MYC (homólogo del oncogén vírico de la mielocitomatosis v-myc (aviar)), CTSE (catepsina E), PPa Ra (receptor alfa activado por el proliferador de peroxisomas), JUN (oncogén jun), TIMP1 (TIMP inhibidor de metalopeptidasas 1), IL5 (interleucina 5 (factor estimulador de colonias, eosinófilos)), IL1A (interleucina 1, alfa), MMP9 (metalopeptidasa matricial 9 (gelatinasa B, 92 kDa gelatinasa, 92 kDa colagenasa de tipo IV)), HTR4 (receptor 4 de 5-hidroxitriptamina (serotonina)), HSPG2 (heparán sulfato proteoglicano 2) , KRAS (homólogo del oncogén vírico del sarcoma de rata Kirsten v-Ki-ras2), CYCS (citocroma c, somático), SMG1 (homólogo de SMG1, cinasa relacionada con la fosfatidilinositol 3-cinasa (C. elegans)), IL1R1 (receptor de la interleucina 1, tipo I), PROK1 (procineticina 1), MAPK3 (proteína cinasa activada por mitógenos 3), NTRK1 (tirosinacinasa neurotrófica, receptor, tipo 1), IL13 (interleucina 13), MME (metaloendopeptidasa de la membrana), TKT (transcetolasa), CXCR2 (receptor 2 de quimiocinas (motivo C-X-C)), IGF1R (receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1), RARA (receptor del ácido retinoico, alfa), CREBBP (proteína de unión a CREB), PTGS1 (prostaglandinaendoperóxido sintasa 1 (prostaglandina G/H sintasa y ciclooxigenasa)), GALT (galactosa-1-fosfato uridililtransferasa), CHRM1 (receptor colinérgico, muscarínico 1), ATXN1 (ataxina 1), PAWR (PRKC, apoptosis, WT1, regulador), NOTCH2 (homólogo 2 de Notch (Drosophila)), M6PR (receptor de la manosa-6-fosfato (dependiente de cationes)), CYP46A1 (citocromo P450, familia 46, subfamilia A, polipéptido 1), CSNK1 D (caseína cinasa 1, delta), MAPK14 (proteína cinasa activada por mitógenos 14), PRG2 (proteoglicano 2, médula ósea (activador de los linfocitos citolíticos naturales, proteína básica mayor de los gránulos de eosinófilos)), PRKCA (proteína-cinasa C, alfa), L1 CAM (molécula de adhesión celular L1), CD40 (molécula CD40, miembro 5 de la superfamilia del receptor de TNF), NR1I2 (subfamilia 1 del receptor nuclear, grupo I, miembro 2), JAG2 (jagged 2), CTNND1 (catenina (proteína asociada a la caderina), delta 1), c DH2 (caderina 2, tipo 1, N-caderina (neuronal)), CMA1 (quimasa 1, mastocitos), SORT1 (sortilina 1), DLK1 (homólogo 1 tipo delta (Drosophila)), THEM4 (miembro 4 de la superfamilia de la tioesterasa), j Up (placoglobina de unión), CD46 (molécula CD46, proteína reguladora del complemento), CCL11 (ligando quimiocina 11 (motivo C-C)), CAV3 (caveolina 3) , RNASE3 (ribonucleasa, familia A de la ARNasa, 3 (proteína catiónica eosinofílica)), HSPA8 (proteína 8 del choque térmico de 70kDa), CASP9 (caspasa 9, cisteína-peptidasa relacionada con la apoptosis), CYP3A4 (citocromo P450, familia 3, subfamilia A, polipéptido 4), CCR3 (receptor 3 de quimiocinas (motivo C-C)), TFAP2A (factor de transcripción AP-2 alfa (proteína 2 de unión potenciadora activadora alfa)), SCP2 (proteína 2 portadora de esterol), CDK4 (cinasa 4 dependiente de ciclina), HIF1A (factor 1 inducible por hipoxia, subunidad alfa (factor de transcripción básico hélicebucle-hélice)), TCF7L2 (2 similar al factor de transcripción 7 (específico de linfocitos T, secuencia HMG)), IL1R2 (receptor de interleucina 1, tipo II), B3GALTL (similar a la beta 1,3-galactosiltransferasa), MDM2 (homólogo de la proteína de unión a p53 Mdm2 (ratón)), RELA (homólogo A del oncogén vírico de la reticuloendoteliosis v-rel (aviar)), CASP7 (caspasa 7, cisteína-peptidasa relacionada con la apoptosis), IDE (enzima que degrada insulina), FABp4 (proteína 4 de unión a ácidos grasos, adipocitos), CASK (serina proteína cinasa dependiente de calcio/calmodulina (familia MAGUK)), ADCYAP1R1 (receptor de tipo 1 del polipéptido 1 activador de la adenilato ciclasa (pituitaria)), ATF4 (factor 4 de la transcripción activador (elemento B67 potenciador de respuesta a tax)), PDGFA (polipéptido alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas), C21 o f33 (marco abierto de lectura 33 del cromosoma 21), SCG5 (secretogranina V (proteína 7B2)), RNF123 (proteína dedo RING 123), NFKB1 (factor nuclear del gen del polipéptido ligero de kappa potenciador en linfocitos B 1), ERBB2 (homólogo 2 del oncogén vírico de la leucemia eritroblástica verb-b2, homólogo del oncogén derivado de neuro/glioblastoma (aviar)), CAV1 (caveolina 1, proteína de las caveolas, 22 kDa), MMP7 (metalopeptidasa matricial 7 (matrilisina, uterina)), TGFA (factor de crecimiento transformante, alfa), RXRA (receptor X del retinoide X, alfa), STX1A (sintaxina 1A (cerebro)), PSMC4 (subunidad 26S del proteasoma (prosoma, complejo endopeptidásico multicatalítico), ATPasa, 4), P2RY2 (receptor purinérgico P2Y, acoplado a la proteína G, 2), TNFRSF21 (superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 21), DLG1 (discos, homólogo 1 grande (Drosophilá)), NUMBL (de tipo homólogo de numb (Drosophilá)), SPN (sialoforina), PLSCR1 (fosfolípido escramblasa 1), UBQLN2 (ubiquilina 2), UbQlN1 (ubiquilina 1), PCSK7 (tipo 7 de la proproteína convertasa subtilisina/kexina), SPON1 (espondina 1, proteína de la matriz extracelular), SILV (homólgo silver (ratón)), QPCT (glutaminil-peptido ciclotransferasa), HESS (pilosa y potenciadora del corte y empalme 5 (Drosophilá)), GCC1 (1 que contiene el dominio de superhélice y GRIP) y cualquiera de sus combinaciones.
El animal o célula modificados genéticamente podrán comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más secuencias cromosómicas alteradas que codifican una proteína asociada con un trastorno de la secretasa y cero, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más secuencias integradas cromosómicamente que codifican una proteína alterada asociada con un trastorno de la secretasa.
Los ejemplos de proteínas asociadas con la esclerosis lateral amiotrófica podrán incluir SOD1 (superóxido-dismutasa 1), ELA2 (esclerosis lateral amiotrófica 2), FUS (fusionado con el sarcoma), TARDBP (proteína de unión a ADN TAR), VAGFA (factor A de crecimiento endotelial vascular), VAGFB (factor B de crecimiento endotelial vascular) y VAGFC (factor C de crecimiento endotelial vascular) y cualquiera de sus combinaciones.
Por ejemplo, la patente de los EE. UU. con N.° de publicación 20110023144 describe la utilización de nucleasas con dedos de zinc para modificar genéticamente células, animales y proteínas asociados con la enfermedad esclerosis lateral amiotrófica (ELA). La ELA se caracteriza por la degeneración gradual e inexorable de ciertas células nerviosas en la corteza cerebral, tronco cerebral y médula espinal que participan en el movimiento voluntario.
Los trastornos de las neuronas motoras y las proteínas asociadas con estos trastornos constituyen un conjunto diverso de proteínas que ejercen una función en la susceptibilidad a desarrollar un trastorno de las neuronas motoras, la presencia del trastorno de las neuronas motoras, la gravedad del trastorno de las neuronas motoras o cualquier combinación de estos. La presente divulgación comprende editar cualquiera de las secuencias cromosómicas que codifican proteínas asociadas con la enfermedad ELA, un trastorno de las neuronas motoras específico. Las proteínas asociadas con la ELA se seleccionan normalmente en función de una asociación experimental entre las proteínas relacionadas con ELA y la ELA. Por ejemplo, la velocidad de producción o la concentración de circulación de una proteína asociada con la ELA podrá estar elevada o disminuida en una población que padece ELA respecto a una población que no padece ELA. Se podrán evaluar las diferencias en los niveles de proteína utilizando técnicas proteómicas que incluyen, sin carácter limitante, la inmunoelectrotransferencia, tinción inmunohistoquímica, ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) y espectrometría de masas. Como alternativa, se podrán identificar las proteínas asociadas con la ELA obteniendo los perfiles de expresión génica de los genes que codifican las proteínas utilizando técnicas genómicas que incluyen, sin carácter limitante, análisis por micromatriz de ADN, análisis en serie de la expresión génica (SAGE) y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (Q-PCR).
A modo de ejemplo no limitante, las proteínas asociadas con la ELA incluyen, sin carácter limitante, las siguientes proteínas: SOD1 superóxido dismutasa 1, ELA3 esclerosis lateral amiotrófica soluble 3 SETX senataxina ELA5 esclerosis lateral amiotrófica 5 FUS fusionada en sarcoma ELA7 esclerosis lateral amiotrófica 7 ELA2 lateral amiotrófica DPP6 Dipeptidil-peptidasa 6 esclerosis 2 NEFH neurofilamento, pesado PTGS1 prostaglandina- polipéptido endoperóxido sintasa 1 SLC1A2 familia 1 portadora de solutos TNFRSF10B factor de necrosis tumoral (superfamilia del receptor de afinidad elevada glial, transportador glutamato), miembro 10b miembro 2 PRPH periferina HSP90AA1 proteína de choque térmico 90 kDa alfa (citosólico), clase A miembro 1 GRIA2 receptor de glutamato, IFNG interferón, gamma ionotrópico, AMPA 2 S100B S100 unión a calcio FGF2 factor de crecimiento de fibroblastos 2 proteína B AOX1 aldehído oxidasa 1 CS citrato sintasa TARDBP proteína de unión a ADN TAR TXN tiorredoxina RApH1 asociación a Ras MAP3K5 proteína activada por mitógenos (RaIGDS/AF-6) y cinasa 5 pleckstrina dominios de homología 1 NBEAL1 1 tipo neurobeachina GPX1 glutatión peroxidasa 1 ICA1L autoantígeno de células isleta RAC1 relacionada con ras C3 botulinum 1.69 kDa-sustrato de toxina tipo 1 MAPT asociado a microtúbulos ITPR2 inositol 1,4,5- proteína tau receptor trifosfato, tipo 2 ELA2CR4 lateral amiotrófica GLS glutaminasa esclerosis 2 (juvenil) región cromosómica, candidato 4 ELA2CR8 lateral amiotrófica CNTFR región cromosómica del receptor (juvenil) 2 de esclerosis de factor neurotrófico ciliar 8 ELA2CR11 lateral amiotrófica FOLH1 región cromosómica (juvenil) de esclerosis 2 folato hidrolasa 1, candidato 11 FAM117B familia con la secuencia P4HB prolil 4-hidroxilasa, similaridad a 117, polipéptido beta miembro B CNTF factor neurotrófico ciliar SQSTM1 secuestosoma 1 STRADB cinasa relacionada con STE20 NAIP familia NLR, proteína inhibidora beta del adaptador de la apoptosis YWHAQ tirosina 3- SLC33A1 familiar portadora de solutos 33 monooxigenasa/triptof (transportador de acetil-CoA), una proteína de activación del miembro 5-monooxigenasa 1, polipéptido theta TRAK2 proteína de tráfico, FIG. homólgo 4, SAC1 dominio que contiene fosfatasa de lípidos de unión a kinesina 2 NIF3L1 NIF3 NGG1 de interacción INA internexina factor neuronal tipo 3 proteína filamentosa intermedia 1, alfa PARD3B par-3 de partición COX8A citocromo c oxidasa defectuoso 3 homólogo B subunidad VIIIA CDK15 cinasa dependiente de ciclina HECW1 HECT, C2 y WW 15 dominio que contiene E3 ubiquitina proteína ligasa 1 NOS1 óxido nítrico sintasa 1 MET met protooncogén SOD2 superóxido dismutasa 2, HSPB1 proteína 1 de choque térmico 27 kDa mitocondrial NEFL neurofilamento, ligero CTSB catepsina B polipéptido ANG angiogenina, HSPA8 choque térmico 70 kDa ribonucleasa, familia de RNasa A proteína 8, 5 VAPB VAMP (vesículas- ESR1 receptor de estrógeno 1 asociado a proteína de membrana)-proteína asociada B y C SNCA sinucleína, alfa HGF factor de crecimiento de hepatocitos CAT catalasa ACTB actina, beta NEFM neurofilamento, medio TH tirosina hidroxilasa polipéptido BCL2 linfocito B CLL/linfoma 2 FAS Fas (superfamilia del receptor TNF, miembro 6) CASP3 caspasa 3, apoptosis- CLU cisteína peptidasa relacionada con clusterina SMN1 supervivencia de neuronas motoras G6PD glucosa-6-fosfato 1, deshidrogenasa telomérica BAX BCL2-asociado X HSF1 factor proteína de transcripción de choque térmico 1 RNF19A proteína dedo RING 19A JUN oncogén jun ELA2CR12 lateral amiotrófica HSPA5 choque térmico 70 kDa esclerosis 2 (juvenil) proteína 5 región cromosómica, candidato 12 MAPK14 proteína activada por mitógenos IL10 interleucina 10 cinasa 14 APEX1 APEX nucleasa TXNRD1 tiorredoxin reductasa 1 (enzima de reparación de ADN multifunctional) 1 NOS2 óxido nítrico sintasa 2, TIMP1 TIMP inhibidor inducible por metalopeptidasa 1 CASP9 caspasa 9, apoptosis- XIAP inhibidor ligado a X de peptidasa de apoptosis de cisteína relacionada GLG1 glucoproteína de golgi 1 EPO eritropoyetina VEGFA endotelial vascular ELN elastina factor de crecimiento A GDNF derivado de células gliales NFE2L2 factor nuclear (factor eritroide- neurotrófico derivado 2)-tipo 2 SLC6A3 familia portadora de solutos 6 HSPA4 choque térmico 70 kDa (transportador 4 de proteína neurotransmisora, dopamina), miembro 3 APOE apolipoproteína E PSMB8 proteasoma (prosoma, complejo endopeptidásico multicatalítico) subunidad, beta tipo, 8 DCTN1 dinactina 1 TIMP3 TIMP inhibidor de metalopeptidasa 3 KIFAP3 cinesina-asociado SLC1A1 familia portadora de solutos 1 proteína 3 (transportador de glutamato con elevada afinidad neuronal/epitelial, sistema Xag), miembro 1 SMN2 supervivencia de neuronas motoras CCNC ciclina C 2, centromérico MPP4 proteína de membrana, STUB1 STIP1 proteína 1 que contiene la secuencia 4 U-palmitoilada y de homología ELA2 beta amiloide (A4) PRDX6 proteína precursora de peroxirredoxina 6 SYP sinaptofisina CABIN1 proteína 1 de unión a calcineurina CASP1 caspasa 1, apoptosis- GART fosforribosilglicinamida formiltransferasa relacionada con cisteína, peptidasa fosforribosilglicinamida sintetasa, fosforribosilaminoimidazol sintetasa CDK5 cinasa 5 dependiente de ciclina 5 ATXN3 ataxina 3 RTN4 reticulon 4 C1QB componente del complemento 1, subcomponente q, cadena B VEGFC factor de crecimiento nervioso HTT receptor de huntingtina PARK7 enfermedad de Parkinson 7 x Dh xantina deshidrogenasa GFAP proteína fibrilar glial ácida MAP2 proteína asociada a microtúbulos 2 CYCS citocromo c, somático FCGR3B Fragmento Fc de IgG, afinidad baja IIIb, CCS chaperona de cobre para UBL5 5 tipo ubiquitina superóxido dismutasa MMP9 metalopeptidasa matricial SLC18A3 familia portadora de solutos 189 ( (acetilcolina vesicular), miembro 3 TRPM7 receptor transitorio HSPB2 choque térmico 27 kDa canal de potencial de cationes, proteína 2 subfamilia M, miembro 7 AKT1 timoma murino v-akt DERL1 familia del dominio tipo Der1, oncogén vírcio homólogo 1 miembro 1 CCL2 quimiocina (motivo C--C) NGRN neugrina, ligando de neurita 2 asociado con la excrecencia GSR glutatión reductasa TPPP3 miembro 3 de la famila de proteínas que promueven la polimerización de tubulina APAF1 peptidasa apoptótica BTBD10 BTB (POZ) 10 que contiene el factor 1 de activación del dominio GLUD1 glutamato CXCR4 quimiocina (motivo C--X--C) deshidrogenasa 1 receptor 4 SLC1A3 familia portadora de solutos 1 FLT1 tirosina relacionada con fms (transportador de glutamato con afinidad elevada glial), miembro 3 cinasa 1 PON1 paraoxonasa 1 AR receptor androgénico LIF factor inhibidor de la leucemia ERBB3 homólogo 3 del oncogén vírico de la leucemia eritroblástica v-erb-b2 LGALS1 lectina, galactósido- CD44 molécula de unión a CD44, soluble, 1 TP53 proteína tumoral p53 TLR3 receptor 3 de tipo toll GRIA1 receptor de glutamato, GAPDH gliceraldehído-3- ionotrópico, AMPA 1 fosfato deshidrogenasa GRIK1 receptor de glutamato, DES desmina ionotrópico, kainato 1 CHAT colina acetiltransferasa FLT4 tirosina cinasa 4 relacionada con fms CHMP2B modificador de cromatina BAG1 proteína asociada a BCL22B atanogeno MT3 metalotioneína 3 CHRNA4 receptor colinérgico, nicotínico, alfa 4 GSS glutatión sintetasa BAK1 antagonista/eliminador de BCL2 1 KDR dominio de inserción cinasa GSTP1 glutatión S-transferasa receptor (un tipo III pi 1 receptor tirosina cinase) OGG1 8-oxoguanina ADN IL6 interleucina 6 (interferón, glicosilasa beta 2).
El animal o célula podrán comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más secuencias cromosómicas alteradas que codifican una proteína asociada con ELA y cero, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más secuencias integradas cromosómicamente que codifican la proteína alterada asociada con ELA. Las proteínas asociadas con la ELA preferidas incluyen SOD1 (superóxido-dismutasa 1), ELA2 (esclerosis lateral amiotrófica 2), FUS (fusionado con el sarcoma), TARDBP (proteína de unión a ADN TAR), VAGfA (factor A de crecimiento endotelial vascular), VAGFB (factor B de crecimiento endotelial vascular) y VAGFC (factor C de crecimiento endotelial vascular) y cualquiera de sus combinaciones.
Los ejemplos de proteínas asociadas con enfermedades priónicas podrán incluir SOD1 (superóxido-dismutasa 1), ELA2 (esclerosis lateral amiotrófica 2), FUS (fusionado con el sarcoma), TARDBP (proteína de unión a ADN TAR), VAGFA (factor A de crecimiento endotelial vascular), VAGFB (factor B de crecimiento endotelial vascular) y VAGFC (factor C de crecimiento endotelial vascular) y cualquiera de sus combinaciones.
Los ejemplos de proteínas relacionadas con afecciones neurodegenerativas en trastornos priónicos podrán incluir A2M (Alfa-2-Macroglobulina), AATF (factor de la transcripción que es un antagonista respecto a la apoptosis), ACPP (Fosfatasa ácida de la próstata), ACTA2 (Alfa actina 2 músculo liso de la aorta), ADAM22 (dominio de metalopeptidasa AdAM), ADORA3 (Receptor de adenosina A3) o ADRA1D (Receptor adrenérgico alfa-1D para el adrenorreceptor alfa-1D), por ejemplo.
Los ejemplos de proteínas asociadas con la inmunodeficiencia podrán incluir A2M [alfa-2-macroglobulina]; AANAT [arilalquilamina W-acetiltransferasa]; ABCA1 [casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 1]; ABCA2 [casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 2]; o ABCA3 [casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 3]; por ejemplo.
Los ejemplos de proteínas asociadas con trastornos por repeticiones de trinucleótidos incluyen AR (receptor androgénico), FMR1 (retraso mental asociado al cromosoma X frágil 1), HTT (huntingtina) o DMPK (proteína cinasa de la distrofia miotónica), FXN (frataxina), ATXN2 (ataxina 2), por ejemplo.
Los ejemplos de proteínas asociadas con trastornos de la neurotransmisión incluyen SST (somatostatina), NOS1 (óxido nítrico-sintasa 1 (neuronal)), ADRA2A (receptor adrenérgico alfa-2A), ADRA2C (receptor adrenérgico alfa-2C), tAc R1 (receptor 1 de la taquiquinina 1) o HTR2c (receptor 2C de 5-hidroxitriptamina (serotonina)), por ejemplo.
Los ejemplos de secuencias asociadas con el neurodesarrollo incluyen A2BP1 [proteína 1 de unión a la ataxina 2], AADAT [aminoadipato-aminotransferasa], AANAT [arilalquilamina W-acetiltransferasa], ABAT [4-aminobutirato aminotransferasa], ABCA1 [casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 1] o ABCA13 [casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 13], por ejemplo.
Se podrán seleccionar ejemplos adicionales de afecciones preferidas que se pueden tratar con el presente sistema entre: Síndrome de Aicardi-Goutieres; Enfermedad de Alexander; Síndrome de Allan-Herndon-Dudley; Trastornos relacionados con POLG; Alfa-Manosidosis (Tipo II y III); Síndrome de Alstróm; Síndrome de Angelman; Ataxia-Telangiectasia; Lipofuscinosis cereoides neuronales; Beta-Talasemia; Atrofia óptica bilateral y Atrofia óptica (infantil) de tipo 1; Retinoblastoma (bilateral); Enfermedad de Canavan; Síndrome cerebrooculofacioesquelético 1 [COFS1]; Xantomatosis cerebrotendinosa; Síndrome Cornelia de Lange; Trastornos relacionados con MAPT; Enfermedades priónicas genéticas; Síndrome de Dravet; Enfermedad de Alzheimer familiar de inicio temprano; Ataxia de Friedreich [FRDA]; Síndrome de Fryns; Fucosidosis; Distrofia muscular congenital de Fukuyama; Galactosialidosis; Enfermedad de Gaucher; Acidemias orgánicas; Linfohistiocitosis hemofagocíticas; Síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford; Mucolipidosis II; Enfermedad de almacenamiento de ácido siálico libre infantil; Neurodegeneración asociada a PLA2G6; Síndrome de Jervell y Lange-Nielsen; Epidermolisis bullosa de la unión; Enfermedad de Huntington; Enfermedad de Krabbe (Infantil); NARp y Síndrome de Leigh asociados al ADN mitocondrial; Síndrome de Lesch-Nyhan; Lisencefalía asociada a LIS1; Síndrome de Lowe; Enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce; Síndrome de duplicación de MECP2; Trastornos del transporte de cobre relacionados con ATP7A; Distrofia muscular relacionada con LAMA2; Deficiencia de arilsulfatasa A; Tipos I, II o III de mucopolisacaridosis; Trastornos de la biogénesis del peroxisoma, Síndrome del espectro de Zellweger; Trastornos de neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro; Deficiencia de la esfingomielinasa ácida; Tipo C de la enfermedad de Niemann-Pick; Encefalopatía de glicina; Trastornos relacionados con la ARX; Trastornos del ciclo de la urea; Osteogénesis imperfecta relacioanda con COL1A1/2; Síndromes de deleción de ADN mitocondrial; Trastornos relacionados con PLP1; Síndrome de Perry; Síndrome de Phelan-McDermid; Tipo II de glucogenosis (Enfermedad de Pompe) (Infantil); Trastornos relacionados con MAPT; Trastornos relacionados con MECP2; Condrodisplasia rizomélica punteada de tipo 1; Síndrome de Roberts; Enfermedad de Sandhoff; Enfermedad de Schindler - Tipo 1; Deficiencia de adenosina-desaminasa; Síndrome de Smith-Lemli-Opitz; Atrofia muscular espinal; Ataxia espinocerebelosa con inicio en la infancia; Deficiencia de hexosaminidasa A; Displasia tanatofórica de tipo 1; Trastornos relacionados con el colágeno de tipo VI; Síndrome de Usher de tipo I; Distrofia muscular congénita; Síndrome de Wolf-Hirschhorn; Deficiencia de la lipasa ácida lisosomal y Xerodermia pigmentosa.
Como será evidente, se prevé que el presente sistema se pueda utilizar para que tenga como diana cualquier secuencia polinucleotídica de interés. Algunos ejemplos de afecciones o enfermedades que se podrán tratar de manera útil utilizando el presente sistema se incluyen en las Tablas anteriores y también se proporcionan en ellas ejemplos de genes que se asocian en la actualidad con esas afecciones. Sin embargo, los genes ejemplificados no son exhaustivos. Por ejemplo, "StCas9 no modificada" se refiere a una Cas9 no modificada procedente de S. termophilus, cuya secuencia proteica se proporciona en la base de datos SwissProt con el número de acceso G3ECR1. De manera similar, la Cas9 de S. pyogenes se incluye en SwissProt con el número de acceso Q99ZW2.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Actividad del complejo CRISPR en el núcleo de una célula eucariota
Un ejemplo del sistema CRISPR de tipo II es el locus CRISPR de tipo II de Streptococcus pyogenes SF370, que contiene una agrupación de cuatro genes Cas9, Cas1, Cas2 y Csn1, así como también dos elementos de ARN no codificantes, ARNtracr y una matriz característica de secuencias repetitivas (repeticiones directas) espaciadas entre sí por fragmentos cortos de secuencias no repetitivas (espaciadores, cada uno de aproximadamente 30 pb). En este sistema, se genera una rotura bicatenaria de ADN diana (DSB) dirigida en cuatro pasos secuenciales (Fig. 2A). En primer lugar, dos ARN no codificantes, la matriz de pre-ARNcr y el ARNtracr, se transcriben a partir del locus CRISPR. En segundo lugar, el ARNtracr se hibrida con las repeticiones directas de pre-ARNcr que se procesa a continuación para generar ARNcr maduros que contienen secuencias espaciadoras individuales. En tercer lugar, el complejo ARNcrmaduro:ARNtracr dirige a Cas9 al ADN diana constituido por el protoespaciador y la PAM correspondiente mediante la formación de un complejo heterobicatenario entre la región espaciadora del ARNcr y el ADN protoespaciador. Finalmente, Cas9 media la escisión del ADN diana en dirección 5' respecto a PAM para crear una DSB en el protoespaciador (Fig. 2A). Este ejemplo describe un proceso a modo de ejemplo para adaptar este sistema de nucleasa programable por ARN para dirigir la actividad del complejo CRISPR en los núcleos de células eucariotas. Cultivo celular y transfección
La línea celular renal embrionaria humana (HEK) HEK 293FT (Life Technologies) se mantuvo en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (HyClone), GlutaMAX 2 mM (Life Technologies) y 100 U/mL de penicilina y 100 pg/mL de estreptomicina incubando a 37 °C con un 5% de CO2. La línea celular neuro2A (N2A) de ratón (ATCC) se mantuvo en DMEM suplementado con un 5% de suero bovino fetal (HyClone), GlutaMAX 2 mM (Life Technologies), 100 U/mL de penicilina y 100 pg/mL de estreptomicina a 37 °C con un 5% de CO2.
Se sembraron células HEK 293FT o N2A en placas de 24 pocillos (Corning) un día antes de la transfección con una densidad de 200000 células por pocillo. Se transfectaron las células utilizando Lipofectamina 2000 (Life Technologies) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Para cada pocillo de una placa de 24 pocillos se utilizaron un total de 800 ng de plásmidos.
Ensayo Surveyor y análisis de secuenciación para determinar la modificación genómica
Se transfectaron las células HEK 293FT o N2A con ADN plasmídico tal como se ha descrito anteriormente. Tras la transfección, se incubaron las células a 37 °C durante 72 horas antes de la extracción de ADN genómico. Se extrajo el ADN genómico utilizando el kit de extracción de ADN QuickExtract (Epicentre) siguiendo el protocolo del fabricante. Resumiendo, se resuspendieron las células en la solución QuickExtract y se incubaron a 65 °C durante 15 minutos y a 98 °C durante 10 minutos. El ADN genómico extraído se procesó inmediatamente o se almacenó a -20 °C.
Se amplificó por PCR la región genómica que rodea al sitio diana de CRISPR para cada gen y se purificaron los productos utilizando la Columna QiaQuick Spin (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante. Se mezclaron 400 ng en total de productos de PCR purificados con 2 pL del tampón 10X de PCR para la Taq polimerasa (Enzymatics) y agua ultrapura hasta un volumen final de 20 pL y se sometieron a un proceso de rehibridación para permitir la formación de un complejo heterobicatenario: a 95 °C durante 10min, de 95 °C a 85 °C con una rampa de - 2 °C/s, de 85 °C a 25 °C a - 0.25 °C/s y se mantuvo a 25 °C durante 1 minuto. Tras la rehibridación, se trataron los productos con la nucleasa Surveyor y el potenciador S Surveyor (Transgenomics) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante y se analizaron en geles de poliacrilamida Novex TBE al 4-20% (Life Technologies). Se tiñeron los geles con tinte oro SYBR para ADN (Life Technologies) durante 30 minutos y se obtuvieron imágenes con un sistema de obtención de imágenes de geles Gel Doc (Bio-rad). La cuantificación se basó en las intensidades de las bandas relativas, como una medición de la fracción de ADN escindido. La Fig. 7 proporciona una ilustración esquemática de este ensayo Surveyor.
Ensayo del polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción para la detección de la recombinación homóloga. Se transfectaron las células HEK 293FT y N2A con ADN plasmídico y se incubaron a 37 °C durante 72 horas antes de la extracción del ADN genómico tal y como se ha descrito anteriormente. Se amplificó por PCR la región genómica diana utilizando cebadores fuera de los brazos de homología del molde de recombinación homóloga (RH). Se separaron los productos de la PCR en un gel de agarosa al 1% y se extrajeron con un kit MinElute GelExtraction (Qiagen). Se digirieron los productos purificados con HindIII (Fermentas) y se analizaron en un gel de poliacrilamida Novex TBE al 6% (Life Technologies).
Predicción y análisis de la estructura secundaria del ARN
Se realizó una predicción de la estructura secundaria del ARN utilizando el servidor web con conexión a internet RNAfoId, desarrollado en el Instituto de Química Teórica de la Universidad de Viena, utilizando el algoritmo de predicción con estructura centroide (remítase a, p. ej., A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; y PA Carr y GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62).
Purificación de ARN:
Las células HEK 293FT se mantuvieron y transfectaron tal y como se ha indicado anteriormente. Se recolectaron las células mediante tripsinización y se lavó a continuación con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se extrajo el ARN celular total con el reactivo TRI (Sigma) siguiendo el protocolo del fabricante. Se cuantificó el ARN total extraído utilizando Naonodrop (Thermo Scientific) y se normalizó respecto a la misma concentración.
Análisis mediante la técnica de Northern de la expresión de ARNcr y ARNtracr en células de mamífero
Se mezclaron los ARN con volúmenes iguales de tampón de carga 2X (Ambion), se calentó a 95 °C durante 5 min, se enfrió en hielo durante 1 min y a continuación se colocó en geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 8% (SequaGel, National Diagnostics) después de pretratar el gel durante al menos 30 minutos. Las muestras se sometieron a electroforesis durante 1.5 horas con un límite de 40W. Posteriormente, se transfirió el ARN a una membrana Hybond N+ (GE Healthcare) a 300 mA en un aparato de transferencia semiseco (Bio-rad) a temperatura ambiente durante 1.5 horas. Se reticuló el ARN con la membrana utilizando el botón de autorreticulación en el Reticulador con UV de Stratagene Stratalinker (Stratagene). Se prehibridó la membrana en tampón de hibridación ULTRAhyb-Oligo (Ambion) durante 30 min con rotación a 42 °C y a continuación se añadieron las sondas y se hibridaron durante toda la noche. Se encargaron las sondas a IDT y se marcaron con [gamma-32P] ATP (Perkin Elmer) con la polinucleótido-cinasa T4 (New England Biolabs). Se lavó la membrana una vez con 2xSSC, 0.5% SDS precalentado (42 °C) durante 1 min y a continuación se lavó dos veces durante 30 minutos a 42 °C. Se expuso la membrana a una pantalla de luminiscencia durante una hora o durante toda la noche a temperatura ambiente y a continuación se realizó un barrido con un lector de luminiscencia fotoestimulada (Typhoon).
Construcción y evaluación del sistema CRISPR bacteriano
Se amplificaron mediante PCR los elementos del locus CRISPR incluidos el ARNtracr, Cas9 y el líder a partir del ADN genómico de Streptococcus pyogenes SF370 con brazos de homología flanqueantes para el ensamblaje de Gibson. Se introdujeron dos sitios BsaI de tipo IIS entre dos repeticiones directas para facilitar la inserción sencilla de espaciadores (Fig. 8). Se clonaron los productos de la PCR en pACYC184 digerido con EcoRV en dirección 3' respecto al promotor tet utilizando la Mezcla Maestra (Master Mix) para el ensamblaje de Gibson (NEB). Se omitieron otros elementos endógenos del sistema CRISPR, con la excepción de los últimos 50 pb de Csn2. Se clonaron los oligos (Integrated DNA Technology) que codificaban espaciadores con regiones protuberantes complementarias en el vector pDC000 digerido con BsaI (NEB) y se ligaron a continuación con la ligasa T7 (Enzymatics) para generar los plásmidos pCRISPR. Plásmidos de exposición que contienen espaciadores con expresión de PAM en células de mamíferos (constructos de expresión ilustrados en la Fig. 6A, con una funcionalidad determinada por los resultados del ensayo Surveyor mostrado en la Fig. 6B). Los sitios de inicio de la transcripción están marcados como 1 y también se indican el terminador de la transcripción y la secuencia que se utilizó como sonda en la técnica de Northern. También se confirmó mediante la técnica de Northern la expresión del ARNtracr procesado. La Fig. 6C muestra los resultados de un análisis mediante la técnica de Northern del ARN total extraído de células 293FT transfectadas con constructos de expresión U6 que portan ARNtracr largo o corto, así como también SpCas9 y DR-EMX1(1)-DR. Los cuadros de la izquierda y la derecha son de células 293FT transfectadas sin o con SpRNasa III, respectivamente. U6 indica control de carga sometido a una técnica de transferencia con una sonda cuya diana es el ARNnp de U6 humana. La transfección del constructo de expresión ARNtracr corto conllevó niveles abundantes de la forma procesada del ARNtracr (~75 pb). Se detectaron cantidades muy pequeñas del ARNtracr largo en la técnica de Northern.
Para promover una iniciación transcripcional precisa, se seleccionó el promotor U6 basado en la ARN polimerasa III para impulsar la expresión de ARNtracr (Fig. 2C). De manera similar, se desarrolló un constructo basado en el promotor U6 para expresar una matriz de pre-ARNcr constituida por un único espaciador flanqueado por dos repeticiones directas (DR, por sus siglas en inglés, también englobadas en la expresión "secuencias pareja de tracr"; Fig. 2C). Se diseñó el espaciador inicial para que su diana fuera un sitio diana de 33 pares de bases (pb) (protoespaciador de 30 pb más una secuencia con un motivo CRISPR de 3 pb (PAM) que cumpliera el requisito del motivo de reconocimiento NGG de Cas9) en el locus de EXM1 humano (Fig. 2C), un gen clave en el desarrollo de la corteza cerebral.
Para estudiar si la expresión heteróloga del sistema CRISPR (SpCas9, SpRNasa III, ARNtracr y pre-ARNcr) en células de mamífero puede lograr la escisión dirigida de cromosomas de mamíferos, se transfectaron las células HEK 293FT con combinaciones de componentes CRISPR. Ya que las DSB en los núcleos de mamífero se reparan parcialmente mediante la ruta de unión de extremos no homólogos (NHEJ), que conlleva la formación de indels, se utilizó el ensayo Surveyor para detectar una actividad de escisión potencial en el locus EXM1 diana (Fig. 7) (remítase a, p. ej., Guschin et al., 2010, Methods Mol Biol 649 247): La cotransfección con los cuatro componentes CRISPR fue capaz de inducir hasta un 5.0% de escisión en el protoespaciador (remítase a la Fig. 2D). La cotransfección con todos los componentes CRISPR menos la SpRNasa III también indujo hasta un 4.7% de indel en el protoespaciador, lo que sugiere que podrá haber RNasas de mamífero endógenas que sean capaces de colaborar con la maduración del ARNcr tal como, por ejemplo, las enzimas relacionadas Dicer y Drosha. La eliminación de cualquiera de los tres componentes restantes anuló la actividad de escisión genómica del sistema CRISPR (Fig. 2D). La secuenciación de Sanger de los amplicones que contenían el locus diana verificó la actividad de escisión: en 43 clones secuenciados, se detectaron 5 alelos mutados (11.6%). Experimentos similares que utilizaban varias secuencias guía produjeron porcentajes indel de hasta un 29% (remítase a las Figs. 3-6, 10 y 11). Estos resultados definen un sistema de tres componentes para la modificación genómica mediada por CRISPR eficaz en células de mamífero. Para optimizar la eficacia de escisión, los solicitantes también estudiaron si diferentes isoformas de ARNtracr afectaban a la eficacia de escisión y observaron que, en este sistema a modo de ejemplo, únicamente la forma del transcrito corto (89 pb) era capaz de mediar en la escisión del locus genómico EXM1 humano (Fig. 6B).
La Fig. 12 proporciona un análisis mediante la técnica de Northern adicional del procesamiento de ARNcr en células de mamífero. La Fig. 12A ilustra una representación esquemática que muestra el vector de expresión para un espaciador único flanqueado por dos repeticiones directas (DR-EMX1(1)-DR). El espaciador de 30 pb cuya diana es el protoespaciador 1 del locus EXM1 humano (remítase a la Fig. 6) y las secuencias de repeticiones directas se muestran en la secuencia bajo la Fig. 12A. La línea indica la región cuya secuencia complementaria inversa se utilizó para generar sondas de la técnica de Northern para la detección de ARNcr de EMX1 (1). La Fig. 12B muestra un análisis mediante la técnica de Northern del ARN total extraído de células 293FT transfectadas con constructos de expresión U6 que portaban DR-EMX1(1)-DR. Los cuadros de la izquierda y la derecha son de células 293FT transfectadas sin o con SpRNasa III, respectivamente. Se procesó DR-EMX1(1)-DR para obtener ARNcr maduros únicamente en presencia de SpCas9 y ARNtracr corto y no dependió de la presencia de SpRNasa III. El ARNcr maduro detectado a partir del ARN total de 293FT transfectadas fue de ~33 pb y es más corto que el ARNcr maduro de 39-42 pb de S. pyogenes. Estos resultados demuestran que se puede trasplantar un sistema CRISPR en células eucariotas y reprogramarlo para facilitar la escisión de polinucleótidos diana de mamífero endógenos.
La Fig. 2 ilustra el sistema CRISPR bacteriano descrito en este ejemplo. La Fig. 2A ilustra una representación esquemática que muestra el locus 1 de CRISPR procedente de Streptococcus pyogenes SF370 y un mecanismo propuesto para la escisión del ADN mediado por CRISPR por parte de este sistema. El ARNcr maduro procesado procedente de la matriz de espaciadores de repeticiones directas dirige a Cas9 a las dianas genómicas constituidas por protoespaciadores complementarios y un motivo adyacente al protoespaciador (PAM). Tras el apareamiento de bases diana-espaciador, Cas9 media una rotura bicatenaria en el ADN diana. La Fig. 2B ilustra la modificación de la Cas9 de S. pyogenes (SpCas9) y la RNasa III (SpRNasa III) con señales de ubicación nuclear (NLS) para posibilitar la entrada en el núcleo de mamíferos. La Fig. 2C ilustra la expresión en mamíferos de SpCas9 y SpRNasa III impulsada por el promotor constitutivo EF1a y de ARNtracr y la matriz de pre-ARNcr (DR-Espaciador-DR) impulsada por el promotor de la ARN Pol3 U6 para promover la iniciación y terminación de la transcripción precisas. Se utiliza un protoespaciador del locus EXM1 humano con una secuencia PAM satisfactoria como el espaciador en la matriz de pre-ARNcr. La Fig. 2D ilustra un ensayo con la nucleasa surveyor para inserciones y deleciones poco importantes mediadas por SpCas9. Se expresó SpCas9 con y sin SpRNasa III, ARNtracr y una matriz de pre-ARNcr que portaba el espaciador diana de EMX1. La Fig. 2E ilustra una representación esquemática de un apareamiento de bases entre el locus diana y ARNcr cuya diana es EMX1, así como también un cromatograma a modo de ejemplo que muestra una microdeleción adyacente al sitio de escisión de SpCas9. La Fig. 2F ilustra alelos mutados identificados a partir del análisis de la secuenciación de 43 amplicones clonales que muestra varias micro inserciones y deleciones. Los guiones indican bases eliminadas y las bases no alineadas o emparejadas erróneamente indican inserciones o mutaciones. Escala de la barra = 10 gm.
Para simplificar en mayor grado el sistema de tres componentes, se adaptó el diseño del híbrido ARNcr-ARNtracr quimérico, donde un ARNcr maduro (que comprende una secuencia guía) se podrá fusionar con un ARNtracr parcial mediante un elemento tallo-bucle para mimetizar la estructura bicatenaria ARNcr:ARNtracr natural. Para incrementar la eficacia de suministro conjunto, se creó un vector de expresión bicistrónico para impulsar la expresión conjunta de un ARN quimérico y SpCas9 en células transfectadas. En paralelo, se utilizaron vectores bicistrónicos para expresar un pre-ARNcr (DR-secuencia guía-DR) con SpCas9, para inducir el procesamiento y obtener ARNcr con un ARNtracr expresado por separado (comparar la Fig. 11B, parte superior e inferior). La Fig. 8 proporciona ilustraciones esquemáticas de vectores de expresión bicistrónicos para la matriz de pre-ARNcr (Figura 8A) o ARNcr quimérico (representado por la línea corta después del sitio de inserción de la secuencia guía y antes del promotor EF1a de la Fig. 8B) con hSpCas9, que muestra la ubicación de diversos elementos y el punto de inserción de la secuencia guía. La secuencia expandida alrededor de la ubicación del sitio de inserción de la secuencia guía en la Fig. 8B también muestra una secuencia DR parcial (GTTTAGAGCTA (SEQ ID NO: 90)) y una secuencia de ARNtracr parcial (TAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTT (SEQ ID NO: 91)). Se pueden insertar secuencias guía entre los sitios BbsI utilizando oligonucleótidos hibridados. El diseño de la secuencia para los oligonucleótidos se muestra bajo las ilustraciones esquemáticas de la Fig. 8, donde se indican adaptadores de la ligadura apropiados. WPRE representa el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de las marmotas. Se estudió la eficacia de la escisión mediada por ARN quimérico teniendo como diana el mismo locus EXM1 descrito anteriormente. La utilización del ensayo Surveyor y de la secuenciación de Sanger de amplicones, los solicitantes confirmaron que el diseño del ARN quimérico facilita la escisión del locus EMX1 humano con una tasa de modificación de aproximadamente un 4.7% (Fig. 3).
Se estudió la posibilidad de generalizar la escisión mediada por CRISPR en células eucariotas teniendo como diana loci genómicos adicionales tanto en células de ratón como humanas diseñando ARN quiméricos que tenían como diana múltiples sitios en el EMX1 y PVALB humanos así como también en los loci Th de ratón. La Fig. 13 ilustra la selección de algunos protoespaciadores escogidos como diana adicionales en el PVALB humano (Fig. 13A) y en los loci Th de ratón (Fig. 13B). Se proporcionan las secuencias esquemáticas de los loci génicos y la ubicación de tres protoespaciadores dentro del último exón de cada una. Las secuencias subrayadas incluyen 30 pb de la secuencia protoespaciadora y 3 pb en el extremo 3' que corresponde a las secuencias PAM. Los protoespaciadores en las hebras sentido y antisentido se indican encima y debajo de las secuencias de ADN, respectivamente. Se logró una tasa de modificación de un 6.3% y un 0.75% para el PVALB humano y loci Th de ratón, respectivamente, lo que demuestra la gran aplicabilidad del sistema CRISPR para modificar diferentes loci en múltiples organismos (Fig. 5). Aunque solamente se detectó escisión con uno de cada tres espaciadores para cada locus utilizando los constructos quiméricos, se escindieron todas las secuencias diana con una eficacia de producción de indel que alcanzó un 27% cuando se utilizó la disposición de pre-ARNcr expresada conjuntamente (Figs. 6 y 13).
La Fig. 11 proporciona una ilustración adicional de que SpCas9 se puede reprogramar para que tenga como diana múltiples loci genómicos en células de mamífero. La Fig. 11A proporciona una representación esquemática del locus EMX1 humano que muestra la ubicación de cinco protoespaciadores, indicados por las secuencias subrayadas. La Fig. 11B proporciona una representación esquemática del complejo pre-ARNcr/ARNtracr que muestra la hibridación entre la región de repeticiones directas del pre-ARNcr y el ARNtracr (parte superior) y una representación esquemática de un diseño de a Rn quimérico que comprende una secuencia guía de 20 pb y una secuencia pareja de tracr y una secuencia tracr constituidas por repeticiones directas parciales y secuencias de ARNtracr hibridadas en una estructura de horquilla (parte inferior). Los resultados de un ensayo Surveyor para comparar la eficacia de la escisión mediada por Cas9 en cinco protoespaciadores en el locus EMX1 humano se ilustra en la Fig. 11C. Cada protoespaciador será la diana o bien del complejo pre-ARNcr/ARNtracr (ARNcr) procesado o bien del ARN quimérico (ARNqui).
Ya que la estructura secundaria de ARN puede ser crucial para las interacciones intermoleculares, se utilizó un algoritmo de predicción de la estructura basado en la energía libre mínima y el conjunto de estructuras ponderado por Boltzmann para comparar la estructura secundaria putativa de todas las secuencias guía utilizadas en el experimento que tiene como diana el genoma (remítase a, p. ej., Gruber et al., 2008, Nucleic Acids Research, 36: W70). Los análisis revelaron que en la mayoría de los casos, las secuencias guía eficaces en el contexto del ARNcr quimérico estuvieron sustancialmente exentas de motivos de estructura secundaria, mientras que las secuencias guía ineficaces tendían a formar estructuras secundarias internas que podrían prevenir el apareamiento de bases con el ADN protoespaciador diana. Por lo tanto es posible que la variabilidad en la estructura secundaria del espaciador pueda tener un impacto en la eficacia de la interferencia mediada por CRISPR cuando se utilice un ARNcr quimérico.
Se muestran diseños vectoriales adicionales para SpCas9 en la Fig. 22, que ilustra vectores de expresión únicos que incorporan un promotor U6 ligado a un sitio de inserción para un oligo guía y un promotor Cbh ligado a una secuencia codificante de SpCas9. El vector que se muestra en la Fig. 22b incluye una secuencia codificante de ARNtracr ligada a un promotor H1.
En el ensayo bacteriano, todos los espaciadores facilitaron una interferencia de CRISPR eficaz (Fig. 3C). Estos resultados sugieren que podrá haber factores adicionales que afecten la eficacia de la actividad CRISPR en células de mamífero.
Para investigar la especificidad de la escisión mediada por CRISPR, se analizó el efecto de mutaciones de nucleótido único en la secuencia guía en la escisión del protoespaciador en el genoma de mamíferos utilizando una serie de ARNcr quiméricos cuya diana es EMX1 con mutaciones de punto único (Fig. 3A). La Fig. 3B ilustra los resultados de un ensayo con nucleasa Surveyor que compara la eficacia de la escisión de Cas9 cuando se empareja con diferentes ARN quiméricos mutantes. El emparejamiento erróneo de bases únicas de hasta 12 pb en 5' respecto a la PAM anuló sustancialmente la escisión genómica por parte de SpCas9, mientras que los espaciadores con mutaciones en posiciones más alejadas en dirección 5' retuvieron la actividad contra el protoespaciador diana original (Fig. 3B). Además de la PAM, SpCas9 tiene una especificidad de base única dentro de las últimas 12 pb del espaciador. Además, CRISPR es capaz de mediar la escisión genómica tan eficazmente como una pareja de nucleasas TALE (TALEN) que tengan como diana el mismo protoespaciador EMX1. La Fig. 3C proporciona una representación esquemática que muestra el diseño de TALEN cuya diana es EMX1 y la Fig. 3D muestra un gel Surveyor que compara la eficacia de TALEN y Cas9 (n=3).
Habiendo establecido un conjunto de componentes para lograr una edición génica mediada por CRISPR en células de mamífero mediante el mecanismo NHEJ propenso a error, se estudió la capacidad de CRISPR de estimular la recombinación homóloga (RH), una ruta de reparación génica sumamente fiel para realizar ediciones precisas en el genoma. La SpCas9 no modificada es capaz de mediar DSB específicas del sitio, que se podrán reparar mediante NHEJ y RH. Además, se practicó una sustitución de aspartato-por-alanina (D10A) en el dominio catalítico RuvC I de SpCas9 para convertir la nucleasa en una nickasa (SpCas9n; ilustrado en la Fig. 4A) (remítase a, p. ej., Sapranauskas etal., 2011, Nucleic Acids Resch, 39: 9275; Gasiunas et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109:E2579), de modo que el ADN genómico en el que se ha practicado un corte monocatenario experimente la reparación dirigida por la homología sumamente fiel (HDR). El ensayo Surveyor confirmó que SpCas9n no genera indels en el protospaciador de EXM1 diana. Tal y como se ilustra en la Fig. 4B, la expresión conjunta del ARNcr quimérico cuya diana es EMX1 con SpCas9 produjo indels en el sitio diana, mientras que la expresión conjunta con SpCas9n no lo hizo (n=3). Además, en la secuenciación de 327 amplicones no se detectó ningún indel inducido por SpCas9n. Se seleccionó el mismo locus para estudiar la RH mediada por CRISPR cotransfectando células HEK 293FT con el ARN quimérico cuya diana es EXM1, hSpCas9 o hSpCas9n, así como también un molde de RH para introducir un par de sitios de restricción (HindIIIy NheI) cerca del protoespaciador. La Fig. 4C proporciona una ilustración esquemática de la estrategia de RH, con ubicaciones relativas de puntos de recombinación y secuencias de hibridación del cebador (flechas). SpCas9 y SpCas9n ciertamente catalizaron la integración del molde de RH en el locus EMX1. La amplificación por pCr de la región diana seguida por una digestión de restricción con HindIII reveló los productos de escisión correspondientes a los tamaños de fragmentos esperados (flechas en el análisis por gel del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción que se muestra en la Fig. 4D), donde SpCas9 y SpCas9n actúan como mediadores para obtener niveles similares de eficacias de RH. Los solicitantes además verificaron la RH utilizando la secuenciación de Sanger de amplicones genómicos (Fig. 4E). Estos resultados demuestran la utilidad de CRISP para facilitar la inserción génica dirigida en el genoma de mamíferos. Dada la especificidad de la diana de 14 pb (12 pb del espaciador y 2 pb del PAM) de la SpCas9 no modificada, la disponibilidad de una nickasa puede reducir significativamente la probabilidad de modificaciones fuera de la diana, ya que las roturas de hebra monocatenaria no son sustratos para la ruta NHEJ propensa a errores.
Se construyeron constructos de expresión que mimetizan la arquitectura natural de los loci CISPR con espaciadores dispuestos en una matriz (Fig. 2A) para estudiar la posibilidad de tener como diana secuencias múltiples. Utilizando una única matriz CRISPR única que codifica un par de espaciadores cuya diana es EMX1 y PVALB, se detectó una escisión eficaz en ambos loci (Fig. 4F, que muestra tanto un diseño esquemático de la matriz de ARNcr con un ensayo de transferencia Surveyor que muestra una mediación eficaz de la escisión). También se estudió la deleción dirigida de regiones genómicas más grandes mediante DBS concurrentes utilizando espaciadores contra dos dianas dentro de EMX1 espaciadas por 119 pb y se detectó una eficacia de la deleción de un 1.6% (3 de cada 182 amplicones; Fig. 4G). Esto demuestra que el sistema CRISPR puede mediar la edición múltiple dentro de un único genoma.
Ejemplo 2: Modificaciones y alternativas del sistema CRISPR
La capacidad de utilizar ARN para programar una escisión de ADN específica de la secuencia define una nueva clase de herramientas para la modificación del genoma para varias aplicaciones de investigación e industriales. Varios aspectos del sistema CRISPR se pueden mejorar adicionalmente para incrementar la eficacia y versatilidad de CRISPR dirigiéndose a sus dianas. La actividad óptima de Cas9 podrá depender de la disponibilidad de Mg2+ libre en niveles más elevados que los que están presentes en el núcleo de mamíferos (remítase a, p. ej., Jinek et al., 2012, Science, 337:816) y la preferencia por un motivo NGG adyacente en dirección 3' respecto al protoespaciador restringe la posibilidad de tener como diana, como media, cada 12 pb en el genoma humano (Fig. 9, evaluando tanto la hebra codificante como la no codificante de secuencias del cromosoma humano). Algunas de estas restricciones se pueden superar explorando la diversidad de los loci de CRISPR en el metagenoma microbiano (remítase a, p. ej., Makarova et al., 2011, Nat Rev Microbiol, 9:467). Otros loci de CRISPR se podrán trasplantar a un medio con células de mamíferos mediante un proceso similar al descrito en el Ejemplo 1. Por ejemplo, la Fig. 10 ilustra la adaptación del sistema CRISPR de tipo II procedentes de CRISPR 1 de Streptococcus thermophilus LMD-9 para la expresión heteróloga en células de mamífero para lograr la edición genómica mediada por CRISPR. La Fig. 10A proporciona una ilustración esquemática de CRISPR 1 procedentes de S. thermophilus LMD-9. La Figura 10B ilustra el diseño de un sistema de expresión para el sistema CRISPR de S. thermophilus. Se expresa hStCas9 optimizada para codones humanos utilizando un promotor EF1a constitutivo. Las versiones maduras de ARNtracr y ARNcr se expresan utilizando el promotor U6 para promover una iniciación de la transcripción precisa. Se ilustran las secuencias procedentes del ARNcr maduro y ARNtracr. Se utiliza una única base indicada mediante la "a" minúscula en la secuencia de ARNcr para eliminar la secuencia de poliU, que actúa como un terminador transcripcional de la ARN polIII. La Fig. 10C proporciona una representación esquemática que muestra las secuencias guía que tienen como diana el locus EMX1 humano. La Fig. 10D muestra el resultado de la escisión mediada por hStCas9 en el locus diana utilizando el ensayo Surveyor. Los espaciadores 1 y 2 del ARN guía inducen un 14% y un 6.4%, respectivamente. Los análisis estadísticos de la actividad de escisión en réplicas biológicas en estos dos sitios de protoespaciadores también se proporcionan en la Fig. 5. La Figura 14 proporciona una representación esquemática de un protoespaciador y la secuencia PAM correspondiente adicionales que son las dianas del sistema c RiSPR de S. thermophilus en el locus EMX1 humano. Se resaltan dos secuencias protoespaciadoras y se indican sus secuencias PAM correspondientes que cumplen el requisito del motivo NNAGAAW mediante un subrayado en 3' respecto a la secuencia resaltada correspondiente. Ambos protoespaciadores tienen como diana la hebra antisentido.
Ejemplo 3: Algoritmo de selección de la secuencia diana de muestra
Se diseñó un programa software para identificar secuencias diana de CRISPR candidatas en ambas hebras de una secuencia de ADN inicial basándose en una longitud de la secuencia guía deseada y una secuencia con un motivo CRISPR (PAM) para una enzima CRISPR especificada. Por ejemplo, los sitios diana para Cas9 procedente de S. pyogenes, con secuencias PAM NGG, se podrán identificar buscando 5’-Nx-NGG-3’ tanto en la secuencia inicial como en la secuencia complementaria inversa de la secuencia inicial. Igualmente, los sitios diana para Cas9 procedente del CRISPR1 de S. thermophilus, con secuencia PAM NNAGAAW, se podrán identificar buscando 5’-Nx-NNAGAAW-3’ tanto en la secuencia inicial como en la secuencia complementaria inversa de la secuencia inicial. Igualmente, los sitios diana para Cas9 procedente del CRISPR3 de S. thermophilus, con secuencia PAM NGGNG, se podrán identificar buscando 5’-Nx-NGGNG-3’ tanto en la secuencia inicial como en la secuencia complementaria inversa de la secuencia inicial. El valor "x" en Nx, por ejemplo, 20, lo podrá fijar el programa o lo podrá especificar el usuario.
Debido a que múltiples apariciones en el genoma del sito diana de ADN podrán conllevar una edición genómica no específica, tras identificar todos los sitios potenciales, el programa filtra las secuencias basándose en el número de veces que aparecen en el genoma de referencia relevante. Para aquellas enzimas CRISPR para las cuales se determina la especificidad secuencial mediante una secuencia "seminal", tal como las 11-12 pb en 5' desde la secuencia PAM, incluida la propia secuencia PAM, el paso de filtración se podrá basar en la secuencia seminal. Por lo tanto, para evitar la edición de loci genómicos adicionales, los resultados se filtran según el número de apariciones de la secuencia seminal:PAM en el genoma relevante. Se podrá permitir que el usuario escoja la longitud de la secuencia seminal. También se podrá permitir que el usuario especifique el número de apariciones de la secuencia seminal:PAM en un genoma a efectos de pasar el filtro. De manera predeterminada se criba para identificar secuencias únicas. Se altera el nivel de filtración cambiando tanto la longitud de la secuencia seminal como el número de apariciones de la secuencia en el genoma. El programa podrá proporcionar además, o como alternativa, la secuencia de una secuencia guía complementaria a la secuencia o secuencias diana indicadas proporcionando la secuencia complementaria inversa de la secuencia o secuencias diana identificadas. En la Fig. 18 se proporciona un ejemplo de la visualización de algunos sitios diana del genoma humano.
En la solicitud de los EE. UU. con N.° de serie 61/064798 (expediente 44790.11.2022; referencia Broad BI-2012/084) se pueden consultar más detalles de métodos y algoritmos para optimizar la selección secuencial.
Ejemplo 4: Evaluación de múltiples híbridos de ARNcr-ARNtracr quiméricos
Este ejemplo describe los resultados obtenidos para ARN quiméricos (ARNqui; que comprenden una secuencia quía, una secuencia pareja de tracr y una secuencia tracr en un único transcrito) que tienen secuencias tracr que incorporan longitudes diferentes de una secuencia de ARNtracr no modificada. La Fig. 16a ilustra una representación esquemática de un vector de expresión bicistrónico para ARN quimérico y Cas9. Cas9 está impulsada por el promotor CBh y el ARN quimérico está impulsado por un promotor U6. El ARN guía quimérico está constituido por una secuencia guía de 20 pb (Ns) unida a la secuencia tracr (abarca desde el primer "U" de la hebra inferior hasta el final del transcrito), que está truncada en varias posiciones tal y como se indica. Las secuencias guía y tracr están separadas por la secuencia pareja de tracr GUUUUa Ga GCUA (SeQ ID NO: 63) seguida por la secuencia bucle GAAA. Los resultados de los ensayos SURVEYOR para los indels mediados por Cas9 en los loci EMX1 y PVALB humanos se ilustran en las Figs. 16b y 16c, respectivamente. Las flechas indican los fragmentos SURVEYOR esperados. Los ARNqui están indicados por su designación "+n" y ARNcr se refiere a un ARN híbrido donde las secuencias guía y tracr se expresan como transcritos separados. La cuantificación de estos resultados, que se realiza por triplicado, se ilustra mediante el histograma de las Figs. 17a y 17b, que corresponden a las Figs. 16b y 16c, respectivamente ("N.D." indica que no se detectaron indels). En la Tabla D se proporcionan las ID de los protoespaciadores y su diana genómica correspondiente, secuencia protoespaciadora, secuencia PAM y ubicación en la hebra. Se diseñaron las secuencias guía para que fueran complementarias a la secuencia protoespaciadora total en el caso de transcritos separados en el sistema híbrido o únicamente a la porción subrayada en el caso de los ARN quiméricos.
Tabla D:
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(SEQ ID NOS: 93 a 97, respectivamente).
En la solicitud de los EE. UU. con N.° de serie 61/836127 (expediente 44790.08.2022; referencia Broad BI-2013/004G) se pueden consultar más detalles para optimizar las secuencias guía.
Inicialmente, se escogieron como diana tres sitios dentro del locus EMX1 en células HEK 293FT humanas. Se evaluó la eficacia de modificación genómica para cada ARNqui utilizando el ensayo con nucleasa SURVEYOR, que detecta mutaciones que son el resultado de roturas bicatenarias de ADN (DSB) y su reparación posterior mediante la ruta de reparación del daño en el ADN por unión de extremos no homólogos (NHEJ). Los constructos designados ARNqui(+n) indican que se incluye hasta el nucleótido n del ARNtracr no modificado en el constructo de ARN quimérico, donde se utilizan valores de 48, 54, 67 y 85 para n. Los ARN quiméricos que contienen fragmentos más grandes de ARNtracr no modificado (ARNqui(+67) y ARNqui(+85)) mediaron en la escisión de ADN en los tres sitios diana de EMX1, donde el ARNqui(+85) en particular demostró niveles de escisión del ADN significativamente más elevados que los híbridos ARNcr/ARNtracr correspondientes que expresaban las secuencias guía y tracr en transcritos separados (Figs. 16b y 17a). También se escogieron como diana utilizando los ARNqui dos sitios en el locus PVALB que no produjeron una escisión detectable utilizando el sistema híbrido (secuencia guía y secuencia tracr expresadas como transcritos separados). ARNqui(+67) y ARNqui(+85) fueron capaces de mediar en una escisión significativa en los dos protoespaciadores de PVALB (Figs. 16c y 17b).
Para la totalidad de las cinco dianas en los loci EMX1 y PVALB, se observó un incremento constante en la eficacia de modificación genómica al incrementar la secuencia de la longitud tracr. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, la estructura secundaria formada por el extremo 3' del ARNtracr podrá ejercer una función en el aumento de la velocidad de la formación del complejo CRISPR.
Ejemplo 5: Diversidad de Cas9
El sistema CRISPR-Cas es un mecanismo inmunitario adaptativo contra ADN exógeno invasor empleado por varias especies de bacterias y arqueas. El sistema CRISPR-Cas9 de tipo II está constituido por un conjunto de genes que codifican proteínas causantes de la "adquisición" de ADN foráneo en el locus CRISPR, así como también por un conjunto de genes que codifican la "ejecución" del mecanismo de escisión del ADN; estos incluyen la ADN nucleasa (Cas9), un ARNcr transactivante no codificante (ARNtracr) y una matriz de espaciadores derivados del ADN foráneo flanqueados por repeticiones directas (ARNcr). Tras la maduración mediante Cas9, la estructura bicatenaria ARNtracr y ARNcr guía a la nucleasa Cas9 a una secuencia de ADN diana especificada por las secuencias guía espaciadoras y media en roturas bicatenarias en el ADN cerca de un motivo con una secuencia corta en el ADN diana que se requiere para la escisión y que es específica de cada sistema CRISPR-Cas. Los sistemas de CRISPR-Cas de tipo II se hallan repartidos en todo el reino bacteriano y son sumamente diversos en la secuencia y tamaño de la proteína Cas9, secuencia de repeticiones directas de ARNcr y ARNtracr, organización genómica de estos elementos y requisitos del motivo de la escisión diana. Otras especies podrán tener múltiples sistemas CRISPR-Cas diferentes.
Los solicitantes evaluaron 207 Cas9s putativas procedentes de especies bacterianas identificadas en función de la homología secuencial con Cas9s conocidas y estructuras ortólogas a subdominios conocidos, incluidos el dominio de la endonucleasa HNH y los dominios de la endonucleasa RuvC [información procedente de Eugene Koonin y Kira Makarova]. Los análisis filogenéticos en función de la conservación de la secuencia proteica de este conjunto reveló cinco familias de Cas9s, incluidos tres grupos de Cas9s grandes (~1400 aminoácidos) y dos de Cas9s pequeñas (~1100 aminoácidos) (remítase a las Figs. 19 y 20A-F).
Se pueden consultar más detalles de Cas9s y mutaciones en la enzima Cas9 para convertirla en una nickasa o proteína de unión a ADN y utilizarla con una funcionalidad alterada en las solicitudes de los EE. UU. con N.os de serie 61/836101 y 61/835 936 (Expedientes 44790.09.2022 y 4790.07.2022 y Referencia Broad BI-2013/004E y BI-2013/004F respectivamente).
Ejemplo 6: Ortólogos de Cas9
Los solicitantes analizaron ortólogos de Cas9 para identificar las secuencias PAM relevantes y el ARN guía quimérico correspondiente. Tener un conjunto expandido de PAM proporciona la posibilidad de tener más dianas a lo largo del genoma y también incrementa significativamente el número de sitios diana únicos y proporciona la posibilidad de identificar Cas9s novedosas con mayores niveles de especificidad en el genoma.
La especificidad de los ortólogos de Cas9 se puede evaluar estudiando la capacidad de cada Cas9 de tolerar emparejamientos erróneos entre el ARN guía y su ADN diana. Por ejemplo, se ha caracterizado la especificidad de SpCas9 estudiando el efecto de mutaciones del ARN guía en la eficacia de escisión. Se obtuvieron colecciones de ARN guía con emparejamientos erróneos únicos o múltiples entre la secuencia guía y el ADN diana. En función de estas observaciones, se pueden seleccionar los sitios diana de SpCas9 en función de las siguientes directrices:
Para maximizar la especificidad de SpCas9 para editar un gen particular, se debería escoger un sitio diana dentro del locus de interés de modo que las secuencias genómicas "fuera de la diana" potenciales cumplieran los siguientes cuatro requisitos: En primer lugar, y sobre todo, no deben estar seguidas por una PAM con secuencias 5’-NGG o NAG. En segundo lugar, su similaridad secuencial global respecto a la secuencia diana deberá minimizarse. En tercer lugar, un número máximo de emparejamientos erróneos debería situarse dentro de la región próxima a PAM del sitio fuera de la diana. Finalmente, un número máximo de emparejamientos erróneos deberán ser consecutivos o separados por menos de cuatro bases.
Se pueden utilizar métodos similares para evaluar la especificidad de otros ortólogos de Cas9 y para establecer el criterio para la selección de sitios diana específicos dentro de los genomas de especies diana. Como se ha mencionado anteriormente, los análisis filogenéticos en función de la conservación de la secuencia proteica de este conjunto reveló cinco familias de Cas9s, incluidos tres grupos de Cas9s grandes (~1400 aminoácidos) y dos de Cas9s pequeñas (~1100 aminoácidos) (remítase a las Figs. 19 y 20A-F). Se pueden consultar más detalles de ortólogos de Cas en las solicitudes de los EE. UU. con N.os de serie 61/836 101 y 61/835 936 (Expediente 44790.09.2022 y 4790.07.2022 y Referencia Broad BI-2013/004E y BI-2013/004F respectivamente).
Ejemplo 7: Mejora metodológica para simplificar la clonación y el suministro
En lugar de codificar el promotor U6 y el ARN guía en un plásmido, los solicitantes amplificaron el promotor U6 con un oligo de ADN para añadir el ARN guía. El producto de la PCR resultante se podrá utilizar para transfectar células con el fin de impulsar la expresión del ARN guía.
Par de cebadores a modo de ejemplo que permiten la generación de un producto de PCR constituido por el promotor U6:ARNguía cuya diana es el locus Emx1 humano:
Cebador directo: AAACTCTAGAgagggcctatttcccatgattc (SEQ ID NO:)
Cebador inverso (que porta el ARN guía, que está subrayado) acctctagAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATGCTGT TTTGTTTCCAAAACAGCATAGCTCTAAAACCCCTAGTCATTGGAGGTGACGGTGTTTCGTCCTTTCCACaag (SEQ ID NO: 99)
Ejemplo 8: Mejora metodológica para mejorar la actividad:
En lugar de utilizar los promotores de la pol3, en particular la ARN polimerasa III (p. ej., promotores U6 o H1), para expresar los ARN guía en células eucariotas, los solicitantes expresan la polimerasa T7 en células eucariotas para impulsar la expresión de ARN guía utilizando el promotor T7.
Un ejemplo de este sistema podrá conllevar la introducción de tres fragmentos de ADN:
1. vector de expresión para Cas9
2. vector de expresión para la polimerasa T7
3. vector de expresión que contiene ARNguía fusionado con el promotor T7
Ejemplo 9: Mejora metodológica para reducir la toxicidad de Cas9: Suministro de Cas9 en forma de ARNm
El suministro de Cas9 en forma de ARNm permite la expresión transitoria de Cas9 en células, para reducir la toxicidad. Por ejemplo, se podrán amplificar SpCas9 humanizados utilizando el siguiente par de cebadores:
Cebador directo (para añadir al promotor T7 para la transcripción in vitro):
TAATACGACTCACTATAGGAAGTGCGCCACCATGGCCCCAAAGAAGAAGCGG (SEQ ID NO: 100) Cebador inverso (para añadir a la cola de poliA):
GGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTttcttaCTTTTTCTTTTTTGCCTGGCCG (SEQ ID NO: 101)
Los solicitantes transfectaron células con el ARNm de Cas9, con ARN guía en forma de casetes de ADN o ARN para impulsar la expresión del ARN guía en células eucariotas.
Ejemplo 10: Mejora metodológica para reducir la toxicidad de Cas9: Uso de un promotor inducible
Los solicitantes activan de manera transitoria la expresión de Cas9 únicamente cuando se necesita para llevar a cabo la modificación genómica. Los ejemplos de sistemas inducibles incluyen promotores inducibles por tetraciclina (Tet-On o Tet-Off), sistemas activadores de la transcripción de doble híbrido que son moléculas de bajo peso molecular (FKBP, ABA, etc) o sistemas inducibles por la luz (Fitocromo, dominios LOV o criptocromo).
Ejemplo 11: Mejora del sistema Cas9 para una aplicación in vivo
Los solicitantes llevaron a cabo una búsqueda metagenómica para Cas9 con un peso molecular bajo. La mayoría de los homólogos de Cas9 son bastante grandes. Por ejemplo, la SpCas9 tiene una longitud de aproximadamente 1368 aa, que es demasiado grande para empaquetarse fácilmente en vectores víricos para el suministro. Se ha generado una representación gráfica de la distribución de la longitud de los homólogos de Cas9 a partir de secuencias depositadas en GenBank (Fig. 23). Algunas de las secuencias podrán haberse anotado erróneamente y, por lo tanto, la frecuencia exacta de cada longitud puede que no sea necesariamente exacta. No obstante, proporciona un atisbo de la distribución de las proteínas Cas9 y sugiere que existen homólogos de Cas9 más cortos.
Mediante análisis computacionales, los solicitantes observaron que en la cepa bacteriana Campylobacter, existen dos proteínas Cas9 con menos de 1000 aminoácidos. A continuación se presenta la secuencia para una Cas9 de Campylobacter jejuni. Con esta longitud, CjCas9 se puede empaquetar fácilmente en vectores de AAV, lentivirus, adenovirus y de otros virus para un suministro robusto en células primarias y modelos en animales in vivo. En una realización preferida de la divulgación, se utiliza la proteína Cas9 procedente de S. aureus.
>Cas9 de Campylobacter jejuni (CjCas9) MARILAFDIGISSIGWAFSENDELKDCGVRIFTKVENPKTGESLALPRRLARSARKRLARRKARLNHLKHLIANEFKLNYED YQSFDESLAKAYKGSLISPYELRFRALNELLSKQDFARVILHIAKRRGYDDIKNSDDKEKGAILKAIKQNEEKLANYQSVGE YLYKEYFQKFKENSKEFTNVRNKKESYERCIAQSFLKDELKLIFKKQREFGFSFSKKFEEEVLSVAFYKRALKDFSHLVGN CSFFTDEKRAPKNSPLAFMFVALTRIINLLNNLKNTEGILYTKDDLNALLNEVLKNGTLTYKQTKKLLGLSDDYEFKGEKGT YFIEFKKYKEFIKALGEHNLSQDDLNEIAKDITLIKDEIKLKKALAKYDLNQNQIDSLSKLEFKDHLNISFKALKLVTPLMLEGK KYDEACNELNLKVAINEDKKDFLPAFNETYYKDEVTNPVVLRAIKEYRKVLNALLKKYGKVHKINIELAREVGKNHSQRAKI EKEQNENYKAKKDAELECEKLGLKINSKNILKLRLFKEQKEFCAYSGEKIKISDLQDEKMLEIDHIYPYSRSFDDSYMNKVL VFTKQNQEKLNQTPFEAFGNDSAKWQKIEVLAKNLPTKKQKRILDKNYKDKEQKNFKDRNLNDTRYIARLVLNYTKDYLD FLPLSDDENTKLNDTQKGSKVHVEAKSGMLTSALRHTWGFSAKDRNNHLHHAIDAVIIAYANNSIVKAFSDFKKEQESNSA ELYAKKISELDYKNKRKFFEPFSGFRQKVLDKIDEIFVSKPERKKPSGALHEETFRKEEEFYQSYGGKEGVLKALELGKIRK VNGKIVKNGDMFRVDIFKHKKTNKFYAVPIYTMDFALKVLPNKAVARSKKGEIKDWILMDENYEFCFSLYKDSLILIQTKDM QEPEFVYYNAFTSSTVSLIVSKHDNKFETLSKNQKILFKNANEKEVIAKSIGIQNLKVFEKYIVSALGEVTKAEFRQREDFKK. (SEQ ID NO: 102)
El elemento ARNtracr putativo para esta CjCas9 es:
TATAATCTCATAAGAAATTTAAAAAGGGACTAAAATAAAGAGTTTGCGGGACTCTGCGGGGTTACAATCCCCTAAAAC CGCTTTTAAAATT (SEQ ID NO: 103)
La secuencia de la repetición directa es:
ATTTTACCATAAAGAAATTTAAAAAGGGACTAAAAC (SEQ ID NO: 104)
Un ejemplo de un ARNguía quimérico para CjCas9 es:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGUCCCGAAAGGGACUAAAAUAAAGAGUUUGCGGGACUCUGCGGGGUU ACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU (SEQ ID NO: 105)
Ejemplo 12: Optimización de Cas9
Para una función mejorada o para desarrollar nuevas funciones, los solicitantes generan proteínas de Cas9 quiméricas combinando fragmentos procedentes de homólogos de Cas9 diferentes. Por ejemplo, dos proteínas Cas9 quiméricas a modo de ejemplo:
Por ejemplo, los solicitantes fusionaron el extremo N de St1Cas9 (el fragmento de esta proteína está en negrita) con el extremo C de SpCas9 (el fragmento de esta proteína está subrayado).
>St1(N)Sp(C)Cas9 MSDLVLGLDIGIGSVGVGILNKVTGEIIHKNSRIFPAAQAENNLVRRTNRQGRRLARRKKHRRVRLNRLFEESGLITDFTK ISINLNPYQLRVKGLTDELSNEELFIALKNMVKHRGISYLDDASDDGNSSVGDYAQIVKENSKQLETKTPGQIQLERYQT YGQLRGDFTVEKDGKKHRLINVFPTSAYRSEALRILQTQQEFNPQITDEFINRYLEILTGKRKYYHGPGNEKSRTDYGRY RTSGETLDNIFGILIGKCTFYPDEFRAAKASYTAQEFNLLNDLNNLTVPTETKKLSKEQKNQIINYVKNEKAMGPAKLFK YIAKLLSCDVADIKGYRIDKSGKAEIHTFEAYRKMKTLETLDIEQMDRETLDKLAYVLTLNTEREGIQEALEHEFADGSFS QKQVDELVQFRKANSSIFGKGWHNFSVKLMMELIPELYETSEEQMTILTRLGKQKTTSSSNKTKYIDEKLLTEEIYNPVV AKSVRQAIKIVNAAIKEYGDFDNIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYL QNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQR KFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREI NNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKR PLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVA YSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKG NELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQ AENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD (SEQ ID NO: 106) >Sp(N)St1 (C)Cas9 MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYL QEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFR GHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGL TPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQD LTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQ IHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERM TNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFD SVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGW GRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTV KVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARETNEDDEKKAIQKIQKANKDEKDAAMLKAANQYNGKAELPHSVFHGHKQLATKIR LWHQQGERCLYTGKTISIHDLINNSNQFEVDHILPLSITFDDSLANKVLVYATANQEKGQRTPYQALDSMDDAWSFREL KAFVRESKTLSNKKKEYLLTEEDISKFDVRKKFIERNLVDTRYASRVVLNALQEHFRAHKIDTKVSVVRGQFTSQLRRH WGIEKTRDTYHHHAVDALIIAASSQLNLWKKQKNTLVSYSEDQLLDIETGELISDDEYKESVFKAPYQHFVDTLKSKEFE DSILFSYQVDSKFNRKISDATIYATRQAKVGKDKADETYVLGKIKDIYTQDGYDAFMKIYKKDKSKFLMYRHDPQTFEKVI EPILENYPNKQINEKGKEVPCNPFLKYKEEHGYIRKYSKKGNGPEIKSLKYYDSKLGNHIDITPKDSNNKVVLQSVSPWR ADVYFNKTTGKYEILGLKYADLQFEKGTGTYKISQEKYNDIKKKEGVDSDSEFKFTLYKNDLLLVKDTETKEQQLFRFLS RTMPKQKHYVELKPYDKQKFEGGEALIKVLGNVANSGQCKKGLGKSNISIYKVRTDVLGNQHIIKNEGDKPKLDF (SEQ ID NO: 107)
El beneficio de generar Cas9 quimérica incluye:
reducir la toxicidad
mejorar la expresión en células eucariotas
mejorar la especificidad
reducir el peso molecular de la proteína, generar proteínas con un peso molecular más bajo combinando los dominios más pequeños de diferentes homólogos de Cas9.
alterar el requisito de la secuencia PAM
Ejemplo 13: Utilización de Cas9 como una proteína de unión a ADN genérico
Los solicitantes utilizaron Cas9 como una proteína de unión a ADN genérico mutando los dos dominios catalíticos (D10 y H840) responsables de escindir ambas hebras del ADN diana. Con el fin de aumentar la transcripción génica en un locus diana, los solicitantes fusionaron un dominio de activación transcripcional (VP64) con Cas9. Los solicitantes hipotetizaron que sería importante observar una ubicación nuclear marcada de la proteína de fusión Cas9-VP64 debido a que la potencia de activación del factor de la transcripción está en función del tiempo empleado en la diana. Por lo tanto, los solicitantes clonaron un conjunto de constructos Cas9-VP64-GFP, transfectaron con ellos células 293 y evaluaron su ubicación con un microscopio fluorescente 12 horas después de la transfección.
Se clonaron los mismos constructos como 2A-GFP, en lugar de una fusión directa, para estudiar funcionalmente los constructos sin un GFP voluminoso presente que interfiriera. Los solicitantes eligieron como diana el locus Sox2 con el transactivador de Cas9 debido a que podría ser útil para la reprogramación celular y a que el locus ya había sido validado como una diana para la activación transcripcional mediada por TALE-TF. Para el locus Sox2, los solicitantes escogieron ocho dianas cerca del sitio de inicio transcripcional (TSS, por sus siglas en inglés). Cada diana tuvo una longitud de 20 pb con un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) NGG cercano. Cada constructo Cas9-VP64 se utilizó con cada ARN de crispr quimérico (ARNqui) generado por pCr para cotransfectar células 293. Se evaluó la activación transcripcional 72 horas después de la transfección utilizando RT-qPCR.
Para optimizar en mayor grado el activador transcripcional, los solicitantes titularon la relación de ARNqui (Sox2.1 y Sox2.5) respecto a Cas9 (NLS-VP64-NLS-hSpCas9-NLS-VP64-NLS), que se había utilizado para transfectar células 293 y lo cuantificaron utilizando RT-qPCR. Estos resultados indican que Cas9 se puede utilizar como un dominio de unión a ADN genéri
Los solicitantes diseñaron una segunda generación de constructos. (Siguiente tabla).
pLenti-EF1 a-GFP-2A-6xHis-NLS-VP64-NLS-hSpCsn1 (D10A, H840A)-NLS
pLenti-EF1 a-GFP-2A-6xHis-NLS-VP64-NLS-hSpCsn1 (D10A, H840A)
pLenti-EF1 a-GFP-2A-6xHis-NLS-VP64-NLS-NLS-hSpCsn1(D10A, H840A)
pLenti-EF1 a-GFP-2A-6xHis-NLS-hSpCsn1 (D10A, H840A)-NLS
pLenti-EF1a-GFP-2A-6xHis-NLS-hSpCsn1(D10A, H840A)
pLenti-EF1 a-GFP-2A-6xHis-NLS-NLS-hSpCsn1 (D10A, H840A)
Los solicitantes utilizan estos constructos para evaluar la activación transcripcional (constructos fusionados con VP64) y represión (únicamente Cas9) mediante RT-qPCR. Los solicitantes evalúan la ubicación celular de cada constructo utilizando un anticuerpo anti-His, la actividad nucleasa utilizando un ensayo con nucleasa Surveyor y la afinidad de unión al ADN utilizando un ensayo de desplazamiento en gel. En una realización preferida de la divulgación, el ensayo de desplazamiento en gel es un ensayo de desplazamiento en gel EMSA.
Ejemplo 14: Cas9 transgénica y ratones con inserción génica
Para generar un ratón que exprese la nucleasa Cas9 los solicitantes proponen dos estrategias generales, la transgénica y la inserción génica. Se podrán aplicar estas estrategias para generar cualquier otro organismo modelo de interés, p. ej., ratas. Para cada una de las estrategias generales, los solicitantes generaron Cas9 activa constitutivamente y Cas9 que se expresa condicionalmente (dependiente de la recombinasa Cre). La nucleasa Cas9 activa constitutivamente se expresa en el siguiente contexto: pCAG-NLS-Cas9-NLS-P2A-EGFP-WPRE-bGHpoliA. pCAG es el promotor, NLS es una señal de ubicación nuclear, P2A es la secuencia de escisión peptídica, EGFP es la proteína fluorescente verde potenciada, WPRE es el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de las marmotas y bGHpoliA es la secuencia señal poliA de la hormona del crecimiento bovino (Figs. 25A-B). La versión condicional tiene un elemento de tipo casete de parada adicional, loxP-SV40 poliA x3-loxP, tras el promotor y antes de NLS-Cas9-NLS (es decir, pCAG-loxP-SV40poliAx3-loxP-NLS-Cas9-NLS-P2A-EGFP-WPRE-bGHpoliA). Los elementos de expresión importantes se pueden visualizar tal como en la Fig. 26. El constructo constitutivo debería expresarse en todos los tipos celulares a lo largo del desarrollo, mientras que el constructo condicional únicamente permitirá la expresión de Cas9 cuando la misma célula esté expresando la Cre recombinasa. Esta última versión permitirá la expresión específica del tejido de Cas9 cuando Cre esté bajo la expresión de un promotor específico del tejido. Además, se podría inducir la expresión de Cas9 en ratones adultos colocando Cre bajo la expresión de un promotor inducible tal como el sistema Tet on u off. Validación de los constructos Cas9: Se validó funcionalmente cada plásmido de tres maneras: 1) transfección transitoria en células 293 y a continuación la confirmación de la expresión de GFP; 2) transfección transitoria en células 293 y a continuación técnicas inmunofluorescentes utilizando un anticuerpo que reconozca la secuencia P2A; y 3) transfección transitoria y a continuación un ensayo con nucleasa Surveyor. Las células 293 podrán ser células 293FT o 293 T dependiendo de las células que sean de interés. En una realización preferida, las células son células 293FT. Los resultados de Surveyor se sometieron a un ensayo en la fila superior e inferior del gel para determinar los constructos condicional y constitutivo, respectivamente. Cada uno se estudió en presencia y ausencia de ARN quimérico cuya diana era el locus hEMX1 (ARN quimérico hEMX1.1). Los resultados indican que el constructo puede dirigirse con éxito al locus hEMX1 únicamente en presencia de ARN quimérico (y Cre en el caso condicional). Se cuantificó el gel y se presentan los resultados como una eficacia de corte promedio y una desviación estándar para las tres muestras.
Ratón Cas9 transgénico: Para generar ratones transgénicos con los constructos, los solicitantes inyectan ADN lineal, puro en el pronúcleo de un zigoto de una hembra CB56 con un pseudoembarazo. Se identifican los fundadores, se genotipan y se retrocruzan en ratones CB57. Los constructos se clonaron con éxito y se verificaron mediante secuenciación Sanger.
Ratón con inserción génica Cas9: Para generar ratones con una inserción génica Cas9 los solicitantes dirigen los mismos constructos constitutivos y condicionales al locus Rosa26. Los solicitantes realizaron esto clonando cada uno en un vector dirigido a Rosa26 con los siguientes elementos: Brazo de homología corto Rosa26 - casete de expresión Cas9 constitutivo/condicional - brazo de homología largo pPGK-Neo-Rosa26 - pPGK-DTA. pPGk es el promotor para el marcador de selección positiva Neo, que confiere resistencia a neomicina, un brazo corto de 1 kb, un brazo largo de 4.3 kb y una toxina diftérica de selección negativa (DTA) impulsada por PGK.
Los dos constructos se introdujeron por electroporación en R1 mESC y se permitió que crecieran durante 2 días antes de que se llevara a cabo la selección con neomicina. Se recogieron las colonias individuales que habían sobrevivido los días 5-7 y se cultivaron en pocillos individuales. 5-7 días más tarde, se recolectaron las colonias, la mitad se congelaron y la otra mitad se utilizaron para el genotipado. Se realizó el genotipado mediante PCR genómica, donde un cebador se hibridó dentro del plásmido donante (AttpF) y el otro fuera del brazo de homología corto (Rosa26-R). De las 22 colonias recolectadas para el caso condicional, 7 fueron positivas (Izquierda). De las 27 colonias recolectadas para el caso constitutivo, cero fueron positivas (Derecha). Es probable que Cas9 cause algún nivel de toxicidad en las mESC y por esta razón no hubiera clones positivos. Para estudiar esto, los solicitantes introdujeron un plásmido de expresión Cre en células Cas9 condicionales donde la modificación dirigida se había realizado correctamente y observaron una toxicidad muy baja después de muchos días en cultivo. El número de copias de Cas9 reducido en las células Cas9 donde la modificación dirigida se había realizado correctamente (1-2 copias por célula) es suficiente para permitir la expresión estable y relativamente sin citotoxicidad. Además, estos datos indican que el número de copias de Cas9 determina la toxicidad. Tras la electroporación cada célula debería adquirir varias copias de Cas9 y es esta probablemente la razón por la que no se observaron colonias positivas en el caso del constructo de Cas9 constitutivo. Esto proporciona una evidencia sólida de que la utilización de una estrategia condicional, dependiente de Cre debería mostrar una toxicidad reducida. Los solicitantes inyectaron células donde la modificación dirigida se había realizado correctamente en un blastocisto y se implantó en un ratón hembra. Se identificaron los quiméricos y se retrocruzaron. Se identificaron los fundadores y se genotiparon.
Utilidad del ratón Cas9 condicional: los solicitantes han demostrado en células 293 que el constructo de expresión de Cas9 condicional se puede activar mediante la expresión conjunta con Cre. Los solicitantes han demostrado también que R1 mESC modificadas de manera dirigida correctamente pueden tener una Cas9 activa cuando se expresa Cre. Debido a que Cas9 está seguida por la secuencia de escisión peptídica de P2A y a continuación EGFP, los solicitantes identifican una expresión exitosa observando EGFP. Este mismo concepto es el que hace que el ratón Cas9 condicional sea tan útil. Los solicitantes podrán cruzar su ratón Cas9 condicional con un ratón que exprese ubicuamente Cre (línea ACTB-Cre) y podrán lograr un ratón que exprese Cas9 en cada célula. Solamente se debería necesitar el suministro de ARN quimérico para inducir la edición genómica en ratones embrionarios o adultos. De manera interesante, si el ratón Cas9 condicional se cruza con un ratón que expresa Cre controlado por un promotor específico del tejido, únicamente debería haber Cas9 en los tejidos que también expresen Cre. Esta estrategia se podrá utilizar para editar el genoma únicamente en tejidos concretos suministrando el ARN quimérico al mismo tejido.
Ejemplo 15: Diversidad de Cas9 y ARN quiméricos
El sistema CRISPR-Cas es un mecanismo inmunitario adaptativo contra ADN exógeno invasor empleado por varias especies de bacterias y arqueas. El sistema CRISPR-Cas9 de tipo II está constituido por un conjunto de genes que codifican proteínas causantes de la "adquisición" de ADN foráneo en el locus CRISPr , así como también por un conjunto de genes que codifican la "ejecución" del mecanismo de escisión del ADN; estos incluyen la ADN nucleasa (Cas9), un ARNcr transactivante no codificante (ARNtracr) y una matriz de espaciadores derivados del ADN foráneo flanqueados por repeticiones directas (ARNcr). Tras la maduración mediante Cas9, la estructura bicatenaria ARNtracr y ARNcr guía a la nucleasa Cas9 a una secuencia de ADN diana especificada por las secuencias guía espaciadoras y media en roturas bicatenarias en el ADN cerca de un motivo con una secuencia corta en el ADN diana que se requiere para la escisión y que es específica de cada sistema CRISPR-Cas. Los sistemas de CRISPR-Cas de tipo II se hallan repartidos en todo el reino bacteriano y son sumamente diversos en la secuencia y tamaño de la proteína Cas9, secuencia de repeticiones directas de ARNcr y ARNtracr, organización genómica de estos elementos y requisitos del motivo de la escisión diana. Una especie podrá tener múltiples sistemas CRISPR-Cas diferentes.
Los solicitantes evaluaron 207 Cas9s putativas procedentes de especies bacterianas identificadas en función de la homología secuencial con Cas9s conocidas y estructuras ortólogas a subdominios conocidos, incluidos el dominio de la endonucleasa HNH y los dominios de la endonucleasa RuvC [información procedente de Eugene Koonin y Kira Makarova]. Los análisis filogenéticos en función de la conservación de la secuencia proteica de este conjunto reveló cinco familias de Cas9s, incluidos tres grupos de Cas9s grandes (~1400 aminoácidos) y dos de Cas9s pequeñas (~1100 aminoácidos) (Figs. 19A-D y 20A-F).
Los solicitantes también han optimizado ARN guía de Cas9 utilizando métodos in vitro.
Ejemplo 16: Mutaciones de Cas9
En este ejemplo, los solicitantes han mostrado que las siguientes mutaciones pueden convertir SpCas9 en una enzima que practica un corte monocatenario: D10A, E762A, H840A, N854A, N863A, D986A.
Los solicitantes proporcionan secuencias que muestran donde se ubican los puntos de mutación dentro del gen de SpCas9 (Fig. 24A-M). Los solicitantes también muestran que las nickasas aún son capaces de mediar en la recombinación homóloga. Además, los solicitantes muestran que SpCas9 con estas mutaciones (individualmente) no induce la rotura bicatenaria.
Todos los ortólogos de Cas9 comparten la organización general de 3-4 dominios RuvC y un dominio HNH. El dominio RuvC más cercano al extremo 5' escinde la hebra no complementaria y el dominio HNH escinde la hebra complementaria. Todas las notaciones hacen referencia a la secuencia guía.
El residuo catalítico en el dominio RuvC 5' se identifica mediante comparación de la homología de la Cas9 de interés con otros ortólogos de Cas9 (del locus de CRISPR de tipo II de S. pyogenes, locus 1 de CRISPR de S. thermophilus, locus 3 de CRISPR de S. thermophilus y locus de CRISPR de tipo II de Franciscilla novicida) y el residuo de Asp conservado se muta en alanina para convertir Cas9 en una enzima que practica cortes monocatenarios en la hebra complementaria. De manera similar, los residuos de His y Asn conservados en los dominios HNH se mutan en alanina para convertir Cas9 en una enzima que practica cortes monocatenarios en la hebra no complementaria.
Ejemplo 17: Activación transcripcional de Cas9 y represor de Cas9
Activación transcripcional de Cas9
Se diseñó y estudió una segunda generación de constructos (Tabla 1). Estos constructos se utilizan para evaluar la activación transcripcional (constructos fusionados con VP64) y represión (únicamente Cas9) mediante RT-qPCR. Los solicitantes evalúan la ubicación celular de cada constructo utilizando un anticuerpo anti-His, la actividad nucleasa utilizando un ensayo con nucleasa Surveyor y la afinidad de unión al ADN utilizando un ensayo de desplazamiento en gel.
Represor Cas
Previamente se había mostrado que dCas9 se puede utilizar como un dominio de unión a ADN genérico para reprimir la expresión génica. Los solicitantes describen un diseño de dCas9 mejorado así como también fusiones de dCas9 a los dominios represores KRAB y SID4x. De la colección plasmídica creada para modular la transcripción utilizando Cas9 de la Tabla 1, se caracterizaron funcionalmente por qPCR los siguientes plásmidos represores: pXRP27, pXRP28, pXRP29, pXRP48, pXRP49, pXRP50, pXRP51, pXRP52, pXRP53, pXRP56, pXRP58, pXRP59, pXRP61 y pXRP62. Se realizó una cotransfección con cada plásmido represor dCas9 y dos ARN guía cuya diana era la hebra codificante del gen de la beta-catenina. Se aisló el ARN 72 horas después de la transfección y se cuantificó la expresión génica por RT-qPCR. El gen de control endógeno fue GAPDH. Se utilizaron dos ARNhc validados como controles positivos. Los controles negativos fueron ciertos plásmidos con los que se realizó una transfección sin ARNg, estos se denotan como "control pXRP##". Los plásmidos pXRP28, pXRP29, pXRP48, y pXRP49 pudieron reprimir el gen de la beta-catenina cuando se utilizó la estrategia de modificación dirigida especificada. Estos plásmidos corresponden a dCas9 sin un dominio funcional (pXRP28 y pXRP28) y dCas9 fusionado con SID4x (pXRP48 y pXRP49).
En un trabajo adicional se investiga: la repetición del experimento anterior, escoger como diana diferentes genes, utilizar otros ARNg para determinar la posición que se puede escoger como diana óptima y la represión múltiple.
Tabla 1
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Ejemplo 18: Deleción dirigida de genes que participan en la biosíntesis de colesterol, biosíntesis de ácidos grasos y otros trastornos metabólicos, genes que codifican proteínas plegadas erróneamente que participan en enfermedades amiloideas y de otro tipo, oncogenes que impulsan la transformación celular, genes víricos latentes y genes que conllevan trastornos negativos dominantes, entre otros trastornos.
Los solicitantes demuestran el suministro génico de un sistema CRISPR-Cas al tejido hepático, cerebral, ocular, epitelial, hematopoyético o de otro tipo de un sujeto o paciente que lo necesite, que padezca trastornos metabólicos, amiloidosis y enfermedades relacionadas con la agregación proteica, transformación celular consecuencia de mutaciones y traslocaciones genéticas, efectos negativos dominantes de mutaciones génicas, infecciones víricas latentes y otros síntomas relacionados que utilizan un sistema de suministro vírico o con nanopartículas.
Diseño del estudio: Los sujetos o pacientes que lo necesiten, que padezcan trastornos metabólicos, amiloidosis y enfermedades relacionadas con la agregación proteica que incluyen, sin carácter limitante, humanos, primates no humanos, cánidos, félidos, bóvidos, équidos y otros animales domésticos y mamíferos relacionados. El sistema CRISPR-Cas está guiado por un ARN guía quimérico y tiene como diana un sitio específico de los loci genómicos humanos que se van a escindir. Después de la escisión y de la reparación mediada por la unión de extremos no homólogos, una mutación con un desplazamiento en el marco de lectura da como resultado la inactivación génica. Los solicitantes seleccionan ARN guía que tienen como diana genes que participan en los trastornos mencionados anteriormente para que sean específicos respecto a los loci endógenos con una actividad fuera de la diana mínima. Se pueden codificar dos o más ARN guía en una única matriz CRISPR para inducir roturas bicatenarias simultáneas en el ADN que conlleve microdeleciones de los genes o regiones cromosómicas afectados.
Identificación y diseño de dianas génicas
Para cada gen ligado con una enfermedad candidato, los solicitantes seleccionan secuencias de ADN de interés que incluyen exones que codifican proteínas, secuencias que incluyen y flanquean sitios de mutación negativa dominante conocidos, secuencias que incluyen y flanquean secuencias repetitivas patológicas. Para las estrategias de inactivación génica, los exones codificantes tempranos más cercanos al codón de inicio ofrecen las mejores opciones para lograr una inactivación completa y minimizar la posibilidad de productos proteicos truncados que retengan una función parcial. Los solicitantes analizan las secuencias de interés para todas las secuencias posibles de 20 pb que puedan ser dianas adyacentes en 5' a un motivo NGG (para el sistema SpCas9) o NNAGAAW (para un sistema St1Cas9). Los solicitantes escogen secuencias para un reconocimiento de Cas9 guiado por ARN sencillo y singular en el genoma para minimizar los efectos fuera de la diana en función de un algoritmo computacional para determinar la especificidad.
Clonación de secuencias guía en un sistema de suministro
Se sintetizan secuencias guía como oligonucleótidos de 20-24 pb bicatenarios. Después de un tratamiento de fosforilación en 5' de oligos y de la hibridación para formar estructuras bicatenarias, se ligan los oligos en un vector adecuado dependiendo del método de suministro:
Métodos de suministro derivados de virus
Los vectores derivados de AAV (PX260, 330, 334, 335) se han descrito en otro punto
Los vectores derivados de lentivirus utilizan una estrategia de clonación similar que consiste en ligar directamente secuencias guía en un único vector que porta un esqueleto de ARN quimérico impulsado por un promotor U6 y una Cas9 o nickasa de Cas9 impulsada por un promotor EF1a.
La producción de virus se describe en otro punto.
Métodos de suministro de ARN con nanopartículas
1. Se sintetizan las secuencias guía como un oligonucleótido bicatenario que codifica un promotor T7-secuencia guía-ARN quimérico. Se añade un promotor T7 en 5' de Cas9 mediante un método de PCR.
2. Se transcriben in vitro ARN guía quiméricos y Cas9 impulsados por T7, y el ARNm de Cas9 se le añade adicionalmente la caperuza y una cola de A utilizando kits comerciales. Se purifican los productos de ARN siguiendo las instrucciones del kit.
Métodos de suministro hidrodinámicos en la vena de la cola (para ratones)
Se clonan las secuencias guía en plásmidos de AAV tal y como se ha descrito anteriormente y en otro punto de esta solicitud.
Validación in vitro en líneas celulares
Transfección
1. Transfección con ADN plasmídico
Se transfectan células renales embrionarias humanas (HEK293T) o células madre embrionarias humanas (hES), otros tipos celulares relevantes, con plásmidos que portan secuencias guía utilizando métodos basados en lípidos, principios químicos o electroporación. Para una transfección de 24 pocillos de células HEK293T (~260000 células), se realiza una transfección con un total de 500 ng de ADN en cada pocillo único utilizando Lipofectamina 2000. Para una transfección de 12 pocillos de células hES, se realiza una transfección con un total de 1 ug de ADN en un pocillo único utilizando Fugene HD.
2. Transfección con ARN
Se utiliza el ARN purificado descrito anteriormente para transfectar con él células HEK293T. Se podrá realizar una transfección con 1-2 ug de ARN de ~260000 utilizando Lipofectamina 2000 siguiendo las instrucciones del proveedor. El suministro de ARN de Cas9 y ARN quimérico se muestra en la Fig. 28.
Ensayo para determinar la formación de indel in vitro
Se recolectan las células 72 horas después de la transfección y se someten a un ensayo para determinar la formación de indel como una indicación de roturas bicatenarias.
Resumiendo, se amplifica por PCR la región genómica alrededor de la secuencia diana (tamaño del amplicón de ~400-600 pb) utilizando una polimerasa de fidelidad elevada. Se purifican los productos, se normalizan respecto a una concentración idéntica y se hibridan lentamente desde 95 °C hasta 4 °C para permitir la formación de ADN heterobicatenarios. Después de la hibridación, se utiliza la enzima Cel-I para escindir las estructuras heterobicatenarias y se separan los productos resultantes en un gel de poliacrilamida y se calcula la eficacia de indel.
Estudio demostrativo preliminar in vivo en animales
Mecanismos de suministro
La producción de AAV o Lentivirus se describe en otro punto.
Formulación con nanopartículas: se mezcla ARN con la formulación de nanopartículas
Las inyecciones hidrodinámicas en la vena de la cola con ADN plasmídico en ratones se realizan utilizando kits comerciales.
Cas9 y las secuencias guía se suministran como virus, una mezcla de ARN con nanopartículas recubiertas o ADN plasmídico y se inyecta en los animales de estudio. Se inyecta un conjunto paralelo de animales de control con solución salina estéril, Cas9 y GFP o una secuencia guía y GFP solo.
Tres semanas después de la inyección, se estudiaron los animales para determinar una mejora de los síntomas y se sacrificaron. Se analizaron los sistemas orgánicos relevantes para determinar la formación de indel. Los ensayos fenotípicos incluyen los niveles sanguíneos de HDL, LDL, lípidos.
Ensayo para determinar la formación de indel
Se extrajo el ADN del tejido utilizando kits comerciales; se realizará el ensayo indel tal como se ha descrito para la prueba in vitro.
Las aplicaciones terapéuticas del sistema CRISPR-Cas son capaces de lograr una deleción dirigida controlada temporalmente y específica del tejido de los genes ligados con una enfermedad candidatos. Los ejemplos incluyen genes que participan en el metabolismo del colesterol y ácidos grasos, enfermedades amiloideas, enfermedades negativas dominantes, infecciones víricas latentes entre otros trastornos.
Ejemplo 19: Integración dirigida de reparación para genes que portan mutaciones que provocan enfermedades; reconstitución de deficiencias enzimáticas y otras enfermedades relacionadas.
Diseño del estudio
I. Identificación y diseño de dianas génicas
• Descritas en el Ejemplo 22
II. Clonación de secuencias guía y moldes de reparación en un sistema de suministro
• Descritos en el Ejemplo 22
• Los solicitantes clonan moldes de reparación de ADN para incluir brazos de homología con un alelo asociado a una enfermedad así como también un molde de reparación no modificado
III. Validación in vitro en líneas celulares
a. La transfección se describe anteriormente en el Ejemplo 22; se contransfectan tipos celulares relevantes con Cas9, ARN guía y molde de reparación.
b. Ensayo para la reparación in vitro
i. Los solicitantes recolectan células 72 horas después de la transfección y las someten a un ensayo para determinar la reparación
ii. Resumiendo, los solicitantes amplifican regiones genómicas alrededor del molde de reparación con PCR utilizando una polimerasa de fidelidad elevada. Los solicitantes secuencian los productos para determinar una disminución de la incidencia del alelo mutante.
IV. Estudio demostrativo preliminar in vivo en animales
a. Los mecanismos de suministro se describen anteriormente en los Ejemplos 22 y 34.
b. Ensayo para la reparación in vivo
i. Los solicitantes realizan el ensayo de reparación tal como se describe en la prueba in vitro.
V. Aplicaciones terapéuticas
El sistema CRISPR-Cas es capaz de lograr una deleción dirigida controlada temporalmente y específica del tejido de los genes ligados con una enfermedad candidatos. Los ejemplos incluyen genes que participan en el metabolismo del colesterol y ácidos grasos, enfermedades amiloideas, enfermedades negativas dominantes, infecciones víricas latentes entre otros trastornos.
Ejemplo de una mutación de aminoácido único con un molde de reparación:
Enfermedad GEN ESPACIADOR PAM
Polineuropatía amiloide TTR AGCCTTT CT GAACACAT G CGG
familiar CA
Mecanismo Referencias
Reparación de V30M Transthyretin mutations in health and disease (Joao etal. Human
Mutation,
Volumen 5, Número 3, páginas 191-196, 1995)
Alelo V30M CCTGCCATCAATGTGGCCATGCATGTGTTCAGAAAGGCT
(SEQ ID NO: 120)
Alelo no modificado CCTGCCATCAATGTGGCCGTGCATGTGTTCAGAAAGGCT
(SEQ ID NO: 121)
Ejemplo 20: Aplicaciones terapéuticas del sistema CRISPR-Cas en glaucoma, amiloidosis y la enfermedad de Huntington.
Glaucoma: Los solicitantes diseñan ARN guía para que tengan como diana el primer exón del gen de la micilina (MYOC). Los solicitantes utilizan vectores adenovíricos (Ad5) para empaquetar Cas9 así como también un ARN guía cuya diana es el gen MYOC. Los solicitantes inyectan vectores adenovíricos en la red trabecular donde se han relacionado las células con la fisiopatología del glaucoma. Los solicitantes probaron inicialmente esto en modelos en ratones que portaban el gen MYOC mutado para observar si mejoraban la agudeza visual y disminuía la presión en los ojos. La aplicación terapéutica en seres humanos emplea una estrategia similar.
Amiloidosis: Los solicitantes diseñan ARN guía para que tengan como diana el primer exón del gen de la transtiretina (TTR) en el hígado. Los solicitantes utilizan AAV8 para empaquetar Cas9 así como también el ARN guía cuya diana es el primer exón del gen TTR. Se ha demostrado que AAV8 es eficaz para dirigirse al hígado y se administrará por vía intravenosa. Cas9 puede impulsarse utilizando promotores específicos del hígado tales como el promotor de la albúmina o utilizando un promotor constitutivo. Un promotor de pol3 impulsa el ARN guía.
Como alternativa, los solicitantes utilizan el suministro hidrodinámico de ADN plasmídico para inactivar el gen TTR. Los solicitantes suministran un plásmido que codifica Cas9 y el ARNguía cuya diana es el exón1 de TTR.
Como una estrategia alternativa adicional, los solicitantes administran una combinación de ARN (ARNm para Cas9 y ARN guía). El ARN se puede empaquetar utilizando liposomas tal como Invivofectamina de Life Technologies y se suministran por vía intravenosa. Para reducir la inmunogenicidad inducida por el ARN, incrementar el nivel de expresión de Cas9 y la estabilidad del ARN guía, los solicitantes modifican el ARNm de Cas9 utilizando la adición de la caperuza en 5'. Los solicitantes también incorporan nucleótidos de ARN modificados en ARNm de Cas9 y ARN guía para incrementar su estabilidad y reducir la inmunogenicidad (p. ej., activación de TLR). Para aumentar la eficacia, los solicitantes administran múltiples dosis del virus, ADN o ARN.
Enfermedad de Huntington: Los solicitantes diseñan ARN guía en función de mutaciones específicas del alelo en el gen HTT de los pacientes. Por ejemplo, en un paciente que es heterozigoto para HTT con una repetición CAG expandida, los solicitantes identifican secuencias de nucleótidos únicas respecto al alelo de HTT mutante y lo utilizan para diseñar ARNguía. Los solicitantes se cercioran de que la base mutada se ubica en los últimos 9 pb del ARN guía (que los solicitantes han verificado que tiene la capacidad de discriminar entre emparejamientos erróneos de una única base de ADN entre el tamaño diana y el ARN guía).
Los solicitantes empaquetan el ARN guía y Cas9 específicos del alelo HTT mutante en AAV9 y los suministran al cuerpo estriado de pacientes con la enfermedad de Huntington. Se inyecta el virus en el cuerpo estriado estereotácticamente mediante una craneotomía. Existe constancia de que AAV9 transduce neuronas eficazmente. Los solicitantes impulsan Cas9 utilizando un promotor específico de neuronas tal como la Sinapsina I humana.
Ejemplo 21: Aplicación terapéutica del sistema CRISPR-Cas en VIH
La infección vírica crónica es una fuente de morbimortalidad significativa. Aunque para muchos de estos virus existen terapias antivíricas convencionales que tienen como diana diversos aspectos de la replicación vírica y actúan eficazmente sobre ellos, las modalidades terapéuticas actuales son normalmente de naturaleza no curativa debido a la "latencia vírica". En virtud de esta naturaleza, la latencia vírica se caracteriza por una fase inactiva en el ciclo vital vírico sin una producción vírica activa. Durante este periodo, el virus es capaz en gran medida de evadir tanto la vigilancia inmunitaria como las opciones terapéuticas convencionales lo que le permite establecer reservas víricas de duración prolongada dentro del hospedador a partir de las cuales la reactivación posterior puede permitir la propagación continuada y transmisión del virus. La capacidad de mantener de manera estable el genoma vírico es crucial para la latencia vírica, lo que se logra mediante una latencia episómica o provírica, que almacena el genoma vírico en el citoplasma o lo integra en el genoma del hospedador, respectivamente. En ausencia de vacunaciones eficaces que prevendrían la infección primaria, las infecciones víricas crónicas caracterizadas por reservas latentes y episodios de actividad lítica pueden tener consecuencias significativas: el virus del papiloma humano (VPH) puede dar como resultado cáncer del cuello uterino, el virus de la hepatitis C (VHC) predispone al carcinoma hepatocelular y el virus de la inmunodeficiencia humana destruye en última instancia el sistema inmunitario del hospedador y da como resultado susceptibilidad a infecciones oportunistas. Así pues, estas infecciones requieren el uso de por vida de las opciones terapéuticas antivíricas disponibles en la actualidad. Una complicación adicional es la elevada mutabilidad de muchos de estos genomas víricos lo que conlleva el desarrollo de cepas resistentes para las que no existe una terapia eficaz. El sistema CRISPR-Cas es un sistema inmunitario adaptativo bacteriano capaz de inducir roturas bicatenarias (DSB) en el ADN de manera múltiple, específica de la secuencia y se ha reconstituido recientemente en sistemas celulares de mamíferos. Se ha demostrado que la utilización de uno o varios ARN guía que tienen como diana el ADN puede dar como resultado tanto indels como deleciones de los intrones, respectivamente. Así pues, esta nueva tecnología representa un medio por el cual la mutagénesis de ADN múltiple y dirigida se puede lograr dentro de una única célula con una eficacia y especificidad elevadas. En consecuencia, el suministro del sistema CRISPR-Cas dirigido contra secuencias de ADN vírico podría permitir la desorganización y deleción dirigidas de genomas víricos latentes incluso en ausencia de una producción vírica en marcha.
Como ejemplo, la infección crónica por VIH-1 representa un problema de salud global con 33 millones de individuos infectados y una incidencia anual de 2.6 millones de infecciones. La utilización de una terapia antirretrovírica, multimodal sumamente activa (HAART, por sus siglas en inglés), que tiene como diana simultáneamente múltiples aspectos de la replicación vírica, ha permitido que la infección por VIH se trate, en gran medida, como una enfermedad crónica, no terminal. Sin tratamiento, la evolución del VIH en SIDA tiene lugar normalmente en un plazo de 9-10 años, tiene como resultado la reducción del sistema inmunitario hospedador y la aparición de infecciones oportunistas que normalmente conducen a la muerte poco después. Debido a la latencia vírica, la interrupción de HAART conlleva invariablemente un rebrote vírico. Además, incluso interrupciones temporales en la terapia pueden seleccionar las cepas resistentes de VIH no controlables con los medios disponibles. Adicionalmente, los costes de la terapia HAART son importantes: en los EE. UU. $10000-150000 por persona y año. Así pues, las estrategias de tratamiento que tienen como diana directamente el genoma del VIH más que el proceso de la replicación vírica representan un medio mediante el cual la erradicación de las reservas latentes podría permitir una opción terapéutica curativa.
El desarrollo y suministro de un sistema CRISPR-Cas cuya diana es el VIH-1 representa una estrategia única diferenciable de los medios existentes de mutagénesis de ADN dirigida, es decir, ZFN y TALEN, con numerosas implicaciones terapéuticas. La desorganización y eliminación dirigidas del genoma del VIH-1 mediante indels y DSB mediadas por CRISPR junto con HAART podría permitir la prevención simultánea de una producción vírica activa así como también el agotamiento de reservas víricas latentes dentro del hospedador.
Una vez integrado en el sistema inmunitario del hospedador, el sistema CRISPR-Cas permite la generación de una subpoblación de VIH-1 resistente que, incluso en ausencia de una erradicación vírica completa, podría permitir el mantenimiento y reconstitución de la actividad inmunitaria del hospedador. Esto podría prevenir potencialmente la infección primaria al desorganizar el genoma vírico y evitar así la producción e integración vírica, y representaría un medio para la "vacunación". La naturaleza múltiple del sistema CRISPR-Cas permite tener como diana múltiples aspectos del genoma simultáneamente dentro de células individuales.
Como en HAART, la elusión por parte del virus mediante la mutagénesis se minimiza ya que hace necesaria la adquisición de múltiples mutaciones adaptativas a la vez. Se pueden tener como diana múltiples cepas de VIH-1 simultáneamente lo que minimiza la oportunidad de una superinfección y previene la creación posterior de nuevas cepas recombinantes. La especificidad de la secuencia mediada por nucleótidos, más que por proteínas, del sistema CRISPR-Cas permite la generación rápida de opciones terapéuticas sin que sea necesario alterar dramáticamente el mecanismo de suministro.
Con el fin de lograr esto, los solicitantes generan ARN guía para CRISPR-Cas que tengan como diana la inmensa mayoría del genoma del VIH-1 a la vez que se tienen en cuenta variantes de la cepa del VIH-1 para conseguir una eficacia y alcance máximos. Los análisis secuenciales de la conservación genómica entre subtipos y variantes de VIH-1 debería permitir tener como diana regiones conservadas flanqueantes del genoma con el objetivo de eliminar las secuencias víricas intrónicas o la inducción de mutaciones del desplazamiento del marco de lectura que alterarían las funciones génicas del virus.
Los solicitantes logran el suministro del sistema CRISPR-Cas mediante la infección convencional mediada por adenovirus o lentivirus del sistema inmunitario del hospedador. Dependiendo de la estrategia, las células inmunitarias del hospedador se podrían a) aislar, transducir con CRISPR-Cas, seleccionar y reintroducir en el hospedador o b) transducir in vivo mediante el suministro sistémico del sistema CRISPR-Cas. La primera estrategia permite la generación de una población inmunitaria resistente mientras que la segunda es más probable que actúe sobre reservas víricas latentes dentro del hospedador.
Ejemplos de espaciadores diana potenciales del VIH-1 adaptados de Mcintyre et al, que generan ARNhc contra VIH-1 optimizados para cubrir las máximas variantes de VIH-1.
CACTGCTTAAGCCTCGCTCGAGG (SEQ ID NO: 122)
TCACCAGCAATATTCGCTCGAGG (SEQ ID NO: 123)
CACCAGCAATATTCCGCTCGAGG (SEQ ID NO: 124)
TAGCAACAGACATACGCTCGAGG (SEQ ID NO: 125)
GGGCAGTAGTAATACGCTCGAGG (SEQ ID NO: 126)
CCAATTCCCATACATTATTGTAC (SEQ ID NO: 127)
Ejemplo 22: Corrección dirigida de deltaF508 u otras mutaciones en la fibrosis quística
Un aspecto de la divulgación proporciona una composición farmacéutica que podrá comprender una partícula para la terapia génica con CRISPR-Cas y un portador farmacéutico biocompatible. De acuerdo con otro aspecto, un método de terapia génica para el tratamiento de un sujeto que tiene una mutación en el gen CFTR comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una partícula para la terapia génica de CRISPR-Cas a las células de un sujeto. Este Ejemplo demuestra una transferencia génica o suministro génico de un sistema CRISPR-Cas en las vías respiratorias de un sujeto o un paciente que lo necesite, aquejado de fibrosis quística o de síntomas relacionados con la fibrosis quística utilizando partículas de un virus adenoasociado (AAV).
Diseño del estudio: Sujetos o pacientes que lo necesiten: Seres humanos, primates no humanos, cánidos, félidos, bóvidos, équidos y otros animales domésticos, relacionados. Este estudio somete a ensayo la eficacia de la transferencia génica de un sistema CRISPR-Cas mediante un vector AAV. Los solicitantes determinan los niveles transgénicos suficientes para la expresión génica y utilizan un sistema CRISPR-Cas que comprende una enzima Cas9 que tenga como diana deltaF508 u otras mutaciones inductoras de CFTR.
Los sujetos tratados recibieron una cantidad farmacéuticamente eficaz de un sistema vectorial de AAV aerosolizado por pulmón suministrado endobronquialmente mientras respiraban de manera espontánea. Los sujetos de control reciben una cantidad equivalente de un sistema vectorial de AAV pseudotipado con un gen de control interno. Se podrá suministrar el sistema vectorial junto con un portador farmacéutico biocompatible o farmacéuticamente aceptable. Tres semanas o un intervalo temporal apropiado después de la administración del vector, los sujetos tratados se estudian para determinar la mejora de los síntomas relacionados con la fibrosis quística.
Los solicitantes utilizan un adenovirus o una partícula de AAV.
Los solicitantes clonan los siguientes constructos génicos, cada uno ligado operablemente a una o más secuencias reguladoras (promotor Cbh o EF1a para Cas9, promotor U6 o H1 para ARN guía quimérico), en uno o más vectores de AAV o adenovirus o cualquier otro vector compatible: Un ARN guía quimérico cuya diana es CFTRdelta508 (Fig. 31B), un molde de reparación para la mutación deltaF508 (Fig. 31C) y una enzima Cas9 con codones optimizados opcionalmente con una o más señales o secuencias de ubicación nuclear (NLS), p. ej., dos (2) NLS.
Identificación del sitio diana de Cas9.
Los solicitantes analizaron el locus genómico CFTR humano e identificaron el sitio diana de Cas9 (Fig. 31A). (Las PAM podrán contener un motivo NGG o NNAGAAW).
Estrategia de reparación génica
Los solicitantes introducen un sistema vectorial de adenovirus/AAV que comprende Cas9 (o una nickasa Cas9) y el ARN guía junto con un sistema vectorial de adenovirus/AAV que comprende el molde de reparación por homología que contiene el residuo F508 en el sujeto mediante uno de los métodos de suministro discutidos anteriormente. El sistema CRISPR-Cas está guiado por un ARN guía quimérico de CFTRdelta 508 y tiene como diana un sitio específico del locus genómico de CFTR que se van a escindir o en los que se va a practicar un corte monocatenario. Después de la escisión, se inserta el molde de reparación en el sitio de escisión mediante recombinación homóloga y se corrige la deleción que da como resultado la fibrosis quística o causa síntomas relacionados con la fibrosis quística. Esta estrategia para dirigir el suministro y proporcionar una introducción sistémica de los sistemas CRISPR con los ARN guía apropiados se puede emplear para actuar sobre mutaciones genéticas para editar o manipular de otra manera genes que causan enfermedades y trastornos metabólicos, hepáticos, renales y proteicos tales como aquellos de la Tabla B. Ejemplo 23: Generación de una colección de células con inactivación génica
Este ejemplo muestra cómo generar una colección de células donde cada célula tiene un único gen inactivado:
Los solicitantes generan una colección de células ES donde cada célula tiene un único gen inactivado y la totalidad de la colección de células ES tendrá cada gen individual inactivado. Esta colección es útil para el cribado de la función génica en procesos celulares así como también en enfermedades.
Para generar esta colección celular, los solicitantes integran Cas9 impulsada por un promotor inducible (p. ej., promotor inducible por doxiciclina) en el interior de la célula ES. Además, los solicitantes integran un único ARN guía cuya diana es un gen específico de la célula ES. Para generar la colección de células ES, los solicitantes simplemente mezclan las células ES con una colección de genes que codifican ARN guía que tengan como diana cada gen del genoma humano. Los solicitantes introducen en primer lugar un único sitio BxB1 attB en el locus AAVS1 de la célula ES humana. A continuación los solicitantes utilizan la integrasa de BxB1 para facilitar la integración de los genes de ARN guía individuales en el sitio BxB1 attB en el locus AAVS1. Para facilitar la integración, cada gen de ARN guía está contenido en un plásmido que porta un único sitio attP. De esta manera, BxB1 recombinará el sitio attB en el genoma con el sitio attP en el plásmido que contiene el ARN guía.
Para generar la colección celular, los solicitantes toman la colección de células que tienen ARN guía únicos integrados e inducen la expresión de Cas9. Tras la inducción, Cas9 media la ruptura bicatenaria en los sitios especificados por el ARN guía. Para verificar la diversidad de esta colección celular, los solicitantes llevan a cabo la secuenciación exómica completa para asegurarse de que los solicitantes son capaces de observar mutaciones en cada sitio diana único. Esta colección celular se puede utilizar para varias aplicaciones, que incluyen un cribado basado en la colección completa, o se puede clasificar en clones celulares individuales para facilitar la generación rápida de líneas celulares clónales con genes humanos individuales inactivados.
Ejemplo 24: Modificación de microalgas utilizando Cas9
Métodos de suministro de Cas9
Método 1: Los solicitantes suministran Cas9 y un ARN guía utilizando un vector que exprese Cas9 controlado por un promotor constitutivo tal como Hsp70A-Rbc S2 o Beta2-tubulina.
Método 2: Los solicitantes suministran Cas9 y una polimerasa T7 utilizando vectores que expresen Cas9 y la polimerasa T7 controlados por un promotor constitutivo tal como Hsp70A-Rbc S2 o Beta2-tubulina. Los ARN guía se suministrarán utilizando un vector que contenga el promotor T7 que impulsa el ARN guía.
Método 3: Los solicitantes suministran ARNm de Cas9 y ARN guía transcrito in vitro a células de algas. El ARN se puede transcribir in vitro. El ARNm de Cas9 estará constituido por la región codificante de Cas9 así como también la UTR 3' de Cop1 para garantizar la estabilización del ARNm de Cas9.
Para la recombinación homóloga, los solicitantes proporcionan un molde de reparación dirigido por homología adicional. Secuencia para un casete que impulse la expresión de Cas9 controlada por el promotor de la beta-2 tubulina, seguida por la UTR 3' de Cop1.
TCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACAC CGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGT TTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACC ACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAAC CCGCAAACATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCGCCGAAGAAAAAGCGCAAGGTCGAAGCGTCCGACAA GAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCC CAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTC GACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCG GATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAG TCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTAC CACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTG ATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACA GCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAG CGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCT GCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAG CAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCT GGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGA CATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCAC CAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGA GCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCT GGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTT CGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTA CCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTG GCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAA GTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAG AAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGA CCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCA ACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTC CGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTC CTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGA TCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACA CCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATT TCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGA CATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGC CATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGA GAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAA GCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCA GAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCG GCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTG ACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTAC TGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGC CTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCA CAGAT CCTGGACTCCCGGAT GAACACT AAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCC TGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCAC GCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTC GTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACC GCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAA GCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGC GGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGT CTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCT TCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGA GTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGC CAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGC CGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAAC TTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGG AACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGC TAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATC CACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGT ACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCG ACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACAGCCCCAAGAAGAAGAGAAAGGTGGAGGCCAGCTAAGGATCCGGCAAGACTG GCCCCGCTTGGCAACGCAACAGTGAGCCCCTCCCTAGTGTGTTTGGGGATGTGACTATGTATTCGTGTGTTGGCCA ACGGGTCAACCCGAACAGATTGATACCCGCCTTGGCATTTCCTGTCAGAATGTAACGTCAGTTGATGGTACT (SEQ ID NO: 128)
Secuencia para un casete que impulse la expresión de la polimerasa T7 controlada por el promotor de la beta-2 tubulina, seguida por la UTR 3' de Cop1:
TCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACAC CGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGT TTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACC ACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAAC CCGCAAACatgcctaagaagaagaggaaggttaacacgattaacatcgctaagaacgacttctctgacatcgaactggctgctatcccgttcaacactctggctgac cattacggtgagcgtttagctcgcgaacagttggcccttgagcatgagtcttacgagatgggtgaagcacgcttccgcaagatgtttgagcgtcaacttaaagctggtgaggt tgcggataacgctgccgccaagcctctcatcactaccctactccctaagatgattgcacgcatcaacgactggtttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccg acagccttccagttcctgcaagaaatcaagccggaagccgtagcgtacatcaccattaagaccactctggcttgcctaaccagtgctgacaatacaaccgttcaggctgta gcaagcgcaatcggtcgggccattgaggacgaggctcgcttcggtcgtatccgtgaccttgaagctaagcacttcaagaaaaacgttgaggaacaactcaacaagcgc gtagggcacgtctacaagaaagcatttatgcaagttgtcgaggctgacatgctctctaagggtctactcggtggcgaggcgtggtcttcgtggcataaggaagactctattca tgtaggagtacgctgcatcgagatgctcattgagtcaaccggaatggttagcttacaccgccaaaatgctggcgtagtaggtcaagactctgagactatcgaactcgcacct gaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcgctggctggcatctctccgatgttccaaccttgcgtagttcctcctaagccgtggactggcattactggtggtggctatt gggctaacggtcgtcgtcctctggcgctggtgcgtactcacagtaagaaagcactgatgcgctacgaagacgtttacatgcctgaggtgtacaaagcgattaacattgcgc aaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcggtcgccaacgtaatcaccaagtggaagcattgtccggtcgaggacatccctgcgattgagcgtgaagaa ctcccgatgaaaccggaagacatcgacatgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaacgtgctgccgctgctgtgtaccgcaaggacaaggctcgcaagtctcgccgta tcagccttgagttcatgcttgagcaagccaataagtttgctaaccataaggccatctggttcccttacaacatggactggcgcggtcgtgtttacgctgtgtcaatgttcaaccc gcaaggtaacgatatgaccaaaggactgcttacgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaaggttactactggctgaaaatccacggtgcaaactgtgcgggtgtc gacaaggttccgttccctgagcgcatcaagttcattgaggaaaaccacgagaacatcatggcttgcgctaagtctccactggagaacacttggtgggctgagcaagattct ccgttctgcttccttgcgttctgctttgagtacgctggggtacagcaccacggcctgagctataactgctcccttccgctggcgtttgacgggtcttgctctggcatccagcacttct ccgcgatgctccgagatgaggtaggtggtcgcgcggttaacttgcttcctagtgaaaccgttcaggacatctacgggattgttgctaagaaagtcaacgagattctacaagc agacgcaatcaatgggaccgataacgaagtagttaccgtgaccgatgagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaatg gctggcttacggtgttactcgcagtgtgactaagcgttcagtcatgacgctggcttacgggtccaaagagttcggcttccgtcaacaagtgctggaagataccattcagccag ctattgattccggcaagggtctgatgttcactcagccgaatcaggctgctggatacatggctaagctgatttgggaatctgtgagcgtgacggtggtagctgcggttgaagca atgaactggcttaagtctgctgctaagctgctggctgctgaggtcaaagataagaagactggagagattcttcgcaagcgttgcgctgtgcattgggtaactcctgatggtttc cctgtgtggcaggaatacaagaagcctattcagacgcgcttgaacctgatgttcctcggtcagttccgcttacagcctaccattaacaccaacaaagatagcgagattgatg cacacaaacaggagtctggtatcgctcctaactttgtacacagccaagacggtagccaccttcgtaagactgtagtgtgggcacacgagaagtacggaatcgaatcttttg cactgattcacgactccttcggtacgattccggctgacgctgcgaacctgttcaaagcagtgcgcgaaactatggttgacacatatgagtcttgtgatgtactggctgatttcta cgaccagttcgctgaccagttgcacgagtctcaattggacaaaatgccagcacttccggctaaaggtaacttgaacctccgtgacatcttagagtcggacttcgcgttcgcgt aaGGATCCGGCAAGACTGGCCCCGCTTGGCAACGCAACAGTGAGCCCCTCCCTAGTGTGTTTGGGGATGTGACTAT GTATTCGTGTGTTGGCCAACGGGTCAACCCGAACAGATTGATACCCGCCTTGGCATTTCCTGTCAGAATGTAACGTC AGTTGATGGTACT (SEQ ID NO: 129)
Secuencia de ARN guía impulsada por el promotor T7 (promotor T7, Ns que representa la secuencia de direccionamiento):
qaaatTAATACGACTCACTATANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNqttttaqaqctaGAAAtaqcaaqttaaaataaqqctaqtccqttatcaactt gaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt (SEQ ID NO: 130)
Suministro de genes:
Se utilizarán para la electroporación las cepas CC-124 y CC-125 de Chlamydomonas reinhardtiidel Centro de Recursos de Chlamydomonas. El protocolo de electroporación sigue el protocolo estándar recomendado por el kit de modificación de Chlamydomonas de GeneArt.
Asimismo, los solicitantes generan una línea de Chlamydomonas reinhardtii que exprese Cas9 constitutivamente. Esto se puede realizar utilizando pChlamy1 (linealizada utilizando PvuI) y seleccionando las colonias resistentes a higromicina. A continuación se muestra la secuencia de pChlamy1 que contiene Cas9. De esta manera, para lograr genes inactivados únicamente se necesita suministrar el ARN para el ARNguía. Para la recombinación homóloga los solicitantes suministran ARNguía así como también un molde de recombinación homóloga linealizado.
pChlamy1-Cas9:
TGCGGTATTTCACACCGCATCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAAT ACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTT AAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCG ATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATC TGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCC GGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTA GAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCG TTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGC GGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCAC TGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAG AATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTT AAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGA TGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGA AGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTAT TGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCC GTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCG CTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGC AGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATAC CTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGTTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGAC GATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACG ACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGAC AGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCT TTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTA TGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGC GTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACC GAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGTCGCTGAGGCTTGACATGATTGGTGCGTATGTTTGTATGAAGCT ACAGGACTGATTTGGCGGGCTATGAGGGCGGGGGAAGCTCTGGAAGGGCCGCGATGGGGCGCGCGGCGTCCAG AAGGCGCCATACGGCCCGCTGGCGGCACCCATCCGGTATAAAAGCCCGCGACCCCGAACGGTGACCTCCACTTTC AGCGACAAACGAGCACTTATACATACGCGACTATTCTGCCGCTATACATAACCACTCAGCTAGCTTAAGATCCCATC AAGCTTGCATGCCGGGCGCGCCAGAAGGAGCGCAGCCAAACCAGGATGATGTTTGATGGGGTATTTGAGCACTTG CAACCCTTATCCGGAAGCCCCCTGGCCCACAAAGGCTAGGCGCCAATGCAAGCAGTTCGCATGCAGCCCCTGGAG CGGTGCCCTCCTGATAAACCGGCCAGGGGGCCTATGTTCTTTACTTTTTTACAAGAGAAGTCACTCAACATCTTAAA ATGGCCAGGTGAGTCGACGAGCAAGCCCGGCGGATCAGGCAGCGTGCTTGCAGATTTGACTTGCAACGCCCGCAT TGTGTCGACGAAGGCTTTTGGCTCCTCTGTCGCTGTCTCAAGCAGCATCTAACCCTGCGTCGCCGTTTCCATTTGCA GGAGATTCGAGGTACCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCGCCGAAGAAAAAGCGCAAGGTCGAAGCG TCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTAC AAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCC CTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGG AAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGAC TGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGG TGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCT GCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCC CGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATC AACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATC GCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAAC TTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGAC AACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTG CT GAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCT AT GATCAAGAGAT ACGACG AGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTT CGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAA 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GATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACAGCCCCAAGAAGAAGAGAAAGGTGGAGGCCAGCTAACATATGATTCG AATGTCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCA ACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGC GCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCA CTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTC ACAACCCGCAAACATGACACAAGAATCCCTGTTACTTCTCGACCGTATTGATTCGGATGATTCCTACGCGAGCCTGC GGAACGACCAGGAATTCTGGGAGGTGAGTCGACGAGCAAGCCCGGCGGATCAGGCAGCGTGCTTGCAGATTTGAC TTGCAACGCCCGCATTGTGTCGACGAAGGCTTTTGGCTCCTCTGTCGCTGTCTCAAGCAGCATCTAACCCTGCGTC GCCGTTTCCATTTGCAGCCGCTGGCCCGCCGAGCCCTGGAGGAGCTCGGGCTGCCGGTGCCGCCGGTGCTGCGG GTGCCCGGCGAGAGCACCAACCCCGTACTGGTCGGCGAGCCCGGCCCGGTGATCAAGCTGTTCGGCGAGCACTG GTGCGGTCCGGAGAGCCTCGCGTCGGAGTCGGAGGCGTACGCGGTCCTGGCGGACGCCCCGGTGCCGGTGCCC CGCCTCCTCGGCCGCGGCGAGCTGCGGCCCGGCACCGGAGCCTGGCCGTGGCCCTACCTGGTGATGAGCCGGAT GACCGGCACCACCTGGCGGTCCGCGATGGACGGCACGACCGACCGGAACGCGCTGCTCGCCCTGGCCCGCGAAC 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Para todas las células de Chlamydomonas reinhardtii modificadas, los solicitantes utilizan PCR, el ensayo con nucleasa SURVEYOR y la secuenciación de ADN para verificar el éxito en la modificación.
Ejemplo 25: Uso de Cas9 para actuar sobre varios tipos de enfermedad
Enfermedades en las que participan mutaciones en la secuencia que codifica la proteína:
Se podrá actuar sobre trastornos dominantes inactivando el alelo negativo dominante. Los solicitantes utilizan Cas9 para actuar sobre una única secuencia en el alelo negativo dominante e introducir una mutación mediante NHEJ. El indel inducido por NHEJ podrá ser capaz de introducir una mutación de desplazamiento del marco de lectura en el alelo negativo dominante y eliminar la proteína negativa dominante. Esto podría funcionar si el gen es haplosuficiente (p. ej., mutación de MYOC que induce glaucoma y la enfermedad de Huntington).
Se podrá actuar sobre trastornos recesivos reparando la mutación ligada a la enfermedad en ambos alelos. Para células en división, los solicitantes utilizan Cas9 para introducir roturas bicatenarias cerca del sitio de mutación e incrementan la tasa de recombinación homóloga utilizando un molde de recombinación exógeno. Para células en división, esto se podrá lograr utilizando una actividad nickasa múltiple para catalizar el reemplazo de la secuencia mutante en ambos alelos mediante la ligadura mediada por NHEJ de un fragmento de ADN exógeno que porta regiones protuberantes complementarias.
Los solicitantes también utilizan Cas9 para introducir mutaciones protectoras (p. ej., inactivación de CCR5 para prevenir la infección por VIH, inactivación de PCSK9 para reducir el colesterol o introducir la A673T en APP para reducir la probabilidad de la aparición de la enfermedad de Alzheimer).
Enfermedades en las que participan secuencias no codificantes
Los solicitantes utilizan Cas9 para alterar secuencias no codificantes en la región promotora, para alterar los sitios de unión del factor de transcripción y para alterar los elementos potenciadores o represores. Por ejemplo, se podrá utilizar Cas9 para extirpar el potenciador de Klf1 EHS1 en células madre hematopoyéticas para reducir los niveles de BLC11a y reactivar la expresión de gen de la globina fetal en eritrocitos diferenciados.
Los solicitantes también utilizan Cas9 para alterar motivos funcionales en las regiones no traducidas en 5' o 3'. Por ejemplo, para el tratamiento de la distrofia miotónica, se podrá utilizar Cas9 para eliminar expansiones de repeticiones de CTG en gen DMPK.
Ejemplo 26: Nickasa múltiple
Los aspectos de la optimización y la descripción de Cas9 detallada en esta solicitud también se podrán utilizar para generar nickasas Cas9. Los solicitantes utilizan nickasas Cas9 combinadas con pares de ARN guía para generar roturas bicatenarias de ADN con regiones protuberantes definidas. Cuando se utilizan dos parejas de ARN guía, es posible extirpar un fragmento de ADN intrónico. Si se escinde un fragmento de ADN exógeno mediante dos parejas de ARN guía para generar regiones protuberantes compatibles con el ADN genómico, entonces se podrá ligar el fragmento de ADN exógeno con el ADN genómico para reemplazar el fragmento que se ha extirpado. Por ejemplo, esto se podrá utilizar para eliminar la expansión por repeticiones de trinucleótidos en el gen huntintina (HTT) para tratar la enfermedad de Huntington.
Si se proporciona un ADN exógeno que porta un número menor de repeticiones de CAG, entonces será posible generar un fragmento de ADN que porte las mismas regiones protuberantes y se podrá ligar con el locus genómico de HTT y reemplazar el fragmento extirpado.
L o c u s H T T c o n
e l f r a g m e n to
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y d o s p a re ja s
d e A R N g u ía s
Fragmento de ADN exógeno
con menor número de
repeticiones de CAG y
también escindido por CQaCCCTaGAAA . . número reducido de repeticiones de CAG. . OCCCGOOGGCACCC
« T XCXXTC ¡CE i 'X'CTTT . . fm x x x x w ;
la nickasa de Cas9 y
dos parejas de ARN guías (SEQ ID NO: 132 a SEQ ID NO: 139)
La ligación del fragmento de ADN exógeno en el genoma no requiere la maquinaria de recombinación homologa y, por lo tanto, se podrá utilizar este método en células posmitóticas tales como neuronas.
Ejemplo 27: Suministro del sistema CRISPR
Se podrá suministrar Cas9 y su ARN guía quimérico, o combinación de ARNtracr y ARNcr, bien como ADN o como ARN. Se podrá utilizar el suministro de Cas9 y de ARN guía ambos como moléculas de ARN (normal o que contenga modificaciones de bases o de esqueleto) para reducir la cantidad de tiempo que la proteína Cas9 permanece en la célula. Esto podrá reducir el nivel de actividad de escisión fuera de la diana en la célula diana. Ya que el suministro de Cas9 como ARNm requiere tiempo para que sea traducido y de lugar a una proteína, podrá ser conveniente suministrar el ARN guía varias horas después del suministro del ARNm de Cas9, para maximizar el nivel de ARN guía disponible para la interacción con la proteína Cas9.
En situaciones en las que la cantidad de ARN guía es limitante, podrá ser deseable introducir Cas9 como ARNm y el ARN guía en forma de un casete de expresión de ADN con un promotor que impulse la expresión del ARN guía. De esta manera, se amplificará la cantidad de ARN guía disponible mediante la transcripción.
Se pueden utilizar varios sistemas de suministro para introducir Cas9 (ADN o ARN) y ARN guía (ADN o ARN) en la célula hospedadora. Estos incluyen la utilización de liposomas, vectores víricos, electroporación, nanopartículas, nanoalambres (Shalek et al., Nano Letters, 2012) y exosomas. Se podrán utilizar liposomas de tipo caballo de Troya moleculares (Pardridge et al., Cold Spring Harb Protoc; 2010; doi:10.1101/pdb.prot5407) para suministrar Cas9 y ARN guía a través de la barrera hematoencefálica.
Ejemplo 28: Estrategias terapéuticas para trastornos por repeticiones de trinucleótidos
Tal y como se ha mencionado previamente en la solicitud, el polinucleótido diana de un complejo CRISPR podrá incluir varios genes y polinucleótidos asociados a una enfermedad y algunos de estos genes asociados con una enfermedad podrán pertenecer a un conjunto de trastornos genéticos denominados trastornos por repeticiones de trinucleótidos (denominados también trastornos por expansión de repeticiones de trinucleótidos, trastornos por expansión de repeticiones de tripletes o trastornos por reiteración de codones).
Estas enfermedades están provocadas por mutaciones en las que las repeticiones de trinucleótidos de ciertos genes exceden el umbral normal y estable, que podrán diferir normalmente en un gen. El descubrimiento de más trastornos por expansión de repeticiones ha permitido la clasificación de estos trastornos en varias categorías en función de características similares subyacentes. La enfermedad de Huntington (HD) y las ataxias espinocerebelosas que están causadas por una expansión de repeticiones de CAG en porciones que codifican proteínas de genes específicos se incluyen en la Categoría I. Las enfermedades o trastornos por expansiones que tienden a convertirlos en fenotípicamente diversos y que incluyen expansiones tienen normalmente una magnitud pequeña, también se observan en exones de genes y se incluyen en la Categoría II. La Categoría III incluye trastornos o enfermedades que se caracterizan por expansiones de repeticiones mucho mayores que las de las Categorías I o II y se ubican normalmente fuera de las regiones que codifican proteínas. Los ejemplos de enfermedades o trastornos de la Categoría III incluyen, sin carácter limitante, el síndrome ligado al cromosoma X frágil, la distrofia miotónica, dos de las ataxias espinocerebelosas, la epilepsia mioclónica juvenil y la ataxia de Friedreich.
Se podrán adoptar estrategias terapéuticas similares, como la mencionada para la ataxia de Friedreich posteriormente, para abordar otras repeticiones de trinucleótidos o trastornos por expansiones también. Por ejemplo, otra enfermedad por repeticiones triples que se puede tratar utilizando una estrategia casi idéntica es la distrofia miotónica 1 (DM1), donde existe un motivo CTG expandido en la UTR de 3'. En la ataxia de Friedreich, la enfermedad es el resultado de la expansión de trinucleótidos de GAA en el primer intrón de la frataxina (FXN). Una estrategia terapéutica que utiliza CRISPR consiste en extirpar la repetición de GAA del primer intrón. Se cree que la repetición de GAA expandida afecta a la estructura de ADN y conlleva el reclutamiento y formación de heterocromatina que desactiva el gen de la frataxina (Fig. 32 A).
Ventaja competitiva respecto a otras estrategias terapéuticas se enuncian a continuación:
La atenuación génica de ARNip no es aplicable a este caso, ya que la enfermedad es debida a una expresión reducida de frataxina. Se está explorando en la actualidad la terapia génica vírica. Se utilizaron vectores derivados de HSV-1 para suministrar el gen de la frataxina en modelos en animales y han mostrado un efecto terapéutico. Sin embargo, la eficacia a largo plazo del suministro de frataxina con virus presenta varios problemas: En primer lugar, es difícil regular la expresión de frataxina para que coincida con los niveles naturales en individuos sanos y, en segundo lugar, la sobreexpresión a largo plazo de frataxina conlleva la muerte celular.
Se podrán utilizar nucleasas para extirpar la repetición de GAA con el fin de restaurar un genotipo sano, pero las estrategias con TALEN y la nucleasa con dedos de zinc requieren el suministro de dos parejas de nucleasas muy eficaces, lo que es difícil para ambos suministros así como también la manipulación de la nucleasa (la extirpación eficaz del ADN genómico por ZFN o TALEN es difícil de lograr).
A diferencia de las estrategias anteriores, el sistema CRISPR-Cas tiene ventajas claras. La enzima Cas9 es más eficaz y más flexible en lo que se refiere a la multiplicidad, queriéndose dar a entender con esto que se pueden fijar una o más dianas a la vez. Hasta la fecha, la extirpación eficaz por parte de Cas9 de ADN genómico > 30% en células humanas y podrá ser de hasta un 30%, y se podrá mejorar en el futuro. Además, en lo que respecta a ciertos trastornos por repeticiones de trinucleótidos como la enfermedad de Huntington (HD), se podrán abordar las repeticiones por trinucleótidos en la región codificante si existen diferencias entre los dos alelos. Específicamente, si un paciente de HD es heterocigoto para la HTT mutante y existen diferencias de nucleótidos tales como SNP entre los alelos de HTT no modificados y los mutantes, entonces se podrá utilizar Cas9 para que tenga como diana específicamente el alelo de HTT mutante. ZFN o las TALEN no tendrán la capacidad de distinguir entre dos alelos en función de diferencias de una única base.
Al adoptar una estrategia que utiliza la enzima CRISPR-Cas 9 para abordar la ataxia de Friedreich, los solicitantes diseñan varios ARN guía cuya diana son los sitios que flanquean la expansión de GAA y se escogen los más eficaces y específicos (Fig.32B).
Los solicitantes suministran una combinación de ARN guía cuya diana es el intrón 1 de FXN junto con Cas9 para mediar en la extirpación de la región de expansión de GAA. Se podrá utilizar AAV9 para mediar en el suministro eficaz de Cas9 y en la médula espinal.
Si el elemento Alu adyacente a la expansión GAA se considera importante, podrá haber restricciones respecto al número de sitios que se pueden escoger como diana pero los solicitantes podrán adoptar estrategias para evitar su alteración.
Estrategias alternativas:
Más que modificar el genoma utilizando Cas9, los solicitantes también podrán activar directamente el gen FXN utilizando un dominio de unión a ADN basado en Cas9 (deficiente en actividad nucleasa) para tener como diana un dominio de activación de la transcripción del gen FXN.
Ejemplo 29: Estrategias para minimizar la escisión fuera de la diana utilizando la nickasa Cas9
Tal y como se ha mencionado previamente en la solicitud, se podrá mutar Cas9 para mediar en la escisión monocatenaria mediante una o más de las siguientes mutaciones: D10A, E762A y H840A.
Para mediar en la inactivación génica mediante NHEJ, los solicitantes utilizan una versión nickasa de Cas9 junto con dos ARN guía. El corte monocatenario fuera de la diana por parte de cada ARN guía individual se podrá reparar principalmente sin mutación, las roturas bicatenarias (que pueden conllevar mutaciones mediante NHEJ) únicamente ocurren cuando los sitios diana están adyacentes entre sí. Debido a que las roturas bicatenarias introducidas al practicar un corte monocatenario doble no son romas, la coexpresión de enzimas que procesan los extremos tales como TREX1 incrementará el nivel de actividad NHEJ.
La siguiente lista de dianas en forma tabulada se refiere a genes que participan en las siguientes enfermedades:
Enfermedad de Lafora - diana GSY1 o PPP1R3C (PTG) para reducir el glucógeno en las neuronas.
Hipercolesterolemia - diana PCSK9
Las secuencias diana se enumeran en parejas (L y R) con diferentes números de nucleótidos en el espaciador (de 0 a 3 pb). También se podrá utilizar por sí mismo cada espaciador con la Cas9 no modificada para introducir una rotura bicatenaria en el locus diana.
GYS1 (humano) GGCC-L ACCCTTGTTAGCCACCTCCC 140 (SEQ ID NO:)
GGCC-R GAACGCAGTGCTCTTCGAAG 141
GGNCC-L CTCACGCCCTGCTCCGTGTA 142
GGNCC-R GGCGACAACTACTTCCTGGT 143
GGNNCC-L CTCACGCCCTGCTCCGTGTA 144
GGNNCC-R GGGCGACAACTACTTCCTGG 145
GGNNNCC-L CCTCTTCAGGGCCGGGGTGG 146
GGNNNCC-R GAGGACCCAGGTGGAACTGC 147
PCSK9 (humano) GGCC-L TCAGCTCCAGGCGGTCCTGG 148
GGCC-R AGCAGCAGCAGCAGTGGCAG 149
GGNCC-L TGGGCACCGTCAGCTCCAGG 150
GGNCC-R CAGCAGTGGCAGCGGCCACC 151
GGNNCC-L ACCTCTCCCCTGGCCCTCAT 152
GGNNCC-R CCAGGACCGCCTGGAGCTGA 153
GGNNNCC-L CCGTCAGCTCCAGGCGGTCC 154
GGNNNCC-R AGCAGCAGCAGCAGTGGCAG 155
PPP1R3C (PTG) (humano) GGCC-L ATGTGCCAAGCAAAGCCTCA 156
GGCC-R TTCGGTCATGCCCGTGGATG 157
GGNCC-L GTCGTTGAAATTCATCGTAC 158
GGNCC-R ACCACCTGTGAAGAGTTTCC 159
GGNNCC-L CGTCGTTGAAATTCATCGTA 160
GGNNCC-R ACCACCTGTGAAGAGTTTCC 161
Gys1 (de ratón) GGCC-L GAACGCAGTGCTTTTCGAGG 162
GGCC-R ACCCTTGTTGGCCACCTCCC 163
GGNCC-L GGTGACAACTACTATCTGGT 164
GGNCC-R CTCACACCCTGCTCCGTGTA 165
GGNNCC-L GGGTGACAACTACTATCTGG 166
GGNNCC-R CTCACACCCTGCTCCGTGTA 167
GGNNNCC-L CGAGAACGCAGTGCTTTTCG 168
GGNNNCC-R ACCCTTGTTGGCCACCTCCC 169
PPP1R3C (PTG) (de ratón) GGCC-L ATGAGCCAAGCAAATCCTCA 170
GGCC-R TTCCGTCATGCCCGTGGACA 171
GGNCC-L CTTCGTTGAAAACCATTGTA 172
GGNCC-R CCACCTCTGAAGAGTTTCCT 173
GGNNCC-L CTTCGTTGAAAACCATTGTA 174
GGNNCC-R ACCACCTCTGAAGAGTTTCC 175
GGNNNCC-L CTTCCACTCACTCTGCGATT 176
GGNNNCC-R ACCATGTCTCAGTGTCAAGC 177
PCSK9 (de ratón) GGCC-L GGCGGCAACAGCGGCAACAG 178
GGCC-R ACTGCTCTGCGTGGCTGCGG 179
GGNNCC-L CCGCAGCCACGCAGAGCAGT 180
GGNNCC-R GCACCTCTCCTCGCCCCGAT 181
Estrategias alternativas para mejorar la estabilidad del ARN guía e incrementar la especificidad.
1. Los nucleótidos en 5' del ARN guía se podrán unir mediante enlaces de tipo tioléster en lugar de mediante un enlace de tipo fosfoéster como en el ARN natural. El enlace de tipo tioléster podrá evitar que el ARN guía sea digerido por la maquinaria de degradación de ARN endógena.
2. Los nucleótidos en la secuencia guía (5' 20 pb) del ARN guía pueden utilizar ácidos nucleicos con puentes (BNA, por sus siglas en inglés) como la base para mejorar la especificidad de unión.
Ejemplo 30: CRISPR-Cas para una edición genómica rápida y múltiple
Los aspectos de la divulgación se refieren a protocolos y métodos mediante los cuales se podrá estudiar la eficacia y especificidad de la modificación génica en los 3-4 días posteriores al diseño de la diana y se podrán obtener líneas células clonales modificadas en 2-3 semanas.
Las nucleasas programables son una tecnología poderosa para mediar en la alteración genómica con una precisión elevada. Se puede utilizar la nucleasa Cas9 guiada por ARN del sistema inmunitario adaptativo CRISPR microbiano para facilitar una edición genómica eficaz en células eucariotas simplemente especificando una secuencia de direccionamiento de 20 nt en su ARN guía. Los solicitantes describen un conjunto de protocolos para aplicar Cas9 con el objetivo de facilitar una edición genómica eficaz en células de mamífero y generar líneas celulares para estudios funcionales posteriores. Comenzando con el diseño de la diana, se puede lograr una modificación génica eficaz y específica en 3-4 días, y se pueden obtener líneas celulares clonales modificadas en 2-3 semanas.
La capacidad de modificar organismos y sistemas biológicos encierra un potencial enorme para aplicaciones en la ciencia básica, medicina y biotecnología. Las endonucleasas específicas de secuencias programables que facilitan la edición precisa de loci genómicos endógenos permiten en la actualidad la investigación sistemática de elementos genéticos y variaciones genéticas causales en una amplia gama de especies, incluidas aquellas que previamente no han sido tratables genéticamente. Han aparecido varias tecnologías de edición genómica en los últimos años incluidas las nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activadoras de la transcripción (TALEN) y el sistema CRISPR-nucleasa Cas guiado por a Rn . Las dos primeras tecnologías utilizan una estrategia común de fijar dominios catalíticos de endonucleasa a proteínas de unión a ADN modulares para inducir roturas bicatenarias (DSB) de ADN diana en loci genómicos específicos. Por el contrario, Cas9 es una nucleasa guiada por ARN pequeños mediante emparejamientos de bases de tipo Watson-Crick con el ADN diana, que presenta un sistema que es fácil de diseñar, eficaz y muy adecuado para edición génica múltiple y ultrarrápida para varios organismos y tipos celulares. En la presente, los solicitantes describen un conjunto de protocolos para aplicar la nucleasa Cas9 desarrollada recientemente con el objetivo de facilitar una edición genómica eficaz en células de mamífero y generar líneas celulares para estudios funcionales posteriores.
Como las ZFN y TALEN, Cas9 promueve la edición genómica estimulando DSB en los loci genómicos diana. Tras la escisión por parte de Cas9, el locus diana entra en una de las dos rutas principales de reparación del daño del ADN, la ruta de unión de extremos no homólogos propensa a error (NHEJ) o la de reparación dirigida por homología sumamente fiel (HDR). Se podrán utilizar ambas rutas para lograr el resultado de edición deseado.
NHEJ: En ausencia de un molde de reparación, el proceso NHEJ liga de nuevo las DSB, lo que podrá dejar una cicatriz en forma de mutaciones indel. Se puede aprovechar este proceso para lograr inactivaciones genómicas, ya que los indels que ocurran dentro de un exón codificante podrán conllevar mutaciones de desplazamiento del marco de lectura y un codón de parada prematura. También se podrá hacer uso de múltiples DSB para que medien en deleciones más grandes en el genoma.
HDR: La reparación dirigida por la homología es una ruta de reparación de ADN importante alternativa a NHEJ. Aunque la HDR ocurre normalmente con frecuencias más bajas que la NHEJ, se podrá aprovechar para generar modificaciones definidas, precisas en un locus diana en presencia de un molde de reparación introducido de manera exógena. El molde de reparación podrá estar en forma de ADN bicatenario, diseñado de manera similar al ADN convencional cuya diana son constructos con brazos de homología que flanquean la secuencia de inserción, u oligonucleótidos de ADN monocatenarios (ODNmc). El último proporciona un método simple y eficaz para realizar ediciones pequeñas en el genoma tal como la introducción de mutaciones de nucleótidos únicos para explorar variaciones genéticas causales. A diferencia de la NHEJ, la HDR está activa por lo general únicamente en células en división y su eficacia varía dependiendo del tipo celular y el estado.
Información general sobre CRISPR: El sistema CRISPR-Cas, por el contrario, es como mínimo un sistema de dos componentes constituido por la nucleasa Cas9 y un ARN guía corto. La redirección de Cas9 a loci diferentes o la edición simultánea de genes múltiples requiere simplemente la clonación de un oligonucleótido de 20 pb diferente. Aunque la especificidad de la nucleasa Cas9 aún no se ha elucidado completamente, el emparejamiento de bases de tipo Watson-Crick simple del sistema CRISPR-Cas es probablemente más predecible que el de los dominios TALEN o ZFN.
El CRISPR-Cas de tipo II (repeticiones palindrómicas cortas espaciadas entre sí regularmente y agrupadas) es un sistema inmunitario adaptativo bacteriano que utiliza Cas9 para escindir elementos genéticos foráneos. Cas9 está guiada por una pareja de ARN no codificantes, un ARNcr variable y un ARNtracr auxiliar necesario. El ARNcr contiene una secuencia guía de 20 nt que determina la especificidad ubicando el ADN diana mediante emparejamiento de bases de tipo Watson-Crick. En el sistema bacteriano natural, se cotranscriben múltiples ARNcr para dirigir Cas9 contra diversas dianas. En el sistema CRISPR-Cas obtenido a partir de Streptococcus pyogenes, el ADN diana debe preceder inmediatamente a un motivo adyacente al protoespaciador 5’-NGG/NRG (PAM), que puede variar para otros sistemas CRISPR.
Se reconstituye CRISPR-Cas en células de mamífero mediante la expresión heteróloga de Cas9 optimizada para codones humanos y los componentes de ARN necesarios. Además, el ARNcr y el ARNtracr se pueden fusionar para crear un ARN guía sintético quimérico (ARNsg). Por lo tanto, se puede redirigir Cas9 hacia cualquier diana de interés alterando la secuencia guía de 20 nt dentro del ARNsg.
Dada su facilidad de implementación y su capacidad de multiplicidad, se ha utilizado Cas9 para generar células eucariotas modificadas que portan mutaciones específicas mediante NHEJ y HDR. Además, la inyección directa de ARNsg y ARNm que codifica Cas9 en embriones ha permitido la generación rápida de ratones transgénicos con múltiples alelos modificados; estos resultados suponen una promesa para la edición de organismos que de otra manera serían genéticamente intratables.
Se ha modificado una Cas9 mutante que porta una alteración en uno de sus dominios catalíticos para practicar un corte monocatenario en lugar de escindir ADN, lo que permite roturas monocatenarias y la reparación preferencial mediante HDR, lo que mejora potencialmente mutaciones indel no deseadas consecuencia de DSB fuera de la diana. Además, se ha adaptado un mutante Cas9 con ambos residuos catalíticos de escisión de ADN mutados para permitir la regulación transcripcional en E. coli, lo que demuestra el potencial de funcionalización de Cas9 para aplicaciones diversas. Ciertos aspectos se refieren a la construcción y aplicación de Cas9 para la edición múltiple de células humanas.
Los solicitantes han proporcionado una Cas9 flanqueada por una secuencia de ubicación nuclear, optimizada para codones humanos para facilitar la edición génica eucariota. Los solicitantes describen consideraciones para diseñar la secuencia guía de 20 nt, protocolos para la construcción rápida y la validación funcional de ARNsg y finalmente la utilización de la nucleasa Cas9 para mediar tanto en las modificaciones genómicas mediante NHEJ como HDR en líneas de células renales embrionarias humanas (HEK-293FT) y líneas de células madre humanas (HUES9). Este protocolo se puede aplicar igualmente a otros organismos y tipos celulares.
Selección de la diana para el ARNsg: Existen dos consideraciones principales en la selección de la secuencia guía de 20 nt para la modificación dirigida de genes: 1) la secuencia diana debería preceder al 5'NGG PAM para la Cas9 de S. pyogenes y 2) se deberían escoger las secuencias guía para minimizar la actividad fuera de la diana. Los solicitantes proporcionan una herramienta de diseño para dirigir Cas9 conectada a internet que toma una secuencia de interés inicial e identifica sitios diana adecuados. Para evaluar experimentalmente las modificaciones fuera de la diana para cada ARNsg, los solicitantes también proporcionan sitios fuera de la diana predichos computacionalmente para cada diana prevista, los clasifican de acuerdo con análisis de especificidad cuantitativos de los solicitantes teniendo en cuenta la identidad de los emparejamientos erróneos de las bases, posición y distribución.
La información detallada de los sitios fuera de la diana predichos computacionalmente es de la siguiente manera:
Consideraciones para las actividades de escisión fuera de la diana: De manera similar a otras nucleasas, Cas9 puede escindir fuera de la diana de los ADN diana en el genoma con frecuencias reducidas. El grado en el que una secuencia guía concreta exhibirá actividad fuera de la diana depende de una combinación de factores que incluyen la concentración enzimática, los parámetros termodinámicos de la secuencia guía específica empleada y la abundancia de secuencias similares en el genoma diana. Para la aplicación rutinaria de Cas9, es importante considerar maneras de minimizar el grado de escisión fuera de la diana y también ser capaces de detectar la presencia de escisión fuera de la diana.
Minimizar la actividad fuera de la diana: Para la aplicación en líneas celulares, los solicitantes recomiendan seguir dos pasos para reducir el grado de modificación genómica fuera de la diana. En primer lugar, utilizando la herramienta de selección de la diana de CRISPR con conexión a internet de los autores, es posible evaluar computacionalmente la probabilidad de que una secuencia guía concreta tenga sitios fuera de la diana. Estos estudios se realizan mediante una búsqueda exhaustiva en el genoma para detectar secuencias fuera de la diana que son secuencias similares a la secuencia diana. Una investigación experimental completa del efecto de las bases emparejadas erróneamente entre el ARNsg y su ADN diana reveló que la tolerancia de emparejamientos erróneos 1) depende de la posición - las 8-14 pb en el extremo 3' de la secuencia guía son menos tolerantes a los emparejamientos erróneos que las bases en 5', 2) depende de la cantidad - en general, no se toleran más de 3 emparejamientos erróneos, 3) depende de la secuencia guía - algunas secuencias guía son menos tolerantes a los emparejamientos erróneos que otras y 4) depende de la concentración - la escisión fuera de la diana es sumamente sensible a la cantidad de ADN transfectado. La herramienta vía web para el análisis de los sitios diana de los solicitantes (disponible en la página web genomeengineering.org/tools) integra estos criterios para proporcionar predicciones de sitios fuera de la diana probables en el genoma diana. En segundo lugar, los solicitantes recomiendan titular la cantidad del plásmido de expresión de ARNsg y Cas9 para minimizar la actividad fuera de la diana.
Detección de actividades fuera de la diana: Utilizando la herramienta vía web para dirigir CRISPR de los solicitantes, es posible generar una lista de los sitios fuera de la diana más probables así como también de cebadores que realizan análisis de secuenciación o SURVEYOR de esos sitios. Para los clones isogénicos generados utilizando Cas9, los solicitantes recomiendan vivamente secuenciar esos sitios candidatos fuera de la diana para comprobar la presencia de cualesquiera mutaciones no deseadas. Cabe señalar que podrán existir modificaciones fuera de la diana en sitios que no están incluidos en la lista de candidatos predicha y debería realizarse una secuenciación del genoma completo para corroborar fehacientemente la ausencia de sitios fuera de la diana. Además, en los ensayos múltiples donde se inducen varias DSB en el mismo genoma, podrá haber tasas de eventos de traslocación bajas y se pueden evaluar utilizando diversas técnicas tales como la secuenciación profunda.
La herramienta con conexión a internet proporciona las secuencias para todos los oligos y cebadores necesarios para 1) preparar los constructos de ARNsg, 2) someter a ensayo la eficacia de la modificación diana y 3) evaluar la escisión en los sitios fuera de la diana potenciales. Cabe destacar que debido a que el promotor de la ARN polimerasa III U6 utilizado para expresar el ARNsg prefiere un nucleótido de guanina (G) como la primera base de su transcrito, se añade una extra G en 5' del ARNsg donde la secuencia guía de 20 nt no comienza con G.
Estrategias para la construcción y suministro de ARNsg: Dependiendo de la aplicación deseada se podrán suministrar ARNsg como 1) amplicones de PCR que contengan un casete de expresión o 2) plásmidos que expresen ARNsg. El suministro de ARNsg basado en PCR une la secuencia de ARNsg personalizada al cebador de PCR inverso utilizado para amplificar un molde del promotor U6. El amplicón resultante se podrá utilizar para una cotransfección con un plásmido que contenga Cas9 (PX165). Este método es óptimo para un cribado rápido de múltiples ARNsg candidatos, ya que se pueden realizar transfecciones celulares para un estudio funcional unas pocas horas después de obtener los cebadores que codifican ARNsg. Debido a que este método simple obvia la necesidad de una clonación con plásmidos y la verificación de la secuencia, es muy adecuada para estudiar o para cotransfectar un gran número de ARNsg para generar grandes colecciones con inactivaciones génicas u otras aplicaciones sensibles a la escala. Nótese que los cebadores que codifican ARNsg tienen más de 100 pb, en comparación con los oligos de 20 pb requeridos para el suministro de ARNsg con plásmidos.
La construcción de un plásmido de expresión para ARNsg también es sencilla y rápida y conlleva un paso de clonación único con una pareja de oligonucleótidos parcialmente complementarios. Tras la hibridación de las parejas de oligos, las secuencias guías resultantes se podrán insertar en un plásmido que porte tanto Cas9 como un esqueleto invariante que porte el resto de la secuencia de ARNsg (PX330). Los plásmidos de transfección también se podrán modificar para permitir la producción de virus para el suministro in vivo.
Además de la PCR y los métodos de suministro con plásmidos, se puede introducir tanto Cas9 como ARNsg en las células como ARN.
Diseño de un molde de reparación: Tradicionalmente, las modificaciones dirigidas de ADN han requerido el uso de moldes de reparación del donante de tipo plásmidos que contengan brazos de homología que flanqueen el sitio de la alteración. La longitud de los brazos de homología de cada lado puede variar pero normalmente serán más largos de 500 pb. Se puede utilizar este método para generar modificaciones grandes, que incluyen la inserción de genes indicadores tales como proteínas fluorescentes o marcadores de resistencia a antibióticos. El diseño y construcción de plásmidos dirigidos se ha descrito en otro punto.
Más recientemente, se han utilizado oligonucleótidos de ADN monocatenarios (ODNmc) en lugar de plásmidos dirigidos para modificaciones cortas dentro de un locus definido sin clonación. Para lograr eficacias de HDR elevadas, los ODNmc contienen secuencias flanqueantes de al menos 40 pb en cada lado que son homólogas respecto a la región diana y se pueden orientar tanto en dirección sentido como antisentido respecto al locus diana.
Estudio funcional
Ensayo con nucleasa SURVEYOR: Los solicitantes detectaron mutaciones indel tanto mediante el ensayo con la nucleasa SURVEYOR como mediante la secuenciación con amplicones de PCR. La herramienta de diseño de la diana de CRISPR con conexión a internet de los solicitantes proporciona cebadores recomendados para ambas estrategias. Sin embargo, los cebadores de secuenciación o SURVEYOR también se podrán diseñar manualmente para amplificar la región de interés a partir del ADN genómico y evitar los amplicones no específicos utilizando Cebador-BLAST de NCBI. Los cebadores SURVEYOR deberían diseñarse para amplificar 300-400 pb (para un amplicón total de 600-800 pb) en cada lado de la diana de Cas9 para permitir una visualización clara de las bandas de escisión mediante electroforesis en gel. Para prevenir una formación excesiva del dímero del cebador, deberían diseñarse cebadores SURVEYOR que tengan normalmente una longitud por debajo de 25 nt con temperaturas de fusión de ~60°C. Los solicitantes recomiendan estudiar cada pareja de cebadores candidatos para detectar amplicones de PCR específicos así como también la ausencia de escisión no específica durante el proceso de digestión con la nucleasa SURVEYOR.
HDR mediada con plásmidos o con ODNmc: Se puede detectar HDR mediante amplificación por PCR y secuenciación de la región modificada. Los cebadores de PCR para este objetivo deberían hibridarse fuera de la región delimitada por los brazos de homología para evitar una detección falsa del molde de reparación residual (HDR Dir e Inv, Fig. 30). Para una HDR mediada por ODNmc, se pueden utilizar cebadores de PCR SURVEYOR.
Detección de indels o HDR por secuenciación: Los solicitantes detectaron las modificaciones diana en el genoma mediante la secuenciación de Sanger o secuenciación profunda de última generación (NGS, por sus siglas en inglés). Para la primera, se puede amplificar la región modificada a partir del ADN genómico utilizando cebadores SURVEYOR o HDR. Los amplicones se deben subclonar en un plásmido tal como pUC19 para la transformación; se pueden secuenciar las colonias individuales para revelar el genotipo clonal.
Los solicitantes diseñaron cebadores para la secuenciación de última generación (NGS) para amplicones más cortos, normalmente con un tamaño comprendido en el intervalo de 100-200 pb. Para detectar mutaciones NHEJ, es importante diseñar cebadores con al menos 10-20 pb entre las regiones de unión al cebador y el sitio diana de Cas9 para permitir la detección de los indels más largos. Los solicitantes proporcionan directrices para un método de PCR de dos pasos para unir adaptadores de código de barra a una secuenciación profunda múltiple. Los solicitantes recomiendan la plataforma Illumina debido a sus niveles de falsos positivos de indels generalmente bajos. Los análisis fuera de la diana (descritos previamente) se pueden realizar entonces mediante programas de alineación de lectura tales como ClustalW, Geneious o simples programas específicos de análisis de la secuencia.
Materiales y reactivos
Preparación de ARNsg:
Agua destilada exenta de DNasaRNasa UltraPure (Life Technologies, n.° de cat. 10977-023)
Polimerasa de fusión Herculase II (Agilent Technologies, n.° de cat. 600679)
CRUCIAL. La polimerasa Taq estándar, que carece de actividad correctora de errores exonucleasa 3'-5' tiene una fidelidad más baja y puede conllevar errores de amplificación. Herculase II es una polimerasa sumamente fiel (fidelidad equivalente a Pfu) que produce rendimientos elevados de producto de PCR con una optimización mínima. Se podrán sustituir por otras polimerasas sumamente fieles.
Tampón de reacción Herculase II (5x; Agilent Technologies, incluido con la polimerasa)
Solución de mezcla de dNTP (25 mM cada uno, Enzymatics, n.° de cat. N205L)
MgCl2 (25mM; ThermoScientific, n.° de cat. R0971)
Kit de extracción del gel QIAquick (Qiagen, n.° de cat. 28704)
Kit miniprep con centrifugación QIAprep (Qiagen, n.° de cat. 27106)
Tampón TBE UltraPure (10X; Life Technologies, n.° de cat. 15581-028)
Agarosa LE SeaKem (Lonza, n.° de cat. 50004)
Tinte para ADN seguro SYBR (10000x; Life Technologies, n.° de cat. S33102)
Conjunto de patrones de ADN Plus 1 kb (Life Technologies, n.° de cat. 10787-018)
Tampón de carga TrackIt Cian Naranja (Life Technologies, n.° de cat. 10482-028)
FastDigest BbsI (Bpil) (Fermentas/ThermoScientific, n.° de cat. FD1014)
Tampón Tango Fermentas (Fermentas/ThermoScientific, n.° de cat. BY5)
DL-ditiotreitol (DTT; Fermentas/ThermoScientific, n.° de cat. R0862)
ADN ligasa T7 (Enzymatics, n.° de cat. L602L)
Crucial: no sustituir la ligasa T4 utilizada más comúnmente. La ligasa T7 tiene una actividad más de 1000 veces superior en los extremos cohesivos que en los extremos romos y una actividad global superior que las ligasas T4 concentradas comercializadas.
Tampón de ligación rápido T72X (incluido con la ADN ligasa T7, Enzymatics, n.° de cat. L602L)
Polinucleótido cinasa T4 (New England Biolabs, n.° de cat. M0201S)
Tampón de reacción de la ADN ligasa T4 (10X; New England Biolabs, n.° de cat. B0202S)
Adenosina 5'-trifosfato (10 mM; New England Biolabs, n.° de cat. P0756S)
DNasa dependiente de ATP PlasmidSafe (Epicentre, n.° de cat. E3101K)
Escherichia coli (E. coli) químicamente competente One Shot Stbl3 (Life Technologies, n.° de cat. C7373-03) Medio SOC (New England Biolabs, n.° de cat. B9020S)
Medio LB (Sigma, n.° de cat. L3022)
Medio de agar LB (Sigma, n.° de cat. L2897)
Ampicilina, esterilizada por filtración (100 mg ml-1; Sigma, n.° de cat. A5354)
Cultivo de células de mamíferos:
Células HEK293FT (Life Technologies, n.° de cat. R700-07)
Medio Eagle mínimo de Dulbecco (DMEM, 1X, concentración de glucosa elevada; Life Technologies, n.° de cat. 10313­ 039)
Medio Eagle mínimo de Dulbecco (DMEM, 1X, concentración de glucosa elevada, sin rojo fenol; Life Technologies, n.° de cat. 31053-028)
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, 1X; Life Technologies, n.° de cat. 14190-250)
Suero bovino fetal, cualificado e inactivado térmicamente (Life Technologies, n.° de cat. 10438-034)
Medio con suero reducido Opti-MEM I (FBS; Life Technologies, n.° de cat. 11058-021)
Penicilina-estreptomicina (100x; Life Technologies, n.° de cat. 15140-163)
TrypLE™ Express (1X, sin rojo fenol; Life Technologies, n.° de cat. 12604-013)
Reactivo de transfección Lipofectamina 2000 (Life Technologies, n.° de cat. 11668027)
Kit S 4D-Nucleofector® X para líneas celulares Amaxa SF (32 RCT; Lonza, n.° de cat. V4XC-2032)
Línea celular HUES 9 (HARVARD STEM CELL SCIENCE)
Matriz de la membrana de base con poco factor de crecimiento y exenta de LDEV Geltrex (Life Technologies, n.° de cat. A1413201)
Medio mTeSR1 (Stemcell Technologies, n.° de cat. 05850)
Solución de separación celular Accutase (Stemcell Technologies, n.° de cat. 07920)
Inhibidor de ROCK (Y-27632; Millipore, n.° de cat. SCM075)
Kit S 4D-Nucleofector® X para células primarias Amaxa P3 (32 RCT; Lonza, n.° de cat. V4XP-3032)
Análisis del genotipado:
Solución de extracción de ADN QuickExtract (Epicentre, n.° de cat. QE09050)
Cebadores de PCR para secuenciación o análisis RFLP, SURVEYOR (remítase a la tabla de cebadores)
Polimerasa de fusión Herculase II (Agilent Technologies, n.° de cat. 600679)
CRUCIAL. Ya que el ensayo Surveyor es sensible a los emparejamientos erróneos de una única base, es particularmente importante utilizar una polimerasa sumamente fiel. Se podrán sustituir por otras polimerasas sumamente fieles.
Tampón de reacción Herculase II (5x; Agilent Technologies, incluido con la polimerasa)
Solución de mezcla de dNTP (25 mM cada uno, Enzymatics, n.° de cat. N205L)
Kit de extracción del gel QIAquick (Qiagen, n.° de cat. 28704)
Tampón Taq (10x; Genscript, n.° de cat. B0005)
Kit para la detección de mutaciones SURVEYOR para una electroforesis en gel estándar (Transgenomic, n.° de cat.
706025)
Tampón TBE UltraPure ( 10x; Life Technologies, n.° de cat. 15581-028)
Agarosa LE SeaKem (Lonza, n.° de cat. 50004)
Geles de TBE al 4-20% 1.0 mm, 15 pocillos (Life Technologies, n.° de cat. EC62255BOX)
Tampón para muestras TBE de densidad elevada Novex® (5X; Life Technologies, n.° de cat. LC6678)
Tinte para gel con ácido nucleico oro SYBR (10000x; Life Technologies, n.° de cat. S-11494)
Conjunto de patrones de ADN Plus 1 kb (Life Technologies, n.° de cat. 10787-018)
Tampón de carga TrackIt Cian Naranja (Life Technologies, n.° de cat. 10482-028)
FastDigest HindIII (Fermentas/ThermoScientific, n.° de cat. FD0504)
Equipo
Puntas de pipeta estériles con filtro (Corning)
Tubos de microcentrífuga estándar de 1.5 mL (Eppendorf, n.° de cat. 0030125.150)
Placas de PCR de 96 pocillos Axygen (VWR, n.° de cat. PCR-96M2-HSC)
Tubos de PCR tira con 8 unidades Axygen (Fischer Scientific, n.° de cat. 14-222-250)
Tubos Falcon, polipropileno, 15 mL (BD Falcon, n.° de cat. 352097)
Tubos Falcon, polipropileno, 50 mL (BD Falcon, n.° de cat. 352070)
Tubo de fondo redondo con tapón con filtro para células, 5 mL (BD Falcon, n.° de cat. 352235)
Placas Petri (60 mm x 15 mm; BD Biosciences, n.° de cat. 351007)
Placa para el cultivo tisular (24 pocillos; BD Falcon, n.° de cat. 353047)
Placa para el cultivo tisular (96 pocillos; fondo plano; BD Falcon, n.° de cat. 353075)
Placa para el cultivo tisular (100 mm; BD Falcon, 353003)
Termociclador de 96 pocillos con una funcionalidad de variación escalonada de la temperatura programable (Applied Biosystems Veriti, n.° de cat. 4375786).
Microcentrífugas Desktop 5424, 5804 (Eppendorf)
Sistema de electroforesis en gel (Fuente de alimentación básica PowerPac, Bio-Rad, n.° de cat. 164-5050 y bandeja para geles para sistemas Sub-Cell GT, Bio-Rad, n.° de cat. 170-4401)
Minicelda Novex XCell SureLock (Life Technologies, n.° de cat. EI0001)
Sistema de obtención de imágenes de gel digital (GelDoc EZ, Bio-Rad, n.° de cat. 170-8270 y bandeja para muestras azules Bio-Rad, n.° de cat. 170-8273)
Transiluminador de luz azul y gafas de filtro naranjas (Safelmager 2.0; Invitrogen, n.° de cat. G6600)
Software de cuantificación en gel (Bio-Rad, ImageLab, incluido con GelDoc EZ o ImageJ de acceso libre de los Institutos Nacionales de Salud, disponible en la página web rsbweb.nih.gov/ij/) para espectrofotómetro UV (NanoDrop 2000c, Thermo Scientific)
Preparación de reactivos
Solución para electroforesis Tris-borato EDTA (TBE). Diluir tampón TBE en agua destilada hasta conseguir una solución de trabajo 1X para conformar los geles de agarosa y para su uso como un tampón para la electroforesis en gel. El tampón se podrá almacenar a temperatura ambiente (18 - 22 °C) durante al menos 1 año.
• ATP, 10 mM. Dividir ATP 10 mM en alícuotas de 50-pL y almacenar a - 20 °C durante hasta 1 año; evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación.
• DTT, 10 mM. Preparar una solución de DTT 10 mM en agua destilada y almacenar en alícuotas de 20-pL a - 70 °C durante hasta 2 años; para cada reacción, utilizar una alícuota nueva, ya que el DTT se oxida fácilmente.
• Medio de cultivo D10. Para cultivar células HEK293FT, preparar medio de cultivo D10 suplementando DMEM con GlutaMAX 1X y un 10% (vol/vol) de suero bovino fetal. Tal y como se indica en el protocolo, este medio también se puede suplementar con penicilina-estreptomicina 1X. El medio D10 se puede preparar con antelación y almacenar a 4 °C durante hasta 1 mes.
• Medio de cultivo mTeSR1. Para cultivar células madre embrionarias humanas, preparar medio mTeSR1 suplementando el suplemento 5X (incluido con el medio basal mTeSR1) y 100 pg/mL de Normocina.
Procedimiento
Diseño de componentes de direccionamiento y utilización de la herramienta con conexión a internet • Tiempo 1 d 1| Secuencia de ADN genómico diana inicial. Los solicitantes proporcionan una herramienta de diseño para dirigir Cas9 con conexión a Internet que utiliza una secuencia de interés inicial, identifica y clasifica los sitios diana adecuados y predice computacionalmente los sitios fuera de la diana para cada diana prevista. Como alternativa, se puede seleccionar manualmente la secuencia guía identificando la secuencia de 20 pb que está adyacente en dirección 5' respecto a cualquier 5’-NGG.
2| Encargar los oligos y cebadores necesarios especificados por la herramienta con conexión a internet. Si el sitio se escoge manualmente, deberán designarse los oligos y cebadores.
Preparación del constructo de expresión del ARNsg
3| Para generar el constructo de expresión del ARNsg, se puede utilizar tanto el protocolo con plásmido o con PCR. (A) mediante amplificación por PCR • Tiempo 2 h
(i) Los solicitantes preparan un molde para la PCR U6 diluido. Los solicitantes recomiendan utilizar PX330 como molde para la PCR, pero asimismo se podrá utilizar cualquier plásmido que contenga U6 como molde para la PCR. Los solicitantes diluyeron el molde con ddH2Ü hasta una concentración de 10 ng/pL. Nótese que si se utiliza como molde un plásmido o casete que ya contiene un ARNsg impulsado por U6, será necesario realizar una extracción en gel para corroborar que el producto contiene únicamente el ARNsg deseado y no trazas del ARNsg remanente del molde.
(ii) Los solicitantes prepararon oligos para PCR diluidos. Se diluyen los cebadores U6-Dir y U6-ARNsg-Inv hasta una concentración final de 10 pM en ddH2 Ü (añadir 10 pL de cebador 100 pM a 90 pL de ddH2Ü).
(iii) Reacción de PCR con U6-ARNsg. Los solicitantes preparan la siguiente reacción para cada cebador U6-ARNsg-Cebador Inv y mezcla maestra según se necesite:
Componente: Cantidad (pL) Concentración final
Tampón para PCR Herculase II, 5X 10 1X
dNTP, 100mM (25mM cada uno) 0.5 1 mM
Molde U6 (PX330) 1 0.2 ng/pL
U6-Cebador dir 1 0.2 pM
U6-ARNsg-Cebador Inv (variable) 1 0.2 pM
Polimerasa de fusión Herculase II 0.5
Agua destilada 36
Total 50
(iv) Los solicitantes realizaron una reacción de PCR en las reacciones a partir del paso (iii) utilizando las siguientes condiciones para los ciclos:
Número de Desnaturalización Hibridación Extensión
ciclos
1 95 °C, 2 m
2-31 95 °C, 20 s 60 °C, 20 s 72 °C, 20 s
32 72 °C, 3 m
(v) Después de que la reacción se completara, los solicitantes analizaron en gel el producto para verificar una amplificación con una única banda exitosa. Se conforma un gel de agarosa al 2% (p/vol) en tampón TBE 1X con tinte seguro SYBR 1X. Se analizan en gel 5 pL del producto de la PCR a 15 V cm-1 durante 20-30 min. Los amplicones exitosos deberían generar un único producto de 370 pb y el molde debería ser invisible. No debería ser necesario realizar una extracción en gel con el amplicón de la PCR.
(vi) Los solicitantes purificaron el producto de PCR utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Eluir el ADN en 35 pL de Tampón EB o agua. Se podrán almacenar los productos de PCR purificados a 4 °C o -20 °C.
(B) Clonación de ARNsg en un vector de expresión bicistrónico que contiene Cas9 • Tiempo 3 d
(i) Preparar los insertos con oligos de ARNsg. Los solicitantes resuspendieron las bandas superior e inferior de oligos para cada diseño de ARNsg hasta una concentración final de 100 pM. Fosforilar e hibridar el oligo de la siguiente manera:
Oligo 1 (100 pM) 1 pL
Oligo 2 (100 pM) 1 pL
Tampón de ligación T4, 10X 1 pL
T4 PNK 1 pL
ddH2Q 6 pL
Total 10 pL
(ii) Hibridar en un termociclador utilizando los siguientes parámetros:
37 °C durante 30 m
95 °C durante 5 m
Descenso en rampa hasta 25 °C a 5 °C por m
(iii) Los solicitantes diluyeron oligos fosforilados e hibridados en un factor de 1:200 añadiendo 1 pL de oligo a 199 pL de ddH2O a temperatura ambiente.
(iv) Clonar el oligo de ARNsg en PX330. Los solicitantes prepararon una reacción Golden Gate para cada ARNsg. Los solicitantes también recomiendan preparar PX330 solo, sin inserto, como control negativo.
PX330 (100 ng) x pL
Oligo bicatenario diluido del paso (iii) 2 pL
Tampón Tango, 10X 2 pL
DTT, 10mM 1 pL
ATP, 10mM 1 pL
FastDigest BbsI 1 pL
Ligasa T7 0.5 gL
ddH2Q x uL
Total 20 uL
(v) Incubar la reacción Golden Gate durante 1 h en total:
Número de ciclos Condiciones
1-6 37 °C durante 5 m, 21 °C durante 5 m
(vi) Los solicitantes trataron la reacción Golden Gate con exonucleasa PlasmidSafe para digerir cualquier ADN linealizado residual. Este paso es opcional pero sumamente recomendable.
Reacción Golden Gate del paso 4 11 gL
Tampón PlasmidSafe 10X 1.5 gL
ATP, 10 mM 1.5 gL
Exonuclease PlasmidSafe 1 uL
Total 15 gL
(vii) Los solicitantes incubaron la reacción con PlasmidSafe a 37 °C durante 30 min, seguido por la inactivación a 70 °C durante 30 min. Punto de parada: después de la finalización, la reacción se podrá congelar y continuar más tarde. El ADN circular debería ser estable durante al menos 1 semana.
(viii) Transformación. Los solicitantes transformaron una cepa de E. coli competente con el plásmido tratado con PlasmidSafe, de acuerdo con el protocolo suministrado con las células. Los solicitantes recomiendan Stbl3 para una transformación rápida. Resumiendo, los solicitantes añadieron 5 gL del producto del paso (vii) a 20 gL de células Stbl3 químicamente competentes enfriadas con hielo. Esto se incuba a continuación en hielo durante 10 m, se somete a un choque térmico a 42 °C durante 30 s, se vuelve a colocar en hielo inmediatamente durante 2 m, se añaden 100 gL de medio SQC y esto se coloca en placas con LB que contiene 100 gg/mL de ampicilina y se incuba durante toda la noche a 37 °C.
(ix) Día 2: Los solicitantes inspeccionaron las placas para detectar crecimiento de colonias. Normalmente, no hay colonias en las placas de control negativo (únicamente ligación de PX330 digerido con Bbsl, sin oligo de ARNsg hibridado) y entre decenas y cientos de colonias en las placas de clonación de PX330-ARNsg.
(x) Los solicitantes recogieron 2-3 colonias de cada placa para comprobar la inserción correcta del ARNsg. Los solicitantes utilizaron una punta de pipeta estéril para inocular una única colonia en 3 mL de cultivo con medio LB con 100 gg/mL de ampicilina. Se incuba y agita a 37 °C durante toda la noche.
(xi) Día 3: Los solicitantes aislaron ADN plasmídico de los cultivos después de la noche utilizando el kit miniprep con centrifugación QiAprep de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
(xii) Validación de la secuencia del plásmido CRISPR. Los solicitantes verificaron la secuencia de cada colonia secuenciando a partir del promotor U6 utilizando el U6-Cebador Dir. Opcional: secuenciar el gen Cas9 utilizando los cebadores enumerados en la siguiente tabla de cebadores.
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Los solicitantes referenciaron los resultados de la secuenciación respecto a la secuencia del vector de clonación PX330 para comprobar que la secuencia guía de 20 pb se había insertado entre el promotor U6 y el resto del esqueleto del ARNsg. Se pueden consultar los detalles y la secuencia del mapa de PX330 en formato de mapa de vectores de GenBank (archivo *.gb) en la página web crispr.genome-engineering.org.
(Opcional) Diseño del molde de ODNmc • Tiempo 3d planificación por adelantado
3| Diseñar y encargar ODNmc. Se pueden adquirir directamente del proveedor tanto el ODNmc sentido como el antisentido. Los solicitantes recomiendan diseñar brazos de homología de al menos 40 pb en cada lado y de 90 pb para una eficacia de HDR óptima. Según la experiencia de los solicitantes, los oligos antisentido tienen unas eficacias de modificación ligeramente más elevadas.
4| Los solicitantes resuspendieron y diluyeron ultrámeros de ODNmc hasta una concentración final de 10 pM. No combinar o hibridar los ODNmc sentido y antisentido. Almacenar a -20 °C.
5| Nótese que para las aplicaciones de HDR, los solicitantes recomiendan clonar el ARNsg en el plásmido PX330.
Validación funcional de los ARNsg: cultivo celular y transfecciones • Tiempo 3-4 d
Se ha utilizado el sistema CRISPR-Cas en varias líneas celulares de mamíferos. Las condiciones podrán variar para cada línea celular. Los siguientes protocolos detallan las condiciones de transfección para células HEK239FT. Nótese que para las transfecciones HDR mediadas por ODNmc, se utiliza el kit Nucleofector para líneas celulares Amaxa SF para un suministro óptimo de ODNmc. Esto se describe en la siguiente sección.
7| Mantenimiento de HEK293FT. Se mantienen las células de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Resumiendo, los solicitantes cultivaron las células en medio D10 (GlutaMax DMEM suplementado con un 10% de suero bovino fetal) a 37 °C y un 5% de CO2.
8| Para realizar el pase, los solicitantes retiraron el medio y lavaron una vez añadiendo suavemente DPBS en el lateral del recipiente, de modo que no se desplazaran las células. Los solicitantes añadieron 2 mL de TrypLE a un matraz T75 y este se incubó durante 5 m a 37 °C. Se añadieron 10 mL de medio D10 caliente para inactivar y se transfirieron a un tubo Falcon de 50 mL. Los solicitantes disociaron las células separándolas suavemente y las volvieron a sembrar en matraces nuevos según fuera necesario. Los solicitantes normalmente realizaron pases de las células cada 2-3 d con una relación de división de 1:4 o 1:8 y nunca permitieron que las células alcanzaran más de un 70% de confluencia. Las líneas celulares se vuelven a iniciar tras alcanzar 15 números de pases.
9| Preparar las células para la transfección. Los solicitantes colocaron células bien disociadas en placas de 24 pocillos en medio D10 sin antibióticos 16-24 h antes de la transfección con una densidad de siembra de 1.3 x 105 células por pocillo y un volumen de siembra de 500 pL. Se aumentó o disminuyó la escala según el manual del fabricante según se necesitara. Se sugiere no colocar en las placas células por encima de la densidad recomendada ya que al hacerlo se podrá reducir la eficacia de la transfección.
101 En el día de la transfección, las células tienen un estado óptimo con un 70-90% de confluencia. Las células se podrán transfectar con Lipofectamina 2000 o el kit Nucleofector para líneas celulares Amaxa SF de acuerdo con los protocolos del fabricante.
(A) Para los ARNsg clonados en PX330, los solicitantes realizaron una transfección con 500 ng del plásmido CRISPR con secuencia verificada; cuando se utilizó más de un plásmido para la transfección, se mezcla con una relación equimolar y no más de 500 ng en total.
(B) Para ARNsg amplificado mediante PCR, los solicitantes mezclaron lo siguiente:
PX165 (únicamente Cas9) 200 ng
amplicón de ARNsg (cada uno) 40 ng
pllC19 rellenar hasta 500 ng de ADN total
Los solicitantes recomiendan transfectar en triplicados técnicos para una cuantificación fiable e incluir controles para la transfección (p. ej., plásmido GFP) para monitorizar la eficacia de la transfección. Además, se podrán realizar transfecciones con el plásmido de clonación PX330 y/o amplicón de ARNsg solos como un control negativo para ensayos funcionales posteriores.
111 Los solicitantes añadieron el complejo de Lipofectamina a las células suavemente ya que las células HEK293FT se pueden separar muy fácilmente de la placa y dar como resultado una eficacia de la transfección inferior.
12| Los solicitantes comprobaron las células 24 h después de la transfección para determinar la eficacia estimando la fracción de células fluorescentes en el control (p. ej., GFP) de la transfección utilizando un microscopio fluorescente. Normalmente, hay más de un 70% de células transfectadas.
131 Los solicitantes suplementaron el medio de cultivo con 500 pL más de medio D10 caliente. Añadir D10 muy lentamente al lateral del pocillo y no utilizar medio frío, ya que las células se pueden separar fácilmente.
14| Antes de la recolección para el análisis indel, se incuban las células durante 48-72 h en total después de la transfección. La eficacia indel no se incrementa de manera apreciable después de las 48 h.
(Opcional) Cotransfección de plásmidos CRISPR y ODNmc o plásmidos de direccionamiento para HR • Tiempo 3-4 d
15| Linealizar el plásmido de direccionamiento. Se linealiza el vector de direccionamiento si es posible cortando una vez en un sitio de restricción en el esqueleto del vector cerca de uno de los brazos de homología o en el extremo distal de cualquier brazo de homología.
16| Los solicitantes analizaron una pequeña cantidad del plásmido linealizado junto con plásmido no cortado en un gel de agarosa al 0.8-1% para comprobar el éxito de la linealización. El plásmido linealizado debería desplazarse en mayor grado que el plásmido superenrollado.
17| Los solicitantes purificaron el plásmido linealizado con el kit de purificación de PCR QIAQuick.
18| Preparar las células para la transfección. Los solicitantes cultivaron HEK293FT en matraces T75 o T225. Se prevé un recuento de células suficiente antes del día de la transfección. Para el formato de tira con cubetas Amaxa, se utilizan 2 x 106 células por transfección.
19| Preparar placas para la transfección. Los solicitantes añadieron 1 mL de medio D10 caliente en cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Las placas se colocan en el incubador para mantener el medio caliente.
20| Nucleofección. Los solicitantes transfectaron células HEK293FT de acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit Nucleofector 4D para líneas celulares Amaxa SF, adaptado en los siguientes pasos.
a. Para la cotransfección con ODNmc y CRISPR, premezclar el siguiente ADN en tubos para PCR:
plásmido pCRISPR (Cas9 ARNsg) 500 ng
molde de ODNmc (10 pM) 1 pL
b. Para la cotransfección con un plásmido dirigido para HDR y CRISPR, premezclar el siguiente ADN en tubos para PCR:
plásmido CRISPR (Cas9 ARNsg) 500 ng
Plásmido dirigido linealizado 500 ng
Para los controles de transfección, remítase a la sección previa. Además, los solicitantes recomiendan realizar una transfección con ODNmc o plásmido dirigido solo como un control negativo.
211 Disociar en células únicas. Los solicitantes eliminaron el medio y lavaron una vez suavemente con DPBS, teniendo cuidado de no desplazar las células. Se añadieron 2 mL de TrypLE a un matraz T75 y este se incubó durante 5 m a 37 °C. Se añadieron 10 mL de medio D10 caliente para inactivar y se separaron suavemente en un tubo Falcon de 50 mL. Se recomienda que las células se separen suavemente y se disocien en células únicas. Los agregados grandes reducirán la eficacia de la transfección. Los solicitantes toman una alícuota de 10 pL de la suspensión y la diluyeron con 90 pL de medio D10 para el recuento. Los solicitantes contaron las células y calcularon el número de células y volumen de suspensión necesarios para la transfección. Los solicitantes transfectaron normalmente 2 x 105 células por condición utilizando las tiras Nucleocuvette Amaxa y recomiendan realizar los cálculos para un 20% más de células de las requeridas con el fin de ajustar respecto a pérdidas de volumen en los pasos de pipeteo posteriores. El volumen necesario se transfiere a un tubo Falcon nuevo.
23| Los solicitantes sedimentaron por centrifugación el tubo nuevo a 200 x g durante 5 m.
Los solicitantes prepararon la solución de transfección mezclando la solución SF y el suplemento S1 tal como lo recomienda Amaxa. En el caso de las tiras con cubetas de Amaxa, se necesita un volumen total de 20 pL de solución SF suplementada por transfección. Igualmente, los solicitantes recomiendan realizar los cálculos para un 20% más de volumen del requerido.
25| Los solicitantes eliminaron el medio completamente de las células sedimentadas del paso 23 y las resuspendieron suavemente en un volumen apropiado (20 pL por 2 x 105 células) de solución SF suplementada con S1. No dejar las células en solución SF durante un periodo de tiempo prolongado.
26| Se pipetean 20 pL de células resuspendidas en cada premezcla de ADN del paso 20. Se pipetea suavemente para mezclar y se transfiere a la cámara con tiras Nucleocuvette. Esto se repite para cada condición de transfección.
Electroporar las células utilizando el programa Nucleofector 4D recomendado por Amaxa, CM-130.
28| Los solicitantes pipetearon suave y lentamente 100 pL de medio D10 caliente en cada cámara con tiras Nucleocuvette y transfirieron todo el volumen en una placa precalentada del paso 19. CRUCIAL. Las células son muy frágiles en esta etapa y un pipeteo vigoroso puede provocar la muerte celular. Incubar durante 24 h. En este punto, se puede estimar la eficacia de la transfección a partir de la fracción de células fluorescentes en un control de transfección positivo. La nucleofección normalmente conlleva eficacias de transfección superiores a un 70-80%. Los solicitantes añadieron lentamente 1 mL de medio D10 caliente a cada pocillo sin desplazar las células. Incubar las células durante 72 h en total.
Cultivo de células madre embrionarias humanas (HUES 9) y transfección • Tiempo 3-4 d
Mantenimiento de la línea hESC (HUES9). Los solicitantes mantienen la línea celular HUES9 de manera rutinaria en condiciones exentas de alimentadoras (feeders) con medio mTesR1. Los solicitantes prepararon medio mTeSR1 añadiendo el suplemento 5X incluido con el medio basal y 100 pg/mL de Normocina. Los solicitantes prepararon una alícuota de 10 mL de medio mTeSR1 suplementado adicionalmente con inhibidor de Rock 10 pM. Recubrimiento de la placa de cultivo tisular. Diluir GelTrex frío 1:100 en DMEM frío y recubrir la totalidad de la superficie de una placa de cultivo tisular de 100 mm.
Colocar la placa en un incubador durante al menos 30 m a 37 °C. Descongelar un vial de células a 37 °C en un tubo Falcon de 15 mL, añadir 5 mL de medio mTeSR1 y sedimentar a 200 x g durante 5 m. Retirar por aspiración el recubrimiento GelTrex y sembrar ~1 x 106 células con 10 mL de medio mTeSR1 que contiene inhibidor de Rock. Cambiar a medio mTeSR1 normal 24 h después de la transfección y realimentar diariamente. Pase de células. Realimentar las células con medio mTeSR1 fresco diariamente y realizar un pase antes de que alcancen un 70% de confluencia. Retirar por aspiración el medio mTeSR1 y lavar las células una vez con DPBS. Disociar las células añadiendo 2 mL de Accutase e incubar a 37 °C durante 3 - 5 m. Añadir 10 mL de medio mTeSR1 a las células separadas, transferir a un tubo Falcon de 15 mL y resuspender suavemente. Volver a colocar en placas recubiertas con GelTrex en medio mTeSR1 con inhibidor de Rock 10 pM. Cambiar a medio mTeSR1 normal 24 h después de la colocación en placas.
Transfección. Los solicitantes recomiendan cultivar las células durante al menos 1 semana después de la congelación antes de la transfección utilizando el kit 4-D Nucleofector para células primarias P3 Amaxa (Lonza). Realimentar las células en crecimiento en la fase logarítmica con medio fresco 2 h antes de la transfección. Disociar en células únicas o pequeñas agrupaciones de no más de 10 células con accutase y resuspensión suave. Contar el número de células necesarias para la nucleofección y sedimentar por centrifugación a 200 x g durante 5 m. Eliminar el medio completamente y resuspender en el volumen recomendado de solución de nucleofección P3 suplementada con S1. Colocar suavemente en placas recubiertas las células electroporadas en presencia del inhibidor de Rock 1X.
Comprobar el éxito de la transfección y realimentar diariamente con medio mTeSR1 regular comenzando 24 h después de la nucleofección. Normalmente, los solicitantes observan una eficacia de transfección superior a un 70% con la Nucleofección Amaxa. Recolectar el ADN. Disociar las células 48-72 h después de la transfección utilizando accutase e inactivar añadiendo 5 volúmenes de mTeSR1. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 m. Las células sedimentadas se pueden procesar directamente para la extracción de ADN con la solución QuickExtract. Se recomienda no disociar las células mecánicamente sin accutase. Se recomienda no sedimentar por centrifugación las células sin inactivar accutase o por encima de la velocidad recomendada; hacer esto podría provocar la lisis de las células.
Aislamiento de líneas celulares clonales mediante FACS. Tiempo • 2-3 h de trabajo; 2-3 semanas de expansión Se podrá realizar un aislamiento clonal 24 h después de la transfección mediante FACS o dilución en serie.
54| Preparar el tampón FACS. Las células que no necesitan separación utilizando un fluorescente coloreado se podrán separar en medio D10 regular suplementado con penicilina/estreptomicina 1X. Si también se requiere separación mediante un fluorescente coloreado, se sustituye un DPBS o DMEM exento de fenol por DMEM normal. Suplementar con penicilina/estreptomicina 1X y filtrar a través de un filtro Steriflip de .22 pm.
55| Preparar placas de 96 pocilios. Los solicitantes añadieron 100 pL de medio D10 suplementado con penicilina/estreptomicina 1X por pocillo y se preparó el número de placas según se necesitaron para el número deseado de clones.
56| Preparar las células para FACS. Los solicitantes disociaron las células aspirando el medio completamente y añadiendo 100 pL de TrypLE por pocillo en una placa de 24 pocillos. Incubar durante 5 m y añadir 400 pL de medio D10 caliente.
57| Se transfieren las células resuspendidas a un tubo Falcon de 15 mL y se separaron suavemente 20 veces. Se recomienda una comprobación con un microscopio para garantizar la disociación en células únicas.
58| Sedimentar las células por centrifugación a 200 x g durante 5 minutos.
591 Los solicitantes aspiraron el medio y resuspendieron las células en 200 pL de medio FACS.
601 Se filtran las células a través de un filtro con una retícula de 35 pm y se pasaron al interior de tubos FACS marcados. Los solicitantes recomiendan utilizar el tubo Falcon BD de 12 x 75 mm con un tapón con filtro para células.
Colocar las células en hielo hasta la separación.
611 Los solicitantes separaron células únicas en placas de 96 pocillos preparadas en el paso 55. Los solicitantes recomiendan que en cada placa se designe un único pocillo donde se separen 100 células como control positivo.
NOTA. El resto de las células se podrán guardar y utilizarlas para el genotipado en el nivel de la población para calibrar la eficacia de la modificación global.
62| Los solicitantes devolvieron las células al incubador y permitieron que se expandieran durante 2-3 semanas. 5 días después de la separación se añadieron 100 pL de medio D10 caliente. Cambiar 100 pL de medio cada 3-5 días según sea necesario.
631 Se inspeccionan las colonias para determinar la aparición "clonal" 1 semana después de la separación: colonias redondeadas que se extienden desde un punto central. Marcar los pocillos que están vacíos o que se puedan haber sembrado con dobletes o multipletes.
64| Cuando las células son confluentes en más de un 60%, los solicitantes prepararon un conjunto de placas replicadas para el pase. Se añaden 100 pL de medio D10 en cada pocillo de las placas replicadas. Los solicitantes disocian las células directamente pipeteando arriba y abajo vigorosamente 20 veces. Se coloca un 20% del volumen resuspendido en las placas replicadas preparadas para mantener las líneas clonales. Cambiar el medio cada 2-3 d después de ese momento y realizar pases en consecuencia.
65| Utilizar el resto del 80% de las células para el aislamiento del ADN y el genotipado.
Opcional: Aislamiento de líneas celulares clónales mediante dilución. Tiempo • 2-3 h de trabajo; 2-3 semanas de expansión
66| Los solicitantes disociaron células de placas de 24 pocillos tal y como se ha descrito anteriormente. Comprobar que se disocian en células únicas. Se puede utilizar un filtro para células para prevenir el agrupamiento de células.
67| Se cuenta el número de células en cada condición. Diluir en serie cada condición en medio D10 hasta alcanzar una concentración final de 0.5 células por 100 pL. Para cada placa de 96 pocillos, los solicitantes recomiendan diluir hasta un recuento final de 60 células en 12 mL de D10. Se recomienda un recuento del número de células preciso para una dilución clonal apropiada. Se podrán volver a contar las células en una etapa de dilución en serie intermedia para garantizar la exactitud.
68| Se utilizó una pipeta multicanal para pipetear 100 pL de células diluidas en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. NOTA. El resto de las células se podrán guardar y utilizarlas para el genotipado en el nivel de la población para calibrar la eficacia de la modificación global.
691 Los solicitantes inspeccionaron las colonias para determinar la aparición "clonal" ~1 semana después de la colocación en placas: colonias redondeadas que se extienden desde un punto central. Marcar los pocillos que se puedan haber sembrado con dobletes o multipletes.
701 Los solicitantes devolvieron las células al incubador y permitieron que se expandieran durante 2-3 semanas. Se realimentan las células según sea necesario tal y como se detalla en la sección anterior.
Ensayo SURVEYOR para determinar la eficacia de escisión CRISPR. Tiempo • 5-6 h
Antes de someter a ensayo la eficacia de escisión de las células transfectadas, los solicitantes recomiendan estudiar cada cebador SURVEYOR nuevo en muestras de control negativo (no transfectadas) mediante el paso de la digestión con la nucleasa SURVEYOR utilizando el protocolo que se describe posteriormente. Ocasionalmente, incluso los productos de PCR SURVEYOR con una única banda limpia pueden generar bandas de escisión de la nucleasa SURVEYOR no específicas e interferir potencialmente con análisis de indel exactos.
711 Recolectar células para el ADN. Disociar las células y sedimentarlas por centrifugación a 200 x g durante 5 m. NOTA. Replicar las placas en esta etapa según sea necesario para mantener las líneas celulares transfectadas.
72| Aspirar el sobrenadante completamente.
731 Los solicitantes utilizaron la solución de extracción de ADN QuickExtract de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los solicitantes utilizaron normalmente 50 pL de la solución para cada pocillo de una placa de 24 pocillos y 10 pL para una placa de 96 pocillos.
74| Los solicitantes normalizaron el ADN extraído respecto a una concentración final de 100-200 ng/pL con ddhbO.
Punto de parada: El ADN extraído se podrá almacenar a -20 °C durante varios meses.
75| Preparar la PCR SURVEYOR. Preparar una mezcla maestra con los siguientes componentes utilizando cebadores SURVEYOR proporcionados mediante la herramienta algorítmica con conexión a internet/computacional de los solicitantes:
Componente: Cantidad (pL) Concentración final
Tampón para PCR Herculase II, 5X 10 1X
dNTP, 100mM (25mM cada uno) 1 1 mM
Cebador Dir SURVEYOR (10 pM) 1 0,2 uM
Cebador Inv SURVEYOR (10 pM) 1 0,2 uM
Polimerasa de fusión Herculase II 1
MgCl2 (25 mM) 2 1 mM
Agua destilada 33
Total 49 (para cada reacción)
76| Los solicitantes añadieron 100-200 ng de molde de ADN genómico normalizado del paso 74 en cada reacción. 77| Se realizó la reacción de PCR utilizando las siguientes condiciones para los ciclos, durante no más de 30 ciclos de amplificación:
Número de Desnaturalización Hibridación Extensión
ciclos
1 95°C, 2 min
2-31 95°C, 20 s 60°C, 20 s 72°C, 30 s
32 72°C, 3 min
78| Los solicitantes analizaron 2-5 pL del producto de PCR en un gel al 1% para comprobar que hubiera un producto con una única banda. Aunque estas condiciones de PCR están diseñadas para funcionar con la mayoría de las parejas de cebadores SURVEYOR, algunos cebadores podrán necesitar una optimización adicional mediante el ajuste de la concentración del molde, concentración de MgCL y/o la temperatura de hibridación.
79| Los solicitantes purificaron las reacciones de PCR utilizando el kit de purificación de PCR QIAQuick y normalizaron el eluído hasta 20 ng/pL. Punto de parada: Se podrá almacenar el producto de PCR purificado a -20 °C.
801 Formación de ADN heterobicatenario. Se preparó la reacción de hibridación de la siguiente manera:
Tampón de PCR Taq, 10X 2 pL
ADN normalizado (20 ng/pL) 18 pL
Volumen total 20 pL
811 Hibridar la reacción utilizando las siguientes condiciones:
Número de ciclos Condición
1 95 °C, 10 mn
2 95 °C-85 °C, -2 °C/s
3 85 °C, 1 min
4 85 °C-75 °C, -0.3 °C/s
5 75 °C, 1 min
6 75 °C-65 °C, -0.3 °C/s
7 65 °C, 1 min
8 65 °C-55 °C, -0.3 °C/s
9 55 °C, 1 min
10 55 °C-45 °C, -0.3 °C/s
11 45 °C, 1 min
12 45 °C-35 °C, -0.3 °C/s
13 35 °C, 1 min
14 35 °C-25 °C, -0.3 °C/
15 25 °C, 1 min
82| Digestión con la nucleasa S SURVEYOR. Los solicitantes prepararon una mezcla maestra y añadieron los siguientes componentes en hielo para hibridar las estructuras heterobicatenarias del paso 81 para obtener un volumen final total de 25 pL:
Componente Cantidad (pL) Concentración final
Solución de MgCl2 , 0.15 M 2,5 15mM
ddH2O 0,5
Nucleasa S SURVEYOR 1 1X
Potenciador S SURVEYOR 1 1X
Total 5
83| Agitar bien vorticialmente y sedimentar por centrifugación. Incubar la reacción a 42 °C durante 1 h.
84| Opcional: se podrán añadir 2 pL de la solución de parada del kit SURVEYOR. Punto de parada. El producto digerido se podrá almacenar a -20 °C para un análisis en un momento posterior.
85| Visualizar la reacción SURVEYOR. Se podrán visualizar los productos de la digestión con la nucleasa SURVEYOR en un gel de agarosa al 2%. Para una resolución mejor, se podrán analizar los productos en un gel de poliacrilamida TBE con un gradiente de un 4-20%. Los solicitantes cargaron 10 pL del producto con el tampón de carga recomendado y realizaron el análisis en el gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Normalmente, los solicitantes continuaron el análisis hasta que el tinte azul de bromofenol hubo migrado hasta la parte inferior del gel. En el mismo gel se incluyen un conjunto de patrones de ADN y controles negativos.
86| Los solicitantes tiñeron el gel con tinte oro SYBR 1X diluido en TBE. El gel se sometió a un balanceo suave durante 15 m.
87| Los solicitantes obtuvieron una imagen del gel utilizando un sistema de obtención de imágenes cuantitativo sin sobreexponer las bandas. Los controles negativos solamente deberían tener una banda correspondiente al tamaño del producto de PCR pero podrán presentar ocasionalmente bandas de escisión no específica de otros tamaños. Estas no interferirán con el análisis si tienen un tamaño diferente de las bandas de escisión diana. La suma de los tamaños de las bandas de escisión diana que proporciona la herramienta algorítmica con conexión a internet/computacional de los solicitantes debería ser igual al tamaño del producto de la PCR.
88| Estimar la intensidad de escisión. Los solicitantes cuantificaron la intensidad integrada de cada banda utilizando ImageJ u otro software de cuantificación en gel.
891 Para cada carril, los solicitantes calcularon la fracción del producto de PCR escindido (fcortada) utilizando la siguiente fórmula: fcortada = (b c) / (a b c), donde a es la intensidad integrada del producto de PCR no digerido y b y c son las intensidades integradas de cada producto de la escisión. 901 Se podrá estimar la eficacia de la escisión utilizando la siguiente fórmula, en función de la distribución de la probabilidad binomial de la formación de la estructura bicatenaria: 91 | indel (%) = 100 X (1 - V(1 -fcortada))
Secuenciación de Sanger para evaluar la eficacia de escisión CRISPR. Tiempo • 3 d
Los pasos iniciales son idénticos a los pasos 71-79 del ensayo SURVEYOR. Nota: se podrán utilizar cebadores SURVEYOR para la secuenciación de Sanger si se incorporan los sitios de restricción apropiados a los cebadores Directo e Inverso. Para la clonación en el esqueleto pUC19 recomendado, se podrá utilizar EcoRI para el cebador Dir y HindIII para el cebador Inv.
92| Digestión del amplicón. Preparar la reacción de digestión de la siguiente manera:
Componente Cantidad (pL)
Tampón Fast Digest, 10X 3
EcoRI FastDigest 1
HindIII FastDigest 1
ADN normalizado (20 ng/pL) 10
ddH?O 15
Volumen total 30
93| Digestión del esqueleto pUC19. Preparar la reacción de digestión de la siguiente manera:
Componente Cantidad (pL)
Tampón Fast Digest, 10X 3
EcorRI FastDigest 1
HindIII FastDigest 1
Fosfatasa alcalina FastAP 1
Vector pUC19 (200 ng/pL) 5
ddHpQ 20
Volumen total 30
94| Los solicitantes purificaron las reacciones de la digestión utilizando el kit de purificación de PCR QIAQuick. Punto de parada: Se podrá almacenar el producto de PCR purificado a -20 °C.
95| Los solicitantes ligaron el esqueleto pUC19 digerido y los amplicones de Sanger con una relación vector:inserto 1:3 de la siguiente manera:
Componente Cantidad (pL)
pUC19 digerido x (50 ng)
Inserto digerido x (relación molar vector:inserto 1:3)
Ligasa T7 1
Tampón de ligación rápida 2X 10
ddH?O x
Volumen total 20
96| Transformación. Los solicitantes transformaron una cepa de E. coli competente con el plásmido tratado con PlasmidSafe, de acuerdo con el protocolo suministrado con las células. Los solicitantes recomiendan Stbl3 para una transformación rápida. Resumiendo, se añaden 5 pL del producto del paso 95 a 20 pL de células Stbl3 químicamente competentes enfriadas en hielo, estas se incuban en hielo durante 10 m, se someten a un choque térmico a 42 °C durante 30 s, se devuelven inmediatamente al hielo durante 2 m, se añaden 100 pL de medio SOC y se colocan en una placa de LB que contiene 100 pg/mL de ampicilina. Esta se incuba durante toda la noche a 37 °C.
97| Día 2: Los solicitantes inspeccionan las placas para detectar crecimiento de colonias. Normalmente, no hay colonias en las placas de control negativo (únicamente ligación de pUC19 digerido con EcoRI-HindIII, sin inserto del amplicón de Sanger) y entre decenas y cientos de colonias en las placas de clonación de pUC19-amplicón de Sanger.
98| Día 3: Los solicitantes aislaron ADN plasmídico de los cultivos después de la noche utilizando el kit miniprep con centrifugación QIAprep de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
991 Secuenciación de Sanger. Los solicitantes verificaron la secuencia de cada colonia secuenciando a partir del esqueleto de pUC19 utilizando el pUC19-Cebador Dir. Los solicitantes referenciaron los resultados de la secuenciación respecto a la secuencia de ADN genómica esperada para comprobar la presencia de mutaciones NHEJ inducidas por Cas9. % de eficacia de la edición = (n.° de clones modificados)/(n.° de clones totales). Es importante escoger un número razonable de clones (>24) para generar eficacias de modificación exactas.
Genotipado para detectar microdeleciones. Tiempo • 2-3 d de trabajo; 2-3 semanas de expansión
100| Se transfectaron las células tal como se ha descrito anteriormente con una pareja de ARNsg cuya diana era la región que se iba a eliminar.
1011 Las líneas clonales se aislaron mediante FACS o dilución en serie 24 h después de la transfección tal y como se ha descrito anteriormente.
102| Se expandieron las células durante 2-3 semanas.
103| Los solicitantes recolectaron el ADN de las líneas clonales tal y como se ha descrito anteriormente utilizando 10 pL de solución QuickExtract y normalizaron el ADN genómico con ddH2 O hasta una concentración final de 50-100 ng/pL.
104| Amplificar por PCR la región modificada. Se preparó la reacción de PCR de la siguiente manera:
Componente: Cantidad (pL) Concentración final
Tampón para PCR Herculase II, 5X 10 1X
dNTP, 100mM (25mM cada uno) 1 1 mM
Cebador Dir eliminación (10 pM) 1 0.2 pM
Cebador Inv eliminación (10 pM) 1 0.2 pM
Polimerasa de fusión Herculase II 1
MgCl2 (25 mM) 2 1 mM
ddH2O 32
Total 48 (para cada reacción)
Nota: si el tamaño de la deleción es superior a 1 kb, preparar un conjunto de reacciones de PCR paralelas con cebadores Dir-presencia e Inv-presencia para realizar un cribado que detecte la presencia del alelo no modificado. 105| Para realizar un cribado que detecte las inversiones, se preparara una reacción de PCR de la siguiente manera: Componente: Cantidad (pL) Concentración final Tampón para PCR Herculase II, 5X 10 1X
dNTP, 100mM (25mM cada uno) 1 1 mM
Cebador Dir eliminación o Inv-eliminación (10 pM) 1 0.2 pM
Cebador Inv presencia o Inv-presencia (10 pM) 1 0.2 pM
Polimerasa de fusión Herculase II 1
MgCl2 (25 mM) 2 1 mM
ddH2O 32
Total 48 (para cada reacción)
Nota: los cebadores se emparejan como Dir-eliminación Dir presencia o Inv-eliminación Inv-presencia.
106| Los solicitantes añadieron 100-200 ng de molde de ADN genómico normalizado del paso 103 en cada reacción. 107| Se realizó la reacción de PCR utilizando las siguientes condiciones para los ciclos:
Número de ciclos Desnaturalización Hibridación Extensión
1 95 °C, 2 min
2-31 95 °C, 20 s 60 °C, 20 s 72 °C, 30 s
32 72 °C, 3 m
108| Los solicitantes analizaron 2-5 pL del producto de PCR en un gel al 1-2% para comprobar que estuviera presente el producto. Aunque estas condiciones de pCr están diseñadas para funcionar con la mayoría de los cebadores, algunos cebadores podrán necesitar una optimización adicional mediante el ajuste de la concentración del molde, concentración de MgCl2 y/o la temperatura de hibridación.
Genotipado para detectar modificaciones dirigidas mediante HDR. Tiempo • 2-3 d, 2-3 h de trabajo
109| Los solicitantes recolectaron el ADN tal y como se ha descrito anteriormente utilizando la solución QuickExtract y normalizaron el ADN genómico con TE hasta una concentración final de 100-200 ng/pL.
110| Amplificar por PCR la región modificada. Se preparó la reacción de PCR de la siguiente manera:
Componente: Cantidad (pL) Concentración final
Tampón para PCR Herculase II, 5X 10 1X
dNTP, 100 mM (25 mM cada uno) 1 1 mM
Cebador Dir HDR (10 pM) 1 0.2 pM
Cebador Inv HDR (10 pM) 1 0.2 pM
Polimerasa de fusión Herculase II 1
MgCl2 (25 mM) 2 1 mM
ddH2O 33
Total 49 (para cada reacción)
111| Los solicitantes añadieron 100-200 ng de molde de ADN genómico del paso 109 en cada reacción y llevaron a cabo el siguiente programa.
Número de ciclos Desnaturalización Hibridación Extensión
1 95 °C, 2 min
2-31 95 °C, 20 s 60 °C, 20 s 72 °C, 30-60 s por kb
32 72 °C, 3 min
112| Los solicitantes analizaron 5 pL del producto de PCR en un gel al 0.8-1% para comprobar que hubiera un producto con una única banda. Los cebadores podrán necesitar una optimización adicional mediante el ajuste de la concentración del molde, concentración de MgCl2 y/o la temperatura de hibridación.
113| Los solicitantes purificaron las reacciones de PCR utilizando el kit de purificación de PCR QIAQuick.
114| En el ejemplo de la HDR, se inserta un sitio de restricción HindIIII en el gen EMX1. Estos se detectan mediante una digestión de restricción del amplicón de la PCR:
Componente Cantidad (pL)
Amplicón de la PCR purificado (200-300 ng) x
Tampón F.D., Verde 1
HindIII 0.5
ddH2O x
Total 10
i. Se digiere el ADN durante 10 m a 37 °C:
ii. Los solicitantes analizaron 10 pL del producto digerido con un tinte de carga en un gel de poliacrilamida TBE con un gradiente de un 4-20% hasta que la banda de xileno cianol hubo migrado hasta la parte inferior del gel.
iii. Los solicitantes tiñeron el gel con tinte oro SYBR 1X a la vez que se sometía a un balanceo durante 15 m.
iv. Se obtienen imágenes de los productos de escisión y se cuantifican tal y como se ha descrito anteriormente en la sección del ensayo SURVEYOR. Se estima la eficacia HDR mediante la fórmula: (b c) / (a b c), donde a es la intensidad integrada del producto de PCR HDR no digerido y b y c son las intensidades integradas de los fragmentos cortados con HindIII.
115| Como alternativa, los amplicones de la PCR purificados del paso 113 se podrán clonar y genotipar utilizando la secuenciación de Sanger o NGS.
Secuenciación profunda y análisis fuera de la diana • Tiempo 1 - 2 d
La herramienta de diseño de la diana de CRISPR con conexión a Internet genera sitios fuera de la diana genómicos candidatos para cada sitio diana identificado. Los análisis fuera de la diana en estos sitios se pueden realizar mediante el ensayo con nucleasa SURVEYOR, secuenciación de Sanger o secuenciación profunda de última generación. Teniendo en cuenta la posibilidad de tasas de modificación bajas o no detectables en muchos de estos sitios, los solicitantes recomiendan la secuenciación profunda con la plataforma Illumina Miseq para conseguir una sensibilidad y exactitud elevadas. Los protocolos variarán con la plataforma de secuenciación; en la presente, los solicitantes describen brevemente un método de PCR de fusión para unir adápteros de secuenciación.
116| Diseño de cebadores para la secuenciación profunda. Se diseñan cebadores para la secuenciación de última generación (NGS) para amplicones más cortos, normalmente con un tamaño comprendido en el intervalo de 100-200 pb. Los cebadores se podrán diseñar manualmente utilizando Cebador-Blast de NCBI o se podrán generar con herramientas de diseño de la diana de CRISPR con conexión a internet (página web en genome-engineering.org/tools).
117| Recolectar ADN genómico de las células diana de Cas9. Normalizar el ADN genómico QuickExtract hasta 100-200 ng/pL con ddH2 O.
118| Preparación por PCR de la colección inicial. Utilizando los cebadores NGS del paso 116, preparar la colección inicial mediante una preparación por PCR.
Componente: Cantidad (pL) Concentración final Tampón para PCR Herculase II, 5X 10 1X
dNTP, 100mM (25mM cada uno) 1 1 mM
Cebador Dir NGS (10 pM) 1 0.2 pM
Cebador Inv NGS (10 pM) 1 0.2 pM
Polimerasa de fusión Herculase II 1
MgCl2 (25 mM) 2 1 mM
ddH2O 33
Total 49 (para cada reacción)
119| Añadir 100-200 ng de molde de ADN genómico normalizado en cada reacción.
120| Realizar la reacción de PCR utilizando las siguientes condiciones para los ciclos, durante no más de 20 ciclos de amplificación:
Número de ciclos Desnaturalización Hibridación Extensión
1 95 °C, 2 min
2-21 95 °C, 20 s 60 °C, 20 s 72 °C, 15 s
22 72 °C, 3 min
1211 Analizar 2-5 pL del producto de PCR en un gel al 1% para comprobar la existencia de un producto con una única banda. Como con todas las PCR de ADN genómico, los cebadores NGS podrán necesitar una optimización adicional mediante el ajuste de la concentración del molde, concentración de MgCl2 y/o la temperatura de hibridación.
122| Purificar las reacciones de PCR utilizando el kit de purificación de PCR QIAQuick y normalizar el eluído hasta 20 ng/pL. Punto de parada: Se podrá almacenar el producto de PCR purificado a -20 °C.
123| Kit de preparación de muestras de ADN Nextera XT. Siguiendo el protocolo del fabricante, generar colecciones listas para la secuenciación Miseq con códigos de barra únicos para cada muestra.
124| Analizar datos de la secuenciación. Los análisis fuera de la diana se podrán realizar mediante programas de alineación de lectura tales como ClustalW, Geneious o simples programas específicos de análisis de la secuencia. Tiempo
Pasos 1 - 2 Diseño y síntesis de oligos de ARNsg y ODNmc: 1 -5 d, variable dependiendo del proveedor
Pasos 3 - 5 Construcción del plásmido CRISPR o casete de expresión de PCR: de 2 h a 3 d
Pasos 6 - 53 Transfección de líneas celulares: 3 d (1 h de tiempo de trabajo)
Pasos 54 - 70 Derivación opcional de líneas celulares: 1-3 semanas, variable dependiendo del tipo celular
Pasos 71 - 91 Validación funcional del NHEJ mediante SURVEYOR: 5-6 h
Pasos 92 - 124 Genotipado mediante secuenciación de Sanger o secuenciación profunda de última generación: 2-3 d (3-4 h de tiempo de trabajo)
Abordar situaciones relacionadas con ejemplos de la presente
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Discusión
Se podrá conferir multiplicidad a CRISPR-Cas fácilmente para facilitar la modificación simultánea de varios genes y mediar en microdeleciones cromosómicas con eficacias elevadas. Los solicitantes utilizaron dos ARNsg para demostrar que se tenía como diana simultáneamente GRIN2B humano y los loci DYRK1A con eficacias de hasta un 68% en células HEK293FT. De manera similar, se podrá utilizar una pareja de ARNsg para mediar en microdeleciones, tales como la escisión de un exón, que se puede genotipar mediante PCR en un nivel clonal. Nótese que la ubicación precisa de las uniones del exón puede variar. Los solicitantes también demostraron el uso de ODNmc y vector dirigido para mediar en HDR tanto con Cas9 no modificada como el mutante nickasa en células HEK 293FT y HUES9 (Fig. 30). Nótese que los solicitantes no han sido capaces de detectar HDR en células HUES9 utilizando la nickasa Cas9, lo que podrá deberse a una eficacia baja o a una diferencia potencial en las actividades de reparación en células HUES9. Aunque estos valores son normales, existe cierta variabilidad en la eficacia de escisión de un ARNsg concreto, y en contadas ocasiones ciertos ARNsg podrán no funcionar por razones que aún no se conocen. Los solicitantes recomiendan diseñar dos ARNsg para cada locus y evaluar sus eficacias en el tipo celular previsto.
Ejemplo 31: NLS
Modulador transcripcional de Cas9. Los solicitantes se propusieron transformar el sistema CRISPR Cas9/ARNg en un sistema de unión a ADN generalizado en el que se pudieran ejecutar otras funciones aparte de la escisión de ADN. Por ejemplo, fusionando uno o más dominios funcionales con Cas9 catalíticamente inactivas, los solicitantes confirieron funciones novedosas tales como la activación/represión transcripcional, metilación/desmetilación o modificaciones de la cromatina. Para lograr este objetivo, los solicitantes generaron un mutante de Cas9 catalíticamente inactivo cambiando dos residuos esenciales para la actividad nucleasa, D10 y H840, por alanina. Mutando estos dos residuos se anula la actividad nucleasa de Cas9 a la vez que se mantiene la capacidad de unirse al ADN diana. Los dominios funcionales en los que los solicitantes decidieron centrarse para estudiar las hipótesis de los solicitantes son el activador transcripcional VP64 y los represores transcripcionales SID y KRAB.
Ubicación nuclear de Cas9: Los solicitantes hipotetizaron que el modulador transcripcional de Cas9 más eficaz estaría principalmente ubicado en el núcleo donde tendría la mayor influencia en la transcripción. Además, cualquier Cas9 residual en el citoplasma podría tener efectos no deseados. Los solicitantes determinaron que la Cas9 no modificada no se ubica en el núcleo sin incluir múltiples señales de ubicación nuclear (NLS) (aunque un sistema CRISPR no necesita tener una o más NLS sino que tiene convenientemente al menos una o más NLS). Debido a que se necesitaron múltiples secuencias NLS se llegó a la conclusión que es difícil colocar Cas9 en el núcleo y que cualquier dominio adicional que se fusione con Cas9 podría alterar la ubicación nuclear. Por lo tanto, los solicitantes generaron cuatro constructos de fusión Cas9-VP64-GFP con diferentes secuencias NLS (pXRP02- pLenti2-EF1a-NLS-hSpCsn1(10A,840A)-NLS-VP64-EGFP, pXRP04- pLenti2-EF1a-NLS-hSpCsn1(10A,840A)-NLS-VP64-2A-EGFP-NLS, pXRP06- pLenti2-EF1a-NLS-EGFP-VP64-NLS-hSpCsn1(10A,840A)-NLS, pXRP08- pLenti2-EF1a-NLS-VP64-NLS-hSpCsn1(10A,840A)-NLS-VP64-EGFP-NLS). Se clonaron estos constructos en un esqueleto de tipo lenti bajo la expresión del promotor EF1a humano. También se añadió el elemento WPRE para una expresión proteica más robusta. Se transfectaron células HEK 293FT con cada constructo utilizando Lipofectame 2000 y se obtuvieron imágenes 24 horas después de la transfección. Se obtuvo la mejor ubicación nuclear cuando las proteínas de fusión tuvieron secuencias NLS o tanto el extremo N como el extremo C de la proteína de fusión. La ubicación nuclear observada más elevada tuvo lugar en el constructo con cuatro elementos NLS.
Para entender más exhaustivamente la influencia de los elementos NLS en Cas9, los solicitantes generaron 16 fusiones Cas9-GFP añadiendo la misma secuencia NLS de importina alfa en el extremo N o C examinando de cero a tres repeticiones en tándem. Se transfectaron células HEK 293FT con cada constructo utilizando Lipofectame 2000 y se obtuvieron imágenes 24 horas después de la transfección. Notablemente, el número de elementos NLS no se correlaciona directamente con la extensión de la ubicación nuclear. Añadir una NLS en el extremo C tiene una influencia mayor en la ubicación nuclear que añadirla en el extremo N.
Activador transcripcional de Cas9: Los solicitantes estudiaron funcionalmente la proteína Cas9-VP64 escogiendo como diana el locus Sox2 y cuantificando la activación transcripcional mediante RT-qPCR. Se escogieron ocho sitios diana de ADN para abarcar el promotor de Sox2. Se transfectaron células HEK 293FT con cada constructo utilizando Lipofectame 2000 y 72 horas después de la transfección se extrajo el ARN total de las células. Se sometió a transcripción inversa 1 gg de ARN para obtener ADNc (Supermezcla qScript) en una reacción de 40 gL. Se añadieron 2 gL del producto de la reacción en 20 gL únicos de una reacción de qPCR con ensayo TaqMan. Cada experimento se realizó en triplicados técnicos y biológicos. Ni la reacción de control de RT ni la de control del molde mostraron ausencia de amplificación. Los constructos que no muestran una ubicación nuclear marcada, pXRP02 y pXRP04, dieron como resultado ausencia de la activación. En el caso del constructo que mostró una ubicación nuclear marcada, pXRP08, se observó una activación moderada. Estadísticamente, se observó una activación significativa en el caso de ARN guía para Sox2.4 y Sox2.5.
Ejemplo 32: Datos en ratones in vivo
Materiales y reactivos
Polimerasa de fusión Herculase II (Agilent Technologies, n.° de cat. 600679)
10x NEBuffer 4 (NEB, n.° de cat. B7004S)
Bsal HF (NEB, n.° de cat. R3535S)
ADN ligasa T7 (Enzymatics, n.° de cat. L602L)
Tampón Fast Digest, 10X (ThermoScientific, n.° de cat. B64)
Notl FastDigest (ThermoScientific, n.° de cat. FD0594)
Fosfatasa alcalina FastAP (ThermoScientific, n.° de cat. EF0651)
Lipofectamina2000 (Life Technologies, n.° de cat. 11668-019)
Tripsina (Life Technologies, n.° de cat. 15400054)
Pinzas n.° 4 (Sigma, n.° de cat. Z168777-1EA)
Pinzas n.° 5 (Sigma, n.° de cat. F6521 -1 EA)
Solución salina equilibrada de Hank 10x (Sigma, n.° de cat. H4641-500ML)
Solución de penicilina/estreptomicina (Life Technologies, n.° de cat. P4333)
Neurobasal (Life Technologies, n.° de cat. 21103049)
Suplemento B27 (Life Technologies, n.° de cat. 17504044)
L-glutamina (Life Technologies, n.° de cat. 25030081)
Glutamato (Sigma, n.° de cat. RES5063G-A7)
p-mercaptoetanol (Sigma, n.° de cat. M6250-100ML)
Anticuerpo de conejo con HA (Cell Signaling, n.° de cat. 3724S)
Kit de obtención de imágenes de células LIVE/DEAD® (Life Technologies, n.° de cat. R37601)
Jeringa 30G de World Precision Instrument (World Precision Instruments, n.° de cat. NANOFlL)
Aparato estereotáctico (Kopf Instruments)
UltraMicroBomba3 (World Precision Instruments, n.° de cat. UMP3-4)
Sacarosa (Sigma, n.° de cat. S7903)
Cloruro de calcio (Sigma, n.° de cat. C1016)
Acetato de magnesio (Sigma, n.° de cat. M0631)
Tris-HCl (Sigma, n.° de cat. T5941)
EDTA (Sigma, n.° de cat. E6758)
NP-40 (Sigma, n.° de cat. NP40)
Fluoruro de fenilmetanosulfonilo (Sigma, n.° de cat. 78830)
Cloruro de magnesio (Sigma, n.° de cat. M8266)
Cloruro de potasio (Sigma, n.° de cat. P9333)
p-glicerofosfato (Sigma, n.° de cat. G9422)
Glicerol (Sigma, n.° de cat. G9012)
Tinte Vybrant® DyeCycle™ Rubí (Life technologies, n.° de cat. S4942)
Separador de células-activadas-fluorescencia FACS de Aria (Koch Institute of MIT, Cambridge EE. UU.)
Kit para tejidos y sangre ADNfácil (Qiagen, n.° de cat. 69504)
Procedimiento
Construcción de ARNg múltiples para su uso in vivo en el cerebro
Los solicitantes diseñaron y amplificaron por PCR ARNg monocatenarios cuya diana eran miembros de la familia DNMT y TET de ratón (tal y como se ha descrito en la presente). La eficacia de direccionamiento se evaluó en una línea celular N2a (Fig.33). Para obtener modificaciones simultáneas de varios genes in vivo, el ARNg eficaz se sometió a un proceso de multiplicación (multiplexed) en un vector de empaquetamiento AAV (Fig. 34). Para facilitar aún más el análisis de la eficacia del sistema, los solicitantes añadieron al sistema un casete de expresión coherente con la proteína de fusión con el dominio GFP-KASH controlado por el promotor de la sinapsina I humana (Fig. 34). Esta modificación permite un análisis adicional de la eficacia del sistema en una población neuronal (consulte un procedimiento más detallado en la sección Separación de núcleos y resultados in vivo).
Todas las 4 partes del sistema se amplificaron mediante PCR utilizando la polimerasa de fusión Herculase II utilizando los siguientes cebadores:
1.er U6 Dir: gagggtctcgtccttgcggccgcgctagcgagggcctatttcccatgattc (SEQ ID NO: 196)
1. er ARNg Inv: ctcggtctcggtAAAAAAgcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaac ttgctaTTTCtagctctaaaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGTGTTTC GTCCTTTCCAC (SEQ ID NO: 197)
2. ° U6 Dir: gagggtctcTTTaccggtgagggcctatttcccatgattcc (SEQ ID NO: 198)
2.° ARNg Inv:
ctcggtctcctcAAAAAAgcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctaTTTCtagctctaaa ac NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGTGTTTC GTCCTTTCCAC (SEQ ID NO: 199)
3.er U6 Dir: gagggtctcTTTgagctcgagggcctatttcccatgattc (SEQ ID NO: 200)
3.er ARNg Inv:
ctcggtctcgcgtAAAAAAgcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctaTTTCtagctctaa a
acNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGTGTTT CGTCCTTTCCA (SEQ ID NO: 201)
hSin_GFP-kash Dir: gagggtctcTTacgcgtgtgtctagac (SEQ ID NO: 202)
hSin_GFP-kash Inv:
ctcggtctcAaggaCAGGGAAGGGAGCAGTGGTTCACGCCTGTAATCCCAGCAATTTGGGAGGCC AA GGTGGGTAGATCACCTGAGATTAGGAGTTGC (SEQ ID NO: 203)
Los solicitantes utilizaron la estrategia Golden Gate para ensamblar todas las partes (relación molecular 1:1) del sistema en una reacción de un único paso:
Figure imgf000184_0001
Sin_GFP-kash 100 ng
10x TampónNE 4 1.0 gl
10x BSA 1.0 gl
ATP 10 mM 1.0 gl
BsaI HF 0,75 gl
Ligasa T7 0,25 gl
ddH?O 10 gl
Número de ciclos Condición
1-50 37 °C durante 5 m, 21 °C durante 5 m
El producto de la reacción Golden Gate se amplificó mediante PCR utilizando la polimerasa de fusión Herculase II y los siguientes cebadores:
Dir 5’ cctgtccttgcggccgcgctagcgagggcc (SEQ ID NO: 204)
Inv 5’ cacgcggccgcaaggacagggaagggagcag (SEQ ID NO: 205)
El producto de la PCR se clonó en un esqueleto de AAV, entre las secuencias ITR utilizando sitios de restricción NotI: Digestión del producto de la PCR:
Tampón Fast Digest, 10X 3 gl
FastDigest NotI 1 gl
ADN 1 gg
ddH2O hasta 30 gL
Digestión del esqueleto de AAV:
Tampón Fast Digest, 10X 3 gl
FastDigest NotI 1 gl
Fosfatasa alcalina FastAP 1 gl
Esqueleto de AAV 1 gg
ddHyQ hasta 30 gL
Después de incubar durante 20 min a 37 °C se purificaron las muestras utilizando el kit de purificación de PCR QIAQuick. Se ligaron las muestras estandarizadas con una relación vector:inserto 1:3 de la siguiente manera: pUC19 digerido 50 ng
Inserto digerido Relación molar vector:inserto 1:3
Ligasa T7 1 gl
Tampón de ligación rápida 2X 5 gl
ddH2O hasta 10 gL
Después de la transformación de las bacterias con el producto de la reacción de ligación, los solicitantes confirmaron los clones obtenidos mediante la secuenciación de Sanger.
Se estudiaron los clones de ADN positivos en células N2a tras la cotransfección con el constructo de Cas9 (Figs. 35 y 36).
Diseño de nuevos constructos de Cas9 para el suministro con AAV
El sistema de suministro de AAV tiene limitaciones de empaquetamiento a pesar de sus características únicas - para suministrar con éxito el casete de expresión in vivo ha de tener un tamaño < 4.7 kb. Para disminuir el tamaño del casete de expresión de SpCas9 y facilitar el suministro los solicitantes estudiaron varias alteraciones: diferentes promotores, una señal de poliA más corta y finalmente una versión más pequeña de Cas9 procedentes de Staphylococcus aureus (SaCas9) (Figs. 37 y 38). Todos los promotores estudiados se habían estudiado previamente y se había publicado que eran activos en las neuronas, incluido Mecp2 de ratón (Gray et al., 2011), Maplb de rata y Maplb de rata truncado (Liu y Fischer, 1996). Se había demostrado previamente que la secuencia de poliA sintética alternativa era también funcional (Levitt et al, 1989; Gray et al, 2011). Se expresaron todos los constructos clonados en células N2a tras la transfección con Lipofectamina 2000 y se estudiaron con el método de inmunoelectrotransferencia (Fig.39).
Estudio de sistemas múltiples de AAV en neuronas primarias
Para confirmar la funcionalidad del sistema desarrollado en las neuronas, los solicitantes utilizan cultivos neuronales primarios in vitro. Se prepararon las neuronas corticales de ratón de acuerdo con el protocolo publicado previamente por Banker y Goslin (Banker y Goslin, 1988).
Se obtuvieron células neuronales a partir de embriones de 16 días. Se extrajeron los embriones de hembras preñadas sacrificadas y decapitadas y las cabezas se colocaron en HBSS enfriado con hielo. A continuación se extrajeron los cerebros del cráneo con pinzas (n.° 4 y n.° 5) y se transfirieron a otro HBSS enfriado en hielo de cambio. Se realizaron pasos adicionales con la ayuda de un microscopio estereoscópico en una placa de Petri rellenada con HSBB enfriado en hielo y pinzas n.° 5. Se separan los hemisferios el uno del otro y del tronco encefálico y se limpian de meninges. A continuación se disectan con sumo cuidado los hipocampos y se colocan en un tubo cónico de 15 mL rellenado con HBSS enfriado en hielo. Las cortezas restantes tras la disección del hipocampo se pueden utilizar para un aislamiento celular adicional utilizando un protocolo análogo tras retirar los restos del tronco encefálico y los bulbos olfatorios. Los hipocampos aislados se lavan tres veces con 10 mL de HBSS enfriado en hielo y se disocian mediante una incubación de 15 min con tripsina en HBSS (4 mL de HBSS añadiendo 10 pL de tripsina al 2.5% por hipocampo) a 37 °C. Después de la tripsinización, se lavan con sumo cuidado los hipocampos tres veces para eliminar cualquier traza de tripsina con HBSS precalentado a 37 °C y se disocian en HBSS caliente. Los solicitantes normalmente disocian las células obtenidas a partir de 10-12 embriones en 1 mL de HBSS utilizando puntas de pipeta de 1 mL y diluyen las células disociadas hasta 4 mL. Las células se colocan en placas con una densidad de 250 células/mm2 y se cultivan a 37 °C y un 5% de CO2 durante hasta 3 semanas.
HBSS
435 mL de H2O
50 mL de Solución salina equilibrada de Hank 10x
16.5 mL de HEPES 0.3M, pH 7.3
5 mL de solución de penicilina-estreptomicina
Filtrar (0.2 pm) y almacenar a 4 °C
Medio para la colocación en placas de neuronas (100 mL)
97 mL de Neurobasal
2 mL de Suplemento B27
1 mL de solución de penicilina-estreptomicina
250 pL de glutamina
125 pL de glutamato
Se transdujeron las neuronas con virus AAV1/2 concentrado o virus AAV1 procedente de medio filtrado de células HEK293FT, entre 4-7 días en cultivo y se mantuvieron durante al menos una semana en cultivo tras la transducción para permitir la expresión del gen suministrado.
Expresión impulsada por AA V del sistema
Los solicitantes confirmaron la expresión de SpCas9 y SaCas9 en cultivos neuronales tras el suministro de AAV utilizando el método de la inmunoelectrotransferencia (Fig. 42). Una semana después de la transducción se recogieron las neuronas en tampón de carga NuPage SDS con p-mercaptoetanol para desnaturalizar las proteínas a 95 °C durante 5 min. Se separaron las muestras en un gel SDS pAg E y se transfirieron a una membrana PVDF para la detección de proteínas mediante WB (siglas en inglés de inmunoelectrotansferencia). Las proteínas Cas9 se detectaron con un anticuerpo con HA.
Se confirmó la expresión de Sin-GFP-kash de AAV con múltiples ARNg mediante un microscopio fluorescente (Fig. 50). Toxicidad
Para evaluar la toxicidad de AAV con el sistema CRISPR, los solicitantes estudiaron la morfología global de las neuronas una semana después de la transducción con el virus (Fig. 45). Además, los solicitantes estudiaron la toxicidad potencial del sistema diseñado con el kit de obtención de imágenes en células LIVE/DEAD® que permite distinguir entre células vivas y muertas en cultivo. Se basa en la presencia de actividad esterasa intracelular (determinada mediante la conversión enzimática de calceína AM no fluorescente en calceína con una fluorescencia verde intensa). Por otra parte, el componente rojo, al que las células son impermeables del kit entra únicamente en las células con membranas dañadas y se une al ADN para generar fluorescencia en células muertas. Ambos fluoróforos se pueden visualizar fácilmente en células vivas con un microscopio fluorescente. La expresión impulsada por AAV de proteínas Cas9 y constructos de ARNg múltiples en las neuronas corticales primarias se toleró bien y no fue tóxica (Figs. 43 y 44), lo que indica que el sistema de a Av diseñado es adecuado para los estudios in vivo.
Producción de virus
Se produjeron virus concentrados de acuerdo con los métodos descritos en McClure et al., 2011. Tuvo lugar la producción de virus en el sobrenadante en células HEK293FT.
Cirugías cerebrales
Para las inyecciones del vector vírico se anestesiaron ratones C57BL/6N macho de 10-15 semanas de edad con un cóctel de Ketamina/Xilazina (dosis de Ketamina de 100 mg/kg y dosis de Xilazina de 10 mg/kg) mediante una inyección intraperitoneal. Se utilizó la administración intraperitoneal de Buprenex como un analgésico preventivo (1 mg/kg). Los animales se inmovilizaron con un aparato estereotáctico Kopf utilizando tacos de posicionamiento intraaurales y barras dentales para mantener inmovilizado el cráneo. Utilizando un taladro manual, se practicó un orificio (1-2 mm) en una posición -3.0 mm posterior a la Bregma y 3.5 mm lateral para la inyección en la región CA1 del hipocampo. Utilizando una jeringa 30G de World Precision Instrument con una profundidad de 2.5 mm, se inyectó la solución con las partículas víricas de AAV en un volumen total de 1 pL. Se monitorizó la inyección mediante la bomba de inyección "UltraMicroBomba3 de World Precision Instruments" con un caudal de 0.5 pL/min para prevenir el daño tisular. Cuando la inyección hubo finalizado, se retiró lentamente la aguja de la inyección con una velocidad de 0.5 mm/min. Tras la inyección, se selló la piel con suturas 6-0 Ethilon. Los animales se hidrataron posoperatoriamente con 1 mL de la solución de Ringer lactato (por vía subcutánea) y se alojaron en un entorno con la temperatura controlada (37 °C) hasta que lograron la recuperación deambulatoria. Los animales se sacrificaron 3 semanas después de la cirugía mediante una anestesia profunda seguida por la retirada del tejido para la separación de los núcleos o con una perfusión de paraformaldehído al 4% para las técnicas inmunoquímicas.
Clasificación de los núcleos y resultados in vivo
Los solicitantes diseñaron un método para identificar genéticamente de manera específica los núcleos de las células neuronales diana del ARNg con GFP para la separación celular activada por fluorescencia (FACS) de los núcleos celulares marcados y el procesamiento posterior del ADN, ARN y proteínas nucleares. Con tal objetivo, se diseñó el vector dirigido múltiple de los solicitantes para que expresara tanto una proteína de fusión entre GFP y el dominio de la proteína de la membrana nuclear de ratón KASH (Starr DA, 2011, Current biology) como los 3 ARNg para tener como diana loci génicos específicos de interés (Fig. 34). Se expresó GFP-KASH controlada por el promotor de la sinapsina humana para marcar específicamente las neuronas. Los aminoácidos de la proteína de fusión GFP-KASH fueron: MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMK QHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKN GIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKSG LRSREEEEETDSRMPHLDSPGSSQPRRSFLSRVIRAALPLQLLLLLLLLLACLLPASEDDYSCTQANNFARSFYPMLRYTN GPPPT (SEQ ID NO: 206)
Una semana después del suministro mediado por AAV1/2 en el cerebro se observó una marcada expresión de GFP-KASH. Para FACS y el procesamiento posterior de los núcleos marcados, se diseccionaron los hipocampos 3 semanas después de la cirugía y se procesaron para la purificación de los núcleos celulares utilizando un paso de centrifugación en gradiente. A tal efecto, se homogeneizó el tejido en sacarosa 320 mM, CaCl2 5 mM, Mg(Ac) 2 3 mM, Tris 10 mM pH 7.8, EDTA 0.1 mM, NP400.1%, Fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) 0.1 mM, p-mercaptoetanol 1 mM utilizando un homogenizador Dounce de 2mL (Sigma). Se centrifugó el homogeneizado en un gradiente de un 25% a un 29% de Optiprep® de acuerdo con el protocolo del fabricante durante 30 min a 3500 rpm a 4 °C. Se resuspendió el sedimento nuclear en sacarosa 340 mM, MgCl2 2 mM, KCl 25 mM, glicerofosfato 65 mM, 5% de glicerol, PMSF 0.1 mM, pmercaptoetanol 1 mM y se añadió tinte Vybrant® DyeCycle™ Rubí (Life technologies) para marcar los núcleos celulares (ofrece una emisión cercana al infrarrojo para el ADN). Los núcleos marcados y purificados se separaron mediante FACS utilizando un separador de células-activadas-fluorescencia Aria y un software BDFACS Diva. Los núcleos GFP+ y GFP- separados se utilizaron finalmente para purificar el ADN genómico utilizando el kit para tejidos y sangre ADNfácil (Qiagen) para un análisis mediante el ensayo Surveyor de las regiones genómicas diana. Se puede utilizar fácilmente la misma estrategia para purificar proteínas o ARN nucleares a partir de las células diana para un procesamiento posterior. Debido al sistema con 2 vectores (Fig. 34) que los solicitantes utilizan en esta estrategia se espera que la escisión de ADN mediada por Cas9 eficaz ocurra únicamente en un subconjunto pequeño de células en el cerebro (células que se coinfectan tanto con el vector dirigido múltiple como el vector que codifica Cas9). El método descrito en la presente permite a los solicitantes purificar específicamente ADN, ARN y proteínas nucleares a partir de la población de células que expresan los 3 ARNg de interés y, por lo tanto, se supone que experimentan una escisión de ADN mediada por Cas9. Utilizando este método, los solicitantes fueron capaces de observar que la escisión del ADN eficaz in vivo tenía lugar únicamente en un pequeño subconjunto de células.
Esencialmente, lo que los solicitantes muestran aquí es una escisión in vivo dirigida. Además, los solicitantes utilizaron una estrategia múltiple, donde se escogen como diana varias secuencias diferentes a la vez, pero independientemente. El sistema presentado se puede aplicar al estudio de afecciones patológicas del cerebro (inactivación génica, p. ej., enfermedad de Parkinson) y también abre un campo para un desarrollo adicional de herramientas de edición genómica en el cerebro. Reemplazando la actividad nucleasa con reguladores de la transcripción génica o reguladores epigenéticos será posible resolver todo un conjunto de preguntas científicas sobre la función de la regulación génica y los cambios epigenéticos en el cerebro no solamente en afecciones patológicas sino también en procesos fisiológicos como el aprendizaje y la formación de la memoria. Finalmente, la tecnología presentada se podrá aplicar en sistemas de mamíferos más complejos como en primates lo que permitirá superar las limitaciones actuales de la tecnología.
Ejemplo 33: Datos del modelo
Se han estudiado específicamente varios modelos de enfermedades. Estos incluyen los genes de riesgo del autismo de novo CHD8, KATNAL2 y SCN2A; y el gen del autismo sindrómico (síndrome Angelman) UBE3A. Obviamente se prefieren estos genes y los modelos de autismo resultantes pero muestran que la invención se podrá aplicar a cualquier gen y, por lo tanto, es posible cualquier modelo.
Los solicitantes han generado estas líneas celulares utilizando la nucleasa Cas9 en células madre embrionarias humanas (hESC). Se crearon las líneas mediante una transfección transitoria de hESC con Cbh-Cas9-2A-EGFP y pU6-ARNsg. Se diseñaron dos ARNsg para cada gen cuyas dianas eran muy frecuentemente los mismos exones en los que se han descrito recientes mutaciones interruptoras (inactivación génica) en pacientes a partir de estudios de secuenciación del exoma completo de pacientes autistas. Se crearon los plásmidos Cas9-2A-EGFP y pU6 específicamente para este proyecto.
Ejemplo 34: Protocolo o sistema de producción de AAV
En la presente se proporciona un protocolo o sistema de producción de AAV que se ha desarrollado para su uso en cribados ultrarrápidos, y con los que funciona especialmente bien, pero que también tiene una aplicabilidad más amplia en la presente invención. La manipulación de la expresión de genes endógenos presenta varios desafíos, ya que la velocidad de expresión depende de muchos factores, incluidos elementos reguladores, procesamiento de ARNm y estabilidad del transcrito. Para superar este desafío, los solicitantes desarrollaron un vector derivado de un virus adenoasociado (AAV) para el suministro. AAV tiene un genoma de ADN monocatenario y, por lo tanto, es menos susceptible a la recombinación.
Protocolo para virus concentrados purificados con heparina de AAV1/2 (serotipo AAV1/2, es decir, cápside de AAV mosaico o híbrida de AAV1/AAV2)
Medio: D10 HEPES
Botella de 500 mL de DMEM con una concentración elevada de gluocosa Glutamax (GIBCO)
50 mL de FBS Hyclone (inactivado térmicamente) (Thermo Fischer)
5.5 mL de solución HEPES (1M, GIBCO)
Células: HEK293FT con pocos pases (pases <10 en el momento de la producción de virus, descongelar nuevas células del pase 2-4 para la producción de virus, cultivar hasta los pases 3-5)
Reactivo de transfección: Polietilenimina (PEI) “Max”
Disolver 50 mg de PEI "Max" en 50 mL de H2 O Ultrapure estéril.
Ajusta a pH 7.1.
Filtrar con un filtro abatible de 0.22 gm
Sellar el tubo y envolverlo con parafilm
Congelar alícuotas a -20 °C (para el almacenamiento, también se puede utilizar inmediatamente)
Cultivo celular
Cultivar HEK293FT con pocos pases en D10 HEPES
Realizar un pase cada día entre 1:2 y 1:2.5
Convenientemente, no permitir que las células alcancen más de un 85% de confluencia
Para T75
Calentar 10 mL de HBSS (-Mg2+, -Ca2+, GIBCO) 1 mL de TrypLE Express (GIBCO) por matraz a 37 °C (baño de agua) Aspirar totalmente el medio
Añadir 10 mL de HBSS caliente suavemente (para eliminar el medio completamente)
Añadir 1 mL de TrypLE por matraz
Colocar el matraz en el incubador (37 °C) durante 1 min
Someter a balanceo el matraz para separar las células
Añadir 9 mL de D10 medio HEPES (37 °C)
Pipetear arriba y abajo 5 veces para generar una suspensión de células únicas
Dividir con una relación 1:2 - 1:2.5 (12 mL de medio para T75) (si las células están creciendo más lentamente, desechar y descongelar un nuevo lote, no tienen un crecimiento óptimo)
Transferir a T225 en cuanto estén presentes suficientes células (para que sea más sencilla la manipulación de cantidades grandes de células)
Producción de AAV (escala de placa de 5*15 cm por constructo):
Colocar 10 millones de células en 21.5 mL de medio en una placa de 15 cm
Incubar durante 18-22 horas a 37 °C
La transfección es ideal con un 80% de confluencia
Por placa
Precalentar 22 mL de medio (D10 HEPES)
Preparar un tubo con una mezcla de ADN (utilizar una maxiprep de ADN endofree):
5.2 gg del vector del plásmido de interés
4.35 gg del plásmido del serotipo AAV1
4.35 gg del plásmido del serotipo AAV2
10.4 gg del plásmido pDF6 (genes cooperadores de adenovirus) Mezclar con un vórtex
Añadir 434 gL de DMEM (¡sin suero!)
Añadir 130 gL de solución PEI
Agitar en un vórtex 5-10 segundos
Añadir una mezcla de ADN/DMEM/PEI a medio precalentado
Agitar brevemente en un vórtex para mezclar
Reemplazar el medio en una placa de 15 cm con una mezcla de ADN/DMEM/PEI
Devolver al incubador a 37 °C
Incubar 48 h antes de la recolección (cerciorarse de que el medio no se ha vuelto demasiado ácido)
Recolección de virus:
1. Aspirar el medio de las placas de 15 cm cuidadosamente (convenientemente no desplazar las células)
2. Añadir 25 mL de DPBS (Invitrogen) a TA en cada placa y retirar suavemente las células con una rasqueta para células. Recoger la suspensión en tubos de 50 mL.
3. Sedimentar las células a 800x g durante 10 minutos.
4. Desechar el sobrenadante.
punto de parada: congelar el sedimento celular a -80 °C si se desea
5. Resuspender el sedimento en NaCl 150 mM, Tris 20 mM pH 8.0, utilizar 10 mL por placa de cultivo tisular.
6. Preparar una solución fresca de desoxicolato de sodio al 10% en dH2 O. Añadir 1.25 mL de este por placa de cultivo tisular hasta una concentración final de un 0.5%. Añadir nucleasa benzonasa hasta una concentración final de 50 unidades por mL. Mezclar el tubo exhaustivamente.
7. Incubar a 37 °C durante 1 h (baño de agua).
8. Retirar los desechos celulares centrifugando a 3000 x g durante 15 min. Transferir a un tubo de 50 mL fresco y cerciorarse de que se han retirado todos los desechos celulares para prevenir el bloqueo de las columnas de heparina.
Purificación con una columna de heparina de AAV1/2:
1. Preparar columnas de heparina HiTrap utilizando una bomba peristáltica de modo que las soluciones fluyan a través de la columna a 1 mL por minuto. Es importante cerciorarse de que no se introducen burbujas de aire en la columna de heparina.
2. Equilibrar la columna con 10 mL de NaCl 150 mM, Tris 20 mM, pH 8.0 utilizando la bomba peristáltica.
3. Unión de virus: Aplicar 50 mL de la solución de virus a la columna y permitir que fluya a su través.
4. Paso de lavado 1: columna con 20 mL de NaCl 100 mM, Tris 20 mM, pH 8.0 (utilizando la bomba peristáltica).
5. Paso de lavado 2: Utilizando una jeringa de 3 mL o de 5 mL continuar lavando la columna con 1 mL de NaCl 200 mM, Tris 20 mM, pH 8.0, seguido por 1 mL de NaCl 300 mM, Tris 20 mM, pH 8.0.
Desechar el flujo que pasa a través de la columna.
(preparar las jeringas con diferentes tampones durante los 50 min en los que fluye a su través la solución vírica anterior).
6. Elución. Utilizar jeringas de 5 mL y una presión suave (caudal < 1 mL/min) para eluir el virus de la columna aplicando: 1.5 mL de NaCl 400 mM, Tris 20 mM, pH 8.0
3.0 mL de NaCl 450 mM, Tris 20 mM, pH 8.0
1.5 mL de NaCl 500 mM, Tris 20 mM, pH 8.0
Recogerlas en un tubo de centrífuga de 15 mL.
Concentración de AAV1/2:
1. Paso de concentración 1: Concentrar el virus eluído utilizando unidades de filtro de centrífuga de 15 mL ultra de Amicon con un peso molecular de corte de 100000. Cargar el eluído de la columna en el concentrador y centrifugar a 2000x g durante 2 minutos (a temperatura ambiente. Comprobar el volumen concentrado - debería ser aproximadamente 500 pL. Si es necesario, centrifugar en intervalos de 1 min hasta que se alcance el volumen correcto.
2. intercambio del tampón: Añadir 1 mL de DPBS estéril a una unidad de filtración, centrifugar en intervalos de 1 min hasta que se alcance el volumen correcto (500 pL).
3. Paso de concentración 2: Añadir 500 pL del concentrado a una unidad de filtración 100K de 0.5 mL Ultra de Amicon. Centrifugar a 6000g durante 2 min. Comprobar el volumen concentrado - debería ser aproximadamente 100 pL. Si es necesario, centrifugar en intervalos de 1 min hasta que se alcance el volumen correcto.
4. Recuperación: Invertir el inserto con el filtro e insertarlo en un tubo de recogida fresco. Centrifugar a 1000g durante 2 min.
Alicuotar y congelar a -80 °C.
Normalmente se requiere 1 pL por sitio de inyección, por lo tanto se recomiendan alícuotas pequeñas (p. ej., 5 pL) (evitar la congelación-descongelación de virus).
Determinar el título de partículas GC resistentes a DNasal utilizando qPCR (remítase al protocolo independiente) Materiales
Amicon Ultra, 0.5 mL, 100K; MILLIPORE; UFC510024
Amicon Ultra, 15 mL, 100K; MILLIPORE; UFC910024
Nucleasa Benzonasa; Sigma-Aldrich, E1014
Cartucho de heparina HiTrap; Sigma-Aldrich; 54836
Desoxicolato de sodio; Sigma-Aldrich; D5670
Protocolo de producción de sobrenadante de AAV1
Medio: D10 HEPES
Botella de 500 mL de DMEM con una concentración elevada de gluocosa Glutamax (Invitrogen)
50 mL de FBS Hyclone (inactivado térmicamente) (Thermo Fischer)
5.5 mL de solución HEPES (1M, GIBCO)
Células: HEK293FT con pocos pases (pases < 10 en el momento de la producción de virus)
Descongelar células nuevas del pase 2-4 para la producción de virus, cultivar hasta los pases 2-5
Reactivo de transfección: Polietilenimina (PEI) “Max”
Disolver 50 mg de PEI "Max" en 50 mL de H2 O Ultrapure estéril
Ajustar a pH 7.1
Filtrar con un filtro abatible de 0.22 |jm
Sellar el tubo y envolverlo con parafilm
Congelar alícuotas a -20 °C (para el almacenamiento, también se puede utilizar inmediatamente)
Cultivo celular
Cultivar HEK293FT con pocos pases en D10 HEPES. Realizar un pase todos los días entre 1:2 y 1:2.5
Convenientemente, permitir que las células alcancen más de un 85% de confluencia
Para T7
Calentar 10 mL de HBSS (-Mg2+, -Ca2+, GIBCO) 1 mL de TrypLE Express (GIBCO) por matraz a 37 °C (baño de agua) Aspirar totalmente el medio
Añadir 10 mL de HBSS caliente suavemente (para eliminar el medio completamente)
Añadir 1 mL de TrypLE por matraz
Colocar el matraz en el incubador (37 °C) durante 1 min
Someter a balanceo el matraz para separar las células
Añadir 9 mL de D10 medio HEPES (37 °C)
Pipetear arriba y abajo 5 veces para generar una suspensión de células únicas
Dividir con una relación 1:2 - 1:2.5 (12 mL de medio para T75) (si las células están creciendo más lentamente, desechar y descongelar un nuevo lote, no tienen un crecimiento óptimo)
Transferir a T225 en cuanto estén presentes suficientes células (para que sea más sencilla la manipulación de cantidades grandes de células)
Producción de AAV (escala de placa de 15 cm única)
Colocar 10 millones de células en 21.5 mL de medio en una placa de 15 cm
Incubar durante 18-22 horas a 37 °C
La transfección es ideal con un 80% de confluencia por placa
Precalentar 22 mL de medio (D10 HEPES)
Preparar un tubo con una mezcla de ADN (utilizar una maxiprep de ADN endofree):
5.2 jg del vector del plásmido de interés
8.7 jg del plásmido del serotipo AAV1
10.4 jg del plásmido DF6 (genes cooperadores de adenovirus)
Agitar en un vórtex para mezclar
Añadir 434 jL de DMEM (¡sin suero!) Añadir 130 jL de solución PEI
Agitar en un vórtex 5-10 segundos
Añadir una mezcla de ADN/DMEM/PEI a medio precalentado
Agitar brevemente en un vórtex para mezclar
Reemplazar el medio en una placa de 15 cm con una mezcla de ADN/DMEM/PEI
Devolver al incubador a 37 °C
Incubar 48 h antes de la recolección (monitorizar convenientemente para cerciorarse de que el medio no se ha vuelto demasiado ácido)
Recolección de virus:
Retirar el sobrenadante de una placa de 15 cm
Filtrar con un filtro de 0.45 jm (unión a proteínas bajo). Alicuotar y congelar a -80 °C
Transducción (cultivos de neuronas primarias en un formato de 24 pocillos, 5DIV)
Reemplazar el medio neurobasal completo en cada pocillo de neuronas que se van a transducir con medio neurobasal fresco (normalmente se reemplazan 400 jL de los 500 jL en cada pocillo)
Descongelar el sobrenadante de AAV en un baño de agua a 37 °C
Permitir que se equilibre en un incubador durante 30 min
Añadir 250 jL de sobrenadante de AAV a cada pocillo
Incubar 24 h a 37 °C
Retirar el medio/sobrenadante y reemplazar con medio neurobasal completo fresco
La expresión comienza a ser visible después de 48 h, y alcanza la saturación aproximadamente 6-7 días después de la infección
Los constructos de un plásmido pAAV con GOI no deberían exceder los 4.8 kb incluidas ambas ITR.
Ejemplo de una secuencia de un codón humano optimizada (es decir, que se está optimizando para la expresión en seres humanos) secuencia: SaCas9 se proporciona a continuación:
ACCGGTGCCACCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCGCCGAAGAAAAAGCGCAAGGTCGAAGCGTCCA TGAAAAGGAACTACATTCTGGGGCTGGACATCGGGATTACAAGCGTGGGGTATGGGATTATTGACTATGAAACAAG GGACGTGATCGACGCAGGCGTCAGACTGTTCAAGGAGGCCAACGTGGAAAACAATGAGGGACGGAGAAGCAAGAG GGGAGCCAGGCGCCTGAAACGACGGAGAAGGCACAGAATCCAGAGGGTGAAGAAACTGCTGTTCGATTACAACCT GCTGACCGACCATTCTGAGCTGAGTGGAATTAATCCTTATGAAGCCAGGGTGAAAGGCCTGAGTCAGAAGCTGTCA GAGGAAGAGTTTTCCGCAGCTCTGCTGCACCTGGCTAAGCGCCGAGGAGTGCATAACGTCAATGAGGTGGAAGAG GACACCGGCAACGAGCTGTCTACAAAGGAACAGATCTCACGCAATAGCAAAGCTCTGGAAGAGAAGTATGTCGCAG AGCTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGATGGCGAGGTGAGAGGGTCAATTAATAGGTTCAAGACAAGCGACTACGT CAAAGAAGCCAAGCAGCTGCTGAAAGTGCAGAAGGCTTACCACCAGCTGGATCAGAGCTTCATCGATACTTATATC GACCTGCTGGAGACTCGGAGAACCTACTATGAGGGACCAGGAGAAGGGAGCCCCTTCGGATGGAAAGACATCAAG GAATGGTACGAGATGCTGATGGGACATTGCACCTATTTTCCAGAAGAGCTGAGAAGCGTCAAGTACGCTTATAACGC AGATCTGTACAACGCCCTGAATGACCTGAACAACCTGGTCATCACCAGGGATGAAAACGAGAAACTGGAATACTATG AGAAGTTCCAGATCATCGAAAACGTGTTTAAGCAGAAGAAAAAGCCTACACTGAAACAGATTGCTAAGGAGATCCTG GTCAACGAAGAGGACATCAAGGGCTACCGGGTGACAAGCACTGGAAAACCAGAGTTCACCAATCTGAAAGTGTATC ACGATATTAAGGACATCACAGCACGGAAAGAAATCATTGAGAACGCCGAACTGCTGGATCAGATTGCTAAGATCCTG ACTATCTACCAGAGCTCCGAGGACATCCAGGAAGAGCTGACTAACCTGAACAGCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCG AACAGATTAGTAATCTGAAGGGGTACACCGGAACACACAACCTGTCCCTGAAAGCTATCAATCTGATTCTGGATGAG CTGTGGCATACAAACGACAATCAGATTGCAATCTTTAACCGGCTGAAGCTGGTCCCAAAAAAGGTGGACCTGAGTCA GCAGAAAGAGATCCCAACCACACTGGTGGACGATTTCATTCTGTCACCCGTGGTCAAGCGGAGCTTCATCCAGAGC ATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAATGATATCATTATCGAGCTGGCTAGGGAGAAGAA CAGCAAGGACGCACAGAAGATGATCAATGAGATGCAGAAACGAAACCGGCAGACCAATGAACGCATTGAAGAGATT ATCCGAACTACCGGGAAAGAGAACGCAAAGTACCTGATTGAAAAAATCAAGCTGCACGATATGCAGGAGGGAAAGT GTCTGTATTCTCTGGAGGCCATCCCCCTGGAGGACCTGCTGAACAATCCATTCAACTACGAGGTCGATCATATTATC CCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAATTCCTTTAACAACAAGGTGCTGGTCAAGCAGGAAGAGAACTCTAAAAAGGGCA ATAGGACTCCTTTCCAGTACCTGTCTAGTTCAGATTCCAAGATCTCTTACGAAACCTTTAAAAAGCACATTCTGAATCT GGCCAAAGGAAAGGGCCGCATCAGCAAGACCAAAAAGGAGTACCTGCTGGAAGAGCGGGACATCAACAGATTCTC CGTCCAGAAGGATTTTATTAACCGGAATCTGGTGGACACAAGATACGCTACTCGCGGCCTGATGAATCTGCTGCGAT CCTATTTCCGGGTGAACAATCTGGATGTGAAAGTCAAGTCCATCAACGGCGGGTTCACATCTTTTCTGAGGCGCAAA TGGAAGTTTAAAAAGGAGCGCAACAAAGGGTACAAGCACCATGCCGAAGATGCTCTGATTATCGCAAATGCCGACTT CATCTTTAAGGAGTGGAAAAAGCTGGACAAAGCCAAGAAAGTGATGGAGAACCAGATGTTCGAAGAGAAGCAGGCC GAATCTATGCCCGAAATCGAGACAGAACAGGAGTACAAGGAGATTTTCATCACTCCTCACCAGATCAAGCATATCAA GGATTTCAAGGACTACAAGTACTCTCACCGGGTGGATAAAAAGCCCAACAGAGAGCTGATCAATGACACCCTGTATA GTACAAGAAAAGACGATAAGGGGAATACCCTGATTGTGAACAATCTGAACGGACTGTACGACAAAGATAATGACAAG CTGAAAAAGCTGATCAACAAAAGTCCCGAGAAGCTGCTGATGTACCACCATGATCCTCAGACATATCAGAAACTGAA GCTGATTATGGAGCAGTACGGCGACGAGAAGAACCCACTGTATAAGTACTATGAAGAGACTGGGAACTACCTGACC AAGTATAGCAAAAAGGATAATGGCCCCGTGATCAAGAAGATCAAGTACTATGGGAACAAGCTGAATGCCCATCTGGA CATCACAGACGATTACCCTAACAGTCGCAACAAGGTGGTCAAGCTGTCACTGAAGCCATACAGATTCGATGTCTATC TGGACAACGGCGTGTATAAATTTGTGACTGTCAAGAATCTGGATGTCATCAAAAAGGAGAACTACTATGAAGTGAAT AGCAAGTGCTACGAAGAGGCTAAAAAGCTGAAAAAGATTAGCAACCAGGCAGAGTTCATCGCCTCCTTTTACAACAA CGACCTGATTAAGATCAATGGCGAACTGTATAGGGTCATCGGGGTGAACAATGATCTGCTGAACCGCATTGAAGTG AATATGATTGACATCACTTACCGAGAGTATCTGGAAAACATGAATGATAAGCGCCCCCCTCGAATTATCAAAACAATT GCCTCTAAGACTCAGAGTATCAAAAAGTACTCAACCGACATTCTGGGAAACCTGTATGAGGTGAAGAGCAAAAAGCA CCCTCAGATTATCAAAAAGGGCTAAGAATTC (SEQ ID NO: 207)
Ejemplo 35: Minimizar la escisión fuera de la diana utilizando una nickasa Cas9 y dos ARN guía
Cas9 es una nucleasa de ADN guiada por ARN que se podrá dirigir a ubicaciones específicas en el genoma con la ayuda de una guía de ARN de 20 pb. Sin embargo, la secuencia guía podrá tolerar algunos emparejamientos erróneos entre la secuencia guía y la secuencia diana de ADN. La flexibilidad no es algo deseable debido a la posibilidad de una escisión fuera de la diana, cuando el ARN guía dirige Cas9 a una secuencia fuera de la diana que tiene unas pocas bases diferentes respecto a la secuencia guía. Para todas las aplicaciones experimentales (modificación dirigida de genes, manipulación de cultivos, aplicaciones terapéuticas, etc.) es importante ser capaces de mejorar la especificidad de la modificación dirigida de genes mediada por Cas9 y reducir la probabilidad de una modificación fuera de la diana por parte de Cas9.
Los solicitantes desarrollaron un método para utilizar una nickasa mutante de Cas9 combinada con dos ARN guía para facilitar las roturas bicatenarias diana en el genoma sin modificaciones fuera de la diana. La nickasa mutante de Cas9 se podrá generar a partir de una nucleasa Cas9 desactivando su actividad de escisión de modo que en lugar de que se escindan las dos hebras del ADN bicatenario se escinda únicamente una hebra. La nickasa de Cas9 se podrá generar induciendo mutaciones en uno o más dominios de la nucleasa Cas9, p. ej., Ruvc1 o HNH. Estas mutaciones podrán incluir, sin carácter limitante, mutaciones en un dominio catalítico de Cas9, p. ej., en SpCas9 estas mutaciones podrán estar en las posiciones D10 o H840. Estas mutaciones podrán incluir, sin carácter limitante, D10A, E762A, H840A, N854A, N863A o D986A en SpCas9 pero se podrán generar nickasas induciendo mutaciones en las posiciones correspondientes en otras enzimas CRISPR u ortólogos de Cas9. En una realización muy preferida de la invención, la nickasa mutante de Cas9 es una nickasa SpCas9 con una mutación D10A.
Este modo de funcionamiento consiste en que cada ARN guía combinado con una nickasa de Cas9 induciría la rotura monocatenaria diana de un ADN bicatenario diana. Debido a que cada ARN guía practica un corte monocatenario, el resultado neto es una rotura bicatenaria. La razón por la que este método elimina las mutaciones fuera de la diana es que es muy improbable tener un sitio fuera de la diana que tenga grados elevados de similitud para ambas secuencias guía (20 pb 2 pb (PAM) = 22 pb de especificidad de cada guía y dos guía significa que cualquier sitio fuera de la diana deberá tener cerca de 44 pb de secuencia homóloga). Aunque aún es probable que las guías individuales puedan tener sitios fuera de la diana, esos sitios fuera de la diana únicamente experimentarán un corte monocatenario, que es poco probable que sea reparado por el proceso NHEJ mutagénico. Por lo tanto, la realización de múltiples cortes monocatenarios en ADN bicatenario proporciona un modo potente de introducir roturas bicatenarias de ADN sin efectos mutagénicos fuera de la diana.
Los solicitantes han llevado a cabo experimentos que conllevan la cotransfección de células HEK293FT con un plásmido que codifica una nickasa de Cas9 (D10A) así como también casetes de expresión de ADN para una o más guías. Los solicitantes transfectaron células utilizando Lipofectamina 2000 y se recolectaron las células transfectadas 48 o 72 horas tras las transfecciones. Se detectaron NHEJ inducidas por cortes monocatenarios dobles utilizando el ensayo con nuclesasa SURVEYOR tal y como se ha descrito previamente en la presente (Figs. 51, 52 y 53).
Los solicitantes han identificado además los parámetros relacionados con una escisión eficaz por parte de la nickasa mutante de Cas9 cuando se combina con dos ARN guía y estos parámetros incluyen, sin carácter limitante, la longitud de la región protuberante 5'. Se ha publicado una escisión eficaz para una región protuberante 5’ de al menos 26 pares de bases. En una realización preferida de la invención, la región protuberante 5' tiene al menos 30 pares de bases y más preferentemente al menos 34 pares de bases. Podrán ser aceptables para la escisión regiones protuberantes de hasta 200 pares de bases, aunque se prefieren las regiones protuberantes 5' de menos de 100 pares de bases y las más preferidas son las regiones protuberantes 5' de menos de 50 pares de bases (Figs. 54 y 55).
Ejemplo 36: Cambio genotípico y fenotípico de ApoB observado in vivo con guías y SaCas9 suministrado por vía intravenosa al hígado utilizando un vector de AAV y un promotor de Cas9 específico para el hígado
En este ejemplo, entre otros:
• AAV2/8 es un vector adenovírico cuya diana es el hígado;
• TBG es un promotor específico del hígado y se utiliza aquí para impulsar la expresión de SaCas9;
• U6 se utiliza aquí para impulsar la expresión de (la guía de) ARNsg;
• ApoB es un gen del metabolismo lipídico. Se puede denominar el “patrón de oro” para el suministro en el hígado y se utiliza comúnmente en los modelos de obesidad en ratones
• “De Diana 1 a Diana 4” se refiere a que se escogieron 4 dianas en ApoB, de las cuales las dianas 1 y tres (D1 y D3) fueron las más útiles;
• Expresión a través del suministro procedente de un vector vírico tal como se observa aquí es una mejora respecto al uso de Anderson/Yin (NBT 2884) del suministro hidrodinámico como el método de suministro, debido a que el suministro hidrodinámico requiere la inyección de varios mL de fluido lo que es estresante para el cuerpo murino y puede ser letal. El suministro hidrodinámico se adecua mejor al suministro del ADN plasmídico (desnudo), aunque los solicitantes han mostrado que el empaquetamiento de las secuencias de Cas9 y guía en un vector de suministro vírico es preferible desde el punto de vista de un gran incremento de la eficacia. Ciertamente, únicamente es necesario introducir volúmenes relativamente pequeños y esto se puede realizar por vía intravenosa (i.v.), que probablemente será mucho más aceptable desde un punto de vista terapéutico.
• Lo que fue particularmente alentador fue que no solamente se observó un cambio genotípico en un gen de tipo “patrón de oro” para el hígado tal como ApoB, sino que también se registraron cambios fenotípicos. Trabajos previos con PCSK9 habían mostrado cambios genotípicos pero no fenotípicos, de modo que los cambios fenotípicos observados con ApoB validan la verosimilitud del suministro de CRlSPR al hígado y su capacidad para realizar un cambio fenotípico en este. Esto está combinado con un medio de suministro más aceptable terapéuticamente (i.v. en comparación con el suministro hidrodinámico). Como tal, se prefiere el suministro vírico de CRlSPR (guía y Cas9), especialmente por vía intravenosa.
• Las dianas incluyen: PCSK9, HMGCR, APOB, LDLR, ANGPTL3, F8, F9/FIX, AAT, FAH, HPD, TAT, ATP7B, UGT1A1, OTC, ARH
Materiales y Métodos
Virus y parámetros de inyección
Constructos utilizados: -AAV2/8 - TBG-SaCas9-U6-ARNsg (Apob-de Diana 1 a Diana 4).
Pruebas in vitro: todos indujeron la escisión del locus ApoB con una eficacia de un 10%-15% en células Hepa.
Resultados in vivo: Ratón - 8 semanas, C57BL/6 (2 animales en cada punto temporal y con 1 animal como control de tipo no modificado inyectado con solución salina)
Inyección en la vena de la cola:
Volumen de inyección: 100 pL de 0.8E12 pv/mL (pv = partícula vírica)
Partícula vírica suministrada: 0.8E11 pv total/animal
Procesamiento del tejido y recogida de datos
El procesamiento del tejido y la recogida de datos se realizaron de la siguiente manera:
Primer punto temporal ~ 1 semana (8 días). Segundo punto temporal ~ 4 semanas.
Perfusión salina seguida de disección aguda del tejido hepático.
(A) Se almacenó medio hígado a -80 °C para los análisis Surveyor y qPCR e inmunoelectrotransferencia de proteínas (X12 tubos/animal).
(B) Se colocó medio hígado en críoprotector y se congeló de manera súbita para el procesamiento en un criostato. Los cortes críotratados se sometieron a una tinción con HE y aceite rojo.
Se utilizaron los ensayos QuickExtract y Surveyor para detectar y cuantificar indel de 2 fragmentos de hígado por animal.
Resultados
Evaluación de indel in vivo
Las figuras muestran la evaluación de indel in vivo para la guía de ApoB (dianas) a lo largo del tiempo (hasta 4 semanas después de la inyección). La Figura 56 A muestra que la guía (diana) 1 indujo el porcentaje más elevado de indel en ApoB. Las dianas 2 y 4 mostraron poco efecto o nada en absoluto, en el sentido de que dieron como resultado solamente una formación de indel muy deficiente o ausente, mientras que la diana 3 mostró algo de actividad. La Figura 56 B muestra los resultados de un ensayo en gel con nucleasa Surveyor para determinar la eficacia de la formación de indel, 4 semanas después de la inyección.
Se puede observar que la diana 1 tiene casi un 9% de formación de indel, lo que representa niveles significativos del locus diana.
Cambio fenotípico mostrado con 2 de las 4 guías diseñadas para una diana
Se observaron cambios fenotípicos con dos de las tres guías utilizadas (dianas 1 y 3), tal como se observa en la Figura 57B, que muestra la tinción con aceite rojo para detectar el fenotipo de acumulación de lípidos hepáticos in vivo tras el suministro de AAV-Cas9-ARNsg. Los parches rojos de aceite mostrados que se acumulan en las 2 Figuras de la izquierda, dianas 1 y 3, muestran que ApoB se ha alterado y se comparan con el control, parte inferior derecha. El gen Apob ha sido alterado como resultado de la escisión genómica dirigida inducida por Cas9, lo que da lugar a este cambio fisiológico/fenotípico. La diana 2 no mostró una diferencia apreciable respecto al control y no se muestra la diana 4. Esta tinción con aceite rojo O es un ensayo donde se visualizan las grasas en el hígado mediante una tinción histológica. Esta tinción se utiliza frecuentemente en investigación para evaluar la cantidad de grasa en el hígado. En la práctica clínica, la tinción con aceite rojo O se ordena principalmente con cortes congelados de muestras para una biopsia hepática para evaluar la cantidad de grasa en el hígado durante un trasplante de hígado y otros procedimientos. Para consultar un protocolo e información sobre este aspecto de los Ejemplos, cabe mencionar: Mehlem et al., “Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease”, Nature Protocols 8, 1149-1154(2013); Maczuga et al., “Therapeutic expression of hairpins targeting apolipoprotein B100 induces phenotypic and transcriptome changes in murine liver,” Gene Therapy (2014) 21, 60-70; Koornneef et al., “Apolipoprotein B Knockdown by AAV-delivered shRNA Lowers Plasma Cholesterol in Mice,” Molecular Therapy (2011) 194, 731-740; Tadin-Strapps et al., “siRNA-induced liver ApoB knockdown lowers serum LDL-cholesterol in a mouse model with human-like serum lipids,” Journal of Lipid Research, Volumen 52, 1084-1097 (2011). La barra de escala en la figura representa 20 micras.
Ejemplo 37: Experimentos de optimización de SaCas9
S e in v e s t i g a r o n lo s s ig u ie n t e s : O p t im iz a c ió n d e la lo n g i t u d d e la g u í a ; P r u e b a d e in t r o n e s ; P r o m o t o r H 1 ; P r u e b a c o n u n a n ic k a s a d o b le D 10 A ; P r u e b a d e l o n g i t u d / D N a d ic io n a l .
Prueba de longitud de la guía de SaCas9: P a r a d e t e r m i n a r la s lo n g i t u d e s d e la s g u í a s d e A R N s g : 20 v s . 21 vs. 22 p b , a s í c o m o t a m b ié n e l e f e c t o d e u n a “ G ” e n e l i n i c io ( e x t r e m o 5 ’) d e la g u í a . C a b e m e n c io n a r la F ig u r a 58. E n e s t e e x p e r im e n t o :
Sitios diana:
A 1 : A A V S 1
E 1 : E M X 1
D 1 , D 2 , ... : N u m e r a c ió n d e lo s s i t i o s d ia n a
T G C , G T C , ... : C o m p o s ic ió n d e b a s e s e n la p o s ic ió n 23 , 22 , 21 n t d e s d e e l e x t r e m o 5 ’ d e P A M .
E l e x p e r im e n t o e n e s t e E je m p lo s e r e a l i z ó m e d ia n t e : 1. L a s e le c c ió n d e d ia n a s u t i l i z a n d o N N G R R c o m o P A M d e n t r o d e d o s g e n e s d e in t e r é s , A A V S 1 y E M X 1. 2. L a s í n t e s i s d e o l i g o s c o r r e s p o n d ie n t e s a la s d ia n a s , p e r o v a r ia n d o la lo n g i t u d d e la p a r t e d e la s e c u e n c ia g u í a c o m p r e n d id a e n e l A R N s g d e 20 a 21 a 22. 3. L a u t i l i z a c ió n d e o l i g o s p a r a c r e a r u n c a s e t e d e e x p r e s ió n d e A R N s g y c o t r a n s f e c t a r c o n p lá s m id o q u e e x p r e s a la p r o t e í n a S a C a s 9 la l í n e a c e lu l a r H E K 293 F T . 4. R e c o le c c ió n d e la s c é lu la s 72 h o r a s d e s p u é s d e la t r a n s f e c c ió n , y s u a n á l i s is a c o n t in u a c ió n m e d ia n t e e l e n s a y o S u r v e y o r p a r a d e t e c t a r in d e l . 5. C á lc u lo , a c o n t in u a c ió n , d e la f r e c u e n c ia d e f o r m a c ió n d e in d e l in d u c id a p o r C a s 9 q u e s e r e s u m ió e n la s f i g u r a s a d ju n t a s .
L a F ig u r a 58 m u e s t r a q u e 21 n t / p a r e s d e b a s e s ( p b ) , r e p r e s e n t a d o s p o r la s b a r r a s g r is e s , e s la lo n g i t u d d e l e s p a c i a d o r ó p t im a , a l m e n o s e n c o m p a r a c ió n c o n 20 o 22 p a r e s d e b a s e s ( r e p r e s e n t a d a s p o r la s b a r r a s n e g r a s y b la n c a s r e s p e c t iv a m e n t e ) a lo la r g o d e u n c o n ju n t o d e d ia n a s y d e n t r o d e d o s g e n e s d i f e r e n t e s ( A A V S 1 y E M X 1 ) . L a s d ia n a s y lo s g e n e s n o s e c o n s id e r a n im p o r t a n t e s , s in o m e r a m e n t e r e p r e s e n t a t i v o s . C o m o t a l , p a r e c e q u e 21 n t o p a r e s d e b a s e s e s e l v a lo r ó p t im o p a r a u n a b u e n a lo n g i t u d , e s p e c ia lm e n t e e n o p a r a S a C a s 9. L a F ig u r a 58 t a m b ié n m u e s t r a q u e u n n t G e n e l e x t r e m o 5 ’ d e la s e c u e n c ia g u í a / d ia n a p o d r á s e r v e n t a jo s o , p . e j . , p a r a e l p r o m o t o r U 6. L a lo n g i t u d d e la g u í a ó p t im a p o d r á s e r e s p e c í f i c a p a r a c a d a p r o t e í n a C a s 9. P o r e je m p lo , p a r a S p C a s 9 , la lo n g i t u d d e la g u í a ó p t im a p o d r á s e r 19 - 20 n t . A s í p u e s , e s t e e je m p lo d e m u e s t r a c ó m o s e p u e d e d e t e r m i n a r y u t i l i z a r la lo n g i t u d d e la g u í a ó p t im a .
Prueba de intrones
S e d is e ñ ó e s t e e x p e r im e n t o p a r a e v a l u a r s i p o d r í a i n s e r t a r s e u n a s e c u e n c ia g u í a e n la s e c u e n c ia i n t r ó n i c a d e C a s 9. S e u t i l i z ó e l s i g u ie n t e c o n s t r u c t o . N ó t e s e la p r e s e n c ia d e l A R N g u í a ( A R N s g ) d e n t r o d e l in t r ó n ( e n t r e lo s e x o n e s N ’ y C ’ t e r m i n a l e s d e C a s 9 ) .
M V - S a C a s 9 ( N - t e r m ) - I n t r ó n ( A R N s g ) - S a C a s 9 ( C - t e r m )
S e e x p r e s ó e l c o n s t r u c t o e n c é lu la s H e p a .
S e p r o b ó c a d a i n t r ó n c o n 2 g u í a s d i f e r e n t e s : A R N s g p a r a Pcsk9 y Hmgcr.
S e m u e s t r a n u n t o t a l d e 9 c o n s t r u c t o s : t r e s E B V 1 , t r e s E B V 2 y t r e s A D V :
Figure imgf000194_0001
D e n t r o d e c a d a g r u p o d e d is e ñ o , lo s t r e s c o n s t r u c t o s c o r r e s p o n d e n a t r e s s i t i o s d e in s e r c ió n d i f e r e n t e s d e A R N s g e n e l in t r ó n .
A D V - d i s e ñ o 3
L o s r e s u l t a d o s s e m u e s t r a n e n la F ig u r a 59. E s t o s r e s u l t a d o s p r o p o r c io n a n u n e s t u d io p r e l i m in a r d e m o s t r a t i v o d e q u e e l e m p a q u e t a m ie n t o c o n é x i t o d e u n a s e c u e n c ia g u í a e n u n in t r ó n d e S a C a s 9 e s c i e r t a m e n t e p o s ib le . E l A R N s g q u e p o r t a la s e c u e n c ia g u í a s e in s e r t a e n u n i n t r ó n s in t é t ic o d e r i v a d o d e A d e n o v i r u s y , a c o n t in u a c ió n , e s t e c a s e t e d e A R N s g -i n t r ó n c o m p le t o s e in s e r t a e n e l g e n d e S a C a s 9. L o s i n t r o n e s s e p u e d e n i n s e r t a r e n c u a l q u ie r p u n t o d e n t r o d e l g e n d e S a C a s 9 s in a l t e r a r d e m a n e r a s ig n i f i c a t i v a la e x p r e s ió n n o r m a l d e la p r o t e í n a d e S a C a s 9. S e p u e d e n i n s e r t a r m ú l t ip le s intrones con ARNsg en diferentes posiciones dentro del gen de SaCas9. La ubicación es flexible y es conveniente incluir esta estrategia amplia de los dos siguientes modos:
La minimización del tamaño permite que el número total de pb o nt en el constructo se reduzca.
La multiplicación permite grados mayores de multiplicidad (cosuministro de múltiples guías) ya que el “espacio” es siempre un problema aquí también. Como las guías no necesitan necesariamente un promotor específico, se pueden empaquetar de manera similar una o más guías en un/el intrón de Cas9.
El texto anterior utiliza “un/el” porque, tal como se ha discutido anteriormente, se pueden introducir en Cas9 varios intrones sintéticos. Podrá ser conveniente insertar el ARNsg en una posición cercana pero al menos a 5-15 pb del extremo 5’ del intrón y también antes del punto de ramificación del intrón. Parte de la secuencia espaciadora del intrón entre el sitio donante de corte y empalme 5’ y el punto de ramificación en el centro del intrón se podrá eliminar si el experto en la técnica lo desea. El que esto se logre en una Cas9, especialmente SaCas9, podrá ser sorprendente también debido a que la estructura de ARNsg es diferente entre Sa y Sp.
Por ahora, se prefieren los ADV, pero esta estrategia tiene una aplicabilidad amplia a lo largo de un conjunto de virus y Cas9 (Sa, Sp, etc.).
Pruebas con el promotor H1
Se diseñó este experimento para investigar promotores alternativos al promotor U6.
A) H1 completo
Se generaron los siguientes constructos:
CMV-SaCas9 con el promotor original H1 que impulsaba un ARNsg (ya fuera Pcsk9-Diana201 o Hmgcr-NuevaDiana5). Como se puede observar en la Figura 60, el promotor H1 completo (barra gris) es aún más débil que el promotor U6 (barra negra), ya que U6 muestra un incremento en la formación porcentual de indel para cada diana probada.
B) Prueba con el promotor H1 doble (H1 corto)
Se generaron los siguientes constructos:
TBG-SaCas9 con dos promotores H1 cortos que impulsaban dos ARNsg (Pcsk9-Diana201 y Hmgcr-DianaNueva5) simultáneamente con el promotor H1 corto doble utilizado en la misma orientación y en orientaciones opuestas.
Como se puede observar en la Figura 61, el promotor H1 corto es más débil que el H1 completo.
Prueba de la nickasa SaCas9 (utilizando el mutante D10A)
Este experimento se centró en la distancia entre los extremos 5’ de dos secuencias guía en un constructo y a continuación midió esta en relación con la eficacia de escisión de la nickasa doble SaCas9 D10A. Las dianas fueron para el gen AAT1 humano. Estas pruebas se realizaron con guías de 20 pb+G clonadas en plásmidos:
Se muestran resultados óptimos entre -5 y 1 pb (5’ a 5’), remítase a la Figura 62.
Ejemplo 38: Investigación in vivo de la función génica en el cerebro de mamíferos utilizando CRISPR-Cas9
Este trabajo presenta los siguientes puntos principales: En primer lugar, una demostración del suministro exitoso de Cas9 mediado por AAV in vivo así como también de la modificación genómica eficaz en neuronas posmitóticas. Desarrollo de una técnica de marcaje nuclear que permite el aislamiento fácil de núcleos neuronales a partir de células que expresan ARNsg y Cas9. Demostración de la aplicación respecto al análisis de secARN del transcriptoma neuronal. Integración de estudios electrofisiológicos con la perturbación genómica mediada por Cas9. Y demostración de un direccionamiento múltiple y la capacidad de estudiar la función génica en el comportamiento de roedores utilizando la edición genómica mediada por Cas9.
Los modelos en animales transgénicos que portan mutaciones asociadas con una enfermedad son tremendamente útiles para el estudio de trastornos neurológicos y ayudan a dilucidar el mecanismo genético y patofisiológico de la enfermedad1. Sin embargo, la generación de modelos en animales que portan modificaciones genéticas únicas o múltiples es particularmente laboriosa y requiere la cría selectiva a lo largo de muchas generaciones lo que requiere mucho tiempo. Por lo tanto, para facilitar la disección rápida de la función génica en procesos cerebrales normales y relacionados con la enfermedad, los inventores necesitan ser capaces de manipular de manera precisa y eficaz el genoma de las neuronas in vivo. La endonucleasa Cas9 asociada con CRISPR de Streptococcus pyogenes (SpCas9) ha demostrado que media de manera precisa y eficaz en la escisión genómica de genes únicos y múltiples en células eucariotas en replicación, lo que da como resultado mutaciones de inserción/deleción (indel) del desplazamiento del marco de lectura23. Aquí, los inventores integran la perturbación genómica mediada por Cas9 con lecturas bioquímicas, de secuenciación, electrofisiológicas y conductuales para estudiar la función tanto de genes individuales como de conjuntos de genes en procesos neurales y sus funciones en los trastornos cerebrales in vivo.
Discusión
Los vectores víricos adenoasociados (AAV) se utilizan comúnmente para suministrar genes recombinantes en el cerebro de ratones4. La principal limitación del sistema AAV es su pequeño tamaño de empaquetamiento, limitado a aproximadamente 4.5 kb sin ITR5, que limita la cantidad de material genético que se puede empaquetar en un único vector. Debido a que el tamaño de SpCas96 ya es 4.2 kb, y deja menos de 0.3 kb para otros elementos genéticos dentro de un único vector de AAV, los inventores diseñaron un sistema vectorial dual que empaqueta casetes de expresión de SpCas9 (AAV-SpCas9) y ARNsg (AAV-SpGuía) en dos vectores víricos separados (Figura 67a). A la vez que se diseñaba el vector AAV-SpCas9, los inventores compararon varios promotores específicos de neuronas cortos así como también señales de poliadenilación para optimizar la expresión de SpCas9. Para su diseño final, los inventores eligieron el promotor Mecp2 de ratón (235 pb, pMecp2)7 y una señal de poliadenilación mínima (48 pb, spA)8 en función de su capacidad para lograr unos niveles suficientes de expresión de SpCas9 en neuronas corticales primarias de ratón cultivadas (Figura 67-c). Para facilitar la identificación por inmunofluorescencia de las neuronas que expresaban SpCas9, los inventores marcaron SpCas9 con el epítopo de identificación HA. Para el vector AAV-SpGuía, los inventores empaquetaron un casete de expresión U6-ARNsg así como también la proteína fluorescente verde (GFP) fusionada con el dominio transmembrana nuclear KASH9 impulsado por el promotor de la Sinapsina I humano (Figura 63a). La proteína de fusión GFP-KASH dirige GFP a la membrana nuclear externa (Figura 67c,d) y hace posible la identificación y la purificación en función de la fluorescencia de los núcleos neuronales intactos transducidos con AAV-SpGuía.
Para estudiar la eficacia de suministro del sistema de suministro vectorial dual de los inventores, estos transdujeron en primer lugar neuronas corticales primarias de ratón cultivadas in vitro y observaron una expresión robusta por AAV-SpCas9 y AAV-SpGuía (Figura 67e), con más de un 80% de eficacia de cotransducción (Figura 67e). De manera importante, en comparación con neuronas no transducidas, la expresión de SpCas9 no afectó de manera adversa la morfología y tasa de supervivencia de las neuronas transducidas (67c,f).
Habiendo establecido un sistema de suministro eficaz, los inventores a continuación buscaron estudiar la edición genómica mediada por SpCas9 en neuronas primarias de ratón. Aunque SpCas9 se ha utilizado para lograr modificaciones genómicas eficaces en varios tipos celulares en división, no está claro si SpCas9 se puede utilizar para lograr eficazmente la edición genómica en neuronas posmitóticas. Para su prueba inicial, los inventores escogieron como diana el gen Mecp2, el cual desempeña una función importante en el síndrome de Rett10, un tipo de trastorno del espectro autista. La proteína MeCP2 se expresa ubicuamente en las neuronas a lo largo de todo el cerebro pero está casi ausente en las células gliales11,12 y se ha demostrado que su deficiencia está asociada con fenotipos morfológicos y electrofisiológicos graves en las neuronas y se cree que ambos contribuyen a los síntomas neurológicos observados en pacientes con el síndrome de Rett13-16. Para tener como diana Mecp2, los inventores diseñaron en primer lugar varios ARNsg cuya diana era el exón 3 del gen Mecp2 de ratón (Figura 68a) y evaluaron su eficacia utilizando células Neuro-2a. Se identificó el ARNsg más eficaz utilizando el ensayo con nucleasa SURVEYOR (figura 68b). Los inventores escogieron el ARNsg más eficaz (Mecp2 diana 5) para los experimentos de direccionamiento a Mecp2 in vitro e in vivo posteriores.
Para evaluar la eficacia de edición del sistema vectorial dual de los inventores en neuronas, estos transdujeron neuronas corticales primarias de ratón de 7 días in vitro (7 DIV, Figura 69a) y midieron la tasa de indel utilizando el ensayo con nucleasa SURVEYOR 7 días después de la transducción (Figura 69b). Merece la pena destacar que el cultivo de neuronas cotransducidas con AAV-SpCas9 y AAV-SpGuía que tenían como diana Mecp2 mostró hasta una reducción del 80% en los niveles proteicos de MeCP2 en comparación con las neuronas de control (Figura 69c,d). Una explicación posible para la discrepancia observada entre la frecuencia de indel relativamente baja (~14%) y la marcada reducción proteica (~80%) podría ser que la mera unión de SpCas9 al sitio diana podría interferir con la transcripción, lo que se ha demostrado en E. co//1718. Los inventores investigaron esta posibilidad utilizando un mutante de SpCas9 con los dominios catalíticos RuvC y HNH inactivados19’20 (D10A y H840A, dSpCas9). La coexpresión de dSpCas9 y ARNsg cuya diana era Mecp2 no redujo los niveles proteicos de MeCP2 (Figura 69a,d), lo que sugiere que la disminución observada del nivel de MeCP2 en presencia de SpCas9 activa se debe a la aparición de una modificación en el locus Mecp2. Otra posible explicación para la discrepancia entre el nivel bajo de indel detectado y el nivel elevado de disminución proteica podría deberse a haber subestimado la verdadera tasa de indel con el ensayo con nucleasa SURVEYOR - se ha demostrado previamente que la exactitud de detección de SURVEYOR es sensible a la composición de la secuencia de indel21.
Previamente se había demostrado que la pérdida de función de MeCP2 estaba asociada con anomalías en el árbol dendrítico y defectos en la morfogénesis de la espina en las neuronas1416. Estos fenotipos de carencia de MeCP2 también se han reproducido en neuronas diferenciadas a partir de células MeCP-KO iPS15. Por lo tanto, los inventores investigaron si la reducción de MeCP2 mediada por SpCas9 en neuronas podía igualmente recapitular fenotipos morfológicos del síndrome de Rett. Ciertamente, las neuronas que coexpresan SpCas9 y ARNsg cuya diana es Mecp2 mostraron una morfología del árbol dendrítico y una densidad de espinas alteradas cuando se compararon con las neuronas de control (Figura 70). Estos resultados demuestran que se puede utilizar SpCas9 para facilitar el estudio de las funciones génicas en ensayos celulares haciendo posible inactivaciones genéticas dirigidas en neuronas posmitóticas.
Dada la complejidad del sistema nervioso, que está constituido por redes intrincadas de tipos celulares heterogéneos, la capacidad de editar de manera eficaz el genoma de las neuronas in vivo podría hacer posible el estudio directo de la función génica en tipos celulares relevantes integrados en sus contextos naturales. En consecuencia, los solicitantes inyectaron por vía estereotáctica una mezcla (proporción 1:1) de AAV-SpCas9 y AAV-SpGuía con un título elevado en el giro dentado del hipocampo en ratones adultos. Los inventores observaron una eficacia de cotransducción elevada (más de un 80%) con ambos vectores en las células granulosas del hipocampo 4 semanas después de la inyección de virus (Figura 63b,c) lo que dio como resultado modificaciones genómicas del locus Mecp2 (Figura 63d). Utilizando el ensayo con nucleasa SURVEYOR, los inventores detectaron ~13% de frecuencia de indel en punciones cerebrales obtenidas a partir de regiones de cerebro inyectadas (Figura 63e). Al igual que el hallazgo de los inventores en neuronas primarias cultivadas, el corte mediado por SpCas9 del locus Mecp2 disminuyó eficazmente los niveles proteicos de MeCP2 en más de un 60%. Adicionalmente, el número de núcleos positivos para MeCP2 en el giro dentado disminuyó en más de un 75% cuando se inyectó AAV-SpCas9 y AAV-SpGuía en comparación con AAV-SpCas9 solo (Figura 63g-h). Estos resultados sugieren que se puede utilizar SpCas9 para perturbar de manera directa genes específicos en contextos biológicos intactos.
Las perturbaciones genómicas dirigidas se pueden acoplar con lecturas cuantitativas para proporcionar una visión de la función biológica de elementos genómicos específicos. Para facilitar el análisis de las células transducidas con AAV-SpCas9 y AAV-SpGuía, los inventores desarrollaron un método para purificar núcleos marcados con GFP-KASH utilizando una clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) (Figura 64a). Los núcleos clasificados se pueden utilizar directamente para purificar ARN y ADN nuclear para análisis de secuenciación o bioquímicos posteriores. Utilizando la secuenciación de sanger, los solicitantes observaron que 13 de los 14 núcleos positivos para GFP únicos contenían una mutación indel en el sitio diana del ARNsg.
Además de la secuenciación de ADN genómico, los núcleos positivos para GFP purificados también se pueden utilizar para un análisis de secARN para estudiar las consecuencias transcripcionales de la disminución de MeCP2 (Figura 64b y Figura 71). Para estudiar el efecto de la inactivación génica de Mecp2 en la transcripción de neuronas procedentes del giro dentado, los inventores prepararon colecciones de secARN utilizando núcleos GFP+ purificados con FACS procedentes de animales que recibían AAV-SpCas9 así como también un ARNsg de control que se había diseñado para tener como diana el gen lacZbacteriano y no el genoma de ratón, o un ARNsg que tenía como diana Mecp2. Todos los ARNsg se han optimizado para minimizar su calificación fuera de la diana (Herramienta de diseño CRISPR: http://tools.genome-engineering.org)2. Los inventores fueron capaces de detectar genes expresados de manera diferencial (Figura 63b) entre los núcleos que expresaban ARNsg para Mecp2 y de control (p<0.01). Los inventores identificaron varios candidatos interesantes entre genes con un descenso regulado en núcleos que expresaban ARNsg para Mecp2: Hpca, Olfml y Ncdn, de los que se ha señalado previamente que desempeñan funciones importantes en los comportamientos de aprendizaje22-24; y Cplx2, del que se ha demostrado que participa en la liberación de vesículas sinápticas y está relacionado con la velocidad de activación neuronal2526. Estos resultados demuestran que la combinación de la perturbación genómica mediada por SpCas9 y el análisis de secARN del nivel de la población proporciona una manera de caracterizar las regulaciones transcripcionales en las neuronas y sugiere genes que podrán ser importantes para funciones neuronales o procesos de la enfermedad específicos.
La edición genómica in vivo mediada por SpCas9 en el cerebro también se puede acoplar con el registro electrofisiológico para estudiar el efecto de las perturbaciones genómicas en tipos celulares o componentes de un circuito específicos. Para estudiar el efecto funcional de la disminución de MeCP2 en la fisiología neuronal, los inventores cosuministraron por vía estereotáctica AAV-SpCas9 y AAV-SpGuía cuya diana era Mecp2 en la capa superficial de la corteza visual primaria (V1) de ratones macho. Se escogió V1 debido a que las neuronas excitadoras corticales de la capa superficial son más accesibles para la obtención de imágenes bifotónicas y el registro objetivo guiado bifotónicamente. Dos semanas después del suministro de SpCas9, se sometió a los ratones a registros yuxtacelulares guiados bifotónicamente para comparar la respuesta electrofisiológica de neuronas KASH-GFP+ y neuronas cercanas GFP- en la capa 2/3 de la V1 de ratón (Figura 64a-c). Los inventores midieron las respuestas neuronales a 18 rejillas deslizantes con incrementos de 20 grados y se calculó la velocidad de activación provocada (FR, por sus siglas en inglés) y el índice de selectividad de la orientación (OSI, por sus siglas en inglés) de las células mediante el promediado con el vector de la respuesta. Tanto FR como OSI se vieron reducidos significativamente en las neuronas con una inactivación génica de MeCP2, GFP+ excitadoras, en comparación con las células excitadoras GFP-cercanas (Figura 64d-e). En comparación, la expresión del ARNsg de control junto con SpCas9 no tuvo ningún efecto sobre FR ni OSI cuando se compara con las células no infectadas cercanas (Figura 64d-e). Estos resultados muestran que la disminución de MeCP2 mediada por SpCas9 en neuronas corticales de V1 adultas altera las propiedades de respuesta visual de las neuronas excitadoras in vivo en un intervalo de dos semanas y además demuestra la versatilidad de SpCas9 para facilitar la inactivación génica dirigida en el cerebro de mamíferos in vivo para estudiar funciones génicas y la disección de circuitos neuronales.
Una ventaja crucial del sistema SpCas9 es su capacidad para facilitar una edición genómica múltiple2. La inducción de inactivaciones génicas estables de múltiples genes en el cerebro de animales vivos tendrá, potencialmente, aplicaciones de largo alcance, tales como la investigación causal de mecanismos multigénicos en afecciones fisiológicas y neuropatológicas. Para estudiar la posibilidad de una edición genómica múltiple en el cerebro, los inventores diseñaron un vector de expresión de ARNsg múltiple constituido por tres ARNsg en tándem, junto con GFP-KASH para el marcaje de los núcleos (Figura 65a). Los inventores escogieron ARNsg que tenían como diana la familia de genes de la ADN-metiltransferasa (DNMT), que está constituida por Dnmtl, Dnmt3a y Dnmt3b. Dnmtl y 3a están sumamente expresados en el cerebro adulto y se había demostrado previamente que la actividad DNMT altera la metilación del ADN y se requieren tanto Dnmt3a como Dnmt1 para la plasticidad sináptica y aprendizaje y formación de la memoria27. Los inventores diseñaron ARNsg individuales contra Dnmt3a y Dnmtl con una eficacia de modificación elevada. Para evitar cualesquiera posibles efectos compensadores por parte de Dnmt3b, los inventores decidieron también tener como diana además este gen a pesar de que se expresa principalmente durante el desarrollo neurológico27. Finalmente, los inventores seleccionaron ARNsg individuales para una escisión del ADN simultánea elevada para la totalidad de los tres genes elegidos como diana (Figura 66b y Figura 72).
Para estudiar la eficacia de la edición genómica múltiple in vivo, los inventores suministraron por vía estereotáctica una mezcla de AAV-SpCas9 y AAV-SpGuía con un título elevado en el giro dentado dorsal y ventral de ratones adultos macho. Después de 4 semanas, se disecaron los hipocampos y se clasificaron mediante FACS los núcleos celulares diana. Los inventores detectaron una frecuencia de indel de ~19% (Dnmt3a), 18% (Dnmtl) y 4% (Dnmt3b) en la población de núcleos clasificados utilizando el ensayo con nucleasa SURVEYOR (Figura 66c) y la secuenciación (Figura 73). La elección como diana de múltiples loci suscita la pregunta acerca de la tasa efectiva de inactivaciones génicas múltiples en células individuales. Mediante la clasificación de núcleos únicos combinada con la secuenciación dirigida, los inventores cuantificaron el direccionamiento simultáneo a múltiples loci DNMT en núcleos neuronales individuales (Fig. 66d). De los núcleos neuronales que portan una modificación en al menos un locus Dnmt, más de un 70% de los núcleos contuvieron indel en Dnmt3a y Dnmtl (~40% contuvo indel en la totalidad de los 3 loci, y ~30% tanto en los loci Dnmt3a como Dnmtl). Estos resultados concuerdan con los niveles de disminución proteica de Dnmt3a y Dnmt1 en el giro dentado (Figura 66e). Debido a la expresión baja de Dnmt3b en el cerebro adulto, los solicitantes no fueron capaces de detectar la proteína Dnmt3b.
Estudios recientes con SpCas9 han demostrado que, aunque cada base dentro de la secuencia de ARNsg de 20 nt contribuye a la especificidad global, los loci genómicos que se emparejan parcialmente con el ARNsg pueden dar como resultado roturas bicatenarias y formación de indel fuera de la diana2829. Para evaluar la tasa de modificaciones fuera de la diana, los inventores identificaron computacionalmente una lista de sitios diana genómicos sumamente similares2 y cuantificaron la tasa de modificaciones utilizando una secuenciación profunda dirigida. El análisis de indel de los loci fuera de la diana predichos en las primeras posiciones reveló una tasa de formación de indel de un 0-1.6%, lo que demuestra que la modificación de SpCas9 es específica. Para incrementar la especificidad de la edición genómica mediada por SpCas9 in vivo, los futuros estudios podrán utilizar estrategias para minimizar eventos fuera de la diana, tales como los cortes monocatenarios dobles3031 y ARNsg truncados28.
Previamente, se había demostrado que la atenuación génica de Dnmt3a y Dnmt1 tenía un efecto en la formación de la memoria dependiente del hipocampo27. En consecuencia, los inventores realizaron pruebas de comportamiento condicionado por el miedo contextual para investigar el efecto de la triple inactivación génica (Dnmt3a, Dnmtl y Dnmt3b) mediada por SpCas9 en la adquisición y consolidación de la memoria. Aunque los inventores no observaron ninguna diferencia entre los ratones de control y con la triple inactivación génica en la fase de adquisición de la memoria, los ratones con la inactivación génica mostraron un deterioro en la consolidación de la memoria cuando se sometieron a pruebas en condiciones de contexto de entrenamiento (Figura 66f). Este efecto se anuló cuando los ratones se sometieron a pruebas en el contexto alterado. Los resultados de los inventores demuestran que la inactivación génica mediada por CRISPR-Cas9 de los miembros de la familia DNMT en las neuronas del giro dentado es suficiente para explorar la función de los genes en las tareas conductuales.
En conjunto, los resultados de los inventores demuestran que el suministro de SpCas9 y ARNsg in vivo mediado por AAV proporciona una tecnología rápida y poderosa para lograr perturbaciones genómicas precisas en circuitos neurológicos intactos. Aunque SpCas9 se ha utilizado ampliamente para modificar células en división, los inventores demuestran que SpCas9 también se puede utilizar para modificar el genoma de neuronas posmitóticas con una eficacia elevada mediante la generación de indel mediada por NHEJ. Las perturbaciones genómicas mediadas por SpCas9 se pueden combinar con análisis bioquímicos, de secuenciación, electrofisiológicos y conductuales para estudiar la función del elemento genómico elegido como diana. Los inventores demostraron que la elección como diana mediada por SpCas9 de genes únicos o múltiples puede recapitular fenotipos morfológicos, electrofisiológicos y conductuales observados utilizando modelos en ratones genéticos clásicos que requieren más tiempo. El estudio actual empleó la Cas9 de Streptococcus pyogenes, que no solo necesita el uso de dos vectores de AaV sino que también limita el tamaño de los elementos promotores que se pueden utilizar para lograr el direccionamiento específico al tipo celular. Dada la diversidad de ortólogos de Cas9, donde algunos son sustancialmente más cortos que SpCas92,32,33, debería ser posible modificar vectores de AAV únicos que expresen tanto Cas9 como ARNsg, tal y como se describe en la presente.
REFERENCIAS
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Métodos
Constructos de ADN
Para la selección de dianas para SpCas9 y la generación de ARN sencillo guía (ARNsg), se seleccionaron las secuencias diana de 20 nt para preceder a una secuencia PAM 5’-NGG. Para minimizar los efectos fuera de la diana, se utilizó la herramienta de diseño CRISPR (http://tools.genome-engineering.org). Se amplificó por PCR el ARNsg utilizando el promotor U6 como molde con un cebador directo: 5’-CGCACGCGTAATTCGAACGCTGACGTCATC-3 y un cebador inverso que contenía el ARNsg con el sitio diana de ADN de 20 nt (Negrita ):
5’-CACACGCGTAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTT C TAGCTCTAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3 ’. (SEQ ID NO: 209)
Se diseñó la secuencia de ARNsg de control para que tuviera como diana el gen lacZ de E. coli: secuencia diana: TGCGAATACGCCCACGCGATGGG (SEQ ID No : 210). El constructo EGFP-KASH1 fue un generoso regalo del Prof. Worman (Universidad de Columbia, NYC) y se utilizó como molde de PCR para clonar el casete codificante en el esqueleto de AAV controlado por el promotor de Sinapsina humano (hSin). A continuación, se introdujo la secuencia codificante U6-Mecp2ARNsg utilizando el sitio MluI. Para la estrategia de direccionamiento a múltiples genes, se amplificaron por PCR ARNsg individuales tal como se ha descrito anteriormente. Se ligaron la totalidad de los tres ARNsg con el casete hSin-GFP-KASH-bGHpA amplificado por PCR utilizando la estrategia de clonación Golden Gate. Después de la amplificación por PCR, el producto de la ligación Golden Gate que contenía tres ARNsg y hSin-GFP-KASH-bGH pA se clonó en un esqueleto de AAV. Se verificó la secuencia de todos los constructores obtenidos. Con el fin de determinar la secuencia del promotor óptima para impulsar la expresión de SpCas9 en neuronas, los inventores estudiaron: las secuencias promotoras hSin1, Mecp2 truncado de ratón (pMecp2) y Map1b de rata truncado (pMap1b)2.
Se utilizaron los siguientes cebadores para amplificar las regiones promotoras:
hSin_D: 5'-GTGTCTAGACTGCAGAGGGCCCTG-3'; (SEQ ID NO: 211)
hSin_I: 5'-GTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGTCGAGAA-3'; (SEQ ID NO: 212)
Mecp2_D 5'-GAGAAGCTTAGCTGAATGGGGTCCGCCTC-3'; (SEQ ID NO: 213)
Mecp2_I 5'-CTCACCGGTGCGCGCAACCGATGCCGGGACC-3'; (SEQ ID NO: 214)
Map1b-283/-58_D 5'-GAGAAGCTTGGCGAAATGATTTGCTGCAGATG-3'; (SEQ ID NO: 215)
Map1b-283/-58_I 5'-CTCACCGGTGCGCGCGTCGCCTCCCCCTCCGC-3'. (SEQ ID NO: 216)
Se ensambló otro truncamiento del promotor maplb de rata con los siguientes oligos:
5'-AGCTTCGCGCCGGGAGGAGGGGGGACGCAGTGGGCGGAGCGGAGACAGCACCTTCGGAGATAATCCTTTCTCCT G CCGCAGAGCAGAGGAGCGGCGGGAGAGGAACACTTCTCCCAGGCTTTAGCAGAGCCGGA-3' (SEQ ID NO: 217) y
5'-CCGGTCCGGCTCTGCTAAAGCCTGGGAGAAGTGTTCCTCTCCCGCCGCTCCTCTGCTCTGCGGCAGGAGAAAGGA T TATCTCCGAAGGTGCTGTCTCCGCTCCGCCCACTGCGTCCCCCCTCCTCCCGGCGCGA-3'. (SEQ ID NO: 218) Se ensambló la señal de poliadenilación sintética corta (spA)3 utilizando los siguientes oligos:
5'-AATTCAATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTG TGTGC-3' (SEQ ID NO: 219) y
5'-GGCCGCACACAAAAAACCAACACACAGATCTAATGAAAATAAAGAT CTTTTATTG-3'. (SEQ ID NO: 220) SpCas9 y su versión mutante D10A (dSpCas9) se han descrito previamente45. Se utilizó el plásmido que codifica la proteína fluorescente roja (mCherry) controlada por el promotor EF1a para la transfección de neuronas con Lipofectamine®2000 (Life Technologies).
Cultivo y transfección de líneas celulares
Se cultivaron células Neuro-2a (N2a) en DMEM que contenía un 5% de suero bovino fetal (BSA). Para las células HEK293FT, se utilizó DMEM que contenía un 10% de suero bovino fetal (FBS). Se mantuvieron las células a 37 °C en una atmósfera con un 5% de CO2. Se transfectaron las células utilizando Lipofectamine®2000 o el reactivo Polietilenimina (PEI) “MAX” (Polysciences), de acuerdo con los protocolos del proveedor.
Producción de vectores de AAV concentrados
Se produjeron partículas de AAV1/2 con un título elevado utilizando plásmidos del serotipo AAV1 y AAV2 en proporciones idénticas y el plásmido cooperador pDF6, y se purificaron en una columna de afinidad por heparina6. La titulación de las partículas víricas se realizó mediante qPCR. Los Servicios del Centro de Vectores UNC (Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill) produjeron partículas de AAV1 con un título elevado. Se produjeron partículas de AAV1 con un título bajo en DMEM tal y como se ha descrito previamente7. Resumiendo, se transfectaron células HEK293FT con el plásmido con el transgén, el plásmido del serotipo pAAV1 y el plásmido cooperador pDF6 utilizando PEI “MAX”. Se recolectó el medio de cultivo después de 48 h y se filtró a través de un filtro de PVDF de 0.45 pm (Millipore).
Cultivo de neuronas corticales primarias
Los animales utilizados para obtener neuronas para los cultivos tisulares se sacrificaron de acuerdo con el protocolo aprobado por el Comité del MIT para el Cuidado Animal (MIT CAC). Se prepararon cultivos primarios a partir de cerebros de ratón embrionarios de 16 días8. Se utilizaron embriones de ambos sexos. Las células se sembraron en placas de 24 pocillos recubiertos de poli-D-lisina (PDL) (BD Biosciences) o cubreobjetos recubiertos con laminina/PDL (VWR). Se cultivaron los cultivos a 37 °C y un 5% de CO2 en medio neurobasal, suplementado con B27, Glutamax (Life Technologies) y una mezcla de penicilina/estreptomicina.
Para la transducción con AAV, se incubaron neuronas corticales en 500 pL de medio de cultivo neurobasal en 7 DIV con 300 pL (infección doble con una proporción 1:1) de medio condicionado que contenía AAV1 de células HEK293FT7. Una semana después de la transducción, se recolectaron las neuronas para un procesamiento posterior o para ser fijadas en paraformaldehído al 4% para tinciones inmunofluorescentes o análisis de la morfología.
Para la visualización de la morfología neuronal, se transfectaron células en DIV7 con el vector de expresión EF1amCherry utilizando Lipofectamine®2000 (Life Technologies) durante una semana tal como se ha descrito previamente9. Para la medición de la longitud dendrítica total, se registraron todas las dendritas de neuronas individuales utilizando el software ImageJ. Se realizó la cuantificación del número de dendritas primarias, puntas dendríticas y el análisis de Sholl10 en imágenes adquiridas con un microscopio fluorescente con un objetivo 40x (microscopio Zeiss AxioCam Ax10, cámara Axiocam MRm). Para el número de dendritas, se contaron los extremos de todas las protuberancias no axonales más largas de 10 pm. Para el análisis de Sholl, se dibujaron de manera automática círculos concéntricos con intervalos de 5 pm en el diámetro alrededor del cuerpo celular y se contó el número de dendritas que cruzaban cada círculo utilizando el software ImageJ con un programa adicional Sholl.
I n y e c c i ó n e s t e r e o t á c t i c a d e A A V 1 / 2 e n e l c e r e b r o d e r a t ó n
El MIT CAC aprobó todos los procedimientos en animales descritos aquí. Los ratones C57BL/6N macho adultos (12-16 semanas de edad) se anestesiaron mediante una inyección intraperitoneal (i.p.) de 100 mg/kg de Ketamina y 10 mg/kg de Xilazina. Se administró una analgesia presintomática (Buneprex, 1 mg/kg, i.p.). Se realizó una craneotomía de acuerdo con procedimientos aprobados y se inyectó 1 pL de una mezcla de AAV 1:1 (1x1013 gv/mL de sMecp2-SpCas9; 6x1012 gv/mL de 3xARNsg para DNMT; 3-5x1012 gv/mL de hSin-GFP-KASH) en: el giro dentado dorsal (anterior/posterior: -1.7; mediolateral: 0.6; dorsal/ventral: -2.15) y/o giro dentado ventral (anterior/posterior: -3.52; mediolateral: 2.65; dorsal/ventral: -3). Para los experimentos de registro electrofisiológico in vivo las coordenadas de la inyección de virus fueron 3 mm lateral (desde Bregma) y 1 mm anterior desde la sutura posterior. Se rebajó el cráneo utilizando un taladro dremel con una refrigeración ocasional con solución salina, y la duramadre restante se sometió a una punción utilizando una micropipeta de vidrio rellenada con el virus suspendido en aceite mineral. Se practicaron varias inyecciones (3-4) en sitios cercanos, con una profundidad de 200-250 pm. Se inyectó un volumen de 150-200 nL de mezcla del virus con una tasa de 75 nL/min en cada sitio. Después de cada inyección, la pipeta se mantuvo en su sitio durante 3-5 minutos antes de retirarla para evitar fugas. Se suturó la incisión y se administraron los analgésicos posoperatorios apropiados (Meloxicam, 1-2 mg/kg) durante tres días después de la cirugía.
R e g i s t r o s d e p a r c h e s u e l t o d i r i g i d o s g u i a d o s b i f o t ó n i c a m e n t e in vivo
Dos semanas después de la inyección de virus, se utilizaron los ratones para experimentos electrofisiológicos. Se anestesiaron los ratones con un 2% de isoflurano y se mantuvieron utilizando un 0.8% de isoflurano. Se escindió la piel, se limpió con sugi y se unió un cabezal metálico al cráneo utilizando pegamento y acrílico dental, y se realizó una craneotomía de 2 mm x 2 mm a lo largo de la corteza visual primaria (V1). A continuación se cubrió el área expuesta con una capa delgada de agarosa al 1.5% en líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa: NaCl 140 mM, KCl 5 mM, CaCl22 mM, MgCl2 1 mM, EDTA 0.01 mM, HEPES 10 mM, glucosa 10 mM; pH 7.4). La temperatura del cuerpo animal se mantuvo durante el experimento a 37.5 °C con una manta eléctrica.
Se estiraron pipetas de borosilicato (WPI) utilizando un estirador láser Sutter P-2000 (Sutter Instruments). El diámetro de la punta fue de aproximadamente 1 pm mientras que la resistencia estuvo comprendida entre 3-5 MQ. Los registros se realizaron utilizando un software a medida (Network Prism, Sur lab), escrito en Matlab (MathWorks), que controlaba un amplificador MultiClamp 700B (Axon). Se insertó un electrodo en forma de pipeta de vidrio en el cerebro con un ángulo de 20-35° y un electrodo con pelet de conexión a tierra de Ag/AgCl (Warner Instruments) se mantuvo en la misma solución que el cerebro y el objetivo. Para la visualización de la fluorescencia, se llenaron las pipetas con Alexa Fluor 594 (Molecular Probes). En primer lugar, la pipeta se dirigió al sitio de inyección utilizando una lente 10x, y a continuación se dirigió a las células GFP+ individuales utilizando una lente 25x mediante la obtención de imágenes bifotónicas simultánea a 770 nm. Se detectó la proximidad celular mediante desviaciones en la resistencia observada en la fijación del voltaje durante un pulso de voltaje ordenado de 5 mV que variaba rápidamente en el tiempo. Una vez que la resistencia se incrementó en 5-10 MQ, se cambió el amplificador a la fijación de corriente, y se registraron los picos con una corriente inyectada cero, bajo un filtro Bessel de 4 KHz y un filtro AC de 300 Hz. Los cerebros inyectados con virus se sometieron a una perfusión post hoc y se realizó una inmunohistoquímica.
E s t i m u l a c i ó n v i s u a l y a n á l i s i s d e l o s d a t o s a p a r t i r d e l o s r e g i s t r o s d e p a r c h e s u e l t o d i r i g i d o s g u i a d o s b i f o t ó n i c a m e n t e in vivo
Para evaluar la selectividad de la orientación y sintonización de las neuronas con el genoma editado, los inventores presentaron rejillas orientadas utilizando un software a medida escrito en Matlab PsychToolbox-3. Se optimizaron las rejillas para la respuesta celular y se presentaron variando la orientación de manera escalonada desde 0-360 grados en escalones de 20 grados, donde cada presentación de la rejilla estuvo precedida por 4 segundos “de apagado” seguido por 4 segundos “de encendido”, con una duración de la presentación total de 144 segundos. Los datos se adquirieron directamente en Matlab y se guardaron como archivos .mat. La detección de picos se realizó mediante análisis rutinarios que utilizaron umbrales definidos manualmente y a continuación un emparejamiento con un molde de la forma de los picos para una verificación adicional. Cada pico se identificó y se presentó en una pantalla en una interfaz gráfica de usuario donde se revisó manualmente para que el técnico detectara falsos positivos y negativos. A continuación se agruparon los tiempos de los picos en respuesta a cada estímulo en los periodos “de encendido” o “de apagado” en función de su posición temporal respecto al estímulo visual, y a los picos “de encendido” para cada estímulo se les restó el número de picos “de apagado” observados durante un periodo temporal igual. Para los experimentos de orientación, n.° de picos por estímulo = (n.° de picos “de encendido”)-(n.° de picos “de apagado”) debido a que los periodos “de encendido” y “de apagado” tuvieron la misma duración.
Para cada célula de interés, se utilizaron los métodos para recoger las respuestas para cada estímulo orientado (de 0 a 360 grados, en escalones de 20 grados). A continuación, se obtuvo una “curva de sintonización” de la orientación frente a la respuesta a partir de estas respuestas para cada ensayo. Se obtuvo computacionalmente el Índice de Selectividad de la Orientación (OSI) a partir del promedio del vector para la orientación preferida de acuerdo con la siguiente fórmula:
n r , _ V(S¡^(0¡)sin(20¡))2 (S¡fi(0¡)cos(20¡))2
“ 1L tR(0t)
Preparación del tejido y purificación de los núcleos celulares
El giro dentado o hipocampo total se disecó rápidamente en DPBS (Life Sciences) enfriado en hielo y se congeló de manera súbita en hielo seco. Para la purificación de los núcleos celulares, se homogeneizó suavemente el tejido en 2 mL de tampón de homogeneización (TH) enfriado en hielo (sacarosa 320 mM, CaCl 5 mM, Mg(Ac) 2 3 mM, Tris 10 mM, pH 7.8, EDTA 0.1 mM, 0.1% de NP40, PMSF 0.1 mM, beta-mercaptoetanol 1 mM) utilizando un homogeneizador Dounce de 2 mL (Sigma); 25 veces con el mortero A y a continuación 25 veces con el mortero B. A continuación, se añadieron 3 mL de TH hasta un total de 5 mL y se mantuvo en hielo durante 5 min. Para la centrifugación en gradiente, se añadieron 5 mL de medio para gradiente de densidad OptiPrep™ al 50% (Sigma) que contenía CaCl 5 mM, Mg(Ac)2 3 mM, Tris 10 mM, pH 7.8, pMs F 0.1 mM, beta-mercaptoetanol 1 mM y se mezcló. El lisado se cargó suavemente sobre la parte superior de 10 mL de una solución OptiPrep™ isoosmolar al 29% en un tubo de centrífuga de 30 mL cónico (Beckman Coulter, rotor SW28). Se centrifugaron las muestras a 10100 xg (7500 rpm) durante 30 min a 4 °C. Se retiró el sobrenadante y los núcleos sedimentados se resuspendieron suavemente en beta-glicerofosfato 65 mM (pH 7.0), MgCl2 2 mM, KCl 25 mM, sacarosa 340 mM y 5% de glicerol. Se controló el número y la calidad de los núcleos purificados utilizando microscopía de campo brillante.
Clasificación de los núcleos celulares
Los núcleos intactos positivos (GFP+) y negativos (GFP-) para GFP purificados se marcaron conjuntamente con el tinte Vybrant® DyeCycle™ Rubí (1:500, Life Technologies) y se clasificaron utilizando BD FACSAria III (Centro de Citometría de Flujo del Instituto Koch, MIT). Se recogieron los núcleos GFP+ y GFP- en tubos Eppendorf de 1.5 mL recubiertos con BSA al 1% y que contenían 400 pL de tampón de resuspensión (beta-glicerofosfato 65 mM, pH 7.0, MgCl22 mM, KCl 25 mM, sacarosa 340 mM y 5% de glicerol). Después de la clasificación, se mantuvieron todas las muestras en hielo y se centrifugaron a 10000 xg durante 20 min a 4 °C. Los núcleos sedimentados se almacenaron a -80 °C o se utilizaron directamente para el procesamiento posterior.
Extracción del ADN genómico y ensayo SURVEYOR™
Para las pruebas funcionales del ARNsg, se cotransfectaron células N2a confluentes al 50-70% con un vector de SpCas9 y de ARNsg amplificado por PCR único. Las células transfectadas únicamente con SpCas9 sirvieron de control negativo. Se recolectaron las células 48 h después de la transfección y se extrajo el ADN utiilzando el kit para tejidos y sangre DNfácil (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del proveedor. Para aislar el ADN genómico de neuronas primarias transducidas con AAV1, se utilizó el kit para tejidos y sangre DNfácil 7 días después de la transducción con AAV, de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
Los núcleos clasificados o los tejidos disecados se lisaron en tampón de lisis (Tris 10 mM, pH 8.0, NaCl 10 mM, EDTA 10 mM, SDS 0.5 mM, proteinasa K (PK, 1 mg/mL) y ARNasa A) a 55° durante 30 min. A continuación, se realizó una extracción con cloroformo-fenol seguida por una precipitación del ADN con etanol, de acuerdo con los procedimientos habituales. Finalmente, se resuspendió el ADN en tampón TE (Tris 10 mM, pH 8.0, EDTA 0.1 mM) y se utilizó para el análisis posterior. Las pruebas funcionales de los ARNsg individuales se realizaron mediante un ensayo con nucleasa SURVEYOR™ (Transgenomics) utilizando los cebadores de PCR que se enumeran en la Tabla Suplementaria 2. Se realizó una cuantificación de la intensidad de las bandas tal y como se ha descrito anteriormente11.
Preparación y secuenciación de la colección de ARN
Dos semanas después del suministro vírico bilateral de SpCas9 con una guía cuya diana era Mecp2 (4 animales) o SpCas9 con ARNg cuya diana era lacZ (4 animales), se disecó rápidamente el giro dentado en DpBs (Life Sciences) enfriado en hielo y se transfirió inmediatamente a una solución RNA-later (Ambion). Después de 24 horas a 4 °C, se pasó el tejido a -80 °C. Se clasificaron por FACS las poblaciones de 100 núcleos neuronales diana en 10 pL de tampón TCL suplementado con un 1% de 2-mercaptoetanol (Qiagen). Después de la centrifugación, las muestras se congelaron inmediatamente a -80 °C. Se purificó el ARN mediante microesferas SPRI AMPuro ARNlimpioXP (Beckman Coulter Genomics) siguiendo las instrucciones de los proveedores y se lavó tres veces con etanol al 80%, omitiendo la elución final. Las microesferas con ARN capturado se secaron con aire y se procesaron inmediatamente para la síntesis de ADNc. Las muestran sin núcleos se utilizaron como controles negativos. Se utilizaron tres muestras de la población para cada animal, un total de 24 muestras de población, en las preparaciones de colecciones de ADNc siguiendo el protocolo SMART-seq212 reemplazando únicamente la enzima transcriptasa inversa con 0.1 pL de enzima Maxima H Minus (200 U/pL, Thermo Scientific) y se redujo a escala la reacción de PCR hasta un volumen de 25 pL. La reacción de fragmentación y adición de identificadores y la amplificación por PCR final se realizaron utilizando el kit de preparación de muestra de ADN Nextera XT (Illumina), con las siguientes modificaciones. Todos los volúmenes de reacción se redujeron a escala en un factor de 4 y las colecciones se combinaron después del paso de amplificación por PCR tomando 2.5 pL de cada muestra. Las colecciones combinadas se limpiaron y se seleccionaron según su tamaño utilizando dos ciclos de limpieza con un volumen de 0.7 de microesferas SPRI AMPuro XP (Beckman Coulter Genomics). Las muestras se cargaron en una matriz de ADN con una sensibilidad elevada (Agilent) para comprobar la calidad de la colección, mientras se realizaba la cuantificación con el kit de ADN con sensibilidad elevada Qubit (Invitrogen). Se diluyeron las colecciones combinadas hasta una concentración final de 4 nM y 12 pmol y se secuenciaron utilizando Illumina Miseq con lecturas de extremos emparejados de 75 pb.
Análisis de datos de las colecciones de ARN
Se creó un índice Bowtie2 basado en el genoma UCSC mm9 de ratón y transcriptoma13 génico conocido, y las lecturas de extremos emparejados se alinearon directamente respecto a este índice utilizando Bowtie2 con opciones de la línea de comandos -q --phred33-quals -n 2 -e 99999999 -1 25 -I 1 -X 1000 -a -m 200 -p 4 --chunkmbs 512. A continuación, se ejecutó RSEM v1.27 con los parámetros predeterminados en las alineaciones creadas por Bowtie2 para estimar los niveles de expresión. Las estimaciones de la expresión del nivel génico de RSEM (tau) se multiplicaron por 1000000 para obtener las estimaciones del transcrito por millón (TPM) para cada gen, y las estimaciones de TPM se transformaron en log-espacio tomando log2(TPM+1). Se consideró que se detectaban los genes si su nivel de expresión transformado era igual o superior a 2 (en escala log2(TPM+1)). Se descarta una colección si tiene menos de 8000 genes detectados. Basándose en este criterio, se filtraron y excluyeron 4 colecciones del análisis posterior. Para detectar genes expresados de manera diferencial entre los animales de control y los animales que expresaban ARNsg para Mecp2, se utilizaron la prueba de la t de Student (Matlab V2013b) y una validación cruzada en 20 ciclos de permutación aleatoria, donde en cada ciclo se escogió al azar una colección de cada animal para excluirla (esto dio como resultado un total de 12 colecciones utilizadas en la prueba de la t cada vez). La prueba de la t se utilizó con todos los genes que tenían un nivel de expresión medio superior a un quantil 0.9 (de manera habitual aproximadamente 5 log2(TPM+1)) para cada muestra. A continuación, se escogieron los genes que fueron significativos (p<0.01) en más de un tercio de los ciclos de permutaciones. Los niveles de expresión de log2(TPM+1) de estos genes a lo largo de las muestras se agruparon utilizando una agrupación jerárquica (Matlab 2013b).
Tinción inmunofluorescente
Cultivo celular: para la tinción inmunofluorescente de neuronas primarias, se fijaron las células 7 días después del suministro vírico con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 20 min a TA. Después de lavar 3 veces con PBS, se bloquearon las células con 5% de suero de cabra normal (NGS) (Life Technologies), 5% de suero de burro (DS) (Sigma) y 0.1% de Triton-X100 (Sigma) en PBS durante 30 min a TA. Las células se incubaron con los anticuerpos primarios en 2.5% de NGS, 2.5% de DS y 0.1% de Triton-X100 durante 1 hora a TA o durante toda la noche a 4 °C. Después de lavar 3 veces con PBST, se incubaron las células con los anticuerpos secundarios durante 1 hora a TA. Finalmente, los cubreobjetos se montaron utilizando medio de montaje VECTASHIELD HardSet con DAPI (Vector Laboratories) y se obtuvieron imágenes utilizando un microscopio Zeiss AxioCam Ax10 y una cámara Axiocam MRm. Se procesaron las imágenes utilizando el software Zen 2012 (Zeiss). Las cuantificaciones se realizaron utilizando el software ImageJ 1.48h y el programa adicional Neuron detector.
Se sacrificaron los ratones 4 semanas después del suministro vírico mediante una dosis letal de Ketamina/Xilazina y se sometieron a una perfusión transcardiaca con PBS y a continuación PFA. El tejido fijado se seccionó utilizando un vibratomo (Leica, VT1000S). A continuación, los cortes de 30 pm se hirvieron durante 2 min en tampón de citrato de sodio (citrato de trisodio deshidratado 10 mM, 0.05% de Tween20, pH 6.0) y se enfriaron a TA durante 20 min. Los cortes se bloquearon con 4% de suero de cabra normal (NGS) en TBST (NaCl 137 mM, Tris 20 mM pH 7.6, 0.2% de Tween-20) durante 1 hora. Se cortaron cortes de 8 pm en parafina utilizando un microtomo (Leica RM2125 RTS) y se tiñeron tal y como se ha descrito previamente14.
Se incubaron los cortes con los anticuerpos primarios diluidos en TBST con 4% de NGS durante toda la noche a 4 °C. Después de 3 lavados en TBST, se incubaron las muestras con los anticuerpos secundarios. Después de lavar con TBST 3 veces, se montaron los cortes utilizando medio de montaje VECTASHIELD HardSet con DAPi y se visualizaron utilizando un microscopio confocal (Zeiss LSM 710, Ax10 ImagerZ2, Software Zen 2012).
Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo de conejo contra Dnmt3a (Santa Cruz, 1:100); anticuerpo de conejo contra MeCP2 (Millipore; 1:200); anticuerpo de ratón contra NeuN (Millipore, 1:50-1:400); anticuerpo de pollo contra GFAP (Abcam, 1:400); anticuerpo de ratón contra Map2 (Sigma, 1:500); anticuerpo de pollo contra GFP (Aves labs, 1:200-1:400); anticuerpo de ratón contra HA (Cell Signaling, 1:100). Anticuerpos secundarios: AlexaFluor®488, 568 o 633 (Life Technologies, 1:500-1:1000).
Cuantificación por el ensayo LIVE/DEAD®
Las neuronas primarias transducidas y de control se tiñeron utilizando el ensayo LIVE/DEAD® (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Para evitar interferencia con la señal de GFP procedente de la expresión de GFP-KASH, se tiñeron las células únicamente para DEAD (homodímero de etidio) y con DAPI (todas las células). Se obtuvieron imágenes de las células teñidas utilizando la microscopía de fluorescencia y se contaron las células positivas para DEAD, GFP y DAPI utilizando el software ImagerJ 1.48h y el programa adicional Neuron detector.
Análisis por inmunoelectrotransferencia
Las neuronas corticales primarias transducidas (24 pocillos, 7 días después del suministro vírico) y muestras de tejido transducido (4 semanas después del suministro vírico) se lisaron en 50 pL de tampón RIPA (Cell Signaling) enfriado en hielo que contenía un 0.1% de SDS e inhibidores de proteasas (Roche, Sigma). Se sonicaron los lisados celulares durante 5 min en un sonicador Bioruptor (Diagenode) y se determinó la concentración proteica utilizando el kit de Ensayo Proteico BCA (Pierce Biotechnology, Inc.). Se disolvieron los lisados proteicos en tampón de muestra de SDS-PAGE, se separaron en condiciones reductoras en geles con 4-15% de Tris-HCl (Bio-Rad) y se analizaron mediante inmunoelectrotransferencia utilizando los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo de conejo contra Dnmt3a (Santa Cruz, 1:500), anticuerpo de ratón contra Dnmt1 (Novus Biologicals, 1:800), anticuerpo de conejo contra Mecp2 (Millipore, 1:400), anticuerpo de conejo contra tubulina (Cell Signaling, 1:10 000) y a continuación los anticuerpos secundarios contra ratón y contra conejo con HRP (Sigma Aldrich, 1:10000). Se visualizó GAPDH directamente con un anticuerpo contra GAPDH acoplado con HRP de conejo (Cell Signaling, 1:10000). La tubulina o GAPDH sirvieron como control de carga. Se obtuvieron imágenes de las membranas de filtro con el sistema ChemiDoc™ MP con el software ImageLab 4.1 (Bio-Rad) y se cuantificó utilizando un software ImageJ 1.48h.
Condicionamiento de miedo contextual de huella (DCFC)
8 semanas después del suministro bilateral de 3xARNsg de DNMT/SpCas9 en el giro dentado dorsal y ventral de ratones macho C57BL/6N de 12 semanas de edad, se habituó a los animales al técnico y cuarto de comportamiento durante 7 días. Diferentes miembros de la misma camada inyectados con SpCas9/GFP-KASH sirvieron de controles. El día 1 de DCFC, las jaulas de los ratones se colocaron en una antecámara aislada para evitar que los ratones recibieran estímulos auditivos antes y después de las pruebas. Los ratones individuales se colocaron en la Cámara FC (Med Associates Inc.) y se llevó a cabo un periodo de habituación de 12 min. Después de la habituación, los ratones se colocaron de nuevo en sus jaulas. El día siguiente (día de entrenamiento) los ratones individuales se colocaron en la cámara y se permitió el habituamiento durante 4 min. Después de otro intervalo de 20 s (pretono), se presentó el tono (estímulo auditivo) con un nivel de 85 dB, 2.8 KHz durante 20 s seguido por un intervalo de huella de 18 s antes de presentar el choque en las patas (0.5 mA, 2 s). Después del choque en las patas, un intervalo de 40 s (postono/choque) precedió al siguiente ensayo idéntico que comenzó con el periodo de 20 s pretono. Se repitió el ensayo de entrenamiento 6 veces antes de colocar a los ratones de nuevo en sus jaulas. El día 3 (día de prueba) los ratones se colocaron en primer lugar en la cámara de contexto de condicionamiento durante 3 min. A continuación, se sometió los ratones a ensayos de prueba de 4 x 100 s que comenzaban con un intervalo de 20 s, seguido por un tono de 20 s y un intervalo postono de 60 s. Finalmente, los ratones se colocaron en una cámara de condicionamiento de contexto alterado (suelo plano vs rugoso, cámara tetramérica vs heptamérica, aroma de vanillina) y se repitió el ensayo de prueba. Se registró el comportamiento de inmovilización y se realizó un análisis con ocultación fuera de línea manualmente y se confirmó con el software Noldus EthoVision XT (Noldus Information Technology).
Análisis por secuenciación profunda y detección de indel
Se utilizó la Herramienta de Diseño CRISPR (http://crispr.mit.edu/) para detectar posibles sitios fuera de la diana para los genes de la familia DNMT, que son diana de CRISPR-SpCas9 en el cerebro. Los núcleos celulares diana del giro dentado se clasificaron mediante FACS 12 semanas después del suministro vírico y se purificó el ADN genómico tal como se ha descrito anteriormente. Para cada gen de interés, se amplificó la región genómica que flanquea el sitio diana de CRISPR mediante un método de PCR de fusión para incorporar los adaptadores Illumina P5 así como también códigos de barra específicos de la muestra únicos en los amplicones diana (para cebadores en y fuera de la diana remítase a la Tabla Suplementaria 3)15. Las muestras de ADN purificadas y con códigos de barras se cuantificaron mediante el Fluorómetro Qubit 2.0 (Life Technologies) y se combinaron en una proporción equimolar. Las colecciones de secuenciación se secuenciaron a continuación con el Secuenciador Personal MiSeq Illumina (Life Technologies) con una longitud de lectura de 300 pb.
Las lecturas de MiSeq se analizaron según se ha descrito previamente en15. Resumiendo, las lecturas se filtraron según la calidad Phred (calificación Q) y se alinearon utilizando un algoritmo Smith-Waterman con la región genómica 50 nucleótidos en dirección 5’ y en dirección 3’ respecto al sitio diana. Se estimaron los indel en la región alineada desde 5 nucleótidos en dirección 5’ hasta 5 nucleótidos en dirección 3’ respecto al sitio diana (30 pb en total). Se utilizaron controles negativos para cada muestra para estimar la inclusión o exclusión de indel como eventos de corte putativos. Los inventores computaron un estimador de máxima probabilidad (MLE) para la fracción de lecturas que tenía regiones diana con indel verdaderos, utilizando la tasa de error por-región-diana-por-lectura a partir de los datos de la muestra de control negativo. Las calificaciones MLE y las tasas de corte para cada diana se enumeran en la Tabla Suplementaria 1.
Análisis estadístico
Todos los experimentos se llevaron a cabo con un mínimo de dos réplicas biológicas independientes. Los estudios estadísticos se realizaron con Prism6 (GraphPad) utilizando la prueba de la t de Student bilateral.
TABLAS SUPLEMENTARIAS
Tabla Suplementaria 1. Análisis fuera de la diana para el direccionamiento a DNMT
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(SEQ ID NO: 221 a 238)
Tabla Suplementaria 2. Cebadores de PCR utilizados en el ensayo SURVEYOR
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Tabla Suplementaria 3. Cebadores utilizados para la amplificación de loci genómicos en y fuera de la diana
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Ejemplo 39: Investigación adicional acerca de la técnica de marcaje nuclear
Este Ejemplo se refiere al marcaje con epítopos de Cas9. Resumiendo, los autores observaron que un epítopo de identificación triple (específicamente 3xHA) mejora la señal de detección.
Materiales y Métodos
Cultivo y transfección celular
Se mantuvo una línea celular renal embrionaria humana (HEK) 293FT (Life Technologies) o una línea celular de ratón Hepa1-6 (Sigma-Aldrich) en Medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (HyClone), GlutaMAx 2 mM (Life Technologies), 100 U/mL de penicilina y 100 pg/mL de estreptomicina incubando a 37 °C con un 5% de CO2.
Se sembraron las células en placas de 24 pocillos (Corning) con una densidad de 120 000 células/pocillo, 24 horas antes de la transfección. Las células se transfectaron utilizando Lipofectamina 2000 (Life Technologies) con un 80-90% de confluencia siguiendo el protocolo recomendado por el proveedor. Para la transfección se utilizó un total de 500 ng de plásmido de Cas9 y 100 ng de U6-ARNsg del producto de PCR.
Ensayo con nucleasa SURVEYOR para la modificación genómica
Se transfectaron células 293FT y HUES62 con ADN tal como se ha descrito anteriormente. Se incubaron las células a 37 °C durante 72 horas después de la transfección antes de la extracción del ADN genómico. Se extrajo el ADN genómico utilizando la Solución de Extracción de ADN QuickExtract (Epicentre) siguiendo el protocolo del proveedor. Resumiendo, las células sedimentadas se resuspendieron en solución QuickExtract y se incubaron a 65 °C durante 15 minutos, 68 °C durante 15 minutos y 98 °C durante 10 minutos.
La región genómica que flanquea el sitio diana CRISPR para cada gen se amplificó por PCR y los productos se purificaron utilizando la columna QiaQuick Spin (Qiagen) siguiendo el protocolo del proveedor. Se mezclaron un total de 400 ng de los productos de PCR purificados con 2 microlitros de tampón para PCR de ADN polimerasa Taq 10x (Enzymatics) y agua ultrapura hasta un volumen final de 20 microlitros y se sometieron a un proceso de rehibridación para permitir que se formara un complejo heterobicatenario: 95 °C durante 10 min, de 95 °C a 85 °C con una rampa de -2 °C/s, de 85 °C a 25 °C a -0.25 °C/s, y se mantuvo a 25 °C durante 1 minuto. Después de la rehibridación, se trataron los productos con nucleasa SURVEYOR y potenciador SURVEYOR S (Transgenomics) siguiendo el protocolo recomendado por el proveedor y se analizó en geles de poliacrilamida Novex TBE al 4-20% (Life Technologies). Los geles se tiñeron con tinte oro para ADN SYBR (Life Technologies) durante 30 minutos y se obtuvieron imágenes con un sistema de obtención de imágenes en geles Gel Doc (Bio-rad). La cuantificación se basó en las intensidades de banda relativas. Se determinó el porcentaje de indel mediante la fórmula 100x(1-(1-(b+c)/(a+b+c))1/2), donde a es la intensidad integrada del producto de PCR no digerido y b y c son las intensidades integradas de cada producto escindido.
Inmunoelectrotransferencia
Se transfectaron células HEK 293FT y se lisaron con tampón RIPA 1X (Sigma-Aldrich) suplementado con inhibidor de proteasas (Roche). Los lisados se cargaron en geles Bolt Bis-Tris Plus al 4-12% (Invitrogen) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con solución salina tamponada con Tris que contenía un 0.1% de Tween-20 y un 5% de agente de bloqueo (G-Biosciences). Las membranas se exploraron con anticuerpo de conejo contra FLAG (1:5000, Abcam), anticuerpo contra GAPDH conjugado con HRP (1:5000, Cell Signaling Technology) y anticuerpos contra conejo conjugados con HRP (1:1000) y se visualizaron con un sistema Gel Doc XR+ (Bio-Rad).
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Claims (31)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende un sistema CRISPR-Cas para su uso en el tratamiento de un trastorno celular posmitótico seleccionado de la Tabla A o Tabla B; donde dicho sistema CRISPR-Cas comprende
una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de ubicación nuclear;
una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula eucariota posmitótica;
una secuencia pareja de tracr; y
una secuencia tracr;
o uno o más polinucleótidos que codifican dicha enzima CRISPR, dicha secuencia guía, dicha secuencia pareja de tracr, y dicha secuencia tracr.
2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:
I. una secuencia polinucleotídica que comprende:
(a) una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana de una célula posmitótica en una célula eucariota, (b) una secuencia pareja de tracr, y
(c) una secuencia tracr, y
II. una secuencia polinucleotídica que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de ubicación nuclear,
donde (a), (b) y (c) se disponen en una orientación de 5' a 3',
donde, cuando se transcriben, la secuencia pareja de tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica respecto a la secuencia de un complejo CRISPR con la secuencia diana, y
donde la secuencia polionucleotídica que codifica una enzima CRISPR es ADN o ARN.
3. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:
I. un polinucleótido que comprende:
(a) una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula eucariota, y
(b) al menos una o más secuencias parejas de tracr,
II. una secuencia polinucleotídica que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de ubicación nuclear, y
III. una secuencia polinucleotídica que comprende una secuencia tracr, donde, cuando se transcriben, la secuencia pareja de tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica respecto a la secuencia de un complejo CRISPR con la secuencia diana, y
donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia pareja de tracr que se hibrida con la secuencia tracr, y la secuencia polinucleotídica que codifica una enzima CRISPR es ADN o ArN.
4. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, 2 o 3, que comprende: un sistema de suministro configurado para suministrar un sistema CRISPR-Cas a una célula de un sujeto, que comprende: (a) un primer elemento regulador operable en la célula, ligado operablemente a una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia guía que se hibrida con una secuencia diana de ADN en la célula y (b) un segundo elemento regulador operable en la célula ligado operablemente a una secuencia polinucleotídica que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de ubicación nuclear, mediante el cual la secuencia guía se dirige a la secuencia diana en la célula.
5. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el sistema comprende un sistema vectorial y los polinucleótidos se ubican en el mismo o diferentes vectores.
6. La composición para su uso de la reivindicación 5, donde el sistema vectorial comprende uno o más vectores víricos.
7. La composición para su uso de la reivindicación 5 o 6, donde el sistema vectorial comprende uno o más lentivirus, uno o más adenovirus, uno o más virus adenoasociados o uno o más virus del herpes.
8. La composición para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, donde cada vector vírico está empaquetado en una partícula vírica.
9. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, donde al menos uno de los vectores comprende además un promotor para impulsar la expresión de la molécula de ácido nucleico que codifica la enzima CRISPr , y donde dicho promotor es para la expresión ubicua o para la expresión específica del tejido.
10. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde dicho promotor es para la expresión ubicua y se selecciona a partir del grupo constituido por CMV, CAG, CBh, PGK, SV40 y cadenas pesada o ligera de la ferritina.
11. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde dicho promotor es para la expresión específica del tejido y se selecciona a partir del grupo constituido por sinapsina I para todas las neuronas, CaMKIIalfa para las neuronas excitatorias, GAD67 o GAD65 o VGAT para las neuronas GABAérgicas, promotor de la albúmina para la expresión en el hígado, y OG-2 para los osteoblastos.
12. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, que comprende más de una secuencia guía y donde cada secuencia guía se dirige a una secuencia diana diferente.
13. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, que comprende además uno o más moldes de reparación.
14. La composición para su uso de la reivindicación 13, donde el uno o más moldes de reparación da como resultado una mutación que comprende una inserción, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos de dicha secuencia diana.
15. La composición para su uso de la reivindicación 14, donde dicha mutación da como resultado uno o más cambios de aminoácidos en una proteína expresada a partir de la secuencia diana.
16. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 15, donde la enzima CRISPR comprende una Cas9.
17. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 16, donde dicha Cas9 es SaCas9 y donde dicho sistema vectorial comprende un único vector vírico que es un vector AAV.
18. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 17, donde la enzima CRISPR comprende una o más mutaciones.
19. La composición para su uso de la reivindicación 18, donde la una o más mutaciones se seleccionan a partir del grupo constituido por D10A, H840A, N854A, N863A en referencia con la numeración de las posiciones de una proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9); o la enzima CRISPR comprende una o más mutaciones en un dominio RuvC1 de la enzima CRISPR.
20. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 19, donde la enzima CRISPR es una nickasa.
21. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, donde el sistema CRISPR-Cas incluye un dominio funcional.
22. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, donde el sistema CRISPR-Cas incluye un dominio activador.
23. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, donde las células son células del cerebro, células del riñón células del corazón, células del sistema digestivo, células del pulmón, células del ojo, células del oído, células de la piel, células de los músculos, células de los huesos o células del hígado.
24. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, donde las células son células inmunitarias.
25. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la composición es terapéutica para una enfermedad, trastorno o indicación de la Tabla A o Tabla B o una función celular o gen de la Tabla C.
26. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para su uso en el tratamiento de afecciones o enfermedades genéticas provocadas por un genotipo deficiente en las células posmitóticas o asociadas con este.
27. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la composición es terapéutica para: un trastorno de repeticiones de trinucleótidos; un trastorno o enfermedad metabólico, del hígado, del riñón o proteico; un trastorno o enfermedad muscular o esquelético; un trastorno o enfermedad neurológico o neuronal; un trastorno o enfermedad oncológico o de desregulación celular; un trastorno o enfermedad sanguíneo o de coagulación; un trastorno o enfermedad relacionado con la inflamación o el sistema inmunitario; o un trastorno o enfermedad ocular.
28. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la célula está ex vivo.
29. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, donde el sistema de suministro comprende un liposoma, partícula, exosoma o microvesícula.
30. Un método in vitro para modificar una célula posmitótica manipulando una secuencia diana en un locus genómico de interés, para provocar de esta manera un cambio fenotípico en la célula, que comprende
suministrar a dicha célula posmitótica una composición modificada o que no tiene un origen natural que comprende:
I. una secuencia polinucleotídica que comprende:
(a) una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula eucariota posmitótica,
(b) una secuencia pareja de tracr, y
(c) una secuencia tracr, y
II. una secuencia polinucleotídica que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de ubicación nuclear,
donde (a), (b) y (c) se disponen en una orientación de 5' a 3',
donde, cuando se transcriben, la secuencia pareja de tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica respecto a la secuencia de un complejo CRISPR con la secuencia diana, y
donde la secuencia polinucleotídica que codifica una enzima CRISPR es ADN o ARN
31. Un método in vitro para modificar una célula posmitótica manipulando una secuencia diana en un locus genómico de interés, para provocar de esta manera un cambio fenotípico en la célula, que comprende
suministrar a dicha célula posmitótica una composición modificada o que no tiene un origen natural que comprende:
I. un polinucleótido que comprende:
(a) una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula eucariota posmitótica, y
(b) al menos una o más secuencias parejas de tracr,
II. una secuencia polinucleotídica que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de ubicación nuclear, y
III. una secuencia polinucleotídica que comprende una secuencia tracr, donde, cuando se transcriben, la secuencia pareja de tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica respecto a la secuencia de un complejo CRISPR con la secuencia diana, y donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia pareja de tracr que se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia polionucleotídica que codifica una enzima CRISPR es ADN o ARN.
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