CN109971755B - 一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的靶向肿瘤的基因治疗药物及其用途 - Google Patents
一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的靶向肿瘤的基因治疗药物及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9系统的特异性靶向人DNMT1基因的sgRNA，及其在指导CRISPR/Cas9系统在治疗和/或预防肿瘤药物中的用途，及对应构建所述sgRNA表达载体的方法，所述的CRISPR/Cas9系统可以快速高效、特异性敲除人DNMT1基因，促使肿瘤细胞中DNMT1基因失活，抑制DNMT1的表达及其对DNA的甲基化作用，从而抑制肿瘤细胞生长。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学与生物医学技术领域，特别涉及基于CRISPR/Cas9系统的特异性靶向人DNMT1基因的sgRNA，及其CRISPR/Cas9载体，以及该特异性靶向敲除DNMT1基因的CRISPR/Cas9系统在制备为肿瘤基因治疗药物中的用途。
背景技术
恶性肿瘤是当前危害人类健康的主要疾病之一。据目前最新癌症统计学数据显示，全球癌症患者每年新发病例为1700万，死亡人数为900万例；2015年我国癌症新发病例数及死亡人数分别为429.2万例和281.4例，发病率也呈明显年轻化趋势。虽然过去20～30年间，传统治疗手段包括放射治疗、化学治疗和手术治疗不断发展，在癌症的治疗中取得了一定疗效，但是新的治疗药物以及新技术的应用仍未能改善癌症患者生存质量和提高患者生存期。
基因治疗是指通过操作遗传物质(包括人类自身的或外源的)来干预疾病的发生、发展和进程，包括替代或纠正人自身基因结构或功能上的错乱、杀灭病变的细胞或增强机体清除病变细胞的能力等。基因治疗能从根本上治愈一些现有的常规疗法所不能解决的疾病，在疾病的治疗和预防方面发挥着重要作用。因此，基因治疗作为肿瘤治疗的新兴手段之一，与传统治疗方式相比，具有显著的优越性。多数基因治疗药物具有良好的安全性、抑瘤率较高，受试个体耐受性好、存活率高，因此有望作为术后放化疗的替代治疗，或者与一线化疗药物联用，以降低化疗药物的治疗剂量和毒副作用，提高癌症的治疗效果。
肿瘤基因治疗的核心是利用载体系统向机体导入具有功能性的基因或导入 RNA等，以抑制肿瘤相关基因的表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡、增强其对放化疗的敏感性，或者提高机体对肿瘤细胞特异性免疫应答能力。
表观遗传学调控机制的改变，例如DNA甲基化，与多种癌症的发生和进展相关。DNA甲基化反应是指在DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase， DNMT)的催化下，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)分子上的甲基基团被转移到胞苷的嘧啶环第5位碳原子上，形成甲基化胞嘧啶。哺乳动物中DNA甲基化修饰通常发生在5’-CpG-3’序列的胞嘧啶，基因组中富含CpG序列的部位称为CpG岛，多位于某些启动子区、第一外显子和基因3’-末端。CpG岛的胞嘧啶甲基化后，突入DNA主沟内，阻碍转录因子与启动子结合而抑制转录；也可通过募集甲基化 CpG结合蛋白(MeCP)结合在甲基化的CPG岛上，使染色质结构紧密，阻止转录因子与启动子结合，从而阻碍转录。由此可见，DNA的甲基化与基因的转录呈负相关，甲基化程度越高，基因的表达越低。研究发现，肿瘤细胞中的部分抑癌基因启动子区域CpG岛过度甲基化，导致抑癌基因不表达，进而促使肿瘤的发生和发展。DNA甲基转移酶作为DNA甲基化过程中关键的酶，目前哺乳动物中DNMT家族有5个成员，分别是DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和 DNMT3L。然而只有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B 3种酶具有甲基转移活性，其中DNMT1在哺乳动物中的含量最高，是调节DNA甲基化最重要的酶，主要在细胞分裂过程中参与甲基化的维持性，可以在甲基化的DNA模板指导下使新合成的DNA链发生甲基化。已经证明在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、宫颈癌、白血病等多种人恶性肿瘤中DNMT1的表达异常增高，且通过DNMT1介导的基因失活促使肿瘤的进展。
因此，调控肿瘤细胞DNMT1已成为近年肿瘤治疗研究的热点和趋势。目前，靶向DNMT1的小分子抑制，如5-氮杂胞苷和地西他滨，作为骨髓增生异常综合征(MDS)的一线用药，尽管在临床治疗中取得了一定疗效，但治疗过程中选择性差，毒性大，以及仅对小部分患者有效等问题，因此，亟需开发针对DNMT1 疗效更为明确的基因治疗药物。由于传统的肿瘤基因治疗药物缺乏对目的基因进行持久、特异性的作用，限制其在临床中的广泛应用。
近年来，寻找特异高效修复的基因打靶工具在肿瘤基因治疗领域中备受关注，基因编辑技术的出现和应用为肿瘤基因治疗提供了强有力的手段。以锌指核酸酶 (ZFN)、Tale样转录因子核酸酶Talen和CRISPR(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，规律成簇间隔短回文重复序列)/Cas9(CRISPR associatednuclease 9，CRISPR相关蛋白核酸酶9)为代表基因编辑技术能够在基因组上任意位点进行突变和修饰，但是ZFN和TALEN的筛选以及组装过程存在着较高的技术难度，筛选的工作量很大，且这两种技术潜在的细胞毒性；与ZFN和 TALEN相比，CRISPR/Cas9系统中Cas9核酸酶对DNA序列的识别更精确，降低了脱靶几率，减低了细胞毒性，同时CRISPR/Cas9系统的人工构建只需要设计与靶序列互补的gRNA即可，操作更简便，成本更低廉，大大提高了基因编辑的效率及获得性，因此，CRISPR/Cas9系统目前已成为基因编辑技术的首选，可用于肿瘤基因治疗的研究中。
CRISPR是细菌和古细菌基因组中一个含有多个短重复序列的位点，具有免疫保护作用。CRISPR/Cas9系统主要依赖gRNA(guide RNA，包括crRNA、 tracrRNA)和Cas9核酸酶来特异性降解入侵的外源DNA。在人工构建的 CRISPR/Cas9系统中，主要有两个成分：引导RNA(guide RNA)和Cas9核酸酶。引导RNA包含两个组分，即骨架RNA(trans-activating crRNA，tracrRNA) 和识别RNA(CRISPR RNA，crRNA)，前者用以结合Cas9核酸酶，后者用以识别DNA靶序列。具体表现为，CRISPR/Cas9基因编辑技术通过gRNA与靶基因互补配对，引导Cas9核酸酶在靶基因下游的前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)前剪切，产生一个双链的切口(double strand breaks，DSBs)。在哺乳动物细胞中，绝大多数由CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑所产生的DSBs 由非同源末端连接(nonhomologous end-joining，NHEJ)修复，导致目标基因处出现插入和缺失(insertion and deletion，INDEL)突变。INDEL突变能够在编码区造成移码突变，进而干扰编码区基因转录和翻译，最终实现敲除特定目标基因的目的。目前，人工构建的CRISPR/Cas9系统中已经把crRNA和tracrRNA融合成一条RNA链，简称sgRNA(single guide RNA)。由此可见，sgRNA是否能够精确靶向目标基因是CRISPR/Cas9系统能否特异性敲除目标基因的先决条件。脱靶和错误靶向都会影响CRISPR/Cas9系统对目标基因特异性敲除的效率。可知，设计并制备得到精确特异靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR/Cas9系统基因敲除的关键性技术。
中国专利文献CN104971361A公开了CRISPR/Cas9技术靶向编辑人DNMT1 基因及其在治疗肿瘤中的用途，但是所涉及的sgRNA以及将所述sgRNA装载到所述的质粒载体后不能有效持久稳定的靶向敲除肿瘤细胞DNMT1基因，进而难以实现稳定的治疗效果。
因此，目前亟需开发一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的高效稳定地靶向敲除肿瘤细胞DNMT1基因的系统。
发明内容
本发明从解决现有技术的不足出发，发明了基于CRISPR/Cas9系统的特异性靶向人DNMT1基因的sgRNA，及其CRISPR/Cas9载体，可快速高效、特异性敲除人DNMT1基因，促使肿瘤细胞中DNMT1基因失活，抑制DNMT1的表达及其对DNA的甲基化作用，从而抑制肿瘤细胞生长，因此，该特异性靶向敲除DNMT1基因的CRISPR/Cas9系统可作为一种全新的肿瘤基因治疗药物应用于肿瘤靶向治疗中。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明的第一个目的在于提供了一种结合于人DNMT1基因靶序列的 sgRNA寡核苷酸。
上述sgRNA寡核苷酸(实则为靶序列+crRNA+tracrRNA)结合在人DNMT1 基因靶序列的规律为5’-GN(18-21)GG，其中3’-NGG为PAM。所述sgRNA的靶位点设计是基于spCas9(Streptococcus pyogenes Cas9，酿脓葡萄球菌Cas9)核酸内切酶识别靶位点的特征和U6启动子的转录特点。
一方面，由于SpCas9核酸内切酶识别靶序列的特征是靶位点3’端具有一个 NGG基序(即PAM，其中N为任意碱基)，且识别的靶序列长度一般在20bp左右，有助于spCas9核酸内切酶的靶向识别和保证靶向切割的效率，因此，所述的靶向人DNMT1基因的sgRNA长度一般为17-25bp。PAM位于DNA靶序列的3’端，是Cas9蛋白识别靶序列的必要条件之一，spCas9核酸内切酶在PAM 前第三位碱基处剪切，产生双链DNA断裂(Double Strand Breaks，DSBs)。另一方面，sgRNA的转录采用U6启动子控制，U6启动子转录通常以G作为起始碱基进行转录，因此在sgRNA将G作为起始碱基，有利于U6启动子正常工作。
上述sgRNA与人DNMT1基因上的靶位点结合区域为人DNMT1保守结构域基因组，优选的结合区域为人DNMT1保守结构域——甲基转移酶结构域，即人DNMT1基因的第31和32外显子。
所述的sgRNA与人DNMT1基因第31和32外显子结合，可尽可能最大程度破坏人DNMT1的活性。由于sgRNA/spCas9所诱导的靶基因插入和缺失 (insertion and deletion，INDEL)突变发生在人DNMT1保守结构域甲基转移酶结构域中，所产生的基因突变中2/3概率的移码突变将导致人DNMT1的整个结构域缺失，而1/3概率的非移码突变也会严重破坏人DNMT1的活性。
所述sgRNA的5’端含有17-25bp碱基序列，优选18-21bp，可与人DNMT1 基因靶序列结合，该结合区且刚好位于人DNMT1保守结构区基因PAM序列3’端上游；此外，所述sgRNA的5’端含有1个碱基G，可提高sgRNA与转录效率。
因此，利用在线软件(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)，同时辅以人工检查，共设计出35个靶向人DNMT1基因组第31和第32外显子的sgRNA，其碱基序列如SEQ ID NO.:1-7所示。
所述的sgRNA与SpCas9核酸内切酶进一步构成的sgRNA/SpCas9系统，通过所述sgRNA特异性靶向于人DNMT1保守的甲基转移酶结构域，SpCas9核酸内切酶在靶位点处进行剪切，产生DSBs，导致人DNMT1保守结构域失活，抑制肿瘤细胞中DNMT1的过度表达和CpG岛过度甲基化，进而抑制与肿瘤发生、发展相关的调节蛋白基因的复制转录，以达到抑制肿瘤细胞生长的目的。
本发明的第二个目的在于提供了一系列靶向人DNMT1保守结构域的 sgRNA序列、及其非病毒表达载体和sgRNA/Cas9质粒，所述的非病毒载体是 Cas9质粒载体。
所述的Cas9质粒载体是SpCas9质粒载体，选自PX330、PX458、PX459、 PX460、PX461或PX462，优选的，所述Cas9质粒载体是PX330或PX459。
所述的SpCas9质粒载体包含SpCas9表达元件和sgRNA表达元件，当表达的sgRNA靶向结合于人DNMT1基因时，与其它类型的Cas9核酸内切酶相比， SpCas9核酸内切酶可高效介导靶基因发生NHEJ，导致目标基因处出现缺失/插入突变(INDEL)突变，进而造成人DNMT1基因靶位点处发生移码突变，干扰其基因转录和翻译，最终实现高效率敲除人DNMT1基因的目的。
进一步的，PX330或PX459质粒载体除含有常规的质粒载体构成元件(如 U6启动子、CBh启动子和核定位信号NLS等)之外，只包含SpCas9表达元件和sgRNA表达元件，其中sgRNA表达元件含有与靶基因结合的sgRNA和由 crRNA与tracrRNA融合形成的嵌合gRNA(chimeric guide RNA)，较分别含有 tracrRNA表达元件和crRNA表达元件的质粒载体或只含有SpCas9表达元件的质粒载体具有更高效的靶向敲除靶标基因的作用。
所述的sgRNA/Cas9质粒是将上述sgRNA制备为双链寡聚核苷酸后装载到 Cas9质粒载体中构建而成的。所述的sgRNA/Cas9质粒在肿瘤细胞中可以持续稳定地表达sgRNA和SpCas9核酸内切酶，在sgRNA准确高效的特异性识别人 DNMT1基因、结合SpCas9核酸内切酶以及SpCas9核酸内切酶对靶基因切割的共同作用下，实现对人DNMT1基因特异性敲除使其失活。
进一步的，将所述的sgRNA装载到PX330或PX459质粒载体构建得到的 sgRNA/Cas9质粒所表达的sgRNA可以靶向于人DNMT1基因座，以及连同 SpCas9核酸内切酶共同作用，使得所述的sgRNA/Cas9质粒具有高效靶向敲除该目的基因的特性。
本发明的第三个目的在于提供了一种靶向敲除人DNMT1基因的sgRNA/Cas9质粒的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)线性Cas9质粒载体的制备：Cas9质粒载体在反应体系中经酶切后形成线性Cas9质粒载体；
(2)sgRNA双链寡聚核苷酸的制备：
a.根据酶切方式，在上述筛选得到的sgRNA及其互补链的5’端添加合适的接头，并分别合成sgRNA的正向寡核苷酸(forward oligo)和反向寡核苷酸 (reverse oligo)；
b.将上述步骤a中制备得到的sgRNA正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，在反应体系中进行磷酸化，然后经过变性、退火，制备为可以载入到上述步骤(1) 所得到的线性Cas9质粒载体中的双链寡聚核苷酸。
(3)将步骤(2)制备得到的sgRNA双链寡聚核苷酸在反应体系中通过连接酶连接到上述步骤(1)制备得到的线性Cas9质粒载体中，得到sgRNA/Cas9 质粒。
(4)将上述步骤(3)制备得到的sgRNA/Cas9质粒在感受态细胞中进行转化，PCR法筛选阳性克隆，以及利用U6启动子进行测序验证。
所述步骤(1)中反应体系由限制性内切酶、缓冲液和余量双蒸水组成，所述的Cas9质粒载体选自SpCas9质粒载体，选自PX330、PX458、PX459、PX460、 PX461或PX462中的一种，优选的Cas9质粒载体为PX330或PX459；所述的限制性内切酶是BbsⅠ酶。
所述步骤(2)的步骤a中酶切方式采用的是BbsⅠ酶切方式，在所述的sgRNA 5’端所添加的接头是CACC，合成得到sgRNA正向寡聚核苷酸；在所述的sgRNA 互补链的5’端所添加的接头是AAAC，合成得到反向寡聚核苷酸。
所述步骤(2)的步骤b中反应体系由等体积等浓度的上述步骤a合成得到的sgRNA正向寡聚核苷酸和反向寡聚核苷酸、缓冲液、T4多聚核苷酸激酶(T4 PolynucleotideKinase，T4PNK)和余量的双蒸水组成，所述的磷酸化是通过T4 PNK的作用分别将上述步骤a中合成得到的sgRNA正向寡聚核苷酸和反向寡聚核苷酸的5’端磷酸化，以利于连接反应。所述的变性，条件为95℃，5min；所述的退火，条件是温度缓慢降至37～40℃。所述的双链寡聚核苷酸如下：
正向寡聚核苷酸(forward oligo)：5’-CACCGN(18-21)-3’
反向寡聚核苷酸(reverse oligo)：3’-CN(18-21)CAAA-5’
所述步骤(3)中反应体系由步骤(1)制备得到的线性Cas9质粒载体、步骤(2)制备得到的sgRNA双链寡聚核苷酸、缓冲溶液和连接酶组成，所述的线性Cas9质粒载体的质量为20～50ng，优选20～30ng；所述的sgRNA双链寡聚核苷酸是经稀释后的，其稀释倍数为1:100～1:200，优选1:100；所述的连接酶为T4 连接酶。
所述步骤(4)中感受态细胞选自Top10或DH5a细胞。
本发明的第四个目的在于提供了一种包括上述sgRNA/Cas9质粒和传输载体的靶向敲除人DNMT1基因的复合物，所述的传输载体与所述的sgRNA/Cas9质粒可以通过静电吸附或物理包裹形成所述的复合物。
所述的传输载体包含脂质体、胶束、纳米粒的一种或多种。其中，所述的脂质体选自阳离子脂质体、中性脂质体、阴性脂质体；所述的胶束载体材料选自商品化的辅料如泊洛沙姆、磷脂等，或PEG与聚酯类的嵌段共聚物(包括：PEG- PCL、PEG-PLA、PEG-PLGA、PEG-PCL-PEG、PEG-PLA-PEG、PEG-PLGA-PEG、 PCL-PEG-PCL、PLA-PEG-PLA、PLGA-PEG-PLGA)，或新设计合成的聚合物载体，或新设计的载体以及内源性成分的衍生物中的一种或几种；所述的纳米粒载体材料可选用商品化的辅料如PLGA、PLA、壳聚糖、透明质酸、PEI等或其衍生物，或PEG与聚酯类的嵌段共聚物(包括PEG-PCL、PEG-PLA、PEG-PLGA、 PEG-PCL-PEG、PEG-PLA-PEG、PEG-PLGA-PEG、PCL-PEG-PCL、PLA-PEG-PLA、 PLGA-PEG-PLGA)，或新设计合成的聚合物载体，或新设计的载体以及内源性成分的衍生物中的一种或几种。
本发明的第五个目的在于还提供了上述sgRNA/Cas9质粒或上述复合物在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的用途。
其中，所述的肿瘤可以选自高表达人DNMT1的卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、宫颈癌、白血病等，优选所述的肿瘤是卵巢癌、宫颈癌或乳腺癌，更优选所述的肿瘤是卵巢癌。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
(1)提供了一种高效且特异性结合于人DNMT1保守功能结构域(具体作用靶点位置：DNMT1：500-600bp)的sgRNA，所述的sgRNA序列可提升Cas9 核酸内切酶靶向切割目标基因DNMT1的效率。
(2)提供了一种靶向敲除人DNMT1基因的Cas9质粒载体，所述的质粒载体具有Cas9核酸内切酶瞬时表达的特性，降低了spCas9-DNMT1表达质粒载体的毒性；所述的Cas9质粒载体编码Cas9核酸酶的N末端和C末端的核苷酸序列上添加NLS(核定位信号)序列时可获得最佳细胞核定位；所述的Cas9质粒载体具有更高效的靶向敲除靶标基因的作用。
(3)提供了一种靶向敲除人DNMT1基因的sgRNA/Cas9质粒，所述的 sgRNA/Cas9质粒可以持续稳定地表达sgRNA和SpCas9核酸内切酶，在sgRNA 准确高效得特异性识别人DNMT1基因、结合SpCas9核酸内切酶以及SpCas9核酸内切酶对靶基因切割的共同作用下，实现对人DNMT1基因特异性敲除使其失活。
(4)提供了一种靶向敲除人DNMT1基因的sgRNA/Cas9质粒的制备方法，采用所述制备方法得到的sgRNA/Cas9质粒通过在肿瘤细胞中表达的sgRNA特异性结合于目的基因DNMT1上，在SpCas9核酸内切酶的作用下高效敲除 DNMT1基因，促使肿瘤细胞中DNMT1基因失活，抑制DNMT1的表达及其对 DNA的甲基化作用，从而抑制肿瘤细胞生长。
(5)提供了一种靶向敲除人DNMT1基因的sgRNA/Cas9质粒在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的用途，所述的sgRNA/Cas9质粒在卵巢癌细胞中可稳定敲除DNMT1基因，具有较高的抑瘤率。
(6)提供了一种包含靶向敲除人DNMT1基因的sgRNA/Cas9质粒和传输载体的复合物，所述的复合物不仅可以直接通过传输载体提高sgRNA/Cas9质粒进入肿瘤细胞的转染效率，而且有利于sgRNA/Cas9质粒在肿瘤细胞中特异性敲除人DNMT1基因的效率，抑制人DNMT1酶活性，达到抗肿瘤的目的。
(7)提供了一种靶向敲除人DNMT1基因的复合物在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的用途，所述的复合物中的sgRNA/Cas9质粒在卵巢癌细胞中可稳定敲除DNMT1基因，具有较高的抑瘤率。
附图说明：
图1 PX330质粒载体的表达元件示意图。
图2 Nci1酶切验证PX459-DNMT1-1质粒介导的对SKOV3细胞DNMT1 基因的靶向切割作用。其中，对照组：PX459空载质粒；DNMT1sgRNA1-1、 DNMT1sgRNA1-2和DNMT1sgRNA1-3表示PX459-DNMT1-1质粒。
图3 Sanger测序法验证PX459-DNMT1-1质粒介导的对SKOV3细胞 DNMT1基因的靶向切割作用。
图4 T7E1限制性酶切法验证sgRNA-DNMT1-4/Cas9系统介导的对 SKOV3细胞DNMT1基因的靶向切割作用。其中，对照组是PX459空载质粒， DNMT1sgRNA4是PX459-DNMT1-4质粒。
图5 Sanger测序法验证sgRNA-DNMT1-4/Cas9系统介导的对SKOV3细胞DNMT1基因的靶向切割作用。
图6 sgRNA/Cas9质粒转染卵巢癌细胞株Ho8910pm 24h、48h和72h后， MTT法检测经两种sgRNA/Cas9质粒分别转染后的Ho8910PM细胞相对于Cas9 空载质粒转染Ho8910PM细胞的增殖抑制率。其中，DNMT1sgRNA-1是PX330- DNMT1-1质粒；DNMT1sgRNA-4是PX330-DNMT1-4质粒；Cas9空载质粒是 PX330质粒载体。
图7 sgRNA/Cas9质粒转染SKOV3细胞24h、48h和72h后，MTT法检测经两种sgRNA/Cas9质粒分别转染后的SKOV3细胞相对于Cas9空载质粒转染SKOV3细胞的增殖抑制率。其中，DNMT1sgRNA-1是PX330-DNMT1-1质粒；DNMT1sgRNA-4是PX330-DNMT1-4质粒；Cas9空载质粒是PX330质粒载体。
图8 Sanger测序法验证sgRNA-DNMT1-27/Cas9系统介导的对SKOV3细胞DNMT1基因的靶向切割作用。
图9 Sanger测序法验证sgRNA-DNMT1-28/Cas9系统介导的对SKOV3细胞DNMT1基因的靶向切割作用。
图10 qPCR法检测PX260-DNMT4质粒对SKOV3细胞DNMT1基因的敲除活性。
图11 qPCR法检测PX330-DNMT-1-1质粒对SKOV3细胞DNMT1基因的敲除活性。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。
实施例1、CRISPR-Cas9特异性敲除人DNMT1基因中用于特异性靶向 DNMT1基因的sgRNA的设计
1、在人DNMT1基因上选择5’-GN(18-21)GG，其中3’-NGG为PAM，因此，靶向人DNMT1基因的sgRNA长度为18～21bp。
2、在设计sgRNA时，5’端以G作为起始碱基。
3、sgRNA在人DNMT1基因上的靶位点结合区域为该基因的保守结构域甲基转移酶结构域，即人DNMT1基因组的第31和32外显子。
4、利用在线软件(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)，同时辅以人工检查，共设计出35个靶向人DNMT1基因组第31和第32外显子的sgRNA，其中具有靶向敲除人DNMT1基因的sgRNA其碱基序列如SEQ ID NO.:1-7所示。
实施例2、靶向人DNMT1基因的sgRNA质粒载体的构建：
1、线性PX330质粒载体的制备：
反应体系如下所示：
PX330质粒载体:3μg
BbsⅠ酶：2μl
缓冲液：2μl
双蒸水体积：20μl
反应体系中，PX330质粒载体经BbsⅠ酶切过夜后形成线性PX330质粒载体。采用同样的方法可以制备得到线性PX459制粒载体。
2、靶向人DNMT1基因的sgRNA寡聚核甘酸的设计和双链制备
(1)在实施例1中所设计的sgRNA中选择2个(分别如序列表SEQ ID NO:1 或4所示)，根据上述步骤1质粒载体所采用的BbsⅠ酶切方式，在所选择的2 个sgRNA的5’端分别添加接头CACC得到正向寡核苷酸(Forward oligo)；根据选择的sgRNA，获得其互补链，且在互补链的5’端加上接头AAAC得到反向寡核苷酸(Reverse oligo)。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸。
(2)将上述步骤(1)中制备得到的sgRNA正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，在反应体系中经T4PNK酶37℃处理30min，在95℃下成对变性5min，然后每分钟降温5℃逐渐退火至40℃或室温，制备为可以载入到上述步骤(1)所得到的线性PX330质粒载体中的双链寡聚核苷酸，其结构如下：
●正向寡聚核苷酸(forward oligo)：5’-CACCGN(18-21)-3’
●反向寡聚核苷酸(reverse oligo)：3’-CN(18-21)CAAA-5’
其中，所述的反应体系如下：
4μl sgRNA正向寡聚核苷酸(20μM)
4μl sgRNA反向寡聚核苷酸(20μM)
1μl T4连接酶缓冲液
0.5μl T4PNK
0.5μl ddH2O
反应体系总体积为10μl。
所述的反应体系还可以是：
1μl sgRNA正向寡聚核苷酸(100μM)
1μl sgRNA反向寡聚核苷酸(100μM)
1μl T4连接酶缓冲液
0.5μl T4PNK
6.5μl ddH2O
反应体系总体积为10μl。
3、将步骤2制备得到的sgRNA双链寡聚核苷酸稀释100倍后，在反应体系中通过T4连接酶连接到上述步骤1制备得到的线性PX330质粒载体质粒载体中，连接过夜后，得到sgRNA/Cas9质粒。
其中，所述的反应体系如下：
1μl线性PX330质粒载体(20～30ng)
0.5μl T4缓冲液
0.5μl T4连接酶
0.5ul sgRNA双链寡聚核苷酸
2.5μl ddH2O
反应体系总体积为5μl。
4、将上述步骤3制备得到的sgRNA/Cas9质粒在Top10或DH5a感受态细胞中进行转化，培养过夜后，PCR挑选阳性克隆，并将阳性克隆和可疑阳性克隆测序验证，核苷酸序列正确的sgRNA/Cas9质粒克隆分别命名为PX330-DNMT1- 1(其中，sgRNA序列如SEQ ID NO:1所示)，PX330-DNMT1-4(其中，sgRNA 序列如SEQ ID NO:4所示)。
采用相同的方法，可以制备得到PX459-DNMT1-1(其中，sgRNA序列如 SEQ ID NO:1所示)和PX459-DNMT1-4(其中，sgRNA序列如SEQ ID NO:4所示)。
实施例3、Nci1酶切和Sanger测序法验证sgRNA/Cas9介导的对SKOV3细胞DNMT1基因的靶向切割
1、SKOV3细胞铺板培养：
将处于对数生长期的SKOV3细胞制备为细胞悬液，并用10％FBS-1640稀释至5×104cells/ml，以100μl/孔接种至细胞培养96孔板，37.0℃，5％CO2条件下培养24h。细胞贴壁后，再更换无血清1640培养基饥饿培养24h。
2、脂质体转染法：
将实施例2构建得到的PX459-DNMT1-1质粒(sgRNA的序列：SEQ ID NO:1) 用脂质体转染法(如：转染试剂lipo2000)转染至步骤1培养的SKOV3细胞中，对照组为PX459空载质粒载体转染SKOV3细胞，在37℃下孵育24h。
3、用嘌呤霉素筛选阳性细胞，48h后收集细胞，抽提细胞基因组DNA。
4、PCR扩增：
以步骤3得到的DNA为模板，使用正向引物1(AGGCAGAGCTTGCAGTGAG) 和反向引物2(CAGGGCGAAAATGACCAC)，按下述条件进行PCR扩增，得到包含DNMT1基因所在片段的PCR扩增产物。
其中，扩增体系为50μl：
基因组模板1μl
10×PCR buffer 5μl
Taq聚合酶0.5μl
2.5mM dNTP 4μl
10uM正反向引物各1μl
双蒸水37.5μl
扩增条件为：
5、对PCR产物进行Nci1限制性酶切
PCR产物 5ul
Buffer 1.5ul
Nci1酶 1ul
双蒸水 12.5ul
总酶切体系 20ul，酶切2小时后用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
检测结果如图2所示，可以看出对照组PX459空载质粒转染的SKOV3细胞 DNA的PCR产物能被Nci1酶切完全，而转染PX459-DNMT1-1质粒的SKOV3 细胞DNA的PCR产物，有一部分不能被酶切，表明DNMT1基因存在突变，根据酶切条带灰度值分析计算DNMT1基因的突变率约为30-50％。
6、Sanger测序分析：
将上述步骤4扩增得到的PCR产物，以正向引物为测序引物进行Sanger测序分析。
图3是经PX459-DNMT1-1质粒转染的SKOV3细胞的PCR产物的结果，可以看出在SEQID NO:1所示的sgRNA作用位点附近出现套峰，表明DNMT1基因存在插入或者缺失突变。
在后续进一步的试验中，将序列如SEQ ID NO:2、3、5-7所示的sgRNA装载到PX330、PX458、PX459、PX460、PX461或PX462构建得到的sgRNA/Cas9 质粒，以及将序列如SEQ IDNO:1和4所示的sgRNA装载到PX458、PX460、 PX461或PX462构建得到的sgRNA/Cas9质粒也表现为基本一致的活性。
实施例4、T7E1酶切和Sanger测序法验证sgRNA/Cas9介导的对SKOV3细胞DNMT1基因的靶向切割
1、SKOV3细胞铺板培养：
将处于对数生长期的SKOV3细胞制备为细胞悬液，并用10％FBS-1640稀释至5×104cells/ml，以100μl/孔接种至细胞培养96孔板，37.0℃，5％CO2条件下培养24h。细胞贴壁后，再更换无血清1640培养基饥饿培养24h。
2、脂质体转染法：
将实施例2构建得到的PX459-DNMT1-4质粒(sgRNA的序列：SEQ ID NO:4) 用脂质体转染法(如：转染试剂lipo2000)转染至步骤1培养的SKOV3细胞中，对照组为PX459空载质粒载体转染SKOV3细胞，在37℃下孵育24h。
3、用嘌呤霉素筛选阳性细胞，48h后收集细胞，抽提细胞DNA。
将收集的细胞在裂解液(10μM Tris-HCl,0.4M NaCl,2μM EDTA,1％SDS) 中用100μg/ml蛋白酶K裂解消化后，直接作为SKOV3细胞基因组模板。
4、PCR扩增：
同实施例4所述的PCR扩增方法
5、T7E1限制性酶切检测：
在含有步骤4的PCR产物体系(20μl)，37℃酶切30min后，加入2μl 10× LoadingBuffer，用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
酶切体系：
PCR产物 10μl
Buffer 1μl
酶 0.5μl
双蒸水 8.5μl
总酶切体系 20μl，酶切2小时后用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
检测结果如图4所示，转染PX459空载质粒载体的SKOV3细胞DNA的PCR产物不能被T7E1特异性酶切，而转染PX459-DNMT1-4质粒的SKOV3细胞DNA的PCR产物，有一部分能被T7E1特异性酶切，表明DNMT1基因存在缺失/插入突变。
6、Sanger测序分析：
将上述步骤4扩增得到的PCR产物，以正向引物为测序引物进行Sanger测序分析。
图5是经PX459-DNMT1-4质粒转染的SKOV3细胞的PCR产物的结果，可以看出在SEQID NO:4所示的sgRNA作用位点附近出现套峰，表明DNMT1基因存在插入或者缺失突变。
在后续进一步的试验中，将序列如SEQ ID NO:2、3、5-7所示的sgRNA装载到PX330、PX458、PX459、PX460、PX461或PX462构建得到的sgRNA/Cas9 质粒，以及将序列如SEQ IDNO:1和4所示的sgRNA装载到PX458、PX460、 PX461或PX462构建得到的sgRNA/Cas9质粒也表现为基本一致的活性。
实施例5、MTT法检测基于CRISPR/Cas9系统特异性敲除人DNMT1基因对人高转移卵巢癌细胞株Ho8910PM增殖活性的抑制效果
1、Ho8910PM细胞铺板培养
将处于对数生长期的Ho8910PM细胞制备为细胞悬液，并用10％FBS-1640 稀释至5×104cells/ml，以100μl/孔接种至细胞培养96孔板，37.0℃，5％CO2条件下培养24h。细胞贴壁后，再更换无血清1640培养基饥饿培养24h。
2、脂质体转染法
将实施例2构建得到的两种sgRNA/Cas9质粒(PX330-DNMT1-1质粒，sgRNA的序列：SEQ ID NO:1；PX330-DNMT1-4质粒，sgRNA的序列：SEQ ID NO:4)分别用脂质体转染法(如：转染试剂lipo2000)转染至步骤1培养的 Ho8910PM细胞中，在37℃下分别孵育24h、48h和72h。对照组为Cas9空载质粒(PX330质粒载体)。
3、MTT法检测细胞活性
MTT法检测上述步骤2经两种sgRNA/Cas9质粒分别转染24h、48h和72h 后存活的Ho8910PM细胞相对于Cas9空载质粒转染Ho8910PM细胞的增殖抑制率。
结果如图6所示，经PX330-DNMT1-1质粒转染Ho8910PM细胞24h、48h 和72h后细胞增殖抑制率相对于对照组Cas9空载质粒转染后的细胞增殖抑制率分别约为8％、18％和9％；经PX330-DNMT1-4质粒转染Ho8910PM细胞24h、 48h和72h后细胞增殖抑制率相对于对照组Cas9空载质粒转染后的细胞增殖抑制率分别约为15％、37％和15.3％。由此表明，经两种sgRNA/Cas9质粒分别转染Ho8910PM细胞后其增殖得到了显著抑制，sgRNA/Cas9系统可高效特异性敲除DNMT1基因。
在后续进一步的试验中，将序列如SEQ ID NO:2、3、5-7所示的sgRNA装载到PX330、PX458、PX459、PX460、PX461或PX462构建得到的sgRNA/Cas9 质粒，以及将序列如SEQ IDNO:1和4所示的sgRNA装载到PX458、PX460、 PX461或PX462构建得到的sgRNA/Cas9质粒也表现为基本一致的活性。
实施例6、MTT法检测基于CRISPR/Cas9系统特异性敲除人DNMT1基因对人卵巢癌细胞株SKOV3增殖活性的抑制效果
1、SKOV3细胞铺板培养
将处于对数生长期的SKOV3细胞制备为细胞悬液，并用10％FBS-1640稀释至5×104cells/ml，以100μl/孔接种至细胞培养96孔板，37.0℃，5％CO2条件下培养24h。细胞贴壁后，再更换无血清1640培养基饥饿培养24h。
2、脂质体转染法
将实施例2构建得到的两种sgRNA/Cas9质粒(PX330-DNMT1-1质粒， sgRNA的序列：SEQ ID NO:1；PX330-DNMT1-4质粒，sgRNA的序列：SEQ ID NO:4)分别用脂质体转染法(如：转染试剂lipo2000)转染至步骤1培养的SKOV3 细胞中，在37℃下分别孵育24h、48h和72h。对照组为Cas9空载质粒(PX330 质粒载体)。
3、MTT法检测细胞活性
MTT法检测步骤2经两种sgRNA/Cas9质粒分别转染24h、48h和72h后存活的SKOV3细胞的相对数量。
结果如图7所示，经PX330-DNMT1-1质粒转染SKOV3细胞24h、48h和 72h后细胞增殖抑制率相对于对照组Cas9空载质粒转染后的细胞增殖抑制率分别约为6％、12.5％和11％；经PX330-DNMT1-4质粒转染SKOV32细胞24h、 48h和72h后细胞增殖抑制率相对于对照组Cas9空载质粒转染后的细胞增殖抑制率分别约为24％、22％和15.5％。由此表明，经两种sgRNA/Cas9质粒分别转染SKOV3细胞后其增殖得到了显著抑制，sgRNA/Cas9系统可高效靶向敲除 DNMT1基因。
在后续进一步的试验中，将序列如SEQ ID NO:2、3、5-7所示的sgRNA装载到PX330、PX458、PX459、PX460、PX461或PX462构建得到的sgRNA/Cas9 质粒，以及将序列如SEQ IDNO:1和4所示的sgRNA装载到PX458、PX460、 PX461或PX462构建得到的sgRNA/Cas9质粒也表现为基本一致的活性。
对比实施例1、不具靶向敲除人DNMT1基因的sgRNA及其敲除作用的验证
1、在实施例中共设计出35个靶向人DNMT1基因组第31和第32外显子的 sgRNA，不具有靶向敲除人DNMT1基因的sgRNA其碱基序列如SEQ ID NO.: 8-35所示。
2、参照实施例2的方法，构建靶向人DNMT1基因的sgRNA质粒载体PX459- DNMT1-27质粒(sgRNA的碱基序列如SEQ ID NO:27所示)和PX459-DNMT1-28质粒(sgRNA的碱基序列如SEQ ID NO:28所示)；
3、参照实施例3的方法，使用Sanger测序法验证上述步骤2构建的sgRNA/Cas9质粒(PX459-DNMT1-27质粒和PX459-DNMT1-28质粒)介导的对 SKOV3细胞DNMT1基因的靶向切割作用。
实验结果如图8和图9所示，sgRNA27和sgRNA28作用位点附近均未出现套峰，表明DNMT1基因未出现插入或者缺失突变。因此，序列如SEQ ID NO:27 和28的sgRNA/Cas9系统对人DNMT1基因无靶向敲除作用。
采用相同的方法验证碱基序列如SEQ ID NO:8-35中其它sgRNA靶向敲除作用，发现这些sgRNA同样不具有敲除人DNMT1基因的活性。
对比实施例2、比较不同靶向人DNMT1基因的sgRNA/Cas9质粒的敲除效率
1、PX260-DNMT1质粒构建
根据专利文献CN104971361A所述的Cas9-4序列(GGGCAGCTTGATCTCTATCTCTGGCTCGCT)，按照该专利文献实施例3所述方法将所述的Cas9-4序列装载到Cas9质粒表达载体PX260中，经转化测序验证后命名为PX260-DNMT4质粒。
2、qPCR法检测PX260-DNMT4质粒的敲除活性
根据实施例3步骤1～4所述方法，采用脂质体转染法将上述步骤1构建的 PX260-DNMT1质粒转入处于对数生长期的SKOV3细胞，24小时后，嘌呤霉素处理细胞筛选转染阳性细胞；48小时后，收集细胞，提取基因组，PCR扩增，对PCR产物进行qPCR验证。对照组为PX260质粒载体。
3、qPCR法检测PX459-DNMT1-1质粒的敲除活性
根据实施例3步骤1～4所述方法制备得到PX459-DNMT1-1质粒转染SKOV3 细胞后的PCR产物，并进行qPCR验证。对照组为PX330质粒载体。
实验结果如图10和图11所示：PX260-DNMT4质粒转染SKOV3细胞后，其PCR扩增效率相对于对照组的降低了约40％；PX459-DNMT1-1质粒转染 SKOV3细胞后，其PCR扩增效率相对于对照组的降低了约60％。由此表明， PX459-DNMT1-1质粒靶向敲除DNMT1基因的活性显著高于PX260-DNMT4质粒的敲除活性。进一步说明，本发明的所提供的sgRNA序列及其表达载体较专利文献CN104971361A所公开的在Cas9核酸内切酶靶向切割目标基因DNMT1 方面具有更高的效率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 成都金凯生物技术有限公司
<120> 一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的靶向肿瘤的基因治疗药物及其用途
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Claims (7)
1.一种CRISPR-Cas9特异性敲除人DNMT1基因中特异性靶向人DNMT1基因的sgRNA，其特征在于：
（1）所述的sgRNA结合在人DNMT1基因靶序列的规律为5’-GN(18-21)GG，其中3’-NGG为PAM；
（2）所述的sgRNA结合在人DNMT1基因的第31和32外显子上；
所述的sgRNA序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示。
2.一种将权利要求1所述的sgRNA装载到Cas9质粒载体构建而成的靶向敲除人DNMT1基因的sgRNA/Cas9质粒，其特征在于，所述的Cas9质粒载体选自PX330、PX458、PX459、PX460、PX461或PX462中任意一种。
3.一种制备如权利要求2所述的靶向敲除人DNMT1基因的sgRNA/Cas9质粒的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
（1）将Cas9质粒载体经限制性内切酶酶切后形成线性Cas9质粒载体；
（2）权利要求1所述的sgRNA，在所述的sgRNA及其互补链的5’端添加符合步骤（1）中限制性内切酶酶切方式的接头，分别合成sgRNA正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，并且在反应体系中进行磷酸化，然后经过变性、退火，制备为载入到上述步骤（1）所得到的线性Cas9质粒载体中的双链寡聚核苷酸；
（3）将所述步骤（2）制备得到的sgRNA双链寡聚核苷酸通过连接酶连接到所述步骤（1）制备得到的线性Cas9质粒载体中，得到sgRNA/Cas9质粒；
（4）将所述步骤（3）制备得到的sgRNA/Cas9质粒在感受态细胞中进行转化，PCR法筛选阳性克隆，得到可用于特异性敲除人DNMT1的sgRNA/Cas9质粒。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的Cas9质粒载体选自PX330、PX458、PX459、PX460、PX461或PX462中任意一种，所述的限制性内切酶是BbsⅠ酶；所述步骤（2）中在所述的sgRNA5’端所添加的接头是CACCG，在所述的sgRNA互补链的5’端所添加的接头是AAAC，所述的变性，其条件是95℃，5~10min；所述的退火，条件是温度降至37~40℃；所述步骤（3）中的连接酶是T4 连接酶，所述的线性Cas9质粒载体的质量为20~50ng，所述的sgRNA双链寡聚核苷酸是经步骤（2）得到的sgRNA双链寡聚核苷酸稀释后的，其稀释倍数为1:100~1:200；所述步骤（4）中感受态细胞选自Top10或DH5a细胞。
5.一种包含权利要求2所述的sgRNA/Cas9质粒与传输载体的靶向敲除人DNMT1基因的复合物，其特征在于，所述的传输载体选自脂质体、胶束、纳米粒的一种或多种；其中，所述的脂质体选自阳离子脂质体、中性脂质体、阴性脂质体；所述的胶束载体材料选自辅料如泊洛沙姆、磷脂，或PEG与聚酯类的嵌段共聚物中的一种或几种；所述的纳米粒载体材料选用辅料如PLGA、PLA、壳聚糖、透明质酸、PEI等或其衍生物，或PEG与聚酯类的嵌段共聚物中的一种或几种。
6.一种如权利要求2所述的靶向敲除人DNMT1基因的sgRNA/Cas9质粒在制备治疗和/或预防卵巢癌药物中的用途。
7.一种如权利要求5所述的靶向人DNMT1基因的复合物在制备治疗和/或预防卵巢癌药物中的用途。
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Address after: 610093 South Keyuan Road, Chengdu High-tech Zone, Chengdu, Sichuan Province, No. 88, 10 buildings, 2 floors, 203 Applicant after: Xinlitai (Chengdu) Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 610093 South Keyuan Road, Chengdu High-tech Zone, Chengdu, Sichuan Province, No. 88, 10 buildings, 2 floors, 203 Applicant before: CHENGDU JINKAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
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Effective date of registration: 20191105 Address after: 610041 Room 203, floor 2, building 10, No. 88, Keyuan South Road, hi tech Zone, Chengdu, Sichuan Province Applicant after: Xinlitai (Chengdu) Biotechnology Co.,Ltd. Applicant after: SHENZHEN SALUBRIS PHARMACEUTICALS Co.,Ltd. Address before: 610093 South Keyuan Road, Chengdu High-tech Zone, Chengdu, Sichuan Province, No. 88, 10 buildings, 2 floors, 203 Applicant before: Xinlitai (Chengdu) Biotechnology Co.,Ltd. |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| CB02 | Change of applicant information | ||
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Address after: 610093 No. 1, floor 3, building 4, No. 1, Keyuan South Road, high tech Zone, Chengdu, Sichuan Applicant after: Xinlitai (Chengdu) Biotechnology Co.,Ltd. Applicant after: SHENZHEN SALUBRIS PHARMACEUTICALS Co.,Ltd. Address before: No.203, 2 / F, building 10, No.88 Keyuan South Road, high tech Zone, Chengdu, Sichuan 610041 Applicant before: Xinlitai (Chengdu) Biotechnology Co.,Ltd. Applicant before: SHENZHEN SALUBRIS PHARMACEUTICALS Co.,Ltd. |
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| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |