CN105561334A - 一种基于温度靶向的纳米凝胶基因递送复合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是一种基于温度靶向的纳米凝胶用于递送表达基因药物的质粒复合物合成及其制备方法。本发明采用自由基共沉淀法合成了具有温度敏感的核壳结构纳米凝胶，该载体以温度敏感性的聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)为内核，带正电荷的聚乙烯亚胺(PEI)为外壳；通过静电吸附作用与基因复合；利用肿瘤微环境中较高温度的被动靶向，制备极具临床应用前景的靶向智能纳米凝胶载体材料，实现基因药物对肿瘤更好的治疗。本发明能使载基因给药系统更好的富集到肿瘤部位，提高基因的转染效率，为肿瘤的基因治疗提供一种新的治疗模式。

Description

一种基于温度靶向的纳米凝胶基因递送复合物及其制备方法与应用

技术领域：

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种基于温度靶向的纳米凝胶基因递送复合物及其制备方法与应用。

背景技术：

恶性肿瘤是当今严重威胁人类健康的三大疾病之一，而传统的手术切除、化疗、放疗三大治疗方法由于缺乏靶向性，在治疗肿瘤的同时对机体的正常器官组织产生严重的毒副作用，并且，晚期转移率高，预后多不良，其疗效难以进一步提高。在肿瘤的靶向治疗领域，基因治疗研究正日益受到科学家的普遍关注和重视。肿瘤基因治疗(tumorgenetherap_y)是肿瘤治疗研究中的一项突破，它是伴随着基因操作和DNA重组技术的成熟而发展起来的治疗手段，首先将外源性基因(基因片段、pDNA、RNA等)导入靶细胞，通过修正、补偿、替代或者抑制肿瘤细胞中异常表达的基因，从而达到治疗的目的，也是目前肿瘤治疗研究中的热点。肿瘤的基因治疗面临的首要技术问题是选择一个靶向、安全、高效的载体，能够将带强负电性的基因导入到靶细胞。传统的物理导入技术有显微注射法、电穿孔法等，虽然转染效率比较高，但是对技术和设备要求很高，而且只能在皮肤、肌肉等有限的组织中应用，对靶细胞也有～定的损害，无法在体内进行。病毒载体(逆转录病毒载体、腺病毒载体及腺病毒相关的病毒载体等)虽然转染效率较高，但是存在明显的非靶向性、高免疫原性等缺陷，而且病毒载体的安全性问题一直备受争议。虽然以阳离子脂质体(1iposome)为代表的非病毒载体克服了病毒载体安全性等问题，但是其血清稳定性差、载体体系组成复杂，结构尺寸分布宽，导致其转染效率偏低，虽然透过添加各种辅助成分(胆固醇、乳化剂和分散剂等)可以提高转染效率，但是大量的辅剂的引进降低了其临床应用价值。所以，设计制备结构简单、体内外稳定、转染效率高、特异靶向性的新型非病毒纳米载体是基因治疗的关键。

中国专利CN200610144255.0，申请公布号为CN101190334A，公开了一种热靶向纳米球抗癌药物载体及其制备方法，所述的热靶向纳米球抗癌药物载体采用可生物降解的材料来制作纳米球药物载体，用于包埋抗癌药物，以实现缓释、控释作用；在所述的纳米球的表面共价交联一种低临界溶解温度为37～43℃的热敏型高分子，热敏型高分子的嫁接会导致纳米球具有热靶向癌组织细胞的功能。但是，该技术方案是将温敏高分子修饰在载体表面，这会导致在相变后封闭载体的药物释放，另外临界温度应该只有一个温度而不能是温度区间。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种基于温度靶向的纳米凝胶基因递送复合物，本发明的另一目的是提供该递送复合物的制备方法，以及在制备治疗肿瘤药物中的应用。

本发明的主要技术方案是，提供一种基于温度靶向的纳米凝胶基因递送复合物及其制备方法与应用，也称递释系统，本发明首先合成了具有温度敏感性的聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)内核和带正电荷的聚乙烯亚胺(PEI)外壳；然后将基因药物如p53质粒、蓖麻毒素A蛋白质粒、siRNA(小分子干扰RNA)等通过PEI的正电荷和基因药物的负电荷相结合，制备靶向基因递送复合物，并对其肿瘤基因治疗进行研究。

在本发明中，我们首先选用温度敏感性的亲水化合物——聚N-异丙基丙烯酰胺来修饰阳离子高分子一一聚乙烯亚胺(PEI，25KD)，二者形成两亲性的共聚物。该共聚物能够随着体积相变温度(VPTT)约32℃，进行自组装，形成具有核-壳结构的温敏性的PNIPAM/PEI纳米凝胶。随后，我们通过透射电子显微镜(TEM)证实该纳米凝胶为粒径较窄(约300nm)、结构明确的核-壳结构。该纳米凝胶复合体明显比PEI表面电位低，下降到约20mV，而在293T细胞中的实验证明该纳米凝胶的材料毒性较PEI明显降低。由于PNIPAM/PEI纳米凝胶复合体的大小均一(约300nm)、结构稳定，以及较弱的表面电位(约2mV)，其在含有血清的条件下，转染效率提高了约2倍。当温度接近肿瘤病灶部位温度时，温度T大于VPTT时，转染效率提高了2倍。

本发明的第一方面，提供一种基于温度靶向的纳米凝胶基因递送复合物该递释复合物，该递送复合物是由递释载体和带负电的基因组成：

所述的递释载体，以温度敏感性的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)为内核，以带正电荷的聚乙烯亚胺(PEI)为外壳；

所述的递释载体通过静电吸附作用与带负电的基因复合。

所述的温度敏感性的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，在32度是发生临界相转变行为。

所述的聚乙烯亚胺(PEI)，分子量25KD，为分枝状；

所述的纳米粒径为300nm±25nm。

优选的，所述的温度敏感性的聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，体积相变温度(VPTT)约32℃，即当温度接近肿瘤病灶部位温度时，温度T大于(相转变温度)VPTT时，能够明显促进细胞对载体的内吞。

所述的带负电的基因，优选p53质粒、蓖麻毒素A蛋白质粒、siRNA(小分子干扰RNA)等。

本发明的第二方面，提供一种基于温度靶向的纳米凝胶基因递送复合物该递释复合物的制备方法，该方法包括如下步骤：

A、阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI的制备

先将PEI、NIPAM、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)溶于PBS中，向该PBS体系中通入N₂除氧后，加入叔丁基过氧化氢(TBHP)，在80℃的油浴封闭环境下搅拌反应2--6h；反应结束后，通入O₂搅拌停止反应；37℃下，15000rpm离心纯化凝胶10--20min；用去离子水(Milli-Qwater)重新溶解凝胶；用30KD的透析膜在Milli-Qwater中透析5-10天，制得阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI。

所述的PEI、NIPAM、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)这三者的重量比例为4/6/0.1～6/4/0.1。

B、靶向纳米凝胶递释复合物的制备

步骤A制备得到的阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI与带负电的基因溶于去离子水中，按照不同的N/P比室温静置，形成粒径为300nm±25nm的基因药物递送系统。

所述的N/P比为聚阳离子纳米凝胶中的氨基与质粒DNA中的磷酸基的摩尔比，分别为3，6，7.5，10，15和30。根据凝胶阻滞实验结果我们确定阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI与带负电的基因比例N/P最优为7.5。

所述的步骤A具体为：

先将25KD的PEI、NIPAM、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)溶于PBS中向该体系中通入30min的N₂除氧后，加入TBHP，在80℃的油浴封闭环境下搅拌反应4h；反应结束后，通入O₂搅拌20min停止反应；37℃下，采用落地式高速冷冻离心机纯化凝胶，15000rpm离心15min；用30mLMilli-Qwater重新溶解凝胶；用30KD的透析膜在Milli-Qwater中透析7天，定期换水。保持反应体系总质量不变的情况下，通过调节PEI和NIPAM的比例，即可制备PEI含量不同的聚阳离子纳米凝胶。

所述的步骤B具体为：

步骤A制备得到的智能靶向纳米凝胶PNIPAM/PEI与带负电的基因溶于去离子水中，按照不同的N/P比室温静置30分钟，形成粒径为300nm左右的基因药物递送系统。

本发明的第三方面，提供一种基于温度靶向的纳米凝胶基因递送复合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

所述的递释复合物中带负电的基因，优选为蓖麻毒素A蛋白的表达质粒(pRA-EGFP)。

进一步地，本发明用小动物活体成像仪(CaliperLifeSciences，Hokpinton，MA)来检测我们制备出的这种稳定、均一的纳米凝胶复合体通过尾静脉注射方式在荷瘤裸鼠体内24小时的富集情况。最后用本发明制备出的温敏的、在血清中具有较高稳定性的PNIPAM/PEI纳米凝胶复合体包裹、转染蓖麻毒素A(RA)蛋白的表达质粒pRA-EGFP。我们发现，制备的纳米凝胶复合体可以将pRA-EGFP质粒成功转染到靶细胞，并且由于纳米凝胶复合体具有在血清中高稳定性，细胞靶向性以及增强细胞内质子缓冲能力等特性，经该纳米凝胶复合体包裹pRA-EGFP质粒处理后的荷瘤裸鼠乳腺肿瘤生长受到明显抑制，其中通过尾静脉注射方式给药的肿瘤体积相对于对照减少了2.3倍，而通过瘤内给药组的肿瘤体积相对于对照组减少了5倍。我们的研究结果表明我们制备出的低毒、温敏性的具有核-壳结构的PNIPAM/PEI阳离子纳米凝胶复合体能够成为高效的基因治疗载体。

本发明制备的智能纳米凝胶基因递送复合物体系具有如下特点：

(1)该载体以温度敏感性的聚异丙基丙烯酰胺为内核，带正电荷的聚乙烯亚胺为外壳，通过带正电荷的PEI可以与带负电荷的基因药物相结合，既能提高基因药物的转染效率也能降低单独PEI用于基因药物转染对细胞造成的毒性；

(2)智能纳米凝胶载体可以利用肿瘤组织的增强渗透保持滞留效应实现肿瘤部位的富集，且肿瘤部位较正常组织较高的温度有利于肿瘤细胞对载体的内吞，加之带正电荷的PEI利用自身的“质子海绵”效应促进基因药物从内体中逃逸到细胞质，显著提高基因的转染效率，更好的实现肿瘤的基因治疗。

附图说明：

图1聚阳离子PNIPAM/PEI纳米凝胶的制备过程；

图2纳米凝胶的核磁共振(1H—NMR)图谱；

图3为聚阳离子PNIPAM/PEI纳米凝胶粒径及zeta电位测定结果，其中A图为纳米凝胶粒径分布图，B图为纳米凝胶zeta电位分布图；

图4聚阳离子纳米凝胶/质粒复合体的凝胶电泳阻滞实验，其中图4A为聚阳离子纳米凝胶/质粒复合物的凝胶电泳阻滞实验；图4B为聚阳离子纳米凝胶/质粒复合体对DNaseI酶切的稳定性；

图5聚阳离子纳米凝胶/质粒复合体转染细胞；

其中图5A荧光显微镜观察聚阳离子纳米凝胶的转染；图5B流式细胞仪检测聚阳离子纳米凝胶的转染效率；图5C荧光显微镜观察聚阳离子纳米凝胶分别包裹QD，pRA-EGFP转染细胞；图5D流式细胞仪检测聚阳离子纳米凝胶的转染效率；

图6聚阳离子纳米凝胶/质粒复合体对细胞的增殖抑制实验；

图7聚阳离子纳米凝胶/质粒复合体在体表分布；

图8聚阳离子纳米凝胶/质粒复合体在体内分布；其中图8A为PEI-FITC组和PNIPAM/PEI-FITC组纳米凝胶在体内的富集情况；图8B为在肿瘤组织中的富集情况；

图9聚阳离子纳米凝胶在裸鼠主要脏器及肿瘤组织的分布情况；

图10聚阳离子纳米凝胶/质粒复合体对裸鼠肿瘤生长抑制实验。

具体实施方式：

以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1：聚阳离子PNIPAM/PEI纳米凝胶的制备

0.80g25KPEI(购自美国Sigma-Aldrich)到50mLPBS溶液，用盐酸调PH到7；准确称取0.60gNIPAM晶体(购自(上海)化成工业发展有限公司)，14.00mgBIS晶体(购自中国梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)到上述溶液中：

将上述混合液转移到250mL磨口烧瓶中(内有一枚搅拌子)，补加

50mLPBS溶液；

将烧瓶底部浸入含有硅油的恒温磁力搅拌器，搅拌下加热硅油到50℃；

向体系中通入高纯氮(N₂)并搅拌30min；

并向体系加入250μl0.01M叔丁基过氧化氢(TBHP)；

30min后，加热硅油到80℃，在80℃条件下，封闭环境下继续搅拌反应4小时；

4小时后，通入O₂，搅拌20分钟；

收集制备的凝胶，37℃下，采用落地式高速冷冻离心机纯化凝15000rpm离心15min；用30mLMilli-Qwater重新溶解凝胶沉淀；

采用MWCO＝30K透析膜透析凝胶溶液，每天更换Milli-Qwater，连续透析7天。聚阳离子PNIPAM/PEI纳米凝胶的合成线路图如图1所示。制得阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI，PEI占递释载体含量的25％。

实施例2：聚阳离子PNIPAM/PEI纳米凝胶核磁共振表征

冷冻干燥透析后的凝胶，取适量凝胶粉末，溶于D₂O中，我们用核磁共振仪对纳米凝胶的组分进行分析，如图2所示，为PEI、NIPAM、PNIPAM/PEI纳米凝胶的核磁共振(¹H-NMR)图谱。各吸收峰如图所示：图中(a)所示为PEI的氨基(2.4ppm)的特征质子共振峰，图中(b)所示为NIPAM异丙基(0.85ppm)的特征质子共振峰，PNIPAM/PEI纳米凝胶中既具有PEI的特征峰，又具PNIPAM的特征峰，可见我们已经成功将PEI与PNIPAM接枝形成纳米凝胶共聚物。

实施例3：不同N/P的复合物溶液的粒径及zeta电位测定

待测样品的准备：用Milli-Qwater稀释10倍透析后的凝胶；

取0.5mL待测样品，加入样品池，并确认测定容器中无气泡产生后。每个样品重复测定3次。测量条件为：170^o散射角，25℃。实验结果如图3所示：(A)为聚阳离子纳米凝胶粒径分布图，从图中可以看到其平均粒径为300nm±25nm；(B)为聚阳离子纳米凝胶的zeta电位分布图，其电位分布为20mV±5mV。

实施例4：聚阳离子纳米凝胶/质粒复合体的凝胶电泳阻滞实验

pRA-EGFP质粒的提取：

(1)大肠杆菌TGl感受态细胞的制备方法如下：

挑取单一大肠杆菌菌落于5mL的LB培养基，37℃振荡培养过夜，制备过夜菌；按l：100将过夜菌接种到100mL液体LB培养基，37℃振荡培养约3h，OD₆₀₀值约为0.4时停止；菌液加入到无菌的50mL离心管，4℃，3500rpm离心10分钟，取细菌沉淀：以初始培养基1/10的体积加入预冷的TSS溶液，100μl/管分装；-80℃保存备用。转化方法如下：将上述连接产物加入100μl大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30分钟后42℃热激90秒，然后冰浴2分钟。加入不含Kan的LB培养基800μl，37℃，180rpm震荡培养45分钟后，将转化菌液涂布于含Kan的LB平板上，37℃倒置培养12小时。

(2)pRA-EGFP质粒的提取：

通过质粒大抽试剂盒提取质粒DNA：挑取LB平板上的单克隆，加入5mL含Kan的LB培养基中，37℃，200rpm培养8小时；再将含Kan的LB培养基稀释菌液至1/500-1/1000，37℃,300rpm培养12小时；收集细菌培养液并于4℃，35000rpm离心20分钟，弃上清；6mLBufferP1缓冲液重悬菌体后，再加入6mLBufferP2缓冲液，上下颠倒数次充分混匀后，室温(15-25℃)静置5分钟；加入6mLChilledBufferP3缓冲液，立即颠倒混匀数次充分混匀，至完全变白；将裂解液加入QIAfilterCartridge，室温静置l0分钟；不要插入注射器内芯；平衡HiSpeedMidi-加入4mLBufferQBT，通过重力作用使其流尽：将QIAfitter下面的帽拧掉，将内芯缓慢插入QIAfilterCartridge，将裂解液打入预先平衡的HiSpeedTip；裂解液通过重力作用通过膜；用20mLBufferQC缓冲液洗脱HiSpeedMidi；然后用5mLBufferQF缓冲液洗脱DNA(注：前3-4滴不要)，用15mL智能靶向纳米凝胶的构建及其抗肿瘤机制的研究离心管接BufferQF缓冲液洗脱的DNA；加入3.5mL(0.7倍体积)的异丙醇，混匀，静置5分钟；将20mL注射器的内芯拔出，插上QIApreapitatorMidiMoclule；将洗脱的DNA/异丙醇加到注射器中，插入内芯，用恒力将混合物推入QIApreapitator：拔掉QIApreapitator，拔出内芯，再插上QIApreapitator，将2mL乙醇加到注射器中，洗DNA；拔掉QtApreapitator，拔出内芯，再插上QIApreapitator，空推一次，尽量将乙醇除尽，重复一次；在吸水纸上晾干QIApreapitator，使乙醇挥发干净；将新的5mL注射器的内芯拔出，插上QIApreapitator，加1mLBufferTE缓冲液至5mL注射器中，将溶解的DNA推入1.5mLEP管中；拔掉QIApreapitator，拔出内芯，再插上QIApreapitator；将得到的DNA溶液转移到5mL注射器中，再推到1.5mLEP管中；用微量紫外分光光度计测定A₂₆₀/A₂₈₀两处的OD值，检测质粒DNA的浓度

(3)聚阳离子纳米凝胶/质粒复合体样品的制备：

聚阳离子PNIPAM/PEI纳米凝胶，用去离子水稀释，分别于pRA.EGFP质粒按N/P比(聚阳离子纳米凝胶中的氨基与质粒DNA中的磷酸基的摩尔比)为3，6，7.5，10，15和30的比例混合(其中质粒含量相同，为6μg/样品)，室温静置30分钟，使聚阳离子纳米凝胶/质粒复合体充分形成。

电泳条件：0.7％琼脂糖(含5ug/mL溴化乙锭)，l×TAE缓冲液，电压80V，DNA条带在紫外灯下进行观察。

用琼脂糖凝胶电泳实验分析裸质粒DNA及聚阳离子纳米凝胶/质粒复合体对DNaseI的酶切稳定性。将DNaseI(10U/mL)溶于上述制备的20ul不同N/P比的聚阳离子纳米凝胶/质粒复合体中，37℃孵育30分钟，然后加入0.5mM的EDTA2μL终止酶切，反应于80℃，2分钟。裸质粒DNA用相同方法处理。然后取10μL用0.7％琼脂糖凝胶电泳实验分析，方法同上述。实验结果如图4.A所示：纳米凝胶与DNA的比例不同，其结合效率也是不同的，随着N/P比的增加，结合DNA的比例也在增加，在N/P比达到7.5时，DNA几乎完全结合到纳米凝胶上。由图4.B结果可知，纳米凝胶可使所载的DNA具有抵抗核酸酶降解的能力。复合体中的DNA在37℃、酶切消化后，仍然保持结构的完整，质粒被阻滞于加样孔中，而裸DNA在相同的条件下30分钟即被完全降解。可见，纳米凝胶的基因转移系统对外源质粒DNA可提供完成的保护作用，使DNA结构保持完好，从而确保其在体内可能得以正常表达。

实施例5：聚阳离子纳米凝胶/质粒复合体细胞转染

细胞铺板：将处于对数生长期的人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞(购自中科院细胞所)消化、离心后计数，在24孔板中每孔接种1.0×10⁵细胞，每孔加入200μL含10％FCS的细胞培养液，放置于7％CO₂，37℃的细胞培养箱中，过夜培养；

用含10％FCS的细胞培养液分别稀释阳离子纳米凝胶-PNIPAM/PE凝胶溶液、25KPEI至不同的浓度，之后按照每孔200μL的量将不同浓度的溶液加入到24孔板中，并放置在7％CO₂，37℃的细胞培养箱中；细胞加入凝胶溶液，放置到相应温度的孵箱中(30℃，37℃)，培养8小时；

制备阳离子PNIPAM/PEI纳米凝胶和25KPEI溶液N/P均为3，6，7.5；

8小时后，用移液枪吸去24孔板中培养液,然后每孔加入PBS溶液并吸弃，以洗去死细胞和未被细胞内吞的高分子，每孔按照此方法，轻柔洗两遍；然后每个补充新的含10％FCS的细胞培养液继续培养16小时；

16小时后，用移液枪吸去24孔板中培养液然后每孔加入PBS溶液并吸弃，轻柔洗两遍；然后用OLYMPUSDP-70荧光显微镜观察转染情况；荧光显微镜观察后，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，制备成细胞悬液，于流式管中，于4℃，1200rpm×5min，洗两遍，之后用200μL流式洗脱液(2％FCS，使用PBS稀释)重悬细胞，流式定量检测荧光凝胶内吞情况，并验证其温度敏感特性，方法同上。实验结果如图5所示。我们选用了3个不同的浓度配比N：P(凝胶：质粒)分别是3，6，7.5。在相同的转染条件下，用流式细胞仪检测其转染效率，结果如图5A、B所示：当N：P＝3时，纳米凝胶转染效率为8.9％，而PEI转染的效率仅为5.7％；而随着N：P的增加，转染效率也随着增大；当N：P＝7.5时，PNIPAM/PEI凝胶转染效率为26.9％，而25KPEI转染的效率仅为16.5％。同样制备方法下，我们分别采用量子点(QD)标记凝胶、凝胶与质粒的浓度配比(N:P比)为7.5转染质粒，在相同的转染条件下，用荧光显微镜观察温度对其转染效率的影响，如图5C、D所示：随着温度的增加，25KPEI转染效率较低，而且没有表现出温度响应性；而我们制备的聚阳离子PNIPAM/PEI纳米凝胶随着温度的增加，当温度T大于VPTT时，其表现出良好的温度响应性，转染效率提高了一倍。这是由于我们合成的具有核-壳结构的两亲性的聚阳离子纳米凝胶具有良好的温度响应性，在形成纳米胶束后，其中的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)内核部分发生明显的由无规线团到卷曲球的相转变，呈现出良好的温敏效应。

实施例6：聚阳离子纳米凝胶/质粒复合体对细胞的增殖抑制实验

细胞铺板：96孔板，方法同实施例5中细胞铺板方法一样。

用含10％FCS的细胞培养液分别稀释阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI凝胶溶液、pRA-EGFP质粒溶液至不同的浓度，之后按照每孔100μL的量将不同浓度的溶液加入到96孔板中，并放置在7％CO₂，37℃的细胞培养箱中；每个样品浓度设置5个复孔，每组重复3次，设不加细胞的空白孔和不进行任何处理的一项对照孔；细胞加入凝胶溶液，放置到孵箱中(37℃)，培养24小时；其中，纳米凝胶/质粒复合体溶液浓度分别为3ug/mL，6.25μg/mL，12.5μg/mL，15μg/mL，17.5μg/mL,25μg/mL；裸质粒溶液的浓度分别为30μg/mL，60μg/mL，90μg/mL，120μg/mL；

24小时后，用移液枪吸去96孔板中培养液然后每孔加入100μlPBS溶液并吸弃，以洗去死细胞和未被细胞内吞的高分子，每孔按照此方法轻柔洗两遍；

配制细胞增殖检测溶液：方法同前述，现用现配；

将细胞增殖检测液加入到每个待检测的样品孔中，动作轻柔，并注意防止气泡的产生，然后将细胞放置在7％CO₂，37℃的细胞培养箱中，孵育2小时；2小时后，使用BIO-TEKElx800全自动酶标仪在450nm波长处，读取样品孔的吸光值，并计算细胞生存率；细胞生存率计算方法：

survivingratio＝(OD450_scan-OD450_nc)/(OD450_pc-OD450_nc)×100％

OD450_sam：实验组在450nm波长下的吸光值；

OD450_no：阴性对照组在450nm波长下的吸光值；

OD450_pc：阳性对照组在450nm波长下的吸光值。

实验结果如图6所示。蓖麻毒素(RicinA)质粒在没有载体协助下，不能够进入细胞，几乎对细胞的增殖抑制不产生影响，从而影响了发挥其抗肿瘤作用，也验证了单独的RA不能进入完整的细胞膜的理论。而纳米凝胶/质粒的复合体的半数抑制浓度(50％growthinhibitoryconcentration，IC50)在12.5μg/mL左右，其杀伤率均明显高于含有同剂量的蓖麻毒素(RicinA)质粒。表明纳米凝胶/质粒复合体可以强烈地抑制细胞蛋白质的合成。我们制备的纳米凝胶/质粒复合体能够在细胞水平上发挥抗肿瘤作用，可以进一步通过动物水平验证我们结论。

实施例7：聚阳离子纳米凝胶/质粒复合体在体内分布

裸鼠乳腺癌肿瘤模型的建立，方法如下：

购买的雌性Balb/c裸鼠(4周龄，约20g)，在进行皮下接种肿瘤细胞实验前，先在恒温(25-27℃)、恒湿(45-50％)、新鲜空气高度除尘除菌、无特殊病原体(SPF级)环境下适应一周，动物饲养在有机玻璃饲养盒内，安放层流式超净架内，每只饲养盒内饲养5只动物，灭菌处理的水和饲料供动物自由摄入。观察一切正常后，方可进行后续实验；取对数生长期的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231-luc细胞，用胰酶将处于对数生长期的MDA-MB-231-luc细胞消化，用无菌PBS重悬细胞，制备成MDA-MB-231-luc细胞悬液，调整细胞浓度至1×10⁷个/mL；选取Balb/c裸鼠(雌性，5周龄，约20g)，取细胞悬液接种至裸鼠右背部皮下，每只裸鼠接种的细胞数为1×10⁷个；裸鼠精心饲养2周后，选择肿瘤生长良好，肿瘤体积长至约50mm³的裸鼠，作为实验模型，然后每只荷瘤裸鼠注射D-Luciferase底物的剂量为150mg/kg，通过小动物活体成像仪(CaliperLifeSciences，Hokpinton，MA)初步观察裸鼠乳腺癌模型的构建情况。

肿瘤体积计算公式：体积V＝长×宽×宽/2。

当裸鼠的肿瘤体积达到50-60mm³时，即可进行体内分布实验。

将荷瘤裸鼠随机分成3组，每组3只，分别通过尾静脉注射100μl/只包裹FITC的PEI溶液(PEI-FITC)和100μl/只包裹FITC的纳米凝胶(PNIPAM/PEI-FITC，i.v.)，以及通过瘤内给药100μl/只样品包裹FITC的纳米凝胶(PNIPAM/PEI-FITC，i.t.)，每只荷瘤裸鼠注射FITC荧光素的剂量为5mg/kg。每天注射1次，连续注射3天。

麻醉荷瘤裸鼠，分别在0h(未注射样品前，作为空白对照)、6h、8h、12h和24h五个不同时间点用小动物活体成像仪考察三组纳米凝胶样品在裸鼠体内分布情况并拍照，激发波长为500nm。

24h后，对荷瘤裸鼠实施安乐死，取出裸鼠的肿瘤组织及心、肝脏、脾脏和肾脏主要组织，同时用小动物成像系统拍照，考察荧光高分子在主要组织的分布，激发波长为500nm。

实验结果如图7，8所示。我们通过皮下接种携带荧光素酶(luc)基因的乳腺癌细胞MDA-MB-231-luc注入裸鼠体内，当裸鼠肿瘤体积达到50-60mm³时，通过对每只荷瘤裸鼠注射D-Luciferase底物，应用小动物活体成像仪(CaliperLifeSciences，Hokpinton，MA)观察乳腺癌模型的建立MDA-MB-231-luc细胞株，如图7所示，使用小动物活体成像仪初步观察，ROI荧光分布显示于裸鼠背部表皮，表明我们已经成功构建了裸鼠皮下乳腺癌模型。

为进一步评价包裹荧光物质FITC的纳米凝胶与包裹荧光物质FITC的PEI在裸鼠体内的分布情况和肿瘤部位的靶向聚集情况，以及评价尾静脉给药与瘤内给药的在体内的给药效果。我们分别通过尾静脉注射包裹等量的FITC的PEI溶液(PEI-FITC)和纳米凝胶(PNIPAM/PEI-FITCi.V.)，以及通过瘤内给药的纳米凝胶(PNIPAM/PEI-FITC，i.t.)，利用小动物活体成像系统通过观察FITC的荧光信号在不同时间点的体内分布情况，来评价纳米凝胶载体在裸鼠体内的分布情况。如图8A所示，PEI-FITC组和PNIPAM/PEI-FITC组纳米凝胶在体内的富集情况。给药24小时，小动物活体成像荧光图片显示出相对于PEI-FITC组，纳米凝胶载体(PNIPAM/PEI-FITC)组可以靶向运载FITC到肿瘤部位；同时，通过瘤内给药的PNIPAM/PEI-FITC纳米凝胶组(PNIPAM/PEI-FITC，i.t.)可以明显增强富集FITC到肿瘤部位。说明反映出纳米凝胶其温度的被动靶向可以促进FITC富集于肿瘤部位。同时，为了更加明确的观察荧光物质FITC的荧光信号，在给药24h后，我们对裸鼠实施安乐死，并取出裸鼠的肿瘤组织、心、肝脏、脾脏和肾脏用小动物活体成像系统进行进一步观察。结果如图8B所示，只有在纳米凝胶(PNIPAM/PEI-FITC)组中FITC主要分布在肿瘤组织中，而且瘤内给药比尾静脉给药更为明显；而通过尾静脉给药的PEI-FITC组中，FITC只富集在肝脏部位，没有靶向到肿瘤部位。这是由于EPR效应以及纳米凝胶具有温度响应性的被动靶向作用，使得凝胶在肿瘤部位具有明显的富集。通过此步的研究，我们可以进一步确定靶向荧光凝胶可以富集在小鼠的肿瘤部位。

实施例8：聚阳离子纳米凝胶在裸鼠主要脏器及肿瘤组织的分布情况

裸鼠乳腺癌肿瘤模型的建立和纳米凝胶在荷瘤裸鼠体内的分布实验，实验方法同实施例7中方法一样。用小动物活体成像仪考察荷瘤裸鼠的体内主要脏器和肿瘤组织的纳米凝胶的荧光分布情况后，将所取出的裸鼠的肿瘤组织及心、肝脏、脾脏和肾脏5种主要脏器，立即固定在4％的多聚甲醛中，室温固定过夜；取出固定好的组织，用组织包埋剂OCT包埋，放置在液氮中迅速冷冻，并于-20℃条件下进行冰冻切片，厚度10μm/样本。

用适量含0.5％DAPI的Mouting，将切片样本覆盖，盖上盖玻片，并用指甲油封片，于4℃恒湿、避光条件保存。

用倒置荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察FITC的绿色荧光和DAPI染色剂的蓝色荧光。

实验结果如图9所示：蓝色荧光为DAPI染的细胞核，绿色荧光表示FITC聚集的位置；从图中我们可以看到载有FITC的纳米凝胶载体主要分布在小鼠的肿瘤中(这是因为肿瘤中的绿色荧光强度最强)，而在肝脏和肾脏中仅有少量的凝胶存在。这是由于具有纳米尺寸凝胶的EPR效应和具有温度敏感的被动靶向作用使得凝胶在肿瘤部位具有明显的富集，同时也印证了肿瘤组织周围具有高温、高渗透、长阻滞现象的存在。

实施例9：聚阳离子纳米凝胶/质粒复合体对裸鼠肿瘤生长抑制实验

裸鼠乳腺癌肿瘤模型的建立，实验方法如实施例7所示：

当裸鼠肿瘤体积达到50-60mm³时(即肿瘤生长进入增生阶段)，即可进行体内肿瘤生长抑制实验，体积计算公式如前所述；

将荷瘤裸鼠随机分成3组，包括对照组、包裹蓖麻毒素(RicinA)质粒的纳米凝胶尾静脉给药组(PNIPAM/PEI-pRA-EGFP，i.v.)和包裹蓖麻毒素(RicinA)质粒的纳米凝胶瘤内给药组(PNIPAM/PEI-pRA-EGFP，i.t.)，每组5只，每只荷瘤裸鼠每次注射的剂量为0.1mL，每只荷瘤裸鼠每次注射蓖麻毒素A质粒的剂量为200μg/只。连续3天，每天注射一次，共计给药3次。

随时观察记录每组荷瘤裸鼠的生存情况，每天测量其肿瘤的大小并测量裸鼠的质量；

在尾静脉注射完药物的第25天，对全部实验的荷瘤裸鼠实施安乐死，取出其肿瘤组织，并测量每组荷瘤裸鼠肿瘤组织的体积和质量，并进行数据整理。实验结果如图10所示：纳米凝胶复合体包裹pRA-EGFP质粒处理后的荷瘤裸鼠乳腺癌肿瘤生长受到明显抑制，统计学差异明显，其中通过尾静脉注射方式给药的肿瘤体积相对于对照组减少了2.3倍，而通过瘤内给药的肿瘤体积相对于对照组减少了5倍；肿瘤体积的抑制效果与图9所示抑制效果得出的结论相一致，即纳米凝胶复合体包裹pRA-EGFP质粒处理后的荷瘤裸鼠乳腺癌肿瘤生长抑制效果明显。我们的研究结果表明我们制备出的低毒、温敏性的具有核-壳结构的PNIPAM/PEI阳离子纳米凝胶复合体能够成为高效的基因治疗载体。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (9)

1.一种基于温度靶向的纳米凝胶基因递送复合物该递释复合物，其特征在于，该递送复合物是由递释载体和带负电的基因组成：

所述的递释载体，以温度敏感性的聚N-异丙基丙烯酰胺为内核，以带正电荷的聚乙烯亚胺为外壳；

所述的递释载体通过静电吸附作用与带负电的基因复合。

2.根据权利要求1所述的一种基于温度靶向的纳米凝胶基因递送复合物该递释复合物，其特征在于，所述的温度敏感性的聚N-异丙基丙烯酰胺在32度是发生临界相转变行为。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于温度靶向的纳米凝胶基因递送复合物该递释复合物，其特征在于，所述的聚乙烯亚胺分子量25KD，为分枝状。

4.根据权利要求1或2所述的一种基于温度靶向的纳米凝胶基因递送复合物该递释复合物，其特征在于，所述的纳米粒径为300nm±25nm。

5.根据权利要求1或2所述的一种基于温度靶向的纳米凝胶基因递送复合物该递释复合物，其特征在于，所述的带负电的基因，为p53质粒、蓖麻毒素A蛋白质粒，或siRNA。

6.如权利要求1所述的一种基于温度靶向的纳米凝胶基因递送复合物该递释复合物的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

A、阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI的制备

先将PEI、NIPAM、N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶于PBS中，向该PBS体系中通入N₂除氧后，加入叔丁基过氧化氢，在80℃的油浴封闭环境下搅拌反应2--6h；反应结束后，通入O₂搅拌停止反应；37℃下，15000rpm离心纯化凝胶10--20min；用去离子水重新溶解凝胶；用30KD的透析膜在去离子水中透析5-10天，制得阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI；

所述的PEI、NIPAM、N,N-亚甲基双丙烯酰胺这三者的重量比例为4/6/0.1～6/4/0.1；

B、靶向纳米凝胶递释复合物的制备

步骤A制备得到的阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI与带负电的基因溶于去离子水中，按照不同的N/P比室温静置，形成粒径为300nm±25nm的基因药物递送系统。

7.根据权利要求6所述的一种基于温度靶向的纳米凝胶基因递送复合物该递释复合物的制备方法，其特征在于，

所述的步骤A具体为：

先将25KD的PEI、NIPAM、N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶于PBS中向该体系中通入30min的N₂除氧后，加入TBHP，在80℃的油浴封闭环境下搅拌反应4h；反应结束后，通入O₂搅拌20min停止反应；37℃下，采用落地式高速冷冻离心机纯化凝胶，15000rpm离心15min；用30mL去离子水重新溶解凝胶；用30KD的透析膜在去离子水中透析7天，定期换水。保持反应体系总质量不变的情况下，通过调节PEI和NIPAM的比例，即可制备PEI含量不同的聚阳离子纳米凝胶。

8.根据权利要求6所述的一种基于温度靶向的纳米凝胶基因递送复合物该递释复合物的制备方法，其特征在于，

所述的步骤B中，所述的N/P比为3，6，7.5，10，15或30。

9.如权利要求1所述的一种基于温度靶向的纳米凝胶基因递送复合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。