CN115245574B - 一种基于CRISPR-Cas9技术特异敲除人兔VEGFA的新型载基因药物 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因药物领域，涉及一种基于CRISPR‑Cas9技术特异敲除人兔VEGFA的新型载基因药物。载基因药物包括药物载体和重组质粒，所述药物载体为一种硫辛酸接枝的聚乙烯亚胺与聚乙二醇的高分子聚合物，所述重组质粒中含有靶向敲除人和兔VEGFA基因的gRNA序列。本发明所制备得药物，在整个观察周期中均具有抑制VEGF表达、阻止视网膜新生血管形成的作用，且一次注药的作用时间至少可维持3个月，与临床用于抗VEGF治疗的药物相比，延长了药物作用时间，减少了注药频率。

Description

一种基于CRISPR-Cas9技术特异敲除人兔VEGFA的新型载基因 药物

技术领域

本发明涉及基因药物领域，尤其涉及一种玻璃体腔注射用、基于CRISPR-Cas9技术、能够特异敲除人兔VEGFA的新型载基因药物。

背景技术

眼底新生血管是糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)和视网膜静脉阻塞(retinal veinobstruction， RVO)等多种眼底血管性疾病的严重并发症，新生血管异常引起的视网膜病变往往会对视力造成不可逆的损害，严重者甚至致盲，它源于现有的血管系统，在缺血、缺氧的环境下被刺激生长，侵入玻璃体腔，最终导致玻璃体积血、牵拉性视网膜脱离和新生血管性青光眼。视网膜新生血管的生成是很多细胞因子和细胞之间相互作用、相互调节的结果，其中包括血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、缺氧诱导因子、胰岛素样生长因子、色素上皮衍生因子、神经粘蛋白等。研究表明，由于视网膜细胞缺血缺氧导致 VEGFA表达增多，进而导致视网膜新生血管的生成。目前，常用的临床治疗方法有视网膜激光光凝术、玻璃体切割手术和玻璃体腔注药术大量研究表明血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是促进视网膜血管生成的主要因素，尤其VEGFA是与新生血管形成最密切相关的一类，因此抗VEGF药物在临床上得到了广泛应用。临床上多采用玻璃体腔注射抗VEGF蛋白类药物或者融合蛋白类药物来治疗视网膜新生血管疾病，以阻止 VEGFA与其受体相结合，从而减少VEGFA的作用，但为了达到预期的治疗效果，患者需要多次进行眼内注药治疗，频繁进行眼内注药会严重增加患者的身体负担和经济负担。因此，许多新兴的抗血管生成药物都在以减少注药频率、减少就诊次数作为研发目的，把长期有效、持续释放或基因治疗作为研发策略。Anne等人以AAV病毒作为药物载体，设计了能够同时表达抗VEGFA microRNA和抗血管生成蛋白色素上皮衍生因子(PigmentEpithelium Derived Factor,PEDF)的载基因药物，用于抑制脉络膜新生血管(choroidalneovascularization,CNV)(Askou A,Alsing S,Benckendorff J,et al.Suppression ofChoroidal Neovascularization by AAV-Based Dual-Acting Antiangiogenic GeneTherapy[J].2019,16:38-50)。他们以激光诱导的CNV小鼠模型作为试验模型，认为这种双效基因药物能够有效抑制 CNV的产生。Egorova等使用包含CXCR4细胞受体配体的模块化多肽载体L1来传递能够靶向VEGFA、VEGFR1和endoglin genes的小干扰RNA，并在CXCR4阳性乳腺癌细胞 MDA-MB-231和内皮细胞中探究这种药物的转染效率，认为这种方法可用于肿瘤抗血管的治疗(Egorova A,Shtykalova S,Maretina M,et al.Synergistic Anti-Angiogenic Effects Using Peptide-Based Combinatorial Delivery of siRNAsTargeting VEGFA,VEGFR1,and Endoglin Genes[J].2019,11(6))，但这些基因类药物尚未能够真正用于临床治疗。

规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9，Cas9)技术是一种高效经济的基因编辑技术。CRISPR/Cas9系统是由CRISPR位点、Cas蛋白和编码DNA序列组成，具有操作性强、编辑效率高等优点。近年来，利用CRISPR/Cas9系统对视网膜细胞进行VEGF相关蛋白进行基因敲除在体外实验和动物实验上得到了有效的验证。基因药物的相关研究中多采用病毒载体来包裹CRISPR/Cas9系统，病毒载体的递送系统虽然具有较高的转染效率，但存在着装载能力有限、免疫原性高、生产成本高等弊端。随着生物材料和生物医学工程技术的发展，非病毒载体已经成为更多研究者关注的热点。

目前用于包裹核酸的非病毒载体有脂质体类、聚合物类和无机材料载体等，其中聚合物类中聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)和聚(L-赖氨酸)(poly(L-lysine)，PLL)是研究较为成熟的两种聚合物，这两种聚合物作为核酸载体均有优缺点。PEI具有较高的细胞转染率，且高分子量PEI比低分子PEI具有更高的转染率，但是高分子量的PEI细胞毒性更大，且不容易降解。PLL含有大量的肽链，在体内能够被降解，而且降解产物赖氨酸为人体的内源性物质，所以PLL在体内的生物相容性良好；但相比于PEI，PLL的转染率相对较低。此外，聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是一种亲水性材料，常被用于PEI和PLL 聚合物的修饰。研究表明PEG修饰的PEI多聚体不仅可以降低PEI的细胞毒性，而且可以增加PEI的溶解性和稳定性。既往研究报道将低分子量线性PEI接枝到PLL和PEG上形成三元聚合物PEG-b-PLL-g-lPEI，将该聚合物作为核酸载体成功转染至多种细胞中(Dai J, Zou S,PeiY,et al.Polyethylenimine-grafted copolymer of poly(l-lysine)and poly(ethyleneglycol)for gene delivery[J].Biomaterials.2011,32(6):1694-705.)，Li利用该聚合物将针对X-连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)的siRNA成功导入人卵巢癌细胞 Skov-3中，并在小鼠肿瘤模型中得到了成功应用(Li J,Cheng D,Yin T,et al.Copolymer of poly(ethylene glycol)and poly(L-lysine)graftingpolyethylenimine through a reducible disulfide linkage for siRNA delivery[J].2014,6(3):1732-40)。Liang等人利用PEG-PEI-胆固醇脂多糖包裹编码有VEGFA的CRISPR/Cas9质粒成功将其转移至骨肉瘤细胞内，降低VEGFA的表达，并在小鼠肿瘤模型中取得了较好的结果(Liang C,Li F,Wang L,et al.Tumor cell-targeted delivery of CRISPR/Cas9 by aptamer-functionalized lipopolymer for therapeutic genome editing ofVEGFA in osteosarcoma[J].2017,147:68-85)。

申请公布号为CN 107384894 A的发明专利申请，公开了一种功能化氧化石墨烯高效运载CRISPR/Cas9用于基因编辑的方法。该方法中的NGO-PEG-PEI/Cas9/sgRNA复合体是将氨基化PEG和PEI共价修饰到氧化石墨烯上，得到NGO-PEGPEI；然后将Cas9蛋白和 sgRNA在室温条件下组装成Cas9/sgRNA复合体；将NGO-PEG-PEI与Cas9/sgRNA复合体在室温条件下进行混合得到。将该复合体与靶基因进行混合，实现靶基因的编辑。

发明内容

本发明提出了一种玻璃体腔注射用、基于CRISPR-Cas9技术、能够特异敲除人兔VEGFA的新型载基因药物PLAP。

所述载基因药物PLAP包括药物载体和重组质粒，所述药物载体为一种硫辛酸(thioctic acid，TA)接枝的聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)与聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)的高分子聚合物，所述重组质粒中含有靶向敲除人和兔VEGFA基因的gRNA 序列。

在进一步的方案中，所述药物载体制备方法为：利用亲水性材料聚乙二醇对聚乙烯亚胺进行修饰，然后接枝硫辛酸，制备出一种新型的高分子聚合物基因载体P[TA- (PEG+PEI)]，将其命名为PTEE。聚乙二醇、聚乙烯亚胺和硫辛酸的用量(摩尔)比为 1:1:2。

所述重组质粒可以同时表达靶向敲除人和兔VEGFA基因的gRNA、Cas9和eGFP序列，所述sgRNA的序列为5’-CCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGG-3’、5’-AAACACAGA CTCGCGTTGCA-3’、5’-TCCAGGAGTACCCTGATGAGA-3’、5’-GCTTCCTACAGCACAACAAAT-3’或5’-ACGCGAGTCTGTGTTTTTGCAGG-3’。

所述重组质粒可以以YSY为出发质粒。

在进一步的方案中，所述载基因药物PLAP中，PTEE浓度为5μg/μl，重组质粒浓度为15ng/μl，PTEE和重组质粒的体积比为3:1。载基因药物PLAP的制备方法为：将 PTEE和重组质粒按照上述配比，在室温下共孵育30分钟，即可配置成新型基因药物 PLAP。

上述基因药物PLAP经过体外细胞试验验证其生物相容性、转染效率和有效性，经过兔眼玻璃体腔注验证其安全和抑制兔眼视网膜新生血管的有效性。

本发明的有益效果为：

本发明采用规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspacedshort palindromic repeats，CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein9，Cas9)技术实现对 VEGFA基因的靶向敲除，旨在抑制VEGFA的表达，从而阻止由视网膜新生血管导致的视力丧失。CRISPR/Cas9系统是由CRISPR位点、Cas蛋白和编码DNA序列组成，是一种高效经济的基因编辑技术，它利用向导RNA特异性识别靶向位点，指导Cas核酸酶对靶基因进行基因编辑，在基因同源性修复过程中造成移码突变，从而实现目标基因的敲除，具有操作性强、编辑效率高等优点。

选用的基因载体为高分子聚合物PTEE，具有转染效率高、毒性小、降解速率快的优势。基因载体包裹的药物核心成分为能够靶向敲除VEGFA基因的CRISPR序列，它基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，利用gRNA特异性识别靶向位点，指导Cas核酸酶对靶基因进行基因编辑，在基因同源性修复过程中造成移码突变，实现对目的基因的编辑。本发明设计的CRISPR序列为人兔共用序列，有利于动物实验向临床试验的转化。

本发明所制备得药物，在整个观察周期中均具有抑制VEGF表达、阻止视网膜新生血管形成的作用，且一次注药的作用时间至少可维持3个月，与临床用于抗VEGF治疗的药物相比，延长了药物作用时间，减少了注药频率。因此，可初步认定该药物是一种玻璃体腔注射用的，能够安全、有效地在眼球局部靶向敲除VEGFA基因，抑制视网膜新生血管形成的抗VEGF基因药物。

本发明提供的新型载基因药物具有高转染效率、安全有效的特点，能够有效抑制兔眼视网膜新生血管的形成，有待于应用于人类眼科视网膜新生血管性疾病。

附图说明

图1为pHNS-U6-sgRNA(VEGFA)-EFla-eGFP-CMV-Cas9-EFla-puro质粒图谱；

图2为质粒-PTEE复合物琼脂糖凝胶电泳图；

图3为质粒-PTEE材料电位分析图；

图4为ARPE-19细胞与不同浓度PTEE材料共孵育后CCK-8结果图；

图5为293T细胞、ARPE-19细胞和Müller细胞以不同材料为载体的转染结果图。光学显微镜(20倍)下观察利用脂质体Lipo 3000(A～C)、jetOPTIMUS材料(D～F)和PTEE纳米材料(G～I)进行细胞转染的293T细胞、ARPE-19细胞和Müller细胞，绿色荧光即表示质粒成功转入细胞基因组内，GFP蛋白能够正常表达。

图6为293T细胞流式荧光测定结果图。A：Lipo 3000组；B：jetOPTIMUS组；C： PTEE组；D：空白对照组。

图7为体外实验VEGFA表达量结果。A：ELISA方法测定VEGFA标准品浓度与相应OD值的拟合关系图。B：各组细胞培养基中VEGFA浓度测定结果直方图。Normoxia Group和Hypoxia Group分别代表常氧组和低氧组；X轴分别为lipo3000实验组、 jetOPTIMUS实验组、PTEE实验组和空白对照组。***代表P<0.001，n＝3。

图8为药物安全性评估眼底照片。A～F：PLAP组和jetPEI组兔眼在注药前、注药后1周和注药后2周的眼底照片。

图9为兔重要脏器病理切片结果图(HE染色20倍)。A为心脏病理切片，B为肝脏病理切片，C为肺病理切片，D为肾脏病理切片。

图10为各组兔眼药物有效性分析的眼底照片。A～C：AAA组表示模型对照组，白色箭头所指的地方为迂曲的新生血管，在玻璃体腔注药后1周即可观察到新生血管，在第5 周时新生血管较前增多，第10周时新生血管模型仍然保持稳定；D～F：jetPEI组表示玻璃体腔注射in vivo-jet-质粒复合物2周后，再注射AAA造模药物后1周、5周和10周的眼底情况，白色箭头所指的地方为新生血管，可见新生血管随着时间推移逐渐减少、萎缩；G～ I：PLAP组表示玻璃体腔注射PLAP新型基因药物2周后，再注射AAA造模药物后1周、5 周和10周的眼底情况，注射造模药后1周时玻璃体混浊1+级，在5周和10周时眼底未见明显异常。

图11为药物有效性分析OCT结果图。A～B：AAA组兔眼注射造模药后3周和10 周时OCT检查结果代表图；C～D：PLAP组兔眼注射造模药后3周和10周时OCT检查结果代表图；E～F：jetPEI组兔眼注射造模药后3周和10周时OCT检查结果代表图。

图12为兔眼房水中VEGFA的表达量测定结果图。A：通过绘制标准品浓度做对数与相应OD值对数生成曲线，并通过回归分析确定的最佳拟合线。B：PLAP、jetPEI、AAA和空白对照组实验兔12周后前房中VEGFA的表达量。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。

实施例1

1.基因药物载体(PTEE)的合成：

以PEI作为主体，利用亲水性材料聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)对聚乙烯亚胺 (polyethylenimine,PEI)进行修饰，然后接枝硫辛酸(thioctic acid，TA)，制备出一种新型的高分子聚合物基因载体P[TA-(PEG+PEI)]，将其命名为PTEE。

上述基因药物载体既保证了PEI较高的转染效率、增加了材料的生物相容性，也能够促进载基因药物在细胞内的药物释放速率，从而达到更好的治疗效果。

2.质粒的构建和合成：

用CRISPR/Cas9技术靶向敲除人VEGFA基因(登录号：NG_008732.1)和兔VEGFA基因(登录号：NC_013680.1)共有序列(共有序列有3条，共有序列1如SEQ ID NO:6所示)；共有序列2如SEQ ID NO:7所示；共有序列3如SEQ ID NO:8所示，构建同时表达 gRNA、Cas9、puro和eGFP的四合一质粒：pHNS-U6-sgRNA(VEGFA)-EFla-eGFP-CMV- Cas9-EFla-puro，如图1所示。其中sgRNA的序列有5条均可以使用，sgRNA1：5’-CCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGG-3’，如SEQID NO:1所示；sgRNA2：5’-AAACACAGACT CGCGTTGCA-3’，如SEQ ID NO:2所示；sgRNA3：5’-TCCAGGAGTACCCTGATGAGA-3’，如SEQ ID NO:3所示；sgRNA4：5’-GCTTCCTACAGCACAACAAAT-3’，如SEQ ID NO:4所示，sgRNA5：5’-ACGCGAGTCTGTGTTTTTGCAGG-3’，如SEQ ID NO:5所示。

上述四合一质粒的构建过程简述如下：

(1)引物退火

1.0μl Oligo F(100μM)；

1.0μl Oligo R(100μM)；

8.0μl 1×退火缓冲液；

将以上溶液混合于PCR管内，在PCR仪中95℃条件下放置10min，取出后降至室温使用。引物序列为：F：5’-CACCGGCCTGTGGGCCTTGCTCAGAG-3’；R：5’-AAACCTCTGAGCAAGGCCCACAGGCC-3’。

(2)连接

0.5μl退火产物；

1.0μl YSY线性化CRISPR/Cas9质粒；(原始质粒是YSY-CRISPR/Cas9质粒，购自于南京尧舜禹公司)

1.0μlT4连接酶；

2.0μl 5×T4 Buffer；

5.5μl Milli Q H₂O(超纯水)；

将以上溶液混合于1.5ml的EP管中，室温孵育30min。

(3)转化

将10μl连接产物用50μl大肠杆菌DH5α感受态细胞(pfu≥10⁸)进行转化。然后涂布于含氨苄(50μg/ml)的LB板，37℃下倒置培养过夜。

(4)转化子验证

①PCR模板的快速制备

以10μl无菌枪头随机挑选克隆，放入EP管中，用作PCR的模板。

②PCR验证体系(10μl)

0.5μl菌落

0.5μl Oligo F(5μM)(引物序列为：5’-CACCGGCCTGTGGGCCTTGCTCAGAG-3’)

0.5μl反向引物(5μM)(引物序列为：5’-AAACCTCTGAGCAAGGCCCACAGGCC- 3’)

5.0μl 2×Mastermix

3.5μl Milli Q H₂O

③PCR反应条件

96℃3min，30(96℃30s，60℃30s，72℃30s)，72℃10min，4℃。

④PCR验证阳性克隆电泳

取2μl的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(1％)鉴定其完整性。

⑤转化子的测序验证

将之前验证正确的阳性克隆菌液在南京尧顺禹生物科技进行测序。

3.聚合物载体PTEE与质粒配比验证

将浓度为15ng/μL的质粒与浓度为5μg/μL的PTEE材料进行不同体积配比，质粒带负电荷，PTEE材料带正电荷。利用琼脂糖凝胶电泳和Zetasizer Nano粒径分析仪评估PTEE与质粒静电相互作用后所形成的复合物的N/P值与电位值。

3.1琼脂糖凝胶电泳

(1)制备1％琼脂糖凝胶

称取0.4g琼脂糖置于锥形瓶中，加入42ml 1×TAE灭菌电泳缓冲液，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0％琼脂糖凝胶液。

(2)胶板制备

取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。

(3)加样

将PTEE材料与质粒按不同配比分为a、b、c、d、e、f六组(具体配比见表1)，共孵育30分钟，每组溶液配制总量为20μl，每孔上样量为9μl。用10ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。

(4)电泳

加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压110mV，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm 处时，停止电泳。

(5)观察照相

在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。

表1质粒-PTEE复合物琼脂糖凝胶电泳制样表

组别	a	b	c	d	e	f
							PTEE材料体积(μl)	0	2	6	10	16	2
质粒体积(μl)	2	2	2	2	2	0
							10×Loading Buffer(μl)	2	2	2	2	2	2
去离子水(μl)	16	14	10	6	0	16
							总体积(μl)	20	20	20	20	20	20

注：上样质粒浓度为15ng/μL，PTEE材料浓度为5μg/μL。

如图2所示，当PTEE材料与质粒体积比为3:1时，质粒与材料能够通过静电作用完全结合。

3.2电位分析

(1)电位分析仪预热30分钟，使用Zetasizer software软件进行电位分析

(2)待测质粒浓度为15ng/μl，PTEE材料浓度为5μg/μl，将两种溶液按照20:80、50:50、80:20、90:10、95:5、99:1、100:0的体积比混合，制备成100ul的质粒-PTEE复合物体系，在室温下孵育30分钟，每组加入900ul去离子水定容至1000μl，具体配比见表2。

表2PTEE/质粒复合物电位分析配比表

编号	1#	2#	3#	4#	5#	6#	7#
								质粒体积(μL)	20	50	80	90	95	99	100
PTEE材料体积(μL)	80	50	20	10	5	1	0

注：质粒浓度为15ng/μL，PTEE材料浓度为5μg/μL。

(3)在软件中选择Measure开始测量样品，设置为手动测量，每组样品测试5次，并评估样品质量，记录质量较好的样品所测得的数据。

如图3所示，PTEE纳米材料与质粒体积配比在4:1至1:1之间的电位在+6.78至 +3.25之间。考虑到zeta电位值在+5至-5之间时由电位仪所测的电位不稳定，而偏正电位更有利于提高质粒-PTEE复合物的转染效率，故最终选定体积配比3:1为PTEE纳米材料与质粒的最佳配比。

基因药物体外细胞试验其安全性和有效性

4.1基因药物的体外生物相容性检测

新型基因药物体外生物相容性采用CCK-8试验进行验证，具体步骤如下：

(1)取生长状况良好的ARPE-19贴壁细胞(该细胞购自于武汉普赛诺生命科技有限公司货号：CL-0026)，弃去瓶中旧培养基，用PBS洗涤2次，使用胰蛋白酶消化细胞2～3分钟，终止消化后将细胞悬液加入15ml离心管中，室温下1000rpm，离心5分钟。

(2)弃废液，加入新鲜完全培养基，重悬细胞。

(3)取2个洁净的96孔板，每孔接种8×10³个细胞、加入100μl新鲜无抗体培养基(90％F/12+10％胎牛血清)，在37℃、5％CO₂条件下培养24小时。

(4)待细胞贴壁情况及生长状态良好，吸除旧培养基，每孔用PBS缓冲液洗涤2 遍，分别加入含PTEE浓度为0μg/μl、0.25μg/μl、0.5μg/μl、0.75μg/μl、1.0μg/μl、 1.25μg/μl、1.5μg/μl、1.75μg/μl的新鲜培养基100μl培养24和48小时，每个药物浓度为一组，每组设置3个复孔。

(5)在细胞与材料共培养24小时和48小时后，每孔加入10μl CCK-8溶液(CCK- 8试剂盒购买于上海碧云天生物技术有限公司产品编号：C0037)，避光放置于37℃培养箱中继续培养2小时。

(6)用酶标仪测定每孔在450nm处的吸光度。

如图4所示，与空白对照组相比，各浓度组中ARPE-19细胞的细胞活力相近，甚至更高，说明0.25～1.75μg/μL的PTEE材料对ARPE-19细胞的细胞活力没有明显影响， PTEE材料具有较好的细胞生物安全性。

细胞转染效率测定

根据筛选出的CRISPR-gRNA序列，将其作为实验质粒分别转染进293T细胞、APRE-19细胞和Müller细胞中，通过观察转染后细胞GFP蛋白的表达情况来评估细胞转染的效率。

本实施例将Lipo 3000组和jetOPTIMUS组作为对照组、PTEE组作为实验组，通过光学显微镜观察每组细胞中荧光蛋白的表达情况，利用流式细胞仪来测定药物在不同细胞中的转染效率。具体如下：

4.2.1细胞转染

(1)当三种细胞293T细胞、APRE-19细胞和Müller细胞在24孔板中融合度达到80％左右时，用移液器吸除24孔板中的旧培养基。

(2)Lipo 3000组：根据Lipofectamine 3000转染试剂盒说明书，将25μl的Opti-MEM培养基与0.75μl的Lipofectamine 3000充分混匀，制备为试剂A。用25μl的Opti- MEM培养基稀释0.5μg质粒，然后添加1μl的P3000试剂，充分混匀，制备为试剂B。将试剂A和试剂B按照1:1混合均匀，室温孵育10分钟，制备为DNA/脂质体复合物。

(3)

组：根据试剂盒说明书，用50μl的/>

buffer稀释0.5μg的质粒，充分混匀后加入0.5μl的/>

reagent，轻微振荡混匀后室温下孵育10分钟，制备为DNA/jet复合物。

(4)PTEE组：根据质粒与PTEE的N/P值，将100μl的PTEE材料(浓度5μg/μ l)与0.5μg质粒充分混匀，室温下孵育30分钟，制备为PLAP载基因药物。

(5)向复合物溶液中加入不含抗生素的新鲜培养基，24孔板每孔含0.5μg质粒，每孔溶液总体积为500μl。

(6)将24孔板在37℃、5％CO₂条件下继续培养24小时，显微镜下观察各组细胞的转染情况，并拍照记录。

如图5所示，PTEE纳米材料组在三种细胞中的转染效率均是最高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

4.2.2流式细胞检测

(1)观察24孔板中转染24小时后的293T、APRE-19和Müller细胞，贴壁情况及生长状态良好。

(2)吸出旧培养基，每孔用PBS洗涤2次，加入500μl胰蛋白酶，在培养箱中静置2分钟，加入等量的培养基中和胰酶，终止消化。

(3)将细胞悬液加入1.5ml的EP管中，室温下转速1000rpm，离心5分钟。

(4)弃上清，用1ml的PBS缓冲液重悬细胞沉淀，然后再次离心。重复洗涤细胞2 次后，用500μl的PBS缓冲液重悬细胞。

(5)利用流式细胞仪检测带有GFP蛋白表达的细胞，进而测定各组质粒载体的转染效率。

对于293T细胞，Lipofectamine 3000组平均转染效率为17.35±3.46％，jetOPTIMUS 组平均转染效率为43.00±0.42％，PTEE组平均转染效率为51.80±0.85％，空白对照组转染效率为0.15±0.07％；对于ARPE-19细胞，Lipofectamine 3000组平均转染效率为5.77±1.06％，jetOPTIMUS组平均转染效率为23.83±2.22％，PTEE组平均转染效率为43.50± 2.07％，空白对照组转染效率为0.20±0.10％；对于Müller细胞，Lipofectamine3000组平均转染效率为1.15±0.21％，jetOPTIMUS组平均转染效率为4.30±0.57％，PTEE组平均转染效率为16.95±0.35％，空白对照组转染效率为0.05±0.07％，由此可见，与对照组相比， PTEE纳米材料组在三种细胞中的转染效率均是最高。其中，293T细胞流式荧光测定结果如图6所示。

4.3载基因药物PLAP的有效性检测

建立ARPE-19细胞低氧模型，采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术(enzymelinkedimmunesorbentassay，ELISA)测定ARPE-19细胞经新型载基因药物PLAP、DNA/lipo3000复合物、DNA/jetPEI复合物转染后细胞培养液中VEGF的表达量，从而验证新型载基因药物PLAP在抑制VEGF方面的有效性。具体如下：

(1)实验分组：准备两个ARPE-19细胞转染24小时后的24孔板，一个为常氧板，另一个为低氧板，两个细胞板均设定有PTEE组、lipo 3000组、jetOPTIMUS组和空白对照组，每个实验组均设置3个复孔。将低氧板置于低氧条件下培养6小时后置于常氧环境中培养6小时；而常氧板置于常氧环境中培养12小时。

(2)收集样本：收集各组细胞培养上清，1000rpm室温下离心5分钟后去除细胞碎片。

(3)从平衡至室温的密封袋中取出微孔板，分别将稀/释后不同浓度的标准品和实验样本加入相应孔中，每孔100μL。用封板膜纸封闭反应孔，室温孵育2小时；

(4)将板内液体吸去，使用洗瓶洗板。每孔加入400μl洗涤液，然后将板内洗涤液吸去，重复操作3次。最后一次洗板结束时将板倒置，在吸水纸上拍干所有残留液体；

(5)在每个微孔内加入100μL检测抗体。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时；

(6)重复第4步洗板操作；

(7)在每个微孔内加入100μL稀释好的链霉亲和素-HRP，室温孵育20分钟。注意避光；

(8)重复第4步洗板操作；

(9)在每个微孔内加入100μL显色底物，室温孵育20分钟。注意避光；

(10)在每个微孔内加入50μL终止液，孔内溶液颜色会从蓝色变为黄色。

如果溶液颜色变为绿色或者颜色变化不一致，请轻拍微孔板，使溶液混合均匀；

(11)加入终止液后30分钟内，使用酶标仪测量450nm的吸光度值，设定540nm作为校正波长。

(12)计算结果：将每个标准品和样品的校正吸光度值(OD 450～OD 540)、复孔读数取平均值，然后减去平均零标准品OD值。通过绘制标准品浓度做对数与相应OD值对数生成曲线，并通过回归分析确定最佳拟合线，利用ELISACalc软件测定出各组样本中VEGFA浓度。

如图7所示，在常氧组中，Lipofectamine 3000组、jetOPTIMUS组、PTEE纳米材料组和空白对照组的VEGFA表达量分别为204.0±11.3pg/mL、196.5±53.0pg/mL、186.7±9.6pg/mL、224.7±17.7pg/mL，各组之间无统计学差异(P>0.05)；在低氧组中，存在基因药物干预时均比单纯低氧条件下培养ARPE-19细胞时的VEGFA表达量低，Lipofectamine 3000组、jetOPTIMUS组、PTEE纳米材料组和空白对照组的VEGFA表达量分别为649.8± 16.3pg/mL、919.9±56.9pg/mL、627.3±94.5pg/mL、2394.2±239.4pg/mL，各实验组与空白对照组之间具有统计学差异(P<0.001)，其中PTEE组的VEGFA表达量最低，说明新型基因药物PLAP具备抑制VEGFA的有效性，但Lipofectamine 3000组、jetOPTIMUS组、 PTEE纳米材料组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)。

5.基因药物PLAP经过兔眼玻璃体腔注验证安全性和有效性

5.1基因药物PLAP的安全性评估

选用体重为2.5±0.5kg的新西兰母兔，实验分为2组，每组实验兔4只，右眼为实验眼，左眼为对照眼。实验组1为PLAP组，向兔右眼玻璃体腔注射50μ/l新型基因药物PLAP(根据PTEE材料最大负载量，质粒药物浓度为0.045μg/μl)；实验/组2为jetPEI组，向兔右眼玻璃体腔注射50μl in vivo-jetPEI载基因药物(根据In vivo-jetPEI转染试剂盒说明书，质粒药物浓度为0.2μg/μl)；左眼均为空白对照眼。在玻璃腔注射药物前、注射药物后7天和14天进行眼底照相，根据玻璃体混浊分级标准对每只兔眼的混浊程度进行分级，在注药后14天进行眼底照相检查，对比每只兔子眼底情况，评估药物安全性。

如图8所示，PLAP组和jetPEI组在术后1周均出现玻璃体混浊，而在术后2周， PLAP组的玻璃体混浊程度明显小于jetPEI组，说明PLAP基因药物在玻璃体腔内具有相对良好的生物安全性。

基因药物PLAP组在注药后12周时，牺牲动物，摘取兔子心脏、肝脏、肺、肾脏，每个脏器取大小为2.0cm×2.0cm×0.3cm的组织块，固定于4％多聚甲醛固定液中48小时后性病理切片，HE染色观察各组织形态。

如图9所示，在实验兔的心、肝、肺、肾病理切片未见明显炎症细胞浸润，说明PLAP药物毒性较低，重要脏器未发生药物毒性反应。

5.2药物有效性分析

5.2.1兔视网膜新生血管模型

本实施例选用兔视网膜新生血管模型：麻醉剂量为每公斤体重注射0.2ml盐酸赛拉嗪注射液 (浓度为20mg/mL)和0.5mL的2％戊巴比妥钠，麻醉方法为肌肉注射。在麻醉状态下，对每只兔子的双眼进行玻璃体腔内注射0.45mg的DL-a-氨基己二酸(DL-a-aminoadipic acid, AAA)，注射部位为11点钟距离角巩膜缘2mm处，针头置于视乳头中央。

动物实验中选择造模药物是DL-α-氨基己二酸，它是一种胶质毒素，能够刺激视网膜神经胶质细胞，从而促进VEGF高表达，虽然该模型与湿性AMD(wet-AMD,wAMD) 和DR没有严格一致的解剖学或遗传学特征，但有研究表明，在长达88周的观察周期内该兔眼视网膜新生血管模型所产生的视网膜新生血管性病变和血管渗漏具有稳定性和持久性，能够很好地模拟人类慢性疾病。其次，玻璃体腔给予阿柏西普后能够完全抑制该模型中血管渗漏的情况，这说明这种新生血管性渗漏是VEGF依赖性的，类似于人眼进行抗VEGF治疗后所出现的反应，并且这种抑制血管渗漏的反应是可逆的，抑制持续时间取决于注射阿柏西普的剂量，这意味着AAA模型是探索人类VEGF相关性视网膜疾病的合适替代品，特别适用于研究治疗视网膜血管性疾病的新制剂、药物治疗效果及作用持续时间。在灵长类动物中构建的激光损伤诱导脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)模型不适用于干预模式下比较药物作用持续时间的研究，因为损伤诱导的渗漏是短暂，而且即使是非常低剂量的抗VEGF药物也能够促进愈合。激光CNV可用于预防模式下的治疗，也就是说，在引起激光损伤之前先给予抗VEGF药物，然后在用药后的不同时间点进行激光诱导。但由于其激光治疗后达到临床显著渗漏的成功率仅为35％至45％，造模效果不稳定，因此需要多种实验动物、多次进行诱导。这是本发明选择兔子作为动物试验对象的原因，在该模型中验证 PLAP新型基因药物的作用效果将更符合临床抗VEGF治疗的原理，使得本发明结果更具说服力。

实验分组和处理

实验分为4组，分别为AAA组、PLAP组、jetPEI组和空白对照组。选用体重为2.5±0.5kg 的新西兰兔，每组实验兔4只，向AAA组兔右眼玻璃体腔注射50μl PBS缓冲液；向PLAP组兔右眼玻璃体腔注射50μl新型基因药物PLAP；向jetPEI组兔右眼玻璃体腔注射 50μl in vivo-jetPEI载基因药物；向空白对照组兔右眼玻璃体腔注射50μl PBS缓冲液。在注药后2周向AAA组、PLAP组和jetPEI组兔眼玻璃腔内注射0.45mg的AAA，空白对照组兔眼不注射造模药。

眼底照相和OCT观察

采用裂隙灯对兔眼进行观察，观察眼前节，并用前置镜观察眼底，观察时间点为AAA注射后1周、5周、10周，对兔眼进行眼底照相，观察眼底新生血管情况，进而评估新型基因药物PLAP的有效性。

如图10各组眼底照相图片所示，在AAA组视网膜新生血管模型在玻璃体腔注射AAA后1周就可观察到新生血管的产生，在注药后10周时模型仍能保持稳定状态。在整个观察期，PLAP组未观察到明显的新生血管，jetPEI组中视网膜新生血管有一定程度的消退，但不能有效地抑制视网膜新生血管的生成，由此可见，新型基因药物PLAP在抑制视网膜新生血管方面效果更明显。

在兔眼造模后3周和10周进行OCT检查，观察不同位置的视网膜形态及视网膜厚度。如图11所示，在AAA组，注射AAA药物3周后能观察到视网膜浅脱离，视网膜结构粗糙、紊乱，10周后可见视网膜变薄、神经纤维层缺失、结构模糊不清；PLAP组注射 AAA药物3周后10周后视网膜均未见明显异常，视网膜结构清晰、完整；jetPEI组注射 AAA药物3周后的视网膜出现浅脱离和视网膜变薄，10周后可见视网膜萎缩。因此，从 OCT结果来看新型基因药物PLAP能够更好地保持兔眼视网膜结构的完整性。

5.2.4 ELISA测定兔眼房水中VEGFA的表达量

抽取四组兔眼房水50ul/眼，采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术测定房水中VEGFA的表达量，选用Rabbit VEGFA ELISA Kit试剂盒，具体方法如下：

(1)使用前将试剂盒各种试剂和待测样品平衡至室温(18～25℃)。

(2)准备一个洁净的96孔板，设置标准孔、测试样品孔和对照孔。

(3)将100μl稀释好的标准品加入标准孔中，将100μl待测样品加入样品孔中，将100μl工作浓度的稀释用缓冲液加入对照孔中，用盖子密封孔板并在37℃孵育1小时。

(4)取下盖子，吸去板内液体，向每孔加入100μl检测试剂A，用盖子密封孔板并在37℃孵育1小时。

(5)取下盖子，吸去板内液体，用洗涤缓冲剂洗板3次。

(6)每孔加入100μl检测试剂B，用盖子密封孔板并在37℃孵育30分钟。

(7)取下盖子，吸去板内液体，用洗涤缓冲剂洗板5次。

(8)每孔加入90μlTMB底物，用盖子密封孔板、避光，在37℃孵育10-20分钟。

(9)每孔加入50μl终止溶液，立即使用酶标仪测量每孔在450nm波长的吸光度。

(10)计算结果：将每个标准品和样品的吸光度值、复孔读数取平均值，然后减去平均零标准品OD值。通过绘制标准品浓度做对数与相应OD值对数生成曲线，并通过回归分析确定最佳拟合线，利用ELISACalc软件测定出各组样本中VEGFA浓度。

如图12所示，AAA组、PLAP组和jetPEI组兔眼房水中VEGFA表达量均比空白对照组兔眼房水中VEGFA表达量高，与AAA组相比，PLAP组和jetPEI组均能抑制VEGFA 的表达，但PTEE组在抑制VEGFA的表达方面效果更明显。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省人民医院

<120> 一种基于CRISPR-Cas技术特异敲除人兔VEGFA的新型载基因药物

<130> 无

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cctgtgggcc ttgctcagag cgg 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaacacagac tcgcgttgca 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccaggagta ccctgatgag a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcttcctaca gcacaacaaa t 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acgcgagtct gtgtttttgc agg 23

<210> 6

<211> 208

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tttttctctc tctctgctga tgctctagct tagatgtctt tccttttgcc tttttgcagt 60

ccctgtgggc cttgctcaga gcggagaaag catttgtttg tacaagatcc gcagacgtgt 120

aaatgttcct gcaaaaacac agactcgcgt tgcaaggcga ggcagcttga gttaaacgaa 180

cgtacttgca ggttggttcc cagagggc 208

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gagatgagct tcctacagca caacaaatgt gaatgcaggt gagga 45

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atcgagacct tggtggacat cttccaggag taccctgatg agatcgagta cat 53

Claims (5)

1.一种基于CRISPR-Cas9技术特异敲除人兔VEGFA的载基因药物，其特征在于，所述载基因药物包括药物载体和重组质粒，所述药物载体为硫辛酸接枝的聚乙烯亚胺与聚乙二醇的高分子聚合物，所述药物载体的制备方法为：以聚乙烯亚胺作为主体，利用亲水性材料聚乙二醇对聚乙烯亚胺进行修饰，然后接枝硫辛酸，制备出高分子聚合物基因载体P[TA-(PEG+PEI)]，其中，聚乙二醇、聚乙烯亚胺和硫辛酸的摩尔比为1:1:2；

所述重组质粒同时表达靶向敲除人VEGFA基因和兔VEGFA基因的sgRNA和Cas9序列，所述sgRNA的序列为如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。

2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas9技术特异敲除人兔VEGFA的载基因药物，其特征在于，所述重组质粒中还含有表达eGFP的序列。

3.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas9技术特异敲除人兔VEGFA的载基因药物，其特征在于，所述重组质粒以YSY为出发质粒。

4.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas9技术特异敲除人兔VEGFA的载基因药物，其特征在于，所述载基因药物中，药物载体的浓度为5μg/μl，重组质粒浓度为15ng/μl，药物载体和重组质粒的体积比为3:1。

5.根据权利要求4所述的一种基于CRISPR-Cas9技术特异敲除人兔VEGFA的载基因药物，其特征在于，载基因药物的制备方法为：将药物载体和重组质粒按照上述配比，在室温下共孵育30分钟，即可配置成载基因药物。

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