CN116459217A - 一种用于蛋白质递送的多级响应型聚合物囊泡的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于蛋白质递送的多级响应型聚合物囊泡的制备方法，涉及生物材料及生物医学领域。本发明以RNaseA为蛋白模型，制备了载蛋白聚合物囊泡，具有较高的包封率和载药量。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料及生物医学领域，具体涉及一种用于蛋白质递送的多级响应型聚合物囊泡的制备方法。
背景技术
蛋白质调节几乎所有的生物过程(如信号转导、细胞代谢、基因转录和翻译、有丝分裂、细胞增殖和凋亡)。因此，几乎所有的病变过程都与特定蛋白质功能异常有关。由于蛋白质极高的精确度和多功能性，蛋白质疗法被认为是一种治疗各种疑难杂症的有效治疗方法。与传统化学药物相比，基于蛋白质的治疗方法具有更高的特异性，更低的不良反应和更短的药物开发周期。与基因类药物相比，蛋白质可以更直接地作用于靶标，并特异性地调节生物过程，从而避免了永久性基因突变以及由于持续性基因表达引起的脱靶效应和致癌风险。迄今为止，多种蛋白质疗法(如胰岛素，单克隆抗体，细胞因子，转录因子，酶和肽等)已被开发为用于治疗糖尿病，癌症，心血管疾病和细菌感染等疾病的药物。基于蛋白质的疗法是市场上增长最快的药物之一，并且已经彻底改变了制药行业。但是，目前临床应用的蛋白类药物的治疗靶点仅位于细胞外部，如细胞膜外表面上的受体，如程序性细胞死亡蛋白1(PD1)、人表皮生长因子受体2(HER2)、分化抗原簇20(CD20)、胰岛素受体等；或胞外可溶性细胞因子，如肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素12(IL12)、血管内皮生长因子(VEGF)等)。据估计，超过70％的基因组编码蛋白质位于细胞内部，然而由于蛋白质表面电荷复杂且尺寸较大，蛋白质药物的胞内靶点输送仍然是一个挑战。为了充分发挥蛋白质的治疗潜力，需要开发合适且多功能的蛋白质输送载体以实现蛋白质药物的跨细胞运输。
目前已开发的蛋白质输送载体有脂质体，内泌体，无机纳米粒子，纳米凝胶和聚合物等。由于蛋白质是一种具有不确定的电荷性质和大尺寸的生物分子，分子表面可用于与载体结合的位点数量有限，且蛋白质的化学修饰过程通常是不可逆的，传统的载体结合方式可能会影响蛋白质活性。因此，为保持蛋白质分子结构，且保护蛋白质免受血液清除机制的影响，蛋白质输送系统必须提供足够大的亲水口袋，以便有效地封装蛋白质。对于靶点在细胞内的生物大分子，若需要进入细胞并发挥生物学功能，调控细胞生理活动，除了跨越运输过程中各种生物障碍，包括其在血液循环中的稳定及长时间循环、在病理组织中的选择性积累以及跨膜输送以外，更大的挑战是内涵体逃逸、在细胞质内释放等。
发明内容
为解决现有技术的问题，本发明提供一种用于蛋白质递送的多级响应型聚合物囊泡的制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种用于蛋白质递送的多级响应型聚合物囊泡的制备方法，包括如下步骤：
1.聚合物的合成
(1)PLys(ss-DBCO/CAA)的合成
1)PLys的合成
①在惰性气体环境中，将三氟乙酰基-L-赖氨酸环内酸酐(Lys(TFA)-NCA)粉末溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得到Lys(TFA)-NCA溶液，随后将正丁胺的二氯甲烷(DCM)溶液加入到上述Lys(TFA)-NCA溶液中，引发开环聚合反应。将反应体系置于25℃-30℃油浴中搅拌48-72小时，反应液在预冷的乙醚中沉淀收集并进行真空干燥，得到PLys(TFA)白色固体。
②将PLys(TFA)溶解在含NaOH的甲醇溶液中，随后将反应体系置于25-30℃油浴中搅拌12-24小时以脱去TFA保护基团，反应液转移至透析袋中进行透析，随后将透析后的样品冷冻干燥，得到PLys白色固体：
其中，所述正丁胺与Lys(TFA)-NCA的摩尔比为1∶90；所述Lys(TFA)-NCA溶液的浓度为0.1-0.25mg/mL，优选为0.25mg/mL；所述正丁胺的DCM溶液中正丁胺与DCM的体积比为1∶9；所述Lys(TFA)-NCA与含NaOH的甲醇溶液的比例为0.37-5mmol∶5-20mL，优选为3.7mmol∶5mL。
基于以上技术方案，优选的，所述惰性气体为氩气或氮气。
基于以上技术方案，优选的，所述含NaOH的甲醇溶液中NaOH的浓度为1-2M，优选为1M。
基于以上技术方案，优选的，所述透析袋的截留分子量(MWCO)为3000-5000Da，优选为3500Da。
基于以上技术方案，优选的，所述透析为先在HCl溶液中透析，再在超纯水中透析，所述透析时间为18-72小时，其中HCl溶液中透析9-36小时，超纯水中透析9-36小时；HCl溶液的浓度为0.01M。例如分别在0.01M HCl溶液中和超纯水中透析三次，每次透析时间为3-12小时。
2)PLys(ss-DBCO)的合成
将二苯并环辛炔-二硫键-羧酸(DBCO-ss-COOH)溶于DMF中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，随后将反应体系置于25-30℃油浴中搅拌3-5小时以活化羧基，得到羧基活化后的反应液。将PLys固体溶解在Hepes缓冲液中，并加入到上述羧基活化后的反应液中，之后将反应体系置于25-30℃油浴中搅拌12-24小时后，反应液转移至透析袋中进行透析，随后将透析后的样品冷冻干燥，得到PLys(ss-DBCO)白色固体：
其中，所述DBCO-ss-COOH与EDC.HCl、NHS的摩尔比为1∶1.2-1.5∶1.2-1.5，优选为1∶1.5∶1.5；所述DBCO-ss-COOH与DMF的比例为9.8μmol：4.0mL；所述Plys在Hepes缓冲液中的浓度为5.0-10.0mg/mL，优选为9.0mg/mL；所述DBCO-ss-COOH与Plys的摩尔比为5∶1。
基于以上技术方案，优选的，所述Hepes缓冲液的pH为8.0-9.0，优选为8.4。
基于以上技术方案，优选的，所述透析袋的截留分子量(MWCO)为3000-5000Da，优选为3500Da。
基于以上技术方案，优选的，所述透析为在超纯水中透析9-36小时，例如在超纯水中透析三次，每次透析时间为3-12小时。
3)PLys(ss-DBCO/CAA)的合成
将PLys(ss-DBCO)溶解在NaHCO3缓冲液中，然后加入顺式-乌头酸酐(CAA)，将反应体系置于0-4℃环境中搅拌2-4小时，随后将反应液转移至超滤管中离心以除去未反应的CAA，冷冻干燥，得到PLys(ss-DBCO/CAA)白色固体：
其中，所述PLys(ss-DBCO)在NaHCO3缓冲液中的浓度为0.5-1mg/mL，优选为1mg/mL；PLys(ss-DBCO)与CAA的摩尔比为1∶10-1∶50，优选为1∶10；
基于以上技术方案，优选的，所述NaHCO3缓冲液的浓度为0.1-0.5M，优选为0.1M；所述NaHCO3缓冲液的pH为9.0-10.0，优选为10.0。
基于以上技术方案，优选的，所述超滤管的截留分子量(MWCO)为3000-5000Da，例如超滤管(MWCO 3000Da)中离心三次。
(2)RGD-PEG-PLys(N3)的合成
1)RGD-PEG-NH2的合成
①将精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽(cRGDfk)溶解在NaHCO3缓冲液中，然后加入叔丁基-亚胺-聚乙二醇-活性酯(NHS-PEG-NH-BOC)，将反应置于25-30℃油浴中搅拌3-5小时，反应液转移至超滤管中离心以除去未反应的cRGDfk，随后将样品冷冻干燥，得到RGD-PEG-NH-BO℃白色固体。
②将冻干后的RGD-PEG-NH-BOC溶解在HCl溶液中，25-30℃油浴中搅拌12-24小时以除去保护性BOC基团，反应液转移至透析袋中进行透析，随后将透析后的样品冷冻干燥，得到RGD-PEG-NH2白色固体：
其中，所述cRGDfk在NaHCO3缓冲液中的浓度为0.5-1mg/mL，优选为1mg/mL；所述NHS-PEG-NH-BOC与cRGDfk的摩尔比为1∶2-1∶5，优选为1∶3；所述NHS-PEG-NH-BOC与HCl溶液的比例为40.0μmol∶10-20mL，优选为40.0μmol∶10mL。
基于以上技术方案，优选的，所述NaHCO3缓冲液的浓度为0.1-0.5M，优选为0.1M；所述NaHCO3缓冲液的pH为9.0-10.0，优选为10.0。
基于以上技术方案，优选的，所述NHS-PEG-NH-BOC的重均分子量为5000Da。
基于以上技术方案，优选的，所述超滤管的截留分子量(MWCO)为3000-5000Da，优选为3000Da，例如超滤管(MWCO 3000Da)中离心三次。
基于以上技术方案，优选的，所述HCl溶液的浓度为1-2M，优选为1M。
基于以上技术方案，优选的，所述透析袋的截留分子量(MWCO)为3000-5000Da，优选为3500Da。
基于以上技术方案，优选的，所述透析为在超纯水中透析9-36小时，例如在超纯水中透析三次，每次透析时间为3-12小时。
2)RGD-PEG-PLys的合成
①首先对获得的RGD-PEG-NH2进行干燥处理：将RGD-PEG-NH2溶解在少量DCM中，加入过量苯混合均匀，冷冻并用冷肼减压抽干，随后转移至无水无氧的环境中，得到干燥处理后的RGD-PEG-NH2。
②在惰性气体环境中，将干燥处理后的RGD-PEG-NH2溶解于DMF中，得到RGD-PEG-NH2的DMF溶液。在惰性气体环境中，将Lys(TFA)-NCA溶解在DMF中，得到Lys(TFA)-NCA的DMF溶液；然后将RGD-PEG-NH2的DMF溶液和Lys(TFA)-NCA的DMF溶液混合，将反应体系置于25-30℃油浴中搅拌48-72小时。反应液在预冷的乙醚中沉淀收集并进行真空干燥，得到RGD-PEG-PLys(TFA)白色固体。
③将RGD-PEG-PLys(TFA)溶解在含NaOH的甲醇溶液中，将反应体系置于25-30℃油浴中搅拌12-24小时以脱去TFA保护基团，反应液转移至透析袋中进行透析，随后将透析后的样品冷冻干燥，得到RGD-PEG-PLys白色固体；
其中，所述RGD-PEG-NH2与少量DCM、过量苯的比例为3.9μmol∶1-2mL：8-16mL，优选为3.9μmol∶1mL∶8mL；所述RGD-PEG-NH2的DMF溶液中RGD-PEG-NH2与DMF比例为3.9μmol：4-8mL，优选为3.9μmol：4mL；所述Lys(TFA)-NCA的DMF溶液中Lys(TFA)-NCA与DMF的比例为353.3μmol∶4-8mL，优选为353.3μmol∶4mL；所述Lys(TFA)-NCA与RGD-PEG-NH2的摩尔比为90∶1；所述Lys(TFA)-NCA与含NaOH的甲醇溶液的比例为353.3μmol：5-20mL，优选为353.3μmol∶5mL。
基于以上技术方案，优选的，所述惰性气体为氩气或氮气。
基于以上技术方案，优选的，所述含NaOH的甲醇溶液中NaOH的浓度为1-2M，优选为1M。
基于以上技术方案，优选的，所述透析袋的截留分子量(MWCO)为3000-5000Da，优选为3500Da。
基于以上技术方案，优选的，所述透析为先在HCl溶液中透析，再在超纯水中透析，所述透析时间为18-72小时，其中HCl溶液中透析9-36小时，超纯水中透析9-36小时；HCl溶液的浓度为0.01M。例如分别在0.01M HCl溶液中和超纯水中透析三次，每次透析时间为3-12小时。
3)RGD-PEG-PLys(N3)的合成
将RGD-PEG-PLys溶于NaHCO3缓冲液中，加入活性酯聚乙二醇叠氮(NHS-PEG4-N3)，将反应体系置于25-30℃油浴中搅拌4-12小时，反应液转移至超滤管中离心以除去未反应的NHS-PEG4-N3，随后将样品冷冻干燥，得到RGD-PEG-PLys(N3)白色固体：
其中，所述RGD-PEG-Plys在NaHCO3缓冲液中的浓度为0.5-1mg/mL，优选为1mg/mL；所述RGD-PEG-Plys与NHS-PEG4-N3的摩尔比为1∶5。
基于以上技术方案，优选的，所述NaHCO3缓冲液的浓度为0.1-0.5M，优选为0.1M；所述NaHCO3缓冲液的pH为9.0-10.0，优选为10.0。
基于以上技术方案，优选的，所述超滤管的截留分子量(MWCO)为3000-5000Da，优选为3000Da；例如超滤管(MWCO 3000Da)中离心三次。
2.载蛋白聚合物囊泡的制备
阳离子嵌段共聚物RGD-PEG-PLys(N3)(以下简称为RPL(N3))与阴离子高聚物PLys(ss-DBCO/CAA)(以下简称为L(ss-D/C))在含有蛋白(RNase A)的缓冲液中首先通过静电作用复合，RGD-PEG-PLys主链上的-N3与PLyys主链上的-DBCO发生无铜做催化剂的点击反应，从而实现阴/阳离子嵌段共聚物链的键合，形成具有亲水空腔的囊泡，其中RNase A被包载于囊泡空腔中。具体制备方法为：
(1)将RNase A溶于Hepes缓冲液中，得到RNase A的溶液。
(2)将RPL(N3)与L(ss-D/C)分别溶于Hepes缓冲液中，分别得到RPL(N3)溶液和L(ss-D/C)溶液；
(3)随后分别将上述RPL(N3)溶液与L(ss-D/C)溶液同时加入到上述RNase A溶液中，25-30℃搅拌24-48小时后使用超滤管(MWCO 30000Da)离心除去未反应的聚合物分子及未包载的RNase A，得到载蛋白聚合物囊泡RNase@RPL-ss-LC。
其中，RNase A溶液的终浓度为0.25-1mg/mL，可以为0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL；RPL(N3)的溶液和L(ss-D/C)溶液的浓度均为0.5mg/mL；RPL(N3)的溶液、L(ss-D/C)的溶液与RNase A溶液的体积比为1∶1∶10-20，优选为1∶1∶20。
基于以上技术方案，优选的，所述Hepes缓冲液的pH为7.4，浓度为10mM。
基于以上技术方案，优选的，所述超滤管的截留分子量(MWCO)为20000-50000Da，优选为30000Da。
基于以上技术方案，优选的，将所得载蛋白聚合物囊泡的溶液进行浓缩，例如浓缩至载蛋白聚合物囊泡RNase@RPL-ss-LC浓度为1mg/mL。
本发明还涉及保护上述方法制备的用于蛋白质递送的多级响应型聚合物囊泡。
本发明制备了RGD功能化的肿瘤靶向性阳离子嵌段共聚物RGD-PEG-PLys(N3)及pH响应性阴离子聚合物PLys(ss-DBCO/CAA)。在蛋白质溶液中，依次通过RGD-PEG-PLys(N3)和PLys(ss-DBCO/CAA)的静电作用和点击反应，形成利用空腔包载蛋白质的聚合物囊泡。由于聚合物囊泡表面RGD配体与肿瘤细胞表面的αvβ3整合素特异性亲和力，聚合物囊泡在肿瘤部位聚集，并由RGD介导细胞内吞。在细胞内吞作用后，进入胞内酸性内涵体的聚合物囊泡由于阴离子聚合物PLys(ss-DBCO/CAA)脱羧导致电荷反转暴露大量正电荷氨基，同时与阳离子嵌段共聚物RGD-PEG-PLys的静电中和作用力消失，导致阳离子聚合物链PLys的正电荷密度增加，因此，高密度正电荷的聚合物囊泡破坏阴离子内涵体膜，并转移至细胞质。最终，聚合物囊泡通过响应胞浆中极高水平的谷胱甘肽，切断聚赖氨酸片段之间的二硫键导致聚合物囊泡解体并释放空腔内蛋白质药物。
本发明的有益效果：
(1)以RNase A为蛋白模型，制备了载蛋白聚合物囊泡RNase@RPL-ss-LC，具有较高的包封率(10.8±0.3％)和载药量(47.9±1.3％)；水合粒径约169.4nm，ζ电位约+1.0mV。
(2)RGD功能化的载蛋白聚合物囊泡RNase@RPL-ss-LC提高U87细胞对负载RNase的摄取能力：孵育细胞24小时后，相比无RGD修饰的RNase@PL-ss-LC，摄取效率提高约4.2倍。
(3)RNase@RPL-ss-LC在酸性环境(pH 5.0)中的ζ电位由+1.0mV升高至+7.2mV。
(4)通过释药实验证明RNase@RPL-ss-LC在酸性环境中保持稳定，还原环境刺激快速释放包载的RNase A。
(5)RNase@RPL-ss-LC对U87细胞表现出显著的细胞毒性(细胞存活率为32.4％)。
附图说明
图1 PLys(ss-DBCO/CAA)及其中间体在D2O中的核磁共振氢谱。
图2 RGD-PEG-PLys(N3)及其中间体在D2O中的核磁共振氢谱。
图3 RPL-ss-LC在PBS缓冲液中孵育168小时后的粒径变化。
图4 RPL-ss-LC聚合物囊泡的红细胞溶血率。
图5 RPL-ss-LC聚合物囊泡与U87细胞孵育48小时后的细胞存活率。
图6载蛋白聚合物囊泡RNase@RPL-ss-LC的粒径分布。
图7 U87细胞对RNase A、RNase@PL-ss-LC和RNase@RPL-ss-LC的摄取情况。
图8 U87细胞与RNase A、RNase@PL-ss-LC或RNase@RPL-ss-LC孵育4小时和孵育24小时的摄取效率。
图9空载体囊泡RPL-ss-LC和载蛋白聚合物囊泡RNase@RPL-ss-LC在pH 7.4或pH5.0条件下孵育12小时后的ζ电位变化。
图10 pH 7.4或5.0条件下PL-ss-LC和RPL-ss-LC与U87细胞孵育后的LDH活性。
图11 RPL-ss-LC在pH 5.0及GSH条件下孵育2小时后的粒径变化。
图12经过pH 5.0和GSH处理后RNase@RPL-ss-LC聚合物囊泡中RNase A的累积释放曲线。
图13 U87细胞与RNase A、RNase@PL-ss-LC或RNase@RPL-ss-LC孵育48小时后的细胞存活率。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
(1)PLys(ss-DBCO/CAA)的合成
1)PLys的合成
在手套箱Ar环境中，将Lys(TFA)-NCA粉末(1g，3.7mmol)溶解在无水DMF(4.0mL)中，随后将DCM稀释10倍的正丁胺(41.5μmol)加入到上述Lys(TFA)-NCA溶液中，引发开环聚合反应。将反应置于25℃油浴中搅拌48小时，反应液在预冷的乙醚中沉淀收集并进行真空干燥得到PLys(TFA)白色固体。将PLys(TFA)溶解在含1M NaOH的甲醇溶液(5mL)中，随后将反应置于30℃油浴中搅拌12小时以脱去TFA保护基团，反应液转移至MWCO 3500Da透析袋中，先在0.01M HCl透析，再在超纯水透析，在0.01M HCl和超纯水中分别透析三次，每次透析时间为6小时，随后将透析后的样品冷冻干燥得到PLys白色固体：
2)PLys(ss-DBCO)的合成
将4.6mg(9.8μmol)DBCO-ss-COOH溶于4.0mL DMF中，加入1.5倍摩尔量的EDC·HCl(2.8mg)和NHS(1.7mg)，随后将反应置于25℃油浴中搅拌4小时以活化羧基。将18.0mg PLys(2.0μmol)固体溶解在2mL Hepes缓冲液(pH 8.4，10mM)，并加入到上述羧基活化后的反应液中。将反应置于25℃油浴中搅拌24小时后，反应液转移至MWCO 3500Da透析袋中，于超纯水中透析三次，每次透析时间为6小时，随后将透析后的样品冷冻干燥得到PLys(ss-DBCO)白色固体：
3)PLys(ss-DBCO/CAA)的合成
将PLys(ss-DBCO)(20mg)以1mg/mL的浓度溶解在20mL NaHCO3缓冲液(0.1M，pH10.0)中，然后加入10倍摩尔量的CAA，将反应置于0℃冰浴中搅拌4小时，随后将反应液转移至超滤管(MWCO 3000Da)中离心三次以除去未反应的CAA，冷冻干燥得到PLys(ss-DBCO/CAA)白色固体：
(2)RGD-PEG-PLys(N3)的合成
1)RGD-PEG-NH2的合成
将cRGDfk(上海杰肽生物科技有限公司)(72.6mg，120.0μmol)以1mg/mL的浓度溶解在NaHCO3缓冲液(0.1M，pH 10.0)中，然后加入BOC-NH-PEG-NHS(Mw 5000Da，200mg，40.0μmol)，将反应置于25℃油浴中搅拌4小时，反应液转移至超滤管(MWCO 3000Da)中离心三次以除去未反应的cRGDfk，随后将样品冷冻干燥得到RGD-PEG-NH-BOC白色固体。将冻干后的RGD-PEG-NH-BOC溶解在10mL 1M HCl中，25℃油浴中搅拌12小时以除去保护性BOC基团，反应液转移至MWCO 3500Da透析袋中，在超纯水中透析三次，每次透析时间为6小时，随后将透析后的样品冷冻干燥得到RGD-PEG-NH2白色固体：
2)RGD-PEG-PLys的合成
首先对获得的RGD-PEG-NH2进行干燥处理：将RGD-PEG-NH2(22.0mg，3.9μmol)溶解在少量DCM(1mL)中，加入过量苯(8mL)混合均匀，冷冻并用冷肼减压抽干，随后转移至无水无氧的手套箱中。在手套箱Ar环境中，将Lys(TFA)-NCA(94.7mg，353.3μmol)溶解在4mLDMF中，然后加入溶解在4mLDMF中的RGD-PEG-NH2，将反应置于25℃油浴中搅拌48小时。反应液在预冷的乙醚中沉淀收集并进行真空干燥得到RGD-PEG-PLys(TFA)白色固体。将RGD-PEG-PLys(TFA)溶解在含1M NaOH的甲醇溶液(5mL)中，将反应置于30℃油浴中搅拌12小时以脱去TFA保护基团，反应液转移至MWCO 3500Da透析袋中，先在0.01M HCl透析，再在超纯水透析，在0.01M HCl和超纯水中分别透析三次，每次透析时间为6小时，随后将透析后的样品冷冻干燥得到RGD-PEG-PLys白色固体：
3)RGD-PEG-PLys(N3)的合成
将RGD-PEG-PLys(20.0mg，1.4μmol)溶于20mL NaHCO3缓冲液(0.1M，pH 10.0)中，加入5倍摩尔量的NHS-PEG4-N3(6.8μmol，2.6mg)，将反应置于25℃油浴中搅拌4小时，反应液转移至超滤管(MWCO 3000Da)中离心三次以除去未反应的NHS-PEG4-N3，随后将样品冷冻干燥得到RGD-PEG-PLys(N3)白色固体：
(3)聚合物囊泡的制备
阳离子嵌段共聚物RGD-PEG-PLys(N3)(以下简称为RPL(N3))与阴离子高聚物PLys(ss-DBCO/CAA)(以下简称为L(ss-D/C))在缓冲液中首先通过静电作用复合，RGD-PEG-PLys主链上的-N3与PLys主链上的-DBCO发生无铜做催化剂的点击反应，从而实现阴/阳离子嵌段共聚物链的键合，形成结构稳定具有水相空腔的囊泡结构RPL-ss-LC。具体制备方法为：将RPL(N3)与L(ss-D/C)分别溶于Hepes缓冲液(pH 7.4，10mM)中，得到RPL(N3)溶液和L(ss-D/C)溶液，浓度均为0.5mg/mL。随后分别将0.5mL上述RPL(N3)溶液与L(ss-D/C)溶液同时加入到10mL Hepes缓冲液(pH 7.4，10mM)中，室温搅拌24小时后通过超滤(MWCO 30000Da)除去未反应的聚合物分子，并浓缩至RPL-ss-LC聚合物囊泡浓度为1mg/mL。
(4)载蛋白聚合物囊泡的制备
使用RNase A作为模型蛋白制备载蛋白聚合物囊泡RNase@RPL-ss-LC：将RNase A(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)溶于10mL Hepes缓冲液(pH 7.4，10mM)中，得到RNase A溶液，终浓度分别为0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL。将RPL(N3)与L(ss-D/C)分别溶于Hepes缓冲液(pH 7.4，10mM)中，得到RPL(N3)溶液和L(ss-D/C)溶液，浓度均为0.5mg/mL。随后分别将0.5mL的RPL(N3)溶液与L(ss-D/C)溶液加入到上述RNase A溶液中，室温搅拌24小时后通过超滤管(MWCO 30000Da)离心除去未反应的聚合物分子及未包载的RNase A，并浓缩至终体积为1mL。
实施例2
对实施例1制备的阳离子嵌段共聚物RPL(N3)与阴离子聚合物L(ss-D/C)的结构进行验证。随后，考察了空载体囊泡RPL-ss-LC及载蛋白囊泡RNase@RPL-ss-LC的理化性质及生物相容性，并对其细胞摄取能力、pH响应性、还原响应性及细胞毒性进行验证。结果如下：
(1)PLys(ss-DBCO/CAA)的核磁共振氢谱结果
通过1H-NMR对PLys(ss-DBCO/CAA)及中间产物结构进行验证。如图1所示PLys的1H-NMR，根据正丁胺端基甲基(-CH3)质子峰(化学位移：0.8ppm)与Lys亚甲基(-CH2-)质子峰(化学位移：1.3-1.9ppm)的积分面积计算出Lys的聚合度为71.0。根据二苯基环辛炔质子峰(化学位移：7.0-7.5ppm)与Lys亚甲基(-CH2-)质子峰(化学位移：1.3-1.9ppm)的积分面积计算出DBCO接枝度为4.3。接枝CAA后，化学位移5.8-6.0ppm处出现的峰为乌头酸中的次甲基(-CH-)质子峰，*表示为衣康酰胺的烯烃(C＝CH2)质子峰(化学位移：5.5-7.0ppm)。上述结果说明已成功合成PLys(ss-DBCO/CAA)。
(2)RGD-PEG-PLys(N3)的核磁共振氢谱
通过1H-NMR对RGD-PEG-PLys(N3)及其中间产物的结构进行验证。如图2所示，根据PEG中的亚甲基(-CH2-)质子峰(化学位移：3.7ppm)与cRGDfk苄基(-C6H5)质子峰(化学位移：7.0-7.5ppm)的积分面积计算得cRGDfk反应效率为78.0％。根据PEG中的亚甲基(-CH2-)质子峰(化学位移：3.7ppm)与Lys亚甲基(-CH2-)质子峰(化学位移：1.3-1.9ppm)的积分面积计算出RGD-PEG-PLys中Lys的聚合度约为71.3。接枝NHS-PEG4-N3后，由酰胺键旁亚甲基(-CH2-)质子峰(化学位移：1.3-1.9ppm)与PEG中的亚甲基(-CH2-)质子峰的积分面积计算出NHS-PEG4-N3的接枝度为4.2。
(3)聚合物囊泡的稳定性
以PBS缓冲液模拟生理环境，测试聚合物囊泡的粒径稳定性。另外，为了考察阴/阳离子聚合物链的键合对于聚合物囊泡RPL-ss-LC结构稳定性的重要作用，同时制备了静电复合的聚合物囊泡RPL/LC。具体制备过程为：将RGD-PEG-PLys(以下简称为RPL)与PLys(CAA)(以下简称为LC)分别溶于Hepes缓冲液(pH 7.4，10mM)中，浓度均为0.5mg/mL。随后分别将0.5mL RPL的Hepes溶液及0.5mL LC的Hepes溶液同时加入到10mL Hepes缓冲液(pH7.4，10mM)中，室温搅拌24小时后通过超滤管(MWCO 30000Da)离心除去未结合的聚合物分子，并浓缩至RPL/LC聚合物囊泡浓度为1mg/mL。
对RPL/LC聚合物囊泡和RPL-ss-LC聚合物囊泡的粒径变化进行测试。如图3所示，聚合物囊泡RPL-ss-LC的水合粒径为128.6±1.8nm，在pH 7.4的PBS缓冲液中孵育168小时后，RPL-ss-LC聚合物囊泡的粒径几乎没有发生改变。与此形成鲜明对比，无交联的RPL/LC聚合物囊泡在pH 7.4的PBS缓冲液中孵育168小时后，粒径增加至1995.3±774.7nm。以上结果证明阴/阳离子交联聚合物极大地提高了囊泡结构的稳定性，在生理环境中孵育长达一周的时间仍能保持稳定的粒径。
(4)聚合物囊泡的生物相容性
通过检测聚合物囊泡的血液相容性及细胞毒性考察其生物相容性。
通过检测RPL-ss-LC的红细胞溶血率评价空载体聚合物囊泡RPL-ss-LC的血液相容性。将无菌脱纤维绵羊血1000g离心3分钟收集红细胞沉淀，使用PBS悬浮红细胞并多次清洗离心至上清无色澄清。随后，PBS悬浮并稀释至红细胞浓度为2％(v/v)。取200μL红细胞悬液，与等体积溶于PBS的RPL-ss-LC(2.0m妙mL)和Tween 20(2.0mg/mL)混合。红细胞终浓度1％(v/v)，RPL-ss-LC及Tween 20终浓度为1.0mg/mL。样品置于37℃恒温摇床震荡，分别于1小时、2小时和12小时取出200μL样品，1000g离心3分钟以沉降红细胞，并收集100μL上清液于96孔板，使用多功能读板机检测释放的血红蛋白在540nm处的吸光度。PBS和蒸馏水分别用作阴性和阳性对照。每组测试三次，溶血率(％)计算公式为：溶血率(％)＝(OD样品-OD阴性对照)/(OD阳性对照-OD阴性对照)×100％。如图4所示，即使RPL-ss-LC聚合物囊泡的浓度为1.0mg/mL时与红细胞孵育12小时，红细胞溶血率仍保持在3.9％的极低水平，对比0.2％Tween 20(74.9％)显著改善了血液相容性。
通过MTT法测定空载体聚合物囊泡RPL-ss-LC对U87细胞(神经胶质瘤细胞)的细胞毒性。将U87细胞以每孔1×104个的细胞密度接种在96孔板中，并在含有10％FBS的DMEM培养基中培养。37℃、5％CO2培养箱中孵育24小时后，将培养基更换为100μL含有不同浓度的RPL-ss-LC的新鲜培养基。37℃、5％CO2培养箱中孵育48小时后，弃除含有样品的培养基，并用100μL PBS清洗两次。随后，每孔加入100μL含有MTT(0.5mg/mL)的新鲜培养基，37℃、5％CO2培养箱中孵育4小时。最后，弃除含有MTT的培养基，加入100μL DMSO震荡溶解甲臜晶体。使用多功能读板机测试570nm和630nm(背景)处的吸光度。未经样品处理的细胞作为对照组，每组3个复孔，细胞存活率计算公式为：细胞存活率(％)＝(OD样品(570nm)-OD样品(630nm))/(OD对照(570nm)-OD对照(630nm))×100％。结果如图5所示，RPL-ss-LC聚合物囊泡的浓度为200μg/mL时与细胞孵育48小时后细胞存活率仍保持在83.3％，显示出良好的细胞相容性。
(5)载蛋白聚合物囊泡的粒径及电位表征
通过纳米粒度仪对RNase@RPL-ss-LC进行理化性质的表征。如表1所示，载药量随着投料比(RNase∶RPL(N3)∶L(ss-D/C))的增加而逐渐增加。考虑到药物实际应用的经济价值，选择蛋白质药物包封率较高的投料比，即RNase∶RPL(N3)∶L(ss-D/C)＝25∶1∶1的投料比制备方案用于后续实验，包封率(10.8±0.3％)和载药量(47.9±1.3％)均保持较高水平。通过纳米粒度仪对不同投料比的载蛋白聚合物囊泡粒径及电位进行检测，如表1及图6所示，本实施例选用的载蛋白聚合物囊泡RNase@RPL-ss-LC(RNase∶RPL(N3)∶L(ss-D/C)＝25∶1∶1)的水合粒径为169.4±3.5nm，PDI为0.24±0.03，且具有较窄的分布范围，ζ电位为+1.0±0.1。接近中性的正电位囊泡在促进细胞摄取的同时，避免了对生物环境中负电荷分子的非特异性吸附。
表1不同蛋白质和载体的投料比制备载蛋白聚合物囊泡RNase@RPL-ss-LC的理化性质
(6)载蛋白聚合物囊泡的细胞摄取实验
通过激光共聚焦显微镜观测U87细胞对负载蛋白RNase A的摄取效果。首先使用Alexa Fluor 647NHS标记RNase A，并制备载蛋白聚合物囊泡RNase@RPL-ss-LC及RNase@PL-ss-LC。将U87细胞以1×105个细胞/mL的密度接种到共聚焦培养皿中，并在含有10％FBS的DMEM培养基中培养。置于37℃、5％CO2培养箱中孵育24小时后，将培养基更换为2mL含有RNase A、RNase@PL-ss-LC或RNase@RPL-ss-LC的新鲜培养基(RNase A浓度：50μg/mL)。37℃、5％CO2培养箱中孵育12小时后，弃除含有样品的培养基，并用PBS清洗两次。随后，每孔加入2mL含有Hoechst 33342(1μL/mL)的新鲜培养基，对细胞核进行染色，37℃、5％CO2培养箱中孵育15分钟后，用PBS洗涤细胞并置于激光共聚焦显微镜下观察。如图7所示CLSM图像，无载体的RNase A实验组细胞中RNase A的荧光信号极其微弱，而有聚合物囊泡包载RNaseA的实验组均在U87细胞中观察到明显的荧光信号。相较于无RGD外层的RNase@PL-ss-LC实验组细胞，RGD修饰的RNase@RPL-ss-LC实验组细胞内观测到具有更为显著的RNase A荧光信号。
为了进一步量化U87细胞对RNase A的摄取效率，按照上述方法制备Alexa Fluor647标记的RNase A、RNase@PL-ss-LC及RNase@RPL-ss-LC。将U87细胞以1×105个细胞/mL的密度接种到六孔板中，并在含有10％FBS的DMEM培养基中培养。置于37℃、5％CO2培养箱中孵育24小时后，将培养基更换为2mL含有RNase A、RNase@PL-ss-LC或RNase@RPL-ss-LC的新鲜培养基(RNase A浓度：50μg/mL)。37℃、5％CO2培养箱中分别孵育4小时或24小时后，弃除含有样品的培养基，经过PBS清洗，胰蛋白酶消化，DMEM吹打来收集细胞，最后用300μL PBS悬浮细胞并用流式细胞仪检测细胞中Alexa Fluor 647信号强度。另外，通过FCM对U87细胞在不同时间内对于聚合物囊泡的摄取能力进行定量，结果如图8所示，聚合物囊泡与细胞孵育4小时时，细胞对RNase@RPL-ss-LC的摄取量比RNase@PL-ss-LC高约1.3倍，而孵育时间延长至24小时后，细胞对RNase@RPL-ss-LC的摄取量比RNase@PL-ss-LC高约4.2倍。综上所述，RGD功能化的聚合物囊泡可显著提高胶质瘤细胞对负载蛋白的摄取能力。
(7)聚合物囊泡的pH响应性
通过纳米粒度仪测试空载体聚合物囊泡RPL-ss-LC及载蛋白聚合物囊泡RNase@RPL-ss-LC在生理环境pH(7.4)或溶酶体环境pH(5.0)中的ζ电位变化。结果如图9所示，载体聚合物囊泡RPL-ss-LC在pH 7.4的PBS中ζ电位为+3.9±0.3mV，而在酸性溶酶体环境(pH5.0PBS)中孵育12小时后，ζ电位增加至+6.1±0.2mV。载蛋白聚合物囊泡RNase@RPL-ss-LC在pH 7.4的PBS中ζ电位为+1.0±0.1mV，pH 5.0的PBS条件下孵育12小时后，ζ电位增加至+7.2±0.3mV。以上结果表明，无论是空载体囊泡还是载蛋白囊泡，都表现出了正电荷的增加，主要是归因于阴离子聚合物链L(ss-D/C)电荷反转为阳离子聚合物链，同时RPL(N3)的氨基失去原本静电作用的阴离子中和电荷，暴露出大量氨基，导致聚合物囊泡表面电荷显著升高。
(8)乳酸脱氢酶(LDH)活性
分别通过测试pH 7.4或pH 5.0条件下PL-ss-LC及RPL-ss-LC聚合物囊泡处理细胞后的LDH活性来考察聚合物囊泡的溶酶体逃逸能力。U87细胞以每孔1×104个的密度接种在96孔板中，并在含有10％FBS的DMEM中培养24小时(37℃，5％CO2)。同时，将制备好的PL-ss-LC及RPL-ss-LC以1mg/mL的载体浓度溶于pH 7.4或pH 5.0PBS缓冲液(200μL、10mM)，室温孵育12小时。取出96孔板，弃除原培养基，分别吸取100μL样品加入96孔板，立即转移至4℃孵育2小时，随后吸取上清液并根据LDH试剂盒说明书检测LDH活性。阳性对照组为0.2％Tween20溶液，阴性对照组为pH 7.4或pH 5.0PBS(10mM)。为保证样品的完整性，相关操作均在低温下进行。LDH活性计算公式为：LDH活性(％)＝(OD样品-OD阴性对照)/(OD阳性对照-OD阴性对照)。如图10所示，PL-ss-LC和RPL-ss-LC聚合物囊泡在pH 7.4条件下对U87细胞膜的破坏能力可忽略不计，LDH含量分别约为1.2％和9.5％，证实细胞膜保留较高的完整性。与此形成鲜明对比，pH5.0条件下的PL-ss-LC及RPL-ss-LC实验组细胞的LDH含量分别升高至14.8％和17.7％，表明生物膜破损导致大量胞内LDH泄漏到细胞外。
(9)聚合物囊泡的还原响应性
将聚合物囊泡依次在pH 5.0及10mM GSH中孵育2小时，并通过DLS对其粒径进行测试。如图11所示，RPL-ss-LC在pH 5.0的PBS中孵育2小时后，粒径由105.8±0.7nm增加至183.1±2.7nm，推测是由于聚合物的脱羧行为导致聚合物链之间失去静电吸引作用力，静电斥力导致结构致密性降低，粒径略微增大。然而，在加入GSH后，RPL-ss-LC的粒径增加至2μm以上，证明聚合物囊泡已响应还原环境结构完全解离。
为了考察载蛋白聚合物囊泡的还原响应性释药行为，使用RNase A作为模型蛋白，制备带有Alexa Fluor 647标记的RNaseAlexa Fluor 647及RNaseAlexa Fluor 647@RPL-ss-LC聚合物囊泡，并依次检测pH 5.0及GSH条件下RNase A的释放量。结果如图12所示，载蛋白聚合物囊泡溶液在pH 5.0条件下处理10小时后，RNase A的释放量仍不足10％，然而在10mM GSH条件下处理1小时后，RNase A的释放量快速增加至58.7％，处理10小时后，释放量增加至98.7％。
(10)载蛋白聚合物囊泡细胞毒性实验
通过MTT法测定RNase A、RNase@PL-ss-LC和RNase@RPL-ss-LC对U87细胞毒性，结果如图13所示，RNase A、RNase@PL-ss-LC和RNase@RPL-ss-LC分别与U87细胞孵育48小时后，RNase A浓度为200μg/mL时，RNase A实验组的细胞存活率仍保持在96.1％，几乎没有受到影响。不同浓度的RNase@PL-ss-LC和RNase@RPL-ss-LC实验组均观察到显著的细胞毒性，且随囊泡浓度增加细胞毒性增强。另外，RNase A浓度为200μ妙mL时，RNase@RPL-ss-LC实验组的细胞存活率仅为32.4％，显著低于该浓度下的RNase@PL-ss-LC实验组细胞存活率(47.0％)。
Claims (10)
1.一种用于蛋白质递送的多级响应型聚合物囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将RNase A溶于Hepes缓冲液中，得到RNase A的溶液；
(2)将RGD-PEG-PLys(N3)与PLys(ss-DBCO/CAA)分别溶于Hepes缓冲液中，分别得到RGD-PEG-PLys(N3)溶液和PLys(ss-DBCO/CAA)溶液；
(3)将上述RGD-PEG-PLys(N3)溶液与PLys(ss-DBCO/CAA)溶液同时加入到RNase A缓冲液中，25-30℃搅拌24-48小时后，离心，得到载蛋白聚合物囊泡。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述RNase A溶液的浓度为0.25-1mg/mL；所述RGD-PEG-PLys(N3)溶液和PLys(ss-DBCO/CAA)溶液的浓度均为0.5mg/mL，RGD-PEG-PLys(N3)溶液、PLys(ss-DBCO/CAA)溶液与RNase A溶液的体积比为1∶1∶10-20；所述Hepes缓冲液的pH为7.4。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述PLys(ss-DBCO/CAA)的合成方法，包括如下步骤：
1)PLys的合成
①在惰性气体中，将Lys(TFA)-NCA粉末溶解在无水N，N-二甲基甲酰胺中，得到Lys(TFA)-NCA溶液，随后将正丁胺的二氯甲烷溶液加入到上述Lys(TFA)-NCA溶液中，于25℃-30℃油浴中搅拌48-72小时，反应液使用乙醚进行沉淀，并进行真空干燥，得到PLys(TFA)白色固体；
②将PLys(TFA)溶解在含NaOH的甲醇溶液中，于25-30℃油浴中搅拌12-24小时，对反应液进行透析，随后将透析后的样品冷冻干燥，得到PLys白色固体：
2)PLys(ss-DBCO)的合成
将DBCO-ss-COOH溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，于25-30℃油浴中搅拌3-5小时，得到羧基活化后的反应液；将PLys固体溶解在Hepes缓冲液中，并加入到上述羧基活化后的反应液中，于25-30℃油浴中搅拌12-24小时，对反应液进行透析，随后将透析后的样品冷冻干燥，得到PLys(ss-DBCO)白色固体：
3)PLys(ss-DBCO/CAA)的合成
将PLys(ss-DBCO)溶解在NaHCO3缓冲液中，再加入CAA，于0-4℃下搅拌2-4小时，对反应液进行离心，冷冻干燥，得到PLys(ss-DBCO/CAA)白色固体：
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述RGD-PEG-PLys(N3)的合成方法，包括如下步骤：
1)RGD-PEG-NH2的合成
①将cRGDfk溶解在NaHCO3缓冲液中，再加入NHS-PEG-NH-BOC，于25-30℃油浴中搅拌3-5小时，对反应液进行离心，冷冻干燥，得到RGD-PEG-NH-BOC白色固体；
②将RGD-PEG-NH-BOC溶解在HCl溶液中，于25-30℃油浴中搅拌12-24小时，对反应液进行透析，随后将透析后的样品冷冻干燥，得到RGD-PEG-NH2白色固体：
2)RGD-PEG-PLys的合成
①对RGD-PEG-NH2进行干燥处理：将RGD-PEG-NH2溶解在二氯甲烷中，加入苯混合均匀，冷冻并用冷肼减压抽干，随后转移至无水无氧的环境中，得到干燥处理后的RGD-PEG-NH2；
②在惰性气体中，将干燥处理后的RGD-PEG-NH2溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，得到RGD-PEG-NH2的N，N-二甲基甲酰胺溶液；在惰性气体中，将Lys(TFA)-NCA溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，得到Lys(TFA)-NCA的N，N-二甲基甲酰胺溶液；之后将RGD-PEG-NH2的N，N-二甲基甲酰胺溶液和Lys(TFA)-NCA的N，N-二甲基甲酰胺溶液混合，置于25-30℃油浴中搅拌48-72小时，反应液使用乙醚进行沉淀，并进行真空干燥，得到RGD-PEG-PLys(TFA)白色固体；
③将RGD-PEG-PLys(TFA)溶解在含NaOH的甲醇溶液中，于25-30℃油浴中搅拌12-24小时，对反应液进行透析，随后将透析后的样品冷冻干燥，得到RGD-PEG-PLys白色固体；
3)RGD-PEG-PLys(N3)的合成
将RGD-PEG-PLys溶于NaHCO3缓冲液中，加入NHS-PEG4-N3，于25-30℃油浴中搅拌4-12小时，对反应液进行离心，随后将样品冷冻干燥，得到RGD-PEG-PLys(N3)白色固体：
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)PLys的合成中，所述正丁胺与Lys(TFA)-NCA的摩尔比为1∶90；所述Lys(TFA)-NCA溶液的浓度为0.1-0.25mg/mL；所述正丁胺的二氯甲烷溶液中正丁胺与二氯甲烷的体积比为1∶9；所述Lys(TFA)-NCA与含NaOH的甲醇溶液的比例为0.37-5mmol∶5-20mL；
步骤2)PLys(ss-DBCO)的合成中，所述DBCO-ss-COOH与EDC·HCl、NHS的摩尔比为1∶1.2-1.5∶1.2-1.5；所述DBCO-ss-COOH与DMF的比例为9.8μmol∶4.0mL；所述Plys在Hepes缓冲液中的浓度为5.0-10.0mg/mL；所述DBCO-ss-COOH与Plys的摩尔比为5∶1。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)RGD-PEG-NH2的合成中，所述cRGDfk在NaHCO3缓冲液中的浓度为0.5-1mg/mL；所述NHS-PEG-NH-BOC与cRGDfk的摩尔比为1∶2-1∶5；所述NHS-PEG-NH-BOC与HCl溶液的比例为40.0μmol∶10-20mL；
步骤2)RGD-PEG-PLys的合成中，所述RGD-PEG-NH2与二氯甲烷、苯的比例为3.9μmol∶1-2mL∶8-16mL；所述RGD-PEG-NH2的N，N-二甲基甲酰胺溶液中RGD-PEG-NH2与N,N-二甲基甲酰胺比例为3.9μmol∶4-8mL；所述Lys(TFA)-NCA的N，N-二甲基甲酰胺溶液中Lys(TFA)-NCA与DMF的比例为353.3μmol∶4-8mL；所述Lys(TFA)-NCA与RGD-PEG-NH2的摩尔比为90∶1；所述Lys(TFA)-NCA与含NaOH的甲醇溶液的比例为353.3μmol∶5-20mL；
步骤3)RGD-PEG-PLys(N3)的合成中，所述RGD-PEG-Plys在NaHCO3缓冲液中的浓度为0.5-1mg/mL；所述RGD-PEG-Plys与NHS-PEG4-N3的摩尔比为1∶5。
7.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述惰性气体为氩气或氮气；所述含NaOH的甲醇溶液中NaOH的浓度为1-2M；所述Hepes缓冲液的pH为8.0-9.0；所述NaHCO3缓冲液的浓度为0.1-0.5M，pH为9.0-10.0；所述NHS-PEG-NH-BOC的重均分子量为5000Da；所述HCl溶液的浓度为1-2M；所述透析使用的透析袋的截留分子量为3000-5000Da；所述超滤使用的超滤管的截留分子量为3000-5000Da。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)PLys的合成中，所述透析为先在HCl溶液中透析9-36小时，再在超纯水中透析9-36小时；
步骤2)PLys(ss-DBCO)的合成中，所述透析为在超纯水中透析9-36小时。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)RGD-PEG-NH2的合成中，所述透析为在超纯水中透析9-36小时；
步骤2)RGD-PEG-PLys的合成中，所述透析为先在HCl溶液中透析9-36小时，再在超纯水中透析9-36小时。
10.权利要求1-9中任意一项所述的方法制备的用于蛋白质递送的多级响应型聚合物囊泡。
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