CN113633613A - 一种siRNA胶束、制备方法、组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种siRNA胶束、制备方法、组合物及其应用，涉及纳米药物技术领域。本发明提供了一种siRNA胶束作为一种新型的SNAs，不仅可以避免血液中核酸酶的降解，而且可以通过SRs介导的胞吞和内吞作用穿越血脑屏障进入脑肿瘤细胞。此外，作为一种新型的高分子胶束，siRNA胶束可以控制封装和释放化学药物，进而用于siRNA/药物(化疗‑RNAi技术)协同治疗脑胶质瘤。药物的类型可以是核酸药物或化学药物，借助siRNA的靶向实现目的基因的沉默，同时又可以释放负载的药物实现肿瘤等其他疾病的治疗。

Description

一种siRNA胶束、制备方法、组合物及其应用

相关申请的交叉引用

本公开要求于2021年07月20日提交中国专利局的申请号为2021108438669、名称为“一种siRNA胶束、制备方法、组合物及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本公开中。

技术领域

本发明涉及纳米药物技术领域，具体而言，涉及一种siRNA胶束、制备方法、组合物及其应用。

背景技术

核酸药物包括具有不同功能的寡聚核糖核苷酸(RNA)和寡聚脱氧核糖核苷酸(DNA)，主要在基因水平上发挥作用，在人类的多种基因疾病的治疗中展现出良好的前景。其中siRNA(小干扰核糖核苷酸)可以在不影响正常基因表达的情况下特定下调靶基因的表达，从而达到基因治疗的目的。然而，siRNA在治疗脑胶质瘤的应用中存在着重重挑战，如半衰期短，容易被降解，难以穿越血脑屏障，难以被细胞内吞等问题。所幸，纳米载体的出现给siRNA在脑胶质瘤方面的应用带来了光明的前景。

目前，迄今为止，siRNA递送载体主要为阳离子纳米粒子，包括聚阳离子、脂质和无机纳米粒子。然而，阳离子纳米粒子可能是有毒的，对动物和人体存在潜在的免疫原性，并且过量的阳离子也使纳米颗粒易于在肾小球基底膜上分解，导致siRNA被肾脏清除。因此，使用非阳离子载体进行高效的siRNA递送是siRNA递送系统发展的新方向。

近年来，已经开发了几种有前途的非阳离子载体，包括基于核糖核蛋白的八聚体、基于bottlebrush结构的聚乙二醇、外泌体，球形核酸和siRNA偶联物。然而，除了SNA纳米颗粒(球形核苷酸纳米颗粒)，多数递送载体都不能使siRNA穿越血脑屏障。但是，现有的SNA虽然可以有效地穿越血脑屏障，并且被靶细胞内吞，但是大多数的SNA的内核难以降解，对人体具有潜在的长期毒性，在靶组织的浓度不高，只能用作核酸药物，不能同时携带化学药物。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种siRNA胶束、制备方法、组合物及其应用以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种siRNA胶束，siRNA胶束是在温度大于LCST时，由一端亲水性siRNA一端疏水的聚合物自组装形成的具有亲水外壳和疏水内核的纳米粒子，形成疏水内核的疏水性聚合物为聚(N-异丙基丙烯酰胺)-DBCO，形成亲水外壳的亲水性分子为N₃-siRNA分子，聚(N-异丙基丙烯酰胺)-DBCO与N₃-siRNA分子通过形成共价键连接。

发明人提供了一种新的非阳离子结构的SNA—siRNAmicelle(即为siRNA胶束)，该胶束由二嵌段复合物自组装形成：

siRNA-disulfide-poly(N-isopropylacrylamide)，其中文名称为siRNA-二硫键-聚(N-异丙基丙烯酰胺)，简称为siRNA-SS-PNIPAM。siRNA胶束作为一种新型的SNAs，不仅可以避免血液中核酸酶的降解，而且可以通过SRs介导的胞吞和内吞作用穿越血脑屏障进入脑肿瘤细胞。此外，作为一种新型的高分子胶束，siRNA胶束可以控制封装和释放化学药物，进而用于siRNA/药物(化疗-RNAi技术)协同治疗脑胶质瘤。

上述胶束可以载药，药物的类型可以是核酸药物或化学药物，借助siRNA实现靶向目的基因的沉默，同时又可以释放负载的药物实现对肿瘤等其他疾病的治疗。

聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物具有温度敏感性的特征，当温度小于LCST(低临界相转变温度)时，聚合物游离存在于溶液中；当温度大于LCST时，形成聚合物胶束。因此，在生理温度条件下，一端亲水(siRNA)和一端疏水(PNIPAM)的二嵌段复合物形成胶束型球形核酸纳米粒子(即为siRNA胶束)。

上述siRNA胶束有良好的均一性和结构稳定性，具有良好的药物装载和优良的药物输送能力，具有良好的生物相容性和还原敏感能力(癌细胞的还原环境下迅速释放药物的能力)。发明人研究发现，siRNA胶束特定下调PLK1基因和STAT3基因，可以协同TMZ(替莫唑胺)表现出良好的抑制肿瘤生长的作用。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述siRNA胶束中聚(N-异丙基丙烯酰胺)-DBCO与N₃-siRNA的物质的量比为1:10-30。例如可以是1:18，1:19，1:20或1:21。

siRNA选自如下至少一种基因的siRNA：荧光报告基因、PLK1基因和STAT3基因；

荧光报告基因为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC。

所述PLK1基因的siRNA如SEQ ID NO.1-2所示，所述STAT3基因的siRNA如SEQ IDNO.3-4所示。

(PLK1基因的siRNA:5’-UGA AGA AGA UCA CCC UCC UUA dTdT-3’(sense，SEQ IDNO.1)；5’-UAA GGA GGG UGA UCU UCU UCA dTdT-3’(antisense，SEQ ID NO.2)；

STAT3基因的siRNA:5’-GGA CGA CUU UGA UUU CAA Ctt-3’(sense，SEQ IDNO.3)；5’-GUU GAA AUC AAA GUC GUC Ctg-3’(antisense，SEQ ID NO.4)；

荧光修饰的siRNA，对照组siRNA序列如下：

Scramble:5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UdTdT-3’(sense，SEQ ID NO.5)；5’-ACG UGA CAC GUU CGG AGA AdTdT-3’(antisense，SEQ ID NO.6.)；

本发明提供了一种siRNA胶束的制备方法，其包括如下步骤：将聚(N-异丙基丙烯酰胺)-DBCO与siRNA分子混合反应，使得N₃-siRNA和聚(N-异丙基丙烯酰胺)-DBCO自组装形成具有亲水外壳和疏水内核的纳米粒子。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述混合反应的温度为-25℃～-18℃，混合反应时间为8-15h。混合反应的温度为-25℃，混合反应时间为12h。

制备聚合物胶束，LCST为37度，实际使用温度低于37度，高于20度能制备得到球形。例如21.7,24.8,26.5,或29.3℃。

优选地，制备方法还包括在混合反应后去除未反应的N₃-siRNA分子和聚(N-异丙基丙烯酰胺)-DBCO。例如通过加热离心的方法去除未反应的N₃-siRNA分子，利用异丙醇溶剂去除未反应的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-DBCO。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述制备方法还包括合成疏水性聚合物(N-异丙基丙烯酰胺)-DBCO，合成(N-异丙基丙烯酰胺)-DBCO的方法包括：以物质的量比为1-1.2:3:1-1.2的PNIPAM-SS-NH₂、DBCO-NHS酯和TEA为原料进行混合反应。优选地，投料比为1:3:1。

需要说明的是，上述物质的量比仅为本发明提供的一种添加反应比，在其他实施方式中，也可根据需要进行自适应选择，只要能制备得到反应物聚(N-异丙基丙烯酰胺)-DBCO的质量配比均在本发明的保护范围之内。

优选地，先以PNIPAM-SS-NH₂、TEA和DMF混合反应，优选地，室温下反应1-2h，然后加入DBCO-NHS酯继续反应制得PNIPAM-SS-DBCO；优选地，继续反应20-24h。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述制备方法还包括合成PNIPAM-SS-NH₂，PNIPAM-SS-NH₂的合成包括：以物质的量比为1-1.1:3:4:4:8的PNIPAM、t-Boc-胱胺、EDC、NHS和TEA为原料混合反应。

优选地，PNIPAM-SS-NH₂的合成是先将PNIPAM、EDC和NHS混合进行活化反应，然后加入t-Boc-胱胺和TEA进行混合反应；

优选地，活化反应是在室温下反应2-5h，加入t-Boc-胱胺和TEA后的混合反应是在室温下反应20-24h。

PNIPAM的分子量为2K-5K。例如可以是2K、3K、4K或5K。

本发明还提供了一种组合物，其包括siRNA胶束或由上述制备方法制备的siRNA胶束、以及药物，siRNA胶束装载有药物。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述药物被包覆于siRNA胶束的疏水内核中。优选地，siRNA胶束理论载药量为5-20wt.％。自组装形成siRNA胶束过程中，疏水性药物被封装到疏水内核中。当温度小于LCST时，siRNA-SS-PNIPAM二嵌段复合物游离存在于水溶液中，当升高温度到37度时，PNIPAM由亲水变为疏水，siRNA-SS-PNIPAM经自组装过程形成siRNA胶束。

优选地，药物选自治疗癌症药物、治疗肥胖相关疾病的药物、治疗糖尿病相关疾病的药物、治疗肝脏功能损伤相关疾病的药物或降糖降脂药物。在其他实施方式中，上述siRNA胶束可以装载疏水性药物。

癌症选自如下疾病中的至少一种：多形性胶质母细胞瘤、肺癌、淋巴瘤、胃癌、食管癌、鼻咽癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌和白血病。

肥胖相关疾病包括如下疾病中的至少一种：肥胖症、代谢综合症、心血管疾病、高脂血症、高胆固醇血症、高血压、胰岛素抗性综合征、肥胖相关的胃食管返流症和脂肪性肝炎。

在其他实施方式中，上述“肥胖相关疾病”可选自如下疾病：过食症(overeating)、暴食症(binge eating)、易饥症、高血压、糖尿病、血浆胰岛素浓度升高、胰岛素抗性、高脂血症、代谢综合征、胰岛素抗性综合征、肥胖相关的胃食管返流症、动脉硬化症、高胆固醇血症、高尿酸血症、下背痛、心脏肥大和左心室肥大、脂肪代谢障碍、非酒精性脂肪性肝炎、心血管疾病，和多囊性卵巢综合征，以及具有这些肥胖相关疾病包括希望减轻体重的那些对象。

抗肥胖症化合物如芬氟拉明、右芬氟拉明、芬特明、西布曲明、奥利司他、神经肽Y5抑制剂和β3肾上腺素能受体激动剂。

糖尿病相关疾病包括如下疾病中的至少一种：二型糖尿病、胰岛素抗性综合征、葡萄糖不耐症、高血脂絮乱、糖尿病肾病变并发症、糖尿病神经病变、糖尿病眼睛病变、心血管疾病、糖尿病足。

肝脏功能损伤相关疾病包括如下疾病中的至少一种：脂肪肝、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌。

上述降糖降脂药物为GLP-1受体激动剂(即GLP-1RA)或GLP-1模拟物、GIP受体激动剂(即葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽受体激动剂，也称为胃抑肽受体激动剂)、二肽基肽酶-4(即DPP-4)抑制剂中的至少一种。GLP-1受体激动剂或GLP-1模拟物选自艾塞那肽、利拉鲁肽、索马鲁肽、口服剂型索马鲁肽、贝那鲁肽、利司那肽和艾塞那肽周制剂中的至少一种。

优选地，上述药物选自替莫唑胺。发明人发现这些siRNA胶束实现了强大的脑肿瘤积累和突出的肿瘤生长抑制，而且没有造成不良反应。当装载商业化的脑肿瘤化疗药物替莫唑胺(TMZ)时，siRNA胶束对TMZ耐药肿瘤显示出显著的协同治疗效果。

本发明还提供了一种组合物或siRNA胶束在制备抗肿瘤药物中的应用；肿瘤选自如下肿瘤中的至少一种：多形性胶质母细胞瘤、肺癌、淋巴瘤、胃癌、食管癌、鼻咽癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌和白血病；

优选地，肿瘤为耐药型肿瘤。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述抗肿瘤药物还包括一种或多种药学上可接受的赋形剂或载剂。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述的药物被配制用于如下至少一种的施用用途：经口施用、注射施用和灌胃施用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种siRNA胶束作为一种新型的SNAs，不仅可以避免血液中核酸酶的降解，而且可以通过SRs介导的胞吞和内吞作用穿越血脑屏障进入脑肿瘤细胞。此外，作为一种新型的高分子胶束，siRNA胶束可以控制封装和释放化学药物，进而用于siRNA/药物(化疗-RNAi技术)协同治疗脑胶质瘤。药物的类型可以是核酸药物或化学药物，借助siRNA的靶向敲除效果实现目的基因的沉默，同时又可以释放负载的药物实现肿瘤等其他疾病的治疗。

siRNA胶束具有良好的结构和稳定性及均一性，具有良好的药物装载和优良的药物输送能力，具有良好的生物相容性和还原敏感能力(癌细胞的还原环境下迅速释放药物的能力)。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为siRNA-SS-PNIPAM二嵌段复合物的合成流程图；

图2为合成PNIPAM聚合物的核磁图谱；

图3为合成PNIPAM-SS-NH₂聚合物的核磁图谱；

图4为合成PNIPAM-SS-DBCO聚合物的核磁图谱；

图5为实施例1的siRNA胶束的自组装形成过程示意图；

图6为实验例1的siRNA胶束的表征结果图；

图7为实验例2-3的实验结果图；

图8为实验例4的实验结果图；

图9为实验例5的siRNA胶束的生物分布和脑切片荧光成像实验结果；

图10为实验例6的检测siRNA胶束体内抗肿瘤效果实验结果图；

图11为实验例7的体外检测siRNA胶束下调STAT3基因表达情况，siSTAT3micelle@TMZ诱导细胞杀伤情况以及siSTAT3胶束抗肿瘤效果实验情况。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种siRNA胶束的制备方法，总的合成过程参照图1所示，具体包括如下步骤：

(1)NIPAM经过RAFT聚合作用形成聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)。需要说明的是，在其他实施方式中，PNIPAM聚合物也可选择市售的成品。

NIPAM(异丙基丙烯酰胺)(sigma)单体，4-Cyano-4-(dodecylsulfanylthiocarbonyl)sulfanylpentanoic acid(DCT，RAFT试剂)(百灵威科技)，引发剂AIBN(偶氮二异丁晴)(阿拉丁)和1，4-二氧六环(阿拉丁)在特定比例下(比例为23:1:0.2、35:1:0.2、55:1:0.2)发生聚合反应(反应温度为70℃)。PNIPAM聚合物的分子量Mn依次分别约为2000、3000、5000，依次分别记为2K、3K和5K。

具体地，本实施例以2K分子量聚合物合成过程为例：

准备一个25mL或者50mL反应管，经由双排管先通入N₂净化30min以除去空气。

将NIPAM(异丙基丙烯酰胺)(0.5g，4.419mmol)，RAFT试剂(77.55mg，0.192mmol)，引发剂AIBN(6.309mg，38.422mmol)加入到15mL 1,4-二氧六环中。

通过双排管抽真空将反应溶液中的氧气排净(2-3次)。再通N₂。

接下来将反应体系在70℃二甲基硅油中(油浴)反应24h。

接着将(油浴)反应后的反应体系置于冰上迅速冷却并暴露在空气中，向反应液中加入5mL的(四氢呋喃)(国药)，并在冰正己烷中进行沉淀(3次)。过滤，真空干燥箱干燥，得到PNIPAM聚合物。

在其他实施方式中，3K和5K聚合物的合成可参照上述过程进行相关参数条件的调整。

本步骤中的合成方程如下：

所得PNIPAM聚合物具有图2所示的核磁图谱(¹H NMR谱图(400MHz)PNIPAM(氯仿-D4))。经过这一反应过程，实施例依次分别得到了聚合度DP＝19,分子量Mn约为2000，聚合度DP＝28,分子量Mn约为3000，聚合度DP＝47,分子量Mn约为5000的不同分子量大小的PNIPAM聚合物。聚合效率(Polymerization ratio)达到85％以上。

(2)合成PNIPAM-SS-NH₂聚合物。

PNIPAM聚合物、t-Boc-cystamine(t-Boc-胱胺，西安点化生物科技有限公司，中国)，1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC,99％,AlfaAesar)、N-hydroxysuccinimide(NHS,98％,Alfa Aesar)、和TEA(三乙胺，Sigma-Aldrich)按物质的量比(1：3：4：4：8)称取备料；将PNIPAM聚合物、EDC和NHS，在室温下溶解于50mL二氯甲烷中，混合物在氮气环境中室温下活化4h，加入t-Boc-胱胺和三乙胺，室温下继续反应24h，浓缩后向反应液中加入三氟乙酸脱BOC，使用乙醚沉淀，得到PNIPAM-SS-NH₂。

本实施例以2K分子量的PNIPAM-SS-NH₂聚合物合成过程为例：

将PNIPAM(0.5g，0.25mmol)、NHS(115.09mg，1mmol)、EDC(191.7mg，1mmol)和50mL无水二氯甲烷密封在150mL的三颈烧瓶中，混合物在氮气环境中室温下搅拌4h进行活化。

向反应液中加入t-Boc-胱胺(189.29mg，0.75mmol)和三乙胺(202.38mg,2mmol)再反应24h。用旋转蒸发仪将反应液浓缩，向浓缩后的反应液中加入1mL三氟乙酸脱BOC，室温下搅拌2h，然后在冷乙醚中沉淀。

收集沉淀并用去离子水透析48h。最后经真空冷冻干燥得到最终产物，核磁共振波谱仪分析。

核磁共振波谱仪分析结果参照图3所示(¹H NMR谱图(400MHz)PNIPAM-SS-NH₂(氯仿-D4))，经过这一反应过程，实施例依次分别得到了聚合度DP＝19,分子量Mn约为2000，聚合度DP＝28,分子量Mn约为3000，聚合度DP＝47,分子量Mn约为5000的不同分子量大小的PNIPAM-SS-NH₂聚合物。结合效率达到80％以上。

(3)合成PNIPAM-SS-DBCO聚合物

PNIPAM-SS-NH₂，DBCO-NHS酯，TEA按照物质的量比(1：3：1)称取备料：将PNIPAM-NH₂，TEA和DMF封装在氮气环境的反应管中，在室温下反应(反应时间为1-2h)，加入DBCO-NHS酯，继续反应(反应时间为24h)，得到PNIPAM-DBCO。

以2K分子量的PNIPAM-DBCO聚合物合成过程为例：

将PNIPAM-NH₂(0.5g,0.25mmol)、TEA(25.298mg,34.85μL,0.25mmol)和DMF(10mL)于50mL反应管中密封，混合物在氮气环境中室温搅拌1-2h。

向反应液中加入DBOC-NHS酯(301.8mg,0.75mmol)，室温下继续搅拌24h。将所得产物用去离子水透析48h。最后经真空冷冻干燥得到最终产物。

核磁共振波谱仪分析结果参照图4所示(¹H NMR谱图(400MHz)PNIPAM-SS-DBCO(甲醇-D4))，经过这一反应过程，实施例依次分别得到了聚合度DP＝19,分子量Mn约为2000，聚合度DP＝28,分子量Mn约为3000，聚合度DP＝47,分子量Mn约为5000的不同分子量大小的PNIPAM-SS-DBCO聚合物。结合效率达到70％以上。

(4)合成PNIPAM-SS-DBCO与siRNA的二嵌段复合物。

PNIPAM-SS-DBCO、叠氮基团修饰的siRNA(N₃-siRNA)按照物质的质量之比为(1：20)加入到1mL DEPC水中，在-25℃条件下反应(反应时间为12h),得到siRNA-SS-PNIPAM。

以2K分子量的PNIPAM-SS-DBCO聚合物与siRNA的二嵌段复合物的合成过程为例：

将siRNA-N₃(500μg,37.88nmol)，PNIPAM-SS-DBCO(2kDa)(1.5mg,0.75μmol)溶解在500μL DEPC水中。

将聚合物与N₃-siRNA的反应液溶液混合均匀，置于-25℃过夜。

将样品置于4℃条件下融化，并将反应溶液升温到37℃条件下加热0.5h，然后离心去除上清3次(15，000rpm，20min)，以除去未反应的游离siRNA。

向离心液中加入500μL DEPC水和350μL异丙醇，在室温下孵育20min，并在12000rpm下离心25min，以除去未反应的PNIPAM。

小心收集上清液，用去离子水透析，得到siRNA-SS-PNIPAM的最终产物。

(5)siRNAmicelle(siRNA胶束)的形成

因为PNIPAM聚合物具有温度敏感性的特征，当温度小于LCST(低临界相转变温度)时，siRNA-SS-PNIPAM的二嵌段复合物游离存在于溶液中；温度大于LCST时，使用生理温度37℃，PNIPAM由亲水变为疏水，siRNA-SS-PNIPAM经自组装过程形成siRNA胶束。因此，在生理温度条件下，一端亲水(siRNA)和一端疏水(PNIPAM)的二嵌段复合物形成实心的胶束型球形核酸纳米粒子。外壳由亲水的siRNA组成，内核是疏水的(如图5所示)。缓释阶段：在肿瘤或者癌细胞还原环境条件下，二硫键断裂，引发siRNA胶束溶胀裂解，进而释放出所包载的药物和siRNA。

实验例1

本实验例对实施例1制备的siRNA胶束进行表征。

实施例1制备的siRNA胶束相对于自由的siRNA，siRNA胶束有着更长的血液循环时间、优异的细胞摄取能力和有效的胞内siRNA释放。同时，通过清道夫受体介导的转胞吞作用，siRNA胶束能够有效穿越BBB。该种球形核酸纳米粒子具有可控性和良好的结构稳定性。参照图6中的d图所示，纳米粒子的形状为实心球形，结构均一性好。基于不同分子量大小的PNIPAM形成的siRNA胶束有着不同的大小，纳米粒子粒径如表1和图6中的b图所示。在37℃下的琼脂糖凝胶电泳结果图中，纳米粒子的迁移率小于游离的siRNA，并且聚合物的分子量越高，迁移率越小(如图6中的a所示)。siRNA胶束相较于siRNA-SS-PNIPAM二嵌段复合物相比，有着更小的电位，并且随着粒径的降低，较小的siRNA胶束具有更致密的siRNA外壳结构，siRNA胶束的电位进一步变小。(如图6中的c所示)。

表1聚合物粒径。

为了给予siRNA胶束还原敏感的能力，在制备聚合物的时候引入了二硫键。在使用10mM GSH处理后使用DLS检测胶束的平均粒径，24小时内，胶束的平均粒径逐渐增大，胶束发生溶胀解离。不使用GSH时，24小时后胶束的平均粒径没有发生变化，证明该siRNA胶束具有良好的还原敏感响应能力(如图6中的e所示)。

实验例2

本实验例使用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测细胞内吞。

siRNA胶束呈负电荷，可以通过细胞膜清道夫受体(scavenger receptor，SRs)介导的胞吞作用被细胞内吞(如图7中的a所示)。

在流式细胞仪实验中，U87MG细胞按3.0×10⁵细胞/孔的密度接种在6孔板中，37℃培养过夜。向培养基中加入PBS、游离的Cy5-siRNA、Cy5-siRNAmicelle(2K)、Cy5-siRNAmicelle(3K)、Cy5-siRNAmicelle(5K)(200nM siRNA)。将细胞置于37℃、含5％CO₂的培养箱中培养8h。除去培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，胰蛋白酶消化，离心，重悬于新鲜的PBS缓冲液中。通过流式细胞术分析样品并进行荧光定量。

与游离的siRNA较弱的Cy5荧光强度相比，5K、3K、2K的siRNA胶束实验组细胞中的Cy5荧光强度逐渐增大。说明与游离的siRNA相比，siRNA胶束可以有效地被细胞内吞，并且较小的胶束有着更强的细胞内吞能力(如图7中的b和c所示)。

在激光共聚焦实验中，将U87MG细胞按1.0×10⁵细胞/孔的密度接种在24孔板中，37℃培养过夜。向培养基中加入PBS、游离的Cy5-siRNA、Cy5-siRNAmicelle(2K)、Cy5-siRNAmicelle(3K)和Cy5-siRNAmicelle(5K)(200nM siRNA)。将细胞置于37℃、含5％CO₂的培养箱中培养8h。然后除去培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，用4％多聚甲醛溶液固定15min，并用10μM DAPI染色10mins。通过激光共聚焦显微镜成像。

细胞中实验组的Cy5荧光强度显著强于游离的Cy5-siRNA的荧光强度，并且纳米粒子粒径越小，荧光强度越强，说明了siRNA胶束可以有效地被细胞摄取，并且较小的siRNA胶束更容易经由SRs介导进入细胞。(如图7中的d所示)。

实验例3

本实验例检测穿越血脑屏障能力和肿瘤细胞渗透能力。

siRNA胶束可以通过SRs介导的胞吞作用穿越血脑屏障。

用bEnd.3细胞建立的体外血脑屏障模型检测siRNA胶束穿越血脑屏障的能力，将bEnd.3细胞(5×10⁴/孔)接种到transwell小室(0.4μm孔径，24mm，)中，将其放入24孔板(每孔装有800μL培养基),建立血脑屏障模型(如图7中的e所示)。测量内皮细胞的跨膜电阻值(TEER)。更换190μL无血清培养基，在小室上腔加入10μL Cy5标记的siRNA酵素(siRNA浓度＝200nM)，置于培养箱中(37℃，50rpm/min)孵育。在1、4、8和12h的时间点，从外侧隔室取样并更换相同体积的培养基。实验结束时，再次测量TEER值检测bEnd.3细胞层的完整性。通过SpectraMax i3x多功能酶标仪(Ex＝645nm，Em＝670nm)测定样品的荧光值并计算siRNA胶束的累积转运率(％)。

Cy5-siRNA胶束穿越BBB是一种时间依赖的渗透现象，Cy5-siRNA胶束通过血脑屏障层的能力与粒径大小有关，较小的siRNA胶束在特定时间点显示出显著更高的累积转运比率。(如图7中的e所示)。

在3D肿瘤球细胞模型穿透试验中，将U87MG细胞按3×10³细胞/孔的密度接种在圆底96孔板中，1000rpm离心3分钟使细胞在底部聚集，孵育48h形成球体。向培养基中加入游离Cy5-siRNA、Cy5-siRNAmicelle(2K)、Cy5-siRNAmicelle(3K)和Cy5-siRNAmicelle(5K)(200nM siRNA)。在37℃、含5％CO₂的培养箱中培养12h。然后用PBS缓冲液冲洗细胞3次，4％多聚甲醛溶液固定20min，用10μM DAPI染色。使用蔡司LSM 880共聚焦显微镜，以20μm为间隔，获得肿瘤球的z轴3D共聚焦图像。在645nm/670nm的λx/λEm处检测到Cy5。

随着扫描深度的增加Cy5荧光强度逐渐减弱。相比之下，粒径最小的siRNA胶束(2K)在3D肿瘤球细胞模型穿透实验中表现出最高的渗透能力(如图7中的f所示)。由于siRNA胶束(2K)具有更高的细胞摄取、更高效的血脑屏障穿越和肿瘤穿透能力，因此我们选择siRNA胶束(2K)进行进一步的体外和体内研究。

实验例4

本实验例检测siRNA胶束的细胞毒性、基因沉默、诱导细胞凋亡的能力。

在细胞毒性实验中，U87MG细胞按5.0×10³细胞/孔的密度接种在96孔板中培养过夜。替换并补充90μL新鲜培养基。然后，向每个孔中加入10μL的PBS、siRNA胶束，使siRNA胶束的最终浓度分别为50、100、200、400、600、800、1000、1200nM，置于37℃、含5％CO₂的培养箱中培养48h。向每个孔中加入10μL MTT(5mg/mL)。孵育4h后去除培养基，加入150μL二甲基亚砜。通过多功能酶标仪测量96孔板在492nm处的吸光值检测细胞活力。

即使在1200nM的高siRNA浓度的情况下，U87MG细胞对siRNA胶束的摄取也并未表现出任何显著的可测量的细胞毒性，(如图8中的a所示)。说明siRNA胶束具有很好的生物相容性。

在体外检测siRNA胶束的基因沉默效果，选用PLK1基因的特异性siRNA序列治疗U87MG细胞。将U87MG细胞以2.0×10⁵细胞/孔的密度接种在6孔板中，培养箱孵育过夜，向培养基中加入PBS、游离siRNA、siScrmicelle和siPLK1micelle(200nM siRNA)，将细胞在5％CO₂、37℃的培养箱中孵育48h。将细胞裂解提取总RNA,使用PrimeScript RT Reagent Kit(Takara,Kyoto,Japan)，TB Green^TM Premix Ex Taq^TM(Takara,Kyoto,Japan)进行荧光定量PCR实验。

经siPLK1micelle处理的实验组，PLK1基因表达水平降低了约34.5％(如图8中的b所示)。对照组则表现出很有限的基因敲除效果，反映了游离siRNA有限的细胞摄取和siPLK1的特异性。

检测siPLK1胶束诱导细胞凋亡的情况。将U87MG细胞按2.0×10⁵细胞/孔的密度接种在6孔板中，培养过夜。替换并补充1800μL新鲜培养基。加入200μL的PBS、游离的siPLK1、siScrmicelle(2K)、siPLK1micelle(400nM siRNA)，培养箱中再培养48h。使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒处理细胞，由流式细胞仪检测细胞凋亡。

相比较于siScrmicelle组和游离siPLK1组，经siPLK1micelle处理的实验组U87MG细胞产生了显著的凋亡效果(28.46％)(如图8中的c所示)。

实验例5

本实验例检测siRNA胶束的生物分布情况和脑切片累积情况。

在siRNAmicelle的生物分布试验中，将游离Cy5-siRNA和Cy5-siRNAmicelle经尾静脉注射到荷瘤2周的原位U87MG肿瘤裸鼠体内。注射后10小时，处死荷瘤小鼠。收集主要器官，包括心、肝、脾、肺、肾和脑，洗涤并称重。为了定量不同器官累积Cy5-siRNA的量，向各个器官加入0.6mL 1％triton X-100充分匀浆。加入0.9mL二甲基亚砜室温孵育过夜。离心(15000rpm，30min)取上清，使用多功能酶标仪测定上清液中的Cy5荧光强度，根据标准曲线计算每克组织中的荧光积累量(％ID/g)。

从结果看出经Cy5-siRNAmicelle处理的实验组有着显著的脑部积累效果，实验证明Cy5-siRNAmicelle组的相对荧光积累量达到15％(ID/g)，约为游离Cy5-siRNA组的5倍(如图9中的a所示)。为了探究siRNA胶束在脑肿瘤中的积累情况，我们采用CLSM对脑切片进行进一步的荧光成像。

在siRNAmicelle的脑切片荧光成像实验中，将游离Cy5-siRNA和Cy5-siRNAmicelle经尾静脉注射到荷瘤2周的U87MG-Luc肿瘤裸鼠体内。注射后10小时，处死荷瘤小鼠。PBS清洗脑肿瘤并置于-80℃冷冻过夜。低温冷冻切片机获取脑部切片。丙酮中固定15分钟，用0.3％Triton X-100洗涤3次。CD31免疫荧光染色，DAPI(5μg/mL)染色20分钟，用CLSM成像系统(Zeiss LSM 880)观察。

脑肿瘤切片荧光成像实验研究表明，Cy5-siRNA胶束显示出比游离Cy5-siRNA更强的红色荧光(如图9中的b所示)，荧光定量结果显示Cy5-siRNA胶束比游离Cy5-siRNA组和PBS组有着显著增强的荧光效果(如图9中的c所示)。证实了siRNA胶束相对于游离siRNA的特异性脑摄取和肿瘤靶向性。

实验例6

本实验例检测siRNA胶束体内抗肿瘤效果。

用U87MG-luc胶质母细胞瘤原位异种移植肿瘤模型检测siRNA胶束的体内抗肿瘤效果，siPLK1用作治疗性siRNA。将PBS、游离的siPLK1、siScrmicelle、siPLK1micelle分别经尾静脉注射进荷瘤小鼠体内，在成像前10-15分钟，以150mg/kg的剂量腹腔注射荧光素，进行体内生物发光成像，用小动物成像系统Lumina IVIS III(IVIS,Lumina III；Caliper,MA,USA)监测肿瘤生长。(如图10中的a所示)。

成像结果表明随着治疗的进行，siPLK1micelle组的小鼠的脑胶质瘤生物发光强度增长速度显著下降，说明siPLK1micelle最有效地抑制GBM肿瘤的生长(如图10中的b所示)。生物发光定量分析结果与生物发光成像结果一致，进一步证实了siPLK1micelle对小鼠脑U87MG-luc肿瘤细胞生长的显著抑制作用；siScrmicelle和游离siPLK1处理组显示出与PBS处理组相似的生物发光，表明对肿瘤生长没有抑制作用(如图10中的c所示)。

siPLK1micelle实验组小鼠的体重几乎没有变化，siScrmicelle、游离siPLK1和PBS处理组都经历了快速的体重减轻(如图10中的d所示)，这可能是由于胶质母细胞瘤的快速增殖和侵袭造成大脑功能障碍。重要的是，生存曲线分析显示siPLK1micelle治疗组显著延长了小鼠的寿命(如图10中的e所示)。该组小鼠的中位生存时间为38天，明显长于siScrmicelle组(21天)、游离siPLK1组(22天)和PBS组(20天)。

实验例7

本实验例检测siSTAT3micelle的体外基因沉默效果，siSTAT3micelle@TMZ体外诱导细胞凋亡情况以及体内抗肿瘤效果。

自组装形成siRNA胶束的过程中可以封装TMZ，将其包裹在疏水内核，实现与siRNA的协同治疗效果(如图11中的a所示)。

在体外检测siSTAT3micelle的基因沉默效果。

将U251-TR细胞以2.0×10⁵细胞/孔的密度接种在6孔板中，培养箱孵育过夜，向培养基中加入PBS、游离的siSTAT3、siScrmicelle、siSTAT3micelle(200nM/400nM siRNA)，将细胞在5％CO₂、37℃的培养箱中孵育48h。将细胞裂解提取总RNA,使用PrimeScript RTReagent Kit(Takara,Kyoto,Japan)，TB Green^TM Premix Ex Taq^TM(Takara,Kyoto,Japan)进行荧光定量PCR实验。

结果显示，siSTAT3micelle处理组细胞STAT3基因表达量显著下降，而且siRNA胶束浓度越高，STAT3基因表达量越低，说明siSTAT3micelle可以有效敲除STAT3基因。

Western blot实验检测基因表达的情况。

将U251-TR细胞以2.0×10⁵细胞/孔的密度接种在6孔板中，培养箱孵育过夜。向培养基中加入PBS、游离的siSTAT3、siScrmicelle、siSTAT3micelle(200nM/400nM siRNA)，将细胞在5％CO2、37℃的培养箱中孵育72h。使用RIPA裂解液(碧云天)将细胞裂解提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量，按照Western blot免疫印迹标准操作规程进行实验，通过ImageJ软件进行数据分析。

结果显示siSTAT3micelle组细胞中STAT3蛋白的表达量显著下降，而且浓度越高，蛋白表达量越低，说明siSTAT3micelle可以有效抑制STAT3基因的表达。体外实验结果说明，siSTAT3胶束在mRNA水平和蛋白质水平上实现了有效的STAT3基因敲除效果(如图11中的b所示)。

探究siSTAT3和TMZ协同治疗诱导细胞杀伤的情况。

U251-TR细胞以5.0×10³细胞/孔的密度接种在96孔板中，培养箱孵育过夜。向培养基中加入PBS、游离siSTAT3和TMZ、siSTAT3micelle、siScrmicelle@TMZ、siSTAT3micelle@TMZ(siRNA浓度400nM，TMZ浓度1.25μg/mL)，置于37℃、含5％CO₂的培养箱中培养72h。向每个孔中加入10μL MTT(5mg/mL)。孵育4h后去除培养基，加入150μL二甲基亚砜。通过多功能酶标仪测量96孔板在492nm处的吸光值检测细胞活力。

与对照组和siSTAT3micelle、siScrmicelle@TMZ组相比，siSTAT3micelle@TMZ处理组显示了更为显著细胞杀伤能力，证实了siSTAT3和TMZ的协同治疗作用(如图11中的c所示)。

探究siSTAT3micelle@TMZ对U251-TR原位脑肿瘤模型的协同抗肿瘤效果实验中，将PBS、游离siSTAT3和TMZ、siSTAT3micelle、siScrmicelle@TMZ、siSTAT3micelle@TMZ经尾静脉注射给药(2mg siRNA equiv/kg)，记录小鼠体重和生存情况。小鼠的相对体重变化以它们的初始体重为标准进行分析(如图11中的d所示)。在治疗后第20天，每组处死一只小鼠，小鼠脑肿瘤用4％多聚甲醛溶液固定并进行石蜡包埋。使用切片机获取脑器官组织切片(厚度:4mm)，进行H&E染色(hematoxylin and eosin)，用数码显微镜(Olympus)观察分析。

实验结果显示，接受siSTAT3micelle@TMZ处理组的小鼠体重变化情况最小(如图11中的e所示)、并且有着最长的中位生存时间(如图11中的f所示)，siSTAT3micelle@TMZ治疗组有最好的治疗效果。经过脑切片HE染色分析，siSTAT3micelle@TMZ处理组小鼠脑胶质瘤组织面积相较于游离siSTAT3和TMZ、siSTAT3micelle、siScrmicelle@TMZ显著减小(如图11中的g所示)，证明siSTAT3micelle@TMZ可以有效地延缓脑胶质瘤的生长，有着良好的协同抗肿瘤效果。

实验例8

本实验例进行药物装载实验。

将TMZ干粉溶解于10mM HEPES缓冲液中(pH 7.4)，按照10％和20％理论载药量将一定量的TMZ和siRNA-SS-PNIPAM水溶液置于冰水浴中充分混合震荡3h。将溶液温度提高到37℃继续震荡2h。接下来在将TMZ与siRNA胶束的混合溶液置于3.5kDa透析袋中，使用37℃HEPES缓冲液进行透析以除去游离的TMZ。使用多功能酶标仪测定TMZ的浓度并计算TMZ的载药效率。

表1：基于2K PNIPAM的siRNA胶束的载药量(DLC(wt.％))和载药率(DLE(％))。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南大学

<120> 一种siRNA胶束、制备方法、组合物及其应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

ugaagaagau cacccuccuu a 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

uaaggagggu gaucuucuuc a 21

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggacgacuuu gauuucaac 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

guugaaauca aagucgucc 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

acgugacacg uucggagaa 19

Claims (10)

1.一种siRNA胶束，其特征在于，siRNA胶束是由亲水性分子和疏水性聚合物自组装形成的具有亲水外壳和疏水内核的纳米粒子，形成所述疏水内核的疏水性聚合物为聚(N-异丙基丙烯酰胺)-DBCO，形成所述亲水外壳的亲水性分子为N₃-siRNA分子，所述聚(N-异丙基丙烯酰胺)-DBCO与所述N₃-siRNA分子通过形成共价键连接。

2.根据权利要求1所述的siRNA胶束，其特征在于，所述siRNA胶束中所述聚(N-异丙基丙烯酰胺)-DBCO与所述N₃-siRNA的物质的量比为1:10-30；

优选地，siRNA选自如下至少一种基因的siRNA：荧光报告基因、PLK1基因和STAT3基因；

优选地，所述PLK1基因的siRNA如SEQ ID NO.1-2所示，所述STAT3基因的siRNA如SEQID NO.3-4所示；

所述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC。

3.一种如权利要求1-2任一项所述的siRNA胶束的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：将所述聚(N-异丙基丙烯酰胺)-DBCO与所述siRNA分子混合反应，使得所述N₃-siRNA和聚(N-异丙基丙烯酰胺)-DBCO自组装形成的具有亲水外壳和疏水内核的纳米粒子。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述混合反应的温度为-25℃～-18℃，所述混合反应时间为8-15h；

优选地，所述制备方法还包括在混合反应后去除未反应的N₃-siRNA分子和聚(N-异丙基丙烯酰胺)-DBCO。

5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括合成聚(N-异丙基丙烯酰胺)-DBCO，合成聚(N-异丙基丙烯酰胺)-DBCO的方法包括：以物质的量比为1-1.2:3:1-1.2的PNIPAM-SS-NH₂、DBCO-NHS酯和TEA为原料进行混合反应；

优选地，先以PNIPAM-SS-NH₂、TEA和DMF混合反应，优选地，室温下反应1-2h，然后加入DBCO-NHS酯继续反应制得聚(N-异丙基丙烯酰胺)-DBCO；优选地，继续反应20-24h。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括合成PNIPAM-SS-NH₂，PNIPAM-SS-NH₂的合成包括：以物质的量比为1-1.1:3:4:4:8的PNIPAM、t-Boc-胱胺、EDC、NHS和TEA为原料混合反应；

优选地，PNIPAM-SS-NH₂的合成是先将PNIPAM、EDC和NHS混合进行活化反应，然后加入t-Boc-胱胺和TEA进行混合反应；

优选地，所述活化反应是在室温下反应2-5h，加入t-Boc-胱胺和TEA后的混合反应是在室温下反应20-24h；

优选地，所述PNIPAM的分子量为2K-5K。

7.一种组合物，其特征在于，其包括权利要求1-2任一项所述的siRNA胶束或权利要求3-6任一项所述的制备方法制备的siRNA胶束、以及药物，所述siRNA胶束装载有药物。

8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述药物被包覆于所述siRNA胶束的疏水内核中；

优选地，siRNA胶束理论载药量为5-20wt.％；

优选地，所述药物选自治疗癌症药物、治疗肥胖相关疾病的药物、治疗糖尿病相关疾病的药物、治疗肝脏功能损伤相关疾病的药物或降糖降脂药物；

优选地，所述癌症选自如下疾病中的至少一种：多形性胶质母细胞瘤、脑肿瘤、肺癌、淋巴瘤、胃癌、食管癌、鼻咽癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌和白血病；

优选地，所述药物选自替莫唑胺。

9.一种如权利要求7-8任一项所述的组合物或权利要求1-2任一项所述的siRNA胶束在制备抗肿瘤药物中的应用；其特征在于，所述肿瘤选自如下肿瘤中的至少一种：多形性胶质母细胞瘤、肺癌、淋巴瘤、胃癌、食管癌、鼻咽癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌和白血病；

优选地，所述肿瘤为耐药型肿瘤。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物还包括一种或多种药学上可接受的赋形剂或载剂。

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